JP2023134463A - 治療用モノクローナル抗体に対する酸性翻訳後修飾としてのグルクロニル化 - Google Patents
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Abstract
【課題】グルクロニル化タンパク質を特定するための方法を提供する。【解決手段】タンパク質を脱グリコシル化することと、脱グリコシル化したタンパク質を非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片を含む一つのFc*断片、および一つのFab2を含む一つのFab2断片を生成することと、イオン交換クロマトグラフィーを使用して該Fc*複合体およびFab2複合体をFc*およびFab2の酸性画分へと分離することと、該酸性画分を乾燥および変性させることと、該酸性画分をアルキル化することと、酸性画分をトリプシンで消化してサンプルを形成することと、該サンプルをNaBH4で還元されたサンプルを形成することと、還元されたサンプルを逆相液体クロマトグラフィー/マススペクトル分析に供して該タンパク質のグルクロニル化を特定することと、を含む、方法である。【選択図】図2
Description
発明の分野
本発明は概して、治療用タンパク質に対する翻訳後修飾を特定するシステムおよび方法に関する。
本発明は概して、治療用タンパク質に対する翻訳後修飾を特定するシステムおよび方法に関する。
発明の背景
医薬品業界において、組換え型モノクローナル抗体(mAb)はタンパク質治療薬の主要なクラスを構成する。mAb構造への変化は、治療用mAbの治療効果、バイオアベイラビリティ、クリアランス、免疫原性特性に影響を与える場合がある。さらに、mAbの変化は、薬物安全性および薬物有効性を変える可能性がある。mAbの一次構造、翻訳後修飾(PTM)、ジスルフィド結合を包括的に特性化することは、薬物有効性および薬物安全性の評価にとって重要であるだけでなく、構造/機能の関係を理解するために重要である。
医薬品業界において、組換え型モノクローナル抗体(mAb)はタンパク質治療薬の主要なクラスを構成する。mAb構造への変化は、治療用mAbの治療効果、バイオアベイラビリティ、クリアランス、免疫原性特性に影響を与える場合がある。さらに、mAbの変化は、薬物安全性および薬物有効性を変える可能性がある。mAbの一次構造、翻訳後修飾(PTM)、ジスルフィド結合を包括的に特性化することは、薬物有効性および薬物安全性の評価にとって重要であるだけでなく、構造/機能の関係を理解するために重要である。
製品およびプロセスの一貫性を確保するために使用される様々なアッセイの中でも、イオン交換クロマトグラフィー(IEX)は、mAb分子の荷電多様性を評価するための一般的に使用される技法である。mAb荷電バリアントは、mAb分子の表面荷電を変えることができる翻訳後修飾(PTM)に起因する場合がしばしばある。かつてないほど進歩しているLC-MS技法のため、数多くの既知または新規のPTMが特定されている。さらに、これらによる荷電多様性への寄与が解明されてきた。技術の進歩は多数の新規のPTMを提供してきたが、mAb活性および安定性を変えるPTMをさらに特性化し、発見する必要性がある。
従って、PTMを特定するためのシステムおよび方法を提供することが本発明の目的である。
グルクロニル化タンパク質医薬品を特定するための組成物および方法が提供されている。一実施形態は、一つのFc*断片(非共有相互作用を介して結合された二つの同一のFc/2断片)および一つのFab2を生成するために、タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、脱グリコシル化したタンパク質医薬品を酵素(例えば、FabRICATOR(登録商標))で処理することとによって、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する方法を提供する。次いで、Fc*断片およびFab2断片は、Fc*およびFab2の酸性画分へと分離される。一実施形態において、Fc*断片およびFab2断片は、イオン交換クロマトグラフィー、例えば強力な陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して分離される。分離されると、酸性画分は収集され、乾燥され、かつ変性される。乾燥され、かつ変性された酸性画分はアルキル化され、次いでトリプシンで消化されてサンプルを形成する。次いで、サンプルはNaBH4で処理されて、還元されたサンプルを形成する。次いで、還元されたFc*サンプルおよび還元されたFab2サンプルの両方は、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定するために、逆相液体クロマトグラフィー/マススペクトル分析に供される。一実施形態において、方法は、マススペクトル分析の結果を還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間で比較して、還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程を含む。医薬品は、モノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。一実施形態において、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で検出される。
一実施形態において、Fc*断片およびFab2断片は、FabRICATOR(登録商標)の名称で販売されている、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換えによって修飾された形態のIdeSを使用して形成される。
開示された方法は、例えばモノクローナル抗体またはその他の治療用タンパク質などのタンパク質医薬品の純度をモニターするために使用することができる。一実施形態は、タンパク質医薬品を分析してタンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、タンパク質医薬品からグルクロニル化したタンパク質を除去して精製したタンパク質医薬品を生成することとによって、タンパク質医薬品の純度を増加させる方法を提供する。グルクロニル化は、上記および実施例に説明した方法を使用して検出することができる。一実施形態において、グルクロニル化タンパク質は、マススペクトル分析と随意に組み合わされる高速液体クロマトグラフィー技法によって検出される。代表的なクロマトグラフィー技法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。典型的に、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で生じる。
別の実施形態は、グルクロニル化のために哺乳類細胞培養から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることによって、翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法を提供し、タンパク質医薬品のグルクロニル化の存在は、タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す。哺乳類細胞培養は典型的に、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含有する。
さらに別の実施形態は、治療用タンパク質を含有するタンパク質医薬品を提供し、治療用タンパク質のアミノ酸の1.0%未満、2.0%未満、3.0%未満、4.0%未満、5.0%未満、6.0%未満、7.0%未満、8.0%未満、9.0%未満、または10%未満がグルクロニル化されている。一実施形態において、アミノ酸はリジンである。典型的に治療用タンパク質は、モノクローナル抗体、組換え型タンパク質、または融合タンパク質である。
[本発明1001]
タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する方法であって、
前記タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、
前記脱グリコシル化したタンパク質医薬品を処理して、非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片を含む一つのFc*断片、および一つのFab2を含む一つのFab2断片を生成することと、
イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記Fc*複合体およびFab2複合体を、Fc*およびFab2の酸性画分へと分離することと、
前記酸性画分を乾燥および変性させることと、
前記酸性画分をアルキル化することと、
前記酸性画分をトリプシンで消化してサンプルを形成することと、
前記サンプルをNaBH4でインキュベートして、還元されたサンプルを形成することと、
前記還元されたサンプルを、逆相液体クロマトグラフィー/マススペクトル分析に供して前記タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間でマススペクトル分析を比較して、前記還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記タンパク質医薬品がモノクローナル抗体を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記Fc*断片およびFab2断片が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換えによって修飾された形態のIdeSを使用して形成される、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記イオン交換クロマトグラフィーが強力な陽イオン交換クロマトグラフィーである、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記酸性画分が、ヨードアセトアミドでアルキル化される、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のアミノ酸の10%未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
[本発明1008]
前記治療用タンパク質のアミノ酸の5%未満がグルクロニル化されている、本発明1007のタンパク質医薬品。
[本発明1009]
前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、本発明1007または1008のタンパク質医薬品。
[本発明1010]
前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、本発明1007~1009のいずれかのタンパク質医薬品。
[本発明1011]
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、本発明1010のタンパク質医薬品。
[本発明1012]
治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のリジンアミノ酸の3%未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
[本発明1013]
タンパク質医薬品の純度を増加させる方法であって、
前記タンパク質医薬品を分析して、前記タンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、
グルクロニル化タンパク質を前記タンパク質医薬品から除去して、精製されたタンパク質医薬品を生成することと
を含む、前記方法。
[本発明1014]
前記グルクロニル化タンパク質が高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記クロマトグラフィー技法が、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記クロマトグラフィー技法がマススペクトル分析と組み合わされる、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、本発明1013~1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、本発明1013~1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法であって、
グルクロニル化のために哺乳類細胞培養物から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることを含み、前記タンパク質医薬品の前記グルクロニル化の存在が、前記タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す、前記方法。
[本発明1021]
前記哺乳類細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記グルクロニル化が前記タンパク質医薬品のリジンアミノ酸上にある、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
前記タンパク質医薬品が、抗体または融合タンパク質である、本発明1020~1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1023のいずれかの方法。
[本発明1001]
タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する方法であって、
前記タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、
前記脱グリコシル化したタンパク質医薬品を処理して、非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片を含む一つのFc*断片、および一つのFab2を含む一つのFab2断片を生成することと、
イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記Fc*複合体およびFab2複合体を、Fc*およびFab2の酸性画分へと分離することと、
前記酸性画分を乾燥および変性させることと、
前記酸性画分をアルキル化することと、
前記酸性画分をトリプシンで消化してサンプルを形成することと、
前記サンプルをNaBH4でインキュベートして、還元されたサンプルを形成することと、
前記還元されたサンプルを、逆相液体クロマトグラフィー/マススペクトル分析に供して前記タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間でマススペクトル分析を比較して、前記還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記タンパク質医薬品がモノクローナル抗体を含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記Fc*断片およびFab2断片が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換えによって修飾された形態のIdeSを使用して形成される、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記イオン交換クロマトグラフィーが強力な陽イオン交換クロマトグラフィーである、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記酸性画分が、ヨードアセトアミドでアルキル化される、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のアミノ酸の10%未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
[本発明1008]
前記治療用タンパク質のアミノ酸の5%未満がグルクロニル化されている、本発明1007のタンパク質医薬品。
[本発明1009]
前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、本発明1007または1008のタンパク質医薬品。
[本発明1010]
前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、本発明1007~1009のいずれかのタンパク質医薬品。
[本発明1011]
前記抗体が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、本発明1010のタンパク質医薬品。
[本発明1012]
治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のリジンアミノ酸の3%未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
[本発明1013]
タンパク質医薬品の純度を増加させる方法であって、
前記タンパク質医薬品を分析して、前記タンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、
グルクロニル化タンパク質を前記タンパク質医薬品から除去して、精製されたタンパク質医薬品を生成することと
を含む、前記方法。
[本発明1014]
前記グルクロニル化タンパク質が高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記クロマトグラフィー技法が、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記クロマトグラフィー技法がマススペクトル分析と組み合わされる、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、本発明1013~1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、本発明1013~1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法であって、
グルクロニル化のために哺乳類細胞培養物から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることを含み、前記タンパク質医薬品の前記グルクロニル化の存在が、前記タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す、前記方法。
[本発明1021]
前記哺乳類細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記グルクロニル化が前記タンパク質医薬品のリジンアミノ酸上にある、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
前記タンパク質医薬品が、抗体または融合タンパク質である、本発明1020~1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1023のいずれかの方法。
発明の詳細な説明
I.定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を意味することを意図する。「可変領域」という用語は、免疫グロブリンのかかるドメインを、抗体(抗体Fcドメインなど)によって広く共有されるドメインと区別することを意図する。可変領域は「超可変領域」を含み、その残基は抗原結合に関与する。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」からのアミノ酸残基(すなわち典型的に、おおよそ軽鎖可変ドメイン内の残基24~34(L1)、50~56(L2)、および89~97(L3)、ならびにおおよそ重鎖可変ドメイン内の残基27~35(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)にある;Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))、および/または「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基26~32(L1)、50~52(L2)、および91~96(L3)、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3);Chothia and Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917)を含む。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書で定義される通りの、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
I.定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を意味することを意図する。「可変領域」という用語は、免疫グロブリンのかかるドメインを、抗体(抗体Fcドメインなど)によって広く共有されるドメインと区別することを意図する。可変領域は「超可変領域」を含み、その残基は抗原結合に関与する。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」からのアミノ酸残基(すなわち典型的に、おおよそ軽鎖可変ドメイン内の残基24~34(L1)、50~56(L2)、および89~97(L3)、ならびにおおよそ重鎖可変ドメイン内の残基27~35(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)にある;Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))、および/または「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメイン内の残基26~32(L1)、50~52(L2)、および91~96(L3)、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3);Chothia and Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917)を含む。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書で定義される通りの、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体(mAb)は、標的物質に特異的に結合する同一の免疫細胞によって作製される抗体を指す。mAbは、がん、関節炎、喘息、大腸炎、自己免疫疾患、および感染症が挙げられるがこれらに限定されない、種々の疾患に対する治療薬として、ますます人気が高まってきている。mAbは、150kDaに近い分子量を含む大きいタンパク質であり、かつ二つの同一の約50kDaの重鎖(HC)および二つの同一の約25kDaの軽鎖(LC)から構成される。これらはまた、三次元構造および生物学的活性を維持する少なくとも16個のジスルフィド結合を含有する。類似の二次タンパク質構造を共有するが、異なるmAbは、可変領域の配列で大きく異なっていて、特に抗体-抗原結合の多様性および特異性に関与する相補性決定領域(CDR)において大きく異なる。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗体の相補性決定領域(「CDR」)と、随意に抗体の「可変領域」抗原認識部位を含むフレームワーク残基とを含有し、また抗原に免疫特異的に結合する能力を示す、抗体の一つ以上の部分を指す。かかる断片としては、Fab’、F(ab’)2、Fv、一本鎖(ScFv)、およびその突然変異体、自然発生バリアント、および融合タンパク質が挙げられ、抗体の「可変領域」抗原認識部位および異種タンパク質(例えば、毒素、異なる抗原の抗原認識部位、酵素、受容体、または受容体リガンド等)が含まれる。
本明細書で使用される「イオン交換クロマトグラフィー(IEX)」は、それらの総電荷に基づいてイオン化可能な分子を分離する方法を指す。タンパク質は、正に荷電した化学基と負に荷電した化学基との両方から作り出される。環境のpHに応じて、タンパク質は正味の正電荷を運ぶこと、または正味の負電荷を運ぶこと、またはいかなる電荷も運ばないことができる。分子が正味の電荷を有しないときのpHは、等電点(pI)と呼ばれる。対象のタンパク質の正味の電荷は、分子の一次配列に基づいて計算することができる等電点とバッファのpHとを組み合わせることによって計算される。IEXカラムに特定のpHでサンプルが装填された時に、適切に荷電されたタンパク質はすべて、カラム内の樹脂に結合する。例えば、正味の負電荷を有するタンパク質は、陰イオン交換樹脂カラムによって捕捉される。
本明細書で使用される「電荷バリアント」とは、修飾されていない形態と比較して、等電点(pI)または電荷を変えたアイソフォームおよびタンパク質バリアントを指す。比較的より低いpIを有する電荷バリアントは、「酸性バリアント」と称される一方、比較的より高いpIを有する電荷バリアントは「塩基性バリアント」と称される。電荷バリアントは抗体の特性に影響を及ぼす可能性がある(タンパク質または細胞膜標的に結合するmAbの能力を変化させることを含む)。これは、抗体の組織浸透、組織分布、および薬物動態に影響を与える可能性がある。電荷バリアントの例としては、脱アミド化、N末端ピログルタミン酸の形成、凝集、異性化、シアル酸付加グリカン、抗体断片化、およびリジン残基での糖化が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「翻訳後修飾(PTM)」とは、タンパク質生合成後のタンパク質上の一つ以上のアミノ酸に生じる生化学的修飾を指す。PTMは、タンパク質折り畳みの調節を介して、特定の細胞区画へのタンパク質の標的化、またはリガンドとその他のタンパク質の間の相互作用の調節を介して、細胞機能において主要な役割を果たす。最も一般的な修飾は、前駆体タンパク質の特異的切断、ジスルフィド結合の形成、または低分子量基の共有結合的付加もしくは除去であり、それ故にアセチル化、アミド化、ビオチン化、システイニル化、脱アミド化、ファルネシル化、ホルミル化、ゲラニル化、グルタチオン化、糖化(炭水化物との非酵素的抱合)、グリコシル化(炭水化物との酵素的抱合)、ヒドロキシル化、メチル化、モノADPリボシル化、ミリストイル化、酸化、パルミトイル化、リン酸化、ポリADPリボシル化、ステアロイル化または硫酸化などの修飾につながる。ユビキチン化は、タンパク質分解経路において重要な別の一般的なPTMである。一部のPTMは、脱抱合酵素の作用によって可逆的である。
本明細書で使用される「N結合グリコシル化」とは、翻訳後タンパク質修飾を指す。N結合グリコシル化は、窒素原子へのオリゴ糖の付着であり、通常はアスパラギン残基のN4である。すべてのN結合炭水化物は、N-アセチルグルコサミンおよびアミノ酸アスパラギンを介して連結される。
本明細書で使用される「ペプチドマッピング」とは、タンパク質を特性化し、かつそれらの一次アミノ酸構造を解明する技法を指す。モノクローナル抗体およびその他の組換え型タンパク質医薬品を特性化するために広く利用される技法である。
本明細書で使用される「グルクロン酸化」とは、補助因子UDP-グルクロン酸に由来するグルクロン酸が求核性官能基を含有する基質に共有結合している抱合反応を指す。
II.グルクロニル化を特定する方法およびその使用方法
A. グルクロニル化の特定
グルクロニル化タンパク質医薬品を特定するための組成物および方法が提供されている。実施例1~3は、治療用タンパク質中のグルクロニル化アミノ酸を検出および特定するために使用される方法の詳細な説明を提供する。一般的に、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定するための一つの方法は、一つのFc*断片(非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片)および一つのFab2断片を生成するために、タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、脱グリコシル化したタンパク質医薬品をFabRICATOR(登録商標)で処理することとを含む。一実施形態において、Fc*断片およびFab2断片は、FabRICATOR(登録商標)の名称で販売されている、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換え型IdeS酵素を使用して生成される。
A. グルクロニル化の特定
グルクロニル化タンパク質医薬品を特定するための組成物および方法が提供されている。実施例1~3は、治療用タンパク質中のグルクロニル化アミノ酸を検出および特定するために使用される方法の詳細な説明を提供する。一般的に、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定するための一つの方法は、一つのFc*断片(非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片)および一つのFab2断片を生成するために、タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、脱グリコシル化したタンパク質医薬品をFabRICATOR(登録商標)で処理することとを含む。一実施形態において、Fc*断片およびFab2断片は、FabRICATOR(登録商標)の名称で販売されている、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換え型IdeS酵素を使用して生成される。
次いで、Fc*断片およびFab2断片は、Fc*およびFab2の酸性画分へと分離される。一実施形態において、Fc*断片およびFab2断片は、イオン交換クロマトグラフィー、例えば強力な陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して分離される。実施例1に記載の通り、脱グリコシル化されたmAbサンプル(約50μg)のアリコートを、質量測定のために、Thermo Exactive Plus EMR質量分析計、またはThermo Q Exactive plus質量分析計に連結されたYMC-BioPro SP-F強力陽イオン交換(SCX)カラム(100×4.6mm)に注入した。サンプルを分離し、そして酢酸アンモニウムベースの緩衝液(緩衝液A:20mM酢酸アンモニウム、pH5.8、緩衝液B:200mM酢酸アンモニウム、pH7.6)を用いたpH勾配で20分間にわたり溶出した。質量検出のための質量分析計の前に分析流量を約2μL/分へと減少させるために、分析スプリッター(約200:1の比率)をSCXカラムの後に接続した。スプリッターからの高流量を、同時UV検出(280nm)のために、Waters ACQUITYフォトダイオードアレイ(PDA)検出器に迂回させた。結果として、酸性のショルダーピークが検出され、これはおおよそ176Daの質量増加があった抗体のバリアントに起因する。
分離されると、酸性画分は収集され、乾燥され、かつ変性される。一実施形態において、収集された酸性画分は最初にSpeedVac(商標)内で乾燥され、次いで5mMのジチオスレイトール(DTT)、8Mの尿素、および100mMのTris-HCl(pH7.5)を含有する20μLの溶液中で、50℃にて30分間の加熱によって変性され、かつ還元された。当然のことながら、当業者は、酸性画分を乾燥および変性するために、その他の還元剤、変性剤、および温度を使用することができることを理解するであろう。
乾燥され、かつ変性された酸性画分はアルキル化され、次いで酵素的に(例えば、トリプシンで)消化されてサンプルを形成する。酸性画分は、それらを10mMヨードアセトアミド(IAA)中で室温にて暗所で30分間インキュベートすることによってアルキル化することができる。画分の消化は、これらを175μLの100mMのTris-HCl(pH7.5)で希釈し、そして1:10(w/w)の酵素対基質比で37℃にて4時間、トリプシンを加えることによって達成することができる。
次いで、トリプシン消化酸性画分を50mMのNaBH4で37℃にて1時間インキュベートし、その後10%のギ酸(FA)でクエンチして還元されたサンプルを形成する。次いで、還元されたサンプルを、逆相液体クロマトグラフィー/マススペクトル分析に供して、タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する。一実施形態において、方法は、マススペクトル分析の結果を還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間で比較して、還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程を含む。医薬品は、モノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。一実施形態において、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で検出される。
B.タンパク質医薬品の純度を増加させる方法
開示された方法は、例えばモノクローナル抗体またはその他の治療用タンパク質などのタンパク質医薬品の純度をモニターするために使用することができる。一実施形態は、タンパク質医薬品を分析してタンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、タンパク質医薬品からグルクロニル化したタンパク質を除去して精製したタンパク質医薬品を生成することとによって、タンパク質医薬品の純度を増加させる方法を提供する。グルクロニル化は、上記および実施例に説明した方法を使用して検出することができる。一実施形態において、グルクロニル化タンパク質は、マススペクトル分析と随意に組み合わされる高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される。代表的なクロマトグラフィー技法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。典型的に、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で生じる。
開示された方法は、例えばモノクローナル抗体またはその他の治療用タンパク質などのタンパク質医薬品の純度をモニターするために使用することができる。一実施形態は、タンパク質医薬品を分析してタンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、タンパク質医薬品からグルクロニル化したタンパク質を除去して精製したタンパク質医薬品を生成することとによって、タンパク質医薬品の純度を増加させる方法を提供する。グルクロニル化は、上記および実施例に説明した方法を使用して検出することができる。一実施形態において、グルクロニル化タンパク質は、マススペクトル分析と随意に組み合わされる高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される。代表的なクロマトグラフィー技法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。典型的に、グルクロニル化はタンパク質医薬品のリジン残基で生じる。
別の実施形態は、グルクロニル化のために哺乳類細胞培養から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることによって、翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法を提供し、タンパク質医薬品のグルクロニル化の存在は、タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す。哺乳類細胞培養は典型的に、チャイニーズハムスター卵巣細胞を含有する。
C.タンパク質医薬品
さらに別の実施形態は、治療用タンパク質を含有するタンパク質医薬品を提供し、治療用タンパク質のアミノ酸の1.0%未満、2.0%未満、3.0%未満、4.0%未満、5.0%未満、6.0%未満、7.0%未満、8.0%未満、9.0%未満、または10%未満がグルクロニル化されている。グルクロニル化パーセントは、開示された方法を使用して決定することができる。一実施形態において、アミノ酸はリジンである。典型的に、治療用タンパク質は、モノクローナル抗体、または融合タンパク質である。
さらに別の実施形態は、治療用タンパク質を含有するタンパク質医薬品を提供し、治療用タンパク質のアミノ酸の1.0%未満、2.0%未満、3.0%未満、4.0%未満、5.0%未満、6.0%未満、7.0%未満、8.0%未満、9.0%未満、または10%未満がグルクロニル化されている。グルクロニル化パーセントは、開示された方法を使用して決定することができる。一実施形態において、アミノ酸はリジンである。典型的に、治療用タンパク質は、モノクローナル抗体、または融合タンパク質である。
タンパク質医薬品は、抗体もしくはその抗原結合断片、組換え型タンパク質、または融合タンパク質であり得る。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
実施例1:抗体インタクトレベルでの修飾特定
方法
mAbはオンラインIEX-MS分析に供された。脱グリコシル化されたmAbサンプル(約50μg)のアリコートを、質量測定のために、Thermo Exactive Plus EMR質量分析計、またはThermo Q Exactive plus質量分析計に連結されたYMC-BioPro SP-F強力陽イオン交換(SCX)カラム(100×4.6mm)に注入した。サンプルを分離し、そして酢酸アンモニウムベースの緩衝液(緩衝液A:20mM酢酸アンモニウム、pH5.8、緩衝液B:200mM酢酸アンモニウム、pH7.6)を用いたpH勾配で20分間にわたり溶出した。質量検出のための質量分析計の前に分析流量を約2μL/分へと減少させるために、分析スプリッター(約200:1の比率)をSCXカラムの後に接続した。スプリッターからの高流量を、同時UV検出(280nm)のために、Waters ACQUITYフォトダイオードアレイ(PDA)検出器に迂回させた。
方法
mAbはオンラインIEX-MS分析に供された。脱グリコシル化されたmAbサンプル(約50μg)のアリコートを、質量測定のために、Thermo Exactive Plus EMR質量分析計、またはThermo Q Exactive plus質量分析計に連結されたYMC-BioPro SP-F強力陽イオン交換(SCX)カラム(100×4.6mm)に注入した。サンプルを分離し、そして酢酸アンモニウムベースの緩衝液(緩衝液A:20mM酢酸アンモニウム、pH5.8、緩衝液B:200mM酢酸アンモニウム、pH7.6)を用いたpH勾配で20分間にわたり溶出した。質量検出のための質量分析計の前に分析流量を約2μL/分へと減少させるために、分析スプリッター(約200:1の比率)をSCXカラムの後に接続した。スプリッターからの高流量を、同時UV検出(280nm)のために、Waters ACQUITYフォトダイオードアレイ(PDA)検出器に迂回させた。
結果
結果として、酸性のショルダーピークが検出され、これはおおよそ176Daの質量増加があった抗体のバリアントに起因する。しかしながら、インタクトレベルでの質量測定は正確ではなかった。これは同じ酸性ショルダーピークにおいて溶出され、かつ質量(162Da)が近い糖化修飾からの複雑な要因のためである。
結果として、酸性のショルダーピークが検出され、これはおおよそ176Daの質量増加があった抗体のバリアントに起因する。しかしながら、インタクトレベルでの質量測定は正確ではなかった。これは同じ酸性ショルダーピークにおいて溶出され、かつ質量(162Da)が近い糖化修飾からの複雑な要因のためである。
実施例2:抗体サブドメインレベルでの新規の酸性修飾の検出
方法
主ピークに対する酸性ピークの解像度を増加させ、かつ質量測定の精度を改善するために、脱グリコシル化mAbサンプルを、二つのヒンジ領域ジスルフィド結合のC末端にて重鎖を切断する酵素であるFabRICATORで処理した。
方法
主ピークに対する酸性ピークの解像度を増加させ、かつ質量測定の精度を改善するために、脱グリコシル化mAbサンプルを、二つのヒンジ領域ジスルフィド結合のC末端にて重鎖を切断する酵素であるFabRICATORで処理した。
結果
この処理は、一つのFab2断片および非共有相互作用(Fc*)を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片の生成をもたらした。消化のアリコートは、上記の通りオンラインIEX-MS分析に供された。予想の通り、Fab2とFc*の両方の酸性ピークにおいて、約176Daの質量増加があった同じ酸性バリアントが検出された(図1A~1P)。
この処理は、一つのFab2断片および非共有相互作用(Fc*)を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片の生成をもたらした。消化のアリコートは、上記の通りオンラインIEX-MS分析に供された。予想の通り、Fab2とFc*の両方の酸性ピークにおいて、約176Daの質量増加があった同じ酸性バリアントが検出された(図1A~1P)。
実施例3:新規の酸性修飾の特定および確認
方法
アミノ酸残基に対する修飾部位をさらに特定し、かつこの不明な修飾の正確な質量を得るために、Fc*断片とFab2断片の酸性画分をペプチドマッピング分析のためにSCXカラムから収集した。収集された酸性画分は最初にSpeedVac内で乾燥され、次いで5mMのジチオスレイトール(DTT)、8Mの尿素、および100mMのTris-HCl(pH7.5)を含有する20μLの溶液中で、50℃にて30分間の加熱によって変性され、かつ還元された。次いでサンプルは、10mMのヨードアセトアミド(IAA)で室温にて暗所で30分間インキュベートすることによってアルキル化された。次いで、還元されたサンプルおよびアルキル化されたサンプルは175μLの100mMのTris-HCl(pH7.5)で希釈され、トリプシンで酵素対基質比1:10(w/w)にて37℃で4時間にわたり消化された。消化は10%のFAを4μL加えることによって停止した。次いで、消化された各タンパク質サンプルのアリコートをRP-UPLCによって分離し、続いてオンラインMS分析を行った。MSおよびMS/MS実験は、MS/MS実験中にペプチド断片化のために、より高エネルギーの衝突解離(HCD)を用いて、Thermo Q Exactive Plus MSシステムで実施された。次いで、MSの未加工データファイルを、170~180Daの質量のmAb配列および可変ワイルドカード修飾を含有するデータベースに対して検索した。
方法
アミノ酸残基に対する修飾部位をさらに特定し、かつこの不明な修飾の正確な質量を得るために、Fc*断片とFab2断片の酸性画分をペプチドマッピング分析のためにSCXカラムから収集した。収集された酸性画分は最初にSpeedVac内で乾燥され、次いで5mMのジチオスレイトール(DTT)、8Mの尿素、および100mMのTris-HCl(pH7.5)を含有する20μLの溶液中で、50℃にて30分間の加熱によって変性され、かつ還元された。次いでサンプルは、10mMのヨードアセトアミド(IAA)で室温にて暗所で30分間インキュベートすることによってアルキル化された。次いで、還元されたサンプルおよびアルキル化されたサンプルは175μLの100mMのTris-HCl(pH7.5)で希釈され、トリプシンで酵素対基質比1:10(w/w)にて37℃で4時間にわたり消化された。消化は10%のFAを4μL加えることによって停止した。次いで、消化された各タンパク質サンプルのアリコートをRP-UPLCによって分離し、続いてオンラインMS分析を行った。MSおよびMS/MS実験は、MS/MS実験中にペプチド断片化のために、より高エネルギーの衝突解離(HCD)を用いて、Thermo Q Exactive Plus MSシステムで実施された。次いで、MSの未加工データファイルを、170~180Daの質量のmAb配列および可変ワイルドカード修飾を含有するデータベースに対して検索した。
結果
結果は、この不明な修飾が+176.03Daのモノアイソトピック質量を示し、またmAb配列の複数のLys残基では低レベルにて生じたことを示した(図2)。正確なデルタ質量に基づいて、この修飾はグルクロン酸化と同じ元素組成物(C6H8O6)を有すると仮定されたが、しかしながらこれは、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼによって触媒されたO結合を通してSerおよびThrで生じると報告された。
結果は、この不明な修飾が+176.03Daのモノアイソトピック質量を示し、またmAb配列の複数のLys残基では低レベルにて生じたことを示した(図2)。正確なデルタ質量に基づいて、この修飾はグルクロン酸化と同じ元素組成物(C6H8O6)を有すると仮定されたが、しかしながらこれは、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼによって触媒されたO結合を通してSerおよびThrで生じると報告された。
トリプシン消化酸性画分を50mMのNaBH4で37℃にて1時間インキュベートし、その後10%のギ酸(FA)でクエンチした。NaBH4で処理されたサンプルは、次いでRP LC/MS分析に供された。結果は、NaBH4によってこの修飾(+176 Da)を減少させる(+178 Da)ことができることを示し、修飾内のSchiff塩基構造の存在を示唆する(図3A~図3B)。
mAbサンプルを100mMのグルクロン酸で37℃にて24時間インキュベートすることによって強制グルクロニル化を実施した。その後のトリプシン消化およびペプチドマッピング分析では、強制修飾サンプルにおいて非常により高い存在量で提示された一連のグルクロニル化されたペプチドが、未処理のサンプルと同じ正確な質量、MS2断片化パターン、および保持時間を示したことが分かった(図4A~図4E、図5A~図5D、図6A~図6D、および図7A~図7D)。
Claims (24)
- タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定する方法であって、
前記タンパク質医薬品を脱グリコシル化することと、
前記脱グリコシル化したタンパク質医薬品を処理して、非共有相互作用を介して一緒に結合された二つの同一のFc/2断片を含む一つのFc*断片、および一つのFab2を含む一つのFab2断片を生成することと、
イオン交換クロマトグラフィーを使用して、前記Fc*複合体およびFab2複合体を、Fc*およびFab2の酸性画分へと分離することと、
前記酸性画分を乾燥および変性させることと、
前記酸性画分をアルキル化することと、
前記酸性画分をトリプシンで消化してサンプルを形成することと、
前記サンプルをNaBH4でインキュベートして、還元されたサンプルを形成することと、
前記還元されたサンプルを、逆相液体クロマトグラフィー/マススペクトル分析に供して前記タンパク質医薬品のグルクロニル化を特定することと
を含む、前記方法。 - 還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間でマススペクトル分析を比較して、前記還元されたサンプルと還元されていないサンプルとの間の質量差を特定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬品がモノクローナル抗体を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記Fc*断片およびFab2断片が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptocoocus pyogenes)由来の組換えによって修飾された形態のIdeSを使用して形成される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィーが強力な陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酸性画分が、ヨードアセトアミドでアルキル化される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のアミノ酸の10%未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
- 前記治療用タンパク質のアミノ酸の5%未満がグルクロニル化されている、請求項7に記載のタンパク質医薬品。
- 前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、請求項7または8に記載のタンパク質医薬品。
- 前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、請求項7~9のいずれか一項に記載のタンパク質医薬品。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項10に記載のタンパク質医薬品。
- 治療用タンパク質を含むタンパク質医薬品であって、前記治療用タンパク質のリジンアミノ酸の3%未満がグルクロニル化されている、前記タンパク質医薬品。
- タンパク質医薬品の純度を増加させる方法であって、
前記タンパク質医薬品を分析して、前記タンパク質医薬品の一つ以上のアミノ酸の一級アミンのグルクロニル化を特定することと、
グルクロニル化タンパク質を前記タンパク質医薬品から除去して、精製されたタンパク質医薬品を生成することと
を含む、前記方法。 - 前記グルクロニル化タンパク質が高速液体クロマトグラフィー技法によって除去される、請求項13に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー技法が、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー技法がマススペクトル分析と組み合わされる、請求項15に記載の方法。
- 前記アミノ酸がリジンアミノ酸である、請求項13~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療用タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、請求項13~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項18に記載の方法。
- 翻訳後に修飾されたタンパク質医薬品を特定する方法であって、
グルクロニル化のために哺乳類細胞培養物から得られたタンパク質医薬品をアッセイすることを含み、前記タンパク質医薬品の前記グルクロニル化の存在が、前記タンパク質医薬品が翻訳後修飾を含むことを示す、前記方法。 - 前記哺乳類細胞培養物がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記グルクロニル化が前記タンパク質医薬品のリジンアミノ酸上にある、請求項20または21に記載の方法。
- 前記タンパク質医薬品が、抗体または融合タンパク質である、請求項20~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項23のいずれか一項に記載の方法。
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