JP2022540267A - CIML NK cells and methods therefor - Google Patents
CIML NK cells and methods therefor Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022540267A JP2022540267A JP2021534175A JP2021534175A JP2022540267A JP 2022540267 A JP2022540267 A JP 2022540267A JP 2021534175 A JP2021534175 A JP 2021534175A JP 2021534175 A JP2021534175 A JP 2021534175A JP 2022540267 A JP2022540267 A JP 2022540267A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- ciml
- expanded
- mixture
- cytokine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 233
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 80
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims abstract description 49
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims abstract description 49
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 125
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 76
- 108010057840 ALT-803 Proteins 0.000 claims description 70
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims description 62
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 62
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 39
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 39
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 35
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 34
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 34
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 30
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 30
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 15
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 14
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 13
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 12
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 12
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 12
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 claims description 11
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 claims description 11
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 9
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 7
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 7
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 6
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 6
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 6
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 6
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 5
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 5
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 5
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 3
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 3
- 102000002698 KIR Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100032852 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 102100021186 Granulysin Human genes 0.000 description 1
- 101710168479 Granulysin Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101150069255 KLRC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100404845 Macaca mulatta NKG2A gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002030 Merkel cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101100261153 Mus musculus Mpl gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229940127143 NHS-IL12 immunocytokine Drugs 0.000 description 1
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 108010004222 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 206010029266 Neuroendocrine carcinoma of the skin Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000017763 cutaneous neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000030941 detection of cell density Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000007773 growth pattern Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003566 hemangioblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 102000053350 human FCGR3B Human genes 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001785 maturational effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 210000000716 merkel cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102220311640 rs1382779104 Human genes 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002483 superagonistic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
Abstract
増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞が提示される。最も典型的には、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、末梢血又は臍帯血の単核球画分に由来する。さらに検討された態様では、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、操作上の複雑性及び産生コストを実質的に低減する、収容される自動化された産生環境下で拡大され、誘導される。Cytokine-induced memory-like (CIML) NK cells with enhanced cytotoxicity are presented. Most typically, CIML NK cells are derived from the mononuclear cell fraction of peripheral blood or cord blood. In further contemplated embodiments, CIML NK cells are expanded and derived in a contained, automated production environment that substantially reduces operational complexity and production costs.
Description
本開示は、活性化された免疫能細胞を作製及び／又は培養するための組成物、方法、及びデバイスに関し、特にそれは、臍帯血（ＣＢ）又は末梢血（ＰＢ）から産生されるメモリー様ＮＫ細胞に関する。 The present disclosure relates to compositions, methods, and devices for generating and/or culturing activated immunocompetent cells, particularly those that contain memory-like NK produced from cord blood (CB) or peripheral blood (PB). Regarding cells.
背景説明は、本開示を理解するのに有用であってもよい情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれもが先行技術であるか若しくは以前に請求された発明に関連すること、又は具体的若しくは暗黙的に参照されるいずれの刊行物も先行技術であることは、承認ではない。 The background information includes information that may be useful in understanding the present disclosure. There is no indication that any of the information provided herein is prior art or relates to the previously claimed invention, or that any publication specifically or implicitly referenced is prior art , not approval.
本明細書中のすべての刊行物及び特許出願は、あたかも各個別の刊行物又は特許出願が参照により援用されることが具体的且つ個別に示された場合と同程度まで参照により援用される。援用された参考文献における用語の定義又は使用が矛盾があるか又は本明細書に提供されるその用語の定義に反する場合、本明細書に提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。 All publications and patent applications herein are incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. If the definition or use of a term in an incorporated reference conflicts or is contrary to the definition of that term provided herein, the definition of that term provided herein shall apply and the The definition of that term does not apply.
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫細胞のグループを成し、それらは、グラニュライシン及びパーフォリンの標的特異的放出を介して抗体依存性細胞毒性を示す細胞傷害性リンパ球として特徴づけられることが多い。大部分のＮＫ細胞が、様々な活性化及び阻害性受容体のコレクションに加えて、特異的な細胞表面マーカー特性（例えば、ＣＤ３－、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ５７＋、ＣＤ８＋）を有する。より最近、ＮＫ細胞が特定のがん治療の有意な成分になっている一方で、ＮＫ細胞（及び特に自己ＮＫ細胞）の有意な量での産生は、全血中のＮＫ細胞の画分が比較的低いことから、有意な障害になっている。 Natural killer (NK) cells constitute a group of innate immune cells that can be characterized as cytotoxic lymphocytes that exhibit antibody-dependent cytotoxicity through target-specific release of granulysin and perforin. many. Most NK cells have specific cell surface marker profiles (eg CD3 − , CD56 + , CD16 + , CD57 + , CD8 + ) in addition to a diverse collection of activating and inhibitory receptors. More recently, while NK cells have become a significant component of certain cancer therapies, the production of significant amounts of NK cells (and autologous NK cells in particular) has been shown to increase the fraction of NK cells in whole blood. Since it is relatively low, it is a significant obstacle.
ＮＫ及びＮＫ様細胞を治療的有効量で得るため、ＮＫ細胞は、様々な前駆細胞から作製され得る。例えば、様々な幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５は、臍帯血由来サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞を誘導及び拡大するための様々なインビトロ手法において報告されている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３４９３－３５００（２０１０））。同様に、ＣＤ３４＋造血細胞は、米国特許出願公開第２０１８／００４４６３６号明細書に報告されている通り、ＩＬ－１２及び他の作用剤に曝露され得る。さらに他の手法では、ヒト血球血管芽細胞は、国際公開第２０１１／０６８８９６号パンフレットに記載の通り、２つの異なるサイトカインカクテルに経時的に曝露され、国際公開第２０１２／１２８６２２号パンフレットに教示の通り、異なるサイトカインカクテルが後胚期の造血幹細胞とともに使用された。これら方法の少なくとも一部がＮＫ細胞の有意なｎ倍拡大をもたらす一方で、かかる拡大のための方法及び試薬は、いずれも時間及び資源への要求が厳しい。さらに、公知の方法の多くが、技術面及び規制面の視点から問題になることが多い、支持細胞層上でのＮＫ細胞培養も必要とすることは注目されるべきである。 To obtain therapeutically effective amounts of NK and NK-like cells, NK cells can be generated from various progenitor cells. For example, various stem cell factors (SCF), FLT3 ligand, interleukin (IL)-2, IL-7 and IL-15 are various in vitro agents for inducing and expanding cord blood-derived cytokine-induced killer (CIK) cells. Methods (Anticancer Research 30:3493-3500 (2010)). Similarly, CD34 + hematopoietic cells can be exposed to IL-12 and other agents as reported in US Patent Application Publication No. 2018/0044636. In yet another approach, human hemangioblasts are exposed to two different cytokine cocktails over time, as described in WO2011/068896, and as taught in WO2012/128622. , different cytokine cocktails were used with postembryonic hematopoietic stem cells. While at least some of these methods result in significant n-fold expansion of NK cells, the methods and reagents for such expansion are both time and resource demanding. Furthermore, it should be noted that many of the known methods also require NK cell culture on feeder layers, which is often problematic from a technical and regulatory point of view.
より単純な方法では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞は、ＴｐｏＲアゴニストに曝露されることで、ＡＭＬ細胞がＮＫ細胞を形成することを誘導し得る。しかし、かかる手法は、治療用細胞製剤における供給源として実行不能である可能性が高い。さらに、代替的方法は、国際公開第２０１１／１０３８８２号パンフレットに開示のように、末梢血液細胞を様々なインターロイキン、幹細胞因子、及びＦＬＴ３リガンドの存在下で培養することに依存している。さらに別の方法では、米国特許出願公開第２０１３／０２９５６７１号明細書は、既存のＮＫ細胞をサイトカインとともに抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ３抗体で刺激する方法を教示する。かかる方法は、手順的により簡単である一方で、該細胞の慎重な操作をさらに必要とし、特定の試薬が要求されることから多大なコストがかかる。 In a simpler method, acute myeloid leukemia (AML) cells can be exposed to a TpoR agonist to induce the AML cells to form NK cells. However, such an approach is likely to be impractical as a source in therapeutic cell formulations. In addition, alternative methods rely on culturing peripheral blood cells in the presence of various interleukins, stem cell factors and FLT3 ligands, as disclosed in WO2011/103882. In yet another method, US Patent Application Publication No. 2013/0295671 teaches a method of stimulating pre-existing NK cells with anti-CD16 and anti-CD3 antibodies along with cytokines. While such methods are procedurally simpler, they also require careful manipulation of the cells and are very costly due to the specific reagent requirements.
さらに公知の方法では、米国特許出願公開第１０，１２５，３５１号明細書は、有核細胞を単離するための密度勾配分離が施され、次いでインターフェロン、インターロイキン、ＣＤ３抗体及びヒトアルブミンを含有する培地で培養される、細胞の供給源としての臍帯血又は末梢血の使用について記載している。最も有利には、かかる方法は、バイオリアクター内での灌流培養に適合可能であり、それ故、操作上の困難を有意に低減する。しかし残念ながら、ＮＫ細胞の収率は比較的低い。 In a further known method, US Pat. No. 10,125,351 discloses that nucleated cells are subjected to density gradient separation to isolate nucleated cells followed by interferon, interleukin, CD3 antibody and human albumin. describes the use of cord blood or peripheral blood as a source of cells, cultured in a medium that supports Most advantageously, such methods are adaptable to perfusion culture in bioreactors, thus significantly reducing operational difficulties. Unfortunately, however, the yield of NK cells is relatively low.
特定の産生方法と無関係に、培養されたＮＫ細胞は、典型的にはがん免疫療法にとって特に望ましいメモリー様特性を示さないことになる。メモリー様ＮＫ細胞を産生するための少なくともいくつかの試みでは、培養されたＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８に曝露され、そのように曝露されたＮＫ細胞は、メモリー様表現型を示し、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、及びＣＤ６９の発現並びにＣＤ５７及びＫＩＲの欠如と相関した（Ｂｌｏｏｄ（２０１２）Ｖｏｌ．１２０，Ｎｏ．２４；４７５１－４７６０を参照）。同様に、国際公開第２０１８／０８９４７６号パンフレットに記載の通り、メモリー様ＮＫ細胞は、様々な刺激性サイトカインを用いてＮＫ細胞を予備活性化し、続いて予備活性化された細胞をＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、又はＦＣ２１支持細胞と接触させることにより調製された。メモリー様ＮＫ細胞を作製するためのさらに別の手法では、国際公開第２０１８／１６５２０８号パンフレットに記載の通り、新規に単離されたＮＫ細胞が、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体に曝露された。かかる方法により、典型的には少なくともいくつかのメモリー様特性を有するＮＫ細胞が産生された一方で、選択された標的細胞に対するかかる活性化ＮＫ細胞の細胞傷害性は、おそらくは特定の活性化受容体の欠如若しくは低発現及び／又は特定の阻害性受容体の発現に起因し、依然として最適未満であった。 Regardless of the particular method of production, cultured NK cells will typically not exhibit memory-like properties that are particularly desirable for cancer immunotherapy. In at least some attempts to produce memory-like NK cells, cultured NK cells have been exposed to IL-12, IL-15, and IL-18, and NK cells so exposed have been shown to develop memory-like NK cells. showed a similar phenotype and correlated with the expression of CD94, NKG2A, NKG2C, and CD69 and the absence of CD57 and KIR (see Blood (2012) Vol. 120, No. 24; 4751-4760). Similarly, as described in WO2018/089476, memory-like NK cells preactivate NK cells using various stimulatory cytokines, followed by preactivating preactivated cells with PM21 particles, EX21 Prepared by contacting exosomes or FC21 feeder cells. In yet another approach to generate memory-like NK cells, de novo isolated NK cells are transformed into IL-18/IL-12-TxM fusion protein complexes, as described in WO2018/165208. exposed to the body. While such methods have typically produced NK cells with at least some memory-like properties, the cytotoxicity of such activated NK cells against selected target cells is presumably dependent on specific activation receptors. was still suboptimal due to the lack or low expression of and/or the expression of certain inhibitory receptors.
したがって、たとえメモリー様ＮＫ細胞を作製する様々な方法が当該技術分野で公知であっても、それらのすべて又はほぼすべてが様々な不利益を被る。結果的に、メモリー様ＮＫ細胞、特に自己メモリー様ＮＫ細胞を有意な量で産生する改善されたシステム及び方法を提供することが求められる。さらに、改善されたシステム及び方法もまた、細胞培養及びＮＫ細胞活性化の自動化を可能にし、かかる方法を臨床的且つ商業的に実行可能にするための実質的に減少した試薬要件を有することになる。 Thus, even though various methods of making memory-like NK cells are known in the art, all or nearly all of them suffer from various disadvantages. Consequently, there is a need to provide improved systems and methods for producing significant amounts of memory-like NK cells, particularly autologous memory-like NK cells. Further, the improved systems and methods also enable automation of cell culture and NK cell activation and have substantially reduced reagent requirements to make such methods clinically and commercially viable. Become.
発明者は、メモリー様ＮＫ細胞の作製及び拡大を概念的に単純且つ効率的な様式で可能にする組成物、方法、及びデバイスを発見している。有利には、メモリー様ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞が所望される量まで拡大され、次いで拡大されたＮＫ細胞がサイトカインの混合物により誘導されることで、サイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞が形成されるという２ステッププロセスで作製可能である。ＮＫ細胞の拡大は、好ましくは、Ｎ－８０３及び抗ＣＤ１６アゴニスト抗体及び任意選択的には抗ＣＤ３抗体を使用する濃縮プロセス中に実施される。次に、メモリー様特性を得るための活性化は、刺激性サイトカインの組み合わせ、最も好ましくはＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＬ－１８又はＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体により実施される。 The inventors have discovered compositions, methods, and devices that enable the generation and expansion of memory-like NK cells in a conceptually simple and efficient manner. Advantageously, memory-like NK cells are expanded to a desired amount of NK cells and then the expanded NK cells are induced with a mixture of cytokines to form cytokine-induced memory-like (CIML) NK cells. It can be produced by a two-step process of NK cell expansion is preferably performed during the enrichment process using N-803 and an anti-CD16 agonistic antibody and optionally an anti-CD3 antibody. Activation to obtain memory-like properties is then carried out by combinations of stimulatory cytokines, most preferably IL-12/IL-15/IL-18 or IL-18/IL-12-TxM fusion protein complexes. be done.
意外にも、活性化マーカー及びＩＦＮ－γ分泌の上方制御に加えて、そのように活性化・拡大されたメモリー様ＮＫ細胞は、ＣＤ２５及びＮＫ活性化受容体ＤＮＡＭ－１の増強された発現、並びに阻害性受容体ＴＩＧＩＴの下方制御された発現を有し、それらはおそらくは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の認められた増強された毒性に寄与したか又はその原因になった。最も注目すべきは、本明細書で提示されるＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、他のＮＫ抵抗性腫瘍細胞株ＭＳ－１に対して、比較的低いエフェクター対標的比で有意な細胞傷害性をさらに示した。 Surprisingly, in addition to upregulating activation markers and IFN-γ secretion, such activated and expanded memory-like NK cells exhibited enhanced expression of CD25 and the NK-activating receptor DNAM-1, and downregulated expression of the inhibitory receptor TIGIT, which likely contributed to or caused the observed enhanced toxicity of CIML NK cells. Most notably, the CIML NK cells presented here also exhibited significant cytotoxicity at relatively low effector-to-target ratios against another NK-resistant tumor cell line, MS-1 .
本発明の主題の一態様では、発明者は、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞を産生する方法であって、生体液から単核球の混合物を単離するステップと、ＮＫ細胞を拡大するため、単核球の混合物を抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３と接触させる別のステップと、を含む方法を検討している。さらなるステップでは、拡大されたＮＫ細胞は、刺激性サイトカイン組成物（典型的には、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む）と接触され、それにより増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞が作製される。所望される場合、検討された方法は、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を再刺激後、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞をＮ－８０３と接触させるステップをさらに含んでもよい。 In one aspect of the present subject matter, the inventors have provided a method of producing CIML NK cells with enhanced cytotoxicity comprising isolating a mixture of mononuclear cells from a biological fluid; another step of contacting the mixture of mononuclear cells with an anti-CD16 antibody and N-803 for expansion. In a further step, expanded NK cells are treated with a stimulatory cytokine composition (typically a mixture of IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex, IL-12, N-803 and IL-18). , or a mixture of IL-12, IL-15, and IL-18), thereby producing CIML NK cells with enhanced cytotoxicity. If desired, the contemplated method may further comprise contacting the CIML NK cells with N-803 after restimulating the CIML NK cells.
好ましくは、必然ではないが、生体液は全血又は臍帯血であり、単核球の混合物は、ＮＫ細胞を濃縮するため、さらに処理されることはない。最も典型的には、単核球の混合物は、約１００～５００×１０６個の細胞を含有し、及び／又は混合物を接触させるステップは、約１００～３００ｍｌの間の体積で、若しくは約１×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度で実施される。さらなる実施形態では、混合物を接触させるステップにおける抗ＣＤ１６抗体は、０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌ間の濃度で存在してもよく、及び／又は混合物を接触させるステップにおけるＮ－８０３は、０．１～１．０ｎＭ間の濃度で存在してもよい。任意選択的には、混合物を接触させるステップは、単核球の混合物を抗ＣＤ３抗体と（例えば、０．１～１．０ｎｇ／ｍｌ間の抗ＣＤ３抗体濃度で）接触させるステップをさらに含んでもよい。 Preferably, but not necessarily, the biological fluid is whole blood or cord blood and the mixture of mononuclear cells is not further processed to enrich for NK cells. Most typically, the mixture of mononuclear cells contains about 100-500×10 6 cells and/or the step of contacting the mixture is performed in a volume of between about 100-300 ml, or about 1 Performed at a cell density of x106 cells/ml. In further embodiments, the anti-CD16 antibody in the contacting mixture may be present at a concentration between 0.05 and 0.5 mcg/ml and/or the N-803 in the contacting mixture is 0 It may be present at concentrations between .1 and 1.0 nM. Optionally, contacting the mixture further comprises contacting the mixture of mononuclear cells with an anti-CD3 antibody (eg, at an anti-CD3 antibody concentration of between 0.1-1.0 ng/ml). good.
いくつかの態様では、刺激性サイトカイン組成物がＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む一方で、その他の態様では、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物を含み、さらなる態様では、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む。最も典型的には、ＮＫ細胞は、約０．５～５．０×１０９個の細胞の全細胞数に拡大され、及び／又は拡大されたＮＫ細胞を刺激性サイトカイン組成物と接触させるステップは、ＮＫ細胞を拡大するステップと同じ容器内で実施される。 In some aspects, the stimulatory cytokine composition comprises an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex, while in other aspects, the stimulatory cytokine composition comprises IL-12, N-803, and IL-18, and in a further aspect, the stimulatory cytokine composition comprises a mixture of IL-12, IL-15, and IL-18. Most typically, the NK cells are expanded to a total cell number of about 0.5-5.0×10 9 cells and/or contacting the expanded NK cells with a stimulatory cytokine composition is performed in the same vessel as the step of expanding the NK cells.
したがって、異なる視点から眺めると、発明者はまた、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞を形成するため、ＮＫ細胞を活性化させる方法を検討している。かかる方法は、拡大された（典型的には全血又は臍帯血の単核球から拡大された）ＮＫ細胞を準備するステップと、拡大されたＮＫ細胞を、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含んでもよい刺激性サイトカイン組成物と接触させ、それにより増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するさらなるステップと、を含むことになる。 Viewed from a different perspective, therefore, the inventors also explore methods of activating NK cells to form CIML NK cells with enhanced cytotoxicity. Such methods comprise the steps of providing expanded NK cells (typically expanded from whole blood or cord blood mononuclear cells); contacting with a stimulatory cytokine composition which may comprise a fusion protein complex, a mixture of IL-12, N-803, and IL-18, or a mixture of IL-12, IL-15, and IL-18, thereby and a further step of generating CIML NK cells with enhanced cytotoxicity.
前記の通り、ＮＫ細胞が全血又は臍帯血から拡大されることが検討される。したがって、ＮＫ細胞は、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を含む輸血を受けている個体と対照的に、自己であってもよい。好ましくは、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む。しかし、さらなる実施形態では、刺激性サイトカイン組成物はまた、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含んでもよい。典型的には、拡大されたＮＫ細胞は、約０．５～５．０×１０９個の細胞の全細胞数を有する。 As noted above, NK cells are contemplated to be expanded from whole blood or cord blood. Thus, the NK cells may be autologous, in contrast to transfused individuals containing CIML NK cells. Preferably, the stimulatory cytokine composition comprises an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex. However, in further embodiments, the stimulatory cytokine composition may also comprise a mixture of IL-12, N-803 and IL-18 or a mixture of IL-12, IL-15 and IL-18. Typically, expanded NK cells have a total cell number of about 0.5-5.0×10 9 cells.
さらに、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞がＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を有することになり、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞がＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ１６の低下した発現を有し、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞がＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＴＩＧＩＴの低下した発現を有し、且つ／又は増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞がＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ２５及び／若しくはＤＮＡＭ１の増強された発現を有することが検討される。 Furthermore, CIML NK cells with enhanced cytotoxicity became cytotoxic to MS-1 cells, and CIML NK cells with enhanced cytotoxicity were contacted with N-803 alone. CIML NK cells with reduced expression of CD16 compared to untreated NK cells and enhanced cytotoxicity had reduced expression of TIGIT compared to expanded NK cells contacted with N-803 alone. and/or CIML NK cells with enhanced cytotoxicity have enhanced expression of CD25 and/or DNAM1 compared to expanded NK cells contacted with N-803 alone. .
したがって、発明者はまた、５以下のエフェクター対標的細胞比で少なくとも５０％殺傷する、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を示す、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞について検討している。さらなる態様では、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ１６の低下した発現を有し、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＴＩＧＩＴの低下した発現を有し、且つ／又はＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ２５及び／若しくはＤＮＡＭ１の増強された発現を有する。 Accordingly, the inventors are also considering CIML NK cells with enhanced cytotoxicity, exhibiting cytotoxicity to MS-1 cells that kill at least 50% at effector to target cell ratios of 5 or less. In a further aspect, the CIML NK cells have reduced expression of CD16 compared to expanded NK cells contacted with N-803 alone and compared to expanded NK cells contacted with N-803 alone. have reduced expression of TIGIT and/or have enhanced expression of CD25 and/or DNAM1 relative to expanded NK cells contacted with N-803 alone.
本発明の主題に限定しない一方で、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、好ましくは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を含む輸血を受けている個体と対照的に自己細胞である。他の実施形態では、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞はまた、組換えＮＫ細胞であってもよい。例えば、かかる組換え細胞は、ＣＤ１６若しくはその変異体、ＩＬ－２若しくはその変異体、及び／又はＩＬ－１５若しくはその変異体を組換え核酸から発現してもよい。 While not limiting to the subject matter of the present invention, the CIML NK cells are preferably autologous, in contrast to transfused individuals containing CIML NK cells. In other embodiments, CIML NK cells may also be recombinant NK cells. For example, such recombinant cells may express CD16 or variants thereof, IL-2 or variants thereof, and/or IL-15 or variants thereof from recombinant nucleic acids.
さらに検討された態様では、発明者はまた、薬学的に許容できる担体を本明細書で提示されるようなＣＩＭＬ ＮＫ細胞と組み合わせて含む医薬組成物について検討している。結果的に、薬剤における、また特にがんの治療における本明細書で提示されるようなＣＩＭＬ ＮＫ細胞の使用が検討される。 In further discussed aspects, the inventors also contemplate pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier in combination with CIML NK cells as provided herein. Consequently, the use of CIML NK cells as presented herein in medicine, and particularly in the treatment of cancer, is contemplated.
したがって、発明者はまた、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞でそれを必要とする個体を治療する方法であって、本明細書で提示されるようなＣＩＭＬ ＮＫ細胞の治療有効量を個体に投与するステップを含む方法について検討している。好ましくは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、個体の自己細胞であり、及び／又はＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、末梢血又は臍帯血由来ＮＫ細胞である。 Accordingly, the inventor also provides a method of treating an individual in need thereof with CIML NK cells comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of CIML NK cells as provided herein. I am considering. Preferably, the CIML NK cells are autologous cells of the individual and/or the CIML NK cells are peripheral blood or cord blood derived NK cells.
様々な目的、特徴、態様、及び利点は、数値に類するものが成分に類するものを表すような貼付の図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明白になるであろう。 Various objects, features, aspects, and advantages will become more apparent from the following detailed description of the preferred embodiments, along with the accompanying drawings in which numerical likenesses represent componentry likenesses.
がんの治療における免疫療法では、様々な細胞に基づく成分の利用が増えており、より最近ではＮＫ細胞が有望なモダリティになっている。一部のＮＫ細胞が比較的高い量で現在利用可能である一方で、自己ＮＫ細胞及び／又はメモリー様ＮＫ細胞の治療的有効量での産生についての問題は、良くても未解決のままである。残念ながら、現在の方法の多くが、支持細胞層の使用又は単離されたＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の分化を必要とし、双方ともに時間・資源集約的である。さらに、要求される様々な操作ステップに起因し、かかる方法は、典型的にはヒト相互作用を必要とし、易汚染性である。さらに、ＮＫ細胞のメモリー様表現型への変換により、少なくとも一部のプロトコルにおいて細胞傷害性が低下することがある、又はかかる細胞が十分な量で送達されないことがある。 Immunotherapy in the treatment of cancer is increasingly utilizing various cell-based components, and more recently NK cells have become a promising modality. While some NK cells are currently available in relatively high amounts, the question of producing autologous NK cells and/or memory-like NK cells in therapeutically effective amounts remains unsolved at best. be. Unfortunately, many of the current methods require the use of feeder layers or differentiation of isolated CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs), both of which are time and resource intensive. Furthermore, due to the various manipulation steps required, such methods typically require human interaction and are prone to contamination. Additionally, conversion of NK cells to a memory-like phenotype may result in reduced cytotoxicity in at least some protocols, or such cells may not be delivered in sufficient quantities.
発明者は現在、メモリー様ＮＫ細胞に容易に変換可能なＮＫ細胞を治療的有効量（例えば、少なくとも０．５×１０９個のＮＫ細胞）で、一旦単核球が生体液（例えば、全血、臍帯血）から得られると、完全に自動化することさえ可能である単純且つ有効な方法で作製するための様々なシステム、組成物、及び方法を発見している。有利には、かかるＮＫ細胞は、自己ＮＫ細胞であり得、メモリー様表現型に誘導され、増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞がもたらされ得る。特に、以下により詳細に説明される通り、そのように作製されたＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、他の（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞と比べて優位な細胞傷害性を有するだけでなく、ＭＳ－１細胞（メルケル細胞がん細胞）など、通常はＮＫ細胞の細胞傷害性に対して抵抗性又はさらに不活性である標的細胞に対して有意な殺傷能力を有することになる。 The inventors have now discovered that a therapeutically effective amount (e.g., at least 0.5 x 10 9 NK cells) of NK cells that are readily convertible to memory-like NK cells, once the mononuclear cells are in a biological fluid (e.g., total We have discovered a variety of systems, compositions and methods for making in a simple and effective manner that can even be fully automated when obtained from blood, cord blood). Advantageously, such NK cells may be autologous NK cells and may be induced to a memory-like phenotype, resulting in cytokine-induced memory-like (CIML) NK cells with enhanced cytotoxicity. In particular, as described in more detail below, the CIML NK cells so generated not only possess superior cytotoxicity compared to other (CIML) NK cells, but also MS-1 cells (Merkel cells). cancer cells), which are normally resistant or even inactive to NK cell cytotoxicity.
いかなる理論又は仮説によっても拘束されることを望んでいないが、発明者は、増強された細胞傷害性が、拡大条件に先立つ（ナイーブ）ＮＫ細胞の供給源、おそらくは拡大及びサイトカイン誘導の中断されない（例えば、培地、培養条件などの変更）性質に起因することがあり、それにより活性化因子の過剰発現及び阻害性受容体の過小発現が生じることがあると考えている。本明細書で提示されるＣＩＭＬ ＮＫ細胞の他の注目すべき特徴の中で、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、典型的には５以下のエフェクター対標的細胞比で少なくとも５０％殺傷する、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を示すことになり、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＴＩＧＩＴ（阻害性受容体）の低下した発現、及びＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ２５及び／又はＤＮＡＭ１（活性化共受容体）の増加した発現を有することになる。したがって、用語「増強された細胞傷害性を有するＮＫ細胞」は、５以下のエフェクター対標的細胞比で少なくとも５０％殺傷する、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＴＩＧＩＴ（阻害性受容体）の低下した発現、及び／又はＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ２５及び／又はＤＮＡＭ１（活性化共受容体）の増加した発現を示すＮＫ細胞を指す。さらに、検討対象のＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、典型的にはＣＤ１６の低下した発現も示すことになる。最も典型的には、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、上記パラメータ（即ち、通常のＮＫ抵抗性細胞に対する細胞傷害性、活性化受容体の増加した発現、阻害性受容体の低下した発現）の３つすべてを示すことになる。 While not wishing to be bound by any theory or hypothesis, the inventors believe that enhanced cytotoxicity is a source of (naive) NK cells prior to expansion conditions, possibly uninterrupted expansion and cytokine induction ( For example, changes in media, culture conditions, etc.) may result in overexpression of activators and underexpression of inhibitory receptors. Among other notable characteristics of CIML NK cells presented herein, CIML NK cells typically kill at least 50% at effector-to-target cell ratios of 5 or less for MS-1 cells. Reduced expression of TIGIT (inhibitory receptor) compared to expanded NK cells contacted with N-803 alone, and expanded NKs contacted with N-803 alone, which would exhibit cytotoxicity will have increased expression of CD25 and/or DNAM1 (activating co-receptor) compared to cells. Thus, the term "NK cells with enhanced cytotoxicity" refers to cytotoxicity to MS-1 cells that kill at least 50% at an effector to target cell ratio of 5 or less, expansion contacted with N-803 alone. decreased expression of TIGIT (inhibitory receptor) compared to NK cells that were exposed to NK cells, and/or CD25 and/or DNAM1 (activating co-receptor) compared to expanded NK cells that were contacted with N-803 alone. refers to NK cells that exhibit increased expression of In addition, the CIML NK cells under study will typically also exhibit reduced expression of CD16. Most typically, CIML NK cells exhibit all three of the above parameters (i.e., cytotoxicity against normal NK-resistant cells, increased expression of activating receptors, decreased expression of inhibitory receptors). will show.
本明細書で検討される１つの例示的プロセスでは、ＮＫ細胞は、第１ステップで、単核球を含有する生体液の画分から、好ましくは約０．５～５．０×１０９個の細胞の全細胞数まで拡大される。特に、かかる拡大は、支持細胞又は培養容器の変更を必要とする他の操作を必要とせず、比較的小さい体積の単一の反応器内で中等度の細胞密度まで（例えば、１００～３００ｍｌ又は約０．５～５．０×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度で）実施され得る。一旦所望されるＮＫ細胞量が達成されると、次にそのように拡大されたＮＫ細胞は、第２ステップで、ＮＫ細胞をメモリー様表現型に活性化するため、刺激性サイトカイン組成物と接触される。好ましくは、刺激性サイトカイン組成物は、図１に例示される通り、必ずしもＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含むことにならない。しかし、刺激性サイトカイン組成物はまた、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含んでもよい。サイトカイン刺激は、典型的には、４～２４時間の期間にわたり実施されることになり、そのように作製されたＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、輸血前に（好ましくはＮ－８０３の存在下で）静止又は再刺激されてもよい。 In one exemplary process discussed herein, NK cells are isolated in a first step from a fraction of a biological fluid containing mononuclear cells, preferably about 0.5-5.0×10 9 It is scaled up to the total number of cells. In particular, such expansion does not require feeder cells or other manipulations that require changes in the culture vessel, up to moderate cell densities (e.g., 100-300 ml or at a cell density of about 0.5-5.0×10 6 cells/ml). Once the desired NK cell mass is achieved, the so expanded NK cells are then contacted in a second step with a stimulatory cytokine composition to activate the NK cells to a memory-like phenotype. be done. Preferably, the stimulatory cytokine composition will not necessarily comprise an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex as illustrated in FIG. However, the stimulatory cytokine composition may also contain a mixture of IL-12, N-803 and IL-18, or a mixture of IL-12, IL-15 and IL-18. Cytokine stimulation will typically be performed over a period of 4-24 hours, and the CIML NK cells so generated are either quiescent (preferably in the presence of N-803) or May be restimulated.
例えば、全血又は臍帯血は、単核球を得るために処理される出発物質として利用可能である。最も典型的には、通常の密度勾配遠心分離を使用して（例えば、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されたＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（商標）（親水性可溶性多糖、密度１．０７７ｇ／ｍＬ）を使用）、処理が実施され得る。一旦単核球が遠心管から分離されると、該細胞は洗浄され、活性化培地（例えば、１０％ヒトＡＢ血清を添加したＮＫ ＭＡＣＳ）中に再懸濁される。活性化培地は、約０．４ｎＭの濃度でのＮ－８０３、及び約１．０ｍｃｇ／ｍｌの濃度での抗ＣＤ１６抗体をさらに含み得る。 For example, whole blood or cord blood are available as starting materials that are processed to obtain mononuclear cells. Most typically, processing is performed using conventional density gradient centrifugation (e.g., using Ficoll-Paque Plus™ (hydrophilic soluble polysaccharide, density 1.077 g/mL) commercially available from GE Lifesciences). can be implemented. Once the mononuclear cells are separated from the centrifuge tube, the cells are washed and resuspended in activation medium (eg NK MACS supplemented with 10% human AB serum). The activation medium may further comprise N-803 at a concentration of about 0.4 nM and an anti-CD16 antibody at a concentration of about 1.0 mcg/ml.
最も典型的には、単核球は、約２００ｍｌの総体積中で１～２×１０６個の細胞／ｍｌの密度を有し、且つ該細胞及び培地は、単一の容器内に存在する。約３～４日後、該細胞にＮ－８０３を含有する新しい培地が供給され、さらなる供給サイクルが、回収、迅速な拡大、及び培養達成を通じて約３日ごとに実施される。特に、かかるスキームにおけるＮＫ細胞拡大の成功は、図２に例示される通り、刺激性因子の適切な選択に有意に依存した。ここで、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を使用するとき、０日目から２０，０００倍を超える著しい拡大が認められた一方で、抗ＣＤ１６抗体単独は、同様の著しい効果をもたらすことができなかった。特に、抗４－１ＢＢ抗体の存在は、ＮＫ細胞を早めに増殖し尽くすように思われた。
Most typically, mononuclear cells have a density of 1-2×10 6 cells/ml in a total volume of about 200 ml, and the cells and medium are in a single container. . After about 3-4 days, the cells are fed with fresh medium containing N-803, and further feeding cycles are performed about every 3 days through harvest, rapid expansion, and culture attainment. In particular, the success of NK cell expansion in such schemes was significantly dependent on the proper selection of stimulatory factors, as illustrated in FIG. Here, a significant expansion of over 20,000-fold from
次に、所望される量、典型的には約０．５～５．０×１０９個の全細胞に達するとき、且つ／又は所望される拡大（例えば少なくとも１００倍の拡大）に達するとき、細胞培養が終結する。特に、明白な単純性にもかかわらず、そのようにして得られた細胞培養物は、約３週後、約８５％を超えるＮＫ細胞とともに、約８％未満のＮＫＴ細胞、及び約２．５％未満のＴ細胞、及び約１．２％未満の二重陰性（ＤＮ）Ｔ細胞を含有する。さらに、全培養プロセスは、培養ステップ中、汚染リスクを実質的に低減し、試薬及び細胞操作を取り除く、自己完結型バイオリアクター内部の単一容器内で実施されてもよいことは理解されるべきである。 then, upon reaching the desired amount, typically about 0.5-5.0×10 9 total cells, and/or reaching the desired expansion (eg, at least 100-fold expansion), Cell culture is terminated. Notably, despite its apparent simplicity, the cell cultures so obtained show, after about 3 weeks, more than about 85% NK cells, with less than about 8% NKT cells, and about 2.5 % T cells and less than about 1.2% double negative (DN) T cells. Additionally, it should be appreciated that the entire culture process may be performed within a single vessel within a self-contained bioreactor, substantially reducing contamination risk and eliminating reagents and cell manipulation during the culture steps. is.
該細胞は、所望される細胞量に達するとき、その後のサイトカイン刺激を意図して、新しい培地に移すことができる。或いは、メモリー様表現型を作製するためのサイトカイン刺激は、典型的には、さらなる培地に、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体（又はＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物）を含む刺激性サイトカイン組成物を添加することにより、同じ培地中で実施され得る。ほとんどの場合、サイトカイン刺激は、約４～２４時間の間、より典型的には１２～１６時間の間の期間にわたり、実施されることになる。容易に理解されるであろうが、次に該細胞は、輸血前に輸血培地に移すことができる。さらに、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の表現型及び／又は細胞傷害性が判定されてもよく、例示的結果が以下により詳細に示される。 When the desired cell mass is reached, the cells can be transferred to fresh medium with the intention of subsequent cytokine stimulation. Alternatively, cytokine stimulation to create a memory-like phenotype typically includes IL-18/IL-12-TxM fusion protein complexes (or IL-12, N-803, and IL-12, N-803, and IL-12-TxM fusion protein complexes in additional media). 18, or a mixture of IL-12, IL-15, and IL-18) can be performed in the same medium. In most cases, cytokine stimulation will be performed over a period of about 4-24 hours, more typically between 12-16 hours. As will be readily appreciated, the cells can then be transferred to transfusion medium prior to transfusion. Additionally, CIML NK cell phenotype and/or cytotoxicity may be determined, with exemplary results presented in more detail below.
好適な生体液に関しては、体液が、本明細書で提示される方法において単離されたＮＫ細胞を受けることになる個体に対して自己であり得ると一般に考えられている。したがって、特に好ましい生体液は、新しい全血、臍帯血（凍結又は新鮮）、及び白血球除去手順において分離された細胞を含む。しかし、生体液がまた、（典型的には他の細胞型の中の）ＮＫ細胞を含有する任意の体液であってもよいことは理解されるべきである。例えば、好適な代替的な生体液は、適合性ＭＨＣタイプに一致しても又は一致しなくてもよい、同種ドナーからの全血を含む。したがって、有効期限に近づいた血液バンク内のサンプルは、ＮＫ細胞レシピエント以外の個体により新規に供与された全血又は貯蔵された臍帯血と同様、使用に適すると思われる。さらに、生体液が臍帯血である場合、ＮＫ細胞レシピエントと十分なＭＨＣ一致後、臍帯血が一致され、供与されてもよいことは注目されるべきである。同様に、単核球を単離又は濃縮する方法が大幅に変化してもよく、当業者が単離及び濃縮の最適な方法を容易に理解するであろうことは注目されるべきである。例えば、生体液が全血又は臍帯血である場合、体液が任意の好適な培地（例えば、フィコール・ハイパック）を用いての勾配密度遠心分離を介して処理されることは好ましい。或いは、単核球は、患者から白血球除去により直接的に入手されてもよく、又は生体液は、抗体を用いる赤血球の除去が施されてもよい。さらなる方法では、単核球は、ビーズが単核球に結合する抗体にコーティングされるか又はそれ以外では共役される場合、磁気ビーズ分離を用いて単離されてもよい。 With respect to suitable biological fluids, it is generally believed that the bodily fluid can be autologous to the individual who will receive the isolated NK cells in the methods presented herein. Accordingly, particularly preferred biological fluids include fresh whole blood, cord blood (frozen or fresh), and cells separated in leukapheresis procedures. However, it should be understood that the biological fluid may also be any biological fluid containing NK cells (typically among other cell types). For example, suitable alternative biological fluids include whole blood from allogeneic donors, which may or may not be matched to compatible MHC types. Therefore, samples in the blood bank approaching their expiration date are likely to be suitable for use, as are freshly donated whole blood or banked umbilical cord blood by individuals other than NK cell recipients. Additionally, it should be noted that if the biological fluid is cord blood, the cord blood may be matched and donated after sufficient MHC matching with the NK cell recipient. Likewise, it should be noted that methods for isolating or enriching mononuclear cells may vary widely and those skilled in the art will readily appreciate the optimal method of isolation and enrichment. For example, if the biological fluid is whole blood or cord blood, it is preferred that the fluid be processed via gradient density centrifugation using any suitable medium (eg, Ficoll Hypaque). Alternatively, mononuclear cells may be obtained directly from the patient by leukapheresis, or the biological fluid may be subjected to red blood cell depletion using antibodies. In a further method, mononuclear cells may be isolated using magnetic bead separation, where the beads are coated or otherwise conjugated with an antibody that binds to mononuclear cells.
同様に、活性化及び供給における培地の特定の性質がＮＫ ＭＡＣＳ培地に限られる必要がないが、ＮＫ細胞の成長を支持することが知られるすべての培地が本明細書での使用に適すると思われることは理解されるべきである。しかし、最も好ましくは、限定培地が使用され、それにヒトＡＢ血清が添加されてもよい。 Likewise, although the particular properties of the medium in activation and feeding need not be limited to NK MACS medium, any medium known to support NK cell growth is considered suitable for use herein. It should be understood that However, most preferably a defined medium is used, to which human AB serum may be added.
単核球の混合物中でのＮＫ細胞の増殖は、好ましくは抗ＣＤ１６抗体とＮ－８０３との組み合わせ、任意選択的には抗ＣＤ３抗体を用いて刺激及び支持される。当該技術分野で公知の／市販の抗ＣＤ１６抗体に対して様々な供給源が存在し、また特に好ましい抗ＣＤ１６抗体は、アゴニスト（活性化する）活性を有し、ヒトＣＤ１６に特異的である。しかし、抗ＣＤ１６抗体以外のアクチベーターもまた、本明細書での使用に適するとみなされ、抗ＣＤ１６抗体断片及び抗ＣＤ１６抗体断片との融合タンパク質を含む。追加的に又は代替的に、検討対象のアクチベーターはまた、特に、ＣＤ３１４又はＮＫＧ２Ｄ、天然細胞傷害性受容体ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４４）及びＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、短い細胞質側末端を保有するＣＤ１５８又はキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーのメンバー（ＫＩＲ２ＤＳ及びＫＩＲ３ＤＳ）、及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃを含む。 Proliferation of NK cells in the mixture of mononuclear cells is preferably stimulated and supported using a combination of anti-CD16 antibody and N-803, optionally anti-CD3 antibody. There are various sources for anti-CD16 antibodies known/commercially available in the art, and particularly preferred anti-CD16 antibodies have agonistic (activating) activity and are specific for human CD16. However, activators other than anti-CD16 antibodies are also considered suitable for use herein, including anti-CD16 antibody fragments and fusion proteins with anti-CD16 antibody fragments. Additionally or alternatively, activators of interest are also, inter alia, CD314 or NKG2D, the natural cytotoxic receptors CD335 (NKp46), CD336 (NKp44) and CD337 (NKp30), CD226 (DNAM-1), Includes CD244 (2B4), CD158 or killer immunoglobulin-like receptor (KIR) family members (KIR2DS and KIR3DS), which possess short cytoplasmic tails, and CD94/NKG2C.
抗ＣＤ１６抗体の濃度は、典型的には、ＮＫ細胞の活性化に対する当該技術分野で既知の場合に従うことになる。したがって、抗ＣＤ１６抗体に適した濃度は、約０．０１～５．０ｍｃｇ／ｍｌの間、より典型的には約０．０１～０．３ｍｃｇ／ｍｌの間、又は約０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの間、又は約０．１～１．０ｍｃｇ／ｍｌの間、又は約１．０～５．０ｍｃｇ／ｍｌの間となる。抗ＣＤ１６抗体への曝露の持続時間に関しては、最も典型的には単核球が単離され、第１（及び／第２、及び／又は第３）の期間、活性化培地と接触されるとき、単核球の混合物が専ら単回、２回、又は３回用量の抗ＣＤ１６抗体に曝露されると一般に考えられる。当業者は、ＮＫ細胞活性化を達成するための適切なスケジュール及び用量を容易に理解できるであろう。最も典型的には、単核球の抗ＣＤ１６抗体への曝露は、単核球のＮ－８０３との曝露と同時的である。しかし、大して好ましくない実施形態では、単核球の抗ＣＤ１６抗体への曝露は、単核球のＮ－８０３との曝露に対して経時的である（ここでは最初に単核球の抗ＣＤ１６抗体への曝露が好ましい順序である）。 The concentration of anti-CD16 antibody will typically follow what is known in the art for NK cell activation. Suitable concentrations for anti-CD16 antibodies are therefore between about 0.01 and 5.0 mcg/ml, more typically between about 0.01 and 0.3 mcg/ml, or between about 0.05 and 0.05 mcg/ml. between 5 mcg/ml, or between about 0.1-1.0 mcg/ml, or between about 1.0-5.0 mcg/ml. With respect to the duration of exposure to anti-CD16 antibody, most typically when mononuclear cells are isolated and contacted with activation medium for a first (and/or second and/or third) period of time , it is generally believed that a mixture of mononuclear cells is exclusively exposed to single, two, or three doses of anti-CD16 antibody. Those of skill in the art will readily appreciate appropriate schedules and dosages to achieve NK cell activation. Most typically, exposure of the mononuclear cells to the anti-CD16 antibody is simultaneous with exposure of the mononuclear cells to N-803. However, in a less preferred embodiment, the exposure of the mononuclear cells to the anti-CD16 antibody is sequential with respect to the exposure of the mononuclear cells to N-803 (where the mononuclear cells were first exposed to the anti-CD16 antibody). is the preferred order).
所望される場合、増殖刺激／支持はまた、典型的には該細胞を抗ＣＤ１６抗体と接触させるのと同時に、細胞を抗ＣＤ３抗体と接触させることを含んでもよい。上記の通り、抗ＣＤ３抗体の濃度は、典型的にはＮＫ細胞の活性化に対する当該技術分野で既知の場合に従うことになる。したがって、抗ＣＤ３抗体に適した濃度は、約０．０１～１０．０ｎｇ／ｍｌの間、より典型的には約０．０１～０．１ｎｇ／ｍｌの間、又は約０．１～０．５ｎｇ／ｍｌの間、又は約０．３～１．０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１．０～５．０ｎｇ／ｍｌの間となる。同様に、抗ＣＤ３抗体への曝露の持続時間に関しては、最も典型的には単核球が単離され、第１（及び／第２、及び／又は第３）の期間、活性化培地と接触されるとき、単核球の混合物が専ら単回、２回、又は３回用量の抗ＣＤ３抗体に曝露されると一般に考えられる。当業者は、ＮＫ細胞活性化を達成するための適切なスケジュール及び用量を容易に理解できるであろう。 If desired, growth stimulation/support may also include contacting the cells with an anti-CD3 antibody, typically at the same time as contacting the cells with an anti-CD16 antibody. As noted above, the concentration of anti-CD3 antibody will typically follow what is known in the art for NK cell activation. Suitable concentrations for anti-CD3 antibodies are therefore between about 0.01 and 10.0 ng/ml, more typically between about 0.01 and 0.1 ng/ml, or between about 0.1 and 0.1 ng/ml. between 5 ng/ml, or between about 0.3-1.0 ng/ml, or between about 1.0-5.0 ng/ml. Similarly, with respect to the duration of exposure to anti-CD3 antibodies, most typically mononuclear cells are isolated and contacted with activation medium for a first (and/or second and/or third) period of time. When administered, it is generally believed that the mixture of mononuclear cells is exclusively exposed to single, two, or three doses of anti-CD3 antibody. Those of skill in the art will readily appreciate appropriate schedules and dosages to achieve NK cell activation.
Ｎ－８０３に関しては、Ｎ－８０３（ヒト配列を有するＩＬ－１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ－１５ＲαＳｕ／ＩｇＧ１ Ｆｃ複合体；米国特許出願公開第２０１９／００２３７６６号明細書を参照、ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏから市販）が活性化及び供給培地中の薬剤として好ましいと考えられる。しかし、ＩＬ－１５活性を有する様々な代替的薬剤もまた、本明細書での使用に適すると思われる。これに関連し、またいかなる理論又は仮説によっても拘束されることを望んでいないが、発明者は、Ｎ－８０３が連続的シグナル伝達のおかげでＮＫ細胞の成長及び拡大を可能にすると考えている。それに対し、単離されたサイトカインとしてのＩＬ－１５は、非常に短い寿命を有し、シグナル伝達活性は、典型的には非常に短期である。ここで単離されたサイトカインとしてのＩＬ－１５が成長培地に添加される場合、シグナル伝達は間欠的にパルス化されることになる。それに対し、Ｎ－８０３が提供される場合、ＩＬ－１５の安定性が劇的に延長され、シグナル伝達は連続的とみなされる。さらに、Ｎ－８０３が生理学的状況（即ちＩＬ－１５ Ｒ－α鎖）及びスーパーアゴニストとして作用するＮ７２Ｄ形態ももたらすことは理解されるべきである。したがって、任意の安定化したＩＬ－１５化合物についても、明示的に本明細書での使用に適すると思われる。 For N-803, N-803 (IL-15N72D with human sequence: IL-15RαSu/IgG1 Fc complex; see US Patent Application Publication No. 2019/0023766, commercially available from ImmunityBio) is activated and fed It is considered preferable as a drug in the culture medium. However, a variety of alternative agents with IL-15 activity are also believed to be suitable for use herein. In this regard, and without wishing to be bound by any theory or hypothesis, the inventors believe that N-803 enables NK cell growth and expansion by virtue of continuous signaling. . In contrast, IL-15 as an isolated cytokine has a very short life span and signaling activity is typically very short term. When IL-15, as a cytokine isolated here, is added to the growth medium, signaling becomes intermittently pulsed. In contrast, when N-803 is provided, the stability of IL-15 is dramatically prolonged and signaling is considered continuous. Furthermore, it should be understood that N-803 also provides a physiological context (ie IL-15 R-α chain) and the N72D form acts as a superagonist. Accordingly, any stabilized IL-15 compound is expressly deemed suitable for use herein.
例えば、ＩＬ－１５シグナル伝達をもたらすすべての化合物及び複合体は、単離された／組換え及び精製されたＩＬ－１５単独よりも長い血清半減期を有する限り、本明細書での使用に適すると思われるに。さらに、安定化したＩＬ－１５化合物がＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒαにおけるヒト配列の少なくとも一部を含むことは一般に好ましい。例えば、好適な化合物は、Ｐ２２３３９（ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒα鎖のＳｕｓｈｉドメインとの複合体であって、その半減期を増強するため、ＩＬ－１５／Ｓｕｓｈｉドメイン複合体をＩｇＧ１ Ｆｃと連結するジスルフィド結合を有するもの；Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８：７６７５を参照）、及びＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃヘテロ二量体であるＸｍＡｂ２４３０６を含む（例えば、国際公開第２０１８／０７１９１９号パンフレットを参照）。 For example, all compounds and complexes that effect IL-15 signaling are suitable for use herein so long as they have a longer serum half-life than isolated/recombinant and purified IL-15 alone. It seems. Furthermore, it is generally preferred that the stabilized IL-15 compounds comprise at least part of the human sequences in IL-15 and/or IL-15Rα. For example, a suitable compound is P22339 (a complex of IL-15 and the Sushi domain of the IL-15Rα chain that links the IL-15/Sushi domain complex with IgG1 Fc to enhance its half-life). Nature, Scientific Reports (2018) 8:7675) and the IL-15/IL-15Rα-Fc heterodimer XmAb24306 (e.g. WO2018/071919). ).
さらに詳細に検討される実施形態では、単核球の混合物は、生体液からの単離後、ＮＫ細胞を活性化するため、抗ＣＤ１６（及び任意選択的には抗ＣＤ３）抗体及びＮ－８０３を含有する培地と一緒に、細胞培養容器に入れられる。最も好ましくは、容器は、細胞の形状、染色、及び／又は成長が顕微鏡又は他の光学機器により観察可能であるように光に対して透明な少なくとも１つの壁（又はその一部）を有する細胞培養フラスコである。したがって、該細胞がバイオリアクター内で継続的又は周期的に監視可能であり、且つそのようにして得られた測定値（例えば、細胞サイズ、細胞数、細胞分布など）が、バイオリアクターに論理的に共役された制御ユニットにおいて自動化された供給スケジュールを誘発又は変更するために使用可能であることは注目されるべきである。最も典型的には、また図２に示される通り、新しい培地へのＮ－８０３の供給は、好ましくは各供給がＮ－８０３を含むことで連続的なシグナル伝達を維持することになる場合、所定のスケジュールを用いて、典型的には３日ごとに実施され得る。下記例における比体積がＮＫ細胞を細胞成長に一致する細胞密度まで拡大するのに適する一方で、該体積が特定の成長パターンに順応するように調節されてもよいことは理解されるべきである。それを達成するため、供給が連続的であってもよいこと、又は所定の体積が容器内で観察される成長動力学に応答して変更されてもよいことも理解されるべきである。 In embodiments discussed in further detail, the mixture of mononuclear cells, after isolation from the biological fluid, is treated with anti-CD16 (and optionally anti-CD3) antibody and N-803 to activate NK cells. is placed in a cell culture vessel along with medium containing Most preferably, the container has at least one wall (or part thereof) that is transparent to light so that the shape, staining, and/or growth of the cells can be observed with a microscope or other optical instrument. A culture flask. Thus, the cells can be continuously or periodically monitored within the bioreactor, and the measurements so obtained (e.g., cell size, cell number, cell distribution, etc.) are logical for the bioreactor. It should be noted that it can be used to trigger or alter automated delivery schedules in a control unit coupled to the . Most typically, and as shown in FIG. 2, the feed of N-803 to fresh medium is preferably where each feed contains N-803 to maintain continuous signaling. Using a predetermined schedule, it can typically be performed every 3 days. While the specific volumes in the examples below are suitable for expanding NK cells to cell densities consistent with cell growth, it should be understood that the volumes may be adjusted to accommodate particular growth patterns. . It should also be understood that to achieve that, the supply may be continuous or the predetermined volume may be varied in response to growth kinetics observed within the container.
ほとんどの場合、培養終了時のＮＫ細胞の収率は、典型的には、すべての生細胞の少なくとも８０％、又は少なくとも８２％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９４％となり、その残りはＮＫＴ細胞、ＤＮ Ｔ細胞、及びＴ細胞である。例えば、残存するＮＫＴ細胞は、典型的には、すべての生細胞の１０％以下、又は８％以下、又は７％以下、又は６％以下となり、残りのＴ細胞は、典型的には、すべての生細胞の５％以下、又は４％以下、又は３％以下、又は２％以下となり、且つ残りのＤＮ Ｔ細胞は、典型的には、すべての生細胞の３％以下、又は２％以下、又は１．５％以下、又は１％以下となる。 In most cases, the yield of NK cells at the end of culture is typically at least 80%, or at least 82%, or at least 85%, or at least 88%, or at least 90% of all viable cells, or At least 92%, or at least 94%, with the remainder being NKT cells, DN T cells, and T cells. For example, residual NKT cells typically make up 10% or less, or 8% or less, or 7% or less, or 6% or less of all viable cells, and the remaining T cells typically make up all viable cells of 5% or less, or 4% or less, or 3% or less, or 2% or less, and the remaining DN T cells are typically 3% or less, or 2% or less of all viable cells , or 1.5% or less, or 1% or less.
したがって、異なる視点から眺めると、本明細書で検討されるシステム及び方法が、ＮＫ細胞を著しく高く拡大する能力があり、且つ典型的な拡大が、単核球の混合物中に最初に存在するＮＫ細胞の数に対して、少なくとも８０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも１２０倍、又は少なくとも１３０倍、又は少なくとも１４０倍であることは理解されるべきである。かかる拡大は、活性化及び培養の非常に単純な様式（ワンポットプロセス）の観点から特に注目すべきである。確かに、一旦単核球の混合物が細胞培養容器に入れられると、全体プロセスは、同じ容器内で連続し得、専ら培地の添加により持続的であり得る。したがって、複合体の処理及び高価な試薬は全体的に回避され、汚染におけるリスクは有意に低下する。 Viewed from a different perspective, therefore, the systems and methods discussed herein are capable of expanding NK cells to a significantly higher degree, and typical expansion occurs in NK cells initially present in a mixture of mononuclear cells. It should be understood that at least 80 times, or at least 100 times, or at least 120 times, or at least 130 times, or at least 140 times the number of cells. Such expansion is particularly noteworthy in view of the very simple mode of activation and cultivation (one-pot process). Indeed, once the mixture of mononuclear cells is placed in the cell culture vessel, the whole process can be continued in the same vessel and sustained exclusively by the addition of medium. Thus, complex handling and expensive reagents are totally avoided and the risk of contamination is significantly reduced.
既に上で認められた通り、ＮＫ細胞は、約０．１～１．０×１０９個の細胞、又は約０．３～３．０×１０９個の細胞、又は約０．５～５．０×１０９個の細胞、又は約０．７～７．０×１０９個の細胞、又は約１～１０×１０９個の細胞、又はさらにそれ以上の全細胞数まで拡大され得る。拡大されたＮＫ細胞の正確な数は、典型的には、特に、ＮＫ細胞における特定の目的、培養条件、及び細胞の開始数に依存することになる。細胞が所望される量に達すると、サイトカイン刺激が拡大培地中で、典型的には刺激性サイトカイン組成物を含有する新しい培地を添加することにより実施されてもよい。 As already noted above, NK cells are about 0.1-1.0×10 9 cells, or about 0.3-3.0×10 9 cells, or about 0.5-5 0×10 9 cells, or about 0.7-7.0×10 9 cells, or about 1-10×10 9 cells, or even more. The exact number of expanded NK cells will typically depend, among other things, on the specific purpose of the NK cells, the culture conditions, and the starting number of cells. When the cells reach the desired amount, cytokine stimulation may be performed in expansion medium, typically by adding new medium containing a stimulatory cytokine composition.
ほとんどの場合、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１などの１以上の活性化サイトカインと、より少ない程度であるが、ＩＬ－４及びＩＬ－７も含むことになる。当然ながら、また以下により詳細に検討される通り、好適なサイトカインはまた、上記サイトカインの誘導体であってもよく、特に好ましい誘導体は、融合複合体を含む。さらに、サイトカインの１以上がまた、適切な組換え核酸のトランスフェクション後、拡大されたＮＫ細胞において発現されてもよいこと（例えば、プラスミド又はウイルス発現ベクターからの一過性発現）は理解されるべきである。 In most cases, the stimulatory cytokine composition will comprise one or more activating cytokines such as IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 and, to a lesser extent, IL-4 and IL-7. will also include Of course, and as discussed in more detail below, suitable cytokines may also be derivatives of the above cytokines, particularly preferred derivatives including fusion complexes. Furthermore, it is understood that one or more of the cytokines may also be expressed in expanded NK cells after transfection of appropriate recombinant nucleic acids (e.g., transient expression from plasmid or viral expression vectors). should.
例えばいくつかの実施形態では、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含むことになり、特に好ましい融合タンパク質複合体は、国際公開第２０１８／１６５２０８号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）に記載されている。かかる場合、融合タンパク質複合体は、３つのサイトカイン機能（ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８）をヒトＩｇＧのＦｃ部分へのそれらの共役を介した安定化形態で提供することは理解されるべきである。さらに、いかなる理論又は仮説によっても拘束されることを望んでいないが、融合タンパク質複合体のＦｃ部分は、さらなる刺激性シグナルを、おそらくは拡大されたＮＫ細胞上でのＣＤ１６との相互作用を通じて提供することがある。しかし、Ｎ－８０８に基づく他の融合タンパク質複合体についても本明細書で明示的に検討される。例えば、好適な融合タンパク質複合体は、標的化ｓｃＦｖ部分、又はＩＬ－１２及びＩＬ－１８以外の（又はそれらに加えての）サイトカイン部分を含んでもよい。当然ながら、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体が多くの場合に好ましい一方で、代替的なＴｘＭ融合タンパク質複合体も好適とみなされ、特に検討された融合複合体が、国際公開第２０１８／１６５２０８号パンフレットに記載のようなＩＬ１５／ＩＬ－１５Ｒα部分、並びにＩＬ－７、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１からなる群から選択される少なくとも１つの追加的なサイトカインを含むことになることは注目されるべきである。それ故、他の好適な選択肢の中で、検討されたＴｘＭ融合複合体は、ＩＬ－１８／ＩＬ－７ ＴｘＭ及び／又はＩＬ－１８／ＩＬ－２１ ＴｘＭを含む。 For example, in some embodiments, the stimulatory cytokine composition will comprise an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex, a particularly preferred fusion protein complex being WO2018/165208 (incorporated herein by reference). In such cases, it is understood that the fusion protein complex provides three cytokine functions (IL-12, IL-15, and IL-18) in a stabilized form via their conjugation to the Fc portion of human IgG. It should be. Furthermore, without wishing to be bound by any theory or hypothesis, the Fc portion of the fusion protein complex provides an additional stimulatory signal, presumably through interaction with CD16 on expanded NK cells. Sometimes. However, other fusion protein conjugates based on N-808 are also expressly contemplated herein. For example, a suitable fusion protein complex may include a targeting scFv portion, or a cytokine portion other than (or in addition to) IL-12 and IL-18. Of course, while IL-18/IL-12-TxM fusion protein complexes are often preferred, alternative TxM fusion protein complexes are also considered suitable, and specifically contemplated fusion complexes have been published internationally. IL15/IL-15Rα portion as described in 2018/165208 and at least one additional cytokine selected from the group consisting of IL-7, IL-18 and IL-21 It should be noted that Therefore, among other preferred options, the TxM fusion complexes considered include IL-18/IL-7 TxM and/or IL-18/IL-21 TxM.
したがって、それ以外の例では、刺激性サイトカイン組成物はまた、ＩＬ－１５の誘導体を含んでもよく、特に好ましい誘導体は、Ｎ－８０３に基づくものである。かかる誘導体は、有利には、ＩＬ－１５Ｒα鎖の存在に起因し、本質的にＩＬ－１５と比べて増強されたシグナル伝達効果を有することになり、代表的な好適な誘導体は、国際公開第２０１６／００４０６０号パンフレット及び国際公開第２０１８／０７５９８９号パンフレットに記載されている。最も典型的には、Ｎ－８０３又は類似の融合タンパク質が使用される場合、追加的なサイトカイン機能が個別のサイトカイン、特にＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、及びＩＬ－１８によって与えられることになる。したがって、本発明の主題のさらに別の態様では、刺激性サイトカイン組成物はまた、個別のサイトカインとして、ＩＬ－７、ＩＬ１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びＩＬ－１８を含んでもよい。したがって、他の選択肢の中で、かかる個別のサイトカインは、単独で又は他の個別のサイトカイン若しくはＴｘＭ構築物と組み合わせて添加されてもよく、それらの各々は、組換えであってもよい（又はさらに該細胞において組換え的に発現されてもよい）。 Thus, in other examples, the stimulatory cytokine composition may also include derivatives of IL-15, particularly preferred derivatives being those based on N-803. Such derivatives will advantageously have an enhanced signaling effect compared to IL-15 due to the presence of the IL-15Rα chain, and representative suitable derivatives are described in International Publication No. It is described in 2016/004060 and WO2018/075989. Most typically, when N-803 or similar fusion proteins are used, additional cytokine functions are provided by individual cytokines, particularly IL-7, IL-12, IL-21, and IL-18. It will be. Thus, in yet another aspect of the present subject matter, the stimulatory cytokine composition may also comprise IL-7, IL12, IL-15, IL-21 and IL-18 as individual cytokines. Thus, among other options, such individual cytokines may be added alone or in combination with other individual cytokines or TxM constructs, each of which may be recombinant (or even may be recombinantly expressed in said cell).
したがって、刺激性サイトカインの１以上がまた、拡大されたＮＫ細胞にトランスフェクトされた組換え核酸から（一過性に）発現され得ることは理解されるべきである。例えば、好適なトランスフェクション方法は、組換え核酸がウイルス発現ベクターである場合のウイルストランスフェクションを含む。他方で、組換え核酸はまた、当該技術分野で周知の方法を用い、エレクトロポレーション又はリポフェクションを用いて、該細胞にトランスフェクトされてもよい。さらに、エレクトロポレーション又はリポフェクションが利用される場合、典型的には核酸がＲＮＡであることが好ましい（しかし、ＤＮＡもまた、本明細書での使用に適すると思われる）。 Therefore, it should be understood that one or more of the stimulatory cytokines can also be (transiently) expressed from recombinant nucleic acid transfected into expanded NK cells. For example, suitable transfection methods include viral transfection when the recombinant nucleic acid is a viral expression vector. Alternatively, recombinant nucleic acids may also be transfected into the cells using electroporation or lipofection, using methods well known in the art. Furthermore, when electroporation or lipofection is utilized, it is typically preferred that the nucleic acid is RNA (although DNA is also considered suitable for use herein).
特定タイプの刺激性サイトカイン組成物と無関係に、１以上のサイトカインが培地中にＮＫ細胞のメモリー様表現型を作製するのに有効な濃度で存在することが一般に検討される。したがって、好適な総サイトカイン濃度は、０．１ｎＭ～１．０ｎＭの間、又は０．５ｎＭ～５．０ｎＭの間、又は１．０ｎＭ～１０ｎＭの間、又は１０ｎＭ～５０ｎＭの間、また場合によってはさらに高い値となる。複数のサイトカインが使用される場合、サイトカインが実質的に等モル濃度で存在することが一般に好ましい（＋／－５０％偏差）。他方で、刺激性サイトカイン組成物がＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む場合、該複合体は、０．５ｎＭ～５．０ｎＭの間、又は１．０ｎＭ～１０ｎＭの間、又は１０ｎＭ～５０ｎＭの間、又はさらに高い値で存在してもよい。 Regardless of the particular type of stimulatory cytokine composition, it is generally contemplated that one or more cytokines will be present in the medium at concentrations effective to create a memory-like phenotype of NK cells. Thus, suitable total cytokine concentrations are between 0.1 nM and 1.0 nM, or between 0.5 nM and 5.0 nM, or between 1.0 nM and 10 nM, or between 10 nM and 50 nM, or optionally an even higher value. When multiple cytokines are used, it is generally preferred that the cytokines are present at substantially equimolar concentrations (+/−50% deviation). On the other hand, when the stimulatory cytokine composition comprises an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex, the complex is between 0.5 nM and 5.0 nM, or between 1.0 nM and 10 nM, or between 10 nM and 50 nM, or even higher.
刺激性サイトカイン組成物のタイミングに関しては、ＮＫ細胞が、刺激性サイトカイン組成物への曝露前に所望される（典型的には最終）量まで最初に拡大されることが一般に好ましい。しかし、代替的態様では、刺激性サイトカイン組成物は、最終の所望される細胞量の約７０％から、又は最終の所望される細胞量の約８０％から、又は最終の所望される細胞量の約９０％から、拡大しているＮＫ細胞集団に添加され得る。本発明の主題のほとんどの態様では、刺激性組成物への曝露は、約２時間～４８時間の間、又は４時間～８時間の間、又は８時間～１２時間の間、又は１２時間～２４時間の間、また場合によってはさらに長い間、続くことになる。 Regarding the timing of the stimulatory cytokine composition, it is generally preferred that the NK cells are first expanded to the desired (typically final) amount prior to exposure to the stimulatory cytokine composition. However, in alternative embodiments, the stimulatory cytokine composition is from about 70% of the final desired cell mass, or from about 80% of the final desired cell mass, or from about 80% of the final desired cell mass. From about 90% can be added to an expanding NK cell population. In most aspects of the present subject matter, exposure to the irritant composition is between about 2 and 48 hours, or between 4 and 8 hours, or between 8 and 12 hours, or between 12 and 12 hours. It will last for 24 hours, and possibly even longer.
刺激性サイトカイン組成物への曝露は、培地と、典型的には新しい培地又は輸血に適した培地との交換により終結され得る。他方で、そのように作製されたＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、継続可能な次の使用に先立つ静止期間、０～４時間の間、４～１２時間の間、１２～２４時間の間、又は１～４日の間、及びさらに長い期間を経ることが可能であることも検討される。さらに容易に理解されるであろうが、ＣＩＭＬ ＮＫはまた、細胞傷害性をさらに増強するため、再刺激を受けてもよく、再刺激は、典型的には、ＩＬ２又はＩＬ－１５などの少なくとも１つの刺激性サイトカインを使用して実施されることになる。最も好ましくは、以下により詳細に示される通り、再刺激は、Ｎ－８０３が使用された場合、（本質的にＩＬ－１５と比べて）意外にも高い細胞傷害性をもたらした。さらに、再刺激が典型的には当該技術分野で周知の標準プロトコルに従うことになることは注目されるべきである Exposure to the stimulatory cytokine composition may be terminated by replacement of the medium, typically with fresh medium or medium suitable for transfusion. On the other hand, the CIML NK cells so generated are kept in a resting period prior to subsequent use that can be continued, between 0 and 4 hours, between 4 and 12 hours, between 12 and 24 hours, or between 1 and 4 hours. It is also contemplated that it may take between days and even longer periods. As will also be readily appreciated, CIML NK may also be restimulated, typically with at least one such as IL2 or IL-15, to further enhance cytotoxicity. It will be performed using one stimulatory cytokine. Most preferably, as shown in more detail below, restimulation resulted in surprisingly high cytotoxicity (essentially compared to IL-15) when N-803 was used. Furthermore, it should be noted that restimulation will typically follow standard protocols well known in the art.
ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の最終処理と無関係に、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞がそれを必要とする個体への輸血に使用されることになり、最も典型的には個体ががんと診断されることになると考えられる。さらに容易に理解されるであろうが、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、個体が、癌ワクチン（例えば、組換え（アデノ）ウイルスワクチン、組換え酵母ワクチン、組換え細菌ワクチン）、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、Ｎ－８０３又はＴｘＭに基づく治療薬、及び／又は標的化インターロイキン（例えば、ＮＨＳ－ＩＬ１２）を受けるような治療計画を形成してもよい。 Regardless of the final treatment of the CIML NK cells, it is believed that the CIML NK cells will be used to transfuse an individual in need thereof, most typically resulting in an individual being diagnosed with cancer. As will also be readily appreciated, CIML NK cells are used by individuals to administer cancer vaccines (e.g., recombinant (adeno)viral vaccines, recombinant yeast vaccines, recombinant bacterial vaccines), chemotherapeutic agents, checkpoint inhibition. A treatment regimen may be formulated to receive agents, N-803 or TxM-based therapeutics, and/or targeted interleukins (eg, NHS-IL12).
本発明の主題に限定するものでないが、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、継続的監視、ＣＯ２及びＯ２レベルの継続的管理、及び細胞密度（例えばコンフルエンス）を検出するための継続的監視を可能にする培養環境下で拡大及び／又は活性化されることがさらに検討される。かかる環境における他のオプションの中で特に好ましい環境は、例えば国際公開第２０１５／１６５７００号パンフレットに記載の通り、自動化された細胞培養及び収集装置である。かかる「ＧＭＢ－ｉｎ－ａ－ｂｏｘ」システムは、有利には、供給スケジュール、ガス調節に及ぶ制御を可能にし、細胞密度、成長（動力学）及び細胞ヘルスのリアルタイム検出を可能にするとともに、操作要求事項の有意な減少により、汚染の可能性を劇的に低減する。 Without limiting the subject matter of the present invention, CIML NK cells allow for continuous monitoring, continuous control of CO2 and O2 levels, and continuous monitoring to detect cell density (e.g., confluence). It is further contemplated to be expanded and/or activated in a culture environment. Among other options in such environments, a particularly preferred environment is an automated cell culture and collection device, for example as described in WO2015/165700. Such a "GMB-in-a-box" system advantageously allows control over feeding schedules, gas regulation, real-time detection of cell density, growth (kinetics) and cell health, as well as operational The significant reduction in requirements dramatically reduces the potential for contamination.
さらに検討された態様では、本明細書で提示されるシステム及び方法により、有利には、特にＮＫ細胞が末梢血から作製されるとき、ＣＤ５６ｄｉｍ及びＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の産生も可能になることは注目されるべきである。次に、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞は、さらなる培養条件に応じて、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞に分化することがある。次に、かかる異なるＮＫ細胞集団は、異なる治療選択肢において、それらの異なる成熟及び細胞傷害性特性が理由で利用され得る。加えて、組成物、システム及び方法がまた、ＮＫＴ細胞を適切な刺激及び培養に応じて作製するのに適することは理解されるべきである。 In further contemplated aspects, the systems and methods presented herein advantageously also enable the production of CD56 dim and CD56 bright NK cells, particularly when the NK cells are generated from peripheral blood. It should be noted. CD56 bright NK cells may then differentiate into CD56 dim cells depending on further culture conditions. Such different NK cell populations can then be utilized in different therapeutic options because of their different maturational and cytotoxic properties. Additionally, it should be understood that the compositions, systems and methods are also suitable for generating NKT cells upon appropriate stimulation and culture.
上記を考慮し、以下により詳細に提示される通り、１つの例示的方法は、単一のフィコール遠心分離ステップによりＣＢＭＣ又はＰＢＭＣを単離することと、その後の該細胞と、約０．４ｎＭのＮ－８０３及び約０．１ｍｃｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６抗体（例えば、クローンＢ７３．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販）、及び任意選択的には１０％ヒトＡＢ血清を有するＮＫ ＭＡＣＳ培地中の約０．５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体とのインキュベーションを伴った。典型的には、１００万個の細胞／ｍｌで１００～１５０ｍＬ（典型的には１３５ｍＬ）のＣＢＭＣを、上記試薬を有する出発物質として使用した。培地は、最終濃度０．４ｎＭに対応するＮ－８０３の濃度での既存の体積に対し、１：２及び１：１０のレジメンで週２回（３～５日間隔）のＮ－８０３による希釈用に使用した。拡大培養は、典型的には、拡大されたＮＫ細胞が全細胞の約９０％～９９％の間（例えば９８％）を形成するときに終結される。終結時、サイトカイン誘導は、以下により詳細に説明するように実施することができる。 In view of the above, and presented in more detail below, one exemplary method is to isolate CBMCs or PBMCs by a single Ficoll centrifugation step, followed by the cells and about 0.4 nM N-803 and about 0.1 mcg/ml anti-CD16 antibody (eg, clone B73.1, commercially available from BD Biosciences), and optionally about 0.5 ng in NK MACS medium with 10% human AB serum /ml of anti-CD3 antibody. Typically, 100-150 mL (typically 135 mL) of CBMC at 1 million cells/ml was used as starting material with the above reagents. Medium is diluted with N-803 twice weekly (3-5 day intervals) at regimens of 1:2 and 1:10 to pre-existing volume at a concentration of N-803 corresponding to a final concentration of 0.4 nM. used for Expansion cultures are typically terminated when expanded NK cells form between about 90% and 99% (eg, 98%) of the total cells. Upon termination, cytokine induction can be performed as described in more detail below.
ＭＮＣを臍帯血又は末梢血から新規に単離した。それを完全ＮＫＭＡＣＳ培地（ＮＫＭＡＣＳ＋添加物＋１０％ｈｕ－ＡＢ－血清）で２回洗浄した。ＭＮＣを、ＧＭＰボックス（体積５００ｍＬ）内、１×１０６個の細胞／ｍＬの密度を有する１５０ｍＬの培地に懸濁した。１５０ｍＬの細胞懸濁液に、抗ＣＤ１６抗体（１ｍｃｇ／ｍＬ）及びＮ－８０３（０．４ｎＭ）を添加した。ＧＭＰボックスでイメージングを開始し、予備プログラム化ステップに従い、細胞を増殖させた。ＧＭＰボックス内の細胞に、１０×サイトカイン培地又は２×サイトカイン培地を交互様式で添加した。ＮＫの濃縮（ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＣＤ１６発現における表現型）及び細胞ヘルス（細胞数、生存度、及び細胞密度）を定期的に監視し、プロットした。 MNC were de novo isolated from cord blood or peripheral blood. It was washed twice with complete NKMACS medium (NKMACS+additives+10% hu-AB-serum). MNC were suspended in 150 mL medium with a density of 1×10 6 cells/mL in a GMP box (500 mL volume). Anti-CD16 antibody (1 mcg/mL) and N-803 (0.4 nM) were added to 150 mL of cell suspension. Imaging was started in the GMP box and cells were grown according to the pre-programming steps. 10× cytokine medium or 2× cytokine medium was added in alternating fashion to the cells in the GMP box. NK enrichment (phenotype in CD3, CD56, and CD16 expression) and cell health (cell number, viability, and cell density) were monitored regularly and plotted.
拡大されたＮＫ細胞からＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するためのサイトカイン誘導は、全細胞の９８％がＮＫ細胞であるポイントに達する際に開始した。そのため、５００ｍＬ及び２．３×１０６個の細胞／ｍＬの密度を有するボックスを２つの別々のボックスに等しく分割した。したがって、５００ｍＬの細胞懸濁液が２つの各ボックスにおいて２５０ｍＬになり、細胞を新しい培地で１：１に希釈した。その後、ＩＬ１８／１２ ＴｘＭを最終濃度１０ｎＭに添加し（対照及び比較の場合、Ｎ－８０３は０．０７ｎＭの最終濃度で使用し）、該細胞をＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体とともに１６時間インキュベートし、そのようにしてＣＩＭＬ ＮＫ細胞を得た。さらに試験するため、該細胞を洗浄し、次に発現分析及び細胞傷害性アッセイを実施した。 Cytokine induction to generate CIML NK cells from expanded NK cells started when reaching a point where 98% of all cells were NK cells. Therefore, a box with a density of 500 mL and 2.3×10 6 cells/mL was divided equally into two separate boxes. Therefore, 500 mL of cell suspension was made up to 250 mL in each of the two boxes and the cells were diluted 1:1 with fresh medium. IL18/12 TxM was then added to a final concentration of 10 nM (for controls and comparisons, N-803 was used at a final concentration of 0.07 nM) and the cells were transfected with IL-18/IL-12-TxM fusion protein complexes. Incubated with the body for 16 hours, thus obtaining CIML NK cells. For further testing, the cells were washed and then expression analysis and cytotoxicity assays were performed.
材料：臍帯血及び末梢血からのＭＮＣ、抗ＣＤ１６抗体、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ；ＮＫ添加物を有するＮＫ ＭＡＣＳ培地、表現型を決定するための染色抗体（ａＣＤ３、ａＣＤ１６、ａＣＤ５６、ａＮＫｐ３０、ａＮＫｐ４４、ａＮＫｐ４６、ａＮＫＧ２Ａ、ａＮＫＧ２Ｄ、ａＴＩＧＩＴ、ａＣＤ３４、ａＴＲＡＩＬ、ａＣＤ５７、ａＣＸＣＲ３、及びａＣＣＲ５）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ヒトＡＢ血清、Ａｃｃｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ；Ｎ－８０３、ボックスキット内のＧＭＰ、Ｎａｎｔｂｉｏ Ｉｎｃ．Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ．。ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体はＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏから入手した。 Materials: MNC from cord and peripheral blood, anti-CD16 antibody, BD bioscience San Diego CA; NK MACS medium with NK supplements, staining antibodies to determine phenotype (aCD3, aCD16, aCD56, aNKp30, aNKp44, aNKp46, aNKG2A, aNKG2D, aTIGIT, aCD34, aTRAIL, aCD57, aCXCR3, and aCCR5), Miltenyi Biotec San Diego, CA; human AB serum, Access Biologicals, San Diego CA; . Culver City CA. . IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex was obtained from ImmunityBio.
そのようにして作製したＣＩＭＬ ＮＫ細胞を細胞傷害性について試験し、表面マーカー発現について選択した。より詳細には、１つの実験セットにおいて、臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を、典型的にはＮＫ細胞傷害性に対して抵抗性を示すメルケル細胞がん細胞（ここではＭＳ－１細胞）に対して試験した。特に、図３中で明らかであるように、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、拡大及びＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への制御曝露後、有意な細胞傷害性を有した一方で、臍帯血細胞をＮ－８０３単独に曝露したときであっても、いくらかの細胞傷害性が認められた。図４は、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体及びＮ－８０３に曝露された臍帯血由来細胞内での表面マーカー発現についての例示的結果を示す。明らかであるように、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、ＣＤ１６の低下した発現を有したが、ＣＤ２５、ＤＮＡＭ１の実質的に増加した発現、及びＩＦＮ－γの強力な分泌を有した。 CIML NK cells so generated were tested for cytotoxicity and selected for surface marker expression. More specifically, in one set of experiments, cord blood-derived CIML NK cells were typically tested against Merkel cell carcinoma cells (here MS-1 cells) that are resistant to NK cytotoxicity. tested. In particular, as evident in FIG. 3, CIML NK cells had significant cytotoxicity after expansion and controlled exposure to the IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex, whereas umbilical cord Some cytotoxicity was observed even when blood cells were exposed to N-803 alone. FIG. 4 shows exemplary results for surface marker expression in cord blood-derived cells exposed to IL-18/IL-12-TxM fusion protein complexes and N-803. As can be seen, CIML NK cells had decreased expression of CD16, but substantially increased expression of CD25, DNAM1, and potent secretion of IFN-γ.
図５で明らかであるように、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を末梢血から誘導したとき、類似する結果が得られた。ここで、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、ＭＳ－１細胞株に対する実質的な細胞傷害性を有し、末梢血からのＮ－８０３対照細胞もいくらかの細胞傷害性を示した。同様に、図６から解釈できるように、末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞における表面マーカーがＣＤ１６及びＴＩＧＩＴの低下した発現を示した一方で、ＣＤ２５、ＤＮＡＭ１、及びＩＦＮ－γ分泌における有意な増加を有した。特に、標準の培養プロトコルを用いてＮＫ細胞を培養したとき、又は新しいＮＫ細胞を使用した場合、ＭＳ－１細胞に対する有意な細胞傷害性は、メモリー様表現型を誘発するため、該細胞をＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８で誘導した場合であっても認められなかった。 Similar results were obtained when CIML NK cells were derived from peripheral blood, as evident in FIG. Here, CIML NK cells had substantial cytotoxicity against the MS-1 cell line, and N-803 control cells from peripheral blood also showed some cytotoxicity. Similarly, as can be interpreted from FIG. 6, surface markers on peripheral blood-derived CIML NK cells showed decreased expression of CD16 and TIGIT, while having significant increases in CD25, DNAM1, and IFN-γ secretion. . In particular, when NK cells were cultured using standard culturing protocols, or when fresh NK cells were used, significant cytotoxicity against MS-1 cells induces a memory-like phenotype and thus induces IL It was absent even when induced with -12, IL-15, and IL-18.
臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を活性化クラスター表現型についても試験し、図７は、Ｎ－８０３との制御曝露をＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への曝露と比較した例示的結果を示す。画像から明らかであるように、Ｎ－８０３への曝露後の培養形態に対するＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への一晩曝露後の培養形態において著しい差異が生じる。これらのＣＩＭＬ ＮＫ細胞の選択された表面マーカーに注目すると、図８に示す通り、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への曝露により、ＣＤ２５（公知の活性化関連受容体）の有意な増加がもたらされることがやはり明白であった。明らかに、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８機能によるサイトカイン刺激により、典型的には通常の新しいＮＫ細胞で認められない（少なくともその程度）、ＣＤ２５の提示が実質的に増強された。 Cord blood-derived CIML NK cells were also tested for an activated cluster phenotype and FIG. Show the results. As is evident from the images, there is a striking difference in culture morphology after overnight exposure to the IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex versus exposure to N-803. Focusing on selected surface markers of these CIML NK cells, as shown in FIG. A significant increase was again evident. Clearly, cytokine stimulation by IL-12, IL-15, IL-18 function substantially enhanced CD25 presentation, typically not seen in normal new NK cells (at least to that extent).
活性化受容体におけるかかる増加及び阻害性受容体における減少は、図９に示す通り、Ｋ５６２細胞に対する殺傷アッセイにおいて培養形態を観察するときも容易に明白であった。ここで、臍帯血由来ＣＩＭＬ細胞は、再刺激時、Ｎ－８０３とのインキュベーションと比べて実質的に増強された活性化クラスター形成を示した。 Such an increase in activating receptors and a decrease in inhibitory receptors was also readily apparent when observing culture morphology in a killing assay on K562 cells, as shown in FIG. Here, cord blood-derived CIML cells showed substantially enhanced activated cluster formation upon restimulation compared to incubation with N-803.
さらなる実験では、発明者はまた、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後の各々の結果を示す図１０Ａ、図１０Ｂ、及び図１０Ｃに例示する通り、Ｋ５６２細胞に対する細胞傷害性の時間経過を検討した。最初の２４時間時点から（図１０Ａ）、試験したいずれのＴｘＭ濃度もＮ－８０３対照よりも低いＥＣ５０を有することから、Ｋ５６２細胞に対する増強された殺傷能力の開始を見ることができる。４８時間時点で（図１０Ｂ）、ＴｘＭ処置サンプルによる増強された殺傷が見られるが、Ｎ－８０３対照の場合、それは低めであった。この時点で、Ｋ５６２の殺傷における増強は約３倍である。７２時間時点で（図１０Ｃ）、すべての条件でＫ５６２の殺傷に対する活性を失い始めているが、ＴｘＭ処置細胞は、対照と比べて約３倍の、それらの増強された殺傷を保持する。 In further experiments, the inventors also investigated the time course of cytotoxicity against K562 cells, as illustrated in FIGS. It was investigated. From the first 24 hour time point (FIG. 10A), an onset of enhanced killing potency against K562 cells can be seen as all TxM concentrations tested have lower EC50s than the N-803 control. At 48 hours (FIG. 10B), there is enhanced killing by the TxM-treated samples, whereas it was lower with the N-803 control. At this time point, the enhancement in K562 killing is about 3-fold. At 72 hours (FIG. 10C), all conditions begin to lose K562 killing activity, while TxM-treated cells retain their enhanced killing, approximately 3-fold compared to controls.
図１１は、拡大された臍帯血由来ＮＫ細胞、Ｎ－８０３刺激を伴う拡大された臍帯血由来ＮＫ細胞、及びＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体で刺激される拡大された臍帯血由来ＮＫ細胞における２４時間にわたる直接的比較を提供する。明らかであるように、全細胞における細胞傷害性は容易に明白であり、拡大されたＮＫ細胞は、％最大殺滅にわたりわずかな利点を有するが、ＣＩＭＬ細胞と比べて実質的により高いＥ；Ｔ比を必要とする。図１２は、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体で刺激される拡大された末梢血由来ＮＫ細胞に対するＮ－８０３刺激を伴う拡大された末梢血由来ＮＫ細胞の、選択されたマーカーの発現を示す。図１２から解釈できるように、活性化を意味している、ＴＩＧＩＴ（及びＣＤ１６）の有意な下方制御及びＣＤ２５の有意な上方制御が認められる。ＣＤ１６の下方制御がＡＤＣＣにおける減少を伴うことがあることは注目されるべきである。しかし、ＡＤＣＣにおける潜在的減少よりも、通常であればＮＫ細胞細胞傷害性に対して抵抗性を示す細胞株に対してのより高度な活性化及び細胞傷害性が重要である。図１３に示す通り、末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞で、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体による２４時間刺激後、類似する細胞傷害性結果が見出される。明確には、Ｋ５６２アッセイにおいて、１０ｎＭのＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への曝露により、より十分な細胞死滅がもたらされた。 FIG. 11 shows expanded cord blood-derived NK cells, expanded cord blood-derived NK cells with N-803 stimulation, and expanded cord blood stimulated with an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex. A direct comparison over 24 hours in blood-derived NK cells is provided. As can be seen, cytotoxicity in whole cells was readily apparent, with expanded NK cells having a slight advantage over % maximal killing but substantially higher E;T compared to CIML cells. Requires a ratio. Figure 12. Selected markers of expanded peripheral blood-derived NK cells with N-803 stimulation on expanded peripheral blood-derived NK cells stimulated with an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex. shows the expression of As can be interpreted from Figure 12, there is a significant downregulation of TIGIT (and CD16) and a significant upregulation of CD25, implying activation. It should be noted that downregulation of CD16 can be accompanied by a decrease in ADCC. However, the potential reduction in ADCC outweighs the higher degree of activation and cytotoxicity against cell lines that are normally resistant to NK cell cytotoxicity. As shown in FIG. 13, similar cytotoxicity results are found in peripheral blood-derived CIML NK cells after 24 hours stimulation with IL-18/IL-12-TxM fusion protein complexes. Clearly, exposure to 10 nM IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex resulted in more extensive cell killing in the K562 assay.
末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を試験したが、図１４は、異なる条件を用いての例示的結果を示す。同じ細胞を細胞傷害性アッセイにおいても使用したが、図１５は例示的結果を示す。図１６から解釈できるように、類似する結果が臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞においてもたらされる。特に、Ｎ－８０３によるサイトカイン誘導は、本質的にＩＬ－１５による誘導より優れる。したがって、多重サイトカイン誘導が上に示すように好ましい一方で、Ｎ－８０３による誘導も明示的に検討対象であることは注目されるべきである。 We tested the secretion of IFN-γ in peripheral blood-derived CIML NK cells and Figure 14 shows exemplary results using different conditions. The same cells were also used in the cytotoxicity assay and Figure 15 shows exemplary results. As can be taken from Figure 16, similar results are produced in cord blood-derived CIML NK cells. In particular, cytokine induction by N-803 is substantially superior to that by IL-15. Therefore, it should be noted that while multiple cytokine induction is preferred as indicated above, induction by N-803 is also explicitly contemplated.
本明細書で用いられるとき、医薬組成物又は薬剤を「投与する」という用語は、医薬組成物又は薬剤の直接及び間接投与の双方を指し、ここで医薬組成物又は薬剤の直接投与は、典型的には医療専門家（例えば、医師、看護師など）によって実施され、且つ間接投与は、医薬組成物又は薬剤を（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などを介する）直接投与における医療専門家に対して準備するか又は利用可能にするステップを含む。最も好ましくは、該細胞又はエキソソームは、皮下又は真皮下注射を介して投与される。しかし、他の検討された態様では、投与はまた、静脈内注射であってもよい。代替的に又は追加的に、抗原提示細胞が、患者の細胞から単離又は成長され、患者にインビトロで感染され、次いで輸血されてもよい。したがって、検討されたシステム及び方法は、高度に個別化されたがん治療における完全な創薬システム（例えば、創薬、治療プロトコル、検証など）と考えることができることは理解されるべきである。 As used herein, the term "administering" a pharmaceutical composition or agent refers to both direct and indirect administration of the pharmaceutical composition or agent, where direct administration of the pharmaceutical composition or agent is typically Indirect administration refers to medical practice in directly administering a pharmaceutical composition or agent (eg, via injection, infusion, oral delivery, topical delivery, etc.). Including preparing or making available to experts. Most preferably, the cells or exosomes are administered via subcutaneous or subdermal injection. However, in other contemplated embodiments, administration may also be by intravenous injection. Alternatively or additionally, antigen-presenting cells may be isolated or grown from the patient's cells, infected in vitro into the patient, and then transfused. Therefore, it should be understood that the system and method discussed can be considered a complete drug discovery system (eg, drug discovery, treatment protocol, validation, etc.) in highly individualized cancer therapy.
本明細書中の値の範囲の列挙は、あくまで個別に該範囲内に該当する別々の各値を指すような簡素化方法として役立つことが意図される。本明細書中で別段の指示がない限り、各個別の値は、あたかも本明細書中に個別に列挙されたように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又はそうでなければ文脈上明らかに矛盾がない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書中の特定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例、又は代表的な用語（例えば「など」）の使用は、あくまで本開示の全範囲をより十分に明示することが意図され、別途主張された本発明の範囲に対して限定することがない。本明細書中の用語は、請求項に係る発明の実施にとって必須である、任意の主張されない要素を示すものとして解釈されるべきではない。 Recitation of ranges of values herein is intended only to serve as a shorthand method, referring individually to each separate value falling within the range. Unless otherwise indicated herein, each individual value is incorporated herein as if individually recited herein. All methods described herein can be performed in any suitable order unless otherwise indicated herein or otherwise clearly contradicted by context. Any and all examples, or use of representative terminology (eg, "such as"), provided herein with respect to particular embodiments is intended solely to more fully clarify the full scope of the present disclosure, and may be used only if otherwise claimed. There is no limitation on the scope of the disclosed invention. No language in the specification should be construed as indicating any non-claimed element essential to the practice of the claimed invention.
既に説明された修飾以外の多数のさらなる修飾が、本明細書で開示される概念の全範囲から逸脱することなく可能であることは、当業者にとって明白であることが理解されよう。したがって、開示された主題は、貼付の特許請求の範囲の範囲内を除き、限定されるべきでない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の双方を解釈する場合、全ての用語は、文脈に一致する最も広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非排他的様式での要素、成分、又はステップを指し、参照される要素、成分、又はステップが、明示的に参照されない他の要素、成分、又はステップとともに存在してもよい、又は利用されてもよい、又は組み合わされてもよいことを示すように解釈されるべきである。本明細書の特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ…及びＮからなる群から選択されるものの少なくとも１つを指す場合、本文は、Ａ＋Ｎ又はＢ＋Ｎなどでない、グループから１つの要素のみを必要とするものとして解釈されるべきである。 It will be apparent to those skilled in the art that numerous further modifications beyond those already described are possible without departing from the full scope of the concepts disclosed herein. Accordingly, the disclosed subject matter is not to be limited except within the scope of the attached claims. Moreover, in interpreting both the specification and the claims, all terms should be interpreted in the broadest possible manner consistent with the context. In particular, the terms "comprises" and "comprising" refer to elements, ingredients, or steps in a non-exclusive manner, where the referenced element, ingredient, or step is not explicitly referenced. It should be construed to indicate that it may be present or utilized or combined with other elements, ingredients or steps. When a claim herein refers to at least one selected from the group consisting of A, B, C... and N, the text requires only one member from the group, not A+N or B+N, etc. should be interpreted as
Claims (40)
生体液から単核球の混合物を単離し、且つＮＫ細胞を拡大するため、前記単核球の前記混合物を抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３と接触させるステップと；
前記拡大されたＮＫ細胞を、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む刺激性サイトカイン組成物と接触させ、それにより増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するステップと、
を含む方法。 A method of producing cytokine-induced memory-like (CIML) NK cells with enhanced cytotoxicity, comprising:
isolating a mixture of mononuclear cells from a biological fluid and contacting said mixture of mononuclear cells with an anti-CD16 antibody and N-803 to expand NK cells;
The expanded NK cells were treated with an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex, a mixture of IL-12, N-803, and IL-18, or IL-12, IL-15, and IL-18. thereby producing said CIML NK cells with enhanced cytotoxicity;
method including.
全血又は臍帯血の単核球から拡大された、拡大されたＮＫ細胞を準備するステップと；
前記拡大されたＮＫ細胞を、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む刺激性サイトカイン組成物と接触させ、それにより増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するステップと、
を含む、方法。 A method of activating NK cells to form cytokine-induced memory-like (CIML) NK cells with enhanced cytotoxicity, comprising:
providing expanded NK cells expanded from whole blood or cord blood mononuclear cells;
The expanded NK cells were treated with an IL-18/IL-12-TxM fusion protein complex, a mixture of IL-12, N-803, and IL-18, or IL-12, IL-15, and IL-18. thereby producing said CIML NK cells with enhanced cytotoxicity;
A method, including
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US2019/040889 WO2021006876A1 (en) | 2019-07-08 | 2019-07-08 | Ciml nk cells and methods therefor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022540267A true JP2022540267A (en) | 2022-09-15 |
Family
ID=74114922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021534175A Withdrawn JP2022540267A (en) | 2019-07-08 | 2019-07-08 | CIML NK cells and methods therefor |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3853353A4 (en) |
| JP (1) | JP2022540267A (en) |
| KR (1) | KR20210079381A (en) |
| CN (1) | CN113195706A (en) |
| AU (1) | AU2019456438A1 (en) |
| CA (1) | CA3117134A1 (en) |
| IL (1) | IL283997A (en) |
| SG (1) | SG11202104256XA (en) |
| WO (1) | WO2021006876A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4301846A1 (en) * | 2021-03-03 | 2024-01-10 | ImmunityBio, Inc. | Highly potent m-cenk cells and methods |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4275680B2 (en) * | 2006-04-28 | 2009-06-10 | 裕 照沼 | Culture methods for lymphocyte activity / proliferation |
| KR20230028807A (en) * | 2014-06-30 | 2023-03-02 | 알토 바이오사이언스 코포레이션 | Il-15-based molecules and methods of use thereof |
| CN105219713A (en) * | 2015-11-20 | 2016-01-06 | 崔长友 | For high proliferation power, the High Fragmentation power NK cell of tumour adoptive immunity |
| US10300089B2 (en) * | 2016-11-08 | 2019-05-28 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Methods for high scale therapeutic production of memory NK cells |
| MX2019010172A (en) * | 2017-02-28 | 2019-12-18 | Affimed Gmbh | Combination of an anti-cd16a antibody with a cytokine. |
| CN117986384A (en) * | 2017-03-06 | 2024-05-07 | 艾尔特生物科技公司 | IL-15-based fusions with IL-12 and IL-18 |
-
2019
- 2019-07-08 CN CN201980082326.4A patent/CN113195706A/en active Pending
- 2019-07-08 KR KR1020217018219A patent/KR20210079381A/en not_active Application Discontinuation
- 2019-07-08 AU AU2019456438A patent/AU2019456438A1/en not_active Abandoned
- 2019-07-08 SG SG11202104256XA patent/SG11202104256XA/en unknown
- 2019-07-08 CA CA3117134A patent/CA3117134A1/en not_active Abandoned
- 2019-07-08 JP JP2021534175A patent/JP2022540267A/en not_active Withdrawn
- 2019-07-08 EP EP19936806.9A patent/EP3853353A4/en not_active Withdrawn
- 2019-07-08 WO PCT/US2019/040889 patent/WO2021006876A1/en unknown
-
2021
- 2021-06-14 IL IL283997A patent/IL283997A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3117134A1 (en) | 2021-01-14 |
| IL283997A (en) | 2021-07-29 |
| CN113195706A (en) | 2021-07-30 |
| EP3853353A1 (en) | 2021-07-28 |
| KR20210079381A (en) | 2021-06-29 |
| EP3853353A4 (en) | 2022-05-18 |
| AU2019456438A1 (en) | 2021-05-20 |
| WO2021006876A1 (en) | 2021-01-14 |
| SG11202104256XA (en) | 2021-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7451468B2 (en) | Expansion of non-hematopoietic tissue resident γδ T cells and use of the cells | |
| US10968431B2 (en) | Adoptive transfer of CD8+ T cell clones derived from central memory cells | |
| US11098284B2 (en) | Enhanced generation of cytotoxic T-lymphocytes by IL-21 mediated FOXP3 suppression | |
| TW202039830A (en) | Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy | |
| JP5894538B2 (en) | ICOS critically regulates the proliferation and function of inflammatory human Th17 cells | |
| AU2016238963A1 (en) | Method and compositions for cellular immunotherapy | |
| JP6073417B2 (en) | Spontaneous killing cell proliferation method and composition for spontaneous killing cell proliferation | |
| KR20170084337A (en) | Gammadelta t cell expansion procedure | |
| TW201435087A (en) | Method for manufacturing immunocyte-containing composition, and cancer-treating composition | |
| US20210361711A1 (en) | CIML NK cells and Methods Therefor | |
| JP2022540267A (en) | CIML NK cells and methods therefor | |
| WO2022228539A1 (en) | Preparation method for car-cik cells having high nkt cell proportion, and application thereof | |
| KR101232128B1 (en) | Method for Preparing Mature Dedritic Cell with Excellent Immune Activity | |
| US20210009954A1 (en) | Mononuclear Cell Derived NK Cells | |
| US20210087530A1 (en) | Compositions and methods for culturing and expanding cells | |
| JP2023504075A (en) | Method for obtaining CAR-NK cells | |
| JP7213976B2 (en) | NK cells derived from mononuclear cells | |
| US20240117309A1 (en) | Methods for expanding t cell populations | |
| KR20230137392A (en) | Highly Potent M-CENK Cells and Methods | |
| CN117120596A (en) | High-efficiency M-CENK cells and methods | |
| Kohgo et al. | Generation of lymphokine activated killer cells in a new high density dialyzing culture apparatus | |
| Riley | Improved Expansion and In Vivo Function of Patient T Cells by a Serum-free Medium |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211021 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211021 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20220616 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220616 |