JP2023043461A - 発光性タンパク質を用いた発光方法 - Google Patents
発光性タンパク質を用いた発光方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】 菌類ルシフェラーゼを用いて、本来の基質である３－ヒドロキシヒスピジンとは異なる基質を光らせる方法の提供。【解決手段】 菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質に、セレンテラジンを接触させることを含む発光方法に関する。【選択図】図２
Description
本開示は、発光性タンパク質を用いた発光方法に関する。
ホタル、ウミホタル、発光キノコ、など、多くの生物が化学的に光を放つ能力を有する。この化学発光反応は、発光性タンパク質の１つである化学発光タンパク質（ルシフェラーゼ）とその発光基質（ルシフェリン）によって起こり、これらの構造は生物種によって多種多様である。現在、さまざまな発光性タンパク質がレポーターやプローブとして生命科学研究に応用されている。ルシフェラーゼを細胞等に発現させてレポーターやプローブとして用いる場合、細胞等に対して発光基質の添加が必要である。ルシフェラーゼとその発光基質の組み合わせは非常に特異性が高い。
ホタルルシフェラーゼの発光基質であるホタルルシフェリン、バクテリアルシフェラーゼの発光基質であるバクテリアルルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェラーゼの発光基質である渦鞭毛藻類ルシフェリン、ウミホタルルシフェラーゼ（Ｖａｒｇｕｌａ／Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ）の発光基質であるヴァルグリンの構造が判明している。
また、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、深海エビルシフェラーゼ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）、カイアシルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）、イクオリン、及びオベリン等の発光タンパク質の発光基質であるセレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）の構造が判明している。
さらに、近年、発光キノコ（発光菌類）のルシフェラーゼの発光基質が３－ヒドロキシヒスピジンであることが判明した（非特許文献１～３、特許文献１）。
また、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、深海エビルシフェラーゼ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）、カイアシルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ）、イクオリン、及びオベリン等の発光タンパク質の発光基質であるセレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）の構造が判明している。
さらに、近年、発光キノコ（発光菌類）のルシフェラーゼの発光基質が３－ヒドロキシヒスピジンであることが判明した（非特許文献１～３、特許文献１）。
Kotlobay et al., Genetically encodable bioluminescent system from fungi, 12728-12732, PNAS December 11, 2018 vol. 115 no. 50www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1803615115
Khakhar et al., Building customizable auto-luminescent luciferase-based reporters in plants eLife 2020;9:e52786.https://doi.org/10.7554/eLife.52786
Mitiouchkina et al., Plants with genetically encoded autoluminescence, NatureBiotechnology VOL 38 August 2020 944-946
ルシフェラーゼとその発光基質ルシフェリンとの組み合わせは非常に特異性が高く、これまで異種由来のルシフェラーゼとルシフェリンの化学発光が可能な組み合わせは報告されていない。ルシフェラーゼに対して複数の異なる発光基質が使用可能であれば、場面に応じた基質を使うことができるため、応用の幅が広がるものと期待される。
発光キノコ等の菌類のルシフェラーゼは、通常、３－ヒドロキシヒスピジンを基質とし、その発光反応を触媒する。
そこで、本開示は、一態様において、菌類ルシフェラーゼを用いて、上記基質とは異なる発光基質を光らせる方法を提供する。
そこで、本開示は、一態様において、菌類ルシフェラーゼを用いて、上記基質とは異なる発光基質を光らせる方法を提供する。
本開示は、一態様において、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質に、セレンテラジンを接触させることを含む発光方法（以下、「本開示に係る発光方法」ともいう。）に関する。
本開示は、一態様において、菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質、その核酸、又はその発現カセットと、セレンテラジンを含むキット（以下、「本開示に係るキット」ともいう。）に関する。
本開示によれば、一態様において、発光キノコ等の菌類に由来するルシフェラーゼを用いて、本来の（内因性の）基質である３－ヒドロキシヒスピジンとは異なる発光基質を光らせることができる。
本開示は、ルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせは特異性が高いと考えられているところ、発光キノコのルシフェラーゼが、内因性ルシフェリンである３－ヒドロキシヒスピジンとは構造が大きく異なるセレンテラジンを基質として発光反応を触媒しうるという知見に基づく。
本開示によれば、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質を用いて、その内因性ルシフェリンである３－ヒドロキシヒスピジンとは異なるセレンテラジンの発光反応を触媒させることができる。
菌類ルシフェラーゼを用いて内因性ルシフェリンと異なるルシフェリン（セレンテラジン）を発光させることができることにより、あるいは、セレンレラジンを発光させることができるルシフェラーゼとして新たに菌類ルシフェラーゼが増えることにより、発光性タンパク質を利用した技術のさらなる拡大及び促進が期待できる。
菌類ルシフェラーゼを用いて内因性ルシフェリンと異なるルシフェリン（セレンテラジン）を発光させることができることにより、あるいは、セレンレラジンを発光させることができるルシフェラーゼとして新たに菌類ルシフェラーゼが増えることにより、発光性タンパク質を利用した技術のさらなる拡大及び促進が期待できる。
［光らせる発光性タンパク質］
本開示に係る発光方法において、光らせる発光性タンパク質は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質である。
本開示に係る発光方法において、光らせる発光性タンパク質は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質である。
本開示において「菌類ルシフェラーゼ」は、一又は複数の実施形態において、菌類の本来の（天然の）ルシフェラーゼ、それらの誘導体、それらの組換え体、それらの機能的断片が含まれうる。
本開示において「ルシフェラーゼ」は、ルシフェリンを酸化することができる酵素を意味し、酸化反応には発光（ルミネセンス）を伴い、酸化ルシフェリンが放出される。
本開示において「誘導体」は、一又は複数の実施形態において、元となるタンパク質のＮ末端、及び／又はＣ末端で、並びに／あるいは天然アミノ酸配列内で、１つ又は複数のアミノ酸が付加される、及び／又は置換される、及び／又は欠失される、及び／又は挿入されるタンパク質を指す。
天然型菌類ルシフェラーゼの誘導体の一又は複数の実施形態として、発光特性が天然型よりも向上した菌類ルシフェラーゼが挙げられ、例えば、発光強度が天然型よりも向上した菌類ルシフェラーゼ、発光量子収率が天然型よりも向上した菌類ルシフェラーゼ等が挙げられる。
本開示において、ルシフェラーゼに関して「機能的断片」とは、一又は複数の実施形態において、ルシフェラーゼの一部（断片）であって、ルミネセンスを伴うルシフェリン酸化反応を触媒できる機能を有する断片のことをいう。例えば、ルシフェラーゼＡの機能的断片とは、ルシフェラーゼＡの一部であって、ルシフェラーゼＡと同様のルシフェラーゼ活性（化学発光酵素活性）を有するものをいう。
本開示において「菌類」とは、一又は複数の実施形態において、生物発光を行いうる菌類であり、一又は複数の実施形態において、生物発光を行いうる担子菌であり、いわゆる発光キノコが含まれうる。
本開示において「菌類（ｆｕｎｇｉ）」とは、一又は複数の実施形態において、キノコ類（ｍｕｃｈｕｒｏｏｍｓ）でありる。
本開示において「ルシフェラーゼ」は、ルシフェリンを酸化することができる酵素を意味し、酸化反応には発光（ルミネセンス）を伴い、酸化ルシフェリンが放出される。
本開示において「誘導体」は、一又は複数の実施形態において、元となるタンパク質のＮ末端、及び／又はＣ末端で、並びに／あるいは天然アミノ酸配列内で、１つ又は複数のアミノ酸が付加される、及び／又は置換される、及び／又は欠失される、及び／又は挿入されるタンパク質を指す。
天然型菌類ルシフェラーゼの誘導体の一又は複数の実施形態として、発光特性が天然型よりも向上した菌類ルシフェラーゼが挙げられ、例えば、発光強度が天然型よりも向上した菌類ルシフェラーゼ、発光量子収率が天然型よりも向上した菌類ルシフェラーゼ等が挙げられる。
本開示において、ルシフェラーゼに関して「機能的断片」とは、一又は複数の実施形態において、ルシフェラーゼの一部（断片）であって、ルミネセンスを伴うルシフェリン酸化反応を触媒できる機能を有する断片のことをいう。例えば、ルシフェラーゼＡの機能的断片とは、ルシフェラーゼＡの一部であって、ルシフェラーゼＡと同様のルシフェラーゼ活性（化学発光酵素活性）を有するものをいう。
本開示において「菌類」とは、一又は複数の実施形態において、生物発光を行いうる菌類であり、一又は複数の実施形態において、生物発光を行いうる担子菌であり、いわゆる発光キノコが含まれうる。
本開示において「菌類（ｆｕｎｇｉ）」とは、一又は複数の実施形態において、キノコ類（ｍｕｃｈｕｒｏｏｍｓ）でありる。
本開示において「菌類ルシフェラーゼ」は、一又は複数の実施形態において、３－ヒドロキシヒスピジンの発光反応を触媒しうるルシフェラーゼということができる。
本開示において「菌類ルシフェラーゼ」は、一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１８／１３９９５６（あるいは、特許文献１）に開示されるルシフェラーゼが挙げられ、当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
本開示において「菌類ルシフェラーゼ」は、一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１８／１３９９５６（あるいは、特許文献１）に開示されるルシフェラーゼが挙げられ、当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
菌類ルシフェラーゼを天然に有する菌類としては、一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１８／１３９９５６（あるいは、特許文献１）に記載されるものが挙げられる。
また、菌類ルシフェラーゼを天然に有する菌類としては、一又は複数の実施形態において、Terashima et al., Mushroom Science and Biotechnology, Vol. 24(4) 176-181, 2017に記載されるものが挙げられ、当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
菌類ルシフェラーゼを天然に有する菌類としては、一又は複数の実施形態において、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘ－ｃｏｅｌｉ（シイノトモシビタケ）
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ（ナラタケ）
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｔａｂｅｓｃｅｎｓ（ナラタケモドキ）
Ｄｉｃｔｙｏｐａｎｕｓ ｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｄｉａｔｕｓ（スズメタケ）
Ｆａｖｏｌａｓｃｈｉａ ｐｅｚｉｚａｅｆｏｒｍｉｓ（エナシラスタケ）
Ｍｙｃｅｎａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓ（ヤコウタケ）
Ｍｙｃｅｎａ ｍａｎｉｐｕｌａｒｉｓ（アミヒカリタケ）
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｇｕｅｐｉｎｉｆｏｒｍｉｓ（ツキヨタケ）
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｎｉｔｉｄｕｓ（シロヒカリタケ）
Ｎｅｏｎｏｔｈｐａｎｕｓ ｎａｍｂｉ（シロヒカリタケ）、
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｇａｌｌｉｃａ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｏｓｔｏｙａｅ
Ｍｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ
Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｓｔｉｐｔｉｃｕｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｄｉｓ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｃａｌｖｅｓｃｅｎｓ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｃｅｐｉｓｔｉｐｅｓ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｆｕｓｃｉｐｅｓ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｇｅｍｉｎａ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｎａｂｓｎｏｎａ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｉｎａｐｉｎａ
Ｃｏｌｌｙｂｉａ ｔｕｂｅｒｏｓａ
Ｄｉｃｔｙｏｐａｎｕｓ ｆｏｌｉｉｃｏｌｕｓ
Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ
Ｆａｖｏｌａｓｃｈｉａ ｍａｎｉｐｕｌａｒｉｓ
Ｆｉｌｏｂｏｌｅｔｕｓ ｈａｎｅｄａｅ
Ｆｉｌｏｂｏｌｅｔｕｓ ｐａｌｌｅｓｃｅｎｓ
Ｆｉｌｏｂｏｌｅｔｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ
Ｇｅｒｒｏｎｅｍａ ｖｉｒｉｄｉｌｕｃｅｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ａｓｔｅｒｉｎａ
Ｍｙｃｅｎａ ｃａｈａｙａ
Ｍｙｃｅｎａ ｃｏｒａｌｌｉｆｏｒｍｉｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｄａｉｓｙｏｇｕｎｅｎｓｉｓ
Ｋｏｂａｙａｓｉ
Ｍｙｃｅｎａ ｄｅｅｐｔｈａ
Ａｒａｖｉｎｄ． ＆ Ｍａｎｉｍ．
Ｍｙｃｅｎａ ｄｉｓｃｏｂａｓｉｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｅｐｉｐｔｅｒｙｇｉａ
Ｍｙｃｅｎａ ｆｅｒａ
Ｍｙｃｅｎａ ｇａｌｏｐｕｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｇｏｍｂａｋｅｎｓｉｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｈａｅｍａｔｏｐｕｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｉｎｃｌｉｎａｔａ
Ｍｙｃｅｎａ ｋｅｎｔｉｎｇｅｎｓｉｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｌａｃｒｉｍａｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｌａｚｕｌｉｎａ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｃｅｎｔｉｐｅｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘ－ｃｏｅｌｉ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘａｅｔｅｒｎａ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘａｒｂｏｒｉｃｏｌａ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘｐｅｒｐｅｔｕａ
Ｍｙｃｅｎａ ｍａｃｕｌａｔａ
Ｍｙｃｅｎａ Ｎｏｃｔｉｃａｅｌｕｍ
Ｍｙｃｅｎａ Ｎｏｃｔｉｌｕｃｅｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｏｌｉｖａｃｅｏｍａｒｇｉｎａｔａ
Ｍｙｃｅｎａ ｐｏｌｙｇｒａｍｍａ
Ｍｙｃｅｎａ ｐｒｕｉｎｏｓｏｖｉｓｃｉｄａ
Ｍｙｃｅｎａ ｐｓｅｕｄｏｓｔｙｌｏｂａｔｅｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｐｕｒａ
Ｍｙｃｅｎａ ｒｏｓｅａ
Ｍｙｃｅｎａ ｓａｎｇｕｉｎｏｌｅｎｔａ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｅｍｉｎａｕ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｉｌｖａｅｌｕｃｅｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｉｎａｒ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｉｎａｒ ｖａｒ． ｔａｎｇｋａｉｓｉｎａｒ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｉｎｇｅｒｉ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｔｙｌｏｂａｔｅｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｕｂｌｕｃｅｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｔｉｎｔｉｎｎａｂｕｌｕｍ
Ｍｙｃｅｎａ ｚｅｐｈｉｒｕｓ
Ｎｅｏｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｇａｒｄｎｅｒｉ
Ｎｅｏｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｎａｍｂｉ
Ｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｅｕｇｒａｍｍｕｓ
Ｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ Ｎｏｃｔｉｌｕｃｅｎｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｉｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｉｌｌｕｄｅｎｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｍａｎｇｅｎｓｉｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｎｉｄｉｆｏｒｍｉｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｉｖａｓｃｅｎｓ
Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ
Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｌｕｘｆｉｌａｍｅｎｔｕｓ
Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｎｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｉｒｒｉｔａｎｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｐｒｕｉｎｏｓｏｖｉｓｃｉｄｕｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｌａｍｐｒｏｓｐｏｒｕｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｒｏｒｉｄｕｓ
Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｒｇａｒｉｔａ
Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｓｃｉｏｄｅｓ
Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ
本開示における「菌類ルシフェラーゼ」は、当業者は上記の菌類から通常の技術を用いた遺伝子クローニングや精製によりその遺伝子やタンパク質を得ることができる。遺伝子クローニングには、例えば、ＷＯ２０１８／１３９９５６（あるいは、特許文献１）に記載される遺伝子配列情報を利用できる。あるいは、既存のルシフェラーゼにおいて相同性の高い領域に基づき設計される縮重プライマーを用いて遺伝子増幅する「ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ」により遺伝子クローニングをしてもよい。
また、菌類ルシフェラーゼを天然に有する菌類としては、一又は複数の実施形態において、Terashima et al., Mushroom Science and Biotechnology, Vol. 24(4) 176-181, 2017に記載されるものが挙げられ、当該文献の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
菌類ルシフェラーゼを天然に有する菌類としては、一又は複数の実施形態において、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘ－ｃｏｅｌｉ（シイノトモシビタケ）
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ（ナラタケ）
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｔａｂｅｓｃｅｎｓ（ナラタケモドキ）
Ｄｉｃｔｙｏｐａｎｕｓ ｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｄｉａｔｕｓ（スズメタケ）
Ｆａｖｏｌａｓｃｈｉａ ｐｅｚｉｚａｅｆｏｒｍｉｓ（エナシラスタケ）
Ｍｙｃｅｎａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓ（ヤコウタケ）
Ｍｙｃｅｎａ ｍａｎｉｐｕｌａｒｉｓ（アミヒカリタケ）
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｇｕｅｐｉｎｉｆｏｒｍｉｓ（ツキヨタケ）
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｎｉｔｉｄｕｓ（シロヒカリタケ）
Ｎｅｏｎｏｔｈｐａｎｕｓ ｎａｍｂｉ（シロヒカリタケ）、
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｇａｌｌｉｃａ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｏｓｔｏｙａｅ
Ｍｙｃｅｎａ ｃｉｔｒｉｃｏｌｏｒ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ
Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｓｔｉｐｔｉｃｕｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｄｉｓ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｃａｌｖｅｓｃｅｎｓ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｃｅｐｉｓｔｉｐｅｓ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｆｕｓｃｉｐｅｓ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｇｅｍｉｎａ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｎａｂｓｎｏｎａ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｉｎａｐｉｎａ
Ｃｏｌｌｙｂｉａ ｔｕｂｅｒｏｓａ
Ｄｉｃｔｙｏｐａｎｕｓ ｆｏｌｉｉｃｏｌｕｓ
Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ
Ｆａｖｏｌａｓｃｈｉａ ｍａｎｉｐｕｌａｒｉｓ
Ｆｉｌｏｂｏｌｅｔｕｓ ｈａｎｅｄａｅ
Ｆｉｌｏｂｏｌｅｔｕｓ ｐａｌｌｅｓｃｅｎｓ
Ｆｉｌｏｂｏｌｅｔｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ
Ｇｅｒｒｏｎｅｍａ ｖｉｒｉｄｉｌｕｃｅｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ａｓｔｅｒｉｎａ
Ｍｙｃｅｎａ ｃａｈａｙａ
Ｍｙｃｅｎａ ｃｏｒａｌｌｉｆｏｒｍｉｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｄａｉｓｙｏｇｕｎｅｎｓｉｓ
Ｋｏｂａｙａｓｉ
Ｍｙｃｅｎａ ｄｅｅｐｔｈａ
Ａｒａｖｉｎｄ． ＆ Ｍａｎｉｍ．
Ｍｙｃｅｎａ ｄｉｓｃｏｂａｓｉｓ
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Ｍｙｃｅｎａ ｆｅｒａ
Ｍｙｃｅｎａ ｇａｌｏｐｕｓ
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Ｍｙｃｅｎａ ｈａｅｍａｔｏｐｕｓ
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Ｍｙｃｅｎａ ｌａｚｕｌｉｎａ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｃｅｎｔｉｐｅｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘ－ｃｏｅｌｉ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘａｅｔｅｒｎａ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘａｒｂｏｒｉｃｏｌａ
Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘｐｅｒｐｅｔｕａ
Ｍｙｃｅｎａ ｍａｃｕｌａｔａ
Ｍｙｃｅｎａ Ｎｏｃｔｉｃａｅｌｕｍ
Ｍｙｃｅｎａ Ｎｏｃｔｉｌｕｃｅｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｏｌｉｖａｃｅｏｍａｒｇｉｎａｔａ
Ｍｙｃｅｎａ ｐｏｌｙｇｒａｍｍａ
Ｍｙｃｅｎａ ｐｒｕｉｎｏｓｏｖｉｓｃｉｄａ
Ｍｙｃｅｎａ ｐｓｅｕｄｏｓｔｙｌｏｂａｔｅｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｐｕｒａ
Ｍｙｃｅｎａ ｒｏｓｅａ
Ｍｙｃｅｎａ ｓａｎｇｕｉｎｏｌｅｎｔａ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｅｍｉｎａｕ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｉｌｖａｅｌｕｃｅｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｉｎａｒ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｉｎａｒ ｖａｒ． ｔａｎｇｋａｉｓｉｎａｒ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｉｎｇｅｒｉ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｔｙｌｏｂａｔｅｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｓｕｂｌｕｃｅｎｓ
Ｍｙｃｅｎａ ｔｉｎｔｉｎｎａｂｕｌｕｍ
Ｍｙｃｅｎａ ｚｅｐｈｉｒｕｓ
Ｎｅｏｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｇａｒｄｎｅｒｉ
Ｎｅｏｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｎａｍｂｉ
Ｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｅｕｇｒａｍｍｕｓ
Ｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ Ｎｏｃｔｉｌｕｃｅｎｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｉｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｉｌｌｕｄｅｎｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｍａｎｇｅｎｓｉｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｎｉｄｉｆｏｒｍｉｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ
Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｉｖａｓｃｅｎｓ
Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ
Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｌｕｘｆｉｌａｍｅｎｔｕｓ
Ｐａｎｅｌｌｕｓ ｐｕｓｉｌｌｕｓ
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｄｅｃｉｐｉｅｎｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｉｒｒｉｔａｎｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｐｒｕｉｎｏｓｏｖｉｓｃｉｄｕｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｌａｍｐｒｏｓｐｏｒｕｓ
Ｒｏｒｉｄｏｍｙｃｅｓ ｒｏｒｉｄｕｓ
Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｒｇａｒｉｔａ
Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｓｃｉｏｄｅｓ
Ｘｙｌａｒｉａ ｈｙｐｏｘｙｌｏｎ
本開示における「菌類ルシフェラーゼ」は、当業者は上記の菌類から通常の技術を用いた遺伝子クローニングや精製によりその遺伝子やタンパク質を得ることができる。遺伝子クローニングには、例えば、ＷＯ２０１８／１３９９５６（あるいは、特許文献１）に記載される遺伝子配列情報を利用できる。あるいは、既存のルシフェラーゼにおいて相同性の高い領域に基づき設計される縮重プライマーを用いて遺伝子増幅する「ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ」により遺伝子クローニングをしてもよい。
本開示において「菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分」とは、一又は複数の実施形態において、菌類ルシフェラーゼそのもの又は菌類ルシフェラーゼの機能的断片であってよい。
本開示において融合タンパク質における、「菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分」以外の融合されるタンパク質・ペプチドとしては特に制限されない。
本開示において融合タンパク質における、「菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分」以外の融合されるタンパク質・ペプチドとしては特に制限されない。
［光らせる工程］
本開示に係る発光方法は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質に、セレンテラジンを接触させる工程を含む。
前記接触は、セレンテラジンを菌類ルシフェラーゼ又は前記融合タンパク質に発光するために適切な量で接触させることができればその方法は特に制限されない。
本開示に係る発光方法は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質に、セレンテラジンを接触させる工程を含む。
前記接触は、セレンテラジンを菌類ルシフェラーゼ又は前記融合タンパク質に発光するために適切な量で接触させることができればその方法は特に制限されない。
本開示において「セレンテラジン」は、特に言及がない場合、天然のセレンテラジン並びにその類似体を意味する。
セレンテラジンとしては、一又は複数の実施形態において、米国出願第１２／０５６０７３号（段落［００８６］）で開示されるもの、例えば、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、ビス－デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン－ｈｈ」）、セレンテラジン－ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、及び２－メチルセレンテラジンが含まれうる。また、「セレンテラジン」としては、その他の一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１２／０６１５２９で開示されるものが含まれうる。
米国出願第１２／０５６０７３号（段落［００８６］）及びＷＯ２０１２／０６１５２９の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
セレンテラジンとしては、一又は複数の実施形態において、米国出願第１２／０５６０７３号（段落［００８６］）で開示されるもの、例えば、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、ビス－デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン－ｈｈ」）、セレンテラジン－ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、及び２－メチルセレンテラジンが含まれうる。また、「セレンテラジン」としては、その他の一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１２／０６１５２９で開示されるものが含まれうる。
米国出願第１２／０５６０７３号（段落［００８６］）及びＷＯ２０１２／０６１５２９の内容は本開示の一部を構成するものとして援用される。
本開示に係る発光方法は、一又は複数の実施形態において、レポーターシステム、分析、及び／又は、観察等に応用できる。
本開示に係る発光方法は、一又は複数の実施形態において、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質がレポーターとして使用されることを含み、その他の一又は複数の実施形態において、該レポーターの発現を確認するために発光を検出することを含む。
本開示に係る発光方法は、一又は複数の実施形態において、共鳴エネルギー移動のために菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質に発光反応を触媒させることを含み、その他の一又は複数の実施形態において、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとして発光反応を触媒させることを含む。
本開示に係る発光方法は、一又は複数の実施形態において、鑑賞のために菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分に発光反応を触媒させることを含む。
本開示に係る発光方法で発光反応を触媒させる菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質は、一又は複数の実施形態において、生体内で局所又は全体で発現している状態、細胞内外で局所又は全体で発現している状態、植物の細胞壁で発現している状態、精製された状態、及び単離された状態等が挙げられる。
本開示に係る発光方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る発光方法で発光させた発光シグナルを検出することを含んでもよい。前記検出は、目視でもよく、光学装置を用いてもよい。
［対象を光らせる方法］
本開示は、その他の態様において、対象を光らせる方法であって、前記対象は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質を備え、本開示に係る発光方法により発光させることを含む方法に関する。
本開示は、その他の態様において、対象を光らせる方法であって、前記対象は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質を備え、本開示に係る発光方法により発光させることを含む方法に関する。
前記「対象」としては、一又は複数の実施形態において、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質を発現する若しくはする可能性のある細胞、組織、生体が挙げられる。
前記「対象」としては、その他の一又は複数の実施形態において、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質を含有する若しくは含有する可能性のある非細胞系組成物、液体、及び／又は物品が挙げられる。
前記「対象」としては、その他の一又は複数の実施形態において、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質を含有する若しくは含有する可能性のある非細胞系組成物、液体、及び／又は物品が挙げられる。
［キット］
本開示は、その他の態様において、菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質、その核酸、又はその発現カセット、及びセレンテラジンを含むキットに関する。
本開示は、その他の態様において、菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質、その核酸、又はその発現カセット、及びセレンテラジンを含むキットに関する。
本開示に係るキットにおける菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質及びセレンテラジンは上述と同様である。
本開示に係るキットにおける核酸は、一又は複数の実施形態において、菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質をコードする核酸である。本開示において、核酸は、合成ＤＮＡ，ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡから選択される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、並びにこれらのＤＮＡの転写生成物が挙げられる。
本開示に係るキットにおける発現カセットは、一又は複数の実施形態において、菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットである。該発現カセットにおいて、前記核酸は、導入される宿主細胞又は無細胞発現システムに応じた発現調節配列が作動的に連結されている。発現調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等が挙げられ、その他には、開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどが挙げられる。
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕 菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質に、セレンテラジンを接触させることを含む、発光方法。
〔２〕 対象を光らせる方法であって、
前記対象は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質を備え、
〔１〕に記載の方法により発光させることを含む、方法。
〔３〕 〔１〕又は〔２〕に記載の方法で発光させた発光シグナルを検出することを含む、検出方法。
〔４〕 菌類ルシフェラーゼが、３－ヒドロキシヒスピジンを基質として発光するルシフェラーゼである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質、その核酸、又はその発現カセット、及び、セレンテラジンを含むキット。
〔１〕 菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質に、セレンテラジンを接触させることを含む、発光方法。
〔２〕 対象を光らせる方法であって、
前記対象は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質を備え、
〔１〕に記載の方法により発光させることを含む、方法。
〔３〕 〔１〕又は〔２〕に記載の方法で発光させた発光シグナルを検出することを含む、検出方法。
〔４〕 菌類ルシフェラーゼが、３－ヒドロキシヒスピジンを基質として発光するルシフェラーゼである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質、その核酸、又はその発現カセット、及び、セレンテラジンを含むキット。
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
菌類ルシフェラーゼがセレンテレジンを基質として発光反応を触媒することを確認するため以下の実験を行った。
［使用したルシフェラーゼ］
（１）ｍｃＬｕｚ：ヤコウタケ（Ｍｙｃｅｎａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓ）の菌類ルシフェラーゼ。入手方法：ＷＯ２０１８／１３９９５６（あるいは、特許文献１）に基づきヤコウタケから遺伝子クローニング（塩基配列は、配列番号：０１）
（２）ｍｌＬｕｚ： シイノトモシビタケ（Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘ－ｃｏｅｌｉ）の菌類ルシフェラーゼ。入手方法：和歌山県宇久井にて採取し、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲを用いて遺伝子クローニング（塩基配列は、配列番号：０２）
（３）ｎｎＬｕｚ：シロヒカリタケ（Ｎｅｏｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｎａｍｂｉ）の菌類ルシフェラーゼ。入手方法：Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ＃１３９６９５）より購入
（４）Ｎｌｕｃ：トゲオキヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）由来のルシフェラーゼ。入手方法：ＮａｎｏＬｕｃ（商品名、プロメガ社製）
（５）Ｒｌｕｃ８：ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のルシフェラーゼ。入手方法：Ｒｌｕｃ８＿Ｓ２５７Ｇ、先行論文により発表（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３， ２０１２）
（６）Ｆｌｕｃ２：ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｌｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ。入手方法：ｌｕｃ２（商品名、プロメガ社製）
（１）ｍｃＬｕｚ：ヤコウタケ（Ｍｙｃｅｎａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓ）の菌類ルシフェラーゼ。入手方法：ＷＯ２０１８／１３９９５６（あるいは、特許文献１）に基づきヤコウタケから遺伝子クローニング（塩基配列は、配列番号：０１）
（２）ｍｌＬｕｚ： シイノトモシビタケ（Ｍｙｃｅｎａ ｌｕｘ－ｃｏｅｌｉ）の菌類ルシフェラーゼ。入手方法：和歌山県宇久井にて採取し、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲを用いて遺伝子クローニング（塩基配列は、配列番号：０２）
（３）ｎｎＬｕｚ：シロヒカリタケ（Ｎｅｏｎｏｔｈｏｐａｎｕｓ ｎａｍｂｉ）の菌類ルシフェラーゼ。入手方法：Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｐｌａｓｍｉｄ＃１３９６９５）より購入
（４）Ｎｌｕｃ：トゲオキヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）由来のルシフェラーゼ。入手方法：ＮａｎｏＬｕｃ（商品名、プロメガ社製）
（５）Ｒｌｕｃ８：ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のルシフェラーゼ。入手方法：Ｒｌｕｃ８＿Ｓ２５７Ｇ、先行論文により発表（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ３， ２０１２）
（６）Ｆｌｕｃ２：ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｌｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ。入手方法：ｌｕｃ２（商品名、プロメガ社製）
［使用したルシフェリン］
（１）セレンテラジン：セレンテラジンｈ（富士フイルム和光純薬株式会社製）
（２）ホタルルシフェリン：Ｄ－ルシフェリン（富士フイルム和光純薬株式会社製）
（３）３－ヒドロキシヒスピジン（論文（Ｋａｓｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｄｖ．，３（４），２０１７）に従った。ただし、同文献補足図１２の有機化合物１７合成時に、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入したＭｇ（ＯＭｅ）2 ｉｎ ＭｅＯＨ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．３３５６５７－５００ＭＬ）を用い、６０℃で１５時間反応を行った。）
（１）セレンテラジン：セレンテラジンｈ（富士フイルム和光純薬株式会社製）
（２）ホタルルシフェリン：Ｄ－ルシフェリン（富士フイルム和光純薬株式会社製）
（３）３－ヒドロキシヒスピジン（論文（Ｋａｓｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ａｄｖ．，３（４），２０１７）に従った。ただし、同文献補足図１２の有機化合物１７合成時に、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入したＭｇ（ＯＭｅ）2 ｉｎ ＭｅＯＨ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．３３５６５７－５００ＭＬ）を用い、６０℃で１５時間反応を行った。）
［発光測定方法］
ルシフェラーゼの発光測定は以下の条件で行った。その結果を図１～４に示す。
ｍｃＬｕｚ、ｍｌＬｕｚ、ｎｎＬｕｚ、Ｎｌｕｃ、Ｒｌｕｃ８、Ｆｌｕｃ２の遺伝子をそれぞれ大腸菌発現用ベクター（ｐＲＳＥＴｂ）にクローニング、大腸菌（ＪＭ１０９（ＤＥ３））に形質転換、それぞれの遺伝子を導入した大腸菌を２３℃で６９時間液体培養した。Ｎｌｕｃ、Ｒｌｕｃ８、Ｆｌｕｃ２は凍結融解法によりタンパク質を抽出しＮｉ－ＮＴＡカラムにより精製を行った。ｍｃＬｕｚ、ｍｌＬｕｚ、ｎｎＬｕｚは先行論文に従い大腸菌からタンパク質を精製した（Ｋｏｔｌｏｂａｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１５ （５０）， ２０１８）。発光測定にはマイクロプレートリーダー（ＳＨ－９０００、Ｃｏｒｏｎａ ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を使用し、２ｎＭの精製タンパク質を１００μｌ入れ、５μＭのセレンテラジンｈを１０μｌ添加した。セレンテラジンｈとＤ－ルシフェリンでは１秒、３－ヒドロキシヒスピジンでは１０秒の露光時間で発光測定した。
ルシフェラーゼの発光測定は以下の条件で行った。その結果を図１～４に示す。
ｍｃＬｕｚ、ｍｌＬｕｚ、ｎｎＬｕｚ、Ｎｌｕｃ、Ｒｌｕｃ８、Ｆｌｕｃ２の遺伝子をそれぞれ大腸菌発現用ベクター（ｐＲＳＥＴｂ）にクローニング、大腸菌（ＪＭ１０９（ＤＥ３））に形質転換、それぞれの遺伝子を導入した大腸菌を２３℃で６９時間液体培養した。Ｎｌｕｃ、Ｒｌｕｃ８、Ｆｌｕｃ２は凍結融解法によりタンパク質を抽出しＮｉ－ＮＴＡカラムにより精製を行った。ｍｃＬｕｚ、ｍｌＬｕｚ、ｎｎＬｕｚは先行論文に従い大腸菌からタンパク質を精製した（Ｋｏｔｌｏｂａｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１５ （５０）， ２０１８）。発光測定にはマイクロプレートリーダー（ＳＨ－９０００、Ｃｏｒｏｎａ ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を使用し、２ｎＭの精製タンパク質を１００μｌ入れ、５μＭのセレンテラジンｈを１０μｌ添加した。セレンテラジンｈとＤ－ルシフェリンでは１秒、３－ヒドロキシヒスピジンでは１０秒の露光時間で発光測定した。
図１は、各ルシフェラーゼにセレンテラジンを接触させた場合の発光強度を示したグラフである。セレンテラジンのルシフェラーゼとして知られているＮｌｕｃとＲｌｕｃ８とともに、３種類の菌類ルシフェラーゼ（ｍｃＬｕｚ，ｍｌＬｕｚ，及びｎｎＬｕｚ）も発光が認められた。
図２は、図１からＮｌｕｃのデータの除いて示したグラフである。菌類ルシフェラーゼは、Ｒｌｕｃ８の約１／４～約１／２の発光強度があることが認められた。
図２は、図１からＮｌｕｃのデータの除いて示したグラフである。菌類ルシフェラーゼは、Ｒｌｕｃ８の約１／４～約１／２の発光強度があることが認められた。
図３は、各ルシフェラーゼにホタルルシフェリンであるＤ－ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを接触させた場合の発光強度を示したグラフである。ホタルルシフェラーゼＦｌｕｃ２以外の発光は認められなかった。
図４は、各ルシフェラーゼに菌類ルシフェラーゼのルシフェリンである３－ヒドロキシヒスピジンを接触させた場合の発光強度を示したグラフである。３種類の菌類ルシフェラーゼ（ｍｃＬｕｚ，ｍｌＬｕｚ，及びｎｎＬｕｚ）以外の発光は認められなかった。
図４は、各ルシフェラーゼに菌類ルシフェラーゼのルシフェリンである３－ヒドロキシヒスピジンを接触させた場合の発光強度を示したグラフである。３種類の菌類ルシフェラーゼ（ｍｃＬｕｚ，ｍｌＬｕｚ，及びｎｎＬｕｚ）以外の発光は認められなかった。
図３及び４に示すとおり、従来、ルシフェラーゼとルシフェリンとの組み合わせは非常に特異性が高いものであるが、図１及び２に示すとおり、菌類ルシフェラーゼとセレンテラジンの組み合わせは、従来の技術常識を超えて、発光を示した。
Claims (5)
- 菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質に、セレンテラジンを接触させることを含む、発光方法。
- 対象を光らせる方法であって、
前記対象は、菌類ルシフェラーゼ、又は、菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光タンパク質部分を有する融合タンパク質を備え、
請求項１に記載の方法により発光させることを含む、方法。 - 請求項１又は２に記載の方法で発光させた発光シグナルを検出することを含む、検出方法。
- 菌類ルシフェラーゼが、３－ヒドロキシヒスピジンを基質として発光するルシフェラーゼである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
- 菌類ルシフェラーゼ若しくは菌類ルシフェラーゼに由来する化学発光性タンパク質部分を有する融合タンパク質、その核酸、又はその発現カセット、及び、セレンテラジンを含むキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021151116A JP2023043461A (ja) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 発光性タンパク質を用いた発光方法 |
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|---|---|---|---|
| JP2021151116A JP2023043461A (ja) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 発光性タンパク質を用いた発光方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023043461A true JP2023043461A (ja) | 2023-03-29 |
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| JP2021151116A Pending JP2023043461A (ja) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 発光性タンパク質を用いた発光方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023043461A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7482563B1 (ja) | 2023-06-21 | 2024-05-14 | 国立大学法人大阪大学 | シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子 |
-
2021
- 2021-09-16 JP JP2021151116A patent/JP2023043461A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7482563B1 (ja) | 2023-06-21 | 2024-05-14 | 国立大学法人大阪大学 | シイノトモシビタケ由来の発光関連遺伝子 |
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