JP2023076603A - アクチビンIIa型受容体変異体を含む医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】アクチビンIIa型受容体変異体およびそれらの使用方法を提供すること。【解決手段】本発明は、細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、Fcドメイン単量体または部分に融合された細胞外ActRIIa変異体を含む。本発明はまた、骨損傷、例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を含む疾患および病態を治療するためにこれらのポリペプチドを使用する医薬組成物および方法に関する。【選択図】 図3
Description
本発明は、アクチビンIIa型受容体変異体およびそれらの使用方法に関する。
健康な骨は、骨の破壊と骨の成長の両方を含む絶え間ないリモデリングを受けている。骨の成長は骨芽細胞種により媒介され、一方、破骨細胞は骨を吸収する。これらのシステムは、同化プログラムのダウンレギュレーション、異化システムのアップレギュレーションまたは両者の組合せによってバランスを欠き正味の骨量減少がもたらされる際に病状が発生する。よって、骨のリモデリングのバランスの制御は、骨折および骨に対する他の損傷の治癒の促進ならびに骨量の減少および骨石灰化に関連する骨粗鬆症などの障害の治療に有用であり得る。
骨の損傷は、加齢性または癌関連の骨量減少、遺伝子的条件、薬物治療の有害副作用、および骨折を含む一定の範囲の根本原因から起こり得る。世界保健機関は、骨粗鬆症だけで米国、欧州および日本で7千5百万人の罹患があり、骨折の重大なリスク因子であると推計している。一般に、骨量減少そのものは、有効な治療がほとんどない病的状態である。代わりに治療は、直接骨の成長を促進し、かつ骨密度を増す薬剤よりも、不動、運動および食事の改善に焦点を当てている。骨粗鬆症に関しては、エストロゲン、カルシトニン、ビタミンK併用のオステオカルシン、および高用量の食事性カルシウムは全て、治療的介入として使用されている。骨粗鬆症に対する他の治療アプローチとしては、ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質(PTHrP:parathyroid hormone related protein)カルシウム受容体作動薬、スタチン、同化ステロイド、ランタンおよびストロンチウム塩、ならびにフッ化ナトリウムが含まれる。しかしながら、このような治療薬には望まない副作用が伴うことが多い。骨損傷または骨脱灰をもたらす疾患の新規かつ有効な治療の必要性が存在する。
本発明は、細胞外アクチビンIIa型受容体(ActRIIa:activin receptor type IIa)変異体を含むポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドとしては、Fcドメイン単量体または部分のN末端またはC末端に融合された細胞外ActRIIa変異体を含む。このような部分は、例えば、アミノ酸または他の共有結合によって結合されていてもよい。Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドはまた、2つのFcドメイン単量体間の相互作用を介して二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)を形成し得る。本発明のポリペプチドは、例えば、骨損傷、例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動を含む疾患または病態を有する対象において骨量または骨塩密度を増加させるために使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドはまた、骨損傷もしくは骨脱灰を含む疾患もしくは病態を発症するリスクがある対象、またはそのような疾患もしくは病態を有する対象においてミオスタチン、アクチビン、および/または骨形成因子9(BMP9)シグナル伝達に作用するために使用することもできる。
一態様において、本発明は、
細胞外アクチビンIIa型受容体(ActRIIa)変異体を含み、前記変異体は、
GAILGRSETQECLX1X2NANWX3X4X5X6TNQTGVEX7CX8GX9X10X11X12X13X14HCX15ATWX16NISGSIEIVX17X18GCX19X20X21DX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号1)の配列を有し、配列中、X1はFまたはYであり;X2はFまたはYであり;X3はEまたはAであり;X4はKまたはLであり;X5はDまたはEであり;X6はRまたはAであり;X7はPまたはRであり;X8はYまたはEであり;X9はDまたはEであり;X10はKまたはQであり;X11はDまたはAであり;X12はKまたはAであり;X13はRまたはAであり;X14はRまたはLであり;X15はFまたはYであり;X16はK、R、またはAであり;X17はK、A、Y、F、またはIであり;X18はQまたはKであり;X19はWまたはAであり;X20はLまたはAであり;X21はD、K、R、A、F、G、M、N、またはIであり;X22はI、F、またはAであり;X23はKまたはTであり;X24はKまたはEであり;X25はDまたはEであり;X26はSまたはNであり;かつ、X27はEまたはQであり、かつ前記変異体は、配列番号73の配列を有する野生型細胞外ActRIIaまたは配列番号76~96の配列のうちいずれか1つを有する細胞外ActRIIaに対して少なくとも1つのアミノ酸置換を有する、ポリペプチドに関する。
細胞外アクチビンIIa型受容体(ActRIIa)変異体を含み、前記変異体は、
GAILGRSETQECLX1X2NANWX3X4X5X6TNQTGVEX7CX8GX9X10X11X12X13X14HCX15ATWX16NISGSIEIVX17X18GCX19X20X21DX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号1)の配列を有し、配列中、X1はFまたはYであり;X2はFまたはYであり;X3はEまたはAであり;X4はKまたはLであり;X5はDまたはEであり;X6はRまたはAであり;X7はPまたはRであり;X8はYまたはEであり;X9はDまたはEであり;X10はKまたはQであり;X11はDまたはAであり;X12はKまたはAであり;X13はRまたはAであり;X14はRまたはLであり;X15はFまたはYであり;X16はK、R、またはAであり;X17はK、A、Y、F、またはIであり;X18はQまたはKであり;X19はWまたはAであり;X20はLまたはAであり;X21はD、K、R、A、F、G、M、N、またはIであり;X22はI、F、またはAであり;X23はKまたはTであり;X24はKまたはEであり;X25はDまたはEであり;X26はSまたはNであり;かつ、X27はEまたはQであり、かつ前記変異体は、配列番号73の配列を有する野生型細胞外ActRIIaまたは配列番号76~96の配列のうちいずれか1つを有する細胞外ActRIIaに対して少なくとも1つのアミノ酸置換を有する、ポリペプチドに関する。
いくつかの実施形態では、前記変異体は、
GAILGRSETQECLFX2NANWX3X4X5X6TNQTGVEX7CX8GX9KX11X12X13X14HCX15ATWX16NISGSIEIVX17X18GCX19X20X21DX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号2)の配列を有し、配列中、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、およびX27は上記のように定義される。
GAILGRSETQECLFX2NANWX3X4X5X6TNQTGVEX7CX8GX9KX11X12X13X14HCX15ATWX16NISGSIEIVX17X18GCX19X20X21DX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号2)の配列を有し、配列中、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、X26、およびX27は上記のように定義される。
いくつかの実施形態では、前記変異体は、
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4X5RTNQTGVEX7CX8GX9KDKRX14HCX15ATWX16NISGSIEIVKX18GCWLDDX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号3)の配列を有し、配列中、X2、X4、X5、X7、X8、X9、X14、X15、X16、X18、X22、X23、X24、X25、X26、およびX27は上記のように定義される。
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4X5RTNQTGVEX7CX8GX9KDKRX14HCX15ATWX16NISGSIEIVKX18GCWLDDX22NCYDRTDCVEX23X24X25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号3)の配列を有し、配列中、X2、X4、X5、X7、X8、X9、X14、X15、X16、X18、X22、X23、X24、X25、X26、およびX27は上記のように定義される。
いくつかの実施形態では、前記変異体は、
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4DRTNQTGVEX7CX8GX9KDKRX14HCX15ATWX16NISGSIEIVKX18GCWLDDX22NCYDRTDCVEX23KX25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号4)の配列を有し、配列中、X2、X4、X7、X8、X9、X14、X15、X16、X18、X22、X23、X25、X26、およびX27は上記のように定義される。
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4DRTNQTGVEX7CX8GX9KDKRX14HCX15ATWX16NISGSIEIVKX18GCWLDDX22NCYDRTDCVEX23KX25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号4)の配列を有し、配列中、X2、X4、X7、X8、X9、X14、X15、X16、X18、X22、X23、X25、X26、およびX27は上記のように定義される。
いくつかの実施形態では、前記変異体は、
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4DRTNQTGVEPCX8GX9KDKRX14HCFATWKNISGSIEIVKX18GCWLDDINCYDRTDCVEX23KX25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号5)の配列を有し、配列中、X2、X4、X8、X9、X14、X18、X23、X25、X26、およびX27は上記のように定義される。
GAILGRSETQECLFX2NANWEX4DRTNQTGVEPCX8GX9KDKRX14HCFATWKNISGSIEIVKX18GCWLDDINCYDRTDCVEX23KX25X26PX27VYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号5)の配列を有し、配列中、X2、X4、X8、X9、X14、X18、X23、X25、X26、およびX27は上記のように定義される。
上述の実施形態のいずれにおいても、X1はFまたはYである。上述の実施形態のいずれにおいても、X2はFまたはYである。上述の実施形態のいずれにおいても、X3はEまたはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X4はKまたはLである。上述の実施形態のいずれにおいても、X5はDまたはEである。上述の実施形態のいずれにおいても、X6はRまたはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X7はPまたはRである。上述の実施形態のいずれにおいても、X8はYまたはEである。上述の実施形態のいずれにおいても、X9はDまたはEである。上述の実施形態のいずれにおいても、X10はKまたはQである。上述の実施形態のいずれにおいても、X11はDまたはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X12はKまたはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X13はRまたはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X14はRまたはLである。上述の実施形態のいずれにおいても、X15はFまたはYである。上述の実施形態のいずれにおいても、X16はK、R、またはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X17はK、A、Y、F、またはIである。上述の実施形態のいずれにおいても、X18はQまたはKである。上述の実施形態のいずれにおいても、X19はWまたはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X20はLまたはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X21はD、K、R、A、F、G、M、N、またはIである。上述の実施形態のいずれにおいても、X22はI、F、またはAである。上述の実施形態のいずれにおいても、X23はKまたはTである。上述の実施形態のいずれにおいても、X24はKまたはEである。上述の実施形態のいずれにおいても、X25はDまたはEである。上述の実施形態のいずれにおいても、X26はSまたはNである。上述の実施形態のいずれにおいても、X27はEまたはQである。上述の実施形態のいずれにおいても、X23はTであり、X24はEであり、X25はEであり、かつ、X26はNであるか、またはX23はTであり、X24はKであり、X25はEであり、かつ、X26はNである。上述の実施形態のいずれにおいても、X17はKである。
上述の実施形態のいずれにおいても、前記変異体は、配列番号6~72のうちいずれか1つの配列を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、位置X24のアミノ酸は、アミノ酸Kで置換可能である。
上述の実施形態のいずれにおいても、位置X24のアミノ酸は、アミノ酸Kで置換可能である。
上述の実施形態のいずれにおいても、位置X24のアミノ酸は、アミノ酸Eで置換可能である。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、1以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6個を超えるアミノ酸)のC末端伸長部をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、C末端伸長部は、アミノ酸配列NPである。いくつかの実施形態では、C末端伸長部は、アミノ酸配列NPVTPK(配列番号155)である。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、1以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6個を超えるアミノ酸)のC末端伸長部をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、C末端伸長部は、アミノ酸配列NPである。いくつかの実施形態では、C末端伸長部は、アミノ酸配列NPVTPK(配列番号155)である。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドのC末端に融合または共有結合された部分をさらに含み得る。この部分は、ポリペプチドの安定性を増すか、または薬物動態特性を改善することができる。いくつかの実施形態では、この部分は、Fcドメイン単量体、Fcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミンである。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのC末端に融合されたFcドメイン単量体をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Fcドメイン単量体に融合された本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドは、2つのFcドメイン単量体間の相互作用を介して二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)を形成し得る。いくつかの実施形態では、Fcドメイン単量体は、配列番号97の配列を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのC末端に融合されたFcドメインをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Fcドメインは、野生型Fcドメインである。いくつかの実施形態では、野生型Fcドメインは、配列番号151の配列を有する。いくつかの実施形態では、Fcドメインは、1以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、1以上のアミノ酸置換を含むFcドメインは、二量体を形成しない。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのC末端に融合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列番号152の配列を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのC末端に融合されたフィブロネクチンドメインをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンドメインペプチドは、配列番号153の配列を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してポリペプチドのC末端に融合されたヒト血清アルブミンをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、配列番号154の配列を有する。
いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸スペーサーである。いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、GGG、GGGA(配列番号98)、GGGG(配列番号100)、GGGAG(配列番号130)、GGGAGG(配列番号131)、またはGGGAGGG(配列番号132)である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸スペーサーは、GGGS(配列番号99)、GGGGA(配列番号101)、GGGGS(配列番号102)、GGGGG(配列番号103)、GGAG(配列番号104)、GGSG(配列番号105)、AGGG(配列番号106)、SGGG(配列番号107)、GAGA(配列番号108)、GSGS(配列番号109)、GAGAGA(配列番号110)、GSGSGS(配列番号111)、GAGAGAGA(配列番号112)、GSGSGSGS(配列番号113)、GAGAGAGAGA(配列番号114)、GSGSGSGSGS(配列番号115)、GAGAGAGAGAGA(配列番号116)、およびGSGSGSGSGSGS(配列番号117)、GGAGGA(配列番号118)、GGSGGS(配列番号119)、GGAGGAGGA(配列番号120)、GGSGGSGGS(配列番号121)、GGAGGAGGAGGA(配列番号122)、GGSGGSGGSGGS(配列番号123)、GGAGGGAG(配列番号124)、GGSGGGSG(配列番号125)、GGAGGGAGGGAG(配列番号126)、およびGGSGGGSGGGSG(配列番号127)、GGGGAGGGGAGGGGA(配列番号128)、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号129)、AAAL(配列番号133)、AAAK(配列番号134)、AAAR(配列番号135)、EGKSSGSGSESKST(配列番号136)、GSAGSAAGSGEF(配列番号137)、AEAAAKEAAAKA(配列番号138)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号139)、GENLYFQSGG(配列番号140)、SACYCELS(配列番号141)、RSIAT(配列番号142)、RPACKIPNDLKQKVMNH(配列番号143)、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(配列番号144)、AAANSSIDLISVPVDSR(配列番号145)、GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(配列番号146)、EAAAK(配列番号147)、またはPAPAP(配列番号148)である。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、(例えば、ヒト対象において)少なくとも7日の血清半減期を有する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、200pM以上のKDでヒト骨形成因子9(BMP9)と結合する。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、アクチビンおよび/またはミオスタチンと結合し、ヒトBMP9との結合は低い(例えば、弱い)。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、ヒトBMP9とは実質的に結合しない。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、200pM以上のKDでヒト骨形成因子9(BMP9)と結合する。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、アクチビンおよび/またはミオスタチンと結合し、ヒトBMP9との結合は低い(例えば、弱い)。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、ヒトBMP9とは実質的に結合しない。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、800pM以下のKDでヒトアクチビンAと結合する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、およそ800pM以下のKDでヒトアクチビンBと結合する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、およそ800pM以下のKDでヒトアクチビンBと結合する。
上述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載のポリペプチドは、およそ5pM以上のKDでヒトGDF-11と結合する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチド)をコードする核酸分子に関する。別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターに関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチド)をコードする核酸分子に関する。別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターに関する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞に関し、その宿主細胞は、前記2つの態様に記載されている核酸分子またはベクターを含み、この核酸分子またはベクターは宿主細胞内で発現される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを作製する方法に関し、その方法は、a)本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供すること、およびb)前記ポリペプチドの形成を可能とする条件下、宿主細胞内で前記核酸分子またはベクターを発現させること、を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、またはベクターと1以上の薬学上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物のいくつかの実施形態では、ポリペプチド、核酸分子、またはベクターは治療上有効な量である。
別の態様では、本発明はまた、Fcドメイン単量体(例えば、配列番号97の配列)のN末端またはC末端に融合された、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体をそれぞれ含む2つの同一のポリペプチドを含む構築物(例えば、ホモ二量体)に関する。これら2つのポリペプチド内の2つのFcドメイン単量体は相互作用して、構築物内にFcドメインを形成する。
別の態様では、本発明はまた、Fcドメイン単量体のN末端またはC末端に融合された、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体をそれぞれ含む2つの異なるポリペプチドを含む構築物(例えば、ヘテロ二量体)に関する。これら2つのポリペプチド内の2つのFcドメイン単量体は相互作用して、構築物内にFcドメインを形成する。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において骨塩密度を増加させる方法に関する。その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において骨吸収を低減する(例えば、骨量減少を低減する)方法に関する。その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において骨形成を増加させる方法に関する。その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において骨強度を増加させる方法に関する。その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、必要とする対象において骨折のリスクを低減する方法に関する。その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、前記対象は、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有するか、或いはそれらを発症するリスクがある。
別の態様では、本発明は、骨損傷を含む疾患または病態を有する或いはそれらを発症するリスクがある対象において、ミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用する(例えば、ミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9のそれらの受容体への結合を低減または阻害する)方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。この態様のいくつかの実施形態では、その疾患または病態は、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。いくつかの実施形態において、骨疾患は、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である。いくつかの実施形態において、骨疾患は、原発性骨粗鬆症である。骨疾患は、続発性骨粗鬆症である。いくつかの実施形態において、骨疾患は骨減少症である。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって原発性骨粗鬆症を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって続発性骨粗鬆症を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって骨減少症を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって骨折を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって骨癌もしくは癌転移関連骨量減少を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによってパジェット病を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって腎性骨異栄養症を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって治療関連骨量減少を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって食事関連骨量減少を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって肥満の治療に関連する骨量減少を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって低重力関連骨量減少を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクターまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することによって不動関連骨量減少を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療する方法に関する。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、原発性骨粗鬆症は加齢性骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、原発性骨粗鬆症はホルモン関連骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、原発性骨粗鬆症はホルモン関連骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、続発性骨粗鬆症は不動誘発性骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、続発性骨粗鬆症はグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、続発性骨粗鬆症はグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、癌は多発性骨髄腫である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療はFGF-21治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療はGLP-1治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療はFGF-21治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療はGLP-1治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療は癌治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療は、肥満および/または2型糖尿病のための治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、治療は、肥満および/または2型糖尿病のための治療である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、食事関連骨量減少はくる病である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は骨折のリスクがある。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において骨形成を増加させる。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において骨吸収を低減する(例えば、骨量減少を低減する)。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、破骨細胞活性を低減するか、または破骨細胞形成を低減する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、骨折のリスクを低減する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、骨の強度を増加させる。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、アクチビンおよび/またはミオスタチンのそれらの受容体への結合を低減または阻害する。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は骨折のリスクがある。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において骨形成を増加させる。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において骨吸収を低減する(例えば、骨量減少を低減する)。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、破骨細胞活性を低減するか、または破骨細胞形成を低減する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、骨折のリスクを低減する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、骨の強度を増加させる。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、アクチビンおよび/またはミオスタチンのそれらの受容体への結合を低減または阻害する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において血管合併症を引き起こさない(例えば、血管透過性または漏出を増加させない)。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象において骨塩密度を増加させる。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、骨は皮質骨である。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、骨は骨梁である。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチド、核酸、ベクター、または医薬組成物は、対象において、骨塩密度を増加させる、骨吸収を低減する(例えば、骨量減少を低減する)、骨吸収の速度を低減する、骨形成を増加させる、骨形成の速度を増加させる、破骨細胞活性を低減する、骨の強度を増加させる、骨芽細胞活性を増加させる、骨折のリスクを低減する、またはミオスタチン、アクチビン、および/もしくはBMP9シグナル伝達に作用するために十分な量で投与される。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチド、核酸、ベクター、または医薬組成物は、対象において、骨塩密度を増加させる、骨吸収を低減する(例えば、骨量減少を低減する)、骨吸収の速度を低減する、骨形成を増加させる、骨形成の速度を増加させる、破骨細胞活性を低減する、骨の強度を増加させる、骨芽細胞活性を増加させる、骨折のリスクを低減する、またはミオスタチン、アクチビン、および/もしくはBMP9シグナル伝達に作用するために十分な量で投与される。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号69の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号69の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部(C末端に例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸NPまたはNPVTPK(配列番号155))を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部を有する配列番号69の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号58の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号58の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部(C末端に例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸NPまたはNPVTPK(配列番号155))を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部を有する配列番号58の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号6の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号6の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部(C末端に例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸NPまたはNPVTPK(配列番号155))を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部を有する配列番号6の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号38の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号38の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部(C末端に例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸NPまたはNPVTPK(配列番号155))を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部を有する配列番号38の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号41の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号41の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部(C末端に例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸NPまたはNPVTPK(配列番号155))を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部を有する配列番号41の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号44の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号44の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部(C末端に例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸NPまたはNPVTPK(配列番号155))を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部を有する配列番号44の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号70の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号70の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部(C末端に例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸NPまたはNPVTPK(配列番号155))を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部を有する配列番号70の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号71の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号71の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部(C末端に例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超える付加的アミノ酸、例えば、アミノ酸VTPK)を有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKEN、ならびに/またはC末端伸長部を有する配列番号71の配列を有する治療上有効な量の変異体、あるいは前記変異体を含有する医薬組成物を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その変異体は、配列番号72の配列を有する。いくつかの実施形態では、配列番号72の配列を有する変異体は、位置X17にアミノ酸K、ならびに/または位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKENを有する。上記態様のいずれかのいくつかの実施形態では、その方法は、対象に、任意選択にて位置X17にアミノ酸K、ならびに/または位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENもしくはTKENを有する配列番号72の配列を有する治療上有効な量の変異体を投与することによって、必要とする対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)において骨塩密度を増加させること、骨形成を増加させること、骨吸収を低減すること(例えば、骨量減少を低減すること)、骨折のリスクを低減すること、骨の強度を増加させること、骨疾患を有する或いはそれを発症するリスクがある対象を治療すること、または骨損傷を含む病態もしくは疾患を治療すること、あるいは対象(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する対象)においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することを含む。
定義
本明細書で使用する場合、用語「細胞外アクチビンIIa型受容体(ActRIIa)変異体」は、野生型細胞外ActRIIaに対して少なくとも1つのアミノ酸置換(例えば、下記に示す配列番号75の配列の太字部分)を有する1回膜貫通型受容体ActRIIaの可溶型細胞外部分または配列番号76~96の配列のうちいずれか1つを有する細胞外ActRIIaを含むペプチドを指す。野生型ヒトActRIIa前駆体タンパク質の配列を下記に示し(配列番号75)、シグナルペプチドを斜体で、細胞外部分を太字で示す。野生型ヒトActRIIa前駆体タンパク質(配列番号75):
本明細書で使用する場合、用語「細胞外アクチビンIIa型受容体(ActRIIa)変異体」は、野生型細胞外ActRIIaに対して少なくとも1つのアミノ酸置換(例えば、下記に示す配列番号75の配列の太字部分)を有する1回膜貫通型受容体ActRIIaの可溶型細胞外部分または配列番号76~96の配列のうちいずれか1つを有する細胞外ActRIIaを含むペプチドを指す。野生型ヒトActRIIa前駆体タンパク質の配列を下記に示し(配列番号75)、シグナルペプチドを斜体で、細胞外部分を太字で示す。野生型ヒトActRIIa前駆体タンパク質(配列番号75):
細胞外ActRIIa変異体は、配列番号1~72のうちいずれか1つの配列を有し得る。特定の実施形態では、細胞外ActRIIa変異体は、配列番号6~72(表2)のうちいずれか1つの配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体は、野生型細胞外ActRIIaの配列(配列番号73)と少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、97%、またはそれを超える)アミノ酸配列同一性を有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「細胞外ActRIIb変異体」は、野生型細胞外ActRIIb(例えば、配列番号74の配列)に対して少なくとも1つのアミノ酸置換を有する1回膜貫通型受容体ActRIIbの可溶型細胞外部分を含むペプチドを指す。細胞外ActRIIb変異体は、下記に示す配列番号149の配列を有し得る。
細胞外ActRIIb変異体(配列番号149):
GRGEAETRECIFYNANWEKDRTNQSGLEPCYGDQDKRRHCFASWKNSSGTIELVKQGCWLDDINCYDRQECVAKKDSPEVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT。
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本明細書で使用する場合、用語「リンカー」は、2つの要素、例えば、ペプチドまたはタンパク質ドメインの間の結合を指す。本明細書に記載のポリペプチドは、ある部分に融合された細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含み得る。この部分は、ポリペプチドの安定性を増すか、または薬物動態特性を改善することができる。この部分(例えば、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン)は、リンカーを介してポリペプチドに融合されていてもよい。リンカーは、共有結合またはスペーサーであり得る。用語「結合」は、化学結合、例えば、アミド結合またはジスルフィド結合、または化学反応、例えば、化学共役から作り出されるいずれの種類の結合も指す。用語「スペーサー」は、2つの要素の間に空間および/またはフレキシビリティを設けるために2つの要素、例えば、ペプチドまたはタンパク質ドメインの間に存在する部分(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマー)またはアミノ酸配列(例えば、1~200アミノ酸の配列)を指す。アミノ酸スペーサーは、ポリペプチドの一次配列の一部である(例えば、ポリペプチド主鎖により空間が設けられたペプチドに融合されている)。例えば、Fcドメインを形成する2つのヒンジ領域の間のジスルフィド結合の形成は、リンカーと見なされない。
本明細書で使用する場合、用語「Fcドメイン」は、2つのFcドメイン単量体の二量体を指す。Fcドメインは、少なくともCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むヒトFcドメインと少なくとも80%の配列同一性(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、または100%の配列同一性)を有する。Fcドメイン単量体は、第2および第3の抗体定常ドメイン(CH2およびCH3)を含む。いくつかの実施形態では、Fcドメイン単量体はまた、ヒンジドメインも含む。Fcドメインは、例えば可変ドメインまたは相補性決定領域(CDR)など、抗原認識領域として働き得る免疫グロブリンのいずれの部分も含まない。野生型Fcドメインでは、2つのFcドメイン単量体は、2つのCH3抗体定常ドメイン間の相互作用、ならびに2つの二量体形成Fcドメイン単量体のヒンジドメイン間で形成する1以上のジスルフィド結合によって二量体を形成する。いくつかの実施形態では、Fcドメインは、「デッドFcドメイン」の典型としてエフェクター機能を欠くように変異させてもよい。特定の実施形態では、Fcドメインの各Fcドメイン単量体は、FcドメインとFcγ受容体の間の相互作用または結合を低減するようにCH2抗体定常ドメイン内にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Fcドメインは、Fcドメインの二量体形成を低減または阻害する1以上のアミノ酸置換を含む。Fcドメインは、IgG、IgE、IgM、IgA、またはIgDを含むいずれの免疫グロブリン抗体アイソタイプであってもよい。加えて、Fcドメインは、IgGサブタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、またはIgG4)であってもよい。Fcドメインはまた、非天然Fcドメイン、例えば、組換えFcドメインであってもよい。
本明細書で使用する場合、用語「アルブミン結合ペプチド」は、血清アルブミンに対して親和性を有し、血清アルブミンと結合する働きをするアミノ酸12~16個のアミノ酸配列を指す。アルブミン結合ペプチドは、例えば、ヒト、マウス、またはラットなど、起源の異なるものであってもよい。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列DICLPRWGCLW(配列番号152)を有する。
本明細書で使用する場合、用語「フィブロネクチンドメイン」は、例えば、インテグリンなどの膜貫通受容体タンパク質、ならびにコラーゲンおよびフィブリンなどの細胞外マトリックス成分と結合する、細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質、またはそのフラグメントを指す。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンドメインは、UniProt ID NO:P02751の配列のアミノ酸610~702を有するフィブロネクチンIII型ドメイン(配列番号153)である。他の実施形態では、フィブロネクチンドメインは、アドネクチンタンパク質である。
本明細書で使用する場合、用語「ヒト血清アルブミン」は、ヒト血漿中に存在するアルブミンタンパク質を指す。ヒト血清アルブミンは、血液中に最も豊富なタンパク質である。ヒト血清アルブミンは、血清タンパク質の約半分を占める。いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、UniProt ID NO:P02768(配列番号154)の配列を有する。
本明細書で使用する場合、用語「融合された」は、化学共役、組換え手段、および化学結合、例えば、アミド結合を含む手段による、2以上の要素、成分、またはタンパク質ドメイン、例えば、ペプチドまたはポリペプチドの組合せまたは結合を表すために使用される。例えば、化学共役、化学結合、ペプチドリンカー、または他のいずれかの共有結合手段を介して2つの単一のペプチドを直列に融合して1つの連続するタンパク質構造、例えばポリペプチドを形成することができる。本明細書に記載のポリペプチドのいくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を、リンカーを介して、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体(例えば、配列番号97の配列)、野生型Fcドメイン(例えば、配列番号151の配列)、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド(例えば、配列番号152の配列)、フィブロネクチンドメイン(例えば、配列番号153の配列)、またはヒト血清アルブミン(例えば、配列番号154の配列))のN末端またはC末端に直列で融合させてよい。例えば、細胞外ActRIIa変異体を、ペプチドリンカーを介して、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン)に融合させるが、この場合、ペプチドリンカーのN末端を、化学結合、例えば、ペプチド結合を介して細胞外ActRIIa変異体のC末端に融合させ、かつ、ペプチドリンカーのC末端を、化学結合、例えば、ペプチド結合を介して、その部分(例えば、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン)のN末端に融合させる。
本明細書で使用する場合、用語「C末端伸長部(extension)」は、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~70(例えば、配列番号6~70)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドのC末端への1以上のアミノ酸の付加を指す。C末端伸長部は、1以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、またはそれを超えるアミノ酸)であり得る。例示的なC末端伸長部は、アミノ酸配列NP(2個のアミノ酸C末端伸長部)およびアミノ酸配列NPVTPK(配列番号155)(6個のアミノ酸C末端伸長部)である。ポリペプチドの活性を混乱させないいずれのアミノ酸配列も使用可能である。配列番号71、すなわち、NPのC末端伸長部を有する配列番号69の配列、および配列番号72、すなわち、NPVTPKのC末端伸長部を有する配列番号69の配列は、本発明のポリペプチドがC末端伸長部を含むように改変され得る可能性のある方法のうち2つに相当する。
本明細書で使用する場合、用語「同一性パーセント(%)(percent(%)identity)」は、配列をアラインし、最大同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入した後(すなわち、ギャップは、最適なアラインメントのために候補配列と参照配列の一方または両方に導入することができ、比較の目的で非相同配列を無視することができる)、参照配列、例えば、野生型細胞外ActRIIa(例えば、配列番号73)のアミノ酸(または核酸)残基と同一である、候補配列、例えば、細胞外ActRIIa変異体のアミノ酸(または核酸)残基のパーセンテージを指す。同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、BLAST、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公開コンピュータソフトウエアを使用するなど、当技術分野の技術の範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大アラインメントを得るために必要なアルゴリズムを含め、アラインメントを評価するための適当なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、所与の参照配列に対する(to,with,or against)所与の候補配列のアミノ酸(または核酸)配列同一性パーセント(あるいは、これは所与の参照配列に対して特定のアミノ酸(または核酸)配列同一性パーセントを有するまたは含む所与の候補配列と表現することもできる)は次のように計算される:
100×(A/Bの分数)
式中、Aは、候補配列と参照配列のアラインメントにおいて同一スコアが与えられたアミノ酸(または核酸)残基の数であり、Bは、参照配列のアミノ酸(または核酸)残基の総数である。いくつかの実施形態では、候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合、参照配列に対する候補配列のアミノ酸(または核酸)配列同一性パーセントは、候補配列に対する参照配列のアミノ酸(または核酸)配列同一性パーセントと等しくない。
100×(A/Bの分数)
式中、Aは、候補配列と参照配列のアラインメントにおいて同一スコアが与えられたアミノ酸(または核酸)残基の数であり、Bは、参照配列のアミノ酸(または核酸)残基の総数である。いくつかの実施形態では、候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合、参照配列に対する候補配列のアミノ酸(または核酸)配列同一性パーセントは、候補配列に対する参照配列のアミノ酸(または核酸)配列同一性パーセントと等しくない。
特定の実施形態では、候補配列との比較のためにアラインされる参照配列は、候補配列が候補配列の全長または候補配列の連続するアミノ酸(または核酸)残基の選択された部分にわたって50%~100%の同一性を示すことを示し得る。比較目的でアラインされる候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%である。候補配列の位置が参照配列の対応する位置と同じアミノ酸(または核酸)残基で占められていれば、それらの分子はその位置において同一である。
本明細書で使用する場合、用語「血清半減期」は、対象に治療タンパク質を投与するという文脈で、その対象においてそのタンパク質の血漿濃度が半分に減少するのに要する時間を指す。タンパク質は、再分布したり、または血流から排除されたり、または例えば、タンパク質分解によって分解されたりすることがある。本明細書に記載されるように、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドは、ヒトにおいて7日の血清半減期を示す。本明細書で使用する場合、用語「親和性」または「結合親和性」は、2分子間の結合相互作用の強度を指す。一般に、結合親和性は、分子とその結合相手、例えば、細胞外ActRIIa変異体とBMP9またはアクチビンAの間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。そうではないことが示されない限り、結合親和性は、固有結合親和性を指し、これは結合対のメンバー間の1:1相互作用を表す。2分子間の結合親和性は、一般に、解離定数(KD)または親和性定数(KA)によって記載される。互いに低い結合親和性を有する2分子は、一般に、ゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があり、大きなKDを示す。互いに高い親和性を有する2分子は、一般に、容易に結合し、結合をより長く維持する傾向があり、小さいKDを示す。2つの相互作用分子のKDは、例えば、表面プラズモン共鳴などの当技術分野で周知の方法および技術を用いて決定することができる。KDは、koff/konの比として計算される。
本明細書で使用される場合、「骨強度」という用語は、骨塩密度に加えて、骨の質によって決定される骨の測定値を指す。骨の質は、骨の形状、微細構造、および構成組織の特性に影響される。骨強度は、骨の骨折リスクを評価するために使用できる。
本明細書で使用する場合、「骨疾患」という用語は、骨の損傷(例えば、骨塩密度の低下、骨強度の低下、および/または骨量減少)を特徴とする状態を指す。このような疾患または病態は、骨芽細胞および/または破骨細胞活性の不均衡(例えば、骨吸収の増加または骨形成の減少)によって引き起こされる可能性がある。骨疾患は、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少(例えば、多発性骨髄腫に関連する骨量減少)、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である。
本明細書で使用する場合、用語「骨塩密度(BMD:bone mineral density)」、「骨密度」、および「骨量」は、骨組織の骨塩(例えば、カルシウム)の量の尺度を指す。BMDは、当業者に公知の十分に確立された臨床技術によって(例えば、単一-1(single-1)または二重エネルギー光子またはX線吸収測定法によって)測定することができる。BMDの概念は、骨の体積当たりの無機塩の量に関するが、臨床上は、それは代用として、イメージング時の骨表面平方センチメートル当たりの光学密度に従って測定される。BMDの測定値は、臨床医学において骨粗鬆症および骨折リスクの間接的指標として使用されている。いくつかの実施形態では、BMD試験結果はTスコアとして示され、Tスコアは健康な30歳の成人の理想的またはピーク骨塩密度と比較した対象のBMDを表す。スコア0は、BMDが健康な若年成人の正常参照値に相当することを示す。測定された対象のBMDと健康な若年成人の参照値のBMDとの違いは、標準偏差単位(SD)で評価される。よって、+1SD~-1SDの間のTスコアは正常なBMDを示し、-1SD~-2.5SDの間のTスコアは低い骨量(例えば、骨減少症)を示し、-2.5SDより低いTスコアは骨粗鬆症または重度の骨粗鬆症を示し得る。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターがそれを必要とする対象に投与され、ここで、患者は低い骨量(例えば、-1SD~-2.5SDの間のTスコア)を有する。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターがそれを必要とする対象に投与され、患者は骨粗鬆症(例えば、-2.5SD未満のTスコア)を有する。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターの投与は、対象を、それらのBMDを増加させることによって治療する。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターの投与は、対象のBMDを増加させて、対象のTスコアに増加をもたらす(例えば、対象のTスコアに0.1以上、0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、1.0以上、または2.0以上の増加をもたらす)。
本明細書で使用する場合、用語「骨リモデリング」または「骨代謝」は、古い骨の不連続部分を新たに合成されたタンパク質性マトリックスのパケットで置き換えることによって骨の強度およびイオンの恒常性を維持するプロセスを指す。骨は破骨細胞によって吸収され、骨化と呼ばれるプロセスで骨芽細胞によって埋められる。骨細胞活性は、このプロセスにおいて重要な役割を果たす。骨量の減少をもたらす状態は、吸収の増加または骨化の減少のいずれかによって起こり得る。健康な個体では、小児期に、骨形成が吸収を上回る。加齢が進むと、吸収が形成を上回る。また、閉経後の高齢女性でも閉経に関連するエストロゲン欠乏のために骨吸収速度の方が一般にはるかに高い。
本明細書で使用する場合、用語「骨吸収」または「骨異化活性」は、破骨細胞が骨の組織を破壊し、無機塩を放出して、骨組織から血液への無機塩(例えば、カルシウム)の移行をもたらすプロセスを指す。骨吸収速度の上昇は、閉経後の女性における加齢を含め、加齢に関連する。高い骨吸収速度、または骨化速度を上回る骨吸収速度は、骨減少症および骨粗鬆症を含む骨塩密度の低下、そして結果としての骨量減少、などの骨障害に関連する。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターは、それを必要とする対象に、その対象における骨吸収(例えば、その対象における骨吸収の量または速度)を低減する(例えば、骨量を低減する)ために投与される。
本明細書で使用する場合、用語「骨形成(bone formation)」、「骨化」、「骨形成(osteogenesis)」、または「骨同化活性」は、骨芽細胞によって新たな骨組織を形成するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含む本発明のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸分子を含有するベクターは、それを必要とする対象に、骨形成を増加させる(例えば、その対象において骨形成(bone formation)の量もしくは速度、または骨形成(osteogenesis)を増す)ために投与される。
本明細書で使用する場合、「ミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用する(affecting)」という句は、ミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9のそれらの受容体、例えば、ActRIIa、ActRIIb、およびBMPRII(例えば、ActRIIa)への結合を変化させることを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9のそれらの受容体、例えば、ActRIIa、ActRIIb、およびBMPRII(例えば、ActRIIa)への結合を低減または阻害する。本明細書に記載されるように、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含む本発明のポリペプチドは、BMP9に対して弱い結合親和性(例えば、KD 200pM以上)を有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「血管合併症」は、血管障害または血管に対するいずれかの損傷、例えば、血管壁に対する損傷を指す。血管壁に対する損傷は、血管透過性または漏出の増加を招き得る。用語「血管透過性または漏出」は、小分子、タンパク質、および細胞を血管に流入させ、血管から流出させる血管壁の能力を指す。血管透過性または漏出の増加は、血管壁に並ぶ内皮細胞間の間隙の増大(例えば、間隙の大きさおよび/もしくは数の増大)ならびに/または血管壁の薄化によって起こり得る。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、単量体がアミノ酸残基であり、それらがアミド結合を介して相互に共有結合されている単一のポリマーを表す。ポリペプチドとは、天然型、組換え型、または合成生産されたいずれのアミノ酸配列も包含するものとする。
本明細書で使用する場合、用語「ホモ二量体(homodimer)」は、2つの同一の高分子、例えば、タンパク質または核酸によって形成された分子構築物を指す。これら2つの同一の単量体は、共有結合または非共有結合によってホモ二量体を形成し得る。例えば、Fcドメインは、2つのFcドメイン単量体が同じ配列を含めば、2つのFcドメイン単量体のホモ二量体であり得る。別の例では、Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含む本明細書に記載のポリペプチドは、2つのFcドメイン単量体の相互作用を介してホモ二量体を形成することができ、これらのFcドメイン単量体はホモ二量体においてFcドメインを形成する。
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロ二量体(heterodimer)」は、2つの異なる高分子、例えば、タンパク質または核酸によって形成された分子構築物を指す。これら2つの単量体は、共有結合または非共有結合によってヘテロ二量体を形成し得る。例えば、Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含む本明細書に記載のポリペプチドは、異なるActRIIa変異体にそれぞれ融合された2つのFcドメイン単量体の相互作用を介してヘテロ二量体を形成することができ、これらのFcドメイン単量体はヘテロ二量体においてFcドメインを形成する。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、必要な細胞成分、例えば、対応する核酸からタンパク質を発現させるために必要とされる細胞小器官を含む媒体を指す。核酸は一般に、当技術分野で公知の従来技術(形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ダイレクトマイクロインジェクションなど)によって宿主細胞に導入することができる核酸ベクター内に含まれる。宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞、または真核細胞、例えば、哺乳動物細胞(例えば、CHO細胞またはHEK293細胞)であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「治療上有効な量」は、骨疾患(例えば、骨粗鬆症あるいは骨損傷を含む病態(condition)、例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少)有する患者の治療において所望の治療効果を達成する上で有効な、本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクター、または本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクターを含有する医薬組成物の量を指す。用語「治療上有効な量」はまた、疾患、例えば、骨損傷を含む疾患または病態を有する患者の治療において所望の治療効果を達成する上で有効な、本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクター、または本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクターを含有する医薬組成物の量を指す。特に、ポリペプチド、核酸、またはベクターの治療上有効な量は、有害な副作用を回避する。
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、有効成分ならびにその有効成分を投与方法に適したものとできるように賦形剤および希釈剤を含む医薬または医薬製剤を指す。本発明の医薬組成物は、ポリペプチド、核酸、またはベクターと適合する薬学上許容される成分を含む。医薬組成物は経口投与用の錠剤もしくはカプセル剤形であっても、または静脈投与または皮下投与用の水性剤形であってもよい。
本明細書で使用する場合、用語「薬学上許容される担体または賦形剤」は、医薬組成物中の賦形剤または希釈剤を指す。薬学上許容される担体は、その製剤の他の成分と適合し、かつ、レシピエントに有害であってはならない。本発明では、薬学上許容される担体または賦形剤は、細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチド、そのポリペプチドをコードする核酸分子、またはそのような核酸分子を含有するベクターに十分な薬学的安定性を提供しなければならない。担体または賦形剤の性質は、投与様式によって異なる。例えば、静脈内投与には、水溶液担体が一般に使用され、経口投与には、固体担体が好ましい。
本明細書で使用する場合、用語「治療するおよび/または予防する」とは、本発明の方法および組成物を用いた、疾患、例えば、骨疾患または病態(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少)の治療および/または予防を指す。一般に、骨疾患または病態の治療は、対象がその骨疾患または病態を発症し、かつ/またはその骨疾患または病態を有すると既に診断された後に行われる。骨疾患または病態の予防は、対象にその骨疾患または病態を発症するリスクがある場合に講じられる方法または手順を指す。この対象は、医師により適応となることが判断される徴候もしくは軽度の症状またはその骨疾患もしくは病態を発症するリスク因子を示し得るか、または家族歴もしくはその骨疾患もしくは病態を発症する遺伝的素因を有し得るが、その疾患をまだ発症していない。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、哺乳動物、例えば、好ましくは、ヒトを指す。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ヒトおよび飼育動物および農用動物、例えば、サル(例えば、カニクイザル)、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどが含まれる。
本発明は、細胞外アクチビンIIa型受容体(ActRIIa)変異体を含むポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン)に融合された細胞外ActRIIa変異体を含む。Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドはまた、2つのFcドメイン単量体間の相互作用を介して二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)を形成し得る。本明細書に記載のActRIIa変異体は、アクチビンおよびミオスタチンに比べて骨形成因子9(BMP9)に対して結合親和性が弱いか、または結合親和性を全く持たない。本発明はまた、対象に本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドを投与することによって、対象において骨塩密度もしくは骨形成を増加させること、またはミオスタチン、アクチビン、および/もしくはBMP9シグナル伝達に作用することにより、骨損傷を含む骨の疾患および病態を治療する方法も含む。
I.細胞外アクチビンIIa型受容体変異体
アクチビンII型受容体は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β:transforming growth factor β)スーパーファミリーのリガンドに対するシグナルを調節する1回膜貫通ドメイン受容体である。TGF-βスーパーファミリーにおけるリガンドは、宿主において筋肉成長、血管成長、細胞分化、恒常性、および骨形成などの多くの生理学的プロセスに関与する。TGF-βスーパーファミリーにおけるリガンドは、例えば、アクチビン、インヒビン、成長分化因子(GDF:growth differentiation factor)(例えば、GDF8、ミオスタチンとしても知られる)、および骨形成因子(BMP)(例えば、BMP9)を含む。アクチビンは、骨組織に豊富に発現し、骨芽細胞機能および破骨細胞機能の両方を制御することによって骨形成を調節する。アクチビンは、骨疾患ではアップレギュレーションを受け、骨芽細胞活性を阻害することが報告されている。ミオスタチンもまた、骨形成の増加および骨芽細胞活性の阻害を介した骨の恒常性に関連付けられている。これらのデータは、アクチビン受容体リガンド(例えば、アクチビンおよびミオスタチン)が骨吸収(骨量減少)を促進し、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少などの骨損傷を含む疾患および病態をもたらし得ることを裏づけている。よって、このシグナル伝達を低減または阻害する方法は、骨損傷を含む疾患および病態の治療において使用可能である。
アクチビンII型受容体は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β:transforming growth factor β)スーパーファミリーのリガンドに対するシグナルを調節する1回膜貫通ドメイン受容体である。TGF-βスーパーファミリーにおけるリガンドは、宿主において筋肉成長、血管成長、細胞分化、恒常性、および骨形成などの多くの生理学的プロセスに関与する。TGF-βスーパーファミリーにおけるリガンドは、例えば、アクチビン、インヒビン、成長分化因子(GDF:growth differentiation factor)(例えば、GDF8、ミオスタチンとしても知られる)、および骨形成因子(BMP)(例えば、BMP9)を含む。アクチビンは、骨組織に豊富に発現し、骨芽細胞機能および破骨細胞機能の両方を制御することによって骨形成を調節する。アクチビンは、骨疾患ではアップレギュレーションを受け、骨芽細胞活性を阻害することが報告されている。ミオスタチンもまた、骨形成の増加および骨芽細胞活性の阻害を介した骨の恒常性に関連付けられている。これらのデータは、アクチビン受容体リガンド(例えば、アクチビンおよびミオスタチン)が骨吸収(骨量減少)を促進し、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少などの骨損傷を含む疾患および病態をもたらし得ることを裏づけている。よって、このシグナル伝達を低減または阻害する方法は、骨損傷を含む疾患および病態の治療において使用可能である。
2つのタイプのアクチビンII型受容体:ActRIIaおよびActRIIbが存在する。研究によれば、BMP9はActRIIaの約300倍の結合親和性でActRIIbと結合することが示されている(例えば、Townson他のJ.Biol.Chem.287:27313,2012参照)。ActRIIaは、ActRIIbに比べて長い半減期を有することが知られている。本発明は、ActRIIaの有益な生理学的特性および薬物動態特性も維持しつつ、ActRIIbによって与えられる生理学的特性を付与するという目的でActRIIaにActRIIbのアミノ酸残基を導入することによって構築される細胞外ActRIIa変異体を記載する。最適なペプチドは、より長い血清半減期および例えば、BMP9に対して低い結合親和性を保持しつつ、骨塩密度の有意な増加を与える。好ましいActRIIa変異体はまた、野生型ActRIIaに比べてアクチビンおよび/またはミオスタチンに対する結合の改善を示し、これにより、それらはリガンド結合に関して内因性のアクチビン受容体と競合可能となり、内因性のアクチビン受容体シグナル伝達を低減または阻害することができる。これらの変異体は、アクチビン受容体シグナル伝達が上昇している障害、例えば、骨疾患を治療し、骨吸収(例えば、骨量減少)または破骨細胞活性の低減、および骨形成、骨塩密度、または骨強度の増加をもたらすために使用することができる。いくつかの実施形態では、BMP9に対する変異体の結合親和性を低減または除去するために細胞外ActRIIa変異体にアミノ酸置換を導入することができる。ヒトActRIIaおよびActRIIbの細胞外部分の野生型アミノ酸配列を下記に示す。
ヒトActRIIa細胞外部分(配列番号73):
GAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS。
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ヒトActRIIb細胞外部分(配列番号74):
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT。
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本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号73の配列を有する野生型細胞外ActRIIaまたは配列番号76~96の配列のうちいずれか1つを有する細胞外ActRIIaに対して少なくとも1つのアミノ酸置換を有する細胞外ActRIIa変異体を含む。27箇所の異なる位置の潜在的アミノ酸置換が細胞外ActRIIa変異体に導入され得る(表1)。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体は、野生型細胞外ActRIIa(配列番号73)の配列と少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、97%、またはそれを超える)アミノ酸配列同一性を有し得る。細胞外ActRIIa変異体は、野生型細胞外ActRIIa(配列番号73)の配列に対して1以上(例えば、1~27、1~25、1~23、1~21、1~19、1~17、1~15、1~13、1~11、1~9、1~7、1~5、1~3、または1~2;例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、または27)のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1の配列を有する細胞外ActRIIa変異体)は、表1に挙げられているような27箇所の位置の全てにアミノ酸置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体は、表1に挙げられているような27箇所の位置のうち複数の位置、例えば、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、または26箇所にアミノ酸置換を含んでいてもよい。
アミノ酸置換は、本発明のActRIIa変異体の活性および/または結合親和性を低下または向上させ得る。ポリペプチド機能を維持するためには、表1および2に示される配列(配列番号1~72(例えば、配列番号6~72))の位置X17のリシン(K)が保持されることが重要である。その位置における置換は、活性の消失をもたらし得る。例えば、
GAILGRSETQECLFYNANWELERTNQTGVERCEGEKDKRLHCYATWRNISGSIEIVAKGCWLDDFNCYDRTDCVETEENPQVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号150)
の配列を有するActRIIa変異体はin vivoにおいて活性が低減され、X17におけるリシン(K)のアラニン(A)での置換が許容されないことを示す。よって、表1および2の変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)を含む本発明のActRIIa変異体)は、位置X17にアミノ酸Kを保持する。
GAILGRSETQECLFYNANWELERTNQTGVERCEGEKDKRLHCYATWRNISGSIEIVAKGCWLDDFNCYDRTDCVETEENPQVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号150)
の配列を有するActRIIa変異体はin vivoにおいて活性が低減され、X17におけるリシン(K)のアラニン(A)での置換が許容されないことを示す。よって、表1および2の変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)を含む本発明のActRIIa変異体)は、位置X17にアミノ酸Kを保持する。
本発明のActRIIa変異体は好ましくは、BMP9に対する結合が低減されているか、弱いか、または実質的に無い。位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TEENを含むActRIIa変異体ならびに位置X24にアミノ酸Kを維持し、かつ、位置X23、X24、X25、およびX26にアミノ酸配列TKENを有する変異体では、BMP9結合が低減されている。配列TEENおよびTKENは、本発明のActRIIa変異体(例えば、表1および2の変異体、例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72))では、BMP9結合の低減をもたらすために互換的に使用可能である。
本発明のActRIIa変異体は、C末端伸長部(例えば、C末端における付加的アミノ酸)をさらに含み得る。C末端伸長部には、表1および2(例えば、配列番号1~70(例えば、配列番号6~70))に示される変異体のいずれかのC末端に1以上の付加的アミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6以上の付加的アミノ酸)を付加することができる。本発明のActRIIa変異体に含まれ得る1つの可能性のあるC末端伸長部はアミノ酸配列NPである。例えば、C末端伸長部を含む配列は、配列番号71(例えば、C末端伸長部NPを有する配列番号69)である。本発明のActRIIa変異体に含まれ得るもう1つの例としてのC末端伸長部はアミノ酸配列NPVTPK(配列番号155)である。例えば、C末端伸長部を含む配列は、配列番号72(例えば、C末端伸長部NPVTPKを有する配列番号69)である。
配列番号2の配列を有する細胞外ActRIIa変異体のいくつかの実施形態では、X3はEであり、X6はRであり、X11はDであり、X12はKであり、X13はRであり、X16はKまたはRであり、X17はKであり、X19はWであり、X20はLであり、X21はDであり、かつ、X22はIまたはFである。配列番号1または2の配列を有する細胞外ActRIIa変異体のいくつかの実施形態では、X17はKである。配列番号1~3の配列を有する細胞外ActRIIa変異体のいくつかの実施形態では、X17はKであり、X23はTであり、X24はEであり、X25はEであり、かつ、X26はNである。配列番号1~5のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体のいくつかの実施形態では、X17はKであり、X23はTであり、X24はKであり、X25はEであり、かつ、X26はNである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、配列番号6~72(表2)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つ)を含む本発明のポリペプチドは、位置X17にアミノ酸Kを有する。位置X17のアミノ酸を変更すると、活性の低減がもたらされる。例えば、
GAILGRSETQECLFYNANWELERTNQTGVERCEGEKDKRLHCYATWRNISGSIEIVAKGCWLDDFNCYDRTDCVETEENPQVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号150)
の配列を有するActRIIa変異体は、in vivoにおいて活性が低減され、X17におけるKのAでの置換が許容されないことを示す。
GAILGRSETQECLFYNANWELERTNQTGVERCEGEKDKRLHCYATWRNISGSIEIVAKGCWLDDFNCYDRTDCVETEENPQVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTS(配列番号150)
の配列を有するActRIIa変異体は、in vivoにおいて活性が低減され、X17におけるKのAでの置換が許容されないことを示す。
いくつかの実施形態では、位置X23、X24、X25、およびX26に配列TEENを有する細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つ)を含む本発明のポリペプチドは、位置X24にアミノ酸Eのアミノ酸Kでの置換を有し得る。いくつかの実施形態では、位置X23、X24、X25、およびX26に配列TKENを有する細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つ)を含む本発明のポリペプチドは、位置X24にアミノ酸Kのアミノ酸Eでの置換を有し得る。位置X23、X24、X25、およびX26に配列TEENまたはTKENを有するポリペプチドは、BMP9に対する結合が低減されているか、または弱い。
いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~70(例えば、配列番号6~70)のうちいずれか1つ)を含む本発明のポリペプチドは、C末端伸長部(例えば、C末端における付加的アミノ酸)をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、C末端伸長部は、アミノ酸配列NPである。例えば、C末端伸長部を含む配列は、配列番号71(例えば、C末端伸長部NPを有する配列番号69)である。いくつかの実施形態では、C末端伸長部は、アミノ酸配列NPVTPK(配列番号155)である。例えば、C末端伸長部を含む配列は、配列番号72(例えば、C末端伸長部NPVTPKを有する配列番号69)である。C末端伸長部には、C末端に1以上の付加的アミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6以上の付加的アミノ酸)を付加することができる。
いくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体を含む本発明のポリペプチドは、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミン)をさらに含んでいてもよく、この部分はリンカーを介して細胞外ActRIIa変異体のN末端またはC末端(例えば、C末端)に融合させることができる。いくつかの実施形態では、この部分は、ポリペプチドの安定性を増すか、または薬物動態特性を改善する。Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドは、2つのFcドメイン単量体間の相互作用を介して二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)を形成することができ、これらのFcドメイン単量体は合わさって二量体においてFcドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体は、以下の表3に示される配列番号76~96のうちいずれの配列も持たない。
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、ヒトにおいて少なくとも7日の血清半減期を有する。ポリペプチドは、200pM以上のKDで骨形成因子9(BMP9)と結合し得る。このポリペプチドは、10pM以上のKDでアクチビンAと結合し得る。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、BMP9またはアクチビンAと結合しない。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、アクチビンおよび/またはミオスタチンと結合し、かつ、BMP9に低い(例えば、弱い)結合を示す。いくつかの実施形態では、BMP9に対する結合が低いまたは弱いポリペプチドは、位置X23、X24、X25、およびX26に配列TEENまたはTKENを有する。
加えて、いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、約200pM以上のKD(例えば、約200、300、400、500、600、700、800、または900pM以上のKD、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、または50nM以上のKD、例えば、約200pM~約50nMの間のKD)でヒトBMP9と結合し得る。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、ヒトBMP9と実質的に結合しない。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、約800pM以下のKD(例えば、約800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1pM以下のKD、例えば、約800pM~約200pMの間のKD)でヒトアクチビンAと結合し得る。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、800pM以下のKD(例えば、約800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1pM以下のKD、例えば、約800pM~約200pMの間のKD)でヒトアクチビンBと結合し得る。このポリペプチドは、およそ5pM以上のKD(例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、または200pM以上のKD)で成長および分化因子11(GDF-11)とも結合し得る。
II.Fcドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドの血清半減期を延長するために、免疫グロブリンのFcドメイン単量体またはFcドメインのフラグメントに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドは、2つのFcドメイン単量体間の相互作用を介して二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)を形成することができ、これらのFcドメイン単量体は二量体においてFcドメインを形成する。従来から当技術分野で知られているように、Fcドメインは、免疫グロブリンのC末端に見られるタンパク質構造である。Fcドメインは、CH3抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体を形成する2つのFcドメイン単量体を含む。野生型Fcドメインは、Fc受容体、例えば、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIVに結合する最小構造を形成する。いくつかの実施形態では、Fcドメインは、「デッド(dead)」Fcドメインに典型的に、エフェクター機能を欠くように変異させることができる。例えば、Fcドメインは、FcドメインとFcγ受容体の間の相互作用を最小にすることが知られている特定のアミノ酸置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、FcドメインはIgG1抗体に由来し、アミノ酸置換L234A、L235A、およびG237Aを含む。いくつかの実施形態では、FcドメインはIgG1抗体に由来し、アミノ酸置換D265A、K322A、およびN434Aを含む。上記のアミノ酸位置は、Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))に従って定義される。アミノ酸残基のKabatのナンバリングは、所与の抗体に関して、抗体配列の相同性領域を「標準」Kabatナンバリング配列とアラインすることによって決定することができる。さらに、いくつかの実施形態では、Fcドメインは、いずれの免疫系関連応答も誘導しない。例えば、Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドの二量体におけるFcドメインは、FcドメインとFcγ受容体の間の相互作用または結合を低減するように改変されてもよい。細胞外ActRIIa変異体に融合させることができるFcドメイン単量体の配列を下記に示す(配列番号97):
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドの血清半減期を延長するために、免疫グロブリンのFcドメイン単量体またはFcドメインのフラグメントに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドは、2つのFcドメイン単量体間の相互作用を介して二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)を形成することができ、これらのFcドメイン単量体は二量体においてFcドメインを形成する。従来から当技術分野で知られているように、Fcドメインは、免疫グロブリンのC末端に見られるタンパク質構造である。Fcドメインは、CH3抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体を形成する2つのFcドメイン単量体を含む。野生型Fcドメインは、Fc受容体、例えば、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIVに結合する最小構造を形成する。いくつかの実施形態では、Fcドメインは、「デッド(dead)」Fcドメインに典型的に、エフェクター機能を欠くように変異させることができる。例えば、Fcドメインは、FcドメインとFcγ受容体の間の相互作用を最小にすることが知られている特定のアミノ酸置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、FcドメインはIgG1抗体に由来し、アミノ酸置換L234A、L235A、およびG237Aを含む。いくつかの実施形態では、FcドメインはIgG1抗体に由来し、アミノ酸置換D265A、K322A、およびN434Aを含む。上記のアミノ酸位置は、Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))に従って定義される。アミノ酸残基のKabatのナンバリングは、所与の抗体に関して、抗体配列の相同性領域を「標準」Kabatナンバリング配列とアラインすることによって決定することができる。さらに、いくつかの実施形態では、Fcドメインは、いずれの免疫系関連応答も誘導しない。例えば、Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドの二量体におけるFcドメインは、FcドメインとFcγ受容体の間の相互作用または結合を低減するように改変されてもよい。細胞外ActRIIa変異体に融合させることができるFcドメイン単量体の配列を下記に示す(配列番号97):
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
いくつかの実施形態では、FcドメインはIgG1抗体に由来し、配列番号97の配列に対してアミノ酸置換L12A、L13A、およびG15Aを含む。いくつかの実施形態では、FcドメインはIgG1抗体に由来し、配列番号97の配列に対してアミノ酸置換D43A、K100A、およびN212Aを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)は、従来の遺伝学的または化学的手段、例えば、化学共役によってFcドメイン単量体(例えば、配列番号97)のN末端またはC末端に融合させることができる。任意選択にて、細胞外ActRIIa変異体とFcドメイン単量体の間にリンカー(例えば、スペーサー)を挿入することができる。Fcドメイン単量体は、細胞外ActRIIa変異体のN末端またはC末端(例えば、C末端)に融合させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、Fcドメインに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。いくつかの実施形態では、Fcドメインは、Fcドメインの二量体形成を低減または阻害する1以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Fcドメインは、ヒンジドメインを含む。Fcドメインは、免疫グロブリン抗体アイソタイプIgG、IgE、IgM、IgA、またはIgDのものであり得る。加えて、Fcドメインは、IgGサブタイプ(例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、またはIgG4)であり得る。Fcドメインはまた、非天然Fcドメイン、例えば、組換えFcドメインであってもよい。
二量体形成が低減されたFcドメインを作出する方法は当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、立体衝突のために二量体形成を障害するように、CH3-CH3二量体界面に大きな側鎖を有する1以上のアミノ酸(例えば、チロシンまたはトリプトファン)を導入してもよい。他の実施形態では、有利な相互作用を除くために、CH3-CH3二量体界面に小さい側鎖を有する1以上のアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、またはトレオニン)を導入してもよい。CH3ドメインに大きなまたは小さな側鎖を有するアミノ酸を導入する方法は、例えば、Ying他(J Biol Chem.287:19399-19408,2012)、米国特許出願公開第2006/0074225号明細書、米国特許第8,216,805号明細書および米国特許第5,731,168号明細書、Ridgway他(Protein Eng.9:617-612,1996)、Atwell他(J Mol Biol.270:26-35,1997)、およびMerchant他(Nat Biotechnol.16:677-681,1998)に記載されており、これらは全て、それらの全内容を本明細書の一部として援用する。
さらに他の実施形態では、2つのFcドメイン間でCH3-CH3界面を構成するCH3ドメインの1以上のアミノ酸残基を、正電荷を有するアミノ酸残基(例えば、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジン)または負電荷を有するアミノ酸残基(例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸)で置換し、その相互作用が、導入された特定の電荷のアミノ酸によって静電気的に不利となるようにする。二量体形成に不利となるように、または二量体形成を妨げるようにCH3ドメインに電荷アミノ酸を導入する方法は、例えば、Ying他(J Biol Chem.287:19399-19408,2012)、米国特許出願公開第2006/0074225号明細書、米国特許出願公開第2012/0244578号明細書、および米国特許出願公開第2014/0024111号明細書に記載されており、これらは全て、それらの全内容を本明細書の一部として援用する。
本発明のいくつかの実施形態では、Fcドメインは、ヒトIgG1の配列に対し以下のアミノ酸置換:T366W、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L351T、L351H、L351N、L352K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q、K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T、およびK409Iの1以上を含む。特定の一実施形態では、Fcドメインは、ヒトIgG1の配列に対してアミノ酸置換T366Wを含む。野生型Fcドメインの配列を配列番号151に示す。
III.アルブミン結合ペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、血清タンパク質結合ペプチドに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。血清タンパク質ペプチドとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、血清タンパク質結合ペプチドに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。血清タンパク質ペプチドとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
一例として、本明細書に記載の方法および組成物において使用可能なアルブミン結合ペプチドは一般に当技術分野で公知である。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列DICLPRWGCLW(配列番号152)を含む。
本発明では、細胞外ActRIIa変異体の血清半減期を延長するために、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)のN末端またはC末端(例えば、C末端)にアルブミン結合ペプチドを連結することができる。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、細胞外ActRIIa変異体のN末端またはC末端に直接またはリンカーを介して連結する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)は、従来の遺伝学的または化学的手段、例えば、化学共役によってアルブミン結合ペプチド(例えば、配列番号152)のN末端またはC末端に融合させることができる。所望により、細胞外ActRIIa変異体とアルブミン結合ペプチドの間にリンカー(例えば、スペーサー)を挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体にアルブミン結合ペプチドが含まれると、その血清アルブミンへの結合を介して治療タンパク質の保持の延長がもたらされ得ると思われる。
IV.フィブロネクチンドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、フィブロネクチンドメインに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。フィブロネクチンドメインとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、フィブロネクチンドメインに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。フィブロネクチンドメインとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
フィブロネクチンドメインは、例えば、インテグリンなどの膜貫通受容体タンパク質、ならびにコラーゲンおよびフィブリンなどの細胞外マトリックス成分と結合する細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質、またはそのフラグメントである。本発明のいくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体の血清半減期を延長するために、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)のN末端またはC末端(例えば、C末端)にフィブロネクチンドメインが連結される。フィブロネクチンドメインは、細胞外ActRIIa変異体のN末端またはC末端に直接またはリンカーを介して連結することができる。
一例として、本明細書に記載の方法および組成物において使用可能なフィブロネクチンドメインは一般に当技術分野で公知である。一実施形態では、フィブロネクチンドメインは、UniProt ID NO:P02751の配列のアミノ酸610~702を有するフィブロネクチンIII型ドメイン(配列番号153)である。別の実施形態では、フィブロネクチンドメインは、アドネクチンタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)は、従来の遺伝学的または化学的手段、例えば、化学共役によってフィブロネクチンドメイン(例えば、配列番号153)のN末端またはC末端に融合させることができる。所望により、細胞外ActRIIa変異体とフィブロネクチンドメインの間にリンカー(例えば、スペーサー)を挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体にフィブロネクチンドメインが含まれると、そのインテグリンならびにコラーゲンおよびフィブリンなどの細胞外マトリックス成分への結合を介して治療タンパク質の保持の延長がもたらされ得ると思われる。
V.血清アルブミン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、血清アルブミンに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。血清アルブミンとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、血清アルブミンに融合された細胞外ActRIIa変異体を含み得る。血清アルブミンとの結合は、タンパク質薬の薬物動態を改善することができる。
血清アルブミンは、哺乳動物において最も豊富な血液タンパク質である球状のタンパク質である。血清アルブミンは、肝臓で生産され、血清タンパク質の約半分を占める。血清アルブミンは血液中では単量体で可溶型である。血清アルブミンの最も重要ないくつかの機能として、体内におけるホルモン、脂肪酸、およびその他のタンパク質の輸送、pHの緩衝、ならびに血管と身体組織の間の体液の適正な分布に必要とされる浸透圧の維持が挙げられる。好ましい実施形態では、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。本発明のいくつかの実施形態では、細胞外ActRIIa変異体の血清半減期を延長するために、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)のN末端またはC末端(例えば、C末端)にヒト血清アルブミンが連結される。ヒト血清アルブミンは、細胞外ActRIIa変異体のN末端またはC末端に直接またはリンカーを介して連結することができる。
一例として、本明細書に記載の方法および組成物において使用可能な血清アルブミンは一般に当技術分野で公知である。一実施形態では、血清アルブミンは、UniProt ID NO:P02768(配列番号154)の配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)は、従来の遺伝学的または化学的手段、例えば、化学共役によってヒト血清アルブミン(例えば、配列番号154)のN末端またはC末端に融合させることができる。所望により、細胞外ActRIIa変異体と血清アルブミンの間にリンカー(例えば、スペーサー)を挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体に血清アルブミンが含まれると、治療タンパク質の保持の延長がもたらされ得ると思われる。
VI.リンカー
本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してある部分に融合された細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含み得る。いくつかの実施形態では、その部分は、ポリペプチドの安定性を高める。例としての部分には、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミンが含まれる。本発明では、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体(例えば、配列番号97の配列)、野生型Fcドメイン(例えば、配列番号151)、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド(例えば、配列番号152)、フィブロネクチンドメイン(例えば、配列番号153)、またはヒト血清アルブミン(例えば、配列番号154))と細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)の間のリンカーは、1~200個のアミノ酸を含むアミノ酸スペーサーであり得る。好適なペプチドスペーサーは当技術分野で公知であり、例えば、グリシン、アラニン、およびセリンなどのフレキシブルなアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、GA、GS、GG、GGA、GGS、GGG、GGGA(配列番号98)、GGGS(配列番号99)、GGGG(配列番号100)、GGGGA(配列番号101)、GGGGS(配列番号102)、GGGGG(配列番号103)、GGAG(配列番号104)、GGSG(配列番号105)、AGGG(配列番号106)、またはSGGG(配列番号107)のモチーフ、例えば、多重または反復モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、GAまたはGS、例えば、GA、GS、GAGA(配列番号108)、GSGS(配列番号109)、GAGAGA(配列番号110)、GSGSGS(配列番号111)、GAGAGAGA(配列番号112)、GSGSGSGS(配列番号113)、GAGAGAGAGA(配列番号114)、GSGSGSGSGS(配列番号115)、GAGAGAGAGAGA(配列番号116)、およびGSGSGSGSGSGS(配列番号117)のモチーフを含む2~12個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、GGAまたはGGS、例えば、GGA、GGS、GGAGGA(配列番号118)、GGSGGS(配列番号119)、GGAGGAGGA(配列番号120)、GGSGGSGGS(配列番号121)、GGAGGAGGAGGA(配列番号122)、およびGGSGGSGGSGGS(配列番号123)のモチーフを含む3~12個のアミノ酸を含み得る。さらにいくつかの実施形態では、スペーサーは、GGAG(配列番号104)、GGSG(配列番号105)、例えば、GGAG(配列番号104)、GGSG(配列番号105)、GGAGGGAG(配列番号124)、GGSGGGSG(配列番号125)、GGAGGGAGGGAG(配列番号126)、およびGGSGGGSGGGSG(配列番号127)のモチーフを含む4~12個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、GGGGA(配列番号101)またはGGGGS(配列番号102)、例えば、GGGGAGGGGAGGGGA(配列番号128)およびGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号129)のモチーフを含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミン)と細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)の間のアミノ酸スペーサーは、GGG、GGGA(配列番号98)、GGGG(配列番号100)、GGGAG(配列番号130)、GGGAGG(配列番号131)、またはGGGAGGG(配列番号132)であり得る。
本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーを介してある部分に融合された細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含み得る。いくつかの実施形態では、その部分は、ポリペプチドの安定性を高める。例としての部分には、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、またはヒト血清アルブミンが含まれる。本発明では、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体(例えば、配列番号97の配列)、野生型Fcドメイン(例えば、配列番号151)、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド(例えば、配列番号152)、フィブロネクチンドメイン(例えば、配列番号153)、またはヒト血清アルブミン(例えば、配列番号154))と細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)の間のリンカーは、1~200個のアミノ酸を含むアミノ酸スペーサーであり得る。好適なペプチドスペーサーは当技術分野で公知であり、例えば、グリシン、アラニン、およびセリンなどのフレキシブルなアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、GA、GS、GG、GGA、GGS、GGG、GGGA(配列番号98)、GGGS(配列番号99)、GGGG(配列番号100)、GGGGA(配列番号101)、GGGGS(配列番号102)、GGGGG(配列番号103)、GGAG(配列番号104)、GGSG(配列番号105)、AGGG(配列番号106)、またはSGGG(配列番号107)のモチーフ、例えば、多重または反復モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、GAまたはGS、例えば、GA、GS、GAGA(配列番号108)、GSGS(配列番号109)、GAGAGA(配列番号110)、GSGSGS(配列番号111)、GAGAGAGA(配列番号112)、GSGSGSGS(配列番号113)、GAGAGAGAGA(配列番号114)、GSGSGSGSGS(配列番号115)、GAGAGAGAGAGA(配列番号116)、およびGSGSGSGSGSGS(配列番号117)のモチーフを含む2~12個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、GGAまたはGGS、例えば、GGA、GGS、GGAGGA(配列番号118)、GGSGGS(配列番号119)、GGAGGAGGA(配列番号120)、GGSGGSGGS(配列番号121)、GGAGGAGGAGGA(配列番号122)、およびGGSGGSGGSGGS(配列番号123)のモチーフを含む3~12個のアミノ酸を含み得る。さらにいくつかの実施形態では、スペーサーは、GGAG(配列番号104)、GGSG(配列番号105)、例えば、GGAG(配列番号104)、GGSG(配列番号105)、GGAGGGAG(配列番号124)、GGSGGGSG(配列番号125)、GGAGGGAGGGAG(配列番号126)、およびGGSGGGSGGGSG(配列番号127)のモチーフを含む4~12個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、GGGGA(配列番号101)またはGGGGS(配列番号102)、例えば、GGGGAGGGGAGGGGA(配列番号128)およびGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号129)のモチーフを含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミン)と細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)の間のアミノ酸スペーサーは、GGG、GGGA(配列番号98)、GGGG(配列番号100)、GGGAG(配列番号130)、GGGAGG(配列番号131)、またはGGGAGGG(配列番号132)であり得る。
いくつかの実施形態では、スペーサーはまた、グリシン、アラニン、およびセリン以外のアミノ酸、例えば、AAAL(配列番号133)、AAAK(配列番号134)、AAAR(配列番号135)、EGKSSGSGSESKST(配列番号136)、GSAGSAAGSGEF(配列番号137)、AEAAAKEAAAKA(配列番号138)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号139)、GENLYFQSGG(配列番号140)、SACYCELS(配列番号141)、RSIAT(配列番号142)、RPACKIPNDLKQKVMNH(配列番号143)、GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(配列番号144)、AAANSSIDLISVPVDSR(配列番号145)、またはGGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(配列番号146)も含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、EAAAK(配列番号147)のモチーフ、例えば、多重または反復モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、(XP)n(ここで、Xは、任意のアミノ酸(例えば、A、K、またはE)であってもよく、nは1~5である)、およびPAPAP(配列番号148)などのプロリンリッチ配列のモチーフ、例えば、多重または反復モチーフを含み得る。
使用するペプチドスペーサーおよびアミノ酸の長さは、関与する2つのタンパク質および最終的なタンパク質融合ポリペプチドに求められるフレキシビリティの程度によって調節することができる。スペーサーの長さは、適正なタンパク質折り畳みを確保し、凝集の形成を避けるように調節することができる。
VII.ベクター、宿主細胞、およびタンパク質生産
本発明のポリペプチドは、宿主細胞から生産することができる。宿主細胞とは、必要な細胞成分、例えば、対応する核酸から本明細書に記載のポリペプチドおよび融合ポリペプチドを発現させるために必要とされる細胞小器官を含む媒体を指す。これらの核酸は、当技術分野で公知の従来技術(例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ダイレクトマイクロインジェクション、または感染など)によって宿主細胞に導入することができる核酸ベクター内に含まれていてもよい。核酸ベクターの選択は、一部は使用する宿主細胞によって異なる。一般に、好ましい宿主細胞は真核生物(例えば、哺乳動物)または原核生物(例えば、細菌)起源である。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞から生産することができる。宿主細胞とは、必要な細胞成分、例えば、対応する核酸から本明細書に記載のポリペプチドおよび融合ポリペプチドを発現させるために必要とされる細胞小器官を含む媒体を指す。これらの核酸は、当技術分野で公知の従来技術(例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ダイレクトマイクロインジェクション、または感染など)によって宿主細胞に導入することができる核酸ベクター内に含まれていてもよい。核酸ベクターの選択は、一部は使用する宿主細胞によって異なる。一般に、好ましい宿主細胞は真核生物(例えば、哺乳動物)または原核生物(例えば、細菌)起源である。
核酸ベクターの構築および宿主細胞
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介(または部位指定)突然変異誘発およびPCR突然変異誘発が含まれる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、遺伝子合成などの標準技術を用いて得ることができる。あるいは、野生型細胞外ActRIIaをコードする核酸分子は、例えば、QuikChange(商標)突然変異誘発などの当技術分野における標準技術を用いて、特定のアミノ酸置換を含むように変異させることができる。核酸分子は、ヌクレオチド合成装置またはPCR技術を用いて合成することができる。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介(または部位指定)突然変異誘発およびPCR突然変異誘発が含まれる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、遺伝子合成などの標準技術を用いて得ることができる。あるいは、野生型細胞外ActRIIaをコードする核酸分子は、例えば、QuikChange(商標)突然変異誘発などの当技術分野における標準技術を用いて、特定のアミノ酸置換を含むように変異させることができる。核酸分子は、ヌクレオチド合成装置またはPCR技術を用いて合成することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、原核生物または真核生物の宿主細胞で核酸分子を複製および発現することができるベクターに挿入することができる。当技術分野では多くのベクターが利用可能であり、本発明の目的において使用できる。各ベクターは種々の成分を含んでいてもよく、これらの成分は特定の宿主細胞と適合するように調節および最適化することができる。例えば、ベクター成分としては、限定されるものではないが、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、目的タンパク質をコードする核酸配列、および転写終結配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を本発明の宿主細胞として使用することができる。哺乳動物細胞種の例としては、限定されるものではないが、ヒト胎児腎(HEK)(例えば、HEK293、HEK293F)細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、COS細胞、PC3細胞、Vero細胞、MC3T3細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、VERY細胞、BHK細胞、MDCK細胞、W138細胞、BT483細胞、Hs578T細胞、HTB2細胞、BT20細胞、T47D細胞、NS0細胞(免疫グロブリン鎖を内因的に生産しないマウス骨髄腫細胞株)、CRL7O3O細胞、およびHsS78Bst細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、大腸菌(E.coli)細胞も本発明の宿主細胞として使用可能である。大腸菌株としては、限定されるものではないが、大腸菌294(ATCC(登録商標)31,446)、大腸菌λ1776(ATCC(登録商標)31,537)、大腸菌BL21(DE3)(ATCC(登録商標)BAA-1025)、および大腸菌RV308(ATCC(登録商標)31,608)が挙げられる。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシングおよびタンパク質産物の修飾(例えば、グリコシル化)に特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系は、発現されるポリペプチドの適正な修飾およびプロセシングを確保するために選択することができる。上記の発現ベクターは、当技術分野における従来技術、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、およびダイレクトマイクロインジェクションを用いて適当な宿主細胞に導入することができる。タンパク質生産用のためにベクターが宿主細胞に導入されれば、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地で宿主細胞を培養する。治療タンパク質の発現のための方法は当技術分野で公知であり、例えば、Paulina Balbas,Argelia Lorence(eds.)、Recombinant Gene Expression:Reviews and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press;第2版(2004年)、およびVladimir VoynovおよびJustin A.Caravella(eds.)、Therapeutic Proteins:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press;第2版(2012年)が参照される。
タンパク質生産、回収および精製
本発明のポリペプチドを生産するために使用される宿主細胞は、当技術分野で公知であり、選択された宿主細胞の培養に好適な培地で増殖させることができる。哺乳動物宿主細胞に好適な培地の例としては、最小必須培地(MEM:Minimal Essential Medium)、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、Expi293(商標)発現培地、ウシ胎仔血清(FBS:fetal bovine serum)を添加したDMEM、およびRPMI-1640が挙げられる。細菌宿主細胞に好適な培地の例としては、選択薬剤、例えば、アンピシリンなどの必要な添加を行ったLuria broth(LB)が挙げられる。宿主細胞は、好適な温度、例えば、約20℃~約39℃、例えば、25℃~約37℃、好ましくは、37℃、および5~10%などのCO2レベルで培養する。培地のpHは、主として宿主生物に応じて、一般に、約6.8~7.4、例えば、7.0である。本発明の発現ベクターでは誘導プロモーターが使用され、プロモーターの活性化に好適な条件下でタンパク質発現が誘導される。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される宿主細胞は、当技術分野で公知であり、選択された宿主細胞の培養に好適な培地で増殖させることができる。哺乳動物宿主細胞に好適な培地の例としては、最小必須培地(MEM:Minimal Essential Medium)、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、Expi293(商標)発現培地、ウシ胎仔血清(FBS:fetal bovine serum)を添加したDMEM、およびRPMI-1640が挙げられる。細菌宿主細胞に好適な培地の例としては、選択薬剤、例えば、アンピシリンなどの必要な添加を行ったLuria broth(LB)が挙げられる。宿主細胞は、好適な温度、例えば、約20℃~約39℃、例えば、25℃~約37℃、好ましくは、37℃、および5~10%などのCO2レベルで培養する。培地のpHは、主として宿主生物に応じて、一般に、約6.8~7.4、例えば、7.0である。本発明の発現ベクターでは誘導プロモーターが使用され、プロモーターの活性化に好適な条件下でタンパク質発現が誘導される。
いくつかの実施形態では、使用する発現ベクターおよび宿主細胞に応じて、発現されるタンパク質を宿主細胞(例えば、哺乳動物宿主細胞)から細胞培養培地へ分泌させることができる。タンパク質の回収は、細胞残渣を除去するために細胞培養培地を濾過することを含み得る。これらのタンパク質をさらに精製してもよい。本発明のポリペプチドは、タンパク質精製の技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質精製のための他のいずれかの標準技術によって、精製することができる。タンパク質は、例えば、プロテインAカラム(例えば、POROSプロテインAクロマトグラフィー)などのアフィニティーカラムを適切に選択し、クロマトグラフィーカラム(例えば、POROS HS-50陽イオン交換クロマトグラフィー)、濾過、限外濾過、塩析および透析法と組み合わせることによって単離および精製することができる。
他の実施形態では、宿主細胞は、発現されたタンパク質を回収するために、例えば、浸透圧ショック、音波処理、または溶解によって破壊することができる。細胞が破壊されれば、細胞残渣を遠心分離または濾過によって除去することができる。場合によっては、精製を容易にするためにポリペプチドをペプチドなどのマーカー配列に結合させることもできる。マーカーアミノ酸配列の例は、ヘキサヒスチジンペプチド(Hisタグ)であり、これはマイクロモルの親和性で、ニッケル官能基を有するアガロースアフィニティーカラムに結合する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、血球凝集素「HA」タグが含まれ、これはインフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する(Wilson他、Cell 37:767,1984)。
あるいは、本発明のポリペプチドは、例えば、遺伝子療法において、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター(例えば、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルスベクター、例えば、変異ワクシニアアンカラ(MVA:Modified Vaccinia Ankara))、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクター))を投与することにより、対象(例えば、ヒト)の細胞によって生産することができる。ベクターは、対象の細胞内にあれば(例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ダイレクトマイクロインジェクション、感染など)、ポリペプチドの発現を促進し、これは次に細胞から分泌される。疾患または障害の治療が所望の転帰である場合には、それ以上の作用は必要とされないと思われる。タンパク質の採集が望まれる場合には、対象から血液を採取し、当技術分野で公知の方法によって血液からタンパク質を精製することができる。
VIII.医薬組成物および製剤
本発明は、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチド)を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療タンパク質として、C末端伸長部(例えば、1、2、3、4、5、6以上の付加的アミノ酸)を有する細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~70(例えば、配列番号6~70)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療タンパク質として、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体、またはその二量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミン)に融合された細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含む本発明の医薬組成物は、療法において、他の薬剤(例えば、治療生物製剤および/または小分子)または組成物と併用することができる。治療上有効な量のポリペプチドに加え、医薬組成物は1種類以上の薬学上許容される担体または賦形剤を含んでいてもよく、当業者に公知の方法によって調剤することはできる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子(DNAもしくはRNA、例えば、mRNA)、またはそのような核酸分子を含有するベクターを含む。
本発明は、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチド)を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療タンパク質として、C末端伸長部(例えば、1、2、3、4、5、6以上の付加的アミノ酸)を有する細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~70(例えば、配列番号6~70)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療タンパク質として、ある部分(例えば、Fcドメイン単量体、またはその二量体、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミン)に融合された細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含む本発明の医薬組成物は、療法において、他の薬剤(例えば、治療生物製剤および/または小分子)または組成物と併用することができる。治療上有効な量のポリペプチドに加え、医薬組成物は1種類以上の薬学上許容される担体または賦形剤を含んでいてもよく、当業者に公知の方法によって調剤することはできる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子(DNAもしくはRNA、例えば、mRNA)、またはそのような核酸分子を含有するベクターを含む。
医薬組成物の許容される担体および賦形剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに無毒である。許容される担体および賦形剤は、リン酸塩、クエン酸塩、HEPES、およびTAEなどのバッファー、アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤、塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、レゾルシノール、および塩化ベンザルコニウムなどの保存剤、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン、および免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、およびリシンなどのアミノ酸、ならびにグルコース、マンノース、スクロース、およびソルビトールなどの炭水化物を含み得る。本発明の医薬組成物は、注射製剤の形態で非経口的に投与することができる。注射用医薬組成物は、無菌溶液または任意の薬学上許容される液体をビヒクルとして用いて調剤することができる。薬学上許容されるビヒクルとしては、限定されるものではないが、無菌水、生理食塩水、および細胞培養培地(例えば、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)、α-改変イーグル培地(α-MEM)、F-12培地)が挙げられる。調剤方法は当技術分野で公知であり、例えば、Banga(ed.)、Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation, Processing and Delivery Systems(第3版)、Taylor & Francis Group,CRC Press(2015)が参照される。
本発明の医薬組成物は、ヒドロキシルメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルなどのマイクロカプセル中に調製してもよい。本発明の医薬組成物はまた、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセルなどの他の薬物送達システム中に調製してもよい。このような技術は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第22版(2012年)に記載されている。in vivo投与に使用される医薬組成物は無菌でなければならない。これは無菌濾過膜を介した濾過によって容易に達成される。
本発明の医薬組成物はまた、徐放性製剤として調製してもよい。徐放性製剤の好適な例としては、本発明のポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド(polyactides)、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー(例えば、LUPRON DEPOT(商標))、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。一部の徐放性製剤は、数ヶ月、例えば、1~6か月にわたって分子の放出を可能とするが、他の製剤は本発明の医薬組成物をより短い期間、例えば、数日~数週間で放出する。
医薬組成物は、必要であれば、単位剤形で形成することができる。医薬製剤中に含まれる有効成分、例えば、本発明のポリペプチドの量は、指定の範囲内で適切な用量が提供されるような量(例えば、0.01~100mg/kg体重の範囲内の用量)である。
遺伝子療法用の医薬組成物は許容される希釈剤中にあってよく、または遺伝子送達ビヒクルが包埋された緩徐放出マトリックスを含み得る。送達方法として流体力学的注射が使用される場合には、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子またはその核酸分子を含有するベクター(例えば、ウイルスベクター)を含有する医薬組成物は、大きな液量で静脈内に容易に送達される。in vivo遺伝子送達ビヒクルとして使用可能なベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルスベクター、例えば、変異ワクシニアアンカラ)、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターが挙げられる。
IX.経路、用量、および投与
治療タンパク質として本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、例えば、静脈内投与、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、または腹腔内投与向けに調剤されてよい。医薬組成物はまた、経口投与、鼻腔投与、噴霧投与、エアロゾル投与、直腸、もしくは膣投与用に調剤し、またはそれらを介して投与することができる。注射製剤に関しては、種々の有効な医薬担体が当技術分野で知られている。例えば、ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,第18版(2014)を参照されたい。
治療タンパク質として本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、例えば、静脈内投与、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、または腹腔内投与向けに調剤されてよい。医薬組成物はまた、経口投与、鼻腔投与、噴霧投与、エアロゾル投与、直腸、もしくは膣投与用に調剤し、またはそれらを介して投与することができる。注射製剤に関しては、種々の有効な医薬担体が当技術分野で知られている。例えば、ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,第18版(2014)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子またはそのような核酸分子を含有するベクターを含む医薬組成物は、遺伝子送達によって送達することができる。遺伝子送達の方法は、当業者に周知である。in vivo遺伝子送達および発現に使用可能なベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルスベクター、例えば、変異ワクシニアアンカラ(MVA))、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするmRNA分子を直接対象に投与してもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子またはそのような核酸分子を含有するベクターは、流体力学的注射プラットフォームを用いて投与することができる。流体力学的注射法では、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を、操作したプラスミド(例えば、ウイルスプラスミド)内の強力なプロモーターの制御下に置く。プラスミドは多くの場合、大きな液量で静脈内に容易に送達される。流体力学的注射は、大きな液量の迅速な注射から得られる高圧が静脈からの流体およびプラスミドの管外遊出をもたらすように細胞透過性を高めるために、静脈内で、制御された流体力学的圧力を使用する。核酸分子の発現は、主として肝臓によって駆動される。マウスでは、流体力学的注射は、多くの場合、プラスミドの尾静脈への注射によって行われる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドをコードするmRNA分子は、流体力学的注射を用いて投与することができる。
本発明の医薬組成物の用量は、投与経路、治療される疾患、および対象の身体的特徴、例えば、年齢、体重、健康状態を含む因子によって決まる。本発明の医薬組成物は、0.01~500mg/kgの範囲(例えば、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、または500mg/kg)、より具体的な実施形態では、約0.1~約30mg/kg、より具体的な実施形態では、約0.3~約30mg/kgの用量の本発明のポリペプチドを含み得る。用量は、対象の疾患の程度および種々のパラメータなどの従来の因子に従って医師が適合させることができる。
医薬組成物は、その剤形に適した様式で、症状の改善または修復をもたらすために治療上有効な量で投与される。医薬組成物は、様々な剤形、例えば、静脈内剤形、皮下剤形、および経口剤形(例えば、摂取可能な溶液、薬物放出カプセル)で投与される。一般に、治療タンパク質は、0.1~100mg/kg、例えば、1~50mg/kgで投与される。本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、それを必要とする対象に、例えば、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、四半期毎、半年毎、1年毎、または医学的に必要に応じて1回以上(例えば、1~10回以上)投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、それを必要とする対象に、毎週、隔週、毎月、隔月、または四半期毎に投与することができる。用量は単回または複数回の投与計画で提供することができる。投与間のタイミングは、医学的状態が改善すると減らすことができ、または患者の健康が減退すると増やすことができる。
X.治療方法
本発明は、ActRIIbの細胞外部分からActRIIaの細胞外部分へアミノ酸を置換すると、特性が改善されたActRIIa変異体が得られるという発見に基づく。ActRIIbからActRIIaに残基を導入することによって作出されたActRIIa変異体は、より長い血清半減期およびBMP9に対する低い結合親和性などのActRIIaの有益な特性を保持し、かつ、アクチビンAおよびBに対する結合の増強(表4参照)などのActRIIbの有益な特性のいくつかを獲得する。これらのActRIIa変異体特性は、リガンド結合に関して内因性のアクチビン受容体と競合させるために治療的に使用することができるポリペプチドを生産する。ActRIIa変異体は受容体の細胞外部分を含むので、それらは可溶型であり、かつ、細胞内シグナル伝達経路を活性化することなく、リガンド(例えば、アクチビンAおよびB、ミオスタチン、GDF11)と結合してそれらを隔離することができる。よって、細胞外ActRIIa変異体は、アクチビンシグナル伝達の上昇が関連付けられている(例えば、アクチビン受容体またはアクチビン受容体リガンドの発現の増加に関連する)疾患または病態を治療するために使用することができる。例えば、アクチビンは骨疾患においてアップレギュレーションを受けることが判明しており、骨芽細胞活性を阻害することが知られ、アクチビンレベルの増加が骨疾患に寄与することが示唆される。アクチビンと結合し、内因性受容体とのその相互作用を低減する治療薬による治療は、骨塩密度を増加させ、骨損傷を含む疾患または病態を有する対象を治療するために使用可能であるということになる。
本発明は、ActRIIbの細胞外部分からActRIIaの細胞外部分へアミノ酸を置換すると、特性が改善されたActRIIa変異体が得られるという発見に基づく。ActRIIbからActRIIaに残基を導入することによって作出されたActRIIa変異体は、より長い血清半減期およびBMP9に対する低い結合親和性などのActRIIaの有益な特性を保持し、かつ、アクチビンAおよびBに対する結合の増強(表4参照)などのActRIIbの有益な特性のいくつかを獲得する。これらのActRIIa変異体特性は、リガンド結合に関して内因性のアクチビン受容体と競合させるために治療的に使用することができるポリペプチドを生産する。ActRIIa変異体は受容体の細胞外部分を含むので、それらは可溶型であり、かつ、細胞内シグナル伝達経路を活性化することなく、リガンド(例えば、アクチビンAおよびB、ミオスタチン、GDF11)と結合してそれらを隔離することができる。よって、細胞外ActRIIa変異体は、アクチビンシグナル伝達の上昇が関連付けられている(例えば、アクチビン受容体またはアクチビン受容体リガンドの発現の増加に関連する)疾患または病態を治療するために使用することができる。例えば、アクチビンは骨疾患においてアップレギュレーションを受けることが判明しており、骨芽細胞活性を阻害することが知られ、アクチビンレベルの増加が骨疾患に寄与することが示唆される。アクチビンと結合し、内因性受容体とのその相互作用を低減する治療薬による治療は、骨塩密度を増加させ、骨損傷を含む疾患または病態を有する対象を治療するために使用可能であるということになる。
本発明は、必要とする対象において骨塩密度を増加させる、骨形成を増加させる、骨強度を増加させる、骨折のリスクを低減する、または骨吸収を低減する(例えば、骨量減少を低減する)ために使用可能な組成物および治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、骨損傷(例えば、骨粗鬆症または骨減少症)をもたらす疾患を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨損傷を含む疾患または病態を有する対象においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用することに向けられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9のそれらの受容体、例えば、ActRIIa、ActRIIb、およびBMPRII(例えば、ActRIIa)への結合を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、ミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用する(例えば、ミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9のそれらの受容体、例えば、ActRIIa、ActRIIb、およびBMPRII(例えば、ActRIIa)への結合を低減または阻害する)と、対象の骨塩密度もしくは骨形成の増加、または対象の骨吸収の低減(例えば、骨量減少の低減)がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体を含むポリペプチド)は、対象において骨塩密度を増加させる、骨形成を増加させる、骨強度を増加させる、骨折のリスクを低減する、骨吸収を低減する(例えば、骨量減少を低減する)、またはミオスタチン、アクチビン、および/もしくはBMP9シグナル伝達に作用するために対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象の骨塩密度を増加させる。本明細書に記載の細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)は、処置前に得られた測定値と比較して、或いは未処置の対象において典型的に観察される骨塩密度、骨強度、骨形成、骨吸収または骨折のリスクと比較して、骨塩密度を増加する、骨形成を増加する、骨強度を増加する、骨吸収(即ち骨量減少)を低減する、または骨折のリスクを低減するであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象において血管合併症、例えば、血管透過性または漏出の増加を引き起こさない。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、対象は、骨損傷を含む疾患または病態(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少)を有する或いはそれらを発症するリスクにある。
本発明はまた、対象に本明細書に記載のポリペプチド(例えば、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチド)を投与することによって、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有する或いはそれらを発症するリスクにある対象を治療する方法も含む。いくつかの実施形態では、原発性骨粗鬆症は、加齢性またはホルモン関連骨粗鬆症(例えば、エストロゲンの低下に関連する)である。いくつかの実施形態では、続発性骨粗鬆症は、不動誘発性またはグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である。いくつかの実施形態では、骨癌は多発性骨髄腫であり、または癌転移関連骨量減少は多発性骨髄腫によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、治療関連骨量減少は、FGF-21もしくはGLP-1による治療、FGF-21もしくはGLP-1含有治療薬による治療、または2型糖尿病および/もしくは肥満の治療のため、あるいは癌治療(例えば、化学療法または放射線)のために起こる。いくつかの実施形態では、食事関連骨量減少は、くる病(例えば、ビタミンD欠乏症)である。いくつかの実施形態では、低重力関連骨量減少は、負荷関連骨量減少である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチド)は、骨損傷を含む疾患または病態(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、大理石骨病、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少)の発症を予防するため、および/あるいは骨損傷を含む疾患または病態を有すると既に診断された患者を治療するために使用することができる。骨損傷を含む疾患または病態を発症する可能性のある患者、例えば、骨損傷、または低骨量の遺伝的素因、家族歴を有する個体に、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチド)を、予防的に、細胞外ActRIIaポリペプチドが骨損傷の発生を予防または遅延し得るように投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド(例えば、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチド)は、対象に、骨損傷を含む疾患または病態(例えば、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少)の発症を予防するため、および/あるいは前記疾患または病態を有する患者を治療するため、あるいは対象においてミオスタチン、アクチビン、および/またはBMP9シグナル伝達に作用するため(例えば、アクチビン、ミオスタチン、および/またはBMP9のそれらの受容体への結合を低減または阻害するため)に投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨塩密度を増加させる(例えば、骨量を増加させる)、例えば、処置前に得られた測定値と比較して、或いは未処置の対象において典型的に観察される骨塩密度と比較して、骨塩密度を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨吸収を低減する(例えば、骨異化活性を低減するもしくは骨量減少を低減する)、例えば、処置前に得られた測定値と比較して、或いは未処置の対象において典型的に観察される骨吸収と比較して、骨吸収を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨形成を増加させる(例えば、骨同化活性を増加させる、または骨形成を増加させる)、例えば、処置前に得られた測定値と比較して、或いは未処置の対象において典型的に観察される骨形成と比較して、骨形成を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる、例えば、処置前に得られた測定値と比較して、或いは未処置の対象において典型的に観察される骨芽細胞活性または骨芽細胞形成と比較して、骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、破骨細胞活性または破骨細胞形成を低減する、例えば、処置前に得られた測定値と比較して、或いは未処置の対象において典型的に観察される破骨細胞活性または破骨細胞形成と比較して、破骨細胞活性または破骨細胞形成を低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、アクチビンおよび/またはミオスタチンのそれらの受容体への結合を低減または阻害する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、骨形成を増加させるか、骨塩密度を増加させるか、または皮質骨もしくは骨梁の骨吸収を低減する(例えば、骨量減少を低減する)。
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、1以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6以上のアミノ酸)のC末端伸長部をさらに含む、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~71(例えば、配列番号6~71)のいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドは、治療タンパク質として使用可能である。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、Fcドメイン単量体に融合された細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドの二量体(例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)は、治療タンパク質として使用可能である。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、ある部分(例えば、野生型Fcドメイン、アミノ酸置換(例えば、二量体形成を低減する1以上の置換)を有するFcドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、または血清アルブミン)に融合された細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のうちいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含むポリペプチドは、治療タンパク質として使用可能である。本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸、または前記核酸を含有するベクターもまた、本明細書に記載の方法のいずれかに従って投与することができる。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、ポリペプチド、核酸、またはベクターは医薬組成物の一部として投与することができる。本明細書に記載の方法に従って対象に投与することができる組成物を以下の表4に列記する。
実施例1:表面プラズモン共鳴(SPR)によるActRIIa変異体結合親和性の評価
ActRIIa変異体とリガンドであるアクチビンA、アクチビンB、成長分化因子11(GDF11)、およびBMP-9との間の相互作用の動態を測定するためにBiacore 3000を使用した。ActRIIa変異体をHEK293細胞で一過性に発現させ、プロテインAセファロースクロマトグラフィーを用いて細胞馴化培地から精製した。ActRIIa変異体を、適正な配向を確保するためにフローセル2~4において捕捉抗体(GEGEからの抗マウス)を用いてチップ(CM4またはCM5)に固定した。フローセル1は非特異的結合およびバルク効果を差し引くために参照セルとして使用した。GE Healthcare(商標)からのHBS-EP+バッファーをランニングバッファーとして使用した。物質移動効果を避けるために40μl/分にて、一定の濃度系で各リガンドを流した。各相互作用のKDを計算するため、BioLogic(商標)ソフトウェアによりScrubber2を用いてデータを解析した(表5)。
ActRIIa変異体とリガンドであるアクチビンA、アクチビンB、成長分化因子11(GDF11)、およびBMP-9との間の相互作用の動態を測定するためにBiacore 3000を使用した。ActRIIa変異体をHEK293細胞で一過性に発現させ、プロテインAセファロースクロマトグラフィーを用いて細胞馴化培地から精製した。ActRIIa変異体を、適正な配向を確保するためにフローセル2~4において捕捉抗体(GEGEからの抗マウス)を用いてチップ(CM4またはCM5)に固定した。フローセル1は非特異的結合およびバルク効果を差し引くために参照セルとして使用した。GE Healthcare(商標)からのHBS-EP+バッファーをランニングバッファーとして使用した。物質移動効果を避けるために40μl/分にて、一定の濃度系で各リガンドを流した。各相互作用のKDを計算するため、BioLogic(商標)ソフトウェアによりScrubber2を用いてデータを解析した(表5)。
実施例2:骨塩密度に及ぼす細胞外ActRIIa変異体の影響
成体雄C57/BL6マウスに偽手術(SHAM)または去勢手術(ORX)のいずれかを施す。両手術群を術後14日間回復させる。全ての動物を従来のケージで食物(既定食)および水を自由に摂らせて飼育する。次に、SHAM動物およびORX動物をビヒクル処置群(VEH)またはActRII変異体処置群のいずれかに割り当て、71日間、ビヒクルまたはActRII変異体(10mg/kg)の週2回(bi-weekly)、全身腹腔内投与を施す。体重を週に2回、処置時に測定した。体組成を試験0日目、次いで、治療開始後14日目、28日目、47日目、および71日目に、MiniSpec LF50 NMRアナライザーを用いて分析する。試験終了日に、対象組織(筋肉、脂肪組織、および脛骨)を外科的に摘出し、秤量し、さらなる分析のために適切に保存する。この時点で、ORX動物をまた、試験(testes)の完全な撤退を確定するために検査する。また、試験終了後にマイクロコンピュータ断層撮影法を用いて、種々の骨の皮質形態計測および柱状構造も評価する。
成体雄C57/BL6マウスに偽手術(SHAM)または去勢手術(ORX)のいずれかを施す。両手術群を術後14日間回復させる。全ての動物を従来のケージで食物(既定食)および水を自由に摂らせて飼育する。次に、SHAM動物およびORX動物をビヒクル処置群(VEH)またはActRII変異体処置群のいずれかに割り当て、71日間、ビヒクルまたはActRII変異体(10mg/kg)の週2回(bi-weekly)、全身腹腔内投与を施す。体重を週に2回、処置時に測定した。体組成を試験0日目、次いで、治療開始後14日目、28日目、47日目、および71日目に、MiniSpec LF50 NMRアナライザーを用いて分析する。試験終了日に、対象組織(筋肉、脂肪組織、および脛骨)を外科的に摘出し、秤量し、さらなる分析のために適切に保存する。この時点で、ORX動物をまた、試験(testes)の完全な撤退を確定するために検査する。また、試験終了後にマイクロコンピュータ断層撮影法を用いて、種々の骨の皮質形態計測および柱状構造も評価する。
実施例3:細胞外ActRIIa変異体の骨梁への影響
8週齢の雄C57Bl/6マウスに、ビヒクルまたはActRIIA/B(配列番号69)のいずれかを20mg/kgで隔週で4週間腹腔内投与した。投与が完了すると、PerkinElmer Quantum FXシステム(10mmのFOV、3分のスキャン、20μmのボクセルサイズ)を使用して、マウスを高解像度でマイクロCT画像化した。脛骨ASBMR骨形態計測パラメータは、近位脛骨成長プレートのすぐ遠位で選択されたスキャンボリューム(scan volume)の50スライス領域からAnalyzeProソフトウェアで測定した。このサブ領域の骨梁骨分率(trabecular bone fraction)から、骨梁数、骨梁厚さ、骨梁間隔のデータを計算した(図2)。ActRIIA/B(配列番号69)による処置は、骨梁骨体積分率、骨梁数の増加、および骨梁間隔の減少をもたらした。骨梁に対するこれらの変化は、骨強度の増加および骨折リスクの低減に関連している。
8週齢の雄C57Bl/6マウスに、ビヒクルまたはActRIIA/B(配列番号69)のいずれかを20mg/kgで隔週で4週間腹腔内投与した。投与が完了すると、PerkinElmer Quantum FXシステム(10mmのFOV、3分のスキャン、20μmのボクセルサイズ)を使用して、マウスを高解像度でマイクロCT画像化した。脛骨ASBMR骨形態計測パラメータは、近位脛骨成長プレートのすぐ遠位で選択されたスキャンボリューム(scan volume)の50スライス領域からAnalyzeProソフトウェアで測定した。このサブ領域の骨梁骨分率(trabecular bone fraction)から、骨梁数、骨梁厚さ、骨梁間隔のデータを計算した(図2)。ActRIIA/B(配列番号69)による処置は、骨梁骨体積分率、骨梁数の増加、および骨梁間隔の減少をもたらした。骨梁に対するこれらの変化は、骨強度の増加および骨折リスクの低減に関連している。
実施例4:骨粗鬆症のマウスモデルにおける細胞外ActRIIa変異体の影響
C57BL/6マウスは、9週齢で精巣摘除術(ORX)または偽手術(sham surgery)を受けた。6週間の回復期間の間にORXマウスは骨粗鬆症の表現型を発症し、その回復期間の後に、ORXマウスは週に2回、ビヒクルまたはActRIIA/B-Fc(Fcドメインに融合した配列番号69、20mg/kg)の腹腔内注射を受けた。実験終了時にマイクロCT(Perkin Elmer Quantum Fx)イメージングを実施した。各データセットのASBMR骨形態計測パラメータは、Bone Morphometry Analysis Add-onを使用して、AnalyzeProソフトウェア(AnalyzeDirect社、カンザス州オーバーランドパーク)を用いて計算した。骨梁パラメータの変化を評価するために、近位脛骨成長板のすぐ遠位にあるCTボリュームの50スライス領域を選択した。図3に示すように、ActRIIA/B-Fcで処置したものは、精巣摘除術に関連して骨体積分率が増加した(骨量減少が低減した)(*=p≦0.05;****=p≦0.0001)。
C57BL/6マウスは、9週齢で精巣摘除術(ORX)または偽手術(sham surgery)を受けた。6週間の回復期間の間にORXマウスは骨粗鬆症の表現型を発症し、その回復期間の後に、ORXマウスは週に2回、ビヒクルまたはActRIIA/B-Fc(Fcドメインに融合した配列番号69、20mg/kg)の腹腔内注射を受けた。実験終了時にマイクロCT(Perkin Elmer Quantum Fx)イメージングを実施した。各データセットのASBMR骨形態計測パラメータは、Bone Morphometry Analysis Add-onを使用して、AnalyzeProソフトウェア(AnalyzeDirect社、カンザス州オーバーランドパーク)を用いて計算した。骨梁パラメータの変化を評価するために、近位脛骨成長板のすぐ遠位にあるCTボリュームの50スライス領域を選択した。図3に示すように、ActRIIA/B-Fcで処置したものは、精巣摘除術に関連して骨体積分率が増加した(骨量減少が低減した)(*=p≦0.05;****=p≦0.0001)。
実施例5:細胞外ActRIIa変異体の投与による骨疾患の治療
本明細書に開示される方法に従って、当該技術分野の医師は、骨塩密度を増加させる、骨形成を増加させる、骨吸収(例えば、骨量減少)を低減する、骨折のリスクを低減するように、骨疾患(例えば、骨粗鬆症または骨減少症)を有するヒト患者などの対象を治療することができる。治療方法は、骨塩密度の標準的な臨床試験(例えば、二重X線吸収測定法)に基づいて、対象を治療の候補として診断または識別することを含み得る。対象を治療するために、当該技術分野の医師は、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号:6~72)のいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含有する組成物を対象に投与することができる。細胞外ActRIIa変異体を含む組成物は、骨疾患を治療するために、例えば非経口注射(例えば、静脈内注射)によって対象に投与されてもよい。細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)は、0.01~500mg/kg(例えば、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、または500mg/kg)のような治療上有効な量で投与される。いくつかの実施形態において、細胞外ActRIIa変異体は、隔月で、月に1回、2週間に1回、または少なくとも週に1回以上(例えば、週に1、2、3、4、5、6または7回以上)、治療上有効な量にて投与される。細胞外ActRIIa変異体は、骨塩密度を増加させる、骨形成を増加させる、骨吸収(例えば、骨量減少)を低減する、または骨折のリスクを低減するのに十分な量で投与される。
本明細書に開示される方法に従って、当該技術分野の医師は、骨塩密度を増加させる、骨形成を増加させる、骨吸収(例えば、骨量減少)を低減する、骨折のリスクを低減するように、骨疾患(例えば、骨粗鬆症または骨減少症)を有するヒト患者などの対象を治療することができる。治療方法は、骨塩密度の標準的な臨床試験(例えば、二重X線吸収測定法)に基づいて、対象を治療の候補として診断または識別することを含み得る。対象を治療するために、当該技術分野の医師は、細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号:6~72)のいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)を含有する組成物を対象に投与することができる。細胞外ActRIIa変異体を含む組成物は、骨疾患を治療するために、例えば非経口注射(例えば、静脈内注射)によって対象に投与されてもよい。細胞外ActRIIa変異体(例えば、配列番号1~72(例えば、配列番号6~72)のいずれか1つの配列を有する細胞外ActRIIa変異体)は、0.01~500mg/kg(例えば、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、または500mg/kg)のような治療上有効な量で投与される。いくつかの実施形態において、細胞外ActRIIa変異体は、隔月で、月に1回、2週間に1回、または少なくとも週に1回以上(例えば、週に1、2、3、4、5、6または7回以上)、治療上有効な量にて投与される。細胞外ActRIIa変異体は、骨塩密度を増加させる、骨形成を増加させる、骨吸収(例えば、骨量減少)を低減する、または骨折のリスクを低減するのに十分な量で投与される。
組成物を患者に投与した後、当該技術分野の専門家は、様々な方法により治療に応答した患者の改善を監視することができる。たとえば、医師は二重X線吸収測定を行うことで患者の骨塩密度を監視することができる。組成物の投与前の試験結果と比較して、患者が組成物の投与後に骨塩密度の増加、骨形成の増加、骨吸収の低減(例えば、骨量減少の低減)、または骨折のリスクの低減を示すという所見は、患者が治療に対して好ましく応答していることを示す。その後の用量は、必要に応じて決定し、そして投与することができる。
その他の実施形態
本発明をその特定の実施形態に関して記載してきたが、さらなる改変が可能であり、本願は、一般に本発明の原理に従う本発明のいずれの変形形態、使用、または適応も包含することが意図され、本開示からのそのような逸脱を含むことは、本発明が属する技術分野内の既知または関連の実施の範囲内にあり、以上に示す本質的特徴に該当し得ることが理解されるであろう。
本発明をその特定の実施形態に関して記載してきたが、さらなる改変が可能であり、本願は、一般に本発明の原理に従う本発明のいずれの変形形態、使用、または適応も包含することが意図され、本開示からのそのような逸脱を含むことは、本発明が属する技術分野内の既知または関連の実施の範囲内にあり、以上に示す本質的特徴に該当し得ることが理解されるであろう。
各個の刊行物、特許、および特許出願の全内容が本明細書の一部として援用されることが具体的かつ個々に示される場合と同等に、全ての刊行物、特許、および特許出願の全内容は本明細書の一部として援用される。
他の実施形態も以下の特許請求の範囲内にある。
他の実施形態も以下の特許請求の範囲内にある。
以下に、上記実施形態から把握できる技術思想を付記として記載する。
[付記1]骨塩密度を増加させることを必要とする対象において骨塩密度を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記2]骨吸収を低減させることを必要とする対象において骨吸収を低減させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記3]骨形成を増加させることを必要とする対象において骨形成を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記4]骨強度を増加させることを必要とする対象において骨強度を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記5]骨折のリスクを低減することを必要とする対象において骨折のリスクを低減する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記6]前記対象が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有するか、或いはそれらを発症するリスクにある、付記1~5のいずれか一項に記載の方法。
[付記7]骨損傷を含む疾患または病態を有する或いはそれらを発症するリスクがある対象において、ミオスタチン、アクチビンおよびBMP9のうちの少なくとも一つのシグナル伝達に作用する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記8]前記疾患または病態が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である、付記7に記載の方法。
[付記9]骨疾患を有するかあるいは骨疾患を発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記10]前記骨疾患が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である、付記9に記載の方法。
[付記11]原発性骨粗鬆症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記12]続発性骨粗鬆症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記13]骨減少症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記14]骨折を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記15]骨癌もしくは癌転移関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記16]パジェット病を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記17]腎性骨異栄養症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記18]治療関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記19]食事関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記20]低重力関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記21]不動関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記22]原発性骨粗鬆症が加齢性骨粗鬆症である、付記6、8、10、および11のいずれか一項に記載の方法。
[付記23]原発性骨粗鬆症はホルモン関連骨粗鬆症である、付記6、8、10、および11のいずれか一項に記載の方法。
[付記24]続発性骨粗鬆症は不動誘発性骨粗鬆症である、付記6、8、10、および12のいずれか一項に記載の方法。
[付記25]続発性骨粗鬆症はグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である、付記6、8、10および12のいずれか一項に記載の方法。
[付記26]癌は多発性骨髄腫である、付記6、8、10、および15のいずれか一項に記載の方法。
[付記27]治療はFGF-21治療である、付記6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
[付記28]治療はGLP-1治療である、付記6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
[付記29]治療は癌治療である、付記6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
[付記30]治療は、肥満または2型糖尿病のための治療である、付記6、8、10および18のいずれか一項に記載の方法。
[付記31]食事関連骨量減少はくる病である、付記6、8、10、および19のいずれか一項に記載の方法。
[付記32]前記方法は対象の骨形成を増加させる、付記1~31のいずれか一項に記載の方法。
[付記33]前記方法は対象における骨吸収を減少させる、付記1~32のいずれか一項に記載の方法。
[付記34]前記方法は骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる、付記1~33のいずれか一項に記載の方法。
[付記35]前記方法は破骨細胞活性を低減するか、または破骨細胞形成を低減する、付記1~34のいずれか一項に記載の方法。
[付記36]前記方法は骨折のリスクを低下させる、付記1~35のいずれか一項に記載の方法。
[付記37]前記方法は骨強度を増加させる、付記1~36のいずれか一項に記載の方法。
[付記38]前記方法は、アクチビンおよびミオスタチンのうちの少なくとも一方のそれらの受容体への結合を低減または阻害する、付記1~37のいずれか一項に記載の方法。
[付記39]前記方法は、前記対象において血管合併症を引き起こさない、付記1~38のいずれか一項に記載の方法。
[付記40]前記方法は血管透過性または漏出を増加させない、付記39に記載の方法。
[付記41]前記方法は、前記対象の骨塩密度を増加させる、付記1~40のいずれか一項に記載の方法。
[付記42]前記骨が皮質骨である、付記1~41のいずれか一項に記載の方法。
[付記43]前記骨が骨梁である、付記1~41のいずれか一項に記載の方法。
[付記44]表4の組成物は、前記対象において、骨塩密度を増加させる、骨吸収を低減する、骨吸収の速度を低減する、骨折のリスクを低減する、骨強度を増加させる、骨形成を増加させる、骨形成の速度を増加させる、破骨細胞活性を低減する、骨芽細胞活性を増加させる、骨疾患を治療する、またはミオスタチン、アクチビン、およびBMP9のうちの少なくとも一つのシグナル伝達に作用するために十分な量で投与される、付記1~43のいずれか一項に記載の方法。
以下に、上記実施形態から把握できる技術思想を付記として記載する。
[付記1]骨塩密度を増加させることを必要とする対象において骨塩密度を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記2]骨吸収を低減させることを必要とする対象において骨吸収を低減させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記3]骨形成を増加させることを必要とする対象において骨形成を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記4]骨強度を増加させることを必要とする対象において骨強度を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記5]骨折のリスクを低減することを必要とする対象において骨折のリスクを低減する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記6]前記対象が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有するか、或いはそれらを発症するリスクにある、付記1~5のいずれか一項に記載の方法。
[付記7]骨損傷を含む疾患または病態を有する或いはそれらを発症するリスクがある対象において、ミオスタチン、アクチビンおよびBMP9のうちの少なくとも一つのシグナル伝達に作用する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記8]前記疾患または病態が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である、付記7に記載の方法。
[付記9]骨疾患を有するかあるいは骨疾患を発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記10]前記骨疾患が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である、付記9に記載の方法。
[付記11]原発性骨粗鬆症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記12]続発性骨粗鬆症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記13]骨減少症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記14]骨折を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記15]骨癌もしくは癌転移関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記16]パジェット病を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記17]腎性骨異栄養症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記18]治療関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記19]食事関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記20]低重力関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記21]不動関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
[付記22]原発性骨粗鬆症が加齢性骨粗鬆症である、付記6、8、10、および11のいずれか一項に記載の方法。
[付記23]原発性骨粗鬆症はホルモン関連骨粗鬆症である、付記6、8、10、および11のいずれか一項に記載の方法。
[付記24]続発性骨粗鬆症は不動誘発性骨粗鬆症である、付記6、8、10、および12のいずれか一項に記載の方法。
[付記25]続発性骨粗鬆症はグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である、付記6、8、10および12のいずれか一項に記載の方法。
[付記26]癌は多発性骨髄腫である、付記6、8、10、および15のいずれか一項に記載の方法。
[付記27]治療はFGF-21治療である、付記6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
[付記28]治療はGLP-1治療である、付記6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
[付記29]治療は癌治療である、付記6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
[付記30]治療は、肥満または2型糖尿病のための治療である、付記6、8、10および18のいずれか一項に記載の方法。
[付記31]食事関連骨量減少はくる病である、付記6、8、10、および19のいずれか一項に記載の方法。
[付記32]前記方法は対象の骨形成を増加させる、付記1~31のいずれか一項に記載の方法。
[付記33]前記方法は対象における骨吸収を減少させる、付記1~32のいずれか一項に記載の方法。
[付記34]前記方法は骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる、付記1~33のいずれか一項に記載の方法。
[付記35]前記方法は破骨細胞活性を低減するか、または破骨細胞形成を低減する、付記1~34のいずれか一項に記載の方法。
[付記36]前記方法は骨折のリスクを低下させる、付記1~35のいずれか一項に記載の方法。
[付記37]前記方法は骨強度を増加させる、付記1~36のいずれか一項に記載の方法。
[付記38]前記方法は、アクチビンおよびミオスタチンのうちの少なくとも一方のそれらの受容体への結合を低減または阻害する、付記1~37のいずれか一項に記載の方法。
[付記39]前記方法は、前記対象において血管合併症を引き起こさない、付記1~38のいずれか一項に記載の方法。
[付記40]前記方法は血管透過性または漏出を増加させない、付記39に記載の方法。
[付記41]前記方法は、前記対象の骨塩密度を増加させる、付記1~40のいずれか一項に記載の方法。
[付記42]前記骨が皮質骨である、付記1~41のいずれか一項に記載の方法。
[付記43]前記骨が骨梁である、付記1~41のいずれか一項に記載の方法。
[付記44]表4の組成物は、前記対象において、骨塩密度を増加させる、骨吸収を低減する、骨吸収の速度を低減する、骨折のリスクを低減する、骨強度を増加させる、骨形成を増加させる、骨形成の速度を増加させる、破骨細胞活性を低減する、骨芽細胞活性を増加させる、骨疾患を治療する、またはミオスタチン、アクチビン、およびBMP9のうちの少なくとも一つのシグナル伝達に作用するために十分な量で投与される、付記1~43のいずれか一項に記載の方法。
Claims (44)
- 骨塩密度を増加させることを必要とする対象において骨塩密度を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 骨吸収を低減させることを必要とする対象において骨吸収を低減させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 骨形成を増加させることを必要とする対象において骨形成を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 骨強度を増加させることを必要とする対象において骨強度を増加させる方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 骨折のリスクを低減することを必要とする対象において骨折のリスクを低減する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 前記対象が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少を有するか、或いはそれらを発症するリスクにある、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 骨損傷を含む疾患または病態を有する或いはそれらを発症するリスクがある対象において、ミオスタチン、アクチビンおよびBMP9のうちの少なくとも一つのシグナル伝達に作用する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 前記疾患または病態が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である、請求項7に記載の方法。
- 骨疾患を有するかあるいは骨疾患を発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 前記骨疾患が、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、骨減少症、大理石骨病、骨折、骨癌もしくは癌転移関連骨量減少、パジェット病、腎性骨異栄養症、治療関連骨量減少、食事関連骨量減少、肥満の治療に関連する骨量減少、低重力関連骨量減少、または不動関連骨量減少である、請求項9に記載の方法。
- 原発性骨粗鬆症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 続発性骨粗鬆症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 骨減少症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 骨折を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 骨癌もしくは癌転移関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- パジェット病を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 腎性骨異栄養症を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 治療関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 食事関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 低重力関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 不動関連骨量減少を有するかまたは発症するリスクがある対象を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量の表4の組成物を投与することを含む方法。
- 原発性骨粗鬆症が加齢性骨粗鬆症である、請求項6、8、10、および11のいずれか一項に記載の方法。
- 原発性骨粗鬆症はホルモン関連骨粗鬆症である、請求項6、8、10、および11のいずれか一項に記載の方法。
- 続発性骨粗鬆症は不動誘発性骨粗鬆症である、請求項6、8、10、および12のいずれか一項に記載の方法。
- 続発性骨粗鬆症はグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症である、請求項6、8、10および12のいずれか一項に記載の方法。
- 癌は多発性骨髄腫である、請求項6、8、10、および15のいずれか一項に記載の方法。
- 治療はFGF-21治療である、請求項6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
- 治療はGLP-1治療である、請求項6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
- 治療は癌治療である、請求項6、8、10、および18のいずれか一項に記載の方法。
- 治療は、肥満または2型糖尿病のための治療である、請求項6、8、10および18のいずれか一項に記載の方法。
- 食事関連骨量減少はくる病である、請求項6、8、10、および19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は対象の骨形成を増加させる、請求項1~31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は対象における骨吸収を減少させる、請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は骨芽細胞活性または骨芽細胞形成を増加させる、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は破骨細胞活性を低減するか、または破骨細胞形成を低減する、請求項1~34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は骨折のリスクを低下させる、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は骨強度を増加させる、請求項1~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、アクチビンおよびミオスタチンのうちの少なくとも一方のそれらの受容体への結合を低減または阻害する、請求項1~37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、前記対象において血管合併症を引き起こさない、請求項1~38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は血管透過性または漏出を増加させない、請求項39に記載の方法。
- 前記方法は、前記対象の骨塩密度を増加させる、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記骨が皮質骨である、請求項1~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記骨が骨梁である、請求項1~41のいずれか一項に記載の方法。
- 表4の組成物は、前記対象において、骨塩密度を増加させる、骨吸収を低減する、骨吸収の速度を低減する、骨折のリスクを低減する、骨強度を増加させる、骨形成を増加させる、骨形成の速度を増加させる、破骨細胞活性を低減する、骨芽細胞活性を増加させる、骨疾患を治療する、またはミオスタチン、アクチビン、およびBMP9のうちの少なくとも一つのシグナル伝達に作用するために十分な量で投与される、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。
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