JP2022550901A - 核酸治療薬のための腫瘍標的化ポリペプチドナノ粒子送達システム - Google Patents
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Abstract
標的化機能を有する線状ヒスチジン-リジンリッチなシステイン含有ペプチド及び4分岐ヒスチジン-リジンリッチなポリペプチドを含む新規の核酸送達システムが提供される。送達システムは、siRNAのような核酸を含む。前記成分は、siRNAのホスフェートとポリペプチドのヒスチジン/リジンとの間の非共有結合的相互作用を介して安定なナノ粒子複合体を形成し、毒性が低減され、遺伝物質を選択的に細胞へ送達する。標的化機能により、核酸送達及びトランスフェクションの効率が向上する。特定の細胞に治療的分子を送達する能力を有する担体分子も提供される。担体分子は、標的化される細胞上で特定の受容体に結合することができる標的化リガンドで修飾されている。治療的分子は、siRNA、miRNA、又は他のオリゴヌクレオチドである。標的化部分は、標的化される細胞上に存在する受容体に対して親和性を示す低分子、ペプチド、又はタンパク質である。【選択図】なし
Description
関連出願への相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下、2019年10月4日出願の、米国仮特許出願第62/910,760号及び2019年10月15日出願の米国仮特許出願第62/915,450号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下、2019年10月4日出願の、米国仮特許出願第62/910,760号及び2019年10月15日出願の米国仮特許出願第62/915,450号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
核酸の送達システム及び使用方法が提供され、核酸分子の標的化送達又は局所的送達の方法が含まれる。
治療薬の標的化送達は、有効性を上昇させながら、副作用を低減させ、腫瘍処置を改善するために、大きな興味及び利益を引き寄せている。腫瘍中のナノ粒子(NP)の集積は、血管透過性滞留性亢進(EPR)効果によるものであると考えられている(Maeda、Bioconjugate Chemistry、21:797~802(2010))。そのため、腫瘍送達は、粒子を腫瘍局在性リガンドでコーティングすることにより改善し得る。リガンドがカーゴ(例えばsiRNA)の抗腫瘍有効性を上昇させる機構は未だ議論されている。腫瘍表面マーカーへの結合が増強すれば、非標的化組織と比較して、腫瘍におけるNPの集積を上昇させ得る。他の研究者は、腫瘍細胞内の標的化及び非標的化NPの集積が同等であると主張してきた。標的化NPの有効性の上昇は、受容体介在性のエンドサイトーシスの増強及びsiRNA治療薬の細胞内局在の上昇により引き起こされると示唆された。Bartlettら、(2007):Proc. Nat’l Acad.Sci.USA、104:15549~15554(2007)。両方の機構が、リガンド標的化治療及び有効性において必須の役割を果たしている可能性が最も高い。
in vivoにおけるsiRNAの標的化送達は挑戦的であり、これは、血清ヌクレアーゼによる分解及び急速なクリアランス、エンドソーム捕捉、並びにナノ粒子(NP)による自然免疫刺激によるものである。近年、siRNAの標的化送達について、前臨床及び臨床治験において非常に限定的な方法が開発されている。1つの手法は、Alnylamによるものである。これにより、合成トリアンテナリーN-アセチルガラクトサミン(GaLNAc)ベースのリガンドが化学修飾されたsiRNAにコンジュゲートしているGalNAc-siRNAが開発された。これにより、ASGPR介在性の肝細胞への効率的な送達が可能になった。Majaら;Nature Communications、9:723(2018)。GaLNAcは、肝臓において、肝臓特異的アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)を標的とする。他の例は、Sanofi Genzymeによる、血友病及び希少出血性疾患(RBD)の治療のためのFitusiran(ALN-AT3、第二相臨床治験、Alnylam)である。これは、皮下投与され、RNAi治療薬は、アンチトロンビン(AT)を標的とすることを目的としている。別の事例では、標的化リガンドが、複数の成分がsiRNAと共に共組織化したときに、リポソーム製剤に組み込まれた。この種類のシステムは、リポソームの安定性、生体適合性、毒性、大規模の製造及び長期保存の点で、課題を多く保持している。Lengら、J. Drug Delivery、ID6971297、(2017)。最も近年には、ポリペプチド/ポリマー及びsiRNAにより形成されたナノ粒子が、in vivoにおいてsiRNAを効率的に送達し、これらの生成物のいくつかは、早期臨床治験に入っている。例えば、ヒスチジン(H)-リジン(K)リッチなポリペプチドは、二重siRNAをその標的に安全かつ有効に送達し、その治療的有効性を達成している。リード薬物の1つは、第IIa相臨床治験で試験されている。参照:Zhouら、Oncotarget、8:80651~80665(2017);国際公開第2011/140285号。
発明の概要
発明の概要
in vitro及びin vivo送達のために核酸を腫瘍標的化するための新規の手法が提供される。本明細書で使用する、ヒスチジン(H)-リジン(K)リッチなポリペプチド(HKP)は、核酸結合ドメインを含み、非細胞特異的形質導入機能(例えば、細胞膜を非選択的に通過する能力)を提供する4分岐反復(H3K)4単位を含む、正に荷電したペプチドを記載するのに使用した。Chouら、Biomaterials、35、846~855(2014)。H3Kの4反復単位及び、末端の標的化リガンドを有する線状ペプチド(略語HKC)を使用した。このペプチドは、核酸結合ドメイン及び細胞特異的標的化機能の両方を含むため、物質が細胞膜を通過し、特異的に核酸を特定の細胞種に送達するのを補助し得る。
いくつかの実施形態において、目的の標的細胞に核酸を送達するための組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、分岐状ポリペプチド(HKP)及び線状ペプチド(HKC)を含む。さらなる別の実施形態において、この組成物は、1つ又は複数の核酸を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
いくつかの実施形態において、4分岐ヒスチジン-リジンリッチなポリペプチドは、a)核酸を1つ又は複数の特定の細胞種への標的化、及びb)標的化された核酸の特定の細胞内相互作用部位への送達に有効な担体である特定の構造及び機能的な性質を有する線状ペプチドを有する製剤において使用する。いくつかの実施形態において、線状ペプチドは、細胞特異的な標的化リガンド(例えば、低分子又は環状ペプチドベースのホーミングドメイン)を含み、これは、核酸に結合し、かつ標的化された細胞のサイトゾルに核酸を送達するのを補助する細胞配向及び輸送性質を提供する正に荷電した線状HKCペプチドとコンジュゲートされている。
他の態様において、直接的な共有結合性連結戦略によって担体を送達するための標的化リガンドをコンジュゲートするための方法が提供される。いくつかの実施形態において、標的化リガンド(例えば、葉酸、RGD又はペプチド)は、共有結合の形成による化学反応を介した、線状ヒスチジン-リジンリッチなシステイン含有(HKC)ペプチドと効果的にコンジュゲートされていた。この方法は、種々の標的化リガンドを、標的核酸を保護するための送達システムに導入するための多用途プラットフォームを提供する。正に荷電したペプチドHKCとリガンドとの間の化学的コンジュゲーションは、ジスルフィド結合、チオール/マレイミドからの硫黄-炭素結合、又は任意の他の共有結合又はヒドラジン及びアミド等の生分解性結合でもよいが、この種類に必ずしも限定されるものではない。
さらに他の態様において、標的化リガンドを有する線状ペプチドであるポリペプチド(HKP)、及び腫瘍標的化のためのsiRNAのナノ粒子製剤化のための新規の方法が提供される。いくつかの実施形態において、核酸は、細胞標的に結合するモチーフを含む標的化線状ポリペプチド及び分岐状ポリペプチドを含む複合体中で送達される。2つのペプチドを、ナノ粒子形態で、標的核酸との混合物中で規定の比率で製剤化する。いくつかの実施形態において、ペプチド/核酸複合体の負電荷(例えば核酸から)の正電荷(例えば、ペプチド及びポリペプチド)に対する比率は、複合体の非細胞特異的な形質導入性質の強さに影響を与え得る。
他の態様において、1つ又は複数の核酸を細胞標的に送達するための組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態において、ペプチド/核酸複合体において、1つ又は複数の核酸は、同時にナノ粒子内で送達された。いくつかの実施形態において、化学療法薬物は、ナノ粒子複合体内で共製剤化し得る。これは、腫瘍の治療のための組合せ両方に利点及び利益を提供する。
したがって、これら及び他の態様は、任意の目的の細胞を標的化するために、任意の種類の標的化モチーフを導入し得るシステムである送達プラットフォームを提供する。いくつかの実施形態において、リンカー(例えば、peg又はポリマー)を介して標的リガンドをペプチドにコンジュゲーションする段階的な方法が開発され、本出願で提示されている。種々の標的化リガンドは、目的の任意の細胞種に対する特異的な形質導入性質を提供する。いくつかの実施形態において、HK正反復単位を有するペプチド中の結合ドメインは、ヒスチジンとホスフェートとの間の水素結合及びプロトン化したリジンとホスホネートとの間のイオン-イオン相互作用を介して負に荷電した核酸に結合する。核酸は保護され、目的の細胞の標的化された領域に送達された。
標的化リガンドの観点において、ペプチドは、環状(c)RGD、APRPG、NGR、F3ペプチド、CGKRK、LyP-1、iRGD、iNGR、T7ペプチド(HAIYPRH)、MMP2-切断可能オクタペプチド(GPLGIAGQ)、CP15(VHLGYAT)、FSH(FSH-β、33~53アミノ酸、YTRDLVKDPARPKIQKTCTF)、LHRH(QHTSYkcLRP)、ガストリン放出ペプチド(GRP)(CGGNHWAVGHLM)、RVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)でもよい。いくつかの実施形態において、標的化リガンドは、さらなる有効性のために1つのシステム内で二価又は三価のホモ又はヘテロペプチドリガンドの組合せに組み込むことができる。
したがって、本発明の態様は、モジュール性であり、任意の核酸を任意の目的の細胞に送達するのに適用し得る送達プラットフォームを提供する。いくつかの実施形態において、多価ペプチド成分と、siRNA、mRNA又はDNAとを含み、ナノ粒子を形成する組成物が提供される。複合体形成は、有効にsiRNA、mRNA又はDNAを保護し、細胞に送達する。いくつかの実施形態において、核酸は可逆的にペプチド担体に結合しており、これによって腫瘍特異的細胞に貫通し、核酸をエンドソームから放出し、標的遺伝子に到達させることが可能になる。
本明細書に記載するsiRNA送達担体の生成は、分岐状ポリペプチド(HKP)、線状ペプチド(HKC)及びsiRNAを組み合わせることによって生じてよく、(a)正に荷電した線状ペプチド、例えば標的化基又は他の機能的部分を連結するための官能基を有するペプチドHKCを調製し;(b)生成物の共有結合及び回収を介して標的化リガンドの線状ペプチドHKCへ結合させ;(c)分岐状ポリペプチド(HKP)、工程(b)の標的化リガンドを有する線状ペプチドHKC及びsiRNAを安定的に組み合わせて均一なナノ粒子を生成する工程を含む方法によって実施し得る。上記の方法において、工程は、同時に行って、それにより好ましい相互作用及びナノ粒子形成を可能にするものであってもよい。この方法によるポリマー性ナノ粒子は、水溶液の種々のsiRNAと複合体を有効に形成してポリナノ粒子を形成し、これは、標的化効果を介して特定の疾患に選択的に集積させることができる。好ましくは、本明細書に記載するポリナノ粒子のサイズは、記載する生成方法に基づいて、10nm~3000nmの範囲でもよい。前臨床試験によれば、好ましいサイズは、動的光散乱法によって決定される40~300nmであろう。
さらに、本明細書に記載するHKCポリペプチド-核酸送達システムは、薬学的組成物の有効成分として使用し得る。したがって、治療的有効用量のHKCペプチド及び核酸を混合物形態で含む薬学的組成物が提供される。これは、投与方法と共に本明細書に記載されている、HKCポリペプチド-核酸送達システムに加えて、1つ又は複数の種類の薬学的に適合性のポリマー又は担体を含み得る。
得られた生成物は、例えば、散剤、液剤、固相、カプセル剤、又は注入可能な形態等の形態で製剤化されてよく、これは、核酸-ペプチドポリナノ粒子の安定性及び有効性を維持するために1つ又は複数の有効な成分、例えば食塩水溶液、バッファー溶液又は他の適合性の成分と混合されてもよい。
本明細書に記載する薬学的組成物は、標準的な方法、例えば経口又は非経口投与によって投与し得る。
実施例1.ペプチド HKC1及びHKC2の合成
HKC1の設計したペプチド配列(配列:KHHHKHHHKHHHKHHHKSSSC)を、固相合成装置によって図3に記載するように合成した。生成物を水(0.065%TFA)及びアセトニトリル(0.05%TFA)を使用したHPLCによって精製し、HPLCのクロマトグラムを図3Aに示す。H3K4C(略語HKC1)の構造は、末端部位に1つのシステインを有する。構造を図3Bに示すように質量分析によってさらに確認した。
HKC1の設計したペプチド配列(配列:KHHHKHHHKHHHKHHHKSSSC)を、固相合成装置によって図3に記載するように合成した。生成物を水(0.065%TFA)及びアセトニトリル(0.05%TFA)を使用したHPLCによって精製し、HPLCのクロマトグラムを図3Aに示す。H3K4C(略語HKC1)の構造は、末端部位に1つのシステインを有する。構造を図3Bに示すように質量分析によってさらに確認した。
HK2Cの第2の設計したペプチド配列(配列:(KHHHKHHHKHHHKHHH)2KCSSC)を、固相合成装置によって図3Bに示すように同様の方法で合成した。
HKC2の第3の設計したペプチド配列(配列:KHHHKHHHKHHHKHHHKCSSC)を、例えば米国特許第7,070,807号、同第7,163,695号及び同第7,772,201号に記載するように固相合成した。
実施例2.スルフィドマレイミドカップリング反応を介したHKC2ペプチドの架橋
図2は、カップリングの一般的なスキームを示す。H3K4C-PEG-標的化リガンド官能化ポリペプチドの調製には、標的化モチーフで官能化されたPEGを使用する。標的化モチーフ、例えば葉酸、RGD及び/又はモノクローナル抗体を有するこのようなPEGは、市販のものであっても、又は当技術分野において周知の方法を使用して事前に調製していてもよい。末端システインを有するHKCを、マレイミド官能化PEG連結標的化モチーフ、例えば(葉酸、RGD、mAb等)に、図2に示すように穏やかな条件下のチオール/マレイミド付加反応を介してコンジュゲートした。
図2は、カップリングの一般的なスキームを示す。H3K4C-PEG-標的化リガンド官能化ポリペプチドの調製には、標的化モチーフで官能化されたPEGを使用する。標的化モチーフ、例えば葉酸、RGD及び/又はモノクローナル抗体を有するこのようなPEGは、市販のものであっても、又は当技術分野において周知の方法を使用して事前に調製していてもよい。末端システインを有するHKCを、マレイミド官能化PEG連結標的化モチーフ、例えば(葉酸、RGD、mAb等)に、図2に示すように穏やかな条件下のチオール/マレイミド付加反応を介してコンジュゲートした。
実施例3.HKC2ペプチドの葉酸との架橋
標的化リガンドを、カップリング反応におけるチオールとマレイミドとの間の共有結合の形成を介して、HKCペプチド上に取り付けた。図4は、HKC2-PEG1000-葉酸を調製するためのスキームを示す。葉酸-PEG1000-Mal(6.0mg、3.7mmol)を無水DMF(2.0mL)に溶解した後、無水DMF中のトリメチルアミン(52uL、0.726g/mL)を添加した。脱気した水(100μL)及びDMF(300μL)の混合物中のHKC(10.0mg、3.7mmol)を、超音波処理及び撹拌によって、窒素下、25℃で混合物に添加した。得られた混合物を窒素下、暗所、25℃で15時間撹拌した。HPLC分析によって、出発物質である葉酸-PEG1000-Malが完全に消費され、反応が完了していることが示された。反応混合物を冷ジエチルエーテル溶液に注いで、黄色沈殿物を得た。混合物を4000rpmで10分間遠心分離し、最上部の透明の上清を廃棄した。黄色沈殿物をアセトン(5.0mL)で洗浄して再度遠心分離し、上清を廃棄した後の生成物を回収した。生成物をさらに分取RP-HLPC又は水中での透析によって精製し、純粋な生成物を得た。生成物の溶液を凍結乾燥させ、前記生成物を黄色粉末として得た(12mg、収率75%)。
標的化リガンドを、カップリング反応におけるチオールとマレイミドとの間の共有結合の形成を介して、HKCペプチド上に取り付けた。図4は、HKC2-PEG1000-葉酸を調製するためのスキームを示す。葉酸-PEG1000-Mal(6.0mg、3.7mmol)を無水DMF(2.0mL)に溶解した後、無水DMF中のトリメチルアミン(52uL、0.726g/mL)を添加した。脱気した水(100μL)及びDMF(300μL)の混合物中のHKC(10.0mg、3.7mmol)を、超音波処理及び撹拌によって、窒素下、25℃で混合物に添加した。得られた混合物を窒素下、暗所、25℃で15時間撹拌した。HPLC分析によって、出発物質である葉酸-PEG1000-Malが完全に消費され、反応が完了していることが示された。反応混合物を冷ジエチルエーテル溶液に注いで、黄色沈殿物を得た。混合物を4000rpmで10分間遠心分離し、最上部の透明の上清を廃棄した。黄色沈殿物をアセトン(5.0mL)で洗浄して再度遠心分離し、上清を廃棄した後の生成物を回収した。生成物をさらに分取RP-HLPC又は水中での透析によって精製し、純粋な生成物を得た。生成物の溶液を凍結乾燥させ、前記生成物を黄色粉末として得た(12mg、収率75%)。
実施例4.1H NMRによるHKC2-PEG-葉酸の特徴づけ
HKC2-PEG-葉酸の構造は、DMSO-d6中の1H NMRによって特徴づけ、結果を図5に示す。試料約5mgをD2O又はDMSO-d6に溶解し、nmrスペクトルを400MHzで記録した。3つのスペクトルを重ね合わせ、差異を明確に見た。D2O中のHKC2が上部、DMSO-d6中のHKC2-PEG-葉酸を中央、葉酸-Peg1000-Malを下部に示す。HKCは葉酸-Peg1000-Malに共有結合しており、7.0ppmにおけるマレイミド二重結合の特徴的なシグナルは、システインとの反応後に消失した。PEG基のCH2プロトンは、3.5ppm領域に存在し、ペプチドプロトンは、HKC2-PEG-葉酸の6.0~9.0ppmに位置する。
HKC2-PEG-葉酸の構造は、DMSO-d6中の1H NMRによって特徴づけ、結果を図5に示す。試料約5mgをD2O又はDMSO-d6に溶解し、nmrスペクトルを400MHzで記録した。3つのスペクトルを重ね合わせ、差異を明確に見た。D2O中のHKC2が上部、DMSO-d6中のHKC2-PEG-葉酸を中央、葉酸-Peg1000-Malを下部に示す。HKCは葉酸-Peg1000-Malに共有結合しており、7.0ppmにおけるマレイミド二重結合の特徴的なシグナルは、システインとの反応後に消失した。PEG基のCH2プロトンは、3.5ppm領域に存在し、ペプチドプロトンは、HKC2-PEG-葉酸の6.0~9.0ppmに位置する。
実施例5.UV/Vis分光分析によるHKC2-PEG-葉酸の特徴づけ
HKC2-PEG-葉酸の構造をさらにUV/Vis分光分析によって特徴づけ、結果を図6に示す。HKC2-PEG-葉酸(上部、赤色曲線)及び葉酸-PEG-Mal(下部、灰色曲線)のUV/Vis分光分析は、室温、水中で測定された。生成物スペクトルでは、ペプチドについては220nm、及び葉酸については275nmに特徴的な吸光度が観察された。
HKC2-PEG-葉酸の構造をさらにUV/Vis分光分析によって特徴づけ、結果を図6に示す。HKC2-PEG-葉酸(上部、赤色曲線)及び葉酸-PEG-Mal(下部、灰色曲線)のUV/Vis分光分析は、室温、水中で測定された。生成物スペクトルでは、ペプチドについては220nm、及び葉酸については275nmに特徴的な吸光度が観察された。
実施例6.質量分析によるHKC2-PEG-葉酸の特徴づけ
HKC2-PEG-葉酸のMALDI-MS(正)分光分析は、Bruker Autoflex Speed分光計を使用して記録した。4302M+付近の分子イオンピークの存在は、カップリング反応からのHKC1の変換が成功したことを示す。図7を参照のこと。
HKC2-PEG-葉酸のMALDI-MS(正)分光分析は、Bruker Autoflex Speed分光計を使用して記録した。4302M+付近の分子イオンピークの存在は、カップリング反応からのHKC1の変換が成功したことを示す。図7を参照のこと。
実施例7.HKC2-PEG2k-RGDとしてRGDリガンドを含むHKC2の調製
第1の工程:c(RGDfk)とN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及びマレイミド(Mal)官能基を有する二官能性PEG分子との間でカップリングを行い、アミンとNHSエステルとの間のカップリングを介してアミド結合を形成する。図8を参照のこと。c(RGDfk)(5.0mg、8.28μmol)を無水DMF(1mL)に溶解し、トリエチルアミン(10μL)を添加した。得られた混合物を室温、N2下で30分間撹拌した後、Mal-PEG2k-NHS(10mg、8.28μmol)を1回で添加し、12時間25℃で撹拌した。反応混合物を冷ジエチルエーテル(20mL)に注いだ。混合物を4000rpmで10分間、5℃で遠心分離し、最上部の透明な上清を廃棄した。白色沈殿をアセトンに再懸濁し、冷ジエチルエーテル(10mL)を添加し、5分間超音波処理した。4000rpm、5℃で10分間再び遠心分離することによって、白色沈殿の回収が可能になった。減圧下で乾燥させて、RGD-PEG2k-Mal(12mg、収率80%)を得た。1H NMRスペクトル(400MHz、DMSO-d6)は、7.0ppmにおいてマレイミドに割り当てられたピークの存在を示したが、NHSエステル(2.8ppm)についてのピークは存在しないことが示された。図9を参照のこと。
第1の工程:c(RGDfk)とN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及びマレイミド(Mal)官能基を有する二官能性PEG分子との間でカップリングを行い、アミンとNHSエステルとの間のカップリングを介してアミド結合を形成する。図8を参照のこと。c(RGDfk)(5.0mg、8.28μmol)を無水DMF(1mL)に溶解し、トリエチルアミン(10μL)を添加した。得られた混合物を室温、N2下で30分間撹拌した後、Mal-PEG2k-NHS(10mg、8.28μmol)を1回で添加し、12時間25℃で撹拌した。反応混合物を冷ジエチルエーテル(20mL)に注いだ。混合物を4000rpmで10分間、5℃で遠心分離し、最上部の透明な上清を廃棄した。白色沈殿をアセトンに再懸濁し、冷ジエチルエーテル(10mL)を添加し、5分間超音波処理した。4000rpm、5℃で10分間再び遠心分離することによって、白色沈殿の回収が可能になった。減圧下で乾燥させて、RGD-PEG2k-Mal(12mg、収率80%)を得た。1H NMRスペクトル(400MHz、DMSO-d6)は、7.0ppmにおいてマレイミドに割り当てられたピークの存在を示したが、NHSエステル(2.8ppm)についてのピークは存在しないことが示された。図9を参照のこと。
この物質を第2の工程に直接使用し、ここで、HKC中のチオールが、RGD-PEG2k-Malのマレイミドと反応し、RGD結合PEGリンカーポリペプチドHKC2-PEG2k-RGDを得た。HKC2(5.4mg、2.0μmol)をDMF(0.6mL)と脱気した水(100μL)との混合物に溶解した。HKC2の溶液を、無水DMF(1mL)に溶解したRGD-PEG2k-Mal(5.0mg、1.69μmol)に撹拌しながら添加した。トリエチルアミン(100uL、無水DMF中10μg/μL)を次いで添加し、混合物をN2下、25℃で15時間撹拌した。反応混合物を冷ジエチルエーテル(20mL)に注いだ。混合物を4000rpm、5℃で10分間遠心分離し、最上部の透明な上清を廃棄した。クルードな生成物を、水を交換しながら、水に対して2日間透析した。減圧下で乾燥させた後、生成物であるHKC2-PEG2k-RGDを得た(7.1mg、収率75%)。生成物を1H NMR(図10参照)及び質量分析を含む分光分析法によって特徴づけた。
実施例8.HKC-PEGn-GalNAcとして三価GalNAcリガンドを含むHKCの調製
HKC1((KHHH)4KSSC)、18.0mg、6.75μmol)をガラスバイアル中のリン酸バッファー、pH=7.2に溶解した。無水DMF(300μL)中のGalNAc3-PEG6-Mal(29.3mg、1.56μmol)を5分間にわたってHKC1溶液にスプリンジ針によって添加した。得られた混合物を窒素雰囲気下で16時間撹拌した。HPLCモニタリングにより、出発物質GalNAcが完全に消費されたことが示された後、クルード生成物をPierce デキストラン脱塩カラムを用いて精製し、純粋な生成物GalNAc3-PEG6-HKC1を19mg、収率80%で白色固体として得た。生成物を、質量分析により(MALDI-TOF-MS 正)m/z4595.824[M+H]、計算MW=4595.9と特徴づけた。HPLC分析により、純度>90%が示された。GalNAc-PEG12-HKC1及びGalNAc-PEG24-HKC1を、GalNAc3-PEG6-Malを対応するGalNAc-PEG12-Mal及びGalNAc-PEG24-Malに置き換えることによって同様の方法で調製した。(図11に示す反応スキーム)。
HKC1((KHHH)4KSSC)、18.0mg、6.75μmol)をガラスバイアル中のリン酸バッファー、pH=7.2に溶解した。無水DMF(300μL)中のGalNAc3-PEG6-Mal(29.3mg、1.56μmol)を5分間にわたってHKC1溶液にスプリンジ針によって添加した。得られた混合物を窒素雰囲気下で16時間撹拌した。HPLCモニタリングにより、出発物質GalNAcが完全に消費されたことが示された後、クルード生成物をPierce デキストラン脱塩カラムを用いて精製し、純粋な生成物GalNAc3-PEG6-HKC1を19mg、収率80%で白色固体として得た。生成物を、質量分析により(MALDI-TOF-MS 正)m/z4595.824[M+H]、計算MW=4595.9と特徴づけた。HPLC分析により、純度>90%が示された。GalNAc-PEG12-HKC1及びGalNAc-PEG24-HKC1を、GalNAc3-PEG6-Malを対応するGalNAc-PEG12-Mal及びGalNAc-PEG24-Malに置き換えることによって同様の方法で調製した。(図11に示す反応スキーム)。
実施例9.ナノ粒子の形成におけるHKC:HKP:TGFβ1の製剤及びそのサイズ分布。HKC=HKC2=K(HHHK)4CSSC。HKP=H3K4b。(図13)。
HKC2、HKP、siRNA(TGFβ1)のナノ粒子形成を、種々の比率で評価した。HKC2をHKP/siRNA製剤に添加すると、同等のナノ粒子サイズが維持されたが、コントロールHKP/siRNA(N:P質量比=4:1)と比較して、有意に多分散指数(PDI)が狭くなった。HKC2/HKP/siRNAは、質量比0:4:1、1:4:1、1:3:1、2:3:1、2:2:1、3:1:1で製剤化した。HKC2(160ng/μL)、HKP(320ng/μL)及びsiRNA(80ng/μL)の水溶液を規定の比率で混合し、30分間室温でインキュベートした。次いで、得られた試料を、Nanoplus90を用いた動的光散乱法により測定した。動的半径及び多分散指数を記録し、図11及び図12に示す。図12から、サイズが、120nm(HKP:siRNA=4:1)から100~113nm(HKC2/HKP/siRNA=1:4:1、1:3:1、2:3:1)へとわずかに減少した。比率が2:2:1、3:1:1に上昇した場合、ナノ粒子サイズも140nm及び180nmに上昇した。別の観点では、PDIは0.22から0.11~0.17に低下しており、これはHKCが被覆表面を充填していることによる利点である(図13を参照)。
HKC2、HKP、siRNA(TGFβ1)のナノ粒子形成を、種々の比率で評価した。HKC2をHKP/siRNA製剤に添加すると、同等のナノ粒子サイズが維持されたが、コントロールHKP/siRNA(N:P質量比=4:1)と比較して、有意に多分散指数(PDI)が狭くなった。HKC2/HKP/siRNAは、質量比0:4:1、1:4:1、1:3:1、2:3:1、2:2:1、3:1:1で製剤化した。HKC2(160ng/μL)、HKP(320ng/μL)及びsiRNA(80ng/μL)の水溶液を規定の比率で混合し、30分間室温でインキュベートした。次いで、得られた試料を、Nanoplus90を用いた動的光散乱法により測定した。動的半径及び多分散指数を記録し、図11及び図12に示す。図12から、サイズが、120nm(HKP:siRNA=4:1)から100~113nm(HKC2/HKP/siRNA=1:4:1、1:3:1、2:3:1)へとわずかに減少した。比率が2:2:1、3:1:1に上昇した場合、ナノ粒子サイズも140nm及び180nmに上昇した。別の観点では、PDIは0.22から0.11~0.17に低下しており、これはHKCが被覆表面を充填していることによる利点である(図13を参照)。
実施例10.HKP単独又は種々の量のHKP及びHKC2と組み合わせて製剤化したCell Death siRNAによる処置のヒト膠細胞腫T98G細胞の生存率に対する効果
HKC2(160ng/μL)、HKP(320ng/μL)及びsiRNA(80ng/μL)の水溶液を規定の比率(HKC2/HKP/siRNAは質量比率0:4:1、0:3:1、1:3:1、2:3:1、0:2:1、2:2:1で製剤化した)で混合し、30分間室温でインキュベートした。トランスフェクション複合体をOPTI-MEMで希釈し、新鮮な培地を補充した培地100μL中の細胞に添加した。トランスフェクション培地は6時間後に10%FBS/DMEM又はEMEMに交換した。トランスフェクションの72時間後に、生細胞の数をCellTiter-Glo Luminescent細胞生存率アッセイ(Promega)によって評価した。未処置の細胞に由来する値(ブランク)を100%と設定した。全ての値は、NS-非サイレンシングsiRNA、CD-CellDeath siRNAの4反復の±S.D.の平均を表す。リポフェクタミン及びHKP/siRNA(4:1)を、ポジティブコントロールとして使用した。2:3:1及び2:2:1の製剤におけるHKC2の添加は、コントロールの0:3:1及び0:2:1と比較して、細胞生存率の点で同等又はさらに良好な細胞死を示した(図14)。
HKC2(160ng/μL)、HKP(320ng/μL)及びsiRNA(80ng/μL)の水溶液を規定の比率(HKC2/HKP/siRNAは質量比率0:4:1、0:3:1、1:3:1、2:3:1、0:2:1、2:2:1で製剤化した)で混合し、30分間室温でインキュベートした。トランスフェクション複合体をOPTI-MEMで希釈し、新鮮な培地を補充した培地100μL中の細胞に添加した。トランスフェクション培地は6時間後に10%FBS/DMEM又はEMEMに交換した。トランスフェクションの72時間後に、生細胞の数をCellTiter-Glo Luminescent細胞生存率アッセイ(Promega)によって評価した。未処置の細胞に由来する値(ブランク)を100%と設定した。全ての値は、NS-非サイレンシングsiRNA、CD-CellDeath siRNAの4反復の±S.D.の平均を表す。リポフェクタミン及びHKP/siRNA(4:1)を、ポジティブコントロールとして使用した。2:3:1及び2:2:1の製剤におけるHKC2の添加は、コントロールの0:3:1及び0:2:1と比較して、細胞生存率の点で同等又はさらに良好な細胞死を示した(図14)。
実施例11.HKP単独又は種々の量のHKP及びHKC2と組み合わせて製剤化したCell Death siRNAによる処置のヒト肝細胞癌HepG2細胞の生存率に対する効果
HKC2(160ng/μL)、HKP(320ng/μL)及びsiRNA(80ng/μL)の混合物の水溶液を規定の比率(HKC2/HKP/siRNAは質量比率0:4:1、0:3:1、1:3:1、2:3:1、0:2:1、2:2:1で製剤化した)で混合し、室温で30分間インキュベートした。トランスフェクション複合体をOPTI-MEMで希釈し、新鮮な培地を補充した培地100μL中の細胞に添加した。トランスフェクション培地は6時間後に10%FBS/DMEM又はEMEMに交換した。トランスフェクション72時間後にCellTiter-Glo Luminescent細胞生存率アッセイ(Promega)を用いて生細胞の数を評価した。未処置細胞に由来する値(ブランク)を100%と設定した。全ての値は、NS-非サイレンシングsiRNA、CD-CellDeath siRNAの4反復の±S.D.の平均を表す。リポフェクタミン及びHKP/siRNA(4:1)は、ポジティブコントロールとして使用した(図15)。HKC2を2:3:1及び2:2:1の製剤に添加すると、細胞生存率の点でコントロールの0:3:1及び0:2:1と比較して同等又はそれ以上の細胞死パーセンテージを示したが、全体的な細胞生存率はヒト膠芽細胞腫T98G細胞株試験と比較して、より高い。
HKC2(160ng/μL)、HKP(320ng/μL)及びsiRNA(80ng/μL)の混合物の水溶液を規定の比率(HKC2/HKP/siRNAは質量比率0:4:1、0:3:1、1:3:1、2:3:1、0:2:1、2:2:1で製剤化した)で混合し、室温で30分間インキュベートした。トランスフェクション複合体をOPTI-MEMで希釈し、新鮮な培地を補充した培地100μL中の細胞に添加した。トランスフェクション培地は6時間後に10%FBS/DMEM又はEMEMに交換した。トランスフェクション72時間後にCellTiter-Glo Luminescent細胞生存率アッセイ(Promega)を用いて生細胞の数を評価した。未処置細胞に由来する値(ブランク)を100%と設定した。全ての値は、NS-非サイレンシングsiRNA、CD-CellDeath siRNAの4反復の±S.D.の平均を表す。リポフェクタミン及びHKP/siRNA(4:1)は、ポジティブコントロールとして使用した(図15)。HKC2を2:3:1及び2:2:1の製剤に添加すると、細胞生存率の点でコントロールの0:3:1及び0:2:1と比較して同等又はそれ以上の細胞死パーセンテージを示したが、全体的な細胞生存率はヒト膠芽細胞腫T98G細胞株試験と比較して、より高い。
登録済み特許及び公開特許出願を含む本明細書で特定される全ての出版物、及びURLアドレス又は寄託番号で特定される全てのデータベースエントリは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載され、多くの詳細が説明目的で示されているが、本発明は、追加の実施形態の影響を受け、本明細書に記載された詳細の一部が本発明の基本原理から逸脱することなく変化し得ることは、当業者には明らかであろう。
Claims (64)
- 結合ドメイン及び細胞特異的標的化リガンドを含むペプチド。
- ペプチドが線状である、請求項1に記載のペプチド。
- ペプチドが分岐状である、請求項1に記載のペプチド。
- C末端システイン並びにヒスチジン及びリジンアミノ酸リッチな配列K(HHHK)4XCを含み、式中「X」が、末端システインと結合ドメインとの間の合成分子リンカー又はペプチドリンカーである、請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチド。
- C末端システイン並びにヒスチジン及びリジンアミノ酸リッチな配列[KHHHKHHHHnKHHHKHHHK]2KXC(n=0、1)を含み、式中「X」が、末端システインと結合ドメインとの間の合成分子リンカー又はペプチドリンカーである、請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチド。
- 「X」が2~20個のアミノ酸による線状又は分岐状ペプチドモチーフを含む、請求項4又は5に記載のペプチド。
- ペプチドモチーフが、3~8個のアミノ酸を有する、請求項6に記載のペプチド。
- ペプチドが、HKC1、HKC2及びHK2Cからなる群から選択される、請求項1に記載のペプチド。
- ペプチドが、化学反応を介して細胞特異的標的化リガンドに共有結合で連結している、請求項1から8のいずれか一項に記載のペプチド。
- ペプチドとリガンドとの間の共有結合性連結が、硫黄-炭素結合を含み、化学反応がシステイン/マレイミド付加反応を含む、請求項9に記載のペプチド。
- ペプチドとリガンドとの間の共有結合性連結が窒素-炭素結合を含む、請求項9に記載のペプチド。
- ペプチドとリガンドとの間の共有結合性連結が、さらなるスペーサー分子、例えばポリエチレングリコール(PEG、Mn=100~5000)部分又は別のポリマーを含む、請求項9に記載のペプチド。
- 哺乳動物細胞に内部移行することができる、請求項1から12のいずれか一項に記載のペプチド。
- 細胞特異的標的化リガンドが、低分子、ペプチド、タンパク質、抗体及びアプタマーからなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載のペプチド。
- 低分子が、葉酸、アニスアミド又はガラクトースである、請求項14に記載のペプチド。
- 低分子又は標的化ペプチドの数が1~4である、請求項14に記載のペプチド。
- 標的化ペプチドが、環状(c)RGD、APRPG、NGR、F3ペプチド、CGKRK、LyP-1、iRGD、iNGR、T7ペプチド(HAIYPRH)、MMP2-切断可能オクタペプチド(GPLGIAGQ)、CP15(VHLGYAT)、FSH(FSH-β、33~53アミノ酸)、YTRDLVKDPARPKIQKTCTF)、LHRH(QHTSYkcLRP)、ガストリン放出ペプチド(GRP)(CGGNHWAVGHLM)及びRVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)からなる群から選択される、請求項14に記載のペプチド。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載のペプチド、並びにヒスチジン(H)及びリジン(K)リッチな反復単位を有する分岐状ポリペプチドを含む、組成物。
- 分岐状ポリペプチドが、K(HHHK)4又はKHHHKHHHHKHHHKHHHK反復単位の4分岐を含む、請求項18に記載の組成物。
- リジン及びヒスチジンが一緒になって結合ドメインとして作用する、請求項18又は19に記載の組成物。
- ヒスチジン領域が、細胞のエンドソーム内で核酸の放出を促進する、請求項20に記載の組成物。
- 分岐状ポリペプチドが、HKP及びHKP(+H)からなる群から選択される、請求項18に記載の組成物。
- 核酸をさらに含む、請求項18から22のいずれか一項に記載の組成物を含む組成物。
- 核酸が、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、mRNA、RNAzyme、DNAzyme及びアプタマー配列からなる群から選択される、請求項23に記載の組成物。
- 核酸が、siRNA、miRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項23に記載の組成物。
- 核酸がsiRNAを含む、請求項23に記載の組成物。
- siRNA分子が16~27塩基対の長さを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項24から26のいずれか一項に記載の組成物。
- siRNA分子が、21~25塩基対の長さを有し、平滑末端又は1~3ヌクレオチドのオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項24から26のいずれか一項に記載の組成物。
- 第2の核酸をさらに含む、請求項23から28のいずれか一項に記載の組成物。
- 第1の核酸配列がsiRNAであり、第2の核酸がsiRNA、miRNA、アンチセンスオリゴ、プラスミド、mRNA、RNAzyme、DNAzyme又はアプタマー配列である、請求項29に記載の組成物。
- ペプチド、ポリペプチド、及び核酸がナノ粒子に自己組織化する、請求項23から30のいずれか一項に記載の組成物。
- 水溶液中で混合した場合に、ペプチド、ポリペプチド、及び核酸がナノ粒子に自己組織化する、請求項31に記載の組成物。
- ナノ粒子がpH範囲6.0~8.0の水性バッファー中で形成される、請求項31又は32に記載の組成物。
- ナノ粒子が、混合条件下で制御された、w:w=3:1~15:1の範囲(重量対重量比率)の窒素対ホスフェート(N:P)比率(総ペプチド:siRNA)で製剤化される、請求項31又は32に記載の組成物。
- ナノ粒子が、混合条件下で制御された、5:1:1、4:1:1、3:1:1、3:2:1、2:2:1)の範囲(w:w:w)の(N:P)比率(HKP:HKC:siRNA)で製剤化される、請求項31又は32に記載の組成物。
- 薬学的な薬物をさらに含む、請求項23から35のいずれか一項に記載の組成物。
- 薬学的な薬物が、低分子薬物、ペプチド薬物又はタンパク質薬物からなる群から選択される、請求項36に記載の組成物。
- 請求項23から37のいずれか一項に記載の組成物を細胞に送達することを含む、核酸を哺乳動物細胞に送達する方法。
- 核酸がin vitroで細胞に送達される、請求項38に記載の方法。
- 核酸がin vivoで細胞に送達される、請求項38に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が実験動物の細胞である、請求項38から40のいずれか一項に記載の方法。
- 実験動物が齧歯類、イヌ、ネコ又は非ヒト霊長類である、請求項41に記載の方法。
- 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項38から40のいずれか一項に記載の方法。
- 治療的有効量の請求項23から37のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における遺伝子治療の方法。
- 哺乳動物が実験動物である、請求項44に記載の方法。
- 実験動物が齧歯類、イヌ、ネコ又は非ヒト霊長類である、請求項45に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項44に記載の方法。
- 請求項23から37のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物に送達することを含む、哺乳動物に治療的化合物を送達する方法。
- 哺乳動物が実験動物である、請求項48に記載の方法。
- 実験動物が齧歯類、イヌ、ネコ又は非ヒト霊長類である、請求項49に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項48に記載の方法。
- a)合成装置を用いてペプチドを合成する工程;b)共有結合を介して標的化リガンドをペプチドへ連結する工程;c)合成したペプチドを回収する工程を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載のペプチドを調製する方法。
- a)請求項1から17のいずれか一項に記載のペプチドを核酸と混合して、複合体を形成する工程、b)請求項18から23のいずれか一項に記載のポリペプチドを規定の比率で混合物に添加して、ナノ粒子を形成する工程、b)ナノ粒子を回収する工程を含む、請求項23に記載の組成物を調製する方法。
- ポリペプチド、ペプチド、及び核酸が水溶液中で混合される、請求項52又は53に記載の方法。
- ポリペプチド及び核酸が、N:P質量比率3~10で混合される、請求項54に記載の方法。
- ペプチド及び核酸がN:P質量比率1~10で混合される、請求項54に記載の方法。
- ポリペプチド及びペプチド比率が1~10である、請求項54に記載の方法。
- ポリペプチド及びペプチド比率が2、3、4及び5である、請求項54に記載の方法。
- 薬学的な薬物をポリペプチド及び核酸と共混合するさらなる工程を含む、請求項53から58のいずれか一項に記載の方法。
- 薬学的な薬物が低分子薬物、ペプチド薬物、又はタンパク質薬物からなる群から選択される、請求項59に記載の方法。
- ナノ粒子サイズが50~300nmである、請求項53から60のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸がsiRNA、miRNA、アンチセンスオリゴ、プラスミド、mRNA、RNAzyme、DNAzyme又はアプタマー配列である、請求項53から61のいずれか一項に記載の方法。
- a)合成装置を使用して分岐状ポリペプチドを合成する工程;b)合成された分岐状ポリペプチドを回収する工程;c)請求項1から17のいずれか一項に記載のペプチドを回収した分岐状ポリペプチドと混合する工程;d)得られた組成物を回収する工程を含む、請求項18に記載の組成物を調製する方法。
- 工程c)においてペプチド及びポリペプチドが規定の比率で混合される、請求項63に記載の方法。
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