JP2022550901A - 核酸治療薬のための腫瘍標的化ポリペプチドナノ粒子送達システム - Google Patents

核酸治療薬のための腫瘍標的化ポリペプチドナノ粒子送達システム Download PDF

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Abstract

標的化機能を有する線状ヒスチジン－リジンリッチなシステイン含有ペプチド及び４分岐ヒスチジン－リジンリッチなポリペプチドを含む新規の核酸送達システムが提供される。送達システムは、ｓｉＲＮＡのような核酸を含む。前記成分は、ｓｉＲＮＡのホスフェートとポリペプチドのヒスチジン／リジンとの間の非共有結合的相互作用を介して安定なナノ粒子複合体を形成し、毒性が低減され、遺伝物質を選択的に細胞へ送達する。標的化機能により、核酸送達及びトランスフェクションの効率が向上する。特定の細胞に治療的分子を送達する能力を有する担体分子も提供される。担体分子は、標的化される細胞上で特定の受容体に結合することができる標的化リガンドで修飾されている。治療的分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は他のオリゴヌクレオチドである。標的化部分は、標的化される細胞上に存在する受容体に対して親和性を示す低分子、ペプチド、又はタンパク質である。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１９年１０月４日出願の、米国仮特許出願第６２／９１０，７６０号及び２０１９年１０月１５日出願の米国仮特許出願第６２／９１５，４５０号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
核酸の送達システム及び使用方法が提供され、核酸分子の標的化送達又は局所的送達の方法が含まれる。
治療薬の標的化送達は、有効性を上昇させながら、副作用を低減させ、腫瘍処置を改善するために、大きな興味及び利益を引き寄せている。腫瘍中のナノ粒子（ＮＰ）の集積は、血管透過性滞留性亢進（ＥＰＲ）効果によるものであると考えられている（Ｍａｅｄａ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１：７９７～８０２（２０１０））。そのため、腫瘍送達は、粒子を腫瘍局在性リガンドでコーティングすることにより改善し得る。リガンドがカーゴ（例えばｓｉＲＮＡ）の抗腫瘍有効性を上昇させる機構は未だ議論されている。腫瘍表面マーカーへの結合が増強すれば、非標的化組織と比較して、腫瘍におけるＮＰの集積を上昇させ得る。他の研究者は、腫瘍細胞内の標的化及び非標的化ＮＰの集積が同等であると主張してきた。標的化ＮＰの有効性の上昇は、受容体介在性のエンドサイトーシスの増強及びｓｉＲＮＡ治療薬の細胞内局在の上昇により引き起こされると示唆された。Ｂａｒｔｌｅｔｔら、（２００７）：Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：１５５４９～１５５５４（２００７）。両方の機構が、リガンド標的化治療及び有効性において必須の役割を果たしている可能性が最も高い。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの標的化送達は挑戦的であり、これは、血清ヌクレアーゼによる分解及び急速なクリアランス、エンドソーム捕捉、並びにナノ粒子（ＮＰ）による自然免疫刺激によるものである。近年、ｓｉＲＮＡの標的化送達について、前臨床及び臨床治験において非常に限定的な方法が開発されている。１つの手法は、Ａｌｎｙｌａｍによるものである。これにより、合成トリアンテナリーＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａＬＮＡｃ）ベースのリガンドが化学修飾されたｓｉＲＮＡにコンジュゲートしているＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡが開発された。これにより、ＡＳＧＰＲ介在性の肝細胞への効率的な送達が可能になった。Ｍａｊａら；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、９：７２３（２０１８）。ＧａＬＮＡｃは、肝臓において、肝臓特異的アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を標的とする。他の例は、Ｓａｎｏｆｉ Ｇｅｎｚｙｍｅによる、血友病及び希少出血性疾患（ＲＢＤ）の治療のためのＦｉｔｕｓｉｒａｎ（ＡＬＮ－ＡＴ３、第二相臨床治験、Ａｌｎｙｌａｍ）である。これは、皮下投与され、ＲＮＡｉ治療薬は、アンチトロンビン（ＡＴ）を標的とすることを目的としている。別の事例では、標的化リガンドが、複数の成分がｓｉＲＮＡと共に共組織化したときに、リポソーム製剤に組み込まれた。この種類のシステムは、リポソームの安定性、生体適合性、毒性、大規模の製造及び長期保存の点で、課題を多く保持している。Ｌｅｎｇら、Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ＩＤ６９７１２９７、（２０１７）。最も近年には、ポリペプチド／ポリマー及びｓｉＲＮＡにより形成されたナノ粒子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてｓｉＲＮＡを効率的に送達し、これらの生成物のいくつかは、早期臨床治験に入っている。例えば、ヒスチジン（Ｈ）－リジン（Ｋ）リッチなポリペプチドは、二重ｓｉＲＮＡをその標的に安全かつ有効に送達し、その治療的有効性を達成している。リード薬物の１つは、第ＩＩａ相臨床治験で試験されている。参照：Ｚｈｏｕら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、８：８０６５１～８０６６５（２０１７）；国際公開第２０１１／１４０２８５号。
発明の概要
腫瘍標的化ＨＫＣ／ＨＫＰ又はＨＫＰ（＋Ｈ）ポリペプチドナノ粒子送達システムを示す図である。グラフは、（Ａ）特異的なヒスチジン／リジン配列を有する分岐状ポリペプチドＨ３Ｋ４Ｂ（ＨＫＰ）又はＨ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂ又は（ＨＫＰ（＋Ｈ））、（Ｂ）腫瘍標的化リガンド、例えばＲＧＤ、葉酸、又はＳｍＡｂ等を有する末端システインによって官能化された線状ポリペプチドと、選択されたｓｉＲＮＡとの間の腫瘍標的化ポリペプチドナノ粒子の形成及びＨＫＣポリペプチド－ｓｉＲＮＡナノプレックス形成を示す。 ＨＫＣ－ＰＥＧ－標的化リガンド官能化ポリペプチド（ＨＫＣ＝ＨＫＣ１、ＨＫＣ２又はＨＫ２Ｃ、図３参照）の調製の概略図である。ＨＫＣは、穏やかな条件下でチオール／マレイミド付加反応を介してマレイミド官能化ＰＥＧ連結標的化モチーフ、例えば（葉酸、ＲＧＤ、ｍＡｂ等）とコンジュゲートした末端システインを有する。 Ｈ３Ｋ４ｂ（略語ＨＫＰ）分岐状ペプチドの構造、末端部位に１つのシステインを有するＨ３Ｋ４Ｃ（略語ＨＫＣ１又はＨＫＣ）の構造、及び配列中に２つのシステインを有するＨＫＣ２の構造を示す図である。配列［（ＫＨＨＨ）４］２ＫＸＣを有する２分岐システイン含有ペプチドＨＫ２Ｃ。 ＨＫＣのＨＰＬＣクロマトグラム、逆相Ａｌｌｔｉｍａ（商標）カラムＣ－１８（４．６ｘ２５０ｍｍ）、室温における溶出＝１５．１９６、水（０．０６５％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）の勾配による、＞９１％を示す図である。 １３３５．６［Ｍ］２＋に二重電荷分子イオンピークが観察された、ＨＫＣ１化合物の質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ、正）を示す図である。 ＨＫＣ２－Ｐｅｇ１０００－葉酸の調製経路を示す図であり、ＨＫＣ１は、塩基性条件下のチオール／マレイミド付加反応を介してマレイミド－ＰＥＧ－葉酸と反応し、コンジュゲーション生成物が得られた。溶媒を除き、次いで透析による精製の後、ＨＫＣ１－Ｐｅｇ１０００－葉酸が得られた。 １Ｈ ＮＭＲによるＨＫＣ２－ＰＥＧ１ｋ－葉酸の特徴づけを示す図であり、（上）Ｄ２Ｏ中のＨＫＣ２及び（中央）ＤＭＳＯ－ｄ６中のＨＫＣ２－ＰＥＧ１ｋ－葉酸及び（下）葉酸－ＰＥＧ１ｋ－Ｍａｌである。ＨＫＣは、葉酸－ＰＥＧ１ｋ－Ｍａｌと共有結合し、７．０ｐｐｍにおけるマレイミド二重結合の特徴的なシグナルは、システインとの反応後消失した。 水中のＨＫＣ２－ＰＥＧ１ｋ－葉酸（上部、赤色曲線）及び葉酸－ＰＥＧ１ｋ－Ｍａｌ（下部、灰色曲線）のＵＶ／Ｖｉｓ（水、２５℃）分光分析を示す図である。ペプチドについては２２０ｎｍ及び葉酸については２７５ｎｍにおける特徴的な吸収度が生成物スペクトルにおいて観察された。 ＨＫＣ２－ＰＥＧ１ｋ－葉酸のＭＡＬＤＩ－ＭＳ（正）分光分析を示す図であり、４３０２Ｍ＋周辺の分子イオンピークは、カップリング反応からのＨＫＣ２の変換が成功していることを示す。 ２工程のＨＫＣ２－ＰＥＧ２ｋ－ＲＧＤの調製を示す図である。第１の工程は、ｃ（ＲＧＤｆｋ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びマレイミド（Ｍａｌ）官能基を有する二官能性ＰＥＧ分子の間のカップリングであって、アミンとＮＨＳの間のカップリングを介してアミド結合が形成される。第２の工程において、ＨＫＣのチオールは、ＲＧＤ－ＰＥＧ２０００－Ｍａｌのマレイミドと反応し、ＲＧＤ結合ＰＥＧリンカーポリペプチドＨＫＣ２－ＰＥＧ２０００－ＲＧＤが得られる。 １Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６、２５℃）分光分析によるＲＧＤ－ＰＥＧ２ｋ－Ｍａｌ中間体の特徴づけを示す図である。８．５～７．２ｐｐｍにおけるＲＧＤシグナル及び７．００ｐｐｍにおけるマレイミドシグナル、約３．５ｐｐｍにおけるＰＥＧエチレンのブロードピークを観察し得る。 ＲＧＤ標的化リガンドによるＨＫＣ２誘導体化の１Ｈ ＮＭＲ分光分析によるＨＫＣ２－ＰＥＧ－ＲＧＤの特徴づけのスタックプロット比較を示す図である。 システイン上のチオールとＭａｌの間のカップリングを介したＳ－Ｃ結合を形成する、ＨＫＣ１とマレイミド（Ｍａｌ）官能基を有する三価ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ分子とのコンジュゲーションからのＨＫＣ１－ＰＥＧｎ－ＧａｌＮＡｃ（ｎ＝６、１２、２４）の調製を示す図である。 ナノ粒子形態のＨＫＣ：ＨＫＰ：ＴＧＦβ１の製剤及びそのサイズ分布を示す図である。ＨＫＣ＝ＨＫＣ２＝Ｋ（ＨＨＨＫ）４ＣＳＳＣ、ＨＫＰ＝Ｈ３Ｋ４ｂ。 ナノ粒子形態のＨＫＣ：ＨＫＰ：ＴＧＦβ１の製剤及びその多分散指数を示す図である。ＨＫＣ＝ＨＫＣ２＝Ｋ（ＨＨＨＫ）４ＣＳＳＣ、ＨＫＰ＝Ｈ３Ｋ４ｂ。 ＨＫＰ単独又は種々の量のＨＫＰ及びＨＫＣ２と組み合わせて製剤化したＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡによる処置のヒト膠芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞の生存率に対する効果を示す図である。ＨＫＣ２（１６０ｎｇ／μＬ）、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μＬ）及びｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μＬ）の水溶液を規定の比率で混合し、室温で３０分間インキュベーションした。トランスフェクション複合体を、ＯＰＴＩ－ＭＥＭで希釈し、新鮮な培地を補充した培地１００μＬ中の細胞に添加した。トランスフェクション培地を、６時間後に１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ又はＥＭＥＭに交換した。トランスフェクションの７２時間後に、生細胞の数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。未処置の細胞から得た値（ブランク）を１００％に設定した。全ての値は、ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡ、ＣＤ－Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡの４反復の±Ｓ．Ｄ．の平均を表す。 ＨＫＰ単独又は種々の量のＨＫＰ及びＨＫＣ２と組み合わせて製剤化したＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡによる処置のヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞の生存率に対する効果を示す図である。ＨＫＣ２（１６０ｎｇ／μＬ）、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μＬ）及びｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μＬ）の混合物の水溶液を室温で３０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体は、ＯＰＴＩ－ＭＥＭで希釈し、新鮮な培地を補充した培地１００μＬ中の細胞に添加した。トランスフェクション培地は、６時間後に１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ又はＥＭＥＭに交換した。トランスフェクションの７２時間後に、生細胞の数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。未処置の細胞から得た値（ブランク）を１００％に設定した。全ての値は、ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡ、ＣＤ－Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡの４反復の±Ｓ．Ｄ．の平均を表す。 ＨＫＣ２－ＰＥＧ１ｋ－葉酸、Ｈ３Ｋ４ｂ（ＨＫＰ）及びｓｉＲＮＡの間での自己組織化を介した製剤及びナノ粒子形成を示す図である。ＴＧＦβ１を、水中で８０ｎｇ／μＬで使用し、等容積の水中ＨＫＣ及びＨＫＰと混合した。 ＨＫＣ１－ＰＥＧ－葉酸、Ｈ３Ｋ４ｂ（ＨＫＰ）及びｓｉＲＮＡの間での自己組織化を介したナノ粒子形成の多分散指数を示す図である。ＴＧＦβ１（水中８０ｎｇ／μＬ）と等容積の水中ＨＫＣ及びＨＫＰを混合した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ送達のために核酸を腫瘍標的化するための新規の手法が提供される。本明細書で使用する、ヒスチジン（Ｈ）－リジン（Ｋ）リッチなポリペプチド（ＨＫＰ）は、核酸結合ドメインを含み、非細胞特異的形質導入機能（例えば、細胞膜を非選択的に通過する能力）を提供する４分岐反復（Ｈ３Ｋ）４単位を含む、正に荷電したペプチドを記載するのに使用した。Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３５、８４６～８５５（２０１４）。Ｈ３Ｋの４反復単位及び、末端の標的化リガンドを有する線状ペプチド（略語ＨＫＣ）を使用した。このペプチドは、核酸結合ドメイン及び細胞特異的標的化機能の両方を含むため、物質が細胞膜を通過し、特異的に核酸を特定の細胞種に送達するのを補助し得る。
いくつかの実施形態において、目的の標的細胞に核酸を送達するための組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、分岐状ポリペプチド（ＨＫＰ）及び線状ペプチド（ＨＫＣ）を含む。さらなる別の実施形態において、この組成物は、１つ又は複数の核酸を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
いくつかの実施形態において、４分岐ヒスチジン－リジンリッチなポリペプチドは、ａ）核酸を１つ又は複数の特定の細胞種への標的化、及びｂ）標的化された核酸の特定の細胞内相互作用部位への送達に有効な担体である特定の構造及び機能的な性質を有する線状ペプチドを有する製剤において使用する。いくつかの実施形態において、線状ペプチドは、細胞特異的な標的化リガンド（例えば、低分子又は環状ペプチドベースのホーミングドメイン）を含み、これは、核酸に結合し、かつ標的化された細胞のサイトゾルに核酸を送達するのを補助する細胞配向及び輸送性質を提供する正に荷電した線状ＨＫＣペプチドとコンジュゲートされている。
他の態様において、直接的な共有結合性連結戦略によって担体を送達するための標的化リガンドをコンジュゲートするための方法が提供される。いくつかの実施形態において、標的化リガンド（例えば、葉酸、ＲＧＤ又はペプチド）は、共有結合の形成による化学反応を介した、線状ヒスチジン－リジンリッチなシステイン含有（ＨＫＣ）ペプチドと効果的にコンジュゲートされていた。この方法は、種々の標的化リガンドを、標的核酸を保護するための送達システムに導入するための多用途プラットフォームを提供する。正に荷電したペプチドＨＫＣとリガンドとの間の化学的コンジュゲーションは、ジスルフィド結合、チオール／マレイミドからの硫黄－炭素結合、又は任意の他の共有結合又はヒドラジン及びアミド等の生分解性結合でもよいが、この種類に必ずしも限定されるものではない。
さらに他の態様において、標的化リガンドを有する線状ペプチドであるポリペプチド（ＨＫＰ）、及び腫瘍標的化のためのｓｉＲＮＡのナノ粒子製剤化のための新規の方法が提供される。いくつかの実施形態において、核酸は、細胞標的に結合するモチーフを含む標的化線状ポリペプチド及び分岐状ポリペプチドを含む複合体中で送達される。２つのペプチドを、ナノ粒子形態で、標的核酸との混合物中で規定の比率で製剤化する。いくつかの実施形態において、ペプチド／核酸複合体の負電荷（例えば核酸から）の正電荷（例えば、ペプチド及びポリペプチド）に対する比率は、複合体の非細胞特異的な形質導入性質の強さに影響を与え得る。
他の態様において、１つ又は複数の核酸を細胞標的に送達するための組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態において、ペプチド／核酸複合体において、１つ又は複数の核酸は、同時にナノ粒子内で送達された。いくつかの実施形態において、化学療法薬物は、ナノ粒子複合体内で共製剤化し得る。これは、腫瘍の治療のための組合せ両方に利点及び利益を提供する。
したがって、これら及び他の態様は、任意の目的の細胞を標的化するために、任意の種類の標的化モチーフを導入し得るシステムである送達プラットフォームを提供する。いくつかの実施形態において、リンカー（例えば、ｐｅｇ又はポリマー）を介して標的リガンドをペプチドにコンジュゲーションする段階的な方法が開発され、本出願で提示されている。種々の標的化リガンドは、目的の任意の細胞種に対する特異的な形質導入性質を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＫ正反復単位を有するペプチド中の結合ドメインは、ヒスチジンとホスフェートとの間の水素結合及びプロトン化したリジンとホスホネートとの間のイオン－イオン相互作用を介して負に荷電した核酸に結合する。核酸は保護され、目的の細胞の標的化された領域に送達された。
標的化リガンドの観点において、ペプチドは、環状（ｃ）ＲＧＤ、ＡＰＲＰＧ、ＮＧＲ、Ｆ３ペプチド、ＣＧＫＲＫ、ＬｙＰ－１、ｉＲＧＤ、ｉＮＧＲ、Ｔ７ペプチド（ＨＡＩＹＰＲＨ）、ＭＭＰ２－切断可能オクタペプチド（ＧＰＬＧＩＡＧＱ）、ＣＰ１５（ＶＨＬＧＹＡＴ）、ＦＳＨ（ＦＳＨ－β、３３～５３アミノ酸、ＹＴＲＤＬＶＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴＦ）、ＬＨＲＨ（ＱＨＴＳＹｋｃＬＲＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）（ＣＧＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ）、ＲＶＧ（ＹＴＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ）でもよい。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、さらなる有効性のために１つのシステム内で二価又は三価のホモ又はヘテロペプチドリガンドの組合せに組み込むことができる。
したがって、本発明の態様は、モジュール性であり、任意の核酸を任意の目的の細胞に送達するのに適用し得る送達プラットフォームを提供する。いくつかの実施形態において、多価ペプチド成分と、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はＤＮＡとを含み、ナノ粒子を形成する組成物が提供される。複合体形成は、有効にｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はＤＮＡを保護し、細胞に送達する。いくつかの実施形態において、核酸は可逆的にペプチド担体に結合しており、これによって腫瘍特異的細胞に貫通し、核酸をエンドソームから放出し、標的遺伝子に到達させることが可能になる。
本明細書に記載するｓｉＲＮＡ送達担体の生成は、分岐状ポリペプチド（ＨＫＰ）、線状ペプチド（ＨＫＣ）及びｓｉＲＮＡを組み合わせることによって生じてよく、（ａ）正に荷電した線状ペプチド、例えば標的化基又は他の機能的部分を連結するための官能基を有するペプチドＨＫＣを調製し；（ｂ）生成物の共有結合及び回収を介して標的化リガンドの線状ペプチドＨＫＣへ結合させ；（ｃ）分岐状ポリペプチド（ＨＫＰ）、工程（ｂ）の標的化リガンドを有する線状ペプチドＨＫＣ及びｓｉＲＮＡを安定的に組み合わせて均一なナノ粒子を生成する工程を含む方法によって実施し得る。上記の方法において、工程は、同時に行って、それにより好ましい相互作用及びナノ粒子形成を可能にするものであってもよい。この方法によるポリマー性ナノ粒子は、水溶液の種々のｓｉＲＮＡと複合体を有効に形成してポリナノ粒子を形成し、これは、標的化効果を介して特定の疾患に選択的に集積させることができる。好ましくは、本明細書に記載するポリナノ粒子のサイズは、記載する生成方法に基づいて、１０ｎｍ～３０００ｎｍの範囲でもよい。前臨床試験によれば、好ましいサイズは、動的光散乱法によって決定される４０～３００ｎｍであろう。
さらに、本明細書に記載するＨＫＣポリペプチド－核酸送達システムは、薬学的組成物の有効成分として使用し得る。したがって、治療的有効用量のＨＫＣペプチド及び核酸を混合物形態で含む薬学的組成物が提供される。これは、投与方法と共に本明細書に記載されている、ＨＫＣポリペプチド－核酸送達システムに加えて、１つ又は複数の種類の薬学的に適合性のポリマー又は担体を含み得る。
得られた生成物は、例えば、散剤、液剤、固相、カプセル剤、又は注入可能な形態等の形態で製剤化されてよく、これは、核酸－ペプチドポリナノ粒子の安定性及び有効性を維持するために１つ又は複数の有効な成分、例えば食塩水溶液、バッファー溶液又は他の適合性の成分と混合されてもよい。
本明細書に記載する薬学的組成物は、標準的な方法、例えば経口又は非経口投与によって投与し得る。
実施例１．ペプチド ＨＫＣ１及びＨＫＣ２の合成
ＨＫＣ１の設計したペプチド配列（配列：ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＳＳＳＣ）を、固相合成装置によって図３に記載するように合成した。生成物を水（０．０６５％ＴＦＡ）及びアセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）を使用したＨＰＬＣによって精製し、ＨＰＬＣのクロマトグラムを図３Ａに示す。Ｈ３Ｋ４Ｃ（略語ＨＫＣ１）の構造は、末端部位に１つのシステインを有する。構造を図３Ｂに示すように質量分析によってさらに確認した。
ＨＫ２Ｃの第２の設計したペプチド配列（配列：（ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２ＫＣＳＳＣ）を、固相合成装置によって図３Ｂに示すように同様の方法で合成した。
ＨＫＣ２の第３の設計したペプチド配列（配列：ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＣＳＳＣ）を、例えば米国特許第７，０７０，８０７号、同第７，１６３，６９５号及び同第７，７７２，２０１号に記載するように固相合成した。
実施例２．スルフィドマレイミドカップリング反応を介したＨＫＣ２ペプチドの架橋
図２は、カップリングの一般的なスキームを示す。Ｈ３Ｋ４Ｃ－ＰＥＧ－標的化リガンド官能化ポリペプチドの調製には、標的化モチーフで官能化されたＰＥＧを使用する。標的化モチーフ、例えば葉酸、ＲＧＤ及び／又はモノクローナル抗体を有するこのようなＰＥＧは、市販のものであっても、又は当技術分野において周知の方法を使用して事前に調製していてもよい。末端システインを有するＨＫＣを、マレイミド官能化ＰＥＧ連結標的化モチーフ、例えば（葉酸、ＲＧＤ、ｍＡｂ等）に、図２に示すように穏やかな条件下のチオール／マレイミド付加反応を介してコンジュゲートした。
実施例３．ＨＫＣ２ペプチドの葉酸との架橋
標的化リガンドを、カップリング反応におけるチオールとマレイミドとの間の共有結合の形成を介して、ＨＫＣペプチド上に取り付けた。図４は、ＨＫＣ２－ＰＥＧ１０００－葉酸を調製するためのスキームを示す。葉酸－ＰＥＧ１０００－Ｍａｌ（６．０ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解した後、無水ＤＭＦ中のトリメチルアミン（５２ｕＬ、０．７２６ｇ／ｍＬ）を添加した。脱気した水（１００μＬ）及びＤＭＦ（３００μＬ）の混合物中のＨＫＣ（１０．０ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）を、超音波処理及び撹拌によって、窒素下、２５℃で混合物に添加した。得られた混合物を窒素下、暗所、２５℃で１５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析によって、出発物質である葉酸－ＰＥＧ１０００－Ｍａｌが完全に消費され、反応が完了していることが示された。反応混合物を冷ジエチルエーテル溶液に注いで、黄色沈殿物を得た。混合物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、最上部の透明の上清を廃棄した。黄色沈殿物をアセトン（５．０ｍＬ）で洗浄して再度遠心分離し、上清を廃棄した後の生成物を回収した。生成物をさらに分取ＲＰ－ＨＬＰＣ又は水中での透析によって精製し、純粋な生成物を得た。生成物の溶液を凍結乾燥させ、前記生成物を黄色粉末として得た（１２ｍｇ、収率７５％）。
実施例４．１Ｈ ＮＭＲによるＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸の特徴づけ
ＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸の構造は、ＤＭＳＯ－ｄ６中の１Ｈ ＮＭＲによって特徴づけ、結果を図５に示す。試料約５ｍｇをＤ２Ｏ又はＤＭＳＯ－ｄ６に溶解し、ｎｍｒスペクトルを４００ＭＨｚで記録した。３つのスペクトルを重ね合わせ、差異を明確に見た。Ｄ２Ｏ中のＨＫＣ２が上部、ＤＭＳＯ－ｄ６中のＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸を中央、葉酸－Ｐｅｇ１０００－Ｍａｌを下部に示す。ＨＫＣは葉酸－Ｐｅｇ１０００－Ｍａｌに共有結合しており、７．０ｐｐｍにおけるマレイミド二重結合の特徴的なシグナルは、システインとの反応後に消失した。ＰＥＧ基のＣＨ２プロトンは、３．５ｐｐｍ領域に存在し、ペプチドプロトンは、ＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸の６．０～９．０ｐｐｍに位置する。
実施例５．ＵＶ／Ｖｉｓ分光分析によるＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸の特徴づけ
ＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸の構造をさらにＵＶ／Ｖｉｓ分光分析によって特徴づけ、結果を図６に示す。ＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸（上部、赤色曲線）及び葉酸－ＰＥＧ－Ｍａｌ（下部、灰色曲線）のＵＶ／Ｖｉｓ分光分析は、室温、水中で測定された。生成物スペクトルでは、ペプチドについては２２０ｎｍ、及び葉酸については２７５ｎｍに特徴的な吸光度が観察された。
実施例６．質量分析によるＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸の特徴づけ
ＨＫＣ２－ＰＥＧ－葉酸のＭＡＬＤＩ－ＭＳ（正）分光分析は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ分光計を使用して記録した。４３０２Ｍ＋付近の分子イオンピークの存在は、カップリング反応からのＨＫＣ１の変換が成功したことを示す。図７を参照のこと。
実施例７．ＨＫＣ２－ＰＥＧ２ｋ－ＲＧＤとしてＲＧＤリガンドを含むＨＫＣ２の調製
第１の工程：ｃ（ＲＧＤｆｋ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びマレイミド（Ｍａｌ）官能基を有する二官能性ＰＥＧ分子との間でカップリングを行い、アミンとＮＨＳエステルとの間のカップリングを介してアミド結合を形成する。図８を参照のこと。ｃ（ＲＧＤｆｋ）（５．０ｍｇ、８．２８μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０μＬ）を添加した。得られた混合物を室温、Ｎ２下で３０分間撹拌した後、Ｍａｌ－ＰＥＧ２ｋ－ＮＨＳ（１０ｍｇ、８．２８μｍｏｌ）を１回で添加し、１２時間２５℃で撹拌した。反応混合物を冷ジエチルエーテル（２０ｍＬ）に注いだ。混合物を４０００ｒｐｍで１０分間、５℃で遠心分離し、最上部の透明な上清を廃棄した。白色沈殿をアセトンに再懸濁し、冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）を添加し、５分間超音波処理した。４０００ｒｐｍ、５℃で１０分間再び遠心分離することによって、白色沈殿の回収が可能になった。減圧下で乾燥させて、ＲＧＤ－ＰＥＧ２ｋ－Ｍａｌ（１２ｍｇ、収率８０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）は、７．０ｐｐｍにおいてマレイミドに割り当てられたピークの存在を示したが、ＮＨＳエステル（２．８ｐｐｍ）についてのピークは存在しないことが示された。図９を参照のこと。
この物質を第２の工程に直接使用し、ここで、ＨＫＣ中のチオールが、ＲＧＤ－ＰＥＧ２ｋ－Ｍａｌのマレイミドと反応し、ＲＧＤ結合ＰＥＧリンカーポリペプチドＨＫＣ２－ＰＥＧ２ｋ－ＲＧＤを得た。ＨＫＣ２（５．４ｍｇ、２．０μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．６ｍＬ）と脱気した水（１００μＬ）との混合物に溶解した。ＨＫＣ２の溶液を、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したＲＧＤ－ＰＥＧ２ｋ－Ｍａｌ（５．０ｍｇ、１．６９μｍｏｌ）に撹拌しながら添加した。トリエチルアミン（１００ｕＬ、無水ＤＭＦ中１０μｇ／μＬ）を次いで添加し、混合物をＮ２下、２５℃で１５時間撹拌した。反応混合物を冷ジエチルエーテル（２０ｍＬ）に注いだ。混合物を４０００ｒｐｍ、５℃で１０分間遠心分離し、最上部の透明な上清を廃棄した。クルードな生成物を、水を交換しながら、水に対して２日間透析した。減圧下で乾燥させた後、生成物であるＨＫＣ２－ＰＥＧ２ｋ－ＲＧＤを得た（７．１ｍｇ、収率７５％）。生成物を１Ｈ ＮＭＲ（図１０参照）及び質量分析を含む分光分析法によって特徴づけた。
実施例８．ＨＫＣ－ＰＥＧｎ－ＧａｌＮＡｃとして三価ＧａｌＮＡｃリガンドを含むＨＫＣの調製
ＨＫＣ１（（ＫＨＨＨ）４ＫＳＳＣ）、１８．０ｍｇ、６．７５μｍｏｌ）をガラスバイアル中のリン酸バッファー、ｐＨ＝７．２に溶解した。無水ＤＭＦ（３００μＬ）中のＧａｌＮＡｃ３－ＰＥＧ６－Ｍａｌ（２９．３ｍｇ、１．５６μｍｏｌ）を５分間にわたってＨＫＣ１溶液にスプリンジ針によって添加した。得られた混合物を窒素雰囲気下で１６時間撹拌した。ＨＰＬＣモニタリングにより、出発物質ＧａｌＮＡｃが完全に消費されたことが示された後、クルード生成物をＰｉｅｒｃｅ デキストラン脱塩カラムを用いて精製し、純粋な生成物ＧａｌＮＡｃ３－ＰＥＧ６－ＨＫＣ１を１９ｍｇ、収率８０％で白色固体として得た。生成物を、質量分析により（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ 正）ｍ／ｚ４５９５．８２４［Ｍ＋Ｈ］、計算ＭＷ＝４５９５．９と特徴づけた。ＨＰＬＣ分析により、純度＞９０％が示された。ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ１２－ＨＫＣ１及びＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ２４－ＨＫＣ１を、ＧａｌＮＡｃ３－ＰＥＧ６－Ｍａｌを対応するＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ１２－Ｍａｌ及びＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ２４－Ｍａｌに置き換えることによって同様の方法で調製した。（図１１に示す反応スキーム）。
実施例９．ナノ粒子の形成におけるＨＫＣ：ＨＫＰ：ＴＧＦβ１の製剤及びそのサイズ分布。ＨＫＣ＝ＨＫＣ２＝Ｋ（ＨＨＨＫ）４ＣＳＳＣ。ＨＫＰ＝Ｈ３Ｋ４ｂ。（図１３）。
ＨＫＣ２、ＨＫＰ、ｓｉＲＮＡ（ＴＧＦβ１）のナノ粒子形成を、種々の比率で評価した。ＨＫＣ２をＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ製剤に添加すると、同等のナノ粒子サイズが維持されたが、コントロールＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（Ｎ：Ｐ質量比＝４：１）と比較して、有意に多分散指数（ＰＤＩ）が狭くなった。ＨＫＣ２／ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡは、質量比０：４：１、１：４：１、１：３：１、２：３：１、２：２：１、３：１：１で製剤化した。ＨＫＣ２（１６０ｎｇ／μＬ）、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μＬ）及びｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μＬ）の水溶液を規定の比率で混合し、３０分間室温でインキュベートした。次いで、得られた試料を、Ｎａｎｏｐｌｕｓ９０を用いた動的光散乱法により測定した。動的半径及び多分散指数を記録し、図１１及び図１２に示す。図１２から、サイズが、１２０ｎｍ（ＨＫＰ：ｓｉＲＮＡ＝４：１）から１００～１１３ｎｍ（ＨＫＣ２／ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ＝１：４：１、１：３：１、２：３：１）へとわずかに減少した。比率が２：２：１、３：１：１に上昇した場合、ナノ粒子サイズも１４０ｎｍ及び１８０ｎｍに上昇した。別の観点では、ＰＤＩは０．２２から０．１１～０．１７に低下しており、これはＨＫＣが被覆表面を充填していることによる利点である（図１３を参照）。
実施例１０．ＨＫＰ単独又は種々の量のＨＫＰ及びＨＫＣ２と組み合わせて製剤化したＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡによる処置のヒト膠細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞の生存率に対する効果
ＨＫＣ２（１６０ｎｇ／μＬ）、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μＬ）及びｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μＬ）の水溶液を規定の比率（ＨＫＣ２／ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡは質量比率０：４：１、０：３：１、１：３：１、２：３：１、０：２：１、２：２：１で製剤化した）で混合し、３０分間室温でインキュベートした。トランスフェクション複合体をＯＰＴＩ－ＭＥＭで希釈し、新鮮な培地を補充した培地１００μＬ中の細胞に添加した。トランスフェクション培地は６時間後に１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ又はＥＭＥＭに交換した。トランスフェクションの７２時間後に、生細胞の数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した。未処置の細胞に由来する値（ブランク）を１００％と設定した。全ての値は、ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡ、ＣＤ－ＣｅｌｌＤｅａｔｈ ｓｉＲＮＡの４反復の±Ｓ．Ｄ．の平均を表す。リポフェクタミン及びＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（４：１）を、ポジティブコントロールとして使用した。２：３：１及び２：２：１の製剤におけるＨＫＣ２の添加は、コントロールの０：３：１及び０：２：１と比較して、細胞生存率の点で同等又はさらに良好な細胞死を示した（図１４）。
実施例１１．ＨＫＰ単独又は種々の量のＨＫＰ及びＨＫＣ２と組み合わせて製剤化したＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｓｉＲＮＡによる処置のヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞の生存率に対する効果
ＨＫＣ２（１６０ｎｇ／μＬ）、ＨＫＰ（３２０ｎｇ／μＬ）及びｓｉＲＮＡ（８０ｎｇ／μＬ）の混合物の水溶液を規定の比率（ＨＫＣ２／ＨＫＰ／ｓｉＲＮＡは質量比率０：４：１、０：３：１、１：３：１、２：３：１、０：２：１、２：２：１で製剤化した）で混合し、室温で３０分間インキュベートした。トランスフェクション複合体をＯＰＴＩ－ＭＥＭで希釈し、新鮮な培地を補充した培地１００μＬ中の細胞に添加した。トランスフェクション培地は６時間後に１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ又はＥＭＥＭに交換した。トランスフェクション７２時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生細胞の数を評価した。未処置細胞に由来する値（ブランク）を１００％と設定した。全ての値は、ＮＳ－非サイレンシングｓｉＲＮＡ、ＣＤ－ＣｅｌｌＤｅａｔｈ ｓｉＲＮＡの４反復の±Ｓ．Ｄ．の平均を表す。リポフェクタミン及びＨＫＰ／ｓｉＲＮＡ（４：１）は、ポジティブコントロールとして使用した（図１５）。ＨＫＣ２を２：３：１及び２：２：１の製剤に添加すると、細胞生存率の点でコントロールの０：３：１及び０：２：１と比較して同等又はそれ以上の細胞死パーセンテージを示したが、全体的な細胞生存率はヒト膠芽細胞腫Ｔ９８Ｇ細胞株試験と比較して、より高い。
登録済み特許及び公開特許出願を含む本明細書で特定される全ての出版物、及びＵＲＬアドレス又は寄託番号で特定される全てのデータベースエントリは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載され、多くの詳細が説明目的で示されているが、本発明は、追加の実施形態の影響を受け、本明細書に記載された詳細の一部が本発明の基本原理から逸脱することなく変化し得ることは、当業者には明らかであろう。

Claims (64)

  1. 結合ドメイン及び細胞特異的標的化リガンドを含むペプチド。
  2. ペプチドが線状である、請求項１に記載のペプチド。
  3. ペプチドが分岐状である、請求項１に記載のペプチド。
  4. Ｃ末端システイン並びにヒスチジン及びリジンアミノ酸リッチな配列Ｋ（ＨＨＨＫ）４ＸＣを含み、式中「Ｘ」が、末端システインと結合ドメインとの間の合成分子リンカー又はペプチドリンカーである、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。
  5. Ｃ末端システイン並びにヒスチジン及びリジンアミノ酸リッチな配列［ＫＨＨＨＫＨＨＨＨｎＫＨＨＨＫＨＨＨＫ］２ＫＸＣ（ｎ＝０、１）を含み、式中「Ｘ」が、末端システインと結合ドメインとの間の合成分子リンカー又はペプチドリンカーである、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。
  6. 「Ｘ」が２～２０個のアミノ酸による線状又は分岐状ペプチドモチーフを含む、請求項４又は５に記載のペプチド。
  7. ペプチドモチーフが、３～８個のアミノ酸を有する、請求項６に記載のペプチド。
  8. ペプチドが、ＨＫＣ１、ＨＫＣ２及びＨＫ２Ｃからなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
  9. ペプチドが、化学反応を介して細胞特異的標的化リガンドに共有結合で連結している、請求項１から８のいずれか一項に記載のペプチド。
  10. ペプチドとリガンドとの間の共有結合性連結が、硫黄－炭素結合を含み、化学反応がシステイン／マレイミド付加反応を含む、請求項９に記載のペプチド。
  11. ペプチドとリガンドとの間の共有結合性連結が窒素－炭素結合を含む、請求項９に記載のペプチド。
  12. ペプチドとリガンドとの間の共有結合性連結が、さらなるスペーサー分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ、Ｍｎ＝１００～５０００）部分又は別のポリマーを含む、請求項９に記載のペプチド。
  13. 哺乳動物細胞に内部移行することができる、請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチド。
  14. 細胞特異的標的化リガンドが、低分子、ペプチド、タンパク質、抗体及びアプタマーからなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載のペプチド。
  15. 低分子が、葉酸、アニスアミド又はガラクトースである、請求項１４に記載のペプチド。
  16. 低分子又は標的化ペプチドの数が１～４である、請求項１４に記載のペプチド。
  17. 標的化ペプチドが、環状（ｃ）ＲＧＤ、ＡＰＲＰＧ、ＮＧＲ、Ｆ３ペプチド、ＣＧＫＲＫ、ＬｙＰ－１、ｉＲＧＤ、ｉＮＧＲ、Ｔ７ペプチド（ＨＡＩＹＰＲＨ）、ＭＭＰ２－切断可能オクタペプチド（ＧＰＬＧＩＡＧＱ）、ＣＰ１５（ＶＨＬＧＹＡＴ）、ＦＳＨ（ＦＳＨ－β、３３～５３アミノ酸）、ＹＴＲＤＬＶＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴＦ）、ＬＨＲＨ（ＱＨＴＳＹｋｃＬＲＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）（ＣＧＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ）及びＲＶＧ（ＹＴＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ）からなる群から選択される、請求項１４に記載のペプチド。
  18. 請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチド、並びにヒスチジン（Ｈ）及びリジン（Ｋ）リッチな反復単位を有する分岐状ポリペプチドを含む、組成物。
  19. 分岐状ポリペプチドが、Ｋ（ＨＨＨＫ）４又はＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ反復単位の４分岐を含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. リジン及びヒスチジンが一緒になって結合ドメインとして作用する、請求項１８又は１９に記載の組成物。
  21. ヒスチジン領域が、細胞のエンドソーム内で核酸の放出を促進する、請求項２０に記載の組成物。
  22. 分岐状ポリペプチドが、ＨＫＰ及びＨＫＰ（＋Ｈ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
  23. 核酸をさらに含む、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の組成物を含む組成物。
  24. 核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ及びアプタマー配列からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
  25. 核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の組成物。
  26. 核酸がｓｉＲＮＡを含む、請求項２３に記載の組成物。
  27. ｓｉＲＮＡ分子が１６～２７塩基対の長さを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. ｓｉＲＮＡ分子が、２１～２５塩基対の長さを有し、平滑末端又は１～３ヌクレオチドのオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 第２の核酸をさらに含む、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 第１の核酸配列がｓｉＲＮＡであり、第２の核酸がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ又はアプタマー配列である、請求項２９に記載の組成物。
  31. ペプチド、ポリペプチド、及び核酸がナノ粒子に自己組織化する、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 水溶液中で混合した場合に、ペプチド、ポリペプチド、及び核酸がナノ粒子に自己組織化する、請求項３１に記載の組成物。
  33. ナノ粒子がｐＨ範囲６．０～８．０の水性バッファー中で形成される、請求項３１又は３２に記載の組成物。
  34. ナノ粒子が、混合条件下で制御された、ｗ：ｗ＝３：１～１５：１の範囲（重量対重量比率）の窒素対ホスフェート（Ｎ：Ｐ）比率（総ペプチド：ｓｉＲＮＡ）で製剤化される、請求項３１又は３２に記載の組成物。
  35. ナノ粒子が、混合条件下で制御された、５：１：１、４：１：１、３：１：１、３：２：１、２：２：１）の範囲（ｗ：ｗ：ｗ）の（Ｎ：Ｐ）比率（ＨＫＰ：ＨＫＣ：ｓｉＲＮＡ）で製剤化される、請求項３１又は３２に記載の組成物。
  36. 薬学的な薬物をさらに含む、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 薬学的な薬物が、低分子薬物、ペプチド薬物又はタンパク質薬物からなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
  38. 請求項２３から３７のいずれか一項に記載の組成物を細胞に送達することを含む、核酸を哺乳動物細胞に送達する方法。
  39. 核酸がｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に送達される、請求項３８に記載の方法。
  40. 核酸がｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達される、請求項３８に記載の方法。
  41. 哺乳動物細胞が実験動物の細胞である、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 実験動物が齧歯類、イヌ、ネコ又は非ヒト霊長類である、請求項４１に記載の方法。
  43. 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。
  44. 治療的有効量の請求項２３から３７のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における遺伝子治療の方法。
  45. 哺乳動物が実験動物である、請求項４４に記載の方法。
  46. 実験動物が齧歯類、イヌ、ネコ又は非ヒト霊長類である、請求項４５に記載の方法。
  47. 哺乳動物がヒトである、請求項４４に記載の方法。
  48. 請求項２３から３７のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物に送達することを含む、哺乳動物に治療的化合物を送達する方法。
  49. 哺乳動物が実験動物である、請求項４８に記載の方法。
  50. 実験動物が齧歯類、イヌ、ネコ又は非ヒト霊長類である、請求項４９に記載の方法。
  51. 哺乳動物がヒトである、請求項４８に記載の方法。
  52. ａ）合成装置を用いてペプチドを合成する工程；ｂ）共有結合を介して標的化リガンドをペプチドへ連結する工程；ｃ）合成したペプチドを回収する工程を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチドを調製する方法。
  53. ａ）請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチドを核酸と混合して、複合体を形成する工程、ｂ）請求項１８から２３のいずれか一項に記載のポリペプチドを規定の比率で混合物に添加して、ナノ粒子を形成する工程、ｂ）ナノ粒子を回収する工程を含む、請求項２３に記載の組成物を調製する方法。
  54. ポリペプチド、ペプチド、及び核酸が水溶液中で混合される、請求項５２又は５３に記載の方法。
  55. ポリペプチド及び核酸が、Ｎ：Ｐ質量比率３～１０で混合される、請求項５４に記載の方法。
  56. ペプチド及び核酸がＮ：Ｐ質量比率１～１０で混合される、請求項５４に記載の方法。
  57. ポリペプチド及びペプチド比率が１～１０である、請求項５４に記載の方法。
  58. ポリペプチド及びペプチド比率が２、３、４及び５である、請求項５４に記載の方法。
  59. 薬学的な薬物をポリペプチド及び核酸と共混合するさらなる工程を含む、請求項５３から５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 薬学的な薬物が低分子薬物、ペプチド薬物、又はタンパク質薬物からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
  61. ナノ粒子サイズが５０～３００ｎｍである、請求項５３から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 核酸がｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ又はアプタマー配列である、請求項５３から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. ａ）合成装置を使用して分岐状ポリペプチドを合成する工程；ｂ）合成された分岐状ポリペプチドを回収する工程；ｃ）請求項１から１７のいずれか一項に記載のペプチドを回収した分岐状ポリペプチドと混合する工程；ｄ）得られた組成物を回収する工程を含む、請求項１８に記載の組成物を調製する方法。
  64. 工程ｃ）においてペプチド及びポリペプチドが規定の比率で混合される、請求項６３に記載の方法。
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