JP2022546777A - 抗ｖｅｇｆ単一ドメイン抗体およびその応用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体およびその応用を提供する。具体的には、本発明は、抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体およびそのＶＨＨ鎖を提供する。本発明は、上記単一ドメイン抗体またはそのＶＨＨ鎖をコードするコード配列、対応する発現ベクターと当該単一ドメイン抗体を発現できる宿主細胞、および本発明の単一ドメイン抗体の生産方法をさらに提供する。本発明の単一ドメイン抗体は、ヒトＶＥＧＦＡを特異的に識別することができ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤと交差反応せず、良好な特異性を有し、本発明の単一ドメイン抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、サルのＶＥＧＦＡを同時に識別することができ、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２と、およびＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との間の相互作用を効果的に遮断することができ、血管新生に対して非常に優れた阻害効果を有し、本発明の単一ドメイン抗体は、非製剤条件下でより良好な安定性を示す。【選択図】 なし

Description

本発明は、生物医学または生物医薬品の技術分野に関し、より具体的には、抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体およびその応用に関する。
既存の血管内皮増殖因子薬は、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名は、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）である）、コンバーセプト（Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）等を含む。２０１８年２月１３日、中国国家食品薬品監督管理局（ＣＦＤＡ）は、成人の糖尿病性黄斑浮腫の治療薬としてアイリーア（ｅｙｌｅａ）（アフリベルセプト眼内注射液）を承認した。抗腫瘍治療用のベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名は、アバスチンである）の価格は、４ｍｌ（１００ｍｇのベバシズマブを含む）の１本あたり１９９８元（中国）であり、推奨用量は、５ｍｇ／ｋｇであり、１４日ごとに１回投与し、患者の体重が６０ｋｇであり、毎回３００ｍｇのベバシズマブ、つまり３本を一月に２回適用すると、つまり、一月に１１９８８元になる。眼疾患の治療のためのコンバーセプトの価格は、０．２ｍｌ（１０ｍｇのコンバーセプトを含む）の１本あたり５５５０元であり、その投与方案は、最初の３ケ月に一月に１回、次の３ケ月に一月に１回、合計１年に６回、つまり１年に３３３００元を注射する。さらに、アフリベルセプトの価格は、０．１ｍｌ（４ｍｇのアフリベルセプトを含む）の１本あたり５８５０元であり、その投与方案は、２ケ月に１回、１年に６回、つまり１年に３５１００元投与する。
単一ドメイン抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）、即ち、重鎖単一ドメイン抗体ＶＨＨ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ―ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）-ラクダの体内に軽鎖を天然に欠く重鎖抗体（ｈｅａｖｙ―ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＨＣＡｂ）が存在し、その可変領域をクローニングすることによって得られる唯一の重鎖可変領域からなる単一ドメイン抗体は、現在使用可能な完全な機能を有する安定した抗原に結合できる最小単位である。単一ドメイン抗体は、安定性が高く、水溶性が高く、ヒト化が簡単で、標的性が高く、浸透性が高いという特徴を有し、免疫実験、診断および治療において、想像を絶する役割を果たす。単一ドメイン抗体は、新世代の抗体診断および治療において徐々に新たな力になりつつある。
より優れた特異性、遮断活性，より優れた臨床効果、生産が簡単で、生産コストを削減し、患者の投薬の負担を軽減することができる、新しい種類の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を開発することが緊急に解決するべき問題になっている。
本発明の目的は、新しい種類の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体およびその応用を提供することである。
具体的には、本発明の目的は、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２と、およびＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との間の相互作用を効果的に遮断でき、血管新生に対して良好な阻害効果を有し、固形腫瘍に対して良好な阻害効果を有し、より良好な特異性を有する単一ドメイン抗体を提供することである。
本発明の第１の態様は、抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供し、前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域ＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３に示されるＣＤＲ３を含む。
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４によって分離される。
本発明の第２の態様は、抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖を提供し、前記ＶＨＨ鎖は、フレームワーク領域ＦＲおよび本発明の第１の態様に記載の相補性決定領域ＣＤＲを含む。
別の好ましい例において、前記フレームワーク領域ＦＲは、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７に示されるＦＲ４、または
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．： １２に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３に示されるＦＲ４を含む。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８または１４に示されたようである。
さらに、新規抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体の重鎖可変領域をさらに提供し、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３に示されるＣＤＲ３を含む。
本発明の第３の態様は、抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、本発明の第２の態様に記載のＶＨＨ鎖を有する。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、二本鎖抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体を含む。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、動物由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、より好ましくは、ヒト化抗体、ヒト―動物キメラ抗体、より好ましくは、完全ヒト化抗体から選択される。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２または当該分野における他の既知の抗体誘導体等の抗体フラグメント、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体または他のサブタイプの抗体のうちの任意の一つまたは複数であり得る。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体である。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、モノマー、二価体（二価抗体）、および／または多価体（多価抗体）を含む。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４に示されるようなアミノ酸配列を有する一つまたは複数のＶＨＨ鎖を含む。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体のＶＨＨ鎖配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４に示されたようである。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖を含む。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４に示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する。
別の好ましい例において、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖の間は、リンカーによって接続される。
本発明の好ましい例において、前記リンカーは、（ＧａＳｂ）ｘ-（ＧｍＳｎ）ｙの配列から選択され、ここで、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、ｘ、ｙ＝０または１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０（好ましくは、ａ＝４およびｂ＝１、ｍ＝３およびｎ＝１）。
本発明の好ましい例において、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１８）、ＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１９）、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２０）からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６に示されたようである。
本発明の好ましい例において、前記二価抗ＶＥＧＦ抗体は、ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）である。
本発明の第４の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖のＣＤＲ領域、本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体からなる群から選択されるタンパク質をコードする。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９または１５に示されるようなヌクレオチド配列を有する。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１７に示されるようなヌクレオチド配列を有する。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
本発明の第５の態様は、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、本発明の第４の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
別の好ましい例において、前記発現ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）、他の遺伝子導入システム、またはその組み合わせからなる群から選択される。
好ましくは、前記発現ベクターは、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、またはその組み合わせ等のウイルスベクターを含む。
本発明の第６の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第５の態様に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノムには本発明の第４の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記原核細胞は、大腸菌、枯草菌、乳酸菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミラビリス変形菌（ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記真核細胞は、ピキア・パストリス（ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・セレビシエ（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコデルマ（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記真核細胞は、フォールアーミーワーム（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）等の昆虫細胞、タバコ等の植物細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞またはＣＯＳ細胞である。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、ピキア・パストリスである。
本発明の第７の態様は、
（ａ）単一ドメイン抗体の生成に適した条件下で、本発明の第６の態様に記載の宿主細胞を培養することにより、記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を含む培養物を得る段階と、
（ｂ）前記培養物から前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を単離または回収する段階と、および
（ｃ）任意選択で、精製および／または修飾して段階（ｂ）のＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を得る段階とを含む抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を生成する方法を提供する。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８または１４に示されるようなアミノ酸配列を有する。
別の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６に示されるようなアミノ酸配列を有する。
本発明の第８の態様は、免疫コンジュゲートを提供し、当該免疫コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体と、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分とを含む。
別の好ましい例において、前記放射性核種は、
（ｉ）Ｔｃ―９９ｍ、Ｇａ―６８、Ｆ―１８、Ｉ―１２３、Ｉ―１２５、Ｉ―１３１、Ｉｎ―１１１、Ｇａ―６７、Ｃｕ―６４、Ｚｒ―８９、Ｃ―１１、Ｌｕ―１７７、Ｒｅ―１８８、またはその組み合わせからなる群から選択される診断用同位体、および／または
（ｉｉ）Ｌｕ―１７７、Ｙ―９０、Ａｃ―２２５、Ａｓ―２１１、Ｂｉ―２１２、Ｂｉ―２１３、Ｃｓ―１３７、Ｃｒ―５１、Ｃｏ―６０、Ｄｙ―１６５、Ｅｒ―１６９、Ｆｍ―２５５、Ａｕ―１９８、Ｈｏ―１６６、Ｉ―１２５、Ｉ―１３１、Ｉｒ―１９２、Ｆｅ―５９、Ｐｂ―２１２、Ｍｏ―９９、Ｐｄ―１０３、Ｐ―３２、Ｋ―４２、Ｒｅ―１８６、Ｒｅ―１８８、Ｓｍ―１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ―１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ―１４９、Ｔｈ―２２７、Ｘｅ―１３３、Ｙｂ―１６９、Ｙｂ―１７７、またはその組み合わせからなる群から選択される治療用同位体を含む。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、薬物または毒素である。
別の好ましい例において、前記薬物は、細胞毒性薬物である。
別の好ましい例において、前記細胞毒性薬物は、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗物、代謝拮抗薬、化学増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ）、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、特に有用な細胞毒性薬物の例としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、例えば、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）またはベンゾジアゼピン含有薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、インドリノベンゾジアゼピン（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記毒素は、オーリスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、クロルテトラサイクリン、メイタンシロイド、ガテキシン、ガテキシンＡ―鎖、コンブレタスタチン、ドカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジヒドロキシアントラクスジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｘｄｉｏｎｅ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン（ａｂｒｉｎ）、アブリンＡ鎖、ボルケンシン（ｖｏｌｋｅｎｓｉｎ）Ａ鎖、α―サルシヌス、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、リストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロトントキシン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン、サポナリアオフイシナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、糖質コルチコイド、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、検出可能なマーカーである。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューター断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生物学的毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ―２等）、抗体、抗体Ｆｃフラグメント、抗体ｓｃＦｖフラグメント、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ―ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、多価（例えば、二価）の本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を含む。
別の好ましい例において、前記多価とは、前記免疫コンジュゲートのアミノ酸配列が、本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体の複数の反復を含むことを指す。
本発明の第９の態様は、
（ａ）血管新生を阻害するための薬物と、
（ｂ）ＶＥＧＦに関連する疾患または病症を治療するための薬物の調製に使用される、本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体の用途を提供する。
本発明の第１０の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体、または本発明の第９の態様に記載の免疫コンジュゲートと、および
（ｉｉ）薬学的に許容されるベクターとを含む。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートのカップリング部分は、薬物、毒素、および／または治療用同位体である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、細胞毒性薬物等の腫瘍を治療する他の薬物をさらに含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２と、およびＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との相互作用の遮断に使用される。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、注射剤形である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ＶＥＧＦに関連する疾患または病症を治療する薬物の調製に使用され、前記疾患または病症は、腫瘍または癌または眼疾患。
別の好ましい例において、前記腫瘍または癌は、乳がん、肺がん、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肺がん、甲状腺がん、鼻咽頭がんのうちの一つまたは複数を含むが、これらに限定されない。
別の好ましい例において、前記眼疾患は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、病的近視、血管新生緑内障および血管新生を伴う他の眼疾患を含むが、これらに限定されない。
本発明の第１１の態様は、
（ａ）血管新生を阻害するための薬物、
（ｂ）ＶＥＧＦに関連する疾患または病症を治療するための薬物、
（ｃ）ヒトＶＥＧＦ分子の検出用、
（ｄ）フロー検出用、
（ｅ）細胞免疫蛍光検出用、
（ｆ）腫瘍治療用、
（ｇ）腫瘍診断用の調製に使用される、本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体の一つまたは複数の用途を提供する。
別の好ましい例において、前記用途は、診断的および／または非診断的、および／または治療的および／または非治療的である。
本発明の第１２の態様は、抗体を提供し、前記抗体は、本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体の一つまたは複数のＶＨＨ鎖を含む。
別の好ましい例において、前記抗体は、本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体の二つのＶＨＨ鎖を含む。
別の好ましい例において、前記抗体は、本発明の第２の態様に記載の重鎖可変領域ＶＨＨを有する。
別の好ましい例において、前記抗体は、正しい空間構造を有するＶＥＧＦＡタンパク質に特異的であることができる。
別の好ましい例において、前記抗体は、ヒト、マウス、ウサギ子、サルのＶＥＧＦＡを識別することができる。
別の好ましい例において、前記抗体は、ヒトＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤと交差反応しない。
別の好ましい例において、前記抗体は、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２と、およびＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との相互作用を遮断することができる。
別の好ましい例において、前記抗体は、血管新生の生成を阻害することができる。
別の好ましい例において、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。
本発明の第１３の態様は、組換えタンパク質を提供し、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）本発明の第２の態様に記載のＶＨＨ鎖または本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体、および
（ｉｉ）発現および／または精製に協力する任意選択のタグ配列を有する。
別の好ましい例において、前記タグ配列は、Ｆｃタグ、ＨＡタグおよび６Ｈｉｓタグを含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、ＶＥＧＦＡタンパク質に特異的に結合する。
本発明の第１４の態様は、薬剤、試薬、検出プレートまたはキットの調製に使用される、本発明の第２の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、本発明の第３の態様に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供し、
ここで、前記試薬、検出プレートまたはキットは、サンプル中のＶＥＧＦタンパク質の検出に使用され、
ここで、前記薬剤は、ＶＥＧＦに関連する疾患または病症の治療または予防に使用される。
別の好ましい例において、前記検出には、フロー検出、細胞免疫蛍光検出が含まれる。
別の好ましい例において、前記疾患または病症は、腫瘍または癌または眼疾患を含む。
別の好ましい例において、前記腫瘍または癌は、乳がん、肺がん、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肺がん、甲状腺がん、鼻咽頭がんのうちの一つまたは複数を含むが、これらに限定されない。
別の好ましい例において、前記眼疾患は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、病的近視、血管新生緑内障および血管新生を伴う他の眼疾患を含むが、これらに限定されない。
本発明の第１５の態様は、疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、必要とする対象に本発明の第３の態様に記載の単一ドメイン抗体、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートを投与する段階を含む。
別の好ましい例において、前記対象は、ヒト、マウス、ウサギ子、サル等の哺乳動物を含む。
本発明の第１６の態様は、サンプル中のＶＥＧＦＡタンパク質を検出する方法を提供し、前記方法は、
（１）サンプルを、本発明の第２の態様に記載のＶＨＨ鎖、本発明の第３の態様に記載の単一ドメイン抗体、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートと接触させる段階と、
（２）抗原―抗体複合体が形成されるかどうかを検出する段階とを含み、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＶＥＧＦＡタンパク質が存在することを示す。
別の好ましい例において、前記方法は、非診断的かつ非治療的方法である。
本発明の第１７の態様は、ＶＥＧＦＡタンパク質検出試薬を提供し、前記検出試薬は、
（ｉ）本発明の第２の態様に記載のＶＨＨ鎖、本発明の第３の態様に記載の単一ドメイン抗体、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートと、および
（ｉｉ）検出学的に許容されるベクターとを含む。
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートのカップリング部分は、診断用同位体である。
別の好ましい例において、前記検出学的に許容されるベクターは、無毒で、不活性な水性ベクター媒体である。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、同位体トレーサー（ｔｒａｃｅｒ）、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、磁性ナノ粒子およびイメージング剤からなる群から選択される一つまたは複数の試薬である。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、インビボ検出に使用される。
別の好ましい例において、前記検出試薬の剤形は、液体または粉末（例えば、水溶液剤、注射剤、凍結乾燥粉末、錠剤、口腔内製剤、吸入剤）である。
本発明の第１８の態様は、ＶＥＧＦＡタンパク質を検出するキットを提供し、前記キットは、本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートまたは本発明の第１７の態様に記載の検出試薬、および説明書を含む。
別の好ましい例において、前記説明書には、前記キットが試験対象のＶＥＧＦＡ発現を非侵襲的に検出することが記載される。
本発明の第１９の態様は、インビボでＶＥＧＦＡタンパク質を検出する造影剤の調製に使用される、本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供する。
別の好ましい例において、前記検出は、癌の診断または予後に使用される。
本発明の第２０の態様は、抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲを提供し、前記ＶＨＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５に示される ＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６に示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７に示されるＦＲ４で構成されるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１２に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３に示されるＦＲ４で構成される。
本発明の第２１の態様は、必要とする対象に本発明の第１０の態様に記載の医薬組成物を投与する段階を含む、ＶＥＧＦに関連する疾患または病症を治療する方法を提供する。
別の好ましい例において、前記対象は、人等の哺乳動物を含む。
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
ヒトＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２との相互作用を遮断できる単一ドメイン抗体のＥＬＩＳＡ同定の結果を示す。候補抗体Ｎｂ２４の遮断活性は、対照抗体アバスチンの遮断活性よりも有意に優れていることが同定される。ここで、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）は、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）である。 ＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する候補抗体の阻害効果の検出結果を示す。ＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する候補抗体Ｎｂ２４の阻害効果は、対照抗体アバスチンの阻害効果よりも強いことが同定される。 酵母で発現させたｈｕＮｂ２４二価体のＳＥＣ―ＨＰＬＣ検出の結果を示す。硫酸アンモニウム沈殿によって精製されたサンプルは、ＳＥＣ―ＨＰＬＣによって同定され、そのサンプルの純度は、９４．１１％に達することができる。 ヒト化後の候補抗体の遮断活性のＥＬＩＳＡ検出である。結果によると、ヒト化前後の抗体の遮断活性が相当であるため（ＩＣ５０ Ｎｂ２４＝０．０４５ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ ｈｕＮｂ２４＝０．０３８ｕｇ／ｍＬ）、ヒト化は成功であることを示す。ここで、Ｎｂ２４は、ヒト化全の抗体であり、ｈｕＮｂ２４は、ヒト化後の抗体である。 酵母で発現させたヒト化二価抗体の遮断活性のＥＬＩＳＡ検出である。結果によると、酵母で発現させた単一ドメイン抗体の二価体の遮断活性が有意に改善され（ＩＣ５０ ｈｕＮｂ２４＝０．０４４ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）＝０．０１３ｕｇ／ｍＬ）、対照抗体のアバスチンの遮断活性よりも有意に高いことを示す（ＩＣ５０ アバスチン＝０．３３１ｕｇ／ｍＬ）。ここで、ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）は、酵母で発現させたヒト化二価抗体である。 ＥＬＩＳＡ検出によるヒト化二価抗体と市販の類似製品の遮断活性の比較である。結果によると、酵母で発現させたヒト化二量体抗体の遮断活性が明らかな利点を有し、いくつかの市販の製品の遮断活性よりも優れていることを示す（ＩＣ５０ ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）＝０．０２２ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アイリーア＝０．０８５ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ コンバーセプト＝０．０８８ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アバスチン＝０．４３９ｕｇ／ｍＬ）。ここで、アイリーアは、アフリベルセプトであり、コンバーセプトは、コンバーセプトである。 ＨＵＶＥＣ細胞的増殖に対する酵母で発現させたヒト化二価抗体の阻害効果の検出結果である。結果によると、酵母で発現させたヒト化二価抗体の効果が同様の市販の対照製品の効果よりも優れていることを示す（ＩＣ５０ ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）＝５３．５９ｎｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アイリーア＝６５．９６ｎｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ コンバーセプト＝１２９．７ｎｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アバスチン＝２５４．７ｎｇ／ｍＬ）。 ＥＬＩＳＡによって候補抗体がＶＥＧＦ相同タンパク質と交差反応できるかどうかを検出した結果である。結果によると、ヒト化二価抗体が、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ等の他の相同タンパク質と交差反応することなく、ヒトＶＥＧＦＡト反応することができ、その特異性が良好であることを示す。 ＥＬＩＳＡによって候補抗体が他の種のＶＥＧＦと交差反応できるかどうかを検出した結果である。結果によると、ヒト化二価抗体がヒト、マウス、ウサギのＶＥＧＦＡを同時に識別できることを示す。 ＥＬＩＳＡによってヒトＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との間の相互作用に対する酵母で発現させたヒト化二価抗体の遮断を検出した結果である。結果によると、候補抗体がヒトＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との間の相互作用を遮断することができ（ＩＣ５０ ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）＝０．１６８ｕｇ／ｍＬ）、遮断活性が対照抗体アバスチン（ＩＣ５０ アバスチン＝０．９６７ｕｇ／ｍＬ）よりも優れていることを示す。 ＯＩＲモデルマウスにおける網膜非灌流領域の面積の統計結果である。マウスに対して異なる濃度の酵母で発現させたヒト化二価抗体を投与し、実験群のマウスの網膜非灌流領域の面積は、陽性対照群の面積よりも小さい。 ＯＩＲモデルマウスにおける網膜血管新生クラスターの統計結果である。アフリベルセプトアイリーア（陽性対照）と比較して、異なる濃度の酵母で発現させたヒト化二価抗体は、マウスの網膜血管新生クラスターに対してより明らかな阻害効果を示し、統計学的差異を有する。 ＳＥＣ―ＨＰＬＣによって様々な温度下での候補抗体の安定性を検出した結果である。図１３Ａは、４℃下で１ケ月間置かれた候補抗体の安定性の結果を示し、結果によると、当該抗体が非製剤条件下で４℃下に１ケ月間おかれた後、純度に明らかな変化がなく、良好な安定性を示したことを示す。 図１３Ｂは、２５℃下で１ケ月間置かれた候補抗体の安定性の結果を示し、結果によると、当該抗体が非製剤条件下で２５℃下に１ケ月間置かれた後、純度に明らかな変化がなく、良好な安定性を示したことを示す。 図１３Ｃは、４０℃下で１５日間置かれた候補抗体の安定性の結果を示し、結果によると、当該抗体が非製剤条件下で４０℃に１５日間置かれた後、純度に明らかな変化がなく、良好な安定性を示したことを示す。 図１３Ｄは、－２０℃下で５回反復して５回凍結融解した候補抗体の安定性の結果を示し、結果によると、当該抗体が非製剤条件下で－２０℃に置かれた後、反復して５回凍結融解して、純度に明らかな変化がなく、良好な安定性を示したことを示す。
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究および広範囲にわたるスクリーニングの後、予期せずに、あるクラスの抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を初めて発見し、実験結果によると、本発明の単一ドメイン抗体が、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤと交差反応することなく、ＶＥＧＦＡを特異的に識別することができ、良好な特異性を有し、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２と、およびＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との間の相互作用を効果的に遮断することができ、血管新生に対して良好な阻害効果を有することを示す。本発明の単一ドメイン抗体の生成は容易である。これに基づいて、本発明を完成させた。
具体的には、本発明は、ヒトＶＥＧＦＡタンパク質を使用してラクダを免疫して、高品質の免疫単一ドメイン抗体遺伝子ライブラリーを取得する。次にＶＥＧＦＲタンパク質分子をＥＬＩＳＡプレートにカップリングして、ＶＥＧＦＲタンパク質の正しい空間構造を示し、この形態の抗原は、バクテリオファージディスプレイ技術を使用して、免疫単一ドメイン抗体遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより（ラクダ重鎖抗体バクテリオファージディスプレイ遺伝子ライブラリー）、ＶＥＧＦＡ特異的単一ドメイン抗体遺伝子を取得する。さらに、この遺伝子を哺乳動物細胞に導入することにより、哺乳動物細胞において高効率的に発現することができかつ特異性が高い単一ドメイン抗体株を取得する。次にＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ルシフェラーゼレポーター遺伝子検出システム等の方法によって、遮断活性を有する抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を同定する。
用語
本明細書で使用されるように、「本発明単一ドメイン抗体」、「本発明の単一ドメイン抗体」、「本発明の抗ＶＥＧＦ抗体」、「本発明のＶＥＧＦ単一ドメイン抗体」、「抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体」という用語は、同じ意味を有し、交換可能に使用され、両方ともＶＥＧＦＡ（ヒトＶＥＧＦＡを含む）を特異的に識別して結合する単一ドメイン抗体を指す。好ましくは、本発明の単一ドメイン抗体の可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３に示されるＣＤＲ３を有する。より好ましくは、本発明の単一ドメイン抗体のフレームワーク領域は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７に示されるＦＲ４、または（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１２に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３に示されるＦＲ４を有する。
本明細書で使用されるように、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、二つの同じ軽鎖（Ｌ）および二つの同じ重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロテトラグリカンタンパク質である。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合によって重鎖と結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖にも、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド結合がある。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後には、複数の定常領域がある。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には、定常領域があり、軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域と反対であり、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域と反対である。特殊のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域との間で界面を形成する。
本明細書で使用されるように、「単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨ」、「ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」、「単一ドメイン抗体」（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ，またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ））という用語は、同じ意味を有しかつ交換可能に使用され、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、完全な機能を有する最小の抗原結合フラグメントである、一つの重鎖可変領域のみで構成される単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築することを指す。通常、まず軽鎖および重鎖定常領域１（ＣＨ１）を天然に欠失する抗体を取得した後、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみで構成される単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築する。
本明細書で使用されるように、「可変」という用語は、抗体の可変領域の特定の部分が、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性を形成する、配列で異なることを示す。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均等に分布されていない。それは、軽鎖および重鎖可変領域において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つのフラグメントに集中する。可変領域におけるより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ四つのＦＲ領域を含み、それらは、一般にβ―シート構成であり、リンクループを形成する三つのＣＤＲによって接続され、特定の場合に、部分的なβシート構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に密着され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ、Ｎｏ．９１―３２４２、ＶＯＬ．Ｉ、６４７―６６９ページ（１９９１）を参照する）。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、それらは、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与等の、様々なエフェクター機能を示す。
当業者に知られているように、免疫コンジュゲートおよび融合発現生成物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素および他の診断用または治療用分子を本発明の抗体またはそのフラグメントに結合することによって形成されるコンジュゲートを含む。本発明は、前記抗ＶＥＧＦ抗体またはそのフラグメントに結合する細胞表面マーカーまたは抗原をさらに含む。
本明細書で使用されるように、「重鎖可変領域」および「ＶＨ」という用語は、交換可能に使用される。
本明細書で使用されるように、「可変領域」および「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」という用語は、交換可能に使用される。
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、三つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
本発明において、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、両方とも、ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合するポリペプチド、例えば、重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。それらは、開始メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）を含むか、含まないことができる。
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、重鎖可変領域に位置する三つの特定の領域によって説明されることができ、当該セグメントを四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分離し、四つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的に保存であり、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは、円形構造を形成し、その間のＦＲによって形成されたβシートを介して空間構造で互いに近接し、重鎖のＣＤＲと対応する軽鎖のＣＤＲとは、抗体の抗原結合部位を構成する。ＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するアミノ酸は、同じ種類の抗体のアミノ酸配列を比較することによって決定されることができる。
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、それらの少なくともいくつかが抗原の血尾久に関与するため、特に興味深い。従って、本発明は、そのＣＤＲが本明細書で同定されたＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有する限り、ＣＤＲ含有抗体重鎖可変領域を有する分子を含む。
本発明は、完全な抗体だけでなく、前記抗体のフラグメント、誘導体および類似体も含む。
本明細書で使用されるように、「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の抗体と実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドフラグメント、誘導体または類似体は、（ｉ）遺伝暗号によってコードされるか、コードされない、一つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド、または（ｉｉ）一つまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物等）との融合によって形成されたポリペプチド、または（ｉｖ）添加アミノ酸配列をこのポリペプチド配列に融合することによって形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製する配列またはプロタンパク質配列、または６Ｈｉｓタグと形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書の教示に従って、これらのフラグメント、誘導体および類似体は、当業者によく知られている範囲に属する。
本発明の抗体は、ＶＥＧＦＡ結合活性を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドを指す。当該用語は、本発明の抗体と同じ機能を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異型をさらに含む。これらの変異型は、一つまたは複数（通常は１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個である）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端への一つまたは複数（通常は２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である）のアミノ酸の追加を含む（これらに限定されない）。例えば、当技術分野において、性能が同様または類似であるアミノ酸を使用して置換する場合、通常、タンパク質の機能を変更しない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端への一つまたは複数のアミノ酸の追加は、通常、タンパク質の機能を変更しない。当該用語は、本発明の抗体の活性フラグメントおよび活性誘導体をさらに含む。
当該ポリペプチドの変異型は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシーの条件下で本発明の抗体をコードするＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を使用して得られたポリペプチドまたはタンパク質を含む。
本発明は、他のポリペプチドを提供し、ほとんどの完全長のポリペプチドに加えて、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体のフラグメントをさらに含む。通常、当該フラグメントは、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸、好ましくは、少なくとも約５０個の連続するアミノ酸、より好ましくは、少なくとも約８０個の連続するアミノ酸、最も好ましくは、少なくとも約１００個の連続するアミノ酸を有する。
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大１０個、好ましくは最大８個、より好ましくは最大５個、最も好ましくは最大３個のアミノ酸が類似または同様の性質のアミノ酸によって置き換えられることによって、ポリペプチドを形成することを指す。これらの保存的変異ポリペプチドは、好ましくは、表１によるアミノ酸の置き換えによって生成される。
Figure 2022546777000001
 本発明は、上記抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工的に合成したＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な追加のコード配列、ならびに成熟ポリペプチドのコード配列（任意選択の追加のコード配列）および非コード配列を含む。
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または追加のコード配列および／または非コード配列をさらに含むポリヌクレオチドであり得る。
本発明は、上記の配列にハイブリダイズし、かつ二つの配列の間で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、ストリンジェントな条件下で本発明の前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドに特に関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、（１）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃等の、より低いイオン強度およびより高い温度下でのハイブリダイゼーションおよび溶出、または（２）ハイブリダイゼーションの場合、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２℃等の、変性剤の追加、または（３）二つの配列の間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上の場合のみのハイブリダイゼーションの発生を指す。また、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
本発明の抗体のヌクレオチドの全長配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得られることができる。実行可能な方法は、特にフラグメントの長さが短い場合に、人工合成を使用して牽連する配列を合成することである。通常、まず、複数の小さなフラグメントを合成し、次に接続することによって、非常に長い配列のフラグメントを得ることができる。さらに、重鎖のコード配列と発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）とを融合させて、融合タンパク質を形成することもできる。
関連する配列が得られたら、組換え法を使用して、関連する配列をまとめて得ることができる。これは、通常、ベクターにクローニングし、細胞に移し、次に従来の方法で増殖した宿主細胞から単離して、関連する配列を得る。本発明に言及される生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。
現在、完全に化学合成によって、本発明のタンパク質（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に当該ＤＮＡ配列を、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学合成によって、突然変異を本発明のタンパク質配列に導入することもできる。
本発明は、上記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように、適切な宿主細胞を形質転換するために使用されることができる。
宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞、または哺乳動物細胞等の高等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌，ストレプトマイセス属、サルモネラ菌の細菌細胞、酵母などの信金細胞、ショウジョウバエＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞の動物細胞等がある。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術を使用して実施することができる。宿主が大腸菌等の原核生物である場合、指数増殖期の後にＤＮＡを吸収できるコンピテント細胞を採取し、当技術分野でよく知られている手順を使用してＣａＣｌ２法で処理することができる。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、形質転換は、エレクトロポレーション法によって行われることもできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション，リポソーム包装等従来の機械的方法等のＤＮＡトランスフェクション法を使用することができる。
得られた形質転換体は、従来の方法で培養され、本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に従って、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択されることができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養される。宿主細胞が適切な細胞密度に成長した後、適切な方法（例えば、温度転換または化学的誘導）を使用して、選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間さらに培養する。
上記の方法における組換えポリペプチドは、細胞内で、または細胞膜上で発現されることができるか、または細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、その物理的、化学的および他の特性を使用して、様々な単離方法によって、組換えタンパク質を単離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例としては、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術とこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、単独で使用することができ、または検出可能なマーカー（診断目的のために）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分または上記の任意のこれらの物質の組み合わせに結合またはカップリングすることができる。
診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューター断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体に結合またはカップリングできる治療剤は、（１）放射性核種、（２）生物毒性、（３）ＩＬ―２等のサイトカイン、（４）金ナノ粒子／ナノロッド、（５）ウイルス粒子、（６）リポソーム、（７）磁性ナノ粒子、（８）プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ―ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、（１０）化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）
血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）は、非常に特異的な血管内皮細胞増殖因子であり、ＶＥＧＦは、内皮細胞膜上のその受容体である血管内皮増殖因子受容体（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＶＥＧＦＲ）に結合し、受容体の自己リン酸化を引き起こすことにより、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化し、マイトジェン特性を達成し、内皮細胞増殖を誘導する。それが血管新生の特性を有するため、ＶＥＧＦは、血液循環が不十分な時に組織への酸素供給を回復することができる。組織中のＶＥＧＦが過剰発現される場合、疾患症状を引き起こす可能性がある。例えば、ＶＥＧＦの過剰発現は、糖尿病性網膜病等の網膜の血管疾患を引き起こす可能性がある。さらに、固形腫瘍は、成長に必要な栄養素を得るのに十分な血管の供給がない場合、一定のサイズ制限を超えて成長することはできないため、当該制限を克服するために、固形腫瘍は、ＶＥＧＦを発現して、成長および転移を可能にする。
ＶＥＧＦファミリーのメンバーは、ＶＥＧＦ―Ａ、ＶＥＧＦ―Ｂ、ＶＥＧＦ―Ｃ、ＶＥＧＦ―Ｄ、ＶＥＧＦ―Ｅ、ＶＥＧＦ―Ｆおよび胎盤増殖因子（Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＧＦ）を含む。ここで、ＶＥＧＦ―Ａは、正常および病理学的新生血管（即ち、血管新生）を調節できる、最も重要な因子である。ＶＥＧＦ―Ａの生物学的効果は、その特異的受容体に結合することによって媒介され、それは、主に特異的受容体である血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ―１）および特異的受容体である血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ―２）に結合する。ここで、ＶＥＧＦＲ―２は、血管内皮細胞の増殖に重要な影響を与える主要なＶＥＧＦＲであると考えられる。ＶＥＧＦＲ―２は、細胞内キナーゼを介して、ＶＥＧＦを誘導して、二量体および自己リン酸化を必要とする受容体をバインディングするようにすることにより、細胞のマイトジェンを増強する。ＶＥＧＦ―ＣおよびＶＥＧＦ―Ｄは、リンパ管の生成を調節することができる。
医薬組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、医薬組成物であり、それは、上記抗体またはその活性フラグメント、および薬学的に許容されるベクターを含む。通常、これらの物質を、無毒で、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で調製されることができ、ここで、ｐＨ値が調製される物質の性質および治療される病症に応じて変化することができるが、ｐＨは、通常約５～８、好ましくは約６～８である。調製された医薬組成物は、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（これらに限定されない）、従来の経路によって投与されることができる。
本発明の医薬組成物は、ＶＥＧＦＡタンパク質分子の結合に直接使用されることができ、従って、腫瘍の治療に使用されることができる。さらに、他の治療剤を同時に使用することもできる。
本発明の医薬組成物は、安全かつ有效量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１―８０ｗｔ％）の本発明の上記単一ドメイン抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む。このようなベクターは、：生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせを含む（これらに限定されない）。医薬製剤は、投与方式と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、注射の形態で、例えば、生理食塩水またはグルコースおよび他のアジュバントを含む水溶液を用いて、従来の方法によって調製されることができる。注射剤、溶液等の医薬組成物は、好ましくは、無菌条件下で製造される。有効成分の投与量は、治療有効量であり、例えば、１日ごとに約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明のポリペプチドは、さらに他の治療剤とともに使用されることができる。
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効量の免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重以下であり、好ましくは、当該用量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な用量は、投与経路、患者の健康状態等の余韻も考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキルの範囲内である。
抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体
本発明において、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、モノマー、二価体（二価抗体）、および／または多価体（多価抗体）を含む。
本発明の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４に示されるようなアミノ酸配列を有する一つ、二つまたは複数のＶＨＨ鎖を含む。
典型的には、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４中に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖を含む。
典型的には、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４中に示されるようなアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する。
典型的には、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４中に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖を含む。
本発明の好ましい例において、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖の間は、リンカーによって接続される。
本発明の好ましい例において、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４に示されるようなアミノ酸配列を有する二つのＶＨＨ鎖の間は、リンカーによって接続される。
本発明の好ましい例において、前記リンカーは、（ＧａＳｂ）ｘ-（ＧｍＳｎ）ｙの配列から選択され、ここで、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、ｘ、ｙ＝０または１または２または３または４または５または６または７または８または９または１０（好ましくは、ａ＝４およびｂ＝１、ｍ＝３およびｎ＝１）。
本発明の好ましい例において、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１８）、ＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１９）、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２０）からなる群から選択される。
本発明の好ましい例において、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６に示されたようである。
本発明の好ましい例において、前記二価抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）である。
標識された単一ドメイン抗体
本発明の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体は、検出可能なマーカーを有する。より好ましくは，前記マーカーは、同位体、コロイド金マーカー、着色マーカーまたは蛍光マーカーからなる群から選択される。
コロイド金標識は、当業者に知られている方法を使用して実行することができる。本発明の好ましい形態において、抗ＶＥＧＦの単一ドメイン抗体は、コロイド金標識を用いて、コロイド金標識された単一ドメイン抗体を得る。
本発明の新規抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体は、非常に優れた特異性、非常に高い力価を有する。
検出方法
本発明は、ＶＥＧＦタンパク質を検出する方法にさらに関する。当該方法の段階は、大まかに次のとおりである。細胞および／または組織サンプルを取得し、サンプルを媒体に溶解し、前記溶解したサンプルでＶＥＧＦタンパク質のレベルを検出する。
本発明の検出方法において、使用されるサンプルは、特に限定されず、代表的な例としては、細胞保存液に存在する細胞含有サンプルである。
キット
本発明は、本発明の抗体（またはそのフラグメント）または検出プレートを含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝剤等をさらに含む。
本発明は、ＶＥＧＦレベルを検出するための検出キットをさらに提供し、当該キットは、ＶＥＧＦタンパク質を識別する抗体、サンプルを溶解するための熱分解媒体、例えば、様々な緩衝液、検出標識、検出基質等の検出に必要な一般的な試薬および緩衝液を含む。当該検出キットは、インビトロ診断装置であり得る。
応用
上記のように、本発明の単一ドメイン抗体は、幅広い生物学的応用価値および臨床的応用価値を有し、その応用は、ＶＥＧＦに関連する疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学研究等の多くの領域に関する。好ましい応用は、ＶＥＧＦに対する臨床診断および標的治療である。
本発明の主な利点は、次のとおりである。
（ａ）本発明の単一ドメイン抗体特異性は、正しい空間構造を有するＶＥＧＦに対してタンパク質である。
（ｂ）本発明の単一ドメイン抗体は、ヒト、マウス、ウサギ子、サルのＶＥＧＦを識別することができる。
（ｃ）本発明の単一ドメイン抗体は、ヒトのＶＥＧＦＡのみを識別し、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤと交差反応せず、良好な特異性を有する。
（ｄ）本発明の単一ドメイン抗体は、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２と、およびＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との間の相互作用を遮断することができ、遮断活性は、アフリベルセプトの遮断活性よりも高い。
（ｅ）本発明の単一ドメイン抗体は、血管新生に対して良好な阻害効果を有し、効果は、市販の製品であるアフリベルセプトの効果よりも優れている。
（ｆ）本発明の単一ドメイン抗体は、良好な抗腫瘍活性を有し、効果は、市販の製品であるアバスチンの効果よりも優れている。
（ｇ）本発明の単一ドメイン抗体の生産は簡単である。
（ｈ）本発明の単一ドメイン抗体は、非製剤条件下でより良好な安定性を示す。
以下の具体的な実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件を示さない実験方法は、通常、一般的な条件、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、メーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。
実施例１：抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のスクリーニングおよび発現
ヒトＶＥＧＦに特異的な単一ドメイン抗体を取得するために、まず、哺乳動物細胞ＨＥＫ２９３Ｆを使用して、ヒトＶＥＧＦＡタンパク質を一過性に発現させ、アフィニティー精製後にラクダ免疫に使用される。具体的な方法については、特許ＣＮ２０１８１０１５１７５２６実施例１および実施例２の方法の説明を参照する。簡単に説明すると、精製されたＶＥＧＦＡタンパク質で２匹の新疆フタコブラクダを免疫し、７回の免疫後にラクダ末梢血からトータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを単離し、その後、逆転写およびＰＣＲによってＶＨＨ遺伝子を増幅し、ＶＨＨ遺伝子をバクテリオファージベクターｐＭＥＣＳにクローニングし、ＴＧ１に形質転換してバクテリオファージディスプレイライブラリーを構築する。構築されたライブラリーのライブラリー容量は、それぞれ６．４×１０８ＣＦＵおよび５．５×１０８ＣＦＵであり、挿入率は、それぞれ９１．７％および９５．８％である。その後、ライブラリーをスクリーニングし、二つのライブラリーをそれぞれ６ラウンドおよび５ラウンドスクリーニングして、抗体遺伝子を含むバクテリオファージの濃縮を取得する。各ライブラリーから３００クローンを選択して、ＰＥ―ＥＬＩＳＡ同定を実施し、得られた陽性クローンをシーケンシングし、異なる配列の単一ドメイン抗体をＦｃと融合して発現させ、ＨＥＫ２９３Ｆシステムを用いて、抗体を一過性に発現させ、発現方法は、特許ＣＮ２０１８１０１５１７５２６の実施例３の方法の説明を参照する。
実施例２：遮断型抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のスクリーニング
ＥＬＩＳＡ法を使用して、ヒトＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ２との間の相互作用を遮断できる単一ドメイン抗体をスクリーニングする。（１）ＶＥＧＦＲ２タンパク質をＥＬＩＳＡプレート（１ｕｇ／ｍＬ、１００ｕＬ／ウェル）にコーティングし、４℃下で一晩インキュベートし、（２）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、３００ｕＬの１％ＢＳＡブロッキング溶液を加え、３７℃下で２時間インキュベートし、（３）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、勾配希釈した５０ｕＬの抗体サンプル（４０ｕｇ／ｍＬから２倍勾配希釈する）を加え、各ウェルに５０ｕＬの０．０８ｕｇ／ｍＬビオチン化ＶＥＧＦＡタンパク質を加え、３７℃下で１時間インキュベートし、（４）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬのＳＡ―ＨＲＰ（１：１０００００希釈）を加え、３７℃下で１時間インキュベートし、（５）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬのＴＭＢ発色溶液を加え、３７℃下で１０分間発色させ、５０ｕＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長下で吸光度を測定する。結果は、図１に示されるように、Ｎｂ２４の遮断活性が、対照抗体アバスチンの遮断活性よりも有意に優れている（ＩＣ５０ Ｎｂ２４＝０．０１４９ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アバスチン＝０．２１７２ｕｇ／ｍＬ）。
実施例３：ＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する候補抗体の阻害効果
簡単に説明すると、方法は、次のとおりである。（１）よく成長したＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン消化し、培地全体を中和し、ＰＢＳで１回洗浄し、３Ｅ４／ｍＬの濃度で再懸濁し、１００ｕＬ／ウェルを９６ウェルプレートに分配し、３７℃下で、５％ＣＯ２で２０時間培養する。（２）翌日、２％ＦＢＳのＤＭＥＭでＶＥＧＦＡを１００ｎｇ／ｍＬに希釈し、抗体を１００００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、１２５０ｎｇ／ｍＬ、３１２．５０ｎｇ／ｍＬ、７８．１３ｎｇ／ｍＬ、３９．０６ｎｇ／ｍＬ、９．７７ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬに勾配希釈する。（３）別の９６ウェルプレートに６０ｕＬのＶＥＧＦＡおよび等量の希釈好的抗体を加えて均等に混合し、３７℃下で２時間共培養し、各混合液は三つのデュープリケートウェルにある。（４）インキュベーターから細胞培養プレートを取り出し、上清を吸引し、次に対応するウェルにそれぞれ１００ｕｌ（３）の混合液を加え、３７℃下で７２時間インキュベートする。（５）７２時間後に、１０ｕｌ／ウェルのＣＣＫ８溶液を加え、２時間発色させ、発色終了後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０波長での吸光値を読み取る。結果は、図２に示されるように、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する候補抗体Ｎｂ２４の阻害効果は、対照抗体アバスチンの阻害効果よりも強い（ＩＣ５０ Ｎｂ２４＝２９．５８ｎｇ／ｍＬ，ＩＣ５０ アバスチン＝７２．２８ｎｇ／ｍＬ）。
実施例４：抗体Ｎｂ２４ヒト化および発現
可変領域を変更せずに候補抗体をヒト化し、四つのフレームワーク領域の配列に対してヒト化設計を実行し、変更方法は、特許ＣＮ２０１８１０１５１７５２６の実施例４の方法を参照する。ヒト化後の抗体ｈｕＮｂ２４配列をｐＦＵＳＥベクターに構築して、ヒト化された単一ドメイン抗体をＦｃ配列と融合させ、ＨＥＫ２９３Ｆシステムを使用して発現し、発現後のタンパク質は、後続の検証に使用されることができる。変更後の配列は、以下の表２に示されたようである。
Figure 2022546777000002
実施例５：ヒト化二価抗体の構築および発現
上記ヒト化抗体を二価の形態に構築し、リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１８）を使用して接続し、接続後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６に示されたとおりであり（対応するそのコーディングヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１７に示されたようである）、その後、ピキアパストリスによって発現される。簡単に説明すると、発現方法は、次のとおりである。（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６に示される単一ドメイン抗体の二価体配列をｐＰＩＣＺａＡベクターに構築し、（２）Ｓａｃ Ｉ制限エンドヌクレアーゼでｐＰＩＣＺａＡ―Ｎｂ２４―Ｎｂ２４を線形化した後、Ｘ―３３コンピテント細胞に電気形質転換し、（３）電気形質転換したサンプルを、様々な濃度のブレオマイシン耐性を含むＹＰＤプレート培地にそれぞれコーティングし、３０℃のインキュベーターで３～４日培養し、具体的な実施形態については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社によって提供されるｐＰＩＣＺａＡベクター説明書を参照することができ、（４）プレート培地でシングルクローンが成長した後、様々な濃度平のプレート上でシングルクローンを選択して、ＢＭＧＹ培地に入れ、ＢＭＧＹ培養液のＯＤ値が約２０に達する場合、菌体を収集した後ＢＭＭＹ培地に交換し、２８℃下で、２５０ｒｐｍで培養し、（５）その後２４時間ごとにサンプリングし、最終体積が１％であるメタノールを加えてサンプリングし、サンプルを１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採集し、－２０℃下で保存し、５日間連続して誘導し、培養を終了し、（６）採集したサンプルをＳＤＳ―ＰＡＧＥで検出し、同時にサンプルを収集し、硫酸アンモニウム沈殿法により標的抗体を精製する。結果は、図３に示されたとおりであり、発現上清から硫酸アンモニウム沈殿によって精製された単一ドメイン抗体の二価体抗体ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）を、ＳＥＣ―ＨＰＬＣで検出したその純度は、９４．１１％であり、後続の研究に使用されることができる。
実施例６：ＥＬＩＳＡ検出によるヒト化抗体および二価抗体の的遮断活性
検出方法は、実施例２と同じであり、結果は、図４に示されるように、ヒト化抗体の遮断活性は、ヒト化前の抗体の遮断活性と同等であり（ＩＣ５０ Ｎｂ２４＝０．０４５ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ ｈｕＮｂ２４＝０．０３８ｕｇ／ｍＬ）、従って、当該ヒト化の変更が成功したことを示す。ヒト化した単一ドメイン抗体と酵母で発現させた二価抗体との遮断活性を比較し、上記の実験を繰り返し、結果は、図５に示されるように、酵母で発現させた単一ドメイン抗体の二価体ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）の遮断活性は、３倍以上増加し（ＩＣ５０ ｈｕＮｂ２４＝０．０４４ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）＝０．０１３ｕｇ／ｍＬ）、対照抗体アバスチンの遮断活性よりも有意に高かった（ＩＣ５０ アバスチン＝０．３３１ｕｇ／ｍＬ）。上記の実験方法を使用して、候補抗体と市販の類似製品との遮断活性を検出および比較し、結果は、図６に示されるように、酵母で発現させたヒト化二量体抗体ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）の遮断活性は、明らかな利点を有する（ＩＣ５０ ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）＝０．０２２ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アイリーア＝０．０８５ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ コンバーセプト＝０．０８８ｕｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アバスチン＝０．４３９ｕｇ／ｍＬ）。これは、酵母で発現させたヒト化二量体が、既存の市販の製品よりも有意に優れた遮断活性を有することを示す。
実施例７：ＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対するヒト化二価抗体の阻害効果
検出方法は、実施例３と同じであり、結果は、図７に示されるように、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する酵母で発現させたヒト化二価抗体ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）の阻害効果は、同様の市販の対照製品よりも優れる（ＩＣ５０ ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）＝５３．５９ｎｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アイリーア＝６５．９６ｎｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ コンバーセプト＝１２９．７ｎｇ／ｍＬ、ＩＣ５０ アバスチン＝２５４．７ｎｇ／ｍＬ）。
実施例８：ＥＬＩＳＡ検出による候補抗体の特異性
ＥＬＩＳＡを使用して、候補抗体がＶＥＧＦ相同タンパク質と交差反応できるかどうかを検証する。（１）１ｕｇ／ｍＬの試験抗体を４℃下で、１００ｕＬ／ウェルのＥＬＩＳＡプレートに一晩コーティングし、（２）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、各ウェルに３００ｕＬの１％ ＢＳＡを加えて、室温下で２時間ブロックし、（３）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬの１ｕｇ／ｍＬビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）―ｈＶＥＧＦＡ、ビオチン―ｈＶＥＧＦＢ、ビオチン―ｈＶＥＧＦＣ、ビオチン―ｈＶＥＧＦＤを加えて、３７℃下で１時間インキュベートし、（４）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬの希釈したＳＡ―ＨＲＰ（１：５０００希釈）を加えて、３７℃下で１時間インキュベートし、（５）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬのＴＭＢ発色溶液を加え、３７℃下で１０分間発色させ、５０ｕＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長下で吸光度を測定する。結果は、図８に示されるように、ヒト化二価抗体ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）は、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ等の他の相同タンパク質と交差反応せずに、ヒトＶＥＧＦＡと反応することができる。
同様に、ＥＬＩＳＡを使用して、候補抗体が他の種のＶＥＧＦと交差反応できるかどうかを検出する。（１）１ｕｇ／ｍＬの試験抗体を４℃下で、１００ｕＬ／ウェルのＥＬＩＳＡプレートに一晩コーティングし、（２）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、各ウェルに３００ｕＬの１％ ＢＳＡを加えて、室温下で２時間ブロックし、（３）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬの１ｕｇ／ｍＬビオチン―ｈＶＥＧＦＡ（ヒト）、ビオチン―ｍＶＥＧＦＡ（マウス）、ビオチン―ｒＶＥＧＦＡ（ウサギ）を加えて、３７℃下で１時間インキュベートし、（４）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬの希釈したＳＡ―ＨＲＰ（１：５０００希釈）を加えて、３７℃下で１時間インキュベートし、（５）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬのＴＭＢ発色溶液を加え、３７℃下で１０分間発色させ、５０ｕＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長下で吸光度を測定する。結果は、図９に示されるように、ヒト化二価抗体ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）は、ヒト、マウス、ウサギのＶＥＧＦＡを同時に識別することができる。さらに、ヒトＶＥＧＦ１２１と蟹食猿との対応する位置の配列は、完全に同じであるため、当該候補抗体は、蟹食猿のＶＥＧＦＡも識別することができると考えられる。
実施例９：ＥＬＩＳＡ検出によるＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＡに対するヒト化二価抗体の遮断作
（１）ＶＥＧＦＲ１タンパク質をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし（１ｕｇ／ｍＬ、１００ｕＬ／ウェル）、４℃下で一晩インキュベートし、（２）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、３００ｕＬの１％ＢＳＡブロッキング溶液を加え、３７℃下で２時間インキュベートし、（３）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０ｕＬの勾配希釈した抗体サンプルを加え（２０ｕｇ／ｍＬから２倍勾配希釈する）、各ウェルに５０ｕＬの０．０８ｕｇ／ｍＬビオチン化ＶＥＧＦＡタンパク質を加え、３７℃下で１時間インキュベートし、（４）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬのＳＡ―ＨＲＰ（１：１０００００希釈）を加え、３７℃下で１時間インキュベートし、（５）ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｕＬのＴＭＢ発色溶液を加え、３７℃下で１０分間発色させ、５０ｕＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの波長下で吸光度を測定する。結果は、図１０に示されるように、候補抗体ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）は、ヒトＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲ１との間の相互作用を遮断することができ（ＩＣ５０ ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）＝０．１６８ｕｇ／ｍＬ）、遮断活性は、対照抗体アバスチンの遮断活性よりも優れる（ＩＣ５０ アバスチン＝０．９６７ｕｇ／ｍＬ）。
実施例１０：新生マウスＯＩＲモデルにおける眼内血管成長に対する候補抗体の阻害効
（１）血管新生を研究するための古典的なマウスモデル-ＯＩＲモデルを使用する。７日齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを７５％酸素濃度の密閉容器で１２日間飼育し、この期間中に、酸素ボックス内の酸素濃度を定期的にモニターリングして７５％に維持し、その後、正常な空気環境下で５日間飼育する。Ｐ７（７日齢）―Ｐ１２（１２日齢）は、網膜血管閉塞期間に対応し、Ｐ１２―Ｐ１７（１７日齢）は、低酸素症―異常な血管増殖期間に対応し、Ｐ１７―Ｐ２１（２１日齢）は、異常な増殖血管回復期間に対応する。異常な血管新生の観察店としてＰ１７を選択し、Ｐ１２の場合、ＯＩＲモデル群のマウスの硝子体に異なる濃度の１ｕＬの抗体薬物ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）を注射し（１．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）、対照抗体アイリーアの濃度は、４０ｍｇ／ｍＬであり、その後、マウスを正常な空気に移して、Ｐ１７まで飼育する。
（２）ＦＩＴＣ―ＩＢ４網膜血管内皮細胞を網膜プレーティングのために染色し、ＯＩＲモデルにおいてＰ１７の場合の異常な血管新生クラスターおよび網膜非灌流領域を観察する：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを犠牲にした後、マウスの眼球を直ちに取り出し、４％のパラホルムアルデヒドで１～２時間固定し、手術顕微鏡下で、角膜輪部に沿って球面を切断し、水晶体と硝子体とを除去し、網膜神経線維層および色素上皮を分離し、鞏膜、脈絡膜、網膜色素上皮層を除去し、網膜神経線維層をＰＢＳですすぎ、残留硝子体を除去し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．３％ＴＸ―１００を含むＰＢＳで１～２時間ブロックし、ＦＩＴＣ―ＩＢ４溶液（１：５０希釈）に４℃下で４８時間加え、取り出した後ＰＢＳで１５分間×３回すすぎ、網膜神経線維層をスライドガラス上にプレーティングし、視神経乳頭を中心として放射状で切開し、封入剤を封入し、蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡下で観察および写真撮影しかつ統計する。
結果は、図１１および図１２に示されるように、図１１において、ＯＩＲ陰性対照群と比較して、薬物ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）の三つの濃度（１．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）は、網膜非灌流領域の面積を減少させることができ、統計学的意味を有し（ｐ＜０．０５）、陽性対照薬のアフリベルセプトアイリーア（４０ｍｇ／ｍＬ）も、網膜非灌流領域の面積を減少させることができる。薬物ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）の三つの濃度（１．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）の網膜非灌流領域の面積は、すべてアイリーアの網膜非灌流領域の面積よりも小さいが、統計学的差異はなく、図１２において、ＯＩＲ対照と比較して、薬物ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）の三つの濃度（１．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）およびアイリーアは、すべて血管新生クラスターを減少させることができ、すべて統計学的意味を有し、アイリーアと比較して、薬物ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）の三つの濃度（１．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）の網膜血管新生クラスターのパーセンテージは、すべて小さく、統計学的差異を有し、薬物ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）の濃度の増加とともに、Ｐ１７の場合に網膜血管新生クラスターのパーセンテージは、減少する（０．５ｖｓ．１、ｐ＝０．００２７、０．５ｖｓ．１．５、ｐ＝０．０１７７、１ｖｓ．１．５、ｐ＝０．２４１７）。
実施例１１：候補抗体の安定性研究
１ｍｇ／ｍＬの濃度の候補抗体ｈｕ ｂｉ―Ｎｂ２４（Ｙ）を、それぞれ－２０℃（凍結融解を繰り返す）、４℃、２５℃、４０℃の条件下で１０ｍＭのＰＢ溶液に入れ、異なる時点でサンプルを採取してＳＥＣ―ＨＰＬＣ検出する。Ａｄｃａｎｃｅ Ｂｉｏ ＳＥＣ １３０Ａ ２．７ｕｍ ７．８＊３００ｍｍカラム（ｃｏｌｕｍｎ）を使用し、検出波長は、２８０ｎｍであり、室温下でタッセルは、０．５ｍＬ／ｍｉｎであり、２００ｍＭのｐＨ７．０ＰＢ溶液を移動相として３０分間イソクラティック溶離する。
検出結果は、図１３に示されるように、４℃下で１ケ月間（図１３Ａ）、２５℃下で１ケ月間（図１３Ｂ）、４０℃下で１５日間（図１３Ｃ）、－２０℃下で５回の凍結融解を繰り返した（図１３Ｄ）条件下で、候補抗体の純度に明らかな変化はなく、当該抗体は、非製剤条件下でより良好な安定性を示すことを示す。
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

Claims (16)

  1. 抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、
    前記ＶＨＨ鎖の相補性決定領域ＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されるＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３に示されるＣＤＲ３を含むことを特徴とする、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）。
  2. 抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖であって、
    前記ＶＨＨ鎖は、フレームワーク領域ＦＲおよび請求項１に記載の相補性決定領域ＣＤＲを含み、好ましくは、前記フレームワーク領域ＦＲは、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７に示されるＦＲ４、または
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．： １２に示されるＦＲ３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１３に示されるＦＲ４を含むことを特徴とする、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖。
  3. 抗ＶＥＧＦ抗体であって、
    前記抗ＶＥＧＦ抗体は、請求項２に記載のＶＨＨ鎖を有することを特徴とする、前記抗ＶＥＧＦ抗体。
  4. 前記抗ＶＥＧＦ抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１４に示されるようなアミノ酸配列を有する一つまたは複数のＶＨＨ鎖を含むことを特徴とする、
    請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。
  5. 前記抗ＶＥＧＦ抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１６に示されたようであることを特徴とする、
    請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体。
  6. ポリヌクレオチドであって、
    前記ポリヌクレオチドは、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖のＣＤＲ領域、請求項２に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体からなる群から選択されるタンパク質をコードすることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
  7. 発現ベクターであって、
    前記発現ベクターは、請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記発現ベクター。
  8. 宿主細胞であって、
    前記宿主細胞は、請求項７に記載の発現ベクターを含むか、またはそのゲノムには請求項６に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、前記宿主細胞。
  9. 抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を生成する方法であって、
    （ａ）単一ドメイン抗体の生成に適した条件下で、請求項８に記載の宿主細胞を培養することにより、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を含む培養物を得る段階と、
    （ｂ）前記培養物から前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を単離または回収する段階と、および
    （ｃ）任意選択で、精製および／または修飾して段階（ｂ）のＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を得る段階とを含むことを特徴とする、前記抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を生成する方法。
  10. 免疫コンジュゲートであって、
    当該免疫コンジュゲートは、
    （ａ）請求項２に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体と、および
    （ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、磁性ナノ粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分とを含むことを特徴とする、前記免疫コンジュゲート。
  11. 請求項２に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体の用途であって、
    （ａ）血管新生を阻害するための薬物と、
    （ｂ）ＶＥＧＦに関連する疾患または病症を治療するための薬物の調製に使用されることを特徴とする、前記用途。
  12. 医薬組成物であって、
    前記医薬組成物は、
    （ａ）請求項１に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体ＶＨＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、請求項２に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体のＶＨＨ鎖、または請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体、または請求項１０に記載の免疫コンジュゲートと、および
    （ｂ）薬学的に許容されるベクターとを含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
  13. 抗体であって、
    前記抗体は、請求項２に記載の抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体の一つまたは複数のＶＨＨ鎖を含むことを特徴とする、前記抗体。
  14. 組換えタンパク質であって、
    前記組換えタンパク質は、
    （ｉ）請求項２に記載のＶＨＨ鎖または請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ抗体と、および
    （ｉｉ）発現および／または精製に協力する任意選択のタグ配列とを有することを特徴とする、前記組換えタンパク質。
  15. サンプル中のＶＥＧＦＡタンパク質を検出する方法であって、
    前記方法は、
    （１）サンプルを、請求項２に記載のＶＨＨ鎖、請求項３に記載の抗体または請求項１０に記載の免疫コンジュゲートと接触させる段階と、
    （２）抗原―抗体複合体が形成されるかどうかを検出する段階とを含み、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＶＥＧＦＡタンパク質が存在することを示すことを特徴とする、前記サンプル中のＶＥＧＦＡタンパク質を検出する方法。
  16. ＶＥＧＦＡタンパク質検出試薬であって、
    前記検出試薬は、
    （ｉ）請求項２に記載のＶＨＨ鎖、請求項３に記載の抗体、または請求項１０に記載の免疫コンジュゲートと、および
    （ｉｉ）検出学的に許容されるベクターとを含むことを特徴とする、前記ＶＥＧＦＡタンパク質検出試薬。
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