JP2023019317A - Method for determining cyp2a6 genetic polymorphism - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子多型の判定方法に関する。 The present invention relates to a method for determining CYP2A6 gene polymorphism.
ＣＹＰ２Ａ６は体内のニコチン代謝に関与する酵素であり、またレトロゾール（アロマターゼ阻害剤／閉経後乳がん治療剤）の代謝にも関与している。
ＣＹＰ２Ａ６には多くのアリルが存在するが、日本人では遺伝子欠損型であるＣＹＰ２Ａ６＊４や、アミノ酸変異を伴う一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）を有するＣＹＰ２Ａ６＊７やＣＹＰ２Ａ６＊１０、またプロモータ領域にＳＮＰを有するＣＹＰ２Ａ６＊９の変異型の遺伝子頻度が高く（２～２０％）、これらの遺伝子型を組み合わせて２つ持つ時、ニコチン代謝の低代謝群（Poor Metabolizer；ＰＭ）となる（非特許文献１）。
日本人において、ＰＭとなる遺伝子型を同定することは重要であるが、ヒトゲノムにはＣＹＰ２Ａ６遺伝子座の近傍に、ＣＹＰ２Ａ６と塩基配列が酷似している別遺伝子（ＣＹＰ２Ａ７）が存在し、遺伝子型の判定を困難にしている。
なお、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子多型をメルティングカーブ解析により判定する方法が報告されている（特許文献１）。この方法では、目的遺伝子部位の増幅と変異部位の検出を一本のキャピラリー内で一度に行うことができる。
CYP2A6 is an enzyme involved in nicotine metabolism in the body, and is also involved in the metabolism of letrozole (an aromatase inhibitor/therapeutic agent for postmenopausal breast cancer).
There are many alleles in CYP2A6, but in Japanese, CYP2A6 * 4 that is a gene deletion type, CYP2A6 * 7 and CYP2A6 * 10 that have a single nucleotide polymorphism (SNP) with amino acid mutation, and The gene frequency of CYP2A6*9 mutants with SNPs in the promoter region is high (2-20%), and when two of these genotypes are combined, it becomes a poor metabolizer of nicotine metabolism (Poor Metabolizer; PM). (Non-Patent Document 1).
In Japanese, it is important to identify the genotype that becomes PM, but in the vicinity of the CYP2A6 locus in the human genome, there is another gene (CYP2A7) whose nucleotide sequence is very similar to that of CYP2A6. making it difficult to judge.
A method for determining CYP2A6 polymorphisms by melting curve analysis has been reported (Patent Document 1). In this method, the amplification of the target gene site and the detection of the mutation site can be carried out at once in one capillary.
本発明の課題は、ＣＹＰ２Ａ６＊４及び／又はＣＹＰ２Ａ６＊７について、従来の方法よりも精度よく遺伝子型を判定する方法を開発し、測定系を確立することにある。 An object of the present invention is to develop a method for genotyping CYP2A6*4 and/or CYP2A6*7 with higher accuracy than conventional methods, and to establish a measurement system.
本発明者らは、新規に設計したＰＣＲプライマー及び加水分解プローブを用い、別遺伝子であるＣＹＰ２Ａ７を増幅せず、ＣＹＰ２Ａ６＊１（野生型）、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域のみを増幅する前処理を行うことにより、高い精度でＣＹＰ２Ａ６＊４及び／又はＣＹＰ２Ａ６＊７を判定できることを見出し、本発明に至った。 The present inventors used newly designed PCR primers and hydrolysis probes to amplify only the regions that characterize CYP2A6*1 (wild type), CYP2A6*4, and CYP2A6*7 without amplifying another gene, CYP2A7. The present inventors have found that CYP2A6*4 and/or CYP2A6*7 can be determined with high accuracy by performing a pretreatment for amplification, leading to the present invention.
すなわち、本発明は、以下の発明に関する：
［１］ＣＹＰ２Ａ６のアリルであるＣＹＰ２Ａ６＊４又はＣＹＰ２Ａ６＊７の少なくとも一方の判定方法であって、
ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いるフォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを、前記工程（１）で用いるリバースプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６特異的な配列にハイブリダイズするプライマーを；
前記工程（２）で用いるフォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを、前記工程（２）で用いるリバースプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）として、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７にはないＣＹＰ２Ａ６特異的な遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを、第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７に特異的でありＣＹＰ２Ａ６にはない遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセットとして、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）として、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列を含む領域にハイブリダイズするプローブを、第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブを；
それぞれ、使用する、前記方法。
［２］ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１４の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１６の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号１７の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２又は配列番号１８の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１９の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号２０の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号２１の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号２２の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、［１］の方法。
［３］ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、［１］又は［２］の方法。
［４］ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７を判定する、［１］～［３］のいずれかの方法であって、ＣＹＰ２Ａ６＊４に関する前記工程（２）～工程（３）と、ＣＹＰ２Ａ６＊７に関する前記工程（２）～工程（３）を、それぞれ、異なる反応容器で実施する、前記方法。
［５］配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブ、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブを含む、ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定用キット。
［６］配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマー、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマー、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブ、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブを含む、ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定用キット。
That is, the present invention relates to the following inventions:
[1] A method for determining at least one of CYP2A6*4 or CYP2A6*7, which is an allele of CYP2A6,
When judging CYP2A6*4,
(1) A step of pre-amplifying with a primer set that simultaneously amplifies regions that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*4 and that does not amplify the CYP2A7 gene;
(2) (a) template DNA obtained by diluting the amplification product obtained in step (1);
(b) a primer set capable of simultaneously amplifying a region of 200 bp or less containing sequences that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*4;
(c) a first TaqMan (registered trademark) probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*1 in the region amplified by the primer set (b) and is labeled with a first fluorescent dye;
(d) in the region amplified by the primer set (b), using a second TaqMan probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*4 and is labeled with a second fluorescent dye that is different from the first fluorescent dye; and performing amplification by the TaqMan method;
(3) After completing the step (2) and/or while performing the step (2), measuring the fluorescence intensity caused by the first fluorescent dye and the fluorescence intensity caused by the second fluorescent dye process;
including
As the forward primer used in the step (1), a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located upstream on the 5′ side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs is used in the step (1). ) as the reverse primer used in ), a primer that hybridizes to a CYP2A6-specific sequence located downstream on the 3′ side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs;
As the forward primer used in the step (2), a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located upstream on the 5' side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs is used in the step (2). ) as the reverse primer used in ), a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located downstream on the 3′ side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs;
As the first TaqMan probe (c) used in the step (2), in the region amplified by the main amplification, 5' upstream from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs, to CYP2A7 A probe that hybridizes to a CYP2A6-specific gene sequence that does not have CYP2A6 is used as the second TaqMan probe (d), and in the region amplified by the main amplification, the 5′ side of the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs a probe that hybridizes to a gene sequence that is specific for CYP2A7 and absent from CYP2A6, upstream of is;
respectively, using
When judging CYP2A6*7,
(1) A step of pre-amplifying with a primer set that simultaneously amplifies regions characterizing CYP2A6*1 and *7 and does not amplify the CYP2A7 gene;
(2) (a) template DNA obtained by diluting the amplification product obtained in step (1);
(b) a primer set capable of simultaneously amplifying a region of 200 bp or less containing sequences that characterize CYP2A6*1 and *7;
(c) a first TaqMan (registered trademark) probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*1 in the region amplified by the primer set (b) and is labeled with a first fluorescent dye;
(d) in the region amplified with the primer set (b), using a second TaqMan probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*7 and is labeled with a second fluorescent dye that is different from the first fluorescent dye; and performing amplification by the TaqMan method;
(3) After completing the step (2) and/or while performing the step (2), measuring the fluorescence intensity caused by the first fluorescent dye and the fluorescence intensity caused by the second fluorescent dye process;
including
As the primer set used in step (1), a primer set capable of hybridizing to a CYP2A6-specific sequence and amplifying a region containing amino acid 471 of CYP2A6;
As the primer set used in the step (2), a primer set capable of hybridizing to a CYP2A6-specific sequence and amplifying a region containing amino acid 471 of CYP2A6;
As the first TaqMan probe (c) used in the step (2), a probe that hybridizes to a region containing a sequence in which the amino acid at position 471 of CYP2A6 is isoleucine. a probe that hybridizes to a region containing a sequence in which the amino acid is threonine (typically a region consisting of 10 to 50 bases, preferably a region consisting of 10 to 20 bases);
The above methods, respectively, using.
[2] When determining CYP2A6*4,
As the primer set used in the step (1), a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 12, and 14 to 20 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 13 A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of bases;
As the primer set (b) used in the step (2), a forward primer represented by a sequence consisting of 21 to 27 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 14, and 21 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 15 A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of bases to 27 bases;
As the first TaqMan probe (c) and the second TaqMan probe (d) used in the step (2), a probe represented by a sequence consisting of 12 to 18 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17 A combination with a probe represented by a sequence consisting of 12 to 18 consecutive bases in the base sequence of;
respectively, using
When judging CYP2A6*7,
As the primer set used in the step (1), a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 18, and a continuous sequence in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of 14 to 20 bases;
As the primer set (b) used in the step (2), a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 19, and 16 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 20 A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of bases to 22 bases;
As the first TaqMan probe (c) and the second TaqMan probe (d) used in the step (2), a probe represented by a sequence consisting of 16 to 22 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 21, and SEQ ID NO: 22 A combination with a probe represented by a sequence consisting of 16 to 22 consecutive bases in the base sequence of;
The method of [1] using, respectively.
[3] When determining CYP2A6*4,
As the primer set used in the step (1), a combination of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
As the primer set (b) used in the step (2), a combination of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
As the first TaqMan probe (c) and the second TaqMan probe (d) used in the step (2), a combination of a TaqMan probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a TaqMan probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6;
respectively, using
When judging CYP2A6*7,
As the primer set used in the step (1), a combination of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
As the primer set (b) used in the step (2), a combination of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9;
As the first TaqMan probe (c) and the second TaqMan probe (d) used in the step (2), a combination of a TaqMan probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 and a TaqMan probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 11;
The method of [1] or [2] using, respectively.
[4] The method according to any one of [1] to [3] for determining CYP2A6*4 and CYP2A6*7, wherein the steps (2) to (3) for CYP2A6*4 and for CYP2A6*7 The above method, wherein the steps (2) to (3) are carried out in different reaction vessels.
[5] forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1, reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3, reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and a TaqMan probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, for determining CYP2A6*4.
[6] forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7, reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 , a TaqMan probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, and a TaqMan probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, a kit for determining CYP2A6*7.
本発明の判定方法を用いることにより、高い精度でＣＹＰ２Ａ６＊４及び／又はＣＹＰ２Ａ６＊７（好ましくはＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７）を測定することができる。また、蛍光強度をリアルタイムで検出する必要がないので、使用装置やアッセイスケジュールを柔軟に変更することが可能となる。本発明により、日本人を含むアジア人集団において、ＣＹＰ２Ａ６のＰＭとなる大半の遺伝子型を容易に判定できることが可能となる。 By using the determination method of the present invention, CYP2A6*4 and/or CYP2A6*7 (preferably CYP2A6*4 and CYP2A6*7) can be measured with high accuracy. Moreover, since it is not necessary to detect the fluorescence intensity in real time, it is possible to flexibly change the equipment used and the assay schedule. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, most genotypes of CYP2A6 PMs can be easily determined in Asian populations including Japanese.
本発明方法では、予備的増幅（プレ増幅、プレＰＣＲ）を行った後、その増幅産物の一部を使用して主増幅（加水分解プローブ法、ＴａｑＭａｎＰＣＲ）を行う。本発明方法における判定対象は、チトクロームＰ４５０（cytochrome P450: CYP）の一種であり、ニコチン代謝反応を触媒するＣＹＰ２Ａ６の遺伝子多型であるＣＹＰ２Ａ６＊１（野生型）、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７である（非特許文献１）。ヒトゲノムでは、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子座の近傍に、ＣＹＰ２Ａ６（配列番号２３；翻訳開始位置は２２番塩基）と塩基配列が酷似している別遺伝子（ＣＹＰ２Ａ７：配列番号２４；翻訳開始位置は３８番塩基）が存在し、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子多型の判定を困難にしている。 In the method of the present invention, after performing preliminary amplification (pre-amplification, pre-PCR), a part of the amplified product is used to perform main amplification (hydrolysis probe method, TaqMan PCR). Objects to be determined in the method of the present invention are CYP2A6*1 (wild type), CYP2A6*4, and CYP2A6*7, which are a type of cytochrome P450 (CYP) and are polymorphisms of CYP2A6 that catalyze nicotine metabolism. There is (Non-Patent Document 1). In the human genome, another gene (CYP2A7: SEQ ID NO: 24; translation initiation position is 38th base) whose nucleotide sequence is very similar to CYP2A6 (SEQ ID NO: 23; translation initiation position is 22nd base) is located near the CYP2A6 locus. exist, making determination of CYP2A6 gene polymorphisms difficult.
ＣＹＰ２Ａ６＊１は野生型であり、正常なニコチン代謝活性を示す。ＣＹＰ２Ａ６＊４は、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との間の非相同組み換えの結果、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の大部分を欠損しており、酵素活性も欠損している。ＣＹＰ２Ａ６＊７は、４７１位のイソロイシンがスレオニンに変異している一塩基多型（ＳＮＰ）であり、酵素活性が低下している（以上、非特許文献１）。
本発明方法では、別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅せず、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域のみを増幅し、かつそれらを明確に区別できる測定系が必要である。
CYP2A6*1 is wild type and exhibits normal nicotine metabolism activity. CYP2A6*4 lacks most of the CYP2A6 gene as a result of non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7, and also lacks enzymatic activity. CYP2A6*7 is a single nucleotide polymorphism (SNP) in which isoleucine at position 471 is mutated to threonine, and the enzymatic activity is reduced (Non-Patent Document 1).
The method of the present invention requires a measurement system that does not amplify the other gene CYP2A7, but amplifies only the regions that characterize CYP2A6*1, CYP2A6*4, and CYP2A6*7, and that can clearly distinguish them.
本発明方法に供する試料は、ゲノムＤＮＡを含むものであれば特に限定されない。例としては、全血や細胞等を挙げることができる。これらの試料から、ＤＮＡの調製のための通常の方法によりＤＮＡを得ることができる。 The sample to be subjected to the method of the present invention is not particularly limited as long as it contains genomic DNA. Examples include whole blood and cells. DNA can be obtained from these samples by conventional methods for the preparation of DNA.
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定
ＣＹＰ２Ａ６＊４は、先述のとおり、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えに拠り、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の大部分を欠損し、機能を欠失しているアリルであり、ＣＹＰ２Ａ７の５’領域と、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’非翻訳領域の融合部分を有する。これを利用し、遺伝子の大部分を欠損したＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域、及びＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域を同時に増幅し、かつ別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅しないプライマー配列を用いてプレ増幅する。
(1) Determination of CYP2A6*4 As described above, CYP2A6*4 is an allele that lacks most of the CYP2A6 gene and lacks function due to non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7. and the 3' untranslated region of the CYP2A6 gene. Utilizing this, the region characterizing CYP2A6*4, which lacks most of the gene, and the region characterizing CYP2A6*1 are simultaneously amplified, and pre-amplified using a primer sequence that does not amplify another gene, CYP2A7.
更に、増幅された領域を鋳型として、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊４をそれぞれ特徴づける各領域に結合する加水分解プローブを設計し、ＴａｑＭａｎＰＣＲにて、ＣＹＰ２Ａ６＊１の存在の有無、及びＣＹＰ２Ａ６＊４の存在の有無を、別々の蛍光値に変換する。これにより、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子型（＊１／＊１、＊１／＊４、＊４／＊４）がそれぞれ判定可能となる。 Furthermore, using the amplified region as a template, hydrolysis probes that bind to each region characterizing CYP2A6 * 1 and CYP2A6 * 4 were designed, and TaqMan PCR was performed to determine the presence or absence of CYP2A6 * 1 and CYP2A6 * 4. Presence or absence is converted to separate fluorescence values. As a result, the genotypes of CYP2A6 (*1/*1, *1/*4, *4/*4) can be determined.
本発明において「ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域」とは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位を含み、且つ、その３’側の下流にＣＹＰ２Ａ６特異配列を含み、その５’側である上流にＣＹＰ２Ａ７特異配列を含む領域のことを指す。 In the present invention, the "region characterizing CYP2A6 * 4" includes a site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs, and includes a CYP2A6-specific sequence downstream of its 3' side, and on its 5' side It refers to a region containing a CYP2A7-specific sequence upstream.
本発明において「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域」とは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位を含み、且つ、その５’側である上流にＣＹＰ２Ａ６特異配列を含む領域のことを指す。 In the present invention, the "region that characterizes CYP2A6*1" refers to a region that contains a site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs, and contains a CYP2A6-specific sequence upstream of the 5' side thereof. .
ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位としては、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子配列の翻訳開始位置から数えて６６５７ｂｐ～６８３１ｂｐとＣＹＰ２Ａ７遺伝子配列の翻訳開始位置から数えて７０４９ｂｐ～７２２２ｂｐとの間、もしくは、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子配列の６７５０ｂｐ～６８３１ｂｐとＣＹＰ２Ａ７遺伝子配列の７１４１ｂｐ～７２２２ｂｐとの間において、高頻度に非相同組換えが生じることが報告されている（FEBS Letters 448(1999)105-110）。 The site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs is between 6657 bp to 6831 bp counting from the translation initiation position of the CYP2A6 gene sequence and 7049 bp to 7222 bp counting from the translation initiation position of the CYP2A7 gene sequence, or the CYP2A6 gene It has been reported that non-homologous recombination frequently occurs between 6750 bp to 6831 bp of the sequence and 7141 bp to 7222 bp of the CYP2A7 gene sequence (FEBS Letters 448 (1999) 105-110).
本発明において「ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセット」とは、組み換えが生じていないＣＹＰ２Ａ６、およびＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じたＣＹＰ２Ａ６＊４を同時に増幅することができ、且つ、組み換えが生じていないＣＹＰ２Ａ７を増幅しないプライマーセットである。 In the present invention, the "primer set that simultaneously amplifies the regions characterizing CYP2A6*1 and CYP2A6*4 and does not amplify the CYP2A7 gene" is CYP2A6 in which recombination does not occur, and non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7. A primer set capable of simultaneously amplifying the resulting CYP2A6*4 and not amplifying CYP2A7 in which recombination has not occurred.
フォワードプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを用い、リバースプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６特異的な配列にハイブリダイズするプライマーを用いることにより、ＣＹＰ２Ａ７を増幅せずに、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を同時に増幅することができる。好ましくは、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域とＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域の増幅産物が、ほぼ同じサイズになるようにプライマーを設計するとよい。 The forward primer uses a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located upstream on the 5' side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs, and the reverse primer uses CYP2A6 and CYP2A7. Simultaneously amplify CYP2A6 * 1 and CYP2A6 * 4 without amplifying CYP2A7 by using a primer that hybridizes to a CYP2A6-specific sequence located downstream on the 3' side from the site where non-homologous recombination occurs can do. Preferably, the primers are designed so that the amplified products of the region that characterizes CYP2A6*1 and the region that characterizes CYP2A6*4 have approximately the same size.
なお、ＣＹＰ２Ａ６＊１には、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の３’非翻訳領域の一部がＣＹＰ２Ａ７遺伝子に置換したアリルＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂが含まれている。ＣＹＰ２Ａ６＊１Ａ（野生型）とＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂとは酵素活性が変わらないため、本発明方法ではＣＹＰ２Ａ６＊１ＢとＣＹＰ２Ａ６＊４を区別できるよう、リバースプライマーは、置換が生じるＣＹＰ２Ａ６遺伝子配列の翻訳開始位置から６６７９ｂｐ～６７３７ｂｐや７０７３ｂｐ～７０９９ｂｐの領域を避けて設定する必要がある。なお、ＣＹＰ２Ａ６＊１ＡとＣＹＰ２Ａ６＊１Ｂは、表現型（酵素活性）が変わらないため、本明細書ではまとめてＣＹＰ２Ａ６＊１と記載する。 CYP2A6*1 contains allele CYP2A6*1B in which part of the 3' untranslated region of the CYP2A6 gene is replaced with the CYP2A7 gene. CYP2A6*1A (wild type) and CYP2A6*1B have the same enzymatic activity, so that the method of the present invention distinguishes between CYP2A6*1B and CYP2A6*4. Therefore, it is necessary to avoid the regions of 6679 bp to 6737 bp and 7073 bp to 7099 bp. Since CYP2A6*1A and CYP2A6*1B do not differ in phenotype (enzyme activity), they are collectively referred to as CYP2A6*1 in this specification.
それぞれのプライマーの長さは、ヒトゲノム中で標的とした配列を特異的に認識する長さを有していれば特に問わないが、一般的には１０塩基から４０塩基の範囲であり、好ましくは１５塩基から３０塩基であり、特に好ましくは１６塩基から２５塩基である。プライマー間の距離、すなわち増幅領域は、１００塩基から５０００塩基の範囲であれば特に問わないが、好ましくは１００塩基から２０００塩基である。主増幅に用いるプライマーおよびプローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定する。 The length of each primer is not particularly limited as long as it has a length that specifically recognizes the target sequence in the human genome, but is generally in the range of 10 to 40 bases, preferably It is 15 to 30 bases, particularly preferably 16 to 25 bases. The distance between the primers, that is, the amplification region, is not particularly limited as long as it is in the range of 100 to 5000 bases, preferably 100 to 2000 bases. The primers and probes used for the main amplification are set so that they can amplify the regions containing the base sequences.
本発明方法における予備的増幅は、前記プライマーを用いること以外は、常法に従って実施することができるが、増幅領域の長さに合わせて適切な伸長時間を設定することにより、組み換えが生じていないＣＹＰ２Ａ７を増幅せずに、各アリルを特徴づける領域のみを増幅することができる。 Preliminary amplification in the method of the present invention can be carried out according to a conventional method, except for using the primers described above. Only the regions that characterize each allele can be amplified without amplifying CYP2A7.
本発明方法では、プレ増幅反応で得られた増幅産物を適宜希釈し上で、主増幅反応の鋳型として用いる。一般的には、二段階ＰＣＲを実施する場合、得られたプレ増幅産物を、主検出工程の増幅を阻害しないヌクレアーゼフリーの溶媒、例えば滅菌処理された超純水にて１００～１０，０００倍に希釈して、鋳型として使用する。 In the method of the present invention, the amplified product obtained in the pre-amplification reaction is diluted appropriately and used as a template for the main amplification reaction. Generally, when performing two-step PCR, the resulting pre-amplification product is magnified 100-10,000-fold in a nuclease-free solvent that does not interfere with amplification in the main detection step, such as sterile ultrapure water. and use as template.
本発明方法におけるＴａｑＭａｎ法による主増幅では、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、当該増幅領域においてＣＹＰ２Ａ６＊１またはＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識する、異なる蛍光色素で標識された２種類のプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う。ＴａｑＭａｎＰＣＲでは、一般に、増幅される領域の塩基配列の一部とアニールする、標識を付したプローブが使用され、ＰＣＲの伸長反応の際にポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性により遊離する標識を検出することにより、目的の増幅産物が検出される。 In the main amplification by the TaqMan method in the method of the present invention, a primer set capable of simultaneously amplifying a region of 200 bp or less containing sequences that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*4, and a primer set that characterizes CYP2A6*1 or CYP2A6*4 in the amplified region Amplification by the TaqMan method is performed using two types of probes labeled with different fluorescent dyes that recognize sequences. TaqMan PCR generally uses labeled probes that anneal with part of the base sequence of the region to be amplified, and detects the label released by the 5' exonuclease activity of the polymerase during the PCR extension reaction. Amplification products of interest are detected.
主増幅に用いるプライマーセットは、プライマー間の距離が、ＴａｑＭａｎプローブ使用時に一般的とされる約２００ｂｐ以下となるように設定し、かつ、プローブの塩基配列を含む領域を増幅できるように設定すること以外は、プレ増幅に用いるプライマーセットと同様に設定することができる。 The primer set used for the main amplification should be set so that the distance between the primers is about 200 bp or less, which is generally considered to be the case when using TaqMan probes, and the region containing the base sequence of the probe can be amplified. Other than that, the primer set can be set in the same manner as the primer set used for pre-amplification.
主増幅用プライマーの配列は、プレ増幅用プライマーの配列と一部配列が重複していてもよいし、同一であってもよい。
例えば、後述する実施例に示すように、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーセットを使用することにより、非相同組換えが生じる部位の５’側上流が、ＣＹＰ２Ａ６由来の配列（すなわち、ＣＹＰ２Ａ６＊１）であっても、ＣＹＰ２Ａ７由来の配列（すなわち、ＣＹＰ２Ａ６＊４）であっても、１セットのプライマーセットで増幅することができる。より具体的には、フォワードプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを用い、リバースプライマーには、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを用いることができる。
The sequence of the main amplification primer may partially overlap with or be the same as the sequence of the pre-amplification primer.
For example, as shown in the examples below, by using a primer set that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7, the 5' upstream of the site where non-homologous recombination occurs is a sequence derived from CYP2A6 (i.e., CYP2A6*1) or a sequence derived from CYP2A7 (that is, CYP2A6*4) can be amplified with one set of primers. More specifically, the forward primer uses a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located upstream on the 5′ side of the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs, and the reverse primer can use a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located downstream, 3′ from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs.
「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブ」とは、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７にはないＣＹＰ２Ａ６特異的な遺伝子配列にハイブリダイズするプローブのことを指す。 The “probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6 * 1” is the region amplified by the main amplification, upstream of the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs 5′ to CYP2A7 It refers to a probe that hybridizes to a CYP2A6-specific gene sequence that does not exist.
「ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブ」とは、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７に特異的でありＣＹＰ２Ａ６にはない遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを指す。 The “probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6 * 4” is the region amplified by the main amplification, upstream of the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs 5′ to CYP2A7 Refers to probes that hybridize to gene sequences that are specific and not found in CYP2A6.
プローブの長さは、１０塩基から５０塩基であり、好ましくは１０塩基から２０塩基である。 The length of the probe is 10 to 50 bases, preferably 10 to 20 bases.
本発明方法におけるＴａｑＭａｎ法による主増幅に用いるプローブは、一の末端が蛍光色素により標識され、他の末端が前記蛍光色素を抑制するクエンチャーにより標識されている。 The probe used for the main amplification by the TaqMan method in the method of the present invention has one end labeled with a fluorescent dye and the other end labeled with a quencher that suppresses the fluorescent dye.
本発明において蛍光色素とは、特定波長の励起光を吸収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する物質を指す。標識に用いる蛍光物質は、プローブの末端に標識可能なものであれば、特に問わない。例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ等いずれであってもよい。好ましくは、ＨＥＸ（５５３ｎｍ）やＦＡＭ（５２０ｎｍ）が挙げられる。
本発明方法においては、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブとＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブとで、異なる蛍光色素を組み合わせて用いる。使用する解析装置に合わせて、検出波長の異なる蛍光色素を選択することができる。
In the present invention, a fluorescent dye refers to a substance that has the property of becoming excited by absorbing excitation light of a specific wavelength and emitting fluorescence when returning to the original ground state. The fluorescent substance used for labeling is not particularly limited as long as the end of the probe can be labeled. For example, FAM, TET, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red, TAMRA, FITC, or the like may be used. HEX (553 nm) and FAM (520 nm) are preferred.
In the method of the present invention, different fluorescent dyes are used in combination for the probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6*1 and the probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6*4. Fluorescent dyes with different detection wavelengths can be selected according to the analysis equipment to be used.
本発明においてクエンチャーとは、蛍光色素の励起エネルギー吸収物質等をいう。使用する種類はＢＨＱ１、ＢＨＱ２、Ｄａｂｃｙｌ等いずれであってもよい。ただし、当該抑制する色素の種類によって蛍光の抑制範囲が異なるため、一のプローブ上で組となる蛍光色素の発光を抑制できるクエンチャーの種類を選択する必要がある。発光を抑制できる選択範囲内では特に問わない。例えば、蛍光色素がＦＡＭやＴＥＴの場合には、抑制範囲の波長がやや短波寄り（４８０ｎｍ～５８０ｎｍ）のＢＨＱ１を、また蛍光物質がＣｙ３やＴｅｘａｓ ｒｅｄの場合には、抑制範囲の波長がやや長波寄り（５５０ｎｍ～６５０ｎｍ）のＢＨＱ２を、選択してもよい。 In the present invention, a quencher refers to a material that absorbs the excitation energy of a fluorescent dye. The type used may be any of BHQ1, BHQ2, Dabcyl, and the like. However, since the range of fluorescence suppression differs depending on the type of dye to be suppressed, it is necessary to select the type of quencher that can suppress the emission of the paired fluorescent dyes on one probe. There is no particular limitation as long as the selection range is such that light emission can be suppressed. For example, when the fluorescent dye is FAM or TET, the wavelength of the suppression range is slightly short (480 nm to 580 nm) BHQ1, and when the fluorescent substance is Cy3 or Texas red, the wavelength of the suppression range is slightly long. A closer (550 nm to 650 nm) BHQ2 may be selected.
本発明において「標識され」とは、前記蛍光色素と前記クエンチャーのうち、いずれか一方は５’末端に、また他方は３’末端に化学的に結合されていることを意味する。通常５’末端に蛍光物質が結合していることが多いが、同様の効果が得られるのであれば３’末端に蛍光物質が結合していても、特に問わない。 In the present invention, the term "labeled" means that one of the fluorescent dye and the quencher is chemically bound to the 5' end and the other is chemically bound to the 3' end. A fluorescent substance is usually bound to the 5'-end, but it does not matter if a fluorescent substance is bound to the 3'-end as long as the same effect can be obtained.
本発明方法における主増幅は、特定のプローブ及びプライマー対を使用する他は、通常のＴａｑＭａｎＰＣＲの方法に従って行うことができる。ＰＣＲの条件は、当業者であれば適宜最適化することができる。 The main amplification in the method of the present invention can be performed according to the usual TaqMan PCR method except for using specific probes and primer pairs. PCR conditions can be appropriately optimized by those skilled in the art.
本発明における判定方法は、前記蛍光色素から発する蛍光を利用する。例えば、５’末端が蛍光物質で標識されているプローブにおいて、当該プローブの上流にハイブリダイゼーションするプライマーと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとを遺伝子増幅用反応液に加え、ＰＣＲ法によって遺伝子増幅反応を行うことで、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、蛍光色素がプローブから遊離することでクエンチャーによる抑制が解除される。 The determination method in the present invention utilizes fluorescence emitted from the fluorescent dye. For example, in a probe whose 5' end is labeled with a fluorescent substance, a primer that hybridizes upstream of the probe and a DNA polymerase having 5'→3' exonuclease activity are added to the reaction solution for gene amplification, and PCR is performed. When the gene amplification reaction is performed according to the method, the probe is decomposed by the 5′→3′ exonuclease activity of the DNA polymerase, and the fluorescent dye is released from the probe, thereby releasing the inhibition by the quencher.
本発明の方法では、ＣＹＰ２Ａ６＊１およびＣＹＰ２Ａ６＊４が、２色の蛍光強度にそれぞれ対応して検出される。これにより、一般的な加水分解プローブによるＳＮＰ判定ソフトウェアが使用可能となる。目視による判定が不要となり、制限酵素処理や電気泳動など、従来法における誤判定や作業時間の問題が解消され、臨床の現場で遺伝子多型判定を短時間で行い、個人ごとの薬物処方設計を支援することが可能となる。また、Ｔｍ値の解析よりも、結果を容易に視覚的に確認することができる。 In the method of the present invention, CYP2A6*1 and CYP2A6*4 are detected corresponding to fluorescence intensities of two colors, respectively. This makes it possible to use SNP determination software using general hydrolysis probes. It eliminates the need for visual judgment and eliminates the problems of erroneous judgment and work time in conventional methods such as restriction enzyme treatment and electrophoresis. It is possible to support Moreover, the results can be visually confirmed more easily than the analysis of the Tm value.
蛍光色素に起因する蛍光強度の測定は、遺伝子増幅反応中にリアルタイムに行ってもよいし、反応終了後に行ってもよい。増幅反応中に測定する場合は、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲの専用装置が必要となる。増幅反応終了後に測定する場合は、遺伝子増幅反応はサーマルサイクラーで行うことができ、解析規模に応じて柔軟に使用する装置を選択することが可能となる。 Measurement of the fluorescence intensity caused by the fluorescent dye may be performed in real time during the gene amplification reaction or may be performed after the completion of the reaction. When measuring during the amplification reaction, a dedicated device for real-time PCR that integrates a thermal cycler and a spectrofluorometer is required. When the measurement is performed after the completion of the amplification reaction, the gene amplification reaction can be performed with a thermal cycler, and the device to be used can be flexibly selected according to the scale of analysis.
本発明方法において、プレ増幅及び主増幅に用いるプライマーセット、及びプローブの設定は、融解温度（Ｔｍ値）が均一で、分子内相互作用を有さず、且つプライマー、プローブ間で分子間二量体を形成し得る相補的配列を避けるように留意するなど、ＰＣＲに用いる条件を考慮して当業者に公知の方法に従って行えばよい。プローブ及びプライマー対の設定は、適当なプライマー・プローブデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。 In the method of the present invention, the primer sets and probes used for pre-amplification and main amplification have a uniform melting temperature (Tm value), no intramolecular interaction, and no intermolecular dimers between the primers and probes. PCR may be carried out according to methods known to those skilled in the art, taking into consideration the conditions used in PCR, such as taking care to avoid complementary sequences that can form nuclei. Appropriate software for primer/probe design may be used to set probes and primer pairs.
（２）ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定
ＣＹＰ２Ａ６＊７は１塩基置換のアリル（SNP ID:rs5031016）であるが、当該ＳＮＰはＣＹＰ２Ａ７と非常に相同性が高い領域（ＣＹＰ２Ａ６遺伝子の翻訳開始位置から６５５８番目）にあり、直接ＴａｑＭａｎプローブで遺伝子型を決定することは困難である。そこで、ＣＹＰ２Ａ６＊７については、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域、及びＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域を同時に増幅し、かつ別遺伝子ＣＹＰ２Ａ７を増幅しないプライマー配列をもちいてプレ増幅する。これは、ＣＹＰ２Ａ６のみ特異的に増幅させることになる。
(2) Determination of CYP2A6*7 CYP2A6*7 is a single-base substitution allele (SNP ID: rs5031016), but the SNP has a very high homology with CYP2A7 (6558th from the translation initiation position of the CYP2A6 gene) and is difficult to genotype directly with TaqMan probes. Therefore, for CYP2A6*7, the region that characterizes CYP2A6*7 and the region that characterizes CYP2A6*1 are simultaneously amplified, and preamplification is performed using a primer sequence that does not amplify another gene, CYP2A7. This results in specific amplification of only CYP2A6.
更に、増幅された領域を鋳型として、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊７をそれぞれ特徴づける同一領域に結合する加水分解プローブを設計し、ＴａｑＭａｎＰＣＲにて、ＣＹＰ２Ａ６＊１の存在の有無、ＣＹＰ２Ａ６＊７の存在の有無を別々の蛍光値に変換する。これにより、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子型（＊１／＊１、＊１／＊７、＊７／＊７）がそれぞれ判定可能となる。 Furthermore, using the amplified region as a template, hydrolysis probes that bind to the same regions that characterize CYP2A6 * 1 and CYP2A6 * 7 were designed, and TaqMan PCR was performed to determine the presence or absence of CYP2A6 * 1 and the presence of CYP2A6 * 7. The presence or absence of is converted into separate fluorescence values. As a result, the genotypes of CYP2A6 (*1/*1, *1/*7, *7/*7) can be determined.
本発明において「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける領域」及び「ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域」とは、いずれも、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域のことを指す。
本発明において、「ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセット」とは、ＣＹＰ２Ａ６特異的配列にハイブリダイズし、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させるプライマーセットである。「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列であり、「ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列のことを指す。
In the present invention, the "region that characterizes CYP2A6*1" and the "region that characterizes CYP2A6*7" both refer to the region containing the 471st amino acid of CYP2A6.
In the present invention, the "primer set that simultaneously amplifies regions that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*7 and does not amplify the CYP2A7 gene" hybridizes to a CYP2A6-specific sequence and contains the amino acid at position 471 of CYP2A6. A primer set that amplifies a region. The “sequence characterizing CYP2A6*1” is a sequence in which the amino acid at position 471 of CYP2A6 is isoleucine, and the “sequence characterizing CYP2A6*7” is a sequence in which the amino acid at position 471 of CYP2A6 is threonine. point to
ＣＹＰ２Ａ６＊７のプレ増幅に用いるプライマーセットは、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットである。ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることができるものであれば、ＣＹＰ２Ａ６＊４のプレ増幅に用いるプライマーセットと、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの一方、もしくは双方が同一であってもよい。同一のプライマーセットを用いることにより、ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７判定のためのプレ増幅を、一つの反応容器で実施することができる。 The primer set used for pre-amplification of CYP2A6*7 is a primer set capable of hybridizing to the CYP2A6-specific sequence and amplifying the region containing amino acid 471 of CYP2A6. A primer set used for pre-amplification of CYP2A6*4 and one or both of a forward primer and a reverse primer, as long as they can hybridize to the CYP2A6-specific sequence and amplify the region containing the amino acid at position 471 of CYP2A6. may be the same. By using the same primer set, pre-amplification for CYP2A6*4 and CYP2A6*7 determination can be performed in one reaction vessel.
ＣＹＰ２Ａ６＊７のＴａｑＭａｎ法による主増幅では、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、当該増幅領域においてＣＹＰ２Ａ６＊１またはＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識する、異なる蛍光色素で標識された２種類のプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う。 In the main amplification of CYP2A6*7 by the TaqMan method, a primer set capable of simultaneously amplifying a region of 200 bp or less containing sequences that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*7, and a primer set that characterizes CYP2A6*1 or CYP2A6*7 in the amplified region Amplification by the TaqMan method is performed using two types of probes labeled with different fluorescent dyes that recognize sequences.
主増幅に用いるプライマーセットは、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットである。主増幅用プライマーの配列は、プレ増幅用プライマーの配列と一部配列が重複していてもよいし、同一であってもよい。 The primer set used for main amplification is a primer set capable of hybridizing to the CYP2A6-specific sequence and amplifying the region containing amino acid 471 of CYP2A6. The sequence of the main amplification primer may partially overlap with or be the same as the sequence of the pre-amplification primer.
「ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブ」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブのことを指す。 The “probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6*1” is a region containing a sequence in which the amino acid at position 471 of CYP2A6 is isoleucine (typically a region consisting of 10 to 50 bases, preferably 10 bases region consisting of 20 bases from )).
「ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識するプローブ」とは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブのことを指す。 The "probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6*7" is a region containing a sequence in which the 471st amino acid of CYP2A6 is threonine (typically a region consisting of 10 to 50 bases, preferably 10 bases region consisting of 20 bases from )).
使用するプライマーおよびプローブ以外の要件や原理に関しては、ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定方法と同じである。 The requirements and principles other than the primers and probes to be used are the same as the determination method for CYP2A6*4.
本発明方法では、ＣＹＰ２Ａ６＊１、ＣＹＰ２Ａ６＊４、ＣＹＰ２Ａ６＊７をそれぞれ特異的に検出するため、ＣＹＰ２Ａ６＊４（及びＣＹＰ２Ａ６＊１）判定のために以下のプライマー、プローブ（１）～（３）を、ＣＹＰ２Ａ６＊７（及びＣＹＰ２Ａ６＊１）判定のために以下のプライマー、プローブ（４）～（６）を設計し、用いることができる。また、その相補的塩基配列を有するプライマー、プローブでもよい。 In the method of the present invention, in order to specifically detect CYP2A6 * 1, CYP2A6 * 4, and CYP2A6 * 7, the following primers and probes (1) to (3) for CYP2A6 * 4 (and CYP2A6 * 1) determination The following primers and probes (4) to (6) can be designed and used for CYP2A6*7 (and CYP2A6*1) determination. In addition, primers and probes having complementary base sequences thereof may also be used.
（１）プレ増幅用プライマー配列：後述する表１に記載のＰＣＲ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１（配列番号１）及びＰＣＲ－２Ａ６－ＲＷ１（配列番号２）に代表される、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないＰＣＲプライマーペア。フォワードプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーであり、リバースプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６特異的な配列にハイブリダイズするプライマーである。このようなプライマーセットとしては、配列番号１２の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せが挙げられる。 (1) Pre-amplification primer sequence: CYP2A6*1 and CYP2A6*4, represented by PCR-2A6st4-FW1 (SEQ ID NO: 1) and PCR-2A6-RW1 (SEQ ID NO: 2) described in Table 1 below. A PCR primer pair that co-amplifies the characterizing region and does not amplify the CYP2A7 gene. The forward primer is a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located upstream on the 5' side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs, and the reverse primer is a primer that hybridizes to the non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7. A primer that hybridizes to a CYP2A6-specific sequence located downstream, 3′ from the site where homologous recombination occurs. Such a primer set includes a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 12, and a sequence consisting of 14 to 20 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 13. A combination with a reverse primer represented by is mentioned.
（２）主増幅用プライマー配列：表１に記載のＰｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１（配列番号３）及びＰｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ４－ＲＶ１（配列番号４）に代表される、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーペア。フォワードプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーであり、リバースプライマーは、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーである。このようなプライマーセットとしては、配列番号１４の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せが挙げられる。 (2) Main amplification primer sequences: Characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*4, typified by Primer-2A6st4-FW1 (SEQ ID NO: 3) and Primer-2A6st4-RV1 (SEQ ID NO: 4) listed in Table 1 A primer pair capable of simultaneously amplifying a region of 200 bp or less. The forward primer is a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located upstream on the 5' side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs, and the reverse primer is a primer that hybridizes to the non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7. It is a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located downstream, 3′ from the site where homologous recombination occurs. Such a primer set includes a forward primer represented by a sequence consisting of 21 to 27 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 14, and a sequence consisting of 21 to 27 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 15. A combination with a reverse primer represented by is mentioned.
（３）加水分解プローブ配列：表１に記載のＰｒｏｂｅ－２Ａ６ｓｔ４（ＨＥＸ）（配列番号５）及びＰｒｏｂｅ－２Ａ７ｓｔ４（ＦＡＭ）（配列番号６）に代表される、（２）のプライマーペアで増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける各配列を認識し、それぞれ別の蛍光として検出可能な加水分解プローブ。ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブは、主増幅で増幅された領域の中で、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７にはないＣＹＰ２Ａ６特異的な遺伝子配列にハイブリダイズするプローブであり、ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブは、主増幅で増幅された領域の中で、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７に特異的でありＣＹＰ２Ａ６にはない遺伝子配列にハイブリダイズするプローブである。ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブとしては、配列番号１６の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブが挙げられる。ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識するプローブとしては、配列番号１７の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブが挙げられる。 (3) Hydrolysis probe sequence: Amplified with the primer pair of (2), represented by Probe-2A6st4 (HEX) (SEQ ID NO: 5) and Probe-2A7st4 (FAM) (SEQ ID NO: 6) listed in Table 1. A hydrolysis probe that recognizes each sequence that characterizes CYP2A6*1 and CYP2A6*4 in the region described above and that is detectable as a separate fluorescence. The probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6 * 1 is located upstream of the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs in the region amplified by the main amplification, CYP2A6 that is not in CYP2A7 A probe that hybridizes to a specific gene sequence and that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6*4 is a probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6*4. On the 5' upstream side is a probe that hybridizes to a gene sequence that is specific to CYP2A7 and absent from CYP2A6. A probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*1 includes a probe represented by a sequence consisting of 12 to 18 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO:16. Probes that recognize sequences that characterize CYP2A6*4 include probes represented by a sequence consisting of 12 to 18 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO:17.
（４）プレ増幅用プライマー配列：後述する表３に記載のＰＣＲ－２Ａ６ｓｔ７－ＦＷ１（配列番号７）〔又はＰＣＲ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１（配列番号１）〕及びＰＣＲ－２Ａ６－ＲＷ１（配列番号２）に代表される、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないＰＣＲプライマーペア。ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットである。このようなプライマーセットとしては、配列番号１２又は配列番号１８の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せが挙げられる。 (4) Pre-amplification primer sequence: PCR-2A6st7-FW1 (SEQ ID NO: 7) [or PCR-2A6st4-FW1 (SEQ ID NO: 1)] and PCR-2A6-RW1 (SEQ ID NO: 2) described in Table 3 below A PCR primer pair that simultaneously amplifies the regions that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*7 and does not amplify the CYP2A7 gene, typified by A primer set capable of hybridizing to a CYP2A6-specific sequence and amplifying a region containing amino acid 471 of CYP2A6. Such a primer set includes a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 12 or 18, and a sequence of 14 to 20 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 13. A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of bases is included.
（５）主増幅用プライマー配列：表３に記載のＰｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ７－ＦＷ１（配列番号８）及びＰｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ７－ＲＶ１（配列番号９）に代表される、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーペア。ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットである。このようなプライマーセットとしては、配列番号１９の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号２０の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せが挙げられる。 (5) Main amplification primer sequences: Characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*7, typified by Primer-2A6st7-FW1 (SEQ ID NO: 8) and Primer-2A6st7-RV1 (SEQ ID NO: 9) listed in Table 3 A primer pair capable of simultaneously amplifying a region of 200 bp or less. A primer set capable of hybridizing to a CYP2A6-specific sequence and amplifying a region containing amino acid 471 of CYP2A6. Such a primer set includes a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 19, and a sequence consisting of 16 to 22 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 20. A combination with a reverse primer represented by is mentioned.
（６）加水分解プローブ配列：表３に記載のＰｒｏｂｅ－２Ａ６ｓｔ１（ＨＥＸ）（配列番号１０）及びＰｒｏｂｅ－２Ａ６ｓｔ７（ＦＡＭ）（配列番号１１）に代表される、（５）のプライマーペアで増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識し、それぞれ別の蛍光として検出可能な加水分解プローブ。ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブであり、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識するプローブは、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブである。ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識するプローブとしては、配列番号２１の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブが挙げられる。ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識するプローブとしては、配列番号２２の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブが挙げられる。 (6) Hydrolysis probe sequence: Amplified with the primer pair of (5), represented by Probe-2A6st1 (HEX) (SEQ ID NO: 10) and Probe-2A6st7 (FAM) (SEQ ID NO: 11) listed in Table 3. A hydrolysis probe that recognizes the sequences that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*7 in the region described above and that are each detectable as distinct fluorescence. A probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*1 is a region containing a sequence in which amino acid 471 of CYP2A6 is isoleucine (typically a region consisting of 10 to 50 bases, preferably 10 to 20 bases). A probe that hybridizes to a region consisting of CYP2A6*7 and that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*7 is a region containing a sequence in which the amino acid at position 471 of CYP2A6 is threonine (typically from 10 to 50 bases region, preferably a region consisting of 10 to 20 bases). Probes that recognize sequences that characterize CYP2A6*1 include probes represented by a sequence consisting of 16 to 22 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO:21. Probes that recognize sequences that characterize CYP2A6*7 include probes represented by a sequence consisting of 16 to 22 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO:22.
本発明の判定用キットは、本発明方法に用いることのできるキットであり、プレ増幅用プライマーセット、及び、主増幅用プライマーセットと２種のプローブを含むことを特徴とする。プローブ及びプライマーセットについては、本発明方法に関し、上記に説明した通りである。
本判定用キットにおいてプローブ及びプライマー対は、混合物とされていてもよいし、別個に収容されていてもよい。本発明キットは、プローブ及びプライマーセットの他に、ＰＣＲを行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。
The determination kit of the present invention is a kit that can be used in the method of the present invention, and is characterized by comprising a pre-amplification primer set, a main amplification primer set, and two types of probes. Probes and primer sets are as described above with respect to the method of the present invention.
In this determination kit, the probes and primer pairs may be mixed or stored separately. The kit of the present invention may further contain reagents required for PCR in addition to the probe and primer set.
本発明方法におけるプレ増幅および主増幅は、前記プローブ及びプライマーを用いること以外は、常法に従って実施することができ、より具体的には、例えば、後述の実施例に記載の手順に従って実施することができる。 Pre-amplification and main amplification in the method of the present invention can be performed according to conventional methods, except for using the probes and primers. More specifically, for example, it can be performed according to the procedures described in Examples below. can be done.
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to Examples, but these are not intended to limit the scope of the present invention.
《実施例１：測定試料並びにプライマー及びプローブの調製》
測定試料となるゲノムＤＮＡは、コリエル研究所（Coriell Institute）から購入したＨａｐＭａｐ ＤＮＡ（HAPMAP PT02）を市販のジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水（DEPC-Treated Water；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）でゲノムＤＮＡ濃度として２ｎｇ／μＬに希釈したものを使用した。測定に使用したＨａｐＭａｐ ＤＮＡを表１１に示す。
<<Example 1: Preparation of measurement samples and primers and probes>>
Genomic DNA as a measurement sample was obtained by treating HapMap DNA (HAPMAP PT02) purchased from Coriell Institute with commercially available diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water (DEPC-Treated Water; Life Technologies Japan Co., Ltd.). A diluted product with a concentration of 2 ng/μL was used. Table 11 shows the HapMap DNA used for the measurement.
ＣＹＰ２Ａ６＊４測定のために、表１に記載のプレＰＣＲ用プライマー、並びにＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー及びプローブを調製した。ＦＷプライマー（ＰＣＲ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１；配列番号１）はＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズし、ＲＶプライマー（ＰＣＲ－２Ａ６－ＲＷ１；配列番号２）はＣＹＰ２Ａ６特異的配列にハイブリダイズする。これにより、ＣＹＰ２Ａ７は増幅せずにＣＹＰ２Ａ６＊１及びアリルＣＹＰ２Ａ６＊４を特異的に増幅することができる。ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ４－ＦＷ１；配列番号３、Ｐｒｉｍｅｒ－２Ａ６ｓｔ４－ＲＶ１；配列番号４）は、ＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズすることから、ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４の双方を増幅することができる。Ａｌｌｅｌｅ Ｘ用プローブ（Ｐｒｏｂｅ－２Ａ６ｓｔ４（ＨＥＸ）；配列番号５）はＴａｑＭａｎＰＣＲ増幅産物中でＣＹＰ２Ａ６特異的配列、すなわちＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識する加水分解プローブであり、Ａｌｌｅｌｅ Ｙ用プローブ（Ｐｒｏｂｅ－２Ａ７ｓｔ４（ＦＡＭ）；配列番号６）は増幅産物中でＣＹＰ２Ａ７、すなわちＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識する加水分解プローブである。
なお、各配列の説明（由来）を表２に示す。
For CYP2A6*4 measurement, pre-PCR primers and TaqMan PCR primers and probes listed in Table 1 were prepared. The FW primer (PCR-2A6st4-FW1; SEQ ID NO:1) hybridizes to the consensus sequence of CYP2A6 and CYP2A7, and the RV primer (PCR-2A6-RW1; SEQ ID NO:2) hybridizes to the CYP2A6-specific sequence. As a result, CYP2A6*1 and allyl CYP2A6*4 can be specifically amplified without amplifying CYP2A7. TaqMan PCR primers (Primer-2A6st4-FW1; SEQ ID NO: 3, Primer-2A6st4-RV1; SEQ ID NO: 4) hybridize to the common sequences of CYP2A6 and CYP2A7, amplifying both CYP2A6*1 and CYP2A6*4. can do. The Allele X probe (Probe-2A6st4 (HEX); SEQ ID NO: 5) is a hydrolysis probe that recognizes a CYP2A6-specific sequence, that is, a sequence that characterizes CYP2A6*1 in the TaqMan PCR amplification product. -2A7st4 (FAM); SEQ ID NO: 6) is a hydrolysis probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A7, ie CYP2A6*4, in the amplification product.
Table 2 shows the description (origin) of each sequence.
また、ＣＹＰ２Ａ６＊７測定のために、表３に記載のプレＰＣＲ用プライマー、並びにＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー及びプローブを調製した。Ｐｒｅ－ＰＣＲ及びＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマーは、いずれもＣＹＰ２Ａ６を特異的に増幅することができる。Ａｌｌｅｌｅ Ｘ用プローブは増幅産物中でＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識する加水分解プローブであり、Ａｌｌｅｌｅ Ｙ用プローブは増幅産物中でＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識する加水分解プローブである。なお、ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プローブの各塩基配列において小文字で示す塩基は、ＣＹＰ２Ａ６＊１又はＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴付ける一塩基置換の位置を示す。
なお、各配列の説明（由来）を表４に示す。
For the measurement of CYP2A6*7, pre-PCR primers and TaqMan PCR primers and probes shown in Table 3 were prepared. Both Pre-PCR and TaqMan PCR primers can specifically amplify CYP2A6. The Allele X probe is a hydrolysis probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6*1 in the amplification product, and the Allele Y probe is a hydrolysis probe that recognizes the sequence that characterizes CYP2A6*7 in the amplification product. In each nucleotide sequence of the TaqMan PCR probe, the lowercase letters indicate the positions of single nucleotide substitutions that characterize CYP2A6*1 or CYP2A6*7.
Table 4 shows the description (origin) of each sequence.
《実施例２：プレＰＣＲ》
プレＰＣＲ用のフォワードプライマー（１００μｍｏｌ／Ｌ）及びリバースプライマー（１００μｍｏｌ／Ｌ）を２．５μＬずつ、並びにDEPC-Treated Waterを９５μＬ混和し、ＣＹＰ２Ａ６＊４測定用及びＣＹＰ２Ａ６＊７測定用の各Pre-PCR Primer Mix (2.5 μmol/L)を調製した。次に、表５に記載の組成（１反応分）に従って、市販のＰＣＲ試薬（TaKaRa LA Taq with GC Buffer；タカラバイオ株式会社）に添付の各試薬、前記Pre-PCR Primer Mix (2.5 μmol/L)、及びDEPC-Treated Waterを混和・撹拌した後、スピンダウンしてpre-PCR Mixtureとした。
９６ウェルプレートの各ウェルにpre-PCR Mixtureを１２μＬずつ分注した。続いて、各HapMap DNA溶液及び陰性対照としてDEPC-Treated Waterを３μＬずつ添加した。９６ウェルプレートにシールした後、タッピングにより混和した。
スピンダウンした後、９６ウェルプレートをPCR System（GeneAmp PCR System 9700；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）にセットして、表６に示す条件で反応させ、プレＰＣＲ反応産物とした。
<<Example 2: Pre-PCR>>
2.5 μL each of forward primer (100 μmol / L) and reverse primer (100 μmol / L) for pre-PCR, and 95 μL of DEPC-Treated Water were mixed, and each Pre- A PCR Primer Mix (2.5 μmol/L) was prepared. Next, according to the composition (for one reaction) shown in Table 5, each reagent attached to a commercially available PCR reagent (TaKaRa LA Taq with GC Buffer; Takara Bio Inc.), the Pre-PCR Primer Mix (2.5 μmol / L ), and DEPC-Treated Water were mixed and stirred, and then spun down to form a pre-PCR Mixture.
12 µL of the pre-PCR Mixture was dispensed into each well of a 96-well plate. Subsequently, 3 µL of each HapMap DNA solution and DEPC-Treated Water as a negative control were added. After sealing in a 96-well plate, it was mixed by tapping.
After spinning down, the 96-well plate was set in a PCR System (GeneAmp PCR System 9700; Life Technologies Japan Co., Ltd.) and reacted under the conditions shown in Table 6 to obtain a pre-PCR reaction product.
《実施例３：ＴａｑＭａｎＰＣＲ》
表７に記載の組成に従って、TaqMan MGB Probe&Primer Mix (10×)を調製した。次に、表８に記載の組成（１反応分）に従って、試験管ミキサーにより混合した後、スピンダウンして、PCR Reaction Mixを調製した。
３８４ウェルプレートの各ウェルに各PCR Reaction Mixを６．０μＬずつ添加した。続いて、前記実施例２で得られたプレＰＣＲ反応産物をDEPC-Treated Waterで１０２４倍希釈したプレＰＣＲ反応産物希釈液、陰性対照としてDEPC-Treated Waterを４．０μＬずつ添加した。なお、各試料に対して反応はデュープリケート（duplicate、２ウェルずつ）で実施した。３８４ウェルプレートにシールを貼り、スピンダウンした後、リアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler 480 II；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）にセットした。
<<Example 3: TaqMan PCR>>
TaqMan MGB Probe&Primer Mix (10×) was prepared according to the composition given in Table 7. Next, according to the composition (for one reaction) shown in Table 8, the mixture was mixed with a test tube mixer and then spun down to prepare a PCR Reaction Mix.
6.0 μL of each PCR Reaction Mix was added to each well of the 384-well plate. Subsequently, 4.0 μL of a pre-PCR reaction product diluent obtained by diluting the pre-PCR reaction product obtained in Example 2 1024-fold with DEPC-Treated Water and DEPC-Treated Water as a negative control were added. For each sample, the reaction was performed in duplicate (2 wells each). A 384-well plate was affixed with a seal, spun down, and set in a real-time PCR device (LightCycler 480 II; Roche Diagnostics Co., Ltd.).
リアルタイムＰＣＲは、表９に示す条件で実施した。反応終了後、エンドポイントでの蛍光量を測定した。得られた測定データを表１０に従って変換し、ＳＮＰ判定とした。なお、測定不能の場合はＮ／Ａと表記した。 Real-time PCR was performed under the conditions shown in Table 9. After completion of the reaction, the amount of fluorescence at the end point was measured. The obtained measurement data were converted according to Table 10 and used as SNP determination. In addition, when measurement was impossible, it described with N/A.
《実施例４：結果と考察》
ＣＹＰ２Ａ６＊４の結果を表１１に示す。また、ＣＹＰ２Ａ６＊４のクラスタリングの結果を図１に示す。図１において、横軸はＨＥＸ（Allele X）の蛍光強度であり、縦軸はＦＡＭ（Allele Y）の蛍光強度である。
すべての測定試料において、デュープリケートの結果は同一であり、また、事前情報と一致した結果が得られた。なお、陰性対照（ゲノムDNAなし）は、ＨＥＸ及びＦＡＭ共に非検出であり、Negativeであった。またクラスタリングは、Allele X & Allele Yのヘテロ接合体（Both Alleles；図１のグラフの右上ゾーン）、Allele Xのホモ接合体（Allele X；図１のグラフの右下ゾーン）、Allele Yのホモ接合体（Allele Y；図１のグラフの左上ゾーン）、陰性対照（Negative；図１のグラフの左下ゾーン）が明瞭に区別され、自動判定可能であった。＊４／＊４（０コピー）と判定された検体は２検体（NA18952、NA18973）であった。
<<Example 4: Results and Considerations>>
Table 11 shows the results of CYP2A6*4. Moreover, the result of clustering of CYP2A6*4 is shown in FIG. In FIG. 1, the horizontal axis is the fluorescence intensity of HEX (Allele X), and the vertical axis is the fluorescence intensity of FAM (Allele Y).
Duplicate results were the same for all measured samples, and results were consistent with prior information. In the negative control (no genomic DNA), HEX and FAM were both non-detectable and negative. In addition, clustering is performed by heterozygotes of Allele X & Allele Y (Both Alleles; upper right zone of graph in Fig. 1), homozygotes of Allele X (Allele X; lower right zone of graph in Fig. 1), and homozygotes of Allele Y. The zygotes (Allele Y; upper left zone of the graph in FIG. 1) and the negative control (Negative; lower left zone of the graph in FIG. 1) were clearly distinguished and could be automatically determined. Two specimens (NA18952, NA18973) were judged to be *4/*4 (0 copies).
ＣＹＰ２Ａ６＊７の結果を表１２に示す。また、ＣＹＰ２Ａ６＊７のクラスタリングの結果を図２に示す。表１２における「*Allele X」は、低シグナル値での判定であることを示す。図２において、横軸はＨＥＸ（Allele X）の蛍光強度であり、縦軸はＦＡＭ（Allele Y）の蛍光強度である。
NA18952及びNA18973の結果の考察は後述するとして、これらを除くすべての測定試料において、デュープリケートの結果は同一であった。なお、陰性対照（ゲノムDNAなし）は、ＨＥＸ及びＦＡＭ共に非検出であり、Negativeであった。またクラスタリングは、Allele X & Allele Yのヘテロ接合体（Both Alleles；図２のグラフの右上ゾーン）、Allele Xのホモ接合体（Allele X；図２のグラフの右下ゾーン）、Allele Yのホモ接合体（Allele Y；図２のグラフの左上ゾーン）、陰性対照（Negative；図２のグラフの左下ゾーン）が明瞭に区別され、自動判定可能であった。なお、プレＰＣＲ反応産物をシークエンスした結果、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のみが増幅されていたこと（すなわち、ＣＹＰ２Ａ７遺伝子が増幅されていないこと）を確認した。
NA18952及びNA18973の結果は低シグナルであり、NA18952及びNA18973が＊４／＊４（０コピー）であることを考慮すると、この結果は妥当であると判断された。
Table 12 shows the results of CYP2A6*7. Moreover, the result of clustering of CYP2A6*7 is shown in FIG. "*Allele X" in Table 12 indicates determination at a low signal value. In FIG. 2, the horizontal axis is the fluorescence intensity of HEX (Allele X), and the vertical axis is the fluorescence intensity of FAM (Allele Y).
The results of NA18952 and NA18973 will be discussed later, and the results of duplicates were the same for all measurement samples except for these. In the negative control (no genomic DNA), HEX and FAM were both non-detectable and negative. In addition, clustering is performed by heterozygotes of Allele X & Allele Y (Both Alleles; upper right zone of graph in Fig. 2), homozygotes of Allele X (Allele X; lower right zone of graph in Fig. 2), and homozygotes of Allele Y. The zygotes (Allele Y; upper left zone of the graph in FIG. 2) and the negative control (Negative; lower left zone of the graph in FIG. 2) were clearly distinguished and could be automatically determined. As a result of sequencing the pre-PCR reaction product, it was confirmed that only the CYP2A6 gene was amplified (that is, the CYP2A7 gene was not amplified).
The results of NA18952 and NA18973 were low signals, and considering that NA18952 and NA18973 were *4/*4 (0 copies), this result was judged to be reasonable.
《比較例：ＴａｑＭａｎＰＣＲ（プレＰＣＲ不実施）》
実施例３と同様にして、PCR Reaction Mixを調製し、３８４ウェルプレートの各ウェルに各PCR Reaction Mixを６．０μＬずつ添加した。続いて、プレＰＣＲ反応産物希釈液の代わりに各HapMap DNA溶液、及び陰性対照としてDEPC-Treated Waterを４．０μＬずつ添加した。なお、各試料に対して反応はデュープリケート（duplicate、２ウェルずつ）で実施した。３８４ウェルプレートにシールを貼り、スピンダウンした後、リアルタイムＰＣＲ装置（LightCycler 480 II；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）にセットし、表９に示す条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。
<<Comparative example: TaqMan PCR (no pre-PCR)>>
A PCR Reaction Mix was prepared in the same manner as in Example 3, and 6.0 μL of each PCR Reaction Mix was added to each well of a 384-well plate. Subsequently, 4.0 μL of each HapMap DNA solution instead of the pre-PCR reaction product diluent and DEPC-Treated Water as a negative control were added. For each sample, the reaction was performed in duplicate (2 wells each). A 384-well plate was sealed, spun down, set in a real-time PCR device (LightCycler 480 II; Roche Diagnostics Co., Ltd.), and real-time PCR was performed under the conditions shown in Table 9.
ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７のクラスタリングの結果を、それぞれ図３及び図４に示す。横軸はＨＥＸ（Allele X）の蛍光強度であり、縦軸はＦＡＭ（Allele Y）の蛍光強度である。どちらの図も、Allele X & Allele Yのヘテロ接合体、Allele Xのホモ接合体、Allele Yのホモ接合体、陰性対照が区別できなかった。一般的に、胚細胞由来の遺伝子多型検査では、末梢血から容易に高品質なゲノムＤＮＡを得られるため、プレＰＣＲを実施する必要はない。しかし、ＣＹＰ２Ａ６＊４及びＣＹＰ２Ａ６＊７の測定では、前処理としてプレＰＣＲを実施する必要があることが判明した。 The results of clustering CYP2A6*4 and CYP2A6*7 are shown in Figures 3 and 4, respectively. The horizontal axis is the fluorescence intensity of HEX (Allele X), and the vertical axis is the fluorescence intensity of FAM (Allele Y). Neither figure could distinguish between Allele X & Allele Y heterozygotes, Allele X homozygotes, Allele Y homozygotes, and negative controls. In general, embryonic cell-derived genetic polymorphism tests do not require pre-PCR because high-quality genomic DNA can be easily obtained from peripheral blood. However, it was found that the measurement of CYP2A6*4 and CYP2A6*7 required pre-PCR as a pretreatment.
《調製例：プライマー及びプローブの設計》
本発明方法で用いることのできるプライマー及びプローブを表１３、表１４に示す。
<<Preparation example: Design of primers and probes>>
Tables 13 and 14 show primers and probes that can be used in the method of the present invention.
本発明は、ＣＹＰ２Ａ６の遺伝子多型の判定に使用することができ、例えば、ニコチン代謝や、それが関与する疾患の診断、治療、予防などの用途に利用できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used to determine genetic polymorphisms of CYP2A6, and can be used, for example, for the diagnosis, treatment and prevention of nicotine metabolism and diseases associated with nicotine metabolism.
Claims (6)
ＣＹＰ２Ａ６＊４の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及びＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊４を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いるフォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを、前記工程（１）で用いるリバースプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６特異的な配列にハイブリダイズするプライマーを；
前記工程（２）で用いるフォワードプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを、前記工程（２）で用いるリバースプライマーとして、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より３’側である下流に位置するＣＹＰ２Ａ６及びＣＹＰ２Ａ７の共通配列にハイブリダイズするプライマーを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）として、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７にはないＣＹＰ２Ａ６特異的な遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを、第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、主増幅で増幅された領域の中の、ＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ａ７との非相同組換えが生じる部位より５’側である上流において、ＣＹＰ２Ａ７に特異的でありＣＹＰ２Ａ６にはない遺伝子配列にハイブリダイズするプローブを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
（１）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける領域を同時に増幅させ、かつＣＹＰ２Ａ７遺伝子を増幅しないプライマーセットにより予備的増幅を行う工程；
（２）（ａ）前記工程（１）で得られた増幅産物を希釈した鋳型ＤＮＡと、
（ｂ）ＣＹＰ２Ａ６＊１及び＊７を特徴づける配列を含む２００ｂｐ以下の領域を同時に増幅できるプライマーセットと、
（ｃ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊１を特徴づける配列を認識し、第１の蛍光色素で標識した第１のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと、
（ｄ）前記プライマーセット（ｂ）で増幅された領域において、ＣＹＰ２Ａ６＊７を特徴づける配列を認識し、前記第１蛍光色素と異なる第２の蛍光色素で標識した第２のＴａｑＭａｎプローブと
を用いて、ＴａｑＭａｎ法による増幅を行う工程；
（３）前記工程（２）の終了後に、及び／又は、前記工程（２）を実施しながら、第１蛍光色素に起因する蛍光強度と、第２蛍光色素に起因する蛍光強度とを測定する工程；
を含み、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセットとして、ＣＹＰ２Ａ６特異配列にハイブリダイズし、且つＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸を含む領域を増幅させることのできるプライマーセットを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）として、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がイソロイシンである配列を含む領域にハイブリダイズするプローブを、第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、ＣＹＰ２Ａ６の４７１位のアミノ酸がスレオニンである配列を含む領域（典型的には１０塩基から５０塩基からなる領域であり、好ましくは１０塩基から２０塩基からなる領域）にハイブリダイズするプローブを；
それぞれ、使用する、前記方法。 A method for determining at least one of CYP2A6*4 or CYP2A6*7, which is an allele of CYP2A6,
When judging CYP2A6*4,
(1) A step of pre-amplifying with a primer set that simultaneously amplifies regions that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*4 and that does not amplify the CYP2A7 gene;
(2) (a) template DNA obtained by diluting the amplification product obtained in step (1);
(b) a primer set capable of simultaneously amplifying a region of 200 bp or less containing sequences that characterize CYP2A6*1 and CYP2A6*4;
(c) a first TaqMan (registered trademark) probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*1 in the region amplified by the primer set (b) and is labeled with a first fluorescent dye;
(d) in the region amplified by the primer set (b), using a second TaqMan probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*4 and is labeled with a second fluorescent dye that is different from the first fluorescent dye; and performing amplification by the TaqMan method;
(3) After completing the step (2) and/or while performing the step (2), measuring the fluorescence intensity caused by the first fluorescent dye and the fluorescence intensity caused by the second fluorescent dye process;
including
As the forward primer used in the step (1), a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located upstream on the 5′ side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs is used in the step (1). ) as the reverse primer used in ), a primer that hybridizes to a CYP2A6-specific sequence located downstream on the 3′ side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs;
As the forward primer used in the step (2), a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located upstream on the 5' side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs is used in the step (2). ) as the reverse primer used in ), a primer that hybridizes to the common sequence of CYP2A6 and CYP2A7 located downstream on the 3′ side from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs;
As the first TaqMan probe (c) used in the step (2), in the region amplified by the main amplification, 5' upstream from the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs, to CYP2A7 A probe that hybridizes to a CYP2A6-specific gene sequence that does not have CYP2A6 is used as the second TaqMan probe (d), and in the region amplified by the main amplification, the 5′ side of the site where non-homologous recombination between CYP2A6 and CYP2A7 occurs a probe that hybridizes to a gene sequence that is specific for CYP2A7 and absent from CYP2A6, upstream of is;
respectively, using
When judging CYP2A6*7,
(1) A step of pre-amplifying with a primer set that simultaneously amplifies regions characterizing CYP2A6*1 and *7 and does not amplify the CYP2A7 gene;
(2) (a) template DNA obtained by diluting the amplification product obtained in step (1);
(b) a primer set capable of simultaneously amplifying a region of 200 bp or less containing sequences that characterize CYP2A6*1 and *7;
(c) a first TaqMan (registered trademark) probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*1 in the region amplified by the primer set (b) and is labeled with a first fluorescent dye;
(d) in the region amplified with the primer set (b), using a second TaqMan probe that recognizes a sequence that characterizes CYP2A6*7 and is labeled with a second fluorescent dye that is different from the first fluorescent dye; and performing amplification by the TaqMan method;
(3) After completing the step (2) and/or while performing the step (2), measuring the fluorescence intensity caused by the first fluorescent dye and the fluorescence intensity caused by the second fluorescent dye process;
including
As the primer set used in step (1), a primer set capable of hybridizing to a CYP2A6-specific sequence and amplifying a region containing amino acid 471 of CYP2A6;
As the primer set used in the step (2), a primer set capable of hybridizing to a CYP2A6-specific sequence and amplifying a region containing amino acid 471 of CYP2A6;
As the first TaqMan probe (c) used in the step (2), a probe that hybridizes to a region containing a sequence in which the amino acid at position 471 of CYP2A6 is isoleucine. a probe that hybridizes to a region containing a sequence in which the amino acid is threonine (typically a region consisting of 10 to 50 bases, preferably a region consisting of 10 to 20 bases);
The above methods, respectively, using.
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１４の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列における連続する２１塩基から２７塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１６の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号１７の塩基配列における連続する１２塩基から１８塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１２又は配列番号１８の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列における連続する１４塩基から２０塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号１９の塩基配列における連続する１８塩基から２４塩基からなる配列で表されるフォワードプライマーと、配列番号２０の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号２１の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブと、配列番号２２の塩基配列における連続する１６塩基から２２塩基からなる配列で表されるプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、請求項１に記載の方法。 When judging CYP2A6*4,
As the primer set used in the step (1), a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 12, and 14 to 20 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 13 A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of bases;
As the primer set (b) used in the step (2), a forward primer represented by a sequence consisting of 21 to 27 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 14, and 21 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 15 A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of bases to 27 bases;
As the first TaqMan probe (c) and the second TaqMan probe (d) used in the step (2), a probe represented by a sequence consisting of 12 to 18 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17 A combination with a probe represented by a sequence consisting of 12 to 18 consecutive bases in the base sequence of;
respectively, using
When judging CYP2A6*7,
As the primer set used in the step (1), a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 18, and a continuous sequence in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of 14 to 20 bases;
As the primer set (b) used in the step (2), a forward primer represented by a sequence consisting of 18 to 24 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 19, and 16 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 20 A combination with a reverse primer represented by a sequence consisting of bases to 22 bases;
As the first TaqMan probe (c) and the second TaqMan probe (d) used in the step (2), a probe represented by a sequence consisting of 16 to 22 consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 21, and SEQ ID NO: 22 A combination with a probe represented by a sequence consisting of 16 to 22 consecutive bases in the base sequence of;
2. The method of claim 1, using respectively.
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号５の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号６の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用し、
ＣＹＰ２Ａ６＊７の判定を行う場合には、
前記工程（１）で用いる前記プライマーセットとして、配列番号１又は配列番号７の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記プライマーセット（ｂ）として、配列番号８の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列からなるリバースプライマーとの組合せを；
前記工程（２）で用いる前記第１ＴａｑＭａｎプローブ（ｃ）及び第２ＴａｑＭａｎプローブ（ｄ）として、配列番号１０の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブと、配列番号１１の塩基配列からなるＴａｑＭａｎプローブとの組合せを；
それぞれ、使用する、請求項１又は２に記載の方法。 When judging CYP2A6*4,
As the primer set used in the step (1), a combination of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
As the primer set (b) used in the step (2), a combination of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
As the first TaqMan probe (c) and the second TaqMan probe (d) used in the step (2), a combination of a TaqMan probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a TaqMan probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6;
respectively, using
When judging CYP2A6*7,
As the primer set used in the step (1), a combination of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
As the primer set (b) used in the step (2), a combination of a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9;
As the first TaqMan probe (c) and the second TaqMan probe (d) used in the step (2), a combination of a TaqMan probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 10 and a TaqMan probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 11;
3. A method according to claim 1 or 2, respectively, for use.
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