JP2023011941A - 三量体安定化ｈｉｖエンベロープタンパク質変異 - Google Patents

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Abstract

【課題】エンベロープタンパク質の三量体形態を安定化する変異を有するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質を提供する。【解決手段】以下のアミノ酸残基：（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；（ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；及び／又は（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅの２つ以上を含み、位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う、組換えＨＩＶエンベロープタンパク質を提供する。【選択図】なし

Description

世界中で数百万人もの人々がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に襲われており、抗レト
ロウイルス治療が広く行き渡った時代でさえも、有効なワクチンによるＨＩＶの予防は非
常に高い優先度であり続けている。ＨＩＶウイルスの様々な株およびクレード間の抗原多
様性が広範な有効性を有するワクチンの開発を困難にしている。ＨＩＶ－１は当該ウイル
スの中で最も一般的であり、かつ最も病原性のある株であり、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの９０％
を超える症例はＨＩＶ－１のグループＭの感染に由来している。グループＭはさらに、ク
レードまたはサブタイプに細分され、クレードＣが最も広範である。有効なワクチンは、
理論上、強力な細胞応答、および様々なクレード由来のＨＩＶ－１株を中和できる広域中
和抗体の両方を誘発できるであろう。
ＨＩＶ表面のエンベロープタンパク質スパイク（Ｅｎｖ）は、糖タンパク質ｇｐ１２０
およびｇｐ４１のヘテロ二量体の三量体で構成される（図１Ａ）。前駆体タンパク質ｇｐ
１６０がフューリンにより切断されてｇｐ１２０とｇｐ４１になり、ｇｐ１２０はスパイ
クの頭部であり、かつＣＤ４受容体結合部位および大きな超可変ループ（Ｖ１～Ｖ５）を
含有し、ｇｐ４１はエンベロープタンパク質スパイクの膜アンカー型ステムである。他の
クラスＩ膜融合タンパク質と同様に、ｇｐ４１は、Ｎ末端融合ペプチド（ＦＰ）、Ｃ末端
膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および細胞質ドメインを含有する。ＨＩＶと標的細胞膜との間
の膜融合には、エンベロープタンパク質の一連の高次構造的な変化が必要になる。ＨＩＶ
ワクチンは、エンベロープタンパク質に基づいて開発することができる。
しかし、ＨＩＶ－１の高い遺伝的変異性、エンベロープタンパク質の高密度の炭水化物
コート、およびエンベロープタンパク質スパイク構造の比較的動的かつ不安定な性質を含
む様々な要因が、エンベロープタンパク質に基づくＨＩＶワクチンの開発を困難なものに
している。野生型のエンベロープタンパク質は、その機能のために不安定である。したが
って、ワクチン候補を生成するために安定化する修飾をエンベロープ構造に導入する場合
もある。エンベロープタンパク質は中和抗体の標的であり、高度にグリコシル化されてお
り、タンパク質エピトープを遮蔽することによって免疫原性を弱めている。全ての既知の
広域中和抗体（ｂＮＡｂ）は、これらのグリカンに適応する。
ワクチン開発のためには、ｂＮＡｂを誘導することができるエンベロープタンパク質を
使用することが好ましい。しかし、大部分のｂＮＡｂは単に、それが任意の高次構造変化
を起こす前の天然のエンベロープタンパク質の高次構造を認識するにすぎない。したがっ
て、天然様のコンパクトでありかつ閉じた高次構造でありながら、非天然であり、かつし
たがって非中和性のエピトープの提示を最小化する安定したエンベロープタンパク質の開
発が、このようなｂＮＡｂを生成する効率を向上させる可能性がある。ＨＩＶワクチンを
作製するための先の取り組みは、三量体ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１４０の融合
前外部ドメインを含有するワクチンの開発に集中していた。ｇｐ１４０は膜貫通（ＴＭ）
および細胞質ドメインを有しないが、ｇｐ１２０とは異なり三量体構造を形成することが
できる。さらに、これらの先の取り組みは主に、クレードＡに集中していた。しかし、誘
導された中和抗体応答の幅は依然として限定的なものである。したがって、複数のＨＩＶ
クレードに対する安定化された天然のエンベロープ三量体が利用可能であることも有益で
あろう。
２０年以上の間、安定なエンベロープタンパク質をその融合前の三量体高次構造におい
て開発する試みは、広域中和抗体の応答を誘導することができるエンベロープタンパク質
の可溶性で安定な三量体の生成においては、限定的な達成のみを伴ってなされてきた。例
えば、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（５０１Ｃ、６０５Ｃおよび５５９Ｐ）がエンベロープタ
ンパク質配列に導入されて、可溶性ｇｐ１４０三量体画分の形成を向上させている（Ｓａ
ｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１７）：８８７５－
８９）。いわゆるＳＯＳＩＰ変異としては、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０にお
いて、当技術分野で使用される従来のナンバリングスキームであるナンバリングに従う５
０１位および６０５位のシステイン残基、ならびに５５９位のプロリン残基が挙げられる
。三次元タンパク質構造において互いに近接する５０１位および６０５位での２個のシス
テイン残基の導入は、ジスルフィド架橋をもたらす。ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰおよびＢ４
１＿ＳＯＳＩＰ（ＳＯＳＩＰ変異を有するＨＩＶ株ＢＧ５０５およびＢ４１（すなわち、
９０３２－０８．Ａ１．４６８５）株由来のエンベロープタンパク質）などのＳＯＳＩＰ
変異体エンベロープタンパク質がワクチン研究に使用されてきており、段階２の自己中和
Ａｂｓを誘導することが示されている（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
（２０１５），３４９（６２２４）：１３９－１４０）。
しかしながら、いわゆるＳＯＳＩＰ変異はエンベロープタンパク質の三量体形態を安定
化することができるものの、このようなＳＯＳＩＰ変異体の三量体画分は通常１０％未満
であり、大量の単量体および凝集体が依然として生成される。三量体形態を安定化する能
力の観点で今日まで知られる最も有望なＳＯＳＩＰ変異体エンベロープタンパク質の１つ
であるＳＯＳＩＰ変異体ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰでさえ、通常最大で２５％の三量体形態
をもたらすにすぎない（Ｊｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（２０１５），１１２（３８），１１９４７－５２）。さらに、この三量体画分で
は、三量体はそれらが尖部で開閉するため完全に安定ではない。したがって、ＳＯＳＩＰ
変異に加えて、Ｅ６４Ｋ、Ａ３１６Ｗ、および２０１Ｃ－４３３Ｃなどのいくつかの追加
の置換が、尖部を安定化し、かつ開閉を妨げるように設計されている（ｄｅ Ｔａｅｙｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５），１６３（７），１７０２－１５；Ｋｗｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（７）５２２
－３１）。
したがって、三量体形成の割合が向上し、三量体の収量が向上し、かつ／または三量体
の安定性が向上した、ＨＩＶエンベロープタンパク質の安定化された三量体が必要とされ
ている。好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質のこのような安定化された三量体は
また、広域中和抗体（ｂＮＡｂ）との良好な結合、および非広域中和抗体（非ｂＮＡｂ）
との相対的に限定的な結合を示すであろう。本発明の目的は、三量体の割合が向上し、か
つ好ましくは三量体の収量も向上したＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を提供することである。
本発明は、以前に記述されたＨＩＶエンベロープ三量体と比較して、三量体形成の割合
が向上し、かつ／または三量体の収量が向上した様々なクレード由来の組換え体ＨＩＶエ
ンベロープタンパク質に関する。Ｅｎｖのフォールディングは最適化され、株特異的な特
性は矯正され、かつ融合プロセスのために重要な融合前の閉じた高次構造の領域は本明細
書に記載の変異によって安定化される。これは、融合前の閉じたＨＩＶ－１エンベロープ
三量体のフォールディングおよび安定性を最適化する普遍的なアプローチを提供する。結
果として得られる安定でありかつ良好にフォールディングされたＨＩＶ Ｅｎｖ三量体は
、例えば、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖ三量体の投与に際して、広域中和抗体を誘導し、かつ
非中和抗体および弱い中和抗体の誘導を低減する確率を向上させるため、免疫化の目的に
とって有用である。本発明はまた、組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする
単離核酸分子およびベクター、これらを含む細胞、ならびに組換え体ＨＩＶエンベロープ
タンパク質、核酸分子、ベクターおよび／または細胞の組成物に関する。
１つの一般的態様では、本発明は、三量体の形成を安定化するエンベロープタンパク質
配列において同定された位置で特定のアミノ酸残基を有する、組換え体ヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質に関する。
ある種の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質は
、
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも２つで指定アミノ酸残基を有するＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列を含み、
位置のナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに
従う。ある種の好ましい実施形態では、６５１位の指定アミノ酸残基がＰｈｅであり；６
５５位の指定アミノ酸残基がＩｌｅであり；５３５位の指定アミノ酸残基がＡｓｎであり
；かつ／または５７３位の指定アミノ酸残基がＰｈｅである。
ある種の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質のアミノ酸配列、ならびに
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つで指定アミノ酸残基によるアミノ酸
置換を含み、
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、
（１）例えば、クレードＣ（例えば、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列を含む）由来
、またはクレードＢ（例えば、
配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を含む）由来のＨＩＶ Ｅｎｖコンセンサスアミノ
酸配列；
（２）例えば、（ａ）：配列番号６のアミノ酸配列、または（ｂ）：１６６位でＧｌｕか
らＡｒｇへの変異を有する配列番号６、または（ｃ）：５０１位および６０５位でＣｙｓ
残基へのアミノ酸の変異を有し、かつ５５９位でＰｒｏ残基へのアミノ酸の変異を有する
（ａ）もしくは（ｂ）、または（ｄ）：さらなるフューリン切断部位変異、例えば、５０
８～５１１位でのＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）によるアミノ酸の置換を有する（ａ）、
（ｂ）もしくは（ｃ）、または（ｅ）配列番号７、または（ｆ）配列番号８もしくは９の
アミノ酸配列を含むＥｎｖなどのモザイクＥｎｖ配列を含む合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク
質；ならびに
（３）少なくとも１００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００
００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％
未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置において見出されるアミノ酸残基で少な
くとも１つの矯正変異を含む、好ましくはクレードＣの、好ましくは野生型ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質である親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であって、矯正変異が、前記コレクショ
ン中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に見出されるア
ミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変異が、前記コレクション中において対
応する位置で最も高頻度に見出されるアミノ酸残基による置換である、親ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質；からなる群から選択され、
位置のナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに
従う。ある種の好ましい実施形態では、６５１位の指定アミノ酸残基がＰｈｅであり；６
５５位の指定アミノ酸残基がＩｌｅであり；５３５位の指定アミノ酸残基がＡｓｎであり
；かつ／または５７３位の指定アミノ酸残基がＰｈｅである。
ある種の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質のアミノ酸配列、ならびに
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つで指定アミノ酸残基によるアミノ酸
置換を含み、
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、
（ａ）５０１位と６０５位におけるＣｙｓ；
（ｂ）５５９位におけるＰｒｏ；ならびに
（ｃ）５０１位と６０５位におけるＣｙｓおよび５５９位のＰｒｏ
からなる群から選択される指定位置で指定アミノ酸残基をもたらす少なくとも１つの変異
を含む、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、
位置のナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに
従う。ある種の好ましい実施形態では、６５１位の指定アミノ酸残基がＰｈｅであり；６
５５位の指定アミノ酸残基がＩｌｅであり；５３５位の指定アミノ酸残基がＡｓｎであり
；かつ５７３位の指定アミノ酸残基がＰｈｅである。
他の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はさらに、
（ｖｉｉｉ）５８８位におけるＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐもしく
はＰｈｅ、好ましくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；
（ｉｘ）６４位におけるＬｙｓ、もしくは６６位におけるＡｒｇ、もしくは６４位におけ
るＬｙｓおよび６６位におけるＡｒｇ；
（ｘ）３１６位におけるＴｒｐ；
（ｘｉ）２０１位および４３３位の両方におけるＣｙｓ；
（ｘｉｉ）５５６位におけるＰｒｏ、もしくは５５８位におけるＰｒｏ、もしくは５５６
位および５５８位におけるＰｒｏ；
（ｘｉｉｉ）５４８～５６８アミノ酸位におけるループ（ＨＲ１ループ）の７～１０アミ
ノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば、（配列番号１２～１７）
のいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｉｖ）５６８位におけるＧｌｙ、もしくは５６９位におけるＧｌｙ、もしくは６３６
位におけるＧｌｙ、もしくは５６８位および６３６位の両方におけるＧｌｙ、もしくは５
６９位および６３６位の両方におけるＧｌｙ；ならびに／または
（ｘｖ）３０２位におけるＴｙｒ、もしくは５１９位におけるＡｒｇ、もしくは５２０位
におけるＡｒｇ、もしくは３０２位におけるＴｙｒおよび５１９位におけるＡｒｇ、もし
くは３０２位におけるＴｙｒおよび５２０位におけるＡｒｇ、もしくは３０２位における
Ｔｙｒおよび５１９位と５２０位の両方におけるＡｒｇ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つで指定アミノ酸残基を含む。
ある種の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はさらに、５０８
～５１１位のＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換などの、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク
質のフューリン切断配列における変異を含む。
一実施形態では、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１４０タンパク質である
。
別の実施形態では、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１６０タンパク質であ
る。
ある種の実施形態では、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、細胞質領域、例えば、
細胞質領域の７アミノ酸後においてトランケートされる。
別の一般的態様では、本発明は、本明細書に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
のいずれかのうち３つの非共有結合性のオリゴマーを含む三量体複合体に関する。
本発明の別の一般的態様は、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフォールディングおよび安
定性（三量体の割合および／または三量体の収量の増加として測定される）を向上させる
方法であって、この方法は、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質において少なくとも１つの矯正
変異、好ましくは少なくとも３つの矯正変異を導入することによって、親ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質のアミノ酸配列を矯正することを含み、矯正変異が、少なくとも１００、好ま
しくは少なくとも５００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００
００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％
未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基でのアミノ酸置
換であり、置換が、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の
頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基によるものであり、好ましくは、置換が、前
記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基によるもの
である、方法を提供することである。本発明はまた、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフォー
ルディングおよび安定性（三量体の割合および／または三量体の収量として測定される）
を向上させるための本発明の前記方法によって得ることができる矯正されたＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質を提供する。本発明はまた、前記矯正されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を含
む医薬組成物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を
矯正し、矯正された安定化ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を組換え体宿主細
胞において発現させるための方法を含む、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を生成するための方
法を提供する。
別の一般的態様では、本発明は、配列番号２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク
質に関し、％同一性を決定する際に、好ましくは、２０４位、５３５位、５７３位、５８
９位、６４７位、６５１位および６５５位、ならびに、好ましくはさらに、６４位、６６
位、２０１位、３１６位、４３３位、５０１位、５０８～５１１位、５５６位、５５８位
、５５９位、５８８位、５４８～５６８位および６０５位が考慮されず、また、ナンバリ
ングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。それにつ
いてのある種の実施形態では、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、配列番号３と少な
くとも９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、％同一性を決定する際
に、好ましくは、２０４位、５３５位、５７３位、５８９位、６４７位、６５１位および
６５５位、ならびに、好ましくはさらに、６４位、６６位、２０１位、３１６位、４３３
位、５０８～５１１位、５５６位、５５８位、５８８位および５４８～５６８位が考慮さ
れず、また、ナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリ
ングに従う。
別の一般的態様では、本発明は、配列番号４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
に関し、％同一性を決定する際に、好ましくは、２０４位、５３５位、５７３位、５８９
位、６４７位、６５１位および６５５位、ならびに、好ましくはさらに、６４位、６６位
、２０１位、３１６位、４３３位、５０１位、５０８～５１１位、５５６位、５５８位、
５５９位、５８８位、５４８～５６８位および６０５位が考慮されず、また、ナンバリン
グは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。それについ
てのある種の実施形態では、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、配列番号５と少なく
とも９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、％同一性を決定する際に
、好ましくは、２０４位、５３５位、５７３位、５８９位、６４７位、６５１位および６
５５位、ならびに、好ましくはさらに、６４位、６６位、２０１位、３１６位、４３３位
、５０８～５１１位、５５６位、５５８位、５８８位および５４８～５６８位が考慮され
ず、また、ナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリン
グに従う。
これらの態様および実施形態では、％同一性の決定のために考慮されない指定位置のアミ
ノ酸の１つ以上は、例えば、２０４位におけるＩｌｅ；６５１位におけるＰｈｅ、Ａｌａ
、ＬｅｕまたはＴｒｐなど（下の表１および２を参照のこと）の本明細書で好ましいもの
として指定されるアミノ酸から選択されることが好ましい。
別の一般的態様では、本発明は、配列番号２、３、４、５、２０、２２、２４、２６、
２７、２８、２９、３０、３１または３２のいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む組換え体ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質に関し、配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１
または３２が特に好ましい。この態様では、％同一性を決定する際に、好ましくは、２０
４位、５３５位、５７３位、５８９位、６４７位、６５１位、６５５位および６５８位、
ならびに、好ましくはさらに、６４位、６６位、２０１位、３１６位、４３３位、５０８
～５１１位、５５６位、５５８位、５８８位および５４８～５６８位が考慮されず、また
、ナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う
。この態様でもまた、％同一性を決定するために考慮されない指定位置のアミノ酸の１つ
以上は、表１の（ｉ）～（ｖｉｉ）、表２の（ｖｉｉｉ）～（ｘｖ）、および／または表
１の（ｘｖｉ）において本明細書で好ましいものとして指定されるアミノ酸、例えば、２
０４位におけるＩｌｅ；６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔまたはＴｒｐなどから
選択されることが好ましい。
別の一般的態様では、本発明は、表面に本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を
ディスプレイする粒子、好ましくはリポソームまたはナノ粒子、例えば、自己組織化ナノ
粒子に関する。
別の一般的態様では、本発明は、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコード
する単離核酸分子、およびプロモーターに作動可能に連結された単離核酸分子を含むベク
ターに関する。一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。別の実施形態では
、ベクターは発現ベクターである。好ましい一実施形態では、ウイルスベクターはアデノ
ウイルスベクターである。
別の一般的態様は、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする単離核酸
分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。このような宿主細胞は、組換え体タンパク
質の生成、組換え体タンパク質の発現、またはウイルス粒子の生成のために使用すること
ができる。
別の一般的態様は、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする単離核酸
またはベクターを含む宿主細胞を、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の生成に好適な条
件下で増殖させることを含む、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を生成する方法に関す
る。
さらに別の一般的態様は、本明細書に記載のような組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
、三量体複合体、単離核酸分子、ベクター、または宿主細胞、および薬学的に許容される
担体を含む組成物に関する。
上述の概要および下記の本発明の詳細な説明は、添付した図面と共に読む場合により良
く理解されるであろう。本発明は図面に示される明確な実施形態に限定されないことを理
解すべきである。
図１Ａと図１Ｂは、ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質の構造の模式図を示す。図１Ａは、全長ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を示す。図１Ｂは、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、およびＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２（ＳＯＳＩＰ．６４４配列）のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う６６４番目の残基で始まるＣ末端トランケーションを含有する可溶性ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を示す。 図２：実施例３に記載されるようなＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより測定した際の本発明の実施形態に従う組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に関する三量体形成の割合（図２Ａ）および三量体の収量（図２Ｂ）を示し；試験された組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、バックボーンＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＣ配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）に導入された１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含有した；三量体の割合および三量体の収量を、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の各々に対する三量体に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＰＧＴ１４５の結合に基づいて決定した；本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の各々についての三量体の収量および三量体形成の割合を、本明細書に記載のいずれの追加の三量体安定化変異も有しないバックボーンＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質のものと比較する。 （上記の通り。） 図３：本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の多角度光散乱を伴うサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）分析のクロマトグラムを示す；試験された組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、バックボーンＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＣ配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）に導入された１つのアミノ酸置換を含有し、実施例２に記載のとおりレクチン親和性クロマトグラフィーによって精製された；ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、実施例３に記載のとおりに実施された；三量体形態に対応するピークが、クロマトグラムの各々において示される。 （上記の通り。） （上記の通り。） 加熱処理後に残存している三量体の割合として報告される本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の熱安定性を示す；試験された組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、バックボーンＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＣ配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）に導入された１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含有した；組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、熱処理にかけられ、熱処理後に残存している三量体の割合は、実施例４に記載のとおりＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって決定された。いずれの追加の三量体安定化変異も有しないバックボーンＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質の熱安定性もまた示される。 図５Ａと図５Ｂは、本発明の実施形態によるバックボーンＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＢ配列ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号５）に導入された１つのアミノ酸置換を有する組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に関して、実施例５に記載のとおりに本発明のいずれの追加の三量体安定化変異も有しないバックボーンＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質のものと比較した、三量体形成の割合（図５Ａ）および三量体の収量（図５Ｂ）を示す；三量体の収量および三量体形成の割合はＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された。 図６：実施例６に記載のとおり本発明の実施形態によるバックボーン合成ＨＩＶエンベロープタンパク質配列ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒに導入されたアミノ酸置換を有する組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に関する三量体形成の割合および三量体の収量を示す；三量体形成の割合および三量体の収量はＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された。 （上記の通り。） 本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の多角度光散乱を伴うサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）分析のクロマトグラムを示す；試験された組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、１つのＫ６５５Ｉ変異と次に続く変異体の各々においてバックボーンＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＣ配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）に導入された追加の変異を含有し、実施例２に記載のとおりレクチン親和性クロマトグラフィーによって精製された；ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、実施例３に記載のとおりに実施された；ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰにおけるｇｐ１４０単量体を表すピークは、三量体ピークの右側の網掛けの枠によって示される。下段のパネルは、各追加の変異がｇｐ１４０の単量体ピークの高さにおいてさらなる下降をもたらすことを認めることができるように、グラフの下方部分を拡大して示す。 図８：本発明の実施形態に従って導入された１つのアミノ酸置換および置換の組み合わせを有するＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ（野生型クレードＡ株に由来する）に関して、実施例９に記載のとおり本発明のいずれの追加の三量体安定化変異も有しないバックボーンＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ配列を有するエンベロープタンパク質のものと比較した、三量体形成の割合（図８Ａ）および三量体の収量（図８Ｂ）を示す。三量体の収量および三量体形成の割合は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された。 （上記の通り。） 本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の多角度光散乱を伴うサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）分析のクロマトグラムを示す；ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、Ｅｎｖをトランスフェクトされた細胞の培養液上清で実施された。三量体形態に対応するピークは、７～７．５分の間に溶出する。暗灰色の線はＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ（野生型クレードＡ株に由来する）であり、明灰色の線は、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ５８８Ｅ置換を有するＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰである。 図１０：実施例１０に記載されるＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ変異体に関する三量体の収量を示す。３つの安定化置換（Ｌ５５６Ｐ、Ｔ６５１ＦおよびＭ５３５Ｎ）を有するＣ９７ＺＡの三量体の収量（図１０ＡおよびＢ）。図１０Ｂにおいて、Ｅｎｖ配列は、図１２で記載される概念的なフレームワークに従ってＣ９７ＺＡ Ｅｎｖ配列を矯正するために追加された追加の変異（２１個の追加の変異）、および追加の安定化置換（Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４ＩおよびＫ５８８Ｅ）の導入によってさらに最適化された。三量体の収量および三量体形成の割合は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された。シグナルは、１に設定されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰのシグナルに正規化された。ＰＮＧＳは、潜在的なＮ－グリコシル化部位である。 （上記の通り。） ４つの安定化置換を有するＨＩＶ－１ Ｅｎｖ株ＤＵ４２２の三量体の収量（詳細については実施例１１を参照のこと）。全ての数値は、１に設定されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（示さず）に正規化された。 株Ｃ９７ＺＡについて示されるＨＩＶ－１ Ｅｎｖ配列を矯正するための全般的な概念。全ＨＩＶ－１データベースにおける出現の頻度が最も高い残基（本明細書において「コンセンサス残基」と称する）（上部の棒）およびＣ９７ＺＡ残基位置の出現割合の低い方から高い方にソートされた株Ｃ９７ＺＡ残基（下段の棒）。コンセンサス残基に置換されるＣ９７ＺＡ配列位置は、次の条件に基づいて選択される：Ｅｎｖデータベース配列において２％未満で出現するＣ９７ＺＡ残基を有する位置（黒色の棒）。Ｅｎｖデータベース配列において２％～７．５％の間で出現し、埋まっているかまたは部分的に埋まっているＣ９７ＺＡ残基を有する位置（暗灰色の棒）。Ｃ９７ＺＡおよび疎水性コンセンサス残基において露出し、かつ疎水性である位置（２つの最も明るい灰色の棒）、ならびに潜在的なＮ－グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）コンセンサス残基（Ｓ２３４Ｎ）である位置。 配列矯正および変異性の安定化を介した融合前の閉じたＨＩＶ ＥＮＶ＿ＳＯＳＩＰ三量体。広域中和抗体用のＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰに正規化された、全てのＳＯＳＩＰ変異体についての細胞培養上清におけるＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナル。 対照Ｅｎｖ＿ＳＯＳＩＰ変異体（バックボーンＳＯＳＩＰ）、実施例１２および図１２に記載の概念に従う矯正されたＥｎｖ変異体、ならびにトランスフェクション後の細胞培養上清を用いて表３に従う追加の安定化置換を有するＥｎｖ変異体の分析的ＳＥＣプロファイル。細胞培養上清の偽シグナルが全てのプロファイルから差し引かれた。三量体ピークは＊で示される。 安定化ＳＯＳＩＰ改変を有しないＨＩＶ－１ Ｅｎｖ ＣｏｎＣ変異体の三量体の収量。 図１６：５８９位、６４７位、６５１位および６５５位でメチオニンへの変異を有するＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの三量体の収量（Ａ）および三量体の割合（Ｂ）。全ての数値は、１に設定されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（示さず）に正規化された。エラーバーは、棒の右端で示される。 （上記の通り。） 図１７：ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定された、実施例１５に記載のとおりの指定変異を有する組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に関する三量体形成の割合（異なる実験に関する図１７Ａ、Ｂ）および三量体の収量（異なる実験に関する図１７Ｃ、Ｄ）を示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 実施例１５に記載のとおりの指定変異を有する組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のＳＥＣ－ＭＡＬＳクロマトグラムを示す。
背景技術において、また本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文および特許が引用
され、または記載されており、これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照により本明
細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、物品などの議論
は、本発明に関する文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容
のいずれかまたは全てが、開示されているまたは特許請求されているあらゆる発明に関す
る先行技術の一部を形成することを承認するものではない。
別途定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本
発明が関係する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。そうでなけ
れば、本明細書で使用する、ある特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する
。本明細書に引用されている全ての特許、公開されている特許出願および公報は、本明細
書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。本明細書で使用する場合
、および添付した特許請求の範囲においては、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」
は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければなら
ない。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度または濃度範囲などの任意の数値は、
全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。した
がって、数値は、通常、列挙された値の±１０％を含む。本明細書で使用する場合、数値
範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み
、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数および値の分数を含む
。
アミノ酸は本開示の全体にわたって参照される。２０個の天然に存在するアミノ酸、お
よび多くの天然に存在しないアミノ酸がある。天然および非天然アミノ酸の両方を含む既
知のアミノ酸の各々は、フルネーム、省略された１文字のコード、および省略された３文
字のコードを有し、その全てが当業者によく知られている。例えば、２０個の天然に存在
するアミノ酸に用いられる３文字および１文字の省略されたコードを次に示す：アラニン
（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アスパラ
ギン（Ａｓｎ；Ｎ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシ
ン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅ
ｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ
；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ
；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。アミノ酸は、それらのフルネーム、１文字の省略
されたコード、または３文字の省略されたコードによって参照され得る。
別途文脈が明白に規定していない限り、本明細書で使用される際のＨＩＶエンベロープ
タンパク質のアミノ酸配列における位置のナンバリングは、例えば、全体が参照により本
明細書に組み込まれるＫｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ １９９８：Ａ Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｓ．Ｋｏｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘ．）に記述されてい
るように、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。ＨＸＢ
２に従うナンバリングは、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の分野において慣例的なものである
。ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有す
る。この配列を有する目的のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のアラインメントを使用して、目的の配
列における対応するアミノ酸のナンバリングを見出すことができる。
語句「からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つで指定アミノ酸残基を有す
るＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列を含む」および「次（アミノ酸残基）のうち
１つ以上を含む」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
用語「配列同一性のパーセント（％）」または「％同一性」は、アミノ酸配列の全長を
構成するアミノ酸残基の数と比較して、２つ以上の整列させたアミノ酸配列の同一のアミ
ノ酸の一致する（「ヒットする」）数を指す。言い換えると、配列が当技術分野において
既知である配列比較アルゴリズムを使用して測定される際に最大限の一致に対して比較さ
れ整列させる場合、または手動で整列させ視覚的に検証される場合、アラインメントを使
用して、２つ以上の配列について、同一のものである（例えば、９５％、９７％または９
８％の同一性）アミノ酸残基の百分率が決定されてもよい。したがって、配列同一性を決
定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加または欠失によって異なってもよ
い。タンパク質配列を整列させるための好適なプログラムは、当業者に知られている。タ
ンパク質配列のパーセント配列同一性は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｏｍｅｇａ、ＦＡＳＴＡ、または例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する
ＢＬＡＳＴなどのプログラムにより決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅ
ｔ ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０
２）。
本明細書で使用する場合、「ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション」は、同じクレード（
例えば、クレードＣ）または異なるクレード（例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃなど）に由来
し得る、野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のランダム配列の典型的な数（例えば、少なく
とも１００、または５００、または１０００、またはそれ以上）のコレクションである。
このような配列の好適なコレクションは、データベースにおいて入手可能であり、下位の
コレクションはそこから、例えば、ＨＩＶ配列データベース（Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から抽出することができる。このようなコレク
ションは、好ましくは、少なくとも１００個のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質配列、１０００
個のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質配列、少なくとも１００００個のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク
質配列、少なくとも５００００個のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質配列を含み、また、９００
００個を超えるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質配列を含有してもよい。
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質における「対応する位置」は、少なくとも２つのＨＩＶ Ｅ
ｎｖ配列が整列しているときのアミノ酸残基の位置を指す。別段の指定がない限り、これ
らの目的のためにナンバリングするアミノ酸位置は、当技術分野で慣例のように、ＨＩＶ
－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。
本明細書で使用する場合、「安定化変異」は、表１の項目（ｉ）～（ｖｉｉ）もしくは
（ｘｖｉ）、または表２の（ｖｉｉｉ）～（ｘｖ）のいずれかにおいて本明細書で記載の
とおりの変異であり、これは、親分子と比較して、その変異が前記親分子における対応す
るアミノ酸の置換によって導入されるときに、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体の割合
および／または三量体の収量（これは、例えば、本明細書に記載のＡｌｐｈａＬＩＳＡも
しくはＳＥＣ－ＭＡＬＳアッセイによって測定することができる）を増加させる。このよ
うな安定化変異に起因するアミノ酸は通常、野生型ＨＩＶ単離株のＥｎｖタンパク質にお
いて、たとえあったとしてもまれにしか見出されない。
本明細書で使用する場合、「矯正変異」は、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質におけるアミ
ノ酸残基の置換であり、このアミノ酸残基は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質配列のコレクシ
ョンにおける対応する位置で、７．５％未満、好ましくは２％未満存在し、置換は、前記
コレクションにおける対応する位置でより高頻度に、例えば、前記コレクションにおける
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の少なくとも１０％において存在するアミノ酸によるものであ
り、好ましくは、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の少なくとも２０％において前記コレクショ
ンにおける対応する位置で存在するアミノ酸によるものであるか、または前記コレクショ
ンにおける対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸によるものである。したがって
、このような矯正変異に起因するアミノ酸は通常、比較的高い割合の野生型ＨＩＶ単離株
のＥｎｖタンパク質において見出され、また、いくつかの場合では、コンセンサスＨＩＶ
Ｅｎｖ配列における対応する位置のものと同じであり得る。
本明細書で使用する場合、「矯正および安定化された」ＨＩＶ Ｅｎｖ配列は通常、少
なくとも１つの矯正変異および少なくとも１つの安定化変異を含有し、好ましくは、親Ｈ
ＩＶ Ｅｎｖ配列と比較して、複数の矯正変異および複数の安定化変異を含有する。
ＨＩＶ株（またはそれに由来するＥｎｖタンパク質）を意味する場合、用語「天然」ま
たは「野生型」は、本明細書では同じ意味で用いられ、天然において、例えば、ＨＩＶ感
染患者において存在するようなＨＩＶ株（またはそれに由来するＥｎｖタンパク質）を指
す。
本発明は一般に、エンベロープタンパク質の三量体形態を安定化するエンベロープタン
パク質配列における指定位置で、ある種のアミノ酸置換を含む組換え体ＨＩＶエンベロー
プ（Ｅｎｖ）タンパク質に関する。同定された本発明のアミノ酸置換の１つ以上をＨＩＶ
エンベロープタンパク質の配列に導入することにより、三量体形成の割合の増加および／
または三量体の収量の増加をもたらすことができる。これは、例えば、三量体に特異的な
抗体、融解温度、サイズ排除クロマトグラフィー、および適切にフォールディングされた
（安定三量体）あるいは不適切にフォールディングされた（不安定または非三量体）Ｅｎ
ｖタンパク質に結合する抗体への結合を用いて測定することができ、三量体の割合および
／または三量体の収量の増加は、安定な、天然の、適切にフォールディングされたＥｎｖ
タンパク質を示すと考えられる。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）
のファミリーの一部であるレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）属のメンバーで
ある。２種のＨＩＶがヒトに感染し、それは、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２である。ＨＩ
Ｖ－１は、ＨＩＶウイルスの最も一般的な株であり、ＨＩＶ－２と比べて病原性が高いこ
とが知られている。本明細書で使用する場合、用語「ヒト免疫不全ウイルス」および「Ｈ
ＩＶ」は、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２を指すが、これらに限定されない。好ましい実施
形態では、ＨＩＶはＨＩＶ－１を指す。
ＨＩＶは、高度な遺伝的分岐を有する複数のクレードに分類される。本明細書で使用す
る場合、用語「ＨＩＶクレード」または「ＨＩＶサブタイプ」は、それらの遺伝的類似性
の度合に従って分類された関連するヒト免疫不全ウイルスを指す。ＨＩＶ－１単離株の最
も大きな群は、グループＭ（主系統）と呼ばれており、少なくとも１０種のクレードＡ～
Ｊからなる。
１つの一般的態様では、本発明は、組換え体ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質
に関する。用語「組換え体」は、タンパク質に関して使用される場合、組換え体技術また
はインビトロでの化学合成によって生成されるタンパク質を指す。本発明の実施形態によ
れば、「組換え体」タンパク質は、それが、対応する天然に存在する配列に見出されない
少なくとも１つの配列要素（例えば、アミノ酸置換、欠失、付加、配列の置換など）を含
有するという点において人工的なアミノ酸配列を有する。好ましくは、「組換え体」タン
パク質は、１つ以上の天然に存在するＨＩＶ株に対して免疫応答を誘導するか、または免
疫を生じさせるように最適化された天然に存在しないＨＩＶエンベロープタンパク質であ
る。
用語「ＨＩＶエンベロープタンパク質」、「ＨＩＶ Ｅｎｖ」および「ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質」は、ＨＩＶビリオンのエンベロープ上で自然に発現され、かつＨＩＶにＨＩ
Ｖ感染細胞の原形質膜を標的化しかつ付着することを可能にする、タンパク質またはその
断片もしくは派生体を指す。用語「エンベロープ」および「Ｅｎｖ」は、本開示を通して
同じ意味で用いられる。ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子は、タンパク質分解的に切断されて２つの
成熟エンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０およびｇｐ４１になる、前駆体タンパク
質ｇｐ１６０をコードする。切断反応は、レトロウイルス性のエンベロープ糖タンパク質
前駆体において高度に保存される配列モチーフにおいて、宿主細胞のプロテアーゼである
フューリンによって（またはフューリン様プロテアーゼによって）媒介される。より具体
的には、ｇｐ１６０は（ｇｐ１６０）３へと三量体形成し、さらに切断を経て、２つの非
共有結合的に会合した成熟糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１になる。続いて、ウイ
ルス侵入が、ｇｐ１２０／ｇｐ４１ヘテロ二量体の三量体によって媒介される。ｇｐ１２
０は受容体結合断片であり、このような受容体を有する標的細胞（例えばヘルパーＴ細胞
など）上のＣＤ４受容体（および共受容体）に結合する。ｇｐ４１は、ｇｐ１２０に非共
有結合しており、融合断片であり、ＨＩＶが細胞に侵入する第２のステップをもたらす。
ｇｐ４１は、最初はウイルスエンベロープ内に埋め込まれているが、ｇｐ１２０がＣＤ４
受容体および共受容体に結合すると、ｇｐ１２０はその高次構造を変化させてｇｐ４１を
露出状態にし、このとき、宿主細胞との融合を促進し得る。ｇｐ１４０はｇｐ１６０の外
部ドメインである。
本発明の実施形態によれば、「ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質」は、ｇｐ１
６０もしくはｇｐ１４０タンパク質、またはその組み合わせ、融合物、トランケーション
もしくは派生体であり得る。例えば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ４１タ
ンパク質と非共有結合的に会合したｇｐ１２０タンパク質を含み得る。「ＨＩＶエンベロ
ープタンパク質」はまた、外部ドメイン（すなわち、細胞外空間に延在するドメイン）に
おけるＣ末端トランケーション、ｇｐ４１の外部ドメインにおけるトランケーション、ｇ
ｐ４１の膜貫通ドメインにおけるトランケーション、またはｇｐ４１の細胞質ドメインに
おけるトランケーションなどの、ｇｐ４１におけるトランケーションを含むエンベロープ
タンパク質を含むが、これらに限定されないトランケートされたＨＩＶエンベロープタン
パク質であり得る。ＨＩＶエンベロープタンパク質はまた、ｇｐ１６０外部ドメイン、ま
たは伸長もしくはトランケートされた種類のｇｐ１４０に対応するｇｐ１４０であり得る
。ｇｐ１４０タンパク質の発現については、いくつかの論文（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，２００１；Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ
ａｌ．，２０１１）に記載されており、このタンパク質は、様々な変異体（例えば様々な
ＨＩＶ株に基づく）において、サービス提供会社から注文することもできる。本発明によ
るｇｐ１４０タンパク質は、ｇｐ１２０ドメインとｇｐ４１外部ドメインが切断されず、
かつ共有結合的に結合されるように切断部位の変異を有することができるか、あるいは、
ｇｐ１２０ドメインとｇｐ４１外部ドメインが切断され、かつ共有結合的に、例えば、ジ
スルフィド架橋によって結合することができる（例えば、ＳＯＳＩＰ変異体など）。「Ｈ
ＩＶエンベロープタンパク質」はさらに、例えば、フューリン切断部位における配列変異
、および／またはいわゆるＳＯＳＩＰ変異を有する天然に存在するＨＩＶエンベロープタ
ンパク質の派生体であり得る。本発明によるＨＩＶエンベロープタンパク質はまた、切断
部位を有することができ、その結果、ｇｐ１２０およびｇｐ４１外部ドメインが非共有結
合的に結合され得る。
本発明の好ましい実施態様では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ１４０タンパク質
またはｇｐ１６０タンパク質であり、より好ましくはｇｐ１４０タンパク質である。他の
好ましい実施形態では、Ｅｎｖタンパク質は、例えば、天然のＥｎｖタンパク質と比較し
て、細胞質領域の７番目の残基の後の残基の欠失によってトランケートされる。
本発明の実施形態によれば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、三量体または単量
体であり得、好ましくは三量体である。三量体は、ホモ三量体（例えば、３つの同一のポ
リペプチド単位を含む三量体）、またはヘテロ三量体（例えば、全てが同一とは限らない
３つのポリペプチド単位を含む三量体）であり得る。好ましくは、三量体は、ホモ三量体
である。切断されたｇｐ１４０またはｇｐ１６０の場合、それは、ｇｐ１２０－ｇｐ４１
二量体であるポリペプチド単位の三量体であり、３つ全てのこれらの二量体が同一である
場合、これはホモ三量体であるとみなされる。
「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、可溶性タンパク質または膜結合性タンパク質で
あり得る。膜結合性エンベロープタンパク質は通常、例えば、図１Ａに示されるような膜
貫通ドメイン（ＴＭ）を含む全長ＨＩＶエンベロープタンパク質において、膜貫通ドメイ
ンを含む。膜結合性タンパク質は、細胞質ドメインを有し得るが、膜結合性になる細胞質
ドメインを必要としない。可溶性エンベロープタンパク質は、少なくとも部分的なまたは
完全な膜貫通ドメインの欠失を含む。例えば、全長ＨＩＶエンベロープタンパク質のＣ末
端をトランケートして膜貫通ドメインを欠失させ、それによって、図１Ｂに示されるよう
な可溶性タンパク質を生成することができる。しかしながら、ＨＩＶエンベロープタンパ
ク質は、図１Ｂに示されるものに対して、より短いトランケーションおよび代替のトラン
ケーション位置を有してもなお可溶性であり得る。トランケーションは様々な位置で行う
ことができ、非限定的な例は、アミノ酸６６４、６５５、６８３などの後であり、これら
は全て可溶性タンパク質をもたらす。本発明による膜結合性Ｅｎｖタンパク質は、天然の
Ｅｎｖタンパク質と比較して、完全なまたは部分的なＣ末端ドメイン（例えば、Ｃ末端細
胞質ドメインの部分的な欠失、例えば、ある種の実施形態では、細胞質領域の７番目の残
基の後）を含み得る。
シグナルペプチドは通常、発現される際にＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のＮ末端に存在す
るが、シグナルペプチダーゼによって切除され、そのため、成熟タンパク質においては存
在しない。シグナルペプチドは、他のシグナル配列と交換することができ、シグナルペプ
チドの一部の非限定的な例が、配列番号１１、１８、３３および３４において本明細書で
提供される。
本発明の実施形態によれば、ＨＩＶエンベロープタンパク質、例えば、ｇｐ１６０また
はｇｐ１４０は、任意のＨＩＶクレード（または「サブタイプ」）、例えば、クレードＡ
、クレードＢ、クレードＣ、クレードＤ、クレードＥ、クレードＦ、クレードＧ、クレー
ドＨなど、またはその組み合わせ（例えば、ＢＣ、ＡＥ、ＡＧ、ＢＥ、ＢＦ、ＡＤＧなど
の異なるサブタイプのウイルス間での組換えに由来する「組換型流行株」すなわちＣＲＦ
においてなど）からのＨＩＶエンベロープタンパク質配列に由来し得る。ＨＩＶエンベロ
ープタンパク質配列は、天然に存在する配列、モザイク配列、コンセンサス配列、合成配
列、またはその任意の派生体もしくは断片であり得る。「モザイク配列」は、１つ以上の
ＨＩＶクレードの少なくとも３つのＨＩＶエンベロープ配列に由来する複数のエピトープ
を含有し、Ｔ細胞エピトープの適用範囲を最適化するアルゴリズムによって設計され得る
。モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質の配列の例は、例えば、Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ
ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１０，１６：３１９－３２３；および国際公開第２０１０
／０５９７３２号パンフレットに記載のもの、例えば、配列番号８および９に示されるも
のなどを含む。本明細書で使用する場合、「コンセンサス配列」は、例えば、相同タンパ
ク質のアミノ酸配列のアラインメント（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用する
）によって決定されるような、相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づく
アミノ酸の人工的な配列を意味する。それは、少なくとも１０００個の天然のＨＩＶ単離
株由来のＥｎｖの配列に基づいて、配列アラインメントにおける各位置で見出される最も
高頻度なアミノ酸残基の計算された順序である。「合成配列」は、２つ以上の天然に存在
するＨＩＶ株に対して免疫応答を誘導するか、または免疫を生じさせるように最適化され
た天然に存在しないＨＩＶエンベロープタンパク質である。モザイクＨＩＶエンベロープ
タンパク質は、合成ＨＩＶエンベロープタンパク質の非限定的な例である。本発明の好ま
しい実施態様では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、本発明による指定位置（ｉ）～（ｖｉ
ｉ）で指定アミノ酸の少なくとも１つを有するコンセンサスＥｎｖタンパク質または合成
Ｅｎｖタンパク質である。本発明による指定位置（ｉ）～（ｖｉｉ）の指定アミノ酸残基
のうち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つを有し、好ましくはさらに、後述のよ
うにＳＯＳＩＰおよび／またはフューリン切断部位変異を有する、コンセンサスＥｎｖタ
ンパク質が特に好ましい。
本発明のある種の実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、天然に存在する配
列、モザイク配列、コンセンサス配列、合成配列などであろうとなかろうと、例えば、フ
ューリン切断部位および／またはいわゆるＳＯＳＩＰ変異において、追加の配列変異を含
む。
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、「ＳＯＳＩＰ変
異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質」である。いわゆるＳＯＳＩＰ変異は、「ＳＯＳ変異」（
新たに作られたシステイン残基間で適切なジスルフィド架橋の導入をもたらす、５０１位
および６０５位におけるＣｙｓ残基）ならびに「ＩＰ変異」（５５９位におけるＰｒｏ残
基）を含む、三量体安定化変異である。本発明の実施形態によれば、ＳＯＳＩＰ変異体Ｅ
ｎｖタンパク質は、５０１位および６０５位におけるＣｙｓ；５５９位におけるＰｒｏ；
ならびに好ましくは、５０１位および６０５位におけるＣｙｓならびに５５９位における
Ｐｒｏからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む。ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質はさらに、例えば、フューリン切断部位において、他の配列変異を含
む。加えて、ある種の実施形態では、Ｅｎｖタンパク質が、ＳＯＳＩＰバリアントにおけ
る５５９位のＰｒｏの代わりとしてだけでなく、すでに５５９位にＰｒｏを有するＳＯＳ
ＩＰバリアントの三量体形成をさらに向上させ得る追加の変異としても作用することがで
きると本明細書で見出された、５５６位もしくは５５８位、または５５６位および５５８
位においてＰｒｏを含むように、さらに変異を追加することが可能である。
本発明のある種の好ましい実施形態では、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
は、５０１位および６０５位においてＣｙｓ、ならびに５５９位においてＰｒｏを含む。
ある種の実施形態では、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質はさらに、フューリン
切断部位における変異を含む。フューリン切断配列における変異は、アミノ酸の置換、欠
失、挿入、または１つの配列の別の配列での置換、またはリンカーアミノ酸配列による置
換であり得る。本発明において好ましくは、フューリン切断部位を変異させることを使用
して、切断部位を最適化することができ、その結果、例えば、残基５０８～５１１の配列
のＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換によって［すなわち、４個のアルギニン残基
による５０９～５１０位での典型的なアミノ酸配列（例えば、ＥＫ）の置換（すなわち、
２個の置換および２個の付加）、一方で５０８位および５１１位では、大部分のＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質において存在するアルギニン残基がすでにあり、そのためこれらは通常
、置換されることを必要としないが、文献における最終結果がアミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲ
として参照されることが多いため、本発明者らは本明細書におけるこの命名法を使用し続
けた］、フューリン切断が野生型と比較して向上する。フューリン切断を向上させる他の
変異が知られており、かつ使用することもできる。あるいは、フューリン切断部位をリン
カーで置換することが可能であり、その結果、フューリン切断はもはや必要なくなるが、
タンパク質は、天然様の高次構造をとることになる（例えば、（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａ
ｌ，２０１５）および（Ｇｅｏｒｇｉｅｖ ｅｔ ａｌ，２０１５）に記載される）。
本発明の特定の実施形態では、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質はさらに、いわ
ゆるＳＯＳＩＰ変異（好ましくは、５０１位および６０５位におけるＣｙｓ、ならびに５
５９位におけるＰｒｏ）、ならびにフューリン切断部位における配列変異、好ましくは、
残基５０８～５１１の配列のＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換の両方を含む。あ
る種の好ましい実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖは、指定のＳＯＳＩＰおよびフューリン切
断部位変異の両方を含み、さらに加えて、５５６位または５５８位、最も好ましくは、５
５６位および５５８位の両方においてＰｒｏ残基を含む。
本発明の好ましい実施態様では、ＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、Ｈ
ＩＶエンベロープクレードＣコンセンサスまたはＨＩＶエンベロープクレードＢコンセン
サスなどの、コンセンサス配列である。特に好ましい実施形態では、ＨＩＶエンベロープ
タンパク質のアミノ酸配列は、ＨＩＶエンベロープクレードＣコンセンサスである。
本発明で使用することができる例示的なＨＩＶエンベロープタンパク質としては、ＨＩ
ＶエンベロープクレードＣコンセンサス（配列番号２）およびＨＩＶエンベロープクレー
ドＢコンセンサス（配列番号４）が挙げられる。これらのＨＩＶエンベロープクレードＣ
およびクレードＢコンセンサス配列は、例えば、配列番号３に示されるＣｏｎＣ＿ＳＯＳ
ＩＰ配列および配列番号５に示されるＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ配列などの、上記のようない
わゆるＳＯＳＩＰ変異および／またはフューリン切断部位における配列変異などの、例え
ば、安定性および／または三量体形成を亢進する追加の変異を含むことができる。
本発明において使用することができる（その際本発明の変異の１つ以上が中に導入され
る、「バックグラウンド」または「親」分子として）好ましいＨＩＶエンベロープタンパ
ク質配列の他の非限定的な例としては、例えば、配列番号６のアミノ酸配列、または１６
６位でのＧｌｕからＡｒｇへの変異、任意選択によりさらに上記のようなＳＯＳＩＰおよ
び／もしくはフューリン切断部位変異を有するもののいずれかを有する配列番号６のアミ
ノ酸配列を含む、合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が挙げられる。別の非限定的な例は、配
列番号７である。さらなる非限定的な例は、配列番号８または９のアミノ酸配列を有する
ものなどのモザイクＨＩＶエンベロープタンパク質である。
ある種の実施形態では、親分子は、野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であって、１個ま
たは好ましくは複数のアミノ酸が本明細書に記載の方法に従って矯正されている。このよ
うな親分子は、少なくとも１００、好ましくは少なくとも５００、好ましくは少なくとも
１０００、好ましくは少なくとも１００００、好ましくは少なくとも２００００の野生型
ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好まし
くは２％未満の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基で少なくとも１つの矯
正変異を含み、矯正変異は、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも
１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換である。好ましくは、前
記置換は、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１５％、少なくと
も２０％、少なくとも２５％の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基による
ものである。好ましくは、前記置換は、前記コレクション中の最も高頻度に対応する位置
で存在するアミノ酸残基によるものである。ある種の好ましい実施形態では、前記親分子
は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５
、１６、１７、１８、１９、または少なくとも２０個のこのような矯正変異を含む。好ま
しくは、野生型Ｅｎｖタンパク質と比較して、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列
のうち２％未満の頻度で対応する位置に存在する、少なくとも１０％、２０％、３０％、
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または全てのアミノ酸残基が、親分
子において矯正され、ある種の実施形態では、野生型Ｅｎｖタンパク質と比較して、前記
コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満の頻度で対応する位置に存在す
る、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％、または全てのアミノ酸残基が、親分子において矯正される。ある種の実施形態では
、野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、クレードＡ株、Ｂ株、またはＣ株に由来し、好ま
しくは、クレードＣ株に由来する。この矯正変異の結果として、親分子は、起源となる野
生型株よりもＨＩＶ Ｅｎｖコンセンサスに対してより高い類似を示すことになり、した
がって、矯正されたアミノ酸残基は、本明細書では「コンセンサスアミノ酸」または「コ
ンセンサス残基」と称される場合がある。この矯正作用の結果、フォールディング、三量
体形成、発現、および／または安定性に関して、結果として生じる親分子の特性が大幅に
高められ、結果として生じる分子は本明細書において「矯正されたＥｎｖタンパク質」と
称される。このような親分子への本発明の安定化変異の追加（例えば、（ｉ）～（ｖｉｉ
）（表１）の１つ以上および／もしくは（ｘｖｉ）（表１）、ならびに／または任意選択
により（ｖｉｉｉ）～（ｘｖ）（表２）により、三量体の割合、三量体の収量、安定性、
広域中和抗体の結合、フォールディングの１つ以上においてよりいっそうの向上がもたら
され、野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に由来する結果として生じる分子は、本明細書に
おいて「矯正および安定化されたＥｎｖタンパク質」と称される。安定化変異の導入が実
際に、結果として生じる配列をコンセンサス配列からわずかに転換し、そのため、矯正お
よび安定化されたＨＩＶ Ｅｎｖ分子の非常に高められた特性の実質的な結果は、２つの
完全に異なる概念に基づくことが当業者には明らかであろう。
本発明による位置（ｉ）～（ｖｉｉ）で指定アミノ酸をもたらす変異は、ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質においても使用することができるが、本発明の変異はＳＯＳＩＰ変異とは独
立しており、かつ加えていくつかの異なるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質バックボーンにおい
て機能することが示されたため、ＳＯＳＩＰ変異は（例えば、Ｅｎｖコンセンサス配列、
または野生型ＨＩＶ単離株由来のＥｎｖタンパク質において）存在せず、かつＳＯＳＩＰ
変異がないことによりその三量体形成を向上させる可能性もある。実際に、本発明による
変異が、ＳＯＳ変異の不存在下およびＩＰ変異の不存在下で機能して、ＨＩＶ Ｅｎｖの
三量体形成特性を向上させることができることが本明細書で示される。
本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＨＩＶエンベロー
プタンパク質のアミノ酸配列における特定された位置である種のアミノ酸残基を有するＨ
ＩＶエンベロープタンパク質を含む。特に、エンベロープタンパク質において７つの位置
が同定され、さらにその同定された位置の各々では特定のアミノ酸残基が望ましい。エン
ベロープタンパク質配列において同定された位置としては、（ｉ）６５１位、（ｉｉ）６
５５位、（ｉｉｉ）５３５位、（ｉｖ）５８９位、（ｖ）５７３位、（ｖｉ）２０４位、
および（ｖｉｉ）６４７位が挙げられ、位置のナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ
２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う。本発明によるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は
、指定位置（ｉ）～（ｖｉｉ）の少なくとも１つ、好ましくは指定位置（ｉ）～（ｖｉｉ
）の少なくとも２つ、より好ましくは指定位置（ｉ）～（ｖｉｉ）の少なくとも３つにお
いて、特定されたアミノ酸残基を有する。本発明の実施形態による指定位置の各々におい
て望ましい特定のアミノ酸残基を表１に示す。これらの選択肢の中で好ましい位置は、（
ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖｉ）および／または（ｖｉｉ）である。こ
れらの選択肢の中で特に好ましい位置は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、お
よび／または（ｖｉｉ）である。追加の好ましい選択肢は、本明細書で後にいくらかより
詳細に言及される（ｘｖｉ）である。
Figure 2023011941000001
１つ以上の指定位置での１つ以上の望ましいアミノ酸（または指定アミノ酸）置換が導
入されるＨＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、「バックボーンＨＩＶエンベ
ロープ配列」または「親ＨＩＶエンベロープ配列」と称される。例えば、配列番号３のＣ
ｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列における６５１位がＰｈｅに変異する場合、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩ
Ｐ配列は、「バックボーン」または「親」配列であるとみなされる。本発明の実施形態に
よる新規の安定化変異を、単独で、またはいわゆるＳＯＳＩＰ変異および／もしくはフュ
ーリン切断部位における変異などの他の変異と組み合わせて導入することができる「バッ
クボーン」または「親」配列として、任意のＨＩＶエンベロープタンパク質を使用するこ
とができる。バックボーンとして使用することができるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の非限
定的な例としては、天然のＨＩＶ単離株、合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、またはコンセ
ンサスＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に由来するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が挙げられ、ある
種の非限定的な例としては、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番
号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９を含むものが挙げられる。
本発明の実施形態によれば、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、１、２、３、４、５、
６、または７つの位置での指定アミノ酸残基などの、６５１位、６５５位、５３５位、５
８９位、５７３位、２０４位、および６４７位からなる群から選択される指定位置のうち
少なくとも１つで指定アミノ酸残基を有することができる。好ましくは、ＨＩＶエンベロ
ープタンパク質は、１、２、または３つの指定位置で置換され、より好ましくは、ＨＩＶ
エンベロープタンパク質は、指定位置の少なくとも２つで置換される。よりいっそう好ま
しくは、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、３つの指定位置、４つの指定位置、５つの指定位
置、６つの指定位置、または７つ全ての指定位置で置換される。好ましくは、ＨＩＶエン
ベロープタンパク質は、指定位置の少なくとも２つで指定アミノ酸残基を含有する。より
好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、指定位置の３つで指定アミノ酸残基を含
有する。他の好ましい実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、指定位置の４、
５、６、または７つ全てで指定アミノ酸残基を含有する。
複数の位置で指定アミノ酸を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の実施形態は、（ＨＩＶ
－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従ってナンバリングされた位置
、続いてその位置に存在する残基の１文字のアミノ酸コード、１つのＨＩＶ Ｅｎｖタン
パク質実施形態内の位置は読点によって隔てられ［例えば、６５１位にＰｈｅ、６５５位
にＩｌｅを有するＥｎｖタンパク質の実施形態は、６５１Ｆ、６５５Ｉと記載される］、
一方で異なる実施形態（すなわち、異なるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質）はセミコロンで隔
てられる）次のものを含む。２つの位置で指定アミノ酸を有するＥｎｖタンパク質に関し
ては：６５１Ｆ、６５５Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｍ；６５１Ｆ、６５
５Ｗ；６５１Ｆ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、５３５Ｑ；６５１Ｆ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、５８
９Ｉ；６５１Ｆ、５８９Ａ；６５１Ｆ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、５７３Ｗ；６５１Ｆ、２０
４Ｉ；６５１Ｆ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６４７Ｉ；６５１Ｆ、６４７Ｍ；６５１Ｌ、６５
５Ｉ；６５１Ｌ、６５５Ｆ；６５１Ｌ、６５５Ｍ；６５１Ｌ、６５５Ｗ；６５１Ｌ、５３
５Ｎ；６５１Ｌ、５３５Ｑ；６５１Ｌ、５８９Ｖ；６５１Ｌ、５８９Ｉ；６５１Ｌ、５８
９Ａ；６５１Ｌ、５７３Ｆ；６５１Ｌ、５７３Ｗ；６５１Ｌ、２０４Ｉ；６５１Ｌ、６４
７Ｆ；６５１Ｌ、６４７Ｉ；６５１Ｌ、６４７Ｍ；６５１Ｍ、６５５Ｉ；６５１Ｍ、６５
５Ｆ；６５１Ｍ、６５５Ａ；６５１Ｍ、６５５Ｌ；６５１Ｍ、６５５Ｗ；６５１Ｍ、５３
５Ｎ；６５１Ｍ、５３５Ｑ；６５１Ｍ、５８９Ｖ；６５１Ｍ、５８９Ｉ；６５１Ｍ、５８
９Ａ；６５１Ｍ、５７３Ｆ；６５１Ｍ、５７３Ｗ；６５１Ｍ、２０４Ｉ；６５１Ｍ、６４
７Ｆ；６５１Ｍ、６４７Ｉ；６５１Ｍ、６４７Ｍ；６５１Ｗ、６５５Ｉ；６５１Ｗ、６５
５Ｆ；６５１Ｗ、６５５Ｍ；６５１Ｗ、６５５Ｗ；６５１Ｗ、５３５Ｎ；６５１Ｗ、５３
５Ｑ；６５１Ｗ、５８９Ｖ；６５１Ｗ、５８９Ｉ；６５１Ｗ、５８９Ａ；６５１Ｗ、５７
３Ｆ；６５１Ｗ、５７３Ｗ；６５１Ｗ、２０４Ｉ；６５１Ｗ、６４７Ｆ；６５１Ｗ、６４
７Ｉ；６５１Ｗ、６４７Ｍ；６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５３５Ｑ；６５５Ｉ、５８
９Ｖ；６５５Ｉ、５８９Ｉ；６５５Ｉ、５８９Ａ；６５５Ｉ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、５７
３Ｗ；６５５Ｉ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、６４７Ｉ；６５５Ｉ、６４
７Ｍ；６５５Ｆ、５３５Ｎ；６５５Ｆ、５３５Ｑ；６５５Ｆ、５８９Ｖ；６５５Ｆ、５８
９Ｉ；６５５Ｆ、５８９Ａ；６５５Ｆ、５７３Ｆ；６５５Ｆ、５７３Ｗ；６５５Ｆ、２０
４Ｉ；６５５Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｆ、６４７Ｉ；６５５Ｆ、６４７Ｍ；６５５Ｍ、５３
５Ｎ；６５５Ｍ、５３５Ｑ；６５５Ｍ、５８９Ｖ；６５５Ｍ、５８９Ｉ；６５５Ｍ、５８
９Ａ；６５５Ｍ、５７３Ｆ；６５５Ｍ、５７３Ｗ；６５５Ｍ、２０４Ｉ；６５５Ｍ、６４
７Ｆ；６５５Ｍ、６４７Ｉ；６５５Ｍ、６４７Ｍ；６５５Ｗ、５３５Ｎ；６５５Ｗ、５３
５Ｑ；６５５Ｗ、５８９Ｖ；６５５Ｗ、５８９Ｉ；６５５Ｗ、５８９Ａ；６５５Ｗ、５７
３Ｆ；６５５Ｗ、５７３Ｗ；６５５Ｗ、２０４Ｉ；６５５Ｗ、６４７Ｆ；６５５Ｗ、６４
７Ｉ；６５５Ｗ、６４７Ｍ；５３５Ｎ、５８９Ｖ；５３５Ｎ、５８９Ｉ；５３５Ｎ、５８
９Ａ；５３５Ｎ、５７３Ｆ；５３５Ｎ、５７３Ｗ；５３５Ｎ、２０４Ｉ；５３５Ｎ、６４
７Ｆ；５３５Ｎ、６４７Ｉ；５３５Ｎ、６４７Ｍ；５３５Ｑ、５８９Ｖ；５３５Ｑ、５８
９Ｉ；５３５Ｑ、５８９Ａ；５３５Ｑ、５７３Ｆ；５３５Ｑ、５７３Ｗ；５３５Ｑ、２０
４Ｉ；５３５Ｑ、６４７Ｆ；５３５Ｑ、６４７Ｉ；５３５Ｑ、６４７Ｍ；５８９Ｖ、５７
３Ｆ；５８９Ｖ、５７３Ｗ；５８９Ｖ、２０４Ｉ；５８９Ｖ、６４７Ｆ；５８９Ｖ、６４
７Ｉ；５８９Ｖ、６４７Ｍ；５８９Ｉ、５７３Ｆ；５８９Ｉ、５７３Ｗ；５８９Ｉ、２０
４Ｉ；５８９Ｉ、６４７Ｆ；５８９Ｉ、６４７Ｉ；５８９Ｉ、６４７Ｍ；５８９Ａ、５７
３Ｆ；５８９Ａ、５７３Ｗ；５８９Ａ、２０４Ｉ；５８９Ａ、６４７Ｆ；５８９Ａ、６４
７Ｉ；５８９Ａ、６４７Ｍ；５７３Ｆ、２０４Ｉ；５７３Ｆ、６４７Ｆ；５７３Ｆ、６４
７Ｉ；５７３Ｆ、６４７Ｍ；５７３Ｗ、２０４Ｉ；５７３Ｗ、６４７Ｆ；５７３Ｗ、６４
７Ｉ；５７３Ｗ、６４７Ｍ；２０４Ｉ、６４７Ｆ；２０４Ｉ、６４７Ｉ；２０１Ｉ、６４
７Ｍ。それらの実施形態の各々は、野生型単離株、またはＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質、またはコンセンサスＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、または合成ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質などの任意のＨＩＶ Ｅｎｖ配列において、本発明に従って存在することが
できる。それらの実施形態の各々は、本発明による（ｉ）～（ｖｉｉ）の他の指定位置の
うちの１つの第３の位置で本発明による好ましいアミノ酸の１つと組み合わせることがで
きる。指定位置（ｉ）～（ｖｉｉ）の３つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するこのよ
うな実施形態は、本発明による（ｉ）～（ｖｉｉ）の他の指定位置のうちの１つの第４の
位置で好ましいアミノ酸の１つと組み合わせることができる。指定位置（ｉ）～（ｖｉｉ
）の４つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するこのような実施形態は、本発明による（
ｉ）～（ｖｉｉ）の他の指定位置のうちの１つの第５の位置で好ましいアミノ酸の１つと
組み合わせることができる。指定位置（ｉ）～（ｖｉｉ）の５つの位置で好ましいアミノ
酸残基を有するこのような実施形態は、本発明による（ｉ）～（ｖｉｉ）の他の指定位置
のうちの１つの第６の位置で好ましいアミノ酸の１つと組み合わせることができる。指定
位置（ｉ）～（ｖｉｉ）の６つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するこのような実施形
態は、本発明による（ｉ）～（ｖｉｉ）の他の指定位置のうちの１つの第７の位置で好ま
しいアミノ酸の１つと組み合わせることができ、その結果、Ｅｎｖタンパク質は、本発明
による７つ全ての位置（ｉ）～（ｖｉｉ）で本発明による好ましいアミノ酸を有する。本
発明の位置（ｉ）～（ｖｉｉ）の３、４、５、６、または７つで本発明による好ましいア
ミノ酸を有するこれらのさらなる実施形態のいずれかは、野生型単離株、ＳＯＳＩＰバリ
アント、コンセンサスＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質などに
由来する、任意のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質において存在することができる。
２つの位置で指定アミノ酸を有する本発明による好ましいＥｎｖタンパク質は：６５１
Ｆ、６５５Ｉ；６５１Ｆ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、５８９Ｉ；６５１
Ｆ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５５
Ｉ、５８９Ｖ；６５５Ｉ、５８９Ｉ；６５５Ｉ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、２０４Ｉ；６５５
Ｉ、６４７Ｆ；５３５Ｎ、５８９Ｖ；５３５Ｎ、５８９Ｉ；５３５Ｎ、５７３Ｆ；５３５
Ｎ、２０４Ｉ；５３５Ｎ、６４７Ｆ；５８９Ｖ、５７３Ｆ；５８９Ｖ、２０４Ｉ；５８９
Ｖ、６４７Ｆ；５８９Ｉ、５７３Ｆ；５８９Ｉ、２０４Ｉ；５８９Ｉ、６４７Ｆ；５７３
Ｆ、２０４Ｉ；５７３Ｆ、６４７Ｆ；２０４Ｉ、６４７Ｆである。少なくとも２つの本発
明による位置で好ましいアミノ酸を有する特に好ましいＥｎｖタンパク質としては：６５
１Ｆ、６５５Ｉ；６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５８９Ｖ；５３５Ｎ、５８９Ｖ；５３
５Ｎ、６４７Ｆが挙げられる。
３つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するいくつかの好ましいＨＩＶ Ｅｎｖタンパ
ク質は：６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、５
８９Ｉ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、５７３Ｆ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、５３５Ｎ；６
５１Ｆ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５８９Ｉ、５
３５Ｎ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、６
４７Ｆ、５３５Ｎ；５８９Ｖ、５７３Ｆ、５３５Ｎ；５８９Ｖ、２０４Ｉ、５３５Ｎ；５
８９Ｖ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；５８９Ｉ、５７３Ｆ、５３５Ｎ；５８９Ｉ、２０４Ｉ、５
３５Ｎ；５８９Ｉ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；５７３Ｆ、２０４Ｉ、５３５Ｎ；５７３Ｆ、６
４７Ｆ、５３５Ｎ；２０４Ｉ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ；６
５１Ｆ、５７３Ｆ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、６４７Ｆ、５
８９Ｖ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８９Ｖ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５８９Ｖ；６５５Ｉ、６
４７Ｆ、５８９Ｖ；５７３Ｆ、２０４Ｉ、５８９Ｖ；５７３Ｆ、６４７Ｆ、５８９Ｖ；２
０４Ｉ、６４７Ｆ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｉ；６５１Ｆ、５７３Ｆ、５
８９Ｉ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、５８９Ｉ；６５１Ｆ、６４７Ｆ、５８９Ｉ；６５５Ｉ、５
７３Ｆ、５８９Ｉ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５８９Ｉ；６５５Ｉ、６４７Ｆ、５８９Ｉ；５
７３Ｆ、２０４Ｉ、５８９Ｉ；５７３Ｆ、６４７Ｆ、５８９Ｉ；
２０４Ｉ、６４７Ｆ、５８９Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、
５７３Ｆ；６５１Ｆ、６４７Ｆ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、
６４７Ｆ、５７３Ｆ；２０４Ｉ、６４７Ｆ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、２０４Ｉ；
６５１Ｆ、６４７Ｆ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、６４７Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、
６４７Ｆ；６５５Ｉ、６５１Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、６５１Ｆ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、
５８９Ｖ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、２０４Ｉである。少なくとも３つの本発明に
よる位置で好ましいアミノ酸を有する特に好ましいＥｎｖタンパク質としては：６５１Ｆ
、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８９Ｖ
；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、６４７Ｆが挙げられる。
４つの位置で好ましいアミノ酸残基を有するいくつかの好ましいＨＩＶ Ｅｎｖタンパ
ク質は：６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５
７３Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５
７３Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、２
０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、２
０４Ｉ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５７３Ｆ、２
０４Ｉ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、２
０４Ｉ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２
０４Ｉ；５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、６
４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、６
４７Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５７３Ｆ、６
４７Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、６
４７Ｆ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６
４７Ｆ；５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、２０４Ｉ、６
４７Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、２０４Ｉ、６
４７Ｆ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６
４７Ｆ；５３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６
４７Ｆ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；５３５Ｎ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６
４７Ｆ；および５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆである。少なくとも４つの位置
で好ましいアミノ酸残基を有する好ましいＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のいくつかの例とし
ては：６５１Ｆ、６５５Ｉ、６４７Ｆ、Ｉ５３５Ｎ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５７３Ｆ、５
８９Ｖが挙げられる。少なくとも４つの位置で指定アミノ酸残基を含むＨＩＶ Ｅｎｖタ
ンパク質の好ましい例としては、５３５Ｎ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉを含む。この
ようなＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号２０、２２、２４、２６、
２７、２８、２９、３０、３１、および３２において提供される。好ましいこのようなＨ
ＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、クレードＣのＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質またはクレードＡの
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、最も好ましくは、クレードＣのＨＩＶ Ｅｎｖタンパ
ク質である。ある種の実施形態では、前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はさらに５８８Ｅを
含み、すなわち、それは少なくとも５３５Ｎ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ
を含む。このようなＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号２０、２４、
２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２において提供される。ある種の実施形
態では、前記ＨＩＶ Ｅｎｖはさらに５５６Ｐを含み、すなわち、それは少なくとも５３
５Ｎ、５５６Ｐ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ、または少なくとも５３５Ｎ、５５６Ｐ
、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉを含む。このようなＨＩＶ Ｅｎｖタンパク
質の非限定的な例は、配列番号２２、２４、２６、２７、２９、３０、３１、および３２
において提供される。
一実施形態では、本発明による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも２つでの指定アミノ酸残基を有するＨＩ
Ｖ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列を含む。
例えば、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、６５１位でＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、
またはＴｒｐの１つ、および５３５位でＡｓｎまたはＧｌｎ、任意選択により、追加の指
定位置で追加の指定アミノ酸残基を有することができる。好ましくは、（ｉ）～（ｖｉｉ
）におけるアミノ酸の少なくとも１つが、アミノ酸置換によって組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質に導入される。例えば、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を、上の（ｉ）～
（ｖｉｉ）におけるアミノ酸残基を全く含有しないか、またはただ１つ含有するＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質から生成することができ、その結果、少なくとも２つの指定アミノ酸残
基の全てまたは１つ以上がアミノ酸置換によって組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に導
入される。
ある種の実施形態では、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はさらに、（ｖｉ
ｉｉ）５８８位においてＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＰｈ
ｅを含み、ＧｌｎまたはＧｌｕが好ましい。
上記の置換が導入されるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＨＩＶ
クレードＡ、クレードＢ、クレードＣなど由来の天然に存在する配列；モザイク配列；コ
ンセンサス配列、例えば、クレードＢまたはクレードＣコンセンサス配列；合成配列；ま
たはその任意の派生体もしくは断片などの、本開示の観点から当業者に知られる任意のＨ
ＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり得る。本発明のある種の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖタ
ンパク質のアミノ酸配列は、例えば、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、および／またはフューリ
ン切断部位における変異などの追加の変異を含む。
特定の一実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、５０１位および６
０５位のＣｙｓ；５５９位のＰｒｏからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含
むＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。好ましい実施形態では、ＳＯＳＩ
Ｐ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、５０１位および６０５位においてＣｙｓ、および
５５９位においてＰｒｏを含む。この実施形態によれば、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパ
ク質は、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列、ならびに
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つで指定アミノ酸残基によるアミノ酸
置換を含む。
ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はさらに、配列番号１０による６０８～５
１１位での置換などの、フューリン切断部位における変異を含むことができる。
別の実施形態では、本発明による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質のアミノ酸配列、ならびに
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つで指定アミノ酸残基によるアミノ酸
置換を含み、
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、
（１）例えば、配列番号２、３、４、もしくは５のアミノ酸配列を含むクレードＣまたは
クレードＢコンセンサス配列などの、ＨＩＶ Ｅｎｖコンセンサス配列；
（２）例えば、（ａ）配列番号６；（ｂ）１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有する
配列番号６；（ｃ）配列番号７；（ｄ）配列番号８または９、任意選択によりさらに上記
のようなＳＯＳＩＰおよび／もしくはフューリン切断部位変異を有する（ａ）、（ｂ）ま
たは（ｄ）のアミノ酸配列を含む、合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
からなる群から選択される。
好ましくは、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミ
ノ酸配列、および２つの位置または３つの位置などの、上の（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる
群から選択される指定位置の少なくとも２つでの指定アミノ酸残基によるアミノ酸置換を
含む。しかしながら、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、１、２、３、４、５、６ま
たは７つの指定位置などの、指定位置の１つ以上での指定アミノ酸残基によるアミノ酸置
換を含むことができる。
特定の一実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、配列番号２のアミ
ノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なア
ミノ酸を含むＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＣである。好ましくは、配列番号２の
ＨＩＶコンセンサスクレードＣ配列はさらに、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、すなわち、５０
１位および６０５位のＣｙｓ、ならびに５５９位のＰｒｏを含み、より好ましくはさらに
、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、および例えば、５０８～５１１位での配列番号１０による置
換などのフューリン切断部位における変異を含む。特に好ましい実施形態では、ＨＩＶ
Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、配列番号３に示される配列、またはそれと少なくとも
９５％同一な配列を含み、好ましくは、５０１位、５５９位、６０５位、および配列番号
１０によって置換されるような５０８～５１１位のアミノ酸が、配列番号３と比較して変
異していない。
別の特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、配列番号４のア
ミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な
アミノ酸配列を含むＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＢである。好ましくは、配列番
号４のＨＩＶコンセンサスクレードＢ配列はさらに、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、すなわち
、５０１位および６０５位のＣｙｓ、ならびに５５９位のＰｒｏを含み、より好ましくは
さらに、いわゆるＳＯＳＩＰ変異、および例えば、５０８～５１１位での配列番号１０に
よる置換などのフューリン切断部位における変異を含む。特に好ましい実施形態では、Ｈ
ＩＶ Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、配列番号５に示される配列、またはそれと少な
くとも９５％同一な配列を含み、好ましくは、５０１位、５５９位、６０５位、および配
列番号１０によって置換されるような５０８～５１１位のアミノ酸が、配列番号５と比較
して変異していない。
さらに別の特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、例えば、
（ａ）配列番号６；（ｂ）１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有する配列番号６；（
ｃ）配列番号７；または（ｄ）配列番号８または９、任意選択によりさらに上記のような
ＳＯＳＩＰ（５０１Ｃ、６０５Ｃ、５５９Ｐ）および／もしくはフューリン切断部位変異
（５０８－５１１ＲＲＲＲＲＲ）を有する（ａ）、（ｂ）または（ｄ）のアミノ酸配列を
含む、合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
さらに他の特定の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖバックボーンタンパク質は、任意選択
により本明細書に記載の方法に従って配列を矯正する変異を含む、野生型クレードＡまた
はクレードＣ ＨＩＶウイルス由来のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
同時に置換することができるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質における２つの位置の例示的な
組み合わせとしては、例えば、二重変異体Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ；Ｉ５３５Ｎ、Ｅ６４
７Ｆ；およびＤ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉにおける、残基５３５、５８９；５３５、６４７；
および５８９、６５５が挙げられる。他の二重変異体としては、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ
；Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ；およびＫ６５５Ｉ、Ｉ５７３Ｆが挙げられる。同時に置換す
ることができるＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質における３つの位置の例示的な組み合わせとし
ては、例えば、三重変異体Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉにおける、５３５、５８
９、６５５が挙げられる。他の三重変異体としては、Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３
Ｆ；およびＫ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎが挙げられる。
本発明のある種の実施形態では、本発明による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はさ
らに、下の表２に示されるような（ｖｉｉｉ）５８８位、（ｉｘ）６４位もしくは６６位
、（ｘ）３１６位、（ｘｉ）２０１位／４３３位、（ｘｉｉ）５５６位もしくは５５８位
、もしくは５５６位および５５８位、（ｘｉｉｉ）５４８～５６８位、（ｘｉｖ）５６８
位、５６９位および６３６位、または（ｘｖ）３０２位、５１９位もしくは５２０位から
なる群から選択される１つ以上の追加の指定位置で指定アミノ酸残基を（例えば、置換を
介して）含むことができる。これらのアミノ酸置換のうち特定のもの（例えば、（ｖｉｉ
ｉ））は、本発明者らによって見出されて、上記のような本発明による変異（ｉ）～（ｖ
ｉｉ）（の組み合わせ）と非常に良好に組み合わされた。これらのアミノ酸置換のうち他
のものは、文献において以前に報告されていた。例えば、Ｄｅ Ｔａｅｙｅ ｅｔ ａｌ
．（Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３（７），１７０２－１５）は、Ｅ６４ＫとＴ３１６Ｗの
二重変異を有するＨＩＶエンベロープタンパク質、および６６Ｒ変異を有するＨＩＶ Ｅ
ｎｖタンパク質を報告し；ならびにＫｗｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１５）２２（７）５２２－３１）は、Ｉ２０４Ｃ、Ａ４３３Ｃの
ジスルフィド置換を有するＨＩＶエンベロープタンパク質を報告し；ならびにＧｕｅｎａ
ｇａ ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１７）４６，７９２－８０３）は、Ｌ５６
８Ｇ、Ｔ５６９ＧまたはＮ６３６Ｇ、およびＮ３０２Ｙ、Ｆ５１９Ｒ、Ｌ５２０Ｒの三重
置換を有するＨＩＶエンベロープタンパク質を報告した。しかしながら、発明者らの知識
の範囲内では、これらの以前に記載された変異は、本明細書に記載の新規の置換、例えば
、表１に列記される置換のいずれかと組み合わされて記載されていなかった。本発明のア
ミノ酸置換と組み合わされたこれらのアミノ酸変異はさらに、三量体の収量および／また
は三量体形成の割合を増加させることができる。これらのアミノ酸置換は、表１に記載の
ような指定位置の１つ以上での指定アミノ酸残基による置換に加えて、本明細書に記載の
組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のいずれかに導入され得る。
Figure 2023011941000002
本発明の指定位置で同定される置換［（ｉ）～（ｖｉｉ）、例えば、表１を参照のこと
］は、天然の配列に存在しないか、またはまれにしか存在せず、以前に報告されたＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質配列における組み合わせにおいては見出されず、かつＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質の三量体形成の向上、三量体の収量の向上、および／または三量体の安定性の
増大をもたらすと以前に示唆されなかった。表２における変異（ｉｘ）～（ｘｉ）（他の
人たちによって以前に報告された）は全て、三量体に特異的な抗体ＰＧＴ１４５が結合す
るｇｐ１２０領域にある。これらの変異は、尖部（分子の先端にある）で閉じた三量体を
保持する。置換（ｘｉｉ）および（ｘｉｉｉ）は全てｇｐ４１のＨＲ１にある。２０４位
を除いて、表１における本発明の変異は全て、ＨＲ１の外部ではあるが、ｇｐ４１領域（
分子の下端）にある。明らかに、以前に記載された変異は、ＰＧＴ１４５の結合によって
測定されるような閉じた尖部を有する三量体形成に対するその驚くべき効果はもとより、
本発明の変異の導入に関するいずれの示唆も提供しなかった。表２の点変異（ｖｉｉｉ）
～（ｘｉｉ）を除いて、Ｅｎｖタンパク質のＨＲ１ループ（ＨＸＢ２単離株のｇｐ１６０
に従うナンバリングによる野生型配列におけるアミノ酸残基５４８～５６８）を、７～１
０アミノ酸を有するより短くかつ可動性の低いループ、好ましくは、例えば、（配列番号
１２～１７）のいずれか１つから選択される配列を有する８アミノ酸のループによって置
換することも可能であり、例えば、ＨＲ１ループを置換するこのようなより短いループに
ついて記載するＫｏｎｇ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ｊｕｌ ２８
；７：１２０４０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２０４０）を参照されたい
。本発明による指定位置（ｉ）～（ｖｉｉ）の少なくとも１つ、および好ましくは、少な
くとも２つに指定アミノ酸残基をさらに有するこのようなＥｎｖバリアントもまた、本発
明の実施形態である。（ｖｉｉｉ）～（ｘｉｉｉ）に列記される変異を、本発明のある種
の実施形態において、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、すなわち、位置（ｉ）～（ｖ
ｉｉ）に指定アミノ酸の１つ以上を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に追加することがで
きる。また、群（ｖｉｉｉ）～（ｘｉｉｉ）内での組み合わせを行うことができ、非限定
的な例は、（（ｉ）～（ｖｉｉ）の少なくとも１つの変異に加えて）（ｖｉｉｉ）および
（ｘｉｉ）（例えば、Ｉ５３５Ｎ、Ａ５５６Ｐ、Ｋ５８８Ｅ）での変異の組み合わせであ
る。ＳＯＳＩＰ変異を有するＨＩＶ Ｅｎｖのバックグラウンドならびに位置（ｉ）～（
ｖｉｉ）の少なくとも１つおよび位置（ｖｉｉｉ）～（ｘｉｉｉ）の少なくとも１つでの
変異の組み合わせにおいてなされた二重変異体のいくつかの非限定的な例としては：５３
５、５８８；５８８、５８９；６５５、５８８；５５８、５３５；および６５５、５５６
；例えば、Ｉ５３５Ｎ、Ｋ５８８Ｅ；５８８Ｑ、Ｄ５８９Ｖ；Ｋ６５５Ｉ、Ｋ５８８Ｅ；
Ａ５５８Ｐ、Ｉ５３５Ｎ；およびＫ６５５Ｉ、Ｌ５５６Ｐなどが挙げられる。このような
三重変異体のいくつかの非限定的な例としては、５５８、５３５、５８８；５５８、５３
５、５８９；５５８、５３５、６５５；および５５８、５３５、６５１、例えば、Ａ５５
８Ｐ、Ｉ５３５Ｎ、Ｋ５８８Ｅ；Ａ５５８Ｐ、Ｉ５３５、Ｄ５８９Ｖ；Ａ５５８Ｐ、Ｉ５
３５Ｎ、Ｋ６５５Ｉ；およびＡ５５８Ｐ、Ｉ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆなどが挙げられる。
本発明による組み合わせのさらなる非限定的な例としては、６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８
９Ｖ、５８８Ｅ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、５８８Ｅ；６５１Ｆ、６５
５Ｉ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、５８８Ｅ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８
９Ｖ、５８８Ｅ、５３５Ｎ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５５６Ｐ；６５１Ｆ、５３
５Ｎ、５５６Ｐ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、５５６Ｐ；６５１Ｆ、５８９Ｉ、５５６Ｐ；６５
１Ｆ、５７３Ｆ、５５６Ｐ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、５５６Ｐ；６５１Ｆ、６４７Ｆ、５５
６Ｐ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５５６Ｐ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５５６Ｐ；６５５Ｉ、５８
９Ｉ、５５６Ｐ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、５５６Ｐ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５５６Ｐ；６５
５Ｉ、６４７Ｆ、５５６Ｐ；５３５Ｎ、５８９Ｖ、５５６Ｐ；５３５Ｎ、５８９Ｉ、５５
６Ｐ；５３５Ｎ、５７３Ｆ、５５６Ｐ；５３５Ｎ、２０４Ｉ、５５６Ｐ；５３５Ｎ、６４
７Ｆ、５５６Ｐ；５８９Ｖ、５７３Ｆ、５５６Ｐ；５８９Ｖ、２０４Ｉ、５５６Ｐ；５８
９Ｖ、６４７Ｆ、５５６Ｐ；５８９Ｉ、５７３Ｆ、５５６Ｐ；５８９Ｉ、２０４Ｉ、５５
６Ｐ；５８９Ｉ、６４７Ｆ、５５６Ｐ；５７３Ｆ、２０４Ｉ、５５６Ｐ；５７３Ｆ、６４
７Ｆ、５５６Ｐ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５５８Ｐ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５５８Ｐ；６５
１Ｆ、５８９Ｖ、５５８Ｐ；６５１Ｆ、５８９Ｉ、５５８Ｐ；６５１Ｆ、５７３Ｆ、５５
８Ｐ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、５５８Ｐ；６５１Ｆ、６４７Ｆ、５５８Ｐ；６５５Ｉ、５３
５Ｎ、５５８Ｐ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５５８Ｐ；６５５Ｉ、５８９Ｉ、５５８Ｐ；６５
５Ｉ、５７３Ｆ、５５８Ｐ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５５８Ｐ；６５５Ｉ、６４７Ｆ、５５
８Ｐ；５３５Ｎ、５８９Ｖ、５５８Ｐ；５３５Ｎ、５８９Ｉ、５５８Ｐ；５３５Ｎ、５７
３Ｆ、５５８Ｐ；５３５Ｎ、２０４Ｉ、５５８Ｐ；５３５Ｎ、６４７Ｆ、５５８Ｐ；５８
９Ｖ、５７３Ｆ、５５８Ｐ；５８９Ｖ、２０４Ｉ、５５８Ｐ；５８９Ｖ、６４７Ｆ、５５
８Ｐ；５８９Ｉ、５７３Ｆ、５５８Ｐ；５８９Ｉ、２０４Ｉ、５５８Ｐ；５８９Ｉ、６４
７Ｆ、５５８Ｐ；５７３Ｆ、２０４Ｉ、５５８Ｐ；５７３Ｆ、６４７Ｆ、５５８Ｐ；６５
５Ｉ、５８９Ｖ、５３５Ｎ、５５６Ｐ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５５６Ｐ；５５
６Ｐ、６５１Ｆ；５５６Ｐ、６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７
３Ｆ、６５１Ｆ、５８８Ｅ、５５６Ｐ；５５６Ｐ、６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７
３Ｆ；５５６Ｐ、６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ；５５６Ｐ、６５
１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；５５６Ｐ、６５１Ｆ、６５
５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ；５５６Ｐ、６５１Ｆ、６５
５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ、６４７Ｆ；５５６Ｐ、６５
１Ｆ、５３５Ｎ、５７３Ｆ；５５６Ｐ、６５１Ｆ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ；５５
６Ｐ、６５１Ｆ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；５５６Ｐ、６５１Ｆ、５３
５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ；５５６Ｐ、６５１Ｆ、５３５Ｎ、５７
３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ、６４７Ｆ；５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７
３Ｆ；５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ；５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３
５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８
９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ；５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０
４Ｉ、５８８Ｑ、６４７Ｆが挙げられる。また、それらの実施形態のいずれかは、任意の
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、例えば、野生型単離株、コンセンサスＥｎｖ、合成Ｅｎｖタ
ンパク質、ＳＯＳＩＰ変異体Ｅｎｖタンパク質、本明細書に記載の概念に従う矯正変異を
含有する野生型単離株などにおいてあり得る。本発明によるいくつかの好ましい組み合わ
せとしては、６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６５１Ｆ、５８８Ｅ、５３５Ｎ、２０４Ｉ
；５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ；２０４Ｉ
、５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；５３５Ｎ、５５６Ｐ
、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；および５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６
５１Ｆ、６５５Ｉが挙げられる。
ある種の好ましい実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、配列番号２０、２２、
２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１および３２のいずれか１つと少なくとも９５
％同一、好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％同一、好ましくは１００
％同一である配列を含む。％同一性の決定については、好ましくは、表１および２の位置
（ｉ）～（ｘｖ）、ならびに好ましくは、５０１位、５５９位および６０５位もまた考慮
されない。好ましくは、それらの位置のアミノ酸残基は、それぞれ配列番号２０、２２、
２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２の配列におけるものである。
ある種の実施形態では、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はさらに：（ｘｖｉ）６５
８位においてＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、またはＬｅｕから選択されるア
ミノ酸残基を含む。好ましくは、６５８位におけるアミノ酸は、ＶａｌまたはＩｌｅであ
り、最も好ましくはＶａｌである。本明細書に記載の表１の（ｉ）～（ｖｉｉ）および／
もしくは表２の（ｖｉｉｉ）～（ｘｖ）から選択される単独の変異または変異の組み合わ
せのいずれかにおいて、Ｅｎｖタンパク質の三量体の割合および三量体の収量が強く増大
することが見出された。
本発明の実施形態によれば、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、表１に示されるよ
うな位置６５１、６５５、５３５、５８９、５７３、２０４、および６４７の１つ以上で
指定アミノ酸残基を有しないＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質と比較して、（ａ）三量体形成の
割合の向上および（ｂ）三量体の収量の向上のうち少なくとも１つを有する。
本明細書で使用する場合、「三量体形成の割合の向上」は、ＨＩＶエンベロープタンパ
ク質のバックボーン配列が本発明のアミノ酸置換の１つ以上を含有する場合に、ＨＩＶエ
ンベロープ配列のバックボーン配列がこのようなアミノ酸置換を含有しない場合に形成さ
れる三量体の割合と比較して、より多い割合の三量体が形成されることを意味する。本明
細書で使用する場合、「三量体の収量の向上」は、ＨＩＶエンベロープタンパク質のバッ
クボーン配列が本発明のアミノ酸置換の１つ以上を含有する場合に、ＨＩＶエンベロープ
配列のバックボーン配列がこのようなアミノ酸置換を含有しない場合に得られるエンベロ
ープタンパク質の三量体形態の総量と比較して、より多くのエンベロープタンパク質の三
量体形態の総量が得られることを意味する。
三量体形成は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形態に特異的に結合する抗体を用い
る抗体結合アッセイによって測定することができる。三量体形態を検出するのに使用する
ことができる三量体に特異的な抗体の例としては、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＰＧＴ
１４５、ＰＧＤＭ１４００、ＰＧ１６、およびＰＧＴ１５１が挙げられるが、これらに限
定されない。好ましくは、三量体に特異的な抗体は、ｍＡｂ ＰＧＴ１４５である。本開
示の観点において当技術分野で知られる任意の抗体結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、
ＡｌｐｈａＬＩＳＡなどを使用して、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量
体形成の割合を測定することができる。
特定の実施形態では、三量体形成はＡｌｐｈａＬＩＳＡによって測定される。Ａｌｐｈ
ａＬＩＳＡはビーズをベースにした近接アッセイであり、ドナービーズの高エネルギー放
射によって生成した一重項酸素分子が、ドナービーズに対しておよそ２００ｎｍ以内の距
離にあるアクセプタービーズに移動される。一重項酸素分子のアクセプタービーズへの移
動により、その後検出され得る化学発光シグナルをもたらす次々と起こる一連の化学反応
を開始させる（Ｅｇｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０
０８，２５（１）：２－１０）。例えば、Ｆｌａｇ－Ｈｉｓタグで標識された組換え体Ｈ
ＩＶエンベロープタンパク質は、三量体に特異的なｍＡｂ、三量体に特異的なｍＡｂに結
合する抗体にコンジュゲートされたドナービーズ、ニッケルにコンジュゲートされたドナ
ービーズ、抗Ｈｉｓ抗体にコンジュゲートされたアクセプタービーズ、および抗Ｆｌａｇ
抗体にコンジュゲートされたアクセプタービーズとともにインキュベートされ得る。形成
された三量体の量は、三量体に特異的なｍＡｂに結合する抗体にコンジュゲートされたド
ナービーズと抗Ｈｉｓ抗体にコンジュゲートされたアクセプタービーズの対から生成され
る化学発光シグナルを測定することによって決定され得る。発現されたＨＩＶエンベロー
プタンパク質の総量は、ニッケルにコンジュゲートされたドナービーズと抗Ｆｌａｇにコ
ンジュゲートされたアクセプタービーズの対から生成される化学発光シグナルを測定する
ことによって決定され得る。例えば、三量体および発現された総エンベロープタンパク質
の量は、実施例３に詳述されるようなＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定され得る
。三量体形成の割合は、形成された三量体の量を発現されたエンベロープタンパク質の総
量で割ることによって計算され得る。
形成された三量体の量および発現されたエンベロープタンパク質の総量はまた、三量体
形態をＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態、例えば、単量体形態から分離すること
ができるクロマトグラフィーの手法を用いて決定され得る。使用することができるこのよ
うな手法の例としては、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ
）が挙げられるが、これに限定されない。ある種の実施形態によれば、三量体形成の割合
は、ＳＥＣ－ＭＡＬＳを用いて決定される。ある種の実施形態によれば、三量体の収量は
、ＳＥＣ－ＭＡＬＳを用いて決定される。
核酸、ベクター、および細胞
別の一般的態様では、本発明は、本発明による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコ
ードする核酸分子、およびその核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子は
、クローニングにより得られるか、もしくは合成的に生成されるＲＮＡの形態またはＤＮ
Ａの形態であり得る。ＤＮＡは、二重鎖または単鎖であり得る。ＤＮＡは、例えば、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはその組み合わせを含むことができる。核酸分子およびベクタ
ーは、組換え体タンパク質の生成、宿主細胞におけるタンパク質の発現、またはウイルス
粒子の生成のために使用され得る。
本発明の実施形態によれば、組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸
は、プロモーターに作動可能に連結され、これは、核酸がプロモーターの制御下にあるこ
とを意味する。プロモーターは、相同プロモーター（すなわち、ベクターと同一の遺伝子
源に由来する）、または異種プロモーター（すなわち、異なるベクターもしくは遺伝子源
に由来する）であり得る。好適なプロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス
最初期（ｈＣＭＶ ＩＥ、または簡潔に「ＣＭＶ」）プロモーター、およびラウス肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセッ
ト内部の核酸の上流に位置する。
本発明の実施形態によれば、ベクターは、発現ベクターであり得る。発現ベクターとし
ては、組換え体タンパク質発現用ベクター、およびウイルスベクターなどの、対象の組織
における発現のために対象に核酸を送達するためのベクターが挙げられるが、これらに限
定されない。本発明とともに使用するのに好適なウイルスベクターの例としては、アデノ
ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、改変ワク
シニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイル
スベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチ
ウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターはまた、非ウイ
ルスベクターであり得る。非ウイルスベクターの例としては、プラスミド、細菌性人工染
色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどが挙げられるが、これらに限定されない
。
本発明のある種の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、例えば、組換
えアデノウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターは、例えば、ヒトアデ
ノウイルス（ＨＡｄＶ、もしくはＡｄＨｕ）、またはチンパンジーもしくはゴリラアデノ
ウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、もしくはＳＡｄＶ）もしくはアカゲザルアデノウイルス
（ｒｈＡｄ）などのサルアデノウイルスに由来し得る。好ましくは、アデノウイルスベク
ターは、組換えヒトアデノウイルスベクター、例えば、組換えヒトアデノウイルス血清型
２６、または組換えヒトアデノウイルス血清型５、４、３５、７、４８などのいずれか１
つである。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｒｈＡｄベクター、例えば、
ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２、またはｒｈＡｄ５３である。
組換えアデノウイルスベクターの調製法は、当技術分野で知られている。例えば、組換
えアデノウイルス２６ベクターの調製法は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２
号パンフレットおよびＡｂｂｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ８１（９）
：４６５４－６３に記載されている。例示的なアデノウイルス２６のゲノム配列は、Ｇｅ
ｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９
２号パンフレットの配列番号１の中に見出される。ｒｈＡｄ５１、ｒｈＡｄ５２およびｒ
ｈＡｄ５３に関する例示的なゲノム配列は、米国特許出願公開第２０１５／０２９１９３
５号明細書において提供される。
本発明の実施形態によれば、本明細書に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、
本明細書に記載のベクターのいずれかによって発現され、かつ／またはコードされ得る。
遺伝暗号の縮重の観点から、当技術分野において完全に常用される方法にしたがって、同
じタンパク質をコードするいくつかの核酸配列が設計され得ることを当業者は十分に認識
している。本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸は、任意選択に
よりコドン最適化されて、宿主細胞（例えば、細菌細胞または哺乳動物細胞）における適
切な発現を確実にすることができる。コドン最適化は、当技術分野で広く適用されている
技術である。
本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子およびベクターのいずれかを含む細胞、好ま
しくは、単離細胞を提供する。細胞は、例えば、組換え体タンパク質の生成、またはウイ
ルス粒子の生成のために使用され得る。
したがって、本発明の実施形態はまた、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を作製する
方法に関する。この方法は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の実施形態によ
る組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターにより宿主細
胞をトランスフェクトすることと、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の発現に好適な条
件下でトランスフェクト細胞を増殖させることと、任意選択により、細胞中で発現された
組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を精製または単離することとを含む。組換え体ＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質は、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど
を含む当技術分野で知られる任意の方法によって、細胞から単離または収集され得る。組
換え体タンパク質発現のために用いられる手法は、本開示の観点における当業者によく知
られているであろう。発現された組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はまた、例えば、組
換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする発現ベクターによりトランスフェクトされ
、かつＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の発現に好適な条件下で増殖された細胞の上清を分析す
ることによって、発現されたタンパク質を精製または単離することなく調査され得る。
好ましい実施形態では、発現された組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、安定化され
た三量体複合体を形成するようにタンパク質の会合を可能にする条件下で精製される。例
えば、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に作動可能に連結された組換え体Ｈ
ＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする発現ベクターによりトランスフェクトされた哺乳動
物細胞は、３３～３９℃、例えば、３７℃および２～１２％ＣＯ２、例えば、８％ＣＯ２
で培養され得る。発現はまた、昆虫細胞または酵母細胞などの、当技術分野では全て従来
法である代替の発現系において実施され得る。続いて、発現されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパ
ク質は、例えば、糖タンパク質に結合するレクチン親和性クロマトグラフィーによって、
細胞培養液から単離され得る。カラムに結合されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、マンノ
ピラノシドを用いて溶出され得る。カラムから溶出されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、
必要に応じてサイズ排除クロマトグラフィーなどのさらなる精製ステップにかけられて、
任意の残留している夾雑物、例えば、細胞夾雑物、またＥｎｖ凝集体、ｇｐ１４０単量体
およびｇｐ１２０単量体も除去され得る。抗体親和性クロマトグラフィー、非ｂＮＡｂに
よるネガティブ選択、抗タグ精製、またはイオン交換クロマトグラフィーなどの他のクロ
マトグラフィー方法、および当技術分野で知られる他の方法を含む代替の精製方法の非限
定的な例も使用して、発現されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を単離することができる。
本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸分子および発現ベクター
は、本開示の観点において当技術分野で知られる任意の方法によって作製され得る。例え
ば、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸は、例えば、部位特異的変異誘
発、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当業者によく知られている遺伝子操作技術お
よび分子生物学的手法を用いて、バックボーンＨＩＶエンベロープ配列に指定位置でアミ
ノ酸置換の少なくとも１つを導入することによって作製することができる。続いて、核酸
分子は、標準的な分子生物学的手法をまた使用して発現ベクターに導入または「クローン
化」され得る。続いて、組換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質は、宿主細胞中の発現ベ
クターから発現され得、発現されたタンパク質は、本開示の観点において当技術分野で知
られる任意の方法によって、細胞培養液から精製され得る。
三量体複合体
別の一般的態様では、本発明は、本発明による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のう
ち３つの非共有結合性のオリゴマーを含む三量体複合体に関する。三量体複合体は、本明
細書に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のいずれかを含むことができる。好まし
くは、三量体複合体は、本発明による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の３つの同一の
単量体（またはｇｐ１４０が切断される場合は同一のヘテロ二量体）を含む。三量体複合
体は、単量体形態などのＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態から分離され得るか、
または三量体複合体は、単量体形態などのＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態とと
もに存在し得る。
組成物および方法
別の一般的態様では、本発明は、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、
単離核酸、ベクター、または宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む組成物に関
する。組成物は、本明細書に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、
単離核酸分子、ベクター、または宿主細胞のいずれかを含むことができる。
担体としては、結合剤、崩壊剤、膨張剤、懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香味剤
、甘味料、防腐剤、色素、可溶化剤およびコーティングなどの１つ以上の薬学的に許容さ
れる賦形剤を挙げることができる。担体または他の材料の厳密な性質は、投与経路、例え
ば、筋肉内、皮内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内、または
腹腔内経路に依存し得る。液体の注射用製剤の場合、例えば、懸濁液および溶液の場合、
好適な担体および添加剤としては、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、着色剤な
どが挙げられる。固体の経口剤の場合、例えば、粉末、カプセル、カプレット、ジェルキ
ャップおよび錠剤の場合、好適な担体および添加剤としては、デンプン、糖、希釈剤、造
粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。鼻腔用スプレー／吸入用混合物の場合
、水溶液／水性懸濁液は、好適な担体および添加剤として、水、グリコール、油、皮膚軟
化薬、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、香味料などを含むことができる。
本発明の組成物を対象への投与に好適な任意の成分で製剤化して、投与を容易にするこ
とができ、かつ効能を高めることができ、この投与として、経口（腸内）投与および非経
口注射が挙げられるがこれらに限定されない。非経口注射としては、静脈内注射または点
滴、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射が挙げられる。本発明の組成物をその他の投
与経路用に製剤化することもでき、その他の投与経路として、経粘膜、眼内、直腸、持続
性皮下注入、舌下投与、舌下、門脈循環をバイパスする口腔粘膜から、吸入または鼻腔内
が挙げられる。
本発明の実施形態はまた、組成物を作製する方法に関する。本発明の実施形態によれば
、組成物を作製する方法は、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体
、単離核酸、ベクター、または宿主細胞を１つ以上の薬学的に許容される担体と混合する
ことを含む。当業者は、このような組成物を調製するのに使用される従来技術に精通して
いるであろう。
ＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶのｇａｇ、ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ遺伝子産物に由
来するタンパク質またはその断片）ならびにウイルスベクターなどのＨＩＶ抗原を発現す
るベクターは、ＨＩＶ感染症に対して対象にワクチン接種するための、または対象におい
てＨＩＶ感染症に対する免疫応答を引き起こすための免疫原性組成物およびワクチンにお
いて以前から使用されてきた。本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態
による免疫原性組成物が投与されることになるか、または投与されたあらゆる動物を意味
しており、好ましくは哺乳動物を意味しており、最も好ましくはヒトを意味する。用語「
哺乳動物」は本明細書で使用する場合、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例とし
て、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、好ましくはヒトが挙げられ
るが、これらに限定されない。本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質はまた、ヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導す
るための抗原として使用することができる。免疫応答は、クレードＡ、クレードＢ、クレ
ードＣなどの１種以上のＨＩＶクレードに対するものであり得る。組成物は、組換え体Ｈ
ＩＶ Ｅｎｖタンパク質が発現されるベクターを含むことができるか、または組成物は、
本発明の実施形態による単離された組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を含むことができ
る。
例えば、組換え体ＨＩＶタンパク質またはその三量体複合体を含む組成物は、それを必
要とする対象に投与されて、対象においてＨＩＶ感染症に対する免疫応答を誘導すること
ができる。アデノウイルスベクターなどの、本発明の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
をコードするベクターを含む組成物であって、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質がベク
ターによって発現される組成物はまた、それを必要とする対象に投与されて、対象におい
てＨＩＶ感染症に対する免疫応答を誘導することができる。本明細書に記載の方法はまた
、本発明の組成物を、好ましくは１種以上のベクター、例えば、アデノウイルスベクター
またはＭＶＡベクターから発現される１種以上の追加のＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶのｇ
ａｇ、ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ遺伝子産物に由来するタンパク質またはその断片）
と組み合わせて投与することを含み、免疫応答をプライムし、かつブーストする方法を含
む。
ある種の実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、任意選択により内因性および／
もしくは外因性のアジュバントと組み合わされた、リポソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ
）、ナノ粒子、ビロソーム、またはエクソソームなどの粒子上にディスプレイされ得る。
可溶性または単量体Ｅｎｖタンパク質それ自体と比較されるとき、このような粒子は通常
、インビボにおいて抗原提示の有効性の亢進を示す。
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をディスプレイするＶＬＰの例は、例えば、ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質を、ＨＩＶのＧａｇコアタンパク質または他のレトロウイルス性のＧａｇタン
パク質などの自己組織化ウイルスタンパク質と共発現することによって作製され得る。Ｖ
ＬＰはウイルスに類似しているが、それらはウイルス性の遺伝物質を含有していないため
、非感染性である。エンベロープまたはキャプシドなどのウイルス構造タンパク質の発現
は、ＶＬＰの自己組織化をもたらすことができる。ＶＬＰは当業者によく知られており、
ワクチンにおけるそれらの使用は、例えば（Ｋｕｓｈｎｉｒ ｅｔ ａｌ，２０１２）に
記載される。
ある種の好ましい実施形態では、粒子はリポソームである。リポソームは、少なくとも
１つの脂質二重層を有する球状小胞である。例えば、ＨＩＶ Ｅｎｖ三量体タンパク質は
、静電相互作用によって、例えば、ＨｉｓタグをＨＩＶ Ｅｎｖ三量体のＣ末端およびリ
ポソームにおける誘導体化された脂質の先端基に組み込まれるＮｉ２＋またはＣｏ２＋な
どの二価のキレート化原子に付加することによって、このようなリポソームに非共有結合
的に結合され得る。ある種の非限定的かつ例示的な実施形態では、リポソームは、１，２
－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、
および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［（Ｎ－（５－アミノ－１－カルボ
キシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］のニッケル塩またはコバルト塩（ＤＧＳ－Ｎ
ＴＡ（Ｎｉ２＋）またはＤＧＳ－ＮＴＡ（Ｃｏ２＋））を６０：３６：４のモル比で含む
。好ましい実施形態では、ＨＩＶ Ｅｎｖ三量体タンパク質は、リポソーム表面に、例え
ば、リポソーム表面に組み込まれたマレイミド官能基を介して、共有結合的に結合される
。そのある種の非限定的かつ例示的な実施形態では、リポソームは、ＤＳＰＣ、コレステ
ロール、および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン
－Ｎ－［４－（ｐ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－カルボキサミド］脂質を５４：
３０：１６のモル比で含む。ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、例えば、ＨＩＶ Ｅｎｖタン
パク質において付加されたＣ末端システインを介して、それに結合され得る。共有結合的
に結合されたバリアントは、より安定であり、高い抗原特異的ＩｇＧ力価を誘発し、Ｅｎ
ｖ三量体の抗原性に関連の低い「下端」のエピトープが隠されている。リポソームに結合
されたＨＩＶ Ｅｎｖ三量体を作製するための方法およびそれらの性質決定のための方法
は知られており、例えば、本明細書に参照として組み込まれる（Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ，
２０１７）に記載されている。本発明はまた、リポソームと融合され、かつ／またはリポ
ソーム上にディスプレイされる本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を提供する。
ある種の実施形態では、本発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、自己組織化粒子に融合
されるか、またはナノ粒子上にディスプレイされる。抗原ナノ粒子は、抗原、例えば、本
発明のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の複数のコピーが存在するポリペプチドの集合体であり
、複数の結合部位（アビディティー）をもたらし、抗原の安定性および免疫原性の向上を
もたらすことができる。ワクチンにおける使用のための自己組織化タンパク質ナノ粒子の
調製法および使用は、当業者によく知られており、例えば、（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，２
０１４）、（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ ｅｔ ａｌ，２０１６）を参照されたい。
非限定的な例として、自己組織化ナノ粒子は、フェリチン、バクテリオフェリチン、また
はＤＰＳに基づき得る。表面上にタンパク質をディスプレイするＤＰＳナノ粒子は、例え
ば、国際公開第２０１１／０８２０８７号パンフレットに記載される。このような粒子上
の三量体ＨＩＶ－１抗原の説明は、例えば、（Ｈｅ ｅｔ ａｌ，２０１６）に記載され
ている。他の自己組織化タンパク質ナノ粒子およびその調製法は、例えば、本明細書に参
照として組み込まれる国際公開第２０１４／１２４３０１号パンフレット、および米国特
許出願公開第２０１６／０１２２３９２号明細書に開示される。本発明はまた、自己組織
化ナノ粒子と融合され、かつ／または自己組織化ナノ粒子上にディスプレイされる本発明
のＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を提供する。本発明はまた、本発明によるＶＬＰ、リポソー
ム、または自己組織化ナノ粒子を含む組成物を提供する。
ある種の実施形態では、アジュバントは、本発明の組成物中に含まれるか、または本発
明の組成物と同時投与される。アジュバントの使用は任意選択であり、アジュバントの使
用により、組成物がワクチン接種の目的のために使用されるときに免疫応答をさらに亢進
し得る。同時投与または本発明による組成物中に含まれるのに好適なアジュバントは、好
ましくは、潜在的に安全であり、十分に許容され、かつ投与対象において効果的なもので
あるべきである。このようなアジュバントは当業者によく知られており、非限定的な例と
しては、ＱＳ－２１、Ｄｅｔｏｘ－ＰＣ、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭｏＧＭ－ＣＳＦ、Ｔｉｔｅｒ
Ｍａｘ－Ｇ、ＣＲＬ－１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊ
ｕｍｅｒ、ＰＧ－０２６、ＧＳＫ－Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ－ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ－０
２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、リン酸アルミニウム（
例えば、ＡｄｊｕＰｈｏｓ）または水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、およびＭ
Ｆ５９が挙げられる。
本発明の他の態様は、それぞれＨＩＶエンベロープコンセンサスクレードＣおよびコン
センサスクレードＢ配列を表す配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、組
換え体ＨＩＶエンベロープタンパク質に関する。これらのコンセンサス配列は、天然に存
在するいずれの配列にも見出されておらず、そのため、新規のＨＩＶエンベロープタンパ
ク質であると考えられる。配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む組換え体
ＨＩＶエンベロープタンパク質は、例えば、配列番号３または５５８位および／もしくは
５５６位にＰｒｏをさらに含む配列番号３；ならびに配列番号５または５５８位および／
もしくは５５６位にＰｒｏをさらに含む配列番号５に示されるそれらの配列においてなど
、任意選択により、いわゆるＳＯＳＩＰ変異および／またはフューリン切断部位における
変異をさらに含むことができる。これらの配列に関する％同一性を決定する際には、変異
したフューリン切断部位ならびに５０１位、６０５位、５５９位、５５６位および５５８
位のアミノ酸は、考慮されないことが好ましい。驚くべきことに、このようなタンパク質
は、高いレベルで発現され、かつ高いレベルの安定性および三量体形成を有することが見
出された。このようなＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は、ある種の実施形態において、バック
ボーンタンパク質として使用することができ、上記の変異が作製されて、本発明の分子を
得ることができる。これらの配列をコードする単離核酸分子、プロモーターに作動可能に
連結されたこれらの配列を含むベクター、および当該タンパク質、単離核酸分子またはベ
クターを含む組成物もまた、本発明によって企図される。
実施形態
実施形態１は、
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ、好ましくはＶａｌまたはＩｌ
ｅ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも２つで指定アミノ酸残基を有するＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列を含む、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、
位置のナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに
従う。
実施形態２は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列、ならびに
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ、好ましくはＶａｌまたはＩｌ
ｅ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つでの指定アミノ酸残基によるアミノ
酸置換を含む、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、
（１）例えば、（配列番号２、３、４、もしくは５）のアミノ酸配列を含む、例えば、ク
レードＣまたはクレードＢ由来のコンセンサス配列を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質；
または
（２）例えば、（ａ）配列番号６；（ｂ）１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有する
配列番号６；（ｃ）配列番号７；または（ｄ）配列番号８もしくは配列番号９）のアミノ
酸配列を含み、（ａ）、（ｂ）または（ｄ）が任意選択によりさらに、ＳＯＳＩＰ（５０
１位および６０５位のＣｙｓ、ならびに５５９位のＰｒｏ）、ならびに／またはフューリ
ン切断部位の変異（例えば、アミノ酸５０８～５１１を置換する配列番号１０）を有し得
る、合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質；または
（３）少なくとも１００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００
００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％
未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基で少なく
とも１つの矯正変異を含む、好ましくはクレードＣの、野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
であって、矯正変異が、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０
％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、矯正変
異が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在するアミノ酸残基に
よる置換である、野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質；からなる群から選択され；かつ
位置のナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに
従う。
実施形態３は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列、ならびに
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎまたはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＡｌａ、好ましくはＶａｌまたはＩｌ
ｅ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅまたはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つでの指定アミノ酸残基によるアミノ
酸置換を含む、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、
（ａ）５０１位と６０５位におけるＣｙｓ；
（ｂ）５５９位におけるＰｒｏ；
（ｃ）５０１位と６０５位におけるＣｙｓおよび５５９位におけるＰｒｏ
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、ＳＯＳＩＰ変異体ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質であり；かつ
位置のナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに
従う。
実施形態４は、（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置の少なくとも２
つで指定アミノ酸残基を含む、実施形態２の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態５は、（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置の少なくとも２
つで指定アミノ酸残基を含む、実施形態３の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態６は、５０１位と６０５位においてＣｙｓまたは５５９位においてＰｒｏ、好
ましくは、５０１位と６０５位においてＣｙｓおよび５５９位においてＰｒｏをさらに含
む、実施形態１、２および４のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態７は、（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置の少なくとも３
つで指定アミノ酸残基を含む、実施形態１～６のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタン
パク質である。
実施形態８は、（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置の少なくとも４
つで指定アミノ酸残基を含む、実施形態１～６のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタン
パク質である。
実施形態９は、（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置の少なくとも５
つで指定アミノ酸残基を含む、実施形態１～６のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタン
パク質である。
実施形態１０は、（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置の少なくとも
６つで指定アミノ酸残基を含む、実施形態１～６のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタ
ンパク質である。
実施形態１１は、（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる群から選択される指定位置の７つで指定
アミノ酸残基を含む、実施形態１～６のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質で
ある。
実施形態１２は、実施形態１、４および５のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパ
ク質であり、少なくとも２つの指定位置および残基は、６５１Ｆ、６５５Ｉ；６５１Ｆ、
５３５Ｎ；６５１Ｆ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、５８９Ｉ；６５１Ｆ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、
２０４Ｉ；６５１Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５８９Ｖ；６５５Ｉ、
５８９Ｉ；６５５Ｉ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、６４７Ｆ；５３５Ｎ、
５８９Ｖ；５３５Ｎ、５８９Ｉ；５３５Ｎ、５７３Ｆ；５３５Ｎ、２０４Ｉ；５３５Ｎ、
６４７Ｆ；５８９Ｖ、５７３Ｆ；５８９Ｖ、２０４Ｉ；５８９Ｖ、６４７Ｆ；５８９Ｉ、
５７３Ｆ；５８９Ｉ、２０４Ｉ；５８９Ｉ、６４７Ｆ；５７３Ｆ、２０４Ｉ；５７３Ｆ、
６４７Ｆ；および２０４Ｉ、６４７Ｆからなる群から選択される組み合わせである。
実施形態１３は、実施形態７の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、少なくとも
３つの指定位置および残基は、６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、５
３５Ｎ；６５１Ｆ、５８９Ｉ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、５７３Ｆ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、２
０４Ｉ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５３５Ｎ；６
５５Ｉ、５８９Ｉ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５
３５Ｎ；６５５Ｉ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；５８９Ｖ、５７３Ｆ、５３５Ｎ；５８９Ｖ、２
０４Ｉ、５３５Ｎ；５８９Ｖ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；５８９Ｉ、５７３Ｆ、５３５Ｎ；５
８９Ｉ、２０４Ｉ、５３５Ｎ；５８９Ｉ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；５７３Ｆ、２０４Ｉ、５
３５Ｎ；５７３Ｆ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；２０４Ｉ、６４７Ｆ、５３５Ｎ；６５１Ｆ、６
５５Ｉ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、５７３Ｆ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、５８９Ｖ；６
５１Ｆ、６４７Ｆ、５８９Ｖ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８９Ｖ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５
８９Ｖ；６５５Ｉ、６４７Ｆ、５８９Ｖ；５７３Ｆ、２０４Ｉ、５８９Ｖ；５７３Ｆ、６
４７Ｆ、５８９Ｖ；２０４Ｉ、６４７Ｆ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｉ；６
５１Ｆ、５７３Ｆ、５８９Ｉ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、５８９Ｉ；６５１Ｆ、６４７Ｆ、５
８９Ｉ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、５８９Ｉ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５８９Ｉ；６５５Ｉ、６
４７Ｆ、５８９Ｉ；５７３Ｆ、２０４Ｉ、５８９Ｉ；５７３Ｆ、６４７Ｆ、５８９Ｉ；２
０４Ｉ、６４７Ｆ、５８９Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、２０４Ｉ、５
７３Ｆ；６５１Ｆ、６４７Ｆ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、２０４Ｉ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、６
４７Ｆ、５７３Ｆ；２０４Ｉ、６４７Ｆ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、２０４Ｉ；６
５１Ｆ、６４７Ｆ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、６４７Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、６
４７Ｆ；６５５Ｉ、６５１Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、６５１Ｆ、５３５Ｎ；６５５Ｉ、５
８９Ｖ、５７３Ｆ；および６５５Ｉ、５８９Ｖ、２０４Ｉからなる群から選択される組み
合わせである。
実施形態１４は、実施形態８の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、少なくとも
４つの指定位置および残基は、６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ；６５１Ｆ、６
５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、５
３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ；６５１Ｆ、６
５５Ｉ、５３５Ｎ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、５
３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６
５５Ｉ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、５
３５Ｎ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、５
８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６
５５Ｉ、５３５Ｎ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５
３５Ｎ、５８９Ｖ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６
５５Ｉ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５
３５Ｎ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５
８９Ｖ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６
５５Ｉ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５
３５Ｎ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５
８９Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；５３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５
７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；５３５Ｎ、５
７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；および５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆからなる
群から選択される組み合わせである。
実施形態１５は、実施形態９の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、少なくとも
５つの指定位置および残基は、６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ；６
５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５
７３Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５１Ｆ、５
３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２
０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５
３５Ｎ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６
５１Ｆ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５
７３Ｆ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６
５５Ｉ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６
４７Ｆ；６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５
７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６
５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２
０４Ｉ、６４７Ｆ；６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；および５３５
Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆからなる群から選択される組み合わせであ
る。
実施形態１６は、実施形態１０の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり、少なくと
も６つの指定位置および残基は、６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、
２０４Ｉ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、
６５５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、
５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；６５１Ｆ、６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、
６４７Ｆ；６５１Ｆ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆ；および６５
５Ｉ、５３５Ｎ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、２０４Ｉ、６４７Ｆからなる群から選択される組
み合わせである。
実施形態１７は、
（ｖｉｉｉ）５８８位におけるＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐもしく
はＰｈｅ、好ましくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；
（ｉｘ）６４位におけるＬｙｓ、もしくは６６位におけるＡｒｇ、もしくは６４位におけ
るＬｙｓおよび６６位におけるＡｒｇの両方；
（ｘ）３１６位におけるＴｒｐ；
（ｘｉ）２０１位および４３３位の両方におけるＣｙｓ；
（ｘｉｉ）５５６位もしくは５５８位におけるＰｒｏ、もしくは５５６位および５５８位
の両方におけるＰｒｏ；
（ｘｉｉｉ）５４８～５６８アミノ酸位におけるループ（ＨＲ１ループ）の７～１０アミ
ノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば、（配列番号１２～１７）
のいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｉｖ）５６８位におけるＧｌｙ、もしくは５６９位におけるＧｌｙ、もしくは６３６
位におけるＧｌｙ、もしくは５６８位および６３６位の両方におけるＧｌｙ、もしくは５
６９位および６３６位の両方におけるＧｌｙ；ならびに／または
（ｘｖ）３０２位におけるＴｙｒ、もしくは５１９位におけるＡｒｇ、もしくは５２０位
におけるＡｒｇ、もしくは３０２位におけるＴｙｒおよび５１９位におけるＡｒｇ、もし
くは３０２位におけるＴｙｒおよび５２０位におけるＡｒｇ、もしくは３０２位における
Ｔｙｒおよび５１９位と５２０位の両方におけるＡｒｇ
からなる群から選択される指定位置の少なくとも１つでの指定アミノ酸残基によるアミノ
酸置換をさらに含む、実施形態１～１６のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
であり、
位置のナンバリングは、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに
従う。
実施形態１８は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異をさら
に含む、実施形態１～１７のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態１９は、フューリン切断部位における変異が、ＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）
による５０８～５１１位での置換である、実施形態１８の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパ
ク質である。
実施形態２０は、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０である実施形態１～１９のいずれかの組
換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態２１は、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、（ｉ）～（ｖｉｉ）からなる
群から選択される指定位置で指定アミノ酸残基の１つ以上を有しないＨＩＶ Ｅｎｖタン
パク質と比較して、三量体形成の割合の向上および三量体の収量の向上の少なくとも１つ
を有する、実施形態１～２０のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態２２は、三量体形成が多角度光散乱を伴うサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ
ＥＣ－ＭＡＬＳ）によって測定される、実施形態２１の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク
質である。
実施形態２３は、６５８位でＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、またはＬｅｕ
、好ましくはＶａｌまたはＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌから選択されるアミノ酸残基を
さらに含む、実施形態１～２２のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態２４は、
（ａ）６５５Ｉ、５８９Ｖ、５７３Ｆ、６５１Ｆ、５８８Ｅ、５３５Ｎ、２０４Ｉ；
（ｂ）５５６Ｐ、６５５Ｉ、５３５Ｎ、５７３Ｆ、５８９Ｖ、２０４Ｉ、５８８Ｑ；
（ｃ）２０４Ｉ、５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；
（ｄ）５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ；および
（ｅ）５３５Ｎ、５５６Ｐ、５８８Ｅ、５８９Ｖ、６５１Ｆ、６５５Ｉ
からなる群から選択されるアミノ酸の組み合わせを含む、実施形態１～２３のいずれかの
組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態２５は、配列番号３、５、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０
、３１、または３２のいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９
％同一または１００％同一、好ましくは、配列番号２０、２２、２４、２６、２７、２８
、２９、３０、３１、または３２のいずれか１つと少なくとも９８％同一であるアミノ酸
配列を含む、実施形態１～２４のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態２６は、実施形態１～２５のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の
うち３つの非共有結合性のオリゴマーを含む三量体複合体である。
実施形態２７は、実施形態１～２５のいずれか１つまたは実施形態２６の三量体複合体
の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をディスプレイする粒子、例えば、リポソームまた
はナノ粒子、例えば、自己組織化ナノ粒子である。
実施形態２８は、実施形態１～２５のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を
コードする単離核酸分子である。
実施形態２９は、プロモーターに作動可能に連結された実施形態２８の単離核酸分子を
含むベクターである。
実施形態３０は、アデノウイルスベクターである実施形態２９のベクターである。
実施形態３１は、実施形態２８の単離核酸分子、または実施形態２９もしくは３０のベ
クターを含む宿主細胞である。
実施形態３２は、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の産生に好適な条件下で実施形態
３１の宿主細胞を増殖させることを含む、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を作製する
方法である。
実施形態３３は、プロモーターに作動可能に連結された実施形態２８の単離核酸を含む
発現ベクターを得ることと；発現ベクターにより細胞をトランスフェクトすることと；組
換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の発現に好適な条件下でトランスフェクト細胞を増殖さ
せることと；安定化された三量体複合体の形成を可能にする条件下で組換え体ＨＩＶ Ｅ
ｎｖタンパク質を精製することとを含む、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を作製する
方法である。
実施形態３４は、バックボーンＨＩＶエンベロープタンパク質配列に（ｉ）～（ｖｉｉ
）からなる群から選択される位置で指定アミノ酸残基をもたらす少なくとも１つのアミノ
酸置換を導入することを含む、実施形態１～２５のいずれか１つによる組換え体ＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質を作製する方法である。
実施形態３５は、アミノ酸置換をコードするヌクレオチド配列がバックボーンＨＩＶエ
ンベロープタンパク質配列をコードする核酸に導入される、実施形態３４による方法であ
る。
実施形態３６は、バックボーンＨＩＶエンベロープタンパク質配列が、配列番号２；配
列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号８；配列番号９
；１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有する配列番号６；５０１位と６０５位でＣｙ
ｓ、および５５９位でＰｒｏ、ならびに／またはアミノ酸５０８～５１１を置換する配列
番号１０を有する配列番号６；１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有し、５０１位と
６０５位でＣｙｓ、および５５９位でＰｒｏ、ならびに／またはアミノ酸５０８～５１１
を置換する配列番号１０をさらに有する配列番号６；５０１位と６０５位でＣｙｓ、およ
び５５９位でＰｒｏ、ならびに／またはアミノ酸５０８～５１１を置換する配列番号１０
を有する配列番号８；５０１位と６０５位でＣｙｓ、および５５９位でＰｒｏ、ならびに
／またはアミノ酸５０８～５１１を置換する配列番号１０を有する配列番号９；ならびに
少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）、好ましくは以下の（ａ）、（ｂ）および
（ｃ）の少なくとも２つ、最も好ましくは以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）：（ａ）５
０１位と５０６位におけるＣｙｓおよび５５９位におけるＰｒｏ、
（ｂ）アミノ酸５０８～５１１を置換する配列番号１０を有し、ならびに／または
（ｃ）少なくとも１００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００
００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％
未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置において存在するアミノ酸残基での少な
くとも１つの矯正変異であって、矯正変異が、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列
のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり
、好ましくは、矯正変異が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存
在するアミノ酸残基による置換である、少なくとも１つの矯正変異をもたらす変異を有す
る野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質からなる群から選択される、実施形態３４または３５
の方法である。
実施形態３７は、実施形態１～２５のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、
実施形態２６の三量体複合体、実施形態２７の粒子、実施形態２８の単離核酸分子、実施
形態２９もしくは３０のベクター、または実施形態３１の宿主細胞、および薬学的に許容
される担体を含む組成物である。
実施形態３８は、アジュバントをさらに含む、実施形態３７の組成物である。
実施形態３９は、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、三量体複合体、粒子、単離核酸
、ベクター、または宿主細胞を１つ以上の薬学的に許容される担体と混合することを含む
、実施形態３７の組成物を作製する方法である。
実施形態４０は、実施形態１～２５のいずれか１つの組換え体ＨＩＶエンベロープタン
パク質、実施形態２６の三量体複合体、実施形態２７の粒子、または実施形態２９もしく
は３０のベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、ＨＩＶ感染症に対して対象
にワクチン接種する方法である。
実施形態４１は、実施形態１～２５のいずれか１つの組換え体ＨＩＶエンベロープタン
パク質、実施形態２６の三量体複合体、実施形態２７の粒子、または実施形態２９もしく
は３０のベクターを含む組成物を対象に投与することを含む、ＨＩＶ感染症に対する免疫
応答を、それを必要とする対象において引き起こす方法である。
実施形態４２は、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％同一な配
列を含む組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態４３は、配列番号３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％同一な配
列を含む組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態４４は、配列番号４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％同一な配
列を含む組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態４５は、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９５％同一な配
列を含む組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態４６は、実施形態４２～４５のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
をコードする単離核酸分子である。
実施形態４７は、プロモーターに作動可能に連結された実施形態４６の単離核酸分子を
含むベクターである。
実施形態４８は、アデノウイルスベクターである実施形態４７のベクターである。
実施形態４９は、実施形態４６の単離核酸分子、または実施形態４７もしくは４８のベ
クターを含む宿主細胞である。
実施形態５０は、実施形態４２～４５のいずれかの組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
、実施形態４６の単離核酸分子、実施形態４７もしくは４８のベクター、または実施形態
４９の宿主細胞、および薬学的に許容される担体を含む組成物である。
実施形態５１は、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体の割合および／または三量体の
収量（フォールディングと安定性を表す）を向上させる方法であり、この方法は、親ＨＩ
Ｖ Ｅｎｖタンパク質において少なくとも１つの矯正変異、好ましくは少なくとも３つの
矯正変異を導入することによって、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列を矯正す
ることを含み、矯正変異が、少なくとも１００、好ましくは少なくとも５００、好ましく
は少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配列の
コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で
対応する位置に見出されるアミノ酸残基でのアミノ酸置換であり、置換が、前記コレクシ
ョン中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に見出される
アミノ酸残基によるものであり、好ましくは、置換が、前記コレクション中において対応
する位置で最も高頻度に見出されるアミノ酸残基によるものである。
実施形態５２は、実施形態５１の方法であり、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配
列のうち７．５％未満の頻度で対応する位置に見出される親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に
おけるアミノ酸残基の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％が矯正される。
実施形態５３は、実施形態５１の方法であり、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配
列のうち２％未満の頻度で対応する位置に見出される親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質におけ
るアミノ酸残基の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％が矯正される。
実施形態５４は、実施形態５１～５３のいずれか１つの方法であり、親ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質はクレードＣ由来である。
実施形態５５は、実施形態５１～５４のいずれか１つの方法であり、親ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質は野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施形態５６は、実施形態５１～５４のいずれか１つの方法であり、親ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質は、以下：
（ａ）５０１位と５０６位におけるＣｙｓ、および５５９位におけるＰｒｏ；
（ｂ）例えば、アミノ酸５０８～５１１を置換する配列番号１０を有する、ＨＩＶ Ｅｎ
ｖタンパク質のフューリン切断配列における変異；
（ｃ）６５１位におけるＰｈｅ；
（ｄ）６５５位におけるＩｌｅ；
（ｅ）５３５位におけるＡｓｎ；
（ｆ）５８９位におけるＶａｌ；
（ｇ）５７３位におけるＰｈｅ；
（ｈ）２０４位におけるＩｌｅ；
（ｉ）６４７位におけるＰｈｅ；
（ｊ）６５８位におけるＶａｌ；
（ｋ）５８８位におけるＧｌｎもしくはＧｌｕ；ならびに／または
（ｌ）５５６位、５５８位、もしくは５５６位および５５８位におけるＰｒｏ
の１つ以上を含む。
実施形態５７は、実施形態５１～５６のいずれかの方法によって得ることができる組換
え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である。
実施例１：ＨＩＶエンベロープクレードＣおよびクレードＢコンセンサス配列の生成
ＨＩＶエンベロープクレードＣコンセンサス配列
ＨＩＶクレードＣエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質コンセンサス配列は、ＨＩＶ Ｅ
ｎｖタンパク質の三量体形成における様々な変異の影響を調査するためのバックボーン配
列として開発された。既知のＨＩＶウイルス単離株由来の３，４３４個のエンベロープタ
ンパク質配列の配列アラインメントを、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベース（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘ）からダウンロー
ドした。３，４３４個の配列から、クレードＣのみの１，２５２個の配列を選択して、Ｈ
ＩＶクレードＣ Ｅｎｖタンパク質コンセンサス配列を生成した。アラインメントに基づ
いてコンセンサス残基を明確に同定することができた位置で、コンセンサス配列を使用し
て、ＢＬＡＳＴ検索によって最も近い野生型配列を同定した。続いて、これらの位置のコ
ンセンサス残基を、ＢＬＡＳＴ検索から同定された最も近い野生型配列におけるアミノ酸
として選択した。ＨＩＶ ＥｎｖクレードＣコンセンサス配列を配列番号２に示す。ＢＬ
ＡＳＴを使用して配列番号２に対して最も高い相同性を有する２つの配列は、Ｇｅｎｂａ
ｎｋ番号ＡＤＭ３０３３７．１およびＡＤＭ３０３４０．１を有する配列であり、両方と
もに、配列番号２と９０％の配列同一性を有した。
ＨＩＶ ＥｎｖクレードＣコンセンサス配列はさらに、５０１位と６０５位でシステイ
ン残基、および５５９位でプロリン残基を含むいわゆるＳＯＳＩＰ変異を導入すること、
ならびに６個のアルギニン残基により残基５０８～５１１のフューリン部位を置換するこ
とによってフューリン切断部位を最適化することによって改変された。さらに、２９５位
のＶａｌがＡｓｎに変異されて（Ｖ２９５Ｎ）、ＨＩＶ株の大部分に存在し、かついくつ
かの実験に使用される特定の抗体への結合を向上させることができるＮ－結合グリコシル
化部位を作り出した。加えて、Ｃ末端を残基６６４でトランケートして、可溶性ＨＩＶ
ｇｐ１４０タンパク質をコードする配列を得た。上記の置換／改変の全ての位置は、ＨＩ
Ｖ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに関する。結果として生じる「
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ」と称されるＨＩＶ ｇｐ１４０配列を（配列番号３）に示す。Ｃ
ｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を、追加の変異、例えば、単一および二重のアミノ酸置換が導入
されるバックボーンまたは親ＨＩＶエンベロープ配列として使用して、本発明の実施形態
による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を生成した。
ＨＩＶエンベロープクレードＢコンセンサス配列
ＨＩＶ ＥｎｖクレードＢコンセンサス配列は、ＨＩＶ ＥｎｖクレードＣコンセンサ
ス配列を生成するための上記のものと同様の手順を用いて生成された。クレードＢコンセ
ンサス配列は、既知のクレードＢウイルス単離株由来の１，７０８個のクレードＢエンベ
ロープタンパク質配列を用いて生成された。ＨＩＶ ＥｎｖクレードＢコンセンサス配列
を配列番号４に示す。
ＨＩＶ ＥｎｖクレードＢコンセンサス配列はさらに、上記のようにいわゆるＳＯＳＩ
Ｐ変異を導入すること、６個のアルギニン残基によりフューリン部位を置換することによ
ってフューリン切断部位を最適化すること、および残基６６４でＣ末端をトランケートす
ることによって改変されて、可溶性ＨＩＶ ｇｐ１４０クレードＢコンセンサス配列をコ
ードする配列を得た。結果として生じる「ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ」と称されるＨＩＶ ｇ
ｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質配列を（配列番号５）に示す。
驚くべきことに、コンセンサスに基づく分子は、天然の単離株に基づく分子と比較して
発現レベルの向上を有し、さらに既に三量体形成レベルの向上を有したことが見出された
。したがって、配列番号２～５を有する分子は既に、驚くほど有利な特性を有する。
実施例２：組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の発現および精製
組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は可溶性ｇｐ１４０タンパク質として発現され、か
つ精製された。単一変異（アミノ酸置換）ならびにその組み合わせ（例えば、二重および
三重変異）をＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンコンセンサス配列に導入して、一連の組
換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質バリアントを生成した。
ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖコンストラクトおよびバリアントの生成および発現
配列番号３に示されるＨＩＶクレードＣ Ｅｎｖコンセンサス配列ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩ
ＰをコードするＤＮＡを合成し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ ０
８８５４）またはＧｅｎｅ Ａｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ、ＣＡ）でコドン最適化した。続いて、コドン最適化された配列をベクターｐｃＤ
ＮＡ２００４にクローン化して、さらなる変異を導入するためのバックボーンＨＩＶエン
ベロープ配列として使用されたＨＩＶクレードＣ ｇｐ１４０ Ｅｎｖコンストラクトを
生成した。ｐｃＤＮＡ２００４ ＨＩＶクレードＣ ｇｐ１４０ Ｅｎｖコンストラクト
上で実施される部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｃ
ｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列に変異を導入した。ＨＥＫ－Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞
またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列またはそのバリアントをコード
する９０％のｐｃＤＮＡ２００４ベクターおよびフューリンプロテアーゼをコードする１
０％のｐｃＤＮＡ２００４ベクター（フューリン－ｐｃＤＮＡ２００４）により、製造業
者の指示書に従って一過的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を３７℃およ
び１０％ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を１２５０×ｇで１０分間回転させた。その
後、０．２２μｍの真空フィルターを使用して遠心上清を滅菌濾過し、さらなる使用まで
４℃で保存した。
９６ウェル形式における発現のために、細胞を３７℃および１０％ＣＯ２で３日間培養し
た。４μＬのＯｐｔｉｍｅｍ（培養培地）を、添加された４μＬの１００ｎｇ／ｕＬ Ｄ
ＮＡおよび８ｕＬのＥｘｐｉ２９３Ｆミックス（５４ｕＬ／ｍＬ Ｏｐｔｉｍｅｍ）と混
合し、２０分間インキュベートした。その後、２００ｕＬ／ウェルのＥｘｐｉ２９３Ｆ細
胞を２．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬで添加した。培養上清を回収し、３００ｇで５分間遠心
して、細胞および細胞片を除去した。その後、０．２２μｍの真空フィルターを使用して
、遠心上清を滅菌濾過し、さらなる使用まで４℃で保存した。
ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質の精製
ｐｃＤＮＡ２００４ベクターから発現されるＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質を
、初回の精製についてはスノードロップ（Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）－レクチ
ンカラム（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、ＡＬ－１２４３）、次の工程についてはＳｕｐｅｒｄ
ｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ）を使用する２段階の精製プロトコルに従っ
て精製して、残留している夾雑物を除去した。スノードロップ（Ｇａｌａｎｔｕｓ ｎｉ
ｖａｌｉｓ）－レクチンカラムを使用する初回の工程のために、培養上清を緩衝液（４０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）で希釈し、４ｍＬ ＣＶのＴｒｉ
ｃｏｒｎ １０－５０レクチンアガロースカラムに毎分４ｍＬの速度で通過させた。その
後、カラムを４カラム容量の緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ
７．５）で洗浄し、４カラム容量の４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび１
Ｍマンノピラノシド ｐＨ７．５を用いて１．６ｍＬ／分の上向きの流れにより溶出した
が、これは、流れの方向を下向きから上向きに変えて、エンベロープタンパク質の溶出の
速度を増大させ、かつ溶出容量を減少させたことを意味している。溶出液をスピンコンセ
ントレータ（５０Ｋ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮
した。
ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質をさらに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ ｐＨ７．５をランニング緩衝液として使用してＳｐｅｒｄｅｘ２００カラムに
より精製した。カラムから溶出した２番目のピークがＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパ
ク質を含有した。このピークを含有する画分をプールし、そのピークの実体は、ウェスタ
ンブロットおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ならびに／またはＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析を使用して
ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質として確認された。精製されたＨＩＶ ｇｐ１４
０ Ｅｎｖタンパク質の濃度を、２８０ｎｍでの光学密度を測定することによって決定し
、精製されたＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質をさらなる使用まで４℃で保存した
。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング分析
発現されたＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質を含有する細胞培養上清および精製
したＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質試料を、４～１２％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ－Ｔｒ
ｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、１×ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、還
元条件下または非還元条件下にて分析し、ｉＢｌｏｔ技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）を使用してブロットした。すべての手順を、製造業者の指示書に従って実施し
た。純度分析のために、ゲルをＫｒｙｐｔｏｎ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｉタンパク
質染料（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で染色した。ウエスタンブロッティング分析のために、メンブ
レンを抗６×ヒスチジンタグ抗体（抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ）で探索した。ゲルおよびブロット
メンブレンをＯｄｙｓｓｅｙ装置（Ｌｉ－Ｃｏｒ）でスキャンし、画像をＯｄｙｓｓｅｙ
３．０ソフトウェア（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を使用して分析した。
ネガティブ染色電子顕微鏡法によるＨＩＶ Ｅｎｖ三量体形成の画像化
スノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン、その後サイズ排除
クロマトグラフィーを用いて精製されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列を有する
エンベロープタンパク質の三量体を、ネガティブ染色電子顕微鏡法（ＮＳ－ＥＭ）を使用
して画像化したが、これはＪｕｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１５（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０１５）１１２（３８）１１９４７－５２）に記載のとおりに実
施された。使用直前に三量体試料をＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．４中に
おいて０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２×１０－１ｍｂａｒの空気中において２
５ｍＡで３０秒間グロー放電されたカーボン被膜２００ Ｃｕメッシュグリッド（ＥＭＳ
ＣＦ２００－Ｃｕ）上に付着させた。その後、３μＬ液滴の希釈された三量体試料をグ
リッドに１分間アプライし、続いて濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ、ｎｏ．１または４）でブロッ
ティングした。グリッドを１分間乾燥させ、次に、３μＬの２．３％酢酸ウラニル（ＵＡ
ｃ）で６０秒間染色した。試料面で４．６８Åのピクセルサイズを得た２５，０００×の
倍率により１２０ｋｅＶで動作するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０電子顕微鏡を使用して
データを収集した。画像をＧａｔａｎ ＢＭ ｕｌｔｒａｓｃａｎにより得た。
画像（三量体が濃縮された材料の）中のほぼすべての粒子が、適切に形成された閉じた三
量体であった（データは示さず）。
実施例３：三量体の収量および三量体形成の割合に関する組換え体ＨＩＶ ｇｐ１４０
Ｅｎｖバリアントのスクリーニング
実施例２で生成される組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質バリアントを三量体形成につ
いて選別して、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列と比較して、形成される三量体の
割合を向上させ、かつ／または三量体の収量を向上させたそれらの変異を同定した。三量
体の割合および三量体の収量のハイスループットなスクリーニングを、ＡｌｐｈａＬＩＳ
Ａアッセイを使用して行って、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に対する一群の広域中
和ＨＩＶ抗体（ｂＮＡｂ）および非ｂＮＡｂの結合を評価した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッ
セイの結果を、サイズ排除クロマトグラフィーおよび多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）
によって確認した。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ分析
ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質の総発現量および実施例２に記載のように生成
されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列に導入された単一アミノ酸置換を有する２００を超える
ＨＩＶ ｇｐ１４０バリアントの適切にフォールディングされた天然の三量体の総量を、
細胞培養上清においてＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定した。二重変異および三
重変異を含有するＨＩＶ ｇｐ１４０バリアントもまた試験された。いずれの追加の変異
も有しないＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を、比較のため
に試験した。
特に、次のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分析のために使用した：ｍＡｂ ＰＧＴ１
４５、ｍＡｂ ＰＧＤＭ１４００、ｍＡｂ ＰＧ１６、ｍＡｂ ＰＧＴ１５１、ｍＡｂ
３５Ｏ２２、ｍＡｂ ＰＧＴ１２８、ｍＡｂ ＰＧ９、ｍＡｂ Ｆ１０５、ｍＡｂ Ｂ６
、ｍＡｂ ４４７－５２ｄ、ｍＡｂ １４ｅ、およびｍＡｂ １７ｂ。ＭＡｂ ４４７－
５２Ｄ（ＡＢ０１４）、ＰＧ９（ＡＢ０１５）およびＰＧ１６（ＡＢ０１６）をＰｏｌｙ
ｍｕｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｆｏｒｓｃｈｕｎ
ｇ ＧｍｂＨ（Ｋｌｏｓｔｅｒｎｅｕｂｕｒｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）から購入した。非中和
抗体ｂ６をＤｅｎｎｉｓ Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から入手し、非中和抗体１４ｅをＪａ
ｍｅｓ Ｅ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（Ｔｕｌａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ Ｏｒｌ
ｅａｎｓ、ＬＡ）から入手した。ｍＡｂ ＰＧＴ１４５（ＰＤＢ：３Ｕ１Ｓ）、ＰＧＤＭ
１４００（ＰＤＢ：４ＲＱＱ）、ＰＧＴ１５１（ＰＤＢ：４ＮＵＧ）、３５Ｏ２２（ＰＤ
Ｂ：４ＴＶＰ）、Ｆ１０５（ＰＤＢ：１Ｕ６Ａ）、ＰＧＴ１２８（ＰＤＢ：３ＴＹＧ）、
および１７ｂ（ＰＤＢ：４ＲＱＳ）に関して、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の評価のために
、公開されている配列をコードする核酸を発現ベクターにクローン化し、生成した。ｍＡ
ｂ Ｆ１０５、Ｂ６、４４７－５２ｄ、１４ｅ、および１７ｂを除いて、分析のために使
用される抗体は広域中和抗体（ｂＮＡｂ）である。ｂＮＡｂは、複数のＨＩＶウイルス株
を中和することができる。ｂＮＡｂのうちＰＧＴ１４５、ＰＧＤＭ１４００、およびＰＧ
１６は、尖部に結合するものであり、三量体に特異的である。ＰＧＴ１５１もまた三量体
に特異的であるが、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の２つのプロトマーの界面で結合し、切断
に依存する。非ｂＮＡｂの結合は、不適切なフォールディングまたは開いた三量体高次構
造を示している。
タンパク質のフォールディングはまた、ＣＤ４の結合後にのみ露出されるＨＩＶエンベ
ロープタンパク質の共受容体結合部位に結合することが知られる抗体（ｍＡｂ １７ｂ）
への可溶性ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質バリアントの結合を測定することによ
って試験した（データは示さず）。具体的には、可溶性受容体ＣＤ４（ｓＣＤ４）を、ｍ
Ａｂ １７と組み合わせて使用して、ＣＤ４に誘導される高次構造変化を評価した。事前
にＣＤ４のエンベロープタンパク質への結合のない状態でのｍＡｂ １７ｂのＨＩＶ ｇ
ｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質バリアントへの結合は、部分的にフォールディングされてい
ないか、または事前に作動したエンベロープタンパク質（すなわち、ＣＤ４結合がない状
態で「開」高次構造の形をとる不安定なＥｎｖ）の指標となる。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイのために、リンカー、続いてソルターゼＡタグ、続いてＦ
ｌａｇタグ、続いて可動性の（Ｇ４Ｓ）７リンカー、最後にＨｉｓタグを含有するｐｃＤ
ＮＡ２００４ベクター中のＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖコンストラクトを作製した（ＨＩ
Ｖ Ｅｎｖタンパク質のＣ末端に置かれたタグの配列は、配列番号１９において提供され
る）。ＨＩＶ ｇｐ１４０ ＥｎｖコンストラクトをＨＥＫ－Ｅｘｐｉ２９３細胞中に発
現させ、これを９６ウェルプレート（２００μＬ／ウェル）中で３日間培養した。未精製
の上清を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０＋０．５ｍ
ｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１２０倍希釈した。ｍＡｂ １７ｂに基づくアッセイのために、上
清を１２倍希釈した。続いて、１０μＬの各希釈物を９６ウェルプレートに移し、４０μ
Ｌのアクセプタービーズ、ドナービーズ、および上に列記されたｍＡｂの１つと混合した
。ドナービーズを、ｍＡｂに結合するＰｒｏｔＡ（カタログ番号：ＡＳ１０２Ｍ、ロット
番号１８３１８２９、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートした。アクセプター
ビーズを、コンストラクトのＨｉｓタグに結合する抗Ｈｉｓ抗体（カタログ番号：ＡＬ１
２８Ｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にコンジュゲートした。エンベロープタンパク質の
全ての形態を含む総タンパク質の収量の定量化のために、Ｈｉｓタグ検出用のニッケルコ
ンジュゲートドナービーズ（カタログ番号：ＡＳ１０１Ｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
とＦｌａｇタグ検出用の抗Ｆｌａｇ抗体コンジュゲートアクセプタービーズ（カタログ番
号：ＡＬ１１２Ｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）とを合わせた組み合わせを使用した。ｓ
ＣＤ４－Ｈｉｓと組み合わせてｍＡｂ １７ｂを使用する試験のために、ＰｒｏｔＡドナ
ービーズおよび抗Ｆｌａｇアクセプタービーズの組み合わせを使用した（データは示さず
）。１つの試料をドナービーズおよびアクセプタービーズと混合して三量体形成を検出し
、同じＥｎｖバリアントの２つ目の試料をニッケルコンジュゲートドナービーズおよび抗
Ｆｌａｇコンジュゲートアクセプタービーズと混合して、発現されたタンパク質の総量（
すなわち、総タンパク質の収量）を測定した。
発現されたＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質を含有する上清、ｍＡｂ、ドナービ
ーズおよびアクセプタービーズの混合物を、室温で振盪することなく２時間インキュベー
トした。その後、化学発光シグナルをＳｙｎｅｒｇｙ ＮＥＯプレートリーダー装置（Ｂ
ｉｏＴｅｋ）により測定した。偽トランスフェクション細胞に起因する平均のバックグラ
ウンドシグナルを、各ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖバリアントについて測定されたＡｌｐ
ｈａＬＩＳＡのカウントから差し引いた。続いて、全データセットを、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳ
ＩＰバックボーン配列シグナルを有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質について測定されたシ
グナルで割って、試験されたＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖバリアントの各々についてのシ
グナルをバックボーンに対して正規化した。ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖバリアントの各
々の三量体に特異的なｍＡｂ ＰＧＴ１４５への結合データを使用して、バリアントの各
々についての三量体形成の割合および三量体の収量を決定した。他のｍＡｂへの結合を使
用して、ＨＩＶ ＥｎｖバリアントのｂＮＡｂおよび非ｂＮＡｂへの一般的な結合パター
ンを評価した（示さず）。
ＨＩＶ Ｅｎｖバリアントの各々に関する三量体形成の割合は、ＨＩＶ Ｅｎｖバリア
ント、ｍＡｂ ＰＧＴ１４５、ＰｒｏｔＡコンジュゲートドナービーズおよび抗Ｈｉｓコ
ンジュゲートアクセプタービーズの試料混合物から得られる正規化された化学発光シグナ
ルを、ＨＩＶ Ｅｎｖバリアント、抗Ｈｉｓコンジュゲートドナービーズおよび抗Ｆｌａ
ｇコンジュゲートアクセプタービーズの試料混合物から得られる正規化された化学発光シ
グナルで割ることにより計算された。
ＨＩＶ Ｅｎｖバリアントの各々に関する三量体の収量は、いずれの追加の変異も有し
ないＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に関する
三量体の収量に対して決定された。ｍＡｂ ＰＧＴ１４５のＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベ
ロープタンパク質への結合から得られる正規化された化学発光シグナルを１に設定し、ｍ
Ａｂ ＰＧＴ１４５のＨＩＶ ｇｐ１４０タンパク質の各々への結合から得られる正規化
された化学発光シグナルをこの値に対して正規化した。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ分析の結果－三量体の割合および三量体の収量
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列における上の表１の（ｉ）～（ｖｉｉ）のリス
ト由来のいくつかの単一、二重および三重アミノ酸置換についてのＡｌｐｈａＬＩＳＡア
ッセイによって決定された三量体形成の割合を図２Ａに示す。試験された単一アミノ酸置
換を含有する約２００個のＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖバリアントの中で、任意の追加の
アミノ酸置換を有しないＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列に対して形成された三量
体の割合と比較して、形成された三量体の割合を少なくとも２５％増加させた７つの置換
位置が同定された。
図２Ａに示される結果は、三量体形成の割合において有意な増加が観察された７つの好
ましい置換位置として、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに
従ってＮ６５１、Ｋ６５５、Ｉ５３５、Ｄ５８９、Ｉ５７３、Ａ２０４およびＥ６４７を
含むことを実証している。具体的には、三量体形成の割合を最も向上させた単一アミノ酸
置換としては、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ（／Ｆ／Ｗ）（Ｋ６５５Ｆが向上をもたらさない
ように見えた実験も１つ存在した）、Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ（／Ａ）、Ｉ５７３Ｆ、Ａ
２０４Ｉ、Ｅ６４７Ｆを含んだ。これらの変異のいくつかと組み合わせて試験された一部
の変異は、Ｋ５８８Ｑ／Ｅ、Ｉ５５６ＰおよびＡ５５８Ｐを含み、これらはさらに、本実
験において本発明の位置（表１の（ｉ）～（ｖｉｉ））で好ましいアミノ酸を有する変異
体の三量体の割合を向上させた。
本実験において試験された全ての二重置換は、対応する単一置換よりも高い割合の三量
体形成を有し、試験された全ての三重置換は、対応する単一変異および二重変異よりも高
い割合の三量体形成を有した（図２Ａ）。予想外かつ驚くべきこれらの結果は、これらの
変異が、エンベロープタンパク質の三量体形成に関するこれらの実験において相乗効果の
形を表すことができたことを示す。
三量体形成の割合の向上に加えて、三量体の収量の増加もまた望ましい。そこで、Ｃｏ
ｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーン配列において単一変異、二重変異および三重変異を含有す
るＨＩＶ ｇｐ１４０バリアントの三量体の収量もまた、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイに
よって決定された。結果を図２Ｂに示す。単一変異（例外はＩ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ａおよ
びＤ５８９Ｉであった）を含有する大部分のＨＩＶ ｇｐ１４０バリアントは、ＣｏｎＣ
＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質よりも高い三量体の収量を有した。しかしながら、
後述のようにＩ５３５Ｎ変異体のより正確なＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は三量体の収量の増加
を示した。さらに、Ｉ５３５Ｎと組み合わせたＤ５８９Ｖなどの追加の変異は、Ｉ５３５
Ｎ変位の存在しない場合にその特定の追加の置換を有するエンベロープタンパク質に関し
て観察された三量体の収量と同じであった。二重変異を有するバリアントの三量体の収量
もまた増加し、この場合、単一変異バリアントの各々は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロ
ープタンパク質よりも高い三量体の収量を有した（図２Ｂ）。
（Ｄｅ Ｔａｅｙｅ ｅｔ ａｌ．、上記）によって記載されたＥ６４Ｋ、Ｔ３１６Ｗ
二重置換、および（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．、上記）によって記載されたジスルフィド二
重置換Ｉ２０４Ｃ、Ａ４３３Ｃを含む、文献において以前に記載されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳ
ＩＰバックボーンにおいて二重変異を有するＨＩＶ ｇｐ１４０バリアントに関する三量
体形成の割合もまた試験された。Ｅ６４Ｋ、Ｔ３１６Ｗ二重置換は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩ
Ｐエンベロープタンパク質よりも低い三量体形成の割合（すなわち、１５％）をもたらし
た（データは示さず）。ジスルフィド二重置換Ｉ２０４Ｃ、Ａ４３３Ｃは三量体の割合を
４３％に増加させたが（データは示さず）、Ｉ５３５Ｎ／Ｋ５８８Ｅ、Ｋ５８８Ｑ／Ｄ５
８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉ／Ｋ５８８Ｅ、Ｉ５３５Ｎ／Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５３５Ｎ／Ｅ６４７Ｆ、
Ｄ５８９Ｖ／Ｋ６５５Ｉ、およびＩ５３５Ｎ／Ｋ６５５Ｉ（図２Ａ）などの本明細書に記
載の新規の二重置換は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ実験において、さらに高い三量体形成の割合
をもたらした。
追加の変異（残基５５８および／または５５６におけるプロリン）もまたＣｏｎＣ＿Ｓ
ＯＳＩＰバックボーンに導入され、三量体形成の割合および三量体の収量がこれらのＨＩ
Ｖ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質に関して測定された。ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボ
ーン中にすでに含有されたＳＯＳＩＰ変異（すなわち、５０１位および６０５位における
Ｃｙｓ、ならびに５５９位におけるＰｒｏ）に加えて、５５８位または５５６位における
Ｐｒｏの単一置換と、５５６位および５５８位の両方におけるプロリンの二重置換の両方
が、三量体形成の割合および三量体の収量を増加させた（データは示さず）。実際に、５
５８位および／または５５６位にＰｒｏ残基をさらに含むＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボ
ーンにおける本発明の新規のアミノ酸安定化置換の１つ以上の導入がさらに、三量体形成
の割合および／または三量体の収量を向上させた（例えば、図２Ａ、例えば、Ａ５５８Ｐ
／Ｉ５３５Ｎ、Ｋ６５５Ｉ／Ｌ５５６Ｐ、およびＡ５５８Ｐ変異を含むいくつかの三重変
異体）。
ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖバリアントの他のｂＮＡｂおよび非ｂＮＡｂへの結合デー
タは、図２Ａおよび２Ｂに列記されるものなど、三量体の収量および三量体形成の割合を
増加させた試験された単一変異、二重変異および三重変異の大部分がまた、ＣｏｎＣ＿Ｓ
ＯＳＩＰバックボーン配列を有するＨＩＶエンベロープタンパク質についてｂＮＡｂおよ
び非ｂＮＡｂへの観察された結合の量と比較して、増加したｂＮＡｂへの結合を有し、か
つ同じであるかまたは減少した非ＮＡｂへの結合を有したことを実証した（データは示さ
ず）。ワクチン開発のためには、ｂＮＡｂへの結合が増加し、かつ非ｂＮＡｂへの結合が
減少することが好ましい。したがって、このデータは、上の表１に示される位置（ｉ）～
（ｖｉｉ）でアミノ酸置換を含むＨＩＶエンベロープタンパク質が、広域中和抗体および
非広域中和抗体に対する結合パターンに関して望ましい特性を有することを実証している
。
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析も使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを使用して選別された
ＨＩＶ ｇｐ１４０バリアントに関する三量体の収量および三量体形成の割合を確かめた
。ＨＩＶ ｇｐ１４０バリアントを３０ｍＬ規模の培養液中で発現させ、Ｐｏｌｙｐｒｅ
ｐ自然落下カラム（Ｂｉｏｒａｄ カタログ番号７３１－１５５０）中の２００μｌのス
ノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）レクチンビーズ（Ｖｅｃｔｏｒｌ
ａｂ カタログ番号ＡＬ－１２４３）上に無細胞上清をアプライすることによって精製し
た。ビーズを２ｍｌの結合緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７
．４）で洗浄した。２５０～５００μｌの４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、
１Ｍマンノピラノシド ｐＨ７．４を使用して、タンパク質を溶出した。ＳＥＣ－ＭＡＬ
Ｓ実験を実施するために、高速液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＯｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ）
と連結したＭｉｎｉＤＡＷＮ ＴＲＥＯＳ装置（Ｗｙａｔｔ）を使用した。全体で１００
μｌのレクチン溶出または約３０μｇのタンパク質のいずれかを、ランニング緩衝液（１
５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で１ｍＬ／分にて平衡
化したＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
）にアプライした。データをＡｓｔｒａ ６ソフトウェアパッケージを使用して分析し、
分子量計算値を屈折率シグナルから導出した。
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質および単一変異を含有するＨＩＶ ｇｐ
１４０バリアントのＳＥＣ－ＭＡＬＳクロマトグラムを図３に示す。概して、ＳＥＣ－Ｍ
ＡＬＳ分析から得られた結果は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ分析から得られた結果と同等であり
、かつ一致した。ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質のクロマトグラムは、４
つの主要なピークを有し、約７．３分で溶出された２番目のピークが三量体のピークであ
る。ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質は、約２７％が三量体であると決定さ
れた。凝集体および単量体の形成は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰコンセンサス配列を有するＨ
ＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク質に関連する多少のミスフォールディングおよび不安
定性があることを示している。図３に示されるクロマトグラムによって実証されるように
、全ての単一置換において、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質の三量体ピー
クと比較して、相対的に高い三量体ピークが得られ、これは、三量体の収量がＨＩＶ ｇ
ｐ１４０バリアントの各々について増加したことを示している。
まとめると、これらの結果は、本明細書の表１の（ｉ）～（ｖｉｉ）において同定され
るアミノ酸置換が、三量体形成の割合の向上および／または三量体の収量の向上を有する
組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をもたらすことを実証している。具体的には、同定さ
れた変異の２つ以上の組み合わせなど、表１の（ｉ）～（ｖｉｉ）の同定された位置で複
数の置換を有するＨＩＶ Ｅｎｖバリアントは、典型的には、単一の変異のみを有するＨ
ＩＶ Ｅｎｖタンパク質と比較して、三量体の収量および／または三量体形成の割合につ
いてよりいっそうの向上を示したが、このことは、表１の（ｉ）～（ｖｉｉ）の組み合わ
せ変異の実現可能な相乗効果を示している。発明者らの知識の範囲内では、アミノ酸置換
のこれらの組み合わせは、天然に存在するＨＩＶエンベロープタンパク質配列においては
報告されておらず、全ての組み合わせ（（ｉ）～（ｖｉｉ）の間での）は、したがって、
三量体安定化変異の新規の組み合わせであると考えられる。本発明の組換え体ＨＩＶエン
ベロープタンパク質などの、三量体形成の割合の増加を有するＨＩＶエンベロープタンパ
ク質は、精製および不所望の非天然の高次構造において調製物中に存在するエンベロープ
タンパク質の除去を要求されることが少なくなるため、ワクチン用など、製造の観点から
も有利である。また、三量体の全体の発現収量の増加は、ワクチン製品の製造に関して有
利である。
実施例４：三量体ＨＩＶエンベロープタンパク質の安定性
本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の熱安定性を、Ａｌｐｈａ
ＬＩＳＡおよび示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって試験した。
ＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用した熱安定性測定
三量体に特異的なｍＡｂ ＰＧＴ１４５に対する結合に基づいて、熱処理後の完全な三
量体の消失を測定することによって、熱安定性を試験した。未精製の上清（２０μｌ）を
６０℃で１時間加熱した。次に、試料を最大速度で５分間遠心分離して、凝集体を除去し
た。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを、実施例３において上述のように実施した。
結果を図４に示し、データを、熱処理後に完全なままの三量体の割合として報告する。
結果から、試験された本発明の単一変異体組換え体ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖタンパク
質の大部分が、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質よりも高い熱安定性を有し
たという見方ができる。本明細書で同定された三量体を安定化する二重置換および三重置
換を有する試験されたＨＩＶエンベロープタンパク質はまた、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエン
ベロープタンパク質よりも高い熱安定性を有することが見出された。
ＤＳＣを使用した熱安定性測定
ＨＩＶ ｇｐ１４０ Ｅｎｖバリアントの融解温度（Ｔｍ）を、ＭｉｃｒｏＣａｌキャ
ピラリーＤＳＣシステムを使用するＤＳＣによって決定した。各測定をスキャン速度１０
０℃／時間で開始温度２０℃および最終温度１１０℃を用いて実施した。０．５ｍｇ／ｍ
Ｌの濃度を有するタンパク質試料（４００μＬ）を各測定のために使用した。データをＯ
ｒｉｇｉｎ Ｊ．ソフトウェア（ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ分析ツール）を使用して分析し
た。
ＤＳＣを使用して測定されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質の融解温度
（Ｔｍ）は６９．８℃であると決定され、融解の開始温度は６０．１℃であった。Ｃｏｎ
Ｃ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質について測定されたＴｍは、６７．０℃のＴｍを
有すると報告された（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ、２０１５）ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰエンベ
ロープタンパク質（いわゆるＳＯＳＩＰ変異を有するＢＧ５０５ウイルス単離株のＨＩＶ
エンベロープタンパク質）についてのものよりも高かった。これは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩ
Ｐバックボーン配列を有するＨＩＶエンベロープタンパク質が、三量体安定化変異を有す
る別の既知のＨＩＶエンベロープ配列よりも、熱安定性に関してより有利な特性を有する
ことを示している。
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰのＫ６５５Ｉ変異体のＴｍは７２．３℃であると測定され、融解
の開始温度は６３．７℃であり、これは、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質
のＴｍよりもさらに高い。ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰのＡ５５８Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ
変異体のＴｍは７７．２９℃であると測定され、開始温度は７４．８７℃であった。した
がって、ＤＳＣの結果は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって決定された熱安定性の結
果を確証する。
まとめると、これらの結果は、本明細書に記載のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、典型的には、このような変異を欠くエンベロープタンパク
質よりも高い熱安定性を有することを実証している。これらの結果はまた、全ての二重置
換ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質バリアントが、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク
質よりも高い熱安定性を有したことを実証している。三重置換ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
バリアントも、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質よりも安定であった。
実施例５：クレードＢエンベロープタンパク質コンセンサス配列に基づく組換え体ＨＩＶ
エンベロープタンパク質バリアント
クレードＢコンセンサス配列ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号５）に導入される単一ア
ミノ酸置換（Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１ＦまたはＫ６５５Ｉ）を含む本発明の実
施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、実施例２に記載のように生成され、
精製された。三量体の収量および三量体形成の割合を、実施例３に記載のようにＡｌｐｈ
ａＬＩＳＡアッセイによって測定した。
結果を図５Ａ（三量体形成の割合）および図５Ｂ（三量体の収量）に示す。報告された
値は、三量体形成の割合および三量体の収量の両方に関して１に設定したＣｏｎＢ＿ＳＯ
ＳＩＰエンベロープタンパク質について測定された値に対するものである。これらの結果
は、試験された変異の全てが、三量体形成の割合を増加させたことを示す。三量体の収量
は、試験された変異の全てについて、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰエンベロープタンパク質と比
較してほとんど同じであるか、または向上した。
これらの結果は、これらの変異もまた、異なるバックボーンＨＩＶエンベロープタンパ
ク質配列、この場合、クレードＢに由来したコンセンサス配列に導入された際に、エンベ
ロープタンパク質に対する安定化効果、例えば、三量体の収量の向上、三量体形成の割合
の向上などを有したことを実証している。
実施例６：合成エンベロープタンパク質配列に基づく組換え体ＨＩＶエンベロープタンパ
ク質バリアント
配列番号７に示される配列を有する合成ＨＩＶエンベロープタンパク質（「ＤＳ＿ｓＣ
４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒ」と命名される）に導入されるアミノ酸置換を含む本発明の
実施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、実施例２に記載のように作製され
、精製された。合成ＨＩＶエンベロープタンパク質ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６
Ｒは、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（残基５０１および６０５におけるＣｙｓ、残基５５９に
おけるＰｒｏ）、ジスルフィド（ＤＳ）結合の導入をもたらす残基２０１および４３３に
おけるＣｙｓ、ならびに尖部を安定化する１６６位におけるＡｒｇを有する。加えて、こ
のタンパク質は６５５位でトランケートされる。三量体形成の割合および三量体の収量を
、実施例３に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって測定した。
結果を図６に示すが、これは、試験されたバリアントの各々についての三量体形成の割
合を、ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒバックボーンについての三量体形成の割合
（図６Ａ）および三量体の収量（図６Ｂ）と比較している。バックボーン配列と比較して
、試験されたバリアントの各々ついては、三量体形成の割合がより多いことが観察された
。
Ｅ１６６Ｒの他に、いくつかの他のまれに存在するアミノ酸を、野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ
タンパク質のコレクションにおける対応する位置でより優勢なものに変化させて（Ａ１１
４Ｑ、Ｅ１１７Ｋ、Ｔ３７５ＳおよびＩ４３４Ｍ）、後述の実施例１２および図１２にお
いてより詳細に説明されるフレームワークに従ってタンパク質を「矯正」した。この「矯
正された」タンパク質では、安定化変異であるＡ２０４ＩおよびＫ６５５Ｉが、ｓＣ４＿
ＳＯＳＩＰをさらにいっそう向上させる（図１３）。
本実施例の結果は、本明細書に記載の変異はまた、異なるバックボーンＨＩＶエンベロ
ープタンパク質配列、この場合、非コンセンサス、合成、Ｅｎｖ配列に導入される際に、
エンベロープタンパク質に対する安定化効果、例えば、三量体形成の割合の向上および／
または三量体の収量の向上を有することを実証していることにおいて、実施例５の結果と
一致する。
実施例７：ＨＩＶ Ｅｎｖ変異のさらなる組み合わせ
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３に示される配列を有する）に導入されるアミノ酸置
換を含む本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、実施例２に記載
のように作製され、精製された。三量体形成の割合を、実施例３に記載のようにＡｌｐｈ
ａＬＩＳＡアッセイによって測定した。その後、組み合わせのうちより少数の選択物（斜
体で下に表されるもの、および加えてＫ６５５Ｉ；Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ；Ｉ５３５Ｎ
、Ｋ６５５Ｉ；Ｄ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉ）を、実施例３に記載のようにスノードロップ（
Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）レクチンを使用して精製し、三量体含量をＳＥＣ
－ＭＡＬＳを使用して分析した。実施例４に記載のように安定性を測定した。
ＳＯＳ変異が除去されている以下の変異体を本実験のために作製した：
Ｋ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ、Ｅ６４７Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ、Ｅ６４７Ｆ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｋ５８８Ｅ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ５８８Ｅ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｉ５３５Ｎ、Ａ２０４
Ｉ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５３５Ｎ、Ｌ５５６Ｐ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、Ｌ５５６Ｐ；
Ｋ６５５Ｉ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４
Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４
Ｉ、Ｋ５８８Ｑ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４
Ｉ、Ｋ５８８Ｑ、Ｅ６４７Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８
Ｑ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８
Ｑ、Ｅ６４７Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８
Ｑ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８
Ｑ、Ｅ６４７Ｆ；
Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８
Ｑ。
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンにおける置換の試験された全ての組み合わせが、Ａ
ｌｐｈａＬＩＳＡにおいてバックボーンと比較して、より高い三量体の割合、より高い三
量体の収量、および６０℃でのより高い三量体の安定性を示した（データは示さず）。Ｓ
ＥＣ＿ＭＡＬＳは、バックボーンにおける試験された全ての変異に関する三量体の割合の
向上を確証した（データは示さず）。
１つずつの追加の変異を９つの変異まで含むセットに関して、ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、Ｓ
ＥＣグラフ（図７）において単量体ピークの高さは低くなったが、一方で三量体ピークの
高さは同一のまま推移したため、各々の次の変異を導入するごとに三量体／単量体の比率
が増加したことを示した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳにおいて試験された全てのバリアントのうち
、Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０
４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ、Ｅ６４７Ｆ置換を有するバリアントは、最も高い三量体の割合（最少
のｇｐ１４０単量体および最少のｇｐ１２０単量体）、最も高い総タンパク質収量、およ
び高温安定性の１種を示した。これは、これらの変異がバックボーンと比較して三量体を
消失することなく組み合わされ得ることを意味している。加えて、これは、概して、任意
選択により表２に記載の変異と組み合わされる表１の（ｉ）～（ｖｉｉ）に記載の変異の
追加が、三量体形成のさらなる向上をもたらすことを示唆している。
「ＳＯＳ変異」が除去された（すなわち、５０１位および６０５位における２つのシス
テイン残基が、コンセンサスクレードＣ配列において本来存在したアミノ酸残基に復帰し
た）Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５
８８Ｑ変異を有するコンストラクトも試験された。その温度安定性は低いものの、この変
異体は、ＳＯＳ変異を含んだ対応する変異体と同等の三量体の割合および収量を有した。
ＳＯＳ変異が除去された変異体はさらに、その対応するＳＯＳを含有する対応物（Ｌ５５
６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ変異
を有する）よりも少ない非ｂＮＡｂに結合したという点で利点を有した。これは、高い三
量体形成の割合などの本発明の有利な特性を、全てのＳＯＳＩＰ変異を有しないＨＩＶ
Ｅｎｖタンパク質においても得ることができることを実証している。
発現レベル、三量体形成および広域中和抗体ＰＧＴ１５１への結合における好ましい特
性の組み合わせに基づいて、１つの変異体（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンにおいて
試験される）は次の変異を有する：Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、
Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ。
ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックグラウンドにおいて、９つの最も好結果の置換は、ｇｐ４
１におけるＬ５５６Ｐ、Ｅ６４７Ｆ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ
、Ｉ５７３Ｆ、およびＫ５８８Ｅ、ならびにｇｐ１２０におけるＡ２０４Ｉであった。こ
れらの９つの全ての置換の組み合わせが、安定性、三量体含量および三量体の収量の増大
に至った。９つの置換を有するこのバリアントにおいてＬ５５６Ｐの追加が三量体の割合
の向上に比較的限定的な効果を有し、かつこの状況におけるＥ６４７Ｆ置換がＰＧＴ１５
１結合を妨害しているように見えたため、これらの２つの変異は、さらなるバリアントに
おいていつも使用されるとは限らず、かつ７つの置換を有するバリアント（ＣｏｎＣ＿Ｓ
ＯＳＩＰ＿７ｍｕｔと命名される、本明細書では「安定化ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ」または
「ＣｏｎＣ＿ｂａｓｅ」と称される場合もあり；Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、
Ｄ５８９Ｖ、Ｉ５７３Ｆ、Ｋ５８８Ｅ、およびＡ２０４Ｉを含む）は、上に示される９つ
の置換を有するバリアントよりもわずかにより安定（融解温度の上昇）であったことが見
出された。このバリアントの完全な配列（安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ、
ＨＩＶ１６０５４４）は配列番号２０において提供される。
この時点で、特定の好ましい変異体［以下の追加の変異を有するＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ
バックボーンにおいて試験される：（ａ）Ｄ２７９Ｎ、Ａ２８１Ｖ、Ａ３６２Ｑ（他の人
たちによって記載されるように、感染初期ウイルスとの類似性を増大させる）；（ｂ）Ｄ
ｅｌ１３９－１５２（抗体を可変ループに誘導する確率を減少させるための可変ループの
欠失）；（ｃ）Ｖ２９５Ｎ（ＨＩＶ株の大部分に存在するグリカン部位の導入）］は、発
現レベル、三量体形成および広域中和抗体への結合における好ましい特性の組み合わせに
基づいて、以下の本発明の安定化変異を有する：Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、
Ｉ５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｅ。このバリアントの完全な配列（安定
化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ３ Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７０６５４、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳ
ＩＰ．ｖ３））は配列番号２８において提供される。
さらなるバリアントにおいて、Ｋ６５８Ｖ変異をこのコンストラクトに追加し（下の実
施例１５も参照のこと）、結果をさらに向上させた。
実施例８：安定化されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をディスプレイする自己組織化粒子
（Ｈｅ ｅｔ ａｌ、２０１６）の記載と同様にして安定化されたＥｎｖタンパク質を
ディスプレイするフェリチンおよびＤＰＳ自己組織化粒子を作製した。これを行うために
、ｇｐ１４０タンパク質は、短いアミノ酸リンカー（例えば、ＧＳＧまたはＡＡＡＧＳで
あるが、他のリンカーも使用することができ、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ、２０１６を参
照のこと）を介してＤＮＡレベルで粒子のＮ末端に融合され、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にお
いて融合タンパク質を発現した。このようにして作製された粒子の一例は、ＣｏｎＣ＿Ｓ
ＯＳＩＰ（配列番号３）ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質に融合したフェリチンに基づき、次の
変異を有した：Ｉ５３５Ｎ、Ａ５５８Ｐ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ６５５Ｉ。三量体形成を向上さ
せると報告された（Ｋｅｓａｖａｒｄｈａｎａ ｅｔ ａｌ、２０１４）追加のＶ５７０
Ｄ変異を有するこのＥｎｖタンパク質を伴うフェリチン粒子も作製したが、この変異は、
不所望である非中和抗体（１７ｂ）の結合の著しい増加をもたらすことが観察された。こ
れらの５つの変異を有するＥｎｖはまた、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃ
ｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）およびマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に由来する２種類のＤＰＳ粒子に融合された（ＤＰＳ粒
子の作製については、例えば、国際公開第２０１１／０８２０８７号パンフレットを参照
のこと）。これらの５つの変異および加えてジスルフィド架橋を導入する二重変異Ｉ２０
１Ｃ－Ａ４３３Ｃを有するＥｎｖもフェリチンに融合された。
粒子をＰＧＤＭ１４０親和性ビーズにより無細胞上清から精製し、その粒子をＴＳＫｇ
ｅｌ Ｇ６０００ＰＷＣＬカラムを用いるＳＥＣ－ＭＡＬＳを使用して分析した。ＳＥＣ
－ＭＡＬＳおよび未変性ＰＡＧＥ（３～１２％）により、ほぼ予想された寸法を有する粒
子が形成されたことを確認した。
類似の方法で、以下の変異の組み合わせ：（Ｌ５５６Ｐ、Ｎ６５１Ｆ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ
５７３Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４Ｉ、Ｋ５８８Ｑ）を有するＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ配列を
有するＨＩＶ ＥｎｖをディスプレイするフェリチンおよびＤＰＳ自己組織化ナノ粒子も
作製する。
さらに、本明細書に記載の他のＨＩＶ Ｅｎｖバリアント、例えば、配列番号２０、２
２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２を有するＨＩＶ Ｅｎｖをデ
ィスプレイするリポソームおよび／または自己組織化ナノ粒子も作製する。
実施例９：クレードＡエンベロープタンパク質配列に基づく組換え体ＨＩＶエンベロープ
タンパク質バリアント
単一アミノ酸置換（Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１Ｆ、Ｋ６５５Ｉ、Ｉ５７３Ｆ、
Ａ２０４ＩまたはＥ６４７Ｆ）を含む本発明の実施形態による組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタ
ンパク質を、実施例２に記載のようにＳＯＳＩＰ改変（「ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ」と命
名される）を有する野生型クレードＡのＨＩＶエンベロープタンパク質に導入した。ＨＩ
Ｖエンベロープタンパク質ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰは、いわゆるＳＯＳＩＰ変異（残基５
０１および６０５におけるＣｙｓ、および残基５５９におけるＰｒｏ）ならびにジスルフ
ィド（ＤＳ）結合の導入をもたらす残基２０１および４３３におけるさらなるＣｙｓ、な
らびに３３２位における潜在的なＮ－グリコシル化部位（Ｔ３３２Ｎ変異）を有する。こ
のタンパク質は６６４位でトランケートされる。ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰの配列を配列番
号２１に示す。
三量体形成の割合および三量体の収量を、実施例３に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡ
アッセイによって測定した。試験されたバリアントの各々ついての三量体形成の割合およ
び三量体の収量をＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰと比較した。バックボーン配列と比較して、よ
り高い割合の三量体形成が、Ｍ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１ＦまたはＫ６５５Ｉ置換
に関して観察された（例えば、図８Ａ）。例えば、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５ＩおよびＭ５３
５Ｎの組み合わせは、三量体の収量および割合のよりいっそうの増加を示した（例えば、
図８Ａおよび８Ｂ）。Ｎ６５１ＦおよびＤ５８９Ｖの組み合わせは、三量体の収量および
割合をよりいっそう向上させた（データは示さず）。クレードＡウイルスに関する本実施
例の結果は、下の実施例１０および１１（クレードＣ）ならびに実施例５（クレードＢ）
のものと一致し、その中で、変異Ｉ５３５Ｎ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１ＦおよびＫ６５５Ｉ
もまた、野生型株に由来するエンベロープタンパク質に対する安定化効果、例えば、三量
体形成の割合の向上および／または三量体の収量の向上を示した。明らかに、本発明のこ
れらの変異はまた、野生型クレードＡ株に由来するＨＩＶ Ｅｎｖの三量体形成を向上さ
せる。
この時点で、発現レベル、三量体形成および広域中和抗体への結合における好ましい特
性の組み合わせに基づく、特定の好ましい変異体（ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰバックボーン
において試験される、は次の変異を有するものである：Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３
５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５８９Ｖ（例えば、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析においてこのような変異
体の三量体形成の著しい向上を示す図９、およびこのような変異体の広域中和抗体の結合
の明らかな向上を示す図１３を参照のこと）。安定化されたＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ Ｅ
ｎｖ（ＨＩＶ１７０８６３）の配列を配列番号２２に示す。
変異Ｑ６５８Ｖの追加は、さらにわずかな向上をもたらした。
さらに好ましいコンストラクトは、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ
、Ｄ５８９Ｖ変異、ならびに「ＤＳ」変異（ジスルフィド結合の導入をもたらす２０１位
および４３３位におけるＣｙｓ）、Ｒ５８８Ｅ、ならびにＱ６５８Ｖを含有する。当該バ
リアント（ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２ Ｅｎｖ、ＨＩＶ１７１８１４）の配列は配列
番号２９において提供される。
実施例１０：クレードＣ野生型エンベロープタンパク質配列に基づく組換え体ＨＩＶエン
ベロープタンパク質バリアント
単一アミノ酸置換Ｔ６５１Ｆ、追加の置換Ｌ５５６Ｐ（Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｌ５
５６Ｐ）を伴うＷＴ Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ配列（配列番号２３）に導入され
る二重アミノ酸置換Ｔ６５１Ｆ、Ｍ５３５Ｎを含む本発明の実施形態による組換え体ＨＩ
Ｖ Ｅｎｖタンパク質が、実施例２に記載のように生成され、発現された。三量体の収量
および三量体形成の割合を、実施例３に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによっ
て測定した。
結果を図１０ＡおよびＢに示す。Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ＿Ｌ５５６Ｐ＿Ｔ６５１Ｆ＿
Ｍ５３５Ｎの三量体の収量は、Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰバックボーンのものより５倍高い
。
Ｌ５５６Ｐ、Ｔ６５１ＦおよびＭ５３５Ｎ置換はこのように、Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ
の大幅な向上をもたらしたが、ｂＮＡｂへの結合およびこのクレードＣ野生型由来のバリ
アントについての三量体の割合は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰバックボーンよりも依然として
非常に低かった。ｗｔ Ｅｎｖはその宿主に適応し得るが、場合によりその全般的な適応
度が低下し、それによりフォールディングが損なわれることがあるため、Ｅｎｖ配列を、
下の実施例１２および図１２に記載の概念的なフレームワークに従って「矯正」した。合
計２１個の残基を変化させて配列を矯正し、３つの潜在的なＮ－グリコシル化部位（ＰＮ
ＧＳ）を追加して、いわゆる「グリカンホール」（野生型ＨＩＶ株Ｅｎｖタンパク質の少
なくとも５０％において潜在的なＮ－グリコシル化部位が存在する位置）をふさいだ。Ｃ
９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰに関する後のこのフレームワークによって導入される変異を、縦列
「矯正変異」において表３に示す。本明細書に開示される安定化変異Ｋ６５５Ｉの追加に
より、Ｄ５８９Ｖ、Ａ２０４ＩおよびＫ５８８Ｅと同様に、三量体の割合および収量がよ
りいっそう増加した。
これらの結果は、本明細書に記載のＴ６５１Ｆ、Ｍ５３５ＮおよびＫ６５５Ｉ、Ｄ５８
９Ｖ、Ａ２０４ＩおよびＫ５８８Ｅ変異もまた、Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ（クレードＣ野
生型株Ｅｎｖタンパク質に由来する）およびそのバリアントに導入される際に、エンベロ
ープタンパク質に対する安定化効果、例えば、三量体の収量の向上、三量体形成の割合の
向上を有したことを実証している。
この時点で、発現レベル、三量体形成および広域中和抗体への結合における好ましい特
性の組み合わせに基づく、特定の好ましいバリアント（Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰバックボ
ーンにおいて試験される）は次の変異を有するものである：Ｑ５６７Ｋ（以前に他の人た
ちによって記載された）；Ａ１９８Ｔ、Ｓ２４３Ｎ、Ｋ２３６Ｔ、Ｖ２９５Ｎ（グリカン
ホールをふさぐため）；Ｍ３４Ｌ、Ｔ４６Ｋ、Ｔ５８Ａ、Ｑ１７１Ｋ、Ｇ１７２Ｖ、Ｐ１
７９Ｌ、Ｌ１８３Ｑ、Ｉ１９２Ｒ、Ｎ２０９Ｔ、Ｍ３０７Ｉ、Ｑ３５０Ｒ、Ｎ３５２Ｈ、
Ｙ３５３Ｆ、Ｄ４１２Ｎ、Ｇ４２９Ｅ、Ｖ４５５Ｔ、Ｉ４８９Ｖ、Ｌ４９１Ｉ、Ｇ５００
Ｋ、Ｓ５４７Ｇ、Ｔ５７８Ａ、Ｔ６５１Ｎ（配列を矯正するため）；Ｖ５０５Ｎ、Ｅ５０
７Ｔ、Ｔ６６３Ｎ（分子の基部に潜在的なＮ－グリコシル化部位を追加される）；および
Ａ２０４Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｌ５５６Ｐ、Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｔ６５１Ｆ、Ｋ６５５
Ｉ（本発明の安定化変異）。このバリアントについてのデータは、例えば、図１３、特に
、その中の「安定化および矯正されたＣ９７ＺＡ」を参照されたい）に示され、元のｗｔ
Ｃ９７ＺＡ Ｅｎｖ分子と比較して、広域中和抗体結合において非常に大きな増加を示
す。このバリアント（安定化および矯正されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ（ＨＩＶ
１７０６９０））の配列は、配列番号２４において提供される。
変異Ｋ６５８Ｖの追加がこのタンパク質をよりいっそう安定化した。
さらに好ましいバリアントは「ＤＳ」変異およびＫ６５８Ｖを含み、このバリアント（
Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２ Ｅｎｖ、ＨＩＶ１７１８１０）の配列は、配列番号３０
において提供される。
実施例１１：別のクレードＣ野生型エンベロープタンパク質配列に基づく組換え体ＨＩＶ
エンベロープタンパク質バリアント
クレードＣ株Ｄｕ４２２由来のＥｎｖタンパク質において、ＳＯＳＩＰ変異を導入し、
かつ２つのグリカンホールを２９５位および３８６位におけるＫ２９５ＮおよびＤ３８６
Ｎ変異によってふさいだ。加えて、いくつかの残基を実施例１２および図１２に記載の概
念的なフレームワークに従って矯正し（Ｖ２７２Ｉ、Ｗ４５６Ｒ、Ｇ４６６ＥおよびＦ６
４３Ｙ）、安定化置換Ｌ５５６Ｐ、Ｉ５３５Ｎ、Ｎ６５１ＦおよびＤ５８９Ｖを導入した
。全ての追加の置換により、より高い三量体の収量および三量体の割合を得た（例えば、
図１１）。
これらの４つの安定化変異を有する特定の試験されたバリアント（配列番号２５）にお
いて、追加のＫ６５５Ｉ置換がさらに、三量体の収量および三量体の割合をそれぞれ１．
３倍および１．４倍増加させた（データは示さず）。
この時点で、発現レベル、三量体形成および広域中和抗体への結合における好ましい特
性の組み合わせに基づく、特定の好ましいＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖバリアントは
次の変異を有するものである：Ｌ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５
８９Ｖ、Ｋ５８８Ｅ、Ｉ２０１Ｃ、Ａ４３３Ｃ、Ｖ２７２Ｉ、Ｗ４５６Ｒ、Ｇ４６６Ｅ、
Ｆ６４３Ｙ、Ｄ３８６Ｎ、およびＫ２９５Ｎ。このバリアント（安定化および矯正された
Ｄｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７０８５９）の配列は、配列番号２６におい
て提供される。このバリアントについてのデータは、例えば、図１３に示され（その中の
安定化および矯正されたＤｕ４２２を参照されたい）、元のｗｔ Ｄｕ４２２ Ｅｎｖ分
子と比較して、広域中和抗体結合において非常に大きな増加を示す。
さらに好ましいバリアントは「ＤＳ」変異およびＫ６５８Ｖをさらに含み、このバリア
ント（Ｄｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ．ｖ１ Ｅｎｖ、ＨＩＶ１７１８１２）の配列は、配列番
号３１において提供される。
実施例１２：矯正および安定化する各種ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ配列
感染した患者から単離されたウイルス由来のｗｔ配列は、適切なフォールディングを阻
害する不安定化変異を獲得した可能性があるため、クレードＣ Ｃ９７ＺＡ、ＤＵ４２２
およびモザイクｓＣ４のｗｔ Ｅｎｖ配列を最初に矯正した。
野生型配列において最適でない変異を検索するために、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースお
よびＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶデータベース（約９０．０００配列）における全ての
ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ配列のアラインメントを行い、各アミノ酸についてアミノ酸分布を計
算した。概して、図１２に記載の概念的なフレームワークに従って、ｗｔ Ｅｎｖ配列中
のいくつかの比較的まれに存在するアミノ酸をより一般的なアミノ酸に置換した（対応す
る位置におけるデータベース中の頻度に基づいて）。
さらに、Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰの尖部での２つの追加の置換Ｙ３５３ＦおよびＱ１７
１Ｋが導入されて、場合によっては抗体を標的化する尖部の結合を向上させ、また、追加
のグリカン部位は、これらの潜在的なＮ－グリコシル化部位（ＰＮＧＳ）が５０％を超え
て保存されていたため、Ｄ４１１Ｎ、Ｋ２３６ＴおよびＶ２９５Ｎの置換により導入され
た。次に、前の実施例に記載の安定化置換を矯正された配列に導入した。
安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰは、置換Ａ２０４Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、Ｋ
５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１ＦおよびＫ６５５Ｉを含有する（安定化されたＣｏｎＣ
＿ＳＯＳＩＰ）。安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰの完全な配列は配列番号２０におい
て提供される。
バリアントＥｎｖタンパク質およびそれらの変異のいくつかの概要が表３に提供される
。
Figure 2023011941000003
Figure 2023011941000004
表３．本明細書に記載のいくつかのＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質バリアント。縦列「文献
由来の変異」には、これらのコンストラクトにおいて使用され、かつ他の人たちによって
以前に記載された変異を記載する。縦列「追加されたＰＮＧＳ」には、潜在的なＮ－グリ
コシル化部位（多くの野生型Ｅｎｖタンパク質がこのような部位を含む位置で）を追加す
る変異を記載する。縦列「リーダー配列」には、リーダー配列が元の（天然の）リーダー
配列でなかった場合に、どのリーダー配列が発現のために使用されたかを記載する。縦列
「矯正変異」には、実施例１２および図１２に記載のように、野生型Ｅｎｖタンパク質の
いくつかのうちのフォールディングおよび安定性（ｂＮＡｂへの結合に基づいて、三量体
の収量および割合として測定される）を向上させる変異を記載する。縦列「安定化変異」
には、本明細書に開示のようにタンパク質を安定化し、かつ三量体形成を向上させる、本
発明の変異を記載する。縦列「さらなる変異」には、いくつかのコンストラクトのために
なされた追加の変異を記載する。縦列「終端」には、最後のアミノ酸の位置を記載する（
表全体にわたるナンバリングは、ＨＸＢ２ Ｅｎｖ配列に関する）。
野生型（ｗｔ）、矯正されたＥｎｖバリアントおよび安定化されたＥｎｖバリアントに
より一過的にトランスフェクトされた細胞の上清を、尖部を対象とする三量体に特異的な
いくつかの広域中和抗体への結合について試験した。矯正置換および特に安定化置換は、
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（図１３）およびＳＥＣ－ＭＡＬＳ（図１４）により決定される三量
体含量に対して著しい影響を有した（図１３および１４）。
矯正および安定化されたＤＳ＿ｓＣ４ Ｅｎｖタンパク質（矯正および安定化されたＤ
Ｓ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ（ＨＩＶ１７０６８６））の好ましいバリアントの配列
は、配列番号２７において提供される。
別の好ましいそのバリアントは、配列番号３２（矯正および安定化されたｓＣ４＿ＳＯ
ＳＩＰ．ｖ４ Ｅｎｖにおいて提供される。
実施例１３：本発明の安定化変異は、ＳＯＳＩＰ変異の不存在下で機能する
前の実施例において示すように、７つの変異（Ａ２０４Ｉ、Ｉ５３５Ｎ、Ｉ５７３Ｆ、
Ｋ５８８Ｅ、Ｄ５８９Ｖ、Ｎ６５１ＦおよびＫ６５５Ｉ）は、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰにお
ける三量体の収量および割合を向上させた（「ＣｏｎＣ＿ｂａｓｅ」または「安定化され
たＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ」または「ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ ７ｍｕｔ」をもたらす）（例
えば、図１３および１５）。
本実施例は、各種ＳＯＳＩＰ変異（すなわち、「ＳＯＳ」変異：５０１位および６０５
位でのＣｙｓ残基による２つの置換；ならびに「ＩＰ変異」：５５９位でのＰｒｏ残基に
よる置換）は、さらなる安定化に寄与するが、本発明の変異から恩恵を得るのに必要とさ
れないことを実証する。
７つの変異は、図１５（ＣｏｎＣ＿ＳＯＳとＣｏｎＣ＿ＳＯＳ，７ｍｕｔを比較する）
に示されるように、安定化Ｉ５５９Ｐ変異（「ＩＰ」変異）を含有しない、いわゆるＣｏ
ｎＣ＿ＳＯＳにおいて三量体の収量を向上させることも示された。したがって、「ＩＰ」
変異は、本明細書に記載の変異から恩恵を得るために必須ではない。Ｉ５５９Ｐ変異の追
加が大幅な増加をもたらしたが、これは、「ＩＰ」変異が本発明の７つの変異を加えたこ
のコンストラクトにおいて有利であることを示す。安定化ＩＰ変異（Ｉ５５９Ｐ）はまた
、Ａ５５８ＰまたはＬ５５６Ｐによって置き換えられ得るが、これらの両方はまた、Ｉ５
５９Ｐ変異を欠くバリアントと比較して大幅な増加をもたらす。
また、上に記載される本発明の７つの変異を含有するが、「ＳＯＳ」変異を欠くＣｏｎ
Ｃ＿ＩＰ，７ｍｕｔはなお、非常に高い三量体の収量を示したが、これは、実施例７にお
ける観察に一致して、「ＳＯＳ」変異もまた、本明細書に記載の変異から恩恵を得るため
に必須ではないことを実証している（例えば、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰとＣｏｎＣ＿ＩＰ，
７ｍｕｔを比較する）。「ＳＯＳ」変異の追加はさらに三量体の収量を増加させる。
したがって、本明細書に記載の安定化変異を含有するＥｎｖ三量体は、ＳＯＳＩＰ変異
によるさらなる安定化から恩恵を得る一方で、３つのＳＯＳＩＰ変異は、本明細書に記載
の安定化変異の恩恵（例えば、三量体の収量の向上）を得るために必要とされない。
実施例１４：６４７位、６５１位または６５５位でのメチオニン置換が三量体の品質を向
上させる
実施例２に記載の変異にさらにつけ加えて、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）バッ
クボーンにおいて、５８９位、６４７位、６５１位および６５５位をＭｅｔ残基によって
個別に置換し、三量体形成の割合および収量について上記のような方法を使用して試験し
た。実施例２に記載の変異のように、６４７位、６５１位または６５５位におけるＭｅｔ
は、図１６で見ることができるように、三量体の品質を向上させた（より高い三量体の割
合および収量、ｂＮＡｂ結合の増加）。
したがって、６５１位でのＰｈｅ、Ａｌａ、またはＴｒｐによる置換に加えて、６５１
位でのＭｅｔによる置換もまた三量体形成を向上させ；６５５位でのＰｈｅ、Ｉｌｅ、ま
たはＴｒｐによる置換に加えて、６５５位でのＭｅｔによる置換もまた三量体形成を向上
させ；かつ６４７位でのＰｈｅまたはＩｌｅによる置換に加えて、６４７位でのＭｅｔに
よる置換もまた三量体形成を向上させる。
実施例１５：６５８位で三量体安定化変異を有するＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
６５８位（ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０に従うナンバリング）で置換変異を
有する組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（配列番号３）バック
ボーンにおいて作製した。Ｋ６５８をＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、または
Ａｌａに変異させた。加えて、いくつかの二重変異がなされ、これらの変異は、上記の安
定化変異の１つであるＫ６５５Ｉと組み合わされた。三量体形成の割合を、実施例３に記
載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによって決定した。
結果を図１７ＡおよびＢ（三量体の割合、異なる実験において測定されたため２つのパ
ネルがある）、ならびに図１７ＣおよびＤ（三量体の収量、異なる実験において測定され
たため２つのパネルがある）において示す。これらの結果は、６５８位でのＩｌｅ、Ｐｈ
ｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、またはＶａｌによる置換が三量体形成の割合の向上および
三量体の収量の向上をもたらしたことを実証している。６５８位でのＩｌｅによる置換は
、上記の表１における変異（ｉ）～（ｖｉｉ）由来の最も機能する単一変異であった（例
えば、図２Ａを参照のこと）Ｋ６５５Ｉ変異とほぼ同じ範囲の増加をもたらした（図１７
Ａ、Ｃ）。６５８位でのＶａｌによる置換は、さらに高い向上をもたらした（図１７Ａ、
Ｃ）。
結果はまた、６５８位でのＩｌｅまたはＶａｌによる置換を上に記載された変異Ｋ６５
５Ｉと組み合わせることができ、これが、対応する単一変異の各々と比較してさらなる向
上をもたらしたことを実証した（図１７Ａ、Ｃ）。
Ｋ６５８Ｖ変異もまたＳＥＣ－ＭＡＬＳを使用して試験された。９６ウェル培養液をＡ
ｌｐｈａＬＩＳＡのためになされたように３日間増殖させた。上清をＳＥＣ－ＭＡＬＳカ
ラムに直接ロードした。偽上清（フューリン発現を有する）に関して得られたクロマトグ
ラムを、Ｅｎｖタンパク質を有する上清のクロマトグラムから差し引いた。三量体タンパ
ク質は、７分と８分の間でカラムから溶出した。結果を図１８に示し、また、結果はＫ６
５８Ｖ変異体が、バックグラウンドＥｎｖタンパク質およびＫ６５５Ｉ変異体Ｅｎｖタン
パク質と比較して三量体形成の向上を示したことを確証した。
本実施例は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の６５８位でのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅ
ｔ、Ｌｅｕ、またはＡｌａによるアミノ酸の置換が三量体の割合および三量体の収量の向
上をもたらしたことを実証している。
バリアントの三量体形成を測定するためのＡｌｐｈａＬＩＳＡおよび／またはＳＥＣ－
ＭＡＬＳを使用したさらなる実験を、ＨＩＶ Ｅｎｖバリアントにおいて実施し、ここで
、Ｋ６５８Ｖ変異は、本明細書に記載のように表１および／または２由来の他の変異と組
み合わされて、ならびにクレードＡおよびＢ由来のＨＩＶ株において存在する。例えば、
６５８Ｖ変異はすでに、上記のようなＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ，７ｍｕｔバリアント（実施
例７）、ならびにＬ５５６Ｐ、Ｋ６５５Ｉ、Ｍ５３５Ｎ、Ｎ６５１Ｆ、Ｄ５８９Ｖ、Ｋ５
８８Ｅを有するＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ（実施例９）、ならびに矯正および安定化された
Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ（実施例１０）を向上させることが示されている。
上記の結果に基づいて、６５８位でのバリン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニ
ン残基、ロイシン残基、メチオニン残基またはアラニン残基、好ましくはバリン残基への
アミノ酸の変異は、様々なバックグラウンドＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質において三量体形
成および／または三量体の収量を向上させることになると見込まれる。
実施例１６．安定化されたＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質による免疫化
ウサギの免疫化試験を可溶性Ｅｎｖタンパク質およびリポソームと結合したＥｎｖタン
パク質を用いて行った。初回抗原刺激を安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ３（配列
番号２８）で実施し、その後４回の追加免疫をそれぞれ別のタンパク質、すなわち、１）
矯正および安定化されたｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ．ｖ４（配列番号３２）；２）矯正および安
定化されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２（配列番号３０）；３）矯正および安定化され
たＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ．ｖ１（配列番号３１）；ならびに４）安定化されたＢＧ５０
５＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２（配列番号２９）で実施した。
連続的な免疫化後に血清を単離し、Ｅｎｖの安定し、閉じた、融合前の高次構造に特に
結合する誘導された抗体について（ＥＬＩＳＡを使用して）、およびｂＮＡｂの誘導につ
いて（ウイルス中和アッセイを使用して）分析する。
上の実施例は、本発明が、融合前の閉じたＨＩＶエンベロープ三量体タンパク質のフォ
ールディングおよび安定性を最適化するための普遍的なアプローチを提供することを実証
している。
本明細書に記載の実施例および実施形態は例示の目的のためのものにすぎないこと、な
らびに上記の実施形態に対してその広い発明思想から逸脱することなく変更がなされ得る
ことは理解されよう。したがって、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定され
るのではなく、添付した特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲に含
まれる変形例を包含することが意図されていると理解されよう。
配列のリスト
配列番号１ ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０（斜体はシグナル配列；灰色の網掛
けによって示される本発明による変異に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミノ酸
）
Figure 2023011941000005
配列番号２ ＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＣ（コンセンサス配列のみ、いずれの
シグナル配列も含まない、膜貫通ドメイン（６６４が最後のアミノ酸）、ＳＯＳＩＰ変異
、および／またはフューリン切断部位；灰色の網掛けによって示される本発明による変異
に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミノ酸）
Figure 2023011941000006
配列番号３ ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ（ＳＯＳＩＰ変異およびフューリン切断部位（斜体）
ならびにＣ末端トランケーションを有する成熟クレードＣコンセンサス配列；灰色の網掛
けによって示される本発明による変異に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミノ酸
）
Figure 2023011941000007
配列番号４ ＨＩＶ ＥｎｖコンセンサスクレードＢ（コンセンサス配列のみ、いずれの
シグナル配列も含まない、膜貫通ドメイン（６６４が最後のアミノ酸）、ＳＯＳＩＰ変異
、および／またはフューリン切断部位；灰色の網掛けによって示される本発明による変異
に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミノ酸）
Figure 2023011941000008
配列番号５ ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰ（ＳＯＳＩＰ変異およびフューリン切断部位（斜体）
ならびにＣ末端トランケーションを有する成熟クレードＢコンセンサス配列；灰色の網掛
けによって示される本発明による変異に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミノ酸
）
Figure 2023011941000009
配列番号６ 合成ＨＩＶエンベロープタンパク質Ｍｏｓ２Ｓ Ｅｎｖ Ｃ４断片；灰色の
網掛けによって示される本発明による変異に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミ
ノ酸）
Figure 2023011941000010
配列番号７ （ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ＿Ｅ１６６Ｒ配列；灰色の網掛けによって示さ
れる本発明による変異に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミノ酸）
Figure 2023011941000011
配列番号８ （Ｍｏｓ１．Ｅｎｖ、モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質配列；灰色の
網掛けによって示される本発明による変異に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミ
ノ酸）
Figure 2023011941000012
配列番号９ （Ｍｏｓ２．Ｅｎｖ、モザイクＨＩＶエンベロープタンパク質配列；灰色の
網掛けによって示される本発明による変異に関する位置（ｉ）～（ｖｉｉ）におけるアミ
ノ酸）
Figure 2023011941000013
配列番号１０ （フューリン切断部位変異体配列）
ＲＲＲＲＲＲ
配列番号１１ （シグナル配列の例（例えば、ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ、およびいくつかの
野生型由来バリアントのために使用される））
ＭＲＶＲＧＩＬＲＮＷＱＱＷＷＩＷＧＩＬＧＦＷＭＬＭＩＣＮＶＶＧ（注記：最後のＶＧ
は、成熟タンパク質の開始、またはシグナル配列の終端になり得る）
配列番号１２ （ＨＲ１ループを置き換えることができる８アミノ酸配列の例）
ＮＰＤＷＬＰＤＭ
配列番号１３ （ＨＲ１ループを置き換えることができる８アミノ酸配列の例）
ＧＳＧＳＧＳＧＳ
配列番号１４ （ＨＲ１ループを置き換えることができる８アミノ酸配列の例）
ＤＤＶＨＰＤＷＤ
配列番号１５ （ＨＲ１ループを置き換えることができる８アミノ酸配列の例）
ＲＤＴＦＡＬＭＭ
配列番号１６ （ＨＲ１ループを置き換えることができる８アミノ酸配列の例）
ＤＥＥＫＶＭＤＦ
配列番号１７ （ＨＲ１ループを置き換えることができる８アミノ酸配列の例）
ＤＥＤＰＨＷＤＰ
配列番号１８ （シグナル配列の例（例えば、ＣｏｎＢ＿ＳＯＳＩＰのために使用される
）
ＭＲＶＫＧＩＲＫＮＹＱＨＬＷＲＷＧＴＭＬＬＧＭＬＭＩＣＳＡ
配列番号１９ （ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおけるＨＩＶ ｇｐ１４０コンストラク
トのために使用されるタグ）
ＡＡＡＬＰＥＴＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ
配列番号２０ （安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ、「ＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ＿７ｍｕ
ｔ」（ＨＩＶ１６０５４４））
Figure 2023011941000014
配列番号２１ （ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ１５０６７３））
Figure 2023011941000015
配列番号２２ （安定化されたＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ１７
０８６３））
Figure 2023011941000016
配列番号２３ （Ｌ５３５ＭおよびＱ５６７Ｋを有するｗｔ Ｃ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ
Ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ１５０６７３））
Figure 2023011941000017
配列番号２４ （矯正および安定化されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖタンパク質（
ＨＩＶ１７０６９０））
Figure 2023011941000018
配列番号２５ （矯正および安定化されたＤｕ４２２コンストラクトのバリアント（ＨＩ
Ｖ１６１８１８））
Figure 2023011941000019
配列番号２６ （矯正および安定化されたＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ（ＨＩＶ１７０８５９
））
Figure 2023011941000020
配列番号２７ （矯正および安定化されたＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ（ＨＩＶ１７０６８
６））
Figure 2023011941000021
配列番号２８ （安定化されたＣｏｎＣ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ３（ＨＩＶ１７０６５４））
Figure 2023011941000022
配列番号２９ （安定化されたＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２（ＨＩＶ１７１８１４））
Figure 2023011941000023
配列番号３０ （矯正および安定化されたＣ９７ＺＡ＿ＳＯＳＩＰ．ｖ２（ＨＩＶ１７１
８１０））
Figure 2023011941000024
配列番号３１ （矯正および安定化されたＤｕ４２２＿ＳＯＳＩＰ．ｖ１（ＨＩＶ１７１
８１２））
Figure 2023011941000025
配列番号３２ （安定化および矯正されたｓＣ４＿ＳＯＳＩＰ．ｖ４）
Figure 2023011941000026
配列番号３３ （シグナル配列の例（例えば、ＤＳ＿ｓＣ４＿ＳＯＳＩＰバリアントのた
めに使用される）
ＭＲＶＲＧＭＬＲＮＷＱＱＷＷＩＷＳＳＬＧＦＷＭＬＭＩＹＳＶ
配列番号３４ （シグナル配列の例（例えば、ＢＧ５０５＿ＳＯＳＩＰバリアントのため
に使用される）
ＭＲＶＭＧＩＱＲＮＣＱＨＬＦＲＷＧＴＭＩＬＧＭＩＩＩＣＳＡ
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２５．ＷＯ ２００７／１０４７９２
２６．ＷＯ ２０１４／１２４３０１
２７．ＵＳ ２０１６／０１２２３９２
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２６．ＷＯ ２０１４／１２４３０１
２７．ＵＳ ２０１６／０１２２３９２

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明等を列挙する。
［発明１］
組換え体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質であって、以下のアミノ酸残基：
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および／または
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
の２つ以上を含み、
前記位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う、組換え体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質。
［発明２］
組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であって、以下のアミノ酸残基：
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および／または
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
の１つ以上を含み、
前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が：
（１）例えば、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列を含むクレードＣ由来の、または例えば、配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を含むクレードＢ由来のＨＩＶ Ｅｎｖコンセンサス配列；
（２）例えば、（ａ）：配列番号６；または（ｂ）：１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変異を有する配列番号６；または（ｃ）：５０１位および６０５位でＣｙｓ残基へのアミノ酸の変異を有し、かつ５５９位でＰｒｏ残基へのアミノ酸の変異を有する（ａ）もしくは（ｂ）；または（ｄ）：さらなるフューリン切断部位変異、例えば、５０８～５１１位でのＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）によるアミノ酸の置換を有する（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）；または（ｅ）配列番号７；または（ｆ）配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を含む合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質；ならびに
（３）少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基で少なくとも１つの矯正変異を含む、好ましくはクレードＣの、好ましくは野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であって、前記矯正変異が、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好ましくは、前記矯正変異が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在する前記アミノ酸残基による置換である、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質；からなる群から選択され、
かつ
前記位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明３］
組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であって、以下のアミノ酸残基：
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および／または
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
の１つ以上を含み、
前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、以下：
（ａ）５０１位および６０５位におけるＣｙｓ；
（ｂ）５５９位におけるＰｒｏ；ならびに
（ｃ）５０１位および６０５位におけるＣｙｓならびに５５９位のＰｒｏ
の少なくとも１つを含むＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり；かつ
位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明４］
（ｉ）～（ｖｉｉ）において示される前記アミノ酸残基の２つ以上を含む、発明２または３に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明５］
５０１位と６０５位においてＣｙｓまたは５５９位においてＰｒｏ、好ましくは、５０１位と６０５位においてＣｙｓおよび５５９位においてＰｒｏを含む、発明１、２または４のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明６］
（ｉ）～（ｖｉｉ）において示される前記アミノ酸残基の３つ以上を含む、発明１～５のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明７］
（ｉ）～（ｖｉｉ）において示される前記アミノ酸残基の４つ以上を含む、発明１～５のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明８］
６５１位においてＰｈｅ、６５５位においてＩｌｅ、５３５位においてＡｓｎ、および５８９位においてＶａｌを含む、発明１～７のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明９］
（ｉ）～（ｖｉｉ）において示される前記アミノ酸残基の５つ以上を含む、発明１～８のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明１０］
以下：
（ｖｉｉｉ）５８８位におけるＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＴｒｐもしくはＰｈｅ、好ましくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；
（ｉｘ）６４位におけるＬｙｓ、もしくは６６位におけるＡｒｇ、もしくは６４位におけるＬｙｓおよび６６位におけるＡｒｇ；
（ｘ）３１６位におけるＴｒｐ；
（ｘｉ）２０１位および４３３位の両方におけるＣｙｓ；
（ｘｉｉ）５５６位もしくは５５８位におけるＰｒｏ、もしくは５５６位および５５８位の両方におけるＰｒｏ；
（ｘｉｉｉ）５４８～５６８アミノ酸位におけるループ（ＨＲ１ループ）の７～１０アミノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば、（配列番号１２～１７）のいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
（ｘｉｖ）５６８位におけるＧｌｙ、もしくは５６９位におけるＧｌｙ、もしくは６３６位におけるＧｌｙ、もしくは５６８位および６３６位の両方におけるＧｌｙ、もしくは５６９位および６３６位の両方におけるＧｌｙ；ならびに／または
（ｘｖ）３０２位におけるＴｙｒ、もしくは５１９位におけるＡｒｇ、もしくは５２０位におけるＡｒｇ、もしくは３０２位におけるＴｙｒおよび５１９位におけるＡｒｇ、もしくは３０２位におけるＴｙｒおよび５２０位におけるＡｒｇ、もしくは３０２位におけるＴｙｒおよび５１９位と５２０位の両方におけるＡｒｇ
の１つ以上をさらに含む、発明１～９のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明１１］
前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは、５０８位～５１１位でのＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換をさらに含む、発明１～１０のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明１２］
配列番号３、５、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、発明１～１１のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明１３］
（ｘｖｉ）６５８位においてＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、またはＬｅｕ、好ましくはＶａｌまたはＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌから選択されるアミノ酸残基をさらに含む、発明１～１２のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明１４］
ｇｐ１４０またはｇｐ１６０タンパク質である、発明１～１３のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明１５］
クレードＣまたはクレードＡ、好ましくはクレードＣ由来の発明１～１４のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
［発明１６］
発明１～１５のいずれか一つに記載の前記組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のうち３つの非共有結合性のオリゴマーを含む三量体複合体。
［発明１７］
発明１～１５のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質もしくは発明１６に記載の三量体複合体をその表面にディスプレイする、粒子、好ましくはリポソームまたはナノ粒子。
［発明１８］
発明１～１５のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする単離核酸分子。
［発明１９］
プロモーターに作動可能に連結された発明１８に記載の前記単離核酸分子を含むベクター。
［発明２０］
アデノウイルスベクターである、発明１９に記載のベクター。
［発明２１］
発明１８に記載の単離核酸分子または発明１９もしくは２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
［発明２２］
前記組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の産生に好適な条件下で発明２１に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を作製する方法。
［発明２３］
発明１～１５のいずれか一つに記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、発明１６に記載の三量体複合体、発明１７に記載の粒子、発明１８に記載の単離核酸分子、または発明１９もしくは２０に記載のベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
［発明２４］
ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を向上させる方法であって、前記方法が、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質における１つ以上のアミノ酸残基を置換することを含み、１つ以上の前記置換が、以下のアミノ酸：
（ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ；
（ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
（ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
（ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
（ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および／または
（ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
の１つ以上をもたらし、
前記位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリングに従う、方法。
［発明２５］
親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフォールディングおよび安定性（三量体の割合および／または三量体の収量の増加として測定される）を向上させる方法であって、前記方法が、前記親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質において少なくとも１つの矯正変異、好ましくは少なくとも３つの矯正変異を導入することによって、前記親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列を矯正することを含み、矯正変異が、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基でのアミノ酸置換であり、前記置換が、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基によるものであり、好ましくは、前記置換が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在する前記アミノ酸残基によるものである、方法。

Claims (25)

  1. 組換え体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質であって
    、以下のアミノ酸残基：
    （ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
    （ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ
    ；
    （ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
    （ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
    （ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
    （ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および／または
    （ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
    の２つ以上を含み、
    前記位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリン
    グに従う、組換え体ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質
    。
  2. 組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であって、以下のアミノ酸残基：
    （ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
    （ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ
    ；
    （ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
    （ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
    （ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
    （ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および／または
    （ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
    の１つ以上を含み、
    前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が：
    （１）例えば、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列を含むクレードＣ由来の、または例
    えば、配列番号４もしくは５のアミノ酸配列を含むクレードＢ由来のＨＩＶ Ｅｎｖコン
    センサス配列；
    （２）例えば、（ａ）：配列番号６；または（ｂ）：１６６位でＧｌｕからＡｒｇへの変
    異を有する配列番号６；または（ｃ）：５０１位および６０５位でＣｙｓ残基へのアミノ
    酸の変異を有し、かつ５５９位でＰｒｏ残基へのアミノ酸の変異を有する（ａ）もしくは
    （ｂ）；または（ｄ）：さらなるフューリン切断部位変異、例えば、５０８～５１１位で
    のＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）によるアミノ酸の置換を有する（ａ）、（ｂ）もしくは
    （ｃ）；または（ｅ）配列番号７；または（ｆ）配列番号８もしくは９のアミノ酸配列を
    含む合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質；ならびに
    （３）少なくとも１０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配
    列のコレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻
    度で対応する位置に存在するアミノ酸残基で少なくとも１つの矯正変異を含む、好ましく
    はクレードＣの、好ましくは野生型ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質である親ＨＩＶ Ｅｎｖタ
    ンパク質であって、前記矯正変異が、前記コレクション中のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち少
    なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基による置換であり、好まし
    くは、前記矯正変異が、前記コレクション中において対応する位置で最も高頻度に存在す
    る前記アミノ酸残基による置換である、親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質；からなる群から選
    択され、
    かつ
    前記位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリン
    グに従う、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  3. 組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であって、以下のアミノ酸残基：
    （ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
    （ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ
    ；
    （ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
    （ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
    （ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
    （ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および／または
    （ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
    の１つ以上を含み、
    前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質が、以下：
    （ａ）５０１位および６０５位におけるＣｙｓ；
    （ｂ）５５９位におけるＰｒｏ；ならびに
    （ｃ）５０１位および６０５位におけるＣｙｓならびに５５９位のＰｒｏ
    の少なくとも１つを含むＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質であり；かつ
    位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリング
    に従う、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  4. （ｉ）～（ｖｉｉ）において示される前記アミノ酸残基の２つ以上を含む、請求項２ま
    たは３に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  5. ５０１位と６０５位においてＣｙｓまたは５５９位においてＰｒｏ、好ましくは、５０
    １位と６０５位においてＣｙｓおよび５５９位においてＰｒｏを含む、請求項１、２また
    は４のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  6. （ｉ）～（ｖｉｉ）において示される前記アミノ酸残基の３つ以上を含む、請求項１～
    ５のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  7. （ｉ）～（ｖｉｉ）において示される前記アミノ酸残基の４つ以上を含む、請求項１～
    ５のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  8. ６５１位においてＰｈｅ、６５５位においてＩｌｅ、５３５位においてＡｓｎ、および
    ５８９位においてＶａｌを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ
    Ｅｎｖタンパク質。
  9. （ｉ）～（ｖｉｉ）において示される前記アミノ酸残基の５つ以上を含む、請求項１～
    ８のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  10. 以下：
    （ｖｉｉｉ）５８８位におけるＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｔｒｐもしく
    はＰｈｅ、好ましくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；
    （ｉｘ）６４位におけるＬｙｓ、もしくは６６位におけるＡｒｇ、もしくは６４位におけ
    るＬｙｓおよび６６位におけるＡｒｇ；
    （ｘ）３１６位におけるＴｒｐ；
    （ｘｉ）２０１位および４３３位の両方におけるＣｙｓ；
    （ｘｉｉ）５５６位もしくは５５８位におけるＰｒｏ、もしくは５５６位および５５８位
    の両方におけるＰｒｏ；
    （ｘｉｉｉ）５４８～５６８アミノ酸位におけるループ（ＨＲ１ループ）の７～１０アミ
    ノ酸を有するループ、好ましくは８アミノ酸のループ、例えば、（配列番号１２～１７）
    のいずれか１つから選択される配列を有するループによる置換；
    （ｘｉｖ）５６８位におけるＧｌｙ、もしくは５６９位におけるＧｌｙ、もしくは６３６
    位におけるＧｌｙ、もしくは５６８位および６３６位の両方におけるＧｌｙ、もしくは５
    ６９位および６３６位の両方におけるＧｌｙ；ならびに／または
    （ｘｖ）３０２位におけるＴｙｒ、もしくは５１９位におけるＡｒｇ、もしくは５２０位
    におけるＡｒｇ、もしくは３０２位におけるＴｙｒおよび５１９位におけるＡｒｇ、もし
    くは３０２位におけるＴｙｒおよび５２０位におけるＡｒｇ、もしくは３０２位における
    Ｔｙｒおよび５１９位と５２０位の両方におけるＡｒｇ
    の１つ以上をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎ
    ｖタンパク質。
  11. 前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフューリン切断配列における変異、好ましくは、５０
    ８位～５１１位でのＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）による置換をさらに含む、請求項１～
    １０のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  12. 配列番号３、５、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３
    ２のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１１の
    いずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  13. （ｘｖｉ）６５８位においてＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、またはＬｅｕ
    、好ましくはＶａｌまたはＩｌｅ、最も好ましくはＶａｌから選択されるアミノ酸残基を
    さらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質
    。
  14. ｇｐ１４０またはｇｐ１６０タンパク質である、請求項１～１３のいずれか一項に記載
    の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  15. クレードＣまたはクレードＡ、好ましくはクレードＣ由来の請求項１～１４のいずれか
    一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の前記組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のうち
    ３つの非共有結合性のオリゴマーを含む三量体複合体。
  17. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質もしくは請
    求項１６に記載の三量体複合体をその表面にディスプレイする、粒子、好ましくはリポソ
    ームまたはナノ粒子。
  18. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質をコードす
    る単離核酸分子。
  19. プロモーターに作動可能に連結された請求項１８に記載の前記単離核酸分子を含むベク
    ター。
  20. アデノウイルスベクターである、請求項１９に記載のベクター。
  21. 請求項１８に記載の単離核酸分子または請求項１９もしくは２０に記載のベクターを含
    む宿主細胞。
  22. 前記組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の産生に好適な条件下で請求項２１に記載の宿
    主細胞を増殖させることを含む、組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を作製する方法。
  23. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え体ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、請求項１
    ６に記載の三量体複合体、請求項１７に記載の粒子、請求項１８に記載の単離核酸分子、
    または請求項１９もしくは２０に記載のベクター、および薬学的に許容される担体を含む
    組成物。
  24. ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の三量体形成を向上させる方法であって、前記方法が、親Ｈ
    ＩＶ Ｅｎｖタンパク質における１つ以上のアミノ酸残基を置換することを含み、１つ以
    上の前記置換が、以下のアミノ酸：
    （ｉ）６５１位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
    （ｉｉ）６５５位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、もしくはＴｒｐ、好ましくはＩｌｅ
    ；
    （ｉｉｉ）５３５位におけるＡｓｎもしくはＧｌｎ、好ましくはＡｓｎ；
    （ｉｖ）５８９位におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、もしくはＡｌａ、好ましくはＶａｌ；
    （ｖ）５７３位におけるＰｈｅもしくはＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ；
    （ｖｉ）２０４位におけるＩｌｅ；および／または
    （ｖｉｉ）６４７位におけるＰｈｅ、Ｍｅｔ、もしくはＩｌｅ、好ましくはＰｈｅ
    の１つ以上をもたらし、
    前記位置のナンバリングが、ＨＩＶ－１単離株ＨＸＢ２のｇｐ１６０におけるナンバリン
    グに従う、方法。
  25. 親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のフォールディングおよび安定性（三量体の割合および／
    または三量体の収量の増加として測定される）を向上させる方法であって、前記方法が、
    前記親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質において少なくとも１つの矯正変異、好ましくは少なく
    とも３つの矯正変異を導入することによって、前記親ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質のアミノ
    酸配列を矯正することを含み、矯正変異が、少なくとも１００、好ましくは少なくとも１
    ０００、好ましくは少なくとも１００００の野生型ＨＩＶ Ｅｎｖ配列のコレクション中
    のＨＩＶ Ｅｎｖ配列のうち７．５％未満、好ましくは２％未満の頻度で対応する位置に
    存在するアミノ酸残基でのアミノ酸置換であり、前記置換が、前記コレクション中のＨＩ
    Ｖ Ｅｎｖ配列のうち少なくとも１０％の頻度で対応する位置に存在するアミノ酸残基に
    よるものであり、好ましくは、前記置換が、前記コレクション中において対応する位置で
    最も高頻度に存在する前記アミノ酸残基によるものである、方法。
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