JP2023072010A - メッセンジャーrnaの精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年4月25日に出願された米国仮特許出願第61/984,503号の優先権を主張するものであり、当該出願の開示内容は参照により本明細書に援用される。
本明細書は、配列表(「Sequence listing.txt」と名付けられ、.txtファイルとして2015年4月24日に電子的に提出されている)を参照するものである。当該.txtファイルは2015年4月22日に作成されたものであり、11,184バイトのサイズがある。当該配列表の全内容が、参照により本明細書において援用される。
特定の態様において、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
メッセンジャーRNA(mRNA)の精製方法であって、
(a)不純調製物からmRNAを沈殿させること、及び
(b)沈殿したmRNAを含有する前記不純調製物を、前記沈殿したmRNAが膜に捕捉される膜ろ過を含む精製工程に供すること、及び
(c)前記mRNAを再可溶化することにより前記膜から前記捕捉された沈殿mRNAを溶離し、それにより精製されたmRNA溶液を得ること、
を含む前記方法。
(項目2)
膜ろ過を含む前記精製工程が、タンジェンシャルフローろ過である、項目1に記載の方法。
(項目3)
膜ろ過を含む前記精製工程が、ダイレクトフローろ過である、項目1に記載の方法。
(項目4)
mRNAを沈殿させる前記ステップが、前記不純調製物を、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチアン酸グアニジニウム、酢酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬を含有する溶液を用いて処理することを含む項目1、2、または3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記試薬が、チオシアン酸グアニジニウムである、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記溶液が、4Mのチオシアン酸グアニジニウム、0.5%のラウリルサルコシルナトリウム、及び25mMのクエン酸ナトリウムを含有する、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記溶液が、4Mのチオシアン酸グアニジニウム、及び0.5%のラウリルサルコシルナトリウムを含有する、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記溶液が、4Mのチオシアン酸グアニジニウム、及び25mMのクエン酸ナトリウムを含有する、項目5に記載の方法。
(項目9)
前記mRNAを沈殿させるステップが、無水エタノールを用いて前記不純調製物を処理するステップを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記膜が、ポリエーテルスルホン(mPES)(修飾なし)、ポリエーテルスルホン(mPES)中空糸膜、フッ化ポリビニリデン(PVDF)、酢酸セルロース、ニトロセルロース、MCE(混合セルロースエステル類)、超高分子量ポリエチレン(UPE)、ポリフルオロテトラエチレン(PTFE)、ナイロン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記方法が、溶離の前に前記捕捉された沈殿mRNAを洗浄することをさらに含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記洗浄ステップが、グアニジニウム緩衝液及びエタノールを含有する洗浄溶液、次いで約70~80%のエタノールを用いた複数回のすすぎサイクルを含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記複数回のすすぎサイクルは、5回より多いサイクルである、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記溶離ステップは、RNAseが含まれていない水を用いて前記捕捉された沈殿mRNAを再可溶化することを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記RNAseが含まれていない水が、5~10分間、再循環される、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記方法がさらに、前記精製されたmRNA溶液を透析するステップを含む、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記精製されたmRNA溶液が、100kDaの分子量カットオフ(MWCO)膜を用いて、1mMのクエン酸ナトリウムと透析される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記mRNAはin vitro合成され、前記不純調製物がIn vitro mRNA合成反応混合物を含有する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記不純調製物が未完了で中断されたRNA配列及び/またはin vitro合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記精製されたmRNA溶液が、1%未満の未完了で中断されたRNA配列及び/またはin vitro合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記精製されたmRNA溶液が、0.5%未満の未完了で中断されたRNA配列及び/またはin vitro合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目19に記載の方法。
(項目22)
前記精製されたmRNA溶液が、0.1%未満の未完了で中断されたRNA配列及び/またはin vitro合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目19に記載の方法。
(項目23)
前記精製されたmRNA溶液が、未完了で中断されたRNA配列及び/またはin vitro合成において用いられた酵素試薬を実質的に含まない、項目19に記載の方法。(項目24)
前記未完了で中断されたRNA配列及び/またはin vitro合成において用いられた酵素試薬が、銀染色、ゲル電気泳動、HPLC、UPLC、及び/またはキャピラリー電気泳動により測定される、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記未完了で中断されたRNA配列が、15未満の塩基を含有する、項目19~24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記未完了で中断されたRNA配列が、約8~12の塩基を含有する、項目19~24のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記in vitro合成において用いられた酵素試薬が、T7 RNAポリメラーゼ、DNAseI、ピロホスファターゼ、及び/またはRNAse阻害剤を含有する、項目19~24のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記mRNAが、バッチ当たり1グラム、10グラム、100グラム、1kg、10kg、または100kg以上の規模で精製される、先行項目のいずれか1項に記載の方法。(項目29)
前記mRNAが、キャップ及びテールが前記mRNAに付加される前に精製される、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
前記mRNAが、キャップ及びテールが前記mRNAに付加された後に精製される、項目1~28のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記mRNAが、キャップが付加された後に精製される、項目1~28のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記mRNAが、キャップ及び/またはテールが前記mRNAに付加される前及び後の両方で精製される、項目1~28のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記mRNAが、約1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、または20kb以上の長さである、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目34)
前記mRNAが、安定性を増強させるために1つ以上の修飾を含有する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記1つ以上の修飾が、修飾ヌクレオチド及び/または修飾糖リン酸主鎖を含有する、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記mRNAが修飾されていない、項目1~33のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記精製されたmRNAが、95%以上の完全性を有する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
前記精製されたmRNAが、98%以上の完全性を有する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記精製されたmRNAが、99%以上の完全性を有する、先行項目のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
メッセンジャーRNA(mRNA)の精製方法であって、
(a)不純調製物からmRNAを沈殿させること、及び
(b)沈殿されたmRNAを含有する前記不純調製物を、前記沈殿されたmRNAがろ過膜に捕捉される一方で不純物が透過により廃棄されるよう、タンジェンシャルフローろ過に供すること、及び
(c)前記沈殿したmRNAの再可溶化により前記捕捉された沈殿mRNAを溶離させ、それにより精製されたmRNA溶液を得ること、
を含む前記方法。
(項目41)
メッセンジャーRNA(mRNA)の作製方法であって、
in vitroでmRNAを合成すること、及び
先行項目のいずれか1項に記載の方法を用いて前記in vitro合成されたmRNAを精製すること、
を含む前記方法。
(項目42)
先行項目のいずれか1項に記載の方法を用いて精製されたメッセンジャーRNA(mRNA)。
(項目43)
ヒト対象への投与に適した単一種のmRNAを5グラム以上含有する精製されたmRNAのバッチ。
(項目44)
10グラム以上の単一種のmRNAを含有する、項目43に記載のバッチ。
(項目45)
25グラム以上の単一種のmRNAを含有する、項目43に記載のバッチ。
(項目46)
mRNA合成工程からの不純物が実質的に含まれていない、項目42~45のいずれか1項に記載のバッチ。
(項目47)
前記バッチが、未完了で中断されたRNA配列、DNA鋳型、及び/または前記単一種のmRNAのin vitro合成において用いられた酵素試薬を実質的に含まない、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記精製されたmRNAが、約5%未満のin vitro合成において用いられた酵素試薬を含有する、項目43~47のいずれか1項に記載のバッチ。
(項目49)
前記精製されたmRNAが、約95%を超える完全性を有する、項目43~48のいずれか1項に記載のバッチ。
(項目50)
先行項目のいずれか1項に記載の方法を用いて精製されたメッセンジャーRNAを含有する組成物。
(項目51)
in vitro合成されたメッセンジャーRNAを含有する組成物であって、前記組成物は、1%未満の未完了で中断されたRNA配列及び/またはin vitro合成において用いられた酵素試薬を含有する、前記組成物。
(項目52)
in vitro合成されたメッセンジャーRNA(mRNA)を含有する組成物であって、前記mRNAは、95%以上の完全性を有する、前記組成物。
本発明がさらに簡便に理解されるために、まず若干数の用語を以下に定義する。以下の用語及び他の用語の追加の定義は、本明細書全体を通して記述されている。
本発明は、とりわけ、mRNAを沈殿させ、次いで膜ろ過(たとえば、タンジェンシャルフローろ過)を行うことを含む工程に基づいた、不純調製物(たとえば、in vitro合成反応混合物)からmRNAを精製するための改善された方法を提供するものである。
本発明を用いて、任意のmRNAを精製してもよい。mRNAとは一般的にDNAからリボソームへと情報を運搬するRNA型と考えられている。mRNAの存在は一般的に非常に短く、プロセッシングと翻訳、その後の分解を含んでいる。一般的に、真核生物体においてmRNAのプロセッシングは、N-終末(5’)末端上に「キャップ」を、及びC-終末(3’)末端上に「テール」を付加することを含む。典型的なキャップは、7-メチルグアノシンキャップであり、7-メチルグアノシンキャップは最初の転写ヌクレオチドに5’-5’-三リン酸結合を介して結合されるグアノシンである。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に存在しているヌクレアーゼに対する抵抗性をもたらすという点で重要である。テールは一般的にポリアデニル化事象であり、それによりポリアデニリル部分がmRNA分子の3’末端に付加される。この「テール」の存在により、エキソヌクレアーゼ分解からのmRNAの保護が供される。メッセンジャーRNAはリボソームにより一連のアミノ酸へと翻訳され、当該アミノ酸がタンパク質を形成する。
RNAポリメラーゼ)、DNAseI、ピロホスファターゼ、ならびに/またはRNAse阻害剤を用いて行われる。正確な条件は具体的な応用方法によって変化し得る。これら試薬の存在は、いくつかの実施形態による最終産物中においては望ましいものではなく、それ故、不純物と呼称され得、これら不純物を1つ以上含有する調製物は不純調製物と呼称され得る。
本発明によると、mRNAはたとえばin vitro合成反応混合物等の不純調製物から当分野に公知の様々な沈殿法を用いて沈殿されてもよい。本明細書において、「沈殿」という用語(またはその文法的に同等のすべての用語)は、溶液中での固体の形成を指す。mRNAに関連して使用されるとき、当該「沈殿」という用語は、液体中のmRNAの不溶性形態または固体形態の形成を指す。
本発明によると、沈殿したmRNAを含有する不純調製物を、当該沈殿したmRNAが膜に捕捉または保持される、膜ろ過を含む精製工程に供してもよい。したがって、一部の実施形態において、不純調製物は、不溶物を除去するための前処理を行わずに沈殿を行った後に膜ろ過に供される。
典型的には、負荷ステップは、膜上に供給物(たとえば沈殿mRNAを含有する不純調製物)を負荷し、供給物を陽圧または陰圧により強制的に通過させ、残留物を膜上に捕捉または保持させることを含む。本明細書において、「残留物」という用語は、膜により保持される任意の非透過性の溶質及び/または不溶性物質を指す。本発明によると沈殿したmRNAは残留物として膜に捕捉される。本明細書において、「膜」という用語は、任意の多孔質の層または物質のシートを指す。本出願において、「膜」という用語は、フィルターと相互交換可能に用いられる。
典型的には、捕捉された不溶性mRNAは、膜上に保持された不純物を取り除くため、溶離の前に洗浄され得る。一部の実施形態において、洗浄ステップは、1以上の洗浄溶液を用いた複数回のすすぎサイクルを含む。たとえば、洗浄ステップは、グアニジニウム緩衝液及びエタノール、その後に70~80%のエタノール(たとえば、約70%、75%、または80%のエタノール)を用いた複数回のすすぎサイクルにより行われてもよい。ある特定の実施形態において、当該複数回のすすぎサイクルは、2回より多い、3回より多い、4回より多い、5回より多い、6回より多い、7回より多い、8回より多い、9回より多い、または10回より多いサイクルである。
典型的には、捕捉または保持されたmRNAは、当該沈殿mRNAの溶液への再可溶化により溶離される。たとえば、捕捉されたmRNAはRNAseが含まれていない水を用いて溶離されてもよい。ある特定の実施形態において、捕捉されたmRNAの溶離は、RNAseを含まない水の再循環が含まれる。たとえば、当該RNAseを含まない水は、約5~30分間(たとえば、約5~25分、約5~20分、または約5~15分)循環されてもよい。特定の実施形態において、当該RNAseを含まない水は、約5~10分間(たとえば、約5、6、7、8、9、または10分間)再循環される。
本発明により提供される特有の利点は、mRNA、特にin vitro合成されたmRNAを大規模で、または工業規模で精製する能力である。たとえばin vitro合成されたmRNAは、バッチ当たり約1グラム、1グラム、10グラム、50グラム、100グラム、200グラム、300グラム、400グラム、500グラム、600グラム、700グラム、800グラム、900グラム、1kg、5kg、10kg、50kg、または100kg以上の規模で精製され得る。一つの特定の実施形態において、in vitro合成されたmRNAはバッチ当たり10グラムの規模で精製され得る。他の特定の実施形態において、in vitro合成されたmRNAはバッチ当たり100グラムの規模で精製され得る。さらに他の特定の実施形態において、in vitro合成されたmRNAはバッチ当たり1kgの規模で精製され得る。
本発明は、治療応用に要求される高度な純度及び完全性を有する精製mRNAの大規模産生に対する緊急の必要性に取り組むものである。従来からある方法は一般的に規模の小さいものであり、充分に費用効率が高く、ヒト対象への投与に適した工業規模でのmRNA製造に必要とされる程度にまで規模を拡張することができない。対照的に、本発明方法は実施例において示されるように十分に拡張可能なものであり、医薬グレードのmRNAの費用効率が高い大規模製造が可能である。
メッセンジャーRNAの合成
蛍ルシフェラーゼ(FFL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)、及びヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)のメッセンジャーRNAを、当該遺伝子をコートするプラスミドDNA鋳型からin vitro転写により合成し、次いでそれらに5’キャップ構造(Cap1)(Fechter, P.; Brownlee, G.G. “Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins” J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249)、及びゲル電気泳動で測定して、およそ200ヌクレオチドの長さの3’ポリ(A)テールを付加した。各mRNA産物中に存在する5’及び3’非翻訳領域はそれぞれX及びYと表され、記述されるように定義される(以下を参照のこと)。標的メッセンジャーRNA構築物の合成は、5’及び3’非翻訳領域に隣接するコード配列からなる初期鎖が合成される2ステップの工程を含んだ。このキャップ及びテールを有さない構築物は精製され、さらにキャップ付加ステップで処理され、次いでポリ-A付加テール付加ステップが行われた。テール付加反応の最後に、初期精製工程と同様の方法で第二の精製ステップが行われた。
構築物の設計:
X1-配列番号1-Y1
AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA(配列番号1)
構築物の設計:
X1-配列番号2-Y1
AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAA(配列番号2)
構築物の設計:
X1-配列番号3-Y2
AUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA(配列番号3)
X1=
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(配列番号4)
Y1=
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU(配列番号5)
Y2=
GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU(配列番号6)
以下の各実施例において、mRNAの合成はRNAseが完全に無い状態で行われた。すべての試験管、バイアル、ピペットチップ、ピペット、緩衝液等は別段の明示が無い限り、ヌクレアーゼ不含有であることが必要であった。
vitro転写を介して合成された。所望されるmRNA前駆体(IVT)構築物を作製するために、約8mgの直線型DNA、rNTP(7.25mM)、DTT(10mM)、T7 RNAポリメラーゼ、RNAse阻害剤、ピロホスファターゼ、及び反応緩衝液(10xで、800mM Hepes(pH 8.0)、20mMのスペルミジン、250mMのMgCl2、pH7.7)の混合物を、RNaseが含まれていない水を用いて調製し、最終体積を180mLとした。反応混合物を20分~60分の間の時間幅で、37℃でインキュベートする。終了した時点で、当該混合物をDNaseIでさらに15分間処理し、適切にクエンチする。
上記のIVTステップからの精製mRNA産物(及び場合によって同様に最初のTFFろ過物)を10分間、65℃で変性させた。別個に、ある分量のGTP(1.0mM)、S-アデノシルメチオニン、RNAse阻害剤、2’-O-メチルトランスフェラーゼ、及びグアニリルトランスフェラーゼを反応緩衝液(10xで、500mMのTris-HCl(pH 8.0)、60mMのKCl、12.5mMのMgCl2)とともに混合し、最終濃度は1.6Lとする。変性が行われた時点で、mRNAを氷上で冷却させ、次いで当該反応混合物へ加えた。混合溶液を37℃で25~90分の間の時間幅でインキュベートした。完了後、ATP(2.0mM)、ポリAポリメラーゼ、及びテール付加反応緩衝液(10xで、500mMのTris-HCl(pH8.0)、2.5MのNaCl、100mMのMgCl2)のアリコートを添加し、総反応混合物をさらに37℃、20~45分の間の時間幅でインキュベートした。完了後、最終反応混合物をクエンチし、適切に精製した。
mRNAの精製
メッセンジャーRNAは様々な方法を用いて沈殿させることができる。たとえば塩化リチウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、酢酸アンモニウム、及び他の塩の使用により、反応混合物からmRNAが効率的に沈殿される。
以下の実施例において、他で別段の表記が無い限り、タンジェンシャルフローろ過(TFF)系は、ろ過膜及び蠕動ポンプ(Spectrum system社)から構成され、膜を通過する液体のタンジェンシャル循環は約130mL/分の供給速度であり、透過に対する流速は30mL/分であった。使用されたTFF膜は、MidiKros 500kDa mPES 115cm2(Spectrum Labs社)であった。使用前に、フィルターカートリッジはヌクレアーゼが含まれていない水を用いて洗浄され、さらに0.2NのNaOHを用いて清浄化された。最終的に当該系は、透過物及び残留物のpHが約pH6に達するまでヌクレアーゼが含まれていない水を用いて清浄化された。TFFを介したmRNAの単離は図1に記載されるように行うことができる。
mRNA精製の代表的な例として、1グラムのバッチの蛍ルシフェラーゼ(FFL)mRNAを、in vitro法を用いて転写し、キャップ及びポリAテールが無い上記の中間構築物を製造した。この反応は、総量約180mLを維持し、完了した時点でDNAseI(約9.0KU)を添加することによりクエンチされた。得られた溶液は4Mのチオシアン酸グアニジニウム、0.5%のラウリルサルコシルナトリウム、及び25mMのクエン酸ナトリウムの均一な溶液(1500mL)を用いて処理され、総量は1.68Lとした。得られた混合物は約5分間、大気温度中に置かれ、次いで1.1Lの無水エタノールでさらに処理された。mRNAはゆっくりと沈殿し、懸濁液は約5分間、大気温度に置かれた。完了した時点で、タンジェンシャルフローろ過(TFF)を用いて全ての不均一懸濁液をろ過膜にポンプで通した。
mRNA精製の第二の代表例として、1グラムのバッチのASS1 mRNAをin vitro法を用いて転写し、キャップ及びポリAテールが無い上記の中間構築物を製造した。この反応は、総量約180mLを維持し、完了した時点でDNAseI(約9.0KU)を添加することによりクエンチされた。得られた溶液を4Mのチオシアン酸グアニジニウム、0.5%のラウリルサルコシルナトリウム、及び25mMのクエン酸ナトリウムの均一な溶液(1500mL)を用いて処理し、総量は1.68Lとした。得られた混合物は約5分間、大気温度中に置かれ、次いで1.1Lの無水エタノールでさらに処理された。メッセンジャーRNAはゆっくりと沈殿し、懸濁液は約5分間、大気温度に置かれた。完了した時点で、タンジェンシャルフローろ過(TFF)を用いて全ての不均一懸濁液をろ過膜にポンプで通し、上述のように単離した。
mRNA精製の第三の代表例として、1.5グラムのバッチの修飾CFTR mRNAをin vitro法を用いて転写し、キャップ及びポリAテールが無い上記の中間構築物を製造した。この反応は、総量約270mLを維持し、完了した時点でDNAseI(約13.5KU)を添加することによりクエンチされた。得られた溶液を4Mのチオシアン酸グアニジニウム、0.5%のラウリルサルコシルナトリウム、及び25mMのクエン酸ナトリウムの均一な溶液(1500mL)を用いて処理し、総量は1.77Lとした。得られた混合物は約5分間、大気温度中に置かれ、次いで1.1Lの無水エタノールでさらに処理された。mRNAはゆっくりと沈殿し、懸濁液は約5分間、大気温度に置かれた。完了した時点で、タンジェンシャルフローろ過(TFF)を用いて全ての不均一懸濁液をろ過膜にポンプで通し、上述のように単離した。
精製されたmRNA中の酵素の存在に関する検証
SYPRO染色ゲル
標準的なSYPRO染色タンパク質ゲルを行い、精製の前後に存在するすべての残留試薬酵素の有無を測定した。ゲルは35分間、200Vで泳動された。
すべてのmRNAバッチ及び分画の銀染色は、SilverQuest(登録商標)(Life Technologies社、カタログ番号LC6070)を用いて、メーカーのプロトコールを使用し行われた。簡潔に述べると、試料を負荷し(RNAseの処理有り、またはなし)、負荷された酵素対照のレーンと比較しながらモニターされた。ゲルは35分間、200Vで泳動された。露出時間は8分間、割り当てられた。
別段の表記が無い限り、mRNAのサイズ及び完全性は、ゲル電気泳動を用いて評価された。自分達で注ぎ作製した1.0%のアガロースゲル、またはInvitrogen社のE-Gelプレキャスト1.2%アガロースゲルのいずれかを用いた。メッセンジャーRNAはウェル当たり1.0~1.5μgの量で負荷した。完了した時点で、mRNAのバンドはエチジウムブロミドを用いて可視化させた。
別段の記載がない限り、蛍ルシフェラーゼ(FFL)、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)のmRNA、及びCFTRのmRNAのin vitroトランスフェクションは、HEK293T細胞を用いて行われた。1マイクログラムの各mRNA構築物のトランスフェクションは、リポフェクタミンを用いて別々のウェル中で行われた。細胞は、選択時点(たとえば4時間、8時間等)で回収され、各タンパク質産物が解析された。FFL mRNAに対しては、生物発光アッセイ法を用いて、細胞溶解物がルシフェラーゼ産生に関し解析された。ASS1 mRNAに対しては、ELISAアッセイ法を用いて、細胞溶解物がASS1産生に関し解析された。CFTR mRNAに対しては、ウェスタンブロット法を用いて、細胞溶解物がCFTR産生に関し解析された。
Promega社のLuciferase Assay System(商品番号E1500)を用いて生物発光アッセイ法が行われた。ルシフェラーゼアッセイ試薬は、10mLのルシフェラーゼアッセイ緩衝液をルシフェラーゼアッセイ基質に加え、ボルテックスにより混合することにより調製された。20μLの均一な試料を96ウェルプレート上に負荷し、次いで20μLの各試料に対するプレート対照を負荷した。それとは別に、120μLのルシフェラーゼアッセイ試薬(上述のように調製)を96ウェルの平底プレートの各ウェルに負荷した。Molecular Device社のFlex Station装置を用いて適切なチャンバーに各プレートを挿入し、発光量を相対発光量(RLU)にて測定した。
続いて標準的なELISA法を、捕捉抗体としてマウス抗ASS1 2D1-2E12
IgGを、二次(検出)抗体としてウサギ抗ASS1 #3285 IgG(Shire Human Genetic Therapies社)を用いて行った。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ウサギIgGは、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)基質溶液の活性化のために用いた。20分後、反応は2NのH2SO4を用いてクエンチされた。検出はMolecular Device社のSpectraMax装置上で吸光(450nm)によりモニターされた。未処理のマウス血清及び器官、ならびにヒトASS1タンパク質を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として用いた。
ウェスタンブロットは免疫沈降法(DynabeadsG)を用いて得られたタンパク質試料上で行われた。概略すると、細胞及び組織のホモジネートを処理し、抗ヒトCFTR抗体(R&D Systems社、MAB25031)に前もって結合されたDynabead Gを用いて処理した。ヒトCFTRタンパク質の検出はAb570を用いて行われた。
本実施例は、沈殿後にタンジェンシャルフローろ過を用いることにより、酵素試薬ならびにショートマーが除去され、蛍ルシフェラーゼ(FFL)mRNA、アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS1)mRNA、及び嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)mRNAの精製が成功したことを示す。多くの典型的なカオトロピック条件の使用に成功し、上記に列記されるmRNAを沈殿させた。
mRNAであった。
FFL構築物:
1.外部供給業者から購入したFFL mRNA
2.市販キットで精製したFFL mRNA
3.沈殿-TFF法で精製したFFL mRNA
当分野の当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識する、または日常的な実験の範囲を超えずに確認することができるであろう。本発明の範囲は上記の詳細な説明に限定されず、以下の請求項において記載される通りである。
Claims (1)
- 図面に記載の発明。
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