JP2022546037A - Ｃｄ７３阻害剤の結晶形態 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＣＤ７３の活性を阻害し、かつがんを治療するのに有用である、５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態、およびこれを含む医薬組成物に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、ＣＤ７３の活性を阻害し、かつがんを治療するのに有用である、５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態、およびこれを含む医薬組成物に関する。
５’－ヌクレオチダーゼまたはエクト－５’ヌクレオチダーゼ（ＥＣ３．１．３．５）としても既知のＣＤ７３は、５’モノヌクレオチドをヌクレオシドに変換する酵素である。ＣＤ７３は、多くの組織において発現し、がん組織において上方調節され、ＣＤ７３経路は、アデノシン受容体シグナル伝達を介して抗腫瘍Ｔ細胞免疫を制限することにより腫瘍の増殖を促進する（Ｚｈａｎｇ Ｂ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０；７０：６４０７－６４１１、Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０１７；２２：１６８６－１６９６）。ＣＤ７３欠損マウスは、抗腫瘍免疫が増大しており、実験的転移に対して耐性である（Ｓｔａｇｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１１；７１：２８９２－２９００）。腫瘍ＣＤ７３によって生成された細胞外アデノシンは、腫瘍微小環境において蓄積し、抗腫瘍Ｔ細胞免疫を損ない（Ｚｈａｎｇ Ｂ、Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ Ｌ）、腫瘍による免疫逃避、腫瘍細胞の増殖、移動、血管新生、転移、および化学療法抵抗性と関連している（Ｉｎｏｕｅ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８：８７３８－８７５１）。また、ＣＤ７３発現の増加は、免疫抑制の増加と関係しているとも報告されている（Ｊｉｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：２２４５－２２５５（２０１０））。
ひいては、ＣＤ７３経路が免疫抑制効果を発揮し、ＣＤ７３経路を遮断することががんの治療において有用であり得ることが示唆されている（Ａｌｌａｒｄ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１６；８：１４５－１６３）。ＣＤ７３阻害剤は、がんの治療用に臨床試験中である（Ｈａｙ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；５（８）：ｅ１２０８８７５、Ａｌｌａｒｄ Ｄ）。
「ＣＤ７３阻害剤」と題された米国特許出願第１６／４８１，１４６号は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１９０７４号の米国国内段階であり、以下の化合物：
（式Ｉ、これは、５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンである）を含む、ある特定のＣＤ７３阻害剤分子を開示している。
したがって、本発明は、化合物：
（５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン）
の結晶形態を提供する。
の結晶形態を提供する。
好ましい実施形態では、結晶形態は、化合物：
（５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン）
のものである。
のものである。
本発明はまた、化合物５－［５－［－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む。
結晶形態１
１つの好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも５００ｇの式：
で示される化合物（５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン）の無水結晶形態を含む組成物を提供する。
１つの好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも５００ｇの式：
別の好ましい実施形態では、組成物における無水結晶形態は、（ａ）０．２度の回折角の許容差を有する、１１．７°、１５．８°、１６．０°、２６．８°、および２７．２°でのピークのうちの１つ以上と組み合わせた、４．７°の回折角２シータでのＸ線回折パターンのピーク、ならびに（ｂ）２５．４、２８．９、４３．１、１０９．３、１２４．４、１２８．２、および１６０．７ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル、のうちの少なくとも１つを特徴とする。
別の好ましい実施形態では、無水結晶形態は、１６．６、１８．３、２０．７、２２．１、２３．９、２６．６、２７．６、２８．１、３０．２、３１．２、３２．２、３８．６、３９．７、４１．２、１１１．０、１１２．０、１３０．７、１４５．１、１４６．３、１５０．１、１５１．０、１５３．４、１５６．７、１５７．６、１５８．６、１５９．３、１６０．７、１６３．４、１６５．９、１６９．４、および１７０．２ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とする１つ以上のピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルをさらに特徴とする。
別の好ましい実施形態では、無水結晶形態は、１６．６、１８．３、２０．７、２２．１、２３．９、２５．４、２６．６、２７．６、２８．１、２８．９、３０．２、３１．２、３２．２、３８．６、３９．７、４１．２、４３．１、１０９．３、１１１．０、１１２．０、１２４．４、１２８．２、１３０．７、１４５．１、１４６．３、１５０．１、１５１．０、１５３．４、１５６．７、１５７．６、１５８．６、１５９．３、１６０．７、１６３．４、１６５．９、１６７．０、１６９．４、および１７０．２ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを特徴とする。
別の好ましい実施形態では、組成物中の無水結晶形態は、化合物５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンのものである。
別の好ましい実施形態では、組成物は、混入物を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％含まない。別の好ましい実施形態では、組成物は、混入物を少なくとも９５％含まない。別の好ましい実施形態では、組成物は、混入物を少なくとも９６％含まない。別の好ましい実施形態では、組成物は、混入物を少なくとも９７％含まない。別の好ましい実施形態では、組成物は、混入物を少なくとも９８％含まない。別の好ましい実施形態では、組成物は、混入物を少なくとも９９％含まない。
別の好ましい実施形態では、組成物は、造粒組成物である。別の好ましい実施形態では、造粒組成物は、湿潤造粒組成物である。別の好ましい実施形態では、造粒組成物は、乾燥造粒組成物である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｋｇの組成物を含む製造容器を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１ｋｇの組成物を含む製造容器を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも５ｋｇの組成物を含む製造容器を提供する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、組成物と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
結晶形態２
別の好ましい実施形態では、結晶形態は、式：
で示される化合物（５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン）の脱溶媒和（無水）結晶形態であり、これは、（ａ）０．２度の回折角の許容差を有する、６．４°、９．６°、１１．０°、および１１．６°でのピークのうちの１つ以上と組み合わせた、４．３～５．５°の回折角２シータでのＸ線回折パターンのピーク、ならびに（ｂ）１７．２、２８．７、１２２．０、１２６．１、１４３．６、および１５５．５ｐｐｍ（それぞれ、±０．２のｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル、のうちの少なくとも１つを特徴とする。
別の好ましい実施形態では、結晶形態は、式：
別の好ましい実施形態では、４．３～５．５°の回折角２シータでのＸ線回折パターンのピークは、４．３°の回折角２シータにある。
別の好ましい実施形態では、脱溶媒和物（無水）結晶形態は、１８．９、２１．１、２２．５、２４．４、２６．７、２７．８、２９．７、３９．７、４１．３、４５．５、５０．１、１１０．７、１１１．７、１１２．４、１２５．０、１２９．１、１４４．８、１４６．２、１４７．２、１４９．９、１５１．１、１５３．０、１５５．５、１５７．２、１５９．０、１６０．６、１６１．４、１６２．７、１６４．８、１６７．０、１６８．３、および１７０．４ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とする１つ以上のピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルをさらに特徴とする。
別の好ましい実施形態では、脱溶媒和物（無水）結晶形態は、１７．２、１８．９、２１．１、２２．５、２４．４、２６．７、２７．８、２８．７、２９．７、３９．７、４１．３、４５．５、５０．１、１１０．７、１１１．７、１１２．４、１２２．０、１２５．０、１２６．１、１２９．１、１４３．６、１４４．８、１４６．２、１４７．２、１４９．９、１５１．１、１５３．０、１５５．５、１５７．２、１５９．０、１６０．６、１６１．４、１６２．７、１６４．８、１６７．０、１６８．３、および１７０．４ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを特徴とする。
別の好ましい実施形態では、脱溶媒和物（無水）結晶形態は、混入物を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％含まない。別の好ましい実施形態では、脱溶媒和物（無水）結晶形態は、混入物を少なくとも９５％含まない。別の好ましい実施形態では、脱溶媒和物（無水）結晶形態は、混入物を少なくとも９６％含まない。別の好ましい実施形態では、脱溶媒和物（無水）結晶形態は、混入物を少なくとも９７％含まない。別の好ましい実施形態では、脱溶媒和物（無水）結晶形態は、混入物を少なくとも９８％含まない。別の好ましい実施形態では、脱溶媒和物（無水）結晶形態は、混入物を少なくとも９９％含まない。
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、または１０００ｇの脱溶媒和物（無水）結晶形態を含む組成物を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１００ｇの脱溶媒和物（無水）結晶形態を含む組成物を提供する。別の好ましい実施形態では、組成物は、造粒組成物である。別の好ましい実施形態では、造粒組成物は、湿潤造粒組成物である。別の好ましい実施形態では、造粒組成物は、乾燥造粒組成物である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｋｇの脱溶媒和物（無水）結晶形態を含む製造容器を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１ｋｇの脱溶媒和物（無水）結晶形態を含む製造容器を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、脱溶媒和物（無水）結晶形態と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
結晶形態３
別の好ましい実施形態では、本出願は、式：
で示される化合物（５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン）の半水和物結晶形態を提供する。
別の好ましい実施形態では、本出願は、式：
別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、（ａ）０．２度の回折角の許容差を有する、１６．４°、１７．８°、および２６．６°でのピークのうちの１つ以上と組み合わせた、５．０°の回折角２シータでのＸ線回折パターンのピーク、ならびに（ｂ）２３．５、３４．６、１１０．２、１２４．１、１２６．８、および１６６．２ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル、のうちの少なくとも１つを特徴とする。
別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、１６．５、１８．９、１９．６、２０．４、２２．６、２４．４、２６．０、２７．４、２８．３、３０．０、３０．９、３８．４、４０．５、１１０．８、１３０．４、１３１．２、１４６．０、１４７．１、１５０．４、１５１．２、１５３．４、１５７．１、１５７．７、１５８．３、１５９．６、１６３．１、および１６９．７ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とする１つ以上のピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルをさらに特徴とする。
別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、１６．５、１８．９、１９．６、２０．４、２２．６、２３．５、２４．４、２６．０、２７．４、２８．３、３０．０、３０．９、３４．６、３８．４、４０．５、１１０．２、１１０．８、１２４．１、１２６．８、１３０．４、１３１．２、１４６．０、１４７．１、１５０．４、１５１．２、１５３．４、１５７．１、１５７．７、１５８．３、１５９．６、１６３．１、１６６．２、および１６９．７ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを特徴とする。
別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、混入物を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％含まない。別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、混入物を少なくとも９５％含まない。別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、混入物を少なくとも９６％含まない。別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、混入物を少なくとも９７％含まない。別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、混入物を少なくとも９８％含まない。別の好ましい実施形態では、半水和物結晶形態は、混入物を少なくとも９９％含まない。
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、または１０００ｇの半水和物結晶形態を含む組成物を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１００ｇの半水和物結晶形態を含む組成物を提供する。
別の好ましい実施形態では、組成物は、造粒組成物である。別の好ましい実施形態では、造粒組成物は、湿潤造粒組成物である。別の好ましい実施形態では、造粒組成物は、乾燥造粒組成物である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｋｇの半水和物結晶形態を含む製造容器を提供する。別の好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１ｋｇの半水和物結晶形態を含む製造容器を提供する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、半水和物結晶形態と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
治療方法
本発明はまた、がんを治療するための方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする患者に、有効量の化合物５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態を投与することを含む。
本発明はまた、がんを治療するための方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする患者に、有効量の化合物５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態を投与することを含む。
別の好ましい実施形態では、がんは、膀胱がん、乳がん、胆管がん、結腸直腸がん、結腸がん、胃がん、胆嚢がん、膠芽腫、頭頸部がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または腎がんである。一実施形態では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。別の実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がんである。
本発明はまた、治療に使用するための化合物５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態を提供する。
本発明はまた、がんの治療に使用するための化合物５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態を提供する。好ましい実施形態では、結晶形態は、化合物５－［５－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－エチルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンのものである。
本発明はまた、がんの治療のための医薬品の製造における化合物５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの結晶形態を提供する。
ＣＤ７３阻害剤治療から利益を得ることができる対象には、非小細胞肺がん、膀胱がん、および黒色腫などの抗ＰＤ１／ＰＤＬ－１阻害剤に対して耐性であるかまた不応性である腫瘍に罹患している対象；非小細胞肺がん、膀胱がん、黒色腫、結腸、および膵臓などのＥＧＦＲ／ＢＲＡＦ／Ｋｒａｓ変異がんに罹患している患者；トリプルネガティブ乳がんなどのエストロゲン受容体（－）がんに罹患している患者；膵がんおよび結腸直腸がんなどのＣＤ７３の発現レベルが高い対象が含まれる。所望の場合、このような対象は、ＩＨＣアッセイによって測定される場合、腫瘍内の高いＣＤ７３発現レベルの存在に基づいて；またはＲＴ－ＰＣＲアッセイによって検出される場合、腫瘍内のＥＧＦＲおよびＢＲＡＦの変異の存在に基づいて；またはＩＨＣアッセイもしくはＲＴ－ＰＣＲアッセイによって検出される場合、腫瘍内のエストロゲン受容体の欠損に基づいて；またはＬＣ－ＭＳアッセイによって検出される場合、腫瘍内もしくは血漿中の高レベルのアデノシンおよびＡＭＰの存在に基づいて、本明細書に開示される化合物またはその薬学的に許容される塩を用いた療法のために選択することができる。薬力学的評価のために、本明細書に記載のＬＣ－ＭＳに基づくエクスビボアッセイを使用して、血中におけるアデノシンへのＡＭＰの変換に対するＣＤ７３阻害剤の効果を測定することができる。
好ましい実施形態では、患者は、血清ＣＤ７３活性が決定されている患者である。１つの好ましい実施形態では、「ＣＤ７３活性を決定すること」は、ＣＤ７３活性が存在するかどうかを決定することを意味する。ＣＤ７３発現またはＣＤ７３活性のレベルを決定するための方法は、当業者に既知であり、例えば、Ｓ Ｍｏｒｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．２０１７；１５：２４４を参照されたい。別の好ましい実施形態では、「ＣＤ７３活性を判定すること」は、ＣＤ７３によるアデノシンへのＡＭＰの変換レベルを定量化することを意味し、ＣＤ７３活性のレベルを定量化することを容易にするＬＣ－ＭＳに基づくアッセイが本明細書に提供される。
別の好ましい実施形態では、患者は、組織内のＣＤ７３発現が決定されている患者である。別の実施形態では、組織は、腫瘍組織である。組織におけるＣＤ７３発現のレベルを決定するための方法は、当業者に既知であり、例えば、ウェスタンブロットまたは免疫組織化学を使用する（Ｘ－Ｒ Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２０１２；１０６：１３０－１３７）。
一実施形態では、本発明は、がんを治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本明細書に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の抗腫瘍薬と同時、別個、または連続した組み合わせで投与することを含む。抗腫瘍薬の非限定的な例としては、ラムシルマブ、ネシツムマブ、オララツマブ、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ガルニセルチブ、アベマシクリブ、ゲフィチニブ、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソームドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、セツキシマブ、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤、イドレラミン２，３－ジオキシゲナーゼ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ならびにＴＧＦβ受容体阻害剤が挙げられる。
別の実施形態では、本発明は、がんを治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本明細書に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の免疫腫瘍薬と同時、別個、または連続した組み合わせで投与することを含む。１つの好ましい実施形態では、免疫腫瘍薬は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体である。免疫腫瘍薬の非限定的な例としては、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＬＹ３３０００５４（その重鎖および軽鎖配列は、それぞれ配列番号１０および１１として、ＷＯ２０１７／０３４９１６およびＵＳ２０１７／００５８０３３に記載されている）。１つの好ましい実施形態では、免疫腫瘍薬は、抗ＰＤ－１抗体である。別の好ましい実施形態では、免疫腫瘍薬は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の好ましい実施形態では、化合物は、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンであり、免疫腫瘍薬は、ＬＹ３３０００５４である。
一実施形態では、本発明は、非小細胞肺がんを治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本明細書に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時、別個、または連続した組み合わせで投与することを含む。１つの好ましい実施形態では、他の薬剤は、オシメルチニブ、セツキシマブ、またはアベマシクリブである。別の好ましい実施形態では、他の薬剤は、オシメルチニブである。別の好ましい実施形態では、他の薬剤は、セツキシマブである。別の好ましい実施形態では、他の薬剤は、アベマシクリブである。
別の好ましい実施形態では、本発明は、黒色腫を治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本明細書に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時、別個、または連続した組み合わせで投与することを含む。１つの好ましい実施形態では、他の薬剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、抗ＰＤ－１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の好ましい実施形態では、他の薬剤は、ＢＲＡＦ阻害剤である。別の好ましい実施形態では、他の薬剤は、抗ＰＤ－１抗体である。別の好ましい実施形態では、他の薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の好ましい実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＬＹ３３０００５４である（その重鎖および軽鎖配列は、それぞれ配列番号１０および１１として、ＷＯ２０１７／０３４９１６およびＵＳ２０１７／００５８０３３に記載されている）。
別の好ましい実施形態では、本発明は、結腸直腸がんを治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本明細書に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時、別個、または連続した組み合わせで投与することを含む。１つの好ましい実施形態では、他の薬剤は、アベマシクリブである。別の好ましい実施形態では、化合物は、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンであり、他の薬剤は、アベマシクリブである。
別の好ましい実施形態では、本発明は、膵がんを治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本明細書に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時、別個、または連続した組み合わせで投与することを含む。１つの好ましい実施形態では、他の薬剤は、アベマシクリブである。別の好ましい実施形態では、化合物は、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンであり、他の薬剤は、アベマシクリブである。
別の好ましい実施形態では、本発明は、トリプルネガティブ乳がんを治療する方法を提供し、この方法は、有効量の本明細書に記載の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時、別個、または連続した組み合わせで投与することを含む。１つの好ましい実施形態では、化合物は、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンである。
上記および本発明の説明全体を通して使用される場合、以下の用語は、別段示されない限り、以下の意味を有するものとする。
「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」は、哺乳動物、例えばヒトへの生物学的に活性な薬剤の送達のために当該技術分野において概して許容されている媒体である。
「治療」、「治療する」、「治療すること」などの用語は、障害の進行を遅延または反転させることを含むことを意味する。また、これらの用語は、障害または状態が実際に排除されていない場合でも、かつ障害または状態の進行自体が遅延または反転されない場合でも、障害または状態の１つ以上の症状を緩和、寛解、減衰、排除、または軽減することも含む。
「有効量」は、治療している臨床医によって患者の生物学的もしくは医学的応答または患者に対する所望の治療効果を誘起させるであろう、本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物の量を意味する。一実施形態では、化合物またはその薬学的に許容される塩は、インビトロまたはエクスビボＣＤ７３酵素アッセイにおいて、アデノシンへのＡＭＰの変換を阻害する。別の実施形態では、化合物またはその薬学的に許容される塩は、異なる用量の化合物を用いて処置した動物由来のマウス全血においてアデノシンへのＡＭＰの変換を阻害する。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ヒトを示す。
有効量は、当業者のような担当診断医により、既知の技法の使用により、および同様の状況下で得られた結果を観察することにより、容易に決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、担当診断医によって多数の要因が考慮され、これらの要因には、患者の人種；患者のサイズ、年齢、および全体的な健康状態；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の程度または関与もしくは重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される調製物の生物学的利用能の特性；選択された投与レジメン；付随する薬物の使用；ならびに他の関連する状況が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の化合物は、好ましくは、経口、静脈内、および経皮経路を含む、化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。最も好ましくは、そのような組成物は、経口投与用である。そのような医薬組成物およびそれらを調製するための方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６を参照されたい）。
本発明の化合物が塩を形成することができるということは、当業者により理解されるであろう。本発明の化合物は、塩基性複素環を含有し、したがって、多数の無機酸および有機酸のうちのいずれかと反応して、薬学的に許容される酸付加塩を形成する。このような薬学的に許容される酸付加塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩（複数可）」は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機塩（複数可）および有機塩（複数可）を指す（Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ ６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ １９７７）。
本明細書で使用される場合、「造粒組成物」は、造粒形態の組成物を指し、これは、医薬品製造プロセスにおいて、医薬組成物の前身となる組成物である。
本明細書で使用される場合、「製造容器」は、医薬品容器の製造に用いられるが、医薬品化学実験室においては使用されない容器を指す。製造容器の例としては、ホッパーコレクタ、ベッド、乾燥機のベッド、造粒機のベッド、乾燥機のトレイ、造粒機のバケツ、および混合用ボウルが挙げられるが、これらに限定されない。
式Ｉの化合物は、当該技術分野において周知かつ認識されている合成方法によって調製することができる。これらの反応のステップに好適な反応条件は、当該技術分野において周知であり、溶媒および共試薬の適切な置換は、当該技術分野の技術の範囲内である。同様に、合成中間体は、必要または所望に応じて、様々な周知の技法によって単離および／または精製され得ること、ならびに多くの場合、様々な中間体は、ほとんどまたは全く精製することなく、その後の合成ステップにおいて直接使用することが可能であることが、当業者によって理解されるだろう。さらに、当業者は、いくつかの状況において、部分が導入される順序が重要ではないことを認識するであろう。本発明の化合物を製造するために必要とされるステップの特定の順序は、当業者によって十分に認識されているように、合成されている特定の化合物、出発化合物、および置換された部分の相対的な傾向に依存する。すべての置換基は、別段示されない限り、以前に定義されたとおりであり、すべての試薬は、当該技術分野において周知かつ認識されている。
本明細書で使用される場合、以下の用語は、示される意味を有する：「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＤＡＳＴ」は三フッ化ジエチルアミノ硫黄を指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し、「ＤＭＡＰ」は、４－ジメチルアミノピリジンを指し、「ｄｍｓｏ」または「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し、「ｅｅ」は鏡像体過剰率を指し、「ＥＳ／ＭＳ」は、エレクトロスプレー質量分析法を指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを指し、「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指し、「ＧＣ－ＭＳ」はガスクロマトグラフィー－質量分析法を指し、「ＨＢＳＳ」はハンクス平衡塩溶液を指し、「ＩＣ５０」は最大半値の阻害濃度を指し、「ＬＡＨ」は水素化アルミニウムリチウムを指し、「ＬＣ－ＥＳ／ＭＳ」は液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法を指し、「ＭＳ」は質量分析法を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し、「ＭＴＢＥ」はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを指し、「ｎＢｕＬｉ」は、ｎ－ブチルリチウムを指し、「ｎｍ」はナノメートル（複数可）を指し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し、「ＯＡｃ」はアセテートを指し、「ｐｓｉ」はポンド／平方インチを指し、「ＲＴ」は室温または周囲温度を指し、「ＳＣＸ」は、強カチオン交換を指し、「ＳＦＣ」は、超臨界流体クロマトグラフィーを指し、「ＳＮＡｒ」は芳香族求核置換を指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「ｔＲ」は保持時間を指し、「ｗ／ｗ」は、溶液中の重量／重量比を指す。
式Ｉの化合物は、以下のスキームにおいて例示されるように合成され得る。
調製および実施例
以下の調製および実施例は、本発明をさらに例示し、本発明の化合物の典型的な合成を表すが、いかなる方法においても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。試薬および出発材料は容易に入手可能であるか、または当業者によって容易に合成することができる。調製および実施例は、限定ではなく例示のために記載され、当業者により様々な変更が行われ得ることを理解すべきである。
以下の調製および実施例は、本発明をさらに例示し、本発明の化合物の典型的な合成を表すが、いかなる方法においても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。試薬および出発材料は容易に入手可能であるか、または当業者によって容易に合成することができる。調製および実施例は、限定ではなく例示のために記載され、当業者により様々な変更が行われ得ることを理解すべきである。
ＬＣ－ＥＳ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００液体クロマトグラフィーシステム上で実施する。エレクトロスプレー質量分析測定（ポジティブおよび／またはネガティブモードで獲得）は、ＨＰ１１００ ＨＰＬＣにインターフェース接続された質量選択検出器四重極質量分析計上で実施する。ＬＣ－ＭＳ条件（低ｐＨ）：カラム：ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）ＮＸ Ｃ－１８ ２．１×５０ｍｍ ３．０μｍ；勾配：５～１００％のＢで３分間、次いで１００％のＢで０．７５分間；カラム温度：５０℃＋／－１０℃；流量：１．２ｍＬ／分；溶媒Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨ含有脱イオン水；溶媒Ｂ：０．１％ギ酸含有ＡＣＮ；波長：２１４ｎｍ。代替的なＬＣ－ＭＳ条件（高ｐＨ）：カラム：ＷＡＴＥＲＳ（商標）ＸＴＥＲＲＡ（登録商標）ＭＳ Ｃ－１８カラム２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ；勾配：５％の溶媒Ａで０．２５分、５％～１００％の勾配の溶媒Ｂで３分間、および１００％の溶媒Ｂで０．５分間、または１０％～１００％の溶媒Ｂで３分間、および１００％の溶媒Ｂで０．７５分間；カラム温度：５０℃±１０℃；流量：１．２ｍＬ／分；溶媒Ａ：１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ９）；溶媒Ｂ：ＡＣＮ；波長：２１４ｎｍ。
分取逆相クロマトグラフィーは、質量選択検出器質量分析計およびＬｅａｐオートサンプラ／フラクションコレクタを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＬＣ－ＥＳ／ＭＳ上で実施する。高ｐＨ方法は、７５×３０ｍｍのＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）－ＮＸ、１０×２０ｍｍのガードを備えた５μｍ粒径カラムで実行する。８５ｍＬ／分の流量。溶離液は、ＡＣＮ中１０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）である。
ＮＭＲスペクトルは、参照標準として残留溶媒［ＣＤＣｌ３、７．２６ｐｐｍ、（ＣＤ３）２ＳＯ、２．５０ｐｐｍ］を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩ ＨＤ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計上で実施し、ｐｐｍで報告されるＣＤＣｌ３または（ＣＤ３）２ＳＯ溶液として得る。ピーク多重度を報告する場合、以下の省略形を使用し得る：ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｍ（多重項）、ｂｒ－ｓ（広帯一重項）、ｄｄ（二重項の二重項）、ｄｔ（三重項の二重項）。結合定数（Ｊ）を報告する場合、ヘルツ（Ｈｚ）で報告する。
調製１
４，４，５，５－テトラメチル－２－［（Ｅ）－３－メチルブタ－１－エニル］－１，３，２－ジオキサボロラン
ピナコールボラン（９．５ｍｌ、６４ｍｍｏｌ）を、氷冷３－メチルブタ－１－イン（４．９１ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）に５分間かけて滴下する。圧力容器を密封し、室温に加温し、１８時間撹拌する。ビス（シクロペンタジエニル）ジルコニウム（ＩＶ）クロリドヒドリド（２．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．１ｍＬ、７．９ｍｍｏｌ）を添加する。圧力容器を密封し、６０℃の油浴中に入れ、１０分間撹拌する。得られた赤色の溶液を、室温に２．５時間冷却する。この反応混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、シリカゲルのパッドで濾過し（１５０ｍＬ）、シリカゲルをＤＣＭ（７００ｍＬ）ですすぎ、真空濃縮して、表題化合物（１１．５ｇ、８２％）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９６（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．０３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）、１．２９（ｓ，１２Ｈ）、２．３７（ｍ，１Ｈ）、５．４０（ｄｄ，１Ｈ）、６．６４（ｄｄ，１Ｈ）。
４，４，５，５－テトラメチル－２－［（Ｅ）－３－メチルブタ－１－エニル］－１，３，２－ジオキサボロラン
調製２
Ｒａｃ－トランス－２－［２－イソプロピルシクロプロピル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン
少量ずつ、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素を、Ｅｔ２Ｏ（７０ｍＬ）およびＫＯＨ水溶液（３０．５ｇ、４３５ｍｍｏｌ、７０ｍＬのＨ２Ｏ）の氷冷二相混合物に添加する。固体が溶解するまで撹拌する（５分未満）。得られたジアゾメタン溶液を、Ｅｔ２Ｏ（７０ｍＬ）中のＰｄ（ＯＡｃ）２（２３７ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）および４，４，５，５－テトラメチル－２－［（Ｅ）－３－メチルブタ－１－エニル］－１，３，２－ジオキサボロラン（４．００ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）の急速に撹拌されている氷冷懸濁液中にピペットで移す。添加が完了した後、反応混合物を室温に加温し、珪藻土で濾過し、濾液を真空濃縮する。得られた残渣をＤＣＭ中に溶解し、シリカゲル（２５ｇ）のプラグで濾過し、真空濃縮して、表題化合物（４．３２ｇ、９９％超）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１０（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：－０．３５（ｍ，１Ｈ）、０．４５（ｍ，１Ｈ）、０．６５（ｍ，１Ｈ）、０．７８（ｍ，１Ｈ）、０．９８（ｍ，７Ｈ）、１．２３（ｓ，１２Ｈ）。
Ｒａｃ－トランス－２－［２－イソプロピルシクロプロピル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン
調製３
４－クロロ－６－（２，４－ジメトキシピリミジン－５－イル）－３－メチル－ピリダジン
圧力バイアル中、２，４－ジメトキシ－５－ピリミジニルボロン酸（６．７５ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）、４，６－ジクロロ－３－メチル－ピリダジン（５．９８ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（０．５５ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（２９．９ｇ、９１．８ｍｍｏｌ）を、１，４－ジオキサン／Ｈ２Ｏ（１５１ｍＬ）の４：１混合物中で合わせる。脱気し、Ｎ２を充填し戻す。容器を密封し、７０℃で３時間加熱する。残渣を珪藻土で濾過し、ＥｔＯＡｃですすぐ。有機混合物を、水、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発乾固させる。得られた黒色の残渣を、０～３０％のＤＣＭ／（ＤＣＭ中の３３％のＭｅＯＨ）の勾配を２００ｍＬ／分の流量で１５分間かけて用いる、３３０ｇのＲＥＤＩＳＥＰ（登録商標）カラムを使用したシリカゲル上でのクロマトグラフィーによって精製し、クロマトグラフィー画分の蒸発後に表題化合物（６．２ｇ、６３％）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６７／２６９［Ｍ＋１］＋Ｈ ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）δ：２．７４（ｓ，３Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ）、４．０３（ｓ，３Ｈ）、８．２０（ｓ，１Ｈ）、８．８７（ｓ，１Ｈ）。
４－クロロ－６－（２，４－ジメトキシピリミジン－５－イル）－３－メチル－ピリダジン
調製３の代替的な手順
１，４－ジオキサン（１１７５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（３４０ｍＬ）中の（２，４－ジメトキシピリミジン－５－イル）ボロン酸（８５ｇ、４３９ｍｍｏｌ）、４，６－ジクロロ－３－メチル－ピリダジン（７５ｇ、４３７ｍｍｏｌ）およびＣｓ２ＣＯ３（３５８ｇ、１０９９ｍｍｏｌ）の混合物に窒素流を５分間通過させる。［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（６．６ｇ、８．７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を７５℃で１６時間撹拌する。反応物を室温に冷却し、混合物を珪藻土で濾過し、濾過ケーキをＥｔＯＡｃですすぐ。得られた層を分離し、有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空濃縮する。得られた残渣に水（５００ｍＬ）を添加し、室温で１６時間撹拌し、得られた固体を濾過する。収集した固体をＨ２Ｏで洗浄し、真空下で１６時間乾燥させて、所望の化合物（７０ｇ、５４％）を褐色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６７／２６９［Ｍ＋１］＋
１，４－ジオキサン（１１７５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（３４０ｍＬ）中の（２，４－ジメトキシピリミジン－５－イル）ボロン酸（８５ｇ、４３９ｍｍｏｌ）、４，６－ジクロロ－３－メチル－ピリダジン（７５ｇ、４３７ｍｍｏｌ）およびＣｓ２ＣＯ３（３５８ｇ、１０９９ｍｍｏｌ）の混合物に窒素流を５分間通過させる。［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（６．６ｇ、８．７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を７５℃で１６時間撹拌する。反応物を室温に冷却し、混合物を珪藻土で濾過し、濾過ケーキをＥｔＯＡｃですすぐ。得られた層を分離し、有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空濃縮する。得られた残渣に水（５００ｍＬ）を添加し、室温で１６時間撹拌し、得られた固体を濾過する。収集した固体をＨ２Ｏで洗浄し、真空下で１６時間乾燥させて、所望の化合物（７０ｇ、５４％）を褐色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６７／２６９［Ｍ＋１］＋
調製４
トランス－５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－２，４－ジメトキシ－ピリミジン
４－クロロ－６－（２，４－ジメトキシピリミジン－５－イル）－３－メチル－ピリダジン（１．９７ｇ、７．３９ｍｍｏｌ）、ｒａｃ－トランス－２－［２－イソプロピルシクロプロピル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン（３．３２ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）、ビス（ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（４－ジメチルアミノフェニル）ホスフィン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１．３５ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（３７ｍＬ）、および１ＭのＮａ２ＣＯ３水溶液（１８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を合わせる。反応容器をＮ２でパージし、９０℃に１８時間加熱する。室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、層を分離する。有機層を、１ＭのＮａ２ＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で連続して洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を真空濃縮する。得られた残渣を、６０～１００％のＥｔＯＡｃ／ＤＣＭの勾配で溶離するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製し、クロマトグラフィー画分の蒸発後、表題化合物を異性体の本質的にラセミ混合物（１．４８ｇ、６４％）として得る。
トランス－５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－２，４－ジメトキシ－ピリミジン
異性体をＳＦＣ（カラム：ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＬＵＸ（登録商標）セルロース－４、４．６×１５０ｍｍ；４０％のＭｅＯＨ／ＣＯ２均一溶媒；流量：５ｍＬ／分、ＵＶ２５０ｎｍ）による精製に供して、６４７ｍｇの異性体１：ｔＲ＝２．５６分および６４７ｍｇの異性体２：ｔＲ＝３．７５分を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１５（Ｍ＋Ｈ）。
調製５
（２Ｓ）－２－クロロ－３－メチル－ブタン酸
Ｌ－バリン（２８６ｇ、２．４４ｍｏｌ）および５ＭのＨＣｌ水溶液（３．２５Ｌ、１６．３ｍｏｌ）の溶液を、０℃で冷却する。内部温度を５℃未満に維持しながら、４ＭのＮａＮＯ２水溶液（１Ｌ、４ｍｏｌ）を２時間かけて滴下する。反応物を、室温に加温しながら２時間撹拌し、室温でさらに１６時間撹拌する。少量ずつ３０分間かけて、Ｎａ２ＣＯ３（２４２ｇ、２．２８ｍｏｌ）を添加する。得られた溶液をＭＴＢＥ（３×１０００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を飽和ＮａＣｌ水溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、有機抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮する。得られた残渣を真空蒸留（１５ｍｂａｒ／１４０℃）によって精製して、表題化合物（２４８ｇ、６８％）を油として得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．１（ｄｔ，Ｊ＝６．６，２．６Ｈｚ，６Ｈ）、２．３４－２．４２（ｍ，１Ｈ）、４．１９－４．２３（ｍ，１Ｈ）、１０．０－１２．０（ｂｒ－ｓ，１Ｈ）。
（２Ｓ）－２－クロロ－３－メチル－ブタン酸
調製６
（２Ｓ）－２－クロロ－３－メチル－ブタン－１－オール
２－メチルテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中の（２Ｓ）－２－クロロ－３－メチル－ブタン酸（１３７ｇ、１ｍｏｌ）の溶液を、０℃に冷却する。内部温度を１０℃未満に維持しながら、メチルテトラヒドロフラン（４８０ｍＬ、１．１ｍｏｌ）中のＬＡＨの２．３Ｍの溶液を、２．５時間かけて滴下する。室温に加温し、混合物を室温で１時間、５０℃で１時間撹拌する。反応物を０℃に冷却し、Ｈ２Ｏ（１．４８ｍＬ）、１５％のＮａＯＨ水溶液（１．４８ｍＬ）、およびＨ２Ｏ（４．４６ｍＬ）を順番にかつ緩徐に添加する。混合物を室温に加温させ、珪藻土の床で濾過し、溶媒を真空蒸発させて、表題化合物（１１０ｇ、８１％）を無色の油として得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９７－１．１（ｍ，６Ｈ）、１．９４－２．１８（ｍ，１Ｈ）、２．６０－３．０９（ｂｒ－ｓ，１Ｈ）、３．７１－３．７８（ｍ，１Ｈ）、３．８０－３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．９０－３．９６（ｍ，１Ｈ）。
（２Ｓ）－２－クロロ－３－メチル－ブタン－１－オール
調製７
（２Ｒ）－２－イソプロピルオキシラン
Ｈ２Ｏ（１９５ｍＬ）中のＫＯＨ（１９５ｇ、３．４８ｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、内部温度を５℃未満に維持しながら、無溶媒の（２Ｓ）－２－クロロ－３－メチル－ブタン－１－オール（１１０ｇ、８０１ｍｍｏｌ）を２０分間かけて添加する。反応混合物を室温に加温させる。１００ｍｂａｒでの真空蒸留によって反応混合物を精製し、２３℃～５０℃に加温して、表題化合物（４７ｇ、６４％）を無色の油として得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．０５（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．５１（ｏ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）、２．５２－２．５４（ｍ，１Ｈ）、２．７０－２．７５（ｍ，２Ｈ）。
（２Ｒ）－２－イソプロピルオキシラン
調製８
（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボン酸エチル
氷浴／水浴（内部温度：８℃）中で冷却した１，４－ジオキサン（８７０ｍＬ）中の２－ジエトキシホスホリル酢酸エチル（１５３ｍＬ、７７２ｍｍｏｌ）の溶液に、ヘキサン中のｎＢｕＬｉの２．５Ｍ溶液（３１０ｍＬ、７８０ｍｍｏｌ）を２５分間かけて滴下する。室温に加温し、４０分間撹拌するこの溶液を、カニューレを介して３Ｌ圧力容器へ移し、１，４－ジオキサン（１８０ｍＬ）中の（２Ｒ）－２－イソプロピルオキシラン（７０ｇ、７７２ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を、５０ｐｓｉの圧力で、１５０℃で１４時間撹拌する。反応混合物を室温に冷却し、Ｈ２Ｏ（７００ｍＬ）を添加する。層を分離し、水相をＭＴＢＥ（２×５００ｍＬ）で再抽出する。有機相を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液（２×３５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮して、粗表題化合物（１０７．７ｇ、９９％超）を黄色の油として得、これは、さらなる精製なしでのその後の使用に適している。ＧＣ－ＭＳ（ｍ／ｚ）：１５６（Ｍ＋）。
（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボン酸エチル
調製９
（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボン酸
２５％のＮａＯＨ水溶液（８００ｍＬ）を含有する１，４－ジオキサン（８００ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボン酸エチル（１０７．７ｇ、４８２．６ｍｍｏｌ）の混合物を、１００℃で７時間撹拌する。混合物を室温に冷却し、水（３００ｍＬ）を添加し、ＭＴＢＥ（２×５００ｍＬ）で抽出し、有機相を廃棄する。ｐＨが約１～２になるまで、水相を３７％のＨＣｌ水溶液（およそ５００ｍＬ）で酸性化する。
（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボン酸
酸性化された水性混合物をＭＴＢＥ（２×６００ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮して、表題化合物（５４．２ｇ、７５％）を琥珀色の油として得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．８１－０．８６（ｍ，１Ｈ）、１．０１（ｄｄ，Ｊ＝５．９，３．７Ｈｚ，６Ｈ）、１．０４－１．１３（ｍ，１Ｈ）、１．２０－１．２４（ｍ，１Ｈ）、１．２８－１．３７（ｍ，１Ｈ）、１．３９－１．４４（ｍ，１Ｈ）。
調製１０
（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イル）（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボキシレート
ＤＣＭ（６９０ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボン酸（５４．２ｇ、３５９ｍｍｏｌ）、２－ヒドロキシイソインドリン－１，３－ジオン（５９．８ｇ、３５９ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（４．４４ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）の懸濁液を、０℃で撹拌する。Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（５０．４ｇ、３９５ｍｍｏｌ）を滴下し、室温に加温し、得られた反応混合物を室温で２時間撹拌する。Ｈ２Ｏ（６００ｍＬ）を添加し、相を分離する。水相をＤＣＭ（２×３００ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られた固体残渣を、１００％のＤＣＭで溶離するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製して、クロマトグラフィー画分の蒸発後、表題化合物（９６ｇ、８８％）を淡黄色の固体として得た。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７４（Ｍ＋１）。
（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イル）（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボキシレート
調製１１
２－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン
ＥｔＯＡｃ（４８０ｍＬ）中の（１，３－ジオキソイソインドリン－２－イル）（１Ｓ，２Ｓ）－２－イソプロピルシクロプロパンカルボキシレート（９６ｇ、３１６ｍｍｏｌ）およびビス（ピナコラート）ジボロン（１６０ｇ、６３０ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素流を１５分間通す。混合物を８５℃で撹拌し、イソニコチン酸エチル（２４．３８ｇ、１５７ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下する。得られた混合物を８５℃で１６時間撹拌する。得られた懸濁液を冷却し、固体を濾過して廃棄し、褐色の濾液を減圧下で蒸発させる。粗残渣をシリカゲルプラグ上で濾過し、２％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する。溶媒を濾液から除去し、得られた残渣を３％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離するシリカゲル上でのクロマトグラフィーを使用して再精製し、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（２５．３ｇ、３８％）を無色の油として得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：－０．３３－－０．３８（ｍ，１Ｈ）、０．４２－０．４７（ｍ，１Ｈ）、０．６３－０．６７（ｍ，１Ｈ）、０．７５－０．８２（ｍ，１Ｈ）、０．８９－１．０２（ｍ，１Ｈ）、０．９８（ｍ，６Ｈ）、１．２４（ｓ，１２Ｈ）。
２－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン
調製１２
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－２，４－ジメトキシ－ピリミジン
４－クロロ－６－（２，４－ジメトキシピリミジン－５－イル）－３－メチル－ピリダジン（１９．１ｇ、７０．６ｍｍｏｌ）、Ｋ３ＰＯ４（４５．９ｇ、２１２ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（３００ｍＬ）、およびＨ２Ｏ（７５ｍＬ）を混合し、この混合物をＮ２で１０分間脱気する。［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（７．９８ｇ １０．６ｍｍｏｌ）を添加する。窒素でさらに２分間発泡させて、２－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン（２２．２ｇ、１０６ｍｍｏｌ）を一度に添加する。得られた混合物を８０℃で１６時間撹拌する。反応物を室温に冷却し、Ｈ２Ｏを添加し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を分離し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣を、８５％のヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶離するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（２１．５ｇ、９２％）を琥珀色の油として単離する。油は室温で静置すると凝固して、オフホワイト色の固体になる。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１５（Ｍ＋１）。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－２，４－ジメトキシ－ピリミジン
実施例１
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン
トランス－５－［５－［２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－２，４－ジメトキシ－ピリミジン異性体１（６２８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３ｍＬ）中に溶解する。１ＭのＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を添加し、７０℃に３時間加熱する。室温に冷却し、反応混合物をＭｅＯＨで洗浄されたＳＣＸカラム（２０ｇ、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ ＳＩＬＩＡＢＯＮＤ Ｔｏｓｉｃ Ａｃｉｄ）に充填し、ＳＣＸカラムをＭｅＯＨ（１４０ｍＬ）で洗浄し、所望の生成物を２ＭのＮＨ３／ＭｅＯＨ（１４０ｍｌ）で溶離する。ＮＨ３／ＭｅＯＨ画分を濃縮して、表題化合物をクリーム色の固体（５４６ｍｇ、９５％）として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８７（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）δ：０．９９（ｍ，９Ｈ）、１．２４（ｍ，１Ｈ）、１．８１（ｍ，１Ｈ）、２．７２（ｓ，３Ｈ）、７．６７（ｓ，１Ｈ）、８．２３（ｓ，１Ｈ）、１１．４３（ｂｓ，２Ｈ）。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン
結晶形態のＸ線粉末回折
遊離塩基化合物をメタノール中に溶解し、５０℃で１時間撹拌し、周囲温度に冷却させて、溶液から結晶化させる。次いで、固体を真空濾過により単離し、真空下７０℃で短時間乾燥させる。
遊離塩基化合物をメタノール中に溶解し、５０℃で１時間撹拌し、周囲温度に冷却させて、溶液から結晶化させる。次いで、固体を真空濾過により単離し、真空下７０℃で短時間乾燥させる。
結晶性固形物のＸＲＤパターンを、３５ｋＶおよび５０ｍＡで動作する、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｒ Ｘ線粉末回折計において取得する。試料を、２θで０．００８°のステップサイズおよび０．５秒／ステップの走査速度で、ならびに０．６ｍｍの発散スリット、５．２８の固定散乱防止スリット、および９．５ｍｍの検出器スリットを用いて、２θで４～４０°で走査する。乾燥粉末を石英試料ホルダに充填し、ガラススライドを使用して滑らかな表面を得る。結晶形態の回折パターンを、周囲温度および相対湿度で収集する。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形態に関して、結晶形態および晶癖などの要因から生じる好ましい配向に起因して、回折ピークの相対強度が変動し得ることは周知である。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ＃２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ＃１８，１８４３～１８４４頁，１９９５を参照されたい。さらに、所与の任意の結晶形態に関して、角度ピーク位置がわずかに変動し得ることも、結晶学の分野において周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度もしくは湿度の変動、試料の変位、または内部標準の有無に起因して変動し得る。本発明の場合、２θで±０．２のピーク位置の変動は、示された結晶形態の明確な特定を妨げることなく、これらの潜在的な変動を考慮に入れる。結晶形態の確認は、特徴的なピーク（単位は°２θ）、典型的にはより顕著なピークの任意の独自の組み合わせに基づいて行われ得る。周囲温度および相対湿度で収集された結晶形態の回析パターンは、８．８５３および２６．７７４度の２シータ度でのＮＩＳＴ ６７５基準ピークに基づいて調整した。
１３Ｃ固体ＮＭＲ（１３Ｃ ｓｓＮＭＲ）
１００．６２２ＭＨｚの炭素周波数および４００．１３１ＭＨｚのプロトン周波数で動作し、Ｂｒｕｋｅｒ ４ｍｍ二重共鳴プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計を使用して、１３Ｃ交差分極／マジック角回転ＮＭＲ（固体ＮＭＲまたはｓｓＮＭＲ）スペクトルを得る。ＴＯＳＳ側波帯抑圧を、ＳＰＩＮＡＬ６４デカップリングＲＡＭＰ １００型Ｈ－核ＣＰパルスを用いる交差分極とともに使用する。取得パラメータは、以下のとおりである：９０°プロトンｒ．ｆ．パルス幅２．６μｓ、接触時間２．０マイクロ秒、パルス繰り返し時間３秒、ＭＡＳ周波数１０ｋＨｚ、スペクトル幅３０ｋＨｚ、取得時間３４マイクロ秒、および走査回数１８，６６１。化学シフトは、別個の実験におけるアダマンタン（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とする。
１００．６２２ＭＨｚの炭素周波数および４００．１３１ＭＨｚのプロトン周波数で動作し、Ｂｒｕｋｅｒ ４ｍｍ二重共鳴プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計を使用して、１３Ｃ交差分極／マジック角回転ＮＭＲ（固体ＮＭＲまたはｓｓＮＭＲ）スペクトルを得る。ＴＯＳＳ側波帯抑圧を、ＳＰＩＮＡＬ６４デカップリングＲＡＭＰ １００型Ｈ－核ＣＰパルスを用いる交差分極とともに使用する。取得パラメータは、以下のとおりである：９０°プロトンｒ．ｆ．パルス幅２．６μｓ、接触時間２．０マイクロ秒、パルス繰り返し時間３秒、ＭＡＳ周波数１０ｋＨｚ、スペクトル幅３０ｋＨｚ、取得時間３４マイクロ秒、および走査回数１８，６６１。化学シフトは、別個の実験におけるアダマンタン（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とする。
調製１３
結晶形態１である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（無水）
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－２，４－ジメトキシ－ピリミジン（２１．５ｇ、６５．６ｍｍｏｌ）および１ＭのＨＣｌ水溶液（１６５ｍＬ、１３５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、４５℃で１６時間撹拌する。室温に冷却し、ＭＴＢＥで抽出する。有機相を廃棄し、ｐＨが約６になるまで、２ＭのＫ２ＨＰＯ４水溶液を水相に添加する（およそ１５０ｍＬ）。得られた混合物を室温で１６時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、水で洗浄し、４５℃の真空オーブン中で１６時間乾燥させて、表題化合物（１４．３ｇ、７６％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８７（Ｍ＋１）。
結晶形態１である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（無水）
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの無水結晶形態（結晶形態１）の調製試料は、以下の表１に記載の回折ピーク（２シータ値）を有するような、ＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。具体的には、パターンは、０．２度の回折角の許容差を有する、１１．７°、１５．８°、および１６．０°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて、４．７°のピークを含む。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの無水結晶形態（形態１）の代表的な１３Ｃ ｓｓＮＭＲ共鳴は、１６．６、１８．３、２０．７、２２．１、２３．９、２５．４、２６．６、２７．６、２８．１、２８．９、３０．２、３１．２、３２．２、３８．６、３９．７、４１．２、４３．１、１０９．３、１１１．０、１１２．０、１２４．４、１２８．２、１３０．７、１４５．１、１４６．３、１５０．１、１５１．０、１５３．４、１５６．７、１５７．６、１５８．６、１５９．３、１６０．７、１６３．４、１６５．９、１６７．０、１６９．４、および１７０．２ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）を含む。
調製１４
結晶形態２である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（脱溶媒和物／無水）
結晶形態１である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（１５．４ｋｇ、５３．８ｍｏｌ）を、３５００Ｌハステロイ反応器中の水（７７０Ｌ）に室温で添加する。得られた懸濁液を室温で１９時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、水で洗浄し、４０℃の真空オーブン中で３日間乾燥させて、表題化合物（１３．８ｋｇ、８９％）を白色の固体として得る。ＨＬＰＣ純度：９９．８％。
結晶形態２である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（脱溶媒和物／無水）
結晶形態１である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（１５．４ｋｇ、５３．８ｍｏｌ）を、３５００Ｌハステロイ反応器中の水（７７０Ｌ）に室温で添加する。得られた懸濁液を室温で１９時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、水で洗浄し、４０℃の真空オーブン中で３日間乾燥させて、表題化合物（１３．８ｋｇ、８９％）を白色の固体として得る。ＨＬＰＣ純度：９９．８％。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの脱溶媒和物結晶形態（形態２）の試料から調製された、関連する結晶形態のファミリーを観察する。１つのファミリーメンバーは、以下の表２に記載の回折ピーク（２シータ値）を有するような、ＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの脱溶媒和物（無水）結晶形態（形態２）の代表的な１３Ｃ ｓｓＮＭＲ共鳴は、１７．２、１８．９、２１．１、２２．５、２４．４、２６．７、２７．８、２８．７、２９．７、３９．７、４１．３、４５．５、５０．１、１１０．７、１１１．７、１１２．４、１２２．０、１２５．０、１２６．１、１２９．１、１４３．６、１４４．８、１４６．２、１４７．２、１４９．９、１５１．１、１５３．０、１５５．５、１５７．２、１５９．０、１６０．６、１６１．４、１６２．７、１６４．８、１６７．０、１６８．３、および１７０．４ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）を含む。
他のファミリーメンバーは、０．２度の回折角の許容差を有する、４．７°、６．４°、９．３°、１１．０°、１１．６°、１８．４°、および２７．９°のピークのうちの１つ以上と組み合わせて、４．３°超かつ最大５．５°の回折ピーク（２シータ値）を有するような、ＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。
調製１５
結晶形態３である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（半水和物）
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－２，４－ジメトキシ－ピリミジン（３１６ｇ、０．９２ｍｏｌ）を、５Ｌフラスコ中の１ＭのＨＣｌ水溶液（２．６Ｌ、２．６ｍｏｌ）に室温で添加する。得られた懸濁液を４５℃に加熱し、この温度で１６時間撹拌する。室温に冷却し、ｐＨが約６になるまで、２Ｍの水性Ｋ２ＨＰＯ４を添加する。得られた混合物を、室温で１時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、４０℃の真空オーブン中で３日間乾燥させて、表題化合物（２５０ｇ、９２％）を白色の固体として得る。ＨＬＰＣ純度：９９％。
結晶形態３である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（半水和物）
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－２，４－ジメトキシ－ピリミジン（３１６ｇ、０．９２ｍｏｌ）を、５Ｌフラスコ中の１ＭのＨＣｌ水溶液（２．６Ｌ、２．６ｍｏｌ）に室温で添加する。得られた懸濁液を４５℃に加熱し、この温度で１６時間撹拌する。室温に冷却し、ｐＨが約６になるまで、２Ｍの水性Ｋ２ＨＰＯ４を添加する。得られた混合物を、室温で１時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、４０℃の真空オーブン中で３日間乾燥させて、表題化合物（２５０ｇ、９２％）を白色の固体として得る。ＨＬＰＣ純度：９９％。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの半水和物結晶形態（結晶形態３）の調製試料は、以下の表３に記載の回折ピーク（２シータ値）を有するような、ＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。具体的には、パターンは、０．２度の回折角の許容差を有する、１６．４°、１７．８°、および２６．６°からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて、５．０°のピークを含む。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの半水和物結晶形態（形態３）の代表的な１３Ｃ ｓｓＮＭＲ共鳴は、１６．５、１８．９、１９．６、２０．４、２２．６、２３．５、２４．４、２６．０、２７．４、２８．３、３０．０、３０．９、３４．６、３８．４、４０．５、１１０．２、１１０．８、１２４．１、１２６．８、１３０．４、１３１．２、１４６．０、１４７．１、１５０．４、１５１．２、１５３．４、１５７．１、１５７．７、１５８．３、１５９．６、１６３．１、１６６．２、および１６９．７ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）を含む。
調製１６
結晶形態１への結晶形態２の変換
結晶形態２である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（５．０ｋｇ、１７．４ｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１００Ｌ）と水（１０Ｌ）の混合物に添加する。得られた溶液を、５０℃未満の減圧下で、１０～１５Ｌに濃縮する。ＴＨＦ（５Ｌ）および水（６０Ｌ）を入れ、５０～６０℃に加熱し、２～４時間撹拌する。２０～２５℃に冷却し、１～２時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、水（１０Ｌ）で洗浄し、乾燥させて、表題化合物（４．２ｋｇ、８４％）をオフホワイト色の固体として得る。ＨＬＰＣ純度：９９．４％。
結晶形態１への結晶形態２の変換
結晶形態２である、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン（５．０ｋｇ、１７．４ｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１００Ｌ）と水（１０Ｌ）の混合物に添加する。得られた溶液を、５０℃未満の減圧下で、１０～１５Ｌに濃縮する。ＴＨＦ（５Ｌ）および水（６０Ｌ）を入れ、５０～６０℃に加熱し、２～４時間撹拌する。２０～２５℃に冷却し、１～２時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、水（１０Ｌ）で洗浄し、乾燥させて、表題化合物（４．２ｋｇ、８４％）をオフホワイト色の固体として得る。ＨＬＰＣ純度：９９．４％。
アデノシンの質量分析およびアデノシン精製
Ａｇｉｌｅｎｔ ３００ ＲａｐｉｄＦｉｒｅ自動抽出システム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェース源を備えたＳｃｉｅｘ ６５００トリプル四重極質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）に連結された３つのＨＰＬＣクォータナリポンプとともに使用する。ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃシステムに、再利用可能なＲａｐｉｄＦｉｒｅ ＨＩＬＩＣ（Ｈ１）固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（Ｇ９２０３－８０１０９）を装着する。
Ａｇｉｌｅｎｔ ３００ ＲａｐｉｄＦｉｒｅ自動抽出システム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェース源を備えたＳｃｉｅｘ ６５００トリプル四重極質量分析計（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）に連結された３つのＨＰＬＣクォータナリポンプとともに使用する。ＲａｐｉｄＦｉｒｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃシステムに、再利用可能なＲａｐｉｄＦｉｒｅ ＨＩＬＩＣ（Ｈ１）固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（Ｇ９２０３－８０１０９）を装着する。
試料の充填および洗浄に使用される溶媒Ａは、５％（ｖ／ｖ）のＡＣＮを含有する５０ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ４．０）である。試料の溶離に使用される溶媒Ｂは、７０％のＡＣＮ／３０％のＭｅＯＨ中の０．３％のギ酸＋２％の水酸化アンモニウムである。試料を、マルチウェルプレートから直接、真空下で収集ループ上に１０μＬ吸引することによって、連続的に分析する。１０μＬの試料をＨＩＬＩＣカートリッジ上に充填し、クォータナリポンプ１によって、溶媒Ａを１．２５ｍＬ／分の流量で３０００ミリ秒間使用して、洗浄する。保持された分析物を、クォータナリポンプ３によって、溶媒Ｂを１．２５ｍＬ／分の流量で３０００ミリ秒間使用して、質量分析計へ溶離する。このシステムを、クォータナリポンプ１によって、溶媒Ａを１．２５ｍＬ／分の流量で３０００ミリ秒間使用して、再平衡化する。
トリプル四重極質量分析計にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を装備し、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を陽性モード（Ｍ＋Ｈ）＋で使用して、分析物をモニタリングする。アデノシンをｍ／ｚ２６８．０５／１３６．０で、アデノシン一リン酸をｍ／ｚ３４８．１／１３６．０でモニタリングする。内部標準としてそれぞれ１３Ｃ５アデノシンおよび１５Ｎ５ ＡＭＰを使用して、アデノシンおよびアデノシン一リン酸の面積比の値を計算する。
ヒトＣＤ７３生化学アッセイ
このアッセイの目的は、ＣＤ７３酵素活性に対する５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを特定および特性評価することである。２μＭのアデノシン一リン酸（Ｓｉｇｍａ＃０１９３０）、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＢＳＡ、０．２ｍＭのオクチルグルコシド、および５０ｐＭのＣＤ７３タンパク質を含有する反応混合物（２０μＬ）を、３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ＃２６４５７３）に添加する。室温で３０分間のインキュベーション後、２％のギ酸および１０μＭの１３Ｃ５－アデノシン（１３Ｃ５で標識されたリボース）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－＃ＣＬＭ－３６７８－０）を含有する２０μＬの停止液を添加し、続いて４０μＬのｄＨ２Ｏを添加することによって、反応を終了させる。アデノシン－およびアデノシンリボース－１３Ｃ５（内部標準）レベルを、上記のように質量分析法を利用して決定する。シグナル比（アデノシンピーク積分／アデノシン内部標準ピーク積分）を使用して、各反応を定量化する。式｛阻害％＝１００×［１－（Ｘ－ＭＩＮ）／（ＭＡＸ－ＭＩＮ）］｝を使用することによって阻害率を計算し、式中、Ｘは、ウェルシグナル比に等しく、ＭＡＸは、ＤＭＳＯ対照のシグナル比中央値に等しく、ＭＩＮは、既知の競合的な阻害剤の１０倍超のＩＣ５０の存在下での酵素活性のシグナル比に等しい。スクリーニング目的のために、各化合物を１％のＤＭＳＯ中５０μＭで試験する。５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンのＩＣ５０を、０．００２５～５０μＭの１０種類の濃度（１：３希釈スキームを使用）で各化合物を試験することによって決定する。
このアッセイの目的は、ＣＤ７３酵素活性に対する５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを特定および特性評価することである。２μＭのアデノシン一リン酸（Ｓｉｇｍａ＃０１９３０）、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＢＳＡ、０．２ｍＭのオクチルグルコシド、および５０ｐＭのＣＤ７３タンパク質を含有する反応混合物（２０μＬ）を、３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ＃２６４５７３）に添加する。室温で３０分間のインキュベーション後、２％のギ酸および１０μＭの１３Ｃ５－アデノシン（１３Ｃ５で標識されたリボース）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－＃ＣＬＭ－３６７８－０）を含有する２０μＬの停止液を添加し、続いて４０μＬのｄＨ２Ｏを添加することによって、反応を終了させる。アデノシン－およびアデノシンリボース－１３Ｃ５（内部標準）レベルを、上記のように質量分析法を利用して決定する。シグナル比（アデノシンピーク積分／アデノシン内部標準ピーク積分）を使用して、各反応を定量化する。式｛阻害％＝１００×［１－（Ｘ－ＭＩＮ）／（ＭＡＸ－ＭＩＮ）］｝を使用することによって阻害率を計算し、式中、Ｘは、ウェルシグナル比に等しく、ＭＡＸは、ＤＭＳＯ対照のシグナル比中央値に等しく、ＭＩＮは、既知の競合的な阻害剤の１０倍超のＩＣ５０の存在下での酵素活性のシグナル比に等しい。スクリーニング目的のために、各化合物を１％のＤＭＳＯ中５０μＭで試験する。５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンのＩＣ５０を、０．００２５～５０μＭの１０種類の濃度（１：３希釈スキームを使用）で各化合物を試験することによって決定する。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンのＩＣ５０は、０．０２８μＭである。
マウスＣＤ７３機序アッセイ
このアッセイの目的は、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを、マウスＣＤ７３酵素活性のその阻害に関して評価することである。このアッセイを、３μＭのＡＭＰおよび５０ｐＭのマウスＣＤ７３酵素を使用することを除き、ヒトＣＤ７３生化学アッセイについて前述したように実施する。
このアッセイの目的は、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを、マウスＣＤ７３酵素活性のその阻害に関して評価することである。このアッセイを、３μＭのＡＭＰおよび５０ｐＭのマウスＣＤ７３酵素を使用することを除き、ヒトＣＤ７３生化学アッセイについて前述したように実施する。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンのＩＣ５０は、０．１７５μＭである。
Ｃａｌｕ６ヒト細胞アッセイ
このアッセイの目的は、ＣＤ７３に対する５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを、細胞に基づくアッセイにおいて試験することである。Ｃａｌｕ６細胞（１５００個／ウェル）を、１００μＬの培地（ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１０９５－０７２）＋１％のピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０－０７０）＋１％のＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０－０５０）＋１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃ＳＨ３００７１）を含有する９６ウェルポリ－Ｄ－リジンコーティング済みプレート（ＢＤ＃３５６６４０）中で増殖させる。プレートを室温で３０分間インキュベートし、続いて３７℃／５％のＣＯ２で一晩インキュベートする。細胞を、アッセイ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのＤ－グルコース、１ｍＭのＫＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２）（９０μＬ／ウェル）で２回洗浄する。次いで、９０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、続いて１ウェル当たり１０μＬのＡＭＰおよび化合物プレミックス（５０μＭのＡＭＰ、１％のＤＭＳＯ中の様々な濃度の５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン）を添加する。プレートを室温で６０分間インキュベートする。次いで、１ウェル当たり１０μＬの上清を取り出して新たなプレートに添加し、続いて２０μＬの停止液（２％のギ酸、１．２μＭのアデノシンリボース－１３Ｃ５（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－＃ＣＬＭ－３６７８－０）および９０μＬのｄｄＨ２Ｏを質量分析のために添加する。アデノシン－およびアデノシンリボース－１３Ｃ５（内部標準）レベルを、ヒトＣＤ７３生化学アッセイについて前述したように、質量分析法（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲａｐｉｄＦｉｒｅ）を利用することによって決定する。阻害率も上記のとおり計算する。
このアッセイの目的は、ＣＤ７３に対する５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを、細胞に基づくアッセイにおいて試験することである。Ｃａｌｕ６細胞（１５００個／ウェル）を、１００μＬの培地（ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１０９５－０７２）＋１％のピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０－０７０）＋１％のＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０－０５０）＋１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃ＳＨ３００７１）を含有する９６ウェルポリ－Ｄ－リジンコーティング済みプレート（ＢＤ＃３５６６４０）中で増殖させる。プレートを室温で３０分間インキュベートし、続いて３７℃／５％のＣＯ２で一晩インキュベートする。細胞を、アッセイ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのＤ－グルコース、１ｍＭのＫＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２）（９０μＬ／ウェル）で２回洗浄する。次いで、９０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、続いて１ウェル当たり１０μＬのＡＭＰおよび化合物プレミックス（５０μＭのＡＭＰ、１％のＤＭＳＯ中の様々な濃度の５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン）を添加する。プレートを室温で６０分間インキュベートする。次いで、１ウェル当たり１０μＬの上清を取り出して新たなプレートに添加し、続いて２０μＬの停止液（２％のギ酸、１．２μＭのアデノシンリボース－１３Ｃ５（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ－＃ＣＬＭ－３６７８－０）および９０μＬのｄｄＨ２Ｏを質量分析のために添加する。アデノシン－およびアデノシンリボース－１３Ｃ５（内部標準）レベルを、ヒトＣＤ７３生化学アッセイについて前述したように、質量分析法（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲａｐｉｄＦｉｒｅ）を利用することによって決定する。阻害率も上記のとおり計算する。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンのＩＣ５０は、０．００７３ｕＭである（実施例２の化合物）。
エクスビボ標的阻害アッセイ
このアッセイの目的は、マウス血中のマウスＣＤ７３に対する５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを、エクスビボに基づくアッセイにおいて試験することである。腫瘍がおよそ４００ｍｍ３に達した後、２０％のＨＰＢＣＤ（２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン）（ｐＨ２）に製剤化された各化合物を動物（６匹／群）に経口投与する。経口投与を介した化合物処置に供された動物から収集した全血を使用するエクスビボアッセイについて記載したように、処置後、血液をヘパリン管中に収集し、１３Ｃ１０－１５Ｎ５－ＡＭＰから、標識されたアデノシン、イノシン、およびヒポキサンチンへの変換のエクスビボ分析に使用する。
このアッセイの目的は、マウス血中のマウスＣＤ７３に対する５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを、エクスビボに基づくアッセイにおいて試験することである。腫瘍がおよそ４００ｍｍ３に達した後、２０％のＨＰＢＣＤ（２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン）（ｐＨ２）に製剤化された各化合物を動物（６匹／群）に経口投与する。経口投与を介した化合物処置に供された動物から収集した全血を使用するエクスビボアッセイについて記載したように、処置後、血液をヘパリン管中に収集し、１３Ｃ１０－１５Ｎ５－ＡＭＰから、標識されたアデノシン、イノシン、およびヒポキサンチンへの変換のエクスビボ分析に使用する。
表４に示すように、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンは、異なる用量の化合物を用いて処置した動物由来のマウス全血においてアデノシン、イノシン、およびヒポキサンチンへのＡＭＰの変換を阻害する。
５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンのＩＣ５０は、０．００７３ｕＭである。
ヒトＣＤ７３アッセイのＣａｌｕ６腫瘍に基づくインビボ標的阻害
このアッセイの目的は、ヒトがんＣａｌｕ６細胞由来の異種移植腫瘍におけるヒトＣＤ７３に対する５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを、インビボ標的阻害アッセイにおいて試験することである。Ｃａｌｕ６細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清を補充したＨＢＳＳ培地中で増殖させる。サブコンフルエント状態の細胞をトリプシンを用いて採取し、血清を欠く増殖培地で２回すすぐ。ＨＢＳＳとＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の１：１の混合物中の５×１０６個をヌードマウス（Ｔｈｅ Ｈａｒｌｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の後部脇腹に注射することによって、皮下腫瘍の増殖を開始させる。平均腫瘍体積がおよそ４００～５００ｍｍ３に達したとき、腫瘍の大きさおよび体重によって動物を無作為化し、示されるそれぞれの処置群に入れる。処置後、腫瘍試料（各５０～８０ｍｇ）を収集し、以下に記載の内部標準を含有する１ｍＬの氷冷抽出緩衝液中で加工する。
このアッセイの目的は、ヒトがんＣａｌｕ６細胞由来の異種移植腫瘍におけるヒトＣＤ７３に対する５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンを、インビボ標的阻害アッセイにおいて試験することである。Ｃａｌｕ６細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清を補充したＨＢＳＳ培地中で増殖させる。サブコンフルエント状態の細胞をトリプシンを用いて採取し、血清を欠く増殖培地で２回すすぐ。ＨＢＳＳとＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の１：１の混合物中の５×１０６個をヌードマウス（Ｔｈｅ Ｈａｒｌｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の後部脇腹に注射することによって、皮下腫瘍の増殖を開始させる。平均腫瘍体積がおよそ４００～５００ｍｍ３に達したとき、腫瘍の大きさおよび体重によって動物を無作為化し、示されるそれぞれの処置群に入れる。処置後、腫瘍試料（各５０～８０ｍｇ）を収集し、以下に記載の内部標準を含有する１ｍＬの氷冷抽出緩衝液中で加工する。
ホイル片および液体Ｎ２を乳鉢へ添加して、予冷する。腫瘍組織をホイル片上に落とし、液体Ｎ２を添加する。別のホイル片を腫瘍組織の上部に置き、腫瘍が完全に粉状になるまで乳棒でたたく。５０～１００ｍｇの腫瘍組織をチューブ（Ｆｉｓｈｅｒｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号０２－６８１－３０２）に入れ、ドライアイス上に置く。１個の金属ビーズ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号６９９８９）ならびに１３Ｃ５－アデノシン、１３Ｃ５－ＡＭＰ、１５Ｎ５－ＧＴＰ、１５Ｎ４－イノシン５’－一リン酸、および１３Ｃ－１５Ｎ－ヒポキサンチンの内部標準（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ ＬａｂおよびＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有する１ｍｌの８０％のメタノールをチューブに添加し、試料を、ＬＣ／ＭＳ分析に使用するまで－８０℃で保存する。
経口投与を介した化合物処置に供された動物から収集した全血を使用するエクスビボアッセイについて記載したように、血液もヘパリン管中に収集し、１３Ｃ５－１５Ｎ５－ＡＭＰから、標識されたアデノシン、イノシン、およびヒポキサンチンへの変換のエクスビボ分析に使用する。
表５に示すように、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンは、異なる用量の化合物を用いて処置したＣａｌｕ６腫瘍においてアデノシンへのＡＭＰの変換を阻害する。
ヒト血清中のＣＤ７３活性を測定するためのＬＣ／ＭＳに基づくアッセイ
新鮮な正常ヒト血液を、１，５００ｇで、室温で１５分間遠心分離し、血清を含有する上部画分を収集する。収集した血清（２５ｕｌ／ウェル）を、様々な濃度の５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンおよび一定濃度のレバミソール（１，５００ｕＭ）を含有する９６ディープウェルプレート（ＤＷＰ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｌｅｓ＆Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．カタログ番号９６８８２０）へ移す。氷上での６０分間のインキュベーション後、１３Ｃ５－１５Ｎ５－ＡＭＰ（５０ｕＭ）をプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートする。次いで、プレートに２００ｕＬ／ウェルの１７．３ＴＣＡを添加してドライアイス上に置き、続いてプレート振とう機（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２６ｆｐｓで３分間振とうする。次いで、プレートを２９４０ｇで、４℃で２０分間遠心分離する。遠心分離後、各ウェルからの１００ｕｌ／ウェルの上清を新たな９６ディープウェルプレートに移し、氷上で１８．４ｕｌ／ウェルの２．５ＭのＮａ２ＣＯ３と混合し、続いて内部標準（ＩＳ：１３Ｃ５－ＡＭＰ、１３Ｃ５－アデノシン、１３Ｃ５－ヒポキサンチン、および１５Ｎ４－イノシン）を含有する２００ｕｌの抽出溶液を添加する。２９４０ｇでの、４℃で２０分間のさらなる遠心分離後、２００ｕｌ／ウェルの上清を、上記のようにＬＣ／ＭＳによる１３Ｃ１０－１５Ｎ５－アデノシン、１３Ｃ１０－１５Ｎ５－イノシン、および１５Ｎ５－ヒポキサンチンの分析に使用する。ＥＣ５０計算について、血清中の５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの濃度を、インシリコモデルに由来するか、または実験的な非結合画分（％）で補正する。
新鮮な正常ヒト血液を、１，５００ｇで、室温で１５分間遠心分離し、血清を含有する上部画分を収集する。収集した血清（２５ｕｌ／ウェル）を、様々な濃度の５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンおよび一定濃度のレバミソール（１，５００ｕＭ）を含有する９６ディープウェルプレート（ＤＷＰ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｌｅｓ＆Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．カタログ番号９６８８２０）へ移す。氷上での６０分間のインキュベーション後、１３Ｃ５－１５Ｎ５－ＡＭＰ（５０ｕＭ）をプレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートする。次いで、プレートに２００ｕＬ／ウェルの１７．３ＴＣＡを添加してドライアイス上に置き、続いてプレート振とう機（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２６ｆｐｓで３分間振とうする。次いで、プレートを２９４０ｇで、４℃で２０分間遠心分離する。遠心分離後、各ウェルからの１００ｕｌ／ウェルの上清を新たな９６ディープウェルプレートに移し、氷上で１８．４ｕｌ／ウェルの２．５ＭのＮａ２ＣＯ３と混合し、続いて内部標準（ＩＳ：１３Ｃ５－ＡＭＰ、１３Ｃ５－アデノシン、１３Ｃ５－ヒポキサンチン、および１５Ｎ４－イノシン）を含有する２００ｕｌの抽出溶液を添加する。２９４０ｇでの、４℃で２０分間のさらなる遠心分離後、２００ｕｌ／ウェルの上清を、上記のようにＬＣ／ＭＳによる１３Ｃ１０－１５Ｎ５－アデノシン、１３Ｃ１０－１５Ｎ５－イノシン、および１５Ｎ５－ヒポキサンチンの分析に使用する。ＥＣ５０計算について、血清中の５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンの濃度を、インシリコモデルに由来するか、または実験的な非結合画分（％）で補正する。
表６は、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオンによるヒト血清中のＣＤ７３活性の阻害についてのデータを含む。
インビボモデル
所望の場合、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン、またはその薬学的に許容される塩のＣＤ７３阻害効果の前臨床モデリングを、例えば、当該技術分野において、例えば、Ｒｏｎｇｖａｕｘ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１３；３１：６３５－７４（およびそこに引用されている文献）、Ｓａｎｍａｍｅｄ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１６；２７：１１９０－１１９８（およびそこに引用されている文献）に記載されている方法に従って実施することができる。
所望の場合、５－［５－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－イソプロピルシクロプロピル］－６－メチル－ピリダジン－３－イル］－１Ｈ－ピリミジン－２，４－ジオン、またはその薬学的に許容される塩のＣＤ７３阻害効果の前臨床モデリングを、例えば、当該技術分野において、例えば、Ｒｏｎｇｖａｕｘ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１３；３１：６３５－７４（およびそこに引用されている文献）、Ｓａｎｍａｍｅｄ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１６；２７：１１９０－１１９８（およびそこに引用されている文献）に記載されている方法に従って実施することができる。
Claims (19)
- 式：
（ａ）０．２度の回折角の許容差を有する、６．４°、９．６°、１１．０°、および１１．６°でのピークのうちの１つ以上と組み合わせた、４．３～５．５°の回折角２シータでのＸ線回折パターンのピーク、ならびに
（ｂ）１７．２、２８．７、１２２．０、１２６．１、１４３．６、および１５５ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル
のうちの少なくとも１つを特徴とする、結晶形態。 - 前記４．３～５．５°の回折角２シータでのＸ線回折パターンのピークが、４．３°の回折角２シータにある、請求項１に記載の結晶形態。
- 請求項１または請求項２に記載の結晶形態を含む、組成物。
- 前記組成物が、造粒組成物である、請求項３に記載の組成物。
- 請求項１または請求項２に記載の結晶形態と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 混入物を少なくとも９５％含まない、請求項１または請求項２に記載の結晶形態。
- 少なくとも１ｋｇの請求項３に記載の組成物を含む、製造容器。
- 式：
- （ａ）０．２度の回折角の許容差を有する、１６．４°、１７．８°、および２６．６°でのピークのうちの１つ以上と組み合わせた、５．０°の回折角２シータでのＸ線回折パターンのピーク、ならびに
（ｂ）２３．５、３４．６、１１０．２、１２４．１、１２６．８、および１６６．２ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル
のうちの少なくとも１つを特徴とする、請求項８に記載の半水和物結晶形態。 - 請求項８または請求項９に記載の半水和物結晶形態を含む、組成物。
- 前記組成物が、造粒組成物である、請求項１０に記載の組成物。
- 請求項８または請求項９に記載の半水和物結晶形態と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 前記結晶形態が、混入物を少なくとも９５％含まない、請求項８または請求項９に記載の半水和物結晶形態。
- 少なくとも１ｋｇの請求項１０に記載の組成物を含む、製造容器。
- ５００グラムの式：
- 前記無水結晶形態が、
（ａ）０．２度の回折角の許容差を有する、１１．７°、１５．８°、１６．０°、２６．８°、および２７．２°でのピークのうちの１つ以上と組み合わせた、４．７°の回折角２シータでのＸ線回折パターンのピーク、ならびに
（ｂ）２５．４、２８．９、４３．１、１０９．３、１２４．４、１２８．２、および１６０．７ｐｐｍ（それぞれ、±０．２ｐｐｍ）でのアダマンタンの高磁場共鳴（δ＝２９．５ｐｐｍ）を基準とするピークを含む、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル
のうちの少なくとも１つを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。 - 前記組成物が、造粒組成物である、請求項１５または請求項１６に記載の組成物。
- 請求項１５または請求項１６に記載の組成物と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 少なくとも１ｋｇの請求項１５または請求項１６に記載の組成物を含む、製造容器。
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