JP2022546402A - Compositions and methods for treating viral infections - Google Patents

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Abstract

本開示は、ウイルスポリメラーゼの存在下でのみ転写され得る形でケモカイン、サイトカイン、またはアポトーシス誘導タンパク質（例えば、カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９））、または他の毒素をコードする組換え核酸コンストラクトまたは複製不全ウイルス様粒子を利用する方法及び組成物を提供する。これらの方法は、多くのウイルス感染症を標的化し、かつウイルス量を減少させるか、または除去するために適合させることができ、ウイルス感染症のための基本的に異なる処置を提供する。【選択図】図１ＡThe present disclosure provides recombinant nucleic acid constructs encoding chemokines, cytokines, or apoptosis-inducing proteins (e.g., caspase 9 (Casp9)), or other toxins in a form that can only be transcribed in the presence of a viral polymerase or replication-deficient virus-like construct. Methods and compositions utilizing particles are provided. These methods target many viral infections and can be adapted to reduce or eliminate viral load, providing fundamentally different treatments for viral infections. [Selection drawing] Fig. 1A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２９日出願の米国特許仮出願第６２／８９３，４６０号；２０２０年１月３１日出願の米国特許仮出願第６２／９６８，３８７号；２０２０年２月１４日出願の米国特許仮出願第６２／９７６，４９１号；及び２０２０年３月５日出願の米国特許仮出願第６２／９８５，５９７号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、それらの全体で参照により本明細書に援用される。 CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS This application is the subject of U.S. Provisional Application No. 62/893,460 filed Aug. 29, 2019; No. 62/976,491, filed February 14, 2020; and U.S. Provisional Application No. 62/985,597, filed March 5, 2020, each of which: incorporated herein by reference in their entireties.

本開示は、ウイルスポリメラーゼの存在下でのみ転写される形でケモカイン、サイトカイン、またはアポトーシス誘導タンパク質（例えば、カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９））をコードする組換え核酸コンストラクトまたは複製不全ウイルス様粒子を利用する方法及び組成物を提供する。これらの方法は、多くのウイルス感染症を標的化し、かつウイルス量を減少させるか、または除去するために適合させることができ、ウイルス感染症のための基本的に異なる処置を提供する。 The present disclosure provides methods that utilize recombinant nucleic acid constructs or replication-deficient virus-like particles that encode chemokines, cytokines, or apoptosis-inducing proteins (e.g., caspase 9 (Casp9)) in a form that is transcribed only in the presence of a viral polymerase. and compositions are provided. These methods target many viral infections and can be adapted to reduce or eliminate viral load, providing fundamentally different treatments for viral infections.

ウイルス感染症は、世界規模の公衆衛生上の困難な課題である。いくつかのウイルス感染症の処置については多少進歩しているが、これらの処置の多くは効果がないか、または世界のほとんどで費用が掛かり過ぎる。例えば、処置が困難な慢性ウイルス感染症のモデルとみなされるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症は依然として、大変な公衆衛生上の問題である。ＨＢＶワクチン接種の導入以来、垂直母子伝染及び水平伝染を含む伝染のリスクは劇的に低下している。しかしながら、全世界で２億４８００万人がいまだにＨＢＶに慢性感染していると推定される。これは、風土性の領域及び国々に高い社会経済的負担を課している。慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）の臨床成果は、Ｂ型肝炎の自発的消散から肝不全、硬変、及び肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生を含む重篤で有害な結果に及ぶ範囲まで、大きく変化する。宿主抗ウイルス免疫により媒介される持続性または再発性肝壊死性炎症が疾患進行の主な原因であり、最終的には進行線維症及び肝臓の発癌現象をもたらす。ＣＨＢの重篤で不利な結果の生涯リスクは、１５％～４０％と高い。不利な臨床成果の発生を防ぐためには、リスクを有する人を早期診断し、適時に抗ウイルス処置することが必要とされる。 Viral infections are a daunting global public health challenge. Although some progress has been made in treating some viral infections, many of these treatments are either ineffective or too expensive in most of the world. For example, hepatitis B virus (HBV) infection, considered a model for chronic viral infections that are difficult to treat, remains a significant public health problem. Since the introduction of HBV vaccination, the risk of transmission, including vertical mother-to-child transmission and horizontal transmission, has decreased dramatically. However, it is estimated that 248 million people worldwide are still chronically infected with HBV. This imposes a high socio-economic burden on endemic regions and countries. The clinical outcome of chronic hepatitis B (CHB) varies greatly, ranging from spontaneous resolution of hepatitis B to severe adverse outcomes including liver failure, cirrhosis, and development of hepatocellular carcinoma (HCC). do. Persistent or recurrent hepatic necroinflammation mediated by host antiviral immunity is a major cause of disease progression, ultimately leading to progressive fibrosis and hepatic carcinogenesis. The lifetime risk of serious adverse consequences of CHB is as high as 15% to 40%. Early diagnosis and timely antiviral treatment of at-risk individuals are required to prevent the occurrence of adverse clinical outcomes.

したがって、ＨＢＶなどのウイルス感染症を処置するために、新たな、より有効で、より広く利用可能な処置が必要とされている。有効なウイルス処置の開発における困難な側面の１つは、宿主細胞のライフサイクルと緊密に結びついているウイルスの複雑なライフサイクルである。例えば、感染肝細胞におけるＨＢＶの存続は、ウイルスＲＮＡの転写のためのテンプレートである共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の存在による。ヌクレオシド類似体を用いる抗ウイルス治療は、感染細胞の細胞質に存在するカプシド内のＨＢＶ ＤＮＡの複製を阻害するが、核ｃｃｃＤＮＡを減少させる、または破壊することはない。多少の進歩にも関わらず、抗ウイルス薬は現在、わずかなウイルス性疾患に対してのみ有効である。 Therefore, new, more effective and more widely available treatments are needed to treat viral infections such as HBV. One of the challenging aspects in developing effective viral treatments is the complex life cycle of the virus, which is tightly coupled with the life cycle of the host cell. For example, HBV persistence in infected hepatocytes is due to the presence of covalently closed circular DNA (cccDNA), which is the template for transcription of viral RNA. Antiviral therapy with nucleoside analogues inhibits replication of HBV DNA within the capsid present in the cytoplasm of infected cells, but does not reduce or destroy nuclear cccDNA. Despite some progress, antiviral drugs are currently effective against only a few viral diseases.

したがって、ウイルス感染症を処置するための展望を変化させるためには、基本的に異なる処置アプローチが必要とされている。 Therefore, fundamentally different treatment approaches are needed to change the landscape for treating viral infections.

第１及び第２のウイルス転写認識シグナルにより挟まれている、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子を含み、さらに、第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーターと、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接している５’側の第２のプロモーターとを含む、組換え核酸配列を本明細書では提供する。 a negative-strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or combination thereof, flanked by first and second viral transcriptional recognition signals; a first promoter upstream (5') of the signal and a second 5' flanking negative-strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof; Provided herein are recombinant nucleic acid sequences, including promoters.

ある特定の実施形態では、ネガティブストランド核酸分子は、ネガティブセンスＲＮＡ、ネガティブセンスＤＮＡ、ノンコーディングネガティブセンスＲＮＡを発現する一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはｐｇＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せである。 In certain embodiments, the negative-strand nucleic acid molecule is negative-sense RNA, negative-sense DNA, single- or double-stranded DNA that expresses non-coding negative-sense RNA, or pgRNA, or any combination thereof.

追加の実施形態では、ウイルス転写認識シグナルは、ネガティブストランドウイルス、ＲＮＡ逆転写ウイルス、またはＤＮＡ逆転写ウイルスから選択されるウイルスから選択される。 In additional embodiments, the viral transcription recognition signal is selected from viruses selected from negative strand viruses, RNA reverse transcription viruses, or DNA reverse transcription viruses.

追加の実施形態では、組換え核酸は、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子の下流（３’側）にポリＡテールをさらに含む。 In additional embodiments, the recombinant nucleic acid further comprises a poly A tail downstream (3') of the negative-strand or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or combination thereof.

追加の実施形態では、アポトーシス誘導タンパク質は、ＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、シトクロムＣ、ＳＭＡＣ、及びアポトーシス誘導因子、またはそれらの組合せからなる群から選択される。 In additional embodiments, the apoptosis-inducing protein is BAX, BID, BAK, BAD, caspase-2, caspase-8, caspase-9, caspase-10, caspase-11, caspase-12, cytochrome C, SMAC, and apoptosis inducers, or selected from the group consisting of combinations;

さらに追加の実施形態では、第１のプロモーターは、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、アルブミンプロモーター及び／または増強要素、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）プロモーター、ＡＡＴ（アルファ－１－アンチトリプシン）プロモーター、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）プロモーターまたはＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）プロモーターからなる群から選択される強力なユビキタスプロモーターまたは肝臓組織特異的プロモーターを含む。 In yet additional embodiments, the first promoter is TBG (thyroxine binding globulin), albumin promoter and/or enhancing element, AFP (alpha-fetoprotein) promoter, AAT (alpha-1-antitrypsin) promoter, ApoE (apolipoprotein A strong ubiquitous or liver tissue-specific promoter selected from the group consisting of the protein E) promoter or the PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) promoter.

さらに追加の実施形態では、第２のプロモーターは、伸長因子１アルファ結合配列（ＥＦＳ）を含む。 In yet additional embodiments, the second promoter comprises an elongation factor 1 alpha binding sequence (EFS).

追加の実施形態では、ケモカインは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、及びＣＸ３ＣＬ１から選択される。 In additional embodiments, the chemokine is CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21 , CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL3CL, and XCL2.

さらなる実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０Ｌ、Ｍｉｇ、及びＣｒｇ－２からなる群から選択される。 In further embodiments, the cytokine is IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, CD40L, Mig, and Crg-2.

追加の実施形態では、ウイルス転写認識シグナルは、イプシロン認識シグナル（配列番号１）を含む。 In additional embodiments, the viral transcriptional recognition signal comprises an epsilon recognition signal (SEQ ID NO: 1).

追加の実施形態では、ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、水疱性口内炎インドウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ハンタンウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、砂バエ熱シチリアウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＣ、トゴトウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、ウシ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒトスプーマウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、及びそれらの組合せである。 In additional embodiments, the virus is hepatitis B virus, hepatitis D virus, Ebola virus, Marburg virus, human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, human respiratory rash virus, bullous virus. Stomatitis India virus, rabies virus, bovine epidemic fever virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Bunyamwella virus, Hantan virus, Nairobi sheep disease virus, sand fly Sicilian virus, influenza virus A, influenza virus C, Togoto Viruses, murine mammary tumor virus, murine leukemia virus, avian leukemia virus, Mason-Pfizer simian virus, bovine leukemia virus, human immunodeficiency virus 1, human spuma virus, duck hepatitis B virus, and combinations thereof.

追加の実施形態では、核酸分子は、ウイルスポリメラーゼ、逆転写酵素、カプシド、エンベロープ、パッケージングシグナル、または転座モチーフのための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。 In additional embodiments, the nucleic acid molecule does not include sequences (coding or non-coding) for viral polymerase, reverse transcriptase, capsid, envelope, packaging signals, or translocation motifs.

本明細書に記載の組換え核酸配列のいずれかを含むベクターを本明細書では提供する。 Provided herein are vectors containing any of the recombinant nucleic acid sequences described herein.

追加の実施形態では、ベクターは、哺乳類細胞に送達するための送達ベクターまたはビヒクルを含む。 In additional embodiments, the vector comprises a delivery vector or vehicle for delivery to mammalian cells.

追加の実施形態では、ベクターまたはビヒクルは、ＶＬＰ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、リポソーム、ナノ粒子、ミセル、ポリマーベシクル、またはポリマーソームを含む。 In additional embodiments, the vector or vehicle comprises a VLP, adeno-associated virus (AAV), liposomes, nanoparticles, micelles, polymeric vesicles, or polymersomes.

本明細書に記載の組換え核酸配列のいずれかまたは本明細書に記載のベクターのいずれかを含む医薬組成物を本明細書では提供する。 Provided herein are pharmaceutical compositions comprising any of the recombinant nucleic acid sequences described herein or any of the vectors described herein.

複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
Ｂ型肝炎ウイルスカプシドまたはＤ型肝炎ウイルスカプシドからのカプシドタンパク質に融合している任意選択の転座モチーフ（ＴＬＭ）；及び
第１及び第２のウイルス転写認識シグナルにより挟まれている、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子
を含み、
さらに、第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーターと、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接する５’側の第２のプロモーターと
を含む、前記複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を本明細書では提供する。 A replication-deficient virus-like particle (VLP),
an optional translocation motif (TLM) fused to the capsid protein from the hepatitis B virus capsid or the hepatitis D virus capsid; and a chemokine, cytokine flanked by first and second viral transcriptional recognition signals. , a negative-strand nucleic acid molecule or a pgRNA nucleic acid molecule encoding an apoptosis-inducing protein, or a combination thereof;
In addition, a first promoter upstream (5') of the first viral transcriptional recognition signal and a negative-strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof. Provided herein are said replication-deficient virus-like particles (VLPs) comprising a second promoter on the ' side.

複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
第１及び第２の標的ウイルス転写認識シグナルにより挟まれている、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子
を含み、
さらに、
第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーターと、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接する５’側の第２のプロモーターと
を含み、その際、ＶＬＰが、標的ウイルス感染細胞について指向性を示す、前記複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をさらに本明細書では提供する。 A replication-deficient virus-like particle (VLP),
a negative-strand or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or combination thereof flanked by first and second target viral transcriptional recognition signals;
moreover,
a first promoter upstream (5') of a first viral transcriptional recognition signal and 5' flanked by a negative-strand or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof and a second promoter of, wherein the VLP exhibits tropism for a target virus-infected cell.

追加の実施形態では、ネガティブストランド核酸分子は、ネガティブセンスＲＮＡ、ネガティブセンスＤＮＡ、ノンコーディングネガティブセンスＲＮＡを発現する一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはｐｇＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せである。 In additional embodiments, the negative-strand nucleic acid molecule is negative-sense RNA, negative-sense DNA, single- or double-stranded DNA that expresses non-coding negative-sense RNA, or pgRNA, or any combination thereof.

追加の実施形態では、複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子の下流（３’側）にポリＡテールをさらに含む。 In additional embodiments, the replication-deficient virus-like particle (VLP) has a polyA tail downstream (3') of a negative-strand or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof. further includes

追加の実施形態では、第１のプロモーターは、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、アルブミンプロモーター及び／または増強要素、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）プロモーター、ＡＡＴ（アルファ－１－アンチトリプシン）プロモーター、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）プロモーターまたはＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）プロモーターからなる群から選択される強力なユビキタスプロモーターまたは肝臓組織特異的プロモーターを含む。 In additional embodiments, the first promoter is TBG (thyroxine binding globulin), albumin promoter and/or enhancing element, AFP (alpha-fetoprotein) promoter, AAT (alpha-1-antitrypsin) promoter, ApoE (apolipoprotein E) a strong ubiquitous or liver tissue-specific promoter selected from the group consisting of promoters or PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) promoters.

追加の実施形態では、第２のプロモーターは、伸長因子１アルファ結合配列（ＥＦＳ）を含む。 In additional embodiments, the second promoter comprises an elongation factor 1 alpha binding sequence (EFS).

追加の実施形態では、ウイルス転写認識シグナルは、ネガティブストランドウイルス、ＲＮＡ逆転写ウイルス、またはＤＮＡ逆転写ウイルスから選択されるウイルスから選択される。 In additional embodiments, the viral transcription recognition signal is selected from viruses selected from negative strand viruses, RNA reverse transcription viruses, or DNA reverse transcription viruses.

追加の実施形態では、ウイルス転写認識シグナルは、イプシロン認識シグナル（配列番号１）を含む。 In additional embodiments, the viral transcriptional recognition signal comprises an epsilon recognition signal (SEQ ID NO: 1).

追加の実施形態では、アポトーシス誘導タンパク質は、ＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、シトクロムＣ、ＳＭＡＣ、及びアポトーシス誘導因子、またはそれらの組合せからなる群から選択される。 In additional embodiments, the apoptosis-inducing protein is BAX, BID, BAK, BAD, caspase-2, caspase-8, caspase-9, caspase-10, caspase-11, caspase-12, cytochrome C, SMAC, and apoptosis inducers, or selected from the group consisting of combinations;

追加の実施形態では、ケモカインは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、及びＣＸ３ＣＬ１から選択される。 In additional embodiments, the chemokine is CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21 , CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL3CL, and XCL2.

追加の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０Ｌ、Ｍｉｇ、及びＣｒｇ－２からなる群から選択される。 In additional embodiments, the cytokine is IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, CD40L , Mig, and Crg-2.

追加の実施形態では、ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、水疱性口内炎インドウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ハンタンウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、砂バエ熱シチリアウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＣ、トゴトウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、ウシ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒトスプーマウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、及びそれらの組合せである。 In additional embodiments, the virus is hepatitis B virus, hepatitis D virus, Ebola virus, Marburg virus, human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, human respiratory rash virus, bullous virus. Stomatitis India virus, rabies virus, bovine epidemic fever virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Bunyamwella virus, Hantan virus, Nairobi sheep disease virus, sand fly Sicilian virus, influenza virus A, influenza virus C, Togoto Viruses, murine mammary tumor virus, murine leukemia virus, avian leukemia virus, Mason-Pfizer simian virus, bovine leukemia virus, human immunodeficiency virus 1, human spuma virus, duck hepatitis B virus, and combinations thereof.

追加の実施形態では、核酸分子は、ウイルスカプシド、ポリメラーゼ、逆転写酵素、エンベロープ、パッケージングシグナル、または転座モチーフのための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。 In additional embodiments, the nucleic acid molecule does not include sequences (coding or non-coding) for viral capsid, polymerase, reverse transcriptase, envelope, packaging signals, or translocation motifs.

本明細書に記載の不全ウイルス様粒子のいずれかを含む医薬組成物をさらに提供する。 Further provided are pharmaceutical compositions comprising any of the defective virus-like particles described herein.

対象に、本明細書に記載の組換え核酸分子、または本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の複製不全ウイルス様粒子を投与することを含む、それを必要とする対象においてウイルス感染症を処置する方法をさらに提供する。 administering to a subject a recombinant nucleic acid molecule as described herein, or a vector as described herein, or a pharmaceutical composition as described herein, or a replication-defective virus-like particle as described herein Further provided are methods of treating a viral infection in a subject in need thereof, comprising:

追加の実施形態では、ウイルス感染症は、ボルチモア分類ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩに分類されるウイルスからの感染症を含む。 In additional embodiments, the viral infection comprises an infection from a virus classified as Baltimore Classification IV, V, VI, or VII.

追加の実施形態では、ウイルス感染症は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、水疱性口内炎インドウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ハンタンウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、砂バエ熱シチリアウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＣ、トゴトウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、ウシ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒトスプーマウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、及びそれらの組合せからなる群から選択されるウイルスからの感染症を含む。 In additional embodiments, the viral infection is hepatitis B virus, hepatitis D virus, Ebola virus, Marburg virus, human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, human respiratory rash virus, vesicular stomatitis Indian virus, rabies virus, bovine epidemic fever virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Bunyamwella virus, Hantan virus, Nairobi sheep disease virus, sand fly Sicilian virus, influenza virus A, influenza virus C, from the group consisting of Thogoto virus, mouse mammary tumor virus, mouse leukemia virus, avian leukemia virus, Mason-Pfizer simian virus, bovine leukemia virus, human immunodeficiency virus 1, human spuma virus, duck hepatitis B virus, and combinations thereof Including infections from selected viruses.

追加の実施形態では、ウイルス感染症は、インフルエンザＡ、Ｂ、Ｃ、及び／または任意のコロナウイルス、及び／またはボルチモア分類第ＩＶ群からの任意のウイルスからなる群から選択されるウイルスからの感染症を含む。 In additional embodiments, the viral infection is an infection from a virus selected from the group consisting of influenza A, B, C, and/or any coronavirus, and/or any virus from Baltimore Classification Group IV including disease.

追加の実施形態では、ウイルス感染症は、フィロウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、オルトヘパドナウイルス、アビヘパドナウイルス、哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス、鳥類Ｃ型レトロウイルス、Ｄ型レトロウイルス、ＢＬＶ－ＨＴＬＶレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、及びそれらの組合せからなる群から選択されるウイルスからの感染症を含む。 In additional embodiments, the viral infection is filovirus, paramyxovirus, morbillivirus, rubulavirus, pneumovirus, vecyclovirus, lyssavirus, ephemerovirus, arenavirus, bunyavirus, hantavirus, nairovirus, phlebovirus. viruses, orthohepadnaviruses, abihepadnaviruses, mammalian retroviruses B, mammalian retroviruses C, avian retroviruses C, avian retroviruses D, BLV-HTLV retroviruses, lentiviruses, spumaviruses, and their Including infections from viruses selected from the group consisting of combinations.

一部の実施形態では、ウイルス感染症は、ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳ、またはＭＥＲＳと称されるウイルスなどのコロナウイルスからの感染症を含む。 In some embodiments, viral infections include infections from coronaviruses, such as the viruses designated COVID-19, SARS, or MERS.

追加の実施形態では、核酸分子、ベクター、医薬組成物、または複製不全ウイルス様粒子は投与されると、肝臓細胞に侵入する。 In additional embodiments, the nucleic acid molecule, vector, pharmaceutical composition, or replication-deficient virus-like particle enters liver cells upon administration.

追加の実施形態では、核酸分子、ベクター、医薬組成物、または複製不全ウイルス様粒子は投与されると、核酸分子を肝臓細胞に送達し、その核酸分子は肝臓細胞中で発現される。 In additional embodiments, the nucleic acid molecule, vector, pharmaceutical composition, or replication-deficient virus-like particle upon administration delivers the nucleic acid molecule to liver cells, where the nucleic acid molecule is expressed.

追加の実施形態では、対象は、急性、慢性、または潜伏ウイルス感染症を有する。 In additional embodiments, the subject has an acute, chronic, or latent viral infection.

追加の実施形態では、投与は、ウイルス感染症を引き起こしているウイルスに感染している細胞に対する免疫応答を誘導する。 In additional embodiments, administration induces an immune response against cells infected with the virus causing the viral infection.

追加の実施形態では、投与は、ウイルス感染症を引き起こしているウイルスに感染している細胞においてアポトーシスを誘導する。 In additional embodiments, administration induces apoptosis in cells infected with a virus causing viral infection.

対象を本明細書に記載の組換え核酸分子、または本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の複製不全ウイルス様粒子のいずれかと接触させることを含む、それを必要とする対象において、ウイルスに感染している細胞に対する免疫応答を誘導する方法をさらに提供する。 A subject is contacted with either a recombinant nucleic acid molecule as described herein, or a vector as described herein, or a pharmaceutical composition as described herein, or a replication-defective virus-like particle as described herein. Further provided is a method of inducing an immune response against cells infected with a virus in a subject in need thereof, comprising:

対象を本明細書に記載の組換え核酸分子、または本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の複製不全ウイルス様粒子のいずれかと接触させることを含む、それを必要とする対象において、ウイルスに感染している細胞に対するアポトーシス応答を誘導する方法をさらに提供する。 A subject is contacted with either a recombinant nucleic acid molecule as described herein, or a vector as described herein, or a pharmaceutical composition as described herein, or a replication-defective virus-like particle as described herein. Further provided are methods of inducing an apoptotic response to cells infected with the virus in a subject in need thereof, comprising:

追加の実施形態では、ウイルスは、ＨＢＶ、ＨＤＶ、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、またはそれらの任意の組合せである。 In additional embodiments, the virus is HBV, HDV, hepatitis A virus (HAV), hepatitis C virus (HCV), or any combination thereof.

対象に、本明細書に記載の組換え核酸分子、または本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の医薬組成物、または本明細書に記載の複製不全ウイルス様粒子を投与することを含む、対象においてＢ型肝炎を処置する方法をさらに提供する。 administering to a subject a recombinant nucleic acid molecule as described herein, or a vector as described herein, or a pharmaceutical composition as described herein, or a replication-defective virus-like particle as described herein Further provided are methods of treating hepatitis B in a subject, comprising:

追加の実施形態では、前記方法は、少なくとも１種の抗ウイルス薬、ＨＢＶポリメラーゼ阻害薬、インターフェロン、ＴＬＲ－７アゴニストまたはＴＬＲ－９アゴニストなどのＴＬＲ調節薬、治療用ワクチン、ある特定の細胞ウイルスＲＮＡセンサーの免疫活性化因子、ウイルス侵入阻害薬、ウイルス成熟阻害薬、別個のカプシドアセンブリ調節薬、別個または未知の機構の抗ウイルス化合物、及びそれらの任意の組合せを投与することをさらに含む。 In additional embodiments, the method comprises at least one antiviral agent, an HBV polymerase inhibitor, an interferon, a TLR modulator such as a TLR-7 agonist or a TLR-9 agonist, a therapeutic vaccine, certain cellular viral RNA Further comprising administering a sensor immune activator, a viral entry inhibitor, a viral maturation inhibitor, a distinct capsid assembly modulator, an antiviral compound of distinct or unknown mechanism, and any combination thereof.

追加の実施形態では、前記方法は、少なくとも１種の抗ウイルス薬３ＴＣ、ＦＴＣ、Ｌ－ＦＭＡＵ、インターフェロン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン（Ｌ－ｄＴ）、バルトルシタビン（３’－バリニルＬ－ｄＣ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－グアニン（ＤＸＧ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－２，６－ジアミノプリン（ＤＡＰＤ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－６－クロロプリン（ＡＣＰ）、ファムシクロビル、ペンシクロビル、ロブカビル、ガンシクロビル、リバビリン、及びそれらの任意の組合せを投与することをさらに含む。 In additional embodiments, the method comprises at least one antiviral agent 3TC, FTC, L-FMAU, interferon, adefovir dipivoxil, entecavir, telbivudine (L-dT), bartolcitabine (3'-valinyl L-dC) ,beta. - D-dioxolanyl-guanine (DXG), beta. - D-dioxolanyl-2,6-diaminopurine (DAPD), beta. -D-dioxolanyl-6-chloropurine (ACP), famciclovir, penciclovir, lobucavir, ganciclovir, ribavirin, and any combination thereof.

追加の実施形態では、維持処置として、または安定しているか、もしくは検出不可能な疾患を達成するために患者が必要とする限り毎週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、１か月に１回、２か月ごとに１回、３か月ごとに１回、４か月ごとに１回、５か月ごとに１回、６か月ごとに１回、または７か月ごとに１回、または８か月ごとに１回、または９か月ごとに１回、または１０か月ごとに１回、または１１か月ごとに１回、または１年に１回を含めて定期的に処置を投与する。 In additional embodiments, once weekly, once every two weeks, once every three weeks as maintenance treatment or as long as the patient needs to achieve stable or undetectable disease , once every month, once every two months, once every three months, once every four months, once every five months, once every six months, or seven Once every month, or Once every 8 months, or Once every 9 months, Or Once every 10 months, Or Once every 11 months, Or Once a year Administer treatment on a regular basis.

Ａ及びＢは、ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ２コンストラクト（６００５ｂｐ）の特徴を示すプラスミドマップ及び組換えコンストラクト図を含む。A and B include a plasmid map and recombination construct diagram characterizing the AAV8-HBV-DRS2 construct (6005 bp). 実験１での非限定的プラスミドマップを示している。A non-limiting plasmid map for Experiment 1 is shown. 実験１でのＨｅｐＧ２（野生型）及びＨｅｐＡＤ３８細胞における試験及び対照コンストラクトの生細胞データを示すグラフを示している。2 shows graphs showing live cell data for test and control constructs in HepG2 (wild-type) and HepAD38 cells in Experiment 1. FIG. 実験１での数値データを示している。Numerical data in Experiment 1 are shown. 図２Ｃ－１の続き。Continuation of Figure 2C-1. Ａ及びＢは、実験２での非限定的プラスミドマップ及びカスパーゼ－９阻害薬の化学構造式ならびにＨｅｐＧ２（野生型）細胞における試験及び対照コンストラクトの生細胞データを示すグラフを示している。A and B show non-limiting plasmid maps and chemical formulas of caspase-9 inhibitors in experiment 2 and graphs showing live cell data of test and control constructs in HepG2 (wild-type) cells. 実験２での非限定的プラスミドマップ及びカスパーゼ－９阻害薬の化学構造式を示している。Non-limiting plasmid maps and chemical structures of caspase-9 inhibitors in Experiment 2 are shown. 実験２でのＨｅｐＡＤ３８細胞（ＨＢＶモデル細胞）における試験及び対照コンストラクトの生細胞データを示すグラフを示している。10 shows graphs showing live cell data for test and control constructs in HepAD38 cells (HBV model cells) in Experiment 2. FIG. 実験２での数値データを示している。Numerical data in Experiment 2 are shown. 図４Ｃ－１の続き。Continuation of Figure 4C-1. 実験２でのプラスミドマップ（Ａ）ならびにＨｅｐＧ２対ＨｅｐＡＤ３８細胞における試験及び対照コンストラクトでの結果を示す比較グラフ（Ｂ）を示している。Plasmid maps for Experiment 2 (A) and comparative graphs showing results for test and control constructs in HepG2 vs. HepAD38 cells (B) are shown. 実験３での試験コンストラクトＡＡＶ－ＨＢＶ－ＤＲＳ２（ＴＢＧ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）のプラスミドマップ及びカスパーゼ－９阻害薬の化学構造式を示している。FIG. 2 shows the plasmid map of test construct AAV-HBV-DRS2 (TBG>HBV-rcCasp9) in experiment 3 and the chemical structures of caspase-9 inhibitors. 実験３でのＨｅｐＧ２対ＨｅｐＡＤ３８細胞（ＨＢＶモデル細胞）における試験及び対照コンストラクトの生細胞データを示す比較グラフを示している。FIG. 4 shows comparative graphs showing live cell data for test and control constructs in HepG2 vs. HepAD38 cells (HBV model cells) in Experiment 3. FIG. 実験３での数値データを示している。Numerical data in Experiment 3 are shown. 図６Ｃ－１の続き。Continuation of Figure 6C-1. 図６Ｃ－２の続き。Continuation of Figure 6C-2. ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ１コンストラクト及び配列の特徴を示すプラスミドマップ及びコンストラクト図を示している。Plasmid maps and construct diagrams characterizing the AAV8-HBV-DRS1 constructs and sequences are shown. 図７－１の続き。Continuation of Figure 7-1. 図７－２の続き。Continuation of Figure 7-2. ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ２コンストラクト及び配列の特徴を示すプラスミドマップ及びコンストラクト図を示している。Plasmid maps and construct diagrams characterizing the AAV8-HBV-DRS2 constructs and sequences are shown. 図７－１の続き。Continuation of Figure 7-1. 図７－２の続き。Continuation of Figure 7-2. 標的化組換えコンストラクトの分布、有効性、特異性／機能性、及び安全性を評価するための、モデルマウスを利用するインビボ試験を示す図である。FIG. 1 shows an in vivo study utilizing a mouse model to assess the distribution, efficacy, specificity/functionality and safety of targeted recombinant constructs. 「インフルエンザハイジャック／スーサイドベクター」がどのようにウイルス機構をハイジャックして、感染細胞においてアポトーシスを誘導するかを示す図及びグラフである。Figures 1A and 1B are diagrams and graphs showing how the "influenza hijack/suicide vector" hijacks the viral machinery and induces apoptosis in infected cells. インフルエンザポリメラーゼと連結するようにトランスで送達された試験コンストラクトが、ウイルス機構をハイジャックして、未処置感染細胞よりも４０％急速にインフルエンザ感染細胞の細胞死を誘導することを示すインビトロ結果である。In vitro results showing that test constructs delivered in trans linked to influenza polymerase hijack the viral machinery and induce cell death of influenza infected cells 40% more rapidly than untreated infected cells. . マウスモデルにおいてＨＢＶハイジャックコンストラクトを使用した結果を示すイメージである。FIG. 2 is an image showing the results of using HBV hijacking constructs in a mouse model. マウスモデルにおいてＨＢＶハイジャックコンストラクトを使用した結果を示すグラフである。Graph showing results of using HBV hijacking constructs in a mouse model. マウスモデルにおいてＨＢＶハイジャックコンストラクトを使用した結果を示す図である。FIG. 4 shows results of using HBV hijacking constructs in a mouse model. コロナウイルス「ハイジャック－ＲＮＡ」コンストラクトのための設計の概観を示す図である。FIG. 1 shows an overview of the design for the coronavirus 'hijack-RNA' construct. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ハイジャックＲＮＡの作用機序を示す図を示している。FIG. 2 shows a diagram showing the mechanism of action of SARS-CoV-2 hijack RNA in SARS-CoV-2 infected cells. Ｃｏｖ－２ハイジャックＤＴＡインビトロ転写ベクターの特徴及び配列を示す非限定的プラスミドマップ及びコンストラクト図を示している。Non-limiting plasmid maps and construct diagrams showing the features and sequences of the Cov-2 hijack DTA in vitro transcription vector are shown. 図１４－１の続き。Continuation of Figure 14-1. 図１４－２の続き。Continuation of Figure 14-2. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ハイジャックＲＮＡコンストラクトの特徴及び配列を示す非限定的プラスミドマップ及びコンストラクト図を示している。Non-limiting plasmid maps and construct diagrams showing the features and sequences of the SARS-CoV-2 hijack RNA constructs are shown. 図１５－１の続き。Continuation of Figure 15-1. 図１５－２の続き。Continuation of Figure 15-2. 図１５－３の続き。Continuation of Figure 15-3. 試験または対照コンストラクトでの処置後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染または非感染細胞の生存度を示す比較グラフである。FIG. 4 is a comparative graph showing viability of SARS-CoV-2 infected or uninfected cells after treatment with test or control constructs.

ある特定の実施形態では、ウイルスポリメラーゼの存在下でのみ転写されるケモカイン、サイトカイン、またはアポトーシス誘導タンパク質（例えば、本明細書において提供されるとおりのカスパーゼ９（Ｃａｓｐ９）など）をコードする組換え核酸コンストラクトまたは複製不全ウイルス様粒子を利用する方法及び組成物を提供する。ある特定の実施形態では、コンストラクトは、ウイルス感染細胞の死滅をもたらすＣａｓｐ９をコードする配列を担持する。これらの方法は、多くのウイルス感染症を標的化し、ウイルス量を減少させる、または除去するように適合させることができ、かつウイルス感染症のための基本的に異なる処置を提供する。 In certain embodiments, a recombinant nucleic acid encoding a chemokine, cytokine, or apoptosis-inducing protein (e.g., caspase 9 (Casp9), etc. as provided herein) that is transcribed only in the presence of a viral polymerase Methods and compositions that utilize constructs or replication-deficient virus-like particles are provided. In certain embodiments, the construct carries a sequence encoding Casp9, which causes killing of virus-infected cells. These methods target many viral infections, can be adapted to reduce or eliminate viral load, and provide fundamentally different treatments for viral infections.

ウイルス感染細胞を破壊するためにウイルス機構を利用する
理論に束縛されることは望まないが、本方法及び組成物は、少なくとも一部では、感染細胞の細胞質に典型的に存在するウイルス機構を利用することに基づく。ある特定の実施形態では、組換え核酸コンストラクトまたは複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をウイルス感染細胞に向ける、または注入することであって、コンストラクトまたはＶＬＰは、Ｂ型肝炎イプシロンシグナル結合配列により挟まれているケモカイン、サイトカイン、またはアポトーシス誘導タンパク質、例えば、Ｃａｓｐ９（及びそのプロモーター）をコードする配列を含有する一本鎖ＲＮＡ核酸コンストラクトを含んでいて、Ｂ型肝炎逆転写酵素により認識されたときにのみ転写される、ウイルス感染細胞に向ける、または注入することは、イプシロン配列がセグメントを転写することを保証して、Ｂ型肝炎感染細胞のアポトーシスを誘引するＣａｓｐ９のためのコーディング配列の翻訳をもたらす。これらのコンストラクトは、非ウイルス感染細胞では別段に分解されるであろう「ウイルス特異的スーサイドコンストラクト」として効果的に機能することとなる。 Utilizes Viral Machinery to Destroy Virus-Infected Cells Without wishing to be bound by theory, the methods and compositions utilize, at least in part, viral machinery typically present in the cytoplasm of infected cells. based on doing In certain embodiments, targeting or injecting recombinant nucleic acid constructs or replication-deficient virus-like particles (VLPs) into virus-infected cells, wherein the constructs or VLPs are flanked by Hepatitis B epsilon signal binding sequences. chemokine, cytokine, or apoptosis-inducing protein, such as Casp9 (and its promoter), only when recognized by Hepatitis B reverse transcriptase. Transcribed, directed, or injected into virus-infected cells ensures that the epsilon sequence transcribes the segment, resulting in translation of the coding sequence for Casp9, which triggers apoptosis of hepatitis B-infected cells. These constructs will effectively function as "virus-specific suicide constructs" that would otherwise be degraded in non-virus infected cells.

したがって、ある特定の実施形態では、本組成物及び方法は、Ｂ型肝炎感染細胞を標的化するように設計された組換え核酸コンストラクト及び複製不全ウイルス様粒子を包含する。ＨＢＶは、一本鎖ＲＮＡ中間体により複製する二本鎖ＤＮＡウイルスを包含するボルチモア第ＶＩＩ群からのものである。Ｂ型肝炎ウイルスが例として示される、この小さなウイルス群は、ウイルスｍＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡを生成するためのテンプレートとして役立つ、後で埋められて共有結合閉環を形成する二本鎖ギャップ付ゲノム（ｃｃｃＤＮＡ）を有する。プレゲノムＲＮＡは、ＤＮＡゲノムを生成するためのウイルス逆転写酵素のためのテンプレートとして役立つ。このウイルスポリメラーゼは、本明細書に記載の組換え核酸コンストラクト及び複製不全ウイルス様粒子中のフランキングイプシロン配列を認識して、毒性作用物質の生成をもたらすものである。したがって、ウイルス感染細胞のみが、ケモカイン、サイトカイン、またはアポトーシス誘導タンパク質（例えば、カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９））の産生により死滅することとなる。 Accordingly, in certain embodiments, the compositions and methods include recombinant nucleic acid constructs and replication-defective virus-like particles designed to target hepatitis B-infected cells. HBV is from Baltimore Group VII, which includes double-stranded DNA viruses that replicate by a single-stranded RNA intermediate. This small group of viruses, of which hepatitis B virus is exemplified, is a double-stranded gapped genome (cccDNA) that is later filled in to form a covalently closed circle that serves as a template for generating viral mRNA and subgenomic RNA. have Pregenomic RNA serves as a template for viral reverse transcriptase to generate the DNA genome. This viral polymerase recognizes flanking epsilon sequences in the recombinant nucleic acid constructs and replication-deficient virus-like particles described herein, resulting in the production of toxic agents. Therefore, only virus-infected cells will die through the production of chemokines, cytokines, or apoptosis-inducing proteins such as caspase 9 (Casp9).

一部の実施形態では、ケモカイン、サイトカイン、またはアポトーシス誘導タンパク質は、ウイルス５’ＵＴＲ及びウイルス３’ＵＴＲにより挟まれていて、したがって、核酸は、式Ｘ－Ｙ－Ｚにより表され得て、式中、Ｘはウイルス５’ＵＴＲであり、Ｙは、ケモカイン、サイトカイン、またはアポトーシス誘導タンパク質（例えば、カスパーゼ９または本明細書において提供されるとおりの他のもの、またはジフテリア毒素Ａ断片）などの目的のタンパク質であり、かつＺは、ウイルス３’ＵＴＲである。５’ＵＴＲと、目的のタンパク質との間、または３’ＵＴＲと、目的のタンパク質との間に介在配列が存在してもよい。転写物が細胞により認識されると、これは、目的のタンパク質をコードする５’－３’逆相補体を産生することとなる。これは、ＡＡＶ発現ベクターまたは他の適切なウイルスベクターでも送達することができる。 In some embodiments, the chemokine, cytokine, or apoptosis-inducing protein is flanked by the viral 5′UTR and the viral 3′UTR, thus the nucleic acid can be represented by the formula XYZ, the formula In, X is the viral 5'UTR and Y is a target such as a chemokine, cytokine, or apoptosis-inducing protein (e.g., caspase 9 or others as provided herein, or diphtheria toxin A fragment). and Z is the viral 3'UTR. There may be intervening sequences between the 5'UTR and the protein of interest or between the 3'UTR and the protein of interest. When the transcript is recognized by the cell, it will produce a 5'-3' reverse complement encoding the protein of interest. It can also be delivered in an AAV expression vector or other suitable viral vector.

一部の実施形態では、５’－ＵＴＲは、ＣＯＶＩＤ－１９（またはＣＯＶＤ－１９）、ＳＡＲＳ、またはＭＥＲＳと称されるウイルスなどのコロナウイルスの５’リーディング配列である。一部の実施形態では、５’－ＵＴＲは、

Figure 2022546402000002
の配列、またはその相補体を含む。 In some embodiments, the 5'-UTR is the 5' reading sequence of a coronavirus, such as the viruses designated COVID-19 (or COVD-19), SARS, or MERS. In some embodiments, the 5'-UTR is
Figure 2022546402000002
 or its complement.

一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、

Figure 2022546402000003
の配列、またはその相補体を含む。 In some embodiments, the 3'UTR is
Figure 2022546402000003
 or its complement.

一部の実施形態では、ジフテリア毒素Ａ断片をコードする核酸配列は、

Figure 2022546402000004
の配列（またはその相補体）を含む。 In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the diphtheria toxin A fragment comprises
Figure 2022546402000004
 (or its complement).

一部の実施形態では、

Figure 2022546402000005
の配列を含む組成物を提供し、これは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び本明細書において提供されるとおりの任意の配列であってよい目的のタンパク質をコードする。上の例では、配列は、ジフテリア毒素Ａ断片をコードする。 In some embodiments
Figure 2022546402000005
 which encodes a protein of interest, which can be the 5'UTR, the 3'UTR and any sequence as provided herein. In the example above, the sequence encodes the diphtheria toxin A fragment.

一部の実施形態では、ジフテリア毒素Ａ断片をコードする核酸配列を、

Figure 2022546402000006
の配列を含み得る逆相補体として提供する。 In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the diphtheria toxin A fragment is
Figure 2022546402000006
 is provided as a reverse complement, which may include the sequence of .

一部の実施形態では、配列を

Figure 2022546402000007
の配列を含み得る逆相補体として提供する。 In some embodiments, the array is
Figure 2022546402000007
 is provided as a reverse complement, which may include the sequence of .

本明細書において提供される（上及び下の）配列はＤＮＡ配列として表されているが、対応するＲＮＡ配列も提供する。 Although the sequences provided herein (above and below) are represented as DNA sequences, the corresponding RNA sequences are also provided.

「核酸配列」及び「核酸分子」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に使用され得る。 The terms "nucleic acid sequence" and "nucleic acid molecule" can be used interchangeably as used herein.

一部の実施形態では、第１及び第２のウイルス転写認識シグナルにより挟まれているケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子を含み、かつさらに、第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーターと、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、ジフテリア毒素Ａ（またはその断片）、またはそれらの任意の組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接する５’側の第２のプロモーターとを含む組換え核酸配列を提供する。ケモカイン、サイトカイン、及びアポトーシス誘導タンパク質の非限定的例を本明細書において提供する。第１及び第２のウイルス転写認識シグナルにより挟まれている実際のタンパク質は、任意の適切なタンパク質であってよい。このコードされるタンパク質は、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはジフテリア毒素Ａ（またはその断片）をコードするものではない、任意の目的のタンパク質で置き換えられてもよい。 In some embodiments, it comprises a negative-strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof flanked by first and second viral transcriptional recognition signals, and further , a first promoter upstream (5′) of the first viral transcriptional recognition signal and a negative strand encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, diphtheria toxin A (or fragment thereof), or any combination thereof. A recombinant nucleic acid sequence is provided that includes a nucleic acid molecule or a second promoter that is 5' adjacent to the pgRNA nucleic acid molecule. Non-limiting examples of chemokines, cytokines, and apoptosis-inducing proteins are provided herein. The actual protein flanked by the first and second viral transcriptional recognition signals can be any suitable protein. The encoded protein may be replaced with any protein of interest that does not encode a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or diphtheria toxin A (or fragment thereof).

本明細書において提供されるとおり、ネガティブストランド核酸分子は、ネガティブセンスＲＮＡ、ネガティブセンスＤＮＡ、ノンコーディングネガティブセンスＲＮＡを発現する一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはｐｇＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せであってよい。一部の実施形態では、ネガティブストランド核酸分子は、ネガティブセンスＲＮＡである。一部の実施形態では、ネガティブストランド核酸分子は、ネガティブセンスＤＮＡである。一部の実施形態では、ネガティブストランド核酸分子は、ノンコーディングネガティブセンスＲＮＡを発現する一本鎖または二本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、ネガティブストランド核酸分子は、ｐｇＲＮＡである。 As provided herein, a negative-strand nucleic acid molecule is negative-sense RNA, negative-sense DNA, single- or double-stranded DNA that expresses non-coding negative-sense RNA, or pgRNA, or any combination thereof. It's okay. In some embodiments, the negative-strand nucleic acid molecule is negative-sense RNA. In some embodiments, the negative-strand nucleic acid molecule is negative-sense DNA. In some embodiments, the negative-strand nucleic acid molecule is single- or double-stranded DNA that expresses non-coding negative-sense RNA. In some embodiments, the negative-strand nucleic acid molecule is pgRNA.

本明細書において提供されるとおり、一部の実施形態では、ウイルス転写認識シグナルは、例えば、ネガティブストランドウイルス、ＲＮＡ逆転写ウイルス、またはＤＮＡ逆転写ウイルスであるウイルスに由来するか、またはそれに基づく。一部の実施形態では、ウイルス転写認識シグナルは、ネガティブストランドウイルスウイルス転写認識シグナルである。一部の実施形態では、ウイルス転写認識シグナルは、ＲＮＡ逆転写ウイルスウイルス転写認識シグナルである。一部の実施形態では、ウイルス転写認識シグナルは、ＤＮＡ逆転写ウイルスウイルス転写認識シグナルである。 As provided herein, in some embodiments, viral transcriptional recognition signals are derived from or based on viruses, eg, negative strand viruses, RNA reverse transcription viruses, or DNA reverse transcription viruses. In some embodiments, the viral transcriptional recognition signal is a negative strand viral viral transcriptional recognition signal. In some embodiments, the viral transcriptional recognition signal is an RNA reverse transcription viral viral transcriptional recognition signal. In some embodiments, the viral transcriptional recognition signal is a DNA reverse transcription viral viral transcriptional recognition signal.

一部の実施形態では、組換え核酸配列は、毒素、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せなどの目的のタンパク質もコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子の下流（３’側）にポリＡテールを含む。 In some embodiments, the recombinant nucleic acid sequence is downstream (3') of the negative-strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule that also encodes a protein of interest, such as a toxin, chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof. contains a polyA tail.

アポトーシス誘導タンパク質は、細胞におけるその発現に基づきアポトーシスを誘導し得る任意のタンパク質であり得る。例には、これに限定されないが、ＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、シトクロムＣ、ＳＭＡＣ、及びアポトーシス誘導因子、またはそれらの組合せが含まれる。したがって、これらのタンパク質は、感染個体に投与されるか、または感染細胞と接触するコンストラクトにおいて目的のタンパク質として発現されて、これらの目的のタンパク質の発現により細胞死を誘導し得る。 An apoptosis-inducing protein can be any protein capable of inducing apoptosis based on its expression in a cell. Examples include, but are not limited to, BAX, BID, BAK, BAD, caspase-2, caspase-8, caspase-9, caspase-10, caspase-11, caspase-12, cytochrome C, SMAC, and apoptosis inducers, or combinations thereof. is included. Thus, these proteins can be administered to infected individuals or expressed as proteins of interest in constructs that contact infected cells, and expression of these proteins of interest can induce cell death.

一部の実施形態では、目的のタンパク質はウイルスタンパク質ではない。 In some embodiments, the protein of interest is not a viral protein.

本実施形態により使用され得るか、またはコードされ得るケモカインの例には、これに限定されないが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、及び／またはＣＸ３ＣＬ１が含まれる。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０Ｌ、Ｍｉｇ、及びＣｒｇ－２からなる群から選択される。 Examples of chemokines that may be used or encoded according to this embodiment include, but are not limited to, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13 , CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL15, CXCL12, CXCL134, CXCL , CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, and/or CX3CL1. In some embodiments, the cytokine is IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, Selected from the group consisting of CD40L, Mig, and Crg-2.

本明細書において提供されるとおり、一部の実施形態では、組換え核酸配列は、細胞において核酸配列の発現を指示するプロモーターをさらに含み得る。一部の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは肝臓組織特異的プロモーターである。肝臓組織特異的プロモーターの例には、これに限定されないが、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、アルブミンプロモーター及び／または増強要素、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）プロモーター、ＡＡＴ（アルファ－１－アンチトリプシン）プロモーター、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）プロモーターまたはＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）プロモーターが含まれる。これらのプロモーターを、本明細書において称されるとおりの第１のプロモーターとして使用することができる。 As provided herein, in some embodiments, a recombinant nucleic acid sequence can further comprise a promoter that directs expression of the nucleic acid sequence in the cell. In some embodiments the promoter is a constitutive promoter. In some embodiments the promoter is a tissue specific promoter. In some embodiments, the promoter is a liver tissue-specific promoter. Examples of liver tissue-specific promoters include, but are not limited to, TBG (thyroxine binding globulin), albumin promoter and/or enhancing elements, AFP (alpha-fetoprotein) promoter, AAT (alpha-1-antitrypsin) promoter, ApoE (apolipoprotein E) or PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) promoters are included. These promoters can be used as primary promoters as referred to herein.

一部の実施形態では、組換え核酸配列は第２のプロモーターを含む。そのような第２のプロモーターの非限定的例は、伸長因子１アルファ結合配列（ＥＦＳ）である。 In some embodiments, the recombinant nucleic acid sequence contains a second promoter. A non-limiting example of such a second promoter is the elongation factor 1 alpha binding sequence (EFS).

一部の実施形態では、ウイルス転写認識シグナル（配列）は、イプシロン認識シグナル（配列番号１）またはコロナウイルス認識配列（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、または配列番号３０において見い出されるものなど）を含む。他のウイルス転写認識シグナル配列を使用し、処置されるウイルスまたはウイルス感染症に特異的なものの代わりに用いることもできる。 In some embodiments, the viral transcriptional recognition signal (sequence) is an epsilon recognition signal (SEQ ID NO: 1) or a coronavirus recognition sequence (SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, or that found in SEQ ID NO: 30). etc.). Other viral transcriptional recognition signal sequences may be used in place of those specific for the virus or viral infection being treated.

本明細書において提供されるとおり、本実施形態は、ウイルス感染症を処置するために使用することができる。そして一部の実施形態では、前記組成物及び方法は、ウイルス感染細胞を特異的に死滅させるために使用することができる。ウイルス感染細胞を特異的に死滅させることの利点は、ウイルスを保持している細胞のみの破壊をもたらし得ることである。ウイルス転写認識シグナルのために使用することができるウイルスの例には、これに限定されないが、コロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、水疱性口内炎インドウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ハンタンウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、砂バエ熱シチリアウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＣ、トゴトウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、ウシ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒトスプーマウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、コロナウイルス、及びそれらの組合せが含まれる。何らかの特定の理論に束縛されることはないが、ウイルス転写認識シグナル配列の選択を使用して、どの種類のウイルス感染症を処置するかを決定することができる。例えば、ウイルス転写認識シグナル配列がＣＯＶＩＤ－１９ウイルス転写認識シグナル配列であるならば、本明細書において提供される核酸分子は、ＣＯＶＩＤ－１９に感染した細胞でのみ発現されるであろう。ＣＯＶＩＤ－１９は非限定的例として使用されたにすぎず、本明細書において提供される実施形態を限定するために使用されるべきではない。 As provided herein, this embodiment can be used to treat viral infections. And in some embodiments, the compositions and methods can be used to specifically kill virus-infected cells. An advantage of specifically killing virus-infected cells is that it may result in destruction of only those cells that harbor the virus. Examples of viruses that can be used for viral transcriptional recognition signals include, but are not limited to, coronaviruses (eg, COVID-19, SARS, MERS), hepatitis B virus, hepatitis D virus, Ebola virus. , Marburg virus, human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, human respiratory rash virus, vesicular stomatitis Indian virus, rabies virus, bovine epidemic fever virus, lymphocytic choriomeningitis virus, buny Yamwella virus, Hantan virus, Nairobi sheep disease virus, sand fly Sicilian virus, influenza virus A, influenza virus C, Togoto virus, mouse mammary tumor virus, mouse leukemia virus, avian leukemia virus, Mason-Pfizer monkey virus, bovine Included are leukemia virus, human immunodeficiency virus 1, human spuma virus, duck hepatitis B virus, coronaviruses, and combinations thereof. Without being bound by any particular theory, selection of viral transcriptional recognition signal sequences can be used to determine which type of viral infection to treat. For example, if the viral transcriptional recognition signal sequence is the COVID-19 viral transcriptional recognition signal sequence, the nucleic acid molecules provided herein will only be expressed in cells infected with COVID-19. COVID-19 was used as a non-limiting example only and should not be used to limit the embodiments provided herein.

一部の実施形態では、核酸分子は、ウイルスポリメラーゼ、逆転写酵素、カプシド、エンベロープ、パッケージングシグナル、または転座モチーフのための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、ウイルスポリメラーゼのための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、逆転写酵素のための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、カプシドタンパク質のための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、エンベロープタンパク質のための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、パッケージングシグナルのための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、転座モチーフのための配列（コーディングまたはノンコーディング）を含まない。 In some embodiments, the nucleic acid molecule does not include sequences (coding or non-coding) for viral polymerase, reverse transcriptase, capsid, envelope, packaging signal, or translocation motifs. In some embodiments, the recombinant nucleic acid molecule does not contain sequences (coding or non-coding) for a viral polymerase. In some embodiments, the recombinant nucleic acid molecule does not contain sequences (coding or non-coding) for reverse transcriptase. In some embodiments, the recombinant nucleic acid molecule does not contain sequences (coding or non-coding) for a capsid protein. In some embodiments, the recombinant nucleic acid molecule does not contain a sequence (coding or non-coding) for an envelope protein. In some embodiments, a recombinant nucleic acid molecule does not contain a sequence (coding or non-coding) for a packaging signal. In some embodiments, the recombinant nucleic acid molecule does not contain sequences (coding or non-coding) for translocation motifs.

本明細書において提供される組換え核酸分子は、ベクター中で提供することができる。ベクターは例えば、例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞に送達するための送達ベクターまたはビヒクルであってよい。一部の実施形態では、細胞は、シノ（ｃｙｎｏ）（例えば、サル）細胞である。一部の実施形態では、ベクターは、組換え核酸分子をヒト及びシノ細胞に送達することができるベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、組換え核酸分子をシノ細胞ではなくヒト細胞に送達することができるベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、組換え核酸分子をヒト細胞ではなくシノ細胞に送達することができるベクターである。 A recombinant nucleic acid molecule provided herein can be provided in a vector. The vector can be, for example, a delivery vector or vehicle for delivery to mammalian cells, such as human cells. In some embodiments, the cells are cyno (eg, monkey) cells. In some embodiments, the vector is a vector capable of delivering recombinant nucleic acid molecules to human and synocells. In some embodiments, the vector is a vector capable of delivering recombinant nucleic acid molecules to human cells other than synocells. In some embodiments, the vector is a vector capable of delivering recombinant nucleic acid molecules to Sino cells rather than human cells.

一部の実施形態では、送達ベクターまたはビヒクルは、ＶＬＰ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、リポソーム、ナノ粒子、ミセル、ポリマーベシクル、またはポリマーソームである。一部の実施形態では、送達ベクターまたはビヒクルはＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、送達ベクターまたはビヒクルはリポソームである。一部の実施形態では、送達ベクターまたはビヒクルはナノ粒子である。一部の実施形態では、送達ベクターまたはビヒクルはミセルである。一部の実施形態では、送達ベクターまたはビヒクルはポリマーベシクルである。一部の実施形態では、送達ベクターまたはビヒクルはポリマーソームである。送達ベクターまたはビヒクルの非限定的例には、米国特許出願公開第２０２００２０６３６２号、米国特許出願公開第２０２００２４６２６７号、米国特許出願公開第２０１７０２７３９０７号、及び米国特許第１０，５５６，０１８号に記載のものが含まれ、これらはそれぞれ、その全体で参照により本明細書に援用される。 In some embodiments, the delivery vector or vehicle is a VLP, adeno-associated virus (AAV), liposomes, nanoparticles, micelles, polymeric vesicles, or polymersomes. In some embodiments, the delivery vector or vehicle is an AAV vector. In some embodiments, the delivery vector or vehicle is a liposome. In some embodiments, the delivery vector or vehicle is a nanoparticle. In some embodiments, the delivery vector or vehicle is a micelle. In some embodiments, the delivery vector or vehicle is a polymeric vesicle. In some embodiments, the delivery vector or vehicle is a polymersome. Non-limiting examples of delivery vectors or vehicles include those described in U.S. Patent Application Publication No. 20200206362, U.S. Patent Application Publication No. 20200246267, U.S. Patent Application Publication No. 20170273907, and U.S. Patent No. 10,556,018. , each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

１７．本明細書において提供される組換え核酸分子を含んでよい複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）も本明細書において提供する。一部の実施形態では、ＶＬＰは、目的のウイルスからのカプシドタンパク質に融合している任意選択の転座モチーフ（ＴＬＭ）を含む。例えば、カプシドタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスカプシドまたはＤ型肝炎ウイルスカプシドまたはコロナウイルス融合タンパク質であってよい。 17. Also provided herein are replication-defective virus-like particles (VLPs) that may comprise the recombinant nucleic acid molecules provided herein. In some embodiments, the VLP comprises an optional translocation motif (TLM) fused to a capsid protein from the virus of interest. For example, the capsid protein can be a hepatitis B virus capsid or a hepatitis D virus capsid or a coronavirus fusion protein.

一部の実施形態では、ＶＬＰにより提供される組換え核酸分子は、目的のタンパク質をコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子である。本明細書において提供されるとおり、目的のタンパク質は、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、ジフテリア毒素Ａ（またはその断片）またはそれらの組合せである。本明細書において提供されるとおり、目的のタンパク質をコードする配列は、第１及び第２のウイルス転写認識シグナルにより挟まれていてよく、さらに、第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーターと、目的のタンパク質（例えば、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せ）をコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接する５’側の第２のプロモーターとを含む。ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せの非限定的例は本明細書において提供されている。 In some embodiments, the recombinant nucleic acid molecule provided by the VLP is a negative-strand or pgRNA nucleic acid molecule encoding a protein of interest. As provided herein, the protein of interest is a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, diphtheria toxin A (or fragment thereof), or a combination thereof. As provided herein, the sequence encoding the protein of interest may be flanked by first and second viral transcriptional recognition signals, and may be further upstream (5′) of the first viral transcriptional recognition signal. ) and a second promoter 5′ flanking a negative-strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule encoding a protein of interest (e.g., a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof) including. Non-limiting examples of chemokines, cytokines, apoptosis-inducing proteins, or combinations thereof are provided herein.

一部の実施形態では、第１及び第２の標的ウイルス転写認識シグナルにより挟まれている目的のタンパク質（例えば、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せ）をコードする本明細書において提供されるものなどの組換え核酸分子（例えば、ネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子）を含み、かつさらに、第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーターと、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接する５’側の第２のプロモーターとを含み、その際、ＶＬＰが標的ウイルス感染細胞について指向性を示す複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。指向性は、ＶＬＰの表面上に発現されるウイルスタンパク質の発現により、さらに、組換え核酸分子によりコードされるウイルス転写認識シグナル配列の供給源による核酸分子の発現の制御により制御することができる。 In some embodiments, provided herein encodes a protein of interest (e.g., a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or combination thereof) flanked by first and second target viral transcriptional recognition signals. and further comprising a first promoter upstream (5′) of a first viral transcriptional recognition signal, a chemokine, and a second promoter 5′ flanked by a negative strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule encoding a cytokine, an apoptosis-inducing protein, or a combination thereof, wherein the VLP is oriented for target virus-infected cells. A replication-deficient virus-like particle (VLP) is provided. Tropism can be controlled by expression of viral proteins expressed on the surface of the VLP and by control of expression of the nucleic acid molecule by the source of the viral transcriptional recognition signal sequence encoded by the recombinant nucleic acid molecule.

本明細書において提供されるとおり、一部の実施形態では、ネガティブストランド核酸分子は、ネガティブセンスＲＮＡ、ネガティブセンスＤＮＡ、ノンコーディングネガティブセンスＲＮＡを発現する一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはｐｇＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せである。 As provided herein, in some embodiments, the negative-strand nucleic acid molecule is negative-sense RNA, negative-sense DNA, single- or double-stranded DNA that expresses non-coding negative-sense RNA, or pgRNA, or any combination thereof.

一部の実施形態では、複製不全ウイルス様粒子は、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子の下流（３’側）にポリＡテール配列をさらに含む。 In some embodiments, the replication-deficient virus-like particle has a polyA tail sequence downstream (3') of the negative-strand or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof. Including further.

一部の実施形態では、複製不全ウイルス様粒子は、プロモーター（例えば、第１のプロモーター及び第２のプロモーター）を含む。そのようなプロモーターの非限定的例は、本明細書において提供されている。 In some embodiments, the replication-deficient virus-like particle comprises a promoter (eg, a first promoter and a second promoter). Non-limiting examples of such promoters are provided herein.

本明細書に記載のとおりの全体設計及び組換え核酸コンストラクト及び複製不全ウイルス様粒子を、ボルチモア第ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、及びＶＩＩ群のウイルスを包含するように適合させることができる。第ＩＶ～ＶＩＩ群のウイルスの１つを標的化するために、例えば、ＨＢＶ例のために記載したとおりのイプシロン認識シグナル配列（配列番号１）に置き換わるであろう特異的ウイルスポリメラーゼ認識シグナルを利用する。ボルチモア群は次のとおり記載される： The overall design and recombinant nucleic acid constructs and replication-deficient virus-like particles as described herein can be adapted to encompass viruses of Baltimore Groups IV, V, VI, and VII. To target one of the Group IV-VII viruses, for example, utilize a specific viral polymerase recognition signal that would replace the epsilon recognition signal sequence (SEQ ID NO: 1) as described for the HBV example. do. The Baltimore group is described as follows:

ボルチモア第ＩＶ群ウイルス：ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを持ち、ピコルナウイルス（Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、及び手足口病ウイルスのような周知のウイルスを含むウイルスの科である）、ＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、及び風疹ウイルスが含まれる。この群には、コロナウイルス、ヘペウイルス（Ｅ型肝炎）、さらにデング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、及びジカウイルスなどのフラビウイルスも含まれる。 Baltimore Group IV Virus: A family of viruses that have a positive-sense single-stranded RNA genome and include well-known picornaviruses (such as hepatitis A virus, enteroviruses, rhinoviruses, polioviruses, and hand-foot-and-mouth disease viruses). some), SARS virus, hepatitis C virus, yellow fever virus, and rubella virus. This group includes coronaviruses, hepeviruses (hepatitis E), and also flaviviruses such as dengue virus, hepatitis C virus, yellow fever virus, and Zika virus.

ボルチモア第Ｖ群ウイルス：一本鎖ＲＮＡウイルス；ネガティブセンス（例えば、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス）。 Baltimore group V virus: single-stranded RNA virus; negative sense (eg, orthomyxovirus, rhabdovirus).

ボルチモア第ＶＩ群ウイルス：ＤＮＡ中間体を介して複製するポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）。 Baltimore group VI virus: A positive-sense single-stranded RNA virus (eg, retrovirus) that replicates through a DNA intermediate.

ボルチモア第ＶＩＩ群ウイルス：一本鎖ＲＮＡ中間体を介して複製する二本鎖ＤＮＡウイルス。 Baltimore Group VII Virus: A double-stranded DNA virus that replicates via a single-stranded RNA intermediate.

ＮＳＶライフサイクル及び複製
ネガティブストランドＲＮＡウイルス（ＮＳＶ、またはボルチモア第Ｖ群ウイルス）は、２１の別個の科に分類され得る。非セグメント化ゲノムからなる科には、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科及びボルナウイルス科が含まれる。オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科はそれぞれ、６～８つ、３つ、または２つのネガティブセンスＲＮＡセグメントのゲノムを含有する（Ｐａｌｅｓｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１３５４－１１３５８， １９９６；及びＢｏｒｉｔｚ， Ｅｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ７３ （８）： ６９３７－６９４５， １９９９）を参照されたい）。 NSV Life Cycle and Replication Negative-strand RNA viruses (NSV, or Baltimore group V viruses) can be classified into 21 distinct families. Families consisting of non-segmented genomes include Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Filoviridae and Bornaviridae. The Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Arenaviridae each contain genomes of 6-8, 3, or 2 negative-sense RNA segments (Palese, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11354-11358, 1996; and Boritz, Eli et al., Journal of Virology.

呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルスなどの多くの高度に流行性のヒト病原体がＮＳＶ内に包含される。ＮＳＶのライフサイクルはいくつかのステップを有する。ウイルスは始めに、ウイルス表面糖タンパク質を介して宿主細胞受容体に結合することにより宿主細胞に感染する。酸性環境下での糖タンパク質ウイルス膜と宿主細胞の形質膜との融合が、細胞質へのウイルスリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の放出を可能にする。多くのＮＳＶは、感染細胞の細胞質において複製する。新たに合成されたＲＮＰ複合体は、形質膜で、またはゴルジ体の膜でウイルス構造タンパク質と共に組み立てられる。このすべての後に、新たに合成されたウイルスの放出が続く。 Included within NSV are many highly prevalent human pathogens such as respiratory rash virus (RSV), parainfluenza virus, influenza virus, Ebola virus, Marburg virus. The NSV lifecycle has several steps. Viruses initially infect host cells by binding to host cell receptors via viral surface glycoproteins. Fusion of the glycoprotein viral membrane with the host cell's plasma membrane in an acidic environment allows release of the viral ribonucleoprotein (RNP) complex into the cytoplasm. Many NSVs replicate in the cytoplasm of infected cells. The newly synthesized RNP complex is assembled with the viral structural proteins at the plasma membrane or at the Golgi membrane. All this is followed by the release of newly synthesized virus.

非セグメント化ＮＳＶの複製及び転写に関して、これらのＮＳＶの遺伝子は、３つの調節領域：遺伝子末端シグナル、遺伝子間領域、及び遺伝子開始シグナルから成る。遺伝子末端シグナルの一例は、高度に保存的遺伝子末端シグナルを含有する水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）と呼ばれる特異的ウイルス中にある。遺伝子間領域は高度に可変的であり、保存ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、または最高１４３のヌクレオチドの領域からなる。様々な長さの遺伝子間領域が転写減衰と相関しているが、しかしながら、多様な遺伝子間領域が遺伝子発現を変更することはない。最初の３つのヌクレオチドが遺伝子発現に重要であるので、遺伝子開始シグナルは高度に特異的である。 For replication and transcription of non-segmented NSVs, the genes of these NSVs consist of three regulatory regions: gene end signal, intergenic region, and gene start signal. One example of a gene end signal is in a specific virus called vesicular stomatitis virus (VSV) that contains a highly conserved gene end signal. Intergenic regions are highly variable and consist of conserved dinucleotide, trinucleotide, or regions of up to 143 nucleotides. Intergenic regions of varying lengths have been correlated with transcriptional attenuation, however, diverse intergenic regions do not alter gene expression. Gene start signals are highly specific, as the first three nucleotides are critical for gene expression.

ヘパドナウイルス科のメンバーであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、レトロウイルスと同様の稀な特徴を伴う小さなＤＮＡウイルスである。ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体を介して複製し、宿主ゲノムに取り込まれ得る。ＨＢＶ複製サイクルの独特の特徴により、ウイルスが感染細胞において存続する別個の可能性がもたらされる。ＨＢＶ関連疾患の様々な形態を診断し、慢性Ｂ型肝炎感染症を処置するために、ウイルス学的及び血清学的アッセイが開発されている。ＨＢＶ感染症は、急性（劇症肝不全を含む）から慢性肝炎、硬変、及び肝細胞癌までに及ぶ範囲の幅広いスペクトルの肝疾患をもたらす。急性ＨＢＶ感染症は、無症候性であり得るか、または症候性急性肝炎を引き起こし得る。ウイルスに感染した成人の多くは回復するが、５％～１０％は、ウイルスを除去することができず、慢性的に感染する。慢性的に感染した人の多くは、長期罹患または死亡をほとんど伴わないか、まったく伴わない軽度肝疾患を有する。慢性ＨＢＶ感染している他の個体は、硬変及び肝臓癌へと進行し得る活動性疾患を発症する。加えて、一部の個体は、ＨＢＶに加えて、Ａ型肝炎、（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎（ＨＤＶ）、またはＥ型肝炎（ＨＥＶ）などの他の肝炎ウイルスに感染する。したがって、ＨＢＶを処置することは、これらの同時感染症、特に、その複製のためにＨＢＶを必要とするＨＤＶの克服において助けとなるであろう。ＨＢＶを処置することで、発癌異常及び硬変の可能性も小さくなるはずである。 Hepatitis B virus (HBV), a member of the Hepadnaviridae family, is a small DNA virus with rare characteristics similar to retroviruses. HBV can replicate and integrate into the host genome through RNA intermediates. Unique features of the HBV replication cycle provide distinct possibilities for virus persistence in infected cells. Virologic and serological assays have been developed to diagnose various forms of HBV-associated disease and to treat chronic hepatitis B infection. HBV infection results in a broad spectrum of liver disease ranging from acute (including fulminant liver failure) to chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Acute HBV infection can be asymptomatic or cause symptomatic acute hepatitis. Although many adults infected with the virus recover, 5% to 10% are unable to clear the virus and become chronically infected. Many chronically infected people have mild liver disease with little or no long-term morbidity or mortality. Other individuals with chronic HBV infection develop active disease that can progress to cirrhosis and liver cancer. In addition, some individuals are infected with other hepatitis viruses in addition to HBV, such as hepatitis A, (HAV), hepatitis C (HCV), hepatitis D (HDV), or hepatitis E (HEV). get infected. Therefore, treating HBV will help in overcoming these co-infections, particularly HDV, which requires HBV for its replication. Treating HBV should also reduce the likelihood of carcinogenesis and cirrhosis.

本発明がより容易に理解され得るように、ある特定の技術及び科学用語を下で具体的に定義する。この文書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書において使用される他の技術及び科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者が一般に理解する意味を有する。 In order that the present invention may be more readily understood, certain technical and scientific terms are specifically defined below. Unless specifically defined elsewhere in this document, all other technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

本明細書で使用される場合、別段に示されていない限り、「約」という用語は、それが修飾している値の±５％を意味することが意図されている。したがって、約１００は、９５～１０５を意味する。加えて、「約」という用語は、「約１、２、３、４、または５」などの一連の用語中の用語を修飾し、これは、「約」という用語が、そのリスト中のメンバーのそれぞれを修飾していると理解されるべきであり、したがって、「約１、２、３、４、または５」は、「約１、約２、約３、約４、または約５」を意味すると理解され得る。同じことが、「少なくとも」という用語またはこれに限定されないが、「未満」、「超」などの他の定量修飾語句により修飾されているリストについても当てはまる。 As used herein, unless otherwise indicated, the term "about" is intended to mean ±5% of the value it modifies. Thus, about 100 means 95-105. In addition, the term "about" modifies a term in a series of terms such as "about 1, 2, 3, 4, or 5," since the term "about" refers to a member in the list. and thus "about 1, 2, 3, 4, or 5" means "about 1, about 2, about 3, about 4, or about 5." can be understood to mean The same is true for lists that are modified by the term "at least" or other quantitative modifiers such as, but not limited to, "less than", "greater than".

本明細書で、及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段に記述していない限り、複数の言及も含む。 As used herein and in the appended claims, the singular forms "a," "an," and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise. .

本明細書で使用される場合、「含む」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」及び「包含する」という用語ならびにそれらの複合は、本明細書で使用される場合、「含むが、これに限定されない」を意味する。様々な組成物、及び方法を、様々な構成要素またはステップを「含む」（「含むが、これに限定されない」を意味すると解釈される）という観点から記載するが、その組成物、方法、及びデバイスは、様々な構成要素及びステップ「から本質的になる」または「からなる」こともでき、そのような用語は、本質的に閉じたメンバー群を定義するものと解釈されるべきである。 As used herein, the terms "comprise," "have," "has," and "include," and combinations thereof when used herein, "include but is not limited to". Although various compositions and methods are described in terms of "comprising" (interpreted to mean "including but not limited to") various components or steps, the compositions, methods and A device may also “consist essentially of” or “consist of” various components and steps, and such terms are to be interpreted as defining an essentially closed group of members.

本明細書に記載の組み換えバリアントを試験するために使用される例示的なコンストラクトのベクターマップが、図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７、及び図８に示されている。他方で、これらのコンストラクトを試験した結果のグラフが、図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ、図４Ｃ、図５Ｂ、図６Ｂ及び図６Ｃに示されている。これらのコンストラクトにおいて有用な例示的な配列は、配列番号ｌ～９に提供されている。これらは、非限定的例であり、処置されるべき目的のウイルスに基づき、変更するか、または適合させることができる。 Vector maps of exemplary constructs used to test the recombinant variants described herein are shown in FIGS. 1A, 1B, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7, and It is shown in FIG. On the other hand, graphs of the results of testing these constructs are shown in Figures 2B, 3B, 4B, 4C, 5B, 6B and 6C. Exemplary sequences useful in these constructs are provided in SEQ ID NOS: 1-9. These are non-limiting examples and can be varied or adapted based on the virus of interest to be treated.

「同時投与」などの用語は、複数の選択された治療薬を一人の患者に投与することを包含することが意味されており、複数の薬剤を同じか、もしくは異なる投与経路により、または同じか、もしくは異なる時間に投与する処置レジメンを含むことが意図されている。 A term such as "co-administration" is meant to encompass the administration of multiple selected therapeutic agents to a single patient, whether the multiple agents are administered by the same or different routes of administration, or by the same or different routes of administration. , or treatment regimens administered at different times.

本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、その存在が、そのタンパク質のために天然に存在するリガンドの存在に起因する生物学的活性と同じであるタンパク質の生物学的活性をもたらす化合物を指す。 As used herein, the term "agonist" refers to a biological activity of a protein whose presence is the same as the biological activity attributable to the presence of a naturally occurring ligand for that protein. refers to the compound that results in

本明細書で使用される場合、「部分アゴニスト」という用語は、その存在が、そのタンパク質のために天然に存在するリガンドの存在に起因するのと同じ種類ではあるが、より低い規模のタンパク質の生物学的活性をもたらす化合物を指す。 As used herein, the term "partial agonist" refers to the presence of a protein of the same type, but on a lower scale, whose presence is due to the presence of a naturally occurring ligand for that protein. Refers to compounds that provide biological activity.

本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、その存在が、タンパク質の生物学的活性の規模の縮小をもたらす化合物を指す。ある特定の実施形態では、アンタゴニストの存在は、タンパク質の生物学的活性の完全な阻害をもたらす。ある特定の実施形態では、アンタゴニストは阻害薬である。 As used herein, the term "antagonist" refers to a compound whose presence results in a reduction in the magnitude of the protein's biological activity. In certain embodiments, the presence of an antagonist results in complete inhibition of the protein's biological activity. In certain embodiments, the antagonist is an inhibitor.

「投与すること」は、治療用組成物（例えば、組換え核酸コンストラクト及び複製不全ウイルス様粒子ならびにこれらの生成物を含む組成物）と併せて用いられる場合、標的組織中に、もしくはその上に直接、治療を投与するか、または患者に治療を投与して、それにより、治療が標的化されている組織にプラスの影響を及ぼすことを意味する。 "Administering" means into or onto a target tissue when used in conjunction with a therapeutic composition (e.g., recombinant nucleic acid constructs and replication-defective virus-like particles and compositions comprising these products). It means administering the treatment directly or administering the treatment to a patient, thereby positively affecting the tissue to which the treatment is targeted.

「対象」または「患者」という用語には、本明細書で使用される場合、これに限定されないが、ヒトならびに野生、家畜、及び牧畜動物などの非ヒト脊椎動物が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の対象または患者は動物である。ある特定の実施形態では、対象または患者は哺乳類である。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象または患者は、非ヒト動物である。ある特定の実施形態では、対象または患者は非ヒト哺乳類である。ある特定の実施形態では、対象または患者は、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜化動物である。ある特定の実施形態では、対象または患者は、イヌまたはネコなどのコンパニオン動物である。ある特定の実施形態では、対象または患者は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの牧畜動物である。ある特定の実施形態では、対象または患者は、動物園の動物である。別の実施形態では、対象または患者は、げっ歯類、イヌ、または非ヒト霊長類などの研究用動物である。ある特定の実施形態では、対象または患者は、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックブタなどの非ヒトトランスジェニック動物である。 The terms "subject" or "patient" as used herein include, but are not limited to, humans and non-human vertebrates such as wild, domestic and farm animals. In certain embodiments, the subject or patient described herein is an animal. In certain embodiments, the subject or patient is a mammal. In certain embodiments, the subject is human. In certain embodiments, the subject or patient is a non-human animal. In certain embodiments, the subject or patient is a non-human mammal. In certain embodiments, the subject or patient is a domesticated animal such as a dog, cat, cow, pig, horse, sheep, or goat. In certain embodiments, the subject or patient is a companion animal such as a dog or cat. In certain embodiments, the subject or patient is a farm animal such as a cow, pig, horse, sheep, or goat. In certain embodiments, the subject or patient is a zoo animal. In another embodiment, the subject or patient is a research animal such as a rodent, dog, or non-human primate. In certain embodiments, the subject or patient is a non-human transgenic animal such as a transgenic mouse or transgenic pig.

「阻害する」という用語は、症状の発症を予防する、症状を緩和する、または疾患、状態もしくは障害を除去するための本明細書の実施形態の治療の投与を含む。 The term "inhibit" includes administration of the treatments of the embodiments herein to prevent the development of symptoms, alleviate symptoms, or eliminate the disease, condition or disorder.

「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤または添加剤が、治療の他の成分と適合性でなければならず、かつその受容者に対して有害でないことを意味する。 "Pharmaceutically acceptable" means that the carrier, diluent or excipient must be compatible with the other ingredients of the treatment and not deleterious to its recipient.

「処置する」、「処置される」、または「処置すること」という用語は、本明細書で使用される場合、治療的処置と、予防的または防止的方策との両方を指し、その際、目的は、不所望の生理学的状態、障害もしくは疾患を阻害する、予防する、もしくは減速させる（軽減する）こと、または有利もしくは所望の臨床結果を改善する、阻害する、もしくは別段に得ることである。本発明の目的では、有利または所望の臨床結果には、これに限定されないが、症状の改善または緩和；状態、障害または疾患の程度の縮小；状態、障害または疾患の状態の安定化（すなわち、悪化させない）；状態、障害または疾患の発症の遅延またはその進行の減速；状態、障害または病態の寛解；及び検出可能であっても検出不可能であっても、状態、障害または疾患の寛解（部分的でも全部でも）、またはその増強もしくは改善が含まれる。処置には、過剰なレベルの副作用を伴わずに臨床的に有意な応答を誘発することが含まれる。処置には、処置を受けない場合に予測される生存と比較しての生存の延長も含まれる。 The terms "treat," "treated," or "treating," as used herein, refer to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, wherein The purpose is to inhibit, prevent, or slow (ameliorate) an undesirable physiological condition, disorder, or disease, or to ameliorate, inhibit, or otherwise obtain a beneficial or desired clinical outcome. . For purposes of the present invention, advantageous or desired clinical results include, but are not limited to, amelioration or alleviation of symptoms; reduction in the extent of a condition, disorder or disease; stabilization of a condition, disorder or disease state (i.e. delaying the onset of a condition, disorder or disease or slowing its progression; remission of a condition, disorder or condition; and remission of a condition, disorder or disease, whether detectable or undetectable ( partly or wholly), or enhancements or improvements thereof. Treatment includes eliciting a clinically significant response without excessive levels of side effects. Treatment also includes prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment.

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源に、または組み換え源に由来するインタクトな免疫グロブリンであってよく、かつインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であってよい。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、さらには一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む様々な形態で存在してよい。 The term "antibody," as used herein, refers to an immunoglobulin molecule that specifically binds an antigen. Antibodies may be intact immunoglobulins derived from natural sources or from recombinant sources, and may be immunoreactive portions of intact immunoglobulins. Antibodies can exist in a variety of forms including, for example, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Fv, Fab and F(ab)2, as well as single chain antibodies and humanized antibodies.

「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、これに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。 The term "antibody fragment" refers to a portion of an intact antibody and refers to the antigen-determining variable regions of the intact antibody. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', F(ab')2, and Fv fragments, linear antibodies, scFv antibodies, and multispecific antibodies formed from antibody fragments. .

「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生か、または特異的免疫学的完全細胞の活性化か、またはその両方のいずれかに関係し得る。当業者であれば、実際的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原としての機能を果たし得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来してよい。当業者であれば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡはしたがって、その用語が本明細書において使用されるとおりである「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列により単独でコードされる必要はないことを理解するであろう。実施形態が、これに限定されないが、１つよりも多い遺伝子からなる部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、及びこれらのヌクレオチド配列が様々な組合せでアレンジされて所望の免疫応答を誘発することは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が全部「遺伝子」によりコードされる必要がないことを理解するであろう。抗原が合成で生成されてもよいし、または生体試料に由来してもよいことは容易に明らかである。そのような生体試料には、これに限定されないが、組織試料、ウイルスを含有することが疑われる組織試料、細胞または生体液が含まれ得る。 The term "antigen" as used herein is defined as a molecule that elicits an immune response. This immune response may involve either antibody production, or activation of specific immunologically intact cells, or both. Those skilled in the art will appreciate that virtually any macromolecule, including any protein or peptide, can serve as an antigen. Additionally, antigens may be derived from recombinant or genomic DNA. It will be appreciated by those skilled in the art that any DNA containing a nucleotide sequence or partial nucleotide sequence that encodes a protein that elicits an immune response thus encodes an "antigen" as that term is used herein. will understand. Furthermore, those skilled in the art will understand that an antigen need not be encoded solely by the full-length nucleotide sequence of a gene. Embodiments include, but are not limited to, the use of partial nucleotide sequences consisting of more than one gene, and it is easy to arrange these nucleotide sequences in various combinations to elicit the desired immune response. is clear to Furthermore, those skilled in the art will understand that an antigen need not be encoded entirely by a "gene". It is readily apparent that the antigen may be synthetically produced or derived from a biological sample. Such biological samples may include, but are not limited to, tissue samples, tissue samples suspected of containing viruses, cells or biological fluids.

「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生か、または特異的免疫学的コンピテント細胞の活性化か、またはその両方のいずれかに関係し得る。 The term "antigen" as used herein is defined as a molecule that elicits an immune response. This immune response may involve either antibody production or activation of specific immunologically competent cells, or both.

本明細書で使用される場合、「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、身体の「外側」を指す。 As used herein, the term "ex vivo" refers to "outside" the body.

「疾患」は、対象がホメオスターシスを維持することができず、疾患が寛解しなければ、動物の健康が悪化し続ける対象の健康状態である。対照的に、対象における「障害」は、対象がホメオスターシスを維持することができるが、対象の健康状態が障害の非存在下においてよりも好ましくない健康状態である。未処置のままであっても、障害は対象の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。 A "disease" is a health condition in a subject in which the subject is unable to maintain homeostasis and the health of the animal continues to deteriorate unless the disease goes into remission. In contrast, a "disorder" in a subject is a condition in which the subject is able to maintain homeostasis, but the subject's health is less favorable than in the absence of the disorder. A disorder, even if left untreated, does not necessarily cause a further deterioration in a subject's health.

「有効量」は、本明細書で使用される場合、治療上または予防上の利点をもたらす量を意味する。 An "effective amount," as used herein, means an amount that provides a therapeutic or prophylactic benefit.

「コードすること」は、ヌクレオチドの規定の配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）またはアミノ酸の規定の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び高分子を合成するためのテンプレートとして機能するための遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、及びそこから生じる生物学的特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生するならば、遺伝子はタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、かつ配列表で通常示されるコーディング鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして用いられるノンコーディング鎖との両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称され得る。 "Encoding" means having either a defined sequence of nucleotides (i.e., rRNA, tRNA and mRNA) or a defined sequence of amino acids as a template for synthesizing other polymers and macromolecules in biological processes. Refers to the inherent properties of a specific sequence of nucleotides in a polynucleotide such as a gene, cDNA, or mRNA to function, and the biological properties resulting therefrom. Thus, a gene encodes a protein if transcription and translation of the mRNA corresponding to that gene produces the protein in a cell or other biological system. Both the coding strand, whose nucleotide sequence is identical to the mRNA sequence and usually shown in sequence listings, and the non-coding strand, used as a template for transcription of the gene or cDNA, are proteins or other can be referred to as encoding the product of

本明細書で使用される場合、「内在性」は、生体、細胞、組織または系に由来するか、その内側で産生される任意の物質を指す。 As used herein, "endogenous" refers to any substance derived from or produced within an organism, cell, tissue or system.

本明細書で使用される場合、「外在性」という用語は、生体、細胞、組織または系から導入されるか、またその外側で産生される任意の物質を指す。 As used herein, the term "exogenous" refers to any substance introduced into or produced outside an organism, cell, tissue or system.

「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、そのプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳と定義される。 The term "expression" as used herein is defined as the transcription and/or translation of a specific nucleotide sequence driven by its promoter.

「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に作動可能に連結されている発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性要素を含み；発現のための他の要素は、宿主細胞により、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み込まれるコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドか、またはリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの当技術分野で公知のものすべてが含まれる。 An "expression vector" refers to a vector containing a recombinant polynucleotide that includes expression control sequences operably linked to the nucleotide sequence to be expressed. An expression vector contains sufficient cis-acting elements for expression; other elements for expression may be supplied by the host cell or in an in vitro expression system. Expression vectors include cosmids, plasmids (e.g., naked or contained in liposomes) and viruses (e.g., lentiviruses, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses) that incorporate recombinant polynucleotides of the art. includes everything known in

「相同な」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。２つの比較される配列の両方における位置が同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットにより占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占められているならば、それらの分子は、その位置において相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列が共有するマッチング数または相同な位置を、比較された位置の数で割って１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列内の位置の１０のうちの６つがマッチしたか、または相同であるならば、それら２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは５０％相同性を共有している。一般に、最大の相同性が得られるように２つの配列をアラインさせて、比較は行われる。 "Homologous" refers to sequence similarity or identity between two polypeptides or between two nucleic acid molecules. If a position in both of the two compared sequences is occupied by the same base or amino acid monomeric subunit, e.g., if a position in each of two DNA molecules is occupied by adenine, then those molecules are homologous at that position. The percent homology between two sequences is a function of the number of matching or homologous positions shared by the two sequences divided by the number of positions compared multiplied by 100. For example, two sequences are 60% homologous if 6 out of 10 of the positions in the two sequences are matched or homologous. As an example, the DNA sequences ATTGCC and TATGGC share 50% homology. Generally, the comparison is performed by aligning the two sequences for maximum homology.

一部の実施形態では、タンパク質は、本明細書において提供される配列に対して少なくとも、または約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％相同性である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。 In some embodiments, the proteins are at least or about 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% homologous to the sequences provided herein. A "conservative amino acid substitution" is one in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g. , tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).

「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体として機能するタンパク質の群と定義される。Ｂ細胞により発現される抗体はときに、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と称される。この群のタンパク質に含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。 The term "immunoglobulin" or "Ig" as used herein is defined as a group of proteins that function as antibodies. Antibodies expressed by B cells are sometimes referred to as BCR (B cell receptor) or antigen receptor. The five members included in this group of proteins are IgA, IgG, IgM, IgD and IgE.

「単離された」は、天然状態から変えられた、または取り除かれたことを意味する。例えば、生体動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その天然状態の共存する物質から部分的に、または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在してもよいし、または例えば、宿主細胞などの非天然環境に存在してもよい。「単離された」生物学的構成要素（核酸、タンパク質または細胞など）は、他の生物学的構成要素（細胞破片、他のタンパク質、核酸または細胞型など）から実質的に分離されているか、または精製されている。「単離されている」生物学的構成要素には、標準的な精製方法により精製された構成要素が含まれる。 "Isolated" means altered or removed from the natural state. For example, a nucleic acid or peptide that occurs naturally in a living animal is not "isolated," but the same nucleic acid or peptide that is partially or completely separated from coexisting materials in its natural state is "isolated." "ing. An isolated nucleic acid or protein can exist in substantially purified form, or can exist in a non-native environment such as, for example, a host cell. Is an “isolated” biological component (such as a nucleic acid, protein or cell) substantially separated from other biological components (such as cell debris, other proteins, nucleic acids or cell types)? , or refined. An "isolated" biological component includes a component purified by standard purification methods.

疾患を予防すること、処置すること、または寛解すること：疾患を「予防すること」は、疾患の完全な発生を阻害することを指す。「処置すること」は、発生が始まった後に、疾患または病的状態の徴候または症状を寛解する治療介入を指す。「寛解すること」は、疾患の徴候または症状の数または重症度を低下させることを指す。 Preventing, treating, or ameliorating a disease: "Preventing" a disease refers to preventing the disease from developing completely. "Treatment" refers to therapeutic intervention that ameliorates the signs or symptoms of a disease or pathological condition after its onset. "Ameliorating" refers to reducing the number or severity of signs or symptoms of a disease.

本明細書で使用される場合、組換え体は一般に、次を指す：組換え核酸またはタンパク質は、天然に存在しない配列を有するものであるか、または２つの別段には分離されている配列のセグメントを人工的に組み合せることにより作製されている配列を有する。この人工的な組合せは多くの場合に、化学合成により、または核酸の単離されたセグメントを人工的に操作することにより、例えば、遺伝子工学技術により達成される。 As used herein, recombinant generally refers to: a recombinant nucleic acid or protein having a non-naturally occurring sequence, or having two otherwise separated sequences; It has a sequence that has been created by artificially combining segments. This artificial combination is often accomplished by chemical synthesis or by artificially manipulating isolated segments of nucleic acids, eg, by genetic engineering techniques.

本明細書で使用される場合、一般に存在する核酸塩基のために次の略語を用いる。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。 As used herein, the following abbreviations are used for commonly occurring nucleobases. "A" refers to adenosine, "C" refers to cytosine, "G" refers to guanosine, "T" refers to thymidine, and "U" refers to uridine.

「白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）」または「白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）」という用語は、本明細書で使用される場合、単球、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球を含む任意の免疫細胞を指す。「リンパ球」という用語は、本明細書で使用される場合、リンパで普通は見い出される細胞を指し、それには、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞、及びＢ細胞が含まれる。上に列挙された免疫細胞の種類をさらなるサブセットに分けることができることは当業者には分かるであろう。 The term "leukocytes" or "white blood cells" as used herein refers to any cells including monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils and lymphocytes. Refers to immune cells. The term "lymphocyte," as used herein, refers to cells normally found in the lymph, including natural killer cells (NK cells), T cells, and B cells. Those skilled in the art will recognize that the types of immune cells listed above can be divided into further subsets.

「腫瘍浸潤白血球」という用語は、本明細書で使用される場合、固形腫瘍に存在する白血球を指す。 The term "tumor-infiltrating leukocytes" as used herein refers to leukocytes present in solid tumors.

「血液試料」という用語は、本明細書で使用される場合、血漿、血液から単離された血液細胞などの血液から調製される任意の試料を指す。 The term "blood sample" as used herein refers to any sample prepared from blood, such as plasma, blood cells isolated from blood.

「精製試料」という用語は、本明細書で使用される場合、１種または複数の細胞サブセットが富化された任意の試料を指す。試料を、サイズ、タンパク質発現などの特徴に基づく細胞の除去または単離により精製することができる。 The term "purified sample" as used herein refers to any sample enriched for one or more cell subsets. A sample can be purified by removal or isolation of cells based on characteristics such as size, protein expression.

薬学的に許容されるビヒクル：本開示で有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９７５）は、１種または複数の治療用組成物、及び追加の医薬品の医薬送達に適切な組成物及び製剤を記載している。 Pharmaceutically Acceptable Vehicles: Pharmaceutically acceptable carriers (vehicles) useful in this disclosure are conventional. Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.M. W. Martin, Mack Publishing Co.; , Easton, Pa. , 15th Edition (1975) describes compositions and formulations suitable for pharmaceutical delivery of one or more therapeutic compositions and additional pharmaceutical agents.

一般に、送達のための適切な担体またはビヒクルの性質は、用いられる特定の投与様式に依存することとなる。例えば、非経口製剤は通常、水、生理学的生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的及び生理学的に許容される液体をビヒクルとして含む注射可能な液体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）では、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含んでよい。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどの少量の非毒性補助物質を含んでよい。 In general, the nature of the appropriate carrier or vehicle for delivery will depend on the particular mode of administration employed. For example, parenteral formulations typically include injectable liquids containing pharmaceutically and physiologically acceptable liquids as vehicles such as water, physiological saline, balanced salt solutions, aqueous dextrose, glycerol and the like. For solid compositions (eg, powder, pill, tablet, or capsule forms), conventional non-toxic solid carriers can include, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, or magnesium stearate. In addition to biologically neutral carriers, pharmaceutical compositions to be administered may contain minor amounts of nontoxic auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, preservatives, and pH buffering agents, for example sodium acetate or sorbitan monolaurate. may contain

一部の実施形態では、組成物は、溶液、懸濁液または他の同様の形態であってもなくても、次のうちの１種または複数を含んでよい：ＤＭＳＯ、注射用水、生理食塩水、好ましくは生理学的生理食塩水などの滅菌希釈剤、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒として役立ち得る合成モノまたはジグリセリドなどの不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調節するための薬剤。 In some embodiments, a composition, whether in solution, suspension, or other similar form, may comprise one or more of the following: DMSO, water for injection, saline. Water, preferably a sterile diluent such as physiological saline, Ringer's solution, isotonic sodium chloride, fixed oils such as synthetic mono- or diglycerides which may serve as solvents or suspending media, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or others. antimicrobials such as benzyl alcohol or methylparaben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates or phosphates and sodium chloride. Or agents to adjust tonicity such as dextrose.

本明細書に記載の組成物及び方法が処置することができる疾患には、ウイルス感染症などの微生物感染症が含まれる。 Diseases that can be treated by the compositions and methods described herein include microbial infections, such as viral infections.

「ウイルス感染症」とは、身体内にウイルスが存在することが原因である感染症を意味する。ウイルス感染症には、宿主に感染して、致命的となるまで長期間、通常は数週間、数か月または数年にわたって宿主の細胞内で増殖することができるウイルス感染症である慢性または持続性ウイルス感染症が含まれる。 By "viral infection" is meant an infection caused by the presence of a virus in the body. Viral infections include chronic or persistent viral infections that can infect a host and multiply within the host's cells for long periods of time, usually weeks, months or years, before becoming fatal. includes sexually transmitted viral infections.

慢性感染症をもたらすウイルスには、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペス、及び他のヘルペスウイルス、Ｂ及びＣ型肝炎のウイルス、さらには、他の肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、及び麻疹ウイルスが含まれ、これらはすべて、重要な臨床的疾患を生じさせ得る。長期感染症は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスの場合であれば、患者にとって致命的である肝臓癌であり得る疾患の誘導に最終的につながり得る。本発明に従って処置することができる他の慢性ウイルス感染症は、本明細書に記載のとおりの不活性な組み換えヌクレオチドベクター／ＶＬＰを転写するための活性化酵素として使用することができるウイルス特異的ポリメラーゼを利用する任意の第Ｖ～ＶＩＩ群ウイルスを含む。 Viruses that cause chronic infections include, for example, human papillomavirus (HPV), herpes simplex and other herpes viruses, hepatitis B and C viruses, as well as other hepatitis viruses, human immunodeficiency virus, and measles virus. , all of which can give rise to significant clinical disease. Long-term infections can ultimately lead to the induction of disease, which in the case of hepatitis C virus, for example, can be liver cancer, which can be fatal to the patient. Other chronic viral infections that can be treated according to the present invention are virus-specific polymerases that can be used as activating enzymes to transcribe inactive recombinant nucleotide vectors/VLPs as described herein. including any Group V-VII virus that utilizes

ある特定の実施形態では、組換え核酸コンストラクト及び複製不全ウイルス様粒子、またはそのようなコンストラクト／粒子を含む組成物を、抗微生物薬、抗ウイルス薬及び／または他の治療薬と同時に投与することができる。別法では、抗微生物薬、抗ウイルス薬及び／または他の治療薬を投与する時間に先立って、コンストラクト／粒子またはそのようなコンストラクト／粒子を含む組成物を、選択された時間に投与することができる。 In certain embodiments, administering the recombinant nucleic acid constructs and replication-deficient virus-like particles, or compositions comprising such constructs/particles, concurrently with antimicrobial agents, antiviral agents, and/or other therapeutic agents can be done. Alternatively, administering the constructs/particles or compositions comprising such constructs/particles at selected times prior to the time of administration of the antimicrobial, antiviral and/or other therapeutic agents. can be done.

抗ウイルス薬には、これに限定されないが、リトナビル、アシクロビル、シドホビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、ジドブジン、リバビリン、及びヒドロキシクロロキンが含まれる。 Antiviral agents include, but are not limited to, ritonavir, acyclovir, cidofovir, ganciclovir, foscarnet, zidovudine, ribavirin, and hydroxychloroquine.

抗ウイルス薬には、次のものなどのＨＩＶ処置がさらに含まれるが、これらに限定されない。 Antiviral agents further include, but are not limited to, HIV treatments such as:

低分子ＨＩＶ融合または侵入阻害薬には：ベビリマット（ＤＳＢ；ＰＡ－４５７）；ビクリビロック、マラビロク（ケモカイン受容体アンタゴニスト」または「ＣＣＲ５阻害薬」）、Ｔ－２０（エンフビルチド、フゼオン、Ｒｏｃｈｅ及びＴｒｉｍｅｒｉｓが開発）、ＴＲＩ－１１４４、及びＴＲＩ－９９９（Ｑｉａｎ， Ｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ． ２００９ Ｍａｒ；２９（２）：３６９－３９３、及びＨａｇｇａｎｉ ａｎｄ Ｔｉｌｔｏｎ， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ． ２０１３ Ｍａｙ；９８（２）： １５８－７０を参照されたい）が含まれる。同様に、抗ＨＩＶｍＡｂの例には、ＣＣＲ５及びＣＤ４に対するものが含まれ、具体的には：イバリズマブ（商品名Ｔｒｏｇａｒｚｏ）は、ＣＤ４に結合する非免疫抑制ヒト化モノクローナル抗体である；ＰＲＯ１４０は、ＣＣＲ５に対して標的化されたヒト化モノクローナル抗体である。 Small molecule HIV fusion or entry inhibitors include: Bevirimat (DSB; PA-457); Vicriviroc, Maraviroc (chemokine receptor antagonists or "CCR5 inhibitors"), T-20 (Enfuvirtide, Fuzeon, developed by Roche and Trimeris) ), TRI-1144, and TRI-999 (Qian, K et al, Med Res Rev. 2009 Mar;29(2):369-393, and Haggani and Tilton, Antiviral Res. 2013 May;98(2):158 -70) are included. Similarly, examples of anti-HIV mAbs include those against CCR5 and CD4, specifically: Ibalizumab (trade name Trogarzo) is a non-immunosuppressive humanized monoclonal antibody that binds to CD4; is a humanized monoclonal antibody targeted against

併用処置のための抗ウイルス薬には、ＨＢＶポリメラーゼ阻害薬、インターフェロン、ＴＬＲ－７アゴニストまたはＴＬＲ－９アゴニストなどのＴＬＲ調節薬、治療用ワクチン、ある特定の細胞ウイルスＲＮＡセンサーの免疫活性化因子、ウイルス侵入阻害薬、ウイルス成熟阻害薬、別個のカプシドアセンブリ調節薬、別個または未知の機構の抗ウイルス化合物のいずれか１つまたはその組合せが含まれ得る。 Antiviral agents for combination treatment include HBV polymerase inhibitors, interferons, TLR modulators such as TLR-7 or TLR-9 agonists, therapeutic vaccines, immune activators of certain cellular viral RNA sensors, Any one or combination of viral entry inhibitors, viral maturation inhibitors, distinct capsid assembly modulators, antiviral compounds of distinct or unknown mechanism may be included.

抗ウイルス薬は、３ＴＣ、ＦＴＣ、Ｌ－ＦＭＡＵ、インターフェロン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン（Ｌ－ｄＴ）、バルトルシタビン（３’－バリニルＬ－ｄＣ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－グアニン（ＤＸＧ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－２，６－ジアミノプリン（ＤＡＰＤ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－６－クロロプリン（ＡＣＰ）、ファムシクロビル、ペンシクロビル、ロブカビル、ガンシクロビル、リバビリン、テノフォビル、ビクテグラビル、エムトリシタビン、ビクタルビ、及びそれらの任意の組合せのうちのいずれか１種またはそれらの組合せであってもよい。 Antiviral drugs include 3TC, FTC, L-FMAU, interferon, adefovir dipivoxil, entecavir, telbivudine (L-dT), vartolcitabine (3'-valinyl L-dC), beta. - D-dioxolanyl-guanine (DXG), beta. - D-dioxolanyl-2,6-diaminopurine (DAPD), beta. - any one or combination of D-dioxolanyl-6-chloropurine (ACP), famciclovir, penciclovir, lobucavir, ganciclovir, ribavirin, tenofovir, victegravir, emtricitabine, bictarbi, and any combination thereof may be

一部の実施形態では、「治療有効量」は、本発明の組換え核酸コンストラクト及び複製不全ウイルス様粒子、またはそのようなコンストラクト／粒子を含む組成物を投与されていない動物または動物群（例えば、２、３、５、１０またはそれ以上の動物）におけるウイルス力価または微生物力価と比べて、組換え核酸コンストラクト及び複製不全ウイルス様粒子、またはそのようなコンストラクト／粒子を含む組成物を投与されて、本明細書に記載の関連方法で処置された対象／患者／動物におけるウイルス力価の少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の減少をもたらす本明細書に記載のとおりの組換え核酸コンストラクト及び複製不全ウイルス様粒子、またはそのようなコンストラクト／粒子を含む組成物の量である。 In some embodiments, a "therapeutically effective amount" is an animal or group of animals that have not been administered the recombinant nucleic acid constructs and replication-defective virus-like particles of the invention, or compositions comprising such constructs/particles (e.g., , 2, 3, 5, 10 or more animals) administered recombinant nucleic acid constructs and replication-defective virus-like particles, or compositions comprising such constructs/particles at least 2.5%, at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 25%, at least 35% of the viral titer in subjects/patients/animals treated with the relevant methods described herein , at least 45%, at least 50%, at least 75%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% of the recombinant nucleic acid constructs and replication-defective virus-like constructs as described herein It is the amount of particles or compositions comprising such constructs/particles.

ウイルスベクター媒介移入の方法の例
ある特定の実施形態では、組換え核酸コンストラクトを、細胞への遺伝子移入を媒介するためのウイルス様粒子（自己複製するその能力を欠いている）に組み込む。典型的には、ウイルスを単純に、ウイルスの取り込みを可能にする生理的条件下で、適切な宿主細胞に暴露する（米国特許第９，０８９，５２０号を参照されたい）。組換えコンストラクトを下で論述するとおりの所望の細胞標的に送達するために、本方法は、様々なウイルスベクターまたはウイルス様粒子を利用するように適合させることができ、不全、または非複製ＶＬＰであるように最適化されているアデノウイルスベクターシステムを含む。 Examples of Viral Vector-Mediated Transfer Methods In certain embodiments, recombinant nucleic acid constructs are incorporated into virus-like particles (lacking their ability to self-replicate) to mediate gene transfer into cells. Typically, the virus is simply exposed to a suitable host cell under physiological conditions that allow uptake of the virus (see US Pat. No. 9,089,520). To deliver the recombinant construct to the desired cellular target as discussed below, the method can be adapted to utilize a variety of viral vectors or virus-like particles, defective, or non-replicating VLPs. including an adenoviral vector system that has been optimized for

１．アデノウイルス
アデノウイルスは、その中規模ＤＮＡゲノム、操作の容易さ、高い力価、広い標的細胞幅、及び高い感染力により、遺伝子移入ベクターとして使用するために特に適切である。およそ３６ｋｂウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なシス作用性要素がその中に含まれる１００～２００塩基対（ｂｐ）末端逆位配列（ＩＴＲ）と境を接している。異なる転写ユニットを含有するゲノムの初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により区分される。 1. Adenoviruses Adenoviruses are particularly suitable for use as gene transfer vectors because of their medium-sized DNA genome, ease of manipulation, high titers, broad target cell width, and high infectivity. The approximately 36 kb viral genome is bounded by 100-200 base pair (bp) inverted terminal repeats (ITRs) within which are contained the cis-acting elements required for viral DNA replication and packaging. The early (E) and late (L) regions of the genome containing different transcription units are separated by the initiation of viral DNA replication.

Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノム及びいくつかの細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、及び宿主細胞シャット・オフに関係する（Ｒｅｎａｎ， Ｍ． Ｊ． （１９９０） Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ．， １９， １９７－２１８）。大部分のウイルスカプシドタンパク質を含む後期遺伝子（ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によりもたらされる単一一次転写物の重要なプロセシングの後に初めて発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は、感染の後期相の間に特に有効であり、このプロモーターからもたらされるｍＲＮＡはすべて、翻訳についてそれらを有用にする５’三分節リーダー（ＴＬ）配列を持つ。 The E1 regions (E1A and E1B) encode proteins responsible for regulation of transcription of the viral genome and several cellular genes. Expression of the E2 regions (E2A and E2B) leads to synthesis of proteins for viral DNA replication. These proteins are involved in DNA replication, late gene expression, and host cell shut-off (Renan, MJ (1990) Radiother Oncol., 19, 197-218). The products of the late genes (LI, L2, L3, L4 and L5), which contain most of the viral capsid proteins, are expressed only after critical processing of a single primary transcript driven by the major late promoter (MLP). . The MLP (located at 16.8 map units) is particularly effective during the late phase of infection and all mRNAs driven from this promoter have a 5' tripartite leader (TL) sequence that makes them useful for translation. have.

ある特定の事例では、大きなＤＮＡのセグメントを含ませることができるので、ＡＡＶの運搬能を最大化することが役立ち得る。ある特定のアデノウイルス産物と関連する毒性及び免疫反応を低下させることも非常に望ましい。これら２つの目標は、アデノウイルス遺伝子の排除が両方の目的に役立つことにおいて、ある程度、同一延長にある。 In certain cases, it may be helpful to maximize the carrying capacity of AAV since it can contain large segments of DNA. It is also highly desirable to reduce the toxicity and immune response associated with certain adenoviral products. These two goals are to some extent cognate in that elimination of adenoviral genes serves both ends.

ウイルスＤＮＡ複製のために必要とされるシス要素はすべて、線状ウイルスゲノムのいずれかの末端にある末端逆位配列（ＩＴＲ）（１００～２００ｂｐ）に局在するので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含有するプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下で複製し得る（Ｈａｙ， Ｒ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８４ Ｊｕｎ． ５；１７５（４）：４９３－５１０）。したがって、これらの要素のアデノウイルスベクターからの欠失は、独立した複製を防ぐこととなる。 All cis elements required for viral DNA replication are localized to inverted terminal repeats (ITRs) (100-200 bp) at either end of the filamentous viral genome, allowing large displacements of DNA is. Plasmids containing ITRs can replicate in the presence of non-defective adenoviruses (Hay, R. T., et al., J Mol. Biol. 1984 Jun. 5;175(4):493-510). Deletion of these elements from the adenoviral vector therefore prevents independent replication.

加えて、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４～３８５ｂｐ（０．５～１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． （１９８７） Ｖｉｒｏｌ．， ６７， ２５５５－２５５８）。このシグナルは、左端に近いが付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０～１．２５マップ単位）断片が２９３細胞においてパッケージングを指示し得ることを実証している（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １０１：１９５－２０２， １９９１）。 In addition, the packaging signal for viral encapsulation is localized to the leftmost 194-385 bp (0.5-1.1 map units) of the viral genome (Hearing et al., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558). This signal mimics the protein recognition site in bacteriophage lambda DNA where a specific sequence near the left end but outside the sticky end sequence mediates binding to proteins required for insertion of the DNA into the head structure. is doing. Ad E1 replacement vectors demonstrate that the leftmost 450 bp (0-1.25 map unit) fragment of the viral genome can direct packaging in 293 cells (Levrero et al., Gene, 101:195). -202, 1991).

以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳類細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示されている。これらの細胞系は、その細胞系によりコードされる、アデノウイルス機能を欠いたアデノウイルスベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスまたは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する。 It has previously been shown that certain regions of the adenoviral genome can integrate into the genome of mammalian cells, thereby allowing the encoded genes to be expressed. These cell lines are capable of supporting replication of adenoviral vectors lacking adenoviral function encoded by the cell line. There are also reports of complementation of replication-defective adenoviral vectors by "assistant" vectors, eg, wild-type virus or conditionally defective mutants.

ＶＬＰ／複製欠損性アデノウイルスベクターをインビトロで生成するために、これらの欠損性ベクターをヘルパーウイルスによりトランスで補完することができる。しかしながら、これは、複製欠損性ベクターの単離を可能にするものではなく、しかしながら、それというのも、複製機能を提供するために必要とされるヘルパーウイルスの存在が、何らかの調製物を汚染するであろうためである。したがって、特異性を複製欠損性ベクターの複製及び／またはパッケージングに加えるであろう追加の要素が必要とされる。その要素は、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。 These defective vectors can be complemented in trans with a helper virus to generate VLP/replication-defective adenoviral vectors in vitro. However, this does not allow the isolation of replication-defective vectors, since the presence of helper viruses required to provide replication functions contaminates any preparation. Because it will be. Therefore, additional elements are required that will add specificity to the replication and/or packaging of replication-defective vectors. Its elements are derived from the packaging function of adenovirus.

アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが判明している（Ｔｉｂｂｅｔｔｓ ｅｔ． ａｌ． （１９７７） Ｃｅｌｌ， １２， ２４３－２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４～３５８ｂｐ）領域に欠失を有する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞系においてさえ不十分にしか成長しないことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ， （１９８３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６７， ８０９－８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイルスＤＮＡ（０～３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイルスは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短い反復性の位置依存性要素が同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５ ＤＮＡ分子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． （１９８７） Ｖｉｒｏｌ．， ６７， ２５５５－２５５８）。 The packaging signal for adenovirus has been found to lie at the left end of the conventional adenovirus map (Tibbetts et. al. (1977) Cell, 12, 243-249). Later studies showed that mutants with deletions in the E1A (194-358 bp) region of the genome grew poorly even in cell lines that complemented the early (E1A) function (Hearing and Shenk , (1983) J. Mol. Biol. 167, 809-822). When compensating adenoviral DNA (0-353 bp) was recombined at the right end of the mutant, the virus was successfully packaged. Further mutational analysis identified a short, repetitive, position-dependent element at the left end of the Ad5 genome. It was found that one copy of the repeat is sufficient for efficient packaging when present at either end of the genome, but not when moved towards the inside of the Ad5 DNA molecule. (Hearing et al., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558).

パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することにより、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。典型的には、変異は、点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細胞内で成長させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとしてもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、これらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含有するウイルスと共に細胞内で成長させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先的に認識される。パッケージング因子の量が限られていることを考慮すると、野生型シグナルを含有するウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分大きい場合、均質に近い系統が達成され得る。 By using mutated versions of the packaging signal, it is possible to generate helper viruses that package with varying efficiencies. Typically mutations are point mutations or deletions. When a helper virus with a low packaging efficiency is grown in a helper cell, the virus is packaged, albeit at a lower rate than the wild-type virus, thereby allowing helper propagation. However, when these helper viruses are grown intracellularly with viruses containing the wild-type packaging signal, the wild-type packaging signal is preferentially recognized over the mutated version. Given the limited amount of packaging factors, viruses containing wild-type signals are selectively packaged compared to helpers. If the preferences are large enough, a nearly homogeneous lineage can be achieved.

特定の組織または種に対するＡＤＶコンストラクトの指向性を改善するために、受容体結合ファイバー配列は多くの場合に、アデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウイルス５において見出されたコクサッキー－アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）リガンドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。生じた「偽型」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となっている。さらに、標的細胞に対してウイルスを再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配列に結合する）の使用、及びカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。別法では、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二官能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によりアデノビリオンに付着することができる。 To improve the tropism of ADV constructs to particular tissues or species, receptor-binding fiber sequences can often be substituted among adenovirus isolates. For example, the coxsackie-adenovirus receptor (CAR) ligand found in adenovirus 5 was substituted for the CD46-binding fiber sequence from adenovirus 35 and greatly improved binding affinity to human hematopoietic cells. Viruses can be produced. The resulting "pseudotyped" virus, Ad5f35, is the basis for several clinically developed virus isolates. In addition, there are various biochemical methods of modifying the fibers that allow retargeting of the virus to target cells. The method involves the use of a bifunctional antibody (one end that binds the CAR ligand and the other end that binds the target sequence) and a fiber that allows association with a customized avidin-based chimeric ligand. Includes metabolic biotinylation. Alternatively, a ligand (eg, anti-CD205) can be attached to adenovirion via a heterobifunctional linker (eg, containing PEG).

２．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスにより感染細胞において二本鎖ＤＮＡに変換する能力により特徴づけられる一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ， （１９９０） Ｉｎ： Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ｅｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １４３７－１５００）。次いで、生じたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞及びその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、それぞれカプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素及びエンベロープ構成要素をコードする３つの遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、ｇａｇ遺伝子から上流に見い出される配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’及び３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列及びエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ， １９９０）。 2. Retroviruses Retroviruses are a group of single-stranded RNA viruses characterized by their ability to convert their RNA into double-stranded DNA in infected cells by a process of reverse transcription (Coffin, (1990) In: Virology, ed. , New York: Raven Press, pp. 1437-1500). The resulting DNA then stably integrates into cellular chromosomes as a provirus and directs synthesis of viral proteins. The integration retains the viral gene sequences in the recipient cell and its progeny. The retroviral genome contains three genes gag, pol and env, which encode capsid proteins, polymerase enzymes and envelope components, respectively. A sequence found upstream from the gag gene, called psi, functions as a signal for packaging of the genome into virions. Two long terminal repeat (LTR) sequences are present at the 5' and 3' ends of the viral genome. They contain strong promoter and enhancer sequences and are also required for integration into the host cell genome (Coffin, 1990).

レトロウイルスベクターをコンストラクトするために、プロモーターをコードする核酸を、ウイルスゲノム内のある特定のウイルス配列の位置に挿入して、複製欠損性であるウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲ及びｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞系をコンストラクトする（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８３） Ｃｅｌｌ， ３３， １５３－１５９）。ヒトｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを、レトロウイルスＬＴＲ配列及びｐｓｉ配列と一緒に、この細胞系に導入するとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いで、それを培養培地中に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ， Ｊ． Ｆ．， ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ， Ｊ． Ｌ． Ｒ．， （１９８８） Ｉｎ： Ｖｅｃｔｏｒｓ： ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ， Ｅｄｓ．）． Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｉｎ： Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ （ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １４９－１８８；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、任意選択で濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くの種類のレトロウイルスの組み込み及び安定な発現は、宿主細胞の***を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， （１９７５） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６７， ２４２－２４８）。レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計されたアプローチが、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれることがある。 To construct a retroviral vector, a nucleic acid encoding a promoter is inserted into the viral genome at a specific viral sequence to generate a virus that is replication defective. To produce virions, a packaging cell line is constructed that contains the gag, pol and env genes but lacks the LTR and psi components (Mann et al., (1983) Cell, 33, 153-159). When a recombinant plasmid containing human cDNA is introduced into this cell line together with the retroviral LTR sequence and the psi sequence (eg, by calcium phosphate precipitation), the psi sequence will convert the RNA transcript of the recombinant plasmid into packaging into viral particles, which are then secreted into the culture medium (Nicolas, JF, and Rubenstein, JLR, (1988) In: Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Rodriquez and Denhardt, Eds.). Nicolas and Rubenstein; Temin et al. , (1986) In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188; Mann et al. , 1983). Medium containing the recombinant retrovirus is collected, optionally concentrated, and used for gene transfer. Retroviral vectors are capable of infecting a wide variety of cell types. However, integration and stable expression of many types of retroviruses require host cell division (Paskind et al., (1975) Virology, 67, 242-248). An approach designed to allow specific targeting of retroviral vectors has recently been developed based on chemical modification of retroviruses by chemical addition of galactose residues to the viral envelope. This modification may be desired to allow specific infection of cells such as hepatocytes via the asialoglycoprotein receptor.

組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、そのアプローチでは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体及び特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体を使用した。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによりビオチン構成要素を介して結合された（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， ９０７９－９０８３）。主要組織適合性複合体クラスＩ及びクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それらの表面抗原を有する様々なヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感染することが実証された（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。 A different approach to targeting recombinant retroviruses has been designed using biotinylated antibodies against retroviral envelope proteins and biotinylated antibodies against specific cellular receptors. The antibodies were conjugated via the biotin component by using streptavidin (Roux et al., (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 9079-9083). Using antibodies against major histocompatibility complex class I and class II antigens, it was demonstrated that a variety of human cells bearing their surface antigens were infected with ecotropic viruses in vitro (Roux et al., 1989). ).

３．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対の線状一本鎖ＤＮＡを利用する。末端逆位反復配列は、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ－１、ＶＰ－２及びＶＰ－３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１種または複数は、ＡＡＶ転写のトランス活性化を担う。 3. Adeno-associated virus AAV utilizes a linear single-stranded DNA of approximately 4700 base pairs. Terminal inverted repeats flank the genome. Two genes are present in the genome and give rise to several different gene products. First, the cap gene produces three different virion proteins (VP), named VP-1, VP-2 and VP-3. Second, the rep gene encodes four nonstructural proteins (NS). One or more of these rep gene products are responsible for transactivating AAV transcription.

ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置により、マップ単位で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９及びｐ４０である。転写により、６つの転写物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の一方がスプライシングされる。マップ単位４２～４６に由来するスプライス部位は、各転写物で同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写物に由来するとみられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写物から生じる。 The three promoters in AAV are named map by map according to their position in the genome. These are, from left to right, p5, p19 and p40. Transcription gives rise to six transcripts, two initiated at each of the three promoters and one of each pair spliced. The splice sites derived from map units 42-46 are the same for each transcript. Four nonstructural proteins appear to be derived from longer transcripts, and all three virion proteins arise from the smallest transcript.

ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩ及びＩＩ、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウイルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると示されている。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現は、ＡＡＶ構造発現を抑制すると考えられており、ヘルパーウイルス感染は、この阻止を排除すると考えられている。 AAV is not associated with any pathological conditions in humans. Interestingly, for efficient replication, AAV requires "helper" functions from viruses such as herpes simplex virus I and II, cytomegalovirus, pseudorabies virus, and of course adenovirus. . The best-characterized of these helpers is adenovirus, and many "early" functions for this virus have been shown to support AAV replication. Low-level expression of AAV rep proteins is thought to repress AAV structural expression, and helper virus infection is thought to eliminate this block.

ＡＡＶベクターの末端反復配列は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化により（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６１：３０９６－３１０１ （１９８７））またはこれに限定されないが、ＡＡＶの公開配列に基づく末端反復配列の化学的合成もしくは酵素的合成を含む他の方法により得ることができる。それは、例えば、機能、すなわち安定した部位特異的な組み込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分析により決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端反復配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを決定することもできる。 The terminal repeats of AAV vectors are generated by restriction endonuclease digestion of plasmids such as p201 containing the AAV or modified AAV genome (Samulski et al., J. Virol., 61:3096-3101 (1987)) or by It can be obtained by other methods including, but not limited to, chemical or enzymatic synthesis of terminal repeats based on the published sequence of AAV. It is possible, for example, to determine the minimal sequence or part of the AAV ITRs required to allow function, ie stable site-specific integration, by deletion analysis. It can also be determined which minor modifications of the sequence can be tolerated while maintaining the ability of the terminal repeats to direct stable site-specific integration.

ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発中であり、エキソビボとインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段階及び臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ， （１９９５） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７７０；７９－９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊｅｅ， ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７７０， ７９－９０；Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０， ３２２７－３２３４；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０， ５２０－５３２；Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， １０６１３－１０６１７， （１９９３）；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４）， Ｂｌｏｏｄ， ８４， １４９２－１５００；Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｎａｔ’ｌ Ｇｅｎｅｔ．， ８， １４８－１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ， Ｍ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ． １９９６ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；６２（６）： １６６９－７６；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３， １４０８２－１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４， １４２６－１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２１７， １２４－１３０）。 AAV-based vectors have proven to be safe and effective vehicles for gene delivery in vitro, and these vectors are under development and have broad applications in potential gene therapy both ex vivo and in vivo. (Carter and Flotte, (1995) Ann. NY Acad. Sci., 770; 79-90; Chatteijee, et al., (1995) Ann., NY Acad., Sci., 770, 79-90;Ferrari et al., (1996) J. Virol., 70, 3227-3234; Flotte et al., Proc.Nat'l Acad.Sci.USA, 90, 10613-10617, (1993);Goodman et al.(1994), Blood, 84, 1492-1500; , (1994) Nat'l Genet., 8, 148-153; Kaplitt, M. G., et al., Ann Thorac Surg. 1996) Proc.Nat'l Acad.Sci.USA, 93, 14082-14087;Koeberl et al., (1997) Proc.Nat'l Acad.Sci.USA, 94,1426-1431; 1996) Virology, 217, 124-130).

肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入及び発現は、嚢胞性線維症の処置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ， １９９５；Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， １０６１３－１０６１７， （１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、及び潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、これらの器官におけるＡＡＶ媒介導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示されたので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０， ５２０－５３２；Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３；Ｋａｐｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４；１９９６；Ｋｏｅｂｅｒｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７；ＭｃＣｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．， ７１３， ９９－１０７；Ｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ３， ２２５－２２８；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０， ８０９８－８１０８）。 AAV-mediated efficient gene transfer and expression in the lung has led to clinical trials for the treatment of cystic fibrosis (Carter and Flotte, 1995; Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90, 10613-10617, (1993)). Similarly, treatment of muscular dystrophy by AAV-mediated gene delivery of the dystrophin gene to skeletal muscle, treatment of Parkinson's disease by tyrosine hydroxylase gene delivery to the brain, treatment of hemophilia B by factor IX gene delivery to the liver, and Potentially, the prospect of treating myocardial infarction with the vascular endothelial growth factor gene to the heart appears promising, as AAV-mediated transgene expression in these organs has recently been shown to be highly efficient ( Fisher et al., (1996) J. Virol., 70, 520-532; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994; 1996; Brain Res., 713, 99-107; Ping et al., (1996) Microcirculation, 3, 225-228; Xiao et al., (1996) J. Virol., 70, 8098-8108).

肝臓指向遺伝子治療と関連する課題は、肝細胞の効率的な標的化、ベクターゲノムの安定性、及び高レベルの発現の持続である。これらの障害の多くをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子移入で克服することができる。インビボ使用のために開発された第１のＡＡＶ遺伝子移入ベクターは、ＡＡＶ２血清型に基づいた。ＡＡＶ２は幅広い指向性を有し、インビボで相対的に効率的に、肝細胞を含む多くの細胞型に形質導入する。カプシドタンパク質は血清プロファイルを付与し、少なくとも１２の霊長類ＡＡＶ血清型が既に特徴づけられている。重要なことに、種々のカプシドタンパク質での組み換えＡＡＶベクターの偽型化により、指向性が劇的に変化し得る。ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は両方とも、肝細胞について、ＡＡＶ２と比較した場合に、より高い親和性を有する。特に、ＡＡＶ８は、ＡＡＶ２と比較した場合に、３～４倍多く肝細胞を形質導入することができ、形質導入される細胞１個あたり３～４倍多いゲノムを送達する（Ｍａｒｋ Ｓ． Ｓａｎｄｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０１１；８０７： １４１－１５７を参照されたい）。用量に応じて、ＡＡＶ８は、門脈内静脈注射後に、マウス肝臓中の肝細胞のうちの最高９０～９５％を形質導入することができる。興味深いことに、静脈内注射の後に、匹敵するレベルの形質導入を達成することができる。ＡＡＶベクターの直接的な実質内注射も、相対的に高レベルで長期間の発現を媒介する。ＡＡＶ８カプシドタンパク質と併せて肝臓特異的プロモーターを使用することにより、追加の特異性を付与することができる。原発性肝細胞障害を処置することに加えて、肝臓クッパー細胞の固定組織マクロファージを回避すること、及び発現を肝細胞に限定することにより、導入遺伝子産物に対する免疫反応を最小化することができる。ＡＡＶ血清型及び肝臓特異的プロモーターの使用により、肝細胞を標的化することができることで、新規の治療アプローチの試験が可能となる。 Challenges associated with liver-directed gene therapy are efficient targeting of hepatocytes, vector genome stability, and sustained high levels of expression. Many of these obstacles can be overcome with adeno-associated virus (AAV) gene transfer. The first AAV gene transfer vectors developed for in vivo use were based on the AAV2 serotype. AAV2 has broad tropism and transduces many cell types, including hepatocytes, with relative efficiency in vivo. The capsid protein confers a seroprofile and at least 12 primate AAV serotypes have been characterized. Importantly, pseudotyping of recombinant AAV vectors with different capsid proteins can dramatically alter tropism. Both AAV8 and AAV9 have higher affinity for hepatocytes when compared to AAV2. In particular, AAV8 can transduce 3-4 times more hepatocytes when compared to AAV2, delivering 3-4 times more genome per transduced cell (Mark S. Sands, Methods Mol. Biol. 2011;807: 141-157). Depending on the dose, AAV8 can transduce up to 90-95% of the hepatocytes in the mouse liver after intraportal vein injection. Interestingly, comparable levels of transduction can be achieved after intravenous injection. Direct intraparenchymal injection of AAV vectors also mediates relatively high levels and long-term expression. Additional specificity can be conferred by using a liver-specific promoter in conjunction with the AAV8 capsid protein. In addition to treating primary hepatocellular injury, immune responses to the transgene product can be minimized by avoiding fixed tissue macrophages in liver Kupffer cells and restricting expression to hepatocytes. The ability to target hepatocytes through the use of AAV serotypes and liver-specific promoters allows testing of novel therapeutic approaches.

４．レンチウイルスベクター
ある特定の実施形態では、電気穿孔により、または核酸、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ、自己複製ＲＮＡウイルスもしくは組込み欠損性レンチウイルスベクター（そのようなベクターについては、米国特許第１０，１３１，８７６号を参照されたい）のトランスフェクションにより、組換え核酸または複製不全ＶＬＰを標的細胞に形質導入する。 4. Lentiviral Vectors In certain embodiments, electroporation or nucleic acid, protein, site-specific nuclease, self-replicating RNA virus or integration-deficient lentiviral vectors (for such vectors see US Pat. No. 10,131, 876) to transduce target cells with recombinant nucleic acids or replication-deficient VLPs.

ある特定の実施形態では、レンチウイルス、ガンマ－、アルファ－レトロウイルスもしくはアデノウイルスを用いて、または核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル、ＯＤＮ）、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰ／Ｒ）、自己複製ＲＮＡウイルス（例えば、ウマ脳症ウイルス）もしくは組込み欠損性レンチウイルスベクターによる電気穿孔もしくはトランスフェクションを用いて、形質導入を行う。 In certain embodiments, using lentiviruses, gamma-, alpha-retroviruses or adenoviruses, or nucleic acids (DNA, mRNA, miRNA, antagomir, ODN), proteins, site-specific nucleases (zinc finger nucleases, TALEN , CRISP/R), self-replicating RNA viruses (eg, equine encephalopathy virus) or integration-deficient lentiviral vectors using electroporation or transfection.

さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターで前記細胞を形質導入することにより、組換え核酸または複製不全ＶＬＰの送達を行うことができる（Ｃｏｃｋｒｅｌｌ Ａｄａｍ Ｓ ｅｔ ａｌ．， “Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ３６， Ｎｏ． ３， Ｊｕｌ． ２００７．を参照されたい）。 In a further embodiment, delivery of recombinant nucleic acids or replication-defective VLPs can be achieved by transducing said cells with a lentiviral vector (Cockrell Adam S et al., "Gene delivery by lentivirus vectors", Molecular Biotechnology , vol.36, No. 3, Jul. 2007.).

ＶＳＶＧ偽型を伴うレンチウイルスベクターは、自動製造方法下での効率的な形質導入を可能にする。しかしながら、本方法は、任意の種類のレンチウイルスベクター（例えば、麻疹ウイルス（ＭＬ－ＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、ヒヒ内在性レトロウイルス（ＢａＥＶ）誘導偽型エンベロープを用いる）の使用に全く適している。ガンマまたはアルファレトロウイルスベクターなどの他のウイルスベクターを使用することもできる。本発明に記載の自動製剤を使用することが必要な場合には、形質導入促進試薬を添加することができる。 Lentiviral vectors with VSVG pseudotypes allow efficient transduction under automated manufacturing methods. However, the method can be used with any type of lentiviral vector (e.g., measles virus (ML-LV), gibbon leukemia virus (GALV), feline endogenous retrovirus (RD114), baboon endogenous retrovirus (BaEV)-induced pseudovirus). (using a mold envelope). Other viral vectors such as gamma or alpha retroviral vectors can also be used. Transduction-enhancing reagents can be added if desired to use the automated formulation according to the present invention.

５．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本方法及び組成物において発現コンストラクトとして用いることができる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ， （１９８８） Ｉｎ： Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ， ｐｐ． ４６７－４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ， （１９８６） Ｉｎ， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， ｐｐ． １１７－１４８；Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ６８：１－１０， １９８８）カナリアポックスウイルス及びヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳類細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。 5. Other Viral Vectors Other viral vectors can also be used as expression constructs in the present methods and compositions. Vaccinia virus (Ridgeway, (1988) In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, pp. 467-492; Baichwal and Sugden, (1986) In, Gene Transfer. , Gene, 68:1-10, 1988) vectors derived from viruses such as canarypox virus and herpes virus are used. These viruses offer several features for use in gene transfer into various mammalian cells.

疾患を処置するための方法
本方法は、組換え核酸、ＶＬＰ生成物、または医薬組成物の投与を様々な有効量で送達することができる、ウイルス疾患または状態を処置または予防する方法も包含する。 Methods for Treating Diseases The present methods also encompass methods of treating or preventing viral diseases or conditions in which administration of recombinant nucleic acids, VLP products, or pharmaceutical compositions can be delivered in various effective amounts. .

「単位用量」という用語は、それが接種源に関するとき、哺乳類のための単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、その際、各単位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫刺激効果をもたらすと計算された所定の量の医薬組成物を含有する。接種源の単位用量に対する詳述は、医薬組成物の固有の特徴及び達成されるべき特定の免疫学的効果により規定され、それらに依存する。 The term "unit dose" when it relates to an inoculum refers to a physically discrete unit suitable as a unit dosage for mammals, each unit containing the desired diluent, together with the required diluent. containing a predetermined amount of the pharmaceutical composition calculated to provide an immunostimulatory effect of The specifics for the unit dose of inoculum are dictated by and depend on the specific characteristics of the pharmaceutical composition and the particular immunological effect to be achieved.

組換え核酸、ＶＬＰ生成物またはその医薬組成物の有効量は、ウイルス感染した細胞、例えば、ＨＢＶ、Ｃｏｖｉｄ－１９などに感染した細胞６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９７％超が死滅するような量であろう。この用語は、「十分な量」とも同義である。 An effective amount of the recombinant nucleic acid, VLP product or pharmaceutical composition thereof is virally infected cells, such as cells infected with HBV, Covid-19, etc. % or greater than 97% kill. The term is also synonymous with "a sufficient amount."

任意の特定の用途での有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、対象の体格、及び／または疾患もしくは状態の重症度などの因子に応じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定され得る。 Effective amounts for any particular use may vary depending on factors such as the disease or condition being treated, the particular composition being administered, the size of the subject, and/or the severity of the disease or condition. The effective amount of a particular composition presented herein can be determined empirically without necessitating undue experimentation.

「接触させる」及び「曝露させる」という用語は、細胞、組織または生体に適用されるとき、医薬組成物及び／または別の薬剤、例えば、抗ウイルス薬などが、標的細胞、組織もしくは生体に送達されるプロセス、または標的細胞、組織もしくは生体のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書において使用される。細胞の死滅または静止を達成するために、組換え核酸、ＶＬＰ生成物またはその医薬組成物、及び／または追加の薬剤（複数可）を、ウイルス感染細胞（複数可）を死滅させるのに有効であるか、またはそれらの細胞の***を防ぐのに有効な合計量で１つまたは複数の細胞に送達する。組換え核酸、ＶＬＰ生成物、または医薬組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の薬剤（複数可）より先に行われ得る、他の薬剤（複数可）と同時であり得る、及び／または他の薬剤（複数可）の後に行われ得る。医薬組成物及び他の薬剤（複数可）が別々に細胞、組織または生体に適用される実施形態では、その医薬組成物及び薬剤（複数可）がなおも、有利に組み合わされた効果をその細胞、組織または生体に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが一般に保証されるであろう。例えば、そうした場合には、２、３、４つまたはそれより多くの様式を用いて、細胞、組織または生体を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）医薬組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様では、１種または複数の薬剤を、組換え核酸、ＶＬＰ、または医薬製品を投与する前及び／または投与した後に、実質的に同時に、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１～約８週間またはそれより長くまで、及びそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与してもよい。またさらに、本明細書において提示される医薬組成物と、１種または複数の薬剤との様々な併用レジメンを用いてよい。 The terms "contact" and "expose" when applied to a cell, tissue or organism refer to the delivery of the pharmaceutical composition and/or another agent, such as an antiviral agent, to the target cell, tissue or organism. It is used herein to describe a process that is carried out or placed in close proximity to a target cell, tissue or organism. To achieve cell killing or stasis, the recombinant nucleic acid, VLP product or pharmaceutical composition thereof, and/or additional agent(s) are effective to kill the virus-infected cell(s). or delivered to one or more cells in a total amount effective to prevent those cells from dividing. Administration of the recombinant nucleic acid, VLP product, or pharmaceutical composition is concurrent with the other agent(s), which can precede the other agent(s) by intervals ranging from minutes to weeks. and/or may be followed by other drug(s). In embodiments in which the pharmaceutical composition and other agent(s) are applied separately to a cell, tissue or organism, the pharmaceutical composition and agent(s) still advantageously exert the combined effect on the cell. , tissue or organism, it will generally be ensured that the effective time does not expire between each delivery point. For example, in such cases, 2, 3, 4 or more modalities may be used to substantially simultaneously (i.e., within less than about 1 minute) contact the cell, tissue or organism with the pharmaceutical composition. It is contemplated that In other aspects, the one or more agents are administered substantially simultaneously, within about 1 minute, to about 24 hours, about 7 hours prior to and/or after administration of the recombinant nucleic acid, VLP, or pharmaceutical product. For days, from about 1 to about 8 weeks or longer, and any derivable range therein. Furthermore, various combination regimens of the pharmaceutical compositions presented herein with one or more agents may be used.

患者に投与するための製剤及び経路
臨床適用が企図される場合、医薬組成物（発現コンストラクト、発現ベクター、融合タンパク質、トランスフェクトまたは形質導入された細胞）を、意図される用途に適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴うであろう。 Formulations and Routes for Administration to Patients When intended for clinical application, the pharmaceutical compositions (expression constructs, expression vectors, fusion proteins, transfected or transduced cells) are prepared in a form suitable for the intended use. may need to be prepared. Generally, this will involve preparing compositions that are essentially free of pyrogens and other impurities that could be harmful to humans or animals.

組換え核酸、ＶＬＰ生成物またはその医薬組成物を例えば、１用量あたり約１～５００万粒子の用量で送達することができる。生成物を例えば、バイアル１本あたり約０．２５ｍｌ～約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含有するバイアルまたは他の容器を提供することができる。 Recombinant nucleic acids, VLP products or pharmaceutical compositions thereof can be delivered, for example, in doses of about 1-5 million particles per dose. The product is for example about 0.25 ml to about 10 ml per vial, eg about 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4. Provide a vial or other container containing 5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 or 10 ml, for example about 2 ml, in volume can do.

組換え核酸またはＶＬＰ生成物を患者に導入するときに、適切な塩及び緩衝剤を用いることが一般に望ましいことがある。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与するときに不利か、アレルギー性か、または他の有害な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体には、あらゆるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は既知である。任意の従来の媒体または薬剤がベクターまたは細胞と不適合ではない限り、治療用組成物におけるその使用が企図される。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。 When introducing recombinant nucleic acids or VLP products into patients, it may generally be desirable to use appropriate salts and buffers. The phrase "pharmaceutically or pharmacologically acceptable" refers to molecular entities and compositions that do not produce an adverse, allergenic, or other untoward reaction when administered to an animal or human. Pharmaceutically acceptable carriers include any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is known. Insofar as any conventional media or agent is incompatible with the vector or cells, its use in therapeutic compositions is contemplated. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions.

製剤化されたら、溶液を、投与製剤に適合した様式で、及び治療上有効であるような量で投与することとなる。それらの製剤は、注射用液剤、薬物放出カプセル剤などの様々な剤形で容易に投与される。例えば、水性液剤での非経口投与では、その液剤は、必要な場合には適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にされ得る。これらの特定の水性液剤は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒体を使用することができる。例えば、１投与量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に加えることができるか、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。処置されている対象の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与を担う者が、個々の対象に対する適切な用量を決定することとなる。さらに、ヒトへの投与では、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準により要求されるとおりの無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性及び純度の基準を満たし得る。 Upon formulation, solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in such amount as is therapeutically effective. These formulations are easily administered in various dosage forms such as injectable solutions, drug release capsules and the like. For parenteral administration in an aqueous solution, for example, the solution can be suitably buffered if necessary and the liquid diluent first rendered isotonic with sufficient saline or glucose. These particular aqueous solutions are especially suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration. In this context, sterile aqueous media can be used. For example, one dose can be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and added to 1000 ml of subcutaneous injection or injected at the proposed site of infusion (see, for example, "Remington's Pharmaceutical Sciences 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). Some variation in dosage will necessarily occur depending on the condition of the subject being treated. In any event, the person responsible for administration will decide the appropriate dose for each individual subject. Moreover, for human administration, preparations may meet sterility, pyrogenicity and general safety and purity standards as required by FDA Office of Biologics standards.

組成物を、対象にエアロゾル化送達するために製剤化することができる。エアロゾル送達では、記載の組成物を水などの水溶液中で、またはハンクス液、リンゲル液、または生理学的生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化することができる。溶液は、懸濁剤、安定化剤または分散剤などの１種または複数の製剤用薬剤を含有してよい。 The composition can be formulated for aerosolized delivery to a subject. For aerosol delivery, the described compositions can be formulated in aqueous solutions such as water, or in physiologically compatible buffers such as Hank's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer. The solution may contain one or more formulating agents such as suspending, stabilizing or dispersing agents.

本開示のポリヌクレオチドを対象の所望の細胞に送達する本開示の送達系は、本開示のＶＬＰに限定されない。一部の実施形態では、送達ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、リポソーム、ナノ粒子、ミセル、ポリマーベシクルまたはポリマーソームを含む。 The delivery systems of this disclosure that deliver polynucleotides of this disclosure to desired cells of a subject are not limited to VLPs of this disclosure. In some embodiments, delivery vectors comprise adeno-associated virus (AAV) vectors, liposomes, nanoparticles, micelles, polymeric vesicles or polymersomes.

一部の実施形態では、送達ベクターは、ＡＡＶに由来するベクターを含む。ＡＡＶベクターは、遺伝子治療のために最も頻繁に使用されるベクターの１つである。ＡＡＶは、小さな非エンベロープＩＩ群ウイルスであり、そのゲノムは、１つの長い一本鎖ＤＮＡ分子でコードされる。ＡＡＶ由来ベクターは、標的細胞に付着及び侵入し、遺伝物質を核に移入する能力を有し、かつその情報を一般的に毒性を伴わずに、持続した期間にわたって発現させる。ＡＡＶ由来ベクターは典型的には、宿主ゲノムへの部位特異的組込みに必要なＡＡＶ構成要素をコードせず、典型的には、染色体外要素として存続する。ＡＡＶベクターは、選択的組織及び器官標的化もある程度可能である。したがって、ＡＡＶベクターは、対象の所望の細胞への本開示の一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドのための可能な送達機構である。 In some embodiments, the delivery vector comprises an AAV-derived vector. AAV vectors are one of the most frequently used vectors for gene therapy. AAV is a small non-enveloped group II virus whose genome is encoded by one long, single-stranded DNA molecule. AAV-derived vectors have the ability to attach and enter target cells, import genetic material into the nucleus, and express that information over a sustained period of time, generally without toxicity. AAV-derived vectors typically do not encode the AAV components required for site-specific integration into the host genome and typically persist as extrachromosomal elements. AAV vectors are also somewhat capable of selective tissue and organ targeting. Thus, AAV vectors are a possible delivery mechanism for single-stranded DNA polynucleotides of the present disclosure into desired cells of a subject.

一部の実施形態では、本開示の組換えポリヌクレオチドを、対象の所望の標的細胞に送達される非ウイルス送達系にパッケージングすることができる。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを、対象の所望の標的細胞に送達されるナノ粒子、ミセル、ポリマーベシクルまたはポリマーソームにパッケージングする。一部の実施形態では、これらの生成物を、吸入器により、またはナノ粒子により送達するためのエアロゾルへと製剤化することができる。追加の送達経路には、局所、経皮、静脈内、皮下、及び髄腔内送達が含まれる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、治療物質をコードするｓｓＲＮＡを封入し、次いで、これを、エアロゾル送達などにより、全身または局所投与することができる。エアロゾル送達を使用して、治療物質を、コロナウイルスなどの本明細書において提示されているとおりのウイルスに感染している患者の肺に送達することができる。 In some embodiments, recombinant polynucleotides of the present disclosure can be packaged in non-viral delivery systems that deliver to the desired target cells of a subject. In some embodiments, polynucleotides of the disclosure are packaged in nanoparticles, micelles, polymeric vesicles or polymersomes that are delivered to the desired target cells of a subject. In some embodiments, these products can be formulated into an aerosol for delivery by an inhaler or by nanoparticles. Additional routes of delivery include topical, transdermal, intravenous, subcutaneous, and intrathecal delivery. In some embodiments, the nanoparticles encapsulate ssRNA encoding therapeutic agents, which can then be administered systemically or locally, such as by aerosol delivery. Aerosol delivery can be used to deliver therapeutic agents to the lungs of patients infected with viruses such as coronaviruses as presented herein.

加えて、ある特定の患者では、いずれの残りのウイルス／ビリオンも減少させる、または除去するために、この処置が定期的に繰り返されるであろうと予測される。そのような定期的な処置は、維持処置として、安定しているか、または検出不可能な疾患を達成するために患者が必要とする限り、１週間ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、１か月ごとに１回から、２か月ごとに１回、３か月ごとに１回、４か月ごとに１回、５か月ごとに１回、６か月ごとに１回、または７か月ごとに１回、または８か月ごとに１回、または９か月ごとに１回、または１０か月ごとに１回、または１１か月ごとに１回、または年に１回まで変動し得る。 Additionally, it is expected that in certain patients this treatment will be repeated periodically to reduce or eliminate any residual virus/virion. Such regular treatment may be as maintenance treatment, once every week, once every two weeks, for as long as the patient needs to achieve stable or undetectable disease. 1 every 3 weeks, 1 every month, 1 every 2 months, 1 every 3 months, 1 every 4 months, 1 every 5 months, 6 or more 1x per month, or 1x every 7 months, or 1x every 8 months, or 1x every 9 months, or 1x every 10 months, or 1x every 11 months , or may vary up to once a year.

併用及び交替治療
ＨＩＶ、ＨＢＶ及びＨＣＶを含む多くのウイルス感染症の薬物耐性バリアントは抗ウイルス薬での長期間の処置後に発生し得ることが認められている。薬物耐性は最も典型的には、ウイルス複製で使用される酵素、最も典型的には、ＨＩＶの場合には、逆転写酵素、プロテアーゼ、もしくはＤＮＡポリメラーゼ、及びＨＢＶの場合には、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＨＣＶの場合には、ＲＮＡポリメラーゼ、プロテアーゼ、もしくはヘリカーゼなどのタンパク質をコードする遺伝子の変異により起こる。最近では、基本薬により引き起こされるものとは異なる変異を誘導する第２、及びことによると第３の抗ウイルス化合物と組み合わせて、またはそれと交替で化合物を投与することにより、ＨＩＶ感染症に対する薬物の有効性が延長され得る、増大し得る、または回復し得ることが実証されている。組合せのために使用することができる化合物は、ＨＢＶポリメラーゼ阻害薬、インターフェロン、ＴＬＲ－７アゴニストまたはＴＬＲ－９アゴニストなどのＴＬＲ調節薬、治療用ワクチン、ある特定の細胞ウイルスＲＮＡセンサーの免疫活性化因子、ウイルス侵入阻害薬、ウイルス成熟阻害薬、別個のカプシドアセンブリ調節薬、別個または未知の機構の抗ウイルス化合物、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。別法では、そのような組合せまたは交替治療により、薬物の薬物動態、生体内分布、または他のパラメーターを変更することができる。一般に、併用治療が典型的には、交替治療よりも好ましく、それというのも、それがウイルスに対して複数の同時ストレスを誘導するためである。 Combination and Alternation Therapies It is recognized that drug-resistant variants of many viral infections, including HIV, HBV and HCV, can develop after long-term treatment with antiviral agents. Drug resistance is most typically associated with enzymes used in viral replication, most typically reverse transcriptase, protease, or DNA polymerase in the case of HIV, and DNA polymerase in the case of HBV, or In the case of HCV, it is caused by mutations in genes encoding proteins such as RNA polymerase, protease, or helicase. More recently, the use of drugs against HIV infection has been demonstrated by administering compounds in combination with, or alternating with, a second, and possibly a third, antiviral compound that induces mutations different from those caused by the base drug. It has been demonstrated that efficacy can be prolonged, increased, or restored. Compounds that can be used for combination include HBV polymerase inhibitors, interferons, TLR modulators such as TLR-7 or TLR-9 agonists, therapeutic vaccines, immune activators of certain cellular viral RNA sensors. , viral entry inhibitors, viral maturation inhibitors, distinct capsid assembly modulators, antiviral compounds of distinct or unknown mechanism, and any combination thereof. Alternatively, such combination or alternation therapy may alter the pharmacokinetics, biodistribution, or other parameters of the drug. In general, combination therapy is typically preferred over alternation therapy because it induces multiple simultaneous stresses on the virus.

ある特定の実施形態では、前記方法は、患者をコンストラクトの送達中にテノフォビルなどの抗ウイルス処置下に維持すること；次いで、患者を、２週間から１か月の範囲の期間にわたって抗ウイルス処置から離して回帰させて、ウイルス複製を可能にし、ウイルス細胞死を制限することにより細胞死を制御するレジメンを含むので、圧倒的なウイルス肝細胞死の状況、または同様の細胞死は存在しない。 In certain embodiments, the method comprises maintaining the patient on antiviral treatment, such as tenofovir, during delivery of the construct; There is no overwhelming viral hepatocyte death situation, or similar cell death, as we include regimens that control cell death by regressing away, allowing viral replication, and limiting viral cell death.

そのような回帰の後に、患者を抗ウイルス処置に戻して、組織の修復を可能にし；患者にとって利益がある限り、８週間ごと、１２週間ごと、１６週間ごと、２０週間ごとなどのサイクルを繰り返す。 After such regression, the patient is returned to antiviral treatment to allow tissue repair; the cycle is repeated every 8 weeks, every 12 weeks, every 16 weeks, every 20 weeks, etc., as long as there is benefit to the patient. .

ＨＢＶを処置するための併用または交替治療のための追加の化合物には、３ＴＣ、ＦＴＣ、Ｌ－ＦＭＡＵ、インターフェロン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン（Ｌ－ｄＴ）、バルトルシタビン（３’－バリニルＬ－ｄＣ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－グアニン（ＤＸＧ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－２，６－ジアミノプリン（ＤＡＰＤ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－６－クロロプリン（ＡＣＰ）、ファムシクロビル、ペンシクロビル、ロブカビル、ガンシクロビル、及びリバビリンが含まれる。 Additional compounds for combination or alternation therapy to treat HBV include 3TC, FTC, L-FMAU, interferon, adefovir dipivoxil, entecavir, telbivudine (L-dT), bartolcitabine (3'-valinyl L- dC), beta. - D-dioxolanyl-guanine (DXG), beta. - D-dioxolanyl-2,6-diaminopurine (DAPD), beta. -D-dioxolanyl-6-chloropurine (ACP), famciclovir, penciclovir, lobucavir, ganciclovir, and ribavirin.

キット
加えて、これらの組換え核酸、ＶＬＰ生成物またはその医薬組成物のある特定の構成要素または実施形態をキットで提供することができる。例えば、組換え核酸、またはＶＬＰ生成物のいずれも、凍結して、単独で、または前処理もしくは後処理ステップからの他の薬剤のいずれかの別々の容器、及び任意選択の取扱説明書と共にパッケージングしてキットとして提供することができる。 Kits Additionally, certain components or embodiments of these recombinant nucleic acids, VLP products or pharmaceutical compositions thereof may be provided in kits. For example, either the recombinant nucleic acid, or the VLP product, may be frozen and packaged alone or in separate containers, either with other agents from pretreatment or posttreatment steps, and optionally with instructions for use. can be packaged and provided as a kit.

一部の実施形態は、キット内の前述の組成物のいずれかを対象とする。一部の実施形態では、キットは、アンプル、使い捨てシリンジ、カプセル、バイアル、管などを含んでよい。一部の実施形態では、キットは、本明細書の実施形態の局所製剤を含む単回用量容器または複数回用量容器を含んでよい。一部の実施形態では、各用量容器は、１回または複数回単位用量を含有してよい。一部の実施形態では、キットは、アプリケーターを含んでよい。一部の実施形態では、キットは、処理／処置の段階で必要とされる構成要素のすべてを含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、防腐剤を含有してもよいし、または防腐剤非含有（例えば、単回使用容器において）であってもよい。一部の実施形態では、組換え核酸またはＶＬＰ生成物を、病院または処置センターに配送するために適切な所望の段階で調製及び凍結してよい。 Some embodiments are directed to any of the aforementioned compositions in kits. In some embodiments, kits may include ampoules, disposable syringes, capsules, vials, tubes, and the like. In some embodiments, the kit may include single-dose or multi-dose containers containing the topical formulations of the embodiments herein. In some embodiments, each dose container may contain one or more unit doses. In some embodiments, the kit may include an applicator. In some embodiments, the kit contains all of the components required for the treatment/treatment step. In some embodiments, cell compositions may contain preservatives or may be preservative-free (eg, in single-use containers). In some embodiments, the recombinant nucleic acid or VLP product may be prepared and frozen at any desired stage suitable for delivery to a hospital or treatment center.

加えて、ある特定の患者では、ウイルス薬剤（複数可）に対する免疫系の応答をブーストするために、前記方法または処置レジメンのいずれかが定期的に繰り返されるであろうと予測される。そのような定期的な処置は、維持処置として、患者が必要とする限り、１週間、１か月ごとに１回から、２か月ごとに１回、３か月ごとに１回、４か月ごとに１回、５か月ごとに１回、６か月ごとに１回、または７か月ごとに１回、または８か月ごとに１回、または９か月ごとに１回、または１０か月ごとに１回、または１１か月ごとに１回、または年に１回まで変動し得る。 In addition, it is expected that any of the methods or treatment regimens will be repeated periodically in certain patients to boost the immune system's response to the viral agent(s). Such regular treatment may range from once every week, once every month, once every two months, once every three months, four times as long as the patient needs it, as maintenance treatment. once every month, once every 5 months, once every 6 months, or once every 7 months, or once every 8 months, or once every 9 months, or It can vary once every 10 months, or once every 11 months, or up to once a year.

本発明を様々な好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明はそれらに限定されることは意図されておらず、むしろ、当業者は、本発明の意図及び添付の特許請求の範囲内で変形及び変更を行うことができることを認めるであろう。 Although the invention has been described in terms of various preferred embodiments, it is not intended that the invention be limited thereto, but rather it will occur to those skilled in the art to vary within the spirit of the invention and the scope of the appended claims. and acknowledge that changes may be made.

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の試験コンストラクトは、ＡＡＶ８を送達ベクターとして利用するが、それというのも、それが肝臓細胞を標的化するためである。非特異的標的化を、示されているとおりの様々な対照において試験する。ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）を肝臓特異的プロモーターとして利用し、これは、肝臓細胞でのみ作製される特異的転写因子により活性化する。これは、逆相補構造にある組換え転写物の発現を駆動し、したがって、非機能性と考えられ、さらに、この場合はイプシロン配列（配列番号１）であるウイルス転写認識シグナルが存在しないと分解される。 In certain embodiments, the test constructs described herein utilize AAV8 as a delivery vector because it targets liver cells. Non-specific targeting is tested in various controls as indicated. TBG (thyroxine-binding globulin) is used as a liver-specific promoter, which is activated by specific transcription factors made only in liver cells. This drives the expression of recombinant transcripts in a reverse complementary conformation and is therefore considered non-functional and degraded in the absence of the viral transcriptional recognition signal, in this case the epsilon sequence (SEQ ID NO: 1). be done.

試験コンストラクトが、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼが存在し、埋没ＨＢＶイプシロン転写認識配列と相互作用して、ＨＢＶ「ウイルススーサイド」転写物を転写するＨＢＶ感染肝臓細胞でのみ発現されることを示すように、これらの実験を設計する。このプロセスの後に、センスＨＢＶ転写物（Ｃａｓｐ９をコードするイプシロン配列により認識されるセンス転写物である）が次いで転写され、かつ宿主細胞機構により翻訳されて、他のいずれの非感染細胞もアポトーシスさせることなく、強力な構成的活性型ＥＦＳプロモーター下にあり、ウイルス感染宿主細胞のプログラム細胞死－アポトーシスを開始させるＣａｓｐ９をコードし得る。 These test constructs were expressed only in HBV-infected liver cells in which HBV DNA polymerase is present and interacts with the buried HBV epsilon transcriptional recognition sequence to transcribe the HBV "viral suicide" transcript. Design your experiment. After this process, the sense HBV transcript (which is the sense transcript recognized by the epsilon sequence encoding Casp9) is then transcribed and translated by the host cell machinery causing any other uninfected cells to undergo apoptosis. It may encode Casp9, which is under a strong, constitutively active EFS promoter and initiates programmed cell death-apoptosis of virus-infected host cells.

これらの結果は、図１～１２の図、マップ、グラフ及び表に図示されており、下の実施例１～６にさらに十分に説明されている。 These results are illustrated in the diagrams, maps, graphs and tables of FIGS. 1-12 and are described more fully in Examples 1-6 below.

実施例１
ＨｅｐＡＤ３８は、テトラサイクリンで調節され得る条件下でヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を複製する細胞系である。抗生物質の存在下では、この細胞系は、プレゲノミック（ｐｇ）ＲＮＡ合成の抑制により、ウイルスを含有しない。培養培地からテトラサイクリンを除去すると、この細胞はウイルスｐｇＲＮＡを発現し、ウイルス複製に特徴的なＤＮＡ中間体を含有する細胞質内でサブウイルス粒子を蓄積し、ウイルス様粒子を上清に分泌する。ＨｅｐＡＤ３８細胞系は、高レベルのＨＢＶ ＤＮＡを産生し得るので、同期でウイルスＤＮＡ合成に依存するウイルス複製周期の解析に有用であるはずである。加えて、この細胞系は、新たな群のＨＢＶ複製の阻害薬のために多様な化合物ライブラリの大規模スクリーニングを可能にするハイスループット細胞ベースアッセイへとフォーマットされている。Ｌａｄｎｅｒ Ｓ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． １９９７ Ａｕｇ；４１（８）：１７１５－２０を参照されたい。したがって、ＨｅｐＡＤ３８細胞系は、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を研究するための適切なインビトロモデルシステムである。 Example 1
HepAD38 is a cell line that replicates human hepatitis B virus (HBV) under conditions that can be regulated by tetracycline. In the presence of antibiotics, this cell line is virus-free due to suppression of pregenomic (pg) RNA synthesis. Upon removal of tetracycline from the culture medium, the cells express viral pgRNA, accumulate subviral particles in the cytoplasm containing DNA intermediates characteristic of viral replication, and secrete virus-like particles into the supernatant. The HepAD38 cell line can produce high levels of HBV DNA and should be useful for the analysis of viral replication cycles that are synchronous and dependent on viral DNA synthesis. In addition, this cell line has been formatted into a high-throughput cell-based assay that allows large-scale screening of diverse compound libraries for a new class of inhibitors of HBV replication. Ladner S. K. et al. Antimicrob Agents Chemother. 1997 Aug;41(8):1715-20. The HepAD38 cell line is therefore a suitable in vitro model system for studying human hepatitis B virus (HBV).

Ｈｅｐ Ｇ２は、高分化型肝細胞癌を有する１５歳の欧州系アメリカ人青年の肝臓組織に由来した不死細胞系である。これらの細胞は、形態的に上皮性であり、５５のモダール染色体数を有し、ヌードマウスでは腫瘍発生性ではない。この細胞は、様々な主要な血漿タンパク質、例えば、アルブミン、及び急性期タンパク質フィブリノーゲン、アルファ２－マクログロブリン、アルファ１－アンチトリプシン、トランスフェリン及びプラスミノーゲンを分泌する。これらは、大規模培養システムにおいて成功裏に成長している。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原は、これらの細胞上で検出されていない。Ｈｅｐ Ｇ２は、ヒト成長ホルモンでの刺激に対して応答する。したがって、Ｈｅｐ Ｇ２細胞は、分極ヒト肝細胞を研究するための適切なインビトロモデルシステムである。 Hep G2 is an immortal cell line derived from the liver tissue of a 15-year-old European-American adolescent with well-differentiated hepatocellular carcinoma. These cells are morphologically epithelial, have a modal chromosome number of 55, and are non-tumorigenic in nude mice. The cells secrete various major plasma proteins such as albumin and the acute phase proteins fibrinogen, alpha2-macroglobulin, alpha1-antitrypsin, transferrin and plasminogen. They have been successfully grown in large scale culture systems. Hepatitis B virus surface antigen has not been detected on these cells. Hep G2 responds to stimulation with human growth hormone. Hep G2 cells are therefore a suitable in vitro model system to study polarized human hepatocytes.

本明細書に記載の「ウイルス特異的細胞傷害性」コンストラクトを試験するために、ＨｅｐＧ２細胞を利用することは、正常で健康な肝臓細胞のための対照として役立つ。ＨｅｐＧ２細胞は、ＨＢＶに感染していない肝臓細胞であるので、それらが、実験１において使用される試験複製不全：ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ１（ＥＦｌａ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）により影響されることはないはずであり、結果は図２Ａ及び図２Ｃに示されている。 Utilizing HepG2 cells to test the "virus-specific cytotoxic" constructs described herein serves as a control for normal healthy liver cells. Since HepG2 cells are HBV-uninfected liver cells, they should not be affected by the test replication deficiency used in Experiment 1: AAV8-HBV-DRS1 (EFla>HBV-rcCasp9). Yes, and the results are shown in FIGS. 2A and 2C.

対照的に、ＨｅｐＡＤ３８細胞系を、本明細書に記載の「ウイルス特異的細胞傷害性」コンストラクト：複製不全コンストラクト：ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ１（ＥＦｌａ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）の１つ（図２Ａに示されているベクター）を試験するためのＨＢＶ＋モデルとして利用した。結果が実験１について示されており、群１～３は、図２Ｂのグラフデータならびに図２Ｃに記載の対応する細胞数及び生存率に示されているとおり、ＨｅｐＡＤ３８細胞中の群２の試験コンストラクトＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ１（ＥＦｌａ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）がウイルス特異的細胞死を示すことを示している。 In contrast, the HepAD38 cell line was transfected with one of the "virus-specific cytotoxic" constructs described herein: replication-deficient construct: AAV8-HBV-DRS1 (EFla>HBV-rcCasp9) (shown in FIG. 2A). vector) was utilized as an HBV+ model for testing. Results are shown for Experiment 1 and Groups 1-3 tested constructs of Group 2 in HepAD38 cells, as shown in the graphical data in FIG. 2B and the corresponding cell numbers and viability reported in FIG. AAV8-HBV-DRS1 (EFla>HBV-rcCasp9) exhibits virus-specific cell death.

実施例２
加えて、図３Ａ及び図３Ｂ、ならびに図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃにおいて示されている実験２では、ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ１（ＥＦｌａ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）コンストラクトをＨｅｐＧ２細胞及びＨｅｐＡＤ３８細胞においてさらに試験し、かつある特定の試験群では、カスパーゼ－９阻害薬Ｚ－ＬＥＨＤ－ＦＭＫを使用して、死滅がＣａｓｐ９発現の結果であることを示した（群３及び群５を参照されたい）。これらの実験からの結果は、群２のＨｅｐＡＤ３８細胞におけるウイルス特異的細胞死を示しており、これはほぼ８０％の割合の細胞死を示した。図５Ａはベクターマップであり、図５Ｂは、ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ１（ＥＦｌａ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）コンストラクトに感染したＨｅｐＡＤ３８細胞における徹底的な細胞死を強調するための、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅｐＡＤ３８細胞における試験コンストラクト及び様々な対照の作用を示す重ね合わせグラフである。 Example 2
In addition, in Experiment 2, shown in FIGS. 3A and 3B and FIGS. 4A, 4B and 4C, the AAV8-HBV-DRS1 (EFla>HBV-rcCasp9) construct was further tested in HepG2 and HepAD38 cells. , and in one particular test group, using the caspase-9 inhibitor Z-LEHD-FMK, showed that killing was a result of Casp9 expression (see Groups 3 and 5). Results from these experiments demonstrated virus-specific cell death in HepAD38 cells of Group 2, which exhibited a nearly 80% rate of cell death. FIG. 5A is a vector map and FIG. 5B is a test construct in HepG2 and HepAD38 cells to highlight the complete cell death in HepAD38 cells infected with the AAV8-HBV-DRS1 (EFla>HBV-rcCasp9) construct. and various controls are overlaid graphs.

実施例３
最後に実験３では、ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ２（ＴＢＧ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）コンストラクトを試験した。このコンストラクトは、肝臓特異的プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）を含有する。これらの実験からの結果は、群２のＨｅｐＡＤ３８細胞におけるウイルス特異的細胞死を示しており、これはほぼ８０％の割合の細胞死を示した（図６Ａ及び図６Ｂ）。このグループ分けでは、群１の細胞は形質導入されてなく、群２の細胞は、ＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ２（ＴＢＧ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）で形質導入された試験細胞であり；群３の細胞は、Ｃａｓｐ９阻害薬ｚ－ＬＥＨＤ．ｆｍｋの付加を伴う同じものであり；群４の細胞は、対照としてＣａｓｐ９阻害薬ｚ－ＬＥＨＤ．ｆｍｋのみと接触させており；群５の細胞は、コンストラクト発現をさらに追跡するために、ＧＦＰを含有するコンストラクトで形質導入され；群６の細胞は、同じＧＦＰコンストラクトで形質導入され、Ｃａｓｐ９阻害薬ｚ－ＬＥＨＤ．ｆｍｋと共にインキュベートもされた。 Example 3
Finally, in Experiment 3, the AAV8-HBV-DRS2 (TBG>HBV-rcCasp9) construct was tested. This construct contains a liver-specific promoter, thyroxine binding globulin (TBG). Results from these experiments demonstrated virus-specific cell death in HepAD38 cells of Group 2, which exhibited a nearly 80% rate of cell death (FIGS. 6A and 6B). In this grouping, group 1 cells were not transduced, group 2 cells were test cells transduced with AAV8-HBV-DRS2 (TBG>HBV-rcCasp9); The Casp9 inhibitor z-LEHD. The same with the addition of fmk; Group 4 cells were treated with the Casp9 inhibitor z-LEHD. cells in group 5 were transduced with a construct containing GFP to further track construct expression; cells in group 6 were transduced with the same GFP construct and treated with a Casp9 inhibitor; z-LEHD. It was also incubated with fmk.

実験２～３における試験ベクター＋Ｃａｓｐ９阻害薬対照群は、細胞死がカスパーゼ－９で開始されていて、ベクター／ＤＮＡ毒性からではないことを示した。 The test vector plus Casp9 inhibitor control groups in Experiments 2-3 showed that cell death was initiated by caspase-9 and not from vector/DNA toxicity.

実験２～３におけるＧＦＰ－ＡＡＶ対照群は、細胞死がＡＡＶ毒性によるものではないことを示した。 The GFP-AAV control group in Experiments 2-3 showed that cell death was not due to AAV toxicity.

実施例４
実験４では、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ産生細胞を、本明細書において提供されるとおりのＨＢＶ ＲＮＡで処置し、平均細胞死パーセントを細胞生存に基づき計算した。４日までに、様々なＨＢＶ産生細胞における平均細胞死は９２％であった（８８．６％から９５．８％の範囲）。非感染細胞では、有意な細胞死は観察されなかった。ＲＴ及び汎カスパーゼ阻害薬は個々に、ＡＡＶ処置された感染細胞において細胞死を阻止した。これらの結果は、ＨＢＶ ＲＮＡコンストラクトがＨＢＶ感染または産生細胞を選択的に死滅させることを示している。 Example 4
In Experiment 4, HBV-infected or HBV-producing cells were treated with HBV RNA as provided herein and average percent cell death was calculated based on cell survival. By day 4, the average cell death in the various HBV-producing cells was 92% (ranging from 88.6% to 95.8%). No significant cell death was observed in uninfected cells. RT and pan-caspase inhibitors individually blocked cell death in AAV-treated infected cells. These results demonstrate that HBV RNA constructs selectively kill HBV-infected or producing cells.

実施例５
インビボマウス肝炎モデル実験
これらのコンストラクトをインビボマウスモデルにおいてさらに試験したところ、結果は、試験コンストラクトＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ１（ＥＦｌａ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）及びＡＡＶ８－ＨＢＶ－ＤＲＳ２（ＴＢＧ＞ＨＢＶ－ｒｃＣａｓｐ９）でのウイルス特異的細胞死を示している（図９）。 Example 5
In vivo mouse hepatitis model experiments These constructs were further tested in an in vivo mouse model and the results show that Virus-specific cell death is shown (Fig. 9).

上のセクションにおいて、感染肝細胞のアポトーシスを誘導するためのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ポリメラーゼ（ｐｏｌ）を選出する新規のインビトロ実証実験からの結果が示されている。ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルも使用して、インビボでこれらのコンストラクト及びアプローチの機構の有効性及び特異性を評価した。 In the top section, results from a novel in vitro demonstration of selecting hepatitis B virus (HBV) polymerase (pol) to induce apoptosis of infected hepatocytes are presented. An HBV transgenic mouse model was also used to assess the mechanistic efficacy and specificity of these constructs and approaches in vivo.

方法
ＡＡＶ粒子に、ＨＢＶ ｐｏｌ（ＨＢＶ ｐｏｌ／ＲＴ）の逆転写酵素（ＲＴ）ドメインに特異的な配列の間に挟まれた非機能性ノンコーディング（ｎｃ）ＲＮＡを発現する特許権下のベクターコンストラクトをパッケージングした。ｎｃＲＮＡは、ＨＢＶ ｐｏｌ／ＲＴにより認識され、カスパーゼ－９（ｃａｓｐ－９）を過剰発現するようにコードされた二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに逆転写されるであろう（図１Ａ及び図ＩＢ）。１群あたり５匹のＨＢＶ遺伝子導入マウスに、ＥＦｌａまたは肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター下でベクターを発現するＡＡＶ粒子、ＧＦＰベクターまたはプラセボを注射する。末梢血を肝臓酵素及びＨＢｅＡｇについて毎週モニターした。１４または２８日目に心臓、肺、腎臓及び肝臓を採取し、ＩＨＣ及びウェスタンブロットによりＡＡＶ ＶＰの組織分布を評価した。Ｃａｓｐ－９、カスパーゼ切断産物及びｃａｓｐ－９でのＨＢＶコアタンパク質の二重染色もＩＨＣにより評価した。加えて、ＨＢＶ ｐｏｌ発現または非発現ＨｅｐＧ２－Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ細胞をヌードマウスの肝臓に、局所腫瘍成長を促進するためのマトリゲルと共に移植した。次いで、マウスを、試験ベクターを発現するＡＡＶで処置した。様々な時点で、マウスにＤ－ルシフェリン基質を注射して、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓ５イメージングシステムを用いて腫瘍サイズの変化を定量化した。 Methods Patented vector constructs expressing non-functional non-coding (nc) RNA flanked by sequences specific for the reverse transcriptase (RT) domain of HBV pol (HBV pol/RT) in AAV particles. was packaged. The ncRNA will be recognized by HBV pol/RT and reverse transcribed into double-stranded (ds) DNA encoded to overexpress caspase-9 (casp-9) (FIGS. 1A and IB). . Five HBV-transgenic mice per group are injected with AAV particles expressing vectors under the EFla or liver-specific thyroxine-binding globulin (TBG) promoters, GFP vectors or placebo. Peripheral blood was monitored weekly for liver enzymes and HBeAg. Hearts, lungs, kidneys and livers were harvested on days 14 or 28 to assess the tissue distribution of AAV VP by IHC and Western blot. Double staining of HBV core protein with Casp-9, caspase cleavage products and casp-9 was also assessed by IHC. In addition, HBV pol-expressing or non-expressing HepG2-Red-Fluc cells were implanted into the liver of nude mice together with matrigel to promote local tumor growth. Mice were then treated with AAV expressing the test vector. At various time points, mice were injected with D-luciferin substrate and changes in tumor size were quantified using the IVIS Lumina S5 imaging system.

結果
処置後１４日目に遺伝子導入マウスから採取した器官は、ＨＢＶを発現する肝臓及び腎臓細胞では有意なｃａｓｐ－９発現を示したが、ＨＢＶを発現しないものでは示さなかった。ＴＢＧプロモーターを含むベクターで処置されたマウスの腎臓組織は、未処置及びＧＦＰ対照と比較してｃａｓｐ－９発現の増加がなかった。さらに、処置ＡＡＶ粒子について陽性に染色された他の器官の細胞は、ｃａｓｐ－９過剰発現を示さなかった。処置後２８日目に採取された肝臓は、処置群では広範なアポトーシス好中球浸潤範囲を示したが、対照では示さなかった（図１１Ａ）。４週目に処置群では、ＧＦＰ－ＡＡＶ及びプラセボ対照と比較して、ＡＬＴレベルが１．８～２．２倍上昇し、ＡＳＴレベルが１．４倍上昇した（図１ＩＢ）。末梢ＨＢｅＡｇにおいて、有意な変化はなかった。ヌードマウス異種移植治癒研究の結果を評価する。 Results Organs harvested from transgenic mice 14 days after treatment showed significant casp-9 expression in liver and kidney cells expressing HBV, but not in those not expressing HBV. Kidney tissue from mice treated with vectors containing the TBG promoter had no increase in casp-9 expression compared to untreated and GFP controls. In addition, cells of other organs that stained positive for treated AAV particles did not show casp-9 overexpression. Livers harvested 28 days after treatment showed extensive apoptotic neutrophil infiltration coverage in the treated group but not in the control (FIG. 11A). ALT levels increased 1.8-2.2-fold and AST levels increased 1.4-fold in the treatment group at week 4 compared to GFP-AAV and placebo controls (FIG. 1IB). There were no significant changes in peripheral HBeAg. To evaluate the results of a nude mouse xenograft healing study.

結論
ＨＢＶ ｐｏｌをハイジャックするための新規のＡＡＶベクターは、インビトロ及びインビボでＨＢＶ発現細胞においてＣａｓｐ－９の過剰発現及びアポトーシスを特異的に誘導した。このプロセスの概観を示す図が図１１Ｃに示されている。遺伝子導入マウスにおける肝臓組織の再生が抗原を構成的に発現するので、末梢ＨＢｅＡｇの低下の欠如が予測された。これらのデータは、ＨＢＶ感染症を処置または治癒するための潜在的に新しい経路を示唆している。 Conclusion A novel AAV vector for hijacking the HBV pol specifically induced Casp-9 overexpression and apoptosis in HBV-expressing cells in vitro and in vivo. A diagram showing an overview of this process is shown in FIG. 11C. Lack of reduction in peripheral HBeAg was expected since regenerating liver tissue in transgenic mice constitutively expresses the antigen. These data suggest potentially new routes to treat or cure HBV infection.

配列
配列番号１：ＨＢＶ ＲＮＡポリメラーゼイプシロンシグナル

Figure 2022546402000008
SEQ ID NO: 1: HBV RNA polymerase epsilon signal
Figure 2022546402000008

配列番号２：ＥＦＳプロモーター

Figure 2022546402000009
SEQ ID NO: 2: EFS promoter
Figure 2022546402000009

配列番号３：カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９）ヒトＯＲＦ

Figure 2022546402000010
SEQ ID NO: 3: Caspase 9 (Casp9) human ORF
Figure 2022546402000010

配列番号４：Ｃａｓｐ９の逆相補体

Figure 2022546402000011
SEQ ID NO: 4: reverse complement of Casp9
Figure 2022546402000011

配列番号５：ＥＦＳプロモーターの逆相補体

Figure 2022546402000012
SEQ ID NO: 5: reverse complement of EFS promoter
Figure 2022546402000012

配列番号６：ＳＶ４０ポリＡ

Figure 2022546402000013
SEQ ID NO: 6: SV40 PolyA
Figure 2022546402000013

配列番号７：ＳＶ４０ポリＡの逆相補体

Figure 2022546402000014
SEQ ID NO: 7: Reverse complement of SV40 polyA
Figure 2022546402000014

配列番号８：コンストラクト（転写物）：（１７４６ｂｐ）

Figure 2022546402000015
SEQ ID NO: 8: Construct (transcript): (1746 bp)
Figure 2022546402000015

配列番号９
ＨＢＶイプシロンシグナルの間に挟まれた「ｚｓＧｒｅｅｎ遺伝子を駆動するＥＦＳプロモーター」の逆相補配列：

Figure 2022546402000016
SEQ ID NO:9
Reverse complementary sequence of "EFS promoter driving zsGreen gene" sandwiched between HBV epsilon signals:
Figure 2022546402000016

実施例６
インフルエンザ特異的Ｃａｓｐ９コンストラクト及び実験
インフルエンザウイルスを処置するために設計された試験コンストラクトを試験するために、次の配列及びコンストラクトを利用することとする。インフルエンザウイルスは、ウイルスタンパク質を発現するか、またはそのウイルスゲノムを複製するためにインフルエンザポリメラーゼ複合体を利用する一本鎖ネガティブセンスＲＮＡウイルスであるので、ネガティブセンスノンコーディング（ｎｃ）ＲＮＡを発現するベクターコンストラクトは、インフルエンザポリメラーゼと連結するように設計されている（実施例１～４に記載のとおりのＨＢＶについて特異的に設計されたものと同様の手法で）。ｎｃＲＮＡは、ウイルス機構を「ハイジャック」して、感染細胞において特異的にアポトーシス誘導し、これは、潜在的な抗ウイルス処置である（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。 Example 6
Influenza-Specific Casp9 Constructs and Experiments To test test constructs designed to treat influenza virus, the following sequences and constructs will be utilized. Since influenza virus is a single-stranded negative-sense RNA virus that expresses viral proteins or utilizes the influenza polymerase complex to replicate its viral genome, vectors that express negative-sense non-coding (nc) RNA Constructs are designed to couple with influenza polymerase (in a similar manner to those specifically designed for HBV as described in Examples 1-4). The ncRNAs "hijacked" the viral machinery and specifically induced apoptosis in infected cells, a potential antiviral treatment (FIGS. 10A and 10B).

方法
多くのインフルエンザウイルス株で高度保存されているインフルエンザゲノムＲＮＡノンコーディング配列（ＮＣＳ）領域の間にあるｚｓＧｒｅｅｎマーカー（ＡＡＶ．ｉｎｆｖ．ｒｃＺｓＧｒｅｅｎ）またはカスパーゼ－９（ｃａｓｐ９）遺伝子（ＡＡＶ．ｉｎｆｖ．ｒｃＣａｓｐ９）の逆相補鎖を転写する、ｎｃＲＮＡを発現する新規のベクター（これはインフルエンザ「ハイジャックＲＮＡ」、またはインフルエンザ感染細胞のためのＲＮＡスーサイドベクターと考えられ得る）で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をパッケージングした。これらの配列の実施形態は、下で配列番号１０～２４として示されている。これらのインフルエンザ（ｎｃ）ＲＮＡコンストラクトを試験するためにインビトロ系として、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１もしくはＨ３Ｎ２、またはインフルエンザＢウイルスに０．１ＭＯＩで感染させた。インフルエンザ感染細胞についてのハイジャックベクター、またはＲＮＡスーサイドベクターの機能性を決定するために、ｃａｓｐ９阻害薬Ｚ－ＬＥＨＤ－ＦＭＫの存在及び非存在下で、インフルエンザ感染及び非感染ＭＤＣＫ細胞をＡＡＶ．ｉｎｆｖ．ｒｃＺｓＧｒｅｅｎベクターで、及びＡＡＶ．ｉｎｆｖ．ｒｃＣａｓｐ９で形質導入した。ｚｓＧｒｅｅｎ発現を決定するために、フローサイトメトリーを使用した。細胞生存及び増殖をＦＡＣＳ、アネキシンアッセイ、及び自動細胞カウントにより毎日評価した。 Methods The zsGreen marker (AAV.infv.rcZsGreen) or the caspase-9 (casp9) gene (AAV.infv.rcCasp9) located between highly conserved influenza genomic RNA noncoding sequence (NCS) regions in many influenza virus strains. package adeno-associated virus (AAV) with a novel vector expressing ncRNA (which can be considered an influenza "hijack RNA", or RNA suicide vector for influenza-infected cells) that transcribes the reverse complement of rang. Embodiments of these sequences are shown below as SEQ ID NOS: 10-24. As an in vitro system to test these influenza (nc) RNA constructs, Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells were infected with influenza A H1N1 or H3N2, or influenza B virus at a MOI of 0.1. To determine the functionality of hijacking vectors, or RNA-suicide vectors, on influenza-infected cells, influenza-infected and uninfected MDCK cells were infected with AAV. infv. rcZsGreen vector and AAV. infv. Transduced with rcCasp9. Flow cytometry was used to determine zsGreen expression. Cell survival and proliferation were assessed daily by FACS, annexin assays, and automated cell counts.

結果
すべてのＡＡＶ．ｉｎｆｖ．ｒｃＺｓＧｒｅｅｎベクター形質導入されたインフルエンザ感染細胞はｚｓＧｒｅｅｎタンパク質を成功裏に産生し、ハイジャック／スーサイドＲＮＡコンストラクトが認識されて、各インフルエンザ株においてポリメラーゼ複合体により転写されたことが確認された。インフルエンザ感染により、非処置細胞のうちの６０％～６８％が６日目までに死滅した。インフルエンザ感染後２４時間目にｃａｓｐ９ハイジャック／スーサイドベクターで処置された感染細胞のうちの９１％～９５％が処置後３日目に死滅した。培養物におけるＣａｓｐ－９阻害はベクター誘導細胞死を救済して、感染細胞の寿命を５～６日まで延長した（図１０Ｂ）。非感染対照群では、有意な細胞死はなかった。 Results All AAV. infv. Influenza-infected cells transduced with the rcZsGreen vector successfully produced zsGreen protein, confirming that the hijack/suicide RNA construct was recognized and transcribed by the polymerase complex in each influenza strain. Influenza infection killed 60%-68% of the untreated cells by day 6. Of the infected cells treated with the casp9 hijack/suicide vector 24 hours after influenza infection, 91%-95% died 3 days after treatment. Casp-9 inhibition in culture rescued vector-induced cell death and extended the lifespan of infected cells by 5-6 days (Fig. 10B). There was no significant cell death in the uninfected control group.

結論
インフルエンザポリメラーゼと連結するようにトランスで送達されたベクターはウイルス機構をハイジャックして、インフルエンザ感染細胞の死滅を非処置感染細胞よりも４０％急速に誘導した。この効果は、おそらくインフルエンザポリメラーゼの保存性によりウイルス株全体で見られた。この新規のアプローチを、インフルエンザのための有効な処置を開発するために使用することができるであろう。 Conclusions Vectors delivered in trans to link with influenza polymerase hijacked the viral machinery and induced death of influenza-infected cells 40% more rapidly than untreated infected cells. This effect was seen across virus strains, probably due to the conservation of influenza polymerase. This novel approach could be used to develop effective treatments for influenza.

配列
配列番号１０
ベクターの３’ノンコーディング領域

Figure 2022546402000017
SEQ ID NO: 10
3' non-coding region of the vector
Figure 2022546402000017

配列番号１１
ベクターの５’ノンコーディング領域

Figure 2022546402000018
SEQ ID NO: 11
5' non-coding region of the vector
Figure 2022546402000018

配列番号１２
インフルエンザ特異的Ｃａｓｐ９ベクター

Figure 2022546402000019
SEQ ID NO: 12
Influenza-specific Casp9 vector
Figure 2022546402000019

重要な特徴５’：
配列番号１３：ベクターの５’ノンコーディング領域：ＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧ
配列番号１４：非特異的緩衝配列ＧＴＧ
配列番号１５：逆転写中にポリＡシグナルで「どもる（ｓｔｕｔｔｅｒｅｄ）」Ｕ５～７リピート：ＴＴＴＴＴＴ
配列番号１６：インフルエンザ種で最も一般的な非特異的緩衝配列：ＡＴＣＡ
配列番号１７：「最終＋センスＣａｓｐ９転写物」の停止コドン：ＴＴＡ Important feature 5':
SEQ ID NO: 13: 5' non-coding region of vector: AGTAGAAACAAGG
SEQ ID NO: 14: non-specific buffer sequence GTG
SEQ ID NO: 15: U 5-7 repeats 'stuttered' with poly A signal during reverse transcription: TTTTTT
SEQ ID NO: 16: Non-specific buffering sequence most common in influenza strains: ATCA
SEQ ID NO: 17: Stop codon of "final+sense Casp9 transcript": TTA

重要な特徴３’：
配列番号１８：「最終＋センスＣａｓｐ９転写物」の開始コドン：ＣＡＴ
配列番号１９：非特異的緩衝配列：ＴＣＣ
配列番号２０：ベクターの３’ノンコーディング領域：ＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＴ Important feature 3':
SEQ ID NO: 18: Start codon of "final + sense Casp9 transcript": CAT
SEQ ID NO: 19: non-specific buffering sequence: TCC
SEQ ID NO: 20: 3' non-coding region of vector: CCTGCTTTTGCT

配列番号２１
インフルエンザポリメラーゼ複合体認識及び逆転写のための（－）ｓｓＲＮＡ転写物
（試験ベクターにより発現される転写物）

Figure 2022546402000020
SEQ ID NO:21
(-) ssRNA transcripts for influenza polymerase complex recognition and reverse transcription (transcripts expressed by the test vector)
Figure 2022546402000020

一般的なベクター構造
一部の実施形態では、一般的なベクター構造は、次の式：
配列番号２２－ＯＲＦ－配列番号２３
を有し、式中、
配列番号２２は、ＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡであり；
ＯＲＦは、任意のタンパク質コーディング配列であり；かつ
配列番号２３は、ＣＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＴである。 General Vector Structure In some embodiments, the general vector structure has the formula:
SEQ ID NO:22-ORF-SEQ ID NO:23
and where
SEQ ID NO: 22 is AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTA;
ORF is any protein coding sequence; and SEQ ID NO: 23 is CATTCCCCTGCTTTTGCT.

配列番号２４
実験的検出のためのＧＦＰマーカーコンストラクト（Ｃａｓｐ９の代わり）

Figure 2022546402000021
SEQ ID NO:24
GFP marker construct for experimental detection (alternative to Casp9)
Figure 2022546402000021

実施例７
この実験では、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２）またはインフルエンザＢウイルスに感染させなかったか、感染させた。次に、非感染及び感染細胞を、ヒトｃａｓｐ９をコードするハイジャックＲＮＡを含むＡＡＶ粒子またはＧＦＰを含むＡＡＶ粒子で処置した。これらの独立した実験をそれぞれ３連で実行した。 Example 7
In this experiment, Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells were either uninfected or infected with influenza A (H1N1 or H3N2) or influenza B virus. Uninfected and infected cells were then treated with AAV particles containing hijacked RNA encoding human casp9 or AAV particles containing GFP. Each of these independent experiments was performed in triplicate.

Ｃａｓｐ９発現及びその切断産物（カスパーゼ３及び７）をフローサイトメトリーにより測定した。Ｃａｓｐ９発現は、非感染細胞と比較して、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染で４倍増加した。ハイジャックＲＮＡ ＡＡＶは、非感染細胞には作用しなかったが、感染細胞で使用したときには、「ハイジャック」ＲＮＡ ＡＡＶはｃａｓｐ９を非感染細胞と比較して１０倍増加させ、かつ非処置感染細胞と比較して３倍増加させた。 Casp9 expression and its cleavage products (caspase 3 and 7) were measured by flow cytometry. Casp9 expression was increased 4-fold in H1N1 influenza infection compared to uninfected cells. Hijacking RNA AAV had no effect on uninfected cells, but when used in infected cells, "hijacking" RNA AAV increased casp9 10-fold compared to uninfected cells and three-fold increase compared to

ハイジャックＲＮＡ ＡＡＶの有効性を、自動細胞カウント及びＦＡＣＳ解析で細胞生存及び増殖をモニタリングすることにより毎日測定した。「ハイジャック」ＲＮＡ ＡＡＶでの非感染細胞の処置は、細胞生存に対して作用をもたらさなかった。しかしながら、ハイジャックＲＮＡ ＡＡＶでのインフルエンザＢ、Ｈ１Ｎ１、またはＨ３Ｎ２感染細胞の処置は、細胞生存を非処置感染細胞、またはＧＦＰ ＡＡＶ処置感染細胞と比較して１２０時間ほど増大させた。 Efficacy of hijacked RNA AAV was measured daily by monitoring cell survival and proliferation with automated cell counts and FACS analysis. Treatment of uninfected cells with 'hijack' RNA AAV had no effect on cell survival. However, treatment of influenza B, H1N1, or H3N2 infected cells with hijack RNA AAV increased cell survival by 120 hours compared to untreated infected cells or GFP AAV treated infected cells.

培養物における感染細胞パーセンテージを、ＦＡＣＳ解析を使用して、インフルエンザ核タンパク質細胞内染色を介してモニターした。ハイジャックＲＮＡ ＡＡＶでの処置は、７２時間までにＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、またはインフルエンザＢ感染細胞のパーセンテージを低下させ、９６時間までにインフルエンザ感染を完全に撲滅した。 The percentage of infected cells in culture was monitored via influenza nucleoprotein intracellular staining using FACS analysis. Treatment with hijack RNA AAV reduced the percentage of H1N1, H3N2, or influenza B infected cells by 72 hours and completely eradicated influenza infection by 96 hours.

これらの結果は、カスパーゼ－９を発現するハイジャックＲＮＡ ＡＡＶが細胞培養においてインフルエンザ感染を効果的に死滅させることを示している。 These results demonstrate that hijack RNA AAV expressing caspase-9 effectively kills influenza infection in cell culture.

実施例８
コロナウイルスコンストラクト設計
ＣｏＶポリメラーゼ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ－ポリメラーゼまたはＲｄＲｐ）を介しての（＋）ｓｓＲＮＡからのサブゲノム（－）ｓｓＲＮＡ合成。コロナウイルスＲｄＲｐは、遺伝子間テンプレート－スイッチングドナーシグナルで休止し、コピー選択機構により、５’末端リーダーをコピーするためのゲノムの５’末端近位の高度に相似のアクセプター部位へと移入される。転写調節配列（ＴＲＳ）は、テンプレートスイッチングシグナルとして機能する。ＴＲＳは、ポジティブストランドでは５’ＡＣＧＡＡＣ３’（配列番号３１）であり、ネガティブストランドでは３’ＵＧＣＵＵＧ５’（配列番号３２）である。サブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ）がその中に複数のＴＲＳをまだ有するならば、ＲｄＲｐは、新たなｓｍＲＮＡを小さなゲノムとして認識し、その上でネガティブストランド合成を開始し、内部ドナーシグナルでテンプレートをスイッチし、ネガティブストランドテンプレートを作製して、より短い内部にネストされた（ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｎｅｓｔｅｄ）ｓｇｍＲＮＡを合成する。リーダーＲＮＡ（６０～８０ｎｔ）配列は常に、サブゲノムネガティブストランドの３’末端及びサブゲノムのｍＲＮＡの５’末端にとどまる。 Example 8
Coronavirus construct design Subgenomic (−) ssRNA synthesis from (+) ssRNA via CoV polymerase (RNA-dependent RNA-polymerase or RdRp). Coronavirus RdRp pauses at an intergenic template-switching donor signal and is transferred by a copy selection mechanism into a highly homologous acceptor site proximal to the 5' end of the genome to copy the 5' leader. Transcriptional regulatory sequences (TRS) function as template switching signals. The TRS is 5'ACGAAC3' (SEQ ID NO:31) on the positive strand and 3'UGCUUG5' (SEQ ID NO:32) on the negative strand. If the subgenomic mRNA (sgmRNA) still has multiple TRSs in it, RdRp recognizes the new smRNA as a small genome and initiates negative strand synthesis on it, switching templates with internal donor signals, A negative strand template is generated to synthesize shorter internally nested sgmRNAs. The leader RNA (60-80 nt) sequence always remains at the 3' end of the subgenomic negative strand and the 5' end of the subgenomic mRNA.

サブゲノム（－）ｓｓＲＮＡは、ウイルスタンパク質合成のための新たなｍＲＮＡを生成するための中間体である。したがって、リーダーＲＮＡ及びＴＲＳ配列を模倣するが、目的の遺伝子（例えば、カスパーゼ－９）のネガティブストランドを持つ（－）ｓｓＲＮＡであるコロナウイルス「ハイジャックＲＮＡ」を設計することができる。この戦略の概観は、図１２Ａ及び図１２Ｂに示されている。 Subgenomic (−) ssRNA is an intermediate for generating new mRNA for viral protein synthesis. Thus, a coronavirus "hijack RNA" can be designed that is a (-) ssRNA that mimics the leader RNA and TRS sequences but carries the negative strand of the gene of interest (eg, caspase-9). An overview of this strategy is shown in Figures 12A and 12B.

標準的な方法
分子生物学における標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ （１９８２ ＆ １９８９ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ；Ｗｕ （１９９３） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｖｏｌ． ２１７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）に記載されている。標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ．１－４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ（細菌細胞でのクローニング及びＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞及び酵母でのクローニング（Ｖｏｌ．２）、グリココンジュゲート及びタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載）にもある。 標準的な方法 分子生物学における標準的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ （１９８２ ＆ １９８９ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif.). Standard methods are described by Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc.; New York, NY (Cloning and DNA mutagenesis in bacterial cells (Vol. 1), Cloning in mammalian cells and yeast (Vol. 2), Glycoconjugates and protein expression (Vol. 3), and Bioinformatics (Vol. 3). .4)).

免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化を含むタンパク質精製のための方法は、（Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． １， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化は記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ， ＮＹ， ｐｐ． １６．０．５－１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｃｏ． （２００１） Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ；ｐｐ． ４５－８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （２００１） ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．， ｐｐ． ３８４－３９１を参照されたい）。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の生成、精製、及び断片化は記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９９９） Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，前出）。リガンド／受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。 Methods for protein purification, including immunoprecipitation, chromatography, electrophoresis, centrifugation, and crystallization are described in (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc. ., New York). Chemical analysis, chemical modification, post-translational modification, generation of fusion proteins, glycosylation of proteins have been described (e.g. Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; See Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; sea bream). The generation, purification, and fragmentation of polyclonal and monoclonal antibodies have been described (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; 1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, supra). Standard techniques for characterizing ligand/receptor interactions are available (see, e.g., Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York). want to be).

本明細書において引用される参照文献はすべて、それぞれ個々の刊行物、データベースエントリ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅｌＤエントリ）、特許出願、または特許が具体的かつ個別に、参照により援用されると示されている場合と同程度に参照により援用される。参照により援用されるというこの陳述は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従って、いずれもすべて個々の刊行物、データベースエントリ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅｌＤエントリ）、特許出願、または特許に関することが出願人により意図されており、これらはそれぞれ、そのような引用が参照により援用されるという専用の陳述に直接隣接していなくても、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に同定される。本明細書内に、参照により援用されるという専用の陳述が含まれたとしても、それは、参照により援用されるというこの一般的陳述を何ら弱めるものではない。本明細書における参照文献の引用は、その参照文献が関連する先行技術であることを容認することを意図したものでもなければ、これらの刊行物または文献の内容または日付について何らかの承認を構成するものでもない。 All references cited herein are indicated that each individual publication, database entry (e.g., Genbank sequence or GenelD entry), patent application, or patent is specifically and individually incorporated by reference. incorporated by reference to the same extent. This statement that it is incorporated by reference is subject to §37C. F. R. Consistent with § 1.57(b)(1), any and all references to individual publications, database entries (e.g., Genbank sequences or GenelD entries), patent applications, or patents are intended by Applicant, which each, even if not immediately adjacent to a dedicated statement that such citation is incorporated by reference. F. R. Unambiguously identified in accordance with §1.57(b)(2). The inclusion within this specification of a specific statement of incorporation by reference does not in any way weaken this general statement of incorporation by reference. Citation of a reference herein is not intended as an admission that the reference is pertinent prior art, nor does it constitute any admission as to the contents or dates of these publications or documents. not.

実施例９
この実験では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ依存性ＲＮＡ－ポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）により認識されるように設計された合成ＲＮＡ（「ハイジャックＲＮＡ」）を、細胞培養においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を撲滅するその能力について試験した。認識により、ハイジャックＲＮＡは、ジフテリア毒素断片Ａ（ＤＴ－Ａ）に転写されて、特異的に感染細胞においてアポトーシスを誘導するであろうので、これは、潜在的な処置であり得るであろう（図１３）。 Example 9
In this experiment, synthetic RNAs (“hijack RNAs”) designed to be recognized by the SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA-polymerase (RdRp) were used to eradicate SARS-CoV-2 infection in cell culture. tested for its ability. Upon recognition, the hijack RNA would be transcribed into diphtheria toxin fragment A (DT-A) and specifically induce apoptosis in infected cells, so this could be a potential treatment. (Fig. 13).

方法
ＤＴ－Ａ ｃＤＮＡの逆相補鎖及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｇＲＮＡの二次構造を含有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ハイジャックＲＮＡを発現する新規のベクター（図１５）で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をパッケージングした。ベロ細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０株に０．１ＭＯＩで感染させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及び非感染ベロ細胞を試験（図１５）または対照（ＧＦＰ）ＡＡＶで形質導入した。非感染ジャーカット、ＨＥＫ及びＢＨＫ－２１細胞も試験ＡＡＶで形質導入して、非感染細胞におけるハイジャックＲＮＡの潜在的なオフターゲット作用をさらに調査した。ＦＡＣＳ及び自動細胞カウントにより毎日、細胞死及び生存を評価した。細胞イメージングを介して細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察することにより、かつウイルスタンパク質の細胞内染色を介してのＦＡＣＳにより、細胞培養における感染の根絶を確立した。感染及び非感染細胞におけるＤＴ－Ａ産生を、培養物上清及び細胞溶解産物のウェスタンブロット（ＷＢ）分析により測定した。様々な（０～１００ｎｇ）濃度のインビトロ転写されたハイジャックＲＮＡ（図１４）で細胞をトランスフェクトすることにより、同じ実験を繰り返した。ハイジャックＲＮＡのＲｄＲｐ特異的発現を評価するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲｄＲｐを発現する安定なベロ及びジャーカット細胞系も生成した。 Method Adeno-associated virus (AAV) with a novel vector expressing SARS-CoV-2 hijack RNA containing the reverse complement of DT-A cDNA and the secondary structure of SARS-CoV-2 sgRNA (Figure 15). was packaged. Vero cells were infected with SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 strain at 0.1 MOI. SARS-CoV-2 infected and uninfected Vero cells were transduced with test (Figure 15) or control (GFP) AAV. Uninfected Jurkat, HEK and BHK-21 cells were also transduced with test AAV to further investigate potential off-target effects of hijack RNAs in uninfected cells. Cell death and survival were assessed daily by FACS and automated cell counts. Eradication of infection in cell culture was established by observing cytopathic effect (CPE) via cell imaging and by FACS via intracellular staining of viral proteins. DT-A production in infected and uninfected cells was measured by Western blot (WB) analysis of culture supernatants and cell lysates. The same experiment was repeated by transfecting cells with various (0-100 ng) concentrations of in vitro transcribed hijack RNA (FIG. 14). Stable Vero and Jurkat cell lines expressing SARS-CoV-2RdRp were also generated to assess RdRp-specific expression of hijack RNA.

結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、試験ＡＡＶ形質導入から４８時間以内に培養物から成功裏に根絶され、細胞増殖アッセイ及び細胞イメージにおけるＣＰＥの非存在、さらにはＦＡＣＳ解析により確認された（図１６Ａ）。同じ結果が、ハイジャックＲＮＡトランスフェクションから２４時間以内に観察された。試験ＡＡＶまたはハイジャックＲＮＡは、非感染細胞に対して作用を有さなかった（図１６Ｂ）。ＲｄＲｐ発現において同様の結果が観察され、仮定されていた作用機序が確認された。 Results SARS-CoV-2 infection was successfully eradicated from cultures within 48 hours of test AAV transduction, confirmed by the absence of CPE in cell proliferation assays and cell images, as well as by FACS analysis (Fig. 16A). ). The same results were observed within 24 hours of hijack RNA transfection. Test AAV or hijack RNA had no effect on uninfected cells (Fig. 16B). Similar results were observed for RdRp expression, confirming the postulated mechanism of action.

結論
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲｄＲｐと連結するようにトランスで送達されるか、発現されるＲＮＡは、ウイルス機構をハイジャックし、感染細胞において急速な死滅を誘導したが、非感染細胞においては誘導しなかった。いくつかの異なる細胞系において実証されたとおり、ハイジャックＲＮＡの死滅分子（ｋｉｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）ＤＴ－Ａへの翻訳はウイルスＲｄＲｐに依存し、この処置の特異性及び感受性が確認された。この新規のアプローチは、ＣＯＶＩＤ－１９感染を根絶するための有効な処置を開発するために使用することができるであろう。 Conclusion RNA delivered in trans or expressed to link with SARS-CoV-2RdRp hijacked the viral machinery and induced rapid death in infected, but not uninfected, cells. rice field. As demonstrated in several different cell lines, translation of hijack RNA into the kill molecule DT-A is dependent on viral RdRp, confirming the specificity and sensitivity of this treatment. This novel approach could be used to develop effective treatments to eradicate COVID-19 infection.

本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載のものに加えて、前述の記載及び添付の図面から、当業者には本発明の様々な変更が明白になるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に該当することが意図されている。 This invention should not be limited in scope by the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the invention, in addition to those described herein, will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying drawings. Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.

Claims (52)

組換え核酸分子であって、
第１及び第２のウイルス転写認識シグナルにより挟まれている、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、ジフテリア毒素Ａ（またはその断片）、またはそれらの任意の組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子；
前記第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーター；及び
ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、ジフテリア毒素Ａ（またはその断片）、またはそれらの任意の組合せをコードする前記ネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接する５’側の第２のプロモーター
を含む前記組換え核酸分子。 A recombinant nucleic acid molecule comprising
A negative-strand or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, diphtheria toxin A (or fragment thereof), or any combination thereof, flanked by first and second viral transcriptional recognition signals ;
a first promoter upstream (5') of said first viral transcriptional recognition signal; and said negative encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, diphtheria toxin A (or fragment thereof), or any combination thereof. Said recombinant nucleic acid molecule comprising a second promoter 5' flanking the stranded nucleic acid molecule or the pgRNA nucleic acid molecule. 前記ネガティブストランド核酸分子が、ネガティブセンスＲＮＡ、ネガティブセンスＤＮＡ、ノンコーディングネガティブセンスＲＮＡを発現する一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せである、請求項１に記載の組換え核酸分子。 2. The recombinant nucleic acid of claim 1, wherein said negative-strand nucleic acid molecule is negative-sense RNA, negative-sense DNA, single- or double-stranded DNA that expresses non-coding negative-sense RNA, or any combination thereof. molecule. 前記第１及び第２のウイルス転写認識シグナルが、ネガティブストランドウイルス、ＲＮＡ逆転写ウイルス、またはＤＮＡ逆転写ウイルスから選択されるウイルスから選択される、請求項１または２に記載の組換え核酸分子。 3. The recombinant nucleic acid molecule of claim 1 or 2, wherein said first and second viral transcription recognition signals are selected from viruses selected from negative strand viruses, RNA reverse transcription viruses, or DNA reverse transcription viruses. ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードする前記ネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子の下流（３’側）にポリＡテールをさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の組換え核酸分子。 4. The method of any of claims 1-3, further comprising a poly A tail downstream (3') of said negative strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof. recombinant nucleic acid molecule. 前記アポトーシス誘導タンパク質が、ＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、シトクロムＣ、ＳＭＡＣ、及びアポトーシス誘導因子、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。 said apoptosis-inducing protein consists of BAX, BID, BAK, BAD, caspase-2, caspase-8, caspase-9, caspase-10, caspase-11, caspase-12, cytochrome C, SMAC, and an apoptosis-inducing factor, or any combination thereof The recombinant nucleic acid molecule of any one of claims 1-4, selected from the group. 前記第１のプロモーターが、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、アルブミンプロモーター及び／または増強要素、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）プロモーター、ＡＡＴ（アルファ－１－アンチトリプシン）プロモーター、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）プロモーターまたはＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）プロモーターからなる群から選択される強力なユビキタスプロモーターまたは肝臓組織特異的プロモーターを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。 wherein said first promoter is TBG (thyroxine binding globulin), albumin promoter and/or enhancing element, AFP (alpha-fetoprotein) promoter, AAT (alpha-1-antitrypsin) promoter, ApoE (apolipoprotein E) promoter or PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) promoter, a strong ubiquitous promoter or a liver tissue-specific promoter. 前記第２のプロモーターが伸長因子１アルファ結合配列（ＥＦＳ）を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。 7. The recombinant nucleic acid molecule of any one of claims 1-6, wherein said second promoter comprises an elongation factor 1 alpha binding sequence (EFS). 前記ケモカインがＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、及びＣＸ３ＣＬ１から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。 said chemokine is , CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, and CX3CL1 to A recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 3. 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０Ｌ、Ｍｉｇ、及びＣｒｇ－２からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。 said cytokine is IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, CD40L, Mig, and Crg -2. The recombinant nucleic acid molecule of any one of claims 1-8. 前記ウイルス転写認識シグナルが、配列番号１に記載のとおりのイプシロン認識シグナルまたは配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０からなる群から選択されるコロナウイルス認識配列を含む、請求項３に記載の組換え核酸分子。 wherein said viral transcriptional recognition signal comprises an epsilon recognition signal as set forth in SEQ ID NO: 1 or a coronavirus recognition sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 30. 4. The recombinant nucleic acid molecule of paragraph 3. 前記ウイルスが、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、水疱性口内炎インドウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ハンタンウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、砂バエ熱シチリアウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＣ、トゴトウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、ウシ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒトスプーマウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、コロナウイルス、及びそれらの任意の組合せである、請求項３に記載の組換え核酸分子。 The virus is coronavirus, hepatitis B virus, hepatitis D virus, Ebola virus, Marburg virus, human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, human respiratory rash virus, vesicular stomatitis India Viruses, rabies virus, bovine epidemic fever virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Bunyamwella virus, Hantan virus, Nairobi sheep disease virus, sand fly Sicilian virus, influenza virus A, influenza virus C, Thogoto virus, murine mammary tumor virus, murine leukemia virus, avian leukemia virus, Mason-Pfizer simian virus, bovine leukemia virus, human immunodeficiency virus 1, human spuma virus, duck hepatitis B virus, coronaviruses, and any combination thereof; 4. The recombinant nucleic acid molecule of claim 3. ウイルスポリメラーゼ、逆転写酵素、カプシド、エンベロープ、パッケージングシグナル、または転座モチーフのための配列(コーディングまたはノンコーディング）を含まない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。 12. The recombinant nucleic acid molecule of any one of claims 1-11, which does not contain sequences (coding or non-coding) for viral polymerases, reverse transcriptase, capsids, envelopes, packaging signals, or translocation motifs. . 請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸配列を含むベクター。 A vector comprising a recombinant nucleic acid sequence according to any one of claims 1-12. 哺乳類細胞に送達するための送達ベクターまたはビヒクルを含む、請求項１３に記載のベクター。 14. The vector of claim 13, comprising a delivery vector or vehicle for delivery to mammalian cells. ＶＬＰ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、リポソーム、ナノ粒子、ミセル、ポリマーベシクル、またはポリマーソームを含む、請求項１４に記載の送達ベクターまたはビヒクル。 15. The delivery vector or vehicle of claim 14, comprising VLPs, adeno-associated virus (AAV), liposomes, nanoparticles, micelles, polymeric vesicles, or polymericsomes. 請求項１～１２に記載の組換え核酸配列のいずれか１つ、または請求項１３～１５に記載のベクターのいずれか１つを含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising any one of the recombinant nucleic acid sequences of claims 1-12 or any one of the vectors of claims 13-15. 複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
Ｂ型肝炎ウイルスカプシドもしくはＤ型肝炎ウイルスカプシドからのカプシドタンパク質またはコロナウイルス融合タンパク質に融合している任意選択の転座モチーフ（ＴＬＭ）；及び
第１及び第２のウイルス転写認識シグナルにより挟まれている、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、ジフテリア毒素Ａ（またはその断片）、またはそれらの任意の組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子；
前記第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーター：及び
ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、ジフテリア毒素Ａ（またはその断片）、またはそれらの任意の組合せをコードする前記ネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接する５’側の第２のプロモーター
を含む、前記複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。 A replication-deficient virus-like particle (VLP),
an optional translocation motif (TLM) fused to a capsid protein from a hepatitis B virus capsid or a hepatitis D virus capsid or a coronavirus fusion protein; and flanked by first and second viral transcriptional recognition signals. a negative-strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, diphtheria toxin A (or fragment thereof), or any combination thereof;
a first promoter upstream (5') of said first viral transcriptional recognition signal; and said negative encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, diphtheria toxin A (or fragment thereof), or any combination thereof. Said replication-deficient virus-like particle (VLP) comprising a second promoter 5' flanking the stranded nucleic acid molecule or the pgRNA nucleic acid molecule. 複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、
第１及び第２の標的ウイルス転写認識シグナルにより挟まれている、ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、ジフテリア毒素Ａ（またはその断片）、またはそれらの任意の組合せをコードするネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子；
前記第１のウイルス転写認識シグナルの上流（５’側）の第１のプロモーター；及び
ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、ジフテリア毒素Ａ（またはその断片）、またはそれらの任意の組合せをコードする前記ネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子に隣接する５’側の第２のプロモーター
を含み、その際、前記ＶＬＰが標的ウイルス感染細胞について指向性を示す、前記複製不全ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。 A replication-deficient virus-like particle (VLP),
A negative-strand nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, diphtheria toxin A (or fragment thereof), or any combination thereof, flanked by first and second target viral transcriptional recognition signals molecule;
a first promoter upstream (5') of said first viral transcriptional recognition signal; and said negative encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, diphtheria toxin A (or fragment thereof), or any combination thereof. Said replication-deficient virus-like particle (VLP) comprising a second promoter 5' adjacent to the stranded nucleic acid molecule or pgRNA nucleic acid molecule, wherein said VLP is tropic for a target virus-infected cell. 前記ネガティブストランド核酸分子が、ネガティブセンスＲＮＡ、ネガティブセンスＤＮＡ、ノンコーディングネガティブセンスＲＮＡを発現する一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せである、請求項１７または１８に記載の複製不全ウイルス様粒子。 19. The replication of claim 17 or 18, wherein said negative-strand nucleic acid molecule is negative-sense RNA, negative-sense DNA, single- or double-stranded DNA expressing non-coding negative-sense RNA, or any combination thereof. Incomplete virus-like particles. ケモカイン、サイトカイン、アポトーシス誘導タンパク質、またはそれらの組合せをコードする前記ネガティブストランド核酸分子またはｐｇＲＮＡ核酸分子の下流（３’側）にポリＡテールをさらに含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 20. Any one of claims 17-19, further comprising a poly A tail downstream (3') of said negative strand or pgRNA nucleic acid molecule encoding a chemokine, cytokine, apoptosis-inducing protein, or a combination thereof. A replication-deficient virus-like particle as described. 前記第１のプロモーターが、ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）、アルブミンプロモーター及び／または増強要素、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）プロモーター、ＡＡＴ（アルファ－１－アンチトリプシン）プロモーター、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）プロモーターまたはＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）プロモーターからなる群から選択される強力なユビキタスプロモーターまたは肝臓組織特異的プロモーターを含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 wherein said first promoter is TBG (thyroxine binding globulin), albumin promoter and/or enhancing element, AFP (alpha-fetoprotein) promoter, AAT (alpha-1-antitrypsin) promoter, ApoE (apolipoprotein E) promoter or PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) promoter, a strong ubiquitous promoter or a liver tissue-specific promoter. 前記第２のプロモーターが伸長因子１アルファ結合配列（ＥＦＳ）を含む、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 The replication-deficient virus-like particle of any one of claims 17-21, wherein said second promoter comprises an elongation factor 1 alpha binding sequence (EFS). 前記ウイルス転写認識シグナルが、ネガティブストランドウイルス、ＲＮＡ逆転写ウイルス、またはＤＮＡ逆転写ウイルスから選択されるウイルスから選択される、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 A replication-deficient virus-like particle according to any one of claims 17 to 22, wherein said viral transcription recognition signal is selected from viruses selected from negative strand viruses, RNA reverse transcription viruses or DNA reverse transcription viruses. 前記ウイルス転写認識シグナルが、前記イプシロン認識シグナル（配列番号１）または配列番号２５もしくは配列番号２６などのコロナウイルスのウイルス認識配列を含む、請求項２３に記載の複製不全ウイルス様粒子。 24. The replication-defective virus-like particle of claim 23, wherein said viral transcriptional recognition signal comprises said epsilon recognition signal (SEQ ID NO: 1) or a coronavirus viral recognition sequence such as SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26. 前記アポトーシス誘導タンパク質が、ＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、シトクロムＣ、ＳＭＡＣ、及びアポトーシス誘導因子からなる群から選択される、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 wherein said apoptosis-inducing protein is selected from the group consisting of BAX, BID, BAK, BAD, caspase-2, caspase-8, caspase-9, caspase-10, caspase-11, caspase-12, cytochrome C, SMAC, and an apoptosis-inducing factor. 25. The replication-deficient virus-like particle of any one of Items 17-24. 前記ケモカインが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、及びＣＸ３ＣＬ１から選択される、請求項１７～２５のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 the chemokine is CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, and CX3CL1; The replication-deficient virus-like particle of any one of Claims 1 to 3. 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０Ｌ、Ｍｉｇ、及びＣｒｇ－２からなる群から選択される、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 said cytokine is IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, CD40L, Mig, and Crg -2. 前記ウイルスが、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、水疱性口内炎インドウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ハンタンウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、砂バエ熱シチリアウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、トゴトウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、ウシ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒトスプーマウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、コロナウイルス、及びそれらの任意の組合せである、請求項１７～２７のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 The virus is coronavirus, hepatitis B virus, hepatitis D virus, Ebola virus, Marburg virus, human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, human respiratory rash virus, vesicular stomatitis India Viruses, rabies virus, bovine epidemic fever virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Bunyamwella virus, Hantan virus, Nairobi sheep disease virus, sand fly Sicilian virus, influenza virus A, influenza virus B, influenza virus C, Thogoto virus, mouse mammary tumor virus, mouse leukemia virus, avian leukemia virus, Mason-Pfizer simian virus, bovine leukemia virus, human immunodeficiency virus 1, human spuma virus, duck hepatitis B virus, coronaviruses, and any thereof The replication-deficient virus-like particle of any one of claims 17-27, which is a combination. 前記核酸分子が、ウイルスカプシド、ポリメラーゼ、逆転写酵素、エンベロープ、パッケージングシグナル、または転座モチーフのための配列(コーディングまたはノンコーディング）を含まない、請求項１７～２８のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子。 29. A nucleic acid molecule according to any one of claims 17-28, wherein said nucleic acid molecule does not contain sequences (coding or non-coding) for viral capsid, polymerase, reverse transcriptase, envelope, packaging signals or translocation motifs. replication-deficient virus-like particles. 請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子を含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the replication-deficient virus-like particle of any one of claims 17-29. それを必要とする対象においてウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のベクター、請求項１６もしくは３０に記載の医薬組成物、または請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子を投与することを含む、前記方法。 A method of treating a viral infection in a subject in need thereof, wherein said subject is administered a recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 1-12 or any one of claims 13-15 30. Said method comprising administering the vector of claim 16, the pharmaceutical composition of claim 16 or 30, or the replication-defective virus-like particle of any one of claims 17-29. 前記ウイルス感染症が、ボルチモア分類ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩに分類されるウイルスからの感染症を含む、請求項３１に記載の方法。 32. The method of claim 31, wherein the viral infection comprises an infection from a virus classified as Baltimore Classification IV, V, VI, or VII. 前記ウイルス感染症が、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、水疱性口内炎インドウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ流行熱ウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ハンタンウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス、砂バエ熱シチリアウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＣ、トゴトウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス白血病ウイルス、トリ白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、ウシ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒトスプーマウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、及びそれらの組合せからなる群から選択されるウイルスからの感染症を含む、請求項３２に記載の方法。 The viral infection is coronavirus, hepatitis B virus, hepatitis D virus, Ebola virus, Marburg virus, human parainfluenza virus 1, measles virus, mumps virus, human respiratory rash virus, bullous Stomatitis India virus, rabies virus, bovine epidemic fever virus, lymphocytic choriomeningitis virus, Bunyamwella virus, Hantan virus, Nairobi sheep disease virus, sand fly Sicilian virus, influenza virus A, influenza virus C, Togoto murine mammary tumor virus, murine leukemia virus, avian leukemia virus, Mason-Pfizer simian virus, bovine leukemia virus, human immunodeficiency virus 1, human spuma virus, duck hepatitis B virus, and combinations thereof. 33. The method of claim 32, comprising an infection from a virus that 前記ウイルス感染症が、フィロウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ニューモウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、オルトヘパドナウイルス、アビヘパドナウイルス、哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス、鳥類Ｃ型レトロウイルス、Ｄ型レトロウイルス、ＢＬＶ－ＨＴＬＶレトロウイルス、レンチウイルス、スプーマウイルス、及びそれらの組合せからなる群から選択されるウイルスからの感染症を含む、請求項３２に記載の方法。 The viral infection is filovirus, paramyxovirus, morbillivirus, rubulavirus, pneumovirus, vecyclovirus, lyssavirus, ephemerovirus, arenavirus, bunyavirus, hantavirus, nairovirus, phlebovirus, orthohepadna from the group consisting of viruses, abihepadnaviruses, mammalian retroviruses type B, mammalian retroviruses type C, avian retroviruses type C, type D retroviruses, BLV-HTLV retroviruses, lentiviruses, spumaviruses, and combinations thereof 33. The method of claim 32, comprising infection from a selected virus. 前記核酸分子、ベクター、医薬組成物、または複製不全ウイルス様粒子が、投与されると、肝臓細胞に侵入する、請求項３１に記載の方法。 32. The method of claim 31, wherein the nucleic acid molecule, vector, pharmaceutical composition, or replication-deficient virus-like particle enters liver cells upon administration. 前記核酸分子、ベクター、医薬組成物、または複製不全ウイルス様粒子が、投与されると、前記核酸分子を肝臓細胞に送達して、前記核酸分子が前記肝臓細胞で発現される、請求項３５に記載の方法。 36. The method of claim 35, wherein said nucleic acid molecule, vector, pharmaceutical composition or replication defective virus-like particle upon administration delivers said nucleic acid molecule to liver cells such that said nucleic acid molecule is expressed in said liver cells. described method. 前記対象が、急性、慢性、または潜伏ウイルス感染症を有する、請求項３１～３６のいずれか１項に記載の方法。 The method of any one of claims 31-36, wherein the subject has an acute, chronic, or latent viral infection. 投与が、前記ウイルス感染症を引き起こしているウイルスに感染している細胞に対する免疫応答を誘導する、請求項３１～３７のいずれか１項に記載の方法。 38. The method of any one of claims 31-37, wherein administration induces an immune response against cells infected with the virus causing said viral infection. 投与が、前記ウイルス感染症を引き起こしているウイルスに感染している細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項３１～３８のいずれか１項に記載の方法。 39. The method of any one of claims 31-38, wherein administering induces apoptosis in cells infected with the virus causing said viral infection. それを必要とする対象において、ウイルスに感染している細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記対象を、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のベクター、請求項１６もしくは３０に記載の医薬組成物、または請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子と接触させることを含む、前記方法。 A method of inducing an immune response against cells infected with a virus in a subject in need thereof, wherein the subject is a recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 1-12, or Contacting with the vector of any one of claims 13 to 15, the pharmaceutical composition of any one of claims 16 or 30, or the replication-deficient virus-like particle of any one of claims 17 to 29. The method above. それを必要とする対象において、ウイルスに感染した細胞に対するアポトーシス応答を誘導する方法であって、前記対象を、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１６もしくは３０に記載の医薬組成物、または請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子を含む医薬組成物と接触させることを含む、前記方法。 13. A method of inducing an apoptotic response against virus-infected cells in a subject in need thereof, said subject comprising a recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 1-12, or claim 13. 15, or the pharmaceutical composition of any one of claims 16 or 30, or the pharmaceutical composition comprising the replication-deficient virus-like particle of any one of claims 17-29; The above method, comprising contacting. 前記ウイルスが、コロナウイルス、インフルエンザ、ＨＢＶ、ＨＤＶ、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、またはそれらの任意の組合せである、請求項３１～４１のいずれか１項に記載の方法。 42. Any one of claims 31-41, wherein the virus is coronavirus, influenza, HBV, HDV, hepatitis A virus (HAV), hepatitis C virus (HCV), or any combination thereof. the method of. 対象において、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、またはコロナウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に、前記対象を、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１６もしくは３０に記載の医薬組成物、または請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子を投与することを含む、前記方法 A method of treating hepatitis B, influenza, or coronavirus infection in a subject, wherein said subject comprises the recombinant nucleic acid molecule of any one of claims 1-12, or administering the vector according to any one of claims 13 to 15, or the pharmaceutical composition according to claims 16 or 30, or the replication-deficient virus-like particle according to any one of claims 17 to 29 the method, comprising 少なくとも１種の抗ウイルス薬、ＨＢＶポリメラーゼ阻害薬、インターフェロン、ＴＬＲ－７アゴニストまたはＴＬＲ－９アゴニストなどのＴＬＲ調節薬、治療用ワクチン、ある特定の細胞ウイルスＲＮＡセンサーの免疫活性化因子、ウイルス侵入阻害薬、ウイルス成熟阻害薬、別個のカプシドアセンブリ調節薬、別個または未知の機構の抗ウイルス化合物、及びそれらの任意の組合せを投与することをさらに含む、請求項３１～４３のいずれか１項に記載の方法。 at least one antiviral agent, an HBV polymerase inhibitor, an interferon, a TLR modulator such as a TLR-7 agonist or a TLR-9 agonist, a therapeutic vaccine, an immune activator of certain cellular viral RNA sensors, viral entry inhibition 44. Any one of claims 31-43, further comprising administering a drug, a viral maturation inhibitor, a distinct capsid assembly modulator, an antiviral compound of distinct or unknown mechanism, and any combination thereof. the method of. 少なくとも１種の抗ウイルス薬３ＴＣ、ＦＴＣ、Ｌ－ＦＭＡＵ、インターフェロン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン（Ｌ－ｄＴ）、バルトルシタビン（３’－バリニルＬ－ｄＣ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－グアニン（ＤＸＧ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－２，６－ジアミノプリン（ＤＡＰＤ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－６－クロロプリン（ＡＣＰ）、ファムシクロビル、ペンシクロビル、ロブカビル、ガンシクロビル、リバビリン、テノフォビル、ビクテグラビル、エムトリシタビン、ビクタルビ、及びそれらの任意の組合せを投与することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。 At least one antiviral agent 3TC, FTC, L-FMAU, interferon, adefovir dipivoxil, entecavir, telbivudine (L-dT), bartolcitabine (3'-valinyl L-dC), beta. - D-dioxolanyl-guanine (DXG), beta. - D-dioxolanyl-2,6-diaminopurine (DAPD), beta. -D-dioxolanyl-6-chloropurine (ACP), famciclovir, penciclovir, lobucavir, ganciclovir, ribavirin, tenofovir, victegravir, emtricitabine, bictarbi, and any combination thereof, claim 44 The method described in . それを必要とする対象において、インフルエンザウイルスに感染した細胞に対するアポトーシス応答を誘導する方法であって、前記対象を、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１６もしくは３０に記載の医薬組成物、または請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子と接触させることを含む、前記方法。 A method of inducing an apoptotic response against influenza virus-infected cells in a subject in need thereof, wherein the subject is a recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 1-12, or contacting with the vector of any one of claims 13-15, or the pharmaceutical composition of any one of claims 16 or 30, or the replication-deficient virus-like particle of any one of claims 17-29. The method above. インフルエンザウイルスを含む前記ウイルスが、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣ、またはそれらの任意の組合せである、請求項３１～４１のいずれか１項に記載の方法。 42. The method of any one of claims 31-41, wherein the virus, including influenza virus, is influenza A, influenza B, influenza C, or any combination thereof. 対象においてインフルエンザを処置する方法であって、前記対象に、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１６もしくは３０に記載の医薬組成物、または請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子を投与することを含む、前記方法。 A method of treating influenza in a subject, wherein said subject is administered a recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 1-12, or a vector according to any one of claims 13-15, or Said method comprising administering the pharmaceutical composition according to claim 16 or 30, or the replication-deficient virus-like particle according to any one of claims 17-29. 少なくとも１種の抗ウイルス薬３ＴＣ、ＦＴＣ、Ｌ－ＦＭＡＵ、インターフェロン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、テルビブジン（Ｌ－ｄＴ）、バルトルシタビン（３’－バリニルＬ－ｄＣ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－グアニン（ＤＸＧ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－２，６－ジアミノプリン（ＤＡＰＤ）、ベータ．－Ｄ－ジオキソラニル－６－クロロプリン（ＡＣＰ）、ファムシクロビル、ペンシクロビル、ロブカビル、ガンシクロビル、リバビリン、テノフォビル、ビクテグラビル、エムトリシタビン、ビクタルビ、及びそれらの任意の組合せを投与することをさらに含む、請求項３１～４３のいずれか１項に記載の方法。 At least one antiviral agent 3TC, FTC, L-FMAU, interferon, adefovir dipivoxil, entecavir, telbivudine (L-dT), bartolcitabine (3'-valinyl L-dC), beta. - D-dioxolanyl-guanine (DXG), beta. - D-dioxolanyl-2,6-diaminopurine (DAPD), beta. -D-dioxolanyl-6-chloropurine (ACP), famciclovir, penciclovir, lobucavir, ganciclovir, ribavirin, tenofovir, victegravir, emtricitabine, bictarbi, and any combination thereof, claim 31 44. The method of any one of claims 1-43. それを必要とする対象において、コロナウイルスに感染した細胞に対するアポトーシス応答を誘導する方法であって、前記対象を、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１６もしくは３０に記載の医薬組成物、または請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子と接触させることを含む、前記方法。 A method of inducing an apoptotic response against coronavirus-infected cells in a subject in need thereof, wherein the subject is a recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 1-12, or contacting with the vector of any one of claims 13-15, or the pharmaceutical composition of any one of claims 16 or 30, or the replication-deficient virus-like particle of any one of claims 17-29. The method above. 対象においてコロナウイルス感染症を処置する方法であって、前記対象に、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組換え核酸分子、または請求項１３～１５のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１６もしくは３０に記載の医薬組成物、または請求項１７～２９のいずれか１項に記載の複製不全ウイルス様粒子を投与することを含む、前記方法。 A method of treating a coronavirus infection in a subject, comprising administering to said subject a recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 1-12, or a recombinant nucleic acid molecule according to any one of claims 13-15. Said method comprising administering a vector, or a pharmaceutical composition according to claim 16 or 30, or a replication-defective virus-like particle according to any one of claims 17-29. 前記処置を、維持処置として、または安定しているか、もしくは検出不可能な疾患を達成するために患者が必要とする限り毎週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、１か月に１回、２か月ごとに１回、３か月ごとに１回、４か月ごとに１回、５か月ごとに１回、６か月ごとに１回、または７か月ごとに１回、または８か月ごとに１回、または９か月ごとに１回、または１０か月ごとに１回、または１１か月ごとに１回、または１年に１回を含めて定期的に投与する、請求項３１～５１のいずれか１項に記載の方法。 The treatment may be administered as maintenance treatment or as long as the patient needs to achieve stable or undetectable disease, once weekly, once every two weeks, once every three weeks, once every three weeks. Once every month, Once every 2 months, Once every 3 months, Once every 4 months, Once every 5 months, Once every 6 months, or 7 months once every 8 months, or once every 9 months, or once every 10 months, or once every 11 months, or once a year 52. The method of any one of claims 31-51, administered periodically.
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