JP2023062550A - Method of detecting salmonella infection using bama protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＢａｍＡタンパク質を利用したサルモネラ属菌感染の検出方法、ならびに当該検出方法に用いるための抗原試薬およびキットに関する。 The present invention relates to a detection method for Salmonella infection using BamA protein, and an antigen reagent and kit for use in the detection method.
サルモネラ属菌は、２，６００種類以上の血清型に細分されるグラム陰性桿菌である。サルモネラ症（家畜・家禽）および家禽サルモネラ感染症は、それぞれ、家畜伝染病予防法に基づく届出伝染病および法定伝染病に指定されており、それらの感染予防対策が重要である。家畜や家禽にサルモネラ属菌が感染すると、発熱、食欲不振、元気消失を主徴として、急性敗血症や慢性的な下痢症を引き起こす。しかしながら、科学的手法の限界などから国内外の家畜や家禽のサルモネラ症の発生は、完全には抑制されていない。また、サルモネラ症が発生した農場では、菌の清浄化に難渋する場合がある。 Salmonella spp. are Gram-negative bacilli subdivided into over 2,600 serotypes. Salmonellosis (livestock and poultry) and poultry salmonella infections are designated as notifiable and legally designated infectious diseases under the Act on Domestic Animal Infectious Diseases Control, respectively, and preventive measures against these infections are important. Infection of livestock and poultry with Salmonella spp. is characterized by fever, anorexia and lethargy, and causes acute sepsis and chronic diarrhea. However, the outbreak of salmonellosis in domestic and foreign livestock and poultry has not been completely controlled due to the limitations of scientific methods. In addition, salmonellosis-affected farms may have difficulty cleaning up the fungus.
菌の清浄化に向けた取り組みとして、宿主からの菌の分離培養や血清中の抗体測定によるモニタリングが実施されている。血清中の抗体の定期的な測定によってサルモネラ属菌の感染時期を推定することにより、適切な感染対策措置を講じることが可能となる。 Efforts to cleanse the bacteria include isolating and culturing the bacteria from the host and monitoring by measuring antibodies in serum. By estimating the timing of infection with Salmonella spp. by periodically measuring antibodies in serum, it becomes possible to take appropriate infection control measures.
一方、農場においてサルモネラ症が発生した場合、感染拡大の防止を目的として、ワクチンを投与する場合がある。現在、国内でウシおよびニワトリに接種されているサルモネラワクチンは、菌体をホルマリン処理により不活化したワクチンであり、感染防止対策として非常に有効な手段となっている。 On the other hand, when salmonellosis occurs on a farm, a vaccine may be administered to prevent the spread of infection. Salmonella vaccines currently inoculated to cattle and chickens in Japan are inactivated by formalin treatment, and are a very effective means for preventing infection.
しかしながら、ワクチン接種個体の血清中の抗サルモネラ抗体を測定すると、サルモネラ属菌の感染個体と同様に、陽性反応を示してしまう。すなわち、ワクチン接種により、サルモネラ属菌の感染個体と非感染個体の区別がつかなくなるといった科学的瑕疵が生じてしまう。このためサルモネラ属菌の感染個体とワクチン接種個体とを識別できる検査法の開発が望まれている。 However, when anti-Salmonella antibodies are measured in the sera of vaccinated individuals, they show a positive reaction, similar to Salmonella-infected individuals. In other words, vaccination results in a scientific flaw that makes it impossible to distinguish Salmonella-infected individuals from non-infected individuals. Therefore, it is desired to develop a test method capable of distinguishing Salmonella-infected individuals from vaccinated individuals.
このような識別が可能な検査法としては、例えば、サルモネラ属菌のべん毛抗原を構成するタンパク質を利用した検査法が知られている（特許文献１）。 As an inspection method capable of such discrimination, for example, an inspection method using a protein that constitutes flagellar antigens of Salmonella spp. is known (Patent Document 1).
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、不活化ワクチンを接種した個体と識別して、サルモネラ属菌に感染した個体を検出することが可能な新たな方法を提供することにある。また、本発明は、この検出に用いるための試薬およびキットを提供することをも目的とする。 The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a new method capable of detecting individuals infected with Salmonella spp. by distinguishing them from individuals vaccinated with an inactivated vaccine. is to provide Another object of the present invention is to provide reagents and kits for use in this detection.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、サルモネラ属菌の菌体膜タンパク質であるＢａｍＡタンパク質が、不活化ワクチンを接種した個体で生産される抗サルモネラ抗体よりも、サルモネラ属菌に感染した個体で生産される抗サルモネラ抗体に対して高い親和性を有し、当該タンパク質を抗サルモネラ抗体の検出のための抗原として用いることにより、高い精度でサルモネラ属菌の感染を検出することが可能であることを見出した。その一方、サルモネラ属菌のＩＩＩ型分泌装置より菌体外へ分泌されるタンパク質（ＳｓｅＧタンパク質やＳｓｅＦタンパク質）、菌体膜タンパク質(ＬｐｔＤタンパク質）、およびＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を抗原として用いた場合には、上記２つの抗サルモネラ抗体への親和性に有意な差異が認められなかった。以上から、ＢａｍＡタンパク質が示した特異性は、サルモネラ属菌を構成する分子に共通の事象ではないことが判明した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors found that BamA protein, which is a cell membrane protein of Salmonella spp. It has a high affinity for anti-Salmonella antibodies produced by individuals infected with the genus Salmonella, and by using the protein as an antigen for detecting anti-Salmonella antibodies, it can detect Salmonella infection with high accuracy. found that it is possible to On the other hand, when proteins (SseG protein and SseF protein) secreted from the type III secretion apparatus of Salmonella spp., cell membrane proteins (LptD protein) and LPS (Lipopolysaccharide) are used as antigens, , no significant difference in affinity to the two anti-Salmonella antibodies was observed. From the above, it was found that the specificity exhibited by the BamA protein is not a common phenomenon among the molecules that constitute Salmonella.
本発明は、上記知見に基づく、ＢａｍＡタンパク質を利用したサルモネラ属菌感染の検出方法、当該検出方法に用いるための試薬およびキットに関し、より詳しくは、以下を提供するものである。 Based on the above findings, the present invention relates to a detection method for Salmonella infection using BamA protein, reagents and kits for use in the detection method, and more specifically provides the following.
（１）ＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片を抗原として試料中の抗サルモネラ抗体を免疫学的に検出することを含む、サルモネラ属菌感染の検出方法。 (1) A method for detecting infection with Salmonella, which comprises immunologically detecting an anti-Salmonella antibody in a sample using BamA protein or a functional fragment thereof as an antigen.
（２）ＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片を含む、サルモネラ属菌感染を免疫学的に検出するための抗原試薬。 (2) an antigen reagent for immunologically detecting Salmonella infection, comprising a BamA protein or a functional fragment thereof;
（３）（２）に記載の抗原試薬を含む、サルモネラ属菌感染を免疫学的に検出するのためのキット。 (3) A kit for immunologically detecting Salmonella infection, comprising the antigen reagent according to (2).
本発明により、ＢａｍＡタンパク質を利用して、簡便かつ高い精度で、サルモネラ属菌感染を検出することが可能となった。サルモネラ属菌は、家畜や家禽に感染して、その生産性に影響を与え、経済的な損失を生じさせるばかりでなく、ヒトにおいて食中毒を引き起こす人獣共通感染症の原因菌である。本発明を利用すれば、家畜や家禽などの動物やヒトにおいて、効率的にサルモネラ属菌の感染予防を行うことが可能となる。特に、ニワトリにおいては、ワクチン接種個体の血清が、ひな白痢（家禽サルモネラ感染症）の診断に使用する、ひな白痢急速凝集診断液に対して偽陽性を示す場合があり、ワクチン接種がひな白痢の診断を困難にしている。本発明は、こうした既存の診断の補助としても利用できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it has become possible to detect Salmonella infection simply and with high accuracy using the BamA protein. Salmonella is a zoonotic pathogen that infects livestock and poultry, affecting their productivity and causing economic losses, as well as causing food poisoning in humans. By using the present invention, it becomes possible to efficiently prevent Salmonella infection in animals such as livestock and poultry, and in humans. In particular, in chickens, the serum of vaccinated individuals may show false positives against the rapid-aggregating brood diarrhea (poultry salmonella infection) diagnostic fluid used to diagnose brood dysentery (poultry salmonella infection). makes diagnosis difficult. The present invention can also be used as an adjunct to such existing diagnoses.
本発明は、ＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片を抗原として試料中の抗サルモネラ抗体を免疫学的に検出することを含む、サルモネラ属菌感染の検出方法を提供する。 The present invention provides a method for detecting Salmonella spp. infection, which comprises immunologically detecting anti-Salmonella antibodies in a sample using BamA protein or a functional fragment thereof as an antigen.
本発明の検出方法において感染を検出する「サルモネラ属菌」としては、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． ｅｎｔｅｒｉｃａに属するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｄｕｂｌｉｎ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｐｕｌｌｏｒｕｍなどの各血清型のサルモネラ属菌が挙げられるが、これらに制限されない。 Examples of "Salmonella spp." to be detected in the detection method of the present invention include Salmonella enterica subsp. Salmonella Typhimurium, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Dublin, Salmonella Enteritidis, Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum, etc. belonging to the genus Salmonella enterica, but these is not limited to
本発明においてサルモネラ属菌感染の検出に用いる「試料」としては、抗サルモネラ抗体が存在し得る試料である限り特に制限はない。一般的には、サルモネラ属菌が感染し得る個体から採取された血清、血漿、および全血などの血液試料である。試料の由来する生物としては、サルモネラ属菌が感染し得る生物であれば特に制限はなく、ヒトおよび他の動物が挙げられる。動物は、家畜であってもよく、愛玩動物（ペット）であっても、実験動物であっても、それ以外の用途の動物であってもよい。動物としては、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、カモ、ウズラ、キジ、ハト、七面鳥、ホロホロ鳥、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。 In the present invention, the "sample" used for detection of Salmonella infection is not particularly limited as long as it can contain anti-Salmonella antibodies. Generally, blood samples such as serum, plasma, and whole blood taken from individuals that can be infected with Salmonella spp. The organism from which the sample is derived is not particularly limited as long as it can be infected with Salmonella spp., and includes humans and other animals. The animal may be a domestic animal, a companion animal (pet), an experimental animal, or an animal for other purposes. Examples of animals include, but are not limited to, chickens, ducks, geese, ducks, quails, pheasants, pigeons, turkeys, guinea fowls, cows, pigs, horses, sheep, goats, dogs, cats, and the like.
これらの試料は、必要に応じて希釈液で希釈または懸濁したものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液などの緩衝液が挙げられる。また、本発明における試料は、必要に応じて適宜前処理が施されたものであってもよい。前処理としては、例えば、凍結、濃縮、分画、精製などの処理や、ｐＨ調整剤、安定化剤、保存剤、防腐剤などの添加処理などが挙げられ、これら処理のうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。 These samples may be diluted or suspended in a diluent if necessary. Examples of the diluent include phosphate buffer, Tris buffer, Good's buffer, borate buffer, acetate buffer, citrate buffer, glycine buffer, succinate buffer, phthalate buffer, and the like. Buffers are included. In addition, the sample in the present invention may be appropriately pretreated as necessary. Examples of the pretreatment include treatments such as freezing, concentration, fractionation, and purification; It may be one or a combination of two or more.
本発明においては、サルモネラ属菌感染の指標として、試料中の抗サルモネラ抗体を検出する。「抗サルモネラ抗体」は、前記サルモネラ属菌に特異的に結合可能な抗体であり、より具体的には、試料の由来する個体の体内において産生された抗体である。抗サルモネラ抗体のアイソタイプは、生物種により変動し得るが、例えば、IｇＹ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡのうちのいずれであってもよく、これらのうちの２種以上の組み合わせであってもよい。また、アイソタイプとしては、それぞれ、いずれのサブクラスであってもよい。サルモネラ属菌感染後の個体の体内における抗サルモネラ抗体の出現時期および持続時間は、抗体の種類により変動し得る。従って、本発明において検出するサルモネラ属菌感染には、サルモネラ属菌の現在および過去の感染が含まれる。 In the present invention, an anti-Salmonella antibody in a sample is detected as an indicator of Salmonella infection. An "anti-Salmonella antibody" is an antibody that can specifically bind to the Salmonella spp., more specifically, an antibody produced in the body of an individual from whom a sample is derived. The isotype of the anti-Salmonella antibody may vary depending on the species, and may be, for example, IgY, IgG, IgM, IgA, or a combination of two or more of these. Moreover, each isotype may be of any subclass. The time of appearance and duration of anti-Salmonella antibodies in an individual's body after infection with Salmonella spp. can vary depending on the type of antibody. Accordingly, Salmonella infections detected in the present invention include current and past infections with Salmonella.
本発明においては、抗サルモネラ抗体の検出のための抗原として、ＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片を用いることを特徴とする。「ＢａｍＡタンパク質」は、サルモネラ属菌の菌体膜タンパク質であるである。ＢａｍＡタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：２に、当該タンパク質をコードするＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：１に示す。但し、自然界においては、遺伝子の変異により当該タンパク質のアミノ酸配列が変化しうることは理解されたい。抗原としては、ＢａｍＡタンパク質の「機能的断片」を用いることもできる。ここで機能的断片とは、抗サルモネラ抗体に対して結合活性を有するＢａｍＡタンパク質の断片を意味する。ＢａｍＡタンパク質の断片の抗サルモネラ抗体への結合活性は、後述する免疫学的手法により評価することができる。ＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片は、抗サルモネラ抗体への結合活性を損なわない限り、変異導入などの修飾を行ってもよい。 The present invention is characterized by using a BamA protein or a functional fragment thereof as an antigen for detecting anti-Salmonella antibodies. "BamA protein" is a cell membrane protein of Salmonella spp. A typical amino acid sequence of BamA protein is shown in SEQ ID NO: 2, and a typical nucleotide sequence of DNA encoding the protein is shown in SEQ ID NO: 1. However, it should be understood that in nature, the amino acid sequence of the protein may change due to genetic mutation. A "functional fragment" of the BamA protein can also be used as the antigen. Here, the functional fragment means a fragment of BamA protein having binding activity to anti-Salmonella antibody. The binding activity of the BamA protein fragment to the anti-Salmonella antibody can be evaluated by an immunological technique described below. The BamA protein or a functional fragment thereof may be modified such as mutagenesis as long as the binding activity to the anti-Salmonella antibody is not impaired.
ＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片は、当技術分野で周知の方法により、組換えタンパク質または天然タンパク質として調製することができる。組換えタンパク質は、例えば、ＢａｍＡタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１記載の塩基配列を含むＤＮＡ）または当該タンパク質の断片をコードするＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入し、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、当該宿主細胞の抽出物または培養上清から精製することにより調製することができる。精製手段としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過などが挙げられるが、これらに制限されない。また、ＢａｍＡタンパク質またはその断片を宿主細胞（例えば、大腸菌など）で、複数のヒスチジンが付加された組換えタンパク質として、またはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として発現させる場合、発現させた組換えタンパク質は、それぞれニッケルカラムまたはグルタチオンカラムを用いて、アフィニティー精製することができる。融合タンパク質の精製後に、トロンビンまたは第Ｘａ因子で必要に応じて切断することにより、目的のタンパク質や断片以外の領域を除去することができる。天然のタンパク質は、当業者に公知の方法、例えば、ＢａｍＡタンパク質に対する抗体が結合したアフィニティカラムに、サルモネラ属菌の抽出物を接触させることにより、調製することができる。 A BamA protein or functional fragment thereof can be prepared as a recombinant or natural protein by methods well known in the art. Recombinant protein is obtained by inserting DNA encoding BamA protein (eg, DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) or DNA encoding a fragment of the protein into an appropriate expression vector, It can be prepared by introducing into a suitable host cell and purifying from an extract or culture supernatant of the host cell. Purification means include, but are not limited to, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, gel filtration, and the like. Also, when expressing the BamA protein or a fragment thereof in a host cell (e.g., E. coli, etc.) as a recombinant protein with multiple histidines or as a fusion protein with a glutathione-S-transferase protein, the expressed combination Recombinant proteins can be affinity purified using nickel or glutathione columns, respectively. After purification of the fusion protein, regions other than the target protein or fragment can be removed by cleaving with thrombin or factor Xa as necessary. The native protein can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, by contacting the Salmonella extract with an affinity column conjugated with antibodies against the BamA protein.
本発明に用いる免疫学的測定法の検出原理としては、高感度な検出システムを構築することができる点で、サンドイッチ法が好適である。サンドイッチ法においては、固相化した捕捉用分子で抗サルモネラ抗体を捕捉し、それを標識物質が結合した検出用分子に認識させ、洗浄後、標識物質の種類に応じた検出を行う。固相としては、例えば、プラスチックプレートなどのプレート、ニトロセルロースなどの繊維状物質、磁性粒子やラテックス粒子などの粒子を用いることができる。 As the detection principle of the immunoassay method used in the present invention, the sandwich method is suitable in that a highly sensitive detection system can be constructed. In the sandwich method, an anti-Salmonella antibody is captured by a immobilized capture molecule, recognized by a detection molecule bound to a labeling substance, washed, and then detected according to the type of labeling substance. Examples of the solid phase include plates such as plastic plates, fibrous substances such as nitrocellulose, and particles such as magnetic particles and latex particles.
サンドイッチ法においては、抗サルモネラ抗体の捕捉用分子および検出用分子の少なくとも一方の分子に、抗原としてのＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片を用いる。他の一方の分子は、抗サルモネラ抗体に結合し得る限り特に制限はないが、例えば、抗サルモネラ抗体に対する抗体（二次抗体）やその他抗サルモネラ抗体に結合するタンパク質を用いることができる。 In the sandwich method, BamA protein or a functional fragment thereof is used as an antigen for at least one of the capturing molecule and the detecting molecule of the anti-Salmonella antibody. The other molecule is not particularly limited as long as it can bind to an anti-Salmonella antibody. For example, an antibody (secondary antibody) to an anti-Salmonella antibody or other protein that binds to an anti-Salmonella antibody can be used.
検出用分子には、通常、標識物質が結合されている。標識物質としては、検出可能な物質であれば特に制限はないが、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、βガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）などの酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光色素、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）などの蛍光蛋白質、１２５Ｉなどの放射性同位元素、金粒子、アビジン、ビオチン、ラテックスなどが挙げられる。標識物質として酵素を用いた場合には、基質として、発色基質、蛍光基質、あるいは化学発光基質などを添加することにより、基質に応じて種々の検出を行うことができる。 A labeling substance is usually bound to the detection molecule. Labeling substances are not particularly limited as long as they are detectable substances. and rhodamine isothiocyanate (RITC), fluorescent proteins such as allophycocyanin (APC) and phycoerythrin (R-PE), radioactive isotopes such as 125 I, gold particles, avidin, biotin, and latex. be done. When an enzyme is used as a labeling substance, various detections can be performed depending on the substrate by adding a chromogenic substrate, a fluorescent substrate, a chemiluminescent substrate, or the like.
試料中の抗サルモネラ抗体を定量する場合には、ＥＬＩＳＡなどの、マイクロプレートのウェルやビーズを固相とするサンドイッチ法が好ましい。得られた測定値からの抗サルモネラ抗体量の特定は、一般的に、標準試料による測定値との比較により行うことができる。この場合、例えば、標準試料による測定値に基づいて作成された標準曲線上のどの位置に、実際の測定値が位置づけられるかを調べることにより、試料中の抗サルモネラ抗体量を求めることができる。 When quantifying an anti-Salmonella antibody in a sample, a sandwich method such as ELISA using microplate wells or beads as a solid phase is preferred. Identification of the amount of anti-Salmonella antibody from the obtained measured value can generally be carried out by comparison with the measured value of a standard sample. In this case, for example, the amount of anti-Salmonella antibody in the sample can be determined by examining where the actual measured value is positioned on a standard curve created based on the measured value of the standard sample.
一方、簡便かつ迅速に抗サルモネラ抗体を検出するには、イムノクロマトグラフィーが好適である。イムノクロマトグラフィーのデバイスの一態様について説明すると、当該デバイスは、ニトロセルロース膜のような多孔性素材からなるマトリックス上に、捕捉用分子をライン状に固相化した検出ゾーンと、その上流側に、標識した検出用分子を担持した標識試薬ゾーンを含む。通常、標識試薬ゾーンは、標識した検出用分子を担持した多孔性のパッドにより構成される。マトリックスの上流端には、展開液を貯蔵した展開液槽が設けられている。さらに、通常、前記検出ゾーンの下流に、標識した検出用分子の展開を確認するために当該検出用分子を捕捉する分子をライン状に固相化した展開確認部と、さらにその下流に、展開液を吸収するための多孔性の吸収パッドが設けられた展開液吸収ゾーンが設けられている。さらに、標識が酵素標識である場合には、標識試薬ゾーンよりも上流に、標識酵素の基質を担持した基質ゾーンが設けられる。 On the other hand, immunochromatography is suitable for simple and rapid detection of anti-Salmonella antibodies. To explain one aspect of the immunochromatographic device, the device comprises a detection zone in which capture molecules are immobilized in a line on a matrix made of a porous material such as a nitrocellulose membrane, and upstream of the detection zone, It includes a labeled reagent zone carrying labeled detection molecules. Typically, the labeled reagent zone consists of a porous pad carrying labeled detection molecules. A developing liquid tank storing a developing liquid is provided at the upstream end of the matrix. In addition, usually downstream of the detection zone, a development confirming section in which a molecule capturing the detection molecule is linearly immobilized in order to confirm the development of the labeled molecule for detection, and further downstream thereof, a development A developer absorption zone is provided with porous absorbent pads for absorbing liquid. Furthermore, when the label is an enzyme label, a substrate zone carrying a substrate for the labeling enzyme is provided upstream of the labeling reagent zone.
使用時には、試料を標識試薬ゾーンに添加し、押し込み部を加圧して突起部を移動させることにより、展開液パッドを展開液槽に挿入し、展開液パッドを通じて展開液をマトリックスに供給する。展開液が基質ゾーンを通過する際に基質が展開液中に溶出され、基質を含む展開液が流動する。展開液が標識試薬ゾーンを通過する際に、標識した検出用分子と試料とが展開液中に溶出され、基質、標識した検出用分子および試料を含む展開液が流動する。試料中に抗サルモネラ抗体が含まれる場合には、抗サルモネラ抗体と標識した検出用分子とが結合して複合体を形成し、この複合体が検出ゾーンに到達すると、検出ゾーン上の捕捉用分子と複合体中の抗サルモネラ抗体とが結合する。その結果、抗サルモネラ抗体を介して標識した検出用分子が検出ゾーンに固定される。こうして検出ゾーンにおける標識を測定することにより、抗サルモネラ抗体が検出される。試料中に抗サルモネラ抗体が含まれていない場合には、標識した検出用分子は検出ゾーンに固定されず、さらに下流に移動するため、検出ゾーンにおいて標識は検出されない。なお、検出ゾーンの下流の展開液確認部には、検出用分子を捕捉する分子が固相化されているため、標識した検出用分子は展開液確認部に固定される。よって、展開液確認部に標識が検出された場合、展開液が正しく展開されたことを意味する。展開液は、最終的に、その下流の吸収パッドに吸収される。 In use, the developer pad is inserted into the developer reservoir by adding a sample to the labeling reagent zone, pressurizing the indentation to move the protrusion, and supplying the developer to the matrix through the developer pad. When the developing liquid passes through the substrate zone, the substrate is eluted into the developing liquid, and the developing liquid containing the substrate flows. When the developing solution passes through the labeling reagent zone, the labeled detection molecules and the sample are eluted into the developing solution, and the developing solution containing the substrate, the labeled detection molecules and the sample flows. When an anti-Salmonella antibody is contained in the sample, the anti-Salmonella antibody and the labeled detection molecule bind to form a complex, and when this complex reaches the detection zone, the capture molecule on the detection zone and the anti-Salmonella antibody in the complex. As a result, the detectable molecule labeled via the anti-Salmonella antibody is immobilized in the detection zone. Anti-Salmonella antibodies are thus detected by measuring the label in the detection zone. If the sample does not contain anti-Salmonella antibodies, the labeled detection molecule will not be immobilized in the detection zone and will migrate further downstream, so no label will be detected in the detection zone. In addition, since the molecules that capture the detection molecules are immobilized in the developing solution confirming portion downstream of the detection zone, the labeled detecting molecules are immobilized in the developing solution confirming portion. Therefore, when the label is detected in the developing liquid confirming portion, it means that the developing liquid has been correctly developed. The developing solution is eventually absorbed by the downstream absorbent pad.
本発明の検出方法によれば、サルモネラ属菌に感染した個体と不活化したサルモネラ属菌をワクチンとして接種した個体を識別することができる。ワクチンとして使用する不活化したサルモネラ属菌は、例えば、サルモネラ属菌の加熱処理、化学消毒剤処理、放射線あるいは紫外線の照射、変異促進物質処理などにより調製することができる。不活化処理としては、好適には、加熱処理または化学消毒剤であるホルマリンによる処理が用いられる。不活化したサルモネラ属菌は、異なるサルモネラ属菌の混合物（例えば、異なる種や異なる血清型のサルモネラ属菌の混合物）であってもよい。 According to the detection method of the present invention, individuals infected with Salmonella can be distinguished from individuals vaccinated with inactivated Salmonella. Inactivated Salmonella used as a vaccine can be prepared by, for example, heat treatment of Salmonella, treatment with chemical disinfectants, irradiation with radiation or ultraviolet rays, treatment with a mutagen. Heat treatment or treatment with formalin, which is a chemical disinfectant, is preferably used as the inactivation treatment. The inactivated Salmonella may be a mixture of different Salmonella (eg, different species or different serotypes of Salmonella).
本発明は、また、ＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片を含む、サルモネラ属菌感染を免疫学的に検出するための抗原試薬を提供する。当該抗原試薬は、抗原であるＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片のみからなるものであっても、これに標識物質が結合したものであっても、これを固相化したものであってもよい。また、これらを含む組成物であってもよい。組成物に含まれる他の成分としては、特に制限されないが、例えば、滅菌水、生理食塩水、界面活性剤、保存剤などが挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上の組み合わせであってもよい。 The present invention also provides an antigenic reagent for immunological detection of Salmonella infection comprising a BamA protein or functional fragment thereof. The antigen reagent may consist of only the antigen BamA protein or a functional fragment thereof, or may be one bound to a labeling substance, or one immobilized with a labeling substance. Moreover, the composition containing these may be used. Other components contained in the composition are not particularly limited, but include, for example, sterile water, physiological saline, surfactants, preservatives, etc., and even one of these may be used in combination of two or more. It may be a combination.
本発明は、また、前記抗原試薬を含む、サルモネラ属菌感染を免疫学的に検出するためのキットを提供する。キットには、抗原試薬以外に、免疫学的検出法において備えるべき構成をさらに備えていてもよい。このような構成としては、例えば、標準試料（各濃度の抗サルモネラ抗体など）、対照試薬、反応用バッファー、希釈液、洗浄液などが挙げられるが、これらに制限されない。標識物質が酵素である場合には、標識物質の検出や定量に必要な基質や反応停止液などをさらに含んでいてもよい。 The present invention also provides a kit for immunologically detecting Salmonella infection, comprising the antigen reagent. In addition to the antigen reagent, the kit may further include components that should be included in the immunological detection method. Examples of such a configuration include, but are not limited to, standard samples (such as anti-Salmonella antibodies at various concentrations), control reagents, reaction buffers, diluents, washing solutions, and the like. When the labeling substance is an enzyme, it may further contain a substrate, a reaction stop solution, and the like necessary for detection and quantification of the labeling substance.
検出にサンドイッチ法を採用する場合において、ＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片が結合した固相を抗サルモネラ抗体の捕捉用分子（本発明の抗原試薬の一態様）として用いる場合には、本発明のキットにおいては、さらに、抗サルモネラ抗体の検出用分子として標識物質が結合した二次抗体などを備えていてもよい。一方、標識されたＢａｍＡタンパク質またはその機能的断片を抗サルモネラ抗体の検出用分子（本発明の抗原試薬の一態様）として用いる場合には、本発明のキットにおいては、さらに、抗サルモネラ抗体の捕捉用分子として、二次抗体などが結合した固相を備えていてもよい。 In the case of adopting the sandwich method for detection, when using the solid phase to which the BamA protein or its functional fragment is bound as a molecule for capturing the anti-Salmonella antibody (one aspect of the antigen reagent of the present invention), the kit of the present invention may further comprise a secondary antibody to which a labeling substance is bound as a molecule for detection of the anti-Salmonella antibody. On the other hand, when a labeled BamA protein or a functional fragment thereof is used as a molecule for detection of an anti-Salmonella antibody (an embodiment of the antigen reagent of the present invention), the kit of the present invention further comprises capturing an anti-Salmonella antibody. As a molecule for use, a solid phase to which a secondary antibody or the like is bound may be provided.
また、検出にイムノクロマトグラフィーを採用する場合には、抗サルモネラ抗体の捕捉用分子および／または標識した検出用分子を担持したゾーンを含むデバイスをさらに含んでいてもよい。デバイスは、展開液パッドや吸収パッドなど、イムノクロマトグラフィーに適したその他の構成を備えることができる。 When immunochromatography is employed for detection, the device may further comprise a zone carrying anti-Salmonella antibody capture molecules and/or labeled detection molecules. The device can include other configurations suitable for immunochromatography, such as developing pads and absorbent pads.
本発明のキットには、当該キットの使用説明書をさらに含んでいてもよい。 The kit of the present invention may further include instructions for use of the kit.
以下、実施例および比較例に基づいて本発明をより具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples and comparative examples.
Ａ．材料および方法
（１）抗原の精製
抗原として利用したサルモネラ属菌由来の分子は、以下のとおりである。
A. Materials and Methods (1) Purification of Antigens Salmonella-derived molecules used as antigens are as follows.
（ａ）実施例
ＢａｍＡタンパク質（８０４アミノ酸，分子量９０４２２，菌体膜タンパク質）（配列番号：１、２）
(a) Example BamA protein (804 amino acids, molecular weight 90422, cell membrane protein) (SEQ ID NO: 1, 2)
（ｂ）比較例
（ｉ）ＳｓｅＧタンパク質（２３０アミノ酸、分子量２４２３７、ＩＩＩ型分泌装置より菌体外へ分泌されるタンパク質）（配列番号３、４）
（ｉｉ）ＳｓｅＦタンパク質（２６１アミノ酸、分子量２６５９５、ＩＩＩ型分泌装置より菌体外へ分泌されるタンパク質）（配列番号５、６）
（ｉｉｉ）ＬｐｔＤタンパク質（７８６アミノ酸、分子量８９５４０、菌体膜タンパク質）（配列番号７、８）
（ｉｖ）ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）
(b) Comparative example (i) SseG protein (230 amino acids, molecular weight 24237, protein secreted extracellularly from type III secretion apparatus) (SEQ ID NOs: 3 and 4)
(ii) SseF protein (261 amino acids, molecular weight 26595, protein secreted from the type III secretion apparatus to the outside of the cell) (SEQ ID NOs: 5 and 6)
(iii) LptD protein (786 amino acids, molecular weight 89540, cell membrane protein) (SEQ ID NOS: 7 and 8)
(iv) LPS (Lipopolysaccharide)
（２）抗原遺伝子のクローニング
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｘ３３０６株のＤＮＡを鋳型に、表１に記載の各種プライマーを用いてＰＣＲ行った。
(2) Cloning of antigen gene
PCR was performed using the DNA of Salmonella enterica serovar Typhimurium x3306 strain as a template and various primers listed in Table 1.
次に、ＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローニング法を用いてクローニングし、その後、大腸菌内において、（１）に記載の各サルモネラタンパク質を高発現させた。タンパク質発現のためのプラスミドとしては、ｐＥＴ１５１／Ｄ－ＴＯＰＯを使用した。このプラスミドを用いて発現させたタンパク質のＮ末側には、Ｈｉｓタグ（６ｘ）が付加される。 Next, the PCR product was cloned using the TOPO cloning method, and then each Salmonella protein described in (1) was highly expressed in E. coli. pET151/D-TOPO was used as plasmid for protein expression. A His tag (6x) is added to the N-terminus of the protein expressed using this plasmid.
（３）抗原の精製
５ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン入り）中で、一晩、前記サルモネラ属菌を前培養（静置培養）した。次いで、１００ｍＬのＬＢ培地にて吸光度（６００ｎｍ）が０．３になるまで振盪培養し、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを加えて、さらに６時間培養した。培養後、菌体を回収し、超音波処理により菌体を破砕した。次いで、破砕した菌体をＵｒｅａ ｌｙｓｉｓバッファーにて溶解し、ニッケルカラムを用いて各種タンパク質を捕捉して精製し、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶出バッファーにて溶出した。
(3) Antigen Purification The Salmonella spp. was precultured (static culture) overnight in 5 mL of LB medium (containing ampicillin). Then, the mixture was cultured with shaking in 100 mL of LB medium until the absorbance (600 nm) reached 0.3, added with Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, and further cultured for 6 hours. After culturing, the cells were recovered and disrupted by ultrasonic treatment. Then, the disrupted cells were dissolved in a urealysis buffer, various proteins were captured and purified using a nickel column, and eluted with an imidazole elution buffer.
ＬＰＳは、５ｍｌのＬＢ培地中で３７℃で一晩静置培養したサルモネラ属菌からＬＰＳ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ社）を用いて精製した。 LPS was purified from Salmonella spp. cultured overnight at 37° C. in 5 ml of LB medium using an LPS extraction kit (iNtRON).
（４）ニワトリ血清
ニワトリ（白色レグホン）に対して、生後１週間目と３週間目に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたは不活化ワクチン（熱不活化した死菌）を２回接種し、２週間後に血清を採取した。
(4) Chicken serum Chickens (white leghorn) were inoculated twice with Salmonella enterica serovar Typhimurium or inactivated vaccine (killed heat-inactivated bacteria) at 1 and 3 weeks after birth, and serum was taken.
サルモネラ属菌感染群においては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｒｏＡ変異株（１ｘ１０７ ＣＦＵ／ｍｌ／２００μｌ ＰＢＳ）を静脈に２回接種した。 In the Salmonella-infected group, the Salmonella enterica serovar Typhimurium aroA mutant strain (1×10 7 CFU/ml/200 μl PBS) was intravenously inoculated twice.
ワクチン接種群においては、１００度５分間の熱処理により不活化したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ａｒｏＡ変異株（１ｘ１０７ ＣＦＵ／ｍｌ／２００μｌ ＰＢＳ）を静脈に２回接種した。 In the vaccinated group, Salmonella enterica serovar Typhimurium aroA mutant (1× 10 7 CFU/ml/200 μl PBS) inactivated by heat treatment at 100° C. for 5 minutes was intravenously inoculated twice.
（５）エライザ法
０．５μｇ／ｍｌに調整した抗原（組み換えサルモネラタンパク質）を３７℃、１時間反応させ抗原を固相化した後、ブロッキングワン（ナカライテスク）を用いて室温で１時間ブロッキングした。次いで、固相化した各種タンパク質に対して、サルモネラ感染群およびワクチン接種群の血清をそれぞれ、３７℃で１時間反応させ、さらに、２次抗体（ＨＲＰ標識ウサギ抗ニワトリＩｇＹ抗体）を、３７℃で１時間反応させた。次いで、基質としてのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を添加して、ＨＲＰ標識を発色させ、吸光プレートリーダー（４５０ｎｍ）を用いて、ニワトリＩｇＹを定量した。
(5) ELISA method An antigen (recombinant salmonella protein) adjusted to 0.5 µg/ml was allowed to react at 37°C for 1 hour to immobilize the antigen, and then blocked at room temperature for 1 hour using Blocking One (Nacalai Tesque). . Next, the sera of the Salmonella-infected group and the vaccinated group were each allowed to react with the immobilized proteins at 37°C for 1 hour. was reacted for 1 hour. Then, TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) was added as a substrate to develop the HRP label, and chicken IgY was quantified using an absorbance plate reader (450 nm).
Ｂ．結果
（１）ニワトリにおける組換えＢａｍＡタンパク質を抗原としたエライザ法
菌体膜タンパク質であるＢａｍＡタンパク質を抗原として用いて、ニワトリ血清に対してエライザを行った結果、サルモネラ属菌感染群においては、ワクチン接種群と比較して、血清中の抗体価が高かった（図１Ａ）。一方、ＩＩＩ型分泌装置より分泌されるＳｓｅＧタンパク質、ＳｓｅＦタンパク質、膜タンパク質であるＬｐｔＤタンパク質、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｘ３３０６由来のＬＰＳを、それぞれ抗原として用いた場合には、サルモネラ属菌感染群とワクチン接種群との間で血清中の抗体価に有意差は認められなかった（図１Ｂ～Ｅ）。以上の結果から、ＢａｍＡタンパク質は、ワクチン接種個体とサルモネラ属菌感染個体とを区別できる抗原であることが判明した。
B. Results (1) ELISA method using recombinant BamA protein in chickens as an antigen As a result of performing ELISA on chicken serum using BamA protein, which is a cell membrane protein, as an antigen, in the Salmonella spp. The serum antibody titer was higher than in the inoculated group (Fig. 1A). On the other hand, when the SseG protein and SseF protein secreted from the type III secretion apparatus, the LptD protein which is a membrane protein, and the LPS derived from Salmonella enterica serovar Typhimurium x3306 are used as antigens, respectively, the Salmonella-infected group and the vaccine No significant difference was observed in serum antibody titers between the inoculated groups (FIGS. 1B to 1E). From the above results, it was found that the BamA protein is an antigen capable of distinguishing between vaccinated individuals and Salmonella-infected individuals.
本発明によれば、不活化ワクチンを接種した個体と識別して、サルモネラ属菌に感染した個体を特定することができる。本発明は、特に、農業よび医療の分野において利用可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, individuals infected with Salmonella can be identified by distinguishing them from individuals vaccinated with inactivated vaccines. The invention is particularly applicable in the agricultural and medical fields.
配列番号：９～１６
＜２２３＞ プライマー配列
SEQ ID NOS: 9-16
<223> primer sequence
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| JP2021172590A JP2023062550A (en) | 2021-10-21 | 2021-10-21 | Method of detecting salmonella infection using bama protein |
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