JP2023093644A - アンジオテンシノーゲンの発現を調節するための化合物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】必要とする個体において、AGTを調節し、かつRAAS経路関連疾患、障害及び/または病態を調節するための修飾オリゴヌクレオチドを含む、組成物及び化合物を提供する。【解決手段】高血圧などの個体におけるRAAS経路関連疾患、障害及び/または病態は、AGTに対して標的化されたアンチセンス化合物の投与により、治療、改善、遅延または予防することができる。【選択図】なし
Description
配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2016年10月3日に作成されたサイズ456kbのBIOL0270WOSEQ_ST25.txtと題するファイルとして提出される。この電子形式の配列表中の情報は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2016年10月3日に作成されたサイズ456kbのBIOL0270WOSEQ_ST25.txtと題するファイルとして提出される。この電子形式の配列表中の情報は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、動物におけるRAAS経路関連疾患、障害または病態を調節する目的で、アンジオテンシノーゲン(AGT)の発現を調節するための化合物、組成物及び方法を提供する。本発明はまた、AGT阻害薬を動物に投与することによって、高血圧及び器官障害を軽減するための化合物、組成物及び方法を提供する。
SERPINA8またはANHUとしても知られるアンジオテンシノーゲン(AGT)は、セルピンファミリーのメンバーであり、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(RAAS)の一構成要素である。AGTは、主に肝臓で産生された後、循環系中に放出され、そこで、レニンによりアンジオテンシンIに変換される。アンジオテンシンIは、続いて、アンジオテンシン変換酵素(ACE)によって、アンジオテンシンIIに変換される。アンジオテンシンIIは、血管収縮をもたらすペプチドホルモンであり、それにより血圧を上昇させることができる。アンジオテンシンIIはまた、副腎皮質からのホルモンアルドステロンの分泌を刺激する。アルドステロンは、腎臓にナトリウム及び水の再吸収を増加させるように働き、これにより、体内の体液量が増加し、結果として、血圧の上昇が生じ得る。RAAS経路の過剰な刺激または活性は、高い血圧につながる場合がある。慢性的な高い血圧は、高血圧として知られている。高血圧の対象では、この血圧の高さにより、心臓の働きを増大させて血液を血管に循環させる必要がある。
世界保健機関(WHO)は、高血圧を心臓血管疾患の主原因であるとしている。高血圧は、寿命短縮、慢性腎疾患、脳卒中、心筋梗塞、心不全、血管の動脈瘤(例えば、大動脈瘤)、末梢動脈疾患、心臓障害(例えば、心拡大または心肥大)及び他の心臓血管に関連する疾患、障害及び/または病態などの様々な疾患、障害及び病態の主要危険因子である。
治療抵抗性高血圧(RHTN)、すなわち、薬物治療に耐性のある高血圧の罹患率は、集団の高齢化及び肥満症の発生率の絶え間ない増加により、数値が着実に増加している。米国における約1000万人のRHTN成人という現在の予測は、増加していくだろうと考えられている。
抗高血圧薬、腎デナベーション、圧受容器活性化療法、食生活の改善及び生活習慣の改善は、高血圧を軽減し、高血圧に関連する疾患、障害及び/または病態を軽減し得る(Paulis et al.,Nat Rev Cardiol,2012,9:276-285)。しかしながら、高血圧の治療に対して現在承認されている治療法には、全高血圧患者のうちのかなりの部分が十分な血圧制御を達成できていないため、限界がある。例えば、レニン-アンジオテンシン系(RAS)経路の一部を標的にするACE阻害薬及びアンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)などの薬物は、RAAS経路を阻害する能力に限りがある(Nobakht et al.,Nat Rev Nephrol,2011,7:356-359)。更に、ACE阻害薬などの特定の抗高血圧薬は、患者の腎機能を弱める可能性があるため、腎疾患を伴う高血圧患者には禁忌である。
したがって、RAAS経路を阻害し、高血圧を治療するための代替治療を見出す必要がある。アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させるのに有効な手段として注目されている。しかしながら、AGTを標的にする初期のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定的な利益しかもたらさないか(WO1997/33623)、非ヒトAGTを標的にしている(WO2014/018930)。本明細書の化合物及び組成物は、ヒトAGTを阻害する、非常に強力かつ忍容性のある新規化合物を提供するものであり、これらはまた、ヒト対象における使用に適している。更に、本明細書に開示される化合物は、コンジュゲート法を使用してアンチセンス化合物を肝臓に送達し、その腎臓内分布及び活性を制限することにより、高カリウム血症及び/または腎疾患のリスクのある患者において、従来のRAS拮抗薬の忍容性問題を低減すると予想される。
限定するものではないが、特許、特許出願、記事、書籍及び論文を含む、本出願に引用される全ての文献または文献の一部は、本明細書で考察される文献の一部について、またその全体が参照により明示的に本明細書に援用される。
動物においてAGT mRNA及び/またはタンパク質のレベルを低下させるための組成物、化合物及び方法が本明細書で提供される。
本明細書で開示される特定の実施形態は、AGTをコードする核酸配列を標的にする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態において、化合物は、配列番号1~6のうちのいずれかの核酸塩基配列に示されるAGT配列を標的にする。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2250~2337のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2281~2300のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、12~30個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号46、53~54、61、68、76、83、85、93、96~97、109、127、129~130、132、134~15、137~39、142、163~172、180~184、186、189、234、236、238~239、267、313、411、452、463~470、475~478、480、500~503、512、517~518、524~526、654、689、702、725~726、728、738、779、786~787、800、808、810~811、825、865、868、889、894、903、905、909、954、966、1011、1015、1021、1024、1080、1085、1258~1259、1261~1262、1293~1294、1299、1325、1470、1472~1473、1522、1542、1604、1623~1624、1667、1670、1682~1683、1687、1700、1703~1704、1708、1714、1716、1719~1720、1724~1726、1729~1730、1827、1936、1843~1844、1846、1886、1893~1894、1914、
1923、1925、1932、1979、1986、1988、1990、2003、2015、2018、2020、2027~2028、2035、2037、2039、2044の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
1923、1925、1932、1979、1986、1988、1990、2003、2015、2018、2020、2027~2028、2035、2037、2039、2044の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、次式:mCes Aes mCes Aes
Aes Ads mCds Ads Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds mCes Ges Ges Tes Te(配列番号1914)(式中、Aはアデニンであり、mCは5-メチルシトシンであり、Gはグアニンであり、Tはチミンであり、eは2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、dは2’-デオキシヌクレオシドであり、sはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)に従う修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
Aes Ads mCds Ads Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds mCes Ges Ges Tes Te(配列番号1914)(式中、Aはアデニンであり、mCは5-メチルシトシンであり、Gはグアニンであり、Tはチミンであり、eは2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、dは2’-デオキシヌクレオシドであり、sはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)に従う修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
本明細書で開示される特定の実施形態は、次式を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
前述の全般的な説明及び以下の詳細な説明は、いずれも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を制限するものではないことを理解されたい。本明細書中、単数形の使用は、特に明記しない限り、複数を含む。本明細書で使用されるとき、「or(または)」の使用は、別の記載がない限り、「and/or(及び/または)」を意味する。更に、「including(含む)」という用語ならびに「includes(含む)」及び「included(含む)」などの他の形の使用は、限定的ではない。また、「要素」または「成分」などの用語は、特に明記しない限り、1単位を含む要素及び成分と、1つを超える下位単位を含む要素及び成分との両方を包含する。
本明細書で使用される段落見出しは、単に構成上の目的であり、記載される主題の限定を意図するものではない。限定するものではないが、特許、特許出願、記事、書籍及び論文を含む、本出願に引用される全ての文献または文献の一部は、本明細書で考察される文献の一部について、またその全体が参照により明示的に本明細書に援用される。
定義
特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、有機合成化学及び医薬製薬化学に関して使用される用語ならびにこれらの手順及び技術は、当該技術分野にお
いてよく知られており、一般的に使用されるものである。化学合成及び化学分析には、標準的技術を使用することができる。許容される場合、本開示を通して参照される全ての特許、出願、公開出願、ならびに他の公開物、国立生物工学情報センター(NCBI)などのデータベースを通じて取得可能なGENBANKアクセッション番号及び関連する配列情報、ならびに他のデータは、本明細書で考察される文献の一部について、またその全体が参照により本明細書に援用される。
特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、有機合成化学及び医薬製薬化学に関して使用される用語ならびにこれらの手順及び技術は、当該技術分野にお
いてよく知られており、一般的に使用されるものである。化学合成及び化学分析には、標準的技術を使用することができる。許容される場合、本開示を通して参照される全ての特許、出願、公開出願、ならびに他の公開物、国立生物工学情報センター(NCBI)などのデータベースを通じて取得可能なGENBANKアクセッション番号及び関連する配列情報、ならびに他のデータは、本明細書で考察される文献の一部について、またその全体が参照により本明細書に援用される。
特に指示がない限り、次の用語は、次の意味を有する。
「2’-O-メトキシエチル」(2’-MOE及び2’-O(CH2)2-OCH3も同様)は、フロシル環の2’位のO-メトキシ-エチル修飾を指す。2’-O-メトキシエチルで修飾された糖は、修飾糖である。
「2’-O-メトキシエチルヌクレオチド」は、2’-O-メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドを意味する。
「5-メチルシトシン」とは、5’位にメチル基が結合した修飾されたシトシンを意味する。5-メチルシトシンは、修飾核酸塩基である。
「約」は、値の±10%以内を意味する。例えば、「マーカーが約50%増加し得る」と記載される場合、それは、そのマーカーが45%~55%増加し得ることを意味する。
アンジオテンシンIIの再活性化としても知られる「ACEエスケープ」は、血漿アンジオテンシンIIレベルを確実に抑制するための現在利用可能なACE阻害薬の治療が効かなくなることを指す。ACE阻害中の血漿アンジオテンシンIIレベルの上昇は、アンジオテンシンIをアンジオテンシンに変換する他の酵素によって生じる。このアンジオテンシンIIレベルの不完全な遮断は、ACE阻害薬による一部の高血圧の対象の効果的な治療を妨げている。アンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)も同様に、AT1受容体以外の他の受容体がアンジオテンシン代謝産物に結合することから、ACEエスケープの影響を受け得る。
「活性薬剤」または「薬剤」とは、個体に投与したときに治療上の利益をもたらす、医薬組成物中の1つ以上の物質を意味する。例えば、特定の実施形態において、AGTに対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性薬剤である。
「活性標的領域」または「標的領域」とは、1つ以上の活性アンチセンス化合物が標的とする領域を意味する。
「活性アンチセンス化合物」とは、標的核酸レベルまたはタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
「同時に投与される」は、患者において2つの剤の両方の薬理作用が同時に顕在化される任意の方法での2つの剤の共投与を指す。同時投与は、両方の剤が、単一の医薬組成物、同じ剤形または同じ投与経路で投与されることを必要としない。両方の剤の作用が同時に顕在化される必要はない。作用は、ある期間にわたって重複しているだけでよく、同じ時間幅を有する必要はない。
「投与すること」とは、個体に薬剤を提供することを意味し、医療専門家による投与及び自己投与を含むが、これらに限定されない。
「アルドステロンエスケープ」または「アルドステロンブレイクスルー」は、一部の治療中対象において、アルドステロン放出を確実に抑制するための現在利用可能なACE阻害薬 アンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)及び/または直接的レニン阻害薬(DRI)の治療が効かなくなることを指す。このアルドステロンの不完全な遮断は、ACE阻害薬、DRI及びARBによる一部の高血圧の対象の効果的な治療を妨げている。
「剤」とは、動物に投与したときに治療上の利益をもたらすことができる活性物質を意味する。「第1の剤」とは、本明細書で提供される治療用化合物を意味する。例えば、第1の剤は、AGTを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「第2の剤」とは、第2の本明細書に記載される治療用化合物を意味する。例えば、第2の剤は、AGTまたはAGT以外の標的を標的にする第2のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。あるいは、第2の剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド以外の化合物であり得る。
「改善」または「改善する」は、関連する疾患、障害及び/または病態の少なくとも1つの指標、マーカー、徴候または症状の軽減を指す。特定の実施形態において、改善は、病態、障害及び/または疾患の1つ以上の指標の進行の遅延または減速を含む。指標の重症度は、当業者に知られている、主観的または客観的尺度によって決定することができる。
「アンジオテンシノーゲン」及び「AGT」は、本明細書で区別なく用いられる。アンジオテンシノーゲンは、SERPINA8及びANHUとしても知られている。
「アンジオテンシノーゲン核酸」または「AGT核酸」とは、AGTをコードする任意の核酸を意味する。例えば、特定の実施形態において、AGT核酸には、AGTをコードするDNA配列、AGTをコードするDNAから転写されたRNA配列(イントロン及びエクソンを含むゲノムDNAを含む)、及びAGTをコードするmRNA配列が含まれる。「AGT mRNA」は、AGTタンパク質をコードするmRNAを意味する。
「AGT特異的阻害薬」は、AGT mRNA及び/またはAGTタンパク質の発現を特異的に阻害することができる任意の剤を指す。例えば、AGT特異的阻害薬には、AGT mRNA及び/またはAGTタンパク質の発現を特異的に阻害することができる、核酸(RNasH、siRNA及びブロックマーアンチセンス化合物などのアンチセンス化合物を含む)、ペプチド、抗体、小分子及び他の剤が含まれる。特定の実施形態において、AGT特異的阻害薬は、AGT mRNAレベル及び/またはAGTタンパク質発現を特異的に調節することによって、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(RAAS)経路の構成要素に影響を与えることができる。特定の実施形態において、AGT特異的阻害薬は、AGT mRNAレベル及び/またはAGTタンパク質発現を特異的に調節することによって、血圧などのRAAS経路関連疾患、障害及び/または病態に影響を与えることができる。同様に、特定の実施形態において、AGT特異的阻害薬は、動物における他の分子プロセスに影響を与えることができる。
「動物」は、ヒトまたはヒト以外の動物を指し、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ及び非ヒト霊長類(サル及びチンパンジーを含むが、これらに限定されない)が含まれる。
「抗高血圧薬」は、血圧を下げることができる薬物を指す。かかる薬物の例には、RAAS阻害薬、利尿薬、カルシウムチャネル拮抗薬、交感神経受容体遮断薬、交感神経作動薬及び血管拡張薬が挙げられるが、これらに限定されない。一例として、抗高血圧薬カプトプリルを本明細書に記載のAGT化合物と組み合わせて使用して、RAAS経路関連疾患、障害及び/もしくは病態を有する動物、またはそのリスクのある動物を治療すること
ができる。
ができる。
「抗高血圧処置」は、高血圧を軽減するために対象に対して実施される医療処置を指す。かかる処置の例には、腎デナベーション及び圧受容器活性化療法が挙げられる。
「抗体」は、何らかの方法で抗原と特異的に反応することを特徴とする分子を指し、抗体及び抗原は、他方の観点から互いに定義される。抗体は、完全な抗体分子、または重鎖、軽鎖、Fab領域及びFc領域などの任意のその断片もしくは領域を指す。
「アンチセンス活性」とは、アンチセンス化合物のその標的核酸へのハイブリダイゼーションに帰する何らかの検出可能または測定可能な活性を意味する。特定の実施形態において、アンチセンス活性は、標的核酸または当該標的核酸によってコードされているタンパク質の量または発現の減少である。
「アンチセンス化合物」とは、水素結合を介して標的核酸にハイブリダイゼーションを起こすことができるオリゴマー化合物を意味する。
「アンチセンス阻害」とは、アンチセンス化合物の非存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルと比較した、標的核酸に相補的なアンチセンス化合物の存在下での標的核酸レベルまたは標的タンパク質レベルの減少を意味する。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的核酸の対応する領域またはセグメントへのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
「二環式糖」とは、2つの非ジェミナル環原子の架橋によって修飾されたフロシル環を意味する。二環式糖は、修飾糖である。
「二環式核酸」または「BNA」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース部分が、フラノース環上の2つの炭素原子を接続している架橋を含み、これにより二環式系を形成している、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを指す。
「血圧」は、循環系中の血液の血管壁に対する圧力を指す。血圧は、主に動物の心臓の鼓動によるものである。各心拍中に、血圧は、最高(収縮期)血圧(SBP)と最低(拡張期)血圧(DBP)との間で変動する。平均動脈圧(MAP)は、心拍周期中の動脈圧の平均である。血圧は、血圧測定器(すなわち、血圧計)によって測定することができる。安静時の正常血圧は、収縮期100~140mmHg及び拡張期60~90mmHgの範囲内であり、一般に、収縮期圧(最高読み取り値)/拡張期圧(最低読み取り値)mmHgとして表される。
「キャップ構造」または「末端キャップ部分」とは、アンチセンス化合物のいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を意味する。
「cEt」または「拘束エチル」とは、4’-炭素と2’-炭素とを接続する架橋を含み、当該架橋が式:4’-CH(CH3)-O-2’を有する、二環式糖部分を意味する。
「拘束エチルヌクレオシド」(cEtヌクレオシドも同様)とは、4’-CH(CH3)-O-2’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
「化学的に異なる領域」は、同じアンチセンス化合物の別の領域とは何らかの形で化学的に異なるアンチセンス化合物の領域を指す。例えば、2’-O-メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、2’-O-メトキシエチル修飾を含まないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。
「キメラアンチセンス化合物」とは、少なくとも2つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。
「共投与」とは、個体への2つ以上の薬剤の投与を意味する。2つ以上の薬剤は、単一の医薬組成物であってもよいし、別個の医薬組成物であってもよい。2つ以上の薬剤のそれぞれは、同じ投与経路または異なる投与経路で投与することができる。共投与は、同時投与、並行投与または順次投与を包含する。
「相補性」とは、第1の核酸と第2の核酸の核酸塩基間の対合能力を意味する。特定の実施形態において、第1の核酸はアンチセンス化合物であり、第2の核酸は標的核酸である。
「連続した核酸塩基」とは、互いに直接隣接する核酸塩基を意味する。
「デオキシリボヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分の2’位に水素を有するヌクレオチドを意味する。デオキシリボヌクレオチドは、種々の置換基のいずれかで修飾されてもよい。
「希釈剤」とは、薬理活性はないが、薬学的に必要であるか、望ましい、組成物中の成分を意味する。例えば、注射組成物中の希釈剤は、液体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または水であり得る。
「製剤単位」とは、薬剤が提供される形態、例えば、丸剤、錠剤または当該技術分野において知られている他の製剤単位を意味する。特定の実施形態において、製剤単位は、凍結乾燥されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。特定の実施形態において、製剤単位は、再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。
「用量」とは、1回の投与または指定された期間内に提供される薬剤の指定量を意味する。特定の実施形態において、ある用量は、1回、2回またはそれ以上のボーラス、錠剤または注射で投与することができる。例えば、皮下投与が望ましい特定の実施形態において、所望の用量は、1回の注射では容易に対応できない体積を必要とし、そのため、2回以上の注射を使用して所望の用量を達成することができる。特定の実施形態において、薬剤は、長期間にわたる注入または持続注入により投与される。用量は、時間、日、週または月あたりの薬剤の量として示すことができる。
「有効な量」または「治療上有効な量」とは、活性薬剤を必要とする個体において所望の生理学的結果をもたらすのに十分な活性薬剤の量を意味する。有効な量は、治療される個体の健康状態及び身体状態、治療される個体の分類群、組成物の処方、個体の医学的状態の評価、ならびに他の関連因子に応じて、個体間で変動し得る。一例として、有効量のAGTアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血圧を低下させ、かつ/または高血圧による器官障害を改善する。
「完全に相補的」または「100%相補的」とは、第1の核酸の核酸塩基配列の各核酸塩基が、第2の核酸の第2の核酸塩基配列中に相補的な核酸塩基を有することを意味する
。特定の実施形態において、第1の核酸はアンチセンス化合物であり、第2の核酸は標的核酸である。
。特定の実施形態において、第1の核酸はアンチセンス化合物であり、第2の核酸は標的核酸である。
「ギャップマー」とは、RNase H切断を支援する複数のヌクレオシドを有する内側領域が、1つ以上のヌクレオシドを有する外側領域との間に配置されており、ここで、内側領域に含まれるヌクレオシドは、外側領域に含まれる1つ以上のヌクレオシドとは化学的に異なる、キメラアンチセンス化合物を意味する。内側領域は、「ギャップセグメント」と呼ぶことができ、外側領域は、「ウイングセグメント」と呼ぶことができる。
「ギャップ拡大」とは、1~6個のヌクレオシドを有する5’及び3’ウイングセグメントの間に配置され、これらのウイングセグメントに直接隣接した12個以上の連続した2’-デオキシヌクレオシドのギャップセグメントを有するキメラアンチセンス化合物を意味する。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な核酸分子のアニーリングを意味する。特定の実施形態において、相補的な核酸分子には、アンチセンス化合物と核酸標的が挙げられる。
「高血圧」または「HTN」は、動物の血圧が上昇している、慢性的な医学的状態を指す。血圧が上昇すると、心臓の働きを増大させて血液を血管に循環させる必要がある。血圧が持続的に140/90mmHg以上である場合、高血圧と言われる。高血圧は、一次性(本態性)または二次性に分類される。一次性高血圧は、明確な原因がなく、遺伝、食生活、運動不足及び肥満に関連すると考えられている。二次性高血圧は、別の医学的状態によって生じたものである。高血圧は、寿命短縮、慢性腎疾患、脳卒中、心筋梗塞、心不全、血管の動脈瘤(例えば、大動脈瘤)、末梢動脈疾患、器官障害(例えば、心拡大または心肥大)ならびに他の心臓血管系疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状の主要危険因子である。抗高血圧薬、食生活の改善及び生活習慣の改善は、高血圧を軽減し、高血圧に関連する疾患、障害及び/または病態を軽減し得る。高血圧は、薬物介入に抵抗がない(すなわち、市販の薬物での治療法によって制御可能である)場合もあれば、薬物介入に抵抗がある場合もある。
「RAAS関連疾患、障害及び/もしくは病態を有する動物、またはそのリスクのある動物を特定する」とは、RAAS関連疾患、障害及び/もしくは病態の診断を受けた動物を特定すること、またはRAAS関連疾患、障害及び/もしくは病態を発症する素因のある動物を特定することを意味する。RAAS関連疾患、障害及び/または病態を発症する素因のある個体には、例えば、高血圧などのRAAS関連疾患の家族歴を有する個体が含まれる。このような特定は、個体の病歴の評価及び標準的な臨床検査または臨床評価を含む任意の方法によって達成することができる。
「直接隣接する」とは、直接隣接する要素と要素との間に介在する要素が存在しないことを意味する。
「個体」または「対象」または「動物」とは、処置または治療のために選択されるヒトまたはヒト以外の動物を意味する。
「発現または活性を阻害する」は、RNAまたはタンパク質の発現または活性の低下または遮断を指し、必ずしも発現または活性の完全な排除を示すものではない。
「ヌクレオシド間結合」は、ヌクレオシド間の化学結合を指す。
「静脈内投与」とは、静脈内への投与を意味する。
「結合されたヌクレオシド」とは、互いに結合された隣接するヌクレオシドを意味する。
「マーカー」または「バイオマーカー」は、任意の測定可能かつ定量可能な生物学的パラメーターであり、健康または生理機能に関する評価の指標となる。例えば、血圧の上昇または器官障害(例えば、線維症)の軽減は、RAAS関連疾患、障害及び/または病態のマーカーとみなすことができる。
「ミスマッチ」または「非相補的核酸塩基」または「MM」は、第1の核酸の核酸塩基が、第2の核酸または標的核酸の対応する核酸塩基と対合することができない場合を指す。
「修飾ヌクレオシド間結合」は、天然に生じるヌクレオシド間結合(すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合)からの置換または任意の変更を指す。
「修飾核酸塩基」とは、アデニン、シトシン、グアニン、チミジンまたはウラシル以外の任意の核酸塩基を指す。例えば、修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンであり得る。「非修飾核酸塩基」とは、プリン塩基のアデニン(A)及びグアニン(G)と、ピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)とを意味する。
「修飾ヌクレオシド」とは、修飾糖部分及び/または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。
「修飾ヌクレオチド」とは、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合及び/または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。
「修飾オリゴヌクレオチド」とは、修飾ヌクレオシド間結合、修飾糖及び/または修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
「修飾糖」は、天然糖からの置換または変更を指す。例えば、修飾糖は、2’-MOEであり得る。
「調節する」とは、細胞、組織、器官または生物のある特徴を変化または調整することを指す。例えば、AGT mRNAを調節するとは、細胞、組織、器官または生物のAGT mRNA及び/またはAGTタンパク質のレベルを増加または減少させることを意味し得る。AGT mRNA及び/またはタンパク質の調節は、細胞、組織、器官または生物におけるRAAS関連疾患、障害及び/または病態の増大または減少をもたらし得る。「調節薬」は、細胞、組織、器官または生物において変化をもたらす。例えば、AGTアンチセンス化合物は、細胞、組織、器官または生物のAGT mRNA及び/またはAGTタンパク質の量を増加または減少させる調節薬であり得る。
「モノマー」は、オリゴマーの1つの単位を指す。モノマーには、天然に生じるものまたは修飾されたものを問わず、ヌクレオシド及びヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
「モチーフ」とは、アンチセンス化合物の化学的に異なる領域のパターンを意味する。
「天然に生じるヌクレオシド間結合」とは、3’-5’ホスホジエステル結合を意味す
る。
る。
「天然糖部分」とは、DNA(2’-H)またはRNA(2’-OH)に認められる糖を意味する。
「非治療抵抗性高血圧」、「非難治性高血圧」または「制御された高血圧」は、最大3種の抗高血圧剤の同時使用による治療に応答し、結果として、例えば、血圧がSBP<140mmHgまたはDBP<90mmHgとなる高血圧と定義される。
「核酸」は、ヌクレオチドモノマーからなる分子を指す。核酸には、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸(siRNA)及びmicroRNA(miRNA)が含まれる。
「核酸塩基」とは、別の核酸の塩基と対合することができる複素環式部分を意味する。
「核酸塩基配列」とは、任意の糖、結合または核酸塩基の修飾に関係なく、連続した核酸塩基の順序を意味する。
「ヌクレオシド」とは、糖に結合した核酸塩基を意味する。
「ヌクレオシド模倣物」には、オリゴマー化合物の1つ以上の位置で、糖または糖及び塩基、また必須ではないが結合を置換するために使用される構造が含まれ、例えば、モルホリノ、シクロヘキセニル、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、ビシクロまたはトリシクロ糖模倣物、例えば、フラノース以外の糖単位を有するヌクレオシド模倣物である。
「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分にリン酸基が共有結合したヌクレオシドを意味する。
「ヌクレオチド模倣物」には、オリゴマー化合物の1つ以上の位置で、ヌクレオシド及び結合を置換するために使用される構造が含まれ、例えば、ペプチド核酸またはモルホリノ(-N(H)-C(=O)-O-または他の非ホスホジエステル結合によって結合されたモルホリノ)などである。
「器官障害」または「終末器官障害」は、循環系によって栄養補給される主要器官に生じる障害を指し、例えば、心臓(例えば、心筋肥大、心機能低下及び/または心不全)、腎臓(例えば、アルブミン尿、タンパク質尿、腎機能低下及び/または腎不全)、眼(例えば、高血圧性網膜症)、脳(例えば、脳卒中)などである。器官は、動物の高血圧によって障害を生じ得る。特定の実施形態において、心臓障害は、線維症、心拡大につながる心臓細胞及び/または心筋の肥大である。
「オリゴマー化合物」または「オリゴマー」は、2つ以上の下位構造(モノマー)を含み、核酸分子のある領域にハイブリダイズすることができる高分子構造を指す。特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオシドである。特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、アンチセンス化合物である。特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、キメラオリゴヌクレオチドである。
「オリゴヌクレオチド」とは、結合されたヌクレオシドの重合体を指し、ヌクレオシド
のそれぞれは、互いに独立して修飾されていても修飾されていなくてもよい。
のそれぞれは、互いに独立して修飾されていても修飾されていなくてもよい。
「非経口投与」とは、注射または注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与または頭蓋内投与、例えば、髄腔内もしくは脳室内投与が含まれる。投与は、連続的、または長期的、または短期的、または断続的であり得る。
「ペプチド」は、少なくとも2つのアミノ酸をアミド結合によって結合することによって形成された分子を指す。ペプチドは、ポリペプチド及びタンパク質を指す。
「医薬組成物」とは、個体への投与に好適な物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、1つ以上の活性薬剤及び無菌水溶液を含み得る。
「薬学的に許容される担体」とは、オリゴヌクレオチドの構造に干渉しない媒体または希釈剤を意味する。このような特定の担体は、対象による経口摂取用の医薬組成物、例えば、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤及びロゼンジ剤の製剤化を可能にする。例えば、薬学的に許容される担体は、滅菌水またはPBSなどの無菌水溶液であり得る。
「薬学的に許容される誘導体」は、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容される塩、コンジュゲート、プロドラッグまたは異性体を包含する。
「薬学的に許容される塩」とは、アンチセンス化合物の生理学的及び薬学的に許容される塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持し、かつ望ましくない毒性作用を付与しない塩を意味する。
「ホスホロチオエート結合」とは、架橋していない酸素原子のうちの1つを硫黄原子で置き換えることによって、ホスホジエステル結合が修飾されている、ヌクレオシド間の結合を意味する。ホスホロチオエート結合は、修飾ヌクレオシド間結合である。
「部分(portion)」とは、核酸のある所定数の連続した(すなわち、結合された)核酸塩基を意味する。特定の実施形態において、部分は、標的核酸のある所定数の連続した核酸塩基である。特定の実施形態において、部分は、アンチセンス化合物のある所定数の連続した核酸塩基である。
「予防する」とは、疾患、障害または病態の発症、発現または進行を、数分から無期限までの期間、遅延させ、または未然に防ぐことを指す。また、予防するとは、疾患、障害または病態を発症するリスクを低減することも意味する。
「プロドラッグ」とは、不活性形態で調製され、内因性酵素または他の化学物質もしくは条件の作用によって、体内またはその細胞内で活性形態に変換される、治療薬を意味する。
「レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系」、「レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系経路」、「RAAS経路」または「RAAS」は、前駆体要素(アンジオテンシノーゲン)が、レニン及び酵素アンジオテンシン変換酵素(ACE)などの様々な酵素によってアンジオテンシンI及びアンジオテンシンIIなどの下流要素に変換される多要素酵素経路を指す。アンジオテンシンIは、経路中、ステロイドのアルドステロンの分泌を刺激する。RAAS経路は、体内の血圧と体液バランスを制御する。
「レニン-アンジオテンシン系」または「RAS」または「RAS経路」は、RAAS経路の一部を指す。この経路の様々な構成要素は、各構成要素の産生を妨げる作動薬または遮断薬の標的になっている。例えば、レニン阻害薬、ACE阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)などは、RAS経路を阻害または遮断するために開発されている。しかしながら、様々なRAS経路要素を標的にする市販の治療薬は、多様な機序に起因して、RAS経路を完全に阻害または遮断するには効果的ではない(Nobakht et al.,Nat Rev Nephrol,2011,7:356-359)。
「RAAS関連疾患、障害及び/または病態」または「RAAS経路関連疾患、障害及び/または病態」は、動物におけるRAASに関連する任意の疾患、障害または病態を指す。RAAS関連疾患、障害及び/または病態の例には、寿命短縮、高血圧(例えば、非治療抵抗性高血圧、治療抵抗性高血圧)、腎疾患(例えば、慢性腎疾患、多発性嚢胞腎疾患)、脳卒中、心疾患(例えば、心筋梗塞、心不全、心臓弁膜症)、血管の動脈瘤(例えば、大動脈瘤)、末梢動脈疾患、器官障害(例えば、心臓障害または心肥大)、組織線維症ならびに他の心臓血管系疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状が挙げられる。特定の実施形態において、RAAS関連疾患、障害及び/または病態は、高血圧を伴わない。
「治療抵抗性高血圧」または「RHTN」は、(1)薬物クラスが異なる3種の抗高血圧剤の同時使用にかかわらず、SBP≧140mmHgもしくはDBP≧90mmHgの血圧、または(2)血圧にかかわらず4種以上の抗高血圧薬の使用として定義される。
「副作用」とは、治療に起因すると考えられる、所望の効果ではない生理学的疾患及び/または病態を意味する。特定の実施形態において、副作用には、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、ミオパチー及び不調が含まれる。例えば、血清中アミノトランスフェラーゼレベルの増加は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの増加は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。
「一本鎖オリゴヌクレオチド」とは、相補鎖にハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを意味する。
「特異的にハイブリダイズ可能」とは、特異的結合が望まれる条件下、例えば、in vivoアッセイ及び治療的処置の場合における生理学的条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に十分な程度の相補性を有し、所望の作用を誘導するが、非標的核酸に対する作用は最小であるか、全くないアンチセンス化合物を指す。例として、アンチセンス化合物は、化合物の標的核酸への結合が標的核酸の通常の機能に干渉して活性の消失を生じさせ、かつ特異的結合が望まれる条件下でアンチセンス化合物の非標的核酸配列に対する非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、標的に特異的にハイブリダイズ可能である。
「皮下投与」とは、皮膚の直ぐ下への投与を意味する。
「標的にする」または「標的化された」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、所望の作用を誘導するアンチセンス化合物の設計及び選定のプロセスを意味する。
「標的核酸」、「標的RNA」及び「標的RNA転写物」は全てアンチセンス化合物によって標的化が可能な核酸を指す。
「標的セグメント」とは、標的核酸のうち、アンチセンス化合物が標的とするヌクレオチドの配列を意味する。「5’標的部位」とは、標的セグメントの最も5’側のヌクレオ
チドを指す。「3’標的部位」とは、標的セグメントの最も3’側のヌクレオチドを指す。
チドを指す。「3’標的部位」とは、標的セグメントの最も3’側のヌクレオチドを指す。
「治療上有効な量」とは、動物に治療上の利益をもたらす薬剤の量を意味する。
「治療する」とは、動物の疾患、障害または病態の変化または改善を達成するために、当該動物に医薬組成物を投与することを指す。特定の実施形態において、1つ以上の医薬組成物を動物に投与することができる。
「非修飾ヌクレオチド」とは、天然に生じる核酸塩基、糖部分及びヌクレオシド間結合で構成されたヌクレオチドを意味する。特定の実施形態において、非修飾ヌクレオチドは、RNAヌクレオチド(すなわち、β-D-リボヌクレオチド)またはDNAヌクレオチド(すなわち、β-D-デオキシリボヌクレオチド)である。
特定の実施形態
特定の実施形態は、AGTを特異的に調節する化合物を提供する。特定の実施形態において、AGT特異的調節薬は、RAAS関連疾患、障害及び/または病態を治療、予防または改善するために使用されるAGT特異的阻害薬である。特定の実施形態において、AGT特異的阻害薬は、AGT mRNA及び/またはAGTタンパク質の発現を阻害することができる核酸化合物である。特定の実施形態において、核酸化合物は、オリゴマー化合物である。特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
特定の実施形態は、AGTを特異的に調節する化合物を提供する。特定の実施形態において、AGT特異的調節薬は、RAAS関連疾患、障害及び/または病態を治療、予防または改善するために使用されるAGT特異的阻害薬である。特定の実施形態において、AGT特異的阻害薬は、AGT mRNA及び/またはAGTタンパク質の発現を阻害することができる核酸化合物である。特定の実施形態において、核酸化合物は、オリゴマー化合物である。特定の実施形態において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
特定の実施形態において、化合物は、AGT核酸を標的にする。特定の実施形態において、AGT核酸は、GENBANKアクセッション番号NM_000029.3(配列番号1として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号NT_167186.1のヌクレオチド24354000~24370100の相補体(配列番号2として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK307978.1(配列番号3として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK303755.1(配列番号4として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK293507.1(配列番号5として本明細書に援用される)、及びGENBANKアクセッション番号CR606672.1(配列番号6として本明細書に援用される)に示されるヒト配列のうちのいずれかである。
本明細書で開示される特定の実施形態は、AGTをコードする核酸配列を標的にする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態において、化合物は、配列番号1~6のうちのいずれかの核酸塩基配列に示されるAGT配列を標的にする。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1~6のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号1~6のいずれかのうちの長さの等しい部分に対して、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくと
も96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号1~6のいずれかのうちの長さの等しい部分に100%相補的な核酸塩基配列を含む。
も96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%相補的である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号1~6のいずれかのうちの長さの等しい部分に100%相補的な核酸塩基配列を含む。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2027~2068のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2027~2068のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2250~2337のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2250~2337のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2266~2337のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2266~2337のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2281~2300のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも8
0%相補的である、化合物を提供する。
0%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2281~2300のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2324~2346のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号1の核酸塩基2324~2346のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号14~2051の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号40、42、46、47、49、53~55、61、62、68、71、76、82、84、85、89、93、96~98、102、109、114、119、127、129、130~135、137~140、142、143、160、162~207、209、210、223、225~227、230~243、252~254、257、258、262~273、276、278、279、281、284、452、463、464、466、467、470、477、480、500、502、512、517、525、526、726、728、868、905、906、954、961、962、963、965、966、971、973、986、987、989、990、991、994、997、998、1000、1001、1011、1015、1021、1024、1035、1080、1085、1150、1258、1259~1262、1293、1294、1299、1325、1326、1354、1355~1357、1370、1384、1391、1393~1395、1406~1408、1431、1467、1468、1470、1472~1474、1476、1488、1489、1500、1503、1504、1522、1524、1526、1528、1535、1536、1539、1542、1543、1545、1585、1592、1594、1595、1599、1604、1610~1612、1615、1618、1619~1624、1626、1628、1629、1631、1632、1635~1637、1640、1658、1662、1665~1671、1673、1676~1679、1681~1683、1686、1687、16
99~1710、1712、1714~1721、1724~1726、1728~1731、1735、1736、1739~1741、1751、1755、1771、1778、1781~1783、1827、1834、1836、1843~1846、1872、1874、1875~1888、1890~1895、1897、1898、1900、1904~1927、1931~1933、1937、1939、1940、1943、1950、1951、1953、1955~1959、1962、1964~1967、1969~1971、1973、1977~1981、1984~1991、1993~1996、2000~2005、2007~2012、2014~2025、2027、2028、2030、2032~2037、2039~2045、2047、2051の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
99~1710、1712、1714~1721、1724~1726、1728~1731、1735、1736、1739~1741、1751、1755、1771、1778、1781~1783、1827、1834、1836、1843~1846、1872、1874、1875~1888、1890~1895、1897、1898、1900、1904~1927、1931~1933、1937、1939、1940、1943、1950、1951、1953、1955~1959、1962、1964~1967、1969~1971、1973、1977~1981、1984~1991、1993~1996、2000~2005、2007~2012、2014~2025、2027、2028、2030、2032~2037、2039~2045、2047、2051の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号46、53、54、68、76、85、96、97、114、127、129~132、134、135、137~139、142、162~207、225、226、230~243、252、264、266~270、284、464、467、962、963、965、966、973、990、991、997、1000、1001、1011、1261、1299、1355、1356、1470、1472、1473、1503、1504、1522、1526、1535、1536、1542、1543、1545、1595、1599、1604、1620、1623、1624、1626、1640、1662、1666、1667、1669、1670、1673、1682、1683、1687、1699~1706、1708、1712、1714~1716、1719~1721、1724~1726、1729、1730、1736、1778、1783、1836、1843、1875~1888、1893~1895、1897、1900、1904~1908、1911、1914~1918、1920、1922、1923、1925、1926、1931~1933、1937、1939、1955、1958、1959、1962、1966、1967、1970、1971、1973、1977、1978~1981、1985、1986、1987、1988、1990、1991、1994、1996、2000、2002~2005、2010、2011、2014~2025、2027、2028、2035~2037、2039、2041~2045の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号96、127、129~132、139、162~169、171~189、191~193、195、196、198~206、234、236、238~240、267~270、966、1000、1522、1542、1623、1624、1667、1682、1683、1700、1703、1704、1708、1714、1719、1720、1724~1726、1729、1875、1876、1878、1884~1886、1893、1894、1906、1908、1914、1917、1918、1922、1923、1925、1926、1932、1933、1967、1970、1978~1981、1985、1986、1988、1990、1991、2003、2010、2015、2016、2018、2020、2021、2024、2025、2027、2028、2035、2037、2039、2044の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8、少なくとも9、
少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号129、130、132、163~168、171、172、175~186、188、189、192、193、195、198~206、238、239、966、1703、1720、1726、1923、1925、2003、2015の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号46、53~54、61、68、76、83、85、93、96~97、109、127、129~130、132、134~15、137~39、142、163~172、180~184、186、189、234、236、238~239、267、313、411、452、463~470、475~478、480、500~503、512、517~518、524~526、654、689、702、725~726、728、738、779、786~787、800、808、810~811、825、865、868、889、894、903、905、909、954、966、1011、1015、1021、1024、1080、1085、1258~1259、1261~1262、1293~1294、1299、1325、1470、1472~1473、1522、1542、1604、1623~1624、1667、1670、1682~1683、1687、1700、1703~1704、1708、1714、1716、1719~1720、1724~1726、1729~1730、1827、1936、1843~1844、1846、1886、1893~1894、1914、1923、1925、1932、1979、1986、1988、1990、2003、2015、2018、2020、2027~2028、2035、2037、2039、2044の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。本明細書で開示される特定の実施形態は、配列番号238、1714、1719、1893~1894、1914、1923、1925、2003の核酸塩基配列のいずれかのうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物を提供する。
特定の実施形態において、化合物は、8~80、20~80、10~50、20~35、10~30、12~30、15~30、16~30、20~30、20~29、20~28、20~27、20~26、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、15~25、16~25、15~24、16~24、17~24、18~24、19~24、19~22、16~21、18~21または16~20個の結合された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、化合物は、16個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、化合物は、20個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド
を含む。
を含む。
特定の実施形態において、化合物は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79もしくは80個の長さ、または前述の値のうちのいずれか2つによって定義される範囲の結合された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。特定の実施形態において、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。特定の実施形態において、各修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾糖を含むヌクレオシドを少なくとも1つ含む。特定の実施形態において、少なくとも1つの修飾糖は、二環式糖を含む。特定の実施形態において、少なくとも1つの修飾糖は、2’-O-メトキシエチル、拘束エチル、3’-フルオロ-HNAまたは4’-(CH2)n-O-2’架橋(式中、nは1または2である)を含む。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドを少なくとも1つ含む。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、5-メチルシトシンである。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、コンジュゲート基を含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、炭水化物部分である。特定の実施形態において、コンジュゲートは、GalNAc部分である。特定の実施形態において、GalNAcは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6GalNAc3である。特定の実施形態において、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートは、次式を有する。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-
トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、12~30個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号1の領域2250~2337のうちの長さの等しい部分に対して標的化されているか、相補的である、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を更に含む。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、12~30個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号1の領域2266~2337のうちの長さの等しい部分に対して標的化されているか、相補的である、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を更に含む。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、12~30個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号1の領域2281~2300のうちの長さの等しい部分に対して標的化されているか、相補的である、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を更に含む。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態に
おいて、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
おいて、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号1の領域2027~2068のうちの長さの等しい部分に対して標的化されているか、相補的である、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、2’-O-メトキシエチル糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号14~2051のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。特定の実施形態において、化合物は、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号40、42、46、47、49、53~55、61、62、68、71、76、82、84、85、89、93、96~98、102、109、114、119、127、129、130~135、137~140、142、143、160、162~207、209、210、223、225~227、230~243、252~254、257、258、262~273、276、278、279、281、284、452、463、464、466、467、470、477、480、500、502、512、517、525、526、726、728、868、905、906、954、961、962、963、965、966、971、973、986、987、989、990、991、994、997、998、1000、1001、1011、1015、1021、1024、1035、1080、1085、1150、1258、1259~1262、1293、1294、1299、1325、1326、1354、1355~1357、1370、1384、1391、1393~1395、1406~1408、1431、1467、1468、1470、1472~1474、1
476、1488、1489、1500、1503、1504、1522、1524、1526、1528、1535、1536、1539、1542、1543、1545、1585、1592、1594、1595、1599、1604、1610~1612、1615、1618、1619~1624、1626、1628、1629、1631、1632、1635~1637、1640、1658、1662、1665~1671、1673、1676~1679、1681~1683、1686、1687、1699~1710、1712、1714~1721、1724~1726、1728~1731、1735、1736、1739~1741、1751、1755、1771、1778、1781~1783、1827、1834、1836、1843~1846、1872、1874、1875~1888、1890~1895、1897、1898、1900、1904~1927、1931~1933、1937、1939、1940、1943、1950、1951、1953、1955~1959、1962、1964~1967、1969~1971、1973、1977~1981、1984~1991、1993~1996、2000~2005、2007~2012、2014~2025、2027、2028、2030、2032~2037、2039~2045、2047、2051のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
476、1488、1489、1500、1503、1504、1522、1524、1526、1528、1535、1536、1539、1542、1543、1545、1585、1592、1594、1595、1599、1604、1610~1612、1615、1618、1619~1624、1626、1628、1629、1631、1632、1635~1637、1640、1658、1662、1665~1671、1673、1676~1679、1681~1683、1686、1687、1699~1710、1712、1714~1721、1724~1726、1728~1731、1735、1736、1739~1741、1751、1755、1771、1778、1781~1783、1827、1834、1836、1843~1846、1872、1874、1875~1888、1890~1895、1897、1898、1900、1904~1927、1931~1933、1937、1939、1940、1943、1950、1951、1953、1955~1959、1962、1964~1967、1969~1971、1973、1977~1981、1984~1991、1993~1996、2000~2005、2007~2012、2014~2025、2027、2028、2030、2032~2037、2039~2045、2047、2051のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号46、53、54、68、76、85、96、97、114、127、129~132、134、135、137~139、142、162~207、225、226、230~243、252、264、266~270、284、464、467、962、963、965、966、973、990、991、997、1000、1001、1011、1261、1299、1355、1356、1470、1472、1473、1503、1504、1522、1526、1535、1536、1542、1543、1545、1595、1599、1604、1620、1623、1624、1626、1640、1662、1666、1667、1669、1670、1673、1682、1683、1687、1699~1706、1708、1712、1714~1716、1719~1721、1724~1726、1729、1730、1736、1778、1783、1836、1843、1875~1888、1893~1895、1897、1900、1904~1908、1911、1914~1918、1920、1922、1923、1925、1926、1931~1933、1937、1939、1955、1958、1959、1962、1966、1967、1970、1971、1973、1977、1978~1981、1985、1986、1987、1988、1990、1991、1994、1996、2000、2002~2005、2010、2011、2014~2025、2027、2028、2035~2037、2039、2041~2045のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合された
デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
デオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号96、127、129~132、139、162~169、171~189、191~193、195、196、198~206、234、236、238~240、267~270、966、1000、1522、1542、1623、1624、1667、1682、1683、1700、1703、1704、1708、1714、1719、1720、1724~1726、1729、1875、1876、1878、1884~1886、1893、1894、1906、1908、1914、1917、1918、1922、1923、1925、1926、1932、1933、1967、1970、1978~1981、1985、1986、1988、1990、1991、2003、2010、2015、2016、2018、2020、2021、2024、2025、2027、2028、2035、2037、2039、2044のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号129、130、132、163~168、171、172、175~186、188、189、192、193、195、198~206、238、239、966、1703、1720、1726、1923、1925、2003、2015のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは
、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号46、53~54、61、68、76、83、85、93、96~97、109、127、129~130、132、134~15、137~39、142、163~172、180~184、186、189、234、236、238~239、267、313、411、452、463~470、475~478、480、500~503、512、517~518、524~526、654、689、702、725~726、728、738、779、786~787、800、808、810~811、825、865、868、889、894、903、905、909、954、966、1011、1015、1021、1024、1080、1085、1258~1259、1261~1262、1293~1294、1299、1325、1470、1472~1473、1522、1542、1604、1623~1624、1667、1670、1682~1683、1687、1700、1703~1704、1708、1714、1716、1719~1720、1724~1726、1729~1730、1827、1936、1843~1844、1846、1886、1893~1894、1914、1923、1925、1932、1979、1986、1988、1990、2003、2015、2018、2020、2027~2028、2035、2037、2039、2044のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号238、1714、1719、1893~1894、1914、1923、1925、2003のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、
ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6
GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6
GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、化合物は、20個の結合されたヌクレオシドからなり、かつ配列番号1914のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、修飾オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、(a)10個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、(b)5個の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、(c)5個の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、ここで、ギャップセグメントは、5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントとの間に直接隣接して配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、2’-O-メトキシエチル糖を含み、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
本明細書で開示される特定の実施形態は、次式:mCes Aes mCes Aes
Aes Ads mCds Ads Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds mCes Ges Ges Tes Te(配列番号1914)(式中、Aはアデニンであり、mCは5-メチルシトシンであり、Gはグアニンであり、Tはチミンであり、eは2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、dは2’-デオキシヌクレオシドであり、sはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)に従う修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
Aes Ads mCds Ads Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds mCes Ges Ges Tes Te(配列番号1914)(式中、Aはアデニンであり、mCは5-メチルシトシンであり、Gはグアニンであり、Tはチミンであり、eは2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、dは2’-デオキシヌクレオシドであり、sはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)に従う修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
本明細書で開示される特定の実施形態は、次式を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。
特定の実施形態において、本明細書で開示される化合物または組成物は、修飾オリゴヌクレオチドの塩を含む。
特定の実施形態において、本明細書で開示される化合物または組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤を更に含む。
特定の実施形態において、動物は、ヒトである。
特定の実施形態は、本明細書に記載される修飾オリゴヌクレオチドを含む組成物または化合物を提供し、その粘度は、40cP未満である。特定の実施形態において、組成物は、15cP未満の粘度を有する。特定の実施形態において、組成物は、12cP未満の粘度を有する。特定の実施形態において、組成物は、10cP未満の粘度を有する。
本明細書で開示される実施形態は、細胞、組織、器官または動物においてAGTを減少させるのに使用するための、AGTを標的にする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物及び組成物を提供する。特定の実施形態において、AGTの減少は、RAAS経路関連疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状の治療、予防、進行の遅延、発症の遅延及び/または軽減をもたらす。特定の実施形態において、AGTの減少により、高血圧が軽減す
る。特定の実施形態において、AGTの減少により、線維症が軽減または防止される。特定の実施形態において、AGTの減少により、RAAS経路関連疾患、障害及び/または病態の症状またはマーカーが調節される。特定の実施形態において、マーカーは、寿命短縮、高血圧、慢性腎疾患、脳卒中、心筋梗塞、心不全、心臓弁膜症、血管の動脈瘤、末梢動脈疾患、器官障害ならびに他の心臓血管系疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状のうちの1つ以上から選択され得る。
る。特定の実施形態において、AGTの減少により、線維症が軽減または防止される。特定の実施形態において、AGTの減少により、RAAS経路関連疾患、障害及び/または病態の症状またはマーカーが調節される。特定の実施形態において、マーカーは、寿命短縮、高血圧、慢性腎疾患、脳卒中、心筋梗塞、心不全、心臓弁膜症、血管の動脈瘤、末梢動脈疾患、器官障害ならびに他の心臓血管系疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状のうちの1つ以上から選択され得る。
特定の実施形態において、治療法に使用するための、AGTを標的にする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物及び組成物を提供する。特定の実施形態において、AGTを標的にする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物及び組成物は、治療上有効な量で動物に投与される。
特定の実施形態において、薬剤の調製に使用するための、AGTを標的にする修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物及び組成物を提供する。特定の実施形態において、薬剤は、RAAS経路関連疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状の治療、予防、進行の遅延、発症の遅延及び/または軽減のために使用される。
特定の実施形態において、RAAS経路関連疾患及び/または病態、疾患、障害または状態を治療、予防または改善するためのキットが提供され、当該キットは、(i)本明細書に記載されるAGT特異的阻害薬;及び任意に(ii)本明細書に記載される追加の剤または治療法を含む。本発明のキットは、当該キットを使用して、本明細書に記載されるRAAS経路関連疾患、障害または病態を治療、予防または改善するための説明書を更に含み得る。
特定の実施形態において、RAAS経路関連疾患、障害または病態は、寿命短縮、高血圧、腎疾患(例えば、慢性腎疾患)、脳卒中、心疾患(例えば、心筋梗塞、心不全、心臓弁膜症)、血管の動脈瘤、末梢動脈疾患、器官障害ならびに他のRAAS関連疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状である。特定の実施形態において、高血圧は、非治療抵抗性高血圧または治療抵抗性高血圧である。特定の実施形態において、血管の動脈瘤は、大動脈瘤である。特定の実施形態において、器官障害は、心筋肥大または器官もしくは組織の線維症である。特定の実施形態において、器官は、心臓、肝臓または腎臓であり、組織は、心臓、肝臓または腎臓に由来する。
化合物は、本明細書に記載される1つ以上の追加の剤または治療法とともに、併用療法で使用することができる。剤または治療法は、同時または順次、動物に施すことができる。特定の実施形態において、AGTを標的にする修飾オリゴヌクレオチドを含む組成物または化合物は、1つ以上の第2の剤(複数可)と共投与される。特定の実施形態において、第2の剤には、高血圧を軽減させるための処置、食生活の改善、生活習慣の改善、抗線維化薬及び抗高血圧薬、例えば、RASまたはRAAS阻害薬、利尿薬、カルシウムチャネル拮抗薬、交感神経受容体遮断薬、交感神経作動薬及び血管拡張薬が含まれる。特定の実施形態において、第2の剤は、第2のアンチセンス化合物である。更なる実施形態において、第2のアンチセンス化合物は、AGTを標的にする。他の実施形態において、第2のアンチセンス化合物は、AGT以外の化合物を標的にする。
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びsiRNAが含まれるが、これらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であり得、これは、オリゴマー化合物が水素結合を介して標的核酸にハイブリダイゼーションを起こすことができることを意味する。
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びsiRNAが含まれるが、これらに限定されない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であり得、これは、オリゴマー化合物が水素結合を介して標的核酸にハイブリダイゼーションを起こすことができることを意味する。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、5’から3’の方向で記載される場合、アンチセンス化合物が標的にする標的核酸の標的セグメントの逆相補鎖を含む核酸塩基配列を有する。このような特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5’から3’の方向で記載される場合、アンチセンス化合物が標的にする標的核酸の標的セグメントの逆相補鎖を含む核酸塩基配列を有する。
特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物は、10~30個の長さのヌクレオチドである。言い換えれば、アンチセンス化合物は、10~30個の結合された核酸塩基である。他の実施形態において、アンチセンス化合物は、8~80、10~80、12~50、15~30、18~24、19~22または20個の結合された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。このような特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79もしくは80個の長さ、または前述の値のうちのいずれか2つによって定義される範囲の結合された核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、短縮型または切断型修飾オリゴヌクレオチドを含む。短縮型または切断型修飾オリゴヌクレオチドは、5’末端(5’切断)、中央部分または3’末端(3’切断)から欠失した1つのヌクレオシドを有し得る。短縮型または切断型オリゴヌクレオチドは、5’末端から欠失した2つ以上のヌクレオシドを有し得、中央部分から欠失した2つ以上のヌクレオシドを有し得、あるいは3’末端から欠失した2つ以上のヌクレオシドを有し得る。あるいは、例えば、5’末端から1つ以上のヌクレオシドを欠失させ、中央部分から1つ以上のヌクレオシドを欠失させ、かつ/または3’末端から1つ以上のヌクレオシドを欠失させたアンチセンス化合物のように、欠失されたヌクレオシドが修飾オリゴヌクレオチド全体に分散していてもよい。
延長型オリゴヌクレオチド中に1つの追加のヌクレオシドが存在する場合、その追加のヌクレオシドは、当該オリゴヌクレオチドの5’末端、3’末端または中央部分に位置し得る。2つ以上の追加のヌクレオシドが存在する場合、その追加ヌクレオシドは、例えば、当該オリゴヌクレオチドの5’末端(5’付加)、3’末端(3’付加)または中央部分に2つのヌクレオシドが追加されたオリゴヌクレオチドのように、互いに隣接していてよい。あるいは、例えば、5’末端に1つ以上のヌクレオシドを追加し、3’末端に1つ以上のヌクレオシドを追加し、かつ/または中央部分に1つ以上のヌクレオシドを追加したオリゴヌクレオチドのように、追加ヌクレオシドがアンチセンス化合物全体に分散していてもよい。
活性を取り除くことなく、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物の長さを増加もしくは減少させること、及び/またはミスマッチ塩基を導入することが可能である。例えば、Woolfら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7305-7309,1992)では、卵母細胞注入モデルにおける標的RNAの切断を誘導する能力について、13~25核酸塩基長の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドが試験された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端近傍に8または11個のミスマッチ塩基を含む25核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも程度が小さいものの、標的mRNAの特異
的切断を導くことができた。同様に、1または3個のミスマッチを含むものを含む、13核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した場合も、標的特異的切断が達成された。
的切断を導くことができた。同様に、1または3個のミスマッチを含むものを含む、13核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した場合も、標的特異的切断が達成された。
Gautschiら(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,March 2001)は、bcl-2mRNAに対して100%の相補性を有し、かつbcl-xLmRNAに対して3つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドがin vitro及びin vivoで、bcl-2とbcl-xLの両方の発現を減少させることができることを明らかにした。更に、このオリゴヌクレオチドは、in vivoで、強力な抗腫瘍活性を示した。
Maher及びDolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)は、ウサギ網状赤血球アッセイでヒトDHFRの翻訳を阻止する能力について、一連の14核酸塩基タンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドと、それぞれ2つまたは3つの当該タンデムアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列からなる28及び42核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドとを試験した。28または42核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも控えめな程度であったが、3つの14核酸塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれは、単独でも翻訳を阻害することができた。
特定のアンチセンス化合物モチーフ及び機序
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、阻害活性の向上、標的核酸に対する結合親和性の増大、またはin vivoヌクレアーゼによる分解に対する耐性などの特性をアンチセンス化合物に付与するために、パターンまたはモチーフで配置された化学修飾サブユニットを有する。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、阻害活性の向上、標的核酸に対する結合親和性の増大、またはin vivoヌクレアーゼによる分解に対する耐性などの特性をアンチセンス化合物に付与するために、パターンまたはモチーフで配置された化学修飾サブユニットを有する。
キメラアンチセンス化合物は、典型的に、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取込みの増加、標的核酸に対する結合親和性の増大及び/または阻害活性の増大を付与するように修飾された領域を少なくとも1つ含有する。キメラアンチセンス化合物の第2の領域は、例えば、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼRNase Hの基質として機能するなど、別の所望の特性を付与することができる。
アンチセンス活性は、アンチセンス化合物(例えば、オリゴヌクレオチド)の標的核酸とのハイブリダイゼーションを含み、このハイブリダイゼーションが最終的に生物学的作用をもたらす、任意の機序から生じ得る。特定の実施形態において、標的核酸の量及び/または活性が調節される。特定の実施形態において、標的核酸の量及び/または活性が減少する。特定の実施形態において、アンチセンス化合物の標的核酸へのハイブリダイゼーションは、最終的に、標的核酸の分解をもたらす。特定の実施形態において、アンチセンス化合物の標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的核酸の分解を生じない。このような特定の実施形態において、標的核酸にハイブリダイズしたアンチセンス化合物の存在(占有)は、アンチセンス活性の調節をもたらす。特定の実施形態において、特定の化学モチーフまたは化学修飾のパターンを有するアンチセンス化合物は、1つ以上の機序を活用するのに特に適している。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、2つ以上の機序を介して機能し、かつ/または解明されていない機序を介して機能する。したがって、本明細書に記載されるアンチセンス化合物は、特定の機序に限定されない。
アンチセンス機序には、限定するものではないが、RNase H媒介性アンチセンス;RISC経路を活用し、限定するものではないが、siRNA、ssRNA及びmicroRNA機序を含む、RNAi機序;ならびに占有に基づく機序が含まれる。特定のアンチセンス化合物は、このような機序の2つ以上を介して、及び/または更なる機序を介して作用し得る。
RNase H媒介性アンチセンス
特定の実施形態において、アンチセンス活性は、少なくとも部分的には、RNase Hによる標的RNAの分解から生じる。RNase Hは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。「DNA様」である一本鎖アンチセンス化合物が哺乳動物細胞においてRNase H活性を誘発することは、当該技術分野において知られている。したがって、DNAまたはDNA様ヌクレオシドの少なくとも一部を含むアンチセンス化合物は、RNase Hを活性化し、標的核酸の切断をもたらすことができる。特定の実施形態において、RNase Hを活用するアンチセンス化合物は、1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、かかるアンチセンス化合物は、1~8個の修飾ヌクレオシドのブロックを少なくとも1つ有する。このような特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、RNase H活性を支援しない。特定の実施形態において、かかるアンチセンス化合物は、本明細書に記載されるようなギャップマーである。このような特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、DNAヌクレオシドを含む。このような特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、DNA様ヌクレオシドを含む。このような特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、DNAヌクレオシド及びDNA様ヌクレオシドを含む。
特定の実施形態において、アンチセンス活性は、少なくとも部分的には、RNase Hによる標的RNAの分解から生じる。RNase Hは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。「DNA様」である一本鎖アンチセンス化合物が哺乳動物細胞においてRNase H活性を誘発することは、当該技術分野において知られている。したがって、DNAまたはDNA様ヌクレオシドの少なくとも一部を含むアンチセンス化合物は、RNase Hを活性化し、標的核酸の切断をもたらすことができる。特定の実施形態において、RNase Hを活用するアンチセンス化合物は、1つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、かかるアンチセンス化合物は、1~8個の修飾ヌクレオシドのブロックを少なくとも1つ有する。このような特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、RNase H活性を支援しない。特定の実施形態において、かかるアンチセンス化合物は、本明細書に記載されるようなギャップマーである。このような特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、DNAヌクレオシドを含む。このような特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、DNA様ヌクレオシドを含む。このような特定の実施形態において、ギャップマーのギャップは、DNAヌクレオシド及びDNA様ヌクレオシドを含む。
ギャップマーモチーフを有する特定のアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物とみなされる。ギャップマーにおいて、RNaseH切断を支援する複数のヌクレオチドを有する内側領域は、その内側領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外側領域の間に配置されている。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは、通常、エンドヌクレアーゼ切断の基質として機能し、一方、ウイングセグメントは、修飾ヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、ギャップマーの領域は、それぞれ異なる領域を含む糖部分の種類によって区別される。ギャップマーの領域を区別するために使用される糖部分の種類には、いくつかの実施形態において、β-D-リボヌクレオシド、β-D-デオキシリボヌクレオシド、2’-修飾ヌクレオシド(このような2’-修飾ヌクレオシドには、とりわけ、2’-MOE及び2’-O-CH3が含まれ得る)、及び二環式糖修飾ヌクレオシド(このような二環式糖修飾ヌクレオシドには、拘束エチルを有するものなどが含まれ得る)が含まれ得る。特定の実施形態において、ウイングのヌクレオシドは、例えば、2’-MOE、及び拘束エチル(cEt)またはLNAなどの二環式糖部分を含む、いくつかの修飾糖部分を含み得る。特定の実施形態において、ウイングは、いくつかの修飾及び非修飾糖部分を含み得る。特定の実施形態において、ウイングは、2’-MOEヌクレオシド、拘束エチルヌクレオシドまたはLNAヌクレオシドなどの二環式糖部分、及び2’-デオキシヌクレオシドの種々の組み合わせを含み得る。
それぞれ異なる領域は、一様な糖部分、変形形態または交互糖部分を含み得る。ウイング-ギャップ-ウイングモチーフは、「X-Y-Z」と記載されることが多く、ここで、「X」は、5’-ウイングの長さを表し、「Y」は、ギャップの長さを表し、「Z」は、3’-ウイングの長さを表す。「X」及び「Z」は、一様な糖部分、変形形態または交互糖部分を含み得る。特定の実施形態において、「X」及び「Y」は、1つ以上の2’-デオキシヌクレオシドを含み得る。「Y」は、2’-デオキシヌクレオシドを含み得る。本明細書で使用されるとき、「X-Y-Z」と記載されるギャップマーは、ギャップが5’-ウイング及び3’ウイングのそれぞれに直接隣接して配置されるような構成を有する。したがって、5’-ウイングとギャップの間、またはギャップと3’-ウイングに間に介在するヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載されるアンチセンス化合物はいずれもギャップマーモチーフを有し得る。特定の実施形態において、「X」と「Z」は同じであり、他の実施形態において、「X」と「Z」は異なる。特定の実施形態において、「Y」は、8~15個のヌクレオシドである。X、YまたはZは、1、2、3、4、5、6、7
、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30個またはそれ以上のヌクレオシドのいずれかであり得る。
、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30個またはそれ以上のヌクレオシドのいずれかであり得る。
特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物は、ギャップが6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16個の結合されたヌクレオシドからなるギャップマーモチーフを有する。
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の式Aに示す糖モチーフを有する。
(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
式中、
各Aは、独立して、2’-置換ヌクレオシドであり、
各Bは、独立して、二環式ヌクレオシドであり、
各Jは、独立して、2’-置換ヌクレオシドまたは2’-デオキシヌクレオシドのいずれかであり、
各Dは、2’-デオキシヌクレオシドであり、
mは0~4であり、nは0~2であり、pは0~2であり、rは0~2であり、tは0~2であり、vは0~2であり、wは0~4であり、xは0~2であり、yは0~2であり、zは0~4であり、gは6~14であり、
ただし、
m、n及びrのうちの少なくとも1つは、0以外であり、
w及びyのうちの少なくとも1つは、0以外であり、
m、n、p、r及びtの合計は、2~5であり、
v、w、x、y及びzの合計は、2~5である。
(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
式中、
各Aは、独立して、2’-置換ヌクレオシドであり、
各Bは、独立して、二環式ヌクレオシドであり、
各Jは、独立して、2’-置換ヌクレオシドまたは2’-デオキシヌクレオシドのいずれかであり、
各Dは、2’-デオキシヌクレオシドであり、
mは0~4であり、nは0~2であり、pは0~2であり、rは0~2であり、tは0~2であり、vは0~2であり、wは0~4であり、xは0~2であり、yは0~2であり、zは0~4であり、gは6~14であり、
ただし、
m、n及びrのうちの少なくとも1つは、0以外であり、
w及びyのうちの少なくとも1つは、0以外であり、
m、n、p、r及びtの合計は、2~5であり、
v、w、x、y及びzの合計は、2~5である。
RNAi化合物
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、干渉RNA化合物(RNAi)であり、これには、二本鎖RNA化合物(短い干渉RNAまたはsiRNAとも呼ばれる)及び一本鎖RNAi化合物(すなわち、ssRNA)が含まれる。このような化合物は、少なくとも部分的にRISC経路を介して作用し、標的核酸を分解及び/または隔離する(したがって、microRNA/microRNA模倣体化合物を含む)。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、当該アンチセンス化合物をこのような機序に特に適するようにする修飾を含む。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、干渉RNA化合物(RNAi)であり、これには、二本鎖RNA化合物(短い干渉RNAまたはsiRNAとも呼ばれる)及び一本鎖RNAi化合物(すなわち、ssRNA)が含まれる。このような化合物は、少なくとも部分的にRISC経路を介して作用し、標的核酸を分解及び/または隔離する(したがって、microRNA/microRNA模倣体化合物を含む)。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、当該アンチセンス化合物をこのような機序に特に適するようにする修飾を含む。
i.ssRNA化合物
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、一本鎖RNAi化合物(ssRNA)としての使用に特に適したものを含め、修飾された5’末端を含む。このような特定の実施形態において、5’末端は、修飾リン酸部分を含む。特定の実施形態において、このような修飾リン酸は、安定化する(例えば、非修飾5’-リン酸と比較して分解/切断に耐性がある)。特定の実施形態において、このような5’末端ヌクレオシドは、5’-リン部分を安定化させる。特定の修飾5’末端ヌクレオシドは、当該技術分野において、例えば、WO2011/139702に認めることができる。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、一本鎖RNAi化合物(ssRNA)としての使用に特に適したものを含め、修飾された5’末端を含む。このような特定の実施形態において、5’末端は、修飾リン酸部分を含む。特定の実施形態において、このような修飾リン酸は、安定化する(例えば、非修飾5’-リン酸と比較して分解/切断に耐性がある)。特定の実施形態において、このような5’末端ヌクレオシドは、5’-リン部分を安定化させる。特定の修飾5’末端ヌクレオシドは、当該技術分野において、例えば、WO2011/139702に認めることができる。
特定の実施形態において、ssRNA化合物の5’-ヌクレオシドは、式IIcを有する。
式中、
T1は、任意に保護されたリン部分であり、
T2は、式IIcの化合物をオリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、Aは、次式のうちの1つを有し、
T1は、任意に保護されたリン部分であり、
T2は、式IIcの化合物をオリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、Aは、次式のうちの1つを有し、
Q1及びQ2は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C2~C6アルキニルまたはN(R3)(R4)であり、
Q3は、O、S、N(R5)またはC(R6)(R7)であり、
各R3、R4、R5、R6及びR7は、独立して、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキルまたはC1~C6アルコキシであり、
M3は、O、S、NR14、C(R15)(R16)、C(R15)(R16)C(R17)(R18)、C(R15)=C(R17)、OC(R15)(R16)またはOC(R15)(Bx2)であり、
R14は、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
R15、R16、R17及びR18は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
Bx1は、複素環式塩基部分であり、
あるいは、Bx2が存在する場合、Bx2は、複素環式塩基部分であり、Bx1は、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
J4、J5、J6及びJ7は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
あるいは、J4は、J5またはJ7のうちの1つと架橋を形成し、ここで、当該架橋は、O、S、NR19、C(R20)(R21)、C(R20)=C(R21)、C[=C(R20)(R21)]及びC(=O)から選択される1~3個の結合された二価基を含み、J5、J6及びJ7のうちの他の2つは、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキ
シ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
各R19、R20及びR21は、独立して、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
Gは、H、OH、ハロゲンまたはO-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]j-Zであり、
各R8及びR9は、独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキルまたは置換C1~C6アルキルであり、
X1は、O、SまたはN(E1)であり、
Zは、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C2~C6アルキニルまたはN(E2)(E3)であり、
E1、E2及びE3は、それぞれ独立して、H、C1~C6アルキルまたは置換C1~C6アルキルであり、
nは、1~約6であり、
mは、0または1であり、
jは、0または1であり、
各置換基は、ハロゲン、OJ1、N(J1)(J2)、=NJ1、SJ1、N3、CN、OC(=X2)J1、OC(=X2)N(J1)(J2)及びC(=X2)N(J1)(J2)から独立して選択される任意に保護された置換基を1つ以上含み、
X2は、O、SまたはNJ3であり、
各J1、J2及びJ3は、独立して、HまたはC1~C6アルキルであり、
jが1であるとき、ZはハロゲンまたはN(E2)(E3)以外であり、
当該オリゴマー化合物は、8~40個のモノマーサブユニットを含み、標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズ可能である。
Q3は、O、S、N(R5)またはC(R6)(R7)であり、
各R3、R4、R5、R6及びR7は、独立して、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキルまたはC1~C6アルコキシであり、
M3は、O、S、NR14、C(R15)(R16)、C(R15)(R16)C(R17)(R18)、C(R15)=C(R17)、OC(R15)(R16)またはOC(R15)(Bx2)であり、
R14は、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
R15、R16、R17及びR18は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
Bx1は、複素環式塩基部分であり、
あるいは、Bx2が存在する場合、Bx2は、複素環式塩基部分であり、Bx1は、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
J4、J5、J6及びJ7は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
あるいは、J4は、J5またはJ7のうちの1つと架橋を形成し、ここで、当該架橋は、O、S、NR19、C(R20)(R21)、C(R20)=C(R21)、C[=C(R20)(R21)]及びC(=O)から選択される1~3個の結合された二価基を含み、J5、J6及びJ7のうちの他の2つは、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキ
シ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
各R19、R20及びR21は、独立して、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
Gは、H、OH、ハロゲンまたはO-[C(R8)(R9)]n-[(C=O)m-X1]j-Zであり、
各R8及びR9は、独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキルまたは置換C1~C6アルキルであり、
X1は、O、SまたはN(E1)であり、
Zは、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C2~C6アルキニルまたはN(E2)(E3)であり、
E1、E2及びE3は、それぞれ独立して、H、C1~C6アルキルまたは置換C1~C6アルキルであり、
nは、1~約6であり、
mは、0または1であり、
jは、0または1であり、
各置換基は、ハロゲン、OJ1、N(J1)(J2)、=NJ1、SJ1、N3、CN、OC(=X2)J1、OC(=X2)N(J1)(J2)及びC(=X2)N(J1)(J2)から独立して選択される任意に保護された置換基を1つ以上含み、
X2は、O、SまたはNJ3であり、
各J1、J2及びJ3は、独立して、HまたはC1~C6アルキルであり、
jが1であるとき、ZはハロゲンまたはN(E2)(E3)以外であり、
当該オリゴマー化合物は、8~40個のモノマーサブユニットを含み、標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズ可能である。
特定の実施形態において、M3は、O、CH=CH、OCH2またはOC(H)(Bx2)である。特定の実施形態において、M3は、Oである。
特定の実施形態において、J4、J5、J6及びJ7は、それぞれHである。特定の実施形態において、J4は、J5またはJ7のうちの1つと架橋を形成する。
特定の実施形態において、Aは、次式のうちの1つを有する。
式中、
Q1及びQ2は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシまたは置換C1~C6アルコキシである。特定の実施形態において、Q1及びQ2は、それぞれHである。特定の実施形態において、Q1及びQ2は、それぞれ独立して、Hまたはハロゲンである。特定の実施形態において、Q1及びQ2はHであり、Q1及びQ2の一方はF、CH3またはOCH3である。
Q1及びQ2は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシまたは置換C1~C6アルコキシである。特定の実施形態において、Q1及びQ2は、それぞれHである。特定の実施形態において、Q1及びQ2は、それぞれ独立して、Hまたはハロゲンである。特定の実施形態において、Q1及びQ2はHであり、Q1及びQ2の一方はF、CH3またはOCH3である。
特定の実施形態において、T1は、次式を有する。
式中、
Ra及びRcは、それぞれ独立して、保護ヒドロキシル、保護チオール、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、保護アミノまたは置換アミノであり、
Rbは、OまたはSである。特定の実施形態において、RbはOであり、Ra及びRcは、それぞれ独立して、OCH3、OCH2CH3またはCH(CH3)2である。
Ra及びRcは、それぞれ独立して、保護ヒドロキシル、保護チオール、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C1~C6アルコキシ、置換C1~C6アルコキシ、保護アミノまたは置換アミノであり、
Rbは、OまたはSである。特定の実施形態において、RbはOであり、Ra及びRcは、それぞれ独立して、OCH3、OCH2CH3またはCH(CH3)2である。
特定の実施形態において、Gは、ハロゲン、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OCH2CH3、O(CH2)2F、OCH2CHF2、OCH2CF3、OCH2-CH=CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-SCH3、O(CH2)2-OCF3、O(CH2)3-N(R10)(R11)、O(CH2)2-ON(R10)(R11)、O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11)、OCH2C(=O)-N(R10)(R11)、OCH2C(=O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(R11)またはO(CH2)2-N(R12)-C(=NR13)[N(R10)(R11)](式中、R10、R11、R12及びR13は、それぞれ独立して、HまたはC1~C6アルキルである)である。特定の実施形態において、Gは、ハロゲン、OCH3、OCF3、OCH2CH3、OCH2CF3、OCH2-CH=CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2、OCH2C(=O)-N(H)CH3、OCH2C(=O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2またはOCH2-N(H)-C(=NH)NH2である。特定の実施形態において、Gは、F、OCH3またはO(CH2)2-OCH3である。特定の実施形態において、Gは、O(CH2)2-OCH3である。
特定の実施形態において、5’末端ヌクレオシドは、式IIeを有する。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ssRNAに特に適したものを含め、オリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って所定のパターンまたは所定の糖修飾モチーフで配置された、1種以上の修飾糖部分及び/または天然に生じる糖部分を含む。かかるモチーフは、本明細書で考察される糖修飾及び/または他の周知の糖修飾のいずれかを含み得る。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、一様な糖修飾を有する領域を含むか、当該領域からなる。このような特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは
、同じRNA様糖修飾を含む。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、2’-Fヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、2’-OMeヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、2’-MOEヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、cEtヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。特定の実施形態において、一様な領域は、オリゴヌクレオチドの全てを構成するか、オリゴヌクレオチドの全てを本質的に構成する。特定の実施形態において、当該領域は、1~4末端ヌクレオシドを除く、オリゴヌクレオチド全体を構成する。
、同じRNA様糖修飾を含む。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、2’-Fヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、2’-OMeヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、2’-MOEヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、cEtヌクレオシドである。特定の実施形態において、当該領域の各ヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。特定の実施形態において、一様な領域は、オリゴヌクレオチドの全てを構成するか、オリゴヌクレオチドの全てを本質的に構成する。特定の実施形態において、当該領域は、1~4末端ヌクレオシドを除く、オリゴヌクレオチド全体を構成する。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、第1の種類の糖修飾を有するヌクレオチドと第2の種類の糖修飾を有するヌクレオチドでヌクレオシドが交互に繰り返される、1つ以上の交互糖修飾領域を含む。特定の実施形態において、ヌクレオシドは、両種類ともRNA様ヌクレオシドである。特定の実施形態において、交互ヌクレオシドは、2’-OMe、2’-F、2’-MOE、LNA及びcEtから選択される。特定の実施形態において、交互修飾は、2’-Fと2’-OMeである。かかる領域は、連続的であってもよいし、異なる修飾ヌクレオシドまたはコンジュゲートヌクレオシドによって中断されてもよい。
特定の実施形態において、交互修飾の交互領域は、それぞれ1つのヌクレオシドからなる(すなわち、パターンは、(AB)xAyであり、式中、Aは、第1の種類の糖修飾を有するヌクレオシドであり、Bは、第2の種類の糖修飾を有するヌクレオシドであり、xは1~20であり、yは0または1である)。特定の実施形態において、交互モチーフ中の1つ以上の交互領域は、ある種類のヌクレオシドを2つ以上含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、以下のヌクレオシドモチーフのうちのいずれかの領域を1つ以上含み得る。AABBAA;
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA;または
ABABBAABBABABAA;
ここで、Aは第1の種類のヌクレオシドであり、Bは第2の種類のヌクレオシドである。
ABBABB;
AABAAB;
ABBABAABB;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA;または
ABABBAABBABABAA;
ここで、Aは第1の種類のヌクレオシドであり、Bは第2の種類のヌクレオシドである。
特定の実施形態において、A及びBは、2’-F、2’-OMe、BNA及びMOEからそれぞれ選択される。
特定の実施形態において、このような交互モチーフを有するオリゴヌクレオチドは、式IIcまたはIIeのものなどの修飾された5’末端ヌクレオシドも含む。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、2-2-3モチーフを有する領域を含む。かかる領域は、以下のモチーフを含む。
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
式中、Aは、第1の種類の修飾ヌクレオシドであり、
B及びCは、Aとは異なる修飾のヌクレオシドであるが、B及びCは、互いに同じ修飾を有してもよいし、互いに異なる修飾を有してもよく、
x及びyは、1~15である。
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
式中、Aは、第1の種類の修飾ヌクレオシドであり、
B及びCは、Aとは異なる修飾のヌクレオシドであるが、B及びCは、互いに同じ修飾を有してもよいし、互いに異なる修飾を有してもよく、
x及びyは、1~15である。
特定の実施形態において、Aは、2’-OMe修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態において、B及びCは、いずれも2’-F修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態において、Aは、2’-OMe修飾ヌクレオシドであり、B及びCは、いずれも2’-F修飾ヌクレオシドである。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオシドは、以下の糖モチーフを有する。
5’-(Q)-(AB)xAy-(D)z
式中、
Qは、安定化されたリン酸部分を含むヌクレオシドである。特定の実施形態において、Qは、式IIcまたはIIeを有するヌクレオシドであり、
Aは、第1の種類の修飾ヌクレオシドであり、
Bは、第2の種類の修飾ヌクレオシドであり、
Dは、隣接するヌクレオシドとは異なる修飾を含む修飾ヌクレオシドである。したがって、yが0の場合、DはBとは異なる修飾である必要があり、yが1の場合、DはAとは異なる修飾である必要がある。特定の実施形態において、Dは、AとBの両方と異なる。
Xは、5~15であり、
Yは、0または1であり、
Zは、0~4である。
5’-(Q)-(AB)xAy-(D)z
式中、
Qは、安定化されたリン酸部分を含むヌクレオシドである。特定の実施形態において、Qは、式IIcまたはIIeを有するヌクレオシドであり、
Aは、第1の種類の修飾ヌクレオシドであり、
Bは、第2の種類の修飾ヌクレオシドであり、
Dは、隣接するヌクレオシドとは異なる修飾を含む修飾ヌクレオシドである。したがって、yが0の場合、DはBとは異なる修飾である必要があり、yが1の場合、DはAとは異なる修飾である必要がある。特定の実施形態において、Dは、AとBの両方と異なる。
Xは、5~15であり、
Yは、0または1であり、
Zは、0~4である。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオシドは、以下の糖モチーフを有する。
5’-(Q)-(A)x-(D)z
式中、
Qは、安定化されたリン酸部分を含むヌクレオシドである。特定の実施形態において、Qは、式IIcまたはIIeを有するヌクレオシドであり、
Aは、第1の種類の修飾ヌクレオシドであり、
Dは、Aとは異なる修飾を含む修飾ヌクレオシドである。
Xは、11~30であり、
Zは、0~4である。
5’-(Q)-(A)x-(D)z
式中、
Qは、安定化されたリン酸部分を含むヌクレオシドである。特定の実施形態において、Qは、式IIcまたはIIeを有するヌクレオシドであり、
Aは、第1の種類の修飾ヌクレオシドであり、
Dは、Aとは異なる修飾を含む修飾ヌクレオシドである。
Xは、11~30であり、
Zは、0~4である。
特定の実施形態において、上記モチーフ中のA、B、C及びDは、2’-OMe、2’-F、2’-MOE、LNA及びcEtから選択される。特定の実施形態において、Dは、末端ヌクレオシドを表す。特定の実施形態において、かかる末端ヌクレオシドは、標的核酸にハイブリダイズしないように設計する(ただし、1つ以上は偶然にハイブリダイズし得る)。特定の実施形態において、各Dヌクレオシドの核酸塩基は、標的核酸の対応する位置での核酸塩基の同一性にかかわらず、アデニンである。特定の実施形態において、各Dヌクレオシドの核酸塩基は、チミンである。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ssRNAとしての使用に特に適したものを含め、オリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って所定のパターンまたは所定の修飾ヌクレオシド間結合モチーフで配置された修飾ヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、交互ヌクレオシド間結合モチーフを有する領域を含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、一様に修飾されたヌクレオシド間結合の領域を含む。このような特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって一様に結合された領域を含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって一様に結合される。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択される。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも1つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートであ
る。
る。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも6個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも8個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも6個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間結合のブロックを少なくとも1つ含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも8個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間結合のブロックを少なくとも1つ含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間結合のブロックを少なくとも1つ含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも12個の連続するホスホロチオエートヌクレオシド間結合のブロックを少なくとも1つ含む。このような特定の実施形態において、少なくとも1つの当該ブロックは、オリゴヌクレオチドの3’末端に位置する。このような特定の実施形態において、少なくとも1つの当該ブロックは、オリゴヌクレオチドの3’末端の3ヌクレオシド以内に位置する。
本明細書に記載される種々の糖モチーフのいずれかを有するオリゴヌクレオチドは、任意の結合モチーフを有し得る。例えば、上記のものを含むが、これらに限定されないオリゴヌクレオチドは、非限定的な以下の表から選択される結合モチーフを有し得る。
ii.siRNA化合物
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、二本鎖RNAi化合物(siRNA)である。このような実施形態において、一方または両方の鎖は、ssRNAに関して上記した任意の修飾モチーフを含み得る。特定の実施形態において、ssRNA化合物は、非修飾RNAであり得る。特定の実施形態において、siRNA化合物は、非修飾RNAヌクレオシドを含むが、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、二本鎖RNAi化合物(siRNA)である。このような実施形態において、一方または両方の鎖は、ssRNAに関して上記した任意の修飾モチーフを含み得る。特定の実施形態において、ssRNA化合物は、非修飾RNAであり得る。特定の実施形態において、siRNA化合物は、非修飾RNAヌクレオシドを含むが、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。
いくつかの実施形態は、二本鎖組成物に関し、各鎖は、1つ以上の修飾または非修飾ヌクレオシドの位置によって定義されるモチーフを含む。特定の実施形態において、完全にまたは少なくとも部分的にハイブリダイズして2本鎖領域を形成する第1及び第2のオリゴマー化合物を含み、核酸標的に対して相補的であり、かつハイブリダイズする領域を更に含む、組成物が提供される。このような組成物は、核酸標的に対して完全な相補性または部分的な相補性を有するアンチセンス鎖である第1のオリゴマー化合物と、第1のオリゴマー化合物に対して相補性のある1つ以上の領域を有し、かつ第1のオリゴマー化合物と少なくとも1つの2本鎖領域を形成するセンス鎖である第2のオリゴマー化合物とを含むのが好適である。
いくつかの実施形態の組成物は、核酸標的にハイブリダイズすることによって遺伝子発現を調節し、その通常の機能の消失をもたらす。いくつかの実施形態において、標的核酸は、AGTである。特定の実施形態において、標的AGTの分解は、本発明の組成物と一緒になって形成される活性化RISC複合体によって促進される。
いくつかの実施形態は、二本鎖組成物に関し、鎖の一方は、対の鎖のRISC(または切断)複合体への優先的な積み込みに影響を与えるのに有用である。組成物は、選択された核酸分子を標的にし、1つ以上の遺伝子の発現を調節するのに有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、標的RNAの一部にハイブリダイズし、これにより、標的RNAの通常の機能の消失をもたらす。
特定の実施形態は、二本鎖組成物に関し、両方の鎖は、ヘミマーモチーフ、完全に修飾されたモチーフ、位置的に修飾されたモチーフまたは交互モチーフを含む。本発明の組成物の各鎖は、例えばsiRNA経路において、特定の役割を果たすように修飾され得る。各鎖中に異なるモチーフを用いることにより、または各鎖中に異なる化学修飾を含む同じモチーフを用いることにより、センス鎖の取込みを阻害しつつ、アンチセンス鎖のRISC複合体に対する標的化が可能となる。このモデルでは、各鎖は、その特定の役割を強化するように独立して修飾され得る。アンチセンス鎖は、5’末端をRISCのある領域での役割を強化するように修飾することができ、一方、3’末端は、RISCの異なる領域での役割を強化するように異なる修飾を施すことができる。
二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、一方の鎖がセンス鎖であり、他方の鎖がアンチセンス鎖である、2つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、自己相補的であり(すなわち、各鎖は、もう一方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み;例えば、アンチセンス鎖とセンス鎖は、二本鎖または二本鎖構造を形成し、例えば、二本鎖領域は、約15~約30、例えば、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個の塩基対であり;アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む(例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の約15~約25個以上のヌクレオチドは、標的核酸またはその一部に対して相補的である)。あるいは、二本鎖オリゴヌクレオチドは、1つのオリゴヌクレオチドから組み立てられ、siRNAの自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカー(複数可)によって結合される。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有する二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドであってよく、ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。二本鎖オリゴヌクレオチドは、2つ以上のループ構造及び自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、in vivoまたはin vitroのいずれかでプロセシングを受けて、RNAiを媒介することが可能な活性siRNA分子を生成することができる。
特定の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、別個のセンス及びアンチセンス配列または領域を含み、ここで、センス及びアンチセンス領域は、当該技術分野において知られているヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合される
か、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用及び/またはスタッキング相互作用によって交互に非共有結合される。特定の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現の阻害を生じさせるような形で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
か、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用及び/またはスタッキング相互作用によって交互に非共有結合される。特定の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現の阻害を生じさせるような形で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
本明細書で使用されるとき、二本鎖オリゴヌクレオチドは、RNAのみを含有する分子に限定されるものではなく、化学修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドを更に包含する。特定の実施形態において、低分子干渉核酸分子は、2’-ヒドロキシ(2’-OH)含有ヌクレオチドを含まない。特定の実施形態において、低分子干渉核酸は、所望により、任意のリボヌクレオチド(例えば、2’-OH基を有するヌクレオチド)を含まない。しかしながら、RNAiを支援する分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないこのような二本鎖オリゴヌクレオチドは、2’-OH基を含むヌクレオチドを1つ以上含有する、1つ以上の結合リンカーまたは他の結合もしくは会合した基、部分もしくは鎖を有し得る。任意に、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド位置の約5、10、20、30、40または50%にリボヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用されるとき、siRNAという用語は、配列特異的RNAiを媒介することが可能な核酸分子を記載するために使用される他の用語、例えば、短い干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、microRNA(miRNA)、小ヘアピンRNA(shRNA)、短い干渉オリゴヌクレオチド、短い干渉核酸、短い干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾siRNA、転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA)及びその他と同等であることが意図される。更に、本明細書で使用されるとき、RNAiという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害またはエピジェネティクスなどの配列特異的RNA干渉を記載するために使用される他の用語と同等であることが意図される。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、転写後レベル及び転写前レベルの両方でエピジェネティック的な遺伝子サイレンシングを行うことができる。非限定的な例として、本発明のsiRNA分子による遺伝子発現のエピジェネティック的な制御は、遺伝子発現を変更させる、クロマチン構造またはメチル化パターンのsiRNA媒介性調節から生じ得る(例えば、Verdel et al.,2004,Science,303,672-676;Pal-Bhadra et al.,2004,Science,303,669-672;Allshire,2002,Science,297,1818-1819;Volpe
et al.,2002,Science,297,1833-1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218;及びHall et
al.,2002,Science,297,2232-2237参照)。
et al.,2002,Science,297,1833-1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218;及びHall et
al.,2002,Science,297,2232-2237参照)。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態の化合物及び組成物は、dsRNA媒介性遺伝子サイレンシングまたはRNAi機序によって、AGTを標的にすることができると考えられ、例えば、自己相補的な配列を含む単一のRNA鎖が二本鎖構造を取ることができる「ヘアピン」もしくはステム-ループ二本鎖RNAエフェクター分子、または2つの異なるRNA鎖を含む二本鎖dsRNAエフェクター分子を含む。種々の実施形態において、dsRNAは、完全にリボヌクレオチドからなるか、リボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの混合物、例えば、2000年4月19日出願のWO00/63364または1999年4月21日出願の米国特許出願第60/130,377号に開示されているRNA/DNAハイブリッドなどからなる。dsRNAまたはdsRNAエフェクター分子は、その分子のあるセグメント中のヌクレオチドが、その分子の別のセグメント中のヌクレオチドと塩基対を形成するような自己相補性領域を含む単一分子であってよい。種々の実施形態において、単一分子からなるdsRNAは、完全にリボヌクレオチドからなるか、デオキシリボヌクレオチド領域に相補的なリボヌクレオチド領域を含む。あるいは、dsRNAは、互いに相補的な領域を有する2つの異なる鎖を含み得る。
種々の実施形態において、両方の鎖が完全にリボヌクレオチドからなるか、一方の鎖が完全にリボヌクレオチドからなり、他方の鎖が完全にデオキシリボヌクレオチドからなるか、一方または両方の鎖がリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物を含有する。特定の実施形態において、相補性領域は、互いに、かつ標的核酸配列に対して、少なくとも70、80、90、95、98または100%相補的である。特定の実施形態において、二本鎖構造中に存在するdsRNAの領域は、少なくとも19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、75,100、200、500、1000、2000または5000個のヌクレオチドを含むか、dsRNA中に存在するcDNAまたは他の標的核酸配列中のヌクレオチドを全て含む。いくつかの実施形態において、dsRNAは、一本鎖末端などのいかなる一本鎖領域も含有しないか、dsRNAは、ヘアピンである。他の実施形態において、dsRNAは、1つ以上の一本鎖領域またはオーバーハングを有する。特定の実施形態において、RNA/DNAハイブリッドは、アンチセンス鎖または領域である(例えば、標的核酸に対して少なくとも70、80、90、95、98または100%の相補性を有する)DNA鎖または領域と、センス鎖または領域である(例えば、標的核酸に対して少なくとも70、80、90、95、98または100%の同一性を有する)るRNA鎖または領域とを含み、逆もまた同様である。
種々の実施形態において、RNA/DNAハイブリッドは、本明細書に記載されている方法、または2000年4月19日出願のWO00/63364もしくは1999年4月21日出願の米国特許出願第60/130,377号に記載されている方法などの酵素的合成法または化学的合成法を使用して、in vitroで作製される。他の実施形態において、in vitroで合成されたDNA鎖は、DNA鎖の細胞への形質転換の前、後、またはそれと同時に、in vivoまたはin vitroで作製されたRNA鎖と複合体化される。更に他の実施形態において、dsRNAは、センス領域及びアンチセンス領域を含有する単一環状核酸であるか、dsRNAは、環状核酸及び第2の環状核酸または線状核酸のいずれかを含む(例えば、2000年4月19日出願のWO00/63364または1999年4月21日出願の米国特許出願第60/130,377号参照)。例示的な環状核酸は、ヌクレオチドの遊離5’ホスホリル基が折り返すような形で別のヌクレオチドの2’ヒドロキシル基に結合されたラリアット構造を含む。
他の実施形態において、dsRNAは、糖の2’位にハロゲン(フッ素基など)を含有するか、アルコキシ基(メトキシ基など)を含有する、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。これは、対応する2’位が水素またはヒドロキシル基を含有する対応するdsRNAと比較してin vitroまたはin vivoにおけるdsRNAの半減期を増大させる。更に他の実施形態において、dsRNAは、隣接するヌクレオチド間に、1つ以上の天然に生じるホスホジエステル結合以外の結合を1つ以上含む。このような結合の例には、ホスホルアミド結合、ホスホロチオエート結合及びホスホロジチオエート結合が挙げられる。dsRNAはまた、米国特許第6,673,661号に教示されているような化学修飾核酸分子であってもよい。他の実施形態において、dsRNAは、例えば、2000年4月19日出願のWO00/63364または1999年4月21日に出願の米国特許出願第60/130,377号によって開示されているように、1本または2本のキャップ鎖を含有する。
他の実施形態において、dsRNAは、少なくとも部分的には、WO00/63364に開示されているdsRNA分子のいずれか、ならびに米国特許仮出願第60/399,998号及び米国特許仮出願第60/419,532号及びPCT/US2003/033466に記載されているdsRNA分子のいずれかであってよい(これらの教示は、参照によって本明細書に援用される)。dsRNAはいずれも、本明細書に記載の方法またはWO00/63364に記載の方法などの標準的な方法を使用してin vitroま
たはin vivoで発現され得る。
たはin vivoで発現され得る。
占有
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、RNase Hによる切断もしくは標的核酸をもたらすこと、またはRISC経路による切断もしくは除去をもたらすことを想定していない。このような特定の実施形態において、アンチセンス活性は、ハイブリダイズしたアンチセンス化合物の存在が標的核酸の活性を遮断する占有から生じ得る。このような特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、一様に修飾されていてもよいし、修飾の組み合わせならびに/または修飾及び非修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、RNase Hによる切断もしくは標的核酸をもたらすこと、またはRISC経路による切断もしくは除去をもたらすことを想定していない。このような特定の実施形態において、アンチセンス活性は、ハイブリダイズしたアンチセンス化合物の存在が標的核酸の活性を遮断する占有から生じ得る。このような特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、一様に修飾されていてもよいし、修飾の組み合わせならびに/または修飾及び非修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
標的核酸、標的領域及びヌクレオチド配列
AGTをコードするヌクレオチド配列には、限定するものではないが、次のもの:GENBANKアクセッション番号NM_000029.3(配列番号1として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号NT_167186.1のヌクレオチド24354000~24370100の相補体(配列番号2として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK307978.1(配列番号3として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK303755.1(配列番号4として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK293507.1(配列番号5として本明細書に援用される)、及びGENBANKアクセッション番号CR606672.1(配列番号6として本明細書に援用される)が含まれる。特定の実施形態において、本明細書に記載されるアンチセンス化合物は、AGTをコードする核酸配列を標的にする。特定の実施形態において、本明細書に記載されるアンチセンス化合物は、配列番号1~6のうちのいずれかの配列を標的にする。
AGTをコードするヌクレオチド配列には、限定するものではないが、次のもの:GENBANKアクセッション番号NM_000029.3(配列番号1として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号NT_167186.1のヌクレオチド24354000~24370100の相補体(配列番号2として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK307978.1(配列番号3として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK303755.1(配列番号4として本明細書に援用される)、GENBANKアクセッション番号AK293507.1(配列番号5として本明細書に援用される)、及びGENBANKアクセッション番号CR606672.1(配列番号6として本明細書に援用される)が含まれる。特定の実施形態において、本明細書に記載されるアンチセンス化合物は、AGTをコードする核酸配列を標的にする。特定の実施形態において、本明細書に記載されるアンチセンス化合物は、配列番号1~6のうちのいずれかの配列を標的にする。
本明細書に含まれる実施例において各配列番号で記載される配列は、糖部分、ヌクレオシド間結合または核酸塩基に対する何らかの修飾に依存しないことを理解されたい。したがって、配列番号によって定義されるアンチセンス化合物は、独立して、糖部分、ヌクレオシド間結合または核酸塩基に対する修飾を1つ以上含み得る。ISIS番号(ISIS
No)によって記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列及びモチーフの組み合わせを示す。
No)によって記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列及びモチーフの組み合わせを示す。
特定の実施形態において、標的領域は、構造的に画定された標的核酸の領域である。例えば、標的領域は、3’UTR、5’UTR、エクソン、イントロン、エクソン/イントロン境界、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終止領域または他の画定された核酸領域を包含し得る。AGTについて構造的に画定された領域は、NCBIなどの配列データベースからアクセッション番号によって得ることができ、そのような情報は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態において、標的領域は、当該標的領域内のある標的セグメントの5’標的部位から当該標的領域内の別の標的セグメントの3’標的部位までの配列を包含し得る。特定の実施形態において、標的領域は、アンチセンス化合物内のアンチセンス化合物の5’末端から少なくとも8個の連続した核酸塩基から選択される少なくとも8個の連続した核酸塩基を包含し得る(残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物の5’末端の直ぐ上流から開始し、当該領域が約8~約80個の核酸塩基を含有するまで連続する、連続したストレッチである)。特定の実施形態において、標的領域は、アンチセンス化合物内のアンチセンス化合物の3’末端から少なくとも8個の連続した核酸塩基から選択される少なくとも8個の連続した核酸塩基を包含し得る(残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物の3’末端の直ぐ下流から開始し、当該領域が約8~約80個の核酸塩基を含有するまで連続する、連続したストレッチである)。特定の実施形態において、標的領域は、配列番号14~2051のうちのいずれかから選択される少なくとも8個の連続した核酸塩基を含み、5’または3’の8個の連続する核酸塩基配列まで最大80個の核酸塩基が
続く。
続く。
特定の実施形態において、「標的セグメント」は、核酸内の標的領域のより小さな下位部分として定義される。例えば、標的セグメントは、標的核酸のうち、1つ以上のアンチセンス化合物が標的とするヌクレオチドの配列であり得る。「5’標的部位」とは、標的セグメントの最も5’側のヌクレオチドを指す。「3’標的部位」とは、標的セグメントの最も3’側のヌクレオチドを指す。
標的化には、アンチセンス化合物がハイブリダイズして所望の作用が生じるような少なくとも1つの標的セグメントを決定することが含まれる。特定の実施形態において、所望の作用は、mRNA標的核酸レベルの減少である。特定の実施形態において、所望の作用は、標的核酸によってコードされているタンパク質のレベルの減少または標的核酸に関連した表現型変化である。
標的領域は、1つ以上の標的セグメントを含有し得る。標的領域内の複数の標的セグメントは、重複していてもよい。あるいは、それらは重複していなくてもよい。特定の実施形態において、標的領域内の標的セグメントは、約300個以下のヌクレオチドによって隔てられている。特定の実施形態において、標的領域内の標的セグメントは、多数のヌクレオチドで隔てられており、標的核酸上、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20もしくは10個のヌクレオチド、およそその数のヌクレオチド、それ以下の数のヌクレオチド、およそその数以下のヌクレオチド、または前述の値のうちのいずれか2つによって定義される範囲の数のヌクレオチドで隔てられている。特定の実施形態において、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上、5個以下または約5個以下のヌクレオチドで隔てられている。特定の実施形態において、標的セグメントは、連続している。本明細書で列挙される5’標的部位または3’標的部位のうちのいずれかである開始核酸を有する範囲によって定義される標的領域が企図される。
好適な標的セグメントは、5’UTR、コード領域、3’UTR、イントロン、エクソンまたはエクソン/イントロン境界内に存在し得る。開始コドンまたは終止コドンを含有する標的セグメントもまた好適な標的セグメントである。好適な標的セグメントは、開始コドンまたは終止コドンなどの特定の構造的に画定された領域を特に除外してもよい。
好適な標的セグメントの決定には、標的核酸の配列とゲノム全体の他の配列との比較が含まれ得る。例えば、BLASTアルゴリズムを使用して、異なる核酸間で類似性を有する領域を同定することができる。この比較により、選択した標的核酸以外の配列(すなわち、非ターゲット配列またはオフターゲット配列)に非特異的にハイブリダイズし得るアンチセンス化合物配列の選択を避けることができる。
活性標的領域内でのアンチセンス化合物の活性(例えば、標的核酸レベルの減少率によって定義されるもの)には、ばらつきが生じ得る。特定の実施形態において、AGT mRNAレベルの減少は、AGT発現の阻害を示す。AGTタンパク質のレベルの減少もまた、AGT発現の阻害を示す。更に、表現型変化もAGT発現を示す。例えば、組織における線維症の低減は、AGT発現の阻害を示し得る。別の例として、高血圧の軽減は、AGT発現の阻害を示し得る。
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるアンチセンス化合物とAGT核酸との間でハイブリダイゼーションが生じる。最も一般的なハイブリダイゼーションの機序には、核酸分子の相補的な核酸塩基間での水素結合(例えば、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の水素結合)が関与する。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるアンチセンス化合物とAGT核酸との間でハイブリダイゼーションが生じる。最も一般的なハイブリダイゼーションの機序には、核酸分子の相補的な核酸塩基間での水素結合(例えば、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の水素結合)が関与する。
ハイブリダイゼーションは、様々な条件下で生じ得る。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、ハイブリダイズされる核酸分子の性質及び組成によって決まる。
ある配列が標的核酸に特異的にハイブリダイズするかどうかについて決定する方法は、当該技術分野においてよく知られている(Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,2001)。特定の実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンス化合物は、AGT核酸と特異的にハイブリダイズ可能である。
相補性
アンチセンス化合物及び標的核酸は、そのアンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の作用(例えば、AGT核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害)を生じるように、その標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるとき、互いに相補的である。
アンチセンス化合物及び標的核酸は、そのアンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の作用(例えば、AGT核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害)を生じるように、その標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるとき、互いに相補的である。
アンチセンス化合物とAGT核酸との間の非相補的核酸塩基は、そのアンチセンス化合物が依然としてAGT核酸に特異的にハイブリダイズすることができるのであれば、許容され得る。更に、アンチセンス化合物は、介在するまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないような形で、AGT核酸の1つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい(例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造)。
特定の実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンス化合物またはその指定された部分は、AGT核酸、標的領域、標的セグメントまたはその指定された部分に対して、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%相補的であるか、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%相補的である。アンチセンス化合物と標的核酸との相補性パーセントは、常法を使用して決定することができる。例えば、アンチセンス化合物の核酸塩基20個中18個が標的領域に対して相補的であり、そのため、特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、90%の相補性になると言える。この例の場合、残りの非相補的核酸塩基は、ひとまとまりになっていてもよいし、相補的核酸塩基の間に散在していてもよく、また、互いに連続している必要も、相補的核酸塩基に対して連続している必要もない。したがって、標的核酸と完全に相補性な2つの領域に挟まれた4つの非相補的核酸塩基を有する18核酸塩基長のアンチセンス化合物は、当該標的核酸と77.8%の総相補性を有し、したがって、本発明の範囲内に包含される。
アンチセンス化合物と標的核酸のある領域との相補性パーセントは、当該技術分野において知られているBLASTプログラム(ベーシックローカルアライメント検索ツール)及びPowerBLASTプログラム(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403 410;Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649 656)を使用して常法により決定することができる。相同性、配列同一性または相補性パーセントは、例えば、Smith及びWatermanのアルゴリズム(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)を使用するギャッププログラム(Wisconsin Sequence
Analysis Package,Version 8 for Unix,Gen
etics Computer Group,University Research
Park,Madison Wis.)によって、デフォルト設定を使用して決定することができる。
Analysis Package,Version 8 for Unix,Gen
etics Computer Group,University Research
Park,Madison Wis.)によって、デフォルト設定を使用して決定することができる。
特定の実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンス化合物またはその指定された部分は、標的核酸またはその指定された部分に対して、完全に相補的(すなわち、100%相補性)である。例えば、アンチセンス化合物は、AGT核酸またはその標的領域もしくは標的セグメントもしくは標的配列に完全に相補的であり得る。本明細書で使用されるとき、「完全に相補的」とは、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確な塩基対を形成できることを意味する。例えば、20個の核酸塩基のアンチセンス化合物は、対応する標的核酸の20個の核酸塩基部分がそのアンチセンス化合物に対して完全に相補的である限り、400核酸塩基長である標的配列に完全に相補的である。完全に相補的とは、第1及び/または第2の核酸の指定された部分に関しても使用され得る。例えば、30個の核酸塩基のアンチセンス化合物の20個の核酸塩基部分は、400核酸塩基長である標的配列に「完全に相補的」であり得る。30個の核酸塩基のオリゴヌクレオチドのうちの20個の核酸塩基部分は、標的配列が、対応する20個の核酸塩基部分を有し、その各核酸塩基が、アンチセンス化合物の20個の核酸塩基部分に対して相補的であれば、その標的配列に完全に相補的である。同時に、当該30個の核酸塩基のアンチセンス化合物全体は、そのアンチセンス化合物の残りの10個の核酸塩基も同様に標的配列に対して相補的であるかどうかに応じて、標的配列に完全に相補的である場合もあれば、そうでない場合もある。
非相補的核酸塩基の場所は、アンチセンス化合物の5’末端でも3’末端でもよい。あるいは、1つまたは複数の非相補的核酸塩基は、アンチセンス化合物の内側の位置に存在し得る。2つ以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは、連続していてもよいし(すなわち、結合している)、非連続でもよい。一実施形態において、非相補的核酸塩基は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウイングセグメントに位置する。
特定の実施形態において、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個の長さの核酸塩基または最大11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個の長さの核酸塩基であるアンチセンス化合物は、AGT核酸などの標的核酸またはその指定された部分に対して、4個以下、3個以下、2個以下または1個以下の非相補的核酸塩基(複数可)を含む。
特定の実施形態において、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30個の長さの核酸塩基または最大11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30個の長さの核酸塩基であるアンチセンス化合物は、AGT核酸などの標的核酸またはその指定された部分に対して、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下または1個以下の非相補的核酸塩基(複数可)を含む。
本明細書で提供されるアンチセンス化合物には、標的核酸の一部分に相補的であるものも含まれる。本明細書で使用されるとき、「部分(portion)」は、標的核酸のある領域またはセグメント内の所定数の連続した(すなわち、結合された)核酸塩基を指す。「部分」はまた、アンチセンス化合物の所定数の連続した核酸塩基を指し得る。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも8核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも12核酸塩基部分に相補的である。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも15核酸塩基部分に相補的である。また、標的セグメ
ントの少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20もしくはそれ以上の核酸塩基部分またはこれらの値のうちのいずれか2つによって定義される範囲の核酸塩基部分に相補的であるアンチセンス化合物も企図される。
ントの少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20もしくはそれ以上の核酸塩基部分またはこれらの値のうちのいずれか2つによって定義される範囲の核酸塩基部分に相補的であるアンチセンス化合物も企図される。
同一性
本明細書で提供されるアンチセンス化合物はまた、ある特定のヌクレオチド配列、配列番号もしくは特定のISIS番号によって表される化合物またはその部分に対して、所定の同一性パーセントを有し得る。本明細書で使用されるとき、アンチセンス化合物は、それが同じ核酸塩基対を形成する能力を有するのであれば、本明細書で開示される配列と同一である。例えば、開示されるDNA配列中でチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、ウラシルとチミジンがどちらもアデニンと対合するので、そのDNA配列と同一であるとみなされる。本明細書に記載されるアンチセンス化合物の短縮型及び延長型、ならびに本明細書で提供されるアンチセンス化合物に対して非同一塩基を有する化合物も企図される。非同一塩基は、互いに隣接していてもよいし、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較対象の配列に対して同一の塩基対形成を有する塩基の数に応じて、算出される。
本明細書で提供されるアンチセンス化合物はまた、ある特定のヌクレオチド配列、配列番号もしくは特定のISIS番号によって表される化合物またはその部分に対して、所定の同一性パーセントを有し得る。本明細書で使用されるとき、アンチセンス化合物は、それが同じ核酸塩基対を形成する能力を有するのであれば、本明細書で開示される配列と同一である。例えば、開示されるDNA配列中でチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、ウラシルとチミジンがどちらもアデニンと対合するので、そのDNA配列と同一であるとみなされる。本明細書に記載されるアンチセンス化合物の短縮型及び延長型、ならびに本明細書で提供されるアンチセンス化合物に対して非同一塩基を有する化合物も企図される。非同一塩基は、互いに隣接していてもよいし、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の同一性パーセントは、比較対象の配列に対して同一の塩基対形成を有する塩基の数に応じて、算出される。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物またはその部分は、本明細書で開示されるアンチセンス化合物もしくは配列番号またはその部分の1つ以上と、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である。
修飾
ヌクレオシドは、塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基としても知られる)部分は、通常、複素環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分に結合され得る。オリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合されることによって形成され、線状高分子オリゴヌクレオチドを形成する。リン酸基は、オリゴヌクレオチド構造内で、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成するものと一般に言われている。
ヌクレオシドは、塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基としても知られる)部分は、通常、複素環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の2’、3’または5’ヒドロキシル部分に結合され得る。オリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合されることによって形成され、線状高分子オリゴヌクレオチドを形成する。リン酸基は、オリゴヌクレオチド構造内で、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成するものと一般に言われている。
アンチセンス化合物に対する修飾は、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基に対する置換または変更を包含する。修飾アンチセンス化合物は、例えば、細胞取込みの向上、核酸標的に対する親和性の向上、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増大、または阻害活性の増加などの望ましい特性があるため、天然型よりも好ましいことが多い。
短縮型または切断型アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的核酸に対する結合親和性を増大させるには、化学修飾ヌクレオシドを利用することもできる。したがって、より短いアンチセンス化合物でも、このような化学修飾ヌクレオシドを有するものは、多くの場合、同等の結果を得ることができる。
修飾ヌクレオシド間結合
RNA及びDNAの天然に生じるヌクレオシド間結合は、3’-5’ホスホジエステル結合である。天然に生じるヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物よりも、1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合、すなわち、天然に生じないヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物のほうが、例えば、細胞取込みの向上、核酸標的に対する親和性の向
上及びヌクレアーゼ存在下での安定性の増大などの望ましい特性を有するため、選択されることが多い。
RNA及びDNAの天然に生じるヌクレオシド間結合は、3’-5’ホスホジエステル結合である。天然に生じるヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物よりも、1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合、すなわち、天然に生じないヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物のほうが、例えば、細胞取込みの向上、核酸標的に対する親和性の向
上及びヌクレアーゼ存在下での安定性の増大などの望ましい特性を有するため、選択されることが多い。
修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持するヌクレオシド間結合及びリン原子を持たないヌクレオシド間結合が含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート及びホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限定されない。リン含有結合及びリン非含有結合の調製方法は、よく知られている。
特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物は、1つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合の少なくとも1つは、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態において、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、場合により、糖基が修飾されている1つ以上のヌクレオシドを含有することができる。このような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の向上、結合親和性の増大または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与し得る。特定の実施形態において、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、限定するものではないが、置換基の付加(例えば、5’及び2’置換基、非ジェミナル環原子の架橋による二環式核酸(BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)またはC(R1)(R2)(R、R1及びR2は、それぞれ独立してH、C1~C12アルキルまたは保護基である)による置き換え及びこれらの組み合わせが挙げられる。化学修飾糖の例には、2’-F-5’-メチル置換ヌクレオシド(開示されている他の5’,2’-ビス置換ヌクレオシドについては2008年8月21日に公開されたPCT国際出願WO2008/101157を参照)またはリボシル環酸素原子のSの置き換えと2’位の更なる置換(2005年6月16日に公開された米国特許出願公開US2005-0130923参照)、あるいは、BNAの5’-置換(2007年11月22日に公開されたPCT国際出願WO2007/134181を参照;例えば、5’-メチルまたは5’-ビニル基で置換されたLNA)が挙げられる。
本発明のアンチセンス化合物は、場合により、糖基が修飾されている1つ以上のヌクレオシドを含有することができる。このような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の向上、結合親和性の増大または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与し得る。特定の実施形態において、ヌクレオシドは、化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、限定するものではないが、置換基の付加(例えば、5’及び2’置換基、非ジェミナル環原子の架橋による二環式核酸(BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)またはC(R1)(R2)(R、R1及びR2は、それぞれ独立してH、C1~C12アルキルまたは保護基である)による置き換え及びこれらの組み合わせが挙げられる。化学修飾糖の例には、2’-F-5’-メチル置換ヌクレオシド(開示されている他の5’,2’-ビス置換ヌクレオシドについては2008年8月21日に公開されたPCT国際出願WO2008/101157を参照)またはリボシル環酸素原子のSの置き換えと2’位の更なる置換(2005年6月16日に公開された米国特許出願公開US2005-0130923参照)、あるいは、BNAの5’-置換(2007年11月22日に公開されたPCT国際出願WO2007/134181を参照;例えば、5’-メチルまたは5’-ビニル基で置換されたLNA)が挙げられる。
修飾糖部分を有するヌクレオシドの例には、5’-ビニル、5’-メチル(RまたはS)、4’-S、2’-F、2’-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F及び2’-O(CH2)2OCH3置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。2’位の置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリル、O-C1~C10アルキル、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)及びO-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)(式中、各Rl、Rm及びRnは、独立して、Hまたは置換または無置換C1~C10アルキルである)から選択することもできる。
本明細書で使用されるとき、「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式核酸(BNA)の例には、限定するものではないが、4’リボシル環原子と2’リボシル環原子との間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンス化合物には、1つ以上のBNAヌクレオシドを含み、その架橋は、次式:4’-(CH2)-O-2’(LNA);4’-(CH2)-S-2’;4’-(CH2)2-O-2’(ENA);4’-CH(CH3)-O-2’(cEt)及び4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及びその類似体;2008年7月15日に発行された米国特許第7,399,845号参照);4’-C(
CH3)(CH3)-O-2’(及びその類似体;WO/2009/006478(2009年1月8日公開)として公開されたPCT/US2008/068922参照);4’-CH2-N(OCH3)-2’(及びその類似体;WO/2008/150729(2008年12月11日公開)として公開されたPCT/US2008/064591参照);4’-CH2-O-N(CH3)-2’(2004年9月2日に公開された米国特許出願公開US2004-0171570参照);4’-CH2-N(R)-O-2’(式中、Rは、H、C1~C12アルキル保護基である)(2008年9月23日発行の米国特許第7,427,672号参照);4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(例えば、Zhou,et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134参照)ならびに4’-CH2-C(=CH2)-2’(及びその類似体:WO2008/154401(2008年12月8日公開)として公開されたPCT/US2008/066154参照)のうちの1つを含む。
CH3)(CH3)-O-2’(及びその類似体;WO/2009/006478(2009年1月8日公開)として公開されたPCT/US2008/068922参照);4’-CH2-N(OCH3)-2’(及びその類似体;WO/2008/150729(2008年12月11日公開)として公開されたPCT/US2008/064591参照);4’-CH2-O-N(CH3)-2’(2004年9月2日に公開された米国特許出願公開US2004-0171570参照);4’-CH2-N(R)-O-2’(式中、Rは、H、C1~C12アルキル保護基である)(2008年9月23日発行の米国特許第7,427,672号参照);4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(例えば、Zhou,et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134参照)ならびに4’-CH2-C(=CH2)-2’(及びその類似体:WO2008/154401(2008年12月8日公開)として公開されたPCT/US2008/066154参照)のうちの1つを含む。
更なる二環式ヌクレオシドは、公開文献に報告されている(例えば、Srivastava et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379;Frieden et al.,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372;Elayadi et al.,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561;Braasch et al.,Chem.Biol.,2001,8,1-7;Orum
et al.,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243;Wahlestedt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638;Singh et al.,Chem.Commun.,1998,4,455-456;Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630;Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222;Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039;米国特許第7,399,845号、同第7,053,207号、同第7,034,133号、同第6,794,499号、同第6,770,748号、同第6,670,461号、同第6,525,191号、同第6,268,490号;米国特許出願公開第US2008-0039618号、同第US2007-0287831号、同第US2004-0171570号;米国特許出願第12/129,154号、同第61/099,844号、同第61/097,787号、同第61/086,231号、同第61/056,564号、同第61/026,998号、同第61/026,995号、同第60/989,574号;国際出願第WO2007/134181号、同第WO2005/021570号、同第WO2004/106356号、同第WO99/14226号;ならびにPCT国際出願番号:PCT/US2008/068922、PCT/US2008/066154及びPCT/US2008/064591参照)。前述の二環式ヌクレオシドのそれぞれは、例えばα-L-リボフラノース及びβ-D-リボフラノースを含む、1つ以上の立体化学的糖構造を有するように調製することができる(WO99/14226(1999年3月25日公開)として公開されたPCT国際出願PCT/DK98/00393号参照)。
et al.,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243;Wahlestedt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638;Singh et al.,Chem.Commun.,1998,4,455-456;Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630;Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222;Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039;米国特許第7,399,845号、同第7,053,207号、同第7,034,133号、同第6,794,499号、同第6,770,748号、同第6,670,461号、同第6,525,191号、同第6,268,490号;米国特許出願公開第US2008-0039618号、同第US2007-0287831号、同第US2004-0171570号;米国特許出願第12/129,154号、同第61/099,844号、同第61/097,787号、同第61/086,231号、同第61/056,564号、同第61/026,998号、同第61/026,995号、同第60/989,574号;国際出願第WO2007/134181号、同第WO2005/021570号、同第WO2004/106356号、同第WO99/14226号;ならびにPCT国際出願番号:PCT/US2008/068922、PCT/US2008/066154及びPCT/US2008/064591参照)。前述の二環式ヌクレオシドのそれぞれは、例えばα-L-リボフラノース及びβ-D-リボフラノースを含む、1つ以上の立体化学的糖構造を有するように調製することができる(WO99/14226(1999年3月25日公開)として公開されたPCT国際出願PCT/DK98/00393号参照)。
本明細書で使用されるとき、「単環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分でない修飾糖部分を含むヌクレオシドを指す。特定の実施形態において、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体は、任意の位置で修飾または置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「4’-2’二環式ヌクレオシド」または「4’→2’二環式ヌクレオシド」は、糖環の2’炭素原子と4’炭素原子とを接続するフラノース環の2つの炭素原子を接続する架橋を含むフラノース環を含む二環式ヌクレオシドを指す。
特定の実施形態において、BNAヌクレオシドの二環式糖部分には、限定するものではないが、ペントフラノシル糖部分の4’炭素原子と2’炭素原子との間に少なくとも1つの架橋を有する化合物が含まれ、限定するものではないが、-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-C(=NRa)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(=O)x-及び-N(Ra)-から独立して選択される1個または1~4個の結合基を含む架橋を含み、式中、xは0、1または2であり、nは1、2、3または4であり、各Ra及びRbは、独立して、H、保護基、ヒドロキシル、C1~C12アルキル、置換C1~C12アルキル、C2~C12アルケニル、置換C2~C12アルケニル、C2~C12アルキニル、置換C2~C12アルキニル、C5~C20アリール、置換C5~C20アリール、複素環基、置換複素環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C5~C7脂環式基、置換C5~C7脂環式基、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル(C(=O)-H)、置換アシル、CN、スルホニル(S(=O)2-J1)、またはスルホキシル(S(=O)-J1)であり、各J1及びJ2は、独立して、H、C1~C12アルキル、置換C1~C12アルキル、C2~C12アルケニル、置換C2~C12アルケニル、C2~C12アルキニル、置換C2~C12アルキニル、C5~C20アリール、置換C5~C20アリール、アシル(C(=O)-H)、置換アシル、複素環基、置換複素環基、C1~C12アミノアルキル、置換C1~C12アミノアルキルまたは保護基である。
特定の実施形態において、二環式糖部分の架橋は、-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-または-C(RaRb)-O-N(R)-である。特定の実施形態において、架橋は、4’-CH2-2’、4’-(CH2)2-2’、4’-(CH2)3-2’、4’-CH2-O-2’、4’-(CH2)2-O-2’、4’-CH2-O-N(R)-2’及び4’-CH2-N(R)-O-2’-(式中、Rは、独立して、H、保護基またはC1~C12アルキルである)である。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドは、異性体配置によって更に定義される。例えば、4’-(CH2)-O-2’架橋を含むヌクレオシドは、α-L配置またはβ-D配置を取り得る。これまでに、α-L-メチレンオキシ(4’-CH2-O-2’)BNAがアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれており、アンチセンス活性を示している(Frieden et al.,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドには、4’→2’架橋を有するものが含まれ、かかる架橋には、限定するものではないが、α-L-4’-(CH2)-O-2’、β-D-4’-CH2-O-2’、4’-(CH2)2-O-2’、4’-CH2-O-N(R)-2’、4’-CH2-N(R)-O-2’、4’-CH(CH3)-O-2’、4’-CH2-S-2’、4’-CH2-N(R)-2’、4’-CH2-CH(CH3)-2’、及び4’-(CH2)3-2’(式中、Rは、H、保護基またはC1~C12アルキルである)が含まれる。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドは、次式を有する。
式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
-Qa-Qb-Qc-は、-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(=O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-または-N(Rc)-O-CH2であり、
Rcは、C1~C12アルキルまたはアミノ保護基であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合である。
Bxは、複素環式塩基部分であり、
-Qa-Qb-Qc-は、-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(=O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-または-N(Rc)-O-CH2であり、
Rcは、C1~C12アルキルまたはアミノ保護基であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合である。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドは、次式を有する。
式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
Zaは、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C1~C6アルキル、置換C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオールである。
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
Zaは、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C1~C6アルキル、置換C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオールである。
一実施形態において、置換基のそれぞれは、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(=X)Jc及びNJeC(=X)NJcJdから独立して選択される置換基でモノ置換またはポリ置換され、式中、各Jc、Jd及びJeは、独立して、H、C1~C6アルキルまたは置換C1~C6アルキルであり、Xは、OまたはNJcである。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドは、次式を有する。
式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
Zbは、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C1~C6アルキル、置換C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルキニルまたは置換アシル(C(=O)-)である。
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
Zbは、C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C1~C6アルキル、置換C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルキニルまたは置換アシル(C(=O)-)である。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドは、次式を有する。
式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
Rdは、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
各qa、qb、qc及びqdは、独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニル、C1~C6アルコキシル、置換C1~C6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1~C6アミノアルキルまたは置換C1~C6アミノアルキルである。
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
Rdは、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
各qa、qb、qc及びqdは、独立して、H、ハロゲン、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニル、C1~C6アルコキシル、置換C1~C6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1~C6アミノアルキルまたは置換C1~C6アミノアルキルである。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドは、次式を有する。
式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
qa、qb、qe及びqfは、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、C1~C12アルキル、置換C1~C12アルキル、C2~C12アルケニル、置換C2~C12アルケニル、C2~C12アルキニル、置換C2~C12アルキニル、C1~C12アルコキシ、置換C1~C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)N
JjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり、
あるいはqe及びqfは、一緒になって=C(qg)(qh)であり、
qg及びqhは、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C12アルキルまたは置換C1~C12アルキルである。
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
qa、qb、qe及びqfは、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、C1~C12アルキル、置換C1~C12アルキル、C2~C12アルケニル、置換C2~C12アルケニル、C2~C12アルキニル、置換C2~C12アルキニル、C1~C12アルコキシ、置換C1~C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)N
JjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり、
あるいはqe及びqfは、一緒になって=C(qg)(qh)であり、
qg及びqhは、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C12アルキルまたは置換C1~C12アルキルである。
4’-CH2-O-2’架橋を有する、アデニン、シトシン、グアニン、5-メチル-シトシン、チミン及びウラシル二環式ヌクレオシドの合成及び調製については、そのオリゴマー化及び核酸認識特性とともに記載されている(Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。二環式ヌクレオシドの合成は、WO98/39352及びWO99/14226にも記載されている。
4’-CH2-O-2’及び4’-CH2-S-2’などの4’→2’架橋基を有する種々の二環式ヌクレオシドの類似体も調製されている(Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。核酸ポリメラーゼの基質として使用する二環式ヌクレオシドを含むオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖の調製についても記載されている(Wengel et al.,WO99/14226)。更に、立体配置が制限された新しい高親和性オリゴヌクレオチド類似体である2’-アミノ-BNAの合成についても当該技術分野において記載されている(Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。加えて、2’-アミノ-BNA及び2’-メチルアミノ-BNAが調製されており、相補的RNA鎖とDNA鎖によるその二本鎖の熱安定性については先に報告されている。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドは、次式を有する。
式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
各qi、qj、qk及びqlは、独立して、H、ハロゲン、C1~C12アルキル、置換C1~C12アルキル、C2~C12アルケニル、置換C2~C12アルケニル、C2~C12アルキニル、置換C2~C12アルキニル、C1~C12アルコキシル、置換C1~C12アルコキシル、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり、
qi及びqjまたはql及びqkは、一緒になって、=C(qg)(qh)であり、式中、qg及びqhは、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C12アルキルまたは置換C1~C12アルキルである。
Bxは、複素環式塩基部分であり、
Ta及びTbは、それぞれ独立して、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分または支持体への共有結合であり、
各qi、qj、qk及びqlは、独立して、H、ハロゲン、C1~C12アルキル、置換C1~C12アルキル、C2~C12アルケニル、置換C2~C12アルケニル、C2~C12アルキニル、置換C2~C12アルキニル、C1~C12アルコキシル、置換C1~C12アルコキシル、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJkまたはN(H)C(=S)NJjJkであり、
qi及びqjまたはql及びqkは、一緒になって、=C(qg)(qh)であり、式中、qg及びqhは、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1~C12アルキルまたは置換C1~C12アルキルである。
4’-(CH2)3-2’架橋及びアルケニル類似体架橋4’-CH=CH-CH2-
2’を有する、ある炭素環二環式ヌクレオシドが記載されている(Frier et al.,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443及びAlbaek et al.,J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。炭素環二環式ヌクレオシドの合成及び調製についても、そのオリゴマー化及び生化学的研究とともに記載されている(Srivastava et
al.,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
2’を有する、ある炭素環二環式ヌクレオシドが記載されている(Frier et al.,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443及びAlbaek et al.,J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。炭素環二環式ヌクレオシドの合成及び調製についても、そのオリゴマー化及び生化学的研究とともに記載されている(Srivastava et
al.,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
特定の実施形態において、二環式ヌクレオシドには、以下に示すように、(A)α-L-メチレンオキシ(4’-CH2-O-2’)BNA、(B)β-D-メチレンオキシ(4’-CH2-O-2’)BNA、(C)エチレンオキシ(4’-(CH2)2-O-2’)BNA、(D)アミノオキシ(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA、(E)オキシアミノ(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA、(F)メチル(メチレンオキシ)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(拘束エチルまたはcEtとも呼ばれる)、(G)メチレン-チオ(4’-CH2-S-2’)BNA、(H)メチレン-アミノ(4’-CH2-N(R)-2’)BNA、(I)メチル炭素環式(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA、(J)プロピレン炭素環式(4’-(CH2)3-2’)BNA、及び(K)ビニルBNAが含まれるが、これらに限定されない。
式中、Bxは、塩基部分であり、Rは、独立して、H、保護基、C1~C6アルキルまたはC1~C6アルコキシである。
本明細書で使用されるとき、「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾THPヌクレオシド」という用語は、通常のヌクレオシド中のペントフラノシル残基の代わりに6員テトラヒドロピラン「糖」を有するヌクレオシドを意味し、糖代替物と呼ぶ場合もある。修飾THPヌクレオシドには、当該技術分野においてヘキシトール核酸(HNA)、アニトール核酸(ANA)、マニトール核酸(MNA)と呼ばれるもの(Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854参照)、または以下に示すテトラヒドロピラニル環系を有するフルオロHNA(F-HNA)が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、糖代替物は、次式を有するものから選択される。
式中、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
T3及びT4は、それぞれ独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をオリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、あるいは、T3及びT4の一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をオリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオシド間結合基であり、T3及びT4の他方は、H、ヒドロキシル保護基、結合されたコンジュゲート基または5’もしくは3’末端基であり、
q1、q2、q3、q4、q5、q6及びq7は、それぞれ独立して、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
R1及びR2の一方は、水素であり、他方は、ハロゲン、置換または無置換アルコキシ、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2及びCNから選択され、式中、Xは、O、SまたはNJ1であり、各J1、J2及びJ3は、独立して、HまたはC1~C6アルキルである。
Bxは、複素環式塩基部分であり、
T3及びT4は、それぞれ独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をオリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、あるいは、T3及びT4の一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をオリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオシド間結合基であり、T3及びT4の他方は、H、ヒドロキシル保護基、結合されたコンジュゲート基または5’もしくは3’末端基であり、
q1、q2、q3、q4、q5、q6及びq7は、それぞれ独立して、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニルまたは置換C2~C6アルキニルであり、
R1及びR2の一方は、水素であり、他方は、ハロゲン、置換または無置換アルコキシ、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2及びCNから選択され、式中、Xは、O、SまたはNJ1であり、各J1、J2及びJ3は、独立して、HまたはC1~C6アルキルである。
特定の実施形態において、q1、q2、q3、q4、q5、q6及びq7は、それぞれHである。特定の実施形態において、q1、q2、q3、q4、q5、q6及びq7のうちの少なくとも1つは、H以外である。特定の実施形態において、q1、q2、q3、q4、q5、q6及びq7のうちの少なくとも1つは、メチルである。特定の実施形態において、R1及びR2の一方がFであるTHPヌクレオシドが提供される。特定の実施形態において、R1はフルオロであり、R2はHであり、R1はメトキシであり、R2はHであり、R1はメトキシエトキシであり、R2はHである。
特定の実施形態において、糖代替物は、6個以上の原子を有し、2つ以上のヘテロ原子を有する環を含む。例えば、モルホリノ糖部分を含むヌクレオシド及びそのオリゴマー化合物における使用が報告されている(例えば、Braasch et al.,Biochemistry,2002,41,4503-4510ならびに米国特許第5,698,685号;同第5,166,315号;同第5,185,444号;及び同第5,034,506号参照)。本明細書で使用される場合、「モルホリノ」という用語は、次式を有する糖代替物を意味する。
特定の実施形態において、モルホリノは、例えば、上記のモルホリノ構造に種々の置換基を付加するか、上記のモルホリノ構造の種々の置換基を変更することによって、修飾されてもよい。このような糖代替物は、本明細書中、「修飾モルホリノ」ともいう。
修飾の組み合わせも提供され、限定するものではないが、2’-F-5’-メチル置換ヌクレオシド(開示されている他の5’,2’-ビス置換ヌクレオシドについては2008年8月21日に公開されたPCT国際出願WO2008/101157を参照)及びリボシル環酸素原子のSの置き換えと2’位の更なる置換(2005年6月16日に公開された米国特許出願公開US2005-0130923参照)、あるいは、二環式核酸の5’-置換(2007年11月22日に公開されたPCT国際出願WO2007/134181を参照;4’-CH2-O-2’二環式ヌクレオシドは、5’位が5’-メチルまたは5’-ビニル基で更に置換される)などがある。炭素環二環式ヌクレオシドの合成及び調製についても、そのオリゴマー化及び生化学的研究とともに記載されている(例えば、Srivastava et al.,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379参照)。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、天然に生じるヌクレオシド中のペントフラノシル残基の代わりに6員シクロヘキセニルを有するヌクレオシドである、修飾シクロヘキセニルヌクレオシドを1つ以上含む。修飾シクロヘキセニルヌクレオシドには、当該技術分野において記載されているものが含まれるが、これらに限定されない(例えば、所有者が共通である2010年4月10日に公開されたPCT国際出願WO2010/036696、Robeyns et al.,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984;Horvath et al.,Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623;Nauwelaerts et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348;Gu et al.,,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998;Nauwelaerts et al.,Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463;Robeyns et al.,Acta Crystallographica,Section F:Structural
Biology and Crystallization Communications,2005,F61(6),585-586;Gu et al.,Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123;Gu et al.,Oligonucleotides,2003,13(6),479-489;Wang et
al.,J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505;Verbeure et al.,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947;Wang et al.,J.Org.Chem.,2001,66,8478-82;Wang et al.,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788;Wang et al.,J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602;PCT出願公開WO06/047842;及びPCT出願公開WO01/049687参照;各文献は、その全体を参照により本明細書に援用する)。特定の修飾シクロヘキセニルヌクレオシドは、式Xを有する。
Biology and Crystallization Communications,2005,F61(6),585-586;Gu et al.,Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123;Gu et al.,Oligonucleotides,2003,13(6),479-489;Wang et
al.,J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505;Verbeure et al.,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947;Wang et al.,J.Org.Chem.,2001,66,8478-82;Wang et al.,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788;Wang et al.,J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602;PCT出願公開WO06/047842;及びPCT出願公開WO01/049687参照;各文献は、その全体を参照により本明細書に援用する)。特定の修飾シクロヘキセニルヌクレオシドは、式Xを有する。
式中、独立して、式Xの当該少なくとも1つのシクロヘキセニルヌクレオシド類似体のそれぞれについて、
Bxは、複素環式塩基部分であり、
T3及びT4は、それぞれ独立して、シクロヘキセニルヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、あるいは、T3及びT4の一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、T3及びT4の他方は、H、ヒドロキシル保護基、結合されたコンジュゲート基または5’もしくは3’末端基であり、
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8及びq9は、それぞれ独立して、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C2~C6アルキニルまたは他の糖置換基である。
Bxは、複素環式塩基部分であり、
T3及びT4は、それぞれ独立して、シクロヘキセニルヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、あるいは、T3及びT4の一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、T3及びT4の他方は、H、ヒドロキシル保護基、結合されたコンジュゲート基または5’もしくは3’末端基であり、
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8及びq9は、それぞれ独立して、H、C1~C6アルキル、置換C1~C6アルキル、C2~C6アルケニル、置換C2~C6アルケニル、C2~C6アルキニル、置換C2~C6アルキニルまたは他の糖置換基である。
多くの他の単環式、二環式及び三環式環系が当該技術分野において知られており、本明細書で提供されるオリゴマー化合物に組み込み、ヌクレオシドを修飾するために使用することができる糖代替物として好適である(例えば、総説論文:Leumann,Christian J.Bioorg.&Med.Chem.,2002,10,841-854参照)。このような環系は、その活性を更に向上させるための様々な追加の置換を受け得る。
本明細書で使用されるとき、「2’-修飾糖」とは、2’位が修飾されたフラノシル糖を意味する。特定の実施形態において、このような修飾には、ハライド、限定するものではないが、置換及び無置換アルコキシ、置換及び無置換チオアルキル、置換及び無置換アミノアルキル、置換及び無置換アルキル、置換及び無置換アリルならびに置換及び無置換アルキニルから選択される置換基が含まれる。特定の実施形態において、2’修飾は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(=O)N(H)CH3、及びO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2(式中、n及びmは、1~約10である)を含むがこれらに限定されない置換基から選択される。他の2’-置換基は、C1~C12アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、アンチセンス化合物の薬物動態特性を改善する基または薬力学特性を改善する基、及び類似の特性を有する他の置換基から選択することもできる。特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、2’-MOE側鎖を含む(Baker et al.,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。このような2’-MOE置換は、非修飾ヌクレオシドならびに2’-O-メチル、O-プロピル及びO-アミノプロピルなどの他の修飾ヌクレオシドと比較して結合親和性を改善することが記載されている。2’-MOE置換基を有する
オリゴヌクレオチドはまた、in vivo使用に有用な特徴を有する、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることが示されている(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504;Altmann et al.,Chimia,1996,50,168-176;Altmann et al.,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637;及びAltmann et al.,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
オリゴヌクレオチドはまた、in vivo使用に有用な特徴を有する、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることが示されている(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504;Altmann et al.,Chimia,1996,50,168-176;Altmann et al.,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637;及びAltmann et al.,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
本明細書で使用されるとき、「2’-修飾」または「2’-置換」は、2’位にHまたはOH以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。2’-修飾ヌクレオシドには、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリル、O-C1~C10アルキル、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2’-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)またはO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)(式中、各Rm及びRnは、独立して、Hまたは置換もしくは無置換C1~C10アルキルである)などの架橋していない2’置換基を含むヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。2’-修飾ヌクレオシドは、他の修飾を、例えば、糖の他の位置及び/または核酸塩基に更に含み得る。
本明細書で使用されるとき、「2’-F」は、糖環の2’位にフルオロ基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
本明細書で使用されるとき、「2’-OMe」または「2’-OCH3」、「2’-O-メチル」または「2’-メトキシ」は、それぞれ糖環の2’位に-OCH3基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
本明細書で使用されるとき、「MOE」または「2’-MOE」または「2’-OCH2CH2OCH3」または「2’-O-メトキシエチル」は、それぞれ糖環の2’位に-OCH2CH2OCH3基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
修飾糖の調製方法は、当業者によく知られている。このような修飾糖の調製について教示するいくつかの代表的な米国特許には、限定するものではないが、米国特許第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,670,633号、同第5,700,920号、同第5,792,847号及び同第6,600,032号ならびに2005年12月22日にWO2005/121371として公開された国際出願PCT/US2005/019219(2005年6月2日出願)が含まれ、これらのそれぞれの全体を参照により援用する。
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」とは、複数の結合されたヌクレオシドを含む化合物を指す。特定の実施形態において、複数のヌクレオシドのうちの1つ以上は、修飾されている。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、1つ以上のリボヌクレオシド(RNA)及び/またはデオキシリボヌクレオシド(DNA)を含む。
修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分(天然、修飾またはこれらの組み合わせ)は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションとのために保持される。
特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、修飾糖部分を有するヌクレオシドを1つ以上含む。特定の実施形態において、修飾糖部分は、2’-MOEである。特定の実施形態において、2’-MOE修飾ヌクレオシドは、ギャップマーモチーフ中に配置される。特定の実施形態において、修飾糖部分は、(4’-CH(CH3)-O-2’)架橋基を有する二環式ヌクレオシドである。特定の実施形態において、(4’-CH(CH3)-O-2’)修飾ヌクレオシドは、ギャップマーモチーフのウイング全体に配置される。
修飾核酸塩基
核酸塩基(または塩基)の修飾または置換は、天然または合成の非修飾核酸塩基と構造的に区別可能であるが、機能的には交換可能である。天然核酸塩基と修飾核酸塩基はどちらも水素結合に関与することができる。このような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与し得る。修飾核酸塩基には、合成及び天然核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)などが含まれる。特定の核酸塩基置換は、5-メチルシトシン置換を含め、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。例えば、5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6~1.2℃増加させることが示されている(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)。
核酸塩基(または塩基)の修飾または置換は、天然または合成の非修飾核酸塩基と構造的に区別可能であるが、機能的には交換可能である。天然核酸塩基と修飾核酸塩基はどちらも水素結合に関与することができる。このような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与し得る。修飾核酸塩基には、合成及び天然核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)などが含まれる。特定の核酸塩基置換は、5-メチルシトシン置換を含め、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。例えば、5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6~1.2℃増加させることが示されている(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)。
更なる非修飾核酸塩基には、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニル(-C≡C-CH3)ウラシル及びシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンが含まれる。
複素環式塩基部分にはまた、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン及び2-ピリドンで置き換えられたものも含まれる。アンチセンス化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用な核酸塩基には、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6及びO-6置換プリン、例えば、2アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシンが含まれる。
特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物は、1つ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたギャップ拡大アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾核酸塩基を含む。特定の実施形態において、修飾核酸塩基のうちの少なくとも1つは、5-メチルシトシンである。特定の実施形態において、各シトシンは、5-メチルシトシンである。
医薬組成物を製するための組成物及び方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤の調製のために、薬学的に
許容される活性物質または不活性物質と混合され得る。医薬組成物を製するための組成物及び方法は、限定するものではないが、投与経路、疾患の程度または投与される用量を含む、多くの基準に依存する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または製剤の調製のために、薬学的に
許容される活性物質または不活性物質と混合され得る。医薬組成物を製するための組成物及び方法は、限定するものではないが、投与経路、疾患の程度または投与される用量を含む、多くの基準に依存する。
AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物は、当該アンチセンス化合物を、好適な薬学的に許容される希釈剤または担体と組み合わせることによって、医薬組成物に利用することができる。薬学的に許容される希釈剤には、水、例えば、注射用水(WFI)が含まれる。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれる。水または生理食塩水は、非経口的に送達される組成物での使用に好適な希釈剤である。したがって、一実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物と、薬学的に許容される希釈剤とを含む医薬組成物が、本明細書に記載される方法において利用される。特定の実施形態において、薬学的に許容される希釈剤は、水または生理食塩水である。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、ヒトを含む動物に投与したときに、生物学的に活性な代謝産物またはその残基を(直接的または間接的に)もたらすことができる、あらゆる薬学的に許容される塩、エステルもしくは当該エステルの塩または任意の他のオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、例えば、本開示はまた、アンチセンス化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、当該プロドラッグの薬学的に許容される塩及び他の生物学的同等物に関する。好適な薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の化合物の「薬学的に許容される塩」は、当該技術分野においてよく知られている方法によって調製することができる。薬学的に許容される塩の概説については、Stahl and Wermuth,Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)を参照されたい。ヒトへの治療用投与には、アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩が有用であり、十分な認容性を示す。したがって、一実施形態において、本明細書に記載の化合物は、ナトリウム塩の形態である。
プロドラッグは、アンチセンス化合物の一端または両端に、体内の内因性ヌクレアーゼによって切断されて活性アンチセンス化合物を形成する、更なるヌクレオシドの組み込みを含み得る。
投薬
特定の実施形態において、医薬組成物は、投薬レジメン(例えば、用量、投与頻度及び継続期間)に従って投与され、投薬レジメンは、所望の効果を達成するように選択され得る。所望の効果は、例えば、AGTの減少またはAGTに関連する疾患、障害もしくは病態の予防、減少、改善もしくは進行遅延であり得る。
特定の実施形態において、医薬組成物は、投薬レジメン(例えば、用量、投与頻度及び継続期間)に従って投与され、投薬レジメンは、所望の効果を達成するように選択され得る。所望の効果は、例えば、AGTの減少またはAGTに関連する疾患、障害もしくは病態の予防、減少、改善もしくは進行遅延であり得る。
特定の実施形態において、投薬レジメンの変数を調整して、対象における医薬組成物の所望の濃度をもたらすようにする。投薬レジメンに関して使用される「医薬組成物の濃度」は、化合物、オリゴヌクレオチド、または医薬組成物の活性成分を指し得る。例えば、特定の実施形態において、所望の効果を達成するのに十分な量の医薬組成物の組織濃度または血漿濃度を得るために、用量及び投与頻度を調整する。
投薬は、治療すべき疾患状態の重症度及び応答性に依存し、その治療クールは数日から数ヶ月、あるいは治癒が達成されるか、疾患状態の軽減が達成されるまで続く。投薬は、
薬効及び代謝にも依存する。特定の実施形態において、用量は、体重1kgあたり0.01μg~100mgまたは0.001mg~1000mgの用量範囲内であり、毎日、毎週、隔週、毎月、3ヶ月毎、半年毎もしくは毎年1回以上、または2~20年毎に1回投与することができる。治療が奏効した後、患者は、疾患状態の再発を防ぐために、維持療法を受けるのが望ましい場合があり、この場合、オリゴヌクレオチドは、体重1kgあたり0.01μg~100mgの範囲または0.001mg~1000mgの用量範囲の維持用量で、毎日1回以上から20年毎に1回、投与される。
薬効及び代謝にも依存する。特定の実施形態において、用量は、体重1kgあたり0.01μg~100mgまたは0.001mg~1000mgの用量範囲内であり、毎日、毎週、隔週、毎月、3ヶ月毎、半年毎もしくは毎年1回以上、または2~20年毎に1回投与することができる。治療が奏効した後、患者は、疾患状態の再発を防ぐために、維持療法を受けるのが望ましい場合があり、この場合、オリゴヌクレオチドは、体重1kgあたり0.01μg~100mgの範囲または0.001mg~1000mgの用量範囲の維持用量で、毎日1回以上から20年毎に1回、投与される。
投与
本発明の化合物または医薬組成物は、局所的または全身的治療が望ましいかに応じて、また治療対象領域に応じて、様々な方法で投与することができる。投与は、吸入(すなわち、肺)、経腸(すなわち、腸溶性)、非経口または局所投与であってよい。
本発明の化合物または医薬組成物は、局所的または全身的治療が望ましいかに応じて、また治療対象領域に応じて、様々な方法で投与することができる。投与は、吸入(すなわち、肺)、経腸(すなわち、腸溶性)、非経口または局所投与であってよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物及び組成物は、非経口投与される。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、眼内、筋肉内、頭蓋内、髄腔内、髄内、室内または腫瘍内の注射または注入が含まれるが、これらに限定されない。非経口投与にはまた、経鼻投与が含まれる。
特定の実施形態において、非経口投与は、注入による。注入は、長期的、または連続的、または短期的、または断続的であり得る。特定の実施形態において、注入薬剤は、ポンプで送達される。
特定の実施形態において、非経口投与は、注射による。注射は、シリンジまたはポンプにより送達することができる。特定の実施形態において、注射は、ボーラス注射である。特定の実施形態において、注射は、組織または器官に直接投与される。
特定の実施形態において、非経口投与用製剤は、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤、例えば、限定するものではないが、浸透増強剤、担体化合物及び他の薬学的に許容される担体または賦形剤も含有し得る無菌水溶液を含み得る。
特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物及び組成物は、経腸投与される。腸内投与には、経口、経粘膜、腸または直腸(例えば、坐剤、浣腸)が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、化合物または組成物の経腸投与用製剤は、限定するものではないが、薬学的担体、賦形剤、散剤または顆粒剤、微粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤を含み得る。粘稠剤、矯味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合もある。特定の実施形態において、経腸製剤は、本明細書で提供される化合物が1つ以上の浸透増強剤、界面活性剤及びキレート化剤とともに投与されるものである。
特定の実施形態において、投与は、経肺投与を含む。特定の実施形態において、経肺投与は、エアロゾル化したオリゴヌクレオチドを吸入によって対象の肺に送達することを含む。エアロゾル化したオリゴヌクレオチドを対象が吸入すると、オリゴヌクレオチドは、肺胞のマクロファージ、好酸球、上皮、血管内皮及び細気管支上皮を含む、正常な肺組織及び炎症性肺組織の両方の細胞に分布する。修飾オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の送達に好適な装置には、標準的なネブライザー装置が含まれるが、これに限定されない。更なる好適な装置には、ドライパウダー吸入器または定量吸入器が含まれる。
特定の実施形態において、医薬組成物は、全身曝露ではなく局所曝露を達成するように投与される。例えば、経肺投与は、最小の全身曝露で、医薬組成物を肺に送達する。
コンジュゲート化アンチセンス化合物
特定の実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物は、1つ以上のコンジュゲート基の共有結合によって修飾される。一般に、コンジュゲート基は、結合されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物の1つ以上の特性、限定するものではないが、薬力学、薬物動態、安定性、結合、吸収、細胞分布、細胞取込み、電荷及びクリアランスなどの特性を変更する。本明細書で使用されるとき、「コンジュゲート基」とは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に結合された原子団を含む特性基(radical group)を意味する。一般に、コンジュゲート基は、結合される化合物の1つ以上の特性、限定するものではないが、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取込み、電荷及び/またはクリアランスなどの特性を変更する。コンジュゲート基は、化学技術分野で日常的に使用されており、コンジュゲート基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に共有結合させるコンジュゲートリンカーを含み得る。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、コンジュゲート基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に共有結合させる切断可能部分を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、コンジュゲート基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に共有結合させるコンジュゲートリンカー及び切断可能部分を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、次の一般式を有する。
特定の実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物は、1つ以上のコンジュゲート基の共有結合によって修飾される。一般に、コンジュゲート基は、結合されるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物の1つ以上の特性、限定するものではないが、薬力学、薬物動態、安定性、結合、吸収、細胞分布、細胞取込み、電荷及びクリアランスなどの特性を変更する。本明細書で使用されるとき、「コンジュゲート基」とは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に結合された原子団を含む特性基(radical group)を意味する。一般に、コンジュゲート基は、結合される化合物の1つ以上の特性、限定するものではないが、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取込み、電荷及び/またはクリアランスなどの特性を変更する。コンジュゲート基は、化学技術分野で日常的に使用されており、コンジュゲート基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に共有結合させるコンジュゲートリンカーを含み得る。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、コンジュゲート基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に共有結合させる切断可能部分を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、コンジュゲート基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に共有結合させるコンジュゲートリンカー及び切断可能部分を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、次の一般式を有する。
式中、nは1~約3であり、nが1であるとき、mは0であり、あるいはnが2または3であるとき、mは1であり、jは1または0であり、kは1または0であり、jとkの合計は少なくとも1である。
特定の実施形態において、nは1であり、jは1であり、kは0である。特定の実施形態において、nは1であり、jは0であり、kは1である。特定の実施形態において、nは1であり、jは1であり、kは1である。特定の実施形態において、nは2であり、jは1であり、kは0である。特定の実施形態において、nは2であり、jは0であり、kは1である。特定の実施形態において、nは2であり、jは1であり、kは1である。特定の実施形態において、nは3であり、jは1であり、kは0である。特定の実施形態において、nは3であり、jは0であり、kは1である。特定の実施形態において、nは3であり、jは1であり、kは1である。
コンジュゲート基は、本明細書において、オリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物への共有結合を形成するための結合を提供する基として示される。特定の実施形態において、オリゴマー化合物の結合点は、3’末端ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態において、オリゴマー化合物の結合点は、3’末端ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドの3’-ヒドロキシル基の3’-酸素原子である。特定の実施形態において、オリゴマー化合物の結合点は、5’末端ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態において、オリゴマー化合物の結合点は、5’末端ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドの5’-ヒドロキシル基の5’-酸素原子である。特定の実施形態において、オリゴマー化合物の結合点は、ヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオシド間結合上の任意の反応性部位である。
本明細書で使用されるとき、「切断可能部分」及び「切断可能な結合」とは、特定の生理学的条件下で***または切断することが可能な切断可能な結合または原子団を意味する。特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能な結合である。特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能な結合を含む。特定の実施形態において、切断可能部分は、原子団である。特定の実施形態において、切断可能部分は、細胞内部またはリソソームなどの細胞内区画内部で選択的に切断される。特定の実施形態において、切断可能部分は、ヌクレアーゼなどの内因性酵素によって選択的に分解される。特定の実施形態において、切断可能部分は、1、2、3、4または4つ以上の切断可能な結合を有する原子団を含む。
特定の実施形態において、コンジュゲート基は、切断可能部分を含む。このような特定の実施形態において、切断可能部分は、オリゴマー化合物をコンジュゲートリンカーに共有結合させる。このような特定の実施形態において、切断可能部分は、オリゴマー化合物を細胞標的化部分に共有結合させる。
特定の実施形態において、切断可能な結合は、アミド、ポリアミド、エステル、エーテル、ホスホジエステルの一方もしくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、ジスルフィドまたはペプチドのうちから選択される。特定の実施形態において、切断可能な結合は、ホスホジエステルの一方のエステルである。特定の実施形態において、切断可能な結合は、ホスホジエステルの一方もしくは両方のエステルである。特定の実施形態において、切断可能部分は、オリゴマー化合物と残りのコンジュゲート基との間のホスホジエステル結合である。特定の実施形態において、切断可能部分は、オリゴマー化合物と残りのコンジュゲート基との間に位置しているホスホジエステル結合を含む。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸またはホスホジエステルを含む。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合のいずれかによってコンジュゲートリンカーに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル結合によってコンジュゲートリンカーに結合される。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、切断可能部分を含まない。
特定の実施形態において、切断可能部分は、切断可能なヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドである。特定の実施形態において、ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドは、プリン、置換プリン、ピリミジンまたは置換ピリミジンから選択される、任意に保護された複素環式塩基を含む。特定の実施形態において、切断可能部分は、ウラシル、チミン、シトシン、4-N-ベンゾイルシトシン、5-メチルシトシン、4-N-ベンゾイル-5-メチル-シトシン、アデニン、6-N-ベンゾイルアデニン、グアニン及び2-N-イソブチリルグアニンから選択されるヌクレオシドである。
特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル結合によってオリゴマー化合物の3’末端または5’末端ヌクレオシドのいずれかに結合され、かつホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合によって残りのコンジュゲート基に共有結合された、2’-デオキシヌクレオシドである。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル結合によってオリゴマー化合物の3’末端または5’末端ヌクレオシドのいずれかに結合され、かつホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合によって残りのコンジュゲート基に共有結合された、2’-デオキシアデノシンである。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル結合によって3’末端ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドの3’-ヒドロキシル基の3’-酸素原子に結合された2’-デオキシアデノシンである。特定の実施形態において、切断可能部分は、ホスホジエステル結合によって5’末端ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドの5’-ヒドロキシル基の5’-酸素原子に結合された2’-デオキシアデノシンである。特定の実施形態において、切断可能部分は、オリゴマー化合物のヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドの2’位に結合される
。
。
本明細書で使用されるとき、コンジュゲート基との関係における「コンジュゲートリンカー」とは、直接的または切断可能部分を介して、細胞標的化部分をオリゴマー化合物に共有結合させる任意の原子または原子団を含む、コンジュゲート基の一部を意味する。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル(-S-)及びヒドロキシルアミノ(-O-N(H)-)から選択される基を含む。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、アルキル基、アミノ基、オキソ基、アミド基及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、アルキル基及びアミド基から選択される基を含む。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、アルキル基及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、少なくとも1つのリン結合基を含む。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、少なくとも1つのホスホジエステル基を含む。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、少なくとも1つの中性結合基を含む。
特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、オリゴマー化合物に共有結合される。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、オリゴマー化合物及び分岐基に共有結合される。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、オリゴマー化合物及び係留リガンドに共有結合される。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、切断可能部分に共有結合される。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、切断可能部分及び分岐基に共有結合される。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、切断可能部分及び係留リガンドに共有結合される。特定の実施形態において、コンジュゲートリンカーは、1つ以上の切断可能な結合を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、コンジュゲートリンカーを含まない。
本明細書で使用されるとき、「分岐基」とは、2つ以上のテザー-リガンド及びコンジュゲート基の残りの部分に対して共有結合を形成することができる少なくとも3つの位置を有する原子団を意味する。一般に、分岐基は、コンジュゲートリンカー及び/または切断可能部分を介して、係留リガンドをオリゴマー化合物に接続するための複数の反応部位を提供する。特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む。特定の実施形態において、分岐基は、アルキル、アミノ、オキソ、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む、分枝状脂肪族基を含む。このような特定の実施形態において、分枝状脂肪族基は、アルキル基、アミノ基、オキソ基、アミド基及びエーテル基から選択される基を含む。このような特定の実施形態において、分枝状脂肪族基は、アルキル基、アミノ基及びエーテル基から選択される基を含む。このような特定の実施形態において、分枝状脂肪族基は、アルキル基及びエーテル基から選択される基を含む。特定の実施形態において、分岐基は、単環式環系または多環式環系を含む。
特定の実施形態において、分岐基は、コンジュゲートリンカーに共有結合される。特定の実施形態において、分岐基は、切断可能部分に共有結合される。特定の実施形態において、分岐基は、コンジュゲートリンカー及び係留リガンドのそれぞれに共有結合される。特定の実施形態において、分岐基は、1つ以上の切断可能な結合を含む。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、分岐基を含まない。
特定の実施形態において、本明細書で提供されるコンジュゲート基は、少なくとも1つの係留リガンドを有する細胞標的化部分を含む。特定の実施形態において、細胞標的化部分は、分岐基に共有結合した2つの係留リガンドを含む。特定の実施形態において、細胞
標的化部分は、分岐基に共有結合した3つの係留リガンドを含む。
標的化部分は、分岐基に共有結合した3つの係留リガンドを含む。
本明細書で使用されるとき、「テザー」とは、リガンドをコンジュゲート基の残りの部分に接続する原子団を意味する。特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル基、置換アルキル基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、オキソ基、アミド基、ホスホジエステル基及びポリエチレングリコール基から選択される1つ以上の基を含む、線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル基、エーテル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アミノ基、オキソ基、アミド基及びポリエチレングリコール基から選択される1つ以上の基を含む、線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル基、置換アルキル基、ホスホジエステル基、エーテル基及びアミノ基、オキソ基、アミド基から選択される1つ以上の基を含む、線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル基、エーテル基及びアミノ基、オキソ基、アミド基から選択される1つ以上の基を含む、線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル基、アミノ基及びオキソ基から選択される1つ以上の基を含む、線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル基及びオキソ基から選択される1つ以上の基を含む、線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、任意の組み合わせで、アルキル及びホスホジエステルから選択される1つ以上の基を含む、線状脂肪族基である。特定の実施形態において、各テザーは、少なくとも1つのリン結合基または中性結合基を含む。
特定の実施形態において、テザーは、1つ以上の切断可能な結合を含む。特定の実施形態において、各係留リガンドは、分岐基に結合される。特定の実施形態において、各係留リガンドは、アミド基を介して分岐基に結合される。特定の実施形態において、各係留リガンドは、エーテル基を介して分岐基に結合される。特定の実施形態において、各係留リガンドは、リン結合基または中性結合基を介して分岐基に結合される。特定の実施形態において、各係留リガンドは、ホスホジエステル基を介して分岐基に結合される。特定の実施形態において、各テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合される。特定の実施形態において、各テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合される。
特定の実施形態において、各テザーは、リガンドと分岐基との間の鎖長が約8~約20個の原子を含む。特定の実施形態において、各テザーは、リガンドと分岐基との間の鎖長が約10~約18個の原子を含む。特定の実施形態において、各テザーは、鎖長が約13個の原子を含む。
特定の実施形態において、本開示は、各リガンドがテザーを介してコンジュゲート基の残りの部分に共有結合しているリガンドを提供する。特定の実施形態において、各リガンドは、標的細胞上の少なくとも1種の受容体に対する親和性を有するように選択される。特定の実施形態において、リガンドは、哺乳動物の肝臓細胞の表面上にある少なくとも1種の受容体に対する親和性を有するものが選択される。特定の実施形態において、肝アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP-R)に対する親和性を有するリガンドが選択される。特定の実施形態において、各リガンドは、炭水化物である。特定の実施形態において、各リガンドは、独立して、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサモン及びフコースから選択される。特定の実施形態において、各リガンドは、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)である。特定の実施形態において、標的化部分は、1~3つのリガンドを含む。特定の実施形態において、標的化部分は、3つのリガンドを含む。特定の実施形態において、標的化部分は、2つのリガンドを含む。特定の実施形態において、標的化部分は、1つのリガンドを含む。特定の実施形態にお
いて、標的化部分は、3つのN-アセチルガラクトサミンリガンドを含む。特定の実施形態において、標的化部分は、2つのN-アセチルガラクトサミンリガンドを含む。特定の実施形態において、標的化部分は、1つのN-アセチルガラクトサミンリガンドを含む。
いて、標的化部分は、3つのN-アセチルガラクトサミンリガンドを含む。特定の実施形態において、標的化部分は、2つのN-アセチルガラクトサミンリガンドを含む。特定の実施形態において、標的化部分は、1つのN-アセチルガラクトサミンリガンドを含む。
特定の実施形態において、各リガンドは、炭水化物、炭水化物誘導体、修飾炭水化物、多価炭水化物クラスター、多糖、修飾多糖または多糖誘導体である。特定の実施形態において、各リガンドは、アミノ糖またはチオ糖である。例えば、アミノ糖は、当該技術分野において知られている多数の化合物、例えば、グルコサミン、シアル酸、α-D-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、2-アセトアミド-2-デオキシ-D-ガラクトピラノース(GalNAc)、2-アミノ-3-O-[(R)-1-カルボキシエチル]-2-デオキシ-β-D-グルコピラノース(β-ムラミン酸)、2-デオキシ-2-メチルアミノ-L-グルコピラノース、4,6-ジデオキシ-4-ホルムアミド-2,3-ジ-O-メチル-D-マンノピラノース、2-デオキシ-2-スルホアミノ-D-グルコピラノース及びN-スルホ-D-グルコサミン及びN-グリコロイル-α-ノイラミン酸から選択され得る。例えば、チオ糖は、5-チオ-β-D-グルコピラノース、メチル2,3,4-トリ-O-アセチル-1-チオ-6-O-トリチル-α-D-グルコピラノシド、4-チオ-β-D-ガラクトピラノース及びエチル3,4,6,7-テトラ-O-アセチル-2-デオキシ-1,5-ジチオ-α-D-グルコ-ヘプトピラノシドからなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、本明細書で提供されるコンジュゲート基は、炭水化物クラスターを含む。本明細書で使用されるとき、「炭水化物クラスター」とは、2つ以上の炭水化物残基がテザー基を介して分岐基に結合されたコンジュゲート基の一部を意味する(例えば、炭水化物コンジュゲートクラスターの例については、Maier et al.,“Synthesis of Antisense Oligonucleotides
Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting,” Bioconjugate Chemistry,2003,(14):18-29(その全体を参照により本明細書に援用する)またはRensen et al.,“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting
of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor,” J.Med.Chem.2004,(47):5798-5808を参照されたい)。
Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting,” Bioconjugate Chemistry,2003,(14):18-29(その全体を参照により本明細書に援用する)またはRensen et al.,“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting
of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor,” J.Med.Chem.2004,(47):5798-5808を参照されたい)。
本明細書で使用されるとき、「修飾炭水化物」とは、天然に生じる炭水化物に対して1つ以上の化学修飾を有する任意の炭水化物を意味する。
本明細書で使用されるとき、「炭水化物誘導体」とは、炭水化物を出発物質または中間体として使用して合成することができる任意の化合物を意味する。
本明細書で使用されるとき、「炭水化物」とは、天然に生じる炭水化物、修飾された炭水化物、または炭水化物誘導体を意味する。
特定の実施形態において、細胞標的化部分が次式を有するコンジュゲート基が提供される。
特定の実施形態において、細胞標的化部分が次式を有するコンジュゲート基が提供される。
特定の実施形態において、細胞標的化部分が次式を有するコンジュゲート基が提供される。
特定の実施形態において、コンジュゲート基は、次式を有する。
特定の実施形態において、上式に示すコンジュゲート基に結合されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1914の核酸塩基配列を有する。
上述したコンジュゲート基、コンジュゲート化オリゴマー化合物、例えば、コンジュゲート基、テザー、コンジュゲートリンカー、分岐基、リガンド、切断可能部分及び他の修飾を含むアンチセンス化合物などのいくつかの調製について教示する、代表的な米国特許、米国特許出願公開及び国際特許出願公開には、限定するものではないが、US5,994,517、US6,300,319、US6,660,720、US6,906,182、US7,262,177、US7,491,805、US8,106,022、US7,723,509、US2006/0148740、US2011/0123520、WO2013/033230、WO2014/179620及びWO2012/037254が含まれ、これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する。
上述したコンジュゲート基、コンジュゲート化オリゴマー化合物、例えば、コンジュゲート基、テザー、コンジュゲートリンカー、分岐基、リガンド、切断可能部分及び他の修飾を含むアンチセンス化合物などのいくつかの調製について教示する、代表的な公開物には、限定するものではないが、BIESSEN et al.,“The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor:a Potent C
holesterol Lowering Agent” J.Med.Chem.(1995)38:1846-1852,BIESSEN et al.,“Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein
Receptor” J.Med.Chem.(1995)38:1538-1546,LEE et al.,“New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes” Bioorganic&Medicinal Chemistry(2011)19:2494-2500,RENSEN et al.,“Determination of
the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo” J.Biol.Chem.(2001)276(40):37577-37584,RENSEN et al.,“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor” J.Med.Chem.(2004)47:5798-5808,SLIEDREGT et al.,“Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor” J.Med.Chem.(1999)42:609-618及びValentijn et al.,“Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor” Tetrahedron,1997,53(2),759-770が含まれ、これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する。
holesterol Lowering Agent” J.Med.Chem.(1995)38:1846-1852,BIESSEN et al.,“Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein
Receptor” J.Med.Chem.(1995)38:1538-1546,LEE et al.,“New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes” Bioorganic&Medicinal Chemistry(2011)19:2494-2500,RENSEN et al.,“Determination of
the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo” J.Biol.Chem.(2001)276(40):37577-37584,RENSEN et al.,“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor” J.Med.Chem.(2004)47:5798-5808,SLIEDREGT et al.,“Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor” J.Med.Chem.(1999)42:609-618及びValentijn et al.,“Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor” Tetrahedron,1997,53(2),759-770が含まれ、これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する。
特定の実施形態において、コンジュゲート基には、限定するものではないが、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素が含まれる。特定のコンジュゲート基については、これまでに記載されており、例えば、コレステロール部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、コール酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharan et
al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309;Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10,1111-1118;Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259,327-330;Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49-54)、リン脂質、例えば、ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネ-
ト(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654;Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)がある。
al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309;Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20,533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基もしくはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10,1111-1118;Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259,327-330;Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49-54)、リン脂質、例えば、ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネ-
ト(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654;Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)がある。
特定の実施形態において、コンジュゲート基は、有効な薬剤物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツール酸系薬、セファロスポリン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗菌性物質または抗生物質を含む。
コンジュゲートリンカーのいくつかの非限定的な例には、ピロリジン、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(ADO)、4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸スクシンイミジル(SMCC)及び6-アミノヘキサン酸(AHEXまたはAHA)が挙げられる。他のコンジュゲートリンカーには、限定するものではないが、置換C1~C10アルキル、置換もしくは無置換C2~C10アルケニル、または置換もしくは無置換C2~C10アルキニルが含まれ、ここで、好ましい置換基の非限定的なリストには、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが含まれる。
コンジュゲート基は、オリゴヌクレオチドの一末端もしくは両末端に結合され得(末端コンジュゲート基)、かつ/または任意の内側の位置に結合され得る。
特定の実施形態において、コンジュゲート基は、オリゴマー化合物のオリゴヌクレオチドの3’末端にある。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、3’末端近傍にある。特定の実施形態において、コンジュゲートは、オリゴマー化合物の3’末端であるが、1つ以上の末端基ヌクレオシドの前に結合される。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、末端基内に位置する。
特定の実施形態において、コンジュゲート基は、オリゴマー化合物のオリゴヌクレオチドの5’末端にある。特定の実施形態において、コンジュゲート基は、5’末端近傍にある。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるAGTを標的にする修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲート基を更に含む。特定の実施形態において、GalNAcコンジュゲート基は、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3である。特定の実施形態において、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートは、次式を有する。
特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
細胞培養及びアンチセンス化合物処理
アンチセンス化合物のAGT核酸のレベル、活性または発現に対する作用は、様々な細胞種においてin vitroで試験することができる。このような分析に使用される細胞種は、供給業者(例えば、American Type Culture Collection,Manassas,VA;Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC;Clonetics Corporation,Walkersville,MD)から入手可能であり、供給業者の説明書に従って市販の試薬(例えば、Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用して細胞を培養する。例示的な細胞種には、HepG2細胞、Hep3B細胞、Huh7(肝細胞癌)細胞、初代肝細胞、A549細胞、GM04281線維芽細胞及びLLC-MK2細胞が含まれるが、これらに限定されない。
アンチセンス化合物のAGT核酸のレベル、活性または発現に対する作用は、様々な細胞種においてin vitroで試験することができる。このような分析に使用される細胞種は、供給業者(例えば、American Type Culture Collection,Manassas,VA;Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC;Clonetics Corporation,Walkersville,MD)から入手可能であり、供給業者の説明書に従って市販の試薬(例えば、Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用して細胞を培養する。例示的な細胞種には、HepG2細胞、Hep3B細胞、Huh7(肝細胞癌)細胞、初代肝細胞、A549細胞、GM04281線維芽細胞及びLLC-MK2細胞が含まれるが、これらに限定されない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vitro試験
ここでは、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理するための方法について記載する。この方法は、他のアンチセンス化合物による処理のために適宜変更され得る。
ここでは、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理するための方法について記載する。この方法は、他のアンチセンス化合物による処理のために適宜変更され得る。
一般に、培養中の細胞が約60~80%コンフルエントに達したときに、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために一般に使用される試薬の1つには、カチオン性脂質トランスフェクション試薬LIPOFECTIN(登録商標)(Invitrogen(Carlsbad,CA))が含まれる。OPTI-MEM(登録商標)1(Invitrogen(Carlsbad,CA))中でアンチセンスオリゴヌクレオチドをLIPOFECTIN(登録商標)と混合し、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド最終濃度及び典型的に100nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき2~12ug/mLの範囲であるLIPOFECTIN(登録商標)濃度を得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用される別の試薬には、LIPOFECTAMINE2000(登録商標)(Invitrogen(Carlsbad,CA))が含まれる。OPTI-MEM(登録商標)1低血清培地(Invitrogen(Carlsbad,CA))中でアンチセンスオリゴヌクレオチドをLIPOFECTAMINE2000(登録商標)と混合し、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド最終濃度及び典型的に100nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき2
~12ug/mLの範囲であるLIPOFECTAMINE2000(登録商標)濃度を得る。
~12ug/mLの範囲であるLIPOFECTAMINE2000(登録商標)濃度を得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用される別の試薬には、Cytofectin(登録商標)(Invitrogen(Carlsbad,CA))が含まれる。OPTI-MEM(登録商標)1低血清培地(Invitrogen(Carlsbad,CA))中でアンチセンスオリゴヌクレオチドをCytofectin(登録商標)と混合し、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド最終濃度及び典型的に100nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき2~12ug/mLの範囲であるCytofectin(登録商標)濃度を得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用される別の試薬には、Oligofectamine(商標)(Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA))が含まれる。Opti-MEM(登録商標)1低血清培地(Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA))中でアンチセンスオリゴヌクレオチドをOligofectamine(商標)と混合し、Oligofectamine(商標)のオリゴヌクレオチドに対する比が100nMにつき約0.2~0.8μLとなる、所望のオリゴヌクレオチド濃度を得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用される別の試薬には、FuGENE6(Roche Diagnostics Corp.(Indianapolis,IN))が含まれる。1mLの無血清RPMI中でアンチセンスオリゴマー化合物をFuGENE6と混合し、FuGENE6のオリゴマー化合物に対する比が100nMにつき1~4μLのFuGENE6となる、所望のオリゴヌクレオチド濃度を得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞中に導入するために使用される別の技法には、エレクトロポレーションが含まれる(Sambrook and Russell in Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Third Edition.Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.2001)。
細胞を常法によってアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理から16~24時間後に細胞を回収し、この時点で標的核酸のRNAまたはタンパク質レベルを当該技術分野において周知の方法及び本明細書に記載される方法によって測定する(Sambrook and Russell in Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Third Edition.Cold Spring Harbor laboratory
Press,Cold Spring Harbor,New York.2001)。一般に、処理を複数の反復試験で実施する場合、データは、反復処理の平均として表す。
Press,Cold Spring Harbor,New York.2001)。一般に、処理を複数の反復試験で実施する場合、データは、反復処理の平均として表す。
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに異なる。特定の細胞株に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの至適濃度を決定する方法は、当該技術分野においてよく知られている(Sambrook and Russell in Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Third Edition.Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York.2001)。
LIPOFECTAMINE2000(登録商標)、LipofectinまたはCytofectinを用いてトランスフェクトした場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に、1nM~300nMの範囲の濃度で使用される。エレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、625~20,000nMの範囲のより高い濃度で使用される。
LIPOFECTAMINE2000(登録商標)、LipofectinまたはCytofectinを用いてトランスフェクトした場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に、1nM~300nMの範囲の濃度で使用される。エレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、625~20,000nMの範囲のより高い濃度で使用される。
RNA単離
RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAに関して実施することができる。RNA単離法は、当該技術分野においてよく知られている(Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,3rd Ed.,2001)。RNAは、当該技術分野においてよく知られている方法を使用して、例えば、TRIZOL(登録商標)試薬(Invitrogen(Carlsbad,CA))を使用して、製造元の推奨プロトコルに従って、調製される。
RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAに関して実施することができる。RNA単離法は、当該技術分野においてよく知られている(Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,3rd Ed.,2001)。RNAは、当該技術分野においてよく知られている方法を使用して、例えば、TRIZOL(登録商標)試薬(Invitrogen(Carlsbad,CA))を使用して、製造元の推奨プロトコルに従って、調製される。
標的レベルまたは発現の阻害に関する分析
AGT核酸のレベルまたは発現の阻害は、当該技術分野において周知の様々な方法でアッセイすることができる(Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,2001)。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または定量リアルタイムPCRによって定量することができる。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAに関して実施することができる。RNA単離法は、当該技術分野においてよく知られている。ノーザンブロット分析も当該技術分野において常法である。定量リアルタイムPCRは、市販のABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900 Sequence Detection
System(PE-Applied Biosystems(Foster City,CA)から入手可能)を使用し、製造元の説明書に従って使用することにより、簡便に実施することができる。
AGT核酸のレベルまたは発現の阻害は、当該技術分野において周知の様々な方法でアッセイすることができる(Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,2001)。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または定量リアルタイムPCRによって定量することができる。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+mRNAに関して実施することができる。RNA単離法は、当該技術分野においてよく知られている。ノーザンブロット分析も当該技術分野において常法である。定量リアルタイムPCRは、市販のABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900 Sequence Detection
System(PE-Applied Biosystems(Foster City,CA)から入手可能)を使用し、製造元の説明書に従って使用することにより、簡便に実施することができる。
標的RNAレベルの定量リアルタイムPCR分析
標的RNAレベルの定量は、定量リアルタイムPCRにより、ABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems(Foster City,CA))を製造元の説明書に従って使用して、実施することができる。定量リアルタイムPCR法は、当該技術分野においてよく知られている。
標的RNAレベルの定量は、定量リアルタイムPCRにより、ABI PRISM(登録商標)7600、7700または7900 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems(Foster City,CA))を製造元の説明書に従って使用して、実施することができる。定量リアルタイムPCR法は、当該技術分野においてよく知られている。
リアルタイムPCRの前に、単離したRNAを逆転写酵素(RT)反応に供して、相補的DNA(cDNA)を生成し、次いで、これをリアルタイムPCR増幅の基質として使用する。RT及びリアルタイムPCR反応は、同じサンプルウェルで順次実施される。RT及びリアルタイムPCRの試薬は、Invitrogen(Carlsbad,CA)から得られる。RT、リアルタイムPCRの反応は、当業者によく知られている方法によって実施する。
リアルタイムPCRによって得られた遺伝子(またはRNA)標的の量は、シクロフィリンAなどの発現が一定である遺伝子の発現レベルを使用して正規化するか、RIBOGREEN(登録商標)(Invitrogen,Inc.(Carlsbad,CA))を使用して全RNAを定量することによって正規化する。シクロフィリンA発現は、リアルタイムPCRにより、標的と同時に、マルチプレックスに、または別個に実施することによって定量する。全RNAは、RIBOGREEN(登録商標)RNA定量試薬(Invitrogen,Inc(Eugene,OR))を使用して定量する。RIBOGR
EEN(登録商標)によるRNA定量法は、Jones,L.J.ら(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)に教示されている。CYTOFLUOR(登録商標)4000機器(PE Applied Biosystems)を使用してRIBOGREEN(登録商標)蛍光を測定する。
EEN(登録商標)によるRNA定量法は、Jones,L.J.ら(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)に教示されている。CYTOFLUOR(登録商標)4000機器(PE Applied Biosystems)を使用してRIBOGREEN(登録商標)蛍光を測定する。
プローブ及びプライマーは、AGT核酸にハイブリダイズするように設計する。リアルタイムPCRのプローブ及びプライマーの設計法は、当該技術分野においてよく知られており、PRIMER EXPRESS(登録商標)ソフトウェア(Applied Biosystems(Foster City,CA))などのソフトウェアの使用を含み得る。
タンパク質レベルの分析
AGT核酸のアンチセンス阻害は、AGTタンパク質レベルを測定することによって評価することができる。AGTのタンパク質レベルは、当該技術分野においてよく知られている様々な方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析(免疫ブロット法)、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、定量タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ(例えば、カスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学法、免疫細胞化学法または蛍光標識細胞分取法(FACS)で評価または定量することができる(Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,2001)。標的に対する抗体は、種々の市販供給源から特定及び入手することもできるし、当該技術分野においてよく知られている従来のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体作製法によって調製することもできる。
AGT核酸のアンチセンス阻害は、AGTタンパク質レベルを測定することによって評価することができる。AGTのタンパク質レベルは、当該技術分野においてよく知られている様々な方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析(免疫ブロット法)、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、定量タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ(例えば、カスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学法、免疫細胞化学法または蛍光標識細胞分取法(FACS)で評価または定量することができる(Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,2001)。標的に対する抗体は、種々の市販供給源から特定及び入手することもできるし、当該技術分野においてよく知られている従来のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体作製法によって調製することもできる。
アンチセンス化合物のin vivo試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、AGTの発現を阻害する能力及び体内における高血圧の軽減などの表現型に変化をもたらす能力を評価するために動物で試験される。試験は、正常な動物または実験疾患モデルで実施することができる。動物に投与するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、滅菌注射用水またはリン酸緩衝生理食塩水などの薬学的に許容される希釈剤で製剤化される。投与には、腹腔内、静脈内及び皮下などの非経口投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの用量及び投与頻度の算出は、投与経路及び動物の体重などの因子によって決まる。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置期間後、肝臓組織からRNAを単離し、AGT核酸発現における変化を測定する。AGTタンパク質レベルの変化は、直接測定することができる。AGT発現の変化は、RAAS経路の阻害レベルを決定することによって測定することもできる。AGT阻害のレベルを決定するためのマーカーとして、RAAS経路関連疾患、障害及び/または病態を使用することができる。
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、AGTの発現を阻害する能力及び体内における高血圧の軽減などの表現型に変化をもたらす能力を評価するために動物で試験される。試験は、正常な動物または実験疾患モデルで実施することができる。動物に投与するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、滅菌注射用水またはリン酸緩衝生理食塩水などの薬学的に許容される希釈剤で製剤化される。投与には、腹腔内、静脈内及び皮下などの非経口投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの用量及び投与頻度の算出は、投与経路及び動物の体重などの因子によって決まる。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置期間後、肝臓組織からRNAを単離し、AGT核酸発現における変化を測定する。AGTタンパク質レベルの変化は、直接測定することができる。AGT発現の変化は、RAAS経路の阻害レベルを決定することによって測定することもできる。AGT阻害のレベルを決定するためのマーカーとして、RAAS経路関連疾患、障害及び/または病態を使用することができる。
特定の適応
本発明の特定の実施形態は、化合物、組成物、ならびに当該化合物及び組成物を使用してAGTレベルを減少させる方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、化合物、組成物、ならびに当該化合物または組成物の治療上有効な量を対象に投与することを含む、当該化合物及び組成物を使用して対象を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、RAAS経路関連疾患、障害または病態を有するか、そのリスクがある。特定の実施形態において、化合物または組成物は、アンチセンス化合物を含む。
本発明の特定の実施形態は、化合物、組成物、ならびに当該化合物及び組成物を使用してAGTレベルを減少させる方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、化合物、組成物、ならびに当該化合物または組成物の治療上有効な量を対象に投与することを含む、当該化合物及び組成物を使用して対象を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、RAAS経路関連疾患、障害または病態を有するか、そのリスクがある。特定の実施形態において、化合物または組成物は、アンチセンス化合物を含む。
特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の治療上有効な量の投与は、対象の血清または組織中AGTレベルをモニターして、アンチセンス化合物に対する対象の応答を決定することを伴う。アンチセンス化合物の投与に対する対象の応答を使用して、医師は、治療介入の量及び継続期間を決定する。
特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与は、少なくとも15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%もしくは100%またはこれらの値のうちのいずれか2つによって定義される範囲のAGT発現の減少をもたらす。特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与は、少なくとも15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%もしくは100%またはこれらの値のうちのいずれか2つによって定義される範囲のRAAS経路の阻害をもたらす。特定の実施形態において、AGT核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物の投与は、RAAS経路関連疾患、障害、病態、症状またはマーカー(例えば、高血圧または器官障害)の変化をもたらす。特定の実施形態において、AGTアンチセンス化合物の投与は、少なくとも15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%もしくは100%またはこれらの値のうちのいずれか2つによって定義される範囲の分、RAAS関連疾患、障害、病態、症状またはマーカーを増大または低減させる。
特定の実施形態において、AGTに対して標的化されたアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、AGTレベルを減少させるための薬剤の調製に使用される。特定の実施形態において、AGTに対して標的化されたアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、RAAS関連疾患、障害もしくは病態を患う患者、またはそれらに罹りやすい患者を治療するための薬剤の調製に使用される。
特定の実施形態において、対象におけるAGTレベルの減少は、疾患、病態または障害の治療、改善、予防、進行の遅延または発症の遅延をもたらす。特定の実施形態において、疾患、病態または障害は、寿命短縮、高血圧、高血圧緊急症(すなわち、悪性高血圧)、腎疾患(例えば、慢性腎疾患、多発性嚢胞腎疾患)、子癇前症、マルファン症候群、脳卒中、心疾患(例えば、心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、心臓弁膜症)、血管の動脈瘤、腹部動脈瘤、末梢動脈疾患、器官障害、肺動脈高血圧、肥満、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)ならびにRAAS関連疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状である。特定の実施形態において、高血圧は、非治療抵抗性高血圧または治療抵抗性高血圧である。特定の実施形態において、血管の動脈瘤は、大動脈瘤である。特定の実施形態において、器官障害は、心筋肥大または器官もしくは組織の線維症である。特定の実施形態において、器官は、心臓、肝臓または腎臓であり、組織は、心臓、肝臓または腎臓に由来する。
特定の実施形態において、対象におけるAGTレベルの減少は、RAAS経路関連疾患、障害または病態の治療、改善、予防、進行の遅延または発症の遅延をもたらす。特定の実施形態において、RAAS経路関連疾患、障害または病態は、寿命短縮、高血圧、高血圧緊急症(すなわち、悪性高血圧)、腎疾患(例えば、慢性腎疾患、多発性嚢胞腎疾患)、子癇前症、マルファン症候群、脳卒中、心疾患(例えば、心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、心臓弁膜症)、血管の動脈瘤、腹部動脈瘤、末梢動脈疾患、器官障害、肺動脈高血圧、肥満、メタボリックシンドローム、NASH、NAFLDならびに他のRAAS関連疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状である。特定の実施形態において、高血圧は、非治療抵抗性高血圧または治療抵抗性高血圧である。特定の実施形態において、血管の動脈瘤は、大動脈瘤である。特定の実施形態において、器官障害は、心筋肥大または器官もしくは組織の線維症である。特定の実施形態において、器官は、心臓、肝臓または腎臓であり、組織は、心臓、肝臓または腎臓に由来する。
特定の実施形態において、疾患、障害及び/または病態の症状またはマーカーを調節するための化合物、組成物及び方法が提供される。特定の実施形態において、マーカーは、
寿命短縮、高血圧、高血圧緊急症(すなわち、悪性高血圧)、腎疾患(例えば、慢性腎疾患、多発性嚢胞腎疾患)、子癇前症、マルファン症候群、脳卒中、心疾患(例えば、心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、心臓弁膜症)、血管の動脈瘤、腹部動脈瘤、末梢動脈疾患、器官障害ならびに他のRAAS関連疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状のうちの1つ以上から選択することができる。
寿命短縮、高血圧、高血圧緊急症(すなわち、悪性高血圧)、腎疾患(例えば、慢性腎疾患、多発性嚢胞腎疾患)、子癇前症、マルファン症候群、脳卒中、心疾患(例えば、心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、心臓弁膜症)、血管の動脈瘤、腹部動脈瘤、末梢動脈疾患、器官障害ならびに他のRAAS関連疾患、障害及び/もしくは病態またはその症状のうちの1つ以上から選択することができる。
特定の併用療法
特定の実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンス化合物を含む第1の剤は、1つ以上の第2の剤と共投与される。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである。
特定の実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンス化合物を含む第1の剤は、1つ以上の第2の剤と共投与される。特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである。
特定の実施形態において、かかる第2の剤は、本明細書に記載される第1の剤と同じRAAS経路関連疾患、障害または病態を治療するように設計される。特定の実施形態において、かかる第2の剤は、本明細書に記載される第1の剤と異なる疾患、障害または病態を治療するように設計される。特定の実施形態において、かかる第2の剤は、本明細書に記載される1つ以上の医薬組成物の好ましくない副作用を治療するように設計される。特定の実施形態において、かかる第1の剤は、第2の剤の好ましくない副作用を治療するように設計される。特定の実施形態において、第2の剤は、第1の剤の好ましくない副作用を治療するために、第1の剤と共投与される。特定の実施形態において、第2の剤は、第1の剤と共投与されて、併用または相加効果をもたらす。特定の実施形態において、第2の剤は、第1の剤と共投与されて、相乗効果をもたらす。
特定の実施形態において、第1の剤と第2の剤の共投与は、これらの剤を独立した療法として投与する場合にその治療効果または予防効果を達成するのに必要な用量よりも低い用量での使用を可能にする。特定の実施形態において、共投与される第2の剤の用量は、第2の剤が単独で投与される場合に投与される用量と同じである。特定の実施形態において、共投与される第2の剤の用量は、第2の剤が単独で投与される場合に投与される用量よりも多い。
特定の実施形態において、第1の剤及び1つ以上の第2の剤は、同時に投与される。特定の実施形態において、第1の剤及び1つ以上の第2の剤は、異なる時間に投与される。特定の実施形態において、第1の剤及び1つ以上の第2の剤は、単一の医薬製剤中に一緒に調製される。特定の実施形態において、第1の剤及び1つ以上の第2の剤は、個別に調製される。
特定の実施形態において、第2の剤には、特定の高血圧を軽減させるための処置、食生活の改善、生活習慣の改善、抗線維化薬及び抗高血圧薬、例えば、RAAS阻害薬、エンドセリン受容体拮抗薬、ネプリライシン阻害薬、利尿薬、カルシウムチャネル拮抗薬、交感神経受容体遮断薬、交感神経作動薬及び血管拡張薬が含まれるが、これらに限定されない。
高血圧を軽減させることができる処置の例には、腎デナベーション及び圧受容器活性化療法が挙げられるが、これらに限定されない。
RASまたはRAAS阻害薬の例には、ACE阻害薬(例えば、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル及びベナゼプリル)、アンジオテンシンII受容体拮抗薬(例えば、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン及びバルサルタン)、レニン阻害薬(例えば、アリスキレン)、アルドステロン受容
体拮抗薬(例えば、エプレレノン、スピロノラクトン及びフィネレノン)が挙げられるが、これらに限定されない。
体拮抗薬(例えば、エプレレノン、スピロノラクトン及びフィネレノン)が挙げられるが、これらに限定されない。
エンドセリン受容体拮抗薬の例には、アンブリセンタン、シタキセンタン、アトラセンタン、BQ-123、ジボテンタン、ボセンタン、マシテンタン及びテゾセンタンが挙げられる。
ネプリライシン阻害薬の例にはサクビトリル及びオマパトリラトが挙げられる。
利尿薬の例には、ループ利尿薬(例えば、ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、トラセミド)、チアジド利尿薬(例えば、エピチジド、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド及びベンドロフルメチアジド)、チアジド様利尿薬(例えば、インダパミド、クロルタリドン及びメトラゾン)及びカリウム保持性利尿薬(例えば、アミロライド、トリアムテレン及びスピロノラクトン)が挙げられる。
カルシウムチャネル拮抗薬の例には、ジヒドロピリジン(例えば、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン及びニトレンジピン)及び非ジヒドロピリジン(例えば、ジルチアゼム及びベラパミル)が挙げられる。
交感神経受容体遮断薬の例には、ベータ遮断薬(例えば、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール及びチモロール)、アルファ遮断薬(例えば、ドキサゾシン、フェントラミン、インドラミン、フェノキシベンザミン、プラゾシン、テラゾシン及びトラゾリン)及びアルファ+ベータ混合遮断薬(例えば、ブシンドロール、カルベジロール及びラベタロール)が挙げられる。
血管拡張薬の例には、ニトロプルシドナトリウム及びヒドララジンならびにその誘導体が挙げられる。交感神経作動薬の例には、α-2作動薬(例えば、クロニジン、グアナベンズ、メチルドパ及びモキソニジン)が挙げられる。抗高血圧薬の更なる例には、グアネチジン、レセルピンなどが挙げられる。
第2の剤は、高血圧、器官障害などの疾患、障害及び/または病態を軽減するために、本明細書に記載される治療用化合物と組み合わせて使用することができる。
特定の化合物
ヒトの治療法としての使用を改善する有益な特性を有する好ましいアンチセンス化合物が本明細書の実施例において示される。簡潔性のため、好ましいアンチセンス化合物の選択に寄与する試験のみ記載する。参照を容易にするために、実施例の限定的な要約を以下に提供する。
ヒトの治療法としての使用を改善する有益な特性を有する好ましいアンチセンス化合物が本明細書の実施例において示される。簡潔性のため、好ましいアンチセンス化合物の選択に寄与する試験のみ記載する。参照を容易にするために、実施例の限定的な要約を以下に提供する。
ヒトAGTを標的にするMOE含有及び/またはcEt含有ギャップマーモチーフを含むアンチセンス化合物を2000以上設計した。実施例1は、HepG2細胞で試験した2000以上の強力なアンチセンス化合物のヒトAGT mRNAに対する効果に関する代表的な単回投与阻害データを示す。
in vitro単回投与で試験した2000以上のアンチセンス化合物のうち、用量依存的阻害試験で試験するために、160を超えるアンチセンス化合物を選択して、HepG2細胞における50%阻害濃度(IC50)を決定した(実施例2)。
in vitro用量反応試験に基づいて、実施例3の例示的試験に記載されるように
、ヒトAGTトランスジェニック(huAGT tg)マウスにおける単回投与での効力及び忍容性の試験について、50以上のアンチセンス化合物を選択した。50以上のアンチセンス化合物のうち、huAGT tgマウスにおける用量反応及び忍容性試験のために、約14のアンチセンス化合物を更に選択した(実施例4)。
、ヒトAGTトランスジェニック(huAGT tg)マウスにおける単回投与での効力及び忍容性の試験について、50以上のアンチセンス化合物を選択した。50以上のアンチセンス化合物のうち、huAGT tgマウスにおける用量反応及び忍容性試験のために、約14のアンチセンス化合物を更に選択した(実施例4)。
huAGTマウスにおいて著しい効力及び忍容性を呈した9つのアンチセンス化合物を、更なる試験:粘度アッセイ(実施例5);アンチセンス化合物の忍容性を評価するためのCD1マウス(実施例6)及びスプラーグドーリーラット(実施例7)での試験;サルAGTを阻害する異種間効力を試験するためのサル肝細胞での試験(実施例8);ならびに効力及び忍容性を評価するためのカニクイザルでの試験(実施例9)について選択した。実施例9に記載の試験におけるアンチセンス化合物は、カニクイザルで試験したが、カニクイザルAGT配列がアンチセンス化合物の配列との比較に利用できなかったため、アンチセンス化合物の配列は、近縁のアカゲザルの配列と比較した(実施例8)。
9つのアンチセンス化合物の広範な特性評価に基づいて、アンチセンス化合物ISIS654472(親化合物)の配列を更なる試験に選択した(実施例10)。親化合物ISIS654472の配列を有するが、異なる化学修飾及びGalNAcコンジュゲートを有する、6つのアンチセンス化合物を設計した。新しく設計した6つの化合物をCD1マウス(実施例10)及びスプラーグドーリーラット(実施例11)に投与して、これらの動物モデルにおける忍容性を試験した。6つのGalNAcコンジュゲート化アンチセンス化合物のうち、化合物ISIS757456を選択してhuAGTマウスで試験し、親アンチセンス化合物ISIS654472と比較した。ISIS757456は、非コンジュゲート化化合物ISIS654472と比較して、8倍の効力改善を示した。
したがって、治療薬としての使用に有益な任意の特徴を1つ以上有するアンチセンス化合物が本明細書で提供される。特定の実施形態において、配列番号1~6のいずれかから選択されるヌクレオチドの領域に対して標的化され、または当該領域に特異的にハイブリダイズすることができる本明細書に記載の修飾オリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス化合物が本明細書で提供される。
特定の実施形態において、本明細書に記載される特定のアンチセンス化合物は、AGT発現を阻害する効力があることから、有効である。特定の実施形態において、化合物または組成物は、AGTを少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%阻害する。
特定の実施形態において、本明細書に記載される特定のアンチセンス化合物は、ヒト細胞、例えば、Hep3B細胞株で試験したとき、in vitroでのIC50が20μM未満、10μM未満、8μM未満、5μM未満、2μM未満、1μM未満、0.9μM未満、0.8μM未満、0.7μM未満、0.6μM未満または0.5μM未満であることから、有効的である(実施例2に記載するとおり)。
特定の実施形態において、本明細書に記載される特定のアンチセンス化合物は、実施例4に示すように、in vivoでの50%有効量(ED50)が≦10mpk/週、≦9mpk/週、≦8mpk/週、≦7mpk/週、≦6mpk/週、≦5mpk/週、≦4mpk/週、≦3mpk/週、≦2mpk/週または≦1mpk/週であることから、有効的である。特定の実施形態において、好ましいアンチセンス化合物、例えば、アンチセンス化合物ISIS757456は、実施例12に示すように、≦3mpk/週のED50を有する。
特定の実施形態において、本明細書に記載される特定のアンチセンス化合物は、実施例5に記載されるように、40cP未満、35cP未満、30cP未満、25cP未満、20cP未満、15cP未満または12cP未満の粘度を有することから、有効である。40cPを超える粘度を有するオリゴヌクレオチドは、至適粘度とは言えない。
特定の実施形態において、本明細書に記載される特定のアンチセンス化合物は、実施例に記載のin vivo忍容性測定によって実証されるように、忍容性が高い。特定の実施形態において、本明細書に記載される特定のアンチセンス化合物は、生理食塩水で処置された動物に対して、3倍、2倍または1.5倍以下のALT値及び/またはAST値の増加を有することによって実証されるように、忍容性が高い。
特定の実施形態において、本明細書に記載される特定のアンチセンス化合物は、トランスジェニックマウスにおける50%より大きい阻害効力、≦5mpk/週のED50、40cP未満の粘度、ならびにALT及び/またはASTの3倍以下の増加のうちの1つ以上を有することから、有効である。
特定の実施形態において、ISIS757456(配列番号1914)が好ましい。この化合物は、AGTトランスジェニックマウスにおいて強力な阻害物質であり、CD-1マウスにおいて非常に忍容性のあるアンチセンス化合物であることが判明した。マウスでは、生理食塩水で処置された動物に対して、ALT及び/またはASTレベルが3倍以下の増加であった。huAGTトランスジェニックマウスにおけるED50は、≦3mpk/週であった。
非限定的な開示と参照による援用
本明細書に記載される特定の化合物、組成物及び方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を例示するためにのみ提供するものであり、同化合物を限定するものではない。本出願で言及される参照文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書に記載される特定の化合物、組成物及び方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を例示するためにのみ提供するものであり、同化合物を限定するものではない。本出願で言及される参照文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
実施例1:HepG2細胞におけるヒトアンジオテンシノーゲン(AGT)のアンチセンス阻害
ヒトAGT核酸を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを2000以上設計し、そのin vitroでのAGT mRNAに対する効果について、類似の培養条件を有する一連の実験で試験した。代表的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの結果を以下の表に示す。
ヒトAGT核酸を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを2000以上設計し、そのin vitroでのAGT mRNAに対する効果について、類似の培養条件を有する一連の実験で試験した。代表的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの結果を以下の表に示す。
以下の表中の新しく設計されたキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、MOE及び/またはcEt含有ギャップマーとして設計した。MOE含有オリゴヌクレオチドは、2’-デオキシヌクレオシドを含む中央ギャップセグメントを有し、中央ギャップセグメントには、5’方向及び3’方向にウイングセグメントが配されている。5’ウイングセグメント中の少なくとも1つのヌクレオシド及び/または3’ウイングセグメント中の1つのヌクレオシドが2’-MOE糖修飾を有する。cEt含有オリゴヌクレオチドは、2’-デオキシヌクレオシドを含む中央ギャップセグメントを有し、中央ギャップセグメントには、5’方向及び3’方向にウイングセグメントが配されている。5’ウイングセグメント中の少なくとも1つのヌクレオシド及び/または3’ウイングセグメント中の1つのヌクレオシドがcEt糖修飾を有する。いくつかの場合、MOEとcEtの両方を含有するようにオリゴヌクレオチドを設計した。MOE及びcEt含有オリゴヌクレオチドは、2’-デオキシヌクレオシドを含む中央ギャップセグメントを有し、中央ギャップセグメ
ントには、5’方向及び3’方向にウイングセグメントが配されている。5’ウイングセグメント中の少なくとも1つのヌクレオシド及び/または3’ウイングセグメント中の1つのヌクレオシドがMOE及び/またはcEt糖修飾を有する。
ントには、5’方向及び3’方向にウイングセグメントが配されている。5’ウイングセグメント中の少なくとも1つのヌクレオシド及び/または3’ウイングセグメント中の1つのヌクレオシドがMOE及び/またはcEt糖修飾を有する。
「化学的構造」の欄は、各オリゴヌクレオチドの糖修飾について記載する。「k」は、cEt糖修飾を示し、「d」は、デオキシリボースを示し、「e」は、MOE修飾を示す。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。各ギャップマー中の全てのシトシン残基は、5-メチルシトシンである。
「開始部位」は、ギャップマーが標的にするヒト遺伝子配列中の最も5’側のヌクレオシドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的にするヒト遺伝子配列中の最も3’側のヌクレオシドを示す。以下の表に示される各ギャップマーは、本明細書において配列番号1として示されるヒトAGT mRNA(GENBANKアクセッション番号NM_000029.3)及び/または本明細書において配列番号2として示されるヒトAGTゲノム配列(GENBANKアクセッション番号NT_167186.1からヌクレオチド24354000~24370100を切り出したもの)のいずれかを標的にする。
表1は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して4500nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721(本明細書において配列番号8として示されるフォワード配列CCCTGATGGGAGCCAGTGT;本明細書において配列番号9として示されるリバース配列AGCAGGGAGAAGCCCTTCA;及び本明細書において配列番号10として示されるプローブ配列CCCTGGCTTTCAACACCTACGTCCACTX(配列中、Xは蛍光標識である)を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表2は、更なるギャップマーオリゴヌクレオチドによるAGT mRNA阻害率(%)を示す。約20,000細胞/ウェルの密度で培養したHepG2細胞に、エレクトロポレーションを使用して、4,000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表3は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して500nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表4は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して1000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表5は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して1000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表6は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して1000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS4039(本明細書において配列番号11として示されるフォワード配列GGACAAGGTGGAGGGTCTCA;本明細書において配列番号12として示されるリバース配列AGATCCTTGCAGCACCAGTTG;及び本明細書において配列番号13として示されるプローブ配列ATGAAGAAACTATCTCCCCGGACCATCCAX(配列中、Xは蛍光標識である)を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表7は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して1000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS4039を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表8は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して4000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表9は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して4000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS4039を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表10は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して4000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表11は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して500nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整
した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表12は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるAGT mRNA阻害率(%)を示す。約20,000細胞/ウェルの密度で培養したHepG2細胞に、エレクトロポレーションを使用して、3,000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表13は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して4000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
表14は、20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して4000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトしたHepG2細胞中でのAGT mRNA阻害を示す。約24時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
実施例2:HepG2細胞におけるヒトアンジオテンシノーゲン(AGT)の用量依存性アンチセンス阻害
設計し、実施例1に記載のin vitro単回投与アッセイで試験した2000以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、AGT mRNAの著しい阻害を呈するアンチセンスオリゴヌクレオチドをいくつか選択し、HepG2細胞において種々の用量で更に試験した。いくつかの一連の実験で試験した例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの結果を以下の表に示す。
設計し、実施例1に記載のin vitro単回投与アッセイで試験した2000以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、AGT mRNAの著しい阻害を呈するアンチセンスオリゴヌクレオチドをいくつか選択し、HepG2細胞において種々の用量で更に試験した。いくつかの一連の実験で試験した例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの結果を以下の表に示す。
細胞を20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して、以下の表15に明示するように、0.406μM、0.813μM、1.63μM、3.25μM、6.5μM及び13.0μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRN
Aレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。各オリゴヌクレオチドの50%阻害濃度(IC50)も示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、AGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
Aレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。各オリゴヌクレオチドの50%阻害濃度(IC50)も示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、AGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
細胞を20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して、以下の表16に明示するように、39.1nM、156.3nM、625.0nM、2500nM及び10,000nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。結果は、2回の試験の平均である。各オリゴヌクレオチドの50%阻害濃度(IC50)も示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、AGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
細胞を20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して、以下の表17及び18に明示するように、312.5nM、625nM、1250nM、2500nM及び5000nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。結果は、2回の試験の平均である。各オリゴヌクレオチドの50%阻害濃度(IC50)も示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、AGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
細胞を20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して、以下の表19に明示するように、37nM、111nM、333nM、1,000nM及び3,000nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。結果は、2回の試験の平均である。各オリゴヌクレオチドの50%阻害濃度(IC50)も示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、AGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
細胞を20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して、以下の表20に明示するように。12.3nM、37nM、111nM、333nM、1,000nM及び3,000nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。結果は、2回の試験の平均である。各オリゴヌクレオチドの50%阻害濃度(IC50)も示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、AGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
細胞を20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して、以下の表21に明示するように、0.33μM、1.0μM、3.0μM及び9.0μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。各オリゴヌクレオチドの50%阻害濃度(IC50)も示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、AGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
細胞を20,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して、以下の表22に明示するように、0.44μM、1.33μM、4.0μM及び12.0μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約16時間の処置期間後、RNAを細胞から単離し、AGT mRNAレベルを定量リアルタイムPCRによって測定した。ヒトプライマープローブセットRTS3721を使用してmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT mRNAレベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。各オリゴヌクレオチドの50%阻害濃度(IC50)も示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、AGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
実施例3:トランスジェニックマウスモデルにおけるヒトAGTを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドの単回投与処置の忍容性及び有効性
トランスジェニック(Tg)マウスモデル「huAGT」を作製し、このhuAGT Tgモデルでアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を評価した。in vitro試験から選択したAGTアンチセンスオリゴヌクレオチドをhuAGTマウスで評価した。
トランスジェニック(Tg)マウスモデル「huAGT」を作製し、このhuAGT Tgモデルでアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を評価した。in vitro試験から選択したAGTアンチセンスオリゴヌクレオチドをhuAGTマウスで評価した。
huAGTトランスジェニックマウスを12時間の明暗サイクルで飼育し、通常ラット用飼料を不断給餌した。動物は、実験開始前に研究施設で少なくとも7日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を緩衝生理食塩水(PBS)で調製し、0.2μフィルターで濾過することによって滅菌した。オリゴヌクレオチドを注射用に0.9%PBS中に溶解した。
処置#1
雌の10週齢のトランスジェニックhuAGTマウスをマウス各4匹の群に分けた。8群に対して、2.5週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を20mg/kgの用量で週1回行った(処置3回)。マウスの1群に、2.5週間、PBSの皮下注射を週1回行った。この生理食塩水注射群をオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
雌の10週齢のトランスジェニックhuAGTマウスをマウス各4匹の群に分けた。8群に対して、2.5週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を20mg/kgの用量で週1回行った(処置3回)。マウスの1群に、2.5週間、PBSの皮下注射を週1回行った。この生理食塩水注射群をオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
RNA分析、処置#1
17日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表23に示すように、ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
17日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表23に示すように、ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
血漿中化学マーカー、処置#1
アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、総ビリルビン及び血中尿素窒素(BUN)の血漿中レベルを測定した。結果を表24に示す。肝機能または腎機能マーカーのうちのいずれかのレベル変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、総ビリルビン及び血中尿素窒素(BUN)の血漿中レベルを測定した。結果を表24に示す。肝機能または腎機能マーカーのうちのいずれかのレベル変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
体重及び器官重量、処置#1
トランスジェニックマウスの体重を15日目に測定した。各群の平均体重を以下の表に示す。肝臓、脾臓及び腎臓の重量を試験終了時に測定した。これを表25に示す。器官重量の何らかの変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
トランスジェニックマウスの体重を15日目に測定した。各群の平均体重を以下の表に示す。肝臓、脾臓及び腎臓の重量を試験終了時に測定した。これを表25に示す。器官重量の何らかの変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
処置#2
huAGTマウス2匹からなる群のそれぞれに、2週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を25mg/kg/週の用量で行った。huAGTマウスの1群にPBSの皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
huAGTマウス2匹からなる群のそれぞれに、2週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を25mg/kg/週の用量で行った。huAGTマウスの1群にPBSの皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
RNA分析、処置#2
10日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓から全RNAを抽出した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表26に示すように、ほとんどのアンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの
著しい減少をもたらした。
10日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓から全RNAを抽出した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表26に示すように、ほとんどのアンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの
著しい減少をもたらした。
血漿中化学マーカー、処置#2
アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素の血漿中レベルを測定した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、表27に示す。肝機能マーカーのうちのいずれかのレベル変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素の血漿中レベルを測定した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、表27に示す。肝機能マーカーのうちのいずれかのレベル変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
体重及び器官重量、処置#2
全処置群のhuAGTマウスの体重を1日目及び8日目に測定した。10日目に動物を屠殺し、その肝臓を摘出し、重量を測定した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、表28に示す。器官重量の何らかの変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
全処置群のhuAGTマウスの体重を1日目及び8日目に測定した。10日目に動物を屠殺し、その肝臓を摘出し、重量を測定した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、表28に示す。器官重量の何らかの変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
処置#3
huAGTマウス2匹からなる群のそれぞれに、2週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を25mg/kg/週の用量で行った。huAGTマウス4匹の1群にPBSの皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
huAGTマウス2匹からなる群のそれぞれに、2週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を25mg/kg/週の用量で行った。huAGTマウス4匹の1群にPBSの皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
RNA分析、処置#3
10日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓から全RNAを抽出した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表29に示すように、ほとんどのアンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
10日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓から全RNAを抽出した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表29に示すように、ほとんどのアンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
血漿中化学マーカー、処置#3
アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素の血漿中レベルを測定した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、表30に示す。肝機能マーカーのうちのいずれかのレベル変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素の血漿中レベルを測定した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、表30に示す。肝機能マーカーのうちのいずれかのレベル変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
体重及び器官重量、処置#3
全処置群のhuAGTマウスの体重を1日目及び8日目に測定した。10日目に動物を屠殺し、その肝臓を摘出し、重量を測定した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、表31に示す。重量の何らかの変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
全処置群のhuAGTマウスの体重を1日目及び8日目に測定した。10日目に動物を屠殺し、その肝臓を摘出し、重量を測定した。結果を、マウス2匹の各群について平均し、表31に示す。重量の何らかの変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
処置#4
雄の6週齢のトランスジェニックhuAGTマウスをマウス各3~4匹の群に分けた。8群に対して、2週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を5mg/kgの用量で週1回行った。マウスの1群に、2週間、PBSの皮下注射を週1回行った。この生理食塩水注射群をオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
雄の6週齢のトランスジェニックhuAGTマウスをマウス各3~4匹の群に分けた。8群に対して、2週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を5mg/kgの用量で週1回行った。マウスの1群に、2週間、PBSの皮下注射を週1回行った。この生理食塩水注射群をオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
RNA分析、処置#4
17日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表32に示すように、ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
17日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表32に示すように、ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
血漿中化学マーカー、処置#4
15日目に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、総ビリルビン及び血中尿素窒素(BUN)の血漿中レベルを測定した。結果を表33に示す。肝機能マーカーのうちのいずれかのレベル変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
15日目に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、総ビリルビン及び血中尿素窒素(BUN)の血漿中レベルを測定した。結果を表33に示す。肝機能マーカーのうちのいずれかのレベル変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
体重及び器官重量、処置#4
トランスジェニックマウスの体重を1、8及び13日目に測定した。各群の平均を以下
の表に示す。また、15日目に、肝臓、脾臓及び腎臓の重量を測定した。これを表34に示す。重量の何らかの変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
トランスジェニックマウスの体重を1、8及び13日目に測定した。各群の平均を以下
の表に示す。また、15日目に、肝臓、脾臓及び腎臓の重量を測定した。これを表34に示す。重量の何らかの変化が、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲を越えて生じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、更なる試験から除外した。
実施例4:トランスジェニックマウスモデルにおけるヒトAGTを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドの反復投与処置の忍容性及び有効性
huAGTトランスジェニックマウスにおける単回投与試験から選択したAGTアンチセンスオリゴヌクレオチドを、huAGTトランスジェニックマウスにおける用量反応試験で更に評価した。
huAGTトランスジェニックマウスにおける単回投与試験から選択したAGTアンチセンスオリゴヌクレオチドを、huAGTトランスジェニックマウスにおける用量反応試験で更に評価した。
huAGTトランスジェニックマウスを12時間の明暗サイクルで飼育し、通常ラット用飼料を不断給餌した。動物は、実験開始前に研究施設で少なくとも7日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を緩衝生理食塩水(PBS)で調製し、0.2マイクロフィルターで濾過することによって滅菌した。オリゴヌクレオチドを注射用に0.9%PBS中に溶解した。
処置#1
4点用量反応試験のために、雄のhuAGTマウスをマウス各4匹からなる37群に分けた。36群に対して、2.5週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を5、10、25及び50mg/kg/週の用量で行った(合計3回の投与)。huAGTマウスの1群に生理食塩水の皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
4点用量反応試験のために、雄のhuAGTマウスをマウス各4匹からなる37群に分けた。36群に対して、2.5週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を5、10、25及び50mg/kg/週の用量で行った(合計3回の投与)。huAGTマウスの1群に生理食塩水の皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
RNA分析、処置#1
17日目に、huAGTマウスを屠殺し、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。RT-PCRの結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、生理食塩水処置対照群に対する平均阻害率(%)として示す。表35に示すように、選択したアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドによる処置は、生理食塩水対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
17日目に、huAGTマウスを屠殺し、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。RT-PCRの結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、生理食塩水処置対照群に対する平均阻害率(%)として示す。表35に示すように、選択したアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドによる処置は、生理食塩水対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
体重及び器官重量、処置#1
全処置群のhuAGTマウスの体重を実験の1、8及び15日目に測定した。結果を、各マウス群について平均し、表36に示す。
全処置群のhuAGTマウスの体重を実験の1、8及び15日目に測定した。結果を、各マウス群について平均し、表36に示す。
処置#2
別の4点用量反応試験のために、5つの強力なヒトAGT標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS番号620003、654451、654472、654691及び654999)を先の試験から選択し、in vitroで強力であり、またhuAGTトランスジェニックマウス単回投与試験で強力かつ忍容性を示したISIS568637と比較した。この試験では、huAGTマウスをマウス各3匹からなる25群に分けた。これらの群に、10日にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を1、4、10及び40mg/kgの用量で2回の注射により行った。huAGTマウス3匹の1群に生理食塩水の皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
別の4点用量反応試験のために、5つの強力なヒトAGT標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS番号620003、654451、654472、654691及び654999)を先の試験から選択し、in vitroで強力であり、またhuAGTトランスジェニックマウス単回投与試験で強力かつ忍容性を示したISIS568637と比較した。この試験では、huAGTマウスをマウス各3匹からなる25群に分けた。これらの群に、10日にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を1、4、10及び40mg/kgの用量で2回の注射により行った。huAGTマウス3匹の1群に生理食塩水の皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
RNA分析、処置#2
10日目に、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置huAGTマウスを屠殺し、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照群に対するmRNA平均阻害率(%)として示す。表37に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、生理食塩水対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
10日目に、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置huAGTマウスを屠殺し、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照群に対するmRNA平均阻害率(%)として示す。表37に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、生理食塩水対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
血漿中化学マーカー、処置#2
10日目に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、ビリルビン及びBUNの血漿中レベルを測定した。結果を表38に示す。
10日目に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、ビリルビン及びBUNの血漿中レベルを測定した。結果を表38に示す。
処置#3
3点用量反応試験のために、5つの強力なヒトAGT標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS番号568637、594622、594624、594625及び594627)を先の用量反応試験から選択した。この試験では、huAGTマウスをマウス各3匹からなる16群に分けた。これらの群に、1週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を1、5及び15mg/kgの用量で2回の注射により行った。huAGTマウス3匹の1群に生理食塩水の皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
3点用量反応試験のために、5つの強力なヒトAGT標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド(ISIS番号568637、594622、594624、594625及び594627)を先の用量反応試験から選択した。この試験では、huAGTマウスをマウス各3匹からなる16群に分けた。これらの群に、1週間にわたって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの皮下注射を1、5及び15mg/kgの用量で2回の注射により行った。huAGTマウス3匹の1群に生理食塩水の皮下注射を行い、これをオリゴヌクレオチド処置群と比較する対照群とした。
RNA分析、処置#3
8日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表39に示すように、ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
8日目に、ヒトAGT mRNA発現に関するリアルタイムPCR解析及び測定のために、トランスジェニックマウスの肝臓及び腎臓から全RNAを抽出した。結果を、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対する阻害率(%)として示す。表39に示すように、ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、PBS対照と比較して、ヒトAGT mRNAの著しい減少をもたらした。
血漿中化学マーカー、処置#3
8日目に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、総ビリルビン及び血中尿素窒素(BUN)の血漿中レベルを測定した。結果を表40に示す。
8日目に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、総ビリルビン及び血中尿素窒素(BUN)の血漿中レベルを測定した。結果を表40に示す。
体重及び器官重量、処置#3
トランスジェニックマウスの体重を1、8及び13日目に測定した。各群の平均を以下の表に示す。また、15日目に、肝臓、脾臓及び腎臓の重量を測定した。これを表41に示す。
トランスジェニックマウスの体重を1、8及び13日目に測定した。各群の平均を以下の表に示す。また、15日目に、肝臓、脾臓及び腎臓の重量を測定した。これを表41に示す。
実施例5:9つの有力なAGT標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度評価
40cPを超える粘度を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングして除去する目的で、9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を測定した。40cPを超える粘度を有するオリゴヌクレオチドは、いずれの対象への投与にも粘度が高すぎると考えられる。
40cPを超える粘度を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングして除去する目的で、9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を測定した。40cPを超える粘度を有するオリゴヌクレオチドは、いずれの対象への投与にも粘度が高すぎると考えられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド(32~35mg)をガラスバイアル中に秤量し、水120μLを加え、バイアルを50℃で加熱することによってアンチセンスオリゴヌクレオチドを溶液中に溶解した。予熱した試料の一部(75μL)をマイクロ粘度計(Cambridge)にピペットで分注した。マイクロ粘度計の温度を25℃に設定し、試料の粘度を測定した。予熱した試料の別の部分(20μL)を、85℃、260nMでのUV読み取りのために(Cary UV機器)、水10mL中にピペットで分注した。結果を表42に示す。結果は、試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドが40cPの粘度を超えないことを示している。
実施例6:9つの有力なヒトAGT標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のCD1マウスにおける忍容性
CD1(登録商標)マウス(Charles River,MA)は、多目的マウスモデルであり、安全性及び有効性試験によく利用されている。上記試験から選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドでマウスを処置し、種々の血漿中化学マーカーのレベル変化について評価した。
CD1(登録商標)マウス(Charles River,MA)は、多目的マウスモデルであり、安全性及び有効性試験によく利用されている。上記試験から選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドでマウスを処置し、種々の血漿中化学マーカーのレベル変化について評価した。
上記の実施例で特定した9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドをCD1マウスにおける忍容性について試験した。マウスを1群あたりマウス4匹の群に分け、50mg/kgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを週2回、6週間、皮下注射した(100mg/kg/週の用量)。雄のCD1マウスの一群に、PBSを週2回、6週間、皮下注射した。最終投与から48時間後にマウスを安楽死させ、更なる分析のために器官及び血漿を採取した。
体重及び器官重量
ASO処置CD1マウスの体重を毎週測定した。43日目に、マウスを屠殺し、器官を摘出し、重量を測った。試験終了時の体重及び器官重量をグラム単位(g)で表43に示す。
ASO処置CD1マウスの体重を毎週測定した。43日目に、マウスを屠殺し、器官を摘出し、重量を測った。試験終了時の体重及び器官重量をグラム単位(g)で表43に示す。
血漿中化学マーカー
オリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、ALT(アラニンアミノ基転移酵素)及びAST(アスパラギン酸アミノ基転移酵素)、ビリルビン、クレアチニンならびにBUNの血漿中レベルを測定した。
結果を、各群について平均し、各項目について表44に示す。
オリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、ALT(アラニンアミノ基転移酵素)及びAST(アスパラギン酸アミノ基転移酵素)、ビリルビン、クレアチニンならびにBUNの血漿中レベルを測定した。
結果を、各群について平均し、各項目について表44に示す。
別個の試験で、アンチセンス化合物ISIS568637、594622、594624、594625及び594627についてもCD1マウスで試験したが、いくつかの忍容性の問題を呈したため、この試験は早々に終了した。
実施例7:9つの有力なヒトAGT標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のスプラーグドーリーラットにおける忍容性
スプラーグドーリー(SD)ラットは、安全性及び有効性評価に使用される多目的モデ
ルである。上記実施例に記載した試験から選択した9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドでSDラットを処置し、種々の血漿中化学マーカーのレベル変化について評価した。
スプラーグドーリー(SD)ラットは、安全性及び有効性評価に使用される多目的モデ
ルである。上記実施例に記載した試験から選択した9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドでSDラットを処置し、種々の血漿中化学マーカーのレベル変化について評価した。
処置
雄のSDラットを12時間の明暗サイクルで飼育し、Purina通常ラット用飼料を不断給餌した。ラットを1群あたりラット4匹の群に分け、各群に100mg/kg/週で、6週間、皮下注射した。最終投与から48時間後にラットを安楽死させ、更なる分析のために器官及び血漿を採取した。
雄のSDラットを12時間の明暗サイクルで飼育し、Purina通常ラット用飼料を不断給餌した。ラットを1群あたりラット4匹の群に分け、各群に100mg/kg/週で、6週間、皮下注射した。最終投与から48時間後にラットを安楽死させ、更なる分析のために器官及び血漿を採取した。
器官重量
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したラットの肝臓、脾臓及び腎臓の重量を試験終了時に測定した。体重及び器官重量をグラム単位で表45に示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したラットの肝臓、脾臓及び腎臓の重量を試験終了時に測定した。体重及び器官重量をグラム単位で表45に示す。
肝機能及び腎機能
9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、ALT(アラニンアミノ基転移酵素)及びAST(アスパラギン酸アミノ基転移酵素)、アルブミン、BUN、クレアチニンならびにビリルビンの血漿中レベルを測定した。また、総尿蛋白及び尿クレアチニンレベルを測定し、総尿蛋白とクレアチニンの比(P/C比)を求めた。
9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、ALT(アラニンアミノ基転移酵素)及びAST(アスパラギン酸アミノ基転移酵素)、アルブミン、BUN、クレアチニンならびにビリルビンの血漿中レベルを測定した。また、総尿蛋白及び尿クレアチニンレベルを測定し、総尿蛋白とクレアチニンの比(P/C比)を求めた。
各群の結果を平均し、各項目について表46に示す。
組織学
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したラットの肝臓及び腎臓を顕微鏡で検査したが、処置に関連する顕著な有害な所見は観察されなかった。
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したラットの肝臓及び腎臓を顕微鏡で検査したが、処置に関連する顕著な有害な所見は観察されなかった。
別個の試験で、アンチセンス化合物ISIS568637、594622、594624、594625及び594627についてもSDラットで試験したが、いくつかの忍容性の問題を呈したため、この試験は早々に終了した。
実施例8:9つの有力なヒトAGT標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のカニクイザル肝細胞における効力
本試験に着手した時点で、カニクイザルのゲノム配列は、国立生物工学情報センター(NCBI)データベースで入手できなかったため、カニクイザル遺伝子配列との交差反応性は確認できなかった。その代わりに、相補性について、カニクイザルで使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列をアカゲザル配列と比較した。アカゲザル配列に対して相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、カニクイザル配列とも十分に交差反応性であると予想される。
本試験に着手した時点で、カニクイザルのゲノム配列は、国立生物工学情報センター(NCBI)データベースで入手できなかったため、カニクイザル遺伝子配列との交差反応性は確認できなかった。その代わりに、相補性について、カニクイザルで使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列をアカゲザル配列と比較した。アカゲザル配列に対して相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、カニクイザル配列とも十分に交差反応性であると予想される。
試験したヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アカゲザルゲノム配列(本明細書において配列番号7として示される、GENBANKアクセッション番号NW_001109259.1からヌクレオチド16090000~16106000を切り出したもの)と最大3つのミスマッチを有した。ヒトオリゴヌクレオチドとアカゲザル配列との間の相補性が大きいほど、そのヒトオリゴヌクレオチドは、アカゲザル配列及びカニクイザル配列と交差反応性できる可能性が高くなる。配列番号7に対する各オリゴヌクレオチドの開始部位及び終止部位を表47に示す。「開始部位」は、ギャップマーが標的にするアカゲザル遺伝子配列中の最も5’側のヌクレオチドを示す。
先の試験でAGT mRNAの著しい阻害及び忍容性を示した9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択し、凍結保存された個々の雄のカニクイザル初代肝細胞において種
々の用量で試験した。これらの9つの有力なアンチセンスオリゴヌクレオチドを以下の表に記載する。
々の用量で試験した。これらの9つの有力なアンチセンスオリゴヌクレオチドを以下の表に記載する。
カニクイザル初代肝細胞を35,000細胞/ウェルの密度で培養し、エレクトロポレーションを使用して、以下の表48に明示するように、0.156μM、0.313μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5.0μM、10.0μM及び20.0μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。約24時間の処置期間後、細胞を洗浄し、溶解し、RNAを単離した。サルAGT mRNAレベルを、プライマープローブセットRTS4039を使用して、定量リアルタイムPCRによって測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定した全RNA含量に従ってAGT
mRNA標的レベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
mRNA標的レベルを調整した。無処置の対照細胞に対するAGTの阻害率(%)として結果を示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチド処置細胞では、ほとんどのサルAGT mRNAレベルが用量依存的に著しく減少した。
実施例9:ヒトAGTを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドのカニクイザルにおける効果
12週間の用量反応試験において、上記実施例に記載した試験から選択した9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドでカニクイザルを処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性及び忍容性ならびに肝臓及び腎臓におけるその薬物動態プロファイルを評価した。
12週間の用量反応試験において、上記実施例に記載した試験から選択した9つのアンチセンスオリゴヌクレオチドでカニクイザルを処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性及び忍容性ならびに肝臓及び腎臓におけるその薬物動態プロファイルを評価した。
処置
試験に先立って、サルを隔離状態に置き、その期間中、全般的な健康状態について動物を毎日観察した。サルは2~4歳で、体重は2~4kgであった。無作為に割り当てた5匹の雄のカニクイザルの10群のそれぞれに、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはPBSを皮下注射した。サルには、合計15回の投与で、40mg/kg/週のアンチセンスオリゴヌクレオチドを週1回、12週間投与した(サルは第1週及び第2週に40mg/kgを2回投与する負荷処置を受けた)。対照群のカニクイザルには類似の方法でPBSを注射し、これを対照群とした。
試験に先立って、サルを隔離状態に置き、その期間中、全般的な健康状態について動物を毎日観察した。サルは2~4歳で、体重は2~4kgであった。無作為に割り当てた5匹の雄のカニクイザルの10群のそれぞれに、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはPBSを皮下注射した。サルには、合計15回の投与で、40mg/kg/週のアンチセンスオリゴヌクレオチドを週1回、12週間投与した(サルは第1週及び第2週に40mg/kgを2回投与する負荷処置を受けた)。対照群のカニクイザルには類似の方法でPBSを注射し、これを対照群とした。
試験期間中、疾病または苦痛の徴候についてサルを1日2回観察した。治療、外傷または疾病に起因する一時的または軽微な程度を越える疼痛または苦痛を経験する動物は、獣医スタッフが、試験責任者と相談後、承認された鎮痛薬または痛みを緩和する薬を用いて治療した。更なるモニタリング及び安楽死の可能性を要する、健康状態の悪い動物または瀕死状態であり得る動物を特定した。12週間の試験の最後に、サルを屠殺し、器官を取り出した。実施例に記載のプロトコルは、動物実験委員会(IACUC)による承認を受けたものである。
体重及び器官重量
体重を毎週評価したが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの体重に対する顕著な作用は観察されなかった。77日目に体重を測定し、79日目に器官重量を測定した。これを以下の表49に示す。
体重を毎週評価したが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの体重に対する顕著な作用は観察されなかった。77日目に体重を測定し、79日目に器官重量を測定した。これを以下の表49に示す。
薬力学
試験中、分析のために血漿、血清及び尿を採取した。9つの有力なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、79日目に、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、ALT(アラニンアミノ基転移酵素)及びAST(アスパラギン酸アミノ基転移酵素)、BUNならびにビリルビンの血漿中レベルを測定した。表50に示すように、ALT、AST、BUN及びビリルビンに対する著しい作用は観察されなかった。
試験中、分析のために血漿、血清及び尿を採取した。9つの有力なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、79日目に、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、ALT(アラニンアミノ基転移酵素)及びAST(アスパラギン酸アミノ基転移酵素)、BUNならびにビリルビンの血漿中レベルを測定した。表50に示すように、ALT、AST、BUN及びビリルビンに対する著しい作用は観察されなかった。
更に、ECG、血圧、血漿電解質、蛋白尿、炎症反応(例えば、CRPレベル)または腎臓蓄積における著しい変化は、観察されなかった。概して、アンチセンスオリゴヌクレオチドは良好な忍容性を示した。
RNA分析
試験の最後に、AGTのmRNA発現を測定するリアルタイムPCR解析のために、サルの肝臓及び腎臓からRNAを抽出した。プライマープローブセットRTS4039を使用した。各群の結果を平均し、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対するmRNA阻害率(%)として示す。表51に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、AGT mRNAレベルに異なる効果をもたらした。
試験の最後に、AGTのmRNA発現を測定するリアルタイムPCR解析のために、サルの肝臓及び腎臓からRNAを抽出した。プライマープローブセットRTS4039を使用した。各群の結果を平均し、RIBOGREEN(登録商標)により正規化した、PBS対照に対するmRNA阻害率(%)として示す。表51に示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置は、AGT mRNAレベルに異なる効果をもたらした。
実施例10:GalNAcコンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドのCD-1マウスにおける忍容性
上記試験から有力候補(ISIS654472)の5-10-5完全ホスホロチオエートMOEギャップマーを選択し、これを、同じヌクレオチド配列を有するが、以下の表52に記載するように主鎖構造が異なる、6つの5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3(別名「GalNAc」)-コンジュゲート化5-10-5MOEギャップマーの設計のベースとして使用した。「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。「A」は、アデニン核酸塩基である。「mC」は、5-メチルシトシン核酸塩基である。「G」は、グアニン核酸塩基である。「T」は、チミン核酸塩基である。「e」は、MOE修飾を示す。「d」は、デオキシリボースを示す。
上記試験から有力候補(ISIS654472)の5-10-5完全ホスホロチオエートMOEギャップマーを選択し、これを、同じヌクレオチド配列を有するが、以下の表52に記載するように主鎖構造が異なる、6つの5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3(別名「GalNAc」)-コンジュゲート化5-10-5MOEギャップマーの設計のベースとして使用した。「s」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。「o」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。「A」は、アデニン核酸塩基である。「mC」は、5-メチルシトシン核酸塩基である。「G」は、グアニン核酸塩基である。「T」は、チミン核酸塩基である。「e」は、MOE修飾を示す。「d」は、デオキシリボースを示す。
3点用量反応試験のために、CD1マウス4匹からなる16群のそれぞれに、4週間にわたって、10mg/kg/週のGalNAc-コンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを皮下注射した。マウスの一群に、PBSを週2回、6週間、皮下注射した。ASO処置CD1マウスの体重を毎週測定した。最終投与から48時間後にマウスを安楽死させ、更なる分析のために器官及び血漿を採取した。血漿及び尿を採取し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価するために、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して、アミノ基転移酵素、ビリルビン及びBUNの血漿中レベルを測定した。実験終了時に、肝臓、腎臓及び脾臓を摘出し、重量を測った。
結果を、各群について平均し、表53に示す。
結果を、各群について平均し、表53に示す。
実施例11:GalNAcコンジュゲート化ASOのSDラットにおける忍容性
28匹の雄のSDラットを、1群あたりラット4匹の7群に分けた。ラットに、4週間にわたって、PBS(無処置対照)または10mg/kg/週のGalNAcコンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを皮下注射した。
28匹の雄のSDラットを、1群あたりラット4匹の7群に分けた。ラットに、4週間にわたって、PBS(無処置対照)または10mg/kg/週のGalNAcコンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドを皮下注射した。
血漿及び尿を採取し、臨床化学自動分析装置(Hitachi Olympus AU400e(Melville,NY))を使用して分析して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの肝機能及び腎機能に対する作用を評価した。実験終了時に、肝臓、腎臓及び脾臓を摘出し、重量を測った。
結果を各群動物4匹の平均として示し、表54に示す。
実施例12:非コンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドとGalNAcコンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドの雄及び雌のhuAGTマウスにおける用量反応比較
先の実施例に記載したように、huAGTマウスは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を試験するのに有用である。親5-10-5MOEギャップマー(ISIS654472)と、同じ配列を有するGalNAcコンジュゲート化化合物(ISIS757456)との用量反応比較を実施した。表55に示すように、GalNAcコンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非コンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも8倍強力である。
先の実施例に記載したように、huAGTマウスは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を試験するのに有用である。親5-10-5MOEギャップマー(ISIS654472)と、同じ配列を有するGalNAcコンジュゲート化化合物(ISIS757456)との用量反応比較を実施した。表55に示すように、GalNAcコンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非コンジュゲート化アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも8倍強力である。
配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2016年10月3日に作成されたサイズ456kbのBIOL0270WOSEQ_ST25.txtと題するファイルに対応する。電子形式の配列表及びBIOL0270WOSEQ_ST25.txtと題されたファイルの中の情報は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2016年10月3日に作成されたサイズ456kbのBIOL0270WOSEQ_ST25.txtと題するファイルに対応する。電子形式の配列表及びBIOL0270WOSEQ_ST25.txtと題されたファイルの中の情報は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書で開示される特定の実施形態は、次式:mCes Aes mCes Aes Aes Ads mCds Ads Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds mCes Ges Ges Tes Te(配列番号1914の核酸塩基配列を有する)(式中、Aはアデニンであり、mCは5-メチルシトシンであり、Gはグアニンであり、Tはチミンであり、eは2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、dは2’-デオキシヌクレオシドであり、sはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)に従う修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
本明細書で開示される特定の実施形態は、次式:mCes Aes mCes Aes Aes Ads mCds Ads Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds mCes Ges Ges Tes Te(配列番号1914の核酸塩基配列を有する)(式中、Aはアデニンであり、mCは5-メチルシトシンであり、Gはグアニンであり、Tはチミンであり、eは2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシドであり、dは2’-デオキシヌクレオシドであり、sはホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)に従う修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を提供する。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、GalNAcコンジュゲートを更に含む。特定の実施形態において、コンジュゲートは、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートである。特定の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは、切断可能部分によって、5’-トリスヘキシルアミノ-(THA)-C6 GalNAc3コンジュゲートに結合される。特定の実施形態において、切断可能部分は、リン酸基である。
特定の実施形態において、ISIS757456(配列番号1914の核酸塩基配列を有する)が好ましい。この化合物は、AGTトランスジェニックマウスにおいて強力な阻害物質であり、CD-1マウスにおいて非常に忍容性のあるアンチセンス化合物であることが判明した。マウスでは、生理食塩水で処置された動物に対して、ALT及び/またはASTレベルが3倍以下の増加であった。huAGTトランスジェニックマウスにおけるED50は、≦3mpk/週であった。
[態様1]配列番号1の核酸塩基2250~2337のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物。
[態様2]配列番号1の核酸塩基2281~2300のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物。
[態様3]前記修飾オリゴヌクレオチドが、15~30、15~25、15~24、16~24、17~24、18~24、19~24、20~24、19~22、20~22、16~20、16または20個の結合されたヌクレオシドからなる、態様1または2に記載の化合物。
[態様4]前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号1のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を含む、態様1または2に記載の化合物。
[態様5]前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号1に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%相補的である、先行態様のいずれか一に記載の化合物。
[態様6]12~30個の結合されたヌクレオシドを含み、かつ配列番号14~2051の核酸塩基配列のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
[態様7]12~30個の結合されたヌクレオシドを含み、かつ配列番号46、53~54、61、68、76、83、85、93、96~97、109、127、129~130、132、134~15、137~39、142、163~172、180~184、186、189、234、236、238~239、267、313、411、452、463~470、475~478、480、500~503、512、517~518、524~526、654、689、702、725~726、728、738、779、786~787、800、808、810~811、825、865、868、889、894、903、905、909、954、966、1011、1015、1021、1024、1080、1085、1258~1259、1261~1262、1293~1294、1299、1325、1470、1472~1473、1522、1542、1604、1623~1624、1667、1670、1682~1683、1687、1700、1703~1704、1708、1714、1716、1719~1720、1724~1726、1729~1730、1827、1936、1843~1844、1846、1886、1893~1894、1914、1923、1925、1932、1979、1986、1988、1990、2003、2015、2018、2020、2027~2028、2035、2037、2039、2044の核酸塩基配列のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
[態様8]12~30個の結合されたヌクレオシドを含み、かつ配列番号238、1714、1719、1893~1894、1914、1923、1925、2003の核酸塩基配列のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
[態様9]12~30個の結合されたヌクレオシドを含み、かつ配列番号1914の核酸塩基配列のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
[態様10]一本鎖である、先行態様のいずれか一に記載の化合物。
[態様11]二本鎖である、先行態様のいずれか一に記載の化合物。
[態様12]少なくとも1つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、先行態様のいずれか一に記載の化合物。
[態様13]少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、態様12に記載の化合物。
[態様14]各修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、態様12に記載の化合物。
[態様15]前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾糖を含む、先行態様のいずれか一に記載の化合物。
[態様16]少なくとも1つの修飾糖が二環式糖である、態様15に記載の化合物。
[態様17]少なくとも1つの修飾糖が、2’-O-メトキシエチル、拘束エチル(cEt)、3’-フルオロ-HNAまたは4’-(CH2)n-O-2’架橋(式中、nは1または2である)を含む、態様15に記載の化合物。
[態様18]少なくとも1つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、先行態様のいずれか一に記載の化合物。
[態様19]前記修飾核酸塩基が5-メチルシトシンである、態様18に記載の化合物。
[態様20]前記修飾オリゴヌクレオチドが、12~30個の結合されたヌクレオシドからなり、
a.複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
b.複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、
c.複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、
前記ギャップセグメントは、前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントとの間に配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む、先行態様のいずれか一に記載の化合物。
[態様21]前記修飾オリゴヌクレオチドが16~20個の結合された核酸塩基からなる、態様20に記載の化合物。
[態様22]前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を更に含む、態様20に記載の化合物。
[態様23]前記修飾オリゴヌクレオチドが修飾核酸塩基を更に含む、態様20に記載の化合物。
[態様24]前記修飾オリゴヌクレオチドが、
a.10個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
b.3~5個の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、
c.3~5個の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントと
を含む、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、
前記ギャップセグメントは、前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントとの間に配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、2’-O-メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合を含み、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである、態様20に記載の化合物。
[態様25]次式:mCes Aes mCes Aes Aes Ads mCds Ads Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds mCes Ges Ges Tes Te(配列番号1914);
(式中、
A=アデニン、
mC=5’-メチルシトシン
G=グアニン、
T=チミン、
e=2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、
d=2’-デオキシヌクレオシド、及び
s=ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)
に従う修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
[態様26]コンジュゲート基を更に含む、先行態様のいずれか一に記載の化合物。
[態様27]前記コンジュゲート基がGalNAc部分である、態様26に記載の化合物。
[態様28]配列番号1914のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、20個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、
a.10個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
b.5個の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、
c.5個の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントと、
d.GalNAcコンジュゲートとを含み、
前記ギャップセグメントは、前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントとの間に配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、2’-O-メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合を含み、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである、化合物。
[態様29]次式に従う修飾オリゴヌクレオチド。
[態様31]治療法に使用するための、先行態様のいずれか一に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[態様32]薬剤の調製に使用するための、先行態様のいずれか一に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチドを含む、組成物。
[態様33]細胞、組織、器官または動物においてAGTを減少させるのに使用するための、先行態様のいずれか一に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチド。
[態様34]動物におけるRAAS経路関連疾患、障害及び/または病態に関連する疾患、障害または病態の治療、予防、改善または進行遅延に使用するための、先行態様のいずれか一に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチド。
[態様35]前記疾患、障害または病態が高血圧である、態様34に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチド。
Claims (35)
- 配列番号1の核酸塩基2250~2337のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物。
- 配列番号1の核酸塩基2281~2300のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも8個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を有する12~30個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が配列番号1に対して少なくとも80%相補的である、化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、15~30、15~25、15~24、16~24、17~24、18~24、19~24、20~24、19~22、20~22、16~20、16または20個の結合されたヌクレオシドからなる、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、配列番号1のうちの長さの等しい部分に相補的な少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20個の連続した核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を含む、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基配列が、配列番号1に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または100%相補的である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。
- 12~30個の結合されたヌクレオシドを含み、かつ配列番号14~2051の核酸塩基配列のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
- 12~30個の結合されたヌクレオシドを含み、かつ配列番号46、53~54、61、68、76、83、85、93、96~97、109、127、129~130、132、134~15、137~39、142、163~172、180~184、186、189、234、236、238~239、267、313、411、452、463~470、475~478、480、500~503、512、517~518、524~526、654、689、702、725~726、728、738、779、786~787、800、808、810~811、825、865、868、889、894、903、905、909、954、966、1011、1015、1021、1024、1080、1085、1258~1259、1261~1262、1293~1294、1299、1325、1470、1472~1473、1522、1542、1604、1623~1624、1667、1670、1682~1683、1687、1700、1703~1704、1708、1714、1716、1719~1720、1724~1726、1729~1730、1827、1936、1843~1844、1846、1886、1893~1894、1914、1923、1925、1932、1979、1986、1988、1990、2003、2015、2018、2020、2027~2028、2035、2037、2039、2044の核酸塩基配列のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13
、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。 - 12~30個の結合されたヌクレオシドを含み、かつ配列番号238、1714、1719、1893~1894、1914、1923、1925、2003の核酸塩基配列のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
- 12~30個の結合されたヌクレオシドを含み、かつ配列番号1914の核酸塩基配列のうちの少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または20個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。
- 一本鎖である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。
- 二本鎖である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項12に記載の化合物。
- 各修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項12に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾糖を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。
- 少なくとも1つの修飾糖が二環式糖である、請求項15に記載の化合物。
- 少なくとも1つの修飾糖が、2’-O-メトキシエチル、拘束エチル(cEt)、3’-フルオロ-HNAまたは4’-(CH2)n-O-2’架橋(式中、nは1または2である)を含む、請求項15に記載の化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記修飾核酸塩基が5-メチルシトシンである、請求項18に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、12~30個の結合されたヌクレオシドからなり、
a.複数の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
b.複数の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、
c.複数の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントとを含み、
前記ギャップセグメントは、前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントとの間に配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、修飾糖を含む、先行請求
項のいずれか一項に記載の化合物。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが16~20個の結合された核酸塩基からなる、請求項20に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を更に含む、請求項20に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが修飾核酸塩基を更に含む、請求項20に記載の化合物。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが、
a.10個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
b.3~5個の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、
c.3~5個の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントと
を含む、16~20個の結合されたヌクレオシドからなり、
前記ギャップセグメントは、前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントとの間に配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、2’-O-メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合を含み、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである、請求項20に記載の化合物。 - 次式:mCes Aes mCes Aes Aes Ads mCds Ads Ads Gds mCds Tds Gds Gds Tds mCes Ges Ges
Tes Te(配列番号1914);
(式中、
A=アデニン、
mC=5’-メチルシトシン
G=グアニン、
T=チミン、
e=2’-O-メトキシエチル修飾ヌクレオシド、
d=2’-デオキシヌクレオシド、及び
s=ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)
に従う修飾オリゴヌクレオチドを含む、化合物。 - コンジュゲート基を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記コンジュゲート基がGalNAc部分である、請求項26に記載の化合物。
- 配列番号1914のうちの少なくとも8個の連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有する、20個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、前記修飾オリゴヌクレオチドは、
a.10個の結合されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、
b.5個の結合されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメントと、
c.5個の結合されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメントと、
d.GalNAcコンジュゲートとを含み、
前記ギャップセグメントは、前記5’ウイングセグメントと前記3’ウイングセグメントとの間に配置され、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは、2’-O-メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合を含み、各シトシン残基は、5-メチルシトシンである、化合物。 - 先行請求項のいずれか一項に記載の化合物もしくは修飾オリゴヌクレオチドまたはその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、組成物。
- 治療法に使用するための、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチドを含む、組成物。
- 薬剤の調製に使用するための、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチドを含む、組成物。
- 細胞、組織、器官または動物においてAGTを減少させるのに使用するための、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチド。
- 動物におけるRAAS経路関連疾患、障害及び/または病態に関連する疾患、障害または病態の治療、予防、改善または進行遅延に使用するための、先行請求項のいずれか一項に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチド。
- 前記疾患、障害または病態が高血圧である、請求項34に記載の化合物または修飾オリゴヌクレオチド。
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