JP2022554246A - Ｔｉｒｆ顕微鏡検査法のためのメタ表面を含む回折光学素子 - Google Patents

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Abstract

以下のものを含む回折光学素子（１０）が開示される：第１の表面（Ｓｍ）と第１の表面に対向する第２の表面（Ｓｅ）とを有する基板（ＳＢ）であって、少なくとも１つのスペクトル範囲内で光に対して透明であり及び前記スペクトル範囲内で水より高い屈折率を有する基板（ＢＳ）；及び回折放射線が、基板内を伝播し、前記基板と水との間の全反射の限度角度（θｃ）以上である回折角θｄで基板（Ｓｅ）の前記第２の表面に到達するように、回折放射線（Ｌｄｉｆｆ）に従って入射角で入射する前記スペクトル範囲内の波長λの光線（Ｌｉｎ）を回折することができる少なくとも１つのメタ表面であって、前記入射角に関し５％未満の０回折次数を有する透過及び５０％超の＋１又は－１回折次数に対応する回折放射線（Ｌｄｉｆｆ）の透過を有するように設計されたメタ表面。

Description

本発明は、ＴＩＲＦ顕微鏡検査法（すなわち全反射蛍光顕微鏡検査法：ｔｏｔａｌ－ｉｎｔｅｒｎａｌ－ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の分野に関する。
以下では、その上に入射する放射線の１波長より短い寸法及び周期の基本パターンの周期的又は準周期的繰り返しを含む部品であって前記入射放射線を散乱し及び同時にその位相及びその振幅を修正する部品がメタ表面と呼ばれることになる。
全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡検査法は、スライド試料保持器の極近傍に位置する観察試料中の蛍光分子の励起がナノスケール厚さの領域に閉じ込められる蛍光顕微鏡検査法技術である。これは特に、細胞膜へ局所化される構造及び処理が、回折限界よりはるかに良い軸方向の空間分解能で選択的に観測されることを可能にする。さらに、より伝統的なエピ蛍光技術は、蛍光画像中のより良いコントラストを取得することと細胞光変性及び放射線損傷の影響を低減することとを可能にする。
ＴＩＲＦ顕微鏡検査法が基づく原理が図１Ａに示される。考察されるケースは、屈折率ｎ１＜ｎ２の周囲媒体ＭＡと接触する表面Ｓｅを有する屈折率ｎ２の基板ＳＢのケースである。例えば、基板ＳＢはスライド試料保持器で構成され得る又はこのようなスライドが置かれるガラスで作られた要素で構成され得、周囲媒体ＭＡは蛍光体で標識付けられた細胞を懸濁状態で含む水溶液であり得る。基板ＳＢを通って送達される光線ＦＬＩは表面Ｓｅに入射し；その伝搬方向は、表面に対する法線ｚｓに対し臨界値θｃ（限度角度）より大きな角度をなす：
Figure 2022554246000002
したがって、ビームＦＬＩは全反射され（参照符号ＦＬＲは反射されたビームを表す）、消散波ＯＥが周囲媒体ＭＡ中に出現する。この消散波は表面Ｓからの距離ｚと共に次式のように指数関数的に低下する強度を有する：Ｉ（ｚ）＝Ｉ０ｅ（ｚ／δ）、ここで、進入長δは
Figure 2022554246000003
 により与えられ、λは光放射線の波長である。消散波は、周囲媒体に含まれる蛍光体を励起するが、δ程度の厚さにわたってだけである。これは、それを越えると消散波の強度が急速に無視可能になるためである。一例として、λ＝４８８ｎｍ、ｎ２＝１．５１４（ＢＫ７ガラス）、ｎ１＝１．３３（水）、θ＝６７°＞θｃ≒６１．４５°に関して、δ≒９３ｎｍということが分かった。これは、約１００ｎｍの厚さの層内に位置する蛍光体だけが励起され、及び蛍光画像の生成に寄与するということを意味する。
図１Ｂは、ＴＩＲＦ顕微鏡検査法において最も一般的に使用される構成を示す。
図１Ｂの場合、媒体ＭＡに対向する基板の側に位置する同じ顕微鏡対物レンズＯＢＪは、全反射を介し消散波を生成するため及び蛍光放射線を収集するための両方のために使用される。対物レンズは通常、油浸対物レンズであり、及び高開口数（ＮＡ）（例えば１．４５程度の）を有し得、延いては、高い横方向空間分解能（方向ｚに対し垂直な分解能）が取得されることを可能にするが、これは、横方向空間分解能がｄ＝λ／２ＮＡにより与えられるためである。加えて、高いＮＡを有する対物レンズＯＢＪは、入射光線ＦＬＩが光軸に対して偏向させられる（したがって、レンズによる入射光線ＦＬＩの大きな偏向が取得される）ことを可能にし、したがって光線ＦＬＩは全反射を取得するためには十分に大きい入射角θで伝播することができるので、必須である。しかし、このようなレンズは非常に高価であり、及び著しい収差を導入する。加えて、このようなアセンブリのアラインメントは複雑である。
本発明は、従来技術の上述の欠点を克服することを目的とする。より具体的には、本発明は、例えばＴＩＲＦ顕微鏡検査法を行うことと従来技術の高開口数対物レンズの使用無しで済ますこととを可能にするメタ表面を含む回折光学素子を提供することを目的とする。
この目的を達成するために、本発明の１つの主題は、
－ 第１の表面と第１の表面に対向する第２の表面とを有する基板であって、少なくとも１つのスペクトル範囲内で光に対して透明であり且つ前記スペクトル範囲内で水より高い屈折率を有する、基板；
－ 誘電材料で作られ及び基板の前記第１の表面上に置かれた少なくとも１つのメタ表面であって、メタ表面は、互いに垂直であり且つ基板の表面に平行２つの方向ｘ、ｙにおいて周期的であるパターン（Ｅ１）の繰り返しを介し形成され、前記パターンはｙに沿って直線的である第１のストリップセグメントを含むサブパターンを含み、メタ表面は方向ｙの点線（Ｐ）の第１のストリップ（Ｍ１）を含み、前記点線のストリップは前記サブパターンから形成される、メタ表面、を含む回折光学素子であり：
前記周期パターンはさらに、メタ表面が、方向ｙにおいて連続的である第２のストリップ（Ｍ２）を含むように、方向ｙにおいて直線的である第２のストリップセグメントを含み、
前記メタ表面は、回折放射線を形成するために、前記スペクトル範囲に含まれる波長λの光線であって入射角で入射する光線を回折するために好適であり、前記回折放射線は、基板を通って伝播し及び前記基板と水との間の全反射の限度角度θｃ以上の回折角θｄで基板の前記第２の表面にぶつかるようなやり方で形成され、
メタ表面は、前記入射角において、回折の次数０に関して５％未満の透過率を及び回折の次数－１又は＋１に対応する回折放射線に関して５０％より高い透過率を有するように構成される。
本発明の特別のいくつかの実施形態によると：
－ パターン内で、第１のストリップの面積は第２のストリップの面積より小さく、第１のストリップの幅は３０ｎｍ～５００ｎｍに含まれ、第２のストリップの幅は１００ｎｍ～７００ｎｍに含まれ、及び点線の長さは６０ｎｍ～８００ｎｍに含まれる；
－ サブパターンは前記第１のストリップの２つの逐次点線間に置かれた円盤を含み；
－ 方向ｘのパターンの寸法はＰｘ＜λ／ｎｅａｕが成立するようにされ、ｎｅａｕは水の屈折率である；
－ 方向ｘのメタ表面の全寸法ｘＭＳはｘＭＳ＜２×ｅ×ｓｉｎθｄが成立するようにされ、ｅは基板の厚さである；
－ 方向ｙのパターンの寸法は３００ｎｍ～１０００ｎｍに含まれる；
－ メタ表面の材料の屈折率は基板の材料の屈折率より高い；
－ 回折光学素子は、基板の前記第１の表面上に置かれた複数のメタ表面を含み、メタ表面それぞれのパターンの前記方向ｘの寸法は、各メタ表面が、前記範囲に含まれる波長の光線であって他のメタ表面により回折される波長とは異なる波長の光線を回折するために好適となるように、異なる。
本発明の別の主題は、全反射蛍光顕微鏡検査法により試料を撮像するためのデバイスであって、以下のものを含む光学素子を含むデバイスである：
－ 前記スペクトル範囲内で発射するために好適な少なくとも１つの光源であって、前記光線は前記入射角で前記回折光学素子に入射し、前記光線は、前記回折光学素子による回折後、消散波を基板の第２の表面の少なくとも１つの領域内に生成する、光源；
－ 前記消散波が、生成され、及び前記消散波により励起される蛍光放射線を生成する第２の表面の少なくとも１つの領域に応じて置かれた試料；
－前記試料により発射された前記蛍光放射線を検出するために好適な検出器。
本発明のさらに別の主題は表面プラズモン共鳴を介し生体試料を検出するためのデバイスであって回折光学素子を含むデバイスであり、前記回折光学素子は以下のものを含み：
－ 複数のメタ表面であって、メタ表面それぞれのパターンの前記方向ｘの寸法は、各メタ表面により回折される放射線が、異なる回折角θｄで基板の前記第２の表面にぶつかるように、異なる、複数のメタ表面；
前記デバイスはさらに以下のものを含み：
－ 前記入射角で前記回折光学素子に入射する前記光線を前記スペクトル範囲内で発射するために好適な少なくとも１つの光源；
－ 少なくとも１つの第２の基板、第２の基板の上に置かれた金属層、及び金属層の上に置かれた被解析層を含む試料であって、前記試料は前記回折放射線が試料の金属層により少なくとも部分的に反射されるように第１の基板の上に置かれ、前記回折光学素子はさらに、試料により反射された前記光線を自由空間へ結合するために好適な光結合素子を含む、試料；
－ 試料により反射され及び前記結合要素により自由空間へ結合された前記光線の強度を検出するために好適な検出器、
少なくとも１つのメタ表面は、メタ表面に関連付けられた前記回折角が、金属面から反射されると表面プラズモンの共振励起と前記回折放射線の少なくとも部分的吸収とを生成するように構成される。
本発明の１つの特定実施形態によると、光結合素子は、互いに垂直であり及び基板の表面に平行である２つの方向ｘ、ｙにおいて周期的であるパターンの繰り返しを介し形成される少なくとも１つの出口メタ表面を含み、前記パターンは、ｙに沿って直線的である第１のストリップセグメントを含むサブパターンを含み、前記出口メタ表面は基板の前記第１の表面上に置かれる。
本発明の他の特徴、詳細及び利点は、一例として与えられ及び以下の図を示す添付図面を参照して提供される説明を読むと明確になる：
従来技術から知られたＴＩＲＦ顕微鏡検査法技術である。 従来技術から知られたＴＩＲＦ顕微鏡検査法技術である。 本発明による回折光学素子の概略図である。 それぞれ本発明の第１の実施形態による回折光学素子の概略図及び回折効率を示すグラフである。 それぞれ本発明の第１の実施形態による回折光学素子の概略図及び回折効率を示すグラフである。 それぞれ本発明の第１の実施形態の一変形形態による回折光学素子の概略図及び回折効率を示すグラフである。 それぞれ本発明の第１の実施形態の一変形形態による回折光学素子の概略図及び回折効率を示すグラフである。 ＴＩＲＦ顕微鏡検査法により試料を撮像するための本発明による回折光学素子を含むデバイスの概略図である。 表面プラズモン共鳴を介し生体試料を検出するための本発明による回折光学素子を含むデバイスの概略図である。
添付図面では、別途示さない限り、要素は原寸に比例しない。
図２は本発明による回折光学素子の概略図を示す。この回折光学素子１０は、第１の表面Ｓｍと第１の表面に対向する第２の表面Ｓｅとを有する屈折率ｎ２の基板ＳＢであって少なくとも１つのスペクトル範囲内で光に対して透明であり及び前記スペクトル範囲内で水より高い屈折率ｎ２を有する基板を含む。基板の表面Ｓｅは屈折率ｎ１＜ｎ２の周囲媒体ＭＡと接触する。
加えて、本発明の回折光学素子は誘電材料で作られ及び基板Ｓｍの第１の表面上に置かれる少なくとも１つのメタ表面ＭＳを含む。本発明の１つの好適な実施形態によると、このメタ表面は二酸化チタンで作られる。代替的に、本発明の別の実施形態によると、このメタ表面はシリコンで作られる。
本発明によると、メタ表面は、回折放射線Ｌｄｉｆｆを形成するために、前記スペクトル範囲に含まれる波長λの光線Ｌｉｎであって入射角θｉで入射する光線を回折するために好適であり、前記回折放射線は、基板を通って伝播し及び前記基板と水との間の全反射の限度角度θｃ以上の回折角θｄで基板の前記第２の表面Ｓｅにぶつかるようなやり方で形成される。非限定的例として、光線Ｌｉｎの波長λは４００ｎｍ～８００ｎｍに含まれる。
加えて、メタ表面の構造は、前記入射角θｉにおいて、回折の次数０に関して５％未満の透過率を及び回折の次数－１又は＋１に対応する回折放射線Ｌｄｉｆｆに関して５０％より高い透過率を有するように構成される。
以下において、及びすべての図において、回折放射線Ｌｄｉｆｆは入射放射線が主として回折（又は方向転換）される回折次数のものを表す。
以下では、回折放射線Ｌｄｉｆｆが基板の第２の表面の法線ｚｓに対してなす角度θｄは「回折角」と呼ばれる。本発明の１つの好適な実施形態によると、基板の２つの対向面Ｓｅ及びＳｍは平行であり、及び回折角は回折面Ｓｍの法線と回折放射線とのなす角度に等しい。本発明の本明細書の残りでは、非限定的に、基板の２つの面Ｓｅ及びＳｍは平行である。
本発明の一実施形態によると、基板は、硼珪酸塩ガラス及びＢＫ－７ガラスがそうであるように４００ｎｍから８００ｎｍのスペクトル範囲内で透明である光学ガラスで作られる。この実施形態では、上に述べたように、限度角度θｃはθｃ≒６１°であり、したがって回折角θｄは６１°より大きい。
代替的に、別の実施形態によると、基板は石英又は融解石英で作られる。
本発明の回折光学素子１０は、回折の次数０に関して非常に低い透過率を有し、及び、ブレーズド回折格子と全く同様に、周囲媒体ＭＡ（基板の上の）が水溶性である場合に回折放射線の全反射（ＴＩＲ）を可能にするために十分に大きい角度θｄで入射放射線の強度が（回折の次数＋１に関して）回折の次数－１（又は逆もまた同様）へ主として方向転換されることを可能にする。基板内の回折放射線の全反射は、消散波が周囲媒体ＭＡ（回折放射線が全反射されける領域の上の）内で励起されることを可能にする。
したがって、本発明の光学素子は、消散波が基板（通常はスライドガラス）と水溶性媒体内に保存される試料との間の界面において励起されることを必要とするＴＩＲＦ顕微鏡検査法アプリケーションに特に好適である。具体的には、ＴＩＲＦ顕微鏡検査法では、回折の次数０の透過率は、入射放射線が透過される場合に蛍光体を含む試料により発射されるエピ蛍光放射線から生じる背景雑音を低減するために可能な限り低いことが望ましい。
前述の効果を実現するために、数値シミュレーションを使用することにより、本発明者らは、ここでは本発明の第１の実施形態（図３Ａにおいて詳述される）と第１の実施形態の変形形態（図４Ａに示される）とを参照して説明される、特定タイプのメタ表面を開発した。本発明のすべての実施形態において、メタ表面は、互いに垂直であり且つ基板の表面に平行である２つの方向ｘ、ｙにおいて周期的であるパターンから形成され、パターンの寸法Ｐｘは入射放射線の波長λより短い。パターンは、ｙに沿って直線的である第１のストリップセグメントＰを含むサブパターンＥ２を含む。
本発明のメタ表面は、当業者に知られている方法を使用することにより基板上に生成される。非限定的例として、これらは、電子線リソグラフィ又はナノインプリントリソグラフィを使用することにより、及び次にパターン（及び必要に応じてサブパターン）を形成するためにプラズマエッチングすることにより構造化することにより、生成され得る。これらの方法は高速、再現可能、且つ比較的安価である。
知られているように、方向ｘのパターンの寸法Ｐｘは以下の式により回折の次数ｍ、入射放射線の波長λ、及び回折角θｄに関係する：
Figure 2022554246000004
ここで、方向ｘのパターンＰｘの寸法はメタ表面のパターンの繰り返しの周期を意味するものと理解され得る。
式（２）と式（１）に基づき、本発明のすべての実施形態では、方向ｘのパターンの寸法ＰｘはＰｘ＜λ／ｎ１が成立するようにされる。
したがって、回折ビームの回折角は基板の表面Ｓｅと屈折率ｎ１の周囲媒体ＭＡとの間の界面における臨界角より大きくなる。周囲媒体ＭＡが水である場合、方向ｘのパターンの寸法ＰｘはＰｘ＜λ／１．３３が成立するようにされる。
式（２）に示すように、方向ｘのパターンの寸法が小さいほど、回折角は大きい。加えて、式（１’）が示すように、回折角が大きいほど消散波の進入長は小さい。したがって、ＴＩＲＦ顕微鏡検査法への適用に関して、メタ表面のパターンの寸法が小さいほど試料の蛍光体の励起は薄層へより局所化されることになり、したがってデバイスの距離分解能を改善する。
回折の次数－１又は＋１の効率を最大化するために、及び次数０の透過を制限するために、すべての実施形態において、メタ表面の材料の屈折率ｎｍａｔは基板の材料の屈折率ｎ２より高くなければならない。この条件は、回折の様々な次数の回折効率と入射放射線Ｌｉｎによる方向ｚのメタ表面内で励起されるＢｌｏｃｈモード間の結合との関係の結果である。回折の次数０、１、－１の透過に関して、励起された伝搬性Ｂｌｏｃｈモードは、ほぼ同じ振幅であるが異なる位相プロファイルを有する結合係数を保有し、したがって、回折の次数－１又は＋１に関して建設的に加算されるが次数０に関して破壊的に加算される。したがって、本発明によるメタ表面により、入射放射線は主として回折の次数＋１又は－１へ向けられる。
図３Ａは本発明の第１の実施形態による回折光学素子１０の概略図を示す。この第１の実施形態は、前記サブパターンＥ２から形成される点線Ｐの第１のストリップ（すなわち方向ｙにおいて非連続的ストリップ）Ｍ１を含む。点線Ｐは第１の直線的ストリップセグメントのｙ軸に沿った繰り返しに対応する。加えて、メタ表面が方向ｙにおいて連続である第２のストリップＭ２を含むように、周期パターンＥ１はさらに、方向ｙにおいて直線的であり及びパターンＥ１のｙに沿った寸法全体にわたって延伸する第２のストリップセグメント（第２セグメントＳＰと呼ばれる）を含む。
この実施形態ではしたがって、メタ表面は、ｙに沿って直線的である連続的ストリップＭ２のｘに沿ったアレイを含み、各連続的ストリップ間に、ｙに沿ってまた延伸する点線のストリップＭ１を有する。
実効媒体領域を実現するために十分である実効屈折率勾配をメタ表面のパターン内で生成するために、及びしたがって入射放射線が偏向又は回折されることを保証するために、パターンＥ１内で第１のストリップ（したがって点線Ｐ）の面積が第２のセグメントＳＰの面積より小さいことが必要である。これらの面積は、点線により形成される領域と連続的ストリップＭ１により形成される領域との間の十分な実行屈折率変動を生成するように数値シミュレーションを介し判断される。
同様に、点線Ｐ間の間隔は、点線により形成される領域の実効屈折率に影響を与え、及び、数値シミュレーションにより判断される。
連続的な第２のストリップＭ２に対する点線の第１のストリップＭ１の相対位置Δｙは、方向ｘにおける対称性の破綻を生成する効果があり、これは、メタ表面が入射放射線の強度を回折の別の次数よりむしろ次数１へ方向転換することを可能にする。第２のストリップに対する第１のストリップのこの相対位置は、メタ表面のすべての要素の寸法に依存しており、及び数値的ＲＣＷＡシミュレーションにより最適化される（ＲＣＷＡは、ｒｉｇｏｒｏｕｓ ｃｏｕｐｌｅｄ－ｗａｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（厳密結合波解析）の頭文字語である）。
非限定的例として、この第１の実施形態では、第１のストリップの幅ｌ１は３０ｎｍ～５００ｎｍに含まれ、第２のストリップの幅ｌ２は１００ｎｍ～７００ｎｍに含まれ、及び点線Ｐの長さは６０ｎｍ～８００ｎｍに含まれる。方向ｘにおけるパターンの寸法Ｐｘは３００ｎｍ～１０００ｎｍに含まれ、及びサブパターンの方向ｙにおける寸法Ｐｙは３００ｎｍ～１０００ｎｍに含まれる。ストリップの深さ（方向ｚにおけるメタ表面の寸法）は１００ｎｍ～５００ｎｍに含まれる。通常、波長λは４００ｎｍ～８００ｎｍに含まれる。
図３Ｂは、－５°と５°の間に含まれる入射角の範囲に関する本発明の第１の実施形態による回折光学素子の回折効率を示す。非限定的に与えられるこの例では、第１のストリップの幅は１６０ｎｍに等しく、第２のストリップの幅は６１ｎｍに等しく、及び点線の長さは３２２ｎｍに等しい。第２のストリップに対する第１のストリップの相対位置は１８６ｎｍに等しい。方向ｘにおけるパターンの寸法Ｐｘは４６５ｎｍに等しく、及び方向ｙにおけるサブパターンの寸法Ｐｙは４６５ｎｍに等しい。これらの透過率は６４０ｎｍにおいて取得される。
回折次数－１の効率は、回折次数＋１の効率より高く、及び回折次数０の効率より非常に明確に高い。０°の入射角に関して、回折次数－１の効率は５５％に等しく、回折次数＋１の効率は１５％に等しく、及び回折次数０の効率は約３％である。この例では、回折角θｄは６５°に等しい。
したがって、図３Ａのメタ表面の構造は、入射放射線が主として回折次数－１へ方向転換されることを可能にし、次数０の透過率を非常に低く維持する。
図４Ａは本発明の第１の実施形態の一変形形態による回折光学素子の概略図を示す。この変形形態では、回折光学素子のメタ表面の各サブパターンＥ２は、第１のストリップＭ１の２つの逐次的点線Ｐ間の置かれた円盤Ｃを含む。したがって第１のストリップＭ１は方向ｙにおける点線と円盤Ｃとの交番で形成される。
第１の実施形態のこの変形では、円盤Ｃの径及びサブパターンＥ２内の方向ｙにおける点線Ｐに対するその位置は、パターンＥ１の実効屈折率に対するサブパターンＥ２内の好適な実効屈折率を生成するようにＲＣＷＡシミュレーションにより最適化される。
非限定的例として、第１の実施形態のこの変形形態では、円盤の径は３０ｎｍ～５００ｎｍに含まれ、及びサブパターンの点線からの方向ｙにおけるその分離は２０ｎｍ～１００ｎｍに含まれる。
図４Ｂは、－５°～５°に含まれる入射角の範囲に関する本発明の第１の実施形態の変形形態による回折光学素子の回折効率を示す。非限定的に与えられるこの例では、第１のストリップＭ１の幅は１７０ｎｍに等しく、第２のストリップＭ２の幅は３１ｎｍに等しく、及び点線Ｐの長さは２４６ｎｍに等しい。第２のストリップＭ２に対する第１のストリップＭ１の相対位置は１２３ｎｍに等しい。円盤の径は１１２ｎｍに等しく、及びサブパターンの点線からの方向ｙのその分離は５３ｎｍに等しい。方向ｘにおけるパターンの寸法Ｐｘは４６５ｎｍに等しく、及びサブパターンの方向ｙの寸法Ｐｙは４６５ｎｍに等しい。これらの透過率は６４０ｎｍにおいて取得される。
したがって、この変形形態では、メタ表面はｙに沿って直線的である連続的ストリップＭ２のｘに沿ったアレイを含み、各連続的ストリップ間に、ｙに沿ってまた延伸する点線のストリップＭ１を有し、点線ストリップは各点線間に円盤Ｃを含む。
回折次数－１、＋１の効率は回折次数０の効率より非常に明確に高い。したがって、－５°の入射角に関して、回折次数－１の効率は５１％に等しく、回折次数＋１の効率は２０％に等しく、及び回折次数０の効率は１％未満である。回折次数＋１の効率は回折次数－１の効率に相当する。この例では、回折角θｄは６５°に等しい。
したがって、図４Ａのメタ表面の構造は、入射放射線が主として回折次数－１へ方向転換されることを可能にする一方で、次数０の透過率を極低く維持する。
本発明の別の主題は、上述のような回折光学素子１０を含む全反射蛍光顕微鏡検査法により試料を撮像するためのデバイスＤ１である。デバイスＤ１の概略図が図５に示される。
デバイスＤ１は、基板が透明であるスペクトル範囲内で光線Ｌｉｎを発射するための少なくとも１つの光源ＳＬを含む。回折光学素子は、波長λにおいて光源ＳＬにより発射された光線が入射角θｉでメタ表面ＭＳにぶつかるように、及び前記回折光学素子により回折された光線Ｌｄｉｆｆが基板の第２の面により全反射を介し反射されるように構成され、及び、消散波ＯＥを基板の第２の表面Ｓｅの少なくとも１つの領域内に生成する。
デバイスＤ１はさらに、前記消散波が生成され及び前記消散波により励起された蛍光放射線Ｆｌを生成する第２の表面の少なくとも１つの領域に応じて置かれた試料Ｅｃｈを含む。
一実施形態では、試料Ｅｃｈは細胞培養の試料であり、細胞は、水溶性媒体内に保存され、及び基板ＳＢと同一である材料で作られたスライド上で培養される。回折放射線Ｌｄｉｆｆの回折角θｄは前記基板と水との間の全反射の臨界角より大きいので、第２の表面Ｓｅと水溶性媒体との間の界面において回折された放射線の全反射が消散波ＯＥを生成する。これらの波形は、薄層（約１００ｎｍの厚さの）内に（試料内に）位置し及び蛍光画像の生成に寄与する蛍光体を励起する。
デバイスＤ１は加えて、蛍光放射線Ｆ１を収集するために好適である対物レンズＯｂｊであって試料により発射された前記蛍光放射線を検出するために好適な検出器Ｄｅｔの方向へ向けるために好適な対物レンズＯｂｊを含む。
回折放射線の伝搬の角度は基板内で一定のままなので、回折放射線は、基板の全長にわたって伝播し、消散波を基板の表面から反射の各領域内に生成する。これは、基板の方向ｘの寸法が許せば、消散波が生成される基板の表面から複数の反射の領域、したがって蛍光放射線が試料内で励起され得る複数の領域が存在することとなる、ということを意味する。
消散波が生成される領域の横寸法（方向ｘ、ｙにおける）は、メタ表面ＭＳの横寸法及び入射放射線Ｌｉｎの光線の径の横寸法のうちの最小値により設定される。
メタ表面ＭＳの方向ｘにおける全横方向寸法は、回折角θｄ及び基板の厚さｅにより設定される。具体的には、基板の第２の表面Ｓｅにより反射された回折放射線（反射放射線Ｌｒと呼ばれる）は、メタ表面ＭＳを介して基板から抽出されてはならない。したがって、方向ｘにおけるメタ表面の横方向寸法ｘＭＳは、ｘＭＳ＜２ｅｓｉｎθｄが成立するようにされる。
デバイスＤ１は、ＴＩＲＦ顕微鏡検査法が本発明による回折光学素子１０を使用することにより試料Ｅｃｈに対し行われることを可能にする。この回折光学素子１０は、入射放射線が、光学的回折素子の基板と試料との間の界面において消散波を生成するために好適な方向に回折光学素子の基板を通って伝播するのに十分に偏位することを可能にする。
したがって、デバイスＤ１は、細胞膜へ局所化される構造及び処理が回折限界よりはるかに良い軸方向の空間分解能で選択的に観測されることを可能にする。
加えて、デバイスＤ１は、ＴＩＲＦ顕微鏡検査法が高ＮＡの対物レンズを使用すること無く行われることを可能にし、従来技術のＴＩＲＦ顕微鏡検査法デバイスに対してデバイスＤ１のコストを大幅に低減する。
さらに、デバイスＤ１の回折光学素子の回折次数０の透過率は非常に低いので、入射放射線の直接透過の結果として試料により発射されるエピ蛍光放射線の強度は大幅に低減される。この放射線により生成される背景雑音は低減され、試料の薄層の蛍光画像のコントラストは改善される。
本発明の一実施形態によると、光源ＳＬと回折光学素子との間の入射光放射線の経路は自由空間を通る。この実験的配置は、単純であり、試料の励起領域が容易に制御されることを可能にする。この実施形態では、光源はメタ表面ＭＳに極近接して置かれたレーザ源又はＬＥＤ光源であり得る。光源が、メタ表面ＭＳに極近接して置かれたＬＥＤ光源である場合、試料Ｅｃｈを、メタ表面ＭＳから方向ｘにおいて横に遠い消散波が生成される基板の第２の表面Ｓｅの領域の上に置くことが有利である。換言すれば、基板の表面からの複数の反射に対応する領域の上に試料を置くことが有利である。具体的には、メタ表面により散乱される寄生放射線（すなわちＬＥＤにより発射された放射線）であって試料を照射する寄生放射線の強度は大幅に低減される。したがって、この寄生放射線により生成される背景雑音は低減され、コントラストが改善される。
代替的に、別の実施形態によると、光源ＳＬと回折光学素子との間の入射光放射線の経路は光ファイバを通り、及びデバイスＤ１は、光線Ｌｉｎが回折光学素子のメタ表面ＭＳの方向へ向けられることを可能にする光ファイバ結合器（図５に示さない）を含む。本実施形態の利点は、光ファイバ結合器の好適な配置後は、その後のアラインメントを必要としないということである。この実施形態では、光源ＳＬはレーザ源である。
代替的に、別の実施形態によると、対物レンズＯｂｊはまた、メタ表面ＭＳに入射する放射線Ｌｉｎを平行にするために好適である。この実施形態では、デバイスＤ１は、光源ＳＬにより発射された入射放射線Ｌｉｎを対物レンズＯｂｊの物体焦点面上へ収束させる別のレンズ（図示せず）を含み、このとき放射線の像は対物レンズＯｂｊの画像面内の無限遠に合焦される。この実施形態では、入射放射線の入射角θｉは、反射放射線Ｌｒが対物レンズにより収集されないように構成される。
本発明の一実施形態によると、回折光学素子は基板Ｓｍの前記第１の表面上に置かれる複数のメタ表面ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳｎを含み、各メタ表面のパターンの前記方向ｘにおける寸法Ｐｘは異なる。したがって、各メタ表面は、他のメタ表面により回折される波長とは異なる波長の光線Ｌｉｎを回折するように構成される。本発明の本実施形態では、図５の撮像デバイスＤ１は波長チューニング可能であるという利点を有する。
本発明の別の主題は、本発明による回折光学素子を含む表面プラズモン共鳴を介し生体試料を検出するためのデバイスＤ２である。デバイスＤ２の概略図が図６に示される。
図６のデバイスの回折光学素子は複数（ｎ個）のメタ表面ＭＳ１、ＭＳｉ、…、ＭＳｎを含み、各メタ表面の前記パターンの前記方向ｘにおける寸法Ｐｘは、第ｉ番目メタ表面ＭＳｉにより回折された放射線Ｌｄｉｆｆが角度θ（ｄ，ｉ）で基板の前記第２の表面Ｓｅにぶつかるように、異なる。
図６のデバイスＤ２はさらに、基板が透明であるスペクトル範囲内で光線Ｌｉｎを発射するために好適な少なくとも１つの光源ＳＬを含む。この光源は、光線が入射角θｉでメタ表面に入射するように構成される。
図６のデバイスＤ２はさらに、少なくとも１つの第２の基板Ｓ２、第２の基板の上に置かれた金属層Ｍｅｔ、及び金属層の上に置かれた被解析層Ａｎを含む試料Ｅｃｈを含む。
本発明の一実施形態によると、被解析層は水溶性層である。
試料Ｅｃｈは、前記回折放射線が試料の金属層により少なくとも部分的に反射されるように第１の基板ＳＢの上に置かれ、これにより反射放射線Ｌｒが形成される。
デバイスＤ２の回折光学素子はさらに、基板の第１の表面Ｓｍ上に置かれた光結合素子ＭＳｏｕｔであって試料により反射された前記光線Ｌｒを自由空間へ結合するために好適な光結合素子ＭＳｏｕｔを含む。
本発明の一実施形態によると、光結合素子ＭＳｏｕｔは、互いに垂直であり及び基板の表面に平行である２つの方向ｘ、ｙにおいて周期的であるパターンＥ１の繰り返しを介し形成される少なくとも１つの出口メタ表面を含み、前記パターンは、ｙに沿って直線的である第１のストリップセグメントＰを含むサブパターンＥ２を含み、前記出口メタ表面は基板の前記第１の表面Ｓｍ上に置かれる。
本発明の１つの好適な実施形態によると、光結合素子ＭＳｏｕｔは回折光学素子ＭＳｉｎの「鏡像」である。換言すれば、光学素子ＭＳｏｕｔ及び回折光学素子ＭＳｉｎは方向ｚに平行な軸を中心に互いに軸対称である。
図６のデバイスＤ２は、試料により反射され及び前記結合要素により自由空間へ結合された前記光線の強度を検出するために好適な検出器Ｄｅｔを含む。
一実施形態によると、デバイスＤ２は加えて、前記結合要素により自由空間へ結合された反射放射線Ｌｒを収集するために及び検出器Ｄｅｔの方向へ向けるために好適な対物レンズＯｂｊを含む。
回折光学素子は、メタ表面に関連付けられた回折角θｉが、金属面から反射されると、表面プラズモンの共振励起と前記回折放射線Ｌｄｉｆｆの少なくとも部分的吸収とを生成するように、構成された少なくとも１つのメタ表面ＭＳｉを含む。入射放射線が、金属層Ｍｅｔによる反射に関する表面プラズモン共鳴の励起を可能にする関連回折角θ（ｄ，ｉ）でメタ表面ＭＳｉにより偏位されると、回折放射線は部分的に吸収され、反射放射線Ｌｒの強度は低下する。
一実施形態によると、検出することが望まれ及び被解析層Ａｎ内に存在する特定生物分子の吸着を可能にするように構成された化学的機能化層が、試料の金属層Ｍｅｔの上に置かれる。
したがって、分子の有無を検出するために、光源ＳＬを使用することにより各メタ表面ＭＳを逐次的に照射することと、反射放射線Ｌｒの強度を使用することにより検出器Ｄｅｔを検出することとが必要である。被解析層Ａｎから検出される分子が無い状態での層Ｍｅｔの表面プラズモン共鳴の励起の角度を、θ（ＳＰＲ，０）とする。このとき、表面プラズモン共鳴は、回折角θ（ｄ，ｋ）＝θ（ＳＰＲ，０）に関連付けられたＫ番目メタ表面ＭＳｋにより励起される。この単一メタ表面ＭＳｋに関して、反射放射線Ｌｒの強度は、他のメタ表面により取得される反射放射線Ｌｒの強度と比較して低減される。
検出される分子が被解析層内に存在すると、これらは金属層Ｍｅｔへ吸着することになり、したがって、表面プラズモン共鳴が励起される角度を変更する。次に、表面プラズモン共鳴が励起される角度をθ（ＳＰＲ，１）とする。
したがって、表面プラズモン共鳴を励起する変化（回折角θ（ｄ，ｍ）＝θ（ＳＰＲ，１）に関連する）がメタ表面ＭＳｍ内で観測されると分子がメタ表面へ吸着した（反射放射線Ｌｒの強度が低下する）ということが検出される。
図６のデバイスＤ２は、従来技術のデバイスに対して著しく単純化されたアセンブリにより、表面プラズモン共鳴を介し生物学的検出を行うことを可能にする。より正確には、本デバイスは、入射放射線Ｌｉｎの波長又は入射角θｉが変更されることを必要することなく、表面プラズモン共鳴を介し検出を可能にする。加えて、本デバイスは、表面プラズモン共鳴を励起するためにプリズム（このようなプリズムは嵩張り、アラインメントするのが複雑である）を結合することを主に使用する従来技術のデバイスとは異なり、アラインメントすることが容易である。

Claims (11)

  1. － 第１の表面（Ｓｍ）と前記第１の表面に対向する第２の表面（Ｓｅ）とを有する基板（ＳＢ）であって、少なくとも１つのスペクトル範囲内で光に対して透明であり、及び前記スペクトル範囲内で水より高い屈折率を有する基板；並びに
    － 誘電材料で作られ及び前記基板の前記第１の表面（Ｓｍ）上に置かれた少なくとも１つのメタ表面（ＭＳ）であって、前記メタ表面は、互いに垂直であり且つ前記基板の表面に平行である２つの方向ｘ、ｙにおいて周期的であるパターン（Ｅ１）の繰り返しを介し形成され、前記パターンはｙに沿って直線的である第１のストリップセグメント（Ｐ）を含むサブパターン（Ｅ２）を含む、メタ表面（ＭＳ）
    を含む回折光学素子（１０）であって、
    前記メタ表面は前記方向ｙの点線（Ｐ）の第１のストリップ（Ｍ１）を含み、前記点線のストリップは前記サブパターンから形成され、
    前記周期パターンはさらに、前記メタ表面が、前記方向ｙにおいて連続的である第２のストリップ（Ｍ２）を含むように、前記方向ｙにおいて直線的である第２のストリップセグメントを含み、
    前記メタ表面は、回折放射線（Ｌｄｉｆｆ）を形成するために、前記スペクトル範囲に含まれる波長λの光線（Ｌｉｎ）であって入射角で入射する光線を回折するために好適であり、前記回折放射線は、前記基板を通って伝播し及び前記基板と水との間の全反射の限度角度θｃ以上の回折角θｄで前記基板の前記第２の表面（Ｓｅ）にぶつかるようなやり方で形成され、
    前記メタ表面は、前記入射角において、回折の次数０に関して５％未満の透過率を、及び回折の次数－１又は＋１に対応する回折放射線（Ｌｄｉｆｆ）に関して５０％より高い透過率を有するように構成される、
    回折光学素子。
  2. 前記パターン内で、前記第１のストリップの面積は前記第２のストリップの面積より小さく、前記第１のストリップの幅（ｌ１）は３０ｎｍ～５００ｎｍに含まれ、前記第２のストリップ（ｌ２）の幅は１００ｎｍ～７００ｎｍに含まれ、及び前記点線（Ｐ）の長さは６０ｎｍ～８００ｎｍに含まれる、請求項１に記載の回折光学素子。
  3. 前記サブパターンは前記第１のストリップの２つの逐次点線（Ｐ）間に置かれる円盤（Ｃ）を含む、請求項１又は２に記載の回折光学素子。
  4. 前記方向ｘの前記パターンの寸法（Ｐｘ）はＰｘ＜λ／ｎｅａｕが成立するようにされ、ｎｅａｕは水の屈折率である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の回折光学素子。
  5. 前記方向ｘの前記メタ表面の全寸法ｘＭＳはｘＭＳ＜２×ｅ×ｓｉｎθｄが成立するようにされ、ｅは前記基板の厚さである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の回折光学素子。
  6. 前記方向ｙのパターンの前記寸法（Ｐｙ）は３００ｎｍ～１０００ｎｍに含まれる、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の回折光学素子。
  7. 前記メタ表面の材料の屈折率は前記基板の材料の屈折率より高い、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の回折光学素子。
  8. 前記基板の前記第１の表面（Ｓｍ）上に置かれた複数のメタ表面（ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳｎ）を含み、
    各メタ表面のパターンの前記方向ｘの寸法（Ｐｘ）は、各メタ表面が、前記範囲に含まれる波長であって他のメタ表面により回折される波長とは異なる波長の光線（Ｌｉｎ）を回折するために好適であるように、異なる、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の回折光学素子。
  9. 請求項１乃至８のいずれか一項に記載の回折光学素子（１０）を含む、全反射蛍光顕微鏡検査法により試料を撮像するためのデバイス（Ｄ１）であって、
    － 前記入射角で前記回折光学素子に入射する前記光線（Ｌｉｎ）を前記スペクトル範囲内で発射するために好適な少なくとも１つの光源（ＳＬ）であって、前記回折光学素子による回折後、消散波（ＯＥ）を前記基板の前記第２の表面（Ｓｅ）の少なくとも１つの領域内に生成する、光源（ＳＬ）；
    － 前記消散波が生成され及び前記消散波により励起される蛍光放射線（Ｆｌ）を生成する前記第２の表面の少なくとも１つの領域に応じて置かれた試料（Ｅｃｈ）；及び
    － 前記試料により発射された前記蛍光放射線（Ｆｌ）を検出するために好適な検出器（Ｄｅｔ）
    を含むデバイス。
  10. 請求項１乃至９のいずれか一項に記載の回折光学素子（１０）を含む表面プラズモン共鳴を介し生体試料を検出するためのデバイス（Ｄ２）であって、前記回折光学素子は：
    － 複数のメタ表面（ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳｎ）であって、各メタ表面のパターンの前記方向ｘの寸法（Ｐｘ）は、各メタ表面により回折される前記放射線Ｌｄｉｆｆ）が異なる回折角θｄで前記基板の前記第２の表面（Ｓｅ）にぶつかるように、異なる、複数のメタ表面を含み；
    前記デバイスはさらに：
    － 前記入射角で前記回折光学素子に入射する前記光線（Ｌｉｎ）を前記スペクトル範囲内で発射するために好適な少なくとも１つの光源（ＳＬ）；
    － 少なくとも１つの第２の基板（Ｓ２）、前記第２の基板の上に置かれた金属層（Ｍｅｔ）、及び前記金属層の上に置かれた被解析層（Ａｎ）を含む試料（Ｅｃｈ）であって、前記試料は、前記回折放射線が、前記試料の前記金属層により少なくとも部分的に反射される（Ｌｒ）ように前記第１の基板（ＳＢ）の上に置かれ、前記回折光学素子はさらに、前記試料により反射された前記光線を自由空間へ結合するために好適な光結合素子（ＭＳｏｕｔ）を含む、試料（Ｅｃｈ）；
    － 前記試料により反射され及び前記結合要素により自由空間へ結合される前記光線の強度を検出するために好適な検出器（Ｄｅｔ）であって、少なくとも１つのメタ表面は、前記メタ表面に関連付けられた前記回折角が、前記金属面から反射されると表面プラズモンの共振励起と前記回折放射線（Ｌｄｉｆｆ）の少なくとも部分的吸収とを生成するように構成される、検出器（Ｄｅｔ）
    を含む、デバイス。
  11. 前記光結合素子は、互いに垂直であり及び前記基板の表面に平行である２つの方向ｘ、ｙにおいて周期的であるパターン（Ｅ１）の繰り返しを介し形成される少なくとも１つの出口メタ表面を含み、前記パターンは、ｙに沿って直線的である第１のストリップセグメント（Ｐ）を含むサブパターン（Ｅ２）を含み、前記出口メタ表面は前記基板の前記第１の表面（Ｓｍ）上に置かれる、請求項１０に記載のデバイス。
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