JP2023125973A - Method and device for preparing measurement samples - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血液検体から試料を調製する測定試料の調製方法および試料調製装置に関する。 The present invention relates to a measurement sample preparation method and sample preparation apparatus for preparing a sample from a blood specimen.
血液に含まれる白血球を分析するために、フローサイトメータを用いた分析が広く用いられている。例えば、血液に含まれる測定対象の細胞の細胞表面抗原や細胞内抗原が標識抗体によって免疫染色され、フローサイトメータによる光学的な測定によって免疫染色された細胞が検出される。このようなフローサイトメータ分析用の試料を血液検体から調製する場合、血液中の赤血球を除去する必要がある。特許文献１には、血液から密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を回収し、回収されたＰＢＭＣの細胞表面抗原と細胞内抗原とを染色し、染色された試料をフローサイトメータによって測定して調節性Ｔ細胞を同定することが開示されている。特許文献２には、フローサイトメータによる分析のための試料を調製する方法が開示されている。特許文献２には、血液細胞を染色する工程、赤血球を溶解剤により溶解する工程および染色された血液細胞を固定化する工程が開示されている。
Analysis using a flow cytometer is widely used to analyze leukocytes contained in blood. For example, cell surface antigens and intracellular antigens of cells to be measured contained in blood are immunostained with a labeled antibody, and the immunostained cells are detected by optical measurement using a flow cytometer. When preparing a sample for such flow cytometer analysis from a blood sample, it is necessary to remove red blood cells from the blood.
特許文献１に開示されるように遠心分離によってＰＢＭＣを回収する方法は、赤血球を除去する方法として一般的に用いられているが、遠心分離後に遠心管の中間にできるＰＢＭＣの層だけを取り出す操作は、ピペットの先端をＰＢＭＣの層まで挿入し、ＰＢＭＣ以外の層を吸わないようにＰＢＭＣだけをピペットで吸引する手技が必要であり、自動化が難しい。また、特許文献２の溶解剤を用いる方法は、自動化が容易である一方、溶解剤が直接的または間接的にタンパク発現量に影響し、細胞から得られるシグナルが変化するおそれがある。そのため、たとえば、特許文献１に開示される調節性Ｔ細胞のような希少細胞においては検出性能が低下するおそれがある。このため、自動化が容易であるとともに、シグナルへの影響（測定結果の変動）の少ない、血液検体から試料を調製する測定試料の調製方法および試料調製装置が望まれている。
The method of collecting PBMCs by centrifugation as disclosed in
この発明は、自動化が容易であるとともに、測定対象細胞のシグナルへの影響の少ない、血液検体から試料を調製する測定試料の調製方法および試料調製装置を実現することに向けたものである。 The present invention is directed to realizing a measurement sample preparation method and sample preparation apparatus for preparing a sample from a blood specimen, which is easy to automate and has little influence on signals of cells to be measured.
上記目的を達成するため、第１の発明による測定試料の調製方法は、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去することと、赤血球が除去された血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させることと、を備える。 In order to achieve the above object, a method for preparing a measurement sample according to the first invention involves removing red blood cells from a blood sample using a solid phase capable of binding to red blood cells, and immunizing the blood sample and cells from which red blood cells have been removed. and reacting with a reagent to be dyed.
第１の発明による測定試料の調製方法は、上記のように、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する。これにより、赤血球に結合した固相とともに赤血球を除去することができるので、赤血球を除去する処理の自動化が容易である。また、溶解剤により赤血球を溶解して除去する場合と異なり、測定対象細胞のシグナルへの影響（測定結果の変動）を低減することができる。 As described above, in the method for preparing a measurement sample according to the first invention, red blood cells are removed from a blood sample using a solid phase capable of binding to red blood cells. This allows the red blood cells to be removed together with the solid phase bound to the red blood cells, making it easy to automate the process of removing red blood cells. Furthermore, unlike the case where red blood cells are lysed and removed using a lysing agent, the influence on the signal of the cells to be measured (variation in measurement results) can be reduced.
第２の発明による試料調製装置は、図２に示すように、血液検体と試薬とを反応させて測定試料を調製する試料調製装置（１００）であって、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する第１処理部（２０）と、赤血球が除去された血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させる第２処理部（３０）と、を備える。 As shown in FIG. 2, the sample preparation device according to the second invention is a sample preparation device (100) that prepares a measurement sample by reacting a blood sample and a reagent, and uses a solid phase that can bind to red blood cells. The present invention includes a first processing section (20) that removes red blood cells from a blood sample using a method of removing red blood cells, and a second processing section (30) that causes a reaction between the blood sample from which red blood cells have been removed and a reagent that immunostains cells.
第２の発明による試料調製装置は、上記のように、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する第１処理部（２０）を備える。これにより、赤血球に結合した固相とともに赤血球を除去することができるので、赤血球を除去する処理の自動化が容易である。また、溶解剤により赤血球を溶解して除去する場合と異なり、測定対象細胞のシグナルへの影響（測定結果の変動）を低減することができる。 As described above, the sample preparation device according to the second invention includes the first processing section (20) that removes red blood cells from a blood sample using a solid phase capable of binding to red blood cells. This allows the red blood cells to be removed together with the solid phase bound to the red blood cells, making it easy to automate the process of removing red blood cells. Furthermore, unlike the case where red blood cells are lysed and removed using a lysing agent, the influence on the signal of the cells to be measured (variation in measurement results) can be reduced.
本発明によれば、自動化が容易であるとともに、測定対象細胞のシグナルへの影響の少ない、測定試料の調製方法および試料調製装置を実現することができる。 According to the present invention, it is possible to realize a measurement sample preparation method and sample preparation device that are easy to automate and have little influence on signals from cells to be measured.
本実施形態の測定試料の調製方法（以下、「本実施形態の調製方法」ともいう）は、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去することと、赤血球が除去された前記血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させることと、を含む。本実施形態の調製方法によれば、赤血球が除去され、かつ特定の細胞が免疫染色された測定試料が調製される。 The measurement sample preparation method of this embodiment (hereinafter also referred to as "preparation method of this embodiment") involves removing red blood cells from a blood sample using a solid phase that can bind to red blood cells, and The method includes reacting the blood sample with a reagent for immunostaining cells. According to the preparation method of this embodiment, a measurement sample is prepared in which red blood cells are removed and specific cells are immunostained.
本実施形態の方法によって調製される測定試料は、血液検体に含まれる細胞が免疫染色された測定試料であり、特にフローサイトメータによる測定に適した測定試料である。血液検体は、例えば、生体由来の検体であり、たとえば、被検体から採取された全血である。被検体は、主としてヒトであるが、ヒト以外の他の動物であってもよい。 The measurement sample prepared by the method of this embodiment is a measurement sample in which cells contained in a blood sample are immunostained, and is particularly suitable for measurement with a flow cytometer. The blood specimen is, for example, a specimen derived from a living body, and is, for example, whole blood collected from a subject. The subject is primarily a human, but may also be a non-human animal.
血液検体は、少なくとも測定対象の細胞と赤血球とを含む。測定対象の細胞とは、例えば白血球であり、より具体的には、リンパ球である。さらに具体的にはＴ細胞である。さらに具体的には、測定対象の細胞は、Ｔ細胞のうちの制御性Ｔ細胞（以下、Ｔｒｅｇ細胞ともいう）およびエフェクターＴ細胞 (以下、Ｔｅｆｆ細胞ともいう)である。これらＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞は、後述するようにＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞に特異的に発現する細胞表面抗原および細胞内抗原を免疫染色し、フローサイトメトリー法によって得られる蛍光シグナルを取得することにより、互いに区別されて計数される。 The blood sample includes at least cells to be measured and red blood cells. The cells to be measured are, for example, white blood cells, and more specifically, lymphocytes. More specifically, it is a T cell. More specifically, the cells to be measured are regulatory T cells (hereinafter also referred to as Treg cells) and effector T cells (hereinafter also referred to as Teff cells) among T cells. These Treg cells and Teff cells can be detected by immunostaining cell surface antigens and intracellular antigens that are specifically expressed in Treg cells and Teff cells, as described below, and by obtaining fluorescent signals obtained by flow cytometry. They are counted separately from each other.
Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞以外の細胞から発せられるシグナルは、正確な分類計数を阻害するノイズとなる。特に、血液検体に大量に含まれる赤血球のノイズは大きいため、フローサイトメトリー法による測定前に赤血球を除去する必要がある。 Signals emitted from cells other than Treg cells and Teff cells become noise that inhibits accurate classification counting. In particular, red blood cells contained in a large amount in a blood sample produce a large amount of noise, so it is necessary to remove red blood cells before measurement by flow cytometry.
従来、血液検体に含まれる赤血球を除去するために、溶解剤が広く用いられている。溶解剤としては、例えば、塩化アンモニウムや界面活性剤が一般的である。これらの溶解剤は安価であり、血液検体と混合するだけで赤血球を除去できる点で調製が容易であることから、ＣＤ４やＣＤ２５のような一般的な抗原マーカーを測定するための測定試料の調製においても広く用いられている。しかしながら、発明者らが検討したところ、特定の細胞表面抗原および細胞内抗原の測定にあたって、従来の溶解剤を用いた赤血球除去の方法では、測定対象とする細胞、特に後述の実施例で述べるＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞の測定にあたって、蛍光シグナルに影響があることがわかった。また、発明者らがさらに研究を進めたところ、溶解剤による赤血球除去に代えて、赤血球に結合可能な固相を用いて赤血球を除去することにより、蛍光シグナルへの影響を低減できることがわかった。以下、本実施形態による測定試料の調製方法について、詳述する。 Conventionally, lysing agents have been widely used to remove red blood cells contained in blood samples. As the solubilizing agent, for example, ammonium chloride and a surfactant are generally used. These lysing agents are inexpensive and easy to prepare in that they can remove red blood cells by simply mixing them with a blood sample, so they are useful for preparing measurement samples for measuring common antigen markers such as CD4 and CD25. It is also widely used. However, the inventors have investigated that when measuring specific cell surface antigens and intracellular antigens, the conventional method of removing red blood cells using a lytic agent does not allow the measurement of cells to be measured, especially Treg cells as described in the Examples below. It was found that fluorescence signals were affected when measuring cells and Teff cells. Furthermore, the inventors conducted further research and found that instead of removing red blood cells using a lysing agent, the effect on the fluorescence signal could be reduced by removing red blood cells using a solid phase that can bind to red blood cells. . The method for preparing a measurement sample according to this embodiment will be described in detail below.
＜赤血球除去＞
赤血球に結合可能な固相は、例えば、血液検体と接触することで、血液検体中に浮遊する赤血球を捕捉、吸着することが可能な固相である。赤血球に結合可能な固相は、赤血球に特異的に結合し、測定対象とする細胞、例えば白血球、には結合しない。赤血球に特異的に結合するために、固相の表面には赤血球と結合可能な抗体が固定化されていることが好ましい。赤血球に結合可能な抗体は、例えば、赤血球の表面抗原に抗原抗体反応によって結合可能な抗体（以下、赤血球捕捉抗体ともいう）であることが好ましく、例えば、ＣＤ２３５ａ抗体、ＣＤ５５抗体などが挙げられる。赤血球に特異的に結合可能な抗体としてはＣＤ２３５ａ抗体が特に好ましい。また、マウス由来の血液に含まれる赤血球を除去する場合であれば、ＴＥＲ―１１９抗体を用いてもよい。
<Red blood cell removal>
The solid phase that can bind to red blood cells is, for example, a solid phase that can capture and adsorb red blood cells floating in a blood sample by coming into contact with the blood sample. The solid phase capable of binding to red blood cells specifically binds to red blood cells and does not bind to cells to be measured, such as white blood cells. In order to specifically bind to red blood cells, it is preferable that an antibody capable of binding to red blood cells is immobilized on the surface of the solid phase. The antibody capable of binding to red blood cells is preferably an antibody capable of binding to a surface antigen of red blood cells by an antigen-antibody reaction (hereinafter also referred to as a red blood cell capturing antibody), and examples thereof include CD235a antibody and CD55 antibody. As the antibody capable of specifically binding to red blood cells, CD235a antibody is particularly preferred. Furthermore, if red blood cells contained in mouse-derived blood are to be removed, TER-119 antibody may be used.
赤血球捕捉抗体を固相の表面に固定化する方法としては、例えば、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンの相互作用を用いることが好ましい。例えば、ビオチン化した赤血球捕捉抗体と、ストレプトアビジンが結合した固相とを反応させることで、固相の表面に赤血球捕捉抗体を固定化することができる。赤血球捕捉抗体は予め固相に固定化された状態で血液検体と混合されてもよいし、赤血球捕捉抗体と固相がそれぞれ別に血液検体と混合され、血液検体中で赤血球捕捉抗体が固相に固定化されてもよい。 As a method for immobilizing the red blood cell capturing antibody on the surface of a solid phase, it is preferable to use, for example, interaction between avidin or streptavidin and biotin. For example, by reacting a biotinylated red blood cell capturing antibody with a streptavidin-bound solid phase, the red blood cell capturing antibody can be immobilized on the surface of the solid phase. The red blood cell capturing antibody may be immobilized on a solid phase in advance and mixed with the blood sample, or the red blood cell capturing antibody and the solid phase may be mixed with the blood sample separately, and the red blood cell capturing antibody is immobilized on the solid phase in the blood sample. It may be immobilized.
固相は、粒子であることが好ましい。固相として粒子を用いることで、粒子を血液検体に添加することで、粒子の表面に赤血球を吸着することができる。粒子は血液検体中に分散するため、効率的に赤血球を吸着することができる点で有利である。以下、固相としての粒子を固相粒子という。 Preferably, the solid phase is a particle. By using particles as a solid phase, red blood cells can be adsorbed onto the surface of the particles by adding the particles to a blood sample. Since the particles are dispersed in the blood sample, they are advantageous in that they can efficiently adsorb red blood cells. Hereinafter, particles serving as a solid phase will be referred to as solid phase particles.
固相粒子を用いる場合の赤血球除去の例について、図１を参照して説明する。固相粒子を用いる場合の赤血球除去方法の例としては、（Ａ）ＢＦ（Ｂｏｕｎｄ Ｆｒｅｅ）分離法、（Ｂ）濾過法および（Ｃ）凝集法が挙げられる。 An example of red blood cell removal using solid phase particles will be described with reference to FIG. 1. Examples of red blood cell removal methods using solid phase particles include (A) BF (Bound Free) separation method, (B) filtration method, and (C) agglutination method.
ＢＦ分離法について説明する。ＢＦ分離法では、固相粒子として磁性粒子が用いられる。図１に示すように、第１の工程において、赤血球捕捉抗体が表面に固定化された磁性粒子が血液検体に添加される。血液検体と磁性粒子の混合物は、好ましくは撹拌され、血液検体中に磁性粒子が分散する。第２の工程において、血液検体中の赤血球が磁性粒子の表面に吸着される。第３の工程において、磁性粒子が磁石によって集磁される。例えば、図１に示すよう、血液検体と磁性粒子の混合物を収容した容器の近傍（図１の例では側面）に磁石Ｍを配置し、容器内に分散していた磁性粒子を容器の内側面に局在化する。これにより容器内で赤血球を分離する。第４の工程において、磁性粒子を集磁した状態の容器内の液体のうち赤血球を含まない部分、例えば上清を分取する。これにより、血液検体から赤血球が分離される。 The BF separation method will be explained. In the BF separation method, magnetic particles are used as solid phase particles. As shown in FIG. 1, in the first step, magnetic particles having red blood cell capturing antibodies immobilized on their surfaces are added to the blood sample. The mixture of blood sample and magnetic particles is preferably agitated to disperse the magnetic particles within the blood sample. In the second step, red blood cells in the blood sample are adsorbed to the surface of the magnetic particles. In the third step, the magnetic particles are collected by a magnet. For example, as shown in Figure 1, a magnet M is placed near a container containing a mixture of a blood sample and magnetic particles (in the example of Figure 1, on the side), and the magnetic particles dispersed in the container are removed from the inner surface of the container. to be localized. This separates red blood cells within the container. In the fourth step, a portion of the liquid in the container containing the magnetic particles that does not contain red blood cells, such as a supernatant, is separated. This separates red blood cells from the blood sample.
磁性粒子を集磁するために磁石Ｍを容器の側面に配置する時間は、好ましくは１分以上であり、より好ましくは５分以上である。磁石Ｍを配置する位置は、容器の近傍であって、容器内の磁性粒子を局在化させるのに十分な磁力を与えつつ、局在化された磁性粒子を含む複合体を避けてピペッティングにより上清を吸引できる位置であればよく、例えば容器側面又は底面である。磁石Ｍを容器近傍に配置する第３工程は、磁石Ｍと容器を相対的に移動することによって実現できる。例えば、磁性粒子を含む容器を磁石Ｍに近づけてもよいし、容器に対して磁石Ｍを近づけてもよい。 The time during which the magnet M is placed on the side surface of the container to collect the magnetic particles is preferably 1 minute or more, more preferably 5 minutes or more. The position where the magnet M is placed is in the vicinity of the container, and while providing sufficient magnetic force to localize the magnetic particles within the container, pipetting is performed while avoiding complexes containing localized magnetic particles. Any position may be used as long as the supernatant can be aspirated, for example, the side or bottom of the container. The third step of arranging the magnet M near the container can be realized by relatively moving the magnet M and the container. For example, the container containing the magnetic particles may be brought close to the magnet M, or the magnet M may be brought close to the container.
ＢＦ分離法では、磁性粒子を容器の側面に集磁することで液相内で赤血球を分離することができるため、操作が容易である利点がある。 The BF separation method has the advantage of being easy to operate, since red blood cells can be separated in the liquid phase by concentrating magnetic particles on the side of the container.
次に濾過法について説明する。濾過法では、ＢＦ分離法の第１および第２工程と同様に、固相粒子が血液検体に添加され、赤血球が固相粒子の表面に吸着される。第３工程において、赤血球を吸着した固相粒子を含む血液検体が、フィルタＦを備えるカラムに分注される。フィルタＦは、対象細胞、例えば白血球が通過することを許容するが、固相粒子は通過できない大きさのポアサイズを有する多孔質部材からなる。血液検体がフィルタの上面に分注されると、血液検体がフィルタＦによって濾過され、対象細胞がフィルタＦを通過し、赤血球を吸着した固相粒子がフィルタＦにトラップされる。これにより、対象細胞を含む血液検体から赤血球が分離される。 Next, the filtration method will be explained. In the filtration method, solid phase particles are added to a blood sample, and red blood cells are adsorbed on the surface of the solid phase particles, similar to the first and second steps of the BF separation method. In the third step, a blood sample containing solid particles adsorbed with red blood cells is dispensed into a column equipped with a filter F. Filter F is made of a porous member having a pore size large enough to allow passage of target cells, such as white blood cells, but not solid particles. When the blood sample is dispensed onto the upper surface of the filter, the blood sample is filtered by the filter F, the target cells pass through the filter F, and the solid phase particles adsorbing red blood cells are trapped by the filter F. As a result, red blood cells are separated from the blood sample containing the target cells.
なお、濾過法では、フィルタＦを用いた例を図示ししているが、フィルタに代えてビーズカラムを用いてもよい。ビーズカラムを用いる場合、赤血球捕捉抗体を表面に固定化した固相粒子をカラムに充填し、カラムに血液検体が注入される。固相粒子の間の間隙を血液検体が通過するときに、血液検体に含まれる赤血球が固相粒子表面に吸着される。 In the filtration method, an example using filter F is illustrated, but a bead column may be used instead of the filter. When using a bead column, the column is filled with solid-phase particles on the surface of which a red blood cell-capturing antibody is immobilized, and a blood sample is injected into the column. When the blood sample passes through the gaps between the solid particles, red blood cells contained in the blood sample are adsorbed onto the surfaces of the solid particles.
次に凝集法について説明する。凝集法では、ＢＦ分離法の第１および第２工程と同様に、固相粒子が血液検体に添加される。赤血球が固相粒子の表面に吸着されることで、赤血球と固相粒子とが凝集塊を形成する。第３工程において、赤血球を吸着した固相粒子を含む血液検体が所定時間静置される。赤血球と固相粒子とにより形成される凝集塊は、自重によって容器の底部に沈降する。この状態で、対象細胞を含む上清を分取することで、血液検体から赤血球が分離される。 Next, the aggregation method will be explained. In the agglutination method, solid phase particles are added to the blood sample, similar to the first and second steps of the BF separation method. When the red blood cells are adsorbed onto the surface of the solid phase particles, the red blood cells and the solid phase particles form an aggregate. In the third step, the blood sample containing solid particles adsorbed with red blood cells is allowed to stand for a predetermined period of time. Agglomerates formed by red blood cells and solid phase particles settle to the bottom of the container due to their own weight. In this state, red blood cells are separated from the blood sample by fractionating the supernatant containing the target cells.
凝集法では、赤血球と凝集塊を形成しやすい固相粒子を選択することが好ましく、例えばラテックス粒子を用いることが好ましい。 In the agglutination method, it is preferable to select solid phase particles that easily form aggregates with red blood cells; for example, it is preferable to use latex particles.
＜免疫染色＞
上記のようにして赤血球が除去された血液検体に含まれる細胞が免疫染色される。免疫染色では、例えば、対象細胞の目的となる抗原に結合可能な標識抗体を含む抗体試薬と、血液検体とが混合されることにより、目的となる抗原が標識される。
<Immunostaining>
Cells contained in the blood sample from which red blood cells have been removed as described above are immunostained. In immunostaining, for example, a blood sample is mixed with an antibody reagent containing a labeled antibody capable of binding to the antigen of interest in target cells, thereby labeling the antigen of interest.
標識抗体は、例えば、特定の中心波長を有する励起光が照射されたことに応じて、特定の波長の蛍光シグナルを生じる標識分子によって修飾された抗体である。 A labeled antibody is, for example, an antibody modified with a label molecule that generates a fluorescent signal at a specific wavelength in response to irradiation with excitation light having a specific center wavelength.
免疫染色によって標識される抗原の数は特に限定されず、１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。複数種類の抗原を同時に染色する場合は、互いに異なる蛍光シグナルを発するように標識された複数の標識抗体を含むカクテル試薬と血液検体とを混合することで、複数の目的とする抗原を染色することができる。 The number of antigens labeled by immunostaining is not particularly limited, and may be one type or multiple types. When staining multiple types of antigens at the same time, multiple target antigens can be stained by mixing a blood sample with a cocktail reagent containing multiple labeled antibodies that are labeled to emit different fluorescent signals. I can do it.
抗原の種類は、細胞表面に発現する抗原であってもよいし、細胞内に発現する抗原であってもよいし、それらの組み合わせであってもよい。組み合わせる抗原の種類は、目的とする抗原に応じて変更することができる。例えば、後述する実施例では、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞を目的の細胞としている。Ｔｅｆｆ細胞は、ＣＤ４抗原陽性のＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）のうち、ＣＤ６２Ｌ抗原が低発現の細胞として同定できる。また、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、ＣＤ２５抗原陽性かつＦＯＸＰ３抗原陽性の細胞として同定できる。この例では、細胞表面抗原としてＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５を免疫染色し、かつ、細胞内抗原としてＦＯＸＰ３を免疫染色することができる。 The type of antigen may be an antigen expressed on the cell surface, an antigen expressed within the cell, or a combination thereof. The types of antigens to be combined can be changed depending on the target antigen. For example, in the Examples described below, Treg cells and Teff cells are used as target cells. Teff cells can be identified as cells that express low levels of CD62L antigen among CD4 antigen-positive T cells (CD4+ T cells). Furthermore, Treg cells can be identified as CD25 antigen-positive and FOXP3 antigen-positive cells among CD4+ T cells. In this example, CD4, CD62L, and CD25 can be immunostained as cell surface antigens, and FOXP3 can be immunostained as an intracellular antigen.
発明者らが検討した結果、上記で例示した抗原のうち、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３は、血液検体に含まれる赤血球を除去するために溶解剤によって処理した場合に、蛍光シグナルが低下することを見出した。これは、溶解剤が細胞に影響を与えることにより、細胞表面および細胞内の抗原が刺激を受け、又はダメージを受けることによるものと考えられる。これに対して、溶解剤に代えて、赤血球に結合可能な固相を用いて赤血球を除去する方法を採用したところ、上述の抗原のシグナルに及ぼす影響を低減できることが確認できた。 As a result of investigation, the inventors found that among the antigens listed above, the fluorescent signals of CD62L, CD25, and FOXP3 decreased when they were treated with a lytic agent to remove red blood cells contained in a blood sample. Ta. This is thought to be because the cell surface and intracellular antigens are stimulated or damaged by the effect of the lytic agent on the cells. In contrast, by adopting a method of removing red blood cells using a solid phase capable of binding to red blood cells instead of a lytic agent, it was confirmed that the above-mentioned effect of the antigen on the signal could be reduced.
免疫染色によって細胞表面抗原（例えばＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５）と、細胞内抗原（例えばＦＯＸＰ３）とを染色する場合、細胞表面抗原に特異的に結合する標識抗体を含む第１抗体試薬と、細胞内抗原に特異的に結合する標識抗体を含む第２抗体試薬とを、血液検体と混合する工程を含むことが好ましい。さらに、血液検体と混合する順序は、第１抗体試薬、第２抗体試薬の順であることが好ましい。血液検体は、第１抗体試薬によって細胞表面抗原が染色されたのち、第２抗体試薬の添加前に、固定化剤および膜透過剤と混合されることが好ましい。標識抗体のような大きな分子は細胞膜を通過して細胞内部に入ることができないため、膜透過剤は、標識抗体が細胞膜を通って細胞内に進入することを許容する。固定化剤は、膜透過剤によって処理された細胞膜を通じて、細胞内抗原、つまりタンパク質が拡散しないように固定化する。 When staining cell surface antigens (e.g. CD4, CD62L, CD25) and intracellular antigens (e.g. FOXP3) by immunostaining, a first antibody reagent containing a labeled antibody that specifically binds to the cell surface antigen and an intracellular It is preferable to include a step of mixing the blood sample with a second antibody reagent containing a labeled antibody that specifically binds to the antigen. Furthermore, it is preferable that the first antibody reagent and the second antibody reagent are mixed with the blood sample in that order. After the cell surface antigen of the blood sample is stained with the first antibody reagent, it is preferable that the blood sample is mixed with a fixative and a membrane permeabilizer before addition of the second antibody reagent. Since large molecules such as labeled antibodies cannot cross the cell membrane and enter the cell interior, membrane permeabilizing agents allow the labeled antibody to cross the cell membrane and enter the cell. The immobilizing agent immobilizes the intracellular antigen, ie, protein, so that it does not diffuse through the cell membrane treated with the membrane permeabilizing agent.
＜フローサイトメータによる測定＞
免疫染色された測定試料は、フローサイトメータによる測定に供される。フローサイトメータは、フローサイトメトリー法により、免疫染色された細胞から光学的なシグナル、例えば蛍光シグナルを取得し、蛍光シグナルに基づいて細胞を分析する。
<Measurement using a flow cytometer>
The immunostained measurement sample is subjected to measurement using a flow cytometer. A flow cytometer uses flow cytometry to obtain optical signals, such as fluorescent signals, from immunostained cells, and analyzes the cells based on the fluorescent signals.
上記の方法によって赤血球が除去され、かつ細胞が免疫染色された測定試料をフローサイトメータによって測定した場合のＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞の分類計数の方法について、以下に説明する。 A method for classifying and counting Treg cells and Teff cells when a measurement sample from which red blood cells have been removed and cells have been immunostained by the above method is measured using a flow cytometer will be described below.
まず、血液検体に含まれる白血球からリンパ球が分類される。リンパ球は、例えば前方散乱光強度および側方散乱光強度に基づくパラメータに基づいて分類される。 First, lymphocytes are classified from white blood cells contained in a blood sample. Lymphocytes are classified based on parameters based on forward scattered light intensity and side scattered light intensity, for example.
次に、リンパ球のうち、所定値以上のＣＤ４＋シグナルをもつ細胞が分類される。具体的には、ＣＤ４抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナルが所定値以上である細胞を特定される。分類性能を高めるために、ＣＤ４に対応する蛍光シグナルに加えて、例えば散乱光強度、より好ましくは側方散乱光強度をパラメータとして組み合わせてもよい。 Next, among the lymphocytes, cells having a CD4+ signal of a predetermined value or higher are classified. Specifically, cells in which the fluorescence signal emitted from the labeled antibody that binds to the CD4 antigen is greater than or equal to a predetermined value are identified. In order to improve the classification performance, in addition to the fluorescent signal corresponding to CD4, for example, scattered light intensity, more preferably side scattered light intensity, may be combined as a parameter.
ＣＤ４＋細胞のうち、ＣＤ６２Ｌが低発現である細胞（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）が分類される。具体的には、ＣＤ６２Ｌ抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナルが所定値以下である細胞が特定される。ＣＤ６２Ｌ抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナルの強度を横軸、強度に対応する細胞のカウント数を縦軸とするヒストグラムを作成すると、蛍光シグナルの高値側にＣＤ６２Ｌ高発現の細胞のピークが現れ、低値側にＣＤ６２Ｌ低発現の細胞のピークが現れる、いわゆる二峰性のヒストグラムが描かれる。これら２つのピークの間の谷にあたる部分より蛍光シグナルの低値側にプロットされる細胞がＣＤ６２Ｌｌｏｗとして特定される。 Among CD4+ cells, cells with low expression of CD62L (CD62L low ) are classified. Specifically, cells in which the fluorescence signal emitted from the labeled antibody that binds to the CD62L antigen is below a predetermined value are identified. When creating a histogram with the horizontal axis representing the intensity of the fluorescent signal emitted from the labeled antibody that binds to the CD62L antigen and the vertical axis representing the number of cell counts corresponding to the intensity, a peak of cells with high CD62L expression appears on the high value side of the fluorescent signal. A so-called bimodal histogram is drawn in which a peak of cells with low CD62L expression appears on the low value side. Cells plotted on the lower value side of the fluorescence signal than the valley between these two peaks are identified as CD62L low .
ＣＤ４＋細胞のうち、ＦＯＸＰ３＋かつＣＤ２５＋の細胞が分類される。具体的には、ＦＯＸＰ３抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナル（ＦＯＸＰ３シグナル）が所定値以上であり、かつ、ＣＤ２５抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナル（ＣＤ２５シグナル）が所定値以上である細胞が特定される。ＦＯＸＰ３シグナルの強度を第１軸とし、ＣＤ２５シグナルの強度を第２軸とする二次元分布図を作成した場合、２つのシグナルのそれぞれについて所定値以上の領域と所定値未満の領域とが分けられた４つの象限が得られる。このうち、ＦＯＸＰ３シグナルが所定値以上であり、かつＣＤ２５シグナルが所定値以上である象限にプロットされる細胞がＦＯＸＰ３＋かつＣＤ２５＋の細胞として特定される。これにより血液中のＴｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞の数および割合が求められる。血液中のＴｒｅｇ細胞の割合及びＴｅｆｆ細胞の割合は、免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブ）の薬効予測に有効であることがわかっている。 Among CD4+ cells, FOXP3+ and CD25+ cells are classified. Specifically, the fluorescent signal emitted from the labeled antibody that binds to the FOXP3 antigen (FOXP3 signal) is greater than or equal to a predetermined value, and the fluorescent signal emitted from the labeled antibody that binds to the CD25 antigen (CD25 signal) is greater than or equal to the predetermined value. Cells that are are identified. When creating a two-dimensional distribution map with the intensity of the FOXP3 signal as the first axis and the intensity of the CD25 signal as the second axis, the area where the two signals are above a predetermined value and the area below the predetermined value are separated for each of the two signals. Four quadrants are obtained. Among these, cells plotted in the quadrant in which the FOXP3 signal is greater than or equal to a predetermined value and the CD25 signal is greater than or equal to a predetermined value are identified as FOXP3+ and CD25+ cells. This determines the number and proportion of Treg cells and Teff cells in the blood. It is known that the proportion of Treg cells and Teff cells in the blood is effective in predicting the efficacy of an immune checkpoint inhibitor (nivolumab).
具体的に、ＣＤ４＋かつＣＤ６２Ｌｌｏｗの細胞のリンパ球に対する割合を％Ｔｅｆｆ、ＣＤ４＋かつＦＯＸＰ３＋かつＣＤ２５＋の細胞のリンパ球に対する割合を％Ｔｒｅｇとして求め、以下の式（１）に代入することにより、薬効予測の指標を求めることができる。
指標＝［％Ｔｅｆｆ］２／［％Ｔｒｅｇ］ ・・・（１）
例えば、この指標を経験的に設定したカットオフと比較することにより、患者をニボルマブの奏功群と非奏功群とに層別化することが可能である。本発明による試料調製方法によれば、Ｔｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞からの蛍光シグナルを精度よく検出でき、正確な計数結果を得ることが可能となる。
Specifically, the ratio of CD4+ and CD62L low cells to lymphocytes is determined as %Teff, and the ratio of CD4+, FOXP3+, and CD25+ cells to lymphocytes is determined as %Treg, and by substituting them into the following formula (1), the drug efficacy can be determined. Prediction indicators can be obtained.
Index = [%Teff] 2 / [%Treg] ... (1)
For example, by comparing this index with an empirically established cutoff, it is possible to stratify patients into nivolumab responders and non-responders. According to the sample preparation method according to the present invention, fluorescent signals from Treg cells and Teff cells can be detected with high accuracy, and accurate counting results can be obtained.
＜前処理装置による自動化＞
本実施形態の測定試料の調製方法は、対象細胞に対する蛍光シグナルの影響を低減できる利点を有し、かつ、自動化が容易である利点をさらに有する。以下、赤血球に結合可能な固相として磁性粒子を用いた場合の測定試料の調製の自動化の例について説明する。
<Automation using pre-processing equipment>
The measurement sample preparation method of this embodiment has the advantage of being able to reduce the influence of fluorescent signals on target cells, and further has the advantage of being easy to automate. An example of automation of preparation of a measurement sample when magnetic particles are used as a solid phase capable of binding to red blood cells will be described below.
［試料調製装置の概要］
図２を参照して、一実施形態による試料調製装置１００の概要について説明する。
[Overview of sample preparation device]
An overview of the
図２に示すように、試料調製装置１００は、第１処理部２０と、第２処理部３０とを備える。第１処理部２０は、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する処理を行う。第２処理部３０は、赤血球が除去された血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させる処理を行う。
As shown in FIG. 2, the
第１処理部２０は、処理容器１１を保持するラック１０ａと、反応容器１２を保持するラック１０ｂと、血液検体が収容された検体容器１３を保持するラック１０ｃと、を備える。第１処理部２０は、ラック１０ａ、１０ｂ、１０ｃをそれぞれ横方向（Ｘ１及びＸ２方向）に移動させる第１移動部１５、第２移動部１６、及び第３移動部１７を備える。
The
試料調製装置１００は、第１分注部４１と、容器移送部４２とを備える。第１分注部４１および容器移送部４２は、共通の移送軸４３にＹ方向に移動可能に支持されている。第１分注部４１は、ピペット４１ａを備える。第１分注部４１は、ピペット４１ａを用いて、検体容器１３に収容された血液検体を処理容器１１に分注する。容器移送部４２は、互いに近接及び離間可能な一対のハンド部４２ａを備える。容器移送部４２は、ハンド部４２ａによって反応容器１２を把持し、ラック１０ｂと第２処理部３０との間で反応容器１２を移送する。
The
試料調製装置１００は、血液検体を撹拌する撹拌部５０を備える。撹拌部５０は、検体容器１３をラック１０ｃから取り出して転倒攪拌することにより、検体容器１３内の血液検体を撹拌する。
The
試料調製装置１００は、第２分注部６０を備える。第２分注部６０は、移送軸６１に横方向（Ｘ１及びＸ２方向）に移動可能に支持されている。移送軸６１は、移送軸６２にＹ方向に移動可能に支持されている。これにより、第２分注部６０は、装置内において水平方向に移動可能である。第２分注部６０は、ピペット６０ａを備える。第２分注部６０は、ピペット６０ａを用いて、処理容器１１から上清を吸引し、反応容器１２に分注する。また、第２分注部６０は、後述する試薬設置部７０ａおよび７０ｂに設置される試薬を、第１処理部２０の処理容器１１または第２処理部３０内の反応容器１２に分注する。
The
試料調製装置１００は、試薬設置部７０ａおよび試薬設置部７０ｂを備える。試薬設置部７０ａは、保冷庫を含み、試薬を冷却保持する。試薬設置部７０ｂは、試薬を常温の状態で保持する。
The
試料調製装置１００は、ノズル洗浄部８０を備える。ノズル洗浄部８０は、第２分注部６０のノズルを洗浄する。
The
試料調製装置１００は、装置の各部を制御する制御部９０を備える。制御部９０は、プロセッサおよび記憶部を備える。プロセッサは、たとえばＣＰＵにより構成される。記憶部は、メモリおよびストレージを含みうる。プロセッサは、記憶部に記憶されたプログラムを実行することにより試料調製装置１００の制御部９０として機能する。
The
第１処理部２０は、第１移動部１５に隣接する位置に磁石２１を備える。より具体的には、磁石２１は、第１移動部１５によって、処理容器１１を保持したラック１０ａが原点（最も右側（Ｘ２側））に移動されたときに、ラック１０ａに保持された処理容器１１の側面に隣接する位置に設けられている。図２の例では磁石２１は永久磁石であるが、電磁石であってもよい。
The
第２処理部３０は、遠心管である反応容器１２を周方向に複数保持可能であり、軸を中心に高速回転することで、保持された反応容器１２内の試料の遠心分離を行うことが可能な遠心分離部である。第２処理部３０は、高速で回転するロータ３１と、ロータ３１の外周部に複数設けられたホルダ部３２とを含む。ホルダ部３２は、たとえば筒状形状を有し、内部に反応容器１２を受け容れ可能である。また、ホルダ部３２は、ロータ３１の停止時に、反応容器１２を、その開口が上方に向いた姿勢で保持する。
The second processing section 30 can hold a plurality of
［測定試料の調製方法の概略］
図３を参照して、試料調製装置１００による測定試料の調製方法の概略について説明する。
[Outline of method for preparing measurement sample]
Referring to FIG. 3, an outline of a method for preparing a measurement sample using the
第１分注部４１が、ラック１０ｃに保持された検体容器１３に収容された血液検体の一部を、ラック１０ａに保持された処理容器１１に分注する。第２分注部６０が、血液検体が分注された処理容器１１に、ビオチン化された抗赤血球抗体を含む試薬を分注する。また、ラック１０ｂは、反応容器１２を容器移送部４２により第２処理部３０に移送する。
The
第２分注部６０は、血液検体が分注された処理容器１１に、固相としてのストレプトアビジン結合磁性粒子を含む試薬を分注する。ストレプトアビジン結合磁性粒子とビオチン化された抗赤血球抗体とが反応し、結合することにより、赤血球と固相とを含む複合体が処理容器１１内に形成される。第１移動部１５が処理容器１１を磁石２１の側方に位置付けることにより、複合体が処理容器１１の側方に集められる。
The
第２分注部６０が、複合体が側方に集められた処理容器１１から上清を吸引し、第２処理部３０の反応容器１２に分注する。これにより複合体に含まれる赤血球から、測定対象となる細胞を含む上清が分離される。
The
第２分注部６０は、血液検体が分注された反応容器１２に、抗体試薬を分注する。抗体試薬は、白血球の細胞表面抗原に結合する標識抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌに結合する標識抗体）を含む抗体カクテル試薬である。試料中の白血球と抗体試薬との反応後に、第２処理部３０は、反応容器１２内の試料に対して遠心分離を行う。遠心分離によって、白血球が反応容器１２の底部に沈降する。第２分注部６０は、遠心分離後の試料の上清を吸引して除去する。これにより、標識抗体と反応した白血球が反応容器１２内に残り、未反応の抗体成分を含む上清が除去される。
The
第２分注部６０は、反応容器１２内に固定・透過剤を分注する。固定・透過剤により、細胞膜内のタンパク質が固定化され、かつ細胞膜内への標識抗体の進入を許容するように膜が透過される。固定・透過剤との反応後に、第２処理部３０は、反応容器１２内の試料の遠心分離を行う。遠心分離によって、白血球が反応容器１２の底部に沈降する。第２分注部６０は、遠心分離後の試料の上清を吸引して除去する。これにより、固定・透過剤によって処理された白血球が反応容器１２内に残り、固定・透過剤を含む上清が除去される。
The
第２分注部６０は、反応容器１２内に抗体試薬を第２分注部６０により分注する。抗体試薬は、細胞内抗原に結合する標識抗体（例えばＦＯＸＰ３に結合する標識抗体）を含む試薬である。試料中の白血球と抗体試薬との反応後に、第２処理部３０は、反応容器１２内の試料に対して遠心分離を行う。遠心分離によって、白血球が反応容器１２の底部に沈降する。第２分注部６０は、遠心分離後の試料の上清を吸引して除去する。これにより、標識抗体と反応した白血球が反応容器１２内に残り、未反応の抗体成分を含む上清が除去される。
The
第２分注部６０は、反応容器１２内にバッファ（例えばリン酸緩衝液）を分注する。これにより、測定試料が調製される。容器移送部４２は、測定試料が収容された反応容器１２をラック１０ｂに移送する。
The
［試料調製装置の動作］
図４を参照して、試料調製装置１００による測定試料の動作について説明する。以下では、第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７によるラック１０ａ～１０ｃの移動について、さらに図５～図８も参照する。
[Operation of sample preparation device]
Referring to FIG. 4, the operation of the measurement sample by the
図５に示すように、ラック１０ａ、１０ｂ、１０ｃは、それぞれ、複数（たとえば、６つ）の容器を保持可能である。ラック１０ａ、１０ｂ、１０ｃは、第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７によって、Ｘ１方向及びＸ２方向に搬送される。なお、本実施形態では、第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７が一体的にＸ１方向及びＸ２方向にラックを移動する形態を説明するが、第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７がそれぞれ独立してラックを移動する形態であってもよい。第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７は、ラックに保持された容器の間隔に対応した距離ずつ、ラック１０ａ、１０ｂ、１０ｃをＸ１方向及びＸ２方向に搬送することが可能である。図５～図８では、それぞれの容器の位置をわかりやすく図示するため、容器の間隔に対応する大きさのマス目を図示している。
As shown in FIG. 5, each of the
〈検体分注処理〉
検体分注処理に先立って、図５（Ａ）に示すように、作業者により、ラック１０ａに、空の処理容器１１がセットされる。また、作業者により、ラック１０ｂに、空の反応容器１２がセットされる。また、作業者により、ラック１０ｃに血液検体が収容された検体容器１３がセットされる。
<Sample dispensing process>
Prior to the sample dispensing process, as shown in FIG. 5(A), an
図４のステップＳ２０１において、反応容器１２としての遠心管がラック１０ｂから第２処理部３０に搬送される。図５（Ｂ）に示すように、位置Ｐ１に、最も左側の反応容器１２が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。位置Ｐ１は、最も右側の位置から１２マス目の位置である。位置Ｐ１において、反応容器１２が容器移送部４２により取り出され、第２処理部３０に移送される。図５（Ｃ）に示すように、位置Ｐ１に次の反応容器１２が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。そして、反応容器１２が、容器移送部４２により取り出され、第２処理部３０に順次移送される。最後の反応容器１２が位置Ｐ１に移動されて、容器移送部４２により第２処理部３０に移送されるまで、この処理が繰り返される。
In step S201 in FIG. 4, a centrifugal tube serving as the
ステップＳ２０２において、検体容器１３内の血液検体が撹拌される。図６（Ａ）に示すように、位置Ｐ２に、最も左側の検体容器１３が位置するように、第３移動部１７によりラックがＸ２方向に移動される。位置Ｐ２は、最も右側の位置から８マス目の位置である。位置Ｐ２において、ラック１０ｃの検体容器１３が撹拌部５０により取り出され、転倒撹拌される。
In step S202, the blood sample in the
ステップＳ２０３において、検体容器１３から血液検体が吸引されて、ラック１０ａの処理容器１１に吐出されて、血液検体が分注される。図６（Ｂ）に示すように、ステップＳ２０２において撹拌された検体容器１３が位置Ｐ１に位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。位置Ｐ１において、第１分注部４１が検体容器１３内の血液検体の一部を吸引し、ラック１０ａに保持された処理容器１１に吸引した血液検体を分注する。図６（Ｃ）に示すように、位置Ｐ２に次の検体容器１３が位置するように、ラックがＸ２方向に移動される。位置Ｐ２において検体容器１３が撹拌部５０により撹拌される。この位置Ｐ２における検体容器１３の撹拌と、それに続く位置Ｐ１における血液検体の分注が、すべての検体容器１３に対して行われるまで繰り返される。図６（Ｄ）は、すべての検体容器１３に対する撹拌と分注が完了した状態の図である。
In step S203, the blood sample is aspirated from the
〈ＢＦ分離処理〉
ステップＳ２０４において、血液検体が吐出された処理容器１１に抗体が分注される。図７（Ａ）に示すように、位置Ｐ３に最も左側の処理容器１１が位置するように、ラックがＸ２方向に移動される。位置Ｐ３において、第２分注部６０が、ビオチン化された抗赤血球抗体を処理容器１１に分注する。図７（Ｂ）に示すように、位置Ｐ３に次の処理容器１１が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。そして、位置Ｐ３において、処理容器１１に第２分注部６０により抗赤血球抗体が分注される処理が繰り返される。
<BF separation process>
In step S204, the antibody is dispensed into the
すべての処理容器１１に分注が完了すると、ステップＳ２０５において、処理容器１１内の血液検体の撹拌が行われる。第１移動部１５により、ラックがＸ１方向およびＸ２方向に繰り返し往復移動されて、処理容器１１内の血液検体が撹拌される。処理容器１１を保持するラック１０ａは、その後、所定時間（例えば２０分）静置される。
When dispensing into all processing
ステップＳ２０６において、処理容器１１に緩衝液が分注される。第１移動部１５がラック１０ａを移動させて、位置Ｐ３において、各処理容器１１内に第２分注部６０によりバッファが分注される。第１移動部１５によりラック１０ａが高速移動されて、処理容器１１内の血液検体が撹拌される。その後、静置される。たとえば、緩衝液として、ＢＳＡ溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が分注される。また、緩衝液が分注された血液検体が撹拌される。
In step S206, a buffer solution is dispensed into the
ステップＳ２０７において、処理容器１１に磁性粒子が分注される。たとえば、磁性粒子として、ストレプトアビジン結合磁性粒子が分注される。図７（Ｃ）に示すように、位置Ｐ３に最も左側の処理容器１１が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。位置Ｐ３において、処理容器１１に第２分注部６０により、固相としてのストレプトアビジン結合磁性粒子が分注される。図７（Ｄ）に示すように、位置Ｐ３に次の処理容器１１が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。そして、位置Ｐ３において、処理容器１１に第２分注部６０により磁性粒子を含む固相が分注される処理が繰り返される。
In step S207, magnetic particles are dispensed into the
ステップＳ２０８において、処理容器１１内の血液検体を撹拌して反応が行われる。所要時間はたとえば５分間である。移動部１５によりラックが高速移動されて、処理容器１１内の血液検体が撹拌される。その後、静置される。これにより、赤血球と固相とを含む複合体が処理容器１１内に形成される。
In step S208, the blood sample in the
ステップＳ２０９において、集磁が行われる。図７（Ｅ）に示すように、位置Ｐ４に各処理容器１１が位置するように、ラックがＸ２方向に移動される。位置Ｐ４は、最も右側のマスから６つ分のマスに対応する位置である。位置Ｐ４に隣接する位置に磁石２１が設けられている。磁石２１により、赤血球と固相とを含む複合体が処理容器１１の内側面に集磁される。所要時間はたとえば１０分間である。
In step S209, magnetism is collected. As shown in FIG. 7(E), the rack is moved in the X2 direction so that each processing
ステップＳ２１０において、集磁が行われている処理容器１１内の血液検体の上清（例えば７００μＬ）が吸引され、第２処理部３０の反応容器１２に吐出されて分注される。図８（Ａ）に示すように、位置Ｐ４において各処理容器１１から第２分注部６０により上清が吸引されて、第２処理部３０に移送された各反応容器１２に分注される。
In step S210, the supernatant (for example, 700 μL) of the blood sample in the
ステップＳ２１２において、反応容器１２内の試料が遠心分離される。第２処理部３０は、ロータ３１を高速回転することにより、反応容器１２の底部に白血球を沈降させる。
In step S212, the sample in the
ステップＳ２１３において、反応容器１２内の上清が除去される。第２分注部６０は、遠心分離によって白血球が沈降した反応容器１２の上清（例えば６００μＬ）を吸引して除去する。
In step S213, the supernatant in the
ステップＳ２１４において、反応容器１２内の試料が撹拌される。ステップＳ２１２およびＳ２１３により、反応容器１２の底部に白血球が沈降している。この沈降した白血球を分散させるため、反応容器１２が撹拌される。第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌する。
In step S214, the sample within the
〈第１の染色処理〉
ステップＳ２１５において、反応容器１２に、抗体試薬が分注される。第２分注部６０が、抗体試薬として、ＣＤ２５標識抗体、ＣＤ４標識抗体、ＣＤ６２Ｌ標識抗体を含むカクテル試薬を、第２処理部３０に保持された反応容器１２に分注する。
<First staining treatment>
In step S215, an antibody reagent is dispensed into the
ステップＳ２１６において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌する。所定時間はたとえば３０分間である。
In step S216, the second processing unit 30 stirs the sample in the
ステップＳ２１７において、反応容器１２に固定前検体用の洗浄液が分注される。第２分注部６０は、洗浄液としてのＰＢＳを反応容器１２内に分注する。
In step S217, a washing liquid for the sample before fixation is dispensed into the
ステップＳ２１８において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌する。
In step S218, the second processing unit 30 stirs the sample in the
ステップＳ２１９において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に高速回転させることにより、反応容器１２内の試料を遠心分離する。これにより、抗体試薬と反応した白血球が沈降する。
In step S219, the second processing unit 30 centrifuges the sample in the
ステップＳ２２０において、第２分注部６０が、反応容器１２から上清を吸引して除去する。以上により、表面抗原ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌが、それぞれ対応する標識物質により染色される。
In step S220, the
〈細胞の固定および透過処理〉
ステップＳ２２１において、第２分注部６０が、反応容器１２に固定・透過剤を分注する。
<Cell fixation and permeabilization>
In step S221, the
ステップＳ２２２において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌し、反応が行われる。所定時間はたとえば３０分間である。
In step S222, the second processing unit 30 rotates the
ステップＳ２２３において、第２分注部６０が、反応容器１２に固定後検体用の洗浄液を分注する。
In step S223, the
ステップＳ２２４において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌する。
In step S224, the second processing unit 30 stirs the sample in the
ステップＳ２２４において、第２処理部３０は、ロータ３１を高速回転させることにより、反応容器１２内の試料を遠心分離する。
In step S224, the second processing unit 30 centrifuges the sample in the
ステップＳ２２６において、第２分注部６０が、反応容器１２から上清を吸引して除去する。
In step S226, the
ステップＳ２２７～Ｓ２３０において、洗浄液の分注、撹拌、遠心分離および上清の除去が行われる。つまり、検体の洗浄処理が繰り返される。検体の洗浄処理は、１回、２回、３回以上でもよい。以上により、反応容器１２中の細胞に対する固定化処理および透過処理が行われる。
In steps S227 to S230, dispensing of the washing liquid, stirring, centrifugation, and removal of the supernatant are performed. In other words, the sample washing process is repeated. The specimen may be washed once, twice, three times or more. As described above, the cells in the
〈第２の染色処理〉
ステップＳ２３１において、第２分注部６０が、反応容器１２に抗体試薬を分注する。たとえば、抗体試薬として、抗ＦＯＸＰ３標識抗体を含む試薬が分注される。
<Second staining process>
In step S231, the
ステップＳ２３２において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌して反応が行われる。所定時間はたとえば３０分間である。
In step S232, the second processing unit 30 rotates the
ステップＳ２３３において、第２分注部６０が、反応容器１２に固定後検体用の洗浄液を分注する。ステップＳ２３４～２３６において、上述と同様にして、撹拌、遠心分離、上清の除去が行われ、ステップＳ２３７～Ｓ２４０において、洗浄液の分注、撹拌、遠心分離および上清の除去を含む検体の洗浄処理が繰り返される。検体の洗浄処理は、１回、２回、３回以上でもよい。以上により、反応容器１２中のＦＯＸＰ３が、対応する標識物質により染色される。
In step S233, the
〈容器返却〉
ステップＳ２４１において、第２分注部６０が反応容器１２に緩衝液を分注する。分注により、測定装置への供給に適した所定の液量、所定のｐHになるように反応容器１２内の試料が調整される。たとえば、緩衝液として、ＢＳＡ溶液およびＰＢＳが分注される。
<Container return>
In step S241, the
ステップＳ２４２において、第２処理部３０は、上述と同様によりロータを回転して撹拌が行われる。 In step S242, the second processing unit 30 rotates the rotor to perform stirring in the same manner as described above.
ステップＳ２４３において、容器移送部４２が、第２処理部３０に保持された反応容器１２をロータ３１から取り出して、第２移動部１６に保持されたラック１０ｂにセットする。全ての反応容器１２がラック１０ｂに移送されると、図８（Ｄ）に示すように、移動部１５～１７によりラックがＸ２方向に移動されて、初期位置に戻る。これにより、作業者が反応容器１２を取り出すことが可能になる。
In step S243, the
以上により、試料調製装置１００による試料調製が完了する。
With the above steps, sample preparation by the
＜分離法および溶血法の比較データ＞
以下の実験により、本願発明による分離法と、比較例による溶血法とで、Ｔｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞の検出性能に及ぼす影響を比較した。
<Comparison data of separation method and hemolysis method>
In the following experiment, the effects of the separation method according to the present invention and the hemolysis method according to the comparative example on the detection performance of Treg cells and Teff cells were compared.
（実施例（分離法による試料調製））
ヘパリン採血管に採取した全血検体を試験管に分注した。試験管に５０μＬのビオチン化したＣＤ２３５ａ抗体を加えて撹拌し、室温で２０分間静置した。０．６ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を試験管に加えた。２００μＬのストレプトアビジン結合磁性粒子の含有液（Ｍｏｊｏｓｏｒｔ（登録商標））を試験管に加えて撹拌し、室温で５分間静置した。永久磁石を試験管の側面に接するように配置し、室温で１０分間静置することで、赤血球－ビオチン化ＣＤ２３５a抗体－ストレプトアビジン結合磁性粒子の複合体を試験管の内壁に集めた。試験管内の溶液の上清０．７ｍＬをピペットで採取し、遠心管に分注した。遠心管を室温で５分間、３００Ｇで遠心分離し、上清６００μLを除去することにより、実施例の試料を得た。
(Example (sample preparation by separation method))
Whole blood samples collected in heparin blood collection tubes were dispensed into test tubes. 50 μL of biotinylated CD235a antibody was added to the test tube, stirred, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. 0.6 mL of phosphate buffered saline (PBS) was added to the test tube. 200 μL of a solution containing streptavidin-bound magnetic particles (Mojosort (registered trademark)) was added to the test tube, stirred, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. A permanent magnet was placed in contact with the side of the test tube, and the test tube was allowed to stand for 10 minutes at room temperature, thereby collecting the red blood cell-biotinylated CD235a antibody-streptavidin-bound magnetic particle complex on the inner wall of the test tube. 0.7 mL of the supernatant of the solution in the test tube was collected with a pipette and dispensed into centrifuge tubes. The sample of the example was obtained by centrifuging the centrifuge tube at 300 G for 5 minutes at room temperature and removing 600 μL of the supernatant.
（細胞表面抗原の染色）
試料に、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ６２Ｌの抗体カクテル試薬を５０μＬ添加し、撹拌したのち室温で３０分間静置した。抗体カクテル試薬は、ＦＩＴＣ標識したＣＤ４抗体と、ＰＥ－Ｃｙ７標識したＣＤ２５抗体と、ＡＰＣ標識したＣＤ６２Ｌ抗体を含んでいた。抗体カクテル試薬と反応済みの試料に１ｍＬのＰＢＳを添加し、撹拌した。試料を室温で５分間、３００Ｇで遠心分離し、上清を除去して撹拌した。
(Staining of cell surface antigen)
50 μL of CD4/CD25/CD62L antibody cocktail reagent was added to the sample, stirred, and then allowed to stand at room temperature for 30 minutes. The antibody cocktail reagent contained a FITC-labeled CD4 antibody, a PE-Cy7-labeled CD25 antibody, and an APC-labeled CD62L antibody. 1 mL of PBS was added to the sample that had been reacted with the antibody cocktail reagent and stirred. The samples were centrifuged at 300 G for 5 minutes at room temperature, the supernatant removed and vortexed.
（固定・膜透過）
遠心分離後の試料に０．５ｍＬの固定／膜透過剤（eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent、インビトロジェン社製）を加えて撹拌し、室温で３０分間静置した。試料に１ｍＬの洗浄液（eBioscience Permeabilization Buffer (10X)、インビトロジェン社製）を加えて撹拌した。試料を室温で５分間、４００Ｇで遠心分離し、上清を除去した。遠心分離後の試料に１ｍＬの洗浄液（同上）を加えて撹拌し、室温で５分間、４００Ｇで遠心分離し、上清を除去して撹拌した。
(fixation/membrane permeation)
0.5 mL of fixation/membrane permeabilization agent (eBioscience Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent, manufactured by Invitrogen) was added to the sample after centrifugation, stirred, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. 1 mL of a washing solution (eBioscience Permeabilization Buffer (10X), manufactured by Invitrogen) was added to the sample and stirred. The samples were centrifuged at 400 G for 5 minutes at room temperature and the supernatant was removed. After centrifugation, 1 mL of the washing solution (same as above) was added to the sample and stirred, followed by centrifugation at 400 G for 5 minutes at room temperature, and the supernatant was removed and stirred.
（細胞内抗原の染色）
得られた試料に、ＰＥ標識されたＦＯＸＰ３抗体を含む抗体試薬を５０μＬ添加し、室温で３０分間静置した。試料に１ｍＬの洗浄液（eBioscience Permeabilization Buffer (10X)、インビトロジェン社製）を加えて撹拌した。試料を室温で５分間、４００Ｇで遠心分離し、上清を除去した。遠心分離後の試料に１ｍＬの洗浄液（同上）を加えて撹拌し、室温で５分間、４００Ｇで遠心分離し、上清を除去して撹拌した。
(Staining of intracellular antigen)
50 μL of an antibody reagent containing a PE-labeled FOXP3 antibody was added to the obtained sample, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. 1 mL of a washing solution (eBioscience Permeabilization Buffer (10X), manufactured by Invitrogen) was added to the sample and stirred. The samples were centrifuged at 400 G for 5 minutes at room temperature and the supernatant was removed. After centrifugation, 1 mL of the washing solution (same as above) was added to the sample and stirred, followed by centrifugation at 400 G for 5 minutes at room temperature, and the supernatant was removed and stirred.
（フローサイトメータによる測定）
０．５％ＢＳＡを含む０．３ｍＬのＰＢＳを試料に添加し、撹拌した。得られた試料を市販のフローサイトメータ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ II（ベクトンディッキンソン社製）で測定し、Ｔｅｆｆ細胞（ＣＤ６２ＬｌｏｗかつＣＤ４＋のＴ細胞）と、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ２５＋、Ｆｏｘｐ３＋、かつＣＤ４＋のＴ細胞）をそれぞれ計数した。
(Measurement with flow cytometer)
0.3 mL of PBS containing 0.5% BSA was added to the sample and stirred. The obtained sample was measured using a commercially available flow cytometer FACS Canto II (manufactured by Becton Dickinson) to detect Teff cells (CD62L low and CD4+ T cells) and Treg cells (CD25+, Foxp3+, and CD4+ T cells). Each was counted.
（比較例（溶血法による試料調製））
ヘパリン採血管に採取した全血検体を遠心管に分注した。遠心管に２ｍＬの溶血剤（CyLyse；シスメックス株式会社製）を加えて室温で１０分間静置することにより、血液中の赤血球を溶血した。遠心管をボルテクスミキサーで攪拌したのち、２ｍＬのＰＢＳを遠心管に加えた。遠心管を室温で５分間、３００Ｇで遠心分離し、上清を除去した。遠心管に２ｍＬのＰＢＳを加え、再び遠心管を室温で５分間、３００Ｇで遠心分離して、上清を除去し、比較例の試料を得た。比較例の試料について、実施例と同様の操作を行い、フローサイトメータによる測定を実施した。
(Comparative example (sample preparation by hemolysis method))
Whole blood samples collected in heparin blood collection tubes were dispensed into centrifuge tubes. Red blood cells in the blood were hemolyzed by adding 2 mL of a hemolytic agent (CyLyse; manufactured by Sysmex Corporation) to a centrifuge tube and allowing it to stand at room temperature for 10 minutes. After stirring the centrifuge tube with a vortex mixer, 2 mL of PBS was added to the centrifuge tube. The tubes were centrifuged at 300G for 5 minutes at room temperature and the supernatant was removed. 2 mL of PBS was added to the centrifuge tube, and the centrifuge tube was again centrifuged at 300 G for 5 minutes at room temperature, the supernatant was removed, and a comparative sample was obtained. Regarding the sample of the comparative example, the same operation as in the example was performed, and measurement was performed using a flow cytometer.
（対照実験）
ヘパリン採血管に採取した５ｍｌの全血検体を、５ｍＬの液体培地（10mM HEPES/PRMI-1640）で希釈した。１０ｍＬのリンパ球分離用媒体（Ficoll-Paque Plus、Cytiva社製）を５０ｍＬチューブに入れた。このチューブに、希釈された全血検体を入れて重層した。Ficoll Paque Plusの添付文書に記載のインストラクションにしたがってチューブ内でＰＢＭＣの分離を行い、CELLBANKER2（日本全薬工業社製）を用いてＰＢＭＣを1x10^6 cells/mLとなるように懸濁し、ディープフリーザーで凍結した。凍結処理後、ＰＢＭＣを２４時間以降1週間以内に液体窒素（液相下）へ移管した。解凍した細胞を、10% FBS/RPMI1640で洗浄後、10% FBS/RPMI1640を1x10^6 cells/mLとなるように添加した。２ｍＬの細胞懸濁液を２４穴プレート(コーニング社製) に入れ、４８時間培養した。培養後、細胞培養液を１５ｍＬ チューブに移し、４００Ｇで５分間遠心分離して、対照例の試料を得た。対照例の試料について、実施例と同様の操作を行い、フローサイトメータによる測定を実施した。
(Control experiment)
5 ml of whole blood sample collected into a heparin blood collection tube was diluted with 5 ml of liquid medium (10 mM HEPES/PRMI-1640). 10 mL of lymphocyte separation medium (Ficoll-Paque Plus, manufactured by Cytiva) was placed in a 50 mL tube. A diluted whole blood sample was placed in this tube and layered. Separate PBMC in a tube according to the instructions in the Ficoll Paque Plus package insert, suspend the PBMC at 1x10^6 cells/mL using CELLBANKER2 (manufactured by Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), and place in a deep freezer. It was frozen. After the freezing treatment, PBMCs were transferred to liquid nitrogen (under liquid phase) within 1 week after 24 hours. After washing the thawed cells with 10% FBS/RPMI1640, 10% FBS/RPMI1640 was added at a concentration of 1x10^6 cells/mL. 2 mL of the cell suspension was placed in a 24-well plate (manufactured by Corning) and cultured for 48 hours. After culturing, the cell culture solution was transferred to a 15 mL tube and centrifuged at 400 G for 5 minutes to obtain a control sample. Regarding the sample of the control example, the same operation as in the example was performed, and measurement was performed using a flow cytometer.
（測定結果）
測定した結果を図９および図１０に示す。
(Measurement result)
The measured results are shown in FIGS. 9 and 10.
図９に示すように、Ｔｅｆｆ細胞の検出性能においては、実施例の分離法によって調製した測定用試料は、対照実験の凍結ＰＢＭＣを用いた試料と良好な相関を示した（相関係数＝0.9419）。さらに、実施例は、比較例（相関係数＝0.7064）に比べて相関係数において優位に高い値を示した。 As shown in Figure 9, in terms of Teff cell detection performance, the measurement sample prepared by the separation method of the example showed a good correlation with the sample using frozen PBMC in the control experiment (correlation coefficient = 0.9419). ). Furthermore, the example showed a significantly higher correlation coefficient than the comparative example (correlation coefficient = 0.7064).
図１０に示すように、Ｔｒｅｇ細胞の検出性能においては、実施例の分離法によって調製した測定用試料は、対照実験の凍結ＰＢＭＣを用いた場合の結果と良好な相関を示した（相関係数＝0.8679）。さらに、実施例は、比較例（相関係数＝0.0065）に比べて相関係数において優位に高い値を示した。 As shown in Figure 10, in terms of detection performance of Treg cells, the measurement sample prepared by the separation method of the example showed a good correlation with the results when frozen PBMCs were used in the control experiment (correlation coefficient =0.8679). Furthermore, the example showed a significantly higher correlation coefficient than the comparative example (correlation coefficient = 0.0065).
これらの結果から、本発明による分離法は、Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞の両者に対して溶血法に比べて高い測定精度を示すことがわかった。また、分離法は、凍結ＰＢＭＣを用いて試料調製する場合と同等の測定精度であることがわかった。 From these results, it was found that the separation method according to the present invention exhibits higher measurement accuracy than the hemolysis method for both Teff cells and Treg cells. Furthermore, the separation method was found to have measurement accuracy equivalent to that when preparing samples using frozen PBMC.
（標識からのシグナルに関する考察）
図１１および図１２は、リンパ球に分画された細胞のうちＣＤ４の発現量の大きいＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）を分画したスキャッタグラムである。図１１は、実施例（分離法）のスキャッタグラムであり、図１２は、比較例（溶血法）のスキャッタグラムである。ＣＤ４＋Ｔ細胞の計数結果は、実施例（分離法）が４４．４％に対して比較例（溶血法）が４３．０％であり、有意な差はなかった。
(Considerations regarding signals from labels)
FIGS. 11 and 12 are scattergrams showing T cells that express a large amount of CD4 (CD4+T cells) among cells that have been separated into lymphocytes. FIG. 11 is a scattergram of the example (separation method), and FIG. 12 is a scattergram of the comparative example (hemolysis method). The counting results of CD4+ T cells were 44.4% in the example (separation method) and 43.0% in the comparative example (hemolysis method), with no significant difference.
図１３および図１４は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちＣＤ６２Ｌの発現量の低い細胞（ＣＤ４+、ＣＤ６２ＬＬｏｗのＴ細胞）を分画した、同一の検体から得られたヒストグラムである。図１３は、実施例（分離法）のヒストグラムであり、図１４は、比較例（溶血法）のヒストグラムである。このヒストグラムでは、ＣＤ６２Ｌの蛍光シグナルが所定のカットオフ範囲内に入るものをＣＤ４＋、ＣＤ６２ＬLow Ｔ細胞、つまりＴｅｆｆ細胞として計数した。実施例（分離法）では、Ｔｅｆｆ細胞が８．４８％であるのに対して、比較例（溶血法）では、Ｔｅｆｆ細胞が１５．６％であった。実施例（分離法）のヒストグラムでは、CD62LLow T細胞のピークと、ＣＤ６２Ｌの発現量が高いＴ細胞（CD62LHigh T細胞）のピークが明瞭に分かれており、ピーク間の谷間にプロットされる細胞が少ない。一方、比較例（溶血法）のヒストグラムは、実施例（分離法）のヒストグラムに比べるとＣＤ６２ＬHigh Ｔ細胞のピークが下がっており、２つピークの谷間にプロットされた細胞の数が多くなっている。これは、溶血法ではＣＤ６２Ｌの染色が不十分となり、全体的に蛍光シグナル強度が低下した結果、ＣＤ６２Ｌの発現量の高い細胞（ＣＤ６２ＬHigh Ｔ細胞）が低値側にスライドしたためと考えられる。このデータから、溶血法では、ＣＤ６２Ｌのシグナルが全体的に低下していることが示唆された。 FIG. 13 and FIG. 14 are histograms obtained from the same specimen obtained by fractionating cells with a low expression level of CD62L (CD4 +, CD62L Low T cells) among CD4 + T cells. FIG. 13 is a histogram of the example (separation method), and FIG. 14 is a histogram of the comparative example (hemolysis method). In this histogram, cells whose CD62L fluorescence signal fell within a predetermined cutoff range were counted as CD4+, CD62L Low T cells, that is, Teff cells. In the Example (separation method), Teff cells accounted for 8.48%, whereas in the Comparative Example (hemolysis method), Teff cells accounted for 15.6%. In the histogram of the example (separation method), the peak of CD62L Low T cells and the peak of T cells with high expression level of CD62L (CD62L High T cells) are clearly separated, and the cells plotted in the valley between the peaks Less is. On the other hand, in the histogram of the comparative example (hemolysis method), the peak of CD62L High T cells is lower than the histogram of the example (separation method), and the number of cells plotted in the valley between the two peaks is increased. There is. This is thought to be because CD62L staining was insufficient in the hemolytic method, resulting in an overall decrease in fluorescence signal intensity, and as a result, cells with a high expression level of CD62L (CD62L High T cells) slid to the low value side. This data suggested that the hemolytic method resulted in an overall decrease in the CD62L signal.
図１５および図１６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちＣＤ２５およびＦＯＸＰ３の発現量の高いＴ細胞（CD4+/CD25+/FOXP3＋T細胞）を分画した、同一の検体から得られたスキャッタグラムである。図１５は、実施例（分離法）のスキャッタグラムであり、図１６は、比較例（溶血法）のスキャッタグラムである。ＣＤ２５に対応する蛍光シグナル強度（横軸）およびＦＯＸＰ３に対応する蛍光シグナル強度（縦軸）のそれぞれについて、所定のカットオフ値より高い値を示した細胞をCD25+/FOXP3＋T細胞、つまりＴｒｅｇ細胞として同定した（Ｑ２のゾーンに入った細胞）。実施例（分離法）では、Ｑ２に分画されたＴｒｅｇ細胞は３．８８％であるのに対して、比較例（溶血法）では１．９４％であった。比較例（溶血法）のスキャッタグラムは、実施例（分離法）のスキャッタグラムと比べてＱ３に含まれる細胞数が増加している。すなわち、溶血法では、縦軸方向に細胞のプロットが下がっていることから、ＦＯＸＰ３のシグナルが全体的に低下していることが示唆された。 FIG. 15 and FIG. 16 are scattergrams obtained from the same specimen in which T cells with high expression levels of CD25 and FOXP3 (CD4+/CD25+/FOXP3+ T cells) were fractionated among CD4+ T cells. FIG. 15 is a scattergram of the example (separation method), and FIG. 16 is a scattergram of the comparative example (hemolysis method). For each of the fluorescence signal intensity corresponding to CD25 (horizontal axis) and the fluorescence signal intensity corresponding to FOXP3 (vertical axis), cells that showed a value higher than the predetermined cutoff value were identified as CD25+/FOXP3+ T cells, that is, Treg cells. (cells that entered the Q2 zone). In the example (separation method), the number of Treg cells fractionated in Q2 was 3.88%, whereas in the comparative example (hemolysis method) it was 1.94%. In the scattergram of the comparative example (hemolysis method), the number of cells included in Q3 is increased compared to the scattergram of the example (separation method). That is, in the hemolytic method, the plot of cells decreased in the vertical axis direction, suggesting that the FOXP3 signal decreased overall.
（変形例）
なお、今回開示された実施形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した実施形態の説明ではなく特許請求の範囲によって示され、さらに特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれる。
(Modified example)
Note that the embodiments disclosed this time should be considered to be illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention is indicated by the claims rather than the description of the embodiments described above, and includes all changes within the meaning and range equivalent to the claims.
１０ａ：処理容器移送部、１０ｂ：反応容器供給部、１０ｃ検体セット部、１１：処理容器、１２：反応容器、１３：検体容器、２０：第１処理部、３０：第２処理部、４１：第１分注部、４２：容器移送部、６０：第２分注部、１００：試料調製装置 10a: Processing container transfer section, 10b: Reaction container supply section, 10c Sample setting section, 11: Processing container, 12: Reaction container, 13: Sample container, 20: First processing section, 30: Second processing section, 41: First dispensing section, 42: Container transfer section, 60: Second dispensing section, 100: Sample preparation device
Claims (20)
赤血球が除去された前記血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させることと、を備える、測定試料の調製方法。 removing red blood cells from a blood sample using a solid phase capable of binding to red blood cells;
A method for preparing a measurement sample, comprising reacting the blood sample from which red blood cells have been removed with a reagent for immunostaining cells.
前記血液検体から赤血球を除去することは、前記複合体を磁石により集磁しながら前記血液検体の上清を吸引することを含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の測定試料の調製方法。 the solid phase has magnetic particles;
The measurement sample according to any one of claims 2 to 5, wherein removing the red blood cells from the blood sample includes aspirating the supernatant of the blood sample while collecting the complex with a magnet. Preparation method.
赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する第１処理部と、
赤血球が除去された前記血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させる第２処理部と、を備える、試料調製装置。 A sample preparation device that prepares a measurement sample by reacting a blood sample and a reagent,
a first processing unit that removes red blood cells from the blood sample using a solid phase capable of binding to red blood cells;
A sample preparation device comprising: a second processing unit that causes the blood sample from which red blood cells have been removed to react with a reagent for immunostaining cells.
前記第１処理部は、前記複合体を集磁する磁石を含み、前記複合体を前記磁石により集磁しながら前記血液検体の上清を吸引して前記複合体と前記血液検体の上清とを分離する、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の試料調製装置。 the solid phase has magnetic particles;
The first processing section includes a magnet that collects magnetism of the complex, and sucks the supernatant of the blood sample while collecting magnetism of the complex with the magnet, thereby combining the complex and the supernatant of the blood sample. The sample preparation device according to any one of claims 11 to 14, which separates.
前記第２処理部において反応させる前記血液検体が収容される反応容器が載置される反応容器供給部と、
前記反応容器供給部と前記第２処理部との間で前記反応容器を移送するための容器移送部と、
前記第１処理部において処理される前記血液検体が収容される処理容器に前記検体容器から前記血液検体を分注するための第１分注部と、
試薬設置部に設置される試薬を、前記第１処理部の前記処理容器、または、前記第２処理部内の前記反応容器に分注するための第２分注部と、をさらに備える、請求項１０～１８のいずれか１項に記載の試料調製装置。 a sample setting section on which a sample container containing the blood sample is placed;
a reaction container supply section in which a reaction container containing the blood sample to be reacted in the second processing section is placed;
a container transfer section for transferring the reaction container between the reaction container supply section and the second processing section;
a first dispensing unit for dispensing the blood sample from the sample container into a processing container in which the blood sample to be processed in the first processing unit is accommodated;
Claim further comprising: a second dispensing section for dispensing the reagent installed in the reagent installation section into the processing container of the first processing section or the reaction container within the second processing section. 19. The sample preparation device according to any one of items 10 to 18.
Priority Applications (5)
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| EP23158500.1A EP4235183A3 (en) | 2022-02-28 | 2023-02-24 | Specimen preparation apparatus, specimen processing apparatus, specimen preparation method andspecimen processing method |
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