JP2023116876A - Antioxidative composition - Google Patents

Abstract

To provide a novel antioxidative composition.SOLUTION: An antioxidative composition comprises at least one microbe selected from the group consisting of Anaerotruncus, Ruminococcus, Dorea, Clostridium, Faecalicatena, Blautia and Coprococcus or a culture thereof as an active ingredient.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、抗酸化用組成物に関する。 The present invention relates to antioxidant compositions.

フリーラジカル、活性酸素窒素種（ＲＯＮＳ）などのオキシダントの生成による酸化ストレスは、脂質、タンパク質、核酸などの高分子の過剰な酸化的修飾を引き起こす。これは、細胞機能不全および重要な細胞プロセスの崩壊を誘発し（非特許文献１）、それによって、がん、神経障害、動脈硬化、糖尿病、肝炎、慢性閉塞性肺疾患などの広範な病理を誘発することが知られている（非特許文献２および３）。 Oxidative stress due to the generation of oxidants such as free radicals and reactive oxygen nitrogen species (RONS) causes excessive oxidative modification of macromolecules such as lipids, proteins and nucleic acids. This induces cellular dysfunction and disruption of key cellular processes (1), thereby leading to a wide range of pathologies such as cancer, neuropathy, arteriosclerosis, diabetes, hepatitis, and chronic obstructive pulmonary disease. It is known to induce (Non-Patent Documents 2 and 3).

近年の研究により、腸内細菌が産生する代謝物が、腸内外の生理機能に関連していることが明らかになっている（非特許文献４）。しかし、全身の活性イオウ分子（ＲＳＳ）プールおよび宿主の抗酸化能に対する腸内細菌の寄与は、依然として不明である。 Recent studies have revealed that metabolites produced by intestinal bacteria are related to physiological functions inside and outside the intestine (Non-Patent Document 4). However, the contribution of gut bacteria to the systemic reactive sulfur molecule (RSS) pool and host antioxidant capacity remains unclear.

Sharifi-Rad et al., (2020). Lifestyle, Oxidative Stress, and Antioxidants: Back and Forth in the Pathophysiology of Chronic Diseases. Front Physiol. 11, 694Sharifi-Rad et al., (2020). Lifestyle, Oxidative Stress, and Antioxidants: Back and Forth in the Pathophysiology of Chronic Diseases. Front Physiol. 11, 694 Li et al., (2015). The Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Liver Diseases. Int J Mol Sci. 16(11), 26087-26124Li et al., (2015). The Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Liver Diseases. Int J Mol Sci. 16(11), 26087-26124 Liguori et al., (2018). Oxidative stress, aging, and diseases. Clin Interv Aging. 13, 757-772Liguori et al., (2018). Oxidative stress, aging, and diseases. Clin Interv Aging. 13, 757-772 Fan and Pedersen, (2021). Gut microbiota in human metabolic health and disease. Nat Rev Microbiol. 19(1), 55-71Fan and Pedersen, (2021). Gut microbiota in human metabolic health and disease. Nat Rev Microbiol. 19(1), 55-71

腸内細菌由来の新たな有効成分を提供することにより、酸化ストレスに起因する疾患などの治療、予防などに対して、新たな手段を提供することができる。 By providing a new active ingredient derived from intestinal bacteria, it is possible to provide a new means for treating and preventing diseases caused by oxidative stress.

したがって、本発明は、新規な抗酸化用組成物を提供することを目的とする。 Accordingly, it is an object of the present invention to provide novel antioxidant compositions.

本発明者らは、驚くべきことに、腸内細菌が宿主生体内における活性イオウ分子量に影響を与えることを見出した。そして、この知見に基づき、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have surprisingly found that intestinal bacteria affect the active sulfur molecular weight in the host organism. Based on this knowledge, the present invention has been completed.

すなわち、本発明の一形態によれば、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物が提供される。 That is, according to one aspect of the present invention, the genus Anaerotruncus, the genus Ruminococcus, the genus Dorea, the genus Clostridium, the genus Faecalicatena, the genus Blautia and Provided is an antioxidant composition containing, as an active ingredient, at least one microorganism selected from the group consisting of the genus Coprococcus or a culture thereof.

本発明によれば、新規な抗酸化用組成物を提供することができる。 According to the present invention, a novel antioxidant composition can be provided.

ＳＰＦマウスおよび抗生物質処理ＳＰＦマウス（Ａｂｘマウス）における血漿中活性イオウ分子濃度の測定結果を示すグラフである。4 is a graph showing the measurement results of plasma active sulfur molecule concentrations in SPF mice and antibiotic-treated SPF mice (Abx mice). ＧＦマウスおよびｅｘＧＦマウスにおける血漿中活性イオウ分子濃度の測定結果を示すグラフである。1 is a graph showing the measurement results of plasma active sulfur molecule concentrations in GF mice and exGF mice. ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）の糞便サンプルをメチオニン、システインまたはシスチンの存在下培養した結果を示すグラフである。Fig. 3 is a graph showing the results of culturing fecal samples from SPF mice (without administration of antibiotics) in the presence of methionine, cysteine or cystine. ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）およびＡｂｘマウスの糞便からのＨＭＷ画分の精製物とシスチンとを反応させた結果を示すグラフである。FIG. 10 is a graph showing the results of reacting purified HMW fractions from feces of SPF mice (without administration of antibiotics) and Abx mice with cystine. FIG. Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与または抗生物質投与）にシスチンを経口投与し、血漿中活性イオウ分子濃度を測定した結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of measuring the concentration of active sulfur molecules in plasma after orally administering cystine to C57BL/6 mice (with or without antibiotics). ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルマウスの血清ＡＬＴレベルおよびＭＤＡレベルを測定した結果を示すグラフである。Fig. 3 is a graph showing the results of measuring serum ALT and MDA levels in ConA-induced hepatitis model mice. 抗生物質を投与したＣｏｎＡ誘発肝炎モデルマウスの血清ＡＬＴレベルを測定した結果を示すグラフである。Fig. 3 is a graph showing the results of measuring serum ALT levels in ConA-induced hepatitis model mice to which antibiotics were administered. 異なるスペクトラムを有する抗生物質を投与したマウスの糞便における活性イオウ分子レベルを測定した結果を示すグラフである。4 is a graph showing the results of measuring active sulfur molecule levels in feces of mice administered with antibiotics having different spectra. １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを用いた腸内細菌叢の組成解析の結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of compositional analysis of intestinal flora using 16S rRNA gene sequencing. １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを用いた腸内細菌叢の組成解析の結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of compositional analysis of intestinal flora using 16S rRNA gene sequencing. 単一株を用いて細胞培養を行い、シスチン投与後のシステインパースルフィド産生能を評価した結果を示すグラフである。1 is a graph showing the results of cell culture using a single strain and evaluation of cysteine persulfide-producing ability after administration of cystine. アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）およびクロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）をメチオニン、システインまたはシスチン存在下で培養後の各菌株におけるシステインパースルフィド産生量の結果を示すグラフである。Graph showing results of cysteine persulfide production in each strain after culturing Anaerotruncus colihominis, Dorea longicatena and Clostridium bolteae in the presence of methionine, cysteine or cystine is. アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナ、クロストリジウム・ボルテエおよびバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）からの精製タンパク質とシスチンとＡＯＡＡとを反応させた結果を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the results of reacting purified proteins from Anerotrunkus colihominis, Drea longicatena, Clostridium vortae and Bacteroides thetaiotaomicron with cystine and AOAA. クロストリジウム・ボルテエ培養溶液の投与群およびクロストリジウム・ボルテエ培養溶液の非投与群における血漿中の活性イオウ分子レベルを測定した結果を示すグラフである。2 is a graph showing the results of measurement of active sulfur molecule levels in plasma in a group administered with a culture solution of Clostridium vortae and a group not administered with a culture solution of Clostridium vortae.

以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。 An embodiment according to one aspect of the present invention will be described below. The present invention is not limited only to the following embodiments.

本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。 In this specification, "X to Y" indicating a range means "X or more and Y or less". Unless otherwise specified, measurements of operations and physical properties are performed under the conditions of room temperature (20 to 25° C.)/relative humidity of 40 to 50% RH.

本明細書において、抗酸化とは、活性酸素などによる生体の酸化を防止する作用を意味する。 As used herein, the term "antioxidant" means an action to prevent oxidation of living organisms due to active oxygen and the like.

本明細書において、活性イオウ分子（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｕｌｆｕｒ Ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＳＳ）とは、チオールに硫黄原子が過剰に付加したポリスルフィド構造を有する化合物である。活性イオウ分子としては、例えばシステインパースルフィド（ＣｙｓＳＳＨ）、グルタチオンパースルフィド（ＧＳＳＨ）、過硫化水素（ＨＳＳＨ）などが挙げられる。 As used herein, a reactive sulfur molecule (RSS) is a compound having a polysulfide structure in which a sulfur atom is excessively attached to a thiol. Active sulfur molecules include, for example, cysteine persulfide (CysSSH), glutathione persulfide (GSSH), hydrogen persulfide (HSSH), and the like.

＜抗酸化用組成物＞
本発明の一形態は、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物である。 <Antioxidant composition>
One aspect of the present invention is the genera Anaerotruncus, Ruminococcus, Dorea, Clostridium, Faecalicatena, Blautia and Coprococcus. ) is an antioxidant composition containing, as an active ingredient, at least one microorganism selected from the group consisting of the genus or a culture thereof.

本明細書において、「アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物」を単に「本発明に係る微生物」とも称する。 In this specification, "Anaerotruncus genus, Ruminococcus genus, Dorea genus, Clostridium genus, Faecalicatena genus, Blautia genus and Coprococcus "At least one microorganism selected from the group consisting of genera" is also simply referred to as "the microorganism according to the present invention".

アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属の微生物としては、アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）などが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Anaerotruncus include Anaerotruncus colihominis.

ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物としては、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ）、ルミノコッカス・アルバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒｏｍｉｉ）、ルミノコッカス・ガウブレアウイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｕｖｒｅａｕｉｉ）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔａｒｉｓ）、ルミノコッカス・トルキース（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ）、ルミノコッカス・フェシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｓ）、ルミノコッカス・カリダス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｌｌｉｄｕｓ）、フラベファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）、ルミノコッカス・シャンパネレンシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）、ルミノコッカス・オベウム（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｂｅｕｍ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Ruminococcus include Ruminococcus gnavus, Ruminococcus albus, Ruminococcus bromii, and Ruminococcus gaubleaui. gauvreauii), Ruminococcus Ruminococcus lactaris, Ruminococcus torques, Ruminococcus faecis, Ruminococcus callidus, Ruminococcus flav efaciens), Ruminococcus champanellensis champanellensis), Ruminococcus obeum, and the like.

ドレア（Ｄｏｒｅａ）属の微生物としては、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｄｉｇｅｎｅｒａｎｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Dorea include Dorea formidigenerans and Dorea longicatena.

クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の微生物としては、クロストリジウム・インドリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｉｎｄｏｌｉｓ）、クロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）、クロストリジウム・ラバレンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌａｖａｌｅｎｓｅ）、クロストリジウム・シンビオサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）、クロストリジウム・セレレクレセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）、クロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ）、クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｓｐａｒａｇｉｆｏｒｍｅ）、クロストリジウム・クロストリジフォルメ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｆｏｒｍｅ）、クロストリジウム・ハセワイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈａｔｈｅｗａｙｉ）、クロストリジウム・ネキシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ）、クロストリジウム・グリシルリジニリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎｉｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・アミノバレリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・クラリフラバム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Clostridium include Clostridium indolis, Clostridium bolteae, Clostridium lavalense, Clostridium symbiosum, Clostridium Clostridium celerecrescens ), Clostridium scindens, Clostridium asparagiforme, Clostridium clostridioforme, Clostridium hathewayi, Clostridium Clostridium nexile, Clostridium glycine Examples include Clostridium glycyrrhizinilyticum, Clostridium aminovalericum, Clostridium clariflavum, and the like.

ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属の微生物としては、ファカリカテナ・オロティカ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｏｒｏｔｉｃａ）、ファカリカテナ・コントルタ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、ファカリカテナ・フィシカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｆｉｓｓｉｃａｔｅｎａ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Faecalicatena include Faecalicatena orotica, Faecalicatena contorta, and Faecalicatena fissicatena.

ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属の微生物としては、ブラウティア・ハンセニ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ブラウティア・ウェクレラ（Ｂｌａｕｔｉａ ｗｅｘｌｅｒａｅ）、ブラウティア・ルティ（Ｂｌａｕｔｉａ ｌｕｔｉ）、ブラウティア・ファエシス（Ｂｌａｕｔｉａ ｆａｅｃｉｓ）、ブラウティア・グルセラセア（Ｂｌａｕｔｉａ ｇｌｕｃｅｒａｓｅａ）、ブラウティア・コッコイデス（Ｂｌａｕｔｉａ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ブラウティア・スターコリス（Ｂｌａｕｔｉａ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）、ブラウティア・ヒドロゲノトロフィカ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ブラウティア・オベウム（Ｂｌａｕｔｉａ ｏｂｅｕｍ）などが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Blautia include Blautia hansenii, Blautia wexlerae, Blautia luti, Blautia faecis, Blautia gluceracea (Bl autia glucerasea), Blautia coccoides, Blautia producta, Blautia stercoris, Blautia hydrogenotrophica, Blautia obeum a obeum) and the like.

コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物としては、コプロコッカス・コメス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ）、コプロコッカス・カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）、コプロコッカス・エウタクタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｔａｃｔｕｓ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Coprococcus include Coprococcus comees, Coprococcus catus, Coprococcus eutactus, and the like.

本発明に係る微生物は、好ましくは腸内細菌由来の微生物である。 The microorganisms according to the present invention are preferably microorganisms derived from enterobacteria.

好ましい実施形態では、本発明に係る微生物は、アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ）、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｄｉｇｅｎｅｒａｎｓ）、クロストリジウム・インドリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｉｎｄｏｌｉｓ）、クロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）、クロストリジウム・ラバレンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌａｖａｌｅｎｓｅ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、ファカリカテナ・オロティカ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｏｒｏｔｉｃａ）、ブラウティア・ハンセニ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、コプロコッカス・コメス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ）、クロストリジウム・シンビオサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）およびクロストリジウム・セレレクレセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物であり、より好ましくはアネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）およびクロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物である。 In a preferred embodiment, the microorganism according to the invention is Anaerotruncus colihominis, Ruminococcus gnavus, Dorea formidigenerans, Clostridium indolis, Clostridium bolteae, Clostridium lavalense, Dorea longicatena, Faecalicatena orotica, Blautia hansenii , Coprococcus comes, Clostridium - At least one microorganism selected from the group consisting of Clostridium symbiosum and Clostridium celerecrescens, more preferably Anaerotruncus colihominis, Dorea longicaten a ) and Clostridium bolteae.

本発明に係る抗酸化用組成物は、上記本発明に係る微生物に加え、ファーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フラボニフラクター（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ）属、アナエロスティペス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）属、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、サブドリグラヌラム（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）属、フシカテニバクター（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ）属、ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）属、オシリバクター（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）属、ロニソニエラ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ）属など微生物を含むことができる。 The antioxidant composition according to the present invention includes, in addition to the microorganisms according to the present invention, the genus Faecalibacterium, the genus Flavonifractor, the genus Anaerostipes, and the genus Eubacterium ), Butyrivibrio, Subdoligranulum, Fusicatenibacter, Roseburia, Oscillibacter, Robinsoniella, etc. can.

ファーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物としては、ファーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）などが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Faecalibacterium include Faecalibacterium prausnitzii.

フラボニフラクター（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ）属の微生物としては、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Flavonifractor include Flavonifractor plautii.

アナエロスティペス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）属の微生物としては、アナエロスティペス・ハドラス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓ）、アナエロスティペス・ブチラティカス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｂｕｔｙｒａｔｉｃｕｓ）などが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Anaerostipes include Anaerostipes hadrus, Anaerostipes butyraticus, and the like.

ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物としては、ユーバクテリウム・レクタレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）、ユーバクテリウム・ラムラス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｍｕｌｕｓ）、ユーバクテリウム・ハリイ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Eubacterium include Eubacterium rectale, Eubacterium ramulus, and Eubacterium hallii.

ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属の微生物としては、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）、ブチリビブリオ・クロッソツス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｃｒｏｓｓｏｔｕｓ）などが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Butyrivibrio include Butyrivibrio fibrisolvens and Butyrivibrio crossotus.

サブドリグラヌラム（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）属の微生物としては、サブドリグラヌラム・バリアビレ（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ）などが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Subdoligranulum include Subdoligranulum variabile.

フシカテニバクター（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ）属の微生物としては、フシカテニバクター・サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）などが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Fusicatenibacter include Fusicatenibacter saccharivorans.

ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）属の微生物としては、ロセブリア・ファエシス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｆａｅｃｉｓ）、ロセブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ロセブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Roseburia include Roseburia faecis, Roseburia hominis, Roseburia intestinalis, and the like.

オシリバクター（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）属の微生物としては、オシリバクター・バレリシゲネス（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ）などが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Oscillibacter include Oscillibacter valericigenes.

ロニソニエラ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ）属の微生物としては、ロビソニエラ・ペオリエンシス（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ ｐｅｏｒｉｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Robinsoniella include Robinsoniella peoriensis.

上記微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、理化学研究所 微生物材料開発室（ＪＣＭ）、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）などから入手することができる。 The above microorganisms are National Institute of Technology and Evaluation (NITE), RIKEN Microbial Materials Development Room (JCM), National BioResource Project (NBRP), American Culture Collection (ATCC), German Microorganism Cell Culture Collection (DSMZ) ) can be obtained from

本発明に係る微生物は、従来公知の方法を用いてヒトの糞便から得ることができる。 The microorganism according to the present invention can be obtained from human feces using a conventionally known method.

本発明に係る微生物は、１種のみが単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。 The microorganisms according to the present invention may be used singly or in combination of two or more.

本発明において、本発明に係る微生物の培養物は、微生物を培養した培養液、前記培養液を遠心分離して得られる上清、前記培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣、前記残渣からの精製物および前記残渣の乾燥物を意味する。 In the present invention, the culture of the microorganism according to the present invention includes a culture solution obtained by culturing the microorganism, a supernatant obtained by centrifuging the culture solution, a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution, the above It means the purified product from the residue and the dried product of said residue.

残渣からの精製物（例えば、タンパク質）は、従来公知の手法に記載の方法に従って得ることができる。 A purified product (eg, protein) from the residue can be obtained according to a method described in a conventionally known technique.

残渣の乾燥物は、培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣を風乾処理または減圧乾燥処理を行うことにより得ることができる。 The dried residue can be obtained by subjecting the residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution to air-drying or drying under reduced pressure.

本発明に係る微生物の培養物は、従来公知の微生物の培養方法により得ることができる。例えば、微生物の培養に使用する培地は、固体または液体培地のいずれでもよく、また、使用する微生物が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでもよい。通常、培地は、炭素源、窒素源および無機物を含む。 The culture of microorganisms according to the present invention can be obtained by a conventionally known method for culturing microorganisms. For example, the medium used for culturing microorganisms may be either solid or liquid, as long as it contains a carbon source that can be assimilated by the microorganisms used, an appropriate amount of nitrogen source, inorganic salts and other nutrients. , either synthetic or natural media. Media typically contain a carbon source, a nitrogen source and minerals.

本発明に係る微生物の培養において使用できる炭素源としては、使用する菌株が資化できる炭素源であれば特に制限されない。具体的には、微生物の資化性を考慮して、グルコン酸、カプリン酸、アジピン酸、リンゴ酸、クエン酸、酢酸フェニル、酢酸、乳酸、コハク酸、グルクロン酸、ピルピン酸等の有機酸類およびその塩、ヘキサデカン等の炭化水素、麦、米等の天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、糖類などが挙げられる。上記炭素源は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。上記炭素源は、１種または２種以上選択して使用することができる。 The carbon source that can be used in culturing the microorganism according to the present invention is not particularly limited as long as it can be assimilated by the strain used. Specifically, considering the assimilation of microorganisms, organic acids such as gluconic acid, capric acid, adipic acid, malic acid, citric acid, phenyl acetate, acetic acid, lactic acid, succinic acid, glucuronic acid, and pyrupic acid, and Its salts, hydrocarbons such as hexadecane, natural products such as barley and rice, alcohols such as glycerol, methanol and ethanol, and sugars. The carbon source is appropriately selected in consideration of assimilation by the microorganisms to be cultured. One or more of the above carbon sources can be selected and used.

本発明に係る微生物の培養において使用できる窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素源；アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩、尿素等の無機窒素源などが挙げられる。上記窒素源は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。上記窒素源は、１種または２種以上選択して使用することができる。 Nitrogen sources that can be used in culturing microorganisms according to the present invention include meat extract, fish extract, peptone, polypeptone, tryptone, yeast extract, malt extract, soybean hydrolyzate, soybean powder, casein, milk casein, casamino acid, and glycine. , glutamic acid, various amino acids such as aspartic acid, organic nitrogen sources such as corn steep liquor, other animal, plant, and microbial hydrolysates; ammonia, ammonium salts such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, nitrates such as sodium nitrate, Examples include nitrites such as sodium nitrite and inorganic nitrogen sources such as urea. The nitrogen source is appropriately selected in consideration of assimilation by the microorganisms to be cultured. One or more of the above nitrogen sources can be selected and used.

本発明に係る微生物の培養において使用できる無機物としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などの、リン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、塩化物等のハロゲン化物などが挙げられる。上記無機物は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記無機物を１種または２種以上選択して使用することができる。また、培地中に、必要に応じて、界面活性剤等を添加してもよい。 Inorganic substances that can be used in culturing microorganisms according to the present invention include phosphates, hydrochlorides, sulfates, acetates, carbonates and chlorides of magnesium, manganese, calcium, sodium, potassium, copper, iron and zinc. and the like. The inorganic substance is appropriately selected in consideration of the assimilation by the microorganisms to be cultured. Also, one or more of the above inorganic substances can be selected and used. Moreover, a surfactant or the like may be added to the medium, if necessary.

本発明に係る微生物の培養は、通常の方法によって行える。例えば、微生物の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で、微生物を培養する。前者の場合には、微生物の培養は、振盪あるいは通気攪拌などによって行われる。また、微生物を連続的にまたはバッチで培養してもよい。培養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本発明に係る微生物が増殖できる条件であれば特に制限されず、培養する微生物の種類に応じて適宜選択されうる。培養温度は、通常２０～４２℃、好ましくは３５～４０℃である。また、培養に適当な培地のｐＨは、特に制限されないが、好ましくは５～１１であり、より好ましくは６～１０である。さらに、培養時間は、特に制限されず、培養する微生物の種類、培地の量、培養条件などによって異なる。通常は、培養時間は、好ましくは１６～４８時間、より好ましくは２０～３０時間である。 Cultivation of microorganisms according to the present invention can be carried out by conventional methods. For example, microorganisms are cultured under aerobic or anaerobic conditions, depending on the type of microorganism. In the former case, culturing of microorganisms is carried out by shaking or aeration stirring. Microorganisms may also be cultured continuously or in batches. The culture conditions are appropriately selected depending on the composition of the medium and the culture method, and are not particularly limited as long as the conditions allow the microorganisms according to the present invention to proliferate, and can be appropriately selected according to the type of microorganisms to be cultured. The culture temperature is usually 20-42°C, preferably 35-40°C. In addition, although the pH of the medium suitable for culture is not particularly limited, it is preferably 5-11, more preferably 6-10. Furthermore, the culture time is not particularly limited, and varies depending on the type of microorganism to be cultured, the amount of culture medium, culture conditions, and the like. Usually, the culture time is preferably 16-48 hours, more preferably 20-30 hours.

本発明に係る微生物は、後述の実施例において示すように、生体内における活性イオウ分子のサプライヤーである。活性イオウ分子は、高い抗酸化能を示す生体内物質であることが知られている。そのため、本発明に係る微生物を含む抗酸化用組成物は、対象における酸化ストレスを低減することができる。 The microorganism according to the present invention is a supplier of active sulfur molecules in vivo, as shown in the examples below. Active sulfur molecules are known to be endogenous substances that exhibit high antioxidant capacity. Therefore, the antioxidant composition containing the microorganisms of the present invention can reduce oxidative stress in subjects.

すなわち、一実施形態において、本発明に係る抗酸化用組成物は、酸化ストレス低減のために使用される。他の一実施形態において、本発明に係る抗酸化用組成物は、酸化ストレスに起因する疾患または症状の予防、治療または改善のために使用される。 Thus, in one embodiment, the antioxidant composition according to the present invention is used to reduce oxidative stress. In another embodiment, the antioxidant composition of the present invention is used for prevention, treatment or amelioration of diseases or conditions caused by oxidative stress.

本発明に係る抗酸化用組成物の対象は、哺乳動物であり、好ましくは酸化ストレスに起因する疾患または症状を示す、または前記酸化ストレスに起因する疾患または症状の可能性がある哺乳動物である。ここで、哺乳動物は、ヒト、サル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン等の霊長類、ならびにマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラクダ、ヤギなどの非ヒト哺乳動物双方を包含する。これらのうち、対象は、好ましくはヒトである。 The subject of the antioxidant composition according to the present invention is a mammal, preferably a mammal exhibiting a disease or symptom caused by oxidative stress or possibly having a disease or symptom caused by said oxidative stress. . Here, mammals include primates such as humans, monkeys, gorillas, chimpanzees and orangutans, and non-human species such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, pigs, cows, horses, sheep, camels and goats. It includes both human mammals. Among these, the subject is preferably human.

酸化ストレスに起因する疾患または症状としては、がん、神経障害、動脈硬化（虚血性心疾患、心筋梗塞、脳虚血、脳梗塞など）、糖尿病、肝炎、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、ベーチェット病などの組織障害、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病など）、喫煙などが原因の肺疾患、白内障、肩凝り、冷え性、しわ形成、弾力低下などの皮膚の老化、皮膚の黒化、シミ、ソバカスなどの色素沈着が挙げられる。 Diseases or symptoms caused by oxidative stress include cancer, neuropathy, arteriosclerosis (ischemic heart disease, myocardial infarction, cerebral ischemia, cerebral infarction, etc.), diabetes, hepatitis, chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis, Tissue disorders such as Behçet's disease, neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea), lung diseases caused by smoking, cataracts, stiff shoulders, sensitivity to cold, wrinkles, skin aging such as decreased elasticity, skin aging pigmentation such as darkening of skin, age spots, and freckles.

本発明に係る抗酸化用組成物は、所望の効果を発揮するのに十分な量（すなわち、有効量）の本発明に係る微生物またはその培養物を含む。 The antioxidant composition according to the present invention contains a sufficient amount (that is, an effective amount) of the microorganism according to the present invention or its culture to exhibit the desired effect.

本発明に係る抗酸化用組成物は、本発明に係る微生物またはその培養物そのものでもよく、他の成分をさらに含んでもよい。他の成分としては、シスチンが挙げられる。本発明に係る微生物またはその培養物は、後述の実施例において示すように、他の硫黄含有化合物（例えば、メチオニン、システイン）と比べて、基質としてシスチンを用いることにより、システインパースルフィドを顕著に生成することができる。なお、シスチンは、本発明に係る抗酸化用組成物と併用されて投与されてもよい。 The antioxidant composition according to the present invention may be the microorganism according to the present invention or its culture itself, and may further contain other ingredients. Other components include cystine. As shown in the examples below, the microorganisms or cultures thereof according to the present invention significantly increase cysteine persulfide by using cystine as a substrate compared to other sulfur-containing compounds (e.g., methionine, cysteine). can be generated. In addition, cystine may be administered in combination with the antioxidant composition according to the present invention.

本発明に係る抗酸化用組成物は、さらに製剤化のために許容されうる添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤または非経口製剤として調製されてもよい。抗酸化用組成物は、簡易性の観点から、好ましくは経口製剤である。製剤化のために許容されうる添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、結合剤、増粘剤、分散剤、懸濁化剤、崩壊剤、制菌剤、界面活性剤などを挙げることができる。剤形は特に制限されず、適宜設定すればよいが、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤、溶液、懸濁液、乳濁液、ローション剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、貼付剤などである。 The antioxidant composition according to the present invention may be prepared as an oral preparation or a parenteral preparation according to a conventional method, in combination with additives acceptable for formulation. The antioxidant composition is preferably an oral formulation from the viewpoint of simplicity. Additives acceptable for formulation include, for example, excipients, stabilizers, preservatives, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners, colorants, flavors, buffers, antioxidants, pH Modifiers, binders, thickeners, dispersing agents, suspending agents, disintegrating agents, bacteriostatic agents, surfactants and the like can be mentioned. The dosage form is not particularly limited and may be set as appropriate. They include injections, infusions, external preparations, suppositories, patches, and the like.

本発明に係る抗酸化用組成物は、飲食品の形態であってもよい。 The antioxidant composition according to the present invention may be in the form of food or drink.

飲食品は、本発明に係る抗酸化用組成物に安定剤等の慣用の添加成分を加えて飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を、それらにさらに配合して調製したもの、液状、半液体状もしくは固体状にしたもの、ペースト状にしたもの、または、一般の飲食品へ本発明に係る抗酸化用組成物を添加したものであってもよい。 The food and drink are those prepared as food and drink by adding conventional additives such as stabilizers to the antioxidant composition according to the present invention, various proteins, sugars, fats, trace elements, vitamins, etc. It may be one prepared by blending, one in liquid, semi-liquid or solid form, one in paste form, or one in which the antioxidant composition according to the present invention is added to general food and drink. .

本明細書において、「飲食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物などが経口摂取可能な形態のものであれば特に制限はなく、その形態も液状物（溶液、懸濁液、乳濁液など）、半液体状物、粉末、または固体成形物のいずれのものであってもよい。このため飲食品は、例えば飲料の形態であってもよく、また、サプリメントのような栄養補助食品の錠剤形態であってもよい。 As used herein, the term “food and drink” refers to anything other than pharmaceuticals, and is not particularly limited as long as it is in a form that can be orally ingested by mammals. emulsions, etc.), semi-liquids, powders, or solid formulations. For this reason, the food and drink may be in the form of, for example, a beverage, or may be in the form of tablets of dietary supplements such as supplements.

飲食品として具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品などの水産加工品；畜肉ハム・ソーセージなどの畜産加工品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品；栄養食品などが挙げられる。 Specific examples of foods and drinks include instant noodles, retort foods, canned foods, microwave foods, instant soups/miso soups, instant foods such as freeze-dried foods; soft drinks, fruit juice drinks, vegetable drinks, soy milk drinks, and coffee. Beverages such as beverages, tea drinks, powdered drinks, concentrated drinks, nutritional drinks, and alcoholic beverages; Flour products such as bread, pasta, noodles, cake mixes, fried chicken powder, and bread crumbs; candies, caramel, chewing gum, chocolate, cookies, Confectionery such as biscuits, cakes, pies, snacks, crackers, Japanese sweets, and desserts; sauces, processed tomato seasonings, flavor seasonings, cooking mixes, sauces, dressings, sauces, curry and stew ingredients, etc. Seasonings; fats and oils such as processed oils, butter, margarine, and mayonnaise; dairy products such as milk drinks, yogurts, lactic acid beverages, ice creams and creams; Processed livestock products such as hams and sausages; processed agricultural products such as canned agricultural products, jams, marmalades, pickles, boiled beans and cereals; frozen foods;

本明細書において「飲食品」には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、または、病者用食品のような分類のものも包含される。さらに「飲食品」という用語は、ヒト以外の哺乳動物を対象として使用される場合には、飼料を含む意味で用いられうる。 In this specification, "food and drink" includes categories such as health food, functional food, food for specified health use, nutritional supplement, food with disease risk reduction labeling, and food for sick people. subsumed. Furthermore, the term "food and drink" can be used to include feed when used for mammals other than humans.

本発明に係る飲食品においては、他の機能を有する成分をさらに添加してもよい。また例えば、日常生活で摂取する食品、健康食品、機能性食品、サプリメント（例えば、カルシウム、マグネシウム等のミネラル類、ビタミンＫ等のビタミン類を１種以上含有する食品）に本発明の有効成分を配合することにより、本発明による効果に加えて、他の成分に基づく機能を併せ持つ飲食品を提供することができる。 In the food and drink according to the present invention, ingredients having other functions may be added. Further, for example, the active ingredient of the present invention is added to foods, health foods, functional foods, and supplements (for example, foods containing one or more kinds of minerals such as calcium and magnesium, and vitamins such as vitamin K) that are ingested in daily life. By blending, in addition to the effects of the present invention, it is possible to provide a food or drink having functions based on other ingredients.

＜活性イオウ分子産生促進用組成物および活性イオウ分子の製造方法＞
本発明の一形態は、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を含む、活性イオウ分子産生促進用組成物である。 <Composition for Promoting Production of Active Sulfur Molecules and Method for Producing Active Sulfur Molecules>
One aspect of the present invention is the genera Anaerotruncus, Ruminococcus, Dorea, Clostridium, Faecalicatena, Blautia and Coprococcus. ) A composition for promoting the production of active sulfur molecules, comprising at least one microorganism selected from the group consisting of the genus or a culture thereof.

本発明の一形態は、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物と、シスチンとを接触させることを含む、活性イオウ分子の製造方法である。 One aspect of the present invention is the genera Anaerotruncus, Ruminococcus, Dorea, Clostridium, Faecalicatena, Blautia and Coprococcus. ) A method for producing active sulfur molecules, comprising contacting at least one microorganism selected from the group consisting of genera or a culture thereof with cystine.

これらの形態において、「微生物」および「培養物」は、抗酸化用組成物において説明した事項と同じであるため、説明を省略する。 In these forms, "microorganisms" and "cultures" are the same as those explained in the antioxidant composition, so the explanation is omitted.

本発明に係る微生物またはその培養物は、後述の実施例において示すように、他の硫黄含有化合物（例えば、メチオニン、システイン）と比べて、基質としてシスチンを用いることにより、システインパースルフィドを顕著に生成することができる。そのため、本発明に係る活性イオウ分子産生促進用組成物は、好ましくはシスチンをさらに含む、またはシスチンと併用される。 As shown in the examples below, the microorganisms or cultures thereof according to the present invention significantly increase cysteine persulfide by using cystine as a substrate compared to other sulfur-containing compounds (e.g., methionine, cysteine). can be generated. Therefore, the composition for promoting active sulfur molecule production according to the present invention preferably further contains cystine or is used in combination with cystine.

本発明に係る活性イオウ分子の製造方法において、本発明に係る微生物またはその培養物とシスチンとを接触させる方法は、特に制限されず、例えばシスチンを含む培地で微生物を培養する方法、微生物を培養した培養液とシスチンとを混合する方法、培養液を遠心分離して得られる上清とシスチンとを混合する方法、培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣、残渣からの精製物または残渣の乾燥物とを混合する方法などが挙げられる。 In the method for producing an active sulfur molecule according to the present invention, the method for bringing the microorganism according to the present invention or its culture into contact with cystine is not particularly limited. A method of mixing the culture solution and cystine obtained by centrifuging the culture solution, a method of mixing the supernatant obtained by centrifuging the culture solution and cystine, a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution, a purified product from the residue, or For example, a method of mixing the residue with a dried product can be used.

本発明に係る活性イオウ分子の製造方法において、製造条件は特に制限されず、適宜選択することができる。例えば、微生物とシスチンとを接触させる場合、培養温度、培養時間などは、使用する微生物に応じて適宜選択される。また、培養物とシスチンとを接触させる場合、インキュベーション温度、インキュベーション時間などは、使用した微生物に従って適宜選択される。 In the method for producing an active sulfur molecule according to the present invention, production conditions are not particularly limited and can be appropriately selected. For example, when a microorganism is brought into contact with cystine, the culture temperature, culture time, etc. are appropriately selected according to the microorganism used. When the culture is brought into contact with cystine, the incubation temperature, incubation time, etc. are appropriately selected according to the microorganism used.

本発明に係る活性イオウ分子産生促進用組成物および活性イオウ分子の製造方法により得られる活性イオウ分子は、抗酸化活性を持つ医薬品、合成用の実験試薬などの用途で使用することができる。 Active sulfur molecules obtained by the composition for promoting production of active sulfur molecules and the method for producing active sulfur molecules according to the present invention can be used in applications such as pharmaceuticals having antioxidant activity and experimental reagents for synthesis.

以下に具体例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。なお、特記しない限り、作業は室温（２５℃）で行った。 The present invention will be described below using specific examples, but the present invention is not limited to these examples. In addition, unless otherwise specified, the operation was performed at room temperature (25° C.).

試験例１
＜実験モデルおよび対象の詳細＞
（細菌株および培養条件）
大腸菌は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）から購入した。他の細菌株は、微生物材料開発室（ＪＣＭ）から購入した。表１に、使用した細菌株に関する情報を示す。全ての細菌は、嫌気性条件下、３７℃でＧＡＭブロス（日水製薬株式会社）中で増殖させた。細菌増殖を測定するために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＯＤ_６００測定を行った。 Test example 1
<Details of the experimental model and subject>
(bacterial strains and culture conditions)
E. coli was purchased from the National BioResource Project (NBRP). Other bacterial strains were purchased from the Microbial Materials Development Office (JCM). Table 1 provides information on the bacterial strains used. All bacteria were grown in GAM broth (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at 37° C. under anaerobic conditions. To measure bacterial growth, OD ₆₀₀ measurements were performed using a SpectraMax iD3 (Molecular Devices).

（マウス）
全てのマウスは、日本クレア株式会社から購入した。ジャームフリー（ＧＦ）ＩＱＩマウスはビニールアイソレーターで飼育し、γ線滅菌したＣＥ－２飼料（日本クレア株式会社）を与えた。一方、ｅｘＧＦおよびコンベンショナルのＣ５７ＢＬ／６マウスは、従来の条件下で飼育され、ＣＥ－２飼料を与えられた。１２匹の６週齢ＧＦマウスを２群に分け、一方の群（６匹の雌）は、ビニールアイソレーターで４週間飼育したが、もう一方の群（６匹の雌）は腸内微生物叢を回復させるために通常の条件下でケージに４週間置いた（ｅｘＧＦマウス）。すべてのマウスは、慶應大学の動物施設で飼育した。Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＰＦマウス）は、筑波大学の動物施設で、ＳＰＦ条件下で飼育し、γ線滅菌したＭＦ飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）を与えた。使用した全てのマウスは雌（８～１０週齢）であり、実験手順で使用する前に少なくとも１週間順応させた。すべてのマウスを、１２時間の明暗サイクル下、２１～２２℃で飼育した。すべての実験は、日本学術会議によって発行された「動物実験の適切な実施のためのガイドライン」に従って行われた。 (mouse)
All mice were purchased from CLEA Japan, Inc. Germ-free (GF) IQI mice were housed in vinyl isolators and fed with γ-ray sterilized CE-2 diet (CLEA Japan, Inc.). On the other hand, exGF and conventional C57BL/6 mice were housed under conventional conditions and fed a CE-2 diet. Twelve 6-week-old GF mice were divided into two groups, one group (6 females) was housed in a vinyl isolator for 4 weeks, while the other group (6 females) had gut microbiota. Caged for 4 weeks under normal conditions for recovery (exGF mice). All mice were bred at the Keio University animal facility. Specific pathogen-free (SPF) C57BL/6 mice (SPF mice) were bred under SPF conditions in the animal facility of University of Tsukuba and fed with γ-ray sterilized MF diet (Oriental Yeast Co., Ltd.). All mice used were female (8-10 weeks old) and were acclimated for at least one week prior to use in experimental procedures. All mice were housed at 21-22°C under a 12 hour light/dark cycle. All experiments were performed in accordance with the "Guidelines for the Proper Conduct of Animal Experiments" published by the Science Council of Japan.

［動物への処置］
６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、抗生物質（１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク株式会社）および０．５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン（富士フイルム和光純薬株式会社））を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを２週間与え、その後、それらの血液および糞便を収集した。５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、抗生物質（１ｇ／Ｌのアンピシリンおよび０．５ｇ／Ｌのバンコマイシン）を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを３週間与えた。投与期間中、マウスに９０ｍｇのＬ－シスチン（東京化学工業株式会社）を脱イオン水で最後の１週間は連日経口投与し、その後、それらの血液を採取した。５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、バンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）、ストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社）（５ｇ／Ｌ）、またはエリスロマイシン（ナカライテスク株式会社）（０．２ｇ／Ｌ）を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを３週間与えた。投与期間中、最後の１週間は、ＣＥ－２飼料を、３．７５％シスチンを含むＣＥ－２に変更し、糞便を採取した。採取した血液から血漿を４℃で、８００×ｇで１５分間遠心分離し、ＲＳＳレベルの測定に用いた。採取した糞便サンプルをＲＳＳおよび１６Ｓ分析に用いた。 [Treatment of animals]
Six-week-old C57BL/6 mice were given water containing antibiotics (1 mg/mL ampicillin (Nacalai Tesque, Inc.) and 0.5 mg/mL vancomycin (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) or antibiotics. They were given access to clean water for 2 weeks after which their blood and feces were collected. Five week old C57BL/6 mice were given access to water with or without antibiotics (1 g/L ampicillin and 0.5 g/L vancomycin) for 3 weeks. During the administration period, mice were orally administered 90 mg of L-cystine (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) in deionized water every day for the last week, after which their blood was collected. Water containing vancomycin (0.5 g/L), streptomycin (Nacalai Tesque, Inc.) (5 g/L), or erythromycin (Nacalai Tesque, Inc.) (0.2 g/L) was added to 5-week-old C57BL/6 mice. or given access to antibiotic-free water for 3 weeks. During the last week of administration, the CE-2 diet was changed to CE-2 containing 3.75% cystine, and feces were collected. Plasma from the collected blood was centrifuged at 800×g for 15 minutes at 4° C. and used to measure RSS levels. Collected fecal samples were used for RSS and 16S analysis.

［ＣｏｎＡ誘発肝炎モデル］
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ（ＩＶ型）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）（１５ｍｇ／ｋｇ）を８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に静脈内注射した。注射の１２時間後、肝臓と血液とを採取した。過酸化脂質（マロンジアルデヒド（ＭＤＡ））アッセイのために、肝臓組織を採取した。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性アッセイのために血清を採取した。肝臓組織中のＭＤＡのレベルを、製造業者の指示に従って、脂質過酸化アッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して決定した。ＡＬＴのレベルは、富士ドライケム ３５００マシン（富士フイルム株式会社）を用いた富士ドライケムスライドを用いて測定した。 [ConA-induced hepatitis model]
Concanavalin A (ConA (type IV), Sigma-Aldrich) (15 mg/kg) was injected intravenously into the tail vein of 8-week-old C57BL/6 mice. Twelve hours after injection, liver and blood were collected. Liver tissue was collected for lipid peroxide (malondialdehyde (MDA)) assay. Serum was collected for serum alanine aminotransferase (ALT) activity assay. Levels of MDA in liver tissue were determined using a lipid peroxidation assay kit (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. ALT levels were measured using a Fuji Dry Chem slide with a Fuji Dry Chem 3500 machine (Fuji Film Co., Ltd.).

［糞便細菌培養］
糞便サンプルを、嫌気性チャンバー（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社）中、１ｍＭの硫黄含有アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、またはＬ－シスチン）（いずれも東京化成工業株式会社）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（ナカライテスク株式会社）または上記硫黄含有アミノ酸を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中でホモジナイズした。次いで、糞便ホモジネート（１０ｍｇ／ｍＬ）を、３７℃で６０分間、振盪しながら嫌気培養した。培養後、サンプルを４℃で、１５分間１１００×ｇで遠心分離し、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために上清を収集した。 [Fecal bacteria culture]
Fecal samples were treated with HEPES buffer (pH 7.0) containing 1 mM sulfur-containing amino acid (L-methionine, L-cysteine, or L-cystine) (both Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) in an anaerobic chamber (Sheldon Manufacturing). 5) (Nacalai Tesque, Inc.) or homogenized in HEPES buffer (pH 7.5) containing no sulfur-containing amino acid. Fecal homogenates (10 mg/mL) were then anaerobically incubated at 37° C. for 60 minutes with shaking. After incubation, samples were centrifuged at 1100×g for 15 minutes at 4° C. and supernatants were collected for LC-ESI-MS/MS analysis.

［単一細菌培養］
一晩培養した後、１１００×ｇで２０分間、４℃での遠心分離を用いて細菌をペレット化した。上清を除去し、細菌ペレットを、１ｍＭの硫黄含有アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、またはＬ－シスチン）を補充した１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。各サンプルを３７℃で振盪しながら６０分間培養した。培養後、サンプルを１１００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、次いで、上清をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために収集した。 [Single bacterial culture]
After overnight culture, the bacteria were pelleted using centrifugation at 1100 xg for 20 minutes at 4°C. The supernatant was removed and the bacterial pellet was resuspended in 100 mM HEPES buffer (pH 7.5) supplemented with 1 mM sulfur-containing amino acids (L-methionine, L-cysteine, or L-cystine). Each sample was incubated at 37°C with shaking for 60 minutes. After incubation, samples were centrifuged at 1100×g for 20 min at 4° C., then supernatants were collected for LC-ESI-MS/MS analysis.

［糞便中の高分子量（ＨＭＷ）画分］
糞便サンプルはプロテイナーゼ阻害剤を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でホモジナイズし、次いで４℃で１０分間、９０００×ｇで遠心分離した。ＨＭＷ画分を得るために、上清をＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ（商標）Ｇ－２５カラム（排除限界、５０００分子量、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に適用した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭシスチン、およびＨＭＷ画分（１５μＬ）を含有する反応混合物（５０μＬ）を３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物をメタノールで脱タンパクし、１４０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために得た。 [High molecular weight (HMW) fraction in feces]
Fecal samples were homogenized in 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing proteinase inhibitors and then centrifuged at 9000 xg for 10 minutes at 4°C. To obtain the HMW fraction, the supernatant was applied to a PD MiniTrap™ G-25 column (exclusion limit, 5000 molecular weight, GE Healthcare). A reaction mixture (50 μL) containing 50 mM HEPES buffer (pH 7.5), 0.5 mM cystine, and HMW fraction (15 μL) was incubated at 37° C. for 30 minutes. After incubation, the mixture was deproteinized with methanol and centrifuged at 14000 xg for 10 minutes at 4°C. Supernatants were obtained for LC-ESI-MS/MS analysis.

［細菌タンパク質の精製と酵素活性アッセイ］
２４時間の培養後、細菌を、４℃で２０分間、１１００×ｇでの遠心分離を使用してペレット化した。上清を除去し、０．１ｍｍおよび３．０ｍｍのジルコニアビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて、シェイクマスターネオ細胞破壊装置（株式会社バイオメディカルサイエンス）中で、１％プロテアーゼ阻害剤およびＤＮａｓｅ Ｉ（２ｋＵ／ｍＬ）を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で細菌ペレットをホモジナイズした。ホモジネートを１００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、タンパク質を含む可溶性画分をＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐＴＭ Ｇ－２５カラムにロードしてＨＭＷ画分を得、続いてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒユニット（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（タカラバイオ株式会社）を用いて測定した。 [Purification of bacterial protein and enzyme activity assay]
After 24 hours of culture, bacteria were pelleted using centrifugation at 1100 xg for 20 minutes at 4°C. The supernatant was removed and 1% protease inhibitors and DNase I ( The bacterial pellet was homogenized in 100 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 2 kU/mL). After centrifugation of the homogenate at 10000×g for 5 min at 4° C., the protein-containing soluble fraction was loaded onto a PD MiniTrap™ G-25 column to obtain the HMW fraction followed by an Amicon Ultra Centrifugal Filter unit (Merck). was concentrated using Protein concentration was measured using a BCA protein assay kit (Takara Bio Inc.).

ＨＭＷ画分からの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＬ－シスチン、および細菌タンパク質（３０μｇ）の混合物を、３７℃で３０分間インキュベーションした。アミノオキシ酢酸（ＡＯＡＡ，東京化成工業株式会社）の阻害効果を試験するために、反応混合物に１００μＭのＡＯＡＡを添加してから１５分後にシスチンを添加した。インキュベーション後、混合物をメタノールで脱タンパクし、１４０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために得た。 A mixture of 100 mM HEPES buffer (pH 7.5), 1 mM L-cystine, and bacterial protein (30 μg) from the HMW fraction was incubated at 37° C. for 30 minutes. To test the inhibitory effect of aminooxyacetic acid (AOAA, Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.), cystine was added 15 min after adding 100 μM AOAA to the reaction mixture. After incubation, the mixture was deproteinized with methanol and centrifuged at 14000 xg for 10 minutes at 4°C. Supernatants were obtained for LC-ESI-MS/MS analysis.

［ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析］
ＲＳＳを含む硫黄求核剤のレベルを、β－（４－ヒドロキシフェニル）エチルヨードアセトアミド（ＨＰＥ－ＩＡＭ，コスモ・バイオ株式会社）を用いたＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いて測定した。血漿サンプルを５ｍＭのＨＰＥ－ＩＡＭと３０分間３０℃で反応させ、続いてメタノールを添加し、遠心分離によって上清を収集した。糞便サンプルをメタノールでホモジナイズし、遠心分離によって得られた上清を３０℃で３０分間ＨＰＥ－ＩＡＭと反応させた。同様に、培養した***物からの上清を３０℃で３０分間ＨＰＥ－ＩＡＭと反応させた。これらの反応溶液を、既知量の同位体標識内部標準を含有する０．１％ギ酸（ナカライテスク株式会社）で４倍に希釈し、次いでＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いて分析して、硫黄求核剤のレベルを決定した（Akaike et al. (2017). Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics. Nat Commun 8, 1177；Akiyama et al. (2019). Environmental Electrophile-Mediated Toxicity in Mice Lacking Nrf2, CSE, or Both. Environ Health Perspect 127, 67002）。 [LC-ESI-MS/MS analysis]
Levels of sulfur nucleophiles, including RSS, were measured using LC-ESI-MS/MS analysis with β-(4-hydroxyphenyl)ethyliodoacetamide (HPE-IAM, Cosmo Bio Inc.). Plasma samples were reacted with 5 mM HPE-IAM for 30 minutes at 30° C., followed by the addition of methanol and the supernatant collected by centrifugation. A stool sample was homogenized with methanol, and the supernatant obtained by centrifugation was reacted with HPE-IAM at 30° C. for 30 minutes. Similarly, supernatants from cultured excreta were reacted with HPE-IAM for 30 minutes at 30°C. These reaction solutions were diluted 4-fold with 0.1% formic acid (Nacalai Tesque, Inc.) containing a known amount of isotope-labeled internal standard, and then analyzed using LC-ESI-MS/MS, Levels of sulfur nucleophiles were determined (Akaike et al. (2017). Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics. Nat Commun 8, 1177; Akiyama et al. (2019). Environmental Electrophile-Mediated Toxicity in Mice Lacking Nrf2, CSE, or Both. Environ Health Perspect 127, 67002).

［１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のシーケンシングおよび解析］
細菌のＤＮＡを、ＭａｇＬＥＡＤ １２ ｇＣ核酸抽出装置（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社）を用いて、Kimizuka et al. (2021). Amino Acid-Based Diet Prevents Lethal Infectious Diarrhea by Maintaining Body Water Balance in a Murine Citrobacter rodentium Infection Model. Nutrients 13に記載の方法に従い糞便から抽出した。各ＤＮＡサンプルを、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３およびＶ４領域に特異的な以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：フォワード、５’－ＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＧＣＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＣＡＧＴＡＣＧＧＧＮＧＣＷＣＡＧ－３’（配列番号１）；リバース、５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（配列番号２）。ＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により精製し、アダプターをＮｅｘｔｅｒａ ＸＴインデックスキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いたＰＣＲにより付加した。配列決定は、ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて行った。配列決定データを、ＱＩＩＭＥ２バージョン２０２０．１１（Bolyen et al. (2019). Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol 37, 852-857）によって分析した。ＱＩＩＭＥ２（https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200，アクセス日：２０２１年５月２７日）のＣｕｔａｄａｐｔプラグインを使用して、生配列からプライマー領域をトリミングした。プライマー領域を含まない配列をＤＡＤＡ２アルゴリズム（Callahan et al. (2016). DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods 13, 581-583）によって処理して、アンプリコン配列変異体（ＡＳＶ）配列の構築物を得た。ＳＩＬＶＡデータベース（バージョン１３８）（Callahan et al., 2016）に基づいて分類を割り当てるために、ＢＬＡＳＴ（Pruesse et al. (2007). SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research 35, 7188-7196. ）を使用した。フィーチャーテーブル（Weiss et al. (2017). Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome 5）を用いて高品質配列（１３ ７００）をランダムに選択した。 [16S rRNA gene sequencing and analysis]
Kimizuka et al. (2021). Amino Acid-Based Diet Prevents Lethal Infectious Diarrhea by Maintaining Body Water Balance in a Murine Citrobacter It was extracted from feces according to the method described in rodentium Infection Model. Nutrients 13. Each DNA sample was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the following primers specific for the V3 and V4 regions of the 16S rRNA gene: forward, 5′-GTCGTCGGCAGGCGTCAGTCAGTGTAAGACAGTAAGACAGTACGGGNGCWCAG-3′ (SEQ ID NO: 1); 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′ (SEQ ID NO: 2). PCR products were purified with AMPure XP Beads (Beckman Coulter) and adapters were added by PCR using the Nextera XT index kit (Illumina). Sequencing was performed using the MiSeq System (Illumina). Sequencing data were analyzed by QIIME2 version 2020.11 (Bolyen et al. (2019). Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol 37, 852-857). Primer regions were trimmed from raw sequences using the Cutadapt plugin for QIIME2 (https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200, accessed May 27, 2021). Sequences without primer regions were processed by the DADA2 algorithm (Callahan et al. (2016). DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods 13, 581-583) to generate amplicon sequence variants (ASV ) to obtain a construct of the sequence. To assign classifications based on the SILVA database (version 138) (Callahan et al., 2016), BLAST (Pruesse et al. (2007). SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research 35, 7188-7196.) was used. High quality sequences (13 700) were randomly selected using a feature table (Weiss et al. (2017). Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome 5).

［ＤＮＡ抽出と定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）］
細菌ＤＮＡの抽出および定量は、Ishizuka et al. (2012). Effects of administration of Bifidobacterium animalis subsp. lactis GCL2505 on defecation frequency and bifidobacterial microbiota composition in humans. Journal of Bioscience and Bioengineering 113, 587-591に記載の方法に従って行った。次のユニバーサルプライマー：フォワード、５’－ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ－３’（配列番号３）、およびリバース、５’－ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴ－３’（配列番号４）（Nadkarni et al. (2002). Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology 148, 257-266）を用いて、糞便中の総細菌数をｑＰＣＲにより分析した。ｑＰＣＲはＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）（タカラバイオ株式会社）を用いたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、以下のパラメーターで行った：９５℃で３０秒間の単一サイクル、次いで９５℃で５秒間の３５サイクル、および６０℃で３０秒間。 [DNA extraction and quantitative PCR (qPCR)]
Bacterial DNA extraction and quantification were performed according to the method described in Ishizuka et al. (2012). Effects of administration of Bifidobacterium animalis subsp. lactis GCL2505 on defecation frequency and bifidobacterial microbiota composition in humans. followed. The following universal primers: forward, 5'-TCCTACGGAGGCAGCAGT-3' (SEQ ID NO: 3), and reverse, 5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGT-3' (SEQ ID NO: 4) (Nadkarni et al. (2002). Determination of bacterial load by real). Total bacterial counts in feces were analyzed by qPCR using a -time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology 148, 257-266). qPCR was performed by StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) using TB Green Premix Ex Taq™ (Takara Bio Inc.) with the following parameters: at 95°C A single cycle of 30 seconds, then 35 cycles of 95° C. for 5 seconds and 60° C. for 30 seconds.

［定量化と統計解析］
統計分析を、ｕｎｐａｉｒｅｄスチューデントのｔ検定、クラスカル・ウォリス検定、およびテューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）で行った。 [Quantification and statistical analysis]
Statistical analyzes were performed with GraphPad Prism v.1 using one-way ANOVA with unpaired Student's t-test, Kruskal-Wallis test, and Tukey's multiple comparison test. 9.2.0 (GraphPad Software).

＜結果＞
１．腸内細菌は宿主における活性イオウ分子のサプライヤーである
ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）および抗生物質処理ＳＰＦマウス（Ａｂｘマウス）における血漿中活性イオウ分子濃度を比較した結果を図１Ａに示す。 <Results>
1. Enteric Bacteria Are Suppliers of Active Sulfur Molecules in the Host FIG. 1A shows the results of comparing plasma active sulfur molecule concentrations in SPF mice (non-antibiotic-administered) and antibiotic-treated SPF mice (Abx mice).

図１Ａに示すように、Ａｂｘマウスでは、活性イオウ分子（システインパースルフィドおよびグルタチオンパースルフィド）の血漿中濃度が減少したことが分かる。 As shown in FIG. 1A, plasma concentrations of active sulfur molecules (cysteine persulfide and glutathione persulfide) were found to be decreased in Abx mice.

次に、ＧＦマウスおよびｅｘＧＦマウスにおける血漿中活性イオウ分子濃度を比較した結果を図１Ｂに示す。 Next, FIG. 1B shows the result of comparing the active sulfur molecule concentrations in plasma between GF mice and exGF mice.

図１Ｂに示すように、ｅｘＧＦマウスでは、活性イオウ分子（システインパースルフィドおよびグルタチオンパースルフィド）の血漿中濃度が顕著に増加したことが分かる。 As shown in FIG. 1B, exGF mice showed significantly increased plasma concentrations of active sulfur molecules (cysteine persulfide and glutathione persulfide).

以上より、腸内細菌は、宿主生体内における活性イオウ分子の吸収レベルを増加させることが示唆される。 From the above, it is suggested that intestinal bacteria increase the absorption level of active sulfur molecules in the host organism.

ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）の糞便サンプルをメチオニン、システインまたはシスチンの存在下培養した結果を図２Ａに示す。 The results of culturing fecal samples from SPF mice (without antibiotics) in the presence of methionine, cysteine or cystine are shown in FIG. 2A.

図２Ａに示すように、腸内細菌は、シスチンを主要な基質として活性イオウ分子を産生することが分かる。 As shown in FIG. 2A, enterobacteria produce active sulfur molecules using cystine as a major substrate.

次に、ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）およびＡｂｘマウスの糞便からのＨＭＷ画分の精製物とシスチンとを反応させた結果を図２Ｂに示す。 Next, FIG. 2B shows the results of reacting purified HMW fractions from the feces of SPF mice (without administration of antibiotics) and Abx mice with cystine.

図２Ｂに示すように、ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）の糞便からのＨＭＷ画分の精製物とシスチンとを反応させることで、システインパースルフィドが得られた。一方、Ａｂｘマウスの糞便からのＨＭＷ画分の精製物とシスチンとを反応させても、システインパースルフィドがほとんど得られなかった。 As shown in FIG. 2B, cysteine persulfide was obtained by reacting purified HMW fractions from feces of SPF mice (without antibiotic administration) with cystine. On the other hand, almost no cysteine persulfide was obtained when cystine was reacted with the HMW fraction purified from Abx mouse feces.

以上より、腸内細菌は、基質としてシスチンを用いて、酵素的にシステインパースルフィドの産生を行うことが示唆される。 From the above, it is suggested that enterobacteria enzymatically produce cysteine persulfide using cystine as a substrate.

２．腸内細菌由来の活性イオウ分子は酸化ストレス性肝障害に対する保護効果を有する
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与または抗生物質投与）にシスチンを経口投与し、血漿中活性イオウ分子濃度を測定した結果を図３Ａに示す。 2. Active sulfur molecules derived from intestinal bacteria have a protective effect against oxidative stress-induced liver injury Results of oral administration of cystine to C57BL/6 mice (with or without antibiotics) and measurement of plasma active sulfur molecule concentrations is shown in FIG. 3A.

図３Ａに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）における血漿中活性イオウ分子濃度はシスチンの投与により増加する一方、この影響は、抗生物質による処置により強く抑制された。このことは、シスチンから腸内細菌により酵素的に産生された活性イオウ分子が宿主へ移行し、宿主中の活性イオウ分子のレベルへ影響を与えることを示唆する。 As shown in FIG. 3A, plasma active sulfur molecule concentrations in C57BL/6 mice (without antibiotics) were increased by administration of cystine, whereas this effect was strongly suppressed by treatment with antibiotics. This suggests that active sulfur molecules enzymatically produced by intestinal bacteria from cystine are transferred to the host and affect the level of active sulfur molecules in the host.

次に、ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルマウスの血清ＡＬＴレベルおよびＭＤＡレベルを測定した結果を図３Ｂに示す。図３Ｂにおいて、「Ｃｏｎｔ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）に生理食塩水（コントロール）を経口投与した後、ＣｏｎＡを投与したマウス（コントロール群）であり、「Ｃｙｓｔｉｎｅ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）にシスチンを経口投与した後、ＣｏｎＡを投与したマウス（シスチン処理群）である。 Next, FIG. 3B shows the results of measuring serum ALT and MDA levels in ConA-induced hepatitis model mice. In FIG. 3B, "Cont" is C57BL/6 mice (no antibiotic administration) after oral administration of saline (control), followed by administration of ConA mice (control group), "Cystine" is C57BL /6 mice (no antibiotic administration) were orally administered with cystine, and then ConA was administered (cystine treatment group).

図３Ｂに示すように、肝障害のマーカーである血清ＡＬＴのレベルは、ＣｏｎＡ投与後のコントロール群において上昇する一方、シスチン処理群において著しく減少した。肝障害および酸化ストレスマーカーであるＭＤＡの蓄積は、コントロール群と比べて、シスチン処理群において著しく抑制された。このことは、肝細胞の酸化ストレスの減少を示している。 As shown in FIG. 3B, the level of serum ALT, which is a marker of liver injury, increased in the control group after administration of ConA, but decreased significantly in the cystine-treated group. The accumulation of MDA, which is a marker of liver injury and oxidative stress, was significantly suppressed in the cystine-treated group compared to the control group. This indicates a reduction in hepatocyte oxidative stress.

さらに、抗生物質を投与したＣｏｎＡ誘発肝炎モデルマウスの血清ＡＬＴレベルを測定した結果を図３Ｃに示す。図３Ｃにおいて、「Ｃｏｎｔ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質投与）に生理食塩水（コントロール）を経口投与した後、ＣｏｎＡを投与したマウス（コントロール群）であり、「Ｃｙｓｔｉｎｅ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質投与）にシスチンを経口投与した後、ＣｏｎＡを投与したマウス（シスチン処理群）である。 Furthermore, FIG. 3C shows the results of measuring serum ALT levels in ConA-induced hepatitis model mice administered with antibiotics. In FIG. 3C, "Cont" is C57BL/6 mice (antibiotic administration) orally administered with saline (control) and then ConA-administered mice (control group), and "Cystine" is C57BL/ 6 mice (antibiotic-administered) were orally administered with cystine, and then ConA was administered (cystine-treated group).

図３Ｃに示すように、血清ＡＬＴのレベルは、コントロール群およびシスチン処理群で同程度であることが分かる。 As shown in FIG. 3C, serum ALT levels were found to be similar between the control group and the cystine-treated group.

以上より、シスチンの保護効果は、腸内細菌依存であること、すなわちシスチンからの腸内細菌代謝物（例えば、活性イオウ分子）が酸化ストレス性肝障害における保護的な役割を果たすことが示唆される。 Taken together, it is suggested that the protective effect of cystine is dependent on gut bacteria, that is, gut bacterial metabolites (e.g., reactive sulfur molecules) from cystine play a protective role in oxidative stress-induced liver injury. be.

３．ラクノスピラ科およびルミノコッカス科に属する腸内細菌は、高システインパースルフィド産生能を有する
異なるスペクトラムを有する抗生物質を投与したマウスの糞便における活性イオウ分子レベルを測定した結果を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、「Ｃｏｎｔ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）にシスチンを含む飼料を与えたマウスであり、「ＶＣＭ」、「Ｓｔｐ」および「Ｅｒｙ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（それぞれ、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはエリスロマイシン投与）にシスチンを含む飼料を与えたマウスである。 3. Enteric bacteria belonging to the family Lachnospiraceae and Ruminococcaceae have high cysteine persulfide-producing ability FIG. 4A shows the results of measuring the active sulfur molecule level in the feces of mice administered with antibiotics having different spectra. In FIG. 4A, "Cont" is C57BL/6 mice (no antibiotics) fed a diet containing cystine, "VCM", "Stp" and "Ery" are C57BL/6 mice (respectively , vancomycin, streptomycin, or erythromycin) and mice fed a diet containing cystine.

図４Ａに示すように、Ｅｒｙ投与マウスの糞便におけるシステインパースルフィドのレベルは、すべての群のなかで最も高かった。 As shown in Figure 4A, the levels of cysteine persulfide in the feces of Ery-treated mice were the highest of all groups.

１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを用いた腸内細菌叢の組成解析の結果を図４ＢおよびＣに示す。図４ＢおよびＣにおいて、「Ｃｏｎｔ」、「ＶＣＭ」、「Ｓｔｐ」および「Ｅｒｙ」は、図４Ａと同様である。 The results of compositional analysis of gut microbiota using 16S rRNA gene sequencing are shown in Figures 4B and C. In FIGS. 4B and C, "Cont", "VCM", "Stp" and "Ery" are the same as in FIG. 4A.

図４ＢおよびＣに示すように、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅ）科、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科、およびオシロスピラ（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａｃｅ）科の相対存在量は、Ｅｒｙ投与群において有意に増加した。 As shown in Figures 4B and C, the relative abundances of the families Lachnospirace, Ruminococcaceae, and Oscillospirace were significantly increased in the Ery-treated group.

図４Ｂに示す科に属する各単一株を用いて細胞培養を行い、シスチン投与後のシステインパースルフィド産生能を評価した結果を図４Ｄに示す。 Cell culture was performed using each single strain belonging to the family shown in FIG. 4B, and the results of evaluating the cysteine persulfide-producing ability after administration of cystine are shown in FIG. 4D.

図４Ｄに示すように、ラクノスピラ科およびルミノコッカス科は、他の細菌科と比べて、高いシステインパースルフィドを産生することが分かる。 As shown in FIG. 4D, Lachnospiraceae and Ruminococcaceae produce higher cysteine persulfides than other bacterial families.

アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）およびクロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）をメチオニン、システインまたはシスチン存在下で培養後の各菌株におけるシステインパースルフィド産生量の結果を図４Ｅに示す。 FIG. 4E shows the results of cysteine persulfide production in each strain after culturing Anaerotruncus colihominis, Dorea longicatena, and Clostridium bolteae in the presence of methionine, cysteine, or cystine. shown in

図４Ｅに示すように、アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナおよびクロストリジウム・ボルテエは、シスチンを基質としてシステインパースルフィドを産生した。 As shown in FIG. 4E, Anerotrunkus colihominis, Drea longicatena and Clostridium vorteae produced cysteine persulfide using cystine as a substrate.

アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナ、クロストリジウム・ボルテエおよびバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）からの精製タンパク質をシスチンと反応させた結果を図４Ｆに示す。 The results of reacting purified proteins from Anerotrunkus colihominis, Drea longicatena, Clostridium vortae and Bacteroides thetaiotaomicron with cystine are shown in FIG. 4F.

図４Ｆに示すように、アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナおよびクロストリジウム・ボルテエからの精製タンパク質とシスチンとを反応させると、システインパースルフィドが顕著に生成されたが、バクテロイデス・テタイオタオミクロンからの精製タンパク質とシスチンとを反応させても、少量のシステインパースルフィドのみが生成された。このことは、アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナおよびクロストリジウム・ボルテエが基質としてのシスチンからシステインパースルフィドを生成する酵素をエンコードしていることを示唆する。 As shown in FIG. 4F, reaction of purified proteins from Anerotrunkus colihominis, Drea longicatena and Clostridium vorteae with cystine produced significant cysteine persulfides, whereas cysteine persulfides from Bacteroides thetaiotaomicron were significantly generated. Reaction of the purified protein with cystine produced only a small amount of cysteine persulfide. This suggests that Anerotrunkus colihominis, Drea longicatena and Clostridium vorteae encode enzymes that generate cysteine persulfides from cystine as substrate.

哺乳類では、主なシステインパースルフィド産生酵素であるＣＳＥとＣＢＳとの間の酵素反応はＰＬＰ依存的であることが知られている。図４Ｆは、ＰＬＰ依存性酵素反応の阻害剤であるアミノオキシ酢酸（ＡＯＡＡ）の存在下、精製タンパク質とシスチンとを反応させた結果を示す。 In mammals, the enzymatic reaction between CSE and CBS, the major cysteine persulfide-producing enzymes, is known to be PLP-dependent. FIG. 4F shows the results of reacting the purified protein with cystine in the presence of aminooxyacetic acid (AOAA), an inhibitor of PLP-dependent enzymatic reactions.

図４Ｆに示すように、ＡＯＡＡは、アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナおよびクロストリジウム・ボルテエからの精製タンパク質とシスチンとの反応におけるシステインパースルフィドの精製を阻害するが、バクテロイデス・テタイオタオミクロンからの精製タンパク質とシスチンとの反応におけるシステインパースルフィドの精製には影響がなかった。このことは、腸内細菌の高システインパースルフィド産生酵素がＰＬＰ依存的であることを示す。 As shown in FIG. 4F, AOAA inhibits the purification of cysteine persulfides in the reaction of purified proteins from Anerotrunkus colihominis, Drea longicatena and Clostridium vorteae with cystine, but not from Bacteroides thetaiotaomicron. Purification of cysteine persulfides in the reaction of purified protein with cystine was not affected. This indicates that enterobacterial high cysteine persulfide-producing enzymes are PLP-dependent.

試験例２
７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア株式会社から購入）を以下の３群に分けて３週間飼育した。マウスは、実験手順で使用する前に少なくとも１週間順応させた。すべてのマウスを、１２時間の明暗サイクル下、２１～２２℃で飼育した。すべての実験は、日本学術会議によって発行された「動物実験の適切な実施のためのガイドライン」に従って行われた。 Test example 2
7-week-old C57BL/6 mice (purchased from Clea Japan, Inc.) were divided into the following 3 groups and bred for 3 weeks. Mice were acclimated for at least one week prior to use in experimental procedures. All mice were housed at 21-22°C under a 12 hour light/dark cycle. All experiments were performed in accordance with the "Guidelines for the Proper Conduct of Animal Experiments" published by the Science Council of Japan.

コントロール群（Ｃｏｎｔ）では、水道水を３週間自由飲水させた。 The control group (Cont) was allowed to drink tap water freely for 3 weeks.

クロストリジウム・ボルテエ培養溶液の非投与群（Ｎｏｎ）およびクロストリジウム・ボルテエ培養溶液の投与群（Ｂｏｌｔｅａｅ）では、抗生物質（１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク株式会社）および０．５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン（富士フイルム和光純薬株式会社））を含む水を２週間自由飲水させた後、水道水を１週間自由飲水させた。 In the Clostridium voltae culture solution non-administration group (Non) and the Clostridium voltae culture solution administration group (Boltae), antibiotics (1 mg/mL ampicillin (Nacalai Tesque, Inc.) and 0.5 mg/mL vancomycin (Fuji Film Wako Pure Chemical Co., Ltd.)) was allowed to drink water ad libitum for 2 weeks, and tap water was given ad libitum for 1 week.

３週間の飼育期間中、最後の１週間、Ｎｏｎ群は、変法ＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社）（２００μｌ）を、Ｂｏｌｔｅａｅ群は、クロストリジウム・ボルテエの培養溶液（２００μｌ）を毎日１回１週間経口投与した。 During the last week of the 3-week breeding period, the Non group received modified GAM bouillon (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) (200 μl), and the Boltae group received Clostridium bortae culture solution (200 μl) once daily. It was orally administered weekly.

クロストリジウム・ボルテエの培養溶液の調製方法は、以下のとおりである。 The method for preparing the culture solution of Clostridium vortae is as follows.

クロストリジウム・ボルテエを変法ＧＡＭ寒天培地（日水製薬株式会社）に塗布し、培養を行った。４８時間後に明確なコロニーを採取し、１．６ｍＬの変法ＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社）で２４時間培養を行い、培養溶液を調製した。培養は全て３７℃、嫌気条件下で行なった。 Clostridium vorteae was spread on a modified GAM agar medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and cultured. After 48 hours, distinct colonies were collected and cultured in 1.6 mL of modified GAM bouillon (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) for 24 hours to prepare a culture solution. All cultures were performed at 37° C. under anaerobic conditions.

３週間の飼育期間中、最後の１週間は、Ｃｏｎｔ群を除く全ての群にＣＥ－２飼料（日本クレア株式会社）を、４％シスチンを含むＣＥ－２飼料に変更した。 During the last week of the 3-week breeding period, the CE-2 diet (CLEA Japan, Inc.) was changed to CE-2 diet containing 4% cystine for all groups except the Cont group.

飼育終了時には心採血を実施した。採取した血液から血漿を４℃で、８００×ｇで１５分間遠心分離し、上述のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析と同様の方法により血漿中のシステインパースルフィド（ＣｙｓＳＳＨ）およびグルタチオンパースルフィド（ＧＳＳＨ）レベルを測定した。結果を図５に示す。 Cardiac blood sampling was performed at the end of feeding. Plasma was centrifuged from the collected blood at 4° C. and 800×g for 15 minutes, and plasma cysteine persulfide (CysSSH) and glutathione persulfide (GSSH) were analyzed by the same method as the LC-ESI-MS/MS analysis described above. ) level was measured. The results are shown in FIG.

図５に示すように、クロストリジウム・ボルテエの培養溶液を経口投与することにより、血漿中のＣｙｓＳＳＨおよびＧＳＳＨレベルが上昇したことが分かる。なお、図５において、Ｃｏｎｔ群とＮｏｎ群との間に、統計的有意差はなかった。このことは、投与されたクロストリジウム・ボルテエによる活性イオウ分子の産生が、宿主の抗酸化能を向上させることを示す。 As shown in FIG. 5, oral administration of the Clostridium vortae culture solution increased plasma CysSSH and GSSH levels. In addition, in FIG. 5, there was no statistically significant difference between the Cont group and the Non group. This indicates that the production of reactive sulfur molecules by administered Clostridium vortae enhances the host's antioxidant capacity.

Claims (6)

アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物。 selected from the group consisting of the genera Anaerotruncus, Ruminococcus, Dorea, Clostridium, Faecalicatena, Blautia and Coprococcus An antioxidant composition comprising at least one microorganism or culture thereof as an active ingredient. 前記微生物が腸内細菌由来の微生物である、請求項１に記載の抗酸化用組成物。 2. The antioxidant composition according to claim 1, wherein the microorganism is derived from enterobacteria. 前記微生物がアネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ）、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｄｉｇｅｎｅｒａｎｓ）、クロストリジウム・インドリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｉｎｄｏｌｉｓ）、クロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）、クロストリジウム・ラバレンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌａｖａｌｅｎｓｅ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、ファカリカテナ・オロティカ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｏｒｏｔｉｃａ）、ブラウティア・ハンセニ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、コプロコッカス・コメス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ）、クロストリジウム・シンビオサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）およびクロストリジウム・セレレクレセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物である、請求項１または２に記載の抗酸化用組成物。 The microorganisms include Anaerotruncus colihominis, Ruminococcus gnavus, Dorea formidigenerans, Clostridium indolis, Clostridium voltae (Clost ridium boltae), Clostridium - Clostridium lavalense, Dorea longicatena, Faecalicatena orotica, Blautia hansenii, Coprococcus comes, Clostridium sinensis Biosum (Clostridium symbiosum) and Clostridium 3. The antioxidant composition according to claim 1 or 2, which is at least one microorganism selected from the group consisting of Clostridium celerecrescens. 酸化ストレス低減のために使用される、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗酸化用組成物。 The antioxidant composition according to any one of claims 1 to 3, which is used for reducing oxidative stress. アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を含む、活性イオウ分子産生促進用組成物。 selected from the group consisting of the genera Anaerotruncus, Ruminococcus, Dorea, Clostridium, Faecalicatena, Blautia and Coprococcus A composition for promoting active sulfur molecule production, comprising at least one microorganism or culture thereof. アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物と、シスチンとを接触させることを含む、活性イオウ分子の製造方法。 selected from the group consisting of the genera Anaerotruncus, Ruminococcus, Dorea, Clostridium, Faecalicatena, Blautia and Coprococcus A method for producing active sulfur molecules comprising contacting at least one microorganism or culture thereof with cystine.