JP2023116826A - antigen binding molecule - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
Abstract
Description
本発明は、抗原結合分子、共抑制分子アゴニスト、共抑制分子シグナル活性化剤、医薬組成物、共抑制分子とそのリガンドからなる複合体の検出剤、免疫を抑制する方法、および共抑制分子とそのリガンドからなる複合体の検出方法に関する。 The present invention provides an antigen-binding molecule, a co-inhibitory molecule agonist, a co-inhibitory molecule signal activator, a pharmaceutical composition, a detection agent for a complex comprising a co-inhibitory molecule and its ligand, a method of suppressing immunity, and a co-inhibitory molecule and It relates to a method for detecting a complex consisting of its ligand.
免疫シナプスに存在する分子を薬理学的に標的とした医薬が注目されている（非特許文献１）。そのような分子の中でも共抑制分子を標的とした治療は、がん治療を目的としている。たとえばCTLA-4やPD-1を標的にする抗体が米国食品医薬品局（FDA）により承認されているほか、TIM-3、LAG3、そしてTIGITをブロックする治療の臨床試験が行われている。 Medicines that pharmacologically target molecules present in immune synapses have attracted attention (Non-Patent Document 1). Among such molecules, therapies targeting co-inhibitory molecules are aimed at cancer treatment. Antibodies targeting CTLA-4 and PD-1, for example, have been approved by the US Food and Drug Administration (FDA), and clinical trials are underway to block TIM-3, LAG3, and TIGIT.
自己免疫疾患のマウスモデルにおいて共抑制分子に対するアゴニストの有効性が示されているが、ヒト疾患で有効性が示されたアゴニストは未だない（非特許文献２）。 Although the efficacy of agonists against co-inhibitory molecules has been demonstrated in mouse models of autoimmune diseases, no agonists have yet demonstrated efficacy in human diseases (Non-Patent Document 2).
共抑制分子の一つであるPD-1に対するアゴニストが試されてきている。
たとえば、PD-1 AB-6と呼ばれる抗体が、PD-1の残基100～105で構成されるPD-1ループを伴うβシートに結合することが開示されている（特許文献１）。該文献には、PD-1 AB-6がPD-1を介したアゴニストを提供するように設計されていることが開示されている。
また、ヒトPD-1に対する特異性を有する物質が、ヒトPD-1シグナルを伝達することができる優れた物質であることが開示されている（特許文献２）。しかしながら、該文献の実施例で用いられたPD-1とCD3に対する反応性を有する二重特異的抗体がPD-1に対してアゴニスト活性を有するか否かは実験的に示されていない。
Agonists for PD-1, one of the co-inhibitory molecules, have been tested.
For example, an antibody called PD-1 AB-6 has been disclosed to bind to a β-sheet with a PD-1 loop consisting of residues 100-105 of PD-1 (US Pat. The article discloses that PD-1 AB-6 is designed to provide an agonist through PD-1.
It has also been disclosed that a substance having specificity for human PD-1 is an excellent substance capable of transducing human PD-1 signals (Patent Document 2). However, it has not been experimentally shown whether the bispecific antibodies reactive against PD-1 and CD3 used in the examples of the article have agonistic activity against PD-1.
現在、CC-90006と呼ばれるPD-1アゴニスト抗体を用いた、乾癬を対象とした臨床試験のフェーズ１が進められている（非特許文献３）。
最近、PD-1とCD3の両方を標的とする二重特異的抗体であるONO-4685を用いた、自己免疫疾患を対象とした臨床試験のフェーズ１が開始された（非特許文献４，５）。ONO-4685は、同じT細胞に発現しているPD-1とCD3を架橋してPD-1アゴニストとして作用すること、およびPD-1を発現する細胞と別の細胞に発現するCD3を架橋することでT細胞を傷害する作用を有することが期待されている（非特許文献６）。
Recently,
自己免疫疾患を含む疾患を治療または予防するための医薬が充分に満たされているとはいえない。したがって、自己免疫疾患を含む疾患を治療または予防するためのさらなる治療薬またはその候補が創出されることが期待される。 There is an unsatisfactory supply of medicines for treating or preventing diseases, including autoimmune diseases. Accordingly, it is expected that additional therapeutic agents or candidates for treating or preventing diseases, including autoimmune diseases, will be created.
本発明者らは、自己免疫疾患に対する有効性を潜在的に有する免疫シナプスを標的とした抗原結合分子のコンセプトを創出し、それを実験的に確認した。具体的には、該抗原結合分子は、免疫シナプスに局在する共抑制分子とそのリガンドからなる複合体に特異的に結合することで、免疫シナプスを標的とする。該抗原結合分子は、好ましくは、該共抑制分子に対するアゴニスト活性を有する。該抗原結合分子は、該共抑制分子に対するアゴニスト活性に基づく免疫抑制作用を有する医薬以外に、共抑制分子とそのリガンドからなる複合体の検出にも提供され得る。 The present inventors have created and experimentally confirmed the concept of immune synapse-targeted antigen-binding molecules with potential efficacy against autoimmune diseases. Specifically, the antigen-binding molecule targets the immune synapse by specifically binding to a complex consisting of a co-inhibitory molecule localized at the immune synapse and its ligand. Said antigen-binding molecule preferably has agonist activity to said co-inhibitory molecule. The antigen-binding molecule can be provided for detection of a complex consisting of a co-inhibitory molecule and its ligand, as well as a drug having an immunosuppressive effect based on agonist activity to the co-inhibitory molecule.
本明細書における一態様として、以下の発明が提供される。
［１］第１の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、
前記第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体に特異的に結合し得る、抗原結合分子。
［２］前記第１の抗原結合ドメインの前記第１の複合体への特異的結合が前記第１の複合体中の前記第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方との分子間力による結合である、［１］の抗原結合分子。
［３］前記第１の複合体が存在する免疫シナプスにおいて、前記第１の共抑制分子の下流の第１の細胞内シグナルを活性化し得る、［１］または［２］の抗原結合分子。
［４］前記第１の細胞内シグナルの活性化により、T細胞の活性化が抑制され得る、［３］の抗原結合分子。
［５］前記免疫シナプスが、MHCと前記共抑制分子リガンドを発現している細胞と、前記共抑制分子を発現している前記T細胞の間に形成されたものである、［３］または［４］の抗原結合分子。
［６］第１の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、
前記第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体に結合し得、そして
前記第１の抗原結合ドメインの前記第１の複合体への結合活性が、前記第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子および前記第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方への結合活性よりも高い、抗原結合分子。
［７］前記第１の抗原結合ドメインの前記第１の複合体への結合が前記第１の複合体中の前記第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方との分子間力による結合である、［６］の抗原結合分子。
［８］前記第１の複合体が存在する免疫シナプスにおいて、前記第１の共抑制分子の下流の第１の細胞内シグナルを活性化し得る、［６］または［７］の抗原結合分子。
［９］前記第１の細胞内シグナルの活性化により、T細胞の活性化が抑制され得る、［８］の抗原結合分子。
［１０］前記免疫シナプスが、MHCと前記共抑制分子リガンドを発現している細胞と、前記共抑制分子を発現している前記T細胞の間に形成されたものである、［８］または［９］の抗原結合分子。
［１１］前記結合活性が以下の(a)および(b)のいずれか一方または両方の条件を満たす、［６］から［１０］のいずれかの抗原結合分子：
(a) 前記第１の共抑制分子を強制発現し前記第１の共抑制分子リガンドを強制発現していない第１の細胞を用いたフローサイトメトリーにおいて、前記第１の共抑制分子リガンドの細胞外ドメインまたはその一部を含む第１の可溶型ポリペプチドの存在下における前記第１の抗原結合ドメインの前記第１の細胞への結合活性が、前記第１の可溶型ポリペプチドの非存在下に比べて高い；
(b) 前記第１の共抑制分子リガンドを強制発現し前記第１の共抑制分子を強制発現していない第２の細胞を用いたフローサイトメトリーにおいて、前記第１の共抑制分子の細胞外ドメインまたはその一部を含む第２の可溶型ポリペプチドの存在下における前記第１の抗原結合ドメインの前記第２の細胞への結合活性が、前記第２の可溶型ポリペプチドの非存在下に比べて高い。
［１２］前記第１の細胞および前記第２の細胞の両方がチャイニーズハムスター卵巣細胞由来である、［１０］の抗原結合分子。
［１３］第１の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、
前記第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体に存在するエピトープに特異的に結合し得る、抗原結合分子。
［１４］前記エピトープが、前記第１の複合体を形成していない前記第１の共抑制分子のみまたは前記第１の複合体を形成していない前記第１の共抑制分子リガンドのみには存在しない、［１３］の抗原結合分子。
［１５］前記第１の抗原結合ドメインの前記第１の複合体への特異的結合が前記第１の複合体中の前記第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方との分子間力による結合である、［１３］または［１４］の抗原結合分子。
［１６］前記第１の複合体が存在する免疫シナプスにおいて、前記第１の共抑制分子の下流の第１の細胞内シグナルを活性化し得る、［１３］から［１５］のいずれかの抗原結合分子。
［１７］前記第１の細胞内シグナルの活性化により、T細胞の活性化が抑制され得る、［１６］の抗原結合分子。
［１８］前記免疫シナプスが、MHCと前記共抑制分子リガンドを発現している細胞と、前記共抑制分子を発現している前記T細胞の間に形成されたものである、［１６］または［１７］の抗原結合分子。
［１９］第１の共抑制分子を発現し前記第１の細胞内シグナルの強度が測定可能な第３の細胞と、抗原非依存的なT細胞受容体アクチベーターおよび前記第１の共抑制分子リガンドを発現する第４の細胞とが互いに接触可能な状態で用いられ、且つ、前記第３の細胞における前記第１の細胞内シグナルが前記第１の共抑制分子リガンドに対する阻害抗体により部分的に抑制されている条件下で行われる、前記第１の細胞内シグナルの強度の測定系において、前記抗原結合分子の存在下における前記第１の細胞内シグナルの前記強度が、前記抗原結合分子の非存在下に比べて高い、［３］から［５］、［８］から［１０］、および［１６］から［１８］のいずれかの抗原結合分子。
［２０］前記第３の細胞がJurkat細胞由来であり、および前記第４の細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞由来である、［１９］の抗原結合分子。
［２１］前記第１の細胞内シグナルの前記強度が、前記第１の共抑制分子が活性化したときに生じる、前記第１の共抑制分子の細胞内ドメインと前記細胞内ドメインに直接にまたは間接に相互作用する細胞内タンパク質との近接に基づき測定される、［１９］または［２０］の抗原結合分子。
［２２］前記細胞内タンパク質が脱リン酸化酵素である、［２１］の抗原結合分子。
［２３］T細胞受容体と前記第１の共抑制分子を発現しており、前記T細胞受容体の下流で活性化し得る第２の細胞内シグナルの強度が測定可能であり、前記第１の細胞内シグナルの活性化によって前記第２の細胞内シグナルが抑制され得る第５の細胞と抗原非依存的なT細胞受容体アクチベーターおよび前記第１の共抑制分子リガンドを発現する第６の細胞とが互いに接触可能な条件下で用いられ、且つ、
前記第１の共抑制分子リガンドによる前記第５の細胞における前記第２の細胞内シグナルの抑制が前記第１の共抑制分子リガンドに対する阻害抗体により部分的に抑制されている条件下で行われる、前記第２の細胞内シグナルの強度の測定系において、
前記抗原結合分子の存在下における前記第２の細胞内シグナルの前記強度が、前記抗原結合分子の非存在下に比べて低い、［３］から［５］、［８］から［１０］、および［１６］から［２２］のいずれかの抗原結合分子。
［２４］前記第５の細胞がJurkat細胞由来であり、および前記第６の細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞由来である、［２３］の抗原結合分子。
［２５］前記第２の細胞内シグナルがNFAT活性である、［２３］または［２４］の抗原結合分子。
［２６］前記第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子リガンドの組合せが、PD-1およびPD-L1の組合せ、PD-1およびPD-L2の組合せ、BTLAおよびHVEMの組合せ、TIGITおよびCD155の組合せ、TIGITおよびCD112の組合せ、LAG-3およびMHCクラスII分子の組合せ、CTLA4およびCD80の組合せ、CTLA4およびCD86の組合せ、TIM-3およびgalectin-9の組合せ、TIM-3およびphosphatidylserineの組合せ、TIM-3およびCEACAM-1の組合せ、ならびにTIM-3およびHMGB1の組合せからなる群から選択されるいずれか一つである、［１］から［２５］のいずれかの抗原結合分子。
［２７］前記抗原結合分子が第２の抗原結合ドメインをさらに含む多重抗原結合分子であり、
前記第２の抗原結合ドメインが、第２の共抑制分子リガンドと第２の複合体を形成し得る第２の共抑制分子に特異的に結合し得る、［１］から［２６］のいずれかの抗原結合分子。
［２８］前記第１の複合体が存在する免疫シナプスにおいて、前記第２の共抑制分子の下流の第３の細胞内シグナルを活性化し得る、［２７］の抗原結合分子。
［２９］前記第３の細胞内シグナルの活性化により、前記第２の細胞内シグナルが抑制され得る、［２８］の抗原結合分子。
［３０］前記第２の抗原結合ドメインの前記第２の共抑制分子への結合が、前記第２の共抑制分子リガンドの前記第２の共抑制分子への結合と競合しない、［２７］から［２９］のいずれかの抗原結合分子。
［３１］前記第２の共抑制分子および前記第２の共抑制分子リガンドの組合せが、PD-1およびPD-L1の組合せ、PD-1およびPD-L2の組合せ、BTLAおよびHVEMの組合せ、TIGITおよびCD155の組合せ、TIGITおよびCD112の組合せ、LAG-3およびMHCクラスII分子の組合せ、CTLA4およびCD80の組合せ、CTLA4およびCD86の組合せ、TIM-3およびgalectin-9の組合せ、TIM-3およびphosphatidylserineの組合せ、TIM-3およびCEACAM-1の組合せ、ならびにTIM-3およびHMGB1の組合せからなる群から選択されるいずれか一つの組合せである、［２７］から［３１］のいずれかの抗原結合分子。
［３２］前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが抗体の可変領域またはその対象抗原への結合性のその断片である、［２７］から［３１］のいずれかの抗原結合分子。
［３３］前記第１の共抑制分子が前記第２の共抑制分子と同じである、または異なる、［２７］から［３２］のいずれかの抗原結合分子。
［３４］前記第１の共抑制分子が前記第２の共抑制分子と同じである場合、前記第１の抗原結合ドメインが結合する前記第１の共抑制分子におけるエピトープは、前記第２の抗原結合ドメインが結合する前記第２の共抑制分子におけるエピトープと異なる、［３３］の抗原結合分子。
［３５］前記第１の共抑制分子リガンドが前記第２の共抑制分子リガンドと同じである、または異なる、［２７］から［３４］のいずれかの抗原結合分子。
［３６］前記第１の細胞内シグナルが前記第３の細胞内シグナルと同じである、または異なる、［２８］または［２９］のいずれかの抗原結合分子。
［３７］抗体の定常領域をさらに含む、［１］から［３６］のいずれかの抗原結合分子。
［３８］前記定常領域における少なくとも１残基が、天然型抗体の定常領域の相当する位置のアミノ酸残基とは異なる、［３１］の抗原結合分子。
［３９］［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子を含む、共抑制分子アゴニスト。
［４０］［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子を含有する、共抑制分子シグナル活性化剤。
［４１］［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子を含有する、医薬組成物。
［４２］免疫の異常亢進に起因する疾患を治療するまたは予防するための、［４１］の医薬組成物。
［４３］［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子を含有する、第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体の検出剤。
［４４］［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子を対象に投与することを含む、免疫を抑制する方法。
［４５］［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子を免疫細胞に接触させることを含む、第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体の検出方法。
［４６］［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子をコードする核酸を含む細胞を培養することを含む、抗原結合分子の製造方法。
［４７］第１の共抑制分子またはその部分ポリペプチドおよび前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドまたはその部分ポリペプチドを含む第３の複合体を免疫した非ヒト動物から、［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子を含む血漿または血液を採取することを含む、抗原結合分子の製造方法。
［４８］前記第３の複合体が、前記第１の共抑制分子またはその部分ポリペプチドを前記第１の共抑制分子リガンドまたはその部分ポリペプチドにリンカーを介するか、化学結合により直接的に結合させた１分子である、［４７］の製造方法。
［４９］前記血漿または前記血液から、純度を高めた前記抗原結合分子を含有する組成物を得ることをさらに含む、［４７］または［４８］の製造方法。
［５０］前記抗原結合分子がポリクローナル抗体である、［４７］から［４９］のいずれかの製造方法。
［５１］第１の共抑制分子またはその部分ポリペプチドおよび前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドまたはその部分ポリペプチドを含む第３の複合体を免疫した非ヒト動物から、［１］から［３８］のいずれかの抗原結合分子を発現する細胞クローンを単離することを含む、抗原結合分子の製造方法。
［５２］前記第３の複合体が、前記第１の共抑制分子またはその部分ポリペプチドを前記第１の共抑制分子リガンドまたはその部分ポリペプチドにリンカーを介するか、化学結合により直接的に結合させた１分子である、［５１］の製造方法。
［５３］前記細胞クローンから前記抗原結合分子をコードする核酸を抽出し、単離することをさらに含む、［５１］または［５２］の製造方法。
［５４］前記核酸を組み換えることをさらに含む、［５３］の製造方法。
［５５］前記組み換えられた核酸を他の細胞に導入し、前記抗原結合分子を前記他の細胞に発現させることをさらに含む、［５４］の製造方法。
［５６］前記発現させた抗原結合分子を含有する組成物を得ることをさらに含む、［５５］の製造方法。
［５７］前記組成物における前記発現させた抗原結合分子の純度を高めることをさらに含む、［５６］の製造方法。
The following invention is provided as one aspect in this specification.
[1] An antigen-binding molecule comprising a first antigen-binding domain,
An antigen-binding molecule, wherein said first antigen-binding domain is capable of specifically binding a first complex consisting of a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand to said first co-inhibitory molecule.
[2] the specific binding of the first antigen-binding domain to the first complex is either the first co-inhibitory molecule in the first complex or the first co-inhibitory molecule ligand; The antigen-binding molecule of [1], which is bound by intermolecular force with one or both.
[3] The antigen-binding molecule of [1] or [2], which can activate the first intracellular signal downstream of the first co-inhibitory molecule in the immune synapse where the first complex is present.
[4] The antigen-binding molecule of [3], wherein activation of the first intracellular signal can suppress activation of T cells.
[5] The immune synapse is formed between a cell expressing MHC and the co-inhibitory molecule ligand and the T cell expressing the co-inhibitory molecule, [3] or [ 4] antigen-binding molecule.
[6] An antigen-binding molecule comprising a first antigen-binding domain,
said first antigen binding domain is capable of binding a first complex consisting of a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand to said first co-inhibitory molecule, and said first antigen binding domain The binding activity to the first complex of the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex and the first co-inhibitory molecule ligand that does not form the first complex An antigen-binding molecule that has higher binding activity to either or both.
[7] binding of the first antigen-binding domain to the first complex is either one of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex, or The antigen-binding molecule of [6], which is bound by intermolecular forces with both.
[8] The antigen-binding molecule of [6] or [7], which can activate the first intracellular signal downstream of the first co-inhibitory molecule at the immune synapse where the first complex is present.
[9] The antigen-binding molecule of [8], wherein activation of the first intracellular signal can suppress activation of T cells.
[10] The immune synapse is formed between a cell expressing MHC and the co-inhibitory molecule ligand and the T cell expressing the co-inhibitory molecule, [8] or [ 9] antigen-binding molecule.
[11] The antigen-binding molecule of any one of [6] to [10], wherein the binding activity satisfies one or both of the following conditions (a) and (b):
(a) cells of the first co-inhibitory molecule ligand in flow cytometry using a first cell that forcibly expresses the first co-inhibitory molecule but does not forcibly express the first co-inhibitory molecule ligand; The binding activity of the first antigen-binding domain to the first cell in the presence of the first soluble polypeptide containing the ectodomain or a portion thereof is determined by the non-binding activity of the first soluble polypeptide higher than in presence;
(b) in flow cytometry using a second cell that forcibly expresses the first co-inhibitory molecule ligand but does not forcibly express the first co-inhibitory molecule, The binding activity of the first antigen-binding domain to the second cell in the presence of a second soluble polypeptide comprising the domain or a portion thereof is reduced by the absence of the second soluble polypeptide. higher than below.
[12] The antigen-binding molecule of [10], wherein both the first cell and the second cell are derived from Chinese hamster ovary cells.
[13] An antigen-binding molecule comprising a first antigen-binding domain,
an antigen, wherein said first antigen-binding domain is capable of specifically binding to an epitope present in a first complex consisting of a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand to said first co-inhibitory molecule binding molecule.
[14] The epitope is present only in the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex or only in the first co-inhibitory molecule ligand that does not form the first complex not, the antigen-binding molecule of [13].
[15] the specific binding of the first antigen-binding domain to the first complex is either the first co-inhibitory molecule in the first complex or the first co-inhibitory molecule ligand; The antigen-binding molecule of [13] or [14], which is bound by intermolecular forces with one or both.
[16] The antigen binding of any one of [13] to [15], which can activate a first intracellular signal downstream of the first co-inhibitory molecule at an immune synapse where the first complex resides. molecule.
[17] The antigen-binding molecule of [16], wherein activation of the first intracellular signal can suppress activation of T cells.
[18] said immune synapse is formed between cells expressing MHC and said co-inhibitory molecule ligand and said T cells expressing said co-inhibitory molecule, [16] or [ 17].
[19] a third cell expressing the first co-inhibitory molecule and capable of measuring the intensity of the first intracellular signal, an antigen-independent T cell receptor activator and the first co-inhibitory molecule and a fourth cell that expresses a ligand is used in a state in which they can contact each other, and the first intracellular signal in the third cell is partially inhibited by an inhibitory antibody against the first co-inhibitory molecule ligand In the system for measuring the intensity of the first intracellular signal, which is performed under conditions of suppression, the intensity of the first intracellular signal in the presence of the antigen-binding molecule is The antigen-binding molecule of any of [3] to [5], [8] to [10], and [16] to [18] that is elevated compared to its presence.
[20] The antigen-binding molecule of [19], wherein the third cell is derived from Jurkat cells and the fourth cell is derived from Chinese Hamster Ovary cells.
[21] said intensity of said first intracellular signal is directly between said first co-inhibitory molecule and said intracellular domain when said first co-inhibitory molecule is activated; or The antigen-binding molecule of [19] or [20], measured based on proximity to intracellular proteins with which it indirectly interacts.
[22] The antigen-binding molecule of [21], wherein the intracellular protein is a dephosphorylation enzyme.
[23] The T cell receptor and the first co-inhibitory molecule are expressed, the intensity of a second intracellular signal that can be activated downstream of the T cell receptor is measurable, and the first A fifth cell capable of suppressing the second intracellular signal by activation of the intracellular signal and a sixth cell expressing an antigen-independent T cell receptor activator and the first co-inhibitory molecule ligand are used under conditions that allow contact with each other, and
under conditions in which inhibition of the second intracellular signal in the fifth cell by the first co-inhibitory molecule ligand is partially inhibited by an inhibitory antibody to the first co-inhibitory molecule ligand; In the second intracellular signal intensity measurement system,
wherein the intensity of the second intracellular signal in the presence of the antigen-binding molecule is lower than in the absence of the antigen-binding molecule [3] to [5], [8] to [10], and The antigen-binding molecule of any one of [16] to [22].
[24] The antigen-binding molecule of [23], wherein the fifth cell is derived from Jurkat cells and the sixth cell is derived from Chinese hamster ovary cells.
[25] The antigen-binding molecule of [23] or [24], wherein the second intracellular signal is NFAT activity.
[26] the combination of said first co-inhibitory molecule and said first co-inhibitory molecule ligand is a combination of PD-1 and PD-L1, a combination of PD-1 and PD-L2, a combination of BTLA and HVEM, TIGIT and CD155 combination, TIGIT and CD112 combination, LAG-3 and MHC class II molecule combination, CTLA4 and CD80 combination, CTLA4 and CD86 combination, TIM-3 and galectin-9 combination, TIM-3 and phosphatidylserine combination The antigen-binding molecule of any one of [1] to [25], which is any one selected from the group consisting of a combination, a combination of TIM-3 and CEACAM-1, and a combination of TIM-3 and HMGB1.
[27] the antigen-binding molecule is a multiple antigen-binding molecule further comprising a second antigen-binding domain;
Any of [1] to [26], wherein the second antigen-binding domain is capable of specifically binding a second co-inhibitory molecule capable of forming a second complex with a second co-inhibitory molecule ligand antigen-binding molecule.
[28] The antigen-binding molecule of [27], which can activate a third intracellular signal downstream of the second co-inhibitory molecule at an immune synapse where the first complex is present.
[29] The antigen-binding molecule of [28], wherein activation of the third intracellular signal can suppress the second intracellular signal.
[30] binding of said second antigen binding domain to said second co-inhibitory molecule does not compete with binding of said second co-inhibitory molecule ligand to said second co-inhibitory molecule, from [27] Any antigen-binding molecule of [29].
[31] the combination of said second co-inhibitory molecule and said second co-inhibitory molecule ligand is a combination of PD-1 and PD-L1, a combination of PD-1 and PD-L2, a combination of BTLA and HVEM, TIGIT and CD155 combination, TIGIT and CD112 combination, LAG-3 and MHC class II molecule combination, CTLA4 and CD80 combination, CTLA4 and CD86 combination, TIM-3 and galectin-9 combination, TIM-3 and phosphatidylserine combination The antigen-binding molecule of any one of [27] to [31], which is any one combination selected from the group consisting of a combination, a combination of TIM-3 and CEACAM-1, and a combination of TIM-3 and HMGB1.
[32] The antigen binding of any of [27] to [31], wherein the first antigen-binding domain and the second antigen-binding domain are antibody variable regions or target antigen-binding fragments thereof molecule.
[33] The antigen-binding molecule of any one of [27] to [32], wherein said first co-inhibitory molecule is the same as or different from said second co-inhibitory molecule.
[34] When the first co-inhibitory molecule is the same as the second co-inhibitory molecule, the epitope in the first co-inhibitory molecule to which the first antigen-binding domain binds is the second antigen The antigen-binding molecule of [33], which is different from the epitope on said second co-inhibitory molecule bound by the binding domain.
[35] The antigen-binding molecule of any of [27] to [34], wherein said first co-inhibitory molecule ligand is the same as or different from said second co-inhibitory molecule ligand.
[36] The antigen-binding molecule of any of [28] or [29], wherein said first intracellular signal is the same as or different from said third intracellular signal.
[37] The antigen-binding molecule of any one of [1] to [36], further comprising an antibody constant region.
[38] The antigen-binding molecule of [31], wherein at least one residue in the constant region is different from the corresponding amino acid residue in the constant region of the native antibody.
[39] A co-inhibitory molecule agonist comprising the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38].
[40] A co-inhibitory molecule signal activator comprising the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38].
[41] A pharmaceutical composition comprising the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38].
[42] The pharmaceutical composition of [41] for treating or preventing a disease caused by hyperimmunity.
[43] A first complex comprising the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38], comprising a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand to the first co-inhibitory molecule detection agent.
[44] A method of suppressing immunity, which comprises administering the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38] to a subject.
[45] from a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand to said first co-inhibitory molecule, comprising contacting an immune cell with the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38] A first method for detecting a complex.
[46] A method for producing an antigen-binding molecule, which comprises culturing a cell containing a nucleic acid encoding the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38].
[47] from a non-human animal immunized with a third complex comprising a first co-inhibitory molecule or a partial polypeptide thereof and a first co-inhibitory molecule ligand for said first co-inhibitory molecule or a partial polypeptide thereof, A method for producing an antigen-binding molecule, which comprises collecting plasma or blood containing the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38].
[48] The third complex binds the first co-inhibitory molecule or partial polypeptide thereof to the first co-inhibitory molecule ligand or partial polypeptide thereof via a linker or directly by a chemical bond. [47].
[49] The production method of [47] or [48], further comprising obtaining a composition containing the antigen-binding molecule with increased purity from the plasma or the blood.
[50] The production method of any one of [47] to [49], wherein the antigen-binding molecule is a polyclonal antibody.
[51] from a non-human animal immunized with a third complex comprising a first co-inhibitory molecule or a partial polypeptide thereof and a first co-inhibitory molecule ligand for said first co-inhibitory molecule or a partial polypeptide thereof, A method for producing an antigen-binding molecule, which comprises isolating a cell clone expressing the antigen-binding molecule of any one of [1] to [38].
[52] the third complex binds the first co-inhibitory molecule or a partial polypeptide thereof to the first co-inhibitory molecule ligand or a partial polypeptide thereof via a linker or directly by a chemical bond; The production method of [51], which is one molecule obtained by
[53] The production method of [51] or [52], further comprising extracting and isolating the nucleic acid encoding the antigen-binding molecule from the cell clone.
[54] The production method of [53], further comprising recombination of the nucleic acid.
[55] The production method of [54], further comprising introducing the recombinant nucleic acid into another cell to express the antigen-binding molecule in the other cell.
[56] The production method of [55], further comprising obtaining a composition containing the expressed antigen-binding molecule.
[57] The production method of [56], further comprising increasing the purity of the expressed antigen-binding molecule in the composition.
本発明における抗原結合分子は、免疫シナプスに局在する共抑制分子とそのリガンドからなる複合体に特異的に結合することで免疫シナプスを標的とし、該共抑制分子に対するアゴニスト活性を有することから、自己免疫疾患を含む疾患を治療または予防するための治療薬またはその候補になり得る。 The antigen-binding molecule of the present invention targets the immune synapse by specifically binding to a complex consisting of a co-inhibitory molecule localized at the immune synapse and its ligand, and has agonist activity against the co-inhibitory molecule. It can be a therapeutic agent or a candidate thereof for treating or preventing diseases including autoimmune diseases.
Ａ．定義
本明細書において「共抑制分子」とは、T細胞に発現する膜タンパク質であり、抗原提示細胞に発現する共抑制分子リガンドの特異的結合によりT細胞の活性または活性化を抑制する細胞内シグナルを生じる分子である。
本明細書において「共抑制分子リガンド」とは、抗原提示細胞に発現する膜タンパク質であり、T細胞に発現する共抑制分子への特異的結合により、T細胞に対して、該共抑制分子を介して、該T細胞の活性または活性化を抑制する細胞内シグナルを生じる分子である。
本明細書において「共抑制分子と共抑制分子リガンドからなる複合体」とは、該共抑制分子が該共抑制分子リガンドに結合し得る組合せである場合に、該共抑制分子リガンドが該共抑制分子に結合した状態のそれら分子により形成された複合体のことをいう。
本明細書において「分子間力」とは、主に、ある分子と他の分子の間に働く電磁気学的な力である。分子間力として、イオン間相互作用、水素結合、双極子相互作用、およびファンデルワールス力が例示される。分子間力には、共有結合は包含されない。高分子においては、分子内の別の部分の間に共有結合ではなく分子間力が生じることがある。
本明細書において「結合活性」とは、分子間力の強さを表す際に使用される。ある分子と他の分子との結合活性は、それらの分子間に生じる様々な分子間力の総和により決定される。分子間の結合活性を測定するために、フローサイトメトリー（FCM）、表面プラズモン共鳴（SPR）、バイオレイヤー干渉（BLI）、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）が一般的な手法として採用され得る。
本明細書において、「特異的に結合」とは、たとえば、対象抗原に対する結合活性が他の抗原に対する結合活性よりも高い場合における、該対象抗原に対する結合をいう。本明細書において、「結合活性」は後述の「（ｂ－２） 第２の態様」の「i) 結合活性」で定義される。
本明細書における「分子内の立体構造変化」は、共抑制分子リガンドが共抑制分子に結合することによって生じる、いずれか一方または両方の立体構造の変化（Structure, 2015, Vol.23, pp.2341-2348.およびJ Biol Chem, 2013, Vol.288, pp.11771-11785.を参照）を意味する。生理機能を有するように高次構造を形成したタンパク質は、そのタンパク質の表面に、他のタンパク質との分子間相互作用によってその立体構造に変化を生じさせる可塑的な領域を有することがある。タンパク質の立体構造の変化は、生理機能を有するように高次構造を形成したタンパク質における特定のアミノ酸残基に関する、他のアミノ酸残基との相対的な位置関係の変化を意味する。本明細書においては、特に、共抑制分子リガンドが共抑制分子に結合することによって生じる分子内の立体構造変化を想定する。
本明細書において、抗体の「アーム」とは、自然に存在する抗体と同様な二価抗体における一価を構成する部分を意味する。具体的には当該アームは一の重鎖Fabと一の軽鎖Fabがジスルフィド結合により結合した抗体の部分を指す。アームを含む抗体は二価抗体に限定されず、一価抗体または多価抗体であり得る。
A. Definition As used herein, the term "co-inhibitory molecule" refers to a membrane protein expressed in T cells, which suppresses the activity or activation of T cells by specific binding of co-inhibitory molecule ligands expressed in antigen-presenting cells. It is the molecule that produces the signal.
As used herein, the term "co-inhibitory molecule ligand" refers to a membrane protein expressed in antigen-presenting cells, and by specific binding to the co-inhibitory molecule expressed in T cells, the co-inhibitory molecule is expressed in T cells. It is a molecule that produces an intracellular signal through which the activity or activation of the T cell is suppressed.
As used herein, the term "a complex consisting of a co-inhibitory molecule and a co-inhibitory molecule ligand" means that when the co-inhibitory molecule is a combination capable of binding to the co-inhibitory molecule ligand, the co-inhibitory molecule ligand It refers to a complex formed by molecules that are bound to each other.
As used herein, "intermolecular force" is mainly an electromagnetic force acting between a molecule and another molecule. Intermolecular forces are exemplified by ionic interactions, hydrogen bonding, dipole interactions, and van der Waals forces. Intermolecular forces do not include covalent bonds. In macromolecules, intermolecular forces, rather than covalent bonds, can occur between different moieties within the molecule.
As used herein, the term "binding activity" is used to indicate the strength of intermolecular force. The binding activity of a molecule to another molecule is determined by the sum of various intermolecular forces generated between those molecules. Flow cytometry (FCM), surface plasmon resonance (SPR), biolayer interference (BLI), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be employed as common techniques to measure binding activity between molecules. .
As used herein, “specific binding” refers to binding to a target antigen when, for example, the binding activity to the target antigen is higher than that to other antigens. In the present specification, "binding activity" is defined in "i) binding activity" of "(b-2) Second aspect" below.
As used herein, the term “intramolecular conformational change” refers to any one or both conformational changes caused by binding of a co-inhibitory molecule ligand to a co-inhibitory molecule (Structure, 2015, Vol.23, pp. 2341-2348. and J Biol Chem, 2013, Vol.288, pp.11771-11785.). A protein that has formed a higher-order structure so as to have a physiological function may have a plastic region on the surface of the protein that causes a change in its three-dimensional structure through intermolecular interactions with other proteins. A change in protein conformation means a change in the relative positional relationship of a specific amino acid residue with other amino acid residues in a protein that has formed a higher-order structure so as to have a physiological function. Specifically contemplated herein are intramolecular conformational changes that occur upon binding of a co-inhibitory molecule ligand to a co-inhibitory molecule.
As used herein, an "arm" of an antibody means a portion that constitutes a single valence in a bivalent antibody similar to naturally occurring antibodies. Specifically, the arm refers to a portion of an antibody in which one heavy chain Fab and one light chain Fab are linked via disulfide bonds. Antibodies comprising arms are not limited to bivalent antibodies and can be monovalent or multivalent antibodies.
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。 As used herein, the term "antibody" is used in the broadest sense, and as long as it exhibits the desired antigen-binding activity, it is not limited to, but is not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g., It encompasses a variety of antibody structures, including bispecific antibodies) and antibody fragments.
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。 An "antibody fragment" refers to a molecule other than an intact antibody that contains a portion of the intact antibody that binds to the antigen to which the intact antibody binds. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2 ; diabodies; linear antibodies; single chain antibody molecules (e.g., scFv ); and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。 The term "Fc region" is used herein to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including at least part of the constant region. The term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions. In one embodiment, the human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226 or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) of the Fc region may or may not be present. Unless otherwise specified herein, the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is according to Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Follows the EU Numbering System (also known as the EU Index), as described in MD 1991.
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 "Framework" or "FR" refers to variable domain residues other than hypervariable region (HVR) residues. The FRs of variable domains usually consist of four FR domains: FR1, FR2, FR3 and FR4. Accordingly, HVR and FR sequences usually appear in VH (or VL) in the following order: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相HPLC）で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) を参照のこと。 An "isolated" antibody is one that has been separated from a component of its original environment. In some embodiments, antibodies are analyzed, for example, by electrophoresis (e.g., SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis) or chromatography (e.g., ion exchange or reverse phase HPLC). Purified to greater than 95% or 99% purity as measured. For a review of methods for assessment of antibody purity, see, eg, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。 As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. That is, the individual antibodies that make up the population are mutated antibodies that may arise (e.g., mutated antibodies containing naturally occurring mutations, or mutated antibodies that arise during the manufacture of monoclonal antibody preparations. are identical and/or bind to the same epitope, except that they are present in the same amount. In contrast to polyclonal antibody preparations which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody of a monoclonal antibody preparation is directed against a single determinant on the antigen. Thus, the modifier "monoclonal" indicates the character of the antibody as being obtained from a population of substantially homogeneous antibodies and should not be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, monoclonal antibodies used in accordance with the present invention include, but are not limited to, hybridoma technology, recombinant DNA technology, phage display technology, transgenic animals containing all or part of the human immunoglobulin locus. Such and other exemplary methods for making monoclonal antibodies are described herein.
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。 "Native antibodies" refer to immunoglobulin molecules with varying structures that occur in nature. For example, native IgG antibodies are heterotetrameric glycoproteins of approximately 150,000 daltons composed of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide-bonded. From N-terminus to C-terminus, each heavy chain has a variable region (VH), also called a variable heavy domain or heavy chain variable domain, followed by three constant domains (CH1, CH2 and CH3). Similarly, from N-terminus to C-terminus, each light chain has a variable region (VL), also called a variable light domain or light chain variable domain, followed by a constant light (CL) domain. The light chains of antibodies can be assigned to one of two types, called kappa (κ) and lambda (λ), based on the amino acid sequences of their constant domains.
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。 The terms "variable region" or "variable domain" refer to the domains of the heavy or light chains of an antibody that are responsible for binding the antibody to the antigen. The heavy and light chain variable domains (VH and VL, respectively) of native antibodies are usually similar, with each domain containing four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (HVR). have a structure. (See, eg, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) A single VH or VL domain may be sufficient to confer antigen-binding specificity. Additionally, antibodies that bind a particular antigen may be isolated using the VH or VL domains from the antibody that binds the antigen to screen a complementary library of VL or VH domains, respectively. See, eg, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。 As used herein, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of propagating another nucleic acid to which it has been linked. The term includes vectors as self-replicating nucleic acid structures and vectors that integrate into the genome of a host cell into which they are introduced. Certain vectors are capable of directing the expression of nucleic acids to which they are operably linked. Such vectors are also referred to herein as "expression vectors".
Ｂ．抗原結合分子
本発明の一局面において、抗原結合分子は第１の抗原結合ドメインを含む。
第１の抗原結合ドメインは、第１の複合体に結合し得る限り、如何なる化学的構造を有していてもよく、たとえば、低分子化合物であってもよく、高分子化合物であってもよい。第１の複合体は、第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドからなる。第１の共抑制分子リガンドは、第１の共抑制分子に対するリガンドである。後述される「（ｂ－１０）他の態様」欄において、第１の抗原結合ドメインの具体的な態様が例示される。
B. Antigen-Binding Molecules In one aspect of the invention, an antigen-binding molecule comprises a first antigen-binding domain.
The first antigen-binding domain may have any chemical structure as long as it can bind to the first complex, for example, it may be a low-molecular-weight compound or a high-molecular-weight compound. . The first complex consists of a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand. The first co-inhibitory molecule ligand is a ligand to the first co-inhibitory molecule. Specific embodiments of the first antigen-binding domain are exemplified in the section "(b-10) Other embodiments" described below.
（ｂ－１）第１の態様
一態様において、第１の抗原結合ドメインは、第１の複合体に特異的に結合し得る。
(b-1) First aspect In one aspect, the first antigen-binding domain can specifically bind to the first complex.
該態様において、第１の抗原結合ドメインの第１の複合体への特異的結合は、第１の複合体中の第１の共抑制分子への分子間力による結合であり得、第１の複合体中の第１の共抑制分子リガンドへの分子間力による結合であり得、または第１の複合体中の第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方との分子間力による結合であり得る。第１の抗原結合ドメインの第１の複合体への特異的結合は、好ましくは、第１の複合体中の第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方との分子間力による結合であり得る。これら様々な結合の態様の存在は、第１の抗原結合ドメインが第１の複合体に特異的に結合している限り、第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方に分子間力が形成され得ることを意味する。 In this aspect, the specific binding of the first antigen-binding domain to the first complex can be binding by intermolecular forces to the first co-inhibitory molecule in the first complex, It may be binding by intermolecular forces to the first co-inhibitory molecule ligand in the complex, or intermolecular binding to both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex. It can be force-bonded. Specific binding of the first antigen-binding domain to the first complex preferably results from intermolecular forces with both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex. may be a bond by The existence of these various binding modalities is dependent on the presence of either the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand as long as the first antigen-binding domain specifically binds to the first complex. or that intermolecular forces can form on both.
該態様において、第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方と分子間力による結合を形成する場合には、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方に分子内の立体構造変化がある場合が想定される。この場合において、第１の抗原結合ドメインは、これら二つの分子間の結合によって変化した立体構造を特異的に認識する。
たとえば、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの一方の分子内に立体構造変化がある場合には、第１の抗原結合ドメインは、その結合によって変化した立体構造を認識しつつ、そしてその立体構造の変化を生じた第１の共抑制分子または第１の共抑制分子リガンドと分子間力による結合を形成し得る。
一方、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方の分子内に立体構造変化がある場合には、第１の抗原結合ドメインは、その結合によって変化した第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方の立体構造を認識しつつ、そしてその立体構造の変化を生じた第１の共抑制分子または第１の共抑制分子リガンドと分子間力による結合を形成し得る。
In this embodiment, when the first antigen-binding domain forms a bond with either the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand by intermolecular forces, the first co-inhibitory molecule ligand is It is envisioned that there is an intramolecular conformational change in either or both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand when bound to the first co-inhibitory molecule. In this case, the first antigen-binding domain specifically recognizes the conformation changed by the binding between these two molecules.
For example, if there is a conformational change in one molecule of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand when the first co-inhibitory molecule ligand binds to the first co-inhibitory molecule, The first antigen-binding domain recognizes the three-dimensional structure changed by the binding, and binds to the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand that has undergone the change in three-dimensional structure by intermolecular force. can form.
On the other hand, if there is a conformational change in both the first co-inhibitory molecule ligand and the first co-inhibitory molecule ligand when the first co-inhibitory molecule ligand binds to the first co-inhibitory molecule ligand, The first antigen-binding domain recognizes the conformation of either the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand changed by the binding, and the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand with intermolecular forces.
該態様において、第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの両方と分子間力による結合を形成する場合には、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの分子内に立体構造変化があってもなくてもよい。この場合において仮に立体構造変化を生じるならば、第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方の立体構造に変化を生じ得る。
この場合において、第１の抗原結合ドメインは、第１の複合体に特有な原子の配置を認識し、そして第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの両方と分子間力による結合を形成し得る。この場合における第１の抗原結合ドメインが認識するすべての原子の配置は、第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子のみ、または第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドのみには存在しない。
In this embodiment, when the first antigen-binding domain forms an intermolecular bond with both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand, the first co-inhibitory molecule ligand is the first There may or may not be a conformational change within the molecules of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand upon binding to the co-inhibitory molecule of . In this case, if a conformational change occurs, the conformation of either or both of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand can be changed.
In this case, the first antigen-binding domain recognizes an arrangement of atoms unique to the first complex and binds both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand by intermolecular forces. can form The arrangement of all atoms recognized by the first antigen-binding domain in this case is either the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex, or the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex. co-inhibitory molecular ligands alone.
（ｂ－２）第２の態様
上述の（ｂ－１）とは別の態様において、第１の抗原結合ドメインは、第１の複合体に結合し得る。
(b-2) Second Aspect In an aspect different from (b-1) above, the first antigen-binding domain can bind to the first complex.
該態様において、第１の抗原結合ドメインの第１の複合体への結合活性は、第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子への結合活性よりも高い、第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドへの結合活性よりも高い、または第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子への結合活性と第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドへの結合活性の両方よりも高い。第１の抗原結合ドメインの第１の複合体への結合活性は、好ましくは、第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子への結合活性および第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドへの結合活性の両方よりも高い。 In this aspect, the first complex, wherein the binding activity of the first antigen-binding domain to the first complex is higher than the binding activity to the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex Forming a first complex with binding activity to the first co-inhibitory molecule that is higher than the binding activity to the first co-inhibitory molecule ligand that does not form the body, or to the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex higher than both binding activities to the first co-inhibitory molecule ligand that was not. The binding activity of the first antigen-binding domain to the first complex preferably includes the binding activity to the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex and the activity to form the first complex. The binding activity to the first co-inhibitory molecule ligand is higher than both.
該態様において、第１の抗原結合ドメインの第１の複合体への結合は、第１の複合体中の第１の共抑制分子への分子間力による結合であり得、第１の複合体中の第１の共抑制分子リガンドへの分子間力による結合であり得、または第１の複合体中の第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方との分子間力による結合であり得る。第１の抗原結合ドメインの第１の複合体への結合は、好ましくは、第１の複合体中の第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方との分子間力による結合であり得る。これら様々な結合の態様の存在は、第１の抗原結合ドメインが第１の複合体に結合し、上述の結合活性を有している限り、第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方に分子間力が形成され得ることを意味する。 In this embodiment, the binding of the first antigen-binding domain to the first complex can be binding by intermolecular forces to the first co-inhibitory molecule in the first complex, wherein the first complex or by intermolecular forces with both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex. can be a bond. The binding of the first antigen-binding domain to the first complex is preferably binding by intermolecular forces with both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex. can be The existence of these various binding modalities is the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule, as long as the first antigen-binding domain binds to the first complex and has the binding activity described above. It means that intermolecular forces can be formed on either one or both of the ligands.
該態様において、第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方と分子間力による結合を形成する場合には、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方に分子内の立体構造変化がある場合が想定される。この場合において、第１の抗原結合ドメインは、これら二つの分子間の結合によって変化した立体構造を、その結合による変化前の立体構造よりも認識しやすい。
たとえば、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの一方の分子内に立体構造変化がある場合には、第１の抗原結合ドメインは、その結合によって変化した立体構造をその変化前の立体構造よりも認識しやすく、そしてその立体構造の変化を生じた第１の共抑制分子または第１の共抑制分子リガンドと分子間力による結合を形成しやすい。
一方、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方の分子内に立体構造変化がある場合には、第１の抗原結合ドメインは、その結合によって変化した第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方の立体構造をそれらの変化前の立体構造よりも認識しやすく、そしてその立体構造の変化を生じた第１の共抑制分子または第１の共抑制分子リガンドと分子間力による結合を形成しやすい。
In this embodiment, when the first antigen-binding domain forms a bond with either the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand by intermolecular forces, the first co-inhibitory molecule ligand is It is envisioned that there is an intramolecular conformational change in either or both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand when bound to the first co-inhibitory molecule. In this case, the first antigen-binding domain recognizes the conformation changed by binding between these two molecules more easily than the conformation before the change caused by the binding.
For example, if there is a conformational change in one molecule of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand when the first co-inhibitory molecule ligand binds to the first co-inhibitory molecule, The first antigen-binding domain recognizes the conformation changed by the binding more easily than the conformation before the change, and the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibition molecule that has undergone the change in conformation It is easy to form a bond with a ligand by intermolecular force.
On the other hand, if there is a conformational change in both the first co-inhibitory molecule ligand and the first co-inhibitory molecule ligand when the first co-inhibitory molecule ligand binds to the first co-inhibitory molecule ligand, The first antigen-binding domain recognizes the conformation of either the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand changed by the binding more easily than the conformation before the change, and It is likely to form a bond with the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand that has undergone a conformational change due to intermolecular forces.
該態様において、第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの両方と分子間力による結合を形成する場合には、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの分子内に立体構造変化があってもなくてもよい。この場合において仮に立体構造変化を生じるならば、第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方の立体構造に変化を生じ得る。この場合において、第１の抗原結合ドメインは、第１の複合体に特有な原子の配置を第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子における原子の配置および第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドにおける原子の配置よりも認識しやすく、そして第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの両方と分子間力による結合を形成しやすい。この場合における第１の抗原結合ドメインが認識するすべての原子の配置は、第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子のみ、または第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドのみには存在しない。 In this embodiment, when the first antigen-binding domain forms an intermolecular bond with both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand, the first co-inhibitory molecule ligand is the first There may or may not be a conformational change within the molecules of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand upon binding to the co-inhibitory molecule of . In this case, if a conformational change occurs, the conformation of either or both of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand can be changed. In this case, the first antigen-binding domain has an atomic arrangement unique to the first complex and an atomic arrangement in the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex and the first complex. and are more likely to form bonds with both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand by intermolecular forces. The arrangement of all atoms recognized by the first antigen-binding domain in this case is either the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex, or the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex. co-inhibitory molecular ligands alone.
i) 結合活性
該態様における結合活性は、一般に用いられる分子間の結合活性の測定法を用いればよい。分子間の結合活性の測定法として、フローサイトメトリー（FCM）、表面プラズモン共鳴（SPR）、バイオレイヤー干渉（BLI）、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）が選択され得る。抗原結合分子が第１の抗原結合分子の一つのみを含む場合、抗原結合分子の第１の複合体への結合活性をこれらの測定法により測定した場合、抗原結合分子の第１の複合体へのアフィニティが測定される。抗原結合分子が第１の抗原結合分子の複数を含む場合、抗原結合分子の第１の複合体への結合活性をこれらの測定法により測定した場合、抗原結合分子の第１の複合体へのアビディティが測定される。
i) Binding Activity The binding activity in this embodiment may be measured by a generally used intermolecular binding activity measurement method. Flow cytometry (FCM), surface plasmon resonance (SPR), biolayer interference (BLI), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be selected as methods for measuring binding activity between molecules. When the antigen-binding molecule contains only one of the first antigen-binding molecules, when the binding activity of the antigen-binding molecule to the first complex is measured by these assays, the first complex of the antigen-binding molecule Affinity to is measured. When the antigen-binding molecule contains a plurality of first antigen-binding molecules, when the binding activity of the antigen-binding molecule to the first complex is measured by these assays, the binding activity of the antigen-binding molecule to the first complex is Avidity is measured.
該態様における結合活性は、フローサイトメトリーにより測定されることが好ましい。結合活性がフローサイトメトリーにより測定される場合、第１の複合体が細胞の表面上に形成されるため、第１の複合体における第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの結合態様が、他の測定法よりも生体内の環境により近づく。フローサイトメトリーにより測定された抗原結合分子の第１の複合体への結合活性は、生体内の環境を反映しやすい。 Binding activity in this embodiment is preferably measured by flow cytometry. Binding of the first co-inhibitory molecule to the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex, as the first complex is formed on the surface of the cell when the avidity is measured by flow cytometry The embodiment more closely approximates the in vivo environment than other measurements. The binding activity of the antigen-binding molecule to the first complex measured by flow cytometry tends to reflect the in vivo environment.
該態様における結合活性を測定するためのフローサイトメトリーの一例としては、第１の共抑制分子を強制発現し第１の共抑制分子リガンドを強制発現していない第１の細胞を用いて行われる。
該例においては、第１の可溶型ポリペプチドの存在下と非存在下において、第１の抗原結合ドメインの第１の細胞への結合活性が測定される。
該例においては、第１の可溶型ポリペプチドの存在下における第１の抗原結合ドメインの第１の細胞への結合活性が、第１の可溶型ポリペプチドの非存在下に比べて高い。
An example of flow cytometry for measuring the binding activity in this embodiment is performed using a first cell that forces expression of the first co-inhibitory molecule and does not force expression of the first co-inhibitory molecule ligand. .
In this example, the binding activity of the first antigen-binding domain to the first cell is measured in the presence and absence of the first soluble polypeptide.
In the example, the binding activity of the first antigen-binding domain to the first cell in the presence of the first soluble polypeptide is higher than in the absence of the first soluble polypeptide. .
第１の細胞は、第１の共抑制分子を強制発現しており、且つ第１の共抑制分子リガンドを強制発現していない動物由来の細胞であれば、如何なる細胞でよい。第１の細胞は、好ましくは実質的に第１の共抑制分子リガンドを発現していない。第１の細胞は、より好ましくは第１の共抑制分子リガンドを発現していない。
第１の細胞は、好ましくは浮遊培養できる細胞である。第１の細胞の種類としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞が挙げられる。
The first cell may be any animal-derived cell that forcibly expresses the first co-inhibitory molecule and does not forcibly express the first co-inhibitory molecule ligand. The first cell preferably does not substantially express the first co-inhibitory molecule ligand. The first cell more preferably does not express the first co-inhibitory molecule ligand.
The first cells are preferably cells that can be cultured in suspension. A first cell type includes cells derived from Chinese hamster ovary cells.
本例における測定に用いられる第１の抗原結合ドメインは、抗原結合分子に含まれる状態でもよく、抗原結合分子の一部の状態であってもよい。測定に用いられる第１の抗原結合ドメインは、抗原結合分子に含まれないアミノ酸配列が付加されていてもよい。
本例における測定に用いられる第１の可溶型ポリペプチドは、第１の共抑制分子リガンドの細胞外ドメインまたはその一部を含み且つ可溶型である限り、如何なるポリペプチドであってもよい。第１の共抑制分子リガンドの細胞外ドメインは、Ig-V様ドメインおよびIg-C様ドメインを含む。測定に用いられる第１の可溶型ポリペプチドは、少なくとも第１の共抑制分子リガンドのIg-V様ドメインを含んでいればよい。すなわち、測定に用いられる第１の可溶型ポリペプチドは、第１の共抑制分子リガンドのIg-V様ドメインを含み且つ可溶型である限り、如何なるポリペプチドであってもよい。測定に用いられる第１の可溶型ポリペプチドは、好ましくは第１の共抑制分子リガンドのIg-V様ドメインを含み且つ可溶型である。
The first antigen-binding domain used for measurement in this example may be contained in the antigen-binding molecule or may be a part of the antigen-binding molecule. An amino acid sequence that is not contained in the antigen-binding molecule may be added to the first antigen-binding domain used for measurement.
The first soluble polypeptide used for the measurement in this example may be any polypeptide as long as it contains the extracellular domain of the first co-inhibitory molecule ligand or a portion thereof and is soluble. . The extracellular domain of the first co-inhibitory molecule ligand comprises an Ig-V-like domain and an Ig-C-like domain. The first soluble polypeptide used for measurement should contain at least the Ig-V-like domain of the first co-inhibitory molecule ligand. That is, the first soluble polypeptide used for measurement may be any polypeptide as long as it contains the Ig-V-like domain of the first co-inhibitory molecule ligand and is soluble. The first soluble polypeptide used for measurement preferably comprises the Ig-V-like domain of the first co-inhibitory molecule ligand and is in soluble form.
該態様における結合活性を測定するためのフローサイトメトリーのもう一つの例としては、第１の共抑制分子リガンドを強制発現し第１の共抑制分子を強制発現していない第２の細胞を用いて行われる。
該例においては、第２の可溶型ポリペプチドの存在下と非存在下において、第１の抗原結合ドメインの第２の細胞への結合活性が測定される。
該例においては、第２の可溶型ポリペプチドの存在下における第１の抗原結合ドメインの第２の細胞への結合活性が、第２の可溶型ポリペプチドの非存在下に比べて高い。
Another example of flow cytometry for measuring the binding activity in this embodiment uses a second cell that forces expression of the first co-inhibitory molecule ligand and does not force expression of the first co-inhibition molecule. is done.
In this example, the binding activity of the first antigen-binding domain to the second cell is measured in the presence and absence of the second soluble polypeptide.
In this example, the binding activity of the first antigen-binding domain to the second cell in the presence of the second soluble polypeptide is higher than in the absence of the second soluble polypeptide. .
第２の細胞は、第１の共抑制分子リガンドを強制発現しており、且つ第１の共抑制分子を強制発現していない動物由来の細胞であれば、如何なる細胞でよい。第２の細胞は、好ましくは実質的に第１の共抑制分子を発現していない。第２の細胞は、より好ましくは第１の共抑制分子を発現していない。
第２の細胞は、好ましくは浮遊培養できる細胞である。第２の細胞の種類としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞が挙げられる。
The second cell may be any animal-derived cell that forcibly expresses the first co-inhibitory molecule ligand and does not forcibly express the first co-inhibitory molecule. The second cell preferably does not substantially express the first co-inhibitory molecule. The second cell more preferably does not express the first co-inhibitory molecule.
The second cells are preferably cells that can be cultured in suspension. A second cell type includes cells derived from Chinese hamster ovary cells.
本例における測定に用いられる第１の抗原結合ドメインは、抗原結合分子に含まれる状態でもよく、抗原結合分子の一部の状態であってもよい。測定に用いられる第１の抗原結合ドメインは、抗原結合分子に含まれないアミノ酸配列が付加されていてもよい。
本例における測定に用いられる第２の可溶型ポリペプチドは、第１の共抑制分子の細胞外ドメインまたはその一部を含み且つ可溶型である限り、如何なるポリペプチドであってもよい。第１の共抑制分子の細胞外ドメインは、Ig-V様ドメインを含む。測定に用いられる第２の可溶型ポリペプチドは、少なくとも第１の共抑制分子のIg-V様ドメインを含んでいればよい。すなわち、測定に用いられる第２の可溶型ポリペプチドは、第１の共抑制分子のIg-V様ドメインを含み且つ可溶型である限り、如何なるポリペプチドであってもよい。測定に用いられる第２の可溶型ポリペプチドは、好ましくは第１の共抑制分子のIg-V様ドメインを含み且つ可溶型である。
The first antigen-binding domain used for measurement in this example may be contained in the antigen-binding molecule or may be a part of the antigen-binding molecule. An amino acid sequence that is not contained in the antigen-binding molecule may be added to the first antigen-binding domain used for measurement.
The second soluble polypeptide used for measurement in this example may be any polypeptide as long as it contains the extracellular domain of the first co-inhibitory molecule or a portion thereof and is soluble. The extracellular domain of the first co-inhibitory molecule contains an Ig-V-like domain. The second soluble polypeptide used for measurement should contain at least the Ig-V-like domain of the first co-inhibitory molecule. That is, the second soluble polypeptide used for measurement may be any polypeptide as long as it contains the Ig-V-like domain of the first co-inhibitory molecule and is soluble. The second soluble polypeptide used for measurement preferably contains the Ig-V-like domain of the first co-inhibitory molecule and is in soluble form.
結合活性の具体的な態様として、以下の(a)および(b)のいずれか一方または両方の条件を満たす態様が挙げられる。
(a) 前記第１の共抑制分子を強制発現し前記第１の共抑制分子リガンドを強制発現していない第１の細胞を用いたフローサイトメトリーにおいて、前記第１の共抑制分子リガンドの細胞外ドメインまたはその一部を含む第１の可溶型ポリペプチドの存在下における前記第１の抗原結合ドメインの前記第１の細胞への結合活性が、前記第１の可溶型ポリペプチドの非存在下に比べて高い。
(b) 前記第１の共抑制分子リガンドを強制発現し前記第１の共抑制分子を強制発現していない第２の細胞を用いたフローサイトメトリーにおいて、前記第１の共抑制分子の細胞外ドメインまたはその一部を含む第２の可溶型ポリペプチドの存在下における前記第１の抗原結合ドメインの前記第２の細胞への結合活性が、前記第２の可溶型ポリペプチドの非存在下に比べて高い。
Specific embodiments of the binding activity include embodiments that satisfy one or both of the following conditions (a) and (b).
(a) cells of the first co-inhibitory molecule ligand in flow cytometry using a first cell that forcibly expresses the first co-inhibitory molecule but does not forcibly express the first co-inhibitory molecule ligand; The binding activity of the first antigen-binding domain to the first cell in the presence of the first soluble polypeptide containing the ectodomain or a portion thereof is determined by the non-binding activity of the first soluble polypeptide higher than in existence.
(b) in flow cytometry using a second cell that forcibly expresses the first co-inhibitory molecule ligand but does not forcibly express the first co-inhibitory molecule, The binding activity of the first antigen-binding domain to the second cell in the presence of a second soluble polypeptide comprising the domain or a portion thereof is reduced by the absence of the second soluble polypeptide. higher than below.
該具体的な態様において、(a)の第１の細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞由来であり得る。(b)の第２の細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞由来であり得る。第１の細胞および第２の細胞の両方がチャイニーズハムスター卵巣細胞由来であり得る。
該具体的な態様において、「強制発現」とは、細胞における遺伝子組換えによる外来的なタンパク質の発現である。
フローサイトメトリーは、当業者により通常用いられるものでよく、市販のフローサイトメトリーが用いられ得る。
第１の可溶型ポリペプチドは、第１の共抑制分子リガンドの細胞外ドメインまたはその一部を含むポリペプチドであればよく、そして好ましくは可溶型である。第１の共抑制分子リガンドの細胞外ドメインまたはその一部は、好ましくは第１の共抑制分子リガンドのIg-V様ドメインを含み且つ可溶型である。
第２の可溶型ポリペプチドは、第１の共抑制分子の細胞外ドメインまたはその一部を含むポリペプチドであればよく、そして好ましくは可溶型である。第１の共抑制分子の細胞外ドメインまたはその一部は、好ましくは第１の共抑制分子のIg-V様ドメインを含み且つ可溶型である。
In this specific embodiment, the first cell of (a) can be derived from Chinese Hamster Ovary cells. The second cell in (b) can be derived from Chinese Hamster Ovary cells. Both the first cell and the second cell can be derived from Chinese Hamster Ovary cells.
In this specific embodiment, "forced expression" is expression of a foreign protein by genetic recombination in cells.
Flow cytometry can be commonly used by those skilled in the art, and commercially available flow cytometry can be used.
The first soluble polypeptide may be any polypeptide comprising the extracellular domain of the first co-inhibitory molecule ligand or a portion thereof, and is preferably in soluble form. The extracellular domain of the first co-inhibitory molecule ligand or part thereof preferably comprises the Ig-V-like domain of the first co-inhibitory molecule ligand and is in soluble form.
The second soluble polypeptide may be any polypeptide comprising the extracellular domain of the first co-inhibitory molecule or a portion thereof, and is preferably in soluble form. The extracellular domain of the first co-inhibitory molecule or part thereof preferably comprises the Ig-V-like domain of the first co-inhibitory molecule and is in soluble form.
上記(a)の態様において結合活性が検出される機序として、初めに、第１の可溶型ポリペプチドの存在下において該第１の可溶型ポリペプチドが第１の細胞に強制発現する第１の共抑制分子に結合することにより、第１の複合体が該第１の細胞表面上に形成される。次いで、第１の抗原結合ドメインを含むポリペプチド（該ポリペプチドは抗原結合分子であってもよい。）が、形成された該第１の複合体に結合する。この結合がフローサイトメトリーで検出される。第１の抗原結合ドメインが第１の複合体に特異的に結合するものであるから、第１の可溶型ポリペプチドの非存在下においてはこの結合は検出されない。
上記(b)の態様において結合活性が検出される機序として、初めに、第２の可溶型ポリペプチドの存在下において該第２の可溶型ポリペプチドが第２の細胞に強制発現する第１の共抑制分子リガンドに結合することにより、第１の複合体が該第２の細胞表面上に形成される。次いで、第１の抗原結合ドメインを含むポリペプチド（該ポリペプチドは抗原結合分子であってもよい。）が、形成された該第１の複合体に結合する。この結合がフローサイトメトリーで検出される。第１の抗原結合ドメインが第１の複合体に特異的に結合するものであるから、第２の可溶型ポリペプチドの非存在下においてはこの結合は検出されない。
As a mechanism by which the binding activity is detected in the above embodiment (a), first, the first soluble polypeptide is forcibly expressed in the first cell in the presence of the first soluble polypeptide. A first complex is formed on the first cell surface by binding to the first co-inhibitory molecule. A polypeptide comprising the first antigen-binding domain (which may be an antigen-binding molecule) then binds to the first complex formed. This binding is detected by flow cytometry. Since the first antigen-binding domain specifically binds to the first complex, this binding is not detected in the absence of the first soluble polypeptide.
As a mechanism by which the binding activity is detected in the above embodiment (b), first, the second soluble polypeptide is forcibly expressed in the second cell in the presence of the second soluble polypeptide. A first complex is formed on the second cell surface by binding to the first co-inhibitory molecule ligand. A polypeptide comprising the first antigen-binding domain (which may be an antigen-binding molecule) then binds to the first complex formed. This binding is detected by flow cytometry. Since the first antigen binding domain specifically binds to the first complex, this binding is not detected in the absence of the second soluble polypeptide.
（ｂ－３）第３の態様
上述の（ｂ－１）および（ｂ－２）とは別の態様において、第１の抗原結合ドメインは、第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体に存在するエピトープに特異的に結合し得る。
該エピトープは、好ましくは第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子のみ、または第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドのみには存在しない。この態様には、第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子の一部分と第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドの一部分の両方をエピトープとする場合が包含されるほか、第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子には存在しないが第１の複合体を形成している第１の共抑制分子には存在する立体構造をエピトープとする場合および第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドには存在しないが第１の複合体を形成している第１の共抑制分子リガンドには存在する立体構造をエピトープとする場合のような後述する立体構造変化をエピトープとする場合が包含される。
(b-3) Third embodiment In an embodiment different from the above (b-1) and (b-2), the first antigen-binding domain comprises the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule. It can specifically bind to an epitope present in a first complex consisting of a first co-inhibitory molecule ligand to the molecule.
The epitope is preferably absent from the first co-inhibitory molecule alone not forming the first complex or only the first co-inhibitory molecule ligand not forming the first complex. In this aspect, when both a portion of the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex and a portion of the first co-inhibitory molecule ligand that does not form the first complex are used as epitopes In addition to encompassing Conformation present in the epitope and in the first co-inhibitory molecule ligand that does not form the first complex but not in the first co-inhibitory molecule ligand that does not form the first complex The epitope includes the case where the conformational change described below is used as the epitope, such as the case where the is used as the epitope.
該態様において、第１の抗原結合ドメインのエピトープへの特異的結合は、第１の複合体中の第１の共抑制分子への分子間力による結合であり得、第１の複合体中の第１の共抑制分子リガンドへの分子間力による結合であり得、または第１の複合体中の第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方との分子間力による結合であり得る。第１の抗原結合ドメインの該エピトープへの特異的結合は、好ましくは、第１の複合体中の第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方との分子間力による結合であり得る。これら様々な結合の態様の存在は、第１の抗原結合ドメインが該エピトープに特異的に結合している限り、第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方に分子間力が形成され得ることを意味する。該分子間力は、該第１の抗原結合ドメインと該エピトープの間に生じる分子間力であり得る。 In this embodiment, the specific binding of the first antigen-binding domain to the epitope can be binding by intermolecular forces to the first co-inhibitory molecule in the first complex, may be intermolecular binding to the first co-inhibitory molecule ligand, or in intermolecular binding to both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex. could be. The specific binding of the first antigen-binding domain to the epitope is preferably by intermolecular binding of both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex. could be. The existence of these different binding modalities can be attributed to either or both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand, so long as the first antigen binding domain specifically binds to the epitope. It means that intermolecular forces can be formed. The intermolecular force can be an intermolecular force that occurs between the first antigen binding domain and the epitope.
該態様において、第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方と分子間力による結合を形成する場合には、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方に分子内の立体構造変化がある場合が想定される。この場合において、第１の抗原結合ドメインは、これら二つの分子間の結合によって変化した立体構造をエピトープとして特異的に認識する。
たとえば、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの一方の分子内に立体構造変化がある場合には、第１の抗原結合ドメインは、その結合によって変化した立体構造をエピトープとして認識しつつ、そしてその立体構造の変化を生じた第１の共抑制分子または第１の共抑制分子リガンドと分子間力による結合を形成し得る。
一方、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの両方の分子内に立体構造変化がある場合には、第１の抗原結合ドメインは、その結合によって変化した第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方の立体構造をエピトープとして認識しつつ、そしてその立体構造の変化を生じた第１の共抑制分子または第１の共抑制分子リガンドと分子間力による結合を形成し得る。
In this embodiment, when the first antigen-binding domain forms a bond with either the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand by intermolecular forces, the first co-inhibitory molecule ligand is It is envisioned that there is an intramolecular conformational change in either or both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand when bound to the first co-inhibitory molecule. In this case, the first antigen-binding domain specifically recognizes, as an epitope, the conformation changed by the binding between these two molecules.
For example, if there is a conformational change in one molecule of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand when the first co-inhibitory molecule ligand binds to the first co-inhibitory molecule, The first antigen-binding domain recognizes the conformation changed by the binding as an epitope, and the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand and the intermolecular force that caused the change in conformation can form a bond.
On the other hand, if there is a conformational change in both the first co-inhibitory molecule ligand and the first co-inhibitory molecule ligand when the first co-inhibitory molecule ligand binds to the first co-inhibitory molecule ligand, The first antigen-binding domain recognizes, as an epitope, the conformation of either the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand that has changed due to its binding, and undergoes a conformational change. It can form an intermolecular bond with the first co-inhibitory molecule or the first co-inhibitory molecule ligand.
該態様において、第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの両方と分子間力による結合を形成する場合には、第１の共抑制分子リガンドが第１の共抑制分子に結合したときに第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの分子内に立体構造変化があってもなくてもよい。この場合において仮に立体構造変化を生じるならば、第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方の立体構造に変化を生じ得る。
この場合において、第１の抗原結合ドメインは、第１の複合体に特有な原子の配置をエピトープとして認識し、そして第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの両方におけるエピトープと分子間力による結合を形成し得る。この場合における第１の抗原結合ドメインが認識するエピトープにおけるすべての原子の配置は、第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子のみ、または第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドのみには存在しない。
In this embodiment, when the first antigen-binding domain forms an intermolecular bond with both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand, the first co-inhibitory molecule ligand is the first There may or may not be a conformational change within the molecules of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand upon binding to the co-inhibitory molecule of . In this case, if a conformational change occurs, the conformation of either or both of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand can be changed.
In this case, the first antigen-binding domain recognizes an arrangement of atoms unique to the first complex as an epitope, and the epitope and molecule in both the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand. Inter-force bonds can be formed. The arrangement of all atoms in the epitope recognized by the first antigen-binding domain in this case is either only the first co-inhibitory molecule not forming the first complex, or not forming the first complex. Absent only in the first co-inhibitory molecule ligand.
（ｂ－４）抗原結合分子の免疫シナプスにおける作用
上述の（ｂ－１）、（ｂ－２）および（ｂ－３）の態様において、抗原結合分子は、第１の複合体が存在する免疫シナプスにおいて、第１の共抑制分子の下流の第１の細胞内シグナルを活性化し得る。
「第１の共抑制分子の下流の第１の細胞内シグナル」とは、第１の共抑制分子を発現する細胞において、第１の共抑制分子が活性化したときに生じる細胞内シグナルを意味する。T細胞において、第１の細胞内シグナルの活性化はT細胞受容体からのシグナルを抑制する機能を有し得る。その結果として、T細胞の活性化が抑制され得る。ここで言うT細胞の活性化とは、T細胞の増殖や活性化型細胞への分化などの免疫が活性化する際に現れるT細胞の表現型のほか、免疫を賦活するサイトカイン産生増加のことである。T細胞としては、特に、CD4(+)FoxP3(-) T細胞、およびCD8(+) T細胞が挙げられる。
(b-4) Effect of antigen-binding molecule on immune synapse In the above-described embodiments (b-1), (b-2) and (b-3), the antigen-binding molecule At the synapse, a first intracellular signal downstream of the first co-inhibitory molecule may be activated.
The "first intracellular signal downstream of the first co-inhibitory molecule" means an intracellular signal that occurs when the first co-inhibitory molecule is activated in a cell that expresses the first co-inhibitory molecule. do. In T cells, activation of the first intracellular signal may have the function of suppressing the signal from the T cell receptor. As a result, T cell activation can be suppressed. Here, T cell activation refers to T cell phenotypes that appear when immunity is activated, such as T cell proliferation and differentiation into activated cells, as well as increased production of cytokines that stimulate immunity. is. T cells specifically include CD4(+)FoxP3(-) T cells, and CD8(+) T cells.
「免疫シナプス」とは、共抑制分子リガンドを発現している細胞と、共抑制分子を発現している免疫系の細胞とが近接し、接触し、それらの間に形成されるリング状の構造を意味する（Front Immunol 2016 Vol.7 Article 255, Immunology 2011 Vol.133 pp.420-425）。MHCと共抑制分子リガンドを発現している細胞と共抑制分子を発現しているT細胞の間に形成されたシナプスが、免疫シナプスとして例示される。 "Immune synapse" is a ring-shaped structure formed between cells expressing co-inhibitory molecule ligands and cells of the immune system expressing co-inhibitory molecules that are in close proximity and contact. (Front Immunol 2016 Vol.7 Article 255, Immunology 2011 Vol.133 pp.420-425). Synapses formed between cells expressing MHC and co-inhibitory molecule ligands and T cells expressing co-inhibitory molecules are exemplified as immune synapses.
（ｂ－５）第１の細胞内シグナルの強度の測定
一態様において、第１の共抑制分子の活性化により生じた第１の細胞内シグナルの強度は、in vitroの実験により測定され得る。この測定系で、抗原結合分子の存在下における第１の細胞内シグナルの強度が抗原結合分子の非存在下に比べて高い場合に、抗原結合分子によって第１の細胞内シグナルが活性化されたということができる。
(b-5) Measurement of the intensity of the first intracellular signal In one embodiment, the intensity of the first intracellular signal generated by the activation of the first co-inhibitory molecule can be measured by in vitro experiments. In this measurement system, when the intensity of the first intracellular signal in the presence of the antigen-binding molecule is higher than in the absence of the antigen-binding molecule, the first intracellular signal is activated by the antigen-binding molecule. It can be said that
該態様において、第１の共抑制分子を発現する第３の細胞と、抗原非依存的なT細胞受容体アクチベーターおよび第１の共抑制分子リガンドを発現する第４の細胞とが互いに接触可能な状態で用いられる測定系が、第１の細胞内シグナルの強度の測定系として例示される。該第３の細胞は、第１の共抑制分子の活性化により生じる下流の細胞内シグナルである第１の細胞内シグナルの強度を測定し得る細胞である。 In this embodiment, the third cell expressing the first co-inhibitory molecule and the fourth cell expressing the antigen-independent T cell receptor activator and the first co-inhibitory molecule ligand are contactable with each other. A measurement system used in such a state is exemplified as the first intracellular signal intensity measurement system. The third cell is a cell capable of measuring the intensity of the first intracellular signal, which is the downstream intracellular signal generated by activation of the first co-inhibitory molecule.
該測定系で第３の細胞における第１の細胞内シグナルが第４の細胞における第１の共抑制分子リガンドによって最大限に活性化している状態に至っている場合には、抗原結合分子が第１の細胞内シグナルを活性化したことを確認できない。したがって、該例示において第１の細胞内シグナルの強度の測定は、第４の細胞が発現する第１の共抑制分子リガンドにより第３の細胞における第１の細胞内シグナルの活性化が最大限に達していない条件で行われる。そのような条件とするために、第４の細胞における第１の共抑制分子リガンドに対する阻害抗体を用いることにより、第３の細胞における第１の細胞内シグナルを部分的に抑制する方法が適用され得る。第１の共抑制分子リガンドに対する阻害抗体には、公知の阻害抗体が適用され得る。たとえば、PD-L1に対する阻害抗体としては、YW243.55S70（US2016/0222117 A1を参照；重鎖可変領域配列番号：16および軽鎖可変領域配列番号：17）が用いられ得る。 When the first intracellular signal in the third cell is maximally activated by the first co-inhibitory molecule ligand in the fourth cell in the measurement system, the antigen-binding molecule is the first activation of intracellular signals cannot be confirmed. Therefore, in said exemplification, the measurement of the strength of the first intracellular signal is performed to maximize the activation of the first intracellular signal in the third cell by the first co-inhibitory molecule ligand expressed by the fourth cell. performed under unmet conditions. To achieve such conditions, a method of partially suppressing the first intracellular signal in the third cell by using an inhibitory antibody against the first co-inhibitory molecule ligand in the fourth cell is applied. obtain. A known inhibitory antibody can be applied as the inhibitory antibody against the first co-inhibitory molecule ligand. For example, as an inhibitory antibody against PD-L1, YW243.55S70 (see US2016/0222117 A1; heavy chain variable region SEQ ID NO: 16 and light chain variable region SEQ ID NO: 17) can be used.
該例示において、第３の細胞はJurkat細胞由来であり得る。第４の細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞由来であり得る。好ましい態様において、第３の細胞がJurkat細胞由来であり、且つ第４の細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞由来である。第４の細胞としては、Promega製のPD-L1を発現する人工抗原提示細胞（#J109A）が例示される。 In the exemplification, the third cell can be derived from Jurkat cells. A fourth cell may be derived from Chinese Hamster Ovary cells. In a preferred embodiment, the third cell is derived from Jurkat cells and the fourth cell is derived from Chinese Hamster Ovary cells. The fourth cell is exemplified by Promega's PD-L1-expressing artificial antigen-presenting cells (#J109A).
該例示において、第１の細胞内シグナルの強度は、第１の共抑制分子が活性化したときに生じる、第１の共抑制分子の細胞内ドメインと該細胞内ドメインに直接にまたは間接に相互作用する細胞内タンパク質との近接に基づき測定され得る。近接の検出系は、細胞内に存在する分子間の近接を観察でき、その強度を数値化できる検出系である限り、如何なる検出系でもよい。具体的には、NanoBRET（登録商標）が挙げられる。 In said exemplification, the strength of the first intracellular signal interacts directly or indirectly with the intracellular domain of the first co-inhibitory molecule and said intracellular domain that occurs when the first co-inhibitory molecule is activated. It can be measured based on proximity to working intracellular proteins. The proximity detection system may be any detection system as long as it can observe the proximity between molecules present in cells and quantify the intensity thereof. A specific example is NanoBRET (registered trademark).
該例示において、第１の共抑制分子の細胞内ドメインに直接にまたは間接に相互作用する細胞内タンパク質は、公知のものであってもよく、実験者により新たに発見されたものであってもよい。脱リン酸化酵素が、該細胞内タンパク質として例示される。具体的には、共抑制分子がPD-1である場合、脱リン酸化酵素はSHP-2が例示される。 In the exemplification, the intracellular protein that directly or indirectly interacts with the intracellular domain of the first co-inhibitory molecule may be known or newly discovered by an experimenter. good. Dephosphorylation enzymes are exemplified as the intracellular proteins. Specifically, when the co-inhibitory molecule is PD-1, the dephosphorylation enzyme is exemplified by SHP-2.
（ｂ－６）第１の細胞内シグナルによる免疫活性化シグナルの抑制の測定
一態様において、第１の共抑制分子の活性化により生じた第１の細胞内シグナルによって免疫の活性化シグナルが抑制されたか否かはin vitroの実験により確かめられ得る。その実験で、抗原結合分子の存在下における免疫の活性化シグナルの強度が抗原結合分子の非存在下に比べて低い場合に、抗原結合分子によって免疫の活性化シグナルが抑制されたということができる。免疫の活性化シグナルは、好ましくはT細胞におけるT細胞受容体の下流で活性化し得る第２の細胞内シグナルである。
(b-6) Measurement of suppression of immune activation signal by first intracellular signal In one aspect, immune activation signal is suppressed by first intracellular signal generated by activation of first co-inhibitory molecule It can be confirmed by in vitro experiments. In the experiment, when the strength of the immune activation signal in the presence of the antigen-binding molecule is lower than in the absence of the antigen-binding molecule, it can be said that the antigen-binding molecule suppresses the immune activation signal. . The immune activation signal is preferably a second intracellular signal that can be activated downstream of the T cell receptor in T cells.
該態様において、T細胞受容体および第１の共抑制分子を発現する第５の細胞と、抗原非依存的なT細胞受容体アクチベーターおよび第１の共抑制分子リガンドを発現する第６の細胞とが互いに接触可能な条件下で用いられる測定系が、第２の細胞内シグナルの強度の測定系として例示される。該第５の細胞は、T細胞受容体の活性化により生じる下流の細胞内シグナルである第２の細胞内シグナルの強度を測定し得、第１の細胞内シグナルの活性化によって前記第２の細胞内シグナルが抑制され得る細胞である。第６の細胞は、上述の（ｂ－５）で使われる第４の細胞を利用することができる。 In this embodiment, a fifth cell expressing the T cell receptor and the first co-inhibitory molecule and a sixth cell expressing the antigen-independent T cell receptor activator and the first co-inhibitory molecule ligand A measurement system that is used under conditions that allow contact with each other is exemplified as the second intracellular signal intensity measurement system. The fifth cell is capable of measuring the strength of a second intracellular signal that is a downstream intracellular signal resulting from activation of the T cell receptor, wherein activation of the first intracellular signal results in Cells in which intracellular signals can be suppressed. The sixth cell can use the fourth cell used in (b-5) above.
該測定系の該第５の細胞において、第２の細胞内シグナルが、第６の細胞の第１の共抑制分子リガンドの結合に起因して生じる第５の細胞の第１の共抑制分子の活性化とそれに続く第１の細胞内シグナルの活性化によって最大限に抑制されている状態に至っている場合には、抗原結合分子が第２の細胞内シグナルを抑制したことを確認できない。したがって、該例示において第２の細胞内シグナルの強度の測定は、第６の細胞が発現する第１の共抑制分子リガンドにより第５の細胞における第２の細胞内シグナルが最大限に抑制されていない条件で行われる。そのような条件とするために、第６の細胞における第１の共抑制分子リガンドに対する阻害抗体を用いることにより、第５の細胞における第２の細胞内シグナルの抑制を部分的に抑制する方法が適用され得る。第１の共抑制分子リガンドに対する阻害抗体には、公知の阻害抗体が適用され得る。たとえば、PD-L1に対する阻害抗体としては、YW243.55S70（US2016/0222117 A1を参照；重鎖可変領域配列番号：16および軽鎖可変領域配列番号：17）が用いられ得る。 In the fifth cell of the measurement system, the second intracellular signal of the first co-inhibitory molecule of the fifth cell is generated due to the binding of the first co-inhibitory molecule ligand of the sixth cell. When activation and subsequent activation of the first intracellular signal lead to a state of maximum suppression, it cannot be confirmed that the antigen-binding molecule suppresses the second intracellular signal. Therefore, the measurement of the intensity of the second intracellular signal in the exemplification indicates that the second intracellular signal in the fifth cell is maximally suppressed by the first co-inhibitory molecule ligand expressed by the sixth cell. under no conditions. In order to achieve such conditions, a method of partially suppressing suppression of the second intracellular signal in the fifth cell by using an inhibitory antibody against the first co-inhibitory molecule ligand in the sixth cell. can be applied. A known inhibitory antibody can be applied as the inhibitory antibody against the first co-inhibitory molecule ligand. For example, as an inhibitory antibody against PD-L1, YW243.55S70 (see US2016/0222117 A1; heavy chain variable region SEQ ID NO: 16 and light chain variable region SEQ ID NO: 17) can be used.
該例示において、第５の細胞はJurkat細胞由来であり得る。第６の細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞由来であり得る。好ましい態様において、第５の細胞がJurkat細胞由来であり、且つ第６の細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞由来である。第６の細胞としては、Promega社のPD-L1を発現する人工抗原提示細胞（#J109A）が例示される。 In the exemplification, the fifth cell can be derived from Jurkat cells. A sixth cell may be derived from Chinese Hamster Ovary cells. In a preferred embodiment, the fifth cell is derived from Jurkat cells and the sixth cell is derived from Chinese Hamster Ovary cells. The sixth cell is exemplified by Promega's PD-L1-expressing artificial antigen-presenting cells (#J109A).
該例示において、第２の細胞内シグナルの強度は、T細胞受容体シグナルの下流で働く転写因子による転写活性に基づき測定され得る。転写活性の測定系は、T細胞受容体シグナルの下流で働くことが知られている因子の修飾または結合によるものでも、遺伝子の発現量の変動によるものでもよい。該修飾は、特定のタンパク質のリン酸化状態の変動であってもよい。該結合は、特定のタンパク質間の相互作用であってもよい。遺伝子の発現量の該変動は、特定の転写因子が認識するプロモーターに何らかの酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を融合させたレポーター遺伝子アッセイでもよい。具体的には、第２の細胞内シグナルが転写因子のNFATの活性である態様において、NFAT応答配列（NFAT response element）下流にルシフェラーゼ（Luciferase）を発現制御できるように融合させたレポーター遺伝子が第５の細胞に導入され、そしてルシフェラーゼと反応した基質が発光されるアッセイが、T細胞受容体シグナルの下流シグナルの強度を測定できるレポーター遺伝子アッセイとして例示される。 In this exemplification, the strength of the second intracellular signal can be measured based on transcriptional activity by transcription factors acting downstream of the T cell receptor signal. The measurement system for transcriptional activity may be based on modification or binding of factors known to act downstream of T cell receptor signals, or based on changes in gene expression level. Said modification may be a change in the phosphorylation state of a particular protein. The binding may be an interaction between specific proteins. A reporter gene assay in which a gene encoding a protein having some enzymatic activity is fused to a promoter recognized by a specific transcription factor may be used to detect the change in gene expression level. Specifically, in an aspect in which the second intracellular signal is the activity of the transcription factor NFAT, a reporter gene fused downstream of the NFAT response element so that the expression of luciferase can be controlled is the first. 5 cells and reacted with luciferase, is exemplified as a reporter gene assay that can measure the intensity of the signal downstream of the T cell receptor signal.
（ｂ－７）第１の共抑制分子と第１の共抑制分子リガンドの組合せ
一態様において、第１の抗原結合ドメインが特異的に結合し得る第１の複合体中の第１の共抑制分子は、抗原結合分子を得ようとした者がその時点で知り得る範囲の共抑制分子から適宜選択され得る。第１の共抑制分子は、代表的にはPD-1、BTLA、TIGIT、LAG-3、CTLA4、およびTIM-3が挙げられる。
(b-7) Combination of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand In one aspect, the first co-inhibitory in the first complex to which the first antigen-binding domain can specifically bind The molecule can be appropriately selected from co-inhibitory molecules that are known at the time by a person who intends to obtain an antigen-binding molecule. First co-inhibitory molecules typically include PD-1, BTLA, TIGIT, LAG-3, CTLA4, and TIM-3.
一態様において、第１の複合体中の第１の共抑制分子リガンドは、抗原結合分子を得ようとした者がその時点で知り得る範囲の共抑制分子リガンドから適宜選択され得る。第１の共抑制分子リガンドは、代表的にはPD-L1、PD-L2、HVEM、CD155、CD112、MHCクラスII分子、CD80、CD86、galectin-9、phosphatidylserine、CEACAM-1、およびHMGB1が挙げられる。 In one aspect, the first co-inhibitory molecule ligand in the first complex can be appropriately selected from the range of co-inhibitory molecule ligands known at the time by the person seeking to obtain the antigen-binding molecule. First co-inhibitory molecular ligands typically include PD-L1, PD-L2, HVEM, CD155, CD112, MHC class II molecules, CD80, CD86, galectin-9, phosphatidylserine, CEACAM-1, and HMGB1. be done.
これらの態様において、第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンドの組合せは、好ましくはPD-1およびPD-L1の組合せ、PD-1およびPD-L2の組合せ、BTLAおよびHVEMの組合せ、TIGITおよびCD155の組合せ、TIGITおよびCD112の組合せ、LAG-3およびMHCクラスII分子の組合せ、CTLA4およびCD80の組合せ、CTLA4およびCD86の組合せ、TIM-3およびgalectin-9の組合せ、TIM-3およびphosphatidylserineの組合せ、TIM-3およびCEACAM-1の組合せ、ならびにTIM-3およびHMGB1の組合せからなる群から選択されるいずれか一つである。 In these embodiments, the combination of the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand is preferably a combination of PD-1 and PD-L1, a combination of PD-1 and PD-L2, a combination of BTLA and HVEM , TIGIT and CD155 combination, TIGIT and CD112 combination, LAG-3 and MHC class II molecule combination, CTLA4 and CD80 combination, CTLA4 and CD86 combination, TIM-3 and galectin-9 combination, TIM-3 and Any one selected from the group consisting of a combination of phosphatidylserine, a combination of TIM-3 and CEACAM-1, and a combination of TIM-3 and HMGB1.
（ｂ－８）多重特異性抗原結合分子
一態様において、抗原結合分子は、第２の抗原結合ドメインをさらに含んでいてもよい。その場合、抗原結合分子は、二以上の抗原またはエピトープに結合し得る多重特異性抗原結合分子である。該第２の抗原結合ドメインは、第２の共抑制分子リガンドと第２の複合体を形成し得る第２の共抑制分子に特異的に結合し得る。第２の抗原結合ドメインは、第２の複合体に結合し得ても結合し得ないくてもよい。第１の抗原結合ドメインが第１の複合体に結合することに特徴を有するのに対し、第２の抗原結合ドメインは第２の複合体に結合し得ても結合し得ないくてもよい点で、両ドメインは相違する。第２の抗原結合ドメインは、第２の共抑制分子に対するアゴニスト活性を有することが好ましい。
第２の抗原結合ドメインは、上述の特徴を有する限り、如何なる化学的構造を有していてもよく、たとえば、低分子化合物であってもよく、高分子化合物であってもよい。後述される「（ｂ－１０）他の態様」欄において、第２の抗原結合ドメインの具体的な態様が例示される。
(b-8) Multispecific antigen-binding molecule In one aspect, the antigen-binding molecule may further comprise a second antigen-binding domain. In that case, the antigen-binding molecule is a multispecific antigen-binding molecule capable of binding to more than one antigen or epitope. The second antigen binding domain is capable of specifically binding a second co-inhibitory molecule capable of forming a second complex with a second co-inhibitory molecule ligand. The second antigen binding domain may or may not bind to the second complex. The first antigen-binding domain is characterized by binding to the first complex, whereas the second antigen-binding domain may or may not bind to the second complex The two domains differ in that respect. Preferably, the second antigen binding domain has agonist activity towards the second co-inhibitory molecule.
The second antigen-binding domain may have any chemical structure as long as it has the characteristics described above, and may be, for example, a low-molecular-weight compound or a high-molecular-weight compound. Specific embodiments of the second antigen-binding domain are exemplified in the section "(b-10) Other Embodiments" described below.
該態様において、多重特異性抗原結合分子は、第１の複合体が存在する免疫シナプスにおいて、第２の共抑制分子の下流の第３の細胞内シグナルを活性化し得る。第３の細胞内シグナルの強度は、上述の（ｂ－５）における「第１の細胞内シグナルの強度の測定」と同様にして測定され得る。第３の細胞内シグナルの強度を測定する場合には、「第１の細胞内シグナルの強度の測定」における、第１の共抑制分子が第２の共抑制分子に、第１の共抑制分子リガンドが第２の共抑制分子リガンドに、それぞれ置き換えられる。多重特異性抗原結合分子が第２の共抑制分子の下流の第３の細胞内シグナルを活性化し得るのは、第２の抗原結合ドメインが有する第２の共抑制分子に対するアゴニスト活性であることが好ましい。 In this embodiment, the multispecific antigen binding molecule can activate a third intracellular signal downstream of the second co-inhibitory molecule at the immune synapse where the first complex resides. The intensity of the third intracellular signal can be measured in the same manner as "measurement of the intensity of the first intracellular signal" in (b-5) above. When measuring the intensity of the third intracellular signal, in the "measurement of the intensity of the first intracellular signal", the first co-inhibitory molecule is the second co-inhibitory molecule, the first co-inhibitory molecule Each ligand is replaced by a second co-inhibitory molecule ligand. The ability of the multispecific antigen-binding molecule to activate the third intracellular signal downstream of the second co-inhibitory molecule is the agonistic activity of the second antigen-binding domain to the second co-inhibitory molecule. preferable.
該態様において、該第３の細胞内シグナルの活性化により、第２の細胞内シグナルが抑制され得る。第２の細胞内シグナルの強度は、上述の（ｂ－６）における「第１の細胞内シグナルによる免疫活性化シグナルの抑制の測定」と同様にして測定され得る。 In this embodiment, activation of the third intracellular signal may suppress the second intracellular signal. The intensity of the second intracellular signal can be measured in the same manner as "measurement of suppression of immunostimulatory signal by first intracellular signal" in (b-6) above.
該態様において、第２の抗原結合ドメインの第２の共抑制分子への結合は、好ましくは第２の共抑制分子リガンドの第２の共抑制分子への結合と競合しない。 In this embodiment, binding of the second antigen binding domain to the second co-inhibitory molecule preferably does not compete with binding of the second co-inhibitory molecule ligand to the second co-inhibitory molecule.
（ｂ－９）第２の共抑制分子と第２の共抑制分子リガンドの組合せ
一態様において、第２の抗原結合ドメインが特異的に結合し得る第２の共抑制分子は、多重特異性抗原結合分子を得ようとした者がその時点で知り得る範囲の共抑制分子から適宜選択され得る。第２の共抑制分子は、代表的にはPD-1、BTLA、TIGIT、LAG-3、CTLA4、およびTIM-3が挙げられる。
(b-9) A combination of a second co-inhibitory molecule and a second co-inhibitory molecule ligand In one aspect, the second co-inhibitory molecule to which the second antigen-binding domain can specifically bind is a multispecific antigen The co-inhibitory molecule can be appropriately selected from the range known at the time by a person who intends to obtain the binding molecule. Second co-inhibitory molecules typically include PD-1, BTLA, TIGIT, LAG-3, CTLA4, and TIM-3.
一態様において、第２の共抑制分子と第２の複合体を形成し得る第２の共抑制分子リガンドは、多重特異性抗原結合分子を得ようとした者がその時点で知り得る範囲の共抑制分子リガンドから適宜選択され得る。第２の共抑制分子リガンドは、代表的にはPD-L1、PD-L2、HVEM、CD155、CD112、MHCクラスII分子、CD80、CD86、galectin-9、phosphatidylserine、CEACAM-1、およびHMGB1が挙げられる。 In one embodiment, the second co-inhibitory molecule ligand capable of forming a second complex with the second co-inhibitory molecule is a co-inhibitory molecule within the range known at the time by a person seeking to obtain a multispecific antigen-binding molecule. It can be appropriately selected from inhibitory molecule ligands. Second co-inhibitory molecular ligands typically include PD-L1, PD-L2, HVEM, CD155, CD112, MHC class II molecules, CD80, CD86, galectin-9, phosphatidylserine, CEACAM-1, and HMGB1. be done.
これらの態様において、第２の共抑制分子および第２の共抑制分子リガンドの組合せは、好ましくはPD-1およびPD-L1の組合せ、PD-1およびPD-L2の組合せ、BTLAおよびHVEMの組合せ、TIGITおよびCD155の組合せ、TIGITおよびCD112の組合せ、LAG-3およびMHCクラスII分子の組合せ、CTLA4およびCD80の組合せ、CTLA4およびCD86の組合せ、TIM-3およびgalectin-9の組合せ、TIM-3およびphosphatidylserineの組合せ、TIM-3およびCEACAM-1の組合せ、ならびにTIM-3およびHMGB1の組合せからなる群から選択されるいずれか一つである。 In these embodiments, the combination of the second co-inhibitory molecule and the second co-inhibitory molecule ligand is preferably a combination of PD-1 and PD-L1, a combination of PD-1 and PD-L2, a combination of BTLA and HVEM , TIGIT and CD155 combination, TIGIT and CD112 combination, LAG-3 and MHC class II molecule combination, CTLA4 and CD80 combination, CTLA4 and CD86 combination, TIM-3 and galectin-9 combination, TIM-3 and Any one selected from the group consisting of a combination of phosphatidylserine, a combination of TIM-3 and CEACAM-1, and a combination of TIM-3 and HMGB1.
（ｂ－１０）他の態様
他の態様において、第１の複合体中に第１の共抑制分子の一分子が存在していてもよく、第１の共抑制分子の複数の分子が存在していてもよい。第１の複合体中に第１の共抑制分子リガンドの一分子が存在していてもよく、第１の共抑制分子リガンドの複数の分子が存在していてもよい。第１の複合体は、第１の共抑制分子および第１の共抑制分子リガンド以外の分子を含んでいてもよい。
(b-10) Other Embodiments In another embodiment, one molecule of the first co-inhibitory molecule may be present in the first complex, and a plurality of molecules of the first co-inhibitory molecule are present in the first complex. may be There may be one molecule of the first co-inhibitory ligand in the first complex, or there may be multiple molecules of the first co-inhibitory ligand. The first complex may comprise molecules other than the first co-inhibitory molecule and the first co-inhibitory molecule ligand.
他の態様において、第１の抗原結合ドメインは、抗体の可変領域またはその対象抗原への結合性のその断片であり得る。第１の抗原結合ドメインは、好ましくは一の抗体の可変領域またはその対象抗原への結合性のその断片である。該態様における該「一の抗体の可変領域またはその対象抗原への結合性のその断片」は、一のアームであることを意味する。第１の抗原結合ドメインは、一のアームのみで第１の複合体に特異的に結合し得る。そうすることにより、第１の複合体が免疫シナプスに存在するときに、抗原結合分子は該免疫シナプスに局在し得る。 In other embodiments, the first antigen-binding domain can be the variable region of an antibody or fragment thereof that is capable of binding to the target antigen. The first antigen-binding domain is preferably the variable region of an antibody or a fragment thereof that is capable of binding the target antigen. The "variable region of an antibody or its target antigen-binding fragment" in this embodiment means an arm. The first antigen-binding domain can specifically bind the first complex with only one arm. By doing so, the antigen-binding molecule can localize to the immune synapse when the first complex is present at the immune synapse.
他の態様において、第２の抗原結合ドメインは、抗体の可変領域またはその対象抗原への結合性のその断片であり得る。第２の抗原結合ドメインは、好ましくは一の抗体の可変領域またはその対象抗原への結合性のその断片である。該態様における該「一の抗体の可変領域またはその対象抗原への結合性のその断片」は、一のアームであることを意味する。第２の抗原結合ドメインは、一のアームのみで第２の共抑制分子に特異的に結合し得る。そのような結合により、第２の抗原結合ドメインは第３の細胞内シグナルを活性化し得る。 In other embodiments, the second antigen binding domain can be the variable region of an antibody or fragment thereof that is capable of binding to the target antigen. The second antigen binding domain is preferably the variable region of an antibody or a fragment thereof that is capable of binding the target antigen. The "variable region of an antibody or its target antigen-binding fragment" in this embodiment means an arm. The second antigen binding domain may specifically bind the second co-inhibitory molecule with only one arm. Upon such binding, the second antigen binding domain can activate a third intracellular signal.
第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインの両方が、抗体の可変領域またはその対象抗原への結合性のその断片であることが好ましい。 Both the first antigen-binding domain and the second antigen-binding domain are preferably antibody variable regions or fragments thereof that are capable of binding to the target antigen.
他の態様において、第１の共抑制分子リガンドは、第２の共抑制分子リガンドと同じであってもよく、異なっていてもよい。第１の共抑制分子は、第２の共抑制分子と同じであってもよく、異なっていてもよい。それらの下流シグナルにおいても同様に、第１の細胞内シグナルは、第３の細胞内シグナルと同じであってもよく、異なっていてもよい。第１の共抑制分子が第２の共抑制分子と同じである場合、好ましくは第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインが結合する共抑制分子内のエピトープは互いに異なる。 In other embodiments, the first co-inhibitory molecule ligand may be the same as or different from the second co-inhibitory molecule ligand. The first co-inhibitory molecule may be the same as or different from the second co-inhibitory molecule. Similarly in their downstream signals, the first intracellular signal may be the same as or different from the third intracellular signal. When the first co-inhibitory molecule is the same as the second co-inhibitory molecule, preferably the epitopes in the co-inhibitory molecule bound by the first antigen-binding domain and the second antigen-binding domain are different from each other.
他の態様において、抗原結合分子は抗体の定常領域をさらに含み得る。抗体の定常領域における少なくとも１残基が、天然型抗体の定常領域の相当する位置のアミノ酸残基と異なっていてもよい。さらなる態様において、抗原結合分子は抗体または抗体断片であり得る。該抗体は、好ましくは単離された抗体である。 In other embodiments, the antigen-binding molecule can further comprise an antibody constant region. At least one residue in the constant region of the antibody may differ from the amino acid residue at the corresponding position in the constant region of the native antibody. In further embodiments, the antigen binding molecule can be an antibody or antibody fragment. The antibody is preferably an isolated antibody.
他の態様において、抗原結合分子は、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメインおよび抗体の定常領域以外に、ポリペプチド、糖鎖、または低分子化合物を含み得る。これらの構成は、互いにリンカーや共有結合により連結されていてもよく、分子間力で複合体として存在していてもよい。すべての構成が直接的にまたはリンカーを介して共有結合により結合されていることが好ましい。リンカーの種類は、医薬に用い得るものである限り特に限定されない。 In other embodiments, the antigen-binding molecule may contain a polypeptide, sugar chain, or low-molecular-weight compound in addition to the first antigen-binding domain, the second antigen-binding domain, and the constant region of the antibody. These structures may be linked to each other by linkers or covalent bonds, or may exist as a complex due to intermolecular forces. Preferably, all constituents are covalently linked directly or via linkers. The type of linker is not particularly limited as long as it can be used for medicine.
（ｂ－１１）製法
本発明の別の局面において、上述の抗原結合分子の製造方法が提供される。
一態様において、抗原結合分子の製造方法は、該抗原結合分子をコードする核酸を含む細胞を培養することを含み得る。
(b-11) Manufacturing method In another aspect of the present invention, a method for manufacturing the antigen-binding molecule described above is provided.
In one aspect, a method for producing an antigen-binding molecule can comprise culturing a cell containing a nucleic acid encoding the antigen-binding molecule.
他の態様において、抗原結合分子の製造方法は、第１の共抑制分子またはその部分ポリペプチドおよび第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドまたはその部分ポリペプチドを含む第３の複合体を非ヒト動物に免疫することを含み得る。該第３の複合体は、該第１の共抑制分子またはその部分ポリペプチドを該第１の共抑制分子リガンドまたはその部分ポリペプチドにリンカーを介するか、化学結合により直接的に結合させた１分子であり得る。
該リンカーは該第１の共抑制分子またはその部分ポリペプチドを該第１の共抑制分子リガンドまたはその部分ポリペプチドに化学的に結合できるものである限り特に制限されない。該化学結合は第３の複合体を抗原として機能させ得るものである限り特に制限されない。該化学結合の例として共有結合が挙げられる。該化学結合が共有結合であれば、第３の複合体の安定性が高められる。該共有結合は、システイン残基の側鎖に存在するチオール基を利用したジスルフィド結合が挙げられる。
In another embodiment, the method for producing an antigen-binding molecule comprises a first co-inhibitory molecule or a partial polypeptide thereof and a third complex comprising a first co-inhibitory molecule ligand for the first co-inhibitory molecule or a partial polypeptide thereof It can involve immunizing the body against a non-human animal. The third complex is formed by directly binding the first co-inhibitory molecule or partial polypeptide thereof to the first co-inhibitory molecule ligand or partial polypeptide thereof via a linker or chemically. It can be a molecule.
The linker is not particularly limited as long as it can chemically bind the first co-inhibitory molecule or partial polypeptide thereof to the first co-inhibitory molecule ligand or partial polypeptide thereof. The chemical bond is not particularly limited as long as it allows the third complex to function as an antigen. Examples of such chemical bonds include covalent bonds. If the chemical bond is a covalent bond, the stability of the third complex is enhanced. The covalent bond includes a disulfide bond utilizing a thiol group present on the side chain of a cysteine residue.
該製造方法は、該第３の複合体を免疫した該非ヒト動物から、該抗原結合分子を含む血漿または血液を採取することを含み得る。該製造方法は、該血漿または該血液から、純度を高めた前記抗原結合分子を含有する組成物を得ることをさらに含み得る。
該態様において、該製造方法において、抗原結合分子はポリクローナル抗体であり得る。
The production method may comprise collecting plasma or blood containing the antigen-binding molecule from the non-human animal immunized with the third complex. The production method may further comprise obtaining a composition containing the antigen-binding molecule with increased purity from the plasma or the blood.
In this aspect, in the production method, the antigen-binding molecule can be a polyclonal antibody.
該製造方法は、第３の複合体を免疫した非ヒト動物から、該抗原結合分子を発現する細胞クローンを単離することを含み得る。該製造方法は、該細胞クローンから前記抗原結合分子をコードする核酸を抽出し、単離することをさらに含み得る。該製造方法は、該核酸を組み換えることをさらに含み得る。該製造方法は、該組み換えられた核酸を他の細胞に導入し、前記抗原結合分子を前記他の細胞に発現させることをさらに含み得る。該製造方法は、該発現させた抗原結合分子を含有する組成物を得ることをさらに含み得る。該製造方法は、該組成物における前記発現させた抗原結合分子の純度を高めることをさらに含み得る。 The production method can comprise isolating cell clones expressing the antigen-binding molecule from the non-human animal immunized with the third conjugate. The production method may further comprise extracting and isolating the nucleic acid encoding the antigen-binding molecule from the cell clone. The manufacturing method may further comprise recombining the nucleic acid. The production method may further comprise introducing the recombinant nucleic acid into another cell to express the antigen-binding molecule in the other cell. The manufacturing method can further comprise obtaining a composition containing the expressed antigen-binding molecule. The production method may further comprise increasing the purity of the expressed antigen-binding molecule in the composition.
Ｃ．抗原結合分子の用途
（ｃ－１）共抑制分子アゴニスト
本発明の別の局面において、共抑制分子アゴニストが提供される。
一態様において、共抑制分子アゴニストは上述の抗原結合分子を含む。該共抑制分子アゴニストは、共抑制分子に対してアゴニストとしての作用を期待して使用された場合のほか、共抑制分子に対するアゴニストとして予期せずに使用したが、該使用の結果として共抑制分子に対してアゴニスト活性を有していたまたは有していることが判明した場合も包含する。
C. Use of antigen-binding molecule (c-1) Co-inhibitory molecule agonist In another aspect of the present invention, a co-inhibitory molecule agonist is provided.
In one aspect, the co-inhibitory molecule agonist comprises an antigen binding molecule as described above. The co-inhibitory molecule agonist has been unexpectedly used as an agonist to the co-inhibitory molecule, in addition to being used with the expectation of acting as an agonist to the co-inhibitory molecule, but as a result of the use It also includes cases where it was or was found to have agonist activity against.
（ｃ－２）共抑制分子シグナル活性化剤
本発明の別の局面において、共抑制分子シグナル活性化剤が提供される。
一態様において、共抑制分子シグナル活性化剤は上述の抗原結合分子を含有する。該共抑制分子シグナル活性化剤は、共抑制分子に対してアゴニストとしての作用を期待して使用された場合のほか、共抑制分子に対するアゴニストとして予期せずに使用したが、該使用の結果として共抑制分子に対してアゴニスト活性を有していたまたは有していることが判明した場合も包含する。
(c-2) Co-inhibitory molecule signal activator In another aspect of the present invention, a co-inhibitory molecule signal activator is provided.
In one aspect, the co-inhibitory molecule signaling activator comprises an antigen binding molecule as described above. The co-inhibitory molecule signal activator has been unexpectedly used as an agonist to a co-inhibitory molecule, in addition to the case where it is expected to act as an agonist to the co-inhibitory molecule, but as a result of the use Cases that have or are found to have agonistic activity to co-inhibitory molecules are also included.
（ｃ－３）医薬組成物
本発明の別の局面において、医薬組成物が提供される。
一態様において、医薬組成物は上述の抗原結合分子を含有し得る。該医薬組成物は、免疫の異常亢進に起因する疾患を治療するまたは予防するために用いられ得る。免疫の異常亢進に起因する疾患としては、自己免疫疾患が挙げられる。
(c-3) Pharmaceutical Composition In another aspect of the present invention, a pharmaceutical composition is provided.
In one aspect, the pharmaceutical composition may contain the antigen-binding molecules described above. The pharmaceutical composition can be used to treat or prevent diseases caused by immune hypersensitivity. Diseases caused by abnormal hyperimmunity include autoimmune diseases.
「自己免疫疾患」は、その個体自身の組織から生じかつその個体自身の組織に対して向けられる非悪性疾患または障害のことをいう。本明細書で、自己免疫疾患は、悪性またはがん性の疾患または状態を明確に除外するものであり、特にB細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病 (acute lymphoblastic leukemia: ALL)、慢性リンパ球性白血病 (chronic lymphocytic leukemia: CLL)、ヘアリー細胞白血病、および慢性骨髄芽球性白血病を除外する。自己免疫疾患または障害の例は、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：乾癬および皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患などの炎症性反応；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患に関連する反応（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群；adult respiratory distress syndrome: ARDSを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；例えば湿疹および喘息ならびにT細胞の浸潤および慢性炎症反応を伴う他の状態などのアレルギー性状態；アテローム硬化；白血球接着不全症；関節リウマチ；全身性エリテマトーデス (systemic lupus erythematosus: SLE) （ループス腎炎、皮膚ループスを含むがこれらに限定されない）；糖尿病（例えば、I型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；橋本甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；ならびに典型的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症、および血管炎において見られるサイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫反応；悪性貧血（アジソン病）；白血球の漏出を伴う疾患；中枢神経系 (central nervous system: CNS) 炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（クリオグロブリン血症またはクームス陽性貧血を含むがこれらに限定されない）；重症筋無力症；抗原‐抗体複合体介在性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート‐イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病；スティフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体性腎炎；IgA腎症；IgM多発性ニューロパシー；免疫性血小板減少性紫斑病（immune thrombocytopenic purpura: ITP）または自己免疫性血小板減少症。 "Autoimmune disease" refers to a non-malignant disease or disorder arising from and directed against the individual's own tissues. As used herein, autoimmune disease specifically excludes malignant or cancerous diseases or conditions, in particular B-cell lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic Exclude chronic lymphocytic leukemia (CLL), hairy cell leukemia, and chronic myeloblastic leukemia. Examples of autoimmune diseases or disorders include, but are not limited to: inflammatory reactions such as inflammatory skin diseases including psoriasis and dermatitis (e.g., atopic dermatitis); scleroderma and sclerosis; inflammatory bowel disease-related reactions (e.g., Crohn's disease and ulcerative colitis); respiratory distress syndrome (including adult respiratory distress syndrome (ARDS)); dermatitis; colitis; glomerulonephritis; allergic conditions such as eczema and asthma and other conditions with T-cell infiltration and chronic inflammatory responses; atherosclerosis; rheumatoid arthritis; systemic lupus erythematosus (SLE) (including but not limited to lupus nephritis, cutaneous lupus); diabetes (e.g., type I diabetes or insulin-dependent diabetes mellitus); multiple sclerosis; Raynaud's syndrome; allergic encephalomyelitis; Sjogren's syndrome; juvenile-onset diabetes; and by cytokines and T lymphocytes typically seen in tuberculosis, sarcoidosis, polymyositis, granulomatosis, and vasculitis mediated immune reactions associated with acute and delayed-type hypersensitivity; pernicious anemia (Addison's disease); diseases with extravasation of leukocytes; central nervous system (CNS) inflammatory disorders; anemia (including but not limited to cryoglobulinemia or Coombs' positive anemia); myasthenia gravis; antigen-antibody complex-mediated disease; antiglomerular basement membrane disease; antiphospholipid syndrome; allergic neuritis; Graves disease; Lambert-Eaton myasthenic syndrome; bullous pemphigoid; Nephropathy; IgM polyneuropathy; immune thrombocytopenic purpura (ITP) or autoimmune thrombocytopenia.
該態様において、医薬組成物は他の成分を含み得る。該他の成分としては、対象疾患に適用される他の有効成分、および薬学的許容される担体が挙げられる。該他の有効成分は、対象疾患に応じて適宜選択され得、特に限定されない。該薬学的許容される担体は、特に限定されず、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤が挙げられる。該医薬組成物には、該他の成分の一種以上が使用され得る。 In this aspect, the pharmaceutical composition may contain other ingredients. The other ingredients include other active ingredients applied to target diseases and pharmaceutically acceptable carriers. The other active ingredient may be appropriately selected depending on the target disease and is not particularly limited. The pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited and includes buffers, excipients, stabilizers, or preservatives. One or more of the other ingredients may be used in the pharmaceutical composition.
（ｃ－４）複合体の検出剤および検出方法
本発明の別の局面において、第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体の検出剤が提供される。
一態様において、該検出剤は上述の抗原結合分子を含有し得る。第１の複合体は、目視ではその存在は分からないが、該検出剤によってその存在が明らかにされる。該検出剤が使用される対象は、第１の複合体が存在すると疑われるものであれば特に限定されず、生体、生体内の組織、生体から採取されたサンプル、または生体外に存在する何らかの混合物もしくは細胞であり得る。
(c-4) Complex detection agent and detection method In another aspect of the present invention, a first complex comprising a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand for the first co-inhibitory molecule is provided.
In one aspect, the detection agent may contain an antigen-binding molecule as described above. The presence of the first complex is not visible to the naked eye, but is revealed by the detecting agent. The subject for which the detection agent is used is not particularly limited as long as it is suspected that the first complex exists. It can be a mixture or cells.
本発明の別の局面において、第１の共抑制分子および該第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体の検出方法が提供される。
一態様において、該検出方法は上述の抗原結合分子を免疫細胞に接触させることを含み得る。
該検出方法において、抗原提示細胞が該免疫細胞に近接していてもよい。該免疫細胞は第１の共抑制分子を発現していてもよく、該抗原提示細胞は第１の共抑制分子リガンドを発現していてもよい。該免疫細胞はT細胞であり得る。該検出方法は、生体内に適用されてもよく、生体外で適用されてもよい。該検出方法が生体外で適用される場合には、該免疫細胞は生きたまま該抗原結合分子と接触させてもよく、スライドグラス上に固定化されていてもよい。該検出方法において、該免疫細胞は組織中に存在していてもよく、該免疫細胞以外の一以上の細胞と混在していてもよい。
In another aspect of the invention, a method is provided for detecting a first complex consisting of a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand to the first co-inhibitory molecule.
In one aspect, the detection method can comprise contacting an immune cell with an antigen-binding molecule as described above.
In the detection method, antigen-presenting cells may be in close proximity to the immune cells. The immune cell may express a first co-inhibitory molecule and the antigen-presenting cell may express a first co-inhibitory molecule ligand. The immune cells can be T cells. The detection method may be applied in vivo or ex vivo. When the detection method is applied in vitro, the immune cells may be brought into contact with the antigen-binding molecule while alive, or may be immobilized on a slide glass. In the detection method, the immune cells may be present in the tissue, or mixed with one or more cells other than the immune cells.
（ｃ－５）免疫を抑制する方法
本発明の別の局面において、免疫を抑制する方法が提供される。
一態様において、該方法は上述の抗原結合分子を対象に投与することを含み得る。対象の体内において、T細胞が抗原提示細胞によって活性化されている場合、またはT細胞が抗原提示細胞によって活性化されることが予期される場合、該抗原結合分子が該対象に投与されることにより、該T細胞の活性化が抑えられ、該対象の免疫が抑制される。
T細胞が抗原提示細胞によって活性化されるとき、該T細胞におけるT細胞受容体の下流シグナルが活性化される。一方、抗原提示細胞に発現する第１の共抑制分子リガンドがT細胞に発現する第１の共抑制分子と結合し第１の複合体を形成する。該抗原結合分子は、該第１の複合体に結合し、第１の共抑制分子の下流シグナルを活性化する。該方法においては、前述の活性化されたT細胞受容体の下流シグナルが、活性化された第１の共抑制分子の下流シグナルによって抑制されることにより、対象の免疫が抑制される機序が想定される。
(c-5) Method for Suppressing Immunity In another aspect of the present invention, a method for suppressing immunity is provided.
In one aspect, the method can comprise administering an antigen-binding molecule as described above to a subject. When T cells are activated by antigen-presenting cells in the subject's body, or when T cells are expected to be activated by antigen-presenting cells, the antigen-binding molecule is administered to the subject. This suppresses the activation of the T cells and suppresses the subject's immunity.
When a T cell is activated by an antigen presenting cell, downstream signals of the T cell receptor on the T cell are activated. On the other hand, the first co-inhibitory molecule ligand expressed in antigen-presenting cells binds to the first co-inhibitory molecule expressed in T cells to form a first complex. The antigen-binding molecule binds to the first complex and activates the downstream signal of the first co-inhibitory molecule. In the method, the mechanism by which the immunity of the subject is suppressed by suppressing the downstream signal of the activated T cell receptor by the downstream signal of the activated first co-inhibitory molecule is is assumed.
本発明の抗原結合分子によれば、免疫シナプスに局在する共抑制分子とそのリガンドからなる複合体に特異的に結合することで免疫シナプスを標的とし、該共抑制分子に対するアゴニスト活性を有することから、該抗原結合分子は自己免疫疾患を含む疾患を治療または予防するための治療薬またはその候補になり得る。該抗原結合分子は、少なくとも第１の抗原結合ドメインを含むことにより、免疫シナプスにおいて共抑制分子に対するアゴニスト活性を有する。該抗原結合分子は、第１の抗原結合ドメインに加えて、第２の抗原結合ドメインを含む多重抗原結合分子とすることにより、免疫シナプスにおいて共抑制分子に対する顕著なアゴニスト活性を有する。
一方、共刺激分子へのアゴニスト活性を有する抗原結合分子を得ようと企図した場合、上述の抗原結合分子の第１の抗原結合ドメインが特異的に結合する第１の複合体に含まれる第１の共抑制分子および該第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドは、それぞれ第１の共刺激分子および該第１の共刺激分子に対する第１の共刺激分子リガンドに置き換えられ得る。この場合に得られる抗原結合分子は、第１の共刺激分子および該第１の共刺激分子に対する第１の共刺激分子リガンドからなる第４の複合体に特異的に結合し得る第３の抗原結合ドメインを含む。そのような抗原結合分子は、共刺激分子に対するアゴニスト活性を有し得るから、がんおよび感染症の治療の候補になり得る。この場合、該抗原結合分子は、第３の抗原結合ドメインに加えて、第２の共刺激分子リガンドと第５の複合体を形成し得る第２の共刺激分子に特異的に結合し得る第４の抗原結合ドメインを含む多重抗原結合分子とすることにより、共刺激分子に対する顕著なアゴニスト活性を有することが期待される。
The antigen-binding molecule of the present invention targets an immune synapse by specifically binding to a complex consisting of a co-inhibitory molecule localized at the immune synapse and its ligand, and has agonistic activity against the co-inhibitory molecule. Therefore, the antigen-binding molecule can be a therapeutic agent or a candidate thereof for treating or preventing diseases including autoimmune diseases. By containing at least the first antigen-binding domain, the antigen-binding molecule has agonistic activity against co-inhibitory molecules at the immune synapse. By forming the antigen-binding molecule into a multiple antigen-binding molecule containing a second antigen-binding domain in addition to the first antigen-binding domain, the antigen-binding molecule has a significant agonistic activity against co-inhibitory molecules in the immune synapse.
On the other hand, when it is intended to obtain an antigen-binding molecule having agonist activity to a co-stimulatory molecule, the first and a first costimulatory molecule ligand to said first costimulatory molecule can be replaced by a first costimulatory molecule and a first costimulatory molecule ligand to said first costimulatory molecule, respectively. The antigen-binding molecule obtained in this case is a third antigen capable of specifically binding to a fourth complex consisting of the first costimulatory molecule and the first costimulatory molecule ligand for the first costimulatory molecule. Contains the binding domain. Such antigen-binding molecules may have agonistic activity for co-stimulatory molecules and thus may be candidates for the treatment of cancer and infectious diseases. In this case, the antigen-binding molecule can specifically bind to a second costimulatory molecule capable of forming a fifth complex with a second costimulatory molecule ligand, in addition to the third antigen-binding domain. A multi-antigen-binding molecule containing four antigen-binding domains is expected to have significant agonistic activity against co-stimulatory molecules.
（実施例１）抗ヒトPD-1抗体、抗ヒトCD3抗体、および抗ヒトPD-1抗体由来のアームおよび抗CD3抗体由来のアームを含む二重特異性抗体の作製
PD-1の免疫抑制性シグナルを誘導するアゴニストを創製するためには、T細胞受容体とPD-1とを共局在させる必要があると考えられていた（J. Exp. Med. Vol. 209 No. 6 1201-1217）。本発明者らは抗PD-1アームと抗CD3アームからなる二重特異性抗体を作製して、そのPD-1免疫抑制性シグナル誘導能を評価した。
Example 1 Generation of Anti-Human PD-1 Antibodies, Anti-Human CD3 Antibodies, and Bispecific Antibodies Comprising Anti-Human PD-1 Antibody-Derived Arms and Anti-CD3 Antibody-Derived Arms
In order to create agonists that induce PD-1 immunosuppressive signals, it was thought necessary to co-localize the T-cell receptor with PD-1 (J. Exp. Med. Vol. 209 No. 6 1201-1217). The present inventors generated a bispecific antibody consisting of an anti-PD-1 arm and an anti-CD3 arm and evaluated its ability to induce PD-1 immunosuppressive signals.
ヒトPD-1に結合しその免疫抑制性のシグナルを誘導することが示唆されている3種類の抗ヒトPD-1モノクローナル抗体 PD1-17（重鎖可変領域配列番号：1 および軽鎖可変領域配列番号：2（WO2004/056875を参照）、ならびに重鎖定常領域配列番号：11および軽鎖定常領域配列番号：12）、antibody949（clone 949）（重鎖可変領域配列番号：3および軽鎖可変領域配列番号：4（WO2011/110621を参照）、ならびに重鎖定常領域配列番号：11および軽鎖定常領域配列番号：13）、clone 10（重鎖可変領域配列番号：5 および軽鎖可変領域配列番号：6（WO2010/029435を参照）、ならびに重鎖定常領域配列番号：11、軽鎖定常領域配列番号：13）を当業者公知の方法にて調製した。 Three anti-human PD-1 monoclonal antibodies PD1-17 (heavy chain variable region SEQ ID NO: 1 and light chain variable region sequence No: 2 (see WO2004/056875), and heavy chain constant region SEQ ID NO: 11 and light chain constant region SEQ ID NO: 12), antibody949 (clone 949) (heavy chain variable region SEQ ID NO: 3 and light chain variable region SEQ ID NO: 4 (see WO2011/110621), and heavy chain constant region SEQ ID NO: 11 and light chain constant region SEQ ID NO: 13), clone 10 (heavy chain variable region SEQ ID NO: 5 and light chain variable region SEQ ID NO: :6 (see WO2010/029435), heavy chain constant region SEQ ID NO: 11, light chain constant region SEQ ID NO: 13) were prepared by methods known to those skilled in the art.
抗ヒトCD3抗体として、T細胞受容体を構成するCD3ε鎖に結合して、T細胞受容体の活性化シグナルを誘導することが公知である2種類の抗ヒトCD3モノクローナル抗体OKT3（重鎖可変領域配列番号：7（NCBI Accession: 1SY6_H, GI: 49259178）、軽鎖可変領域配列番号：8（NCBI Accession: 1SY6_L, GI: 49259177）、重鎖定常領域配列番号：14、および軽鎖定常領域配列番号：13）、およびCE115TR（重鎖可変領域配列番号：9 、軽鎖可変領域配列番号：10、重鎖定常領域配列番号：14、軽鎖定常領域配列番号：15）を当業者公知の方法にて調製した。
本発明者らは、上記の3種類の抗ヒトPD-1抗体由来のアーム（本明細書では「抗PD-1アーム」ともいう。）、および上記の2種類の抗ヒトCD3モノクローナル抗体由来のアーム（以下「抗CD3アーム」ともいう。）を実験の目的に応じて組み合わせて、当業者公知の方法で抗PD-1アームと抗CD3アームを含む二重特異性抗体を調製した。以下の実施例において、二種類のアームが組合せられた二重特異性抗体は、たとえば、抗ヒトPD-1であるclone 949由来のアームと抗ヒトCD3抗体であるOKT3由来のアームとが組み合わせられた二重特異性抗体は「clone 949/OKT3」、「OKT3/clone 949」、「clone 949//OKT3」または「OKT3//clone 949」と称される。
As anti-human CD3 antibodies, two types of anti-human CD3 monoclonal antibody OKT3 (heavy chain variable region SEQ ID NO: 7 (NCBI Accession: 1SY6_H, GI: 49259178), light chain variable region SEQ ID NO: 8 (NCBI Accession: 1SY6_L, GI: 49259177), heavy chain constant region SEQ ID NO: 14, and light chain constant region SEQ ID NO: : 13), and CE115TR (heavy chain variable region SEQ ID NO: 9, light chain variable region SEQ ID NO: 10, heavy chain constant region SEQ ID NO: 14, light chain constant region SEQ ID NO: 15) by a method known to those skilled in the art. was prepared.
The present inventors used arms derived from the three anti-human PD-1 antibodies described above (also referred to herein as "anti-PD-1 arms"), and anti-human CD3 monoclonal antibodies derived from the two anti-human CD3 monoclonal antibodies described above. A bispecific antibody containing an anti-PD-1 arm and an anti-CD3 arm was prepared by a method known to those skilled in the art by combining arms (hereinafter also referred to as "anti-CD3 arm") according to the purpose of the experiment. In the following examples, a bispecific antibody in which two types of arms are combined is, for example, an anti-human PD-1 clone 949-derived arm and an anti-human CD3 antibody OKT3-derived arm. Such bispecific antibodies are referred to as "clone949/OKT3", "OKT3/clone949", "clone949//OKT3" or "OKT3//clone949".
（実施例２）抗PD-1アームおよび抗CD3アームを含む二重特異性抗体のPD-1シグナル誘導活性の評価（SHP-2リクルートメント）
抗CD3アームおよび抗PD-1アームを含む二重特異性抗体のPD-1シグナルの誘導活性は、PD-1のシグナル誘導時にPD-1の細胞内ドメインと相互作用する脱リン酸化酵素であるSHP2の近接（SHP-2リクルートメント）を指標に評価された。評価にはNanoBRET（登録商標） PD-1/SHP2 Interaction Assayシステム（Promega）が用いられた。PD-1シグナルの誘導活性は、PD-1とSHP2の近接時のBRETによる蛍光シグナル（618nm）と、ドナーであるSHP2由来の発光（460nm）の比率で求められた。
アッセイの前日にPD-L1を発現する抗原提示細胞（Promega, #J109A）を10%FBS入りのF-12培地（Gibco, 11765-054）で4.0 x 104 細胞/100mL/wellで96 well plate（Costar, #3917）に播種し、37℃のCO2インキュベータで16～24時間培養した。アッセイ当日にHaloTag（登録商標） nanoBRET（登録商標） 618 Ligand（Promega, #G980A）をOpti-MEM（Gibco, #31985-062）で250倍希釈した。培養していたPD-L1発現抗原提示細胞の培地を除き、希釈したHaloTag（登録商標） nanoBRET（登録商標） 618 Ligandを25 μL/well添加した。PD-L1阻害抗体（YW243.55S70）（US2016/0222117 A1を参照）（本実施例および図面においては「anti-PD-L1」または「PDL1b」と記載されることがある。）0.08 μg/mLを含むOpti-MEMで希釈した評価検体（40, 8, 1.6 μg/mL）を25 μL/wellで添加した。なお、PD-L1阻害抗体（YW243.55S70）の可変領域のアミノ酸配列はUS2016/0222117 A1の記載を参照した（重鎖可変領域配列番号：16、軽鎖可変領域配列番号：17）。該PD-L1阻害抗体において、重鎖定常領域にはヒトIgG1ベースの改変Fc体であるF1332（配列番号：18）、軽鎖定常領域にはヒトκ鎖定常領域であるk0MT（配列番号：19）が用いられた。PD-1/SHP2 Jurkat cell（Promega, #CS2009A01）を5 x 104 細胞/50μL/wellで上記の96 well plateに添加して、よく懸濁した後に37℃の5% CO2 インキュベータで2.5時間培養した。nanoBRET（登録商標） Nano-Glo（登録商標） substrate（Promega, #N157A）をOpti-MEMで100倍希釈し、25 mL/wellで培養した96 well plateに添加し、室温で30分間静置したのちEnvision（PerkinElmer, 2104 EnVision）でEm460mMおよびEm618nmを測定した。
得られた値を以下の式１および式２に当てはめ、 BRET Ratio（mBU）を算出した。
(Example 2) Evaluation of PD-1 signal-inducing activity of bispecific antibodies containing anti-PD-1 arm and anti-CD3 arm (SHP-2 recruitment)
PD-1 signal-inducing activity of bispecific antibodies containing anti-CD3 and anti-PD-1 arms is a phosphatase that interacts with the intracellular domain of PD-1 upon PD-1 signal induction It was evaluated using the proximity of SHP2 (SHP-2 recruitment) as an index. The NanoBRET (registered trademark) PD-1/SHP2 Interaction Assay system (Promega) was used for the evaluation. The PD-1 signal-inducing activity was determined by the ratio of the fluorescence signal (618 nm) by BRET when PD-1 and SHP2 were in close proximity to the luminescence (460 nm) from the donor SHP2.
The day before the assay, PD-L1-expressing antigen-presenting cells (Promega, #J109A) were plated at 4.0 x 104 cells/100 mL/well in F-12 medium (Gibco, 11765-054) containing 10% FBS in 96-well plates. (Costar, #3917) and cultured in a CO 2 incubator at 37° C. for 16-24 hours. HaloTag® nanoBRET® 618 Ligand (Promega, #G980A) was diluted 250-fold with Opti-MEM (Gibco, #31985-062) on the day of assay. The medium of the cultured PD-L1-expressing antigen-presenting cells was removed, and 25 µL/well of diluted HaloTag (registered trademark) nanoBRET (registered trademark) 618 Ligand was added. PD-L1 inhibitory antibody (YW243.55S70) (see US2016/0222117 A1) (sometimes referred to as "anti-PD-L1" or "PDL1b" in this example and drawings) 0.08 μg/mL An evaluation sample (40, 8, 1.6 µg/mL) diluted with Opti-MEM containing was added at 25 µL/well. The amino acid sequence of the variable region of the PD-L1 inhibitory antibody (YW243.55S70) was described in US2016/0222117 A1 (heavy chain variable region SEQ ID NO: 16, light chain variable region SEQ ID NO: 17). In the PD-L1 inhibitory antibody, the heavy chain constant region is a human IgG1-based modified Fc body F1332 (SEQ ID NO: 18), and the light chain constant region is a human κ chain constant region k0MT (SEQ ID NO: 19 ) was used. Add PD-1/SHP2 Jurkat cells (Promega, #CS2009A01) to the above 96-well plate at 5 x 10 4 cells/50 μL/well, suspend well, and incubate at 37°C for 2.5 hours in a 5% CO 2 incubator. cultured. nanoBRET (registered trademark) Nano-Glo (registered trademark) substrate (Promega, #N157A) was diluted 100-fold with Opti-MEM, added to a 96-well plate cultured at 25 mL/well, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Em460mM and Em618nm were then measured with Envision (PerkinElmer, 2104 EnVision).
The obtained values were applied to
［式１]
アッセイの結果を図１に示す。該図に示されるように、抗PD-1アームと抗CD3アームを含む二重特異性抗体のSHP2リクルートメント、すなわちPD-1シグナルの誘導活性は明確に示されなかった。 The assay results are shown in FIG. As shown in the figure, the SHP2 recruitment of the bispecific antibody containing anti-PD-1 arm and anti-CD3 arm, ie PD-1 signal-inducing activity, was not clearly demonstrated.
（実施例３）抗PD-1アームおよび抗CD3アームを含む二重特異性抗体のT細胞増殖アッセイでの評価
抗PD-1アームおよび抗ヒトCD3アームを含む二重特異性抗体がprimary CD4陽性T細胞に対する抑制活性を有するか評価するため、健常人から採取した新鮮血から分取したCD4陽性T細胞に対する抑制活性を抗ヒトCD3アームと抗KLH抗体（本明細書では「IC17」と称される。）由来のアーム（重鎖可変領域配列番号：112、軽鎖可変領域配列番号：113、重鎖定常領域配列番号：11、および軽鎖定常領域配列番号：13）およびを含む二重特異性抗体（図２において「OKT3/IC17」と称される。）を陰性対照として評価した。評価の当日、健常人から採血した血液と等量のRPMI1640（Nakarai, #30264-56）を混合した後、血液混合用液の15/50量のフィコールを充填した遠沈管に静かに重層した。20℃に設定した遠心機で400g, 35分間遠心した後、フィコールの上層に白血球画分を新規の遠沈管に分取し、RPMI1640（Nakarai, #30264-56）で50mLにメスアップした。20℃の遠心機で500g, 15分間遠心し、細胞（PBMC）ペレットを回収した。回収したPBMCからヒトCD4+ T Cell Isolation Kit（miltenyi, Cat#130-096-533）を用いて該キットの手順に従い、ヒトCD4陽性T細胞を分取した。その後、得られたCD4陽性T細胞を、96 well 丸底plateに7.6 x 105 細胞/well添加し、10 ng/mLのIL-2および評価抗体（20, 5, 1.25, 0.31, 0.08 μg/mL）存在下で培養した。5日間培養した後、Cell Titer-Glo（登録商標） Luminescent Cell Viability Assay（promega, G7570）で該キットの手順に従って細胞増殖を評価した。その結果を図２に示す。
(Example 3) Evaluation of bispecific antibody containing anti-PD-1 arm and anti-CD3 arm in T cell proliferation assay Bispecific antibody containing anti-PD-1 arm and anti-human CD3 arm is primary CD4 positive In order to evaluate whether it has suppressive activity against T cells, an anti-human CD3 arm and an anti-KLH antibody (herein referred to as "IC17") against CD4-positive T cells isolated from fresh blood collected from healthy subjects were tested. ) (heavy chain variable region SEQ ID NO: 112, light chain variable region SEQ ID NO: 113, heavy chain constant region SEQ ID NO: 11, and light chain constant region SEQ ID NO: 13) and bispecific A sex antibody (referred to as "OKT3/IC17" in Figure 2) was evaluated as a negative control. On the day of evaluation, blood collected from a healthy subject was mixed with an equal amount of RPMI1640 (Nakarai, #30264-56), and then gently layered on a centrifugation tube filled with Ficoll in an amount of 15/50 of the blood mixing solution. After centrifugation at 400 g for 35 minutes in a centrifuge set at 20° C., the leukocyte fraction on the upper layer of Ficoll was separated into a new centrifuge tube and diluted to 50 mL with RPMI1640 (Nakarai, #30264-56). After centrifugation at 500 g for 15 minutes in a centrifuge at 20° C., a cell (PBMC) pellet was recovered. Human CD4+ T Cell Isolation Kit (miltenyi, Cat#130-096-533) was used to isolate human CD4+ T cells from the collected PBMCs according to the procedure of the kit. After that, the obtained CD4-positive T cells were added to a 96-well round-bottom plate at 7.6 x 10 5 cells/well, and 10 ng/mL IL-2 and evaluation antibodies (20, 5, 1.25, 0.31, 0.08 μg/ mL) were cultured in the presence of After 5 days of culture, cell proliferation was assessed by Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (promega, G7570) according to the kit's protocol. The results are shown in FIG.
図２に示されるように、3種類の抗PD-1アームおよび抗ヒトCD3アームを含む二重特異性抗体を検討した結果、これらの二重特異性抗体は、陰性対照の抗ヒトCD3アームおよび抗KLH抗体由来のアームを含む二重特異性抗体に比べて、ヒトCD4陽性T細胞の増殖をむしろ促進した。この結果から、抗PD-1アームおよび抗ヒトCD3アームを含む二重特異性抗体によってCD4陽性T細胞の増殖を抑制し、CD4陽性T細胞に起因する免疫応答を抑制することは困難であることが示唆された。 Bispecific antibodies comprising three anti-PD-1 and anti-human CD3 arms were tested, as shown in FIG. It rather promoted the proliferation of human CD4-positive T cells compared to bispecific antibodies containing anti-KLH antibody-derived arms. From this result, it is difficult to suppress the proliferation of CD4-positive T cells and suppress the immune response caused by CD4-positive T cells with a bispecific antibody containing an anti-PD-1 arm and an anti-human CD3 arm. was suggested.
（実施例４）ヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質の作製
GenBankより得たヒトPD-1をコードする遺伝子配列情報（NM_005018）を基に、細胞外ドメイン（P21-Q167）に対して人工分泌シグナル配列であるHMM+38（塩基配列は配列番号20、アミノ酸配列は配列番号21）をN末端に付加した。また、C末端にはリンカー配列、ヒスチジンタグ、リンカー配列、BAPタグ（ビオチン化タグ、GLNDIFEAQKIEWHE）を付加して発現用コンストラクトとした（塩基配列は配列番号22、アミノ酸配列は配列番号23）。上記デザインの遺伝子を合成し哺乳類細胞用の自社構築ベクター（pBEF-OriP）にサブクローニングすることで発現ベクターとした。この発現ベクターをExpi293（登録商標）F細胞（Thermo Fisher）に対してExpiFectamine（登録商標） 293 Transfection Kitを用いて導入することで、一過性にヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質を発現させた。得られた培養上清をAKTA（登録商標） Avant25装置（GE Healthcare）およびHiTrap（登録商標） Q HPカラム（GE Healthcare） によるイオン交換クロマトグラフィー、HisTrap（登録商標） HPカラム（GE Healthcare）によるアフィニティクロマトグラフィーにて精製した。ヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後に、Superdex（登録商標） 200 increase 10/300カラム（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって精製純度をさらに上げるとともに多量体を除去することで、高純度のヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質の単量体画分を得た。
(Example 4) Production of human PD-1 extracellular domain protein
Based on the gene sequence information (NM_005018) encoding human PD-1 obtained from GenBank, HMM+38 (nucleotide sequence is SEQ ID NO: 20, amino acid Sequence No. 21) was added to the N-terminus. A linker sequence, a histidine tag, a linker sequence, and a BAP tag (biotinylation tag, GLNDIFEAQKIEWHE) were added to the C-terminus to prepare an expression construct (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 22, amino acid sequence: SEQ ID NO: 23). The gene designed above was synthesized and subcloned into an in-house constructed vector (pBEF-OriP) for mammalian cells to obtain an expression vector. Human PD-1 extracellular domain protein was transiently expressed by introducing this expression vector into Expi293 (registered trademark) F cells (Thermo Fisher) using the ExpiFectamine (registered trademark) 293 Transfection Kit. . The obtained culture supernatant was subjected to ion-exchange chromatography using an AKTA (registered trademark) Avant25 device (GE Healthcare) and HiTrap (registered trademark) Q HP column (GE Healthcare), and affinity chromatography using a HisTrap (registered trademark) HP column (GE Healthcare). Purified by chromatography. The fraction containing the human PD-1 extracellular domain protein was concentrated with an ultrafiltration membrane, followed by gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) using a Superdex (registered trademark) 200
BAPタグにBiotinが付加されたヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質を得るためには、ヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質の発現ベクターとともにBiotin ligaseであるBirAの発現ベクターをExpi293（登録商標）F細胞に対してExpiFectamine（登録商標） 293 Transfection Kitを用いて導入することで、目的タンパク質にBiotinを付加させた。上記と同様の手順で、HiTrap（登録商標） Q HPカラム（GE Healthcare） によるイオン交換クロマトグラフィー、HisTrap（登録商標） HPカラム（GE Healthcare）によるアフィニティクロマトグラフィーにて精製した。その後、Biotin付加体の純度を上げる目的でStreptavidin Mutein Matrix（Roche）を使ったアフィニティクロマトグラフィーを行った。ヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後に、HiLoad 16/600 Superdex（登録商標） 200 pgカラム（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって精製純度をさらに上げるとともに多量体を除去することで、高純度のBiotin付加体ヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質の単量体画分を得た。
In order to obtain a human PD-1 ectodomain protein with a BAP tag attached with biotin, the expression vector for the human PD-1 ectodomain protein and the expression vector for the biotin ligase BirA were added to Expi293 (registered trademark) F cells. Biotin was added to the target protein by transfection with ExpiFectamine (registered trademark) 293 Transfection Kit. Purification was performed by ion exchange chromatography using a HiTrap (registered trademark) Q HP column (GE Healthcare) and affinity chromatography using a HisTrap (registered trademark) HP column (GE Healthcare) in the same procedure as above. Then, affinity chromatography using Streptavidin Mutein Matrix (Roche) was performed for the purpose of increasing the purity of the biotin adduct. Fractions containing human PD-1 extracellular domain protein were concentrated with an ultrafiltration membrane and then subjected to gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) using a HiLoad 16/600
（実施例５）ヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質の作製
GenBankより得たヒトPD-L1をコードする遺伝子配列情報（NM_014143）を基に、細胞外ドメイン（F19-R238）に対して人工分泌シグナル配列であるHMM+38（塩基配列は配列番号20、アミノ酸配列は配列番号21）をN末端に付加し、C末端にはリンカー配列、ヒスチジンタグ、リンカー配列、BAPタグ（ビオチン化タグ、GLNDIFEAQKIEWHE）を付加して発現用コンストラクトとした（塩基配列は配列番号24、アミノ酸配列は配列番号25）。上記デザインの遺伝子を合成し哺乳類細胞用のベクター（pBEF-OriP）にサブクローニングすることで発現ベクターとした。この発現ベクターをFreeStyle（登録商標） CHO細胞（Thermo Fisher）に導入することで、一過性にヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質を発現させた。得られた培養上清をAKTA（登録商標） Avant25装置（GE Healthcare）およびHiTrap（登録商標） Q HP カラム（GE Healthcare） によるイオン交換クロマトグラフィー、HisTrap（登録商標） HPカラム（GE Healthcare）によるアフィニティクロマトグラフィーにて精製した。ヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後に、HiLoad 16/600 Superdex（登録商標） 200 pgカラム（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって精製純度をさらに上げるとともに多量体を除去することで、高純度のヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質の単量体画分を得た。
(Example 5) Production of human PD-L1 extracellular domain protein
Based on the gene sequence information (NM_014143) encoding human PD-L1 obtained from GenBank, HMM+38 (nucleotide sequence is SEQ ID NO: 20, amino acid SEQ ID NO: 21) was added to the N-terminus, and a linker sequence, a histidine tag, a linker sequence, and a BAP tag (biotinylation tag, GLNDIFEAQKIEWHE) were added to the C-terminus to form an expression construct (the base sequence is SEQ ID NO: 24, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 25). The gene designed above was synthesized and subcloned into a mammalian cell vector (pBEF-OriP) to obtain an expression vector. Human PD-L1 extracellular domain protein was transiently expressed by introducing this expression vector into FreeStyle (registered trademark) CHO cells (Thermo Fisher). The obtained culture supernatant was subjected to ion-exchange chromatography using an AKTA (registered trademark) Avant25 device (GE Healthcare) and HiTrap (registered trademark) Q HP column (GE Healthcare), and affinity chromatography using a HisTrap (registered trademark) HP column (GE Healthcare). Purified by chromatography. Fractions containing human PD-L1 extracellular domain protein were concentrated with an ultrafiltration membrane and then subjected to gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) using a HiLoad 16/600
BAPタグにBiotinが付加されたヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質の調製は、上記の精製されたヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質をBirA酵素（biotin ligase）の精製タンパク質と混合してBiotin付加反応を行うことで行った。最終濃度として、ヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質が35μM, ATPが10mM、BirA酵素が0.825μM, 50mM Tris-HCl pH8.3, 10mM Mg(OAc)2, 0.05mM Biotinとなるように混合し、4度で16時間程度置くことで反応させた。Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K （Thermo Fisher）を用いた透析により20 mM NaPhospate, 600 mM NaCl, pH7.2に置換することで未反応のBiotinを除去した。その後、Biotin付加体の純度を上げる目的でStreptavidin Mutein Matrix（Roche）を使ったアフィニティクロマトグラフィーを行った。ヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後に、Superdex（登録商標） 200 Increase 10/300 GLカラム（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって精製純度をさらに上げるとともに多量体を除去することで、高純度のBiotin付加体ヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質の単量体画分を得た。
The human PD-L1 ectodomain protein with biotin added to the BAP tag was prepared by mixing the above-mentioned purified human PD-L1 ectodomain protein with the purified protein of BirA enzyme (biotin ligase) and performing the biotin addition reaction. I did it by doing The final concentrations were 35 μM human PD-L1 extracellular domain protein, 10 mM ATP, 0.825 μM BirA enzyme, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 10 mM Mg(OAc) 2 , 0.05 mM Biotin. The mixture was left to react at 4°C for about 16 hours. Unreacted biotin was removed by substitution with 20 mM NaPhospate, 600 mM NaCl, pH 7.2 by dialysis using Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K (Thermo Fisher). Then, affinity chromatography using Streptavidin Mutein Matrix (Roche) was performed for the purpose of increasing the purity of the biotin adduct. Fractions containing human PD-L1 extracellular domain protein were concentrated with an ultrafiltration membrane and then subjected to gel filtration chromatography (size exclusion chromatography) using a
（実施例６）ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質の作製
（１）リンカー融合型ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質の作製
ヒトPD-L1の免疫グロブリンドメインの可変領域F19-N131とヒトPD-1の免疫グロブリンドメインの可変領域N33-E146との間にリンカー配列を挿入することで、両者の近接化による複合体としての安定化を図った。図３にそのデザインを示す。ヒトPD-1に関してはフリー・システイン除去のためC93S改変を導入した。ヒトPD-L1のN131とヒトPD-1のN33との間にリンカーを挿入したバージョンをLinker complex#1とした（塩基配列は配列番号：26、アミノ酸配列は配列番号：27）（図３左）。また、ヒトPD-1のE146とヒトPD-L1のF19との間にリンカーを挿入したバージョンをLinker complex#2とした（塩基配列は配列番号：28、アミノ酸配列は配列番号：29）（図３右）。どちらの複合体タンパク質に関しても、シグナル配列（HMM+38）をN末端に付加し、C末端にはリンカー配列、ヒスチジンタグ、リンカー配列、BAPタグ（GLNDIFEAQKIEWHE）を付加して発現用コンストラクトとした。この発現ベクターをFreeStyle（登録商標） CHO細胞（Thermo Fisher）に導入することで、一過性にタンパク質を発現させた。得られた培養上清をAKTA（登録商標） Avant25装置（GE Healthcare）およびHiTrap（登録商標） Q HP カラム（GE Healthcare） によるイオン交換クロマトグラフィー、HisTrap（登録商標） HPカラム（GE Healthcare）によるアフィニティクロマトグラフィーにて精製した。ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後に、HiLoad 26/600 Superdex（登録商標） 200 pgカラム（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって精製純度をさらに上げるとともに多量体を除去することで、高純度のヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質を得た。
(Example 6) Production of human PD-L1 / human PD-1 complex protein
(1) Preparation of linker-fused human PD-L1 / human PD-1 complex protein By inserting a linker sequence between them, we tried to stabilize them as a complex by bringing them closer together. Figure 3 shows the design. For human PD-1, a C93S modification was introduced to remove free cysteines. A version in which a linker was inserted between N131 of human PD-L1 and N33 of human PD-1 was designated as Linker complex #1 (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 26, amino acid sequence: SEQ ID NO: 27) (Fig. 3, left). ). A version in which a linker was inserted between E146 of human PD-1 and F19 of human PD-L1 was designated as Linker complex #2 (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 28, amino acid sequence: SEQ ID NO: 29) (Fig. 3 right). For both complex proteins, a signal sequence (HMM+38) was added to the N-terminus, and a linker sequence, a histidine tag, a linker sequence and a BAP tag (GLNDIFEAQKIEWHE) were added to the C-terminus to construct expression constructs. The protein was transiently expressed by introducing this expression vector into FreeStyle (registered trademark) CHO cells (Thermo Fisher). The obtained culture supernatant was subjected to ion-exchange chromatography using an AKTA (registered trademark) Avant25 device (GE Healthcare) and HiTrap (registered trademark) Q HP column (GE Healthcare), and affinity chromatography using a HisTrap (registered trademark) HP column (GE Healthcare). Purified by chromatography. Fractions containing human PD-L1/human PD-1 complex protein were concentrated with an ultrafiltration membrane and then subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/600
BAPタグにBiotinが付加されたヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質の調製は、上記の精製されたヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質をBirA酵素（biotin ligase）の精製タンパク質と混合してBiotin付加反応を行うことで行った。最終濃度として、ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質が25μMもしくは26μM, ATPが10mM、BirA酵素が0.825μM, 50mM Tris-HCl pH8.3, 10mM Mg(OAc)2, 0.05mM Biotinとなるように混合し、4度で16時間程度置くことで反応させた。Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 10K （Thermo Fisher）を用いた透析により20 mM NaPhospate, 600 mM NaCl, pH7.2に置換することで未反応のBiotinを除去した。その後、Biotin付加体の純度を上げる目的でStreptavidin Mutein Matrix（Roche）を使ったアフィニティクロマトグラフィーを行った。ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後に、Superdex（登録商標） 200 Increase 10/300 GLカラム（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって精製純度をさらに上げるとともに多量体を除去することで、高純度のBiotin付加体ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質の画分を得た。
For the preparation of human PD-L1/human PD-1 complex protein with biotin added to the BAP tag, the purified human PD-L1/human PD-1 complex protein described above was subjected to purification of the BirA enzyme (biotin ligase). It was performed by mixing with protein and performing Biotin addition reaction. The final concentrations were 25 μM or 26 μM human PD-L1 / human PD-1 complex protein, 10 mM ATP, 0.825 μM BirA enzyme, 50 mM Tris-HCl pH8.3, 10 mM Mg(OAc)2, 0.05 mM Biotin. The mixture was mixed so as to obtain the desired temperature, and left to react at 4°C for about 16 hours. Unreacted biotin was removed by substitution with 20 mM NaPhospate, 600 mM NaCl, pH 7.2 by dialysis using Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 10K (Thermo Fisher). Then, affinity chromatography using Streptavidin Mutein Matrix (Roche) was performed for the purpose of increasing the purity of the biotin adduct. Fractions containing human PD-L1/human PD-1 complex protein were concentrated with an ultrafiltration membrane and then subjected to gel filtration chromatography using a
（２）ジスルフィド結合導入型ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質の作製
ヒトPD-L1とヒトPD-1の相互作用しているアミノ酸残基をシステイン残基に置換することで異所的なジスルフィド結合の形成を促し複合体としての安定化を図った。
(2) Production of disulfide bond-introduced human PD-L1 / human PD-1 complex protein By replacing the interacting amino acid residues of human PD-L1 and human PD-1 with cysteine residues, ectopic The formation of disulfide bonds was promoted to stabilize the complex.
システインに置換する残基は報告されている共結晶の構造データ（PDB:3BIK）を基にした構造モデリングから選択した。分子設計ソフトウエアとしてはDiscovery Studio（ダッソー・システムズ株式会社）のDesign Protein toolsおよびMOE（Chemical Computing Group）のProtein Designの機能を用いた。これらのソフトウエアにより、ヒトPD-L1およびヒトPD-1の間で近接しているC原子を選定するとともに、rotamerを用いたモデリングからシステインに置換することでジスルフィド結合を形成できる残基を選択した。ヒトPD-L1のY56C改変体とヒトPD-1のA132C改変体とを組み合わせたバージョンをS-S complex#1とし、ヒトPD-L1のA18C改変体とヒトPD-1のG90C改変体とを組み合わせたバージョンをS-S complex#2とした。図４には、ジスルフィド結合導入型ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質のデザインが図示される。発現精製に際して、ヒトPD-L1とヒトPD-1との間のヘテロ二量体の形成効率を高めるとともに精製を容易にする目的で、ヒトPD-L1およびヒトPD-1をヘテロ二量体の形成を促進する技術であるKnobs into Holeの改変を含むFcと融合して発現精製に進めた。
Residues for cysteine substitution were selected from structural modeling based on reported co-crystal structural data (PDB:3BIK). As molecular design software, Design Protein tools of Discovery Studio (Dassault Systèmes, Inc.) and Protein Design functions of MOE (Chemical Computing Group) were used. These softwares select C atoms that are in close proximity between human PD-L1 and human PD-1, and select residues that can form disulfide bonds by replacing them with cysteines from modeling using rotamer. did. A version combining the Y56C variant of human PD-L1 and the A132C variant of human PD-1 was designated as S-S
ヒトPD-L1の免疫グロブリンドメインの可変領域F19-A132をリンカー配列、BAPタグ（GLNDIFEAQKIEWHE）、リンカー配列、PreScissionプロテアーゼ認識配列（LEVLFQGP）、リンカー配列をつないだものについてヒンジ領域を含むヒトIgG1型のFcドメインのN末端に融合した。FcドメインにはFcγ受容体および補体C1qに対する結合活性を欠損させるための改変（L235R, G236R, S239K）およびヘテロ二量体の形成を促進するためのKnobs into Hole技術のためのHole改変（D356C, T366S, L368A, Y407V）を導入した。PD-L1を含む融合タンパク質のC末端にはリンカー配列を介して精製用のHisタグを付加した。 Human PD-L1 immunoglobulin domain variable region F19-A132 linker sequence, BAP tag (GLNDIFEAQKIEWHE), linker sequence, PreScission protease recognition sequence (LEVLFQGP), linker sequence Human IgG1 type including hinge region It was fused to the N-terminus of the Fc domain. Modifications (L235R, G236R, S239K) to eliminate Fcγ receptor and complement C1q binding activity in the Fc domain and Hole modification (D356C) for Knobs into Hole technology to promote heterodimer formation , T366S, L368A, Y407V). A His tag for purification was added to the C-terminus of the fusion protein containing PD-L1 via a linker sequence.
一方、ヒトPD-1の免疫グロブリンドメインの可変領域N33-E146（C93S改変を含む）にリンカー配列、BAPタグ（GLNDIFEAQKIEWHE）、リンカー配列、PreScissionプロテアーゼ認識配列（LEVLFQGP）、リンカー配列をつないだものについてヒンジ領域を含むヒトIgG1型のFcドメインのN末端に融合した。FcドメインにはFcγ受容体および補体C1qに対する結合活性を欠損させるための改変（L235R, G236R, S239K）よびKnob改変（Y349C, T366W）を導入した。PD-1を含む融合タンパク質のC末端にはリンカー配列を介して精製用のFLAGタグを付加した。 On the other hand, for human PD-1 immunoglobulin domain variable region N33-E146 (including C93S modification) linked with linker sequence, BAP tag (GLNDIFEAQKIEWHE), linker sequence, PreScission protease recognition sequence (LEVLFQGP), linker sequence It was fused to the N-terminus of a human IgG1 type Fc domain including the hinge region. Modifications (L235R, G236R, S239K) and Knob modifications (Y349C, T366W) for lacking Fcγ receptor and complement C1q binding activity were introduced into the Fc domain. A FLAG tag for purification was added to the C-terminus of the fusion protein containing PD-1 via a linker sequence.
いずれのタンパク質に関しても、人工分泌シグナル配列であるHMM+38をN末端に付加して発現用コンストラクトとした。
S-S complex#1に用いたhPDL1（Y56C）_BAP_PreSission_hole_His10の塩基配列は配列番号：30に、アミノ酸配列は配列番号：31に示され、hPD1（A132C）_BAP_PreSission_knob_FLAGの塩基配列は配列番号：32に、アミノ酸配列は配列番号：33に示される。S-S complex#2に用いたhPDL1(A18C)_BAP_PreSission_hole_His10の塩基配列は配列番号：34に、アミノ酸配列を配列番号：35に示され、hPD1(G90C)_BAP_PreSission_knob_FLAGの塩基配列は配列番号36に、アミノ酸配列は配列番号：37に示される。
For each protein, an artificial secretory signal sequence, HMM+38, was added to the N-terminus to construct the expression construct.
The nucleotide sequence of hPDL1(Y56C)_BAP_PreSission_hole_His10 used for SS
上記デザインの遺伝子を合成し哺乳類細胞用のベクター(pBEF-OriP)にサブクローニングすることで発現ベクターとした。この発現ベクターをFreeStyle（登録商標） CHO細胞（Thermo Fisher）に導入することで、一過性にタンパク質を発現させた。 The gene designed above was synthesized and subcloned into a mammalian cell vector (pBEF-OriP) to obtain an expression vector. The protein was transiently expressed by introducing this expression vector into FreeStyle (registered trademark) CHO cells (Thermo Fisher).
得られた培養上清からAKTA（登録商標） 10S装置（GE Healthcare）もしくはAKTA（登録商標） Avant25装置（GE Healthcare）を用いたクロマトグラフィーにより目的タンパク質を精製した。まずはANTI-FLAG M2 Affinity Gel（Sigma-Aldrich）を用いたアフィニティクロマトグラフィーを実施して、次にHisTrap（登録商標） HPカラム（GE Healthcare）によるアフィニティクロマトグラフィーを実施することでヘテロ二量体を形成している画分を得た。このヘテロ二量体のタンパク質に対してPreScission認識配列を切断するTurbo3C protease（Accelagen）を反応させることで、ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパクとFcドメインとの切り離しを行った。1mgのヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパクに対して80ユニットのTurbo3C proteaseを混合し、その混合液をSlide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K（Thermo Scientific）に充填し、D-PBS(-)に置換しながら、4℃で16時間程度で切断反応を行った。その後、サンプル中に含まれる切断済みのFcドメインや未切断のFc融合体、Turbo3C protease（Hisタグが付加されている）などの不要物を除去するため、HisTrap（登録商標） HPカラム（GE Healthcare）とHiTrap（登録商標） Protein A HPカラム（GE Healthcare）を直列につないだものにサンプルを通過させた。得られた切断反応済みヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質を含む画分を限外ろ過膜で濃縮した後、HiLoad 26/600 Superdex（登録商標） 200 pg（GE Healthcare）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって精製純度をさらに上げるとともに多量体を除去することで、高純度のヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質を得た。 The target protein was purified from the obtained culture supernatant by chromatography using an AKTA (registered trademark) 10S device (GE Healthcare) or an AKTA (registered trademark) Avant25 device (GE Healthcare). The heterodimer was isolated by first affinity chromatography using ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma-Aldrich) followed by affinity chromatography using a HisTrap® HP column (GE Healthcare). A forming fraction was obtained. By reacting this heterodimeric protein with Turbo3C protease (Accelagen) that cleaves the PreScission recognition sequence, the human PD-L1/human PD-1 complex protein was cleaved from the Fc domain. 80 units of Turbo3C protease was mixed with 1 mg of human PD-L1/human PD-1 complex protein, and the mixture was filled in Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K (Thermo Scientific), and D Cleavage reaction was carried out at 4°C for about 16 hours while substituting with -PBS(-). Then, in order to remove unwanted substances such as cleaved Fc domains, uncleaved Fc fusions, and Turbo3C protease (His-tagged) contained in the sample, a HisTrap® HP column (GE Healthcare ) and a HiTrap® Protein A HP column (GE Healthcare) in series. The resulting fraction containing the cleaved human PD-L1/human PD-1 complex protein was concentrated with an ultrafiltration membrane, and then filtered using HiLoad 26/600 Superdex (registered trademark) 200 pg (GE Healthcare). A highly pure human PD-L1 / human PD-1 complex protein was obtained by further increasing the purification purity and removing multimers by gel filtration chromatography (size exclusion chromatography).
BAPタグにBiotinが付加されたヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質の調製は、上記の精製されたヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質をBirA酵素（biotin ligase）の精製タンパク質と混合してBiotin付加反応を行うことで行った。最終濃度として、ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質が21μMもしくは22μM, ATPが10mM、BirA酵素が0.825μM, 50mM Tris-HCl pH8.3, 10mM Mg(OAc)2, 0.05mM Biotinとなるように混合し、4度で16時間程度置くことで反応させた。このサンプルを限外ろ過膜で濃縮した後に、HisTrap（登録商標） HP （GE Healthcare）とSuperdex（登録商標） 200 Increase 10/300 GL（GE Healthcare）を直列につないでサンプルを流すことで不要なBirAを吸着させるとともに、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）によって精製純度をさらに上げるとともに多量体を除去することで、高純度のBiotin付加体ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質の画分を得た。
For the preparation of human PD-L1/human PD-1 complex protein with biotin added to the BAP tag, the purified human PD-L1/human PD-1 complex protein described above was subjected to purification of the BirA enzyme (biotin ligase). It was performed by mixing with protein and performing Biotin addition reaction. The final concentrations were 21 μM or 22 μM human PD-L1 / human PD-1 complex protein, 10 mM ATP, 0.825 μM BirA enzyme, 50 mM Tris-HCl pH8.3, 10 mM Mg(OAc)2, 0.05 mM Biotin. The mixture was mixed so as to obtain the desired temperature, and left to react at 4°C for about 16 hours. After concentrating the sample with an ultrafiltration membrane, the HisTrap® HP (GE Healthcare) and
（実施例７）ウサギからの抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質抗体の作製
前述のとおり調製された4種類の各ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質である、Linker complex#1、Linker complex#2、S-S complex#1、およびS-S complex#2を抗原として用い、ウサギからモノクローナル抗体が作製された。12～13週齢のNZWウサギを4種類の抗原それぞれで免疫感作した。抗原タンパク質溶液を等容量のTiterMax Goldアジュバントと混合し、ウサギの皮内に投与した。免疫は1週間以上の間隔を置き4回繰り返し行った。Linker complex#1およびLinker complex#2は初回免疫時に200μg/headを投与し、その後の免疫では100μg/headを投与した。S-S complex#1およびS-S complex#2は全ての免疫時で100μg/headを投与した。最終免疫感作の1週間後、脾臓と血液を免疫感作動物から採取した。
(Example 7) Generation of anti-human PD-L1/human PD-1 complex protein antibodies from rabbits Each of the four human PD-L1/human PD-1 complex proteins prepared as described above, Linker Monoclonal antibodies were generated from rabbits using
脾臓や血液の細胞に含まれる抗原特異的B細胞を濃縮するため、autoMACS Pro Separator（miltenyi Biotec）を用いたMACSによりヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質に対して結合する細胞のネガティブ・セレクションを行った後に、ウサギIgG型抗体を発現するB細胞を濃縮するためのポジティブ・セレクションを実施した。PD-L1細胞外ドメインタンパク質に対するネガティブ・セレクションではAnti-Biotin MicroBeads（Miltenyi Biotech, 130-090-485）に前述のBAPタグにBiotinが付加されたヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質を結合させて用いた。ウサギIgG型抗体を発現するB細胞のポジティブ・セレクションでは、Anti-mouse IgG MicroBeads（Miltenyi Biotech, 130-048-401）にMouse Anti-Rabbit IgG-PE（SouthernBiotech, 4090-9）を結合させて用いた。 To enrich for antigen-specific B cells in spleen and blood cells, negative selection of cells binding to human PD-L1 ectodomain protein was performed by MACS using the autoMACS Pro Separator (miltenyi Biotec). A positive selection was then performed to enrich for B cells expressing rabbit IgG-type antibodies. For negative selection against PD-L1 ectodomain proteins, anti-biotin MicroBeads (Miltenyi Biotech, 130-090-485) were conjugated with human PD-L1 ectodomain proteins with biotin attached to the aforementioned BAP tag. there was. For positive selection of B cells expressing rabbit IgG antibodies, Anti-mouse IgG MicroBeads (Miltenyi Biotech, 130-048-401) conjugated with Mouse Anti-Rabbit IgG-PE (SouthernBiotech, 4090-9) were used. there was.
MACSによる濃縮操作を経た細胞に対して、ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質に特異的な抗体に対するさらなる濃縮をかけるため、セルソーター（FACS aria III、BD）を用いた選別を実施した。4種類の免疫抗原の各々（免疫に用いたヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質のBAPタグにビオチンを付加したもの）を結合させて、Streptavidin-APC（Miltenyi Biotech, 130-106-791）による染色を行った。同時に、ヒトIgG1型Fcと融合させたヒトPD-1タンパク質（R&D, 1086-PD）を結合させて、Goat anti-Human IgG Fc Cross-Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488（ThermoFisher, SA5-10134）による染色を行った。Anti-Rabbit IgG-PE（SouthernBiotech, 4090-9）によるIgG型抗体を発現するB細胞の選別も併せて行った。セルソーターを用いて、ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質に結合し、ヒトPD-1タンパク質には結合せず、IgG型抗体を発現するB細胞を回収した。 The MACS-enriched cells were sorted using a cell sorter (FACS aria III, BD) to further enrich for antibodies specific to the human PD-L1/human PD-1 complex protein. . Each of the four immunizing antigens (human PD-L1 / human PD-1 complex protein used for immunization with biotin added to the BAP tag) was bound to Streptavidin-APC (Miltenyi Biotech, 130-106- 791). At the same time, human PD-1 protein (R&D, 1086-PD) fused to human IgG1 type Fc was bound and stained with Goat anti-Human IgG Fc Cross-Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 (ThermoFisher, SA5-10134). did B cells expressing IgG type antibodies were also sorted using Anti-Rabbit IgG-PE (SouthernBiotech, 4090-9). A cell sorter was used to collect B cells expressing IgG-type antibodies that bound to the human PD-L1/human PD-1 complex protein but not to the human PD-1 protein.
得られたB細胞を1個/ウェルの密度で、細胞12,500個/ウェルのEL4細胞（European Collection of Cell Cultures）および20倍希釈した活性化ウサギT細胞馴化培地と共に384ウェルプレートに播種し、6～12日間培養して、そのB細胞培養上清中の分泌抗体を使った抗体スクリーニングに供した。EL4細胞は、事前にX線照射装置MX-160Labo（mediXtec）にて10Gyの照射量のX線を作用させて培養に供した。
活性化ウサギT細胞馴化培地は、ウサギ胸腺細胞を、フィトヘマグルチニンM（Roche、カタログ番号11082132）、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（Sigma、カタログ番号P1585）および2％FBSを含有するRPMI-1640培地中で培養することにより、調製した。培養後、B細胞の培養上清をさらなる評価のために回収し、細胞のペレットを凍結保存した。
The resulting B cells were seeded at a density of 1 cell/well in 384-well plates with 12,500 cells/well of EL4 cells (European Collection of Cell Cultures) and 20-fold diluted activated rabbit T cell conditioned medium. Cultured for ˜12 days and subjected to antibody screening using secreted antibody in the B cell culture supernatant. The EL4 cells were cultured in advance by applying X-rays at a dose of 10 Gy using an X-ray irradiator MX-160Labo (mediXtec).
Activated rabbit T cell conditioned medium was prepared by mixing rabbit thymocytes in RPMI-1640 containing phytohaemagglutinin M (Roche, Cat. No. 11082132), phorbol 12-myristate 13-acetate (Sigma, Cat. No. P1585) and 2% FBS. It was prepared by culturing in culture medium. After culture, B cell culture supernatants were harvested for further evaluation and cell pellets were cryopreserved.
B細胞培養上清に含まれる分泌抗体を利用し、抗体の結合特性を指標としたスクリーニングを実施した。ヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質、ヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質、前述の4種のヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質、および陰性対照であるBSAが固相されたMagPlex Microspheres（Luminex）と混合して各種タンパク質に対する結合をフローサイトメーター（iQue Screener, intellicyt）にて確認した。異なるタンパク質は異なる蛍光パターンを有するMagPlex Microspheresに固相することで区別して結合解析を行った。MagPlex Microspheresにストレプトアビジンを固相した後に、ビオチン化された各評価対象タンパク質を固相して評価に用いた。二次抗体にはGoat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific, A-11034）を用いた。データ解析はFlowJoソフトウエア（トミーデジタルバイオロジー）を用いて行った。この実験結果から、陰性対照のBSAやヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質およびヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質には結合せず、各ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質のみに結合する抗体を産生するB 細胞を選抜した。 Using the secretory antibody contained in the B cell culture supernatant, screening was performed using the binding properties of the antibody as an index. MagPlex Microspheres immobilized with human PD-1 ectodomain protein, human PD-L1 ectodomain protein, the four human PD-L1/human PD-1 complex proteins previously described, and BSA as a negative control ( Luminex) and the binding to various proteins was confirmed with a flow cytometer (iQue Screener, Intellicyt). Binding analysis was performed by distinguishing different proteins by immobilizing them on MagPlex Microspheres with different fluorescence patterns. After streptoavidin was immobilized on MagPlex Microspheres, each biotinylated protein to be evaluated was immobilized and used for evaluation. Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, A-11034) was used as the secondary antibody. Data analysis was performed using FlowJo software (Tomy Digital Biology). The results of this experiment show that it does not bind to the negative control BSA, human PD-1 ectodomain protein and human PD-L1 ectodomain protein, but only to each human PD-L1 / human PD-1 complex protein. Antibody-producing B cells were selected.
選択されたB細胞のRNAを、ZR-96 Quick-RNAキット（ZYMO RESEARCH、カタログ番号R1053）を用いて凍結保存細胞ペレットから精製した。調製されたRNAを用いて抗体重鎖可変領域をコードするDNAを逆転写PCRにより増幅し、Fcγ受容体および補体C1qに対する結合活性を欠損させたヒトIgG1重鎖定常領域であるF1332（配列番号：18）をコードするDNAとインフレームになるように再結合させた。また、抗体軽鎖可変領域をコードするDNAを逆転写PCRにより増幅し、ウサギ由来の抗体軽鎖可変領域の場合は改変型のヒトκ型軽鎖定常領域であるk0MTC（配列番号：38）をコードするDNAとインフレームとなるように再結合させた。上述のように再結合させた抗体の重鎖および軽鎖のコード配列を有する発現ベクターを調製し、重鎖と軽鎖の発現ベクターの比が1:1になるように混合したものをExpi293（登録商標）F細胞（Thermo Fisher）に対してExpiFectamine（登録商標） 293 Transfection Kitを用いて導入することで、抗体を一過性に発現させた。得られた培養上清からProtein Aを利用したアフィニティ精製により精製抗体を調製してその後の評価に用いた。
表１に、作製された抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質抗体の30クローンの重鎖および軽鎖それぞれの可変領域および定常領域の配列番号を示す（抗体配列のシグナルペプチドと可変領域との境目については、GENETYX-SV/RCソフトウェア（Ver.15.0.3）のSignal Peptide prediction機能を用いた予測結果に従った。）。
Selected B-cell RNA was purified from cryopreserved cell pellets using the ZR-96 Quick-RNA Kit (ZYMO RESEARCH, Cat# R1053). Using the prepared RNA, the DNA encoding the antibody heavy chain variable region was amplified by reverse transcription PCR, and human IgG1 heavy chain constant region F1332 (SEQ ID NO: : 18) was recombined in-frame with the DNA encoding In addition, the DNA encoding the antibody light chain variable region was amplified by reverse transcription PCR, and in the case of the rabbit-derived antibody light chain variable region, k0MTC (SEQ ID NO: 38), which is a modified human κ-type light chain constant region, was added. It was religated in-frame with the encoding DNA. Expression vectors containing the recombined antibody heavy and light chain coding sequences were prepared as described above and mixed in a 1:1 ratio of heavy and light chain expression vectors to Expi293 ( Antibodies were transiently expressed by transfection into ®F cells (Thermo Fisher) using the ExpiFectamine® 293 Transfection Kit. A purified antibody was prepared from the obtained culture supernatant by affinity purification using Protein A and used for subsequent evaluation.
Table 1 shows the sequence numbers of the variable regions and constant regions of the heavy and light chains of 30 clones of anti-human PD-L1 / human PD-1 complex protein antibodies (antibody sequence signal peptide and variable The boundary with the region followed the prediction results using the Signal Peptide prediction function of the GENETYX-SV/RC software (Ver.15.0.3).).
（実施例８）抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体抗体の特異性評価
実施例７で作製された抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質抗体の30クローンの、細胞表面上で形成させたヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体に対する結合特異性の評価を行った。結合の評価はフローサイトメーター（iQue Screener, intellicyt）を用いて行った。細胞や添加するタンパク質の希釈、ならびに洗浄操作にはD-PBS(-)にBSAを最終濃度0.1%になるように添加した溶液（FACS bufferと呼ぶ）を用いた。評価のためにDXB11s細胞を親株として（parent/CHO）、全長ヒトPD-L1遺伝子（塩基配列は配列番号：110、アミノ酸配列は配列番号：111）を導入することで細胞膜表面上にヒトPD-L1を強制発現させた安定発現株（hPD-L1/CHO）、および全長ヒトPD-1遺伝子（塩基配列は配列番号：108、アミノ酸配列は配列番号：109）を導入することで細胞膜表面上にヒトPD-1を強制発現させた安定発現株（hPD-1/CHO）を準備した。ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質を細胞表面上であらかじめ形成させるために、hPD-L1/CHOは10μg/mLの可溶型ヒトPD-1細胞外ドメイン（ECD）タンパク質と混合し、hPD-1/CHOは10μg/mLの可溶型ヒトPD-L1細胞外ドメイン（ECD）タンパク質と混合して30分以上氷上に置いた。384ウェルのV底プレート（Greiner）に20μg/mLに調製した精製抗体を10μL/wellで添加したのちに、上述のあらかじめヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体を形成させた細胞溶液を1ウェルあたり30000細胞になるように10μL/wellで添加した。4℃で30分間インキュベーションして抗体を結合させたのち、遠心操作後に上清を吸引除去した。続けて50μL/wellのFACS bufferを添加した上で遠心操作後に上清を吸引除去する洗浄操作を2回繰り返した。結合を検出するための2次抗体にはGoat Anti-Human IgG Fc Cross-Adsorbed Secondary Antibody.DyLight 650（Thermo Fisher Scientific, SA5-10137）を用いた。
(Example 8) Specificity evaluation of anti-human PD-L1 / human PD-1 complex antibody Cell surface of 30 clones of anti-human PD-L1 / human PD-1 complex protein antibody produced in Example 7 Assessment of binding specificity to the human PD-L1/human PD-1 complex formed above was performed. Binding was assessed using a flow cytometer (iQue Screener, intellicyt). A solution obtained by adding BSA to D-PBS(-) to a final concentration of 0.1% (referred to as FACS buffer) was used for the dilution of cells and proteins to be added, and for the washing operation. For evaluation, DXB11s cells were used as a parent strain (parent/CHO), and human PD-L1 gene (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 110, amino acid sequence: SEQ ID NO: 111) was introduced into the cell membrane surface. By introducing a stable expression strain (hPD-L1/CHO) forcibly expressing L1 and the full-length human PD-1 gene (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 108, amino acid sequence: SEQ ID NO: 109), A stable expression strain (hPD-1/CHO) in which human PD-1 was forcibly expressed was prepared. hPD-L1/CHO was mixed with 10 μg/mL soluble human PD-1 extracellular domain (ECD) protein to preform the human PD-L1/human PD-1 complex protein on the cell surface. , hPD-1/CHO was mixed with 10 μg/mL soluble human PD-L1 extracellular domain (ECD) protein and left on ice for 30 minutes or longer. After adding 10 μL/well of the purified antibody adjusted to 20 μg/mL to a 384-well V-bottom plate (Greiner), 1 cell solution in which the above-mentioned human PD-L1/human PD-1 complex was previously formed was added. 10 μL/well was added so that 30000 cells per well. After incubating at 4°C for 30 minutes to bind the antibody, the supernatant was removed by aspiration after centrifugation. Subsequently, a washing operation of adding 50 μL/well of FACS buffer and then removing the supernatant by aspiration after centrifugation was repeated twice. Goat Anti-Human IgG Fc Cross-Adsorbed Secondary Antibody.DyLight 650 (Thermo Fisher Scientific, SA5-10137) was used as a secondary antibody for detecting binding.
ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体タンパク質の細胞表面上での形成効率は、可溶型ヒトPD-1細胞外ドメインタンパク質および可溶型ヒトPD-L1細胞外ドメインタンパク質に付加されたビオチンを利用して、Streptavidin-APC（Miltenyi Biotec, 130-106791）を添加して検出することで確認した。
データ解析はFlowJoソフトウエア（トミーデジタルバイオロジー）を用いて行った。
得られた結合データを図５および表２に示す。PD-L1 / PD-1複合体に対して高い結合選択性を有する複数の抗体が得られた。
The formation efficiency of the human PD-L1/human PD-1 complex protein on the cell surface was evaluated by the soluble human PD-1 ectodomain protein and biotin added to the soluble human PD-L1 ectodomain protein. was confirmed by adding and detecting Streptavidin-APC (Miltenyi Biotec, 130-106791).
Data analysis was performed using FlowJo software (Tomy Digital Biology).
The resulting binding data are shown in FIG. 5 and Table 2. Multiple antibodies were obtained with high binding selectivity for the PD-L1/PD-1 complex.
（実施例９）抗ヒトPD-1抗体の調製
ヒトPD-1に結合しその免疫抑制性のシグナルを誘導しうる複数の抗ヒトPD-1抗体を調製した。実施例１に記載したPD1-17、antibody949（clone 949）、clone 10に、PDA0129（重鎖可変領域配列番号：99 、軽鎖可変領域配列番号：100 、重鎖定常領域配列番号：18、軽鎖定常領域配列番号：38）を加えた、4クローンの抗ヒトPD-1抗体を当業者公知の方法で調製した。
(Example 9) Preparation of anti-human PD-1 antibodies A plurality of anti-human PD-1 antibodies capable of binding to human PD-1 and inducing its immunosuppressive signal were prepared. PD1-17 described in Example 1, antibody949 (clone 949),
実施例１１に記載のリガンド結合阻害活性の評価に供するため、陽性対照としてヒトPD-1とヒトPD-L1との結合を阻害することが公知の抗ヒトPD-1モノクローナル抗体5C4（重鎖可変領域配列番号：101 および軽鎖可変領域配列番号：102（WO2006/121168を参照）、ならびに重鎖定常領域配列番号：105および軽鎖定常領域配列番号：15）およびPembrolizumab（重鎖可変領域配列番号：103 および軽鎖可変領域配列番号：104（WO2016/137850を参照）、ならびに重鎖定常領域配列番号：105および軽鎖定常領域配列番号：15）も併せて当業者公知の方法で調製した。 As a positive control, anti-human PD-1 monoclonal antibody 5C4 (heavy chain variable region SEQ ID NO: 101 and light chain variable region SEQ ID NO: 102 (see WO2006/121168), and heavy chain constant region SEQ ID NO: 105 and light chain constant region SEQ ID NO: 15) and Pembrolizumab (heavy chain variable region SEQ ID NO: :103 and light chain variable region SEQ ID NO:104 (see WO2016/137850), and heavy chain constant region SEQ ID NO:105 and light chain constant region SEQ ID NO:15) were also prepared by methods known to those skilled in the art.
（実施例１０）抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体抗体のPD-1シグナル誘導活性の評価（SHP-2リクルートメント）
抗ヒトPD-1抗体（clone949 および PDA0129）がPD-1シグナルの誘導活性を有するかを、実施例２と同様の手順で、PD-1のシグナル誘導時にPD-1の細胞内ドメインと相互作用する脱リン酸化酵素であるSHP2の近接を指標に評価した。
アッセイの結果を図６に示す。2種類の抗ヒトPD-1抗体が明確なSHP2リクルートメント誘導活性、すなわちPD-1シグナルの誘導活性を有しないことが示唆された。
(Example 10) Evaluation of PD-1 signal-inducing activity of anti-human PD-L1 / human PD-1 complex antibody (SHP-2 recruitment)
Anti-human PD-1 antibodies (clone949 and PDA0129) interact with the intracellular domain of PD-1 during PD-1 signal induction in the same manner as in Example 2 to determine whether they have PD-1 signal-inducing activity. The proximity of SHP2, a dephosphorylating enzyme that
The assay results are shown in FIG. It was suggested that the two types of anti-human PD-1 antibodies do not have clear SHP2 recruitment-inducing activity, that is, PD-1 signaling-inducing activity.
実施例７で作製された抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体抗体がPD-1シグナルの誘導活性を有するかを、実施例２と同様の手順で、PD-1のシグナル誘導時にPD-1の細胞内ドメインと相互作用する脱リン酸化酵素であるSHP2の近接を指標に評価した。
アッセイの結果を図７に示す。抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体抗体が、上述した抗ヒトPD-1抗体（clone949 および PDA0129）と異なり、SHP2リクルートメントを誘導する活性、すなわちPD-1シグナルの誘導活性を有することが示された。
Whether the anti-human PD-L1 / human PD-1 complex antibody prepared in Example 7 has PD-1 signal-inducing activity was determined in the same manner as in Example 2, when PD-1 signal was induced. The proximity of SHP2, a phosphatase that interacts with the intracellular domain of -1, was evaluated as an index.
The assay results are shown in FIG. The anti-human PD-L1 / human PD-1 complex antibody, unlike the above-mentioned anti-human PD-1 antibodies (clone949 and PDA0129), has the activity of inducing SHP2 recruitment, that is, the activity of inducing PD-1 signaling. It has been shown.
（実施例１１）抗ヒトPD-1抗体のリガンド結合阻害活性の評価
実施例９で調製された抗ヒトPD-1抗体（PD1-17、clone 949、clone 10、およびPDA0129）の、ヒトPD-1とヒトPD-L1との結合に対する阻害活性を評価した。阻害活性の評価は、ヒトPD-1発現細胞に結合する可溶型ヒトPD-L1細胞外ドメイン(ECD)タンパク質の結合強度が、抗ヒトPD-1抗体の存在下で減弱されるかを指標に行った。結合の評価はフローサイトメーター（iQue Screener, intellicyt）を用いて行った。細胞や添加するタンパク質の希釈、ならびに洗浄操作にはD-PBS(-)にBSAを最終濃度0.1%になるように添加した溶液（FACS bufferと呼ぶ）を用いた。評価には前述の全長ヒトPD-1遺伝子（塩基配列は配列番号：108、アミノ酸配列は配列番号：109）を導入することで細胞膜表面上にヒトPD-1を強制発現させた安定発現株（hPD-1/CHO）を用いた。一連の染色操作はV-Bottom 96 Well Cell Culture Plate（costar, 3894）を用いて行った。FACS bufferにて20, 4, 0.8μg/mLの各濃度に希釈した抗体溶液（100μL/well）を、3 x 106 細胞/mLに調製したhPD-1/CHO細胞50μL/well（150000 細胞/well）と混合して氷上で30分間置くことで抗体を結合させた。その後、10μg/mLのビオチン化された可溶型ヒトPD-L1細胞外ドメイン（ECD）タンパク質と混合して15分氷上に置いた。遠心操作後に上清を吸引除去し、続けて200μL/wellのFACS bufferを添加した上で遠心操作後に上清を吸引除去する洗浄操作を2回繰り返した。結合を検出するためのStreptavidin-APCは1000倍希釈したものを100μL/wellで添加して氷上で30分間インキュベートした。遠心操作後に上清を吸引除去し、続けて200μL/wellのFACS bufferを添加した上で遠心操作後に上清を吸引除去し、最終的に50μL/wellのFACS bufferで懸濁してiQue Screener,による結合データ取得を行った。取得されたデータの解析はFlowJoソフトウエア（トミーデジタルバイオロジー）を用いて行った。
図８に示されるとおり、PD1-17およびclone 10はヒトPD-L1のヒトPD-1への結合を阻害する抗体であり、一方clone 949およびPDA0129は該結合を阻害しない抗体であった。
(Example 11) Evaluation of ligand binding inhibitory activity of anti-human PD-1 antibody The inhibitory activity against the binding of 1 to human PD-L1 was evaluated. Evaluation of inhibitory activity indicates whether the binding strength of soluble human PD-L1 extracellular domain (ECD) protein binding to human PD-1-expressing cells is attenuated in the presence of anti-human PD-1 antibody. went to Binding was assessed using a flow cytometer (iQue Screener, intellicyt). A solution obtained by adding BSA to D-PBS(-) to a final concentration of 0.1% (referred to as FACS buffer) was used for the dilution of cells and proteins to be added, and for the washing operation. For the evaluation, a stable expression strain ( hPD-1/CHO) was used. A series of staining procedures were performed using a V-Bottom 96 Well Cell Culture Plate (costar, 3894). Antibody solution (100 μL/well) diluted to each concentration of 20, 4, and 0.8 μg/mL with FACS buffer was adjusted to 3 x 10 6 cells/mL for hPD-1/CHO cells 50 μL/well (150000 cells/ wells) and placed on ice for 30 minutes to bind antibodies. Then, it was mixed with 10 μg/mL biotinylated soluble human PD-L1 extracellular domain (ECD) protein and left on ice for 15 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed by aspiration, followed by the addition of 200 μL/well of FACS buffer, followed by centrifugation, followed by washing by aspiration and removal of the supernatant, which was repeated twice. Streptavidin-APC for detecting binding was diluted 1000 times and added at 100 μL/well and incubated on ice for 30 minutes. After centrifugation, remove the supernatant by aspiration, add 200 μL/well of FACS buffer, remove the supernatant after centrifugation, and finally suspend in 50 μL/well of FACS buffer. Combined data acquisition was performed. Analysis of the acquired data was performed using FlowJo software (Tomy Digital Biology).
As shown in Figure 8, PD1-17 and
（実施例１２）抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体抗体を利用したPD-1アゴニスト抗体の作製
本発明者らは、上記で作製された抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体抗体を元に、PD-1に対するアゴニスト活性がより強力な、さらなる抗体分子型を検討した。具体的には、内因性のPD-L1 / PD-1複合体が形成されてその免疫抑制性制御の機能が発揮される免疫シナプスやTCRミクロクラスターの局所において、PD-L1によって誘導されるPD-1の免疫抑制性シグナルをさらに増強し得る分子型コンセプトを検討した。本発明者らは、抗PD-L1/PD-1複合体アームおよび抗PD-1アームを含む二重特異性抗体が該分子型コンセプトを満たすと考え、その評価を行った。
(Example 12) Preparation of PD-1 agonist antibody using anti-human PD-L1 / human PD-1 complex antibody The present inventors prepared the anti-human PD-L1 / human PD-1 complex Based on the body antibodies, we investigated additional antibody molecular types with stronger agonistic activity against PD-1. Specifically, PD-L1-induced PD locally at immune synapses and TCR microclusters where endogenous PD-L1/PD-1 complexes are formed and exert their immunosuppressive regulatory function. We investigated a molecular type concept that could further enhance the immunosuppressive signal of -1. The present inventors considered that a bispecific antibody comprising an anti-PD-L1/PD-1 complex arm and an anti-PD-1 arm would satisfy the molecular type concept, and evaluated it.
デザインされた二重特異性抗体の元となる抗ヒトPD-1抗体は、実施例９に記載のPD1-17、antibody949（clone 949）、clone 10、PDA0129の4クローンを用いた。表３に、実施例１１で示されたこれら抗ヒトPD-1抗体の、ヒトPD-L1のヒトPD-1への結合に対する阻害活性の有無がまとめられている。
Anti-human PD-1 antibodies from which designed bispecific antibodies were based were four clones of PD1-17, antibody949 (clone 949),
該二重特異性抗体の元となる抗PD-L1 / PD-1複合体抗体は、実施例７で作製された30クローン（表１）から選択して用いた。表４に、作製された二重特異性抗体における抗PD-1アームおよび抗PD-L1 / PD-1複合体アームの組み合わせのうち、特に後の実施例で用いられた組み合わせを示す。 The anti-PD-L1/PD-1 complex antibody, which is the source of the bispecific antibody, was selected from 30 clones prepared in Example 7 (Table 1) and used. Table 4 shows combinations of anti-PD-1 arms and anti-PD-L1/PD-1 complex arms in prepared bispecific antibodies, particularly those used in later examples.
表５に、上記で作製された抗PD-1アームおよび抗PD-L1 / PD-1複合体アームを含む二重特異性抗体の元となる抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域および定常領域の配列番号を示す（抗体配列のシグナルペプチドと可変領域との境目については、GENETYX-SV/RCソフトウェア（Ver.15.0.3）のSignal Peptide prediction機能を用いた予測結果に従った。）。 Table 5 lists the variable regions and respective variable regions of the heavy and light chains of the antibodies from which the bispecific antibodies comprising the anti-PD-1 arm and the anti-PD-L1/PD-1 complex arm generated above are shown in Table 5. SEQ ID NO of the constant region is shown (The boundary between the signal peptide and the variable region of the antibody sequence was predicted using the Signal Peptide prediction function of the GENETYX-SV/RC software (Ver.15.0.3).) .
（実施例１３）抗PD-L1/PD-1複合体アームと抗PD-1アームを含む二重特異性抗体のPD-1シグナル誘導活性の評価（SHP-2リクルートメント）
抗PD-L1/PD-1複合体アームと抗PD-1アームを含む二重特異性抗体がPD-1シグナルの誘導活性を有するかを、実施例２と同様の手順で、PD-1のシグナル誘導時にPD-1の細胞内ドメインと相互作用する脱リン酸化酵素であるSHP2の近接を指標に評価した。
アッセイの結果を図９に示す。抗PD-L1/PD-1複合体アームと抗PD-1アームを含む二重特異性抗体がSHP2リクルートメントを誘導する活性、すなわちPD-1シグナルの誘導活性を有することが示された。特にantibody949 （clone 949）およびPDA0129といったPD-1とPD-L1との結合を阻害しない特性を有する抗PD-1抗体由来のアームを用いた二重特異性抗体を使うと、SHP2リクルートメントの誘導活性が顕著に高いことが分かった。
(Example 13) Evaluation of PD-1 signal-inducing activity of bispecific antibody containing anti-PD-L1/PD-1 complex arm and anti-PD-1 arm (SHP-2 recruitment)
Whether the bispecific antibody containing the anti-PD-L1/PD-1 complex arm and the anti-PD-1 arm has the PD-1 signal-inducing activity was examined in the same manner as in Example 2. The proximity of SHP2, a phosphatase that interacts with the intracellular domain of PD-1 upon signal induction, was evaluated.
The assay results are shown in FIG. It was shown that a bispecific antibody containing an anti-PD-L1/PD-1 complex arm and an anti-PD-1 arm has the activity of inducing SHP2 recruitment, that is, the activity of inducing PD-1 signaling. SHP2 recruitment was induced using bispecific antibodies, particularly antibody949 (clone 949) and PDA0129, with arms derived from anti-PD-1 antibodies that do not inhibit the binding of PD-1 and PD-L1. It was found that the activity was remarkably high.
（実施例１４）NFAT活性の抑制を指標としたPD-1シグナル誘導活性の評価
抗PD-L1/PD-1複合体アームと抗PD-1アームを含む二重特異性抗体によって誘導されるPD-1シグナルが免疫抑制性の機能を有するかを、免疫活性化を担うT細胞受容体シグナルの下流で働く転写因子NFATの活性を指標に評価した。PD-1/PD-L1 Blockade Bioassayシステム（Promega）を用い、NFAT response element下流でLuciferaseの発光反応が起こることを利用して評価を行った。本アッセイではPD-L1 aAPC/CHO-K1細胞上のTCR stimulatorがPD-1 Effector Cell上のTCRの活性化シグナルを誘導することで、NFAT活性化が起こりレポーター遺伝子であるLuciferaseの発光が観察されるが、PD-L1によるPD-1シグナルの誘導によってNFATの活性化はほぼ完全に抑えられている。ところが、PD-L1阻害抗体の添加によってPD-1シグナル誘導が阻害されるとNFAT活性化が起こる。本発明者らは事前に本アッセイにおいてはPD-L1阻害抗体であるYW243.55S70を添加する最終濃度を40ng/mLにした時に約30%のPD-L1阻害がかかることを見出し、その条件下において二重特異性抗体がNFAT活性化の抑制を誘導するかを評価した。
(Example 14) Evaluation of PD-1 signal-inducing activity using suppression of NFAT activity as an indicator PD induced by a bispecific antibody containing an anti-PD-L1/PD-1 complex arm and an anti-PD-1 arm We evaluated whether -1 signaling has an immunosuppressive function using the activity of the transcription factor NFAT, which works downstream of T cell receptor signaling responsible for immune activation. Using the PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay system (Promega), evaluation was carried out by taking advantage of the luminescence reaction of Luciferase occurring downstream of the NFAT response element. In this assay, the TCR stimulator on PD-L1 aAPC/CHO-K1 cells induces the activation signal of the TCR on PD-1 effector cells, resulting in NFAT activation and the luminescence of the reporter gene Luciferase. However, the induction of PD-1 signaling by PD-L1 almost completely suppresses NFAT activation. However, NFAT activation occurs when PD-1 signal induction is inhibited by the addition of PD-L1 inhibitory antibodies. The present inventors have previously found that in this assay, about 30% PD-L1 inhibition occurs when the final concentration of YW243.55S70, which is a PD-L1 inhibitory antibody, is added to 40 ng / mL. We assessed whether bispecific antibodies induced suppression of NFAT activation in .
反応はRound well 384 Well White Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate（Corning, 3826）を用いて行った。まずPD-L1 aAPC/CHO-K1細胞を2.5 x 105 細胞/mLに調整したものを30μL/wellで添加して37℃の5% CO2の条件で一晩インキュベートして付着させ、その後培養上清を除去した後にYW243.55S70の最終濃度が40ng/mLとなるように各濃度の二重特異性抗体と混合した抗体溶液を10μL/wellで添加した。室温で15分間静置した後に、PD-1 Effector Cellを4.6875 x 105 細胞/mLに調製したものを10μL/wellで添加して37℃の5% CO2の条件にて6時間インキュベートした。Bio-Glo Luciferase Assay System（Prmega, G7940）のLuciferase基質溶液を20μL/wellにて添加して室温で5分間静置した後にLuciferaseの発光をマイクロプレートリーダーEnVision Xcite（PerkinElmer）にて測定した。 Reactions were performed using Round well 384 Well White Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates (Corning, 3826). First, PD-L1 aAPC/CHO-K1 cells adjusted to 2.5 x 10 5 cells/mL were added at 30 μL/well and incubated overnight at 37°C in 5% CO 2 conditions to adhere, and then cultured. After removing the supernatant, 10 μL/well of an antibody solution mixed with bispecific antibodies at various concentrations was added so that the final concentration of YW243.55S70 was 40 ng/mL. After allowing to stand at room temperature for 15 minutes, 10 μL/well of PD-1 Effector Cells adjusted to 4.6875×10 5 cells/mL was added and incubated at 37° C. and 5% CO 2 for 6 hours. A Luciferase substrate solution of Bio-Glo Luciferase Assay System (Prmega, G7940) was added at 20 μL/well, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then Luciferase luminescence was measured using a microplate reader EnVision Xcite (PerkinElmer).
図１０に評価の結果が示される。作製された抗PD-L1/PD-1複合体アームおよび抗PD-1アームを含む二重特異性抗体は、前述のNanoBRET（登録商標）を使用したSHP-2リクルートメントアッセイ系で確認されたSHP2リクルートメント活性を有するだけでなく、本アッセイにより示されたようにNFAT活性を抑制する機能を有することも確認された。 The results of the evaluation are shown in FIG. The generated bispecific antibodies containing anti-PD-L1/PD-1 complex arms and anti-PD-1 arms were confirmed in the aforementioned NanoBRET®-based SHP-2 recruitment assay system. In addition to having SHP2 recruitment activity, it was also confirmed to have a function of suppressing NFAT activity as shown by this assay.
（実施例１５）各分子型コンセプトのデザインおよび各アームの機能、ならびにそれらの作用機序
上述の実施例で検討されたPD-1アゴニスト抗体の具体的な抗体分子のデザインおよび各アームの機能を図１１に、推定された作用機序を図１２に示す。
抗ヒトPD-L1 / ヒトPD-1複合体抗体（図１１上および図１２左）の両アームは、免疫シナプスへのターゲッティング機能に加えてPD-L1のPD-1への相互作用を増強する機能を有することにより、実施例１０で示されたようなPD-1に対するアゴニスト作用を発揮すると推定された。この作用機序は、PD-L1のPD-1への相互作用を増強し得る抗複合体抗体だけでなく、他の共抑制分子リガンドの他の共抑制分子への相互作用を増強し得る抗複合体抗体にも適用され得る。
抗PD-L1/PD-1複合体アームおよび抗PD-1アームを含む二重特異性抗体（図１１下および図１２右）において、抗PD-L1/PD-1複合体アームは、少なくとも免疫シナプスへのターゲッティング機能を有していればよく、PD-L1のPD-1への相互作用を増強する機能を有していても有していなくてもよい。該二重特異性抗体において、抗PD-1アームは、PD-1に対するアゴニスト作用を発揮すると推定された。この作用機序は、PD-L1のPD-1への相互作用を増強し得る抗複合体アームだけでなく、他の共抑制分子リガンドの他の共抑制分子への相互作用を増強し得る抗複合体アームにも適用され得る。
(Example 15) The design of each molecular type concept, the function of each arm, and their mechanism of action. FIG. 11 shows the presumed mechanism of action in FIG.
Both arms of the anti-human PD-L1/human PD-1 complex antibody (Fig. 11 top and Fig. 12 left) enhance the interaction of PD-L1 to PD-1 in addition to the targeting function to the immune synapse. By having the function, it was presumed to exert an agonistic action on PD-1 as shown in Example 10. This mechanism of action suggests not only anti-complex antibodies that can enhance the interaction of PD-L1 to PD-1, but also anti-complex antibodies that can enhance the interaction of other co-inhibitory ligands to other co-inhibitory molecules. It can also be applied to conjugated antibodies.
In bispecific antibodies comprising an anti-PD-L1/PD-1 complex arm and an anti-PD-1 arm (FIG. 11 bottom and FIG. 12 right), the anti-PD-L1/PD-1 complex arm is at least immune As long as it has a synapse-targeting function, it may or may not have a function of enhancing the interaction of PD-L1 with PD-1. In the bispecific antibody, the anti-PD-1 arm was presumed to exert an agonistic effect on PD-1. This mechanism of action suggests not only an anti-complex arm that can enhance the interaction of PD-L1 to PD-1, but also an anti-complex arm that can enhance the interaction of other co-inhibitory ligands to other co-inhibitory molecules. It can also be applied to composite arms.
Claims (15)
前記第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体に特異的に結合し得る、抗原結合分子。 An antigen-binding molecule comprising a first antigen-binding domain,
An antigen-binding molecule, wherein said first antigen-binding domain is capable of specifically binding a first complex consisting of a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand to said first co-inhibitory molecule.
前記第１の抗原結合ドメインが第１の共抑制分子および前記第１の共抑制分子に対する第１の共抑制分子リガンドからなる第１の複合体に結合し得、そして
前記第１の抗原結合ドメインの前記第１の複合体への結合活性が、前記第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子および前記第１の複合体を形成していない第１の共抑制分子リガンドのいずれか一方または両方への結合活性よりも高い、抗原結合分子。 An antigen-binding molecule comprising a first antigen-binding domain,
said first antigen binding domain is capable of binding a first complex consisting of a first co-inhibitory molecule and a first co-inhibitory molecule ligand to said first co-inhibitory molecule, and said first antigen binding domain The binding activity to the first complex of the first co-inhibitory molecule that does not form the first complex and the first co-inhibitory molecule ligand that does not form the first complex An antigen-binding molecule that has higher binding activity to either or both.
(a) 前記第１の共抑制分子を強制発現し前記第１の共抑制分子リガンドを強制発現していない第１の細胞を用いたフローサイトメトリーにおいて、前記第１の共抑制分子リガンドの細胞外ドメインを含む第１の可溶型ポリペプチドの存在下における前記第１の抗原結合ドメインの前記第１の細胞への結合活性が、前記第１の可溶型ポリペプチドの非存在下に比べて高い；
(b) 前記第１の共抑制分子リガンドを強制発現し前記第１の共抑制分子を強制発現していない第２の細胞を用いたフローサイトメトリーにおいて、前記第１の共抑制分子の細胞外ドメインを含む第２の可溶型ポリペプチドの存在下における前記第１の抗原結合ドメインの前記第２の細胞への結合活性が、前記第２の可溶型ポリペプチドの非存在下に比べて高い。 5. The antigen-binding molecule of claim 3 or 4, wherein said binding activity satisfies either one or both of the following conditions (a) and (b):
(a) cells of the first co-inhibitory molecule ligand in flow cytometry using a first cell that forcibly expresses the first co-inhibitory molecule but does not forcibly express the first co-inhibitory molecule ligand; The binding activity of the first antigen-binding domain to the first cell in the presence of the first soluble polypeptide containing the ectodomain is lower than in the absence of the first soluble polypeptide high;
(b) in flow cytometry using a second cell that forcibly expresses the first co-inhibitory molecule ligand but does not forcibly express the first co-inhibitory molecule, The binding activity of the first antigen-binding domain to the second cell in the presence of the second soluble polypeptide containing the domain is higher than that in the absence of the second soluble polypeptide expensive.
前記第１の共抑制分子リガンドによる前記第５の細胞における前記第２の細胞内シグナルの抑制が前記第１の共抑制分子リガンドに対する阻害抗体により部分的に抑制されている条件下で行われる、前記第２の細胞内シグナルの強度の測定系において、
前記抗原結合分子の存在下における前記第２の細胞内シグナルの前記強度が、前記抗原結合分子の非存在下に比べて低い、請求項６から９のいずれか一項に記載の抗原結合分子。 expressing the T cell receptor and the first co-inhibitory molecule, the intensity of a second intracellular signal that can be activated downstream of the T cell receptor can be measured, and the first intracellular signal and a sixth cell expressing an antigen-independent T cell receptor activator and the first co-inhibitory molecule ligand used under conditions that allow contact with each other, and
under conditions in which inhibition of the second intracellular signal in the fifth cell by the first co-inhibitory molecule ligand is partially inhibited by an inhibitory antibody to the first co-inhibitory molecule ligand; In the second intracellular signal intensity measurement system,
10. The antigen-binding molecule of any one of claims 6-9, wherein the intensity of the second intracellular signal in the presence of the antigen-binding molecule is lower than in the absence of the antigen-binding molecule.
前記第２の抗原結合ドメインが、第２の共抑制分子リガンドと第２の複合体を形成し得る第２の共抑制分子に特異的に結合し得る、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗原結合分子。 wherein the antigen-binding molecule is a multiple antigen-binding molecule further comprising a second antigen-binding domain;
12. Any one of claims 1-11, wherein said second antigen binding domain is capable of specifically binding a second co-inhibitory molecule capable of forming a second complex with a second co-inhibitory molecule ligand. The antigen-binding molecule according to .
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