JP2022540090A - 個人のhlaパターンの決定、予後因子としての使用、標的遺伝子、及び治療薬 - Google Patents
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Abstract
本開示は、がん患者及び/又は自己免疫疾患に関連する障害に罹患している患者の身体試料(組織又は血液試料)における個人のHLAパターン(成人及び/又は胚)を決定するインビトロ方法、並びにテーラーメイド治療のために上記患者を層別化する方法に関する。本開示は更に、対応するキット及びその使用、並びにがん、自己免疫疾患、感染症、及び妊娠に関連する状態などの新生物疾患の予後バイオマーカーとしての核酸分子に関連する。本開示はまた、治療薬及び治療薬を製造する方法にも関する。【選択図】図7
Description
本発明は、がん患者及び/又は自己免疫疾患に関連する障害に罹患している患者の身体試料、特に組織又は血液試料における個人のHLAパターン(成人及び/又は胚)を決定するインビトロ方法、及びテーラーメイド治療のために上記患者を層別化する方法に関する。
化学的又は生物学的腫瘍治療は、一人の患者の個々の腫瘍細胞種に焦点を絞っていないが、それらが悪性であるかどうかに関係なく、かつ、個々の患者に関係なく、一般にすべての急速に***する細胞を検出する。
最終的な結果として、この種の治療はしばしば効果がなく、及び/又は重篤な副作用を伴う。より標的化され、高度に個別化された治療が非常に有用である。
生物全体のよく調節された存在の基礎は、細胞間のコミュニケーション又は細胞の対話である。細胞が絶えず死んでも及び/又は再生しても、この対話及びその調節により、生物全体の存在を維持することができる。この対話の結果として、幹細胞研究から既知であるように、細胞の分化も調節される。この対話により、妊娠中の場合のように一方が非常に急速な成長を示したとしても2つの異なる細胞クローンのよく調節された協調が可能となる。
ヒトにおける細胞対話の基礎は、HLA群とのMHC(主要組織適合遺伝子複合体)である。HLA群による細胞の識別は、すべての細胞コミュニケーションの基礎である。細胞コミュニケーションは、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)上のキラー免疫グロブリン様受容体(KIR)又はLILR(白血球免疫グロブリン様受容体)などの特定の受容体と協調して発達し、その後、サイトカイン、成長因子など更なる要因が関与する。
以下に記載することができる様々なHLA群が既知である:
HLA A、B、及びC群(MHC I):これらは実質的にすべての成人及び体細胞を識別する。
HLA D群(DR、DP、DQなど;MHC II):これらは免疫担当細胞及び/又は抗原提示において重要な役割を果たす。
HLA E、F、及びG群:これらは、特にいわゆる浸潤の前部にある、胚細胞を識別する。
HLA A、B、及びC群(MHC I):これらは実質的にすべての成人及び体細胞を識別する。
HLA D群(DR、DP、DQなど;MHC II):これらは免疫担当細胞及び/又は抗原提示において重要な役割を果たす。
HLA E、F、及びG群:これらは、特にいわゆる浸潤の前部にある、胚細胞を識別する。
更に、MHC複合体はまた、クラスIIIに属する補体因子などの更なる物質を含む。
腫瘍細胞は基本的に、生物全体の他の細胞と同じ遺伝暗号を有する。従って、腫瘍細胞は、細胞***及び細胞分化に関して生物全体の情報以外のいかなる情報も有していない。結果として、すべての悪性腫瘍疾患は特有かつ個別であり、すなわちそれぞれの生物に特異的である。
いくつかの腫瘍疾患では、いわゆるがん遺伝子など、追加の遺伝情報が、例えばウイルスベクターによって外部から細胞に導入される。しかしながら、がん遺伝子はまた、生殖から遺伝物質の不可欠な部分を形成し得る。がん遺伝子及び/又はその活性化並びに他の外的要因は、腫瘍細胞の生物学に恒久的に影響を与え得る。それでも、腫瘍細胞は、生物全体の細胞対話及びそこで有効な調節に関与し続ける。
ヒトなどの高度な細胞分化を有する生物は、多能性又は全能性の喪失によってその高い分化に対して「代償を払う」。臓器喪失の場合、元の状態に回復することはもはや不可能であり、結合組織による修復のみが可能である。ヒトデなど、生物がそれほど強く分化しない場合、全能性又は多能性の喪失はそれほどはっきりしたものではなく、従って、例えば腕が失われた場合小さいとはいえ、新しい腕が再び成長することができる。
全能性は基本的に、高等生物の遺伝物質にもコードされている。これは、この遺伝物質が以前は受精卵細胞から分化した生物への発達を制御しなければならなかったという単純な事実によって証明されている。クローン実験はまた、クローン化されたヒツジの「ドリー」の***細胞などの高度に分化した細胞の遺伝物質でも「ゼロに」に「リセット」(「再プログラミング」)することが核中で可能であることを示す。最終的な分析では、これは卵細胞の生殖及び/又は受精にも当てはまり、2つの比較的年齢の高い個々(父親及び母親)の遺伝物質が「ゼロ」にリセットされ、新しい生物の発生のために再びコードされる。
それに対応して、腫瘍細胞には、生物全体において可能なすべての成長及び分化プロセス、すなわち、初期胚-母親細胞の対話及びその後の胚-胎児発達の初期胚着床のメカニズムを基本的にコードする遺伝物質も提供されることは明らかである。
すべての腫瘍細胞は、様々な程度でその分化を失い(従って「脱分化」し)、様々な程度でその「戻り道」を作る。この「戻り道」の必要不可欠な特徴は、細胞分化の喪失及び特定の細胞性能の喪失、並びに制御されない細胞増殖の(再)獲得である。
腫瘍細胞はその表面に典型的な胚HLA群を発現することができることが既知である。それぞれの調査はまだ断片的であるが、胚HLA群のこの発現は、腫瘍細胞が自身の生物の非特異的免疫防御の攻撃を回避する状況に寄与している。表面上でのこれらの典型的なHLA群の発現により、細胞は例えばNK細胞上の対応する受容体を活性化することが可能となるだけでなく、リンパ球、更には免疫担当細胞も活性化することが可能となり、従って、非特異的免疫防御、すなわちNK細胞及びリンパ球の攻撃がないだけでなく、個々の場合では、腫瘍細胞(及び胚細胞)は、すなわち自身の発達に有益な成長因子及びサイトカインの合成によって「免疫防御をそれらのために働かせる」ことができる。
ここで、例えば、TAM(腫瘍関連マクロファージ)又はMDSC(免疫寛容誘導性「骨髄由来抑制細胞」)の現象に言及する必要がある。それらは、悪性腫瘍の微小環境において腫瘍増殖を支援する(すなわち「方向転換」される)。腫瘍において(おそらくNK細胞によって)産生される可能性が高く、かつ、血管新生促進効果を有し、従って腫瘍細胞の増殖及び遊走を支援する、MIF(マクロファージ遊走阻止因子)などのサイトカインにも同じことが同様に当てはまる。
腫瘍細胞は非常に耐性である必要はない。既知であるように、それらは「健常な」分化した標準細胞よりも化学療法に対してより感受性が高く、放射線に対してもより感受性が高い。それらの細胞***速度も特に高くはない。悪性腫瘍細胞に起因する危険性は、何よりも、細胞のコミュニケーションに基づいて、進行する制御されない成長を「強制する」ことができるということである。
この状況はまた、現在の知識によれば、「悪性幹細胞」と称することができる悪性細胞が広がってコロニーを形成するために、主に転移が形成されるという事実によっても示されている。これが正しければ、そのような「悪性幹細胞」は、隣接する組織との細胞コミュニケーションによって、成長制御及び分化圧を局所的に回避することもできるはずである。脱分化から形成されたとしても、幹細胞は一般に幹細胞のように挙動し、この場合、特に胚母体コミュニケーション(胚母体対話)を機能させる様式に焦点を当てる。
細胞の悪性変性は、すべての個人に特異的な固有のプロセスである。これは、個人間に渡って病理学的に十分に分類可能な(常に再発する)腫瘍種があるという事実によって変更されない。この状況はむしろ、悪性腫瘍がすべての脱分化及びすべての「戻り道」によって形成されるわけではないという事実の証拠である。むしろ特定の一群のみが「戻り道」で「生存する」ことができ、従って、個人間に渡って典型的な腫瘍実体をもたらす可能性が高い。
細胞の脱分化又は「変性」はおそらく、すべての生物全体において比較的至る所に存在するプロセスである。しかしながら、腫瘍疾患の形成につながることはほとんどないが、それは、これらの細胞のうちのごく僅かのものしか、サバイバビリティに必要な細胞生物学的及び(細胞間)コミュニケーション前提条件を有していないからである。サバイバビリティを示す細胞は、上記の2つのメカニズムをおそらく組み合わせた形で使用する。一方では、それらは胚母体コミュニケーションの回復を利用して免疫系の攻撃を回避し、細胞成長の過程でこのコミュニケーションからの支援を得ることさえあり、一方では、完全又は部分的に発現した(元々は成人の)HLAパターン(及び自分の母親のパターンに対応するもの(以下を参照))によって保護されつつ、特定の免疫防御の攻撃を回避することができ、従って、増殖する。
「獲得」免疫は妊娠中に発達し、体自身のHLA群に関して耐性があるだけでなく、自身の母親の外来成人HLA群に関しても常に耐性があることを意味する。
現在の知識によると、腫瘍細胞は基本的に、複合体中で共因子としてベータミクログロブリンに結合しつつ、細胞外アルファ1及びアルファ2ドメインによって構成される裂け目において抗原としてペプチドを提示する膜貫通タンパク質として、生物全体のすべての他の体細胞と同じ成人HLA群を発現する。その結果、腫瘍細胞は特定の免疫防御の攻撃から保護される。これは、原則として、元のHLAパターンの一部が「戻り道の途中」で失われるか、より低い密度で発現するか、又は変化した形で、すなわち破損した形で利用可能である場合(これは腫瘍細胞には変則的ではない)にも当てはまる。
ここでは、母親生物中で流され、そこに残っている(これは「マイクロキメリズム」と称される)胚の胚細胞と比較することが有用である。胚細胞(主に胎盤又は栄養膜細胞)上の胚表面構造、特にHLA-G、E、及びFは、母親の免疫系が細胞を攻撃するのを防ぐ。
胚細胞(ここでは通常、胚の真正細胞)の特定の分化がすでに起こっている場合、それらは対応する器官に特異的に組み込まれる。これは、特定の転移形成パターンを好む場合が多い悪性腫瘍の挙動を非常に強く反映している。
胚細胞の胚の表面構造が維持されている場合、胚細胞は、腫瘍細胞と同様に、おそらく母親の生涯を通じて攻撃されない。
妊娠中に非常に多くの胚細胞が母親生物に流れ込む場合、この耐性は、母親の体を「引き継ぐ」試みにもなり得、すなわち、例えば、非常に危険なHELLP症候群(溶血、肝酵素の上昇、血小板数の減少)の場合のように「移植片対宿主」反応が起こる。
しかしながら、おそらく胚細胞が少なくとも部分的にHLA-G、E、F保護を失い、かつ、任意選択で更なる分化を伴うという事実による、マイクロキメリズムに対する逆反応もあり得る。
次いで、胚細胞は分化しているときに母親生物のものとは異なる「成人」HLA構造を示すため、母親生物の炎症性逆反応がある。典型的な結果として、炎症部位の周りに結合組織が形成され、これが特定の免疫疾患を引き起こし得る(橋本甲状腺炎を参照)。
腫瘍細胞は、更なる分化中に表面上にHLA特性を形成し、この特性は宿主生物の特性と異ならないために、生物のこの炎症性逆反応は腫瘍細胞の場合には起こらない。
腫瘍細胞について既知であり説明されているように、成人HLAパターンのこの完全又は不完全な発現は、腫瘍細胞が追加の抗原発現(又は過剰発現)によって抵抗している場合であっても特異的免疫防御の攻撃を妨げる。元の成人HLAパターンの完全又は不完全な発現に起因する保護は明らかに非常に効果的であり、その結果、腫瘍細胞は、(特異的)免疫反応、すなわち、存在しているBリンパ球及びTリンパ球の免疫反応の効果的な攻撃なしに、その特異的抗原パターンを発現することができる(従って、結果として「抵抗することとなる」)。腫瘍抗原発現パターンが個々の腫瘍種に比較的特異的であることは注目に値する。変化及び/又は変異したMHC-/HLA群が、抗原提示カスケード(APM(抗原プロセシング機構))を益々欠陥的にすることも可能であり、従って、典型的なヒト関連又は自身の抗原がほとんど提示されないか又は(もはや)提示されない。しかしながら、そのような推定プロセスの基礎をなす分子メカニズムは不明であり、未だ同定されていない。
生物全体が、HLA発現パターンが生物又は母親とは強く又は完全に異なる体細胞に直面した場合、記憶細胞の形成を伴った免疫防御の攻撃があると想定する必要がある。「記憶」は、当然、多様なHLA群に対して主に向けられる。しかしながら、免疫系のそのような攻撃とそれに続く外来細胞の破壊はまた、他の表面構造に対する抗体の形成を伴うことが既知である。個々の場合では、抗体は、至る所に存在する細胞成分、例えば、リン脂質に対してさえ形成される(「抗リン脂質抗体症候群」)。
このような背景に対し、両方のメカニズムを全体として考慮し、すなわち「戻り道の途中の腫瘍細胞」が他の細胞及び免疫系とどのようにコミュニケーションするか、及び/又は胎児期の喪失したコミュニケーションの特徴がどのようにして回復されるかを全体として考慮し、この理解から、これらの基本原理を考慮した治療概念及び対応する医薬を開発する必要がある。
特定の免疫防御(すなわち、Tリンパ球及びBリンパ球)に加えて、単球及びそれから生じるマクロファージも腫瘍の成長に役割を果たす。しかしながら、マクロファージは、非特異的免疫防御細胞(NKキラー細胞など)又は特異的免疫防御細胞(T細胞及びB細胞など)が存在する場合にのみ活性化することができる。しかしながら、これには、抗原提示細胞(樹状細胞など)が変異又は「外来」タンパク質を提示し、従って、細胞傷害性T細胞の形成をもたらす、「プライミング」が必要である。ここでは、インターフェロン(IFN-γ)及び腫瘍壊死因子(TNF-α)などの多数のサイトカインも役割を果たす。
胚細胞と腫瘍細胞と間の比較は、マクロファージの場合でも生じる。マクロファージは、妊娠している場合に子宮内膜基底に見出され得る。それらは通常、胚の侵入の挙動に対して抑制効果を有し、移植胚と子宮筋層との間のいわば「保護壁」を形成する。一方、胚は、マクロファージ遊走阻止因子、すなわち、マクロファージの攻撃を制限及び阻害する因子を分泌する。これは悪性腫瘍にも同様に当てはまる(上記を参照)。
結論として、現在の理解は、膜結合型MHC I媒介性のペプチド提示及び免疫細胞上の特定の受容体(KIR及びLILRなど)へのその後の結合に基づく腫瘍細胞と免疫細胞との間の直接的な細胞間コミュニケーションに基づいている。
腫瘍細胞と免疫系との間のコミュニケーションの分子的基礎はまだよく理解されていない。いわゆる「チェックポイント」を攻撃する抗体ベースの治療の出現により、それぞれの標的構造の決定(mRNA又はタンパク質ベースでのPD-L1発現の定量化など)並びに/又は腫瘍変異量及び/若しくはMSI状態の決定が、治療又は長期生存期間(DFS、MFS、DSS、又はOS)への反応を予測する場合にある程度影響があることが示されている。
本明細書で使用される疾患の「転帰を予測する」という用語は、所与の治療を受けている患者の転帰の予測及び治療されていない患者の予後の両方を含むことを意味する。「転帰を予測する」という用語は、特に、好ましくは所与の時間枠内において転移又は死亡などの事象を受ける患者のリスクに関し得る。
結論として、複数種の腫瘍に関して、再発の個々のリスク及び化学療法又は代替治療オプションへの反応についてがん患者をより良好に分類する医学的必要性が高い。
これには、一方では、変異(KRAS、NRAS、EGFR、cMET、HER2、ESR1、FGRF3など)、分子サブタイピング転写物(ESR1 PGR、ERBB2など;MKI67、RACGAP1、BIRC5、MYBL1、FOXM1などの増殖遺伝子;KRT4、KRT5、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20などのケラチン;SNAI1、SNAI2、FOXA1などのEMTマーカー)、免疫遺伝子(CD3、CD8、CD19、CD68、CD168、CSF1R、IGKC、IGHM、IFNGなど)、チェックポイント遺伝子(PD-L1、PD-L2、CD86、CD80、L-ICOS、B7-H3、B7-H4;PD1、CTLA4、CD28、ICOSなど)などの腫瘍細胞特異的な特徴の決定、他方では、本開示に記載されるHLA発現パターンの決定(「HLAタイピング」)が含まれ得る。
例えば、両方の膀胱がんのステージの非常に異種の群では、現在の臨床病理学的特徴によって予後を信頼性高く評価できないため、最適な治療手順は明らかではない。
がん、例えば、乳がんの受容体状態を検出するために現在世界的に適用されている標準的な方法論は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋(FFPE)生検又は切除組織の免疫組織化学法(IHC)である。乳がんでは、内分泌治療又は標的化全身治療(例えばトラスツズマブによる)の実施は、殆どはIHCに基づいている。しかしながら、複数のマーカーを検査することによって個々のリスクを決定するIHCベースの手法では、上記の診断/治療の難題を解決するのに役立ち得る膀胱がんの信頼の高い予後のサブ分類は得られない。更に、IHCによる検査は一般に感度の欠如に悩まされている。
従って、信頼性の高い個人のリスク評価を可能にし、好適な腫瘍治療レジメンの選択(すなわち、患者の層別化)を容易にし、かつ、予後及び治療の成功の予測を可能にする、膀胱がんの分子サブタイピングのための信頼性が高く、客観的、定量的、かつ再現性のある検査システムが明らかに必要である。更に、そのような検査システムは、かなりの割合のがん患者に好適である分散型検査を可能とする必要がある。
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これら及び他の目的は、以下に説明される本発明によって解決される。
本発明は、がん患者及び/又は自己免疫疾患に関連する障害に罹患している患者の身体試料(組織又は血液試料)における個人のHLAパターン(成人及び/又は胚)を決定するインビトロ方法、及びテーラーメイド治療のために上記患者を層別化する方法に関する。
本発明は更に、対応するキット及びその使用法、並びにがんなどの新生物疾患、自己免疫疾患、感染症、及び妊娠に関連する状態の予後バイオマーカーとしての核酸分子にも関する。本発明はまた、治療薬及び治療薬を製造する方法に関する。
本明細書で使用される「試料」、「生体試料」、又は「臨床試料」という用語は、患者から得られた試料を指す。試料は、任意の生物学的組織又は生物学的液体であり得る。このような試料には、唾液、血液、血清、血漿、血液細胞(例えば、白血球)、組織、コア若しくは細針生検試料、細胞含有体液、浮遊核酸、尿、腹水、及び胸水、脳脊髄液、涙液、又はそれら由来の細胞が含まれるが、これらに限定されない。生体試料には、組織学的目的のために採取された凍結若しくは固定切片などの組織の切片、又は顕微解剖された細胞若しくはその細胞外部分も含まれ得る。分析される生体試料は、吸引若しくは穿刺、切除、又は生検若しくは切除された細胞材料をもたらす他の外科的方法によって採取された新生物病変由来の組織材料である。そのような生体試料は、患者から得られた細胞を含み得る。細胞は、固形腫瘍材料における細胞「塗抹標本」、洗浄液、又は体液中に見出され得る。試料は、処理された試料、例えば、凍結、固定、包埋された試料などであり得る。試料の好ましい種は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である。FFPE試料の調製は標準的な医療行為であり、これらの試料は長期間保存することができる。
本明細書で使用される「患者」という用語は、脊椎動物などの任意の生物、特にヒト及び別の哺乳動物、例えば齧歯動物、ウサギ、又はサルなどの動物の両方を含む任意の哺乳動物を指す。齧歯動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、又はチンチラであり得る。好ましくは、患者はヒトである。
一態様では、本発明は、腫瘍の個人のHLAパターンを決定する方法であって、第1のHLA遺伝子の第1の領域をコードするRNA転写物の第1の発現レベルを決定することと、第2のHLA遺伝子の第2の領域のRNA転写物の第2の発現レベルを決定することと、決定された第1及び第2の発現レベルを比較して個人のHLAパターンを取得することと、を含み、第1のHLA遺伝子及び第2のHLA遺伝子が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H~HLA-Jをコードする遺伝子からなる群から選択される、方法に関する。
いくつかの実施形態では、第1のHLA遺伝子及び第2のHLA遺伝子は、異なるHLA群をコードし得る。例えば、第1のHLA遺伝子は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-Jからなる群から選択されるものをコードし得る。同様に、第2のHLA遺伝子は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-Jからなる群から選択される別の遺伝子をコードし得る。
このような場合、第1及び第2の発現レベルの比較は「遺伝子間」と称し得る。
特に、第1のHLA遺伝子は、すなわちHLA-A、HLA-B、及びHLA-Cからなる群から選択される古典的なHLA遺伝子をコードし得る。一方、第2のHLA遺伝子は、すなわちHLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、及びHLA-Jからなる群から選択される非古典的なHLA遺伝子又は偽遺伝子をコードし得る。
他の実施形態では、第1のHLA遺伝子及び第2のHLA遺伝子は、同一であるか、又は同じHLA群をコードし得る。例えば、第1及び第2のHLA遺伝子は両方とも、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、及びHLA-Jからなる群から選択される1つをコードし得る。
このような場合、第1発現レベル及び第2発現レベルの比較は「遺伝子内」と称し得る。
特に、本開示は、患者、例えばがん患者における腫瘍の個人のHLAパターンを決定するインビトロ方法であって、例えばがん患者の腫瘍組織又は血液の試料中の成人HLA群(例えば、HLA-A、HLA-B、HLA-C;MHC I)、HLA D群(DR、DP、DQなど;MHC II)、「胚」HLA(例えば、HLA-E、HLA-F、HLA-G)、HLA偽遺伝子(例えば、HLA-H、HLA-J)からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子のRNA転写物の発現レベルを決定することを含む、方法に関する。
本発明によれば、「RNA転写物」という用語は、センス及び/又はアンチセンス方向の転写産物に関する。
好ましくは、この用語は、「メッセンジャーRNA」を意味する「mRNA」を含み及びそれに関し、ペプチド又はタンパク質をコードする「転写物」に関する。mRNAは、典型的には、5’非翻訳領域(5’-UTR)、タンパク質又はペプチドコード領域、及び3’非翻訳領域(3’-UTR)を含む。mRNAは、細胞中及びインビトロで限られた半減期を有する。
アンチセンスRNA(aRNA)転写産物などの他の場合、RNAは、ペプチド又はタンパク質をコードしていなくてもよい。しかしながら、RNAは、mRNAに相補的であり、それにより、ペプチド又はタンパク質への対応するセンスmRNAの翻訳を調節し得る。本開示の目的のために、アンチセンスRNA転写物は、HLA群のタンパク質又はペプチドに直接翻訳されないが、それぞれの「HLA遺伝子」の更なる「領域」(アンチセンス領域)に関するとみなされ得る。
いくつかの場合では、第1の発現レベル及び第2の発現レベルの両方が、センスRNA転写物に関し得る。他の場合には、第1の発現レベルはセンスRNA転写物に関し得るが、第2の発現レベルはアンチセンスRNA転写物に関し得る(又はその逆であり得る)。好ましくは、しかし必ずしもそうではないが、センス及びアンチセンス転写物は、同じHLA群に関する。例えば、アンチセンス転写物は、同じHLA群のセンス転写物に少なくとも部分的に相補的であり得る。
「発現レベル」という用語は、例えば、遺伝子発現の決定されたレベルを指す。「発現レベルのパターン」という用語は、参照遺伝子、例えばハウスキーパー若しくは逆調節遺伝子、又は例えばDNAチップ分析で算出された平均発現値のいずれかと比較した、遺伝子発現の決定されたレベルを指す。パターンは、2つの遺伝子の比較に限定されないが、参照遺伝子又は試料に対する遺伝子の多重比較に関する。特定の「発現レベルのパターン」はまた、本明細書に開示されるいくつかの遺伝子の比較及び測定によって取得及び決定され、これらの転写物の互いに対する相対的な存在量を示し得る。発現レベルはまた、異なる組織、例えば、がん組織対非がん組織における遺伝子の発現と比較して評価され得る。
本明細書で使用される「発現レベル」という用語は、転写物及び/又はタンパク質を生成するための特定の遺伝子(例えば、HLA-E、HLA-F、HLA-G)の発現を指す。本発明によれば、発現レベルは、例えば、転写されたmRNAを測定することにより(例えば、ノーザンブロットにより)、逆転写(RT)定量的PCR(RT-qPCR)により、又はmRNAを直接染色することにより(例えば、インサイチューハイブリダイゼーションにより)、RNA転写レベル、特にmRNAレベル(転写レベル)で決定される。
いくつかの実施形態では、発現レベルは、腫瘍の試料における1つ以上の参照遺伝子の(平均)発現レベルに対して正規化されている。本明細書で使用される「参照遺伝子」という用語は、検査されているシステム、すなわち、がんにおいて、RNA転写物/mRNAレベルで比較的変動しない発現レベルを有する遺伝子を指すことを意味する。このような遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と称され得る。いくつかの実施形態では、1つ以上の参照遺伝子は、CALM2、B2M、RPL37A、GUSB、HPRT1、及びGAPDHを含む群から選択され、好ましくはCALM2及び/又はB2Mである。他の好適な参照遺伝子は、当業者に既知である。
第1及び第2の領域の各々は、エクソン-エクソン境界を含み得、又は1つ以下のエクソンの一部を含み得る(すなわち、エクソン-エクソン境界を含まない)。
例えば、第1の領域及び第2の領域のうちの1つ(例えば、第1の領域)は、2つのエクソンの部分におよび(すなわち、エクソン-エクソン境界を含む)、第1の領域及び第2の領域のうちのもう一方(例えば、第2の領域)は、1つ以下のエクソンの一部を含む(すなわち、エクソン-エクソン境界を含まない。
あるいは、第1の領域は、エクソン-エクソン境界を含み得(すなわち、2つのエクソンの部分におよび得る)、第2の領域は、エクソン-エクソン境界を含み得る。第1の領域及び第2の領域は、共通のエクソンの部分を含み得、又は含み得ない。例えば、第1の領域は、エクソン2とエクソン3との間の境界を含み得る(すなわち、エクソン2/エクソン3の境界を含み得る)。そのような場合、第2の領域は、任意のエクソン(エクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4など)の一部を含み得、又は任意のエクソン-エクソン境界(エクソン3/エクソン4境界、エクソン4/エクソン5境界など)を含み得る。エクソン-エクソン境界の群には、エクソン2/エクソン4境界などのエクソンスキップによって形成される境界も含まれる。
更なる代替では、第1の領域は、1つ以下のエクソンの部分を含み、第2の領域は、1つ以下のエクソンの部分を含む。
いくつかの実施形態では、第1の領域は、HLA群のシグナルペプチド領域をコードし得、第2の領域は、HLA群の膜貫通領域をコードし得る。
一般に、個人のHLAパターンを決定する方法はまた、第1及び第2の発現レベルの比較に基づいて、個人のHLAパターンが主に可溶性であるか又は膜結合性であるかを決定することを含み得る。特に、HLA群のシグナルペプチド領域をコードする領域の発現レベルが、HLA群の膜貫通領域をコードする領域の発現レベルを超える場合、個人のHLAパターンは主に可溶性であると決定され得る。HLA群の膜貫通領域をコードする領域の発現レベルが、HLA群のシグナルペプチド領域をコードする領域の発現レベルと本質的に等しいか又はそれを超える場合、個人のHLAパターンは主に膜結合であると決定され得る。
一般に、個人のHLAパターンを決定する方法はまた、第1及び第2の発現レベルの比較に基づいてHLAアイソフォームを決定することを含み得る。特に、第1のエクソンの一部をコードする領域の発現レベルが、第2のエクソンの一部をコードする領域の発現レベルを超える場合、個人のHLAパターンは、第1のエクソンを含み、かつ、第2のエクソンを含まない1つ以上のアイソフォームを含むと決定され得る。
一般に、個人のHLAパターンを決定する方法はまた、HLA群の1つ以上の更なる領域(例えば、第3の領域)の1つ以上の更なる発現レベル(例えば、第3の発現レベル)を決定することを含み得、比較は更に、個人のHLAパターンを得るために、決定された更なる発現レベルに基づく。
「RNA発現レベル」という用語は、転写されたRNA、初期のスプライシングされていないRNA転写物、又は成熟mRNAに変換されたDNA遺伝子配列情報の決定されたレベルを指す。RNAの発現は、遺伝子のRNA全体又はサブ配列のいずれかのレベルを測定することによってモニタリングできる。
いくつかの実施形態では、RNA転写物の発現レベルを決定することは、RNA転写物の発現レベルがRNA転写物の規定された発現閾値よりも低いか又は高いか(=二分化)を決定することを含む。発現レベルが規定された発現閾値に等しい場合、発現レベルは規定された発現閾値よりも高い発現レベルの群に属するとみなされ得る。従って、本明細書で使用される「規定された発現閾値より高い」という記載は、規定された発現閾値以上である発現レベルを含む。「規定された発現閾値より高い」発現レベルは「発現陽性」とも称され得、「規定された発現閾値より低い」発現レベルは「発現陰性」とも称され得る。
いくつかの実施形態では、1つ以上のHLAのシグナルペプチドの相同領域をコードするRNA転写物の発現レベルが、1つ以上のHLAの相同膜貫通領域をコードする発現レベルに関して決定及び設定され、及び/又は1つ以上のHLAの多様な細胞質尾部が関連して設定され、それにより、分泌されたアルファドメイン対膜貫通局在化HLAの比率を個々のHLA及びHLAアイソフォームについて決定することができる。
「RNA転写物の発現レベルを決定する」ステップは、(i)RNA転写物の発現レベルを測定することと、(ii)(例えば、規定された発現閾値などの参照発現レベルとの比較によって)RNA転写物の測定された発現レベルを分析することと、を含み、RNA転写物の発現レベルを測定する順序は、測定されたRNA転写物発現レベルを分析する順序と関係し得、又は無関係であり得る。
いくつかの実施形態では、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、及びHLA偽遺伝子(HLA-H及び/又はHLA-J)からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、又は4つの遺伝子のRNA転写物の発現レベルが決定される。
いくつかの実施形態では、得られた個人のHLAパターンは、HLA群の1つ以上のアイソフォームの存在及び/又は不存在及び/又は発現レベルを示し得る。例えば、HLA-Gの既知のアイソフォームには、HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4、HLA-G5、HLA-G6、及びHLA-G7が含まれる。同じことが、更なる胚HLA群であるHLA-E及びHLA-F、並びにHLA偽遺伝子であるHLA-H及びHLA-Jにも当てはまる。そのような実施形態では、HLA群の現在既知ではない更なるアイソフォームが存在すると決定され得る。
HLA群の1つ以上のアイソフォームの存在及び/又は発現レベルを示す得られた個人のHLAパターンは更に、腫瘍の分子サブタイプを同定するために及び/又は治療薬を生成する方法において使用され得る。
更に又はあるいは、アイソフォーム、特に、可溶性アイソフォームの存在及び/又は不存在及び/又は発現レベルを示すことは、(a)生殖補助医療、例えば、体外受精(IVF)において胚の着床を安定化するため、(b)例えば宿主対移植片反応において、移植拒絶反応のリスクを低減するため、及び/又は(c)自己免疫の急増のリスクを低減するか若しくはその影響を最小限に抑えるために使用され得る。そのような使用は、特に、HLA-E、HLA-F、及び/又はHLA-Gの可溶性で生物学的に活性なアイソフォームを含む培地又は治療薬を製造することを含み得る。そのような可溶性で生物学的に活性なアイソフォームの例には、HLA-G5が含まれる。
いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍試料における免疫遺伝子の群(CD3、CD8、CD19、CD68、CD168、CSF1R、IGKC、IGHM、IFNGなど)から選択される少なくとも1つの遺伝子のRNA転写物の発現レベルを決定することを更に含む。
本開示の一実施形態として、HLAタイピングと、PD-L1、PD-L2、CD86、CD80、L-ICOS、B7-H3、B7-H4、PD1、CTLA4、CD28、及び/又はICOSのタンパク質ベース及び/又はmRNAベースの評価によって例示されるチェックポイント特性と、の組み合わせは、進行がんの臨床状況においてヒト化抗体などの特定の阻害剤によってチェックポイント遺伝子を標的化する場合に特に関心がある。HLAタイピングは、化学療法剤及び/又はチェックポイント阻害剤(抗PD1又は抗PD-L1又は抗CTLA4薬など)に対する反応の予測のためにチェックポイント標的遺伝子を専ら定量化することの価値を付加するHLA発現パターン情報を提供する。
本開示の一実施形態として、HLAタイピングと免疫遺伝子(CD3、CD8、CD19、CD68、CD168、CSF1R、IGKC、IGHM、IFNGなど)のタンパク質ベース及び/又はmRNAベースの評価によって例示される免疫細胞浸潤の定量化との組み合わせは、特にネオアジュバント治療戦略への反応を予測する場合に、化学療法剤及び/又は抗チェックポイント薬に対する反応予測のためにチェックポイント標的遺伝子を専ら定量化することの価値を付加する。
本発明の1つ以上の実施形態によれば、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、改変された抗体フォーマット、抗体誘導体又は標的結合特性を保持する断片、抗体ベースの結合タンパク質、オリゴペプチド結合剤、及び抗体模倣物からなる群から選択される少なくとも1つを含む。
「抗体」は、「免疫グロブリン」(Ig)とも同義的に称され、一般に、限定するものではないが、2つの重鎖(H)鎖及び2つの軽鎖(L)鎖の4つのポリペプチド鎖を含み、従って、完全長機能的変異体、バリアント、又はそれらの誘導体(Ig分子の必須のエピトープ結合機能を保持するマウス、キメラ、ヒト化、及び完全ヒト抗体を含み、二重特異性、二重特異性、多重特異性、及び二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む)を含む、多量体タンパク質又はその同等のIg相同体(例えば、重鎖のみを含むラクダナノボディ、重鎖又は軽鎖のいずれかに由来し得る単一ドメイン抗体(dAbs))である。免疫グロブリン分子は、任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)又はサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、及びアロタイプであり得る。
本明細書で使用される「抗体ベースの結合タンパク質」は、他の非免疫グロブリン又は非抗体由来の成分の文脈で、少なくとも1つの抗体由来のVH、VL、又はCH免疫グロブリンドメインを含む任意のタンパク質を表し得る。そのような抗体ベースのタンパク質には、(i)免疫グロブリンCHドメインの全部又は一部を有する受容体又は受容体成分を含む、結合タンパク質のFc融合タンパク質、(ii)VH及び/又はVLドメインが代替分子足場に結合している、結合タンパク質、又は(iii)免疫グロブリンVH及び/若しくはVL、並びに/又はCHドメインが、天然に存在する抗体又は抗体断片に通常見出されない様式で結合している及び/又は組み立てられている分子が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「抗体誘導体又は断片」は、完全長ではない抗体に由来する少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む分子に関し、限定するものではないが、単独又は任意の組み合わせの、(i)可変軽鎖(VL)、可変重鎖(VH)、定常軽鎖(CL)、及び定常重鎖1(CH1)ドメインからなる一価断片である、Fab断片、(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された2つのFab断片を含む2価断片である、F(ab’)2断片、(iii)VH及びCH1ドメインからなる、Fab(Fd)断片の重鎖部分、(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなる、可変断片(Fv)断片、(v)単一の可変ドメインを含む、ドメイン抗体(dAb)断片、(vi)単離された相補性決定領域(CDR)、(vii)単鎖Fv断片(scFv)、(viii)VH及びVLドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されているが、同じ鎖上の2つのドメイン間で対を形成するには短すぎる
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を使用し、それにより、ドメインに別の鎖の相補性ドメインと対にならせて2つの
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を作り出す、二価の二重特異性抗体である、ダイアボディ、(ix)相補性軽鎖ポリペプチドと共に、1対の抗原結合領域を形成する、1対のタンデムFvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む、線状抗体、(x)免疫グロブリン重鎖及び/若しくは軽鎖の他の非全長部分、又はそれらの変異体、バリアント、若しくは誘導体を含むが、これらに限定されない、完全長ではない抗体に由来する少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む分子に関する。いずれにしても、上記誘導体又は断片は標的結合特性を保持する。
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を使用し、それにより、ドメインに別の鎖の相補性ドメインと対にならせて2つの
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を作り出す、二価の二重特異性抗体である、ダイアボディ、(ix)相補性軽鎖ポリペプチドと共に、1対の抗原結合領域を形成する、1対のタンデムFvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む、線状抗体、(x)免疫グロブリン重鎖及び/若しくは軽鎖の他の非全長部分、又はそれらの変異体、バリアント、若しくは誘導体を含むが、これらに限定されない、完全長ではない抗体に由来する少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む分子に関する。いずれにしても、上記誘導体又は断片は標的結合特性を保持する。
本明細書で使用される「改変された抗体フォーマット」という用語は、抗体-薬物コンジュゲート、ポリアルキレンオキシド改変scFv、モノボディ、ダイアボディ、ラクダ抗体、ドメイン抗体、二重若しくは三重特異性抗体、IgA、又はJ鎖によって結合された2つのIgG構造、及び分泌成分、サメ抗体、新世界霊長類フレームワーク+非新世界霊長類CDR、ヒンジ領域が除去されたIgG4抗体、CH3ドメインに対して操作された2つの追加の結合部位を有するIgG、Fcγ受容体に対する親和性を増強するように変更されたFc領域を有する抗体、並びにCH3+VL+VHを含む二量体化構築物などを包含する。
本明細書で使用される「抗体模倣物」という用語は、免疫グロブリンファミリーに属さないタンパク質、更にはアプタマーなどの非タンパク質又は合成ポリマーを指す。いくつかの種は、抗体様ベータシート構造を有する。抗体に対する「抗体模倣物」又は「代替足場」の潜在的な利点は、溶解性が良好であること、組織への浸透性が高いこと、熱及び酵素に対する安定性が高いこと、並びに製造コストが比較的低いことである。
いくつかの抗体模倣物は、考えられるすべての標的に対して特異的な結合候補を提供する大規模なライブラリーで提供することができる。抗体の場合と同様に、標的特異的抗体模倣物は、ハイスループットスクリーニング(HTS)技術並びにファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母又は哺乳動物ディスプレイなどの確立されたディスプレイ技術を使用することによって開発することができる。現在開発されている抗体模倣物には、例えば、アンキリンリピートタンパク質(DARPinsと称される)、C型レクチン、S.aureusのAドメインタンパク質、トランスフェリン、リポカリン、フィブロネクチンの第10のIII型ドメイン、クニッツドメインプロテアーゼ阻害剤、ユビキチン由来バインダー(アフィリンと称される)、ガンマクリスタリン由来バインダー、システインノット又はノッチン、チオレドキシンA足場ベースのバインダー、SH-3ドメイン、ストラドボディ、ジスルフィド結合及びCa2+で安定化された膜受容体の「Aドメイン」、CTLA4ベースの化合物、Fyn SH3、及びアプタマー(特異的標的分子に結合するペプチド分子)が含まれる。
本発明の1つ以上の実施形態によれば、免疫チェックポイント阻害剤は、表1に記載の群から選択される少なくとも1つを含む。表1中、DARTは「デュアルアフィニティリターゲティング(Dual-Affinity Re-Targeting)」を示し、mAbは「モノクローナル抗体」を示し、NAは「該当なし」を示す。
別の態様では、本発明は、がんの治療における上記方法の使用であって、第1のステップとして、腫瘍治療のためにがん患者を層別化し、第2のステップとして、選択された抗HLA腫瘍治療レジメンをがん患者に提供することを含む、使用に関する。
本発明による「腫瘍治療のためにがん患者を層別化すること」は、特定の分子腫瘍サブタイプを有する患者群にがん患者を割り当てることを含み、これにより、医療従事者は最も好適な腫瘍治療レジメンを選択することが可能となる。
本開示のいくつかの実施形態では、上記治療は、新生物疾患に罹患している患者のための、ヒト化抗体の使用又はその特異的なHLAアイソフォームに対して生じるRNA若しくはタンパク質ベースの免疫化を含む。
いくつかの実施形態では、上記使用は、エクスビボで可溶性HLAドメインを生成することを含み得る。例えば、該生成は、合成モノマー(α1、α2、α3)、又は天然に存在する順序の多量体(例えば、α1α2α3、α1α2、α1α3)若しくはデノボ順序の多量体(α2α3)、或いはデノボコンカテマー(例えば、α1α1α1、α2α2α2、α3α3α3、α1α1α2、α1α1α3、α1α1α1α1α2α2α2α3α3α3など)として、天然に存在するアルファドメインのいずれかを組み合わせることを含み得る。
上記の治療薬は、自己免疫疾患に関連する障害に罹患している患者又は早期流産の潜在的リスクのある妊婦に適用して、自己免疫症状を軽減し、出産まで妊娠を継続できるようにするために免疫寛容を高めるものであり得る。
一般に、治療薬を製造する方法は、上記の方法を使用して個人のHLAパターンを決定することと、治療薬を製造することと、を含み得る。
いくつかの実施形態では、治療薬は、該治療薬が決定された個人のHLAパターンに特異的に結合するように、タンパク質、タンパク質ドメイン、及び/又はポリペプチドを含み得る。治療薬のそのような結合の結果として、決定された個人のHLAパターンとリガンド又は例えば免疫担当細胞上の受容体との間の結合又は相互作用が妨げられ得る。
例えば、治療薬は、決定された個人のHLAパターンに基づいて、可溶性HLAドメイン又は抗体を含み得る。
いくつかの実施形態では、治療薬は、核酸、特にRNAを含み得る。そのようなRNAは、既知のRNAワクチン接種技術に沿った治療薬の注射後に免疫系によって合成され得る抗原をコードし得る。抗原への治療薬のそのような翻訳の結果として、決定された個人のHLAパターンにもかかわらず、免疫担当細胞の応答が引き起こされ得る。
例えば、治療薬は、決定された個人のHLAパターンに基づく可溶性HLAドメイン又は抗体を含み得る。
いくつかの実施形態では、上記の合成アルファドメインの組み合わせはすべて、シスで(すなわち、HLA-G又はHLA-F又はHLA-E又はHLA-Aなどの、1つのみの単一のHLA遺伝子のアルファドメインを組み合わせることによって)又はトランスで(すなわち、HLA-G及びHLA-E又はHLA-F又はHLA-A;HLA-A及びHLA-E又はHLA-F又はHLA-Gなどの、2つ以上のHLA遺伝子のアルファドメインを組み合わせることによって)起こり得る。
いくつかの実施形態では、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-Fの上記の合成アルファドメインは、適用されるHLAアルファドメインの拡散の低減及び局所停留の増加のために二量体化及び/又は多量体化が可能である可溶性HLAアルファドメインを得るために、HLA-G内の置換と同様の位置に追加のシステインを含むように生物工学的に操作される。
更に別の態様では、本発明は、逆転写(RT)定量的PCR(RT-qPCR)によって、例えば膀胱がん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するためのキットであって、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-Jからなる群から選択される遺伝子に特異的な少なくとも1対のプライマー及び少なくとも1つのプローブを含む、キットに関する。
本発明はまた、腫瘍の分子サブタイプを同定するための上記のキットの使用に関する。
「膀胱がん」という用語は、膀胱又は尿道組織に由来するがんの種類に関連している。いくつかの実施形態では、膀胱がんは、筋層非浸潤性膀胱がん(NMIBC)又は筋層浸潤性膀胱がん(MIBC)である。時折、膀胱がんは転移性である。転移の一般的な部位には、骨、肝臓、肺、及び脳が含まれる。膀胱がんは、ヒト及び他の哺乳動物で発生する。ヒトの症例の大部分は男性で発生するが、女性の膀胱がんも発生し得る。一般に、膀胱がんの治療は、外科手術、薬物療法(免疫療法及び/又は化学療法及び/又はBCGによる免疫療法など)、放射線療法、及び/又は標的化療法を含み得る。
ほぼすべての膀胱がんは尿路上皮から発生する。がんは、膀胱内の他の層に又はそれを介して成長するにつれて更に進行し、ステージへの分類は、より深い組織層での腫瘍の浸潤の進行に従う。ステージは次のように規定される:Ta(pTa):非浸潤性乳頭がん、Tis(pTis):非浸潤性平坦型がん(平坦型上皮内がん、又はCIS)、T1(pT1):腫瘍は膀胱の内側にある細胞層から下の結合組織へと成長しているが、それでもNMIBCであると考えられる、T2(pT2):腫瘍は筋層(MIBC)へと成長している、T3(pT3):腫瘍は膀胱の筋層を介して、それを取り巻く脂肪組織層へ成長している、及びT4(pT4):腫瘍は脂肪組織を越えて近くの臓器又は構造に広がっている。腫瘍は次のうちのいずれかへと成長し得る:前立腺の間質(主要組織)、精嚢、子宮、膣、骨盤壁、又は腹壁。
本発明の意味の範囲内での「プライマー対」及び「プローブ」は、分子生物学の当業者に周知であるこの用語の通常の意味を有するものとする。本発明の好ましい実施形態では、「プライマー対」及び「プローブ」は、検出又は定量化される標的ポリヌクレオチドの領域と同一、相補的、相同、又はその領域の相補体と相同な配列を有するポリヌクレオチド分子であると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、プライマー及び/又はプローブとしての使用のために、ヌクレオチド類似体も含まれる。動的又はリアルタイムPCR適用に使用されるプローブ技術は、例えば、Roche Molecular Diagnosticsにおいて入手可能なTaqMan(登録商標)システム、Scorpion(登録商標)Primersなどの伸長プローブ、Dual Hybridization Probes、Chemicon International,Incにおいて入手可能なAmplifluor(登録商標)、又はMinor GrooveBindersであり得る。
いくつかの実施形態では、キットは、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-Jからなる群から選択される少なくとも2、3又は4つの遺伝子のための特定のプライマー対及び特定のプローブを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、以下を含む:
-少なくとも1対のHLA-G特異的プライマー及び少なくとも1つのHLA-E特異的プローブ;
-少なくとも1対のHLA-G特異的プライマー及び少なくとも1つのHLA-F特異的プローブ;並びに/又は
-少なくとも1対のHLA-F特異的プライマー及び少なくとも1つのHLA-G特異的プローブ。
-少なくとも1対のHLA-G特異的プライマー及び少なくとも1つのHLA-E特異的プローブ;
-少なくとも1対のHLA-G特異的プライマー及び少なくとも1つのHLA-F特異的プローブ;並びに/又は
-少なくとも1対のHLA-F特異的プライマー及び少なくとも1つのHLA-G特異的プローブ。
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも1対のHLA群特異的プライマー及び少なくとも1つのHLA群特異的プローブを含み、プライマーの対及びプローブは両方とも、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-Jからなる群から選択される遺伝子に特異的である。
好ましくは、本発明に従って使用するためのプライマーは、長さが15~30のヌクレオチド、特にデオキシリボヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、プライマーは、(1)標的mRNA配列(例えば、HLA-E、HLA-F、又はHLA-G)に特異的である、(2)120bp未満(好ましくは100bp未満)のアンプリコンサイズを提供する、(3)すべての既知のタンパク質をコードするスプライシングバリアントを検出する、(4)既知の多型(例えば、一塩基多型、SNP)を含まない、(5)mRNA特異的である(エクソン/イントロンの考慮;好ましくはDNAの増幅なし)、(6)二量体化する傾向がない、及び/又は(7)58℃~62℃の範囲の融解温度Tmを有する(好ましくはTmは約60℃である)ように設計される。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、天然(天然に存在する)ヌクレオチドを含み、これには、アデニン(A)、チミジン(T)、シトシン(C)、グアニン(G)、及びウラシル(U)からなる群から選択される核酸塩基、リボース、アラビノース、キシロース、ピラノース、及びデオキシリボースの群から選択される糖(一般に「ヌクレオシド」と称される塩基と糖との組み合わせ)、並びにホスホジエステルヌクレオシド間結合を形成することができる1~3個のリン酸基が含まれる。更に、本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体を指す。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド類似体」は、DNA又はRNAポリメラーゼ(どちらか好適なもの)によって認識され、DNA鎖又はRNA鎖(どちらか好適なもの)に組み込まれる、A、G、C、T、又はUの類似体(すなわち、塩基A、G、C、T、又はUを含むヌクレオチドの類似体)を意味する。そのようなヌクレオチド類似体の例には、5-プロピニルピリミジン(すなわち、5-プロピニル-dTTP及び5-プロピニル-dCTP)、7-デアザプリン(すなわち、7-デアザ-dATP及び7-デアザ-dGTP)、アミノアリル-dNTP、ビオチン-AA-dNTP、2-アミノ-dATP、5-メチル-dCTP、5-ヨード-dUTP、5-ブロモ-dUTP、5-フルオロ-dUTP、N4-メチル-dCTP、2-チオ-dTTP、4-チオ-dTTP、及びアルファ-チオ-dNTPが含まれるが、これらに限定されない。標識された類似体、例えば、DEAC-プロピレンジアミン(PDA)-ATPなどの蛍光類似体、モルフォリノヌクレオシド類似体に基づく類似体、及びロックド核酸(LNA)類似体も含まれる。
本発明に従って使用するためのプライマーに関連して使用される「標的mRNA配列に特異的な」という文言は、温度及び溶液のイオン強度の適切な条件下で、特にPCR条件下で、標的mRNA配列のcDNAにハイブリダイズする(すなわち、アニールする)プライマーの能力を指すことを意味する。温度及び溶液のイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定される。ハイブリダイゼーションには、2つの核酸(すなわち、プライマー及びDNA)が相補的な配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが起こり得る。いくつかの実施形態では、「温度及び溶液イオン強度の好適な条件」は、58℃~62℃の範囲の温度(好ましくは約60℃の温度)及びPCR反応混合物で一般的に使用される溶液のイオン強度を指す。いくつかの実施形態では、プライマーの配列は、当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムによって決定した際に、標的mRNA配列のcDNAの対応する配列に80%、好ましくは85%、より好ましくは90%、更により好ましくは95%、96%、97%、98%、99%又は100%相補的である。
例えば、プライマーは、ストリンジェント又は中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的mRNA配列のcDNAにハイブリダイズし得る。本明細書に記載の「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、5×SSC/5×デンハルト溶液/1.0%SDS中で68℃でハイブリダイズし、0.2×SSC/0.1%SDS中で室温で洗浄するか、又は当該技術分野で認めれているその同等物(例えば、ハイブリダイゼーションを2.5×SSCバッファー中で60℃で行い、続いて、低バッファー濃度で37℃で数回の洗浄ステップを行い、安定を維持する条件)を伴い得る。本明細書で規定される「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、3×SSCで42℃で洗浄すること、又は当該技術分野で認められているその同等物を含むことを伴う。塩濃度及び温度のパラメーターは、プライマーと標的核酸との間の同一性の最適なレベルを達成するために変動し得る。そのような条件に関する指針は、例えば、J.Sambrook et al. eds.,2000, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor;(非特許文献1)及びAusubel et al.eds.,1995,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,N.Y(非特許文献2)で入手可能である。
いくつかの実施形態では、プローブは、上記で規定されたストリンジェントな又は中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的mRNA配列の(増幅された)cDNAにハイブリダイズする。
好ましくは、本発明に従って使用するためのプローブは、20~35ヌクレオチド、特にデオキシリボヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、プローブは、(1)標的mRNA配列(例えば、HLA-E、HLA-F又はHLA-G)に特異的である、(2)既知の多型(例えば、一塩基多型、SNP)を含まない、及び/又は(3)対応するプライマーの融解温度Tmよりも約5℃~8℃高い融解温度Tmを有するように設計される。
本発明に従って使用するためのプローブに関連して使用される「標的mRNA配列に特異的な」という文言は、プローブが、温度及び溶液のイオン強度の好適な条件下で、特にPCR条件下で、標的mRNA配列の(増幅された)cDNAにハイブリダイズする(すなわち、アニールする)能力を指すことを意味する。温度及び溶液のイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定される。ハイブリダイゼーションには、2つの核酸(すなわち、プローブ及びcDNA)が相補的な配列を含む必要があるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが起こり得る。いくつかの実施形態では、「温度及び溶液イオン強度の好適な条件」は、63℃~70℃の範囲の温度及びPCR反応混合物中で一般的に使用される溶液のイオン強度を指す。いくつかの実施形態では、プローブの配列は、当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムによって決定した際に、標的mRNA配列の(増幅された)cDNAの対応する配列に80%、好ましくは85%、より好ましくは90%、更により好ましくは95%、96%、97%、98%、99%又は100%相補的である。
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号1、2、3の配列を含むか若しくはそれを有するHLA-A特異的プライマー、及び/又は配列番号4、5、6の配列を含むか若しくはそれを有するHLA-B/C特異的、及び/又は配列番号7~27の配列を含むか若しくはそれを有するHLA-G特異的プライマー、並びに/或いは配列番号28~33の配列を含むか若しくはそれを有するHLA-H特異的プライマーの使用を含む。
いくつかの実施形態では、定量的PCRは、蛍光ベースの定量的リアルタイムPCRである。
いくつかの実施形態では、プローブの検出は、増幅媒介性プローブ置換に基づく。
いくつかの実施形態では、プローブは、蛍光レポーター部分及び蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
いくつかの実施形態では、キットは、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼを更に含む。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼは、ワンステップ逆転写(RT)定量的PCR(RT-qPCR)を可能にする酵素混合物の形態で提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも1対の参照遺伝子特異的プライマー及び少なくとも1つの参照遺伝子特異的プローブを更に含む。
いくつかの実施形態では、参照遺伝子は、CALM2、B2M、RPL37A、GUSB、HPRT1、及びGAPDHからなる群から選択される1つ以上である。本明細書で使用される場合、CALM2は、カルモジュリン-2、ホスホリラーゼキナーゼ,デルタ(参照配列(mRNA):NM_001743)を指し、B2Mは、ベータ-2ミクログロブリン(参照配列(mRNA):NM_004048)を指し、RPL37Aは、60Sリボソームタンパク質L37a(参照配列(mRNA):NM_000998)を指し、GUSBは、ベータ-グルクロニダーゼ(参照配列(mRNA):NM_000181)を指し、HPRT1は、ヒポキサンチン-ホスホリボシルトランスフェラーゼ1(参照配列(mRNA):NM_000194)を指し、GAPDHは、グリセリンアルデヒド-3-リン酸-デヒドロゲナーゼ(参照配列(mRNA):NM_002046)を指す。
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも1つの対照RNA試料を更に含む。
いくつかの実施形態では、プライマーは、120bp未満のアンプリコンサイズを提供する。
いくつかの実施形態では、HLA-A特異的プライマーは、15~30ヌクレオチドの長さを有し、配列番号1、2、若しくは3の配列のうちの少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含み、及び/又はHLA-B/C特異的プライマーは、15~30ヌクレオチドの長さを有し、配列番号4、5、若しくは6の配列うちの少なくとも10個の連続したヌクレオチドを含み、及び/又はHLA-G特異的プライマーは、15~30ヌクレオチドの長さを有し、配列番号7~27の配列のうちの1つの少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含み、並びに/あるいはHLA-H特異的プライマーは、15~30ヌクレオチドの長さを有し、配列番号28~33の配列のうちの1つの少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、がん適応症は、乳がん、卵巣がん、肺がん、膀胱がん、胃がん、又は結腸がんである。
更なる態様において、本発明は、がんについての予後バイオマーカー又は予測バイオマーカーとして、特に、化学療法に対する耐性を示す又は免疫療法に対する耐性を示す予測バイオマーカーとして、HLA-EのRNA転写物の発現レベル、及び/もしくHLA-FのRNA転写物の発現レベル、並びに/又はHLA-GのRNA転写物の発現レベルの使用に関する。
「マーカー」又は「バイオマーカー」という用語は、存在又は濃度を検出し、例えば数学的アルゴリズムにより、疾患状態などの既知の状態又はこれらの組み合わせと相関させることができる、生体分子、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、ホルモンなどを指す。
本明細書で使用される「予後マーカー」という用語は、治療された又は治療されていない患者においてそれぞれの疾患(例えば、膀胱がん)の起こり得る経過に関する情報を提供するマーカーを指す。いくつかの実施形態では、予後は、疾患特異的生存期間(DSS)、無再発生存期間(RFS)、無増悪生存期間(PFS)、及び無遠隔再発生存期間のうちの1つ以上を含む。いくつかの実施形態では、予後は、DSSを含む。本明細書で使用される「単一の予後バイオマーカー」という用語は、追加の予後マーカーが予後に使用/分析されていないことを意味する。
いくつかの実施形態では、HLA-EのRNA転写物の発現レベル又はHLA-FのRNA転写物の発現レベル又はHLA-GのRNA転写物の発現レベルは、単一の予後バイオマーカーとして使用される。
いくつかの実施形態では、
-HLA-GのRNA転写物の規定された発現閾値よりも低いHLA-EのRNA転写物の発現レベルは、陽性の予後を示し、及び/若しくは
-HLA-FのRNA転写物の規定された発現閾値よりも低いHLA-FのRNA転写物の発現レベルは、陰性の予後を示し、並びに/又は
-HLA-GのRNA転写物の規定された発現閾値よりも低いHLA-FのRNA転写物の発現レベルは、陽性の予後を示す。
-HLA-GのRNA転写物の規定された発現閾値よりも低いHLA-EのRNA転写物の発現レベルは、陽性の予後を示し、及び/若しくは
-HLA-FのRNA転写物の規定された発現閾値よりも低いHLA-FのRNA転写物の発現レベルは、陰性の予後を示し、並びに/又は
-HLA-GのRNA転写物の規定された発現閾値よりも低いHLA-FのRNA転写物の発現レベルは、陽性の予後を示す。
いくつかの実施形態では、陽性の予後は、長期の疾患特異的生存期間(DSS)、無再発生存期間(RFS)、無増悪生存期間(PFS)、及び無遠隔再発生存期間のうちの1つ以上、好ましくはDSSの確率の増加を含む。
いくつかの実施形態では、
-HLA-EのRNA転写物の規定された発現閾値よりも高いHLA-EのRNA転写物の発現レベルは、陰性の予後を示し、及び/若しくは
-HLA-FのRNA転写物の規定された発現閾値よりも高いHLA-FのRNA転写物の発現レベルは、陽性の予後を示し、並びに/又は
-HLA-FのRNA転写物の規定された発現閾値よりも高いHLA-GのRNA転写物の発現レベルは、陰性の予後を示す。
-HLA-EのRNA転写物の規定された発現閾値よりも高いHLA-EのRNA転写物の発現レベルは、陰性の予後を示し、及び/若しくは
-HLA-FのRNA転写物の規定された発現閾値よりも高いHLA-FのRNA転写物の発現レベルは、陽性の予後を示し、並びに/又は
-HLA-FのRNA転写物の規定された発現閾値よりも高いHLA-GのRNA転写物の発現レベルは、陰性の予後を示す。
いくつかの実施形態では、陰性の予後は、長期の疾患特異的生存期間(DSS)、無再発生存期間(RFS)、無増悪生存期間(PFS)、及び無遠隔再発生存期間のうちの1つ以上、好ましくはDSSの確率の低下を含む。
別の態様では、本発明は、例えば本明細書で規定される方法において、膀胱がん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するための、本明細書で規定される1対のプライマー及び/又は本明細書で規定されるプローブの使用であって、該プライマーの対及び/又はプローブは、HLA-E、HLA-F、及びHLA-Gからなる群から選択される遺伝子に特異的である、使用に関する。
いくつかの実施形態では、プローブは、蛍光レポーター部分及び蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
更に別の態様では、本発明は、逆転写(RT)定量的PCR(RT-qPCR)によって膀胱がん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するためのキットを製造するための、本明細書で規定される1対のプライマー及び/又は本明細書で規定されるプローブの使用であって、該プライマーの対及び/又はプローブは、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、又はHLA-Jからなる群から選択された遺伝子に特異的である。
いくつかの実施形態では、プローブは、蛍光レポーター部分及び蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
一態様では、本発明は、がんを有する患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するインビトロ方法であって、RNA転写物の発現レベルを決定することと、その後、上記のHLA発現を決定することと、を含む、方法に関する。
本明細書で使用される「腫瘍の分子サブタイプ」(又は「がんの分子サブタイプ」)という用語は、別個の分子プロファイル、例えば、遺伝子発現プロファイルによって特徴付けられる腫瘍/がんのサブタイプを指す。
いくつかの実施形態では、上記方法は、1つ以上の追加の非参照遺伝子の発現レベル、特に、そのRNA転写物の発現レベルの決定を含む。
本明細書で使用される「非参照遺伝子」という用語は、検査されているシステム、すなわちがんにおけるRNA転写物/mRNAレベルでの可変レベルの発現を有し、従って、例えば、腫瘍/がんのサブタイピング及び/又はがんの進行の評価のために使用することができる遺伝子を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、非参照遺伝子は、腫瘍マーカー、例えば、先行技術からの既知のものから選択される。本発明に従って使用することができる非参照遺伝子は、膀胱特異的又は非膀胱特異的遺伝子であり得る。
いくつかの実施形態では、上記方法は、4つ以上、3つ以上、又は2つ以上の追加の非参照遺伝子の発現レベル、特に、そのRNA転写物の発現レベルの決定を含まない。
いくつかの実施形態では、上記方法は、任意の追加の非参照遺伝子の発現レベル、特に、そのRNA転写物の発現レベルの決定を含まない。言い換えれば、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、又はHLA-J以外の遺伝子、及び任意選択で、HLA-A、HLA-B、HLA-C、及びHLA-Dから選択される少なくとも1つの遺伝子、並びに任意選択で、1つ以上の参照遺伝子の発現レベル、特に、そのRNA転写物の発現レベルは決定されない。
いくつかの実施形態では、最大7つ、好ましくは6つ、より好ましくは5つ、更により好ましくは4つの異なる非参照遺伝子のRNA転写物の発現レベルが決定される。
いくつかの実施形態では、上記方法は、組織学的等級付け又はリンパ節状態の決定などの任意の他の診断ステップを含まない。いくつかの実施形態では、上記方法は、免疫組織化学(IHC)を含むいかなるステップも含まない。
本発明のいくつかの実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、膀胱若しくは尿道腫瘍であるか、又は膀胱若しくは尿道腫瘍に由来する(例えば、転移による)。本明細書で使用される「膀胱(bladder)」という用語は、膀胱(urinary bladder)を指す。
いくつかの実施形態では、腫瘍の試料は、がん患者から単離された腫瘍組織試料(例えば、腫瘍の生検又は切除組織)であり得る。好ましい実施形態では、腫瘍組織試料は、腫瘍組織試料の凍結切片であるか、又は化学的に固定された腫瘍組織試料である。より好ましい実施形態では、腫瘍組織試料は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋(FFPE)腫瘍組織試料である。いくつかの実施形態において、腫瘍の試料は、腫瘍組織試料から抽出された(トータル)RNAである。特に好ましい実施形態では、腫瘍の試料は、FFPE腫瘍組織試料から抽出された(トータル)RNAである。当業者は、RNA抽出手順を行うことができる。例えば、5~10μmのFFPE腫瘍組織巻き状物由来のトータルRNAは、High Pure RNAパラフィンキット(Roche、スイス・バーゼル)、若しくはXTRAKT RNA抽出キットXL(Stratifyer Molecular Pathology、ドイツ・ケルン)、又はRNXtract(登録商標)抽出キット(BioNTech Diagnostics GmbH、ドイツ・マインツ)を使用して抽出することができる。使用/検査する試料材料を冷凍庫に保存し、それぞれの試料材料を解凍した後、適切な時点で本発明の方法を行うことも可能である。試料は、療法治療の開始前、療法治療中、及び/又は療法治療後、すなわち、がん治療薬の投与前、投与中、又は投与後に、がん患者から取得し得る。
更なる態様では、本発明は、腫瘍治療のために患者、例えば、膀胱がんの患者を層別化する方法であって、第1のステップとして、上記で規定されたインビトロ方法を使用してがん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定することと、第2のステップとして、インビトロ方法で同定された分子サブタイプに基づいて腫瘍治療レジメンを選択することと、を含む、方法に関する。
いくつかの実施形態では、腫瘍治療のために膀胱がん患者を層別化する上記方法は、上記で規定されたインビトロ方法を使用してがん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するステップ以外に、組織学的等級付け又はリンパ節状態の決定などの任意の他の診断ステップを含まない。いくつかの実施形態では、上記方法は、免疫組織化学(IHC)を含むいかなるステップも含まない。
いくつかの実施形態では、分子サブタイプは、HER2陽性、トリプルネガティブ(「基底様」とも称される)、ルミナルA、及びルミナルBからなる群から選択される。「基底様」という用語は、そのような腫瘍は、基底上皮細胞の遺伝子発現と遺伝子発現にいくつかの類似性がある事実を指す。「ルミナル」という用語は、腫瘍とルミナル上皮との間の遺伝子発現の類似性に由来する。
いくつかの実施形態では、HER2、ESR1、及びKi67のRNA転写物の発現レベルが決定され、分子サブタイプが、HER2+、HER2-/ESR1+、HER2-/ESR1-/Ki67+、及びHER2-/ESR1-/Ki67-を含む群、好ましくはそれらからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記分子サブタイプは、MIBCに関連する。分子サブタイプは、臨床転帰及び治療への反応で大きく異なり得る。
いくつかの実施形態では、
-分子サブタイプはHER2陽性であり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び/又はBCG点滴注入及び/又は化学療法及び/又は抗HER2療法及び/又は免疫チェックポイントを標的化する抗体の投与及び/又は膀胱切除、続いて、抗HER2治療薬及び/又は化学療法薬の投与を含む;
-分子サブタイプはトリプルネガティブであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び/又はBCG点滴注入及び/又は化学療法、特にネオアジュバント化学療法、及び/又は免疫チェックポイントを標的化する抗体の投与及び/又は膀胱切除を含む;
-分子サブタイプはルミナルAであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び/又はBCG点滴注入及び/又は膀胱切除及び/又は化学療法、特にアジュバント化学療法、及び/又は(アジュバント)内分泌療法を含む;並びに/或いは
-分子サブタイプはルミナルBであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び/又はBCG点滴注入及び/又は内分泌療法及び/又は化学療法、特に、アジュバント化学療法又は周術期における化学療法、及び/又は膀胱切除を含む。
-分子サブタイプはHER2陽性であり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び/又はBCG点滴注入及び/又は化学療法及び/又は抗HER2療法及び/又は免疫チェックポイントを標的化する抗体の投与及び/又は膀胱切除、続いて、抗HER2治療薬及び/又は化学療法薬の投与を含む;
-分子サブタイプはトリプルネガティブであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び/又はBCG点滴注入及び/又は化学療法、特にネオアジュバント化学療法、及び/又は免疫チェックポイントを標的化する抗体の投与及び/又は膀胱切除を含む;
-分子サブタイプはルミナルAであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び/又はBCG点滴注入及び/又は膀胱切除及び/又は化学療法、特にアジュバント化学療法、及び/又は(アジュバント)内分泌療法を含む;並びに/或いは
-分子サブタイプはルミナルBであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び/又はBCG点滴注入及び/又は内分泌療法及び/又は化学療法、特に、アジュバント化学療法又は周術期における化学療法、及び/又は膀胱切除を含む。
いくつかの実施形態では、
-分子サブタイプはルミナルAであり、膀胱がんはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除(TUR)及び/又は桿菌カルメットゲラン(BCG)点滴注入、好ましくはTUR及びBCG点滴注入を含む;
-分子サブタイプはルミナルBであり、膀胱がんはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、アジュバント内分泌療法を伴う又は伴わないアジュバント化学療法を含む;
-分子サブタイプはHER2陽性であり、膀胱がんはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、(ネオ)アジュバント抗HER2療法を伴う又は伴わない(ネオ)アジュバント化学療法を含む;
-分子サブタイプはトリプルネガティブであり、膀胱がんはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンはネオアジュバント化学療法を含む;
-分子サブタイプはルミナルAであり、膀胱がんはMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、(i)膀胱切除及び(ii)アジュバント化学療法及び/又はアジュバント内分泌療法、好ましくはアジュバント化学療法又はアジュバント内分泌療法を含む;
-分子サブタイプはルミナルBであり、膀胱がんはMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、(i)膀胱切除及び(ii)アジュバント化学療法及び/又はアジュバント内分泌療法、好ましくはアジュバント化学療法及びアジュバント内分泌療法を含む;
-分子サブタイプはHER2陽性であり、膀胱がんはMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、(i)膀胱切除及び(ii)アジュバント化学療法及び/又はアジュバント抗HER2療法、好ましくはアジュバント化学療法及びアジュバント抗HER2療法を含む;並びに/或いは
-分子サブタイプはトリプルネガティブであり、膀胱がんはMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、その後の膀胱切除を伴う又は伴わないネオアジュバント化学療法を含む。
-分子サブタイプはルミナルAであり、膀胱がんはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除(TUR)及び/又は桿菌カルメットゲラン(BCG)点滴注入、好ましくはTUR及びBCG点滴注入を含む;
-分子サブタイプはルミナルBであり、膀胱がんはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、アジュバント内分泌療法を伴う又は伴わないアジュバント化学療法を含む;
-分子サブタイプはHER2陽性であり、膀胱がんはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、(ネオ)アジュバント抗HER2療法を伴う又は伴わない(ネオ)アジュバント化学療法を含む;
-分子サブタイプはトリプルネガティブであり、膀胱がんはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンはネオアジュバント化学療法を含む;
-分子サブタイプはルミナルAであり、膀胱がんはMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、(i)膀胱切除及び(ii)アジュバント化学療法及び/又はアジュバント内分泌療法、好ましくはアジュバント化学療法又はアジュバント内分泌療法を含む;
-分子サブタイプはルミナルBであり、膀胱がんはMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、(i)膀胱切除及び(ii)アジュバント化学療法及び/又はアジュバント内分泌療法、好ましくはアジュバント化学療法及びアジュバント内分泌療法を含む;
-分子サブタイプはHER2陽性であり、膀胱がんはMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、(i)膀胱切除及び(ii)アジュバント化学療法及び/又はアジュバント抗HER2療法、好ましくはアジュバント化学療法及びアジュバント抗HER2療法を含む;並びに/或いは
-分子サブタイプはトリプルネガティブであり、膀胱がんはMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、その後の膀胱切除を伴う又は伴わないネオアジュバント化学療法を含む。
いくつかの実施形態では、分子サブタイプはHER2陽性であり、がんは好ましくはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、内分泌療法、ホルモン療法、及び/又は化学療法と組み合わせた抗HER2療法を含み、これらはすべて、アジュバント療法又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
別の実施形態では、分子サブタイプはHER2陽性であり、がんは好ましくはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、点滴注入療法、例えば、BCG点滴注入を含む。
いくつかの実施形態では、分子サブタイプはルミナルBであり、膀胱がんは好ましくはNMIBCであり、腫瘍治療レジメンは、好ましくは内分泌療法と組み合わせた、例えば、タモキシフェン(Nolvadex(登録商標))、フルベストラント(Faslodex(登録商標))、又はアロマターゼ阻害剤と組み合わせた、点滴注入療法(例えば、BCG点滴注入)及び/又はネオアジュバント/アジュバント化学療法を含む。
「抗HER2療法」という用語の意味は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、抗HER2療法は、抗HER2抗体、特にモノクローナル抗HER2抗体の投与を含む。モノクローナル抗HER2抗体には、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))及びペルツズマブ(Perjeta(登録商標))が含まれ、これらは単独又は組み合わせて投与され得る。トラスツズマブは、HER2が過剰発現しているがんにのみ有効である。エルツマキソマブ(Rexomun(登録商標))などの他のモノクローナル抗体は、現在、臨床試験が行われている。抗HER2抗体は、細胞毒性剤、薬物(例えば、免疫抑制剤)、化学療法剤もしくは放射性核種、又は放射性同位元素などの治療部分/治療薬を含むように更に改変することができる。従って、腫瘍治療レジメンが抗HER2療法及び化学療法(の組み合わせ)を含む場合、化学療法剤に結合した抗HER2抗体を使用することができる。細胞毒素又は細胞毒性剤には、細胞に有害であり、特に細胞を殺す任意の薬剤が含まれる。例には、メルタンシン又はエムタンシン(DM1)、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、アマニチン、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は同族体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートは、トラスツズマブ(T)-DM1、例えば、トラスツズマブエムタンシンである。抗体コンジュゲートを形成するための他の好適な治療薬には、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)及びロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、及びシス-ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前のダウノマイシン)及びドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前のアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン(AMC))、並びに代謝拮抗剤(例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン)が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、治療薬は、細胞毒性剤又は放射性毒性剤である。別の実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、治療薬は、GM-CSFである。別の好ましい実施形態では、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、又はリシンAである。更なる治療部分には、mRNA及び/又はタンパク質合成に作用する治療部分が含まれる。いくつかの転写阻害剤が既知である。例えば、転写阻害剤及びDNA損傷剤の両方であるアクチノマイシンDは、DNA内に入り込み、従って転写の開始段階を阻害する。フラボピリドールは、転写の伸長段階を標的化する。α-アマニチンは、RNAポリメラーゼIIに直接結合し、これにより、開始段階及び伸長段階の両方が阻害される。抗HER2抗体を放射性同位元素、例えばヨウ素-131、イットリウム-90、又はインジウム-111に結合させて、細胞毒性放射性医薬品を生成することもできる。抗HER2抗体の投与の代替は、ラパチニブ(Tykerb(登録商標)又はTyverb(登録商標))、アファチニブ、又はネラチニブなど、HER2を標的化する小さな化合物の投与である。抗HER2療法はまた、内分泌療法(抗ホルモン治療とも称される)、例えばプロゲスチンによるホルモン療法、及び/又は化学療法で補充され得る。
化学療法は、細胞増殖抑制化合物又は細胞毒性化合物などの化学療法剤の投与を含む。従来の化学療法剤は、ほとんどのがん細胞の主要な特性のうちの1つである急速な***を行う細胞を死滅させることによって作用する。「化学療法剤」という用語には、タキサン、白金化合物、ヌクレオシド類似体、カンプトテシン類似体、アントラサイクリン及びアントラサイクリン類似体、エトポシド、ブレオマイシン、ビノレルビン、シクロホスファミド、代謝拮抗薬、抗有糸***薬、及び抗体コンジュゲートに関連して上記で開示された薬剤を含むアルキル化剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、化学療法は、白金系であり、すなわち、白金系化合物、例えば、シスプラチンの投与を含む。化学療法剤への言及は、任意のプロドラッグ、例えば、エステル、塩、又は上記薬剤のコンジュゲートなどの誘導体を含み得る。例は、上記薬剤と担体物質、例えば、アルブミン結合パクリタキセルなどのタンパク質結合パクリタキセルとのコンジュゲートである。好ましくは、上記薬剤の塩は薬学的に許容される。化学療法剤は、通常3~6ヶ月間、組み合わせて投与される場合が多い。最も一般的な治療のうちの1つは、ACとして既知である、シクロホスファミド及びドキソルビシン(アドリアマイシン;アントラサイクリン及びアントラサイクリン類似体の群に属する)である。時々、ドセタキセルなどのタキサン薬が追加され、そのレジメンはCATとして既知であり、タキサンはがん細胞中の微小管を攻撃する。同等の結果をもたらす別の一般的な治療は、シクロホスファミド、代謝拮抗剤であるメトトレキサート、及びヌクレオシド類似体(CMF)であるフルオロウラシルである。別の標準的な化学療法治療には、フルオロウラシル、エピルビシン、及びシクロホスファミド(FEC)が含まれ、これらにはドセタキセルなどのタキサン又はビノレルビンを補充することができる。
いくつかの実施形態では、分子サブタイプはルミナルBであり、腫瘍治療レジメンは、化学療法剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、分子サブタイプはルミナルBであり、腫瘍治療レジメンは、タキサン、好ましくはドセタキセルの投与を含む。いくつかの実施形態では、タキサンは、白金系の化学療法と組み合わせて投与される。
内分泌療法(抗ホルモン治療とも称される)は、エストロゲン及び/又はプロゲステロン受容体を遮断する/ダウンレギュレートする薬剤、例えば、タモキシフェン(Nolvadex(登録商標))又はフルベストラント(Faslodex(登録商標))、或いは、アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール(Arimidex(登録商標))又はレトロゾール(Femara(登録商標))によるエストロゲンの生成を妨げる薬剤の投与により、エストロゲンが増え続けることを必要とするがんを標的化する。しかしながら、アロマターゼ阻害剤は、閉経後の患者にのみに好適である。これは、閉経後の女性における活性アロマターゼが閉経前の女性で一般に認められる形態とは異なるため、これらの薬剤は閉経前の女性の優勢なアロマターゼを阻害するのに有効ではないためである。
別の態様では、本発明は、がんの治療に使用され得、方法は、第1のステップとして、上記で規定した方法を使用して腫瘍治療のために膀胱がん患者を層別化し、第2のステップとして、選択された腫瘍治療レジメンを膀胱がん患者に提供することを含む。腫瘍治療レジメンは、上記で規定したインビトロ方法によって同定された分子サブタイプに基づいて選択される。
上記の方法の第1のステップ及び第2のステップは、時間及び/又は場所に関して、互いに別々に行われ得る。第1のステップにより、例えば、異なる時間及び/又は場所において第2のステップを行うために使用される治療指針の発行が付与され得る。第1のステップの直後に第2のステップを行い得る。
いくつかの実施形態では、上記の方法は、アジュバント/ネオアジュバント化学療法に賛成する又は反対する直接的な意思決定のために、上記で規定されたインビトロ方法によって得られた定量的結果を使用することを含む。
別の態様では、本発明は、膀胱がんが本明細書で規定する分子サブタイプによって特徴付けられ、方法が分子サブタイプに基づいて選択される腫瘍治療レジメンを提供することを含む、がんの治療に使用され得る。
別の態様では、本発明は、治療薬を製造する方法であって、上記の方法を使用して個人のHLAパターンを決定することと、決定された個人のHLAパターンに基づいて可溶性HLAドメイン又は抗体を製造することと、を含む、方法に関する。本発明はまた、がんの治療に使用するための上記に従って製造された治療薬に関する。
本発明を以下に詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されず、その理由は、これらが変動し得るためであることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。別段の規定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
以下に、本発明の特定の構成要素を記載する。これらの構成要素は、特定の実施形態とともに列挙され得るが、それらは任意の様式及び任意の数で組み合わされて、追加の実施形態を作り出すことができることを理解されたい。様々に記載された例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。本記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び/又は好ましい構成要素と組み合わせる実施形態をサポートし、包含すると理解されるべきである。更に、本出願において記載されるすべての構成要素の任意の順列及び組み合わせは、文脈で別段の指示がない限り、本出願の記載によって開示されているとみなされるべきである。例えば、当業者には明らかであるように、特定の遺伝子のRNA転写物の発現レベル(特定の遺伝子のRNA転写物の規定された発現閾値よりも高い又は低い)及びそれに基づく分子サブタイプに関する本明細書に開示される特定の実施形態は、所与の腫瘍の分子サブタイプの同定を可能にするように組み合わせることができる。
実施形態及び実施例の説明に進む前に、用語に関するいくつかの一般的な注釈を以下に示す:好ましくは、本明細書で使用する用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms(IUPAC Recommendations)”,H.G.W. Leuenberger,B.Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland,(1995)(非特許文献3)に記載されるように規定される。
本発明の実施は、別段で指示がない限り、化学、生化学、細胞生物学、免疫学、及び当該分野の文献で説明される組換えDNA技術の従来の方法を使用する(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd Edition,J. Sambrook et al. eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 2000)(非特許文献4)。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈が別段で必要としない限り、「含む(comprise)」という語、並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変形は、記載されたメンバー、整数又はステップ又はメンバーの群、整数(複数)又はステップ(複数)を含むことを意味し、しかしながら、任意の他のメンバー、整数又はステップ又はメンバーの群、整数(複数)又はステップ(複数)を除外することを意味しないと理解されるが、いくつかの実施形態では、そのような他のメンバー、整数又はステップ又はメンバーの群、整数(複数)又はステップ(複数)は除外されてもよく、すなわち、主題は、記載されたメンバー、整数又はステップ又はメンバーの群、整数(複数)又はステップ(複数)を含むことから構成される。本発明を記載する文脈で(特に特許請求の範囲の文脈で)使用される「a」及び「an」及び「the」という用語並びに同様の言及は、本明細書で別段で指示がない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内にある各々の別個の値について個別に言及する簡便な方法として機能することを目的としている。本明細書に別段で指示がない限り、各値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書に別段で指示がない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書で提供されるすべての例又は例示的な文言(例えば、「など」)の使用は、単に本発明をより良く例示することを意図しており、別段で特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる文言も、本発明の実施に必要不可欠である特許請求の範囲に記載されていない構成要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用される患者の「試料の分類」という用語は、少なくとも2つのカテゴリーのうちの少なくとも1つとの該試料の関連に関する。これらのカテゴリーは、例えば、「高リスク」及び「低リスク」、高リスク、中リスク、及び低リスクであり得、リスクは、特定の期間において発生する特定の事象、例えば、転移の発生、無病生存期間などの確率である。それは更に、疾患の好ましい若しくは好ましくない臨床転帰、又は所与の治療などに対する反応若しくは非反応などのカテゴリーを意味し得る。分類は、アルゴリズム、特に識別機能を使用して行い得る。アルゴリズムの簡単な例は、第1の定量的パラメーター、例えば、関心のある遺伝子の発現レベルが特定の閾値を上回っているか又は下回っているかによる分類である。患者の試料の分類は、疾患の転帰を予測するために使用することができる。関心のある1つの遺伝子の発現レベルを使用することに代えて、関心のあるいくつかの遺伝子の組み合わせスコアを使用し得る。更に、追加のデータを第1の定量的パラメーターと組み合わせて使用し得る。そのような追加のデータは、患者の性別、年齢、体重、腫瘍のグレード又はステージなどの患者の臨床データであり得る。
「転移」という用語は、がん細胞が元の部位から体の別の部分に広がることを意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの浸潤、体腔及び血管に入るための内皮基底膜の浸透、次いで、血液によって輸送された後での標的臓器の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新しい腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍細胞又は成分が残存して転移能を発達させ得るため、腫瘍転移は原発腫瘍の除去後でもしばしば発生する。
「判別関数」は、対象物又は事象を分類するために使用される一連の変数の関数である。従って、判別関数により、患者、試料、又は事象を、該患者、試料、又は事象から利用可能なデータ又はパラメーターに従ってカテゴリー又は複数のカテゴリーに分類することが可能となる。そのような分類は、当業者に周知の統計分析の標準的な手段である。例えば、患者は、上記の患者、試料、又は事象から得られたデータに従って、「高リスク」又は「低リスク」、「転移の可能性が高い」又は「転移の可能性が低い」、「治療が必要である」又は「治療が不要である」に分類され得る。分類は、「高い対低い」に限定されるものではなく、複数のカテゴリー、等級付けなどへと行い得る。分類を可能にする判別関数の例には、サポートベクターマシン(SVM)、k近傍法(kNN)、(ナイーブ)ベイズモデル、又は例えばサブグループ発見、決定木、データの論理的分析(LAD)などにおける区分定義関数によって規定される判別関数が含まれる。
本明細書で使用される「予測」という用語は、患者が所与の治療に対して有利又は不利に反応する可能性に関する。特に、本明細書で使用される「予測」という用語は、腫瘍を所与の療法で治療した場合の腫瘍の悪性度の個々の評価又は患者の予想生存率(DFS、無病生存期間)に関する。それとは対照的に、「予後」という用語は、腫瘍が未治療のままである場合の腫瘍の悪性度の個々の評価又は患者の予想生存率(DFS、無病生存期間)に関する。
「反応マーカー」という用語は、所与の治療に対する患者の臨床反応を予測するために使用することができるマーカーに関する。反応には、例えばCTスキャン及び/又は血清バイオマーカーによって示されるネオアジュバント療法又は緩和治療の際の腫瘍縮小の直接観察、並びに無病生存期間(DFS)、全生存期間(OAS)、転移特異的生存期間(MSS)、疾患特異的生存期間、及び関連する評価に対する影響が含まれる。
本明細書で使用される患者の「臨床反応」という用語は、全生存期間、無増悪生存期間、無再発生存期間、及び無遠隔再発生存期間などの当該技術分野で通常使用される測定を含む、患者の状態の任意の測定の改善を意味する、患者における特定の治療の有効性に関する。無再発生存期間(RFS)とは、手術から最初の局所再発、領域再発、又は遠隔再発までの時間(年単位)を指す。無遠隔再発生存期間(DFRS)とは、手術及び/又は最初の診断から最初の解剖学的に遠隔の再発までの時間(年単位)を指す。実際のこれらの測定値の計算は、打ち切られる又は考慮されない事象の規定に応じて、研究ごとに変動し得る。
「新生物疾患」という用語は、がん組織を指す。これには、がん腫、例えば、上皮内がん、浸潤性がん腫、転移性がん腫、及び前悪性状態、組織学的起源とは無関係の新形態変化が含まれる。「腺がん」という用語は、腺組織に由来する悪性腫瘍を指す。
「がん(cancer)」及び「がん(cancerous)」という用語は、通常、調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか又は説明する。「がん」という用語は、罹患組織又は細胞凝集の任意のステージ、グレード、組織形態学的特徴、侵襲性、攻撃性、又は悪性度に限定されない。特に、ステージ0のがん、ステージIのがん、ステージIIのがん、ステージIIIのがん、ステージIVのがん、グレードIのがん、グレードIIのがん、グレードIIIのがん、悪性がん、原発がん、並びに他のすべての種類のがん、悪性腫瘍、及び婦人科がんに特に関連する変質が含まれる。「新生物疾患」又は「がん」という用語は、いかなる組織又は細胞種に限定されない。それらは、がん患者の原発性、続発性、又は転移性病変も含み、局所的に沈着しているか又は患者の体全体に遊離浮遊しているがん細胞又は微小残存疾患細胞によって罹患されたリンパ節も含む。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語には、異常に調節された細胞の成長、増殖、分化、接着、及び/又は移動を特徴とする疾患が含まれる。本明細書で使用される、がんという用語はまた、がん転移を含む。「腫瘍」及び「がん」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、悪性又は良性にかかわらず、すべての新生物細胞成長及び増殖、並びにすべての前がん及びがん細胞及び組織を指す。
本明細書で使用される場合、「肺がん」という用語は、肺で診断されるがん又は悪性腫瘍を指し、肺組織のすべてのがん、新生物の成長、及びがん変質を含むことを意味する。肺がんの例には、小細胞肺がん(SCLC)、及び非小細胞肺がん(NSCLC)、特に肺扁平上皮がん、腺がん、気管支肺胞がん、大細胞肺がん、並びに胸膜肺芽腫及びカルチノイド腫瘍などの他のものが含まれるが、これらに限定されない。
「新生物細胞」という用語は、細胞増殖の増加、細胞***の対称性の変化、又は細胞死メカニズムの減少により、正常よりも急速に成長する異常な細胞を指す。従って、本発明の新生物細胞は、良性新生物の細胞であり得、又は悪性新生物の細胞であり得る。
更に、新生物疾患又はがんの「状態を特徴付ける」という用語は、以下の状態のうちの1つ以上の測定及び評価に関するが、これらに限定されない:腫瘍の種類、組織形態学的外観、外部シグナル(例えば、ホルモン、成長因子))への依存、侵襲性、運動性、悪性腫瘍のTNM分類による状態(TNM)、International Union Against Cancerによって開発及び管理されているがんステージ分類システム、又は類似性、攻撃性、悪性度、転移の可能性、及び特定の治療に対する反応。
「治療方法」、「治療様式」、「レジメン」、又は「化学レジメン」及び「治療レジメン」という用語は、抗腫瘍剤、及び/若しくは抗血管剤、及び/若しくは免疫刺激剤、及び/若しくは血液細胞増殖剤の適時の連続的若しくは同時投与、並びに/又はがん治療のための放射線療法、及び/若しくは温熱療法、及び/若しくは低体温療法を指す。これらの投与は、アジュバント及び/又はネオアジュバント様式で行われ得る。そのような「プロトコル」の組成は、単剤の用量、適用の時間枠、及び規定された治療ウィンドウ内での投与頻度において変動し得る。現在、様々な薬物及び/又は物理的様式の様々な組み合わせ並びに様々なスケジュールが調べられている。
「内分泌治療」という用語は、ホルモン/ホルモンレベルの変化によって所望の治療効果を生み出す、ホルモン療法又は抗ホルモン療法として既知である様々な治療方法論を指す。治療には、ホルモン若しくはホルモン類似体、合成ホルモン若しくは他の薬物の患者への投与、或いはホルモン拮抗薬、ホルモン受容体拮抗薬、又は卵巣の外科的切除若しくはホルモン合成の化学的抑制のいずれかによるホルモン除去療法の使用による体内のホルモンレベルの低下が含まれ得る。内分泌療法は、選択的エストロゲン再取り込み阻害剤、選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター、アロマターゼ阻害剤、及び卵巣切除などのホルモン療法を含むように受けるであろう。上記の内分泌治療は、ホルモン若しくはホルモン類似体、合成ホルモン、又は他の薬物、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、及び/又はゴセレリン(商品名Zoladex(登録商標))の患者への投与を含み得る。好ましい実施形態では、上記の内分泌治療は、タモキシフェン又はタモキシフェン及びゴセレリンの投与を含む。更に、上記の内分泌治療は、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、フルベストラント、トレミフェン、及び酢酸メガステロールを含む群から選択される抗エストロゲン薬の投与を含み得る。上記の内分泌治療はまた、エストロゲン、プロゲスチン、及び/又はゲスターゲンの投与を含み得る。
「非タンパク質ベースで遺伝子の発現レベルを決定する」という用語は、二次遺伝子翻訳産物、すなわち、タンパク質に焦点を合わせた方法ではなく、RNA及びDNA分析に基づく遺伝子発現の他のレベルに焦点を合わせた方法に関する。本発明のいくつかの実施形態では、分析は、mRNAの前駆体形態を含む、mRNAを使用する。例示的な決定可能な特性は、HLA mRNA、すなわち、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、又はそれらの一部の量である。
あるいは、本明細書に開示される差次的に発現される遺伝子は、試薬及び化合物を同定するための方法及びがん治療のためのこれらの試薬及び化合物の使用、並びに治療方法において使用され得る。遺伝子の差次的調節は、特定のがん細胞種又はクローンに限定されず、がん細胞、筋肉細胞、間質細胞、結合組織細胞、他の上皮細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、及び免疫系細胞、例えば、リンパ球、マクロファージ、キラー細胞の相互作用を示す。
「RNA発現のパターン」という用語は、参照RNA又は計算された平均発現値のいずれかと比較した、RNA発現の決定されたレベルを指す。パターンは、2つのRNAの比較に限定されず、RNAと参照RNA又は試料との多重比較に関する。特定の「発現レベルのパターン」はまた、いくつかのRNAの比較及び測定によって取得及び決定され、これらの転写物の互いに対する相対的存在量を示し得る。
本発明の意味の範囲内での「発現レベルの参照パターン」は、発現レベルの別のパターンとの比較に使用することができる発現レベルの任意のパターンであると理解されるべきである。本発明の好ましい実施形態では、発現レベルの参照パターンは、例えば、参照群として機能する健常な又は罹患した個体の群において観察される発現レベルの平均的パターンである。
本明細書で使用される「調節された(modulated)」若しくは「調節(modulation)」又は「調節された(regulation)」若しくは「調節(regulation)」及び「示差的に調節された(regulated)」という用語は、アップレギュレーション、すなわち、例えば、作動又は増強による活性化又は刺激、及びダウンレギュレーション、すなわち、例えば、拮抗、軽減、又は阻害による阻害又は抑制の両方を指す。
「反応」、「治療の成功」、又は「治療に対する反応」という句は、ネオアジュバント、アジュバント、及び緩和化学療法の設定において、規定された無腫瘍期間又は無再発期間又は無増悪生存期間(例えば、2年、4年、5年、10年)の観察を指す。この無病期間、無再発期間、又は無増悪生存期間は、異なる腫瘍実体によって変動し得るが、ほとんどの再発が現れる平均期間よりも十分に長い。ネオアジュバント及び緩和療法方法論では、アポトーシス及び腫瘍塊の壊死又は血管新生事象の変化による血液供給の減少による腫瘍の縮小及び退縮の測定によって、反応を更にモニタリングすることができる。
「再発」又は「再発性疾患」という用語には、腫瘍の最初の診断及び治療から何年も後に現れ得る遠隔転移、若しくは局所リンパ節への腫瘍細胞の浸潤などの局所事象、又は適切な時間内に同じ部位及び元の器官での腫瘍細胞の発生が含まれる。
「再発の予測」又は「治療の成功の予測」は、本発明において記載される方法を指し、腫瘍標本は、例えば、その遺伝子発現、ゲノム状態、及び/若しくは組織病理学的パラメーター(TNM及びグレードなど)、並びに/又は画像化データについて分析され、参照試料由来の既知のものとの発現パターンの相関に基づいて更に分類される。この分類は、そのような所与の腫瘍が再発を起こし、従って、所与の治療に対して「無反応」の腫瘍とみなされるという記述となり得るか、又は治療後の無病期間が延長された腫瘍として分類されることになり得る。
本明細書で使用される「マーカー遺伝子」という用語は、発現パターンが、悪性新生物又はがん評価における予測、予後、又は診断プロセスの一部として利用され得るか、あるいは、特に悪性新生物及び婦人科がんの治療又は予防に有用な化合物を同定するための方法において使用され得る、差次的に発現する遺伝子を指す。マーカー遺伝子はまた、標的遺伝子の特徴を有し得る。
本明細書で使用される「標的遺伝子」は、標的遺伝子発現レベル又は標的遺伝子産物活性レベルの調節が悪性新生物の症状を改善するように作用し得る様式でがん、例えば、肺がんに関与する、差次的に発現される遺伝子を指す。標的遺伝子はまた、マーカー遺伝子の特徴を有し得る。
本明細書で使用される「受容体」という用語は、神経伝達物質、ホルモン、又は他の物質、特にエストロゲンのようなホルモンなどの特定の分子(リガンド)に結合し、細胞応答を開始する、細胞膜上又は細胞質若しくは細胞核内のタンパク質に関する。受容体タンパク質の挙動におけるリガンド誘発性の変化は、リガンドの生物学的作用を構成する生理学的変化をもたらす。
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞がある種のシグナル又は刺激を別のものに変換する細胞内又は細胞間プロセスに関し、酵素によって行われ、かつ、ホルモン及び成長因子(細胞間)並びにセカンドメッセンジャー(細胞内)を介して関連付けられる規則正しい順序の細胞内及び細胞外の生化学反応をほとんどの場合に伴い、後者は「セカンドメッセンジャー経路」と考えられているものをもたらす。多くのシグナル伝達経路では、これらの事象に関与するタンパク質及び他の分子の数はプロセスが最初の刺激から生じるに従って増加し、「シグナルカスケード」をもたらし、しばしば比較的小さな刺激をもたらしてこれが大きな応答を誘発する。
本明細書で使用される「小分子」という用語は、約5kD未満、最も好ましくは約4kD未満の分子量を有する化合物を指すことを意味する。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、又は他の有機(炭素含有)若しくは無機分子であり得る。多くの製薬会社は、生物活性を調節する化合物を同定するために本発明のアッセイのいずれかでスクリーニングすることができる化学的及び/又は生物学的混合物、しばしば真菌、細菌、又は藻類の抽出物の広範なライブラリーを有する。
一本鎖核酸配列に関して使用される場合、「実質的に相同」という用語は、上記の低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸配列をハイブリダイズすることができる任意のプローブ(すなわち、それは一本鎖核酸配列の相補体である)を指す。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対形成に関して使用される。
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーションベースの方法」という用語は、相補的な一本鎖核酸又はヌクレオチド類似体を組み合わせて単一の二本鎖分子にするプロセスを付与する方法を指す。ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、通常の条件下でそれらの相補体に結合するため、2つの完全に相補的な鎖は互いに容易に結合する。生物分析において、非常に頻繁に標識される一本鎖プローブは、相補的な標的配列を見出すためのものである。そのような配列が試料に存在する場合、プローブは上記の配列にハイブリダイズし、次いで、これを標識によって検出することができる。他のハイブリダイゼーションベースの方法は、マイクロアレイ及び/又はバイオチップ方法を含む。該方法において、プローブは固相に固定化され、次いで、これを試料に曝露する。相補的な核酸が試料に存在する場合、これらはプローブにハイブリダイズし、従って検出することができる。これらの手法は、「アレイベースの方法」としても既知である。更に別のハイブリダイゼーションベースの方法は、以下に記載されるPCRである。発現レベルの決定に関して、ハイブリダイゼーションベースの方法は、例えば、所与の遺伝子のmRNAの量を決定するために使用することができる。
「アレイ」とは、デバイス上のアドレス可能な場所又は「アドレス」の配置を意味する。場所は、2次元配列、3次元配列、又はその他のマトリックス形式で配置することができる。場所の数は、数個から少なくとも数十万個の範囲であり得る。最も重要なことには、各場所は独立した反応部位を表す。アレイには、核酸アレイ、タンパク質アレイ、及び抗体アレイが含まれるが、これらに限定されない。「核酸アレイ」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は遺伝子のより大きな部分などの核酸プローブを含むアレイを指す。アレイ上の核酸は、好ましくは一本鎖である。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」又は「オリゴヌクレオチドチップ」と称される。本明細書における「マイクロアレイ」は、「バイオチップ」又は「生物学的チップ」とも称され、少なくとも約100/cm2、好ましくは少なくとも約1000/cm2の別個の領域の密度を有する領域のアレイである。マイクロアレイ中の領域は、典型的な寸法、例えば、約10~250μmの範囲の直径を有し、アレイ中の他の領域からほぼ同じ距離だけ離れている。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖又は二本鎖リボヌクレオチド、RNA:DNAハイブリッド、及び二本鎖DNAを含むがこれらに限定されない、比較的短いポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖DNAプローブオリゴヌクレオチドである。更に、適用可能な検出方法論の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、PNA及びモルフォリノなどのヌクレオチド類似体を指す。
本明細書で使用される「PCRベースの方法」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む方法を指す。これは、生物を使用せずに、酵素複製によってDNA又はRNAなどの核酸を指数関数的に増幅するための手法である。PCRはインビトロ技術であるので、DNAの形態に制限なく行うことができ、多様な遺伝子操作を行うように大幅に改変することができる。発現レベルの決定に関して、例えば、PCRベースの方法は、(1)逆転写酵素を用いて、完全なmRNAプール(いわゆるトランスクリプトーム)をcDNAに逆転写し、(2)それぞれのプライマーを用いて、所与のcDNAの存在を検出することにより、所与のmRNAの存在を検出するために使用し得る。この手法は、一般に逆転写酵素PCR(rtPCR)として既知である。「PCRベースの方法」という用語は、エンドポイントPCRの適用、及び増幅された標的の関数として蛍光シグナルを放出し、標的のモニタリング及び定量化を可能にする特殊なフルオロフォア又はインターカレーティング色素を適用する動的/リアルタイムPCR技術の両方を含む。定量化方法は、外部標準曲線による絶対的なもの又は比較内部標準に対する相対的なものいずれかであり得る。
「分子の電気化学的検出に基づく方法」という用語は、分子、特にタンパク質、核酸、抗原、抗体などの生体分子が検出可能なシグナルの生成の下で結合する電極システムを利用する方法に関する。そのような方法は、例えば、国際公開第02/42759号(特許文献1)、国際公開第02/41992号(特許文献2)、及び国際公開第02/097413号(特許文献3)に開示され、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。これらの検出器は、例えばシリコンチップの結晶学的表面によって形成される平面を有する基板、及び例えば櫛型電極又は二次元電極アレイの形状を取り得る電気検出器を含む。これらの電極は、標的分子、例えば、標的核酸分子に特異的に結合することができるプローブ分子、例えば、核酸プローブを担持する。プローブ分子は、例えば、チオール-金結合によって固定化される。この目的のために、プローブは、金の表面を含む電極に結合するチオール基でその5’又は3’末端で修飾されている。これらの標的核酸分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)又はアルカリホスファターゼなどの酵素標識を担持し得る。標的分子がプローブに結合した後、基質が添加される(例えば、特にレドックス反応において上記の酵素によって変換されるα-ナフチルホスフェート又は3,3’5,5’-テトラメチルベンジジン)。次いで、上記反応の生成物又は電子交換によって上記反応で生成した電流は、電気検出器を用いて部位特異的な様式で検出することができる。
「核酸分子」という用語は、DNA、cDNA及び/又はゲノムDNA、RNA、好ましくはmRNA、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、及び/又はモルフォリノを含む、任意の一本鎖又は二本鎖核酸及び/又は類似体分子を示すことを意図している。
「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的サブ配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件に関する。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、異なる状況で異なる。より長い配列は、特に高温でハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びpHにおいて特定の配列の熱融点(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度(規定されたイオン強度、pH、及び核酸濃度下で)である。(標的配列は一般に過剰に存在するため、Tmではプローブの50%が平衡状態で占められている)。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.0M未満のNaイオンであり、典型的には、pH7.0~8.3で約0.01~1.0MのNaイオン(又は他の塩)であり、短いプローブ(例えば、10~50ヌクレオチド)の場合には温度が少なくとも約30℃であり、より長いプローブの場合には少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによっても達成し得る。
「核酸分子の断片」という用語は、特許請求の範囲に記載された配列のうちの1つによる核酸分子のサブセットを含む核酸を示すことを意図している。同じことが「核酸分子の断片」という用語にも当てはまる。
「核酸分子のバリアント」という用語は、本明細書では、特許請求の範囲に記載された配列のうちの1つによる核酸分子と構造及び生物学的活性が実質的に同様である核酸分子を指す。
「核酸分子の同族体」という用語は、核酸分子の配列が特許請求の範囲に記載された配列のうちの1つによる核酸分子と比較して、付加、欠失、置換、又はその他では化学的に修飾された1つ以上のヌクレオチドを有する、該核酸分子を指すが、同族体は常に後者と実質的に同じ結合特性を保持していることを常に条件とする。
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、特許請求の範囲に記載された配列のうちの1つによる核酸分子と同様の標的核酸配列との結合特性を有する核酸分子を指す。
本明細書で使用される「ハイブリダイズする相手」という用語は、ストリンジェントな条件下で核酸分子にハイブリダイズすることができる核酸分子を指す。
「アナメシス」という用語は、診断の策定及び患者への医療ケアの提供に有用な情報を入手することを目的として、患者又はその人を知っていて適切な情報を提供することができる他の人々のいずれかに特定の質問をすることにより、医師又は他の医療専門家によって得られる患者データに関する(この場合、ヘテロアナメシスと称される場合もある)。この種の情報は症状と称され、直接検査によって確認される臨床徴候とは対照的である。
「病因」という用語は、疾患の経過、すなわち、その持続期間、その臨床症状、及びその転帰に関連している。
本明細書の本文全体を通して、いくつかの文書が引用されている。本明細書で引用された各文書(すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書などを含む)は、上記又は下記を問わず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「臨床転帰」という用語は、症状の軽減又は改善などの特に治療後の疾患の臨床結果として規定される。いくつかの実施形態では、不良な臨床転帰は、疾患特異的生存期間(DSS)、無再発生存期間(RFS)、無増悪生存期間(PFS)、及び無遠隔再発生存期間の相対的な減少又はそれ以上を含む。がんに関する「再発」という用語は、元の疾患の同じ部位及び器官における腫瘍細胞の再発、がんの最初の診断及び治療から何年も後に現れ得る転移、又は領域リンパ節への腫瘍細胞の浸潤などの局所的事象を含む。「遠隔再発」とは、がん細胞が領域リンパ節を越えて身体の遠隔部分(すなわち別の臓器)に広がった(転移した)シナリオを指す。無再発生存期間は、一般に、無作為化から最初の再発(recurrence)、再発(relapse)、二次がん、又は死亡までの時間として規定される。無増悪生存期間は、特定の日付(一般には治療の初日又は患者が臨床検査に登録された日)から疾患が「進行」した日又は何らかの原因で患者が死亡した日までに経過した時間である。「DSS」及び「CSS」(「がん特異的生存期間」を表す)という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
「(療法的)治療」という用語は、特に本明細書で使用されるがんの治療に関連して、健康状態を改善し、及び/又は患者の寿命を延長する(延ばす)任意の治療に関する。該治療は、がんを排除し、患者における腫瘍のサイズ若しくは数を減らし、患者におけるがんの発生を阻止若しくは遅延させ、患者における新しいがんの発生を抑制若しくは遅延させ、患者における症状の頻度若しくは重症度を低下させ、及び/又は現在がんを有するか若しくは以前にがんを有していた患者における再発を減少させ得る。いくつかの実施形態では、「治療」及び「療法的治療」という用語は、原発腫瘍の外科的除去、化学療法、抗ホルモン療法、放射線療法、及び免疫療法/標的化療法のうちの1つ以上を指すことを意味する。
アジュバント療法は、一次治療、主治療、又は初期治療に加えて行われる治療である。がん治療で使用される手術及び複雑な治療レジメンにより、この用語は主にアジュバントがん治療を説明するために使用されるようになった。アジュバント療法の例は、通常は手術後(術後)に行われる追加治療(化学療法など)であり、すべての検出可能な疾患が取り除かれるが、潜在性疾患による再発の統計的リスクが依然として残る。ネオアジュバント療法は、一次治療、主治療、又は初期治療の前に行われる治療である(例えば、術前化学療法)。
本明細書で使用される「RNA転写物の規定された発現閾値」という用語は、いくつかの試料(この試料の数は、いくつかの対象、特にがんを有する対象から得られる)から計算された平均カットオフ値(簡潔にはカットオフ)を指し得る。閾値を得るために、対象の数は、異なる分子サブタイプの腫瘍を有する対象、例えば、HER2陽性腫瘍を有する対象及び/又はトリプルネガティブ腫瘍を有する対象及び/又はルミナルA腫瘍を有する対象及び/又はルミナルB腫瘍を有する対象を含み得る。閾値は、RNA転写物の量又は濃度を表し得る。いくつかの実施形態では、閾値は、CT(サイクル閾値;定量サイクル、Cqとも称される)値として与えられる(以下を参照)。いくつかの実施形態では、(相対的な)発現レベル及び発現閾値は、40-ΔCT又は40-ΔΔCT値として表される(以下を参照)。
本明細書で使用される「対象」という用語は、脊椎動物などの任意の生物、特に、ヒト及び別の哺乳動物の両方を含む任意の哺乳動物、例えば、齧歯類、ウサギ、サルなどの動物に関する。齧歯類は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、又はチンチラであり得る。好ましくは、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書において「患者」とも称される、疾患、特に、がんを有するか又は有することが疑われる対象である。平均カットオフ値を決定するために、少なくとも2つの対象、好ましくは少なくとも5つ、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1500、又は少なくとも2000の対象が検査される。
好ましい実施形態の説明に戻り、いくつかの実施形態では、カットオフ/閾値は、1つ以上の以前の臨床研究に基づいて規定される。更に、カットオフ/閾値の確立及び検証のために、追加の臨床研究が実施され得る。カットオフ/閾値は、当該技術分野で既知である技術によって決定/規定され得る。本発明に従って使用される遺伝子マーカーを用いて、様々な臨床研究がすでに実施されている。トレーニング検査設定における一致研究は、「発現陽性」又は「発現陰性」での定量的結果の二分方法に関する臨床的カットオフ/閾値の規定及び検証に十分であり得る。
いくつかの実施形態では、カットオフ/閾値は、IHC-ISHなどの臨床病理学的パラメーター並びに/又は分割検査(SAS Software JMP(登録商標)9.0.0など)によるトレーニングコホートにおける全生存期間(OS)、疾患特異的生存期間(DSS)、及び無増悪生存期間(PFS)のデータに基づいて決定/規定される。
いくつかの実施形態では、RNA転写物の発現レベルは、逆転写(RT)定量的PCR(RT-qPCR)によって決定される。RNAはPCRで直接増幅できないため、酵素逆転写酵素を使用して、それをcDNAに逆転写する必要がある。この目的のために、逆転写の反応とPCRによるDNA増幅とを同じ反応において組み合わせたワンステップRT-qPCRを利用することができる。ワンステップRT-qPCRでは、RNA鋳型は、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、プライマー及びプローブ、dNTP、塩、及び界面活性剤を含む反応混合物中で混合される。第1のPCRステップでは、標的RNAは、標的特異的リバースプライマーを使用して、逆転写酵素によって逆転写される。その後、cDNAは、プライマー/プローブ及びDNAポリメラーゼを使用して増幅される。
例えば、蛍光ベースの定量的リアルタイムPCRを使用することができる。蛍光ベースの定量的リアルタイムPCRは、蛍光標識プローブの使用を含む。好ましくは、蛍光標識プローブは、蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる(=二重標識プローブ)。好適な蛍光レポーター及びクエンチャー色素/部分は、当業者に既知であり、レポーター色素/部分である6-FAM(商標)、JOE(商標)、Cy5(登録商標)、Cy3(登録商標)、及びクエンチャー色素/部分であるダブシル、TAMRA(商標)、BHQ(商標)-1、-2、又は3を含むが、これらに限定されない。プローブ特異的産物の増幅は、プローブの切断(=増幅媒介性プローブ置換)を引き起こし、それによってレポーター蛍光の増加をもたらす。反応における蛍光の増加は、標的増幅産物の増加に正比例する。プローブから発生する蛍光を検出するためのLightCycler 480 IIシステム(Roche)、Versant kPCRシステム(Siemens)、Mx3005Pシステム(Agilent Technologies)、又は同等のリアルタイム機器を使用して、蛍光の増加をリアルタイムで測定することができる。分析出力は、各標的のCT値である。CT(サイクル閾値;定量サイクル、Cqとも称される)値はPCR増幅サイクル数によって決定され、その後、プローブの蛍光シグナルが特定のバックグラウンドシグナルを上回り、CT値は、PCR増幅前の試料中の標的分子の量の尺度である。好ましくは、CT値は、適切なソフトウェア(例えば、MicrosoftExcel(商標))又は統計ソフトウェアパッケージ(例えば、SAS JMP(登録商標)9.0.0、GraphPad Prism4、Genedata Expressionist(商標))を使用して更に分析される。CT値は、既知の標的濃度を用いた標準曲線のCT結果に基づいて、絶対標的分子量(例えば、ng/μl又は分子/μl)に変換することができる。あるいは、標的の量は、参照に基づいてx倍減少又は増加した量(=ΔCT)として報告することができる。低いΔCT値(小さな差)は、高いΔCT(大きな差)と比較して、参照に対する標的の量が多いことを示す。固定値(PCRサイクル数など、例えば40)からΔCTを差し引くことにより、ΔCTを再計算するのが好適である。結果は、標的の量と直接相関する値(高い値=高い量)であり、40-ΔCT値として表され、ここで、1つの整数は、標的の量の2倍を指す(例えば、34の値は33の値の2倍の量を示す)。システムの所望の再現性及び精度に依存して、複数の参照アッセイをパネリングするか、又はキャリブレーターのΔCTを使用して試料のΔCTを再計算/正規化することができる(1点校正;Pfaffl(2001),Nucleic Acid Res.,29(9):e45(非特許文献5))。特定のプローブについて異なるフルオロフォアを使用することにより、同じ反応において異なる標的アッセイを多重化することも可能である。PCRの間、多重化における各標的は並行して増幅されるが、異なる蛍光発光を利用して別々に検出される。
いくつかの実施形態では、40-ΔCT値は、以下のように計算される:40-[患者試料のそれぞれのバイオマーカー(例えば、HLA-E、HLA-F、又はHLA-G)のCT-患者試料の参照遺伝子のCT(例えば、CALM2)](=計算方法1)。2つ以上の参照遺伝子を使用する場合、40-ΔCT値は次のように計算される:40-(患者試料のそれぞれのバイオマーカーのCT-患者試料の選択された参照遺伝子の平均CT)(=計算方法2)。あるいは、40-ΔΔCT値を使用することもでき、40-ΔΔCTは次のように計算することができる:ΔΔCT=40-[(CT 患者試料のバイオマーカー-CT 参照試料のバイオマーカー)-(CT 患者試料の参照遺伝子-CT 参照試料の参照遺伝子)](=計算方法3);例えば、40-ΔΔCT=40-[(CT HLA-G 患者試料-CT HLA-G 参照試料)-(CT 患者試料のCALM2-CT 参照試料のCALM2)]。いくつかの実施形態では、CALM2は、参照遺伝子として使用される。
例えば、バイオマーカーの相対的発現レベルは40-ΔΔCT値として与えられ、これは次のように計算される:40-[(CT 患者試料のバイオマーカー-CT 患者試料の参照遺伝子)-(CT 対照試料のバイオマーカー-CT 対照試料の参照遺伝子)](=計算方法4);例えば、40-ΔΔCT=40-[(CT HLA-G 患者試料-CT 平均CombRef 患者試料)-(CT HLA-G 対照試料-CT 平均CombRef対照試料)]。いくつかの実施形態では、CTは、CT中央値である。参照遺伝子のCTは、単一の参照遺伝子のCT又は2つ以上の参照遺伝子の平均CT(平均CombRefと称される)であり得る。好ましくは、同じ対照試料(キャリブレーターとも称される)がすべての分析で使用され、同じRT-qPCR又はqPCR結果をもたらす。いくつかの実施形態では、対照試料は、細胞株RNA、インビトロで転写された人工RNA、或いは一定の比率のバイオマーカーmRNA若しくはcDNA又はバイオマーカーアンプリコン若しくはバイオマーカーアンプリコンの一部を示す、DNAオリゴヌクレオチドの等モル混合物である。いくつかの実施形態では、CALM2及び/又はB2Mは、参照遺伝子として使用され、陽性対照(例えば、インビトロで転写された人工RNA)は、対照試料(キャリブレーター)として使用される。
別の例示的な実施形態では、平均カットオフ値は、計算方法4による40-ΔΔCT値として与えられ、HLA-Gの平均カットオフ値は、40.10の40-ΔΔCT値である。
いくつかの実施形態では、方法のステップ(例えば、ステップ(a)、(b)、(c)、及び(d))は、ランダムな順序で実施される。好ましい実施形態では、ステップ(a)が最初に実施され、すなわち、その後にステップ(b)、(c)、及び(d)が実施される。いくつかの実施形態では、ステップ(d)は、ステップ(a)、(b)、及び(c)の後に実施される。いくつかの実施形態では、ステップ(a)はステップ(b)の前に実施され、ステップ(b)はステップ(c)の前に実施され、ステップ(c)はステップ(d)の前に実施される。
上記で規定されたプローブは、好ましくは、例えば、蛍光標識、蛍光クエンチング標識、発光標識、放射性標識、酵素標識、及びそれらの組み合わせから選択される標識で標識される。好ましくは、上記で規定されたプローブは、蛍光レポーター部分及び蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
本発明の新規性は、膀胱がんにおけるHLAベースのがんバイオマーカーのmRNAベースの決定だけでなく、サブタイプのアルゴリズム算入も含む。
本発明のこれらの新しい態様はすべて、本発明のRT-qPCRベースの手法及びキットの予後値に寄与する。実際、これらの新規性は、特に進行期の患者の分子サブタイプにおいてより正確で意義のあるHLAタイピングを提供し、これは、最終的には、がんのより個別化された治療決定のための予後ツールを提供する。
本発明の範囲を限定すると解釈されない以下の実施例により、本発明を更に例示する。
実施例1:逆転写(RT)定量PCR(RT-qPCR)によるmRNA発現レベルの決定
RNAをホルマリン固定パラフィン包埋組織(=FFPE組織)から分離した。より具体的には、5~10μmのFFPE腫瘍組織巻き状物由来のトータルRNAを、RNXtract(登録商標)抽出キット(BioNTech Diagnostics GmbH、ドイツ・マインツ)を使用して抽出し、参照遺伝子CALM2の断片のリアルタイム蛍光RT-qPCRによって定量化した。一般に、各々の定量化抽出物(約50~100ng)の2.5μl RNAを、以下に説明するようにRT-qPCRによってアッセイした。
RNAをホルマリン固定パラフィン包埋組織(=FFPE組織)から分離した。より具体的には、5~10μmのFFPE腫瘍組織巻き状物由来のトータルRNAを、RNXtract(登録商標)抽出キット(BioNTech Diagnostics GmbH、ドイツ・マインツ)を使用して抽出し、参照遺伝子CALM2の断片のリアルタイム蛍光RT-qPCRによって定量化した。一般に、各々の定量化抽出物(約50~100ng)の2.5μl RNAを、以下に説明するようにRT-qPCRによってアッセイした。
RT-qPCR法による遺伝子発現の詳細な分析のために、関心のある領域に隣接するプライマー及びそれらとの間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。NCBIプライマー設計ツール(www.ncbi.nlm.nih.go)を使用して、標的特異的プライマー及びプローブを選択した。RNA特異的プライマー/プローブ配列を使用して、エクソン/エクソン境界を横切ってプライマー/プローブ配列を位置選定することによってRNA特異的測定を可能にした。更に、既知の多型(SNP)を有する配列領域に結合しないようにプライマー/プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合には、関連するすべてのスプライスバリアントを増幅するようにプライマーを選択した。従来のPCR反応により、すべてのプライマー対の特異性について調べた。
TaqMan(登録商標)検証実験を行い、標的及び対照の増幅の効率がほぼ等しいことが示されたが、これは比較ΔCT法による遺伝子発現の相対的な定量化の前提条件である。生体試料内の関心のある遺伝子の発現分析を行うために、2つの特定のアッセイのそれぞれのプライマー/プローブを混合することによって4つの二重アッセイ混合物を調製した。CT値を別々に検出するために、アッセイプローブを異なる蛍光プローブで修飾した。各4つのアッセイ混合物は、2μMの未修飾のフォワード及びリバースプライマー並びに1.2μMのプローブを含んだ。各反応について、FFPE切片(上記を参照)から抽出した2.5μlのトータルRNAを、96ウェル光学反応プレートの1つのウェル中で、2.5μlのアッセイ混合物、2.5μlの酵素混合物、及び2.5μlの水と混合した。製造元の説明書に従ってVersant kPCR Cycler(Siemens)又はLight Cycler 480(Roche)を使用して、適切な条件(5分50℃、1サイクル:20秒95℃、1サイクル;15秒95℃;1分60℃、40サイクル)で、PCR反応の測定を行った。これまで分類されていない生体試料の測定前に、実験条件の標準化のために、例えば細胞株、健常な対照試料、規定された分子腫瘍サブタイプの試料を用いた対照実験の測定を使用することができる。
実施例2:DNA配列による古典的及び非古典的なHLA遺伝子の比較
ゲノム解析及び配列アラインメントを、UCSCゲノムブラウザー(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)にアクセスし、HLA-A1(NM_002116.7)、HLA-A2(NM_001242758.1)、HLA-G(NM_002127.5)、HLA-F1(NM_001098479.1)、HLA-F2(NM_018950.2)、HLA-F3(NM_001098478.1)、HLA-J(NR_024240.1)のゲノム配列及びHLA-Hの推定配列(NR_001434.4)をダウンロードすることによって行った。最初のアラインメント分析は、潜在的な翻訳開始領域及び細胞外アルファドメインから膜貫通領域への潜在的な移行に焦点を合わせた。HLA-Hは、エクソン4における単一塩基対の欠失がフレームシフトを引き起こし、エクソン4における未成熟終止コドンをもたらすために、偽遺伝子であると考えられている(Chorney et al.,1990.Transcription analysis, physical mapping, and molecular characterization of a non-classical human leukocyte antigen class I gene.Mol.Cell.Biol.10:243-253(非特許文献6)及びZemmour et al.,1990. HLA-AR,an inactivated antigen-presenting locus related to HLA-A.J.Immunol.144:3619-3629(非特許文献7))。変異によるタンパク質コード能力の機能の喪失によって潜在的に規定される偽遺伝子のそのような規定。しかしながら、配列分析により、5’及び3’末端におけるATGの周囲のヌクレオチドがコザック配列の必要不可欠なものに即していることが明らかになった。
ゲノム解析及び配列アラインメントを、UCSCゲノムブラウザー(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)にアクセスし、HLA-A1(NM_002116.7)、HLA-A2(NM_001242758.1)、HLA-G(NM_002127.5)、HLA-F1(NM_001098479.1)、HLA-F2(NM_018950.2)、HLA-F3(NM_001098478.1)、HLA-J(NR_024240.1)のゲノム配列及びHLA-Hの推定配列(NR_001434.4)をダウンロードすることによって行った。最初のアラインメント分析は、潜在的な翻訳開始領域及び細胞外アルファドメインから膜貫通領域への潜在的な移行に焦点を合わせた。HLA-Hは、エクソン4における単一塩基対の欠失がフレームシフトを引き起こし、エクソン4における未成熟終止コドンをもたらすために、偽遺伝子であると考えられている(Chorney et al.,1990.Transcription analysis, physical mapping, and molecular characterization of a non-classical human leukocyte antigen class I gene.Mol.Cell.Biol.10:243-253(非特許文献6)及びZemmour et al.,1990. HLA-AR,an inactivated antigen-presenting locus related to HLA-A.J.Immunol.144:3619-3629(非特許文献7))。変異によるタンパク質コード能力の機能の喪失によって潜在的に規定される偽遺伝子のそのような規定。しかしながら、配列分析により、5’及び3’末端におけるATGの周囲のヌクレオチドがコザック配列の必要不可欠なものに即していることが明らかになった。
図1は、潜在的な翻訳開始部位におけるHLA-A1、HLA-A2、HLA-B、HLA-E、HLA-F1、HLA-F2、HLA-F3、HLA-J、HLA-G、及びHLA-Hの配列アラインメントを示す。潜在的な開始コドンは黒枠で強調表示されている。
図2は、エクソン4からエクソン5への接合部におけるHLA-A1、HLA-A2、HLA-B、HLA-E、HLA-F1、HLA-F2、HLA-F3、HLA-J、HLA-G、及びHLA-Hの配列アラインメントを示す。未成熟終止コドンを有する配列は、黄色の背景で示されている。
上記のように、HLA-Hは、エクソン4の未成熟終止コドンにより、文献では偽遺伝子として規定されている。それらにより、フレーム内シフトを引き起こす配列GAC-CAG-ACC-CA--CAC(赤色で強調表示された単一ヌクレオチドの欠失)が同定された。Chorney et alの配列(図2に黄色の背景で示されている)と比較すると、研究者らは単一の塩基対の欠失(図2に赤色の背景で示されている)を観察できなかった。この観察は、HLA-Hも完全長タンパク質であり、従って偽遺伝子ではないという仮定につながる。更に、研究者らは、アルファ3ドメインをコードするエクソン5における配列を特定した。単一塩基対の欠失はエクソン5の末端における未成熟終止コドンをもたらすであろうが、これはHLA-Hが膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠いていることを意味するであろう。HLA-Gの場合、イントロン5に未成熟終止コドンを有する転写バリアントは可溶性アイソフォームHLA-G5の翻訳を引き起こすことが既知である。従って、HLA-Hは、可溶性HLA-G5の可溶性類縁体であろう。可溶性HLA-G形態は活性タンパク質であり、様々な受容体、例えば、白血球免疫グロブリン様受容体1及び2(LILRB1及びLILRB2)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体2DL4(KIR2DL4)、及びCD8(Rajagopalan,S. and E. Long,KIR2DL4(CD158d):An activation receptor for HLA-G. Frontiers in Immunology,2012.3(258)(非特許文献8)及びCarosella,et al.,Beyond the increasing complexity of the immunomodulatory HLA-G molecule.Blood,2008.111(10):4862-70(非特許文献9))との相互作用によって免疫細胞阻害を引き起こす。
文献は、配列ctc-acg-gcg-tg-の末端にあるエクソン7における第2の単一のヌクレオチドの欠失を指摘している。研究者らは、エクソン8においてこの配列を同定し、該配列は、非翻訳領域をコードし、タンパク質の翻訳とは関連しない。
図3は、エクソン8におけるHLA-A1、HLA-A2、HLA-B、HLA-E、HLA-F1、HLA-F2、HLA-F3、HLA-J、HLA-G、及びHLA-Hの配列アラインメントを示す。未成熟終止コドンを有する配列は、黄色の背景で示されている。
研究者らはまた、第2の偽遺伝子である、HLA-Jのエクソン5における、同様にChorney et alからの想定される単一塩基対の欠失を有する配列GAC-CAG-ACC-CA-を配列アラインメントから同定した。HLA-H及びHLA-Jの配列比較により、これら2つの偽遺伝子は、RNAに関して69%の配列相同性を有し、アミノ酸配列間では20%しか有していないことが明らかになった(表3)。
表4は、HLA-H及びHLAクラスI遺伝子(HLA-A、B、C)、非古典的なHLAクラスI遺伝子(HLA-E、F、及びG)、並びに更なる偽遺伝子(HLA-J、L、V、Y)の間の相同性を纏めたものである。HLA-H RNAは、HLAクラスI遺伝子(HLA-A、B、C)、非古典的なHLAクラスI遺伝子(HLA-E、F、及びG)と77.4%相同であり、22.6%非相同である。タンパク質配列を考慮すると、HLA-Hは古典的及び非古典的なHLAクラスI遺伝子(HLA-A1、A2、B、C、E、F1、F2、F3、G)と27.3%非相同であり、HLA-Jと58.8%非相同である。
実施例3:免疫療法で治療された尿路上皮がんコホートにおける逆転写(RT)定量的PCR(RT-qPCR)によるHLA mRNA発現レベルの決定
膀胱がん及び上部尿路上皮がんを含む、組織学的に確認された尿路上皮がんを有する72人の新たに診断された患者が2016年から2018年の間に研究に登録された。生検試料が不十分であった6人の患者及びリンパ節転移のために5人の患者を除外した後、72人の患者の最初の研究集団を61人に限定した。尿路上皮がん(UC)コホート内では、49人の患者が尿路上皮膀胱がん(UBC)に罹患し、12人の患者が上部尿路上皮がんに罹患していた。承認された説明書に従って、ニボルマブ、ペンプロリズマブ、及びアテゾリズマブをファーストライン、セカンドライン、及びサードライン単剤治療として付与した。
膀胱がん及び上部尿路上皮がんを含む、組織学的に確認された尿路上皮がんを有する72人の新たに診断された患者が2016年から2018年の間に研究に登録された。生検試料が不十分であった6人の患者及びリンパ節転移のために5人の患者を除外した後、72人の患者の最初の研究集団を61人に限定した。尿路上皮がん(UC)コホート内では、49人の患者が尿路上皮膀胱がん(UBC)に罹患し、12人の患者が上部尿路上皮がんに罹患していた。承認された説明書に従って、ニボルマブ、ペンプロリズマブ、及びアテゾリズマブをファーストライン、セカンドライン、及びサードライン単剤治療として付与した。
生存期間分析では、カプラン・マイヤー生存期間推定及びコックス回帰分析のために、疾患特異的生存期間(DSS)を使用した。完全な生存期間データを61人の患者から入手することができた。データ取得終了の時点で、DSSの中央値は4.32ヶ月であった。
HLA遺伝子の発現を評価するための遺伝子特異的TaqManベースのプライマー/プローブセットを使用した。RT-qPCR法による遺伝子発現の詳細な分析のために、関心のある領域に隣接するプライマー及びそれらとの間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。NCBIプライマー設計ツール(www.ncbi.nlm.nih.go)を使用して、標的特異的プライマー及びプローブを選択した。RNA特異的プライマー/プローブ配列を使用して、エクソン/エクソン境界を横切ってプライマー/プローブ配列を位置選定することによってRNA特異的測定を可能にした。更に、既知の多型(SNP)を有する配列領域に結合しないようにプライマー/プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合には、必要に応じて、関連するすべてのスプライスバリアント又は選択されたスプライスバリアントを増幅するようにプライマーを選択した。従来のPCR反応により、すべてのプライマー対の特異性について調べた。プライマー/プローブを更に最適化した後、表5に列挙されているプライマー及びプローブが最良の結果をもたらした。これらのプライマー/プローブは、例えば特異性及び増幅効率の点で、従来技術から既知となっているプライマー/プローブよりも優れている。CALM2が分析した試料において差示的に調節されないため、試料RNAの量を標準化するためにCALM2を参照遺伝子として選択した。治療前生検又は治療後切除物のために、低いRNA含有量を有する(すなわち、CALM2の生CT値が22未満である)試料対を除外した。
TaqMan(登録商標)検証実験を行い、標的及び対照の増幅の効率がほぼ等しいことが示されたが、これは比較ΔCT法による遺伝子発現の相対的な定量化に好ましい。生体試料内の関心のある遺伝子の発現分析を行うために、2つの特定のアッセイのそれぞれのプライマー/プローブを混合することによって4つの二重アッセイ混合物を調製した。CT値を別々に検出するために、アッセイプローブを異なる蛍光プローブで修飾した。各4つのアッセイ混合物は、2μMの未修飾のフォワード及びリバースプライマー並びに1.2μMのプローブを含んだ。各反応について、FFPE切片(上記を参照)から抽出した2.5μlのトータルRNAを、96ウェル光学反応プレートの1つのウェル中で、2.5μlのアッセイ混合物、2.5μlの酵素混合物、及び2.5μlの水と混合した。製造元の説明書に従ってVersant kPCR Cycler(Siemens)又はLight Cycler 480(Roche)を使用して、適切な条件(5分50℃、1サイクル:20秒95℃、1サイクル;15秒95℃;1分60℃、40サイクル)で、PCR反応の測定を行った。
RT-qPCRによるUCコホートにおけるルミナル及び基底サブタイプの決定により、同様の範囲での19~48の40-DCT値の範囲のKRT5及びKRT20 mRNAの広いダイナミックレンジが明らかになった。PD-1及びPD-L1 mRNA発現のダイナミックレンジは、両方のmRNA分析で19~41の範囲である。FGFR遺伝子のダイナミックレンジは、FGFRファミリー内でかなり個別的である。FGFR1のダイナミックレンジは29~37の40-DCT値の範囲であり、FGFR2のダイナミックレンジについては19~39の40-DCT値、FGFR3のダイナミックレンジについては19~43の40-DCT値、及びFGFR4のダイナミックレンジについては19~36の40-DCT値の範囲である。
図4は、筋層浸潤性膀胱がん患者(n=61)におけるFFPE組織のRT-qPCRによって決定された、ルミナル及び基底サブタイプマーカー、チェックポイント標的遺伝子、並びにFGFR1~4の遺伝子発現のデータ分布を示す。
スピアマン相関により、ルミナル尿路上皮がん細胞種(KRT20)内でのFGFR受容体2(p=0.0008)及び3(p=0.0066)の高い有意な共発現が明らかになった。基底様尿路上皮がんの場合、いかなるFGFR遺伝子の有意なアップレギュレーションは観察することができなかった。更に、FGFR2及びFGFR3の発現は、低いPD-1(p=0.02554)及びPD-L1(p=0.0074)のmRNA発現と有意に関連している。しかしながら、チェックポイントマーカーPD-1(p=0.0004)及びPD-L1(p=0.0452)は、基底様尿路上皮がんサブタイプ(KRT5)での高い有意な発現を示した。PD-1及びPD-L1のmRNA発現は両方とも、以前に説明されているように(Eckstein et al.,Oncotarget2018(非特許文献10))、腫瘍組織への免疫細胞の浸潤に関連している。
図5は、筋層浸潤性膀胱がん患者(n=61)由来の組織のRT-qPCRによって決定された、ルミナル及び基底サブタイプマーカー、チェックポイント標的遺伝子、並びにFGFR1~4遺伝子mRNA発現の遺伝子間スピアマン相関を示す。
ルミナル及び基底マーカー、PD-1、PD-L1、並びにFGFRファミリーのmRNA発現分析に加えて、古典的及び非古典的なHLAの発現プロファイルを実施した。
図6は、筋層浸潤性膀胱がん患者(n=61)由来のFFPE組織のRT-qPCRによって決定された、HLA遺伝子mRNA発現の遺伝子間スピアマン相関を示す。
図6に示すように、多様なHLA遺伝子の遺伝子間相関は複雑なパターンを示す。一例として、HLA-J発現は、非古典的なHLA-G又は古典的なHLA-A若しくはHLA-B/C遺伝子発現と中程度にしか相関しておらず、スピアマン相関係数はそれぞれ0.34.016、及び0.27の範囲である。同様に、HLA-Hエクソン1/2アッセイによって例示される他の偽遺伝子HLA-Hは、古典的及び非古典的なHLA、例えば、HLA-G、HLA-A、HLA-B/C、HLA-Jとわずか又は中程度にしか相関していない(r=0.23993、r=0.2376、r=0.3373、r=0,1550)。重要なことに、他のHLA遺伝子断片と比較した場合、HLA-Hエクソン1/2対HLA-Hエクソン2/3などの1つのHLAの相関係数にはかなりの違いがある。これは、臨床的関連性の遺伝子内及び遺伝子間相互作用をもたらす差示的なスプライシング事象を意味する。
免疫療法を受けているがん患者の疾患特異的生存期間に影響を与えるHLA遺伝子発現の遺伝子間及び遺伝子内相互作用の一例として、HLA-Aと組み合わせたHLA-GのmRNA発現を分析した。エクソン7での翻訳停止後にHLA遺伝子の比較的異種の部分における特有の領域を決定する非常に特異的なアッセイにより、両方の遺伝子を決定した。
図7は、RT-qPCRアッセイによって定量化された、HLA-Aエクソン8、HLA-Gエクソン8、及びHLA-Gエクソン5 mRNA発現を組み合わせることによる層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者(n=61)のFFPE組織の疾患特異的生存期間(DSS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。腫瘍が低いHLA-Gエクソン8 mRNA(<28.43)発現及び低いHLA-Gエクソン5 mRNA(<37.11)発現を示した患者は、最も良い生存期間を示した(灰色、実線)。腫瘍が低いHLA-Gエクソン8 mRNA(<28.43)発現を示したが、高いHLA-Gエクソン5 mRNA(>37.11)発現を示した患者は、2番目に悪い生存期間を示した(灰色、点線)。腫瘍が高いHLA-Gエクソン8 mRNA(>28.43)発現及び高いHLA-Aエクソン8 mRNA(>35.26)発現を示した患者は、2番目に良い生存期間を示した(黒色、点線)。腫瘍が高いHLA-Gエクソン8 mRNA(>28.43)発現を示したが、低いHLA-Aエクソン8 mRNA(<35.26)発現を示した患者は、最も悪い生存生存期間を示した(黒色、実線)。
図7に示すように、先行する化学療法がうまくいかなかった後に免疫腫瘍薬で治療した尿路上皮がん患者は、HLA-Gエクソン8を発現しているがHLA-Aエクソン8を発現していない場合に最も悪い生存期間を有する(青色の曲線と金色の曲線とを比較)。これらのデータは、患者が免疫腫瘍学(「IO」)治療を受けている場合、古典的なHLAの存在が非古典的なHLAの別段で致命的な発現を補い得ることを示している。これはまた、チェックポイント阻害を標的化する免疫調節薬(抗PD1/抗PDL1など)が、少なくとも部分的に無傷の古典的なHLA機能を有する腫瘍においてより効率的であると思われることを示している。更に、これらのデータは、免疫療法の有効性を最大化し、かつ、化学療法と免疫療法との組み合わせに関連する潜在的な危険のリスクを低減するための前提条件である、個々のHLA領域の予後値を特定するための2つ以上のHLA遺伝子の決定の組み合わせの優位性を実証している。
図8は、RT-qPCRアッセイによって定量化された、HLA-Aエクソン8及びHLA-Gエクソン8 mRNA発現の遺伝子間組み合わせによる層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者(n=61)のFFPE組織の疾患特異的生存期間(DSS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。腫瘍が高いHLA-Gエクソン8 mRNA(>28.43)発現及び高いHLA-Aエクソン8 mRNA(>35.26)発現を示した患者は、第2番目に良好な生存期間を示した(黒色、点線)。腫瘍が高いHLA-Gエクソン8 mRNA(>28.43)発現を示したが、低いHLA-Aエクソン8 mRNA(<35.26)発現を示した患者は、最も悪い生存期間を示した(黒色、実線)。
図9は、RT-qPCRアッセイによって定量化された、HLA-Gエクソン8及びエクソン5 mRNA発現の遺伝子内組み合わせによる層別化に基づく、筋層浸潤性膀胱がん患者(n=61)のFFPE組織の疾患特異的生存期間(DSS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。腫瘍が低いHLA-Gエクソン8mRNA(<28.43)発現及び低いHLA-Gエクソン5 mRNA(<37.11)発現を示した患者は、最も良い生存期間を示した(灰色、実線)。腫瘍が低いHLA-Gエクソン8 mRNA(<28.43)発現を示したが、高いHLA-Gエクソン5 mRNA(>37.11)発現を示した患者は、より悪い生存期間を示した(灰色、点線)。
免疫療法を受けているがん患者の疾患特異的生存に影響を与えるHLA遺伝子発現の遺伝子内相互作用の例として、RT-qPCRにより、HLA-Gエクソン8及びHLA-Gエクソン5のHLA-G発現を分析した。HLA-Gエクソン8を決定することにより、遺伝子の3’末端における未翻訳のエクソン(C末端の後、細胞質タンパク質末端を定量化する。これにより、例えば多様な細胞外アルファドメイン及び/又は膜貫通領域並びに細胞質部分を含むか又は除外し得る多数のHLA-Gスプライスバリアントの特有の決定が可能になる。この種のHLA-G決定は、タンパク質レベルで抗体によっては不可能であり、非常に特異的なHLA-G評価を表す。アルファ3ドメインに似ているHLA-Gエクソン5の発現に関連する多数のHLA-Gスプライスバリアント発現を設定した場合、2つのHLA-G mRNA断片の組み合わせを定量化することにより、免疫腫瘍治療(「IO」)の開始から死亡までの時間を考慮する場合の優れた又は劣った疾患特異的生存期間を有する患者の異なる予後サブグループを区別できることが明らかになる。HLA-Gエクソン8を含むスプライスバリアントの発現が低いが、同時にHLA-Gエクソン5を含む断片のレベルが高い患者は、進行した化学療法難治性の状況では、IO治療を開始したにもかかわらず、疾患特異的死亡のリスクがより高くなる。
組み合わせHLA診断の優位性を証明するために、単一の遺伝子の決定の予後値を比較した。図10に示すように、HLA-Gエクソン8のみの決定もまた、一般的な予後値のものである(p=0.0359)。しかしながら、図7に示すように、HLA-Aエクソン8の高発現を同時に示す高い単一遺伝子HLA-Gエクソン8 mRNA発現の「予後不良」群には多数の患者がいる(n=20人はHLA-Aエクソン8発現が高いため低リスクである、n=33人は高いHLA-Gエクソン8 mRNA発現に基づいて「高リスク」である)。従って、「予後不良」群における患者のほぼ2/3は、HLA遺伝子の組み合わせの診断のためのより正確な組織診断を行う場合に追加の治療を省くことができる。
図10は、RT-qPCRアッセイによって定量化された、HLA-Gエクソン8及びエクソン5 mRNA発現のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者(n=61)のFFPE組織の疾患特異的生存(DSS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。腫瘍が高いHLA-Gエクソン8 mRNA(>28.43)発現及び高いHLA-Aエクソン8 mRNA(<28.43)発現を示した患者は、良好な生存期間を示した(灰色、点線)。腫瘍が高いHLA-Gエクソン8 mRNA(>28.43)を示した患者は、より悪い生存期間を示した(黒色、実線)。
実施例4:ネオアジュバント療法で治療された卵巣がん患者コホートにおける逆転写(RT)定量的PCR(RT-qPCR)によるHLAセンス及びHLAアンチセンスmRNA発現レベルの決定
更に、本発明者らは、2つ以上のHLA群遺伝子配列の組み合わせ使用が、婦人科がん、特に卵巣がんなどの膀胱がん以外の他の種類の腫瘍にも適用可能であるかどうかを決定した。更に、本発明者らは、HLA群遺伝子とHLA群アンチセンス発現との組み合わせ使用を、がんの転帰を予測するために決定することができるかどうかを決定した。更に、研究者らは、HLAセンス及びアンチセンスの組み合わせを使用して、化学療法及び/又はホルモン療法などの免疫腫瘍治療以外の治療レジメンに対する反応/非反応を予測することができるかどうかを評価した。
更に、本発明者らは、2つ以上のHLA群遺伝子配列の組み合わせ使用が、婦人科がん、特に卵巣がんなどの膀胱がん以外の他の種類の腫瘍にも適用可能であるかどうかを決定した。更に、本発明者らは、HLA群遺伝子とHLA群アンチセンス発現との組み合わせ使用を、がんの転帰を予測するために決定することができるかどうかを決定した。更に、研究者らは、HLAセンス及びアンチセンスの組み合わせを使用して、化学療法及び/又はホルモン療法などの免疫腫瘍治療以外の治療レジメンに対する反応/非反応を予測することができるかどうかを評価した。
最適な先行手術及びネオアジュバント化学療法の候補に好適ではない組織学的に確認されたFIGOステージIII~IVの上皮卵巣がん又は腹膜がんを有する45人の新たに診断された患者(上記がんは、以下、卵巣がんとも称される)が、2004年9月から2007年12月の間に研究に登録された。他の含入基準は、18歳超の年齢、白金系の化学療法に適した血液学的、腎臓、肝臓、及び心臓の機能であった。除外基準は、70%未満のカルノフスキーパフォーマンスステータス(KPS)、他の悪性腫瘍の病歴、及び手術の禁忌であった。最適な縮小手術の可能性は、開腹腹腔鏡検査によってベースラインで除外した。生検試料がマイクロアレイ分析に十分でなかった9人の患者及び組織学的修正後の腹膜中皮腫の診断のために不適格であることが見出された1人の患者を除外した後、45人の患者の最初の研究集団を35人に制限した。カルボプラチンAUC5及びパクリタキセル175mg/m2 Q3の標準的なレジメンを、3週間ごとに3時間にわたり、6サイクルのネオアジュバント治療として投与した。75歳以上の3人の患者及びパフォーマンスステータスの悪い1人の患者(KPS 70%)では、併用化学療法よりも単剤のカルボプラチンが好ましいものであった。
手術後、手術試料分析を用いて組織病理学的反応を評価した。現在まで、卵巣がんにおけるネオアジュバント化学療法後の治療反応を説明するための組織病理学的基準は確固たるものとして確立されていない。卵巣がん(Le et al. 2007(非特許文献11),Sassen et al.2007(非特許文献12))及び乳がん(Ogston et al.2003(非特許文献13))における一次化学療法への反応に関する文献に従い、手術標本におけるがん細胞の不存在を病理学的完全効奏とみなし、小さなクラスター(<1cm)又は個々のがん細胞のみの残留、及び手術後に肉眼で見える残存がないことを非常に良好な部分寛解とみなす。病理学的部分寛解は、手術時の腫瘍量の減少が30%~90%であると規定され、安定した疾患は、最初の診断の腹腔鏡検査と比較して、腫瘍量の減少がないか、又は手術時の減少が30%未満であると規定された。完全寛解及び非常に良好な部分的寛解を有する患者のみを病理学的反応者とみなし、他のすべての症例を病理学的非反応者とみなした。生存分析のために、最初の診断から進行(PFS)若しくは死亡(OS)までの時間、又は進行と死亡との間の時間(PDT)を、カプラン・マイヤー生存期間推定及びコックス回帰分析に使用した。完全な生存期間データを40人の患者から入手することができた。データ取得終了の時点で、PFSの中央値は14.7ヶ月であり、OSの中央値は33.5ヶ月であったが、これは検査開始時における疾患の非常に進行したステージ(切除不能なFIGO III~IV)を考えると高い。
mRNA検出のために、収集した組織を急速凍結し、分析まで液体窒素中で保存した。約20~100mgの凍結した卵巣腫瘍組織を液体窒素中で粉砕した。市販のキット(Qiagen)を使用してRNAを抽出し、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies,Palo Alto,米国・カリフォルニア州)を使用してRNAの完全性を評価し、Invitrogenキット(Invitrogen Corp.)を使用してcDNAを1mgのトータルRNAから合成し、他で説明されているように(Ihnen et al,2008(非特許文献14))、Affymetrix HG-U133Aマイクロアレイ(Affymetrix Inc.,米国・カリフォルニア州サンタクララ)で分析した。
検証の目的で、RT-qPCRを上記の同一の新鮮な組織生検から単離されたトータルRNAに適用し、独立した技術的手法によってアレイデータを検証した。HLA-F又はHLA-FASの発現を評価するための遺伝子特異的TaqManベースのプライマー/プローブセットを使用した。RT-qPCR法による遺伝子発現の詳細な分析のために、関心のある領域に隣接するプライマー及びそれらとの間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。NCBIプライマー設計ツール(www.ncbi.nlm.nih.go)を使用して、標的特異的プライマー及びプローブを選択した。RNA特異的プライマー/プローブ配列を使用して、エクソン/エクソン境界を横切ってプライマー/プローブ配列を位置選定することによってRNA特異的測定を可能にした。更に、既知の多型(SNP)を有する配列領域に結合しないようにプライマー/プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合には、必要に応じて、すべての関連する又は選択されたスプライスバリアントを増幅するようにプライマーを選択した。従来のPCR反応により、すべてのプライマー対の特異性について調べた。プライマー/プローブを更に最適化した後、表6に列挙されているプライマー及びプローブが最良の結果をもたらした。これらのプライマー/プローブは、例えば、特異性及び増幅効率の点で、従来技術から既知であるプライマー/プローブよりも優れている。CALM2が分析した試料において差示的に調節されないため、試料RNAの量を標準化するためにCALM2を参照遺伝子として選択した。治療前生検又は治療後切除物のために、低いRNA含有量を有する(すなわち、CALM2の生CT値が22未満である)試料対を除外した。
TaqMan(登録商標)検証実験を行い、標的及び対照の増幅の効率がほぼ等しいことが示されたが、これは比較ΔCT法による遺伝子発現の相対的な定量化に好ましい。生体試料内の関心のある遺伝子の発現分析を行うために、2つの特定のアッセイのそれぞれのプライマー/プローブを混合することによって4つの二重アッセイ混合物を調製した。CT値を別々に検出するために、アッセイプローブを異なる蛍光プローブで修飾した。各4つのアッセイ混合物は、2μMの未修飾のフォワード及びリバースプライマー並びに1.2μMのプローブを含んだ。各反応について、FFPE切片(上記を参照)から抽出した2.5μlのトータルRNAを、96ウェル光学反応プレートの1つのウェル中で、2.5μlのアッセイ混合物、2.5μlの酵素混合物、及び2.5μlの水と混合した。製造元の説明書に従ってVersant kPCR Cycler(Siemens)又はLight Cycler 480(Roche)を使用して、適切な条件(5分50℃、1サイクル:20秒95℃、1サイクル;15秒95℃;1分60℃、40サイクル)で、PCR反応の測定を行った。
図11は、RT-qPCRによって決定された、HLA-Fアイソフォームの相対的mRNA発現(40-DCT)及びアンチセンスHLA-F発現のデータ分布を示す。これは、HLA-Fで例示されているように、HLA遺伝子の規定されたセンス及びアンチセンス領域の相対的なmRNA発現レベルを示す。3つの既知のHLA-FアイソフォームHLA-F1、HLA-F2、HLA-F3、及びHLAアンチセンスアイソフォームAS1及びAS2のエクソンを、核酸抽出物のDNAse消化後にRT-qPCRによって決定した。興味深いことに、異なるHLA-F AS領域の発現レベルは著しく異なり、HLA-F AS1 エクソン6の発現は最も高く、ネオアジュバント化学療法前の40-DCT中央値が37.88であった。更に、アイソフォーム比較のサブトラクティブ分析により、卵巣がん試料の治療前生検において、HLA-F2及びHLA-F3の特に高い発現が明らかになった。
HLA-Fの発現を、以前に発表された(Zamagni et al. Oestrogen receptor 1 mRNA is a prognostic factor in ovarian cancer patients treated with neo-adjuvant chemotherapy:determination by array and kinetic PCR in fresh tissue biopsies. ERC 2009(非特許文献15))ホルモン依存性ルミナル及びホルモン非依存性卵巣がんへの分子サブタイピングの文脈で設定した。この目的のために、ESR1、HLA-F3、及びHLA_F AS1エクソン6のmRNA発現を、決定木モデル、遺伝子比、及び線形結合を構築することによって組み合わせた。
図12は、RT-qPCRによって決定されたESR1、HLA-F3、及びHLA-F AS1発現の相対的mRNA発現(40-DCT)のデータ分布を示す。
HLA-F3は、抗原提示のためのタンパク質溝を提示するペプチドを形成するための細胞外アルファ1及びアルファ2ドメインを有するが、T細胞又はナチュラルキラー細胞の活性化などの免疫細胞との相互作用のためのアルファ3ドメインを欠いている、非古典的なMHCI分子である。HLA-Fアイソフォームのすべての既知のアイソフォームと同様に、HLA-F3も膜貫通ドメインを含み、従って免疫細胞相互作用のために細胞表面に存在すると考えられている。
HLA-F3 mRNA発現の予測値を、エンドポイントとしての無増悪生存期間の分割検査によって検査した。
図13は、無増悪生存期間を予測するためにRT-qPCRによって決定された、ネオアジュバントで治療した卵巣がん患者の治療前生検試料におけるHLA-F3 mRNA発現の分割検査を示す。
図13に示すように、治療前HLA-F3(DCT 34.94)の発現中央値に近いカットオフにより、ネオアジュバント卵巣がんコホートを、HLA-F3の低発現時における延長された生存期間(1392日の無増悪生存期間)対短縮された生存期間(400日の無増悪生存期間)に関連する、著しく異なる生存期間中央値及び高いHLA-F3の発現を有する2つの同じサイズの群に分けた。
図14は、進行性卵巣がん患者(n=27)の新鮮な組織のRT-qPCRアッセイによって定量化された、HLA-F3のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく無増悪生存期間(PFS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。腫瘍が高いHLA-F3 mRNA発現(>=34.94)を示した患者は、良好な生存期間を示した(黒色、実線)。腫瘍が低いHLA-F3 mRNA発現(<34.94)を示した患者は、より悪い生存期間を示した(黒色、破線)。
カプラン・マイヤー分析により、HLA-F3 mRNA発現によって生存を予測することの有意性が証明された。図14に示すように、原発性卵巣がん組織において高いHLA-F3 mRNA発現を示した患者では、無増悪生存期間の中央値が28.5ヶ月であったが、HLA-F3 mRNA発現が低い患者では、無増悪生存期間の中央値が12.5ヶ月であった。
同様に、カプラン・マイヤー法による全生存期間分析により、HLA-F3 mRNAに基づいて層別化した場合に有意な生存期間差異が明らかになった。図14に示すように、原発性卵巣がん組織において高いHLA-F3 mRNA発現を示した患者は52.5ヶ月の全生存期間中央値を示したが、HLA-F3 mRNAの発現が低い患者は22.9ヶ月の全生存期間中央値を示した。
図15は、進行性卵巣がん患者(n=27)の新鮮な組織のRT-qPCRアッセイによって定量化された、HLA-F3のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく全生存期間(OS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。腫瘍が高いHLA-F3 mRNA発現(>=34.94)を示した患者は、良好な生存期間を示した(黒色、実線)。腫瘍が低いHLA-F3 mRNA発現(<34.94)を示した患者は、より悪い生存期間を示した(黒色、破線)。
グレード、FIGOステージ、及び原発部位(卵巣対腹膜)などの臨床パラメーターについて調整する際に、高及び低mRNA発現へのmRNA層別化は、6.14(p=0.0132)のL-R Chi2値及び0.22のハザード比で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、すべての他の臨床的要因は有意ではなかった。
図15は、グレード、FIGOステージ、原発部位、HLA-F3 mRNA発現などのcox比例ハザードモデルを使用したPFSの多変量分析に基づいている。グレード、FIGOステージ、及び原発部位(卵巣対腹膜)などの臨床パラメーターについて全生存期間の予測を調整する際に、高及び低mRNA発現へのmRNA層別化は、3.19のL-R Chi2値(p=0.0441)及び0.31のハザード比で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままだったが、すべての他の臨床的要因は有意ではなかった。
図16は、グレード、FIGOステージ、原発部位、及びHLA-F3 mRNA発現を含むcox比例ハザードモデルを使用したOSの多変量分析を示す。
次のステップとして、ESR1 mRNAレベルをホルモン依存性及びホルモン非依存性の卵巣がんへと区別することにより、HLA-F3の発現を分子サブタイプの文脈で設定する。37.75である場合の40-DCT値を使用したESR1 mRNA層別化は、卵巣がんのうちの37%がERS1陰性であり、かつ、約15.72ヶ月の無増悪生存期間の中央値を有しており、これらを、36.47ヶ月の無増悪生存期間の中央値を有する、全ての卵巣がん患者のうちの63%を占めるESR1陽性卵巣がんから区別した(図17)。
図17は、無増悪生存期間を予測するためにRT-qPCRによって決定された、ネオアジュバント療法で治療した卵巣がん患者の治療前生検試料におけるESR1及びHLA-F3 mRNA発現の分割検査を示す。
図18は、進行性卵巣がん患者(n=27)の新鮮な組織のRT-qPCRアッセイによって定量化された、層別化ESR1及びHLA-F3 mRNA発現に基づく無増悪生存期間(PFS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。腫瘍が高いESR1 mRNA発現(>=37.75)及び高いHLA-F3 mRNA発現(>=34.94)を示した患者は、良好な生存期間を示した(黒色、実線)。腫瘍が高いESR1 mRNA発現(>=37.75)及び低いHLA-F3 mRNA発現(<34.94)を示した患者は、より悪い生存期間を示した(黒色、破線)。ESR1 mRNAの発現が低い(<37.75)患者はまた、予後不良を示した(灰色、実線)。
カプラン・マイヤー分析により、ESR1及びHLA-F3 mRNA発現を組み合わせることによって無増悪生存期間を予測することの有意性が証明された。図18に示すように、原発性卵巣がん組織において高いESR1及び高いHLA-F3 mRNA発現を示した患者では、無増悪生存期間の中央値が38.7ヶ月であったが、ESR1 mRNA発現が高く、かつ、HLA-F3 mRNA発現が低い患者では、11.6ヶ月の短縮した無増悪生存期間の中央値であった。ESR1 mRNAの発現が低い患者は、同様の予後不良を示した。
更に、カプラン・マイヤー分析により、ESR1及びHLA-F3 mRNA発現を組み合わせることによって全生存期間を予測することの有意性が証明された。図18に示すように、原発性卵巣がん組織において高いESR1及び高いHLA-F3 mRNA発現を示した患者では、全生存期間の中央値が38.7ヶ月であったが、ESR1 mRNA発現が高く、かつ、HLA-F3 mRNA発現が低い患者では、11.6ヶ月の短縮した無増悪生存期間の中央値であった。ESR1 mRNAの発現が低い患者は、同様の予後不良を示した。
図19は、進行性卵巣がん患者(n=27)の新鮮な組織のRT-qPCRアッセイによって定量化された、層別化ESR1及びHLA-F3 mRNA発現に基づく全生存期間(OS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。腫瘍が高いESR1 mRNA発現(>=37.75)及び高いHLA-F3 mRNA発現(>=34.94)を示した患者は、良好な生存期間を示した(黒色、実線)。腫瘍が高いESR1 mRNA発現(>=37.75)及び低いHLA-F3 mRNA発現(<34.94)を示した患者は、より悪い生存期間を示した(黒色、破線)。ESR1 mRNAの発現が低い(<37.75)患者はまた、予後不良を示した(灰色、実線)。
グレード、FIGOステージ、及び原発部位(卵巣対腹膜)などの臨床パラメーターについて調整する際に、ESR1及びHLA-F3 mRNA発現に基づく組み合わせmRNA層別化は、9.53のL-R Chi2値(p=0.0095)で無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、他のすべての臨床的要因は有意ではなかった。高いESR1及び高いHLA-F3 mRNA発現のハザード比は、高いESR1及び低いHLA-F3又は低いESR1と比較した場合に0.097及び0.152のハザード比に達した(それぞれp=0.0042及びp=0.0136)。
図20は、グレード、FIGOステージ、原発部位、並びにESR1及びHLA-F3 mRNA発現の組み合わせを含むcox比例ハザードモデルを使用したPFSの多変量分析を示す。
更に、全生存期間を分析し、臨床パラメーターであるグレード、FIGOステージ、及び原発部位(卵巣と腹膜)について調整する際に、ESR1及びHLA-F3 mRNA発現に基づく組み合わせmRNA層別化は、6.53(p=0.0383)のL-R Chi2値で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、他のすべての臨床的要因は有意ではなかった。高いESR1及び高いHLA-F3 mRNA発現のハザード比は、高いESR1及び低いHLA-F3又は低いESR1と比較した場合に0.184及び0.230のハザード比に達した(それぞれp=0.0832及びp=0.0182)。
図21は、グレード、FIGOステージ、原発部位、並びにESR1及びHLA-F3のmRNA発現の組み合わせを含むcox比例ハザードモデルを使用したOSの多変量分析を示す。
上記のデータ分析では、40-DCT値として表される正規化された発現レベルを得るために、ハウスキーピング遺伝子に対する個々のHLA-F3 mRNAレベルの調整が必要である。興味深いことに、HLA-F3のゲノム遺伝子座は、リバース鎖のエクソン8の3 ’ゲノム位置において、HLA-F3 mRNAの遺伝子発現調節及びタンパク質翻訳に重要であり得るHLA-F3 ASと称されるアンチセンス遺伝子を含む。推定アンチセンス転写物の関連性を調べて、ハウスキーパーの正規化の必要性を取り除くために、HLA-F3とHLA-FAS1との遺伝子比を調べた。
図22は、進行性卵巣がん患者(n=27)の新鮮な組織のRT-qPCRアッセイによって定量化された、層別化HLA-F3及びHLA-F AS1 mRNA発現に基づく全生存期間(OS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。相対的なmRNA発現の代わりに、ハウスキーパー決定のない遺伝子比を、参照遺伝子としてCALM2を使用する40-DCT法によって決定する。腫瘍が高いHLAF遺伝子比発現(>=2.35)を示した患者は、良好な生存期間を示した(黒色、実線)。腫瘍が低い遺伝子比(<2.35)を示した患者は、より悪い生存期間を示した(黒色、破線)
図22に示すように、カプラン・マイヤー分析により、HLA-F3及びHLA-F AS1 mRNA発現を組み合わせることによって無増悪生存期間を予測することの有意性が証明された。原発性卵巣がん組織において高いHLA-F3 mRNA発現と同時に低レベルのHLA-FAS1 mRNA発現を示す患者では、無増悪生存期間の中央値が38.7ヶ月であったが(遺伝子比>=2.35)、HLA-F3 mRNA発現が低く、かつ、HLA-FAS1 mRNA発現が高い(遺伝子比<2.35)患者は、12.6ヶ月の短縮した無増悪生存期間の中央値を示した。
図23は、進行性卵巣がん患者(n=27)の新鮮な組織のRT-qPCRアッセイによって定量化された、層別化HLA-F3及びHLA-F AS1 mRNA発現に基づく全生存期間(OS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。相対的なmRNA発現の代わりに、ハウスキーパー決定のない遺伝子比を、参照遺伝子としてCALM2を使用する40-DCT法によって決定する。腫瘍が高いHLAF遺伝子比発現(>=2.35)を示した患者は、良好な生存期間を示した(黒色、実線)。腫瘍が低い遺伝子比(<2.35)を示した患者は、より悪い生存期間を示した(黒色、破線)。
カプラン・マイヤー分析により、遺伝子比によって計算されるようにHLA-F3及びHLA-FAS1の組み合わせによって全生存期間を予測することの有意性も証明された。図23に示すように、原発性卵巣がん組織において高いHLA-F遺伝子比(>=2.35)発現を示す患者では、全生存期間の中央値が61.5ヶ月であったが、ESR1 mRNAの発現が高く、かつ、HLA-F3 mRNAの発現が低い患者は、23.1ヶ月の短縮した無増悪生存期間の中央値を示した。
グレード、FIGOステージ、及び原発部位(卵巣対腹膜)を含む臨床パラメーターについて調整する際に、ESR1及びHLA-F3 mRNA発現に基づく組み合わせmRNA層別化は、4.71のL-R Chi2値(p=0.0301)で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、原発部位を除く他のすべての臨床的要因は有意ではなかった(p=0.0479)。高いHLAF3及び低いHLA-FAS1 mRNA発現のハザード比は、0.2866のハザード比に達した(p=0.0301)。
図24は、グレード、FIGOステージ、原発部位、並びにHLA-F3及びHLA-FAS1の組み合わせを含むcox比例ハザードモデルを使用したPFSの多変量分析を示す。
更に、全生存期間を分析し、臨床パラメーターのグレード、FIGOステージ、及び原発部位(卵巣と腹膜)について調整する際に、HLA-F3及びHLA-F AS1 mRNA発現に基づく組み合わせmRNA層別化は、8.41(p=0.0037)のL-R Chi2値で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、他のすべての臨床的要因は有意ではなかった。高いHLA-F3/低いHLA-FAS1対低いHLA-F3/高いHLA-FAS1のハザード比は、0.189のハザード比に達した(p=0.0037)。
図25は、グレード、FIGOステージ、原発部位、並びにHLA-F3及びHLA-F AS1の組み合わせを含むcox比例ハザードモデルを使用したOSの多変量分析を示す。
実施例5:進行性の化学療法難治性尿路上皮がんにおけるHLAプロファイリング
化学療法に難治性であり、その後にPD-1及びPD-L1チェックポイント阻害薬(すなわち、アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブ)によるファーストライン又はセカンドライン免疫腫瘍学(「IO」)治療を受けた原発腫瘍由来のTUR生検及び膀胱切除試料をHLA発現について分析し、組織病理学的及び分子的パラメーター並びにIO治療への反応及びIO後の疾患特異的生存期間に関連させる。
化学療法に難治性であり、その後にPD-1及びPD-L1チェックポイント阻害薬(すなわち、アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブ)によるファーストライン又はセカンドライン免疫腫瘍学(「IO」)治療を受けた原発腫瘍由来のTUR生検及び膀胱切除試料をHLA発現について分析し、組織病理学的及び分子的パラメーター並びにIO治療への反応及びIO後の疾患特異的生存期間に関連させる。
膀胱がん及び上部尿路上皮がんを含む組織学的に確認された尿路上皮がんを有する72人の新たに診断された患者が2016年から2018年の間に研究に登録された。ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びアテズマブを、承認された説明書に従って、ファーストライン、セカンドライン、及びサードラインの単剤治療として投与した。コホートの試料由来のすべてのヘマトキシリン-エオシン(HE)染色腫瘍組織切片を、UICCのTNM分類(2017)に従って、2人の尿路病理学者によって評価及び分類した。世界保健機関(WHO2016)の泌尿生殖器腫瘍の分類に従って、希少な組織学的バリアントを分類した。中心の組織病理学的検討の後、腫瘍材料が十分でないか又は尿路上皮がんではないために18個の組織を除外した。5人の患者からはリンパ節組織のみが利用可能であり、従ってHLA遺伝子発現の予後及び/又は予測効果の一次分析から除外した(図26;コンソート図を参照)。
図26は、進行性又は転移性尿路上皮がんコホートのコンソート図を示す。不十分であるFFPEブロック及び/又はリンパ節組織を除外した後、55人の患者の組織を分析のために入手した。
mRNA検出のために、市販のキット(Xtract、Stratifyer)を使用して、TUR生検、膀胱切除、及び対応するマッピング膀胱組織由来のFFPE組織からRNAを抽出した。各反応について、FFPE切片から抽出した2.5μlのトータルRNAを、96ウェル光学反応プレートの1つのウェル中で、2.5μlのアッセイ混合物、2.5μlの酵素混合物、及び2.5μlの水と混合した。製造元の説明書に従ってVersant kPCR Cycler(Siemens)又はLight Cycler 480(Roche)を使用して、適切な条件(5分50℃、1サイクル;20秒95℃、1サイクル;15秒95℃;1分60℃、40サイクル)で、PCR反応の測定を行った。相対的なmRNA発現は、個々の部位で評価されたRECIST基準に基づいて決定されたIO治療への反応、及びIO治療の開始からがん特異的死亡までで決定された疾患特異的生存期間と関連していた。生物統計学JMPSAS 9.0.0(SAS,Cary,米国・ノースカロライナ)を使用した分割検査を行って、IO治療に反応した可能性のある差異を評価した。
RT-qPCR法による遺伝子発現の詳細な分析のために、関心のある領域に隣接するプライマー及びそれらとの間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。NCBIプライマー設計ツール(www.ncbi.nlm.nih.go)を使用して、標的特異的プライマー及びプローブを選択した。RNA特異的プライマー/プローブ配列を使用して、エクソン/エクソン境界を横切ってプライマー/プローブ配列を位置選定することによってRNA特異的測定を可能にした。更に、既知の多型(SNP)を有する配列領域に結合しないようにプライマー/プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合には、必要に応じて、すべての関連する又は選択したスプライスバリアントを増幅するようにプライマーを選択した。従来のPCR反応により、プライマー対の特異性について調べた。プライマー/プローブを更に最適化した後、上記の表に列挙されているプライマー及びプローブが最良の結果をもたらした。これらのプライマー/プローブは、例えば特異性及び増幅効率の点で、従来技術から既知であるプライマー/プローブよりも優れている。CALM2が分析した試料において差示的に調節されないため、試料RNAの量を標準化するためにCALM2を参照遺伝子として選択した。TaqMan(登録商標)検証実験を行い、標的及び対照の増幅効率がほぼ等しいことが示されたが、これは、比較ΔCT法による遺伝子発現の相対的定量化の前提条件である。
図27は、RT-qPCRアッセイによって定量化されたHLA-F1/F2発現による層別化に基づいて、局所進行性又は転移性UBC(n=55)を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存(DSS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。
図27に示すように、高いHLA-F1/2 mRNA発現(>=34.63)は、より良好な疾患特異的生存期間と有意に関連し、HLA-F1/F2陽性患者では生存確率が2年後に60%であったが、HLA-F1/F2エクソン陰性患者では、生存確率が2年後に20%であった(p=0.0245)。
図28は、RT-qPCRアッセイによって定量化されたHLA-F1/F2及びHLA-Gエクソン8 mRNA発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性UBC(n=55)を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存(DSS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。
図28に示すように、高いHLA-F1/2 mRNA発現(>=34.63)とHLA-Gエクソン8 mRNA発現(>=30.16)とを組み合わせた場合、予測値を改善することができた。興味深いことに、HLA-F1/F2 mRNA発現が高く、かつ、HLA-G mRNA発現が低いことは、より良好な疾患特異的生存期間と有意に関連しており、HLA-F1/F2陽性/HLA-Gエクソン8陰性患者では、生存確率が2年後に80%であったのに対し、HLA-F1/F2エクソン陰性患者では、生存確率が2年後に20%であり、HLA-F1/F2陽性/HLA-Gエクソン8陽性患者では、生存確率が2年後に40%であった(p=0.0245)。
図29は、RT-qPCRアッセイによって定量化されたHLA-F1/F2及びHLA-B/Cエクソン8 mRNA発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性UBC(n=55)を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存(DSS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。
図29に示すように、高いHLA-F1/2 mRNA発現(>=34.63)とHLA-B/C Ex8 mRNA発現(>=34.2)とを組み合わせた場合、高いHLA-B/Cは、より良好な疾患特異的生存期間と有意に関連しており、HLA-B/Cエクソン8及びHLA-F1/F2陰性患者では、2年後に10%の劣った生存確率であり、HLA-B/C陰性及びHLA-F1/F2陽性患者では、2年後に60%の良好な生存確率であった(p=0.0071)。
対照的に、HLA-B/Cエクソン8 mRNA発現を見るだけの場合、有意な値を決定できなかった(p=0.2127)。
図30は、RT-qPCRアッセイによって定量化されたHLA-B/Cエクソン8 mRNA発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性UBC(n=55)を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存(DSS)確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。CALM2を参照遺伝子として使用して、相対的なmRNA発現を40-DCT法によって決定する。
図30に示すように、HLA-B/Cエクソン8 mRNA発現が高い(>=34.2)患者では、HLA-B/C発現が低い患者よりも疾患特異的生存期間が有意に高くなく、生存確率が2年後に60%であったが、HLA-B/Cエクソン8陰性患者では、2年後に40%の低い生存確率であった。これは、HLA発現の組み合わせが生存予測に優れていることを示している。
Claims (18)
- 腫瘍の個人のHLAパターンを決定する方法であって、
-第1のHLA遺伝子の第1の領域をコードするRNA転写物の第1の発現レベルを決定することと、
-少なくとも1つの第2のHLA遺伝子の少なくとも1つの第2の領域のセンス又はアンチセンスRNA転写物の少なくとも第2の発現レベルを決定することと、
-前記決定された第1及び第2の発現レベルを比較して、個人のHLAパターンを得ることと、
を含み、
前記第1のHLA遺伝子及び前記第2のHLA遺伝子は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-Jをコードする遺伝子からなる群から選択される、方法。 - 前記第1のHLA遺伝子及び前記第2のHLA遺伝子が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-D、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-Jからなる群から選択される異なるHLA群をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のHLA遺伝子が、HLA-A、HLA-B、及びHLA-Cからなる群から選択される第1のHLA群をコードし、前記第2のHLA遺伝子が、HLA-D、HLA-E及びHLA-F、HLA-G、HLA-H、並びにHLA-Jからなる群から選択される第2のHLA群をコードする、請求項2に記載の方法。
- 前記第1のHLA遺伝子及び前記第2のHLA遺伝子が、同一であるか、又は同じHLA群をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の発現レベルがセンスRNA転写物に関し、前記第2の発現レベルが前記HLA群のアンチセンスRNA転写物に関する、請求項4に記載の方法。
- -前記第1の領域及び前記第2の領域のうちの一方がエクソン-エクソン境界を含み、前記第1の領域及び前記第2の領域のうちのもう一方がエクソン-エクソン境界を含まない、若しくは
-前記第1の領域がエクソン-エクソン境界を含まず、前記第2の領域がエクソン-エクソン境界を含まない、又は
-前記第1の領域がエクソン-エクソン境界を含み、前記第2の領域がエクソン-エクソン境界を含む、
請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。 - -前記第1の領域及び前記第2の領域のうちの少なくとも1つが、HLA群のシグナルペプチド領域をコードし、及び/又は
-前記第1の領域及び前記第2の領域のうちの少なくとも1つが、HLA群の膜貫通領域をコードする、
請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。 - -前記第1及び第2の発現レベルの前記比較に基づいて、前記個人のHLAパターンが主に可溶性であるか又は膜結合性であるかを決定すること
を更に含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - -前記第1及び第2の発現レベルの前記比較に基づいて、HLAアイソフォームを決定すること
を更に含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。 - HLA群をコードする遺伝子の1つ以上の更なる領域について1つ以上の更なる発現レベルを決定することを更に含み、前記比較は、前記個人のHLAパターンを得るための前記決定された更なる発現レベルに更に基づく請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記比較が発現レベル比の形成を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 特にプライマー及び/又はプローブとして使用するための、配列番号1~69のうちの1つによる核酸分子。
- 請求項12に記載の核酸分子を含むキット。
- 腫瘍の分子サブタイプを同定するための請求項13に記載のキットの使用。
- -請求項1~11のいずれか一項に記載の方法を使用して、個人のHLAパターンを決定することと、
-治療薬が前記決定された個人のHLAパターンに特異的に結合するように、前記決定された個人のHLAパターンに基づいて治療薬を製造することと、ここで、前記治療薬が、タンパク質、タンパク質ドメイン、及び/又はポリペプチドを含む、
を含む、治療薬を製造する方法。 - -請求項1~11のいずれか一項に記載の方法を使用して個人のHLAパターンを決定することと、
-前記決定された個人のHLAパターンに基づいて治療薬を製造することと、ここで、前記治療薬によって免疫系による抗原の合成が可能となるように、前記治療薬が、核酸、特に抗原をコードするRNAを含む、
を含む、治療薬を製造する方法。 - 前記治療薬が、可溶性HLAドメインを含む、請求項15又は16に記載の治療薬。
- 悪性腫瘍又は自己免疫疾患の治療に使用するための請求項15又は16に記載の治療薬。
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