JP2022540090A - 個人のｈｌａパターンの決定、予後因子としての使用、標的遺伝子、及び治療薬 - Google Patents

個人のｈｌａパターンの決定、予後因子としての使用、標的遺伝子、及び治療薬 Download PDF

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Abstract

本開示は、がん患者及び／又は自己免疫疾患に関連する障害に罹患している患者の身体試料（組織又は血液試料）における個人のＨＬＡパターン（成人及び／又は胚）を決定するインビトロ方法、並びにテーラーメイド治療のために上記患者を層別化する方法に関する。本開示は更に、対応するキット及びその使用、並びにがん、自己免疫疾患、感染症、及び妊娠に関連する状態などの新生物疾患の予後バイオマーカーとしての核酸分子に関連する。本開示はまた、治療薬及び治療薬を製造する方法にも関する。【選択図】図７

Description

本発明は、がん患者及び／又は自己免疫疾患に関連する障害に罹患している患者の身体試料、特に組織又は血液試料における個人のＨＬＡパターン（成人及び／又は胚）を決定するインビトロ方法、及びテーラーメイド治療のために上記患者を層別化する方法に関する。
化学的又は生物学的腫瘍治療は、一人の患者の個々の腫瘍細胞種に焦点を絞っていないが、それらが悪性であるかどうかに関係なく、かつ、個々の患者に関係なく、一般にすべての急速に***する細胞を検出する。
最終的な結果として、この種の治療はしばしば効果がなく、及び／又は重篤な副作用を伴う。より標的化され、高度に個別化された治療が非常に有用である。
生物全体のよく調節された存在の基礎は、細胞間のコミュニケーション又は細胞の対話である。細胞が絶えず死んでも及び／又は再生しても、この対話及びその調節により、生物全体の存在を維持することができる。この対話の結果として、幹細胞研究から既知であるように、細胞の分化も調節される。この対話により、妊娠中の場合のように一方が非常に急速な成長を示したとしても２つの異なる細胞クローンのよく調節された協調が可能となる。
ヒトにおける細胞対話の基礎は、ＨＬＡ群とのＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）である。ＨＬＡ群による細胞の識別は、すべての細胞コミュニケーションの基礎である。細胞コミュニケーションは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）上のキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）又はＬＩＬＲ（白血球免疫グロブリン様受容体）などの特定の受容体と協調して発達し、その後、サイトカイン、成長因子など更なる要因が関与する。
以下に記載することができる様々なＨＬＡ群が既知である：
ＨＬＡ Ａ、Ｂ、及びＣ群（ＭＨＣ Ｉ）：これらは実質的にすべての成人及び体細胞を識別する。
ＨＬＡ Ｄ群（ＤＲ、ＤＰ、ＤＱなど；ＭＨＣ ＩＩ）：これらは免疫担当細胞及び／又は抗原提示において重要な役割を果たす。
ＨＬＡ Ｅ、Ｆ、及びＧ群：これらは、特にいわゆる浸潤の前部にある、胚細胞を識別する。
更に、ＭＨＣ複合体はまた、クラスＩＩＩに属する補体因子などの更なる物質を含む。
腫瘍細胞は基本的に、生物全体の他の細胞と同じ遺伝暗号を有する。従って、腫瘍細胞は、細胞***及び細胞分化に関して生物全体の情報以外のいかなる情報も有していない。結果として、すべての悪性腫瘍疾患は特有かつ個別であり、すなわちそれぞれの生物に特異的である。
いくつかの腫瘍疾患では、いわゆるがん遺伝子など、追加の遺伝情報が、例えばウイルスベクターによって外部から細胞に導入される。しかしながら、がん遺伝子はまた、生殖から遺伝物質の不可欠な部分を形成し得る。がん遺伝子及び／又はその活性化並びに他の外的要因は、腫瘍細胞の生物学に恒久的に影響を与え得る。それでも、腫瘍細胞は、生物全体の細胞対話及びそこで有効な調節に関与し続ける。
ヒトなどの高度な細胞分化を有する生物は、多能性又は全能性の喪失によってその高い分化に対して「代償を払う」。臓器喪失の場合、元の状態に回復することはもはや不可能であり、結合組織による修復のみが可能である。ヒトデなど、生物がそれほど強く分化しない場合、全能性又は多能性の喪失はそれほどはっきりしたものではなく、従って、例えば腕が失われた場合小さいとはいえ、新しい腕が再び成長することができる。
全能性は基本的に、高等生物の遺伝物質にもコードされている。これは、この遺伝物質が以前は受精卵細胞から分化した生物への発達を制御しなければならなかったという単純な事実によって証明されている。クローン実験はまた、クローン化されたヒツジの「ドリー」の***細胞などの高度に分化した細胞の遺伝物質でも「ゼロに」に「リセット」（「再プログラミング」）することが核中で可能であることを示す。最終的な分析では、これは卵細胞の生殖及び／又は受精にも当てはまり、２つの比較的年齢の高い個々（父親及び母親）の遺伝物質が「ゼロ」にリセットされ、新しい生物の発生のために再びコードされる。
それに対応して、腫瘍細胞には、生物全体において可能なすべての成長及び分化プロセス、すなわち、初期胚－母親細胞の対話及びその後の胚－胎児発達の初期胚着床のメカニズムを基本的にコードする遺伝物質も提供されることは明らかである。
すべての腫瘍細胞は、様々な程度でその分化を失い（従って「脱分化」し）、様々な程度でその「戻り道」を作る。この「戻り道」の必要不可欠な特徴は、細胞分化の喪失及び特定の細胞性能の喪失、並びに制御されない細胞増殖の（再）獲得である。
腫瘍細胞はその表面に典型的な胚ＨＬＡ群を発現することができることが既知である。それぞれの調査はまだ断片的であるが、胚ＨＬＡ群のこの発現は、腫瘍細胞が自身の生物の非特異的免疫防御の攻撃を回避する状況に寄与している。表面上でのこれらの典型的なＨＬＡ群の発現により、細胞は例えばＮＫ細胞上の対応する受容体を活性化することが可能となるだけでなく、リンパ球、更には免疫担当細胞も活性化することが可能となり、従って、非特異的免疫防御、すなわちＮＫ細胞及びリンパ球の攻撃がないだけでなく、個々の場合では、腫瘍細胞（及び胚細胞）は、すなわち自身の発達に有益な成長因子及びサイトカインの合成によって「免疫防御をそれらのために働かせる」ことができる。
ここで、例えば、ＴＡＭ（腫瘍関連マクロファージ）又はＭＤＳＣ（免疫寛容誘導性「骨髄由来抑制細胞」）の現象に言及する必要がある。それらは、悪性腫瘍の微小環境において腫瘍増殖を支援する（すなわち「方向転換」される）。腫瘍において（おそらくＮＫ細胞によって）産生される可能性が高く、かつ、血管新生促進効果を有し、従って腫瘍細胞の増殖及び遊走を支援する、ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）などのサイトカインにも同じことが同様に当てはまる。
腫瘍細胞は非常に耐性である必要はない。既知であるように、それらは「健常な」分化した標準細胞よりも化学療法に対してより感受性が高く、放射線に対してもより感受性が高い。それらの細胞***速度も特に高くはない。悪性腫瘍細胞に起因する危険性は、何よりも、細胞のコミュニケーションに基づいて、進行する制御されない成長を「強制する」ことができるということである。
この状況はまた、現在の知識によれば、「悪性幹細胞」と称することができる悪性細胞が広がってコロニーを形成するために、主に転移が形成されるという事実によっても示されている。これが正しければ、そのような「悪性幹細胞」は、隣接する組織との細胞コミュニケーションによって、成長制御及び分化圧を局所的に回避することもできるはずである。脱分化から形成されたとしても、幹細胞は一般に幹細胞のように挙動し、この場合、特に胚母体コミュニケーション（胚母体対話）を機能させる様式に焦点を当てる。
細胞の悪性変性は、すべての個人に特異的な固有のプロセスである。これは、個人間に渡って病理学的に十分に分類可能な（常に再発する）腫瘍種があるという事実によって変更されない。この状況はむしろ、悪性腫瘍がすべての脱分化及びすべての「戻り道」によって形成されるわけではないという事実の証拠である。むしろ特定の一群のみが「戻り道」で「生存する」ことができ、従って、個人間に渡って典型的な腫瘍実体をもたらす可能性が高い。
細胞の脱分化又は「変性」はおそらく、すべての生物全体において比較的至る所に存在するプロセスである。しかしながら、腫瘍疾患の形成につながることはほとんどないが、それは、これらの細胞のうちのごく僅かのものしか、サバイバビリティに必要な細胞生物学的及び（細胞間）コミュニケーション前提条件を有していないからである。サバイバビリティを示す細胞は、上記の２つのメカニズムをおそらく組み合わせた形で使用する。一方では、それらは胚母体コミュニケーションの回復を利用して免疫系の攻撃を回避し、細胞成長の過程でこのコミュニケーションからの支援を得ることさえあり、一方では、完全又は部分的に発現した（元々は成人の）ＨＬＡパターン（及び自分の母親のパターンに対応するもの（以下を参照））によって保護されつつ、特定の免疫防御の攻撃を回避することができ、従って、増殖する。
「獲得」免疫は妊娠中に発達し、体自身のＨＬＡ群に関して耐性があるだけでなく、自身の母親の外来成人ＨＬＡ群に関しても常に耐性があることを意味する。
現在の知識によると、腫瘍細胞は基本的に、複合体中で共因子としてベータミクログロブリンに結合しつつ、細胞外アルファ１及びアルファ２ドメインによって構成される裂け目において抗原としてペプチドを提示する膜貫通タンパク質として、生物全体のすべての他の体細胞と同じ成人ＨＬＡ群を発現する。その結果、腫瘍細胞は特定の免疫防御の攻撃から保護される。これは、原則として、元のＨＬＡパターンの一部が「戻り道の途中」で失われるか、より低い密度で発現するか、又は変化した形で、すなわち破損した形で利用可能である場合（これは腫瘍細胞には変則的ではない）にも当てはまる。
ここでは、母親生物中で流され、そこに残っている（これは「マイクロキメリズム」と称される）胚の胚細胞と比較することが有用である。胚細胞（主に胎盤又は栄養膜細胞）上の胚表面構造、特にＨＬＡ－Ｇ、Ｅ、及びＦは、母親の免疫系が細胞を攻撃するのを防ぐ。
胚細胞（ここでは通常、胚の真正細胞）の特定の分化がすでに起こっている場合、それらは対応する器官に特異的に組み込まれる。これは、特定の転移形成パターンを好む場合が多い悪性腫瘍の挙動を非常に強く反映している。
胚細胞の胚の表面構造が維持されている場合、胚細胞は、腫瘍細胞と同様に、おそらく母親の生涯を通じて攻撃されない。
妊娠中に非常に多くの胚細胞が母親生物に流れ込む場合、この耐性は、母親の体を「引き継ぐ」試みにもなり得、すなわち、例えば、非常に危険なＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝酵素の上昇、血小板数の減少）の場合のように「移植片対宿主」反応が起こる。
しかしながら、おそらく胚細胞が少なくとも部分的にＨＬＡ－Ｇ、Ｅ、Ｆ保護を失い、かつ、任意選択で更なる分化を伴うという事実による、マイクロキメリズムに対する逆反応もあり得る。
次いで、胚細胞は分化しているときに母親生物のものとは異なる「成人」ＨＬＡ構造を示すため、母親生物の炎症性逆反応がある。典型的な結果として、炎症部位の周りに結合組織が形成され、これが特定の免疫疾患を引き起こし得る（橋本甲状腺炎を参照）。
腫瘍細胞は、更なる分化中に表面上にＨＬＡ特性を形成し、この特性は宿主生物の特性と異ならないために、生物のこの炎症性逆反応は腫瘍細胞の場合には起こらない。
腫瘍細胞について既知であり説明されているように、成人ＨＬＡパターンのこの完全又は不完全な発現は、腫瘍細胞が追加の抗原発現（又は過剰発現）によって抵抗している場合であっても特異的免疫防御の攻撃を妨げる。元の成人ＨＬＡパターンの完全又は不完全な発現に起因する保護は明らかに非常に効果的であり、その結果、腫瘍細胞は、（特異的）免疫反応、すなわち、存在しているＢリンパ球及びＴリンパ球の免疫反応の効果的な攻撃なしに、その特異的抗原パターンを発現することができる（従って、結果として「抵抗することとなる」）。腫瘍抗原発現パターンが個々の腫瘍種に比較的特異的であることは注目に値する。変化及び／又は変異したＭＨＣ－／ＨＬＡ群が、抗原提示カスケード（ＡＰＭ（抗原プロセシング機構））を益々欠陥的にすることも可能であり、従って、典型的なヒト関連又は自身の抗原がほとんど提示されないか又は（もはや）提示されない。しかしながら、そのような推定プロセスの基礎をなす分子メカニズムは不明であり、未だ同定されていない。
生物全体が、ＨＬＡ発現パターンが生物又は母親とは強く又は完全に異なる体細胞に直面した場合、記憶細胞の形成を伴った免疫防御の攻撃があると想定する必要がある。「記憶」は、当然、多様なＨＬＡ群に対して主に向けられる。しかしながら、免疫系のそのような攻撃とそれに続く外来細胞の破壊はまた、他の表面構造に対する抗体の形成を伴うことが既知である。個々の場合では、抗体は、至る所に存在する細胞成分、例えば、リン脂質に対してさえ形成される（「抗リン脂質抗体症候群」）。
このような背景に対し、両方のメカニズムを全体として考慮し、すなわち「戻り道の途中の腫瘍細胞」が他の細胞及び免疫系とどのようにコミュニケーションするか、及び／又は胎児期の喪失したコミュニケーションの特徴がどのようにして回復されるかを全体として考慮し、この理解から、これらの基本原理を考慮した治療概念及び対応する医薬を開発する必要がある。
特定の免疫防御（すなわち、Ｔリンパ球及びＢリンパ球）に加えて、単球及びそれから生じるマクロファージも腫瘍の成長に役割を果たす。しかしながら、マクロファージは、非特異的免疫防御細胞（ＮＫキラー細胞など）又は特異的免疫防御細胞（Ｔ細胞及びＢ細胞など）が存在する場合にのみ活性化することができる。しかしながら、これには、抗原提示細胞（樹状細胞など）が変異又は「外来」タンパク質を提示し、従って、細胞傷害性Ｔ細胞の形成をもたらす、「プライミング」が必要である。ここでは、インターフェロン（ＩＦＮ－γ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）などの多数のサイトカインも役割を果たす。
胚細胞と腫瘍細胞と間の比較は、マクロファージの場合でも生じる。マクロファージは、妊娠している場合に子宮内膜基底に見出され得る。それらは通常、胚の侵入の挙動に対して抑制効果を有し、移植胚と子宮筋層との間のいわば「保護壁」を形成する。一方、胚は、マクロファージ遊走阻止因子、すなわち、マクロファージの攻撃を制限及び阻害する因子を分泌する。これは悪性腫瘍にも同様に当てはまる（上記を参照）。
結論として、現在の理解は、膜結合型ＭＨＣ Ｉ媒介性のペプチド提示及び免疫細胞上の特定の受容体（ＫＩＲ及びＬＩＬＲなど）へのその後の結合に基づく腫瘍細胞と免疫細胞との間の直接的な細胞間コミュニケーションに基づいている。
腫瘍細胞と免疫系との間のコミュニケーションの分子的基礎はまだよく理解されていない。いわゆる「チェックポイント」を攻撃する抗体ベースの治療の出現により、それぞれの標的構造の決定（ｍＲＮＡ又はタンパク質ベースでのＰＤ－Ｌ１発現の定量化など）並びに／又は腫瘍変異量及び／若しくはＭＳＩ状態の決定が、治療又は長期生存期間（ＤＦＳ、ＭＦＳ、ＤＳＳ、又はＯＳ）への反応を予測する場合にある程度影響があることが示されている。
本明細書で使用される疾患の「転帰を予測する」という用語は、所与の治療を受けている患者の転帰の予測及び治療されていない患者の予後の両方を含むことを意味する。「転帰を予測する」という用語は、特に、好ましくは所与の時間枠内において転移又は死亡などの事象を受ける患者のリスクに関し得る。
結論として、複数種の腫瘍に関して、再発の個々のリスク及び化学療法又は代替治療オプションへの反応についてがん患者をより良好に分類する医学的必要性が高い。
これには、一方では、変異（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＦＧＲＦ３など）、分子サブタイピング転写物（ＥＳＲ１ ＰＧＲ、ＥＲＢＢ２など；ＭＫＩ６７、ＲＡＣＧＡＰ１、ＢＩＲＣ５、ＭＹＢＬ１、ＦＯＸＭ１などの増殖遺伝子；ＫＲＴ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ２０などのケラチン；ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＡ１などのＥＭＴマーカー）、免疫遺伝子（ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ６８、ＣＤ１６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＧＫＣ、ＩＧＨＭ、ＩＦＮＧなど）、チェックポイント遺伝子（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８６、ＣＤ８０、Ｌ－ＩＣＯＳ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４；ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳなど）などの腫瘍細胞特異的な特徴の決定、他方では、本開示に記載されるＨＬＡ発現パターンの決定（「ＨＬＡタイピング」）が含まれ得る。
例えば、両方の膀胱がんのステージの非常に異種の群では、現在の臨床病理学的特徴によって予後を信頼性高く評価できないため、最適な治療手順は明らかではない。
がん、例えば、乳がんの受容体状態を検出するために現在世界的に適用されている標準的な方法論は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検又は切除組織の免疫組織化学法（ＩＨＣ）である。乳がんでは、内分泌治療又は標的化全身治療（例えばトラスツズマブによる）の実施は、殆どはＩＨＣに基づいている。しかしながら、複数のマーカーを検査することによって個々のリスクを決定するＩＨＣベースの手法では、上記の診断／治療の難題を解決するのに役立ち得る膀胱がんの信頼の高い予後のサブ分類は得られない。更に、ＩＨＣによる検査は一般に感度の欠如に悩まされている。
従って、信頼性の高い個人のリスク評価を可能にし、好適な腫瘍治療レジメンの選択（すなわち、患者の層別化）を容易にし、かつ、予後及び治療の成功の予測を可能にする、膀胱がんの分子サブタイピングのための信頼性が高く、客観的、定量的、かつ再現性のある検査システムが明らかに必要である。更に、そのような検査システムは、かなりの割合のがん患者に好適である分散型検査を可能とする必要がある。
国際公開第０２／４２７５９号 国際公開第０２／４１９９２号 国際公開第０２／０９７４１３号
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ "Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ． Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ， ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｌｂｌ， Ｅｄｓ．， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２０００ Ｐｆａｆｆｌ（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２９（９）：ｅ４５ Ｃｈｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ， ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２４３－２５３ Ｚｅｍｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０． ＨＬＡ－ＡＲ，ａｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｌｏｃｕｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＨＬＡ－Ａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３６１９－３６２９ Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｓ． ａｎｄ Ｅ． Ｌｏｎｇ，ＫＩＲ２ＤＬ４（ＣＤ１５８ｄ）：Ａｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＨＬＡ－Ｇ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２．３（２５８） Ｃａｒｏｓｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ＨＬＡ－Ｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｂｌｏｏｄ，２００８．１１１（１０）：４８６２－７０ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ２０１８ Ｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｓａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｏｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｉｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ，２００８ Ｚａｍａｇｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｍＲＮＡ ｉｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｏ－ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ａｒｒａｙ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ＰＣＲ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ． ＥＲＣ ２００９
これら及び他の目的は、以下に説明される本発明によって解決される。
本発明は、がん患者及び／又は自己免疫疾患に関連する障害に罹患している患者の身体試料（組織又は血液試料）における個人のＨＬＡパターン（成人及び／又は胚）を決定するインビトロ方法、及びテーラーメイド治療のために上記患者を層別化する方法に関する。
本発明は更に、対応するキット及びその使用法、並びにがんなどの新生物疾患、自己免疫疾患、感染症、及び妊娠に関連する状態の予後バイオマーカーとしての核酸分子にも関する。本発明はまた、治療薬及び治療薬を製造する方法に関する。
本明細書で使用される「試料」、「生体試料」、又は「臨床試料」という用語は、患者から得られた試料を指す。試料は、任意の生物学的組織又は生物学的液体であり得る。このような試料には、唾液、血液、血清、血漿、血液細胞（例えば、白血球）、組織、コア若しくは細針生検試料、細胞含有体液、浮遊核酸、尿、腹水、及び胸水、脳脊髄液、涙液、又はそれら由来の細胞が含まれるが、これらに限定されない。生体試料には、組織学的目的のために採取された凍結若しくは固定切片などの組織の切片、又は顕微解剖された細胞若しくはその細胞外部分も含まれ得る。分析される生体試料は、吸引若しくは穿刺、切除、又は生検若しくは切除された細胞材料をもたらす他の外科的方法によって採取された新生物病変由来の組織材料である。そのような生体試料は、患者から得られた細胞を含み得る。細胞は、固形腫瘍材料における細胞「塗抹標本」、洗浄液、又は体液中に見出され得る。試料は、処理された試料、例えば、凍結、固定、包埋された試料などであり得る。試料の好ましい種は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。ＦＦＰＥ試料の調製は標準的な医療行為であり、これらの試料は長期間保存することができる。
本明細書で使用される「患者」という用語は、脊椎動物などの任意の生物、特にヒト及び別の哺乳動物、例えば齧歯動物、ウサギ、又はサルなどの動物の両方を含む任意の哺乳動物を指す。齧歯動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、又はチンチラであり得る。好ましくは、患者はヒトである。
一態様では、本発明は、腫瘍の個人のＨＬＡパターンを決定する方法であって、第１のＨＬＡ遺伝子の第１の領域をコードするＲＮＡ転写物の第１の発現レベルを決定することと、第２のＨＬＡ遺伝子の第２の領域のＲＮＡ転写物の第２の発現レベルを決定することと、決定された第１及び第２の発現レベルを比較して個人のＨＬＡパターンを取得することと、を含み、第１のＨＬＡ遺伝子及び第２のＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ～ＨＬＡ－Ｊをコードする遺伝子からなる群から選択される、方法に関する。
いくつかの実施形態では、第１のＨＬＡ遺伝子及び第２のＨＬＡ遺伝子は、異なるＨＬＡ群をコードし得る。例えば、第１のＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊからなる群から選択されるものをコードし得る。同様に、第２のＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊからなる群から選択される別の遺伝子をコードし得る。
このような場合、第１及び第２の発現レベルの比較は「遺伝子間」と称し得る。
特に、第１のＨＬＡ遺伝子は、すなわちＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃからなる群から選択される古典的なＨＬＡ遺伝子をコードし得る。一方、第２のＨＬＡ遺伝子は、すなわちＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、及びＨＬＡ－Ｊからなる群から選択される非古典的なＨＬＡ遺伝子又は偽遺伝子をコードし得る。
他の実施形態では、第１のＨＬＡ遺伝子及び第２のＨＬＡ遺伝子は、同一であるか、又は同じＨＬＡ群をコードし得る。例えば、第１及び第２のＨＬＡ遺伝子は両方とも、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、及びＨＬＡ－Ｊからなる群から選択される１つをコードし得る。
このような場合、第１発現レベル及び第２発現レベルの比較は「遺伝子内」と称し得る。
特に、本開示は、患者、例えばがん患者における腫瘍の個人のＨＬＡパターンを決定するインビトロ方法であって、例えばがん患者の腫瘍組織又は血液の試料中の成人ＨＬＡ群（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ；ＭＨＣ Ｉ）、ＨＬＡ Ｄ群（ＤＲ、ＤＰ、ＤＱなど；ＭＨＣ ＩＩ）、「胚」ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）、ＨＬＡ偽遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊ）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物の発現レベルを決定することを含む、方法に関する。
本発明によれば、「ＲＮＡ転写物」という用語は、センス及び／又はアンチセンス方向の転写産物に関する。
好ましくは、この用語は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味する「ｍＲＮＡ」を含み及びそれに関し、ペプチド又はタンパク質をコードする「転写物」に関する。ｍＲＮＡは、典型的には、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、タンパク質又はペプチドコード領域、及び３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡは、細胞中及びインビトロで限られた半減期を有する。
アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）転写産物などの他の場合、ＲＮＡは、ペプチド又はタンパク質をコードしていなくてもよい。しかしながら、ＲＮＡは、ｍＲＮＡに相補的であり、それにより、ペプチド又はタンパク質への対応するセンスｍＲＮＡの翻訳を調節し得る。本開示の目的のために、アンチセンスＲＮＡ転写物は、ＨＬＡ群のタンパク質又はペプチドに直接翻訳されないが、それぞれの「ＨＬＡ遺伝子」の更なる「領域」（アンチセンス領域）に関するとみなされ得る。
いくつかの場合では、第１の発現レベル及び第２の発現レベルの両方が、センスＲＮＡ転写物に関し得る。他の場合には、第１の発現レベルはセンスＲＮＡ転写物に関し得るが、第２の発現レベルはアンチセンスＲＮＡ転写物に関し得る（又はその逆であり得る）。好ましくは、しかし必ずしもそうではないが、センス及びアンチセンス転写物は、同じＨＬＡ群に関する。例えば、アンチセンス転写物は、同じＨＬＡ群のセンス転写物に少なくとも部分的に相補的であり得る。
「発現レベル」という用語は、例えば、遺伝子発現の決定されたレベルを指す。「発現レベルのパターン」という用語は、参照遺伝子、例えばハウスキーパー若しくは逆調節遺伝子、又は例えばＤＮＡチップ分析で算出された平均発現値のいずれかと比較した、遺伝子発現の決定されたレベルを指す。パターンは、２つの遺伝子の比較に限定されないが、参照遺伝子又は試料に対する遺伝子の多重比較に関する。特定の「発現レベルのパターン」はまた、本明細書に開示されるいくつかの遺伝子の比較及び測定によって取得及び決定され、これらの転写物の互いに対する相対的な存在量を示し得る。発現レベルはまた、異なる組織、例えば、がん組織対非がん組織における遺伝子の発現と比較して評価され得る。
本明細書で使用される「発現レベル」という用語は、転写物及び／又はタンパク質を生成するための特定の遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ）の発現を指す。本発明によれば、発現レベルは、例えば、転写されたｍＲＮＡを測定することにより（例えば、ノーザンブロットにより）、逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、又はｍＲＮＡを直接染色することにより（例えば、インサイチューハイブリダイゼーションにより）、ＲＮＡ転写レベル、特にｍＲＮＡレベル（転写レベル）で決定される。
いくつかの実施形態では、発現レベルは、腫瘍の試料における１つ以上の参照遺伝子の（平均）発現レベルに対して正規化されている。本明細書で使用される「参照遺伝子」という用語は、検査されているシステム、すなわち、がんにおいて、ＲＮＡ転写物／ｍＲＮＡレベルで比較的変動しない発現レベルを有する遺伝子を指すことを意味する。このような遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と称され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の参照遺伝子は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、及びＧＡＰＤＨを含む群から選択され、好ましくはＣＡＬＭ２及び／又はＢ２Ｍである。他の好適な参照遺伝子は、当業者に既知である。
第１及び第２の領域の各々は、エクソン－エクソン境界を含み得、又は１つ以下のエクソンの一部を含み得る（すなわち、エクソン－エクソン境界を含まない）。
例えば、第１の領域及び第２の領域のうちの１つ（例えば、第１の領域）は、２つのエクソンの部分におよび（すなわち、エクソン－エクソン境界を含む）、第１の領域及び第２の領域のうちのもう一方（例えば、第２の領域）は、１つ以下のエクソンの一部を含む（すなわち、エクソン－エクソン境界を含まない。
あるいは、第１の領域は、エクソン－エクソン境界を含み得（すなわち、２つのエクソンの部分におよび得る）、第２の領域は、エクソン－エクソン境界を含み得る。第１の領域及び第２の領域は、共通のエクソンの部分を含み得、又は含み得ない。例えば、第１の領域は、エクソン２とエクソン３との間の境界を含み得る（すなわち、エクソン２／エクソン３の境界を含み得る）。そのような場合、第２の領域は、任意のエクソン（エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４など）の一部を含み得、又は任意のエクソン－エクソン境界（エクソン３／エクソン４境界、エクソン４／エクソン５境界など）を含み得る。エクソン－エクソン境界の群には、エクソン２／エクソン４境界などのエクソンスキップによって形成される境界も含まれる。
更なる代替では、第１の領域は、１つ以下のエクソンの部分を含み、第２の領域は、１つ以下のエクソンの部分を含む。
いくつかの実施形態では、第１の領域は、ＨＬＡ群のシグナルペプチド領域をコードし得、第２の領域は、ＨＬＡ群の膜貫通領域をコードし得る。
一般に、個人のＨＬＡパターンを決定する方法はまた、第１及び第２の発現レベルの比較に基づいて、個人のＨＬＡパターンが主に可溶性であるか又は膜結合性であるかを決定することを含み得る。特に、ＨＬＡ群のシグナルペプチド領域をコードする領域の発現レベルが、ＨＬＡ群の膜貫通領域をコードする領域の発現レベルを超える場合、個人のＨＬＡパターンは主に可溶性であると決定され得る。ＨＬＡ群の膜貫通領域をコードする領域の発現レベルが、ＨＬＡ群のシグナルペプチド領域をコードする領域の発現レベルと本質的に等しいか又はそれを超える場合、個人のＨＬＡパターンは主に膜結合であると決定され得る。
一般に、個人のＨＬＡパターンを決定する方法はまた、第１及び第２の発現レベルの比較に基づいてＨＬＡアイソフォームを決定することを含み得る。特に、第１のエクソンの一部をコードする領域の発現レベルが、第２のエクソンの一部をコードする領域の発現レベルを超える場合、個人のＨＬＡパターンは、第１のエクソンを含み、かつ、第２のエクソンを含まない１つ以上のアイソフォームを含むと決定され得る。
一般に、個人のＨＬＡパターンを決定する方法はまた、ＨＬＡ群の１つ以上の更なる領域（例えば、第３の領域）の１つ以上の更なる発現レベル（例えば、第３の発現レベル）を決定することを含み得、比較は更に、個人のＨＬＡパターンを得るために、決定された更なる発現レベルに基づく。
「ＲＮＡ発現レベル」という用語は、転写されたＲＮＡ、初期のスプライシングされていないＲＮＡ転写物、又は成熟ｍＲＮＡに変換されたＤＮＡ遺伝子配列情報の決定されたレベルを指す。ＲＮＡの発現は、遺伝子のＲＮＡ全体又はサブ配列のいずれかのレベルを測定することによってモニタリングできる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物の発現レベルを決定することは、ＲＮＡ転写物の発現レベルがＲＮＡ転写物の規定された発現閾値よりも低いか又は高いか（＝二分化）を決定することを含む。発現レベルが規定された発現閾値に等しい場合、発現レベルは規定された発現閾値よりも高い発現レベルの群に属するとみなされ得る。従って、本明細書で使用される「規定された発現閾値より高い」という記載は、規定された発現閾値以上である発現レベルを含む。「規定された発現閾値より高い」発現レベルは「発現陽性」とも称され得、「規定された発現閾値より低い」発現レベルは「発現陰性」とも称され得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＬＡのシグナルペプチドの相同領域をコードするＲＮＡ転写物の発現レベルが、１つ以上のＨＬＡの相同膜貫通領域をコードする発現レベルに関して決定及び設定され、及び／又は１つ以上のＨＬＡの多様な細胞質尾部が関連して設定され、それにより、分泌されたアルファドメイン対膜貫通局在化ＨＬＡの比率を個々のＨＬＡ及びＨＬＡアイソフォームについて決定することができる。
「ＲＮＡ転写物の発現レベルを決定する」ステップは、（ｉ）ＲＮＡ転写物の発現レベルを測定することと、（ｉｉ）（例えば、規定された発現閾値などの参照発現レベルとの比較によって）ＲＮＡ転写物の測定された発現レベルを分析することと、を含み、ＲＮＡ転写物の発現レベルを測定する順序は、測定されたＲＮＡ転写物発現レベルを分析する順序と関係し得、又は無関係であり得る。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ偽遺伝子（ＨＬＡ－Ｈ及び／又はＨＬＡ－Ｊ）からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの遺伝子のＲＮＡ転写物の発現レベルが決定される。
いくつかの実施形態では、得られた個人のＨＬＡパターンは、ＨＬＡ群の１つ以上のアイソフォームの存在及び／又は不存在及び／又は発現レベルを示し得る。例えば、ＨＬＡ－Ｇの既知のアイソフォームには、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＨＬＡ－Ｇ４、ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、及びＨＬＡ－Ｇ７が含まれる。同じことが、更なる胚ＨＬＡ群であるＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｆ、並びにＨＬＡ偽遺伝子であるＨＬＡ－Ｈ及びＨＬＡ－Ｊにも当てはまる。そのような実施形態では、ＨＬＡ群の現在既知ではない更なるアイソフォームが存在すると決定され得る。
ＨＬＡ群の１つ以上のアイソフォームの存在及び／又は発現レベルを示す得られた個人のＨＬＡパターンは更に、腫瘍の分子サブタイプを同定するために及び／又は治療薬を生成する方法において使用され得る。
更に又はあるいは、アイソフォーム、特に、可溶性アイソフォームの存在及び／又は不存在及び／又は発現レベルを示すことは、（ａ）生殖補助医療、例えば、体外受精（ＩＶＦ）において胚の着床を安定化するため、（ｂ）例えば宿主対移植片反応において、移植拒絶反応のリスクを低減するため、及び／又は（ｃ）自己免疫の急増のリスクを低減するか若しくはその影響を最小限に抑えるために使用され得る。そのような使用は、特に、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及び／又はＨＬＡ－Ｇの可溶性で生物学的に活性なアイソフォームを含む培地又は治療薬を製造することを含み得る。そのような可溶性で生物学的に活性なアイソフォームの例には、ＨＬＡ－Ｇ５が含まれる。
いくつかの実施形態では、方法は、腫瘍試料における免疫遺伝子の群（ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ６８、ＣＤ１６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＧＫＣ、ＩＧＨＭ、ＩＦＮＧなど）から選択される少なくとも１つの遺伝子のＲＮＡ転写物の発現レベルを決定することを更に含む。
本開示の一実施形態として、ＨＬＡタイピングと、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８６、ＣＤ８０、Ｌ－ＩＣＯＳ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、及び／又はＩＣＯＳのタンパク質ベース及び／又はｍＲＮＡベースの評価によって例示されるチェックポイント特性と、の組み合わせは、進行がんの臨床状況においてヒト化抗体などの特定の阻害剤によってチェックポイント遺伝子を標的化する場合に特に関心がある。ＨＬＡタイピングは、化学療法剤及び／又はチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１又は抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＣＴＬＡ４薬など）に対する反応の予測のためにチェックポイント標的遺伝子を専ら定量化することの価値を付加するＨＬＡ発現パターン情報を提供する。
本開示の一実施形態として、ＨＬＡタイピングと免疫遺伝子（ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ６８、ＣＤ１６８、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＧＫＣ、ＩＧＨＭ、ＩＦＮＧなど）のタンパク質ベース及び/又はｍＲＮＡベースの評価によって例示される免疫細胞浸潤の定量化との組み合わせは、特にネオアジュバント治療戦略への反応を予測する場合に、化学療法剤及び／又は抗チェックポイント薬に対する反応予測のためにチェックポイント標的遺伝子を専ら定量化することの価値を付加する。
本発明の１つ以上の実施形態によれば、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、改変された抗体フォーマット、抗体誘導体又は標的結合特性を保持する断片、抗体ベースの結合タンパク質、オリゴペプチド結合剤、及び抗体模倣物からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
「抗体」は、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも同義的に称され、一般に、限定するものではないが、２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽鎖（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含み、従って、完全長機能的変異体、バリアント、又はそれらの誘導体（Ｉｇ分子の必須のエピトープ結合機能を保持するマウス、キメラ、ヒト化、及び完全ヒト抗体を含み、二重特異性、二重特異性、多重特異性、及び二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む）を含む、多量体タンパク質又はその同等のＩｇ相同体（例えば、重鎖のみを含むラクダナノボディ、重鎖又は軽鎖のいずれかに由来し得る単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ））である。免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、及びアロタイプであり得る。
本明細書で使用される「抗体ベースの結合タンパク質」は、他の非免疫グロブリン又は非抗体由来の成分の文脈で、少なくとも１つの抗体由来のＶＨ、ＶＬ、又はＣＨ免疫グロブリンドメインを含む任意のタンパク質を表し得る。そのような抗体ベースのタンパク質には、（ｉ）免疫グロブリンＣＨドメインの全部又は一部を有する受容体又は受容体成分を含む、結合タンパク質のＦｃ融合タンパク質、（ｉｉ）ＶＨ及び／又はＶＬドメインが代替分子足場に結合している、結合タンパク質、又は（ｉｉｉ）免疫グロブリンＶＨ及び／若しくはＶＬ、並びに／又はＣＨドメインが、天然に存在する抗体又は抗体断片に通常見出されない様式で結合している及び／又は組み立てられている分子が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「抗体誘導体又は断片」は、完全長ではない抗体に由来する少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子に関し、限定するものではないが、単独又は任意の組み合わせの、（ｉ）可変軽鎖（ＶＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、定常軽鎖（ＣＬ）、及び定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含む２価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる、Ｆａｂ（Ｆｄ）断片の重鎖部分、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる、可変断片（Ｆｖ）断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含む、ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されているが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎる
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を使用し、それにより、ドメインに別の鎖の相補性ドメインと対にならせて２つの
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を作り出す、二価の二重特異性抗体である、ダイアボディ、（ｉｘ）相補性軽鎖ポリペプチドと共に、１対の抗原結合領域を形成する、１対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む、線状抗体、（ｘ）免疫グロブリン重鎖及び／若しくは軽鎖の他の非全長部分、又はそれらの変異体、バリアント、若しくは誘導体を含むが、これらに限定されない、完全長ではない抗体に由来する少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子に関する。いずれにしても、上記誘導体又は断片は標的結合特性を保持する。
本明細書で使用される「改変された抗体フォーマット」という用語は、抗体－薬物コンジュゲート、ポリアルキレンオキシド改変ｓｃＦｖ、モノボディ、ダイアボディ、ラクダ抗体、ドメイン抗体、二重若しくは三重特異性抗体、ＩｇＡ、又はＪ鎖によって結合された２つのＩｇＧ構造、及び分泌成分、サメ抗体、新世界霊長類フレームワーク＋非新世界霊長類ＣＤＲ、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体、ＣＨ３ドメインに対して操作された２つの追加の結合部位を有するＩｇＧ、Ｆｃγ受容体に対する親和性を増強するように変更されたＦｃ領域を有する抗体、並びにＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体化構築物などを包含する。
本明細書で使用される「抗体模倣物」という用語は、免疫グロブリンファミリーに属さないタンパク質、更にはアプタマーなどの非タンパク質又は合成ポリマーを指す。いくつかの種は、抗体様ベータシート構造を有する。抗体に対する「抗体模倣物」又は「代替足場」の潜在的な利点は、溶解性が良好であること、組織への浸透性が高いこと、熱及び酵素に対する安定性が高いこと、並びに製造コストが比較的低いことである。
いくつかの抗体模倣物は、考えられるすべての標的に対して特異的な結合候補を提供する大規模なライブラリーで提供することができる。抗体の場合と同様に、標的特異的抗体模倣物は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術並びにファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母又は哺乳動物ディスプレイなどの確立されたディスプレイ技術を使用することによって開発することができる。現在開発されている抗体模倣物には、例えば、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓと称される）、Ｃ型レクチン、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＡドメインタンパク質、トランスフェリン、リポカリン、フィブロネクチンの第１０のＩＩＩ型ドメイン、クニッツドメインプロテアーゼ阻害剤、ユビキチン由来バインダー（アフィリンと称される）、ガンマクリスタリン由来バインダー、システインノット又はノッチン、チオレドキシンＡ足場ベースのバインダー、ＳＨ－３ドメイン、ストラドボディ、ジスルフィド結合及びＣａ２＋で安定化された膜受容体の「Ａドメイン」、ＣＴＬＡ４ベースの化合物、Ｆｙｎ ＳＨ３、及びアプタマー（特異的標的分子に結合するペプチド分子）が含まれる。
本発明の１つ以上の実施形態によれば、免疫チェックポイント阻害剤は、表１に記載の群から選択される少なくとも１つを含む。表１中、ＤＡＲＴは「デュアルアフィニティリターゲティング（Ｄｕａｌ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」を示し、ｍＡｂは「モノクローナル抗体」を示し、ＮＡは「該当なし」を示す。
Figure 2022540090000002
Figure 2022540090000003
別の態様では、本発明は、がんの治療における上記方法の使用であって、第１のステップとして、腫瘍治療のためにがん患者を層別化し、第２のステップとして、選択された抗ＨＬＡ腫瘍治療レジメンをがん患者に提供することを含む、使用に関する。
本発明による「腫瘍治療のためにがん患者を層別化すること」は、特定の分子腫瘍サブタイプを有する患者群にがん患者を割り当てることを含み、これにより、医療従事者は最も好適な腫瘍治療レジメンを選択することが可能となる。
本開示のいくつかの実施形態では、上記治療は、新生物疾患に罹患している患者のための、ヒト化抗体の使用又はその特異的なＨＬＡアイソフォームに対して生じるＲＮＡ若しくはタンパク質ベースの免疫化を含む。
いくつかの実施形態では、上記使用は、エクスビボで可溶性ＨＬＡドメインを生成することを含み得る。例えば、該生成は、合成モノマー（α１、α２、α３）、又は天然に存在する順序の多量体（例えば、α１α２α３、α１α２、α１α３）若しくはデノボ順序の多量体（α２α３）、或いはデノボコンカテマー（例えば、α１α１α１、α２α２α２、α３α３α３、α１α１α２、α１α１α３、α１α１α１α１α２α２α２α３α３α３など）として、天然に存在するアルファドメインのいずれかを組み合わせることを含み得る。
上記の治療薬は、自己免疫疾患に関連する障害に罹患している患者又は早期流産の潜在的リスクのある妊婦に適用して、自己免疫症状を軽減し、出産まで妊娠を継続できるようにするために免疫寛容を高めるものであり得る。
一般に、治療薬を製造する方法は、上記の方法を使用して個人のＨＬＡパターンを決定することと、治療薬を製造することと、を含み得る。
いくつかの実施形態では、治療薬は、該治療薬が決定された個人のＨＬＡパターンに特異的に結合するように、タンパク質、タンパク質ドメイン、及び／又はポリペプチドを含み得る。治療薬のそのような結合の結果として、決定された個人のＨＬＡパターンとリガンド又は例えば免疫担当細胞上の受容体との間の結合又は相互作用が妨げられ得る。
例えば、治療薬は、決定された個人のＨＬＡパターンに基づいて、可溶性ＨＬＡドメイン又は抗体を含み得る。
いくつかの実施形態では、治療薬は、核酸、特にＲＮＡを含み得る。そのようなＲＮＡは、既知のＲＮＡワクチン接種技術に沿った治療薬の注射後に免疫系によって合成され得る抗原をコードし得る。抗原への治療薬のそのような翻訳の結果として、決定された個人のＨＬＡパターンにもかかわらず、免疫担当細胞の応答が引き起こされ得る。
例えば、治療薬は、決定された個人のＨＬＡパターンに基づく可溶性ＨＬＡドメイン又は抗体を含み得る。
いくつかの実施形態では、上記の合成アルファドメインの組み合わせはすべて、シスで（すなわち、ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ａなどの、１つのみの単一のＨＬＡ遺伝子のアルファドメインを組み合わせることによって）又はトランスで（すなわち、ＨＬＡ－Ｇ及びＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－Ｇなどの、２つ以上のＨＬＡ遺伝子のアルファドメインを組み合わせることによって）起こり得る。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆの上記の合成アルファドメインは、適用されるＨＬＡアルファドメインの拡散の低減及び局所停留の増加のために二量体化及び／又は多量体化が可能である可溶性ＨＬＡアルファドメインを得るために、ＨＬＡ－Ｇ内の置換と同様の位置に追加のシステインを含むように生物工学的に操作される。
更に別の態様では、本発明は、逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって、例えば膀胱がん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するためのキットであって、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊからなる群から選択される遺伝子に特異的な少なくとも１対のプライマー及び少なくとも１つのプローブを含む、キットに関する。
本発明はまた、腫瘍の分子サブタイプを同定するための上記のキットの使用に関する。
「膀胱がん」という用語は、膀胱又は尿道組織に由来するがんの種類に関連している。いくつかの実施形態では、膀胱がんは、筋層非浸潤性膀胱がん（ＮＭＩＢＣ）又は筋層浸潤性膀胱がん（ＭＩＢＣ）である。時折、膀胱がんは転移性である。転移の一般的な部位には、骨、肝臓、肺、及び脳が含まれる。膀胱がんは、ヒト及び他の哺乳動物で発生する。ヒトの症例の大部分は男性で発生するが、女性の膀胱がんも発生し得る。一般に、膀胱がんの治療は、外科手術、薬物療法（免疫療法及び／又は化学療法及び／又はＢＣＧによる免疫療法など）、放射線療法、及び／又は標的化療法を含み得る。
ほぼすべての膀胱がんは尿路上皮から発生する。がんは、膀胱内の他の層に又はそれを介して成長するにつれて更に進行し、ステージへの分類は、より深い組織層での腫瘍の浸潤の進行に従う。ステージは次のように規定される：Ｔａ（ｐＴａ）：非浸潤性乳頭がん、Ｔｉｓ（ｐＴｉｓ）：非浸潤性平坦型がん（平坦型上皮内がん、又はＣＩＳ）、Ｔ１（ｐＴ１）：腫瘍は膀胱の内側にある細胞層から下の結合組織へと成長しているが、それでもＮＭＩＢＣであると考えられる、Ｔ２（ｐＴ２）：腫瘍は筋層（ＭＩＢＣ）へと成長している、Ｔ３（ｐＴ３）：腫瘍は膀胱の筋層を介して、それを取り巻く脂肪組織層へ成長している、及びＴ４（ｐＴ４）：腫瘍は脂肪組織を越えて近くの臓器又は構造に広がっている。腫瘍は次のうちのいずれかへと成長し得る：前立腺の間質（主要組織）、精嚢、子宮、膣、骨盤壁、又は腹壁。
本発明の意味の範囲内での「プライマー対」及び「プローブ」は、分子生物学の当業者に周知であるこの用語の通常の意味を有するものとする。本発明の好ましい実施形態では、「プライマー対」及び「プローブ」は、検出又は定量化される標的ポリヌクレオチドの領域と同一、相補的、相同、又はその領域の相補体と相同な配列を有するポリヌクレオチド分子であると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、プライマー及び／又はプローブとしての使用のために、ヌクレオチド類似体も含まれる。動的又はリアルタイムＰＣＲ適用に使用されるプローブ技術は、例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにおいて入手可能なＴａｑＭａｎ（登録商標）システム、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）Ｐｒｉｍｅｒｓなどの伸長プローブ、Ｄｕａｌ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃにおいて入手可能なＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）、又はＭｉｎｏｒ ＧｒｏｏｖｅＢｉｎｄｅｒｓであり得る。
いくつかの実施形態では、キットは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊからなる群から選択される少なくとも２、３又は４つの遺伝子のための特定のプライマー対及び特定のプローブを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、以下を含む：
－少なくとも１対のＨＬＡ－Ｇ特異的プライマー及び少なくとも１つのＨＬＡ－Ｅ特異的プローブ；
－少なくとも１対のＨＬＡ－Ｇ特異的プライマー及び少なくとも１つのＨＬＡ－Ｆ特異的プローブ；並びに／又は
－少なくとも１対のＨＬＡ－Ｆ特異的プライマー及び少なくとも１つのＨＬＡ－Ｇ特異的プローブ。
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１対のＨＬＡ群特異的プライマー及び少なくとも１つのＨＬＡ群特異的プローブを含み、プライマーの対及びプローブは両方とも、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊからなる群から選択される遺伝子に特異的である。
好ましくは、本発明に従って使用するためのプライマーは、長さが１５～３０のヌクレオチド、特にデオキシリボヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、プライマーは、（１）標的ｍＲＮＡ配列（例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、又はＨＬＡ－Ｇ）に特異的である、（２）１２０ｂｐ未満（好ましくは１００ｂｐ未満）のアンプリコンサイズを提供する、（３）すべての既知のタンパク質をコードするスプライシングバリアントを検出する、（４）既知の多型（例えば、一塩基多型、ＳＮＰ）を含まない、（５）ｍＲＮＡ特異的である（エクソン／イントロンの考慮；好ましくはＤＮＡの増幅なし）、（６）二量体化する傾向がない、及び／又は（７）５８℃～６２℃の範囲の融解温度Ｔｍを有する（好ましくはＴｍは約６０℃である）ように設計される。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、天然（天然に存在する）ヌクレオチドを含み、これには、アデニン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びウラシル（Ｕ）からなる群から選択される核酸塩基、リボース、アラビノース、キシロース、ピラノース、及びデオキシリボースの群から選択される糖（一般に「ヌクレオシド」と称される塩基と糖との組み合わせ）、並びにホスホジエステルヌクレオシド間結合を形成することができる１～３個のリン酸基が含まれる。更に、本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体を指す。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド類似体」は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ（どちらか好適なもの）によって認識され、ＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖（どちらか好適なもの）に組み込まれる、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、又はＵの類似体（すなわち、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、又はＵを含むヌクレオチドの類似体）を意味する。そのようなヌクレオチド類似体の例には、５－プロピニルピリミジン（すなわち、５－プロピニル－ｄＴＴＰ及び５－プロピニル－ｄＣＴＰ）、７－デアザプリン（すなわち、７－デアザ－ｄＡＴＰ及び７－デアザ－ｄＧＴＰ）、アミノアリル－ｄＮＴＰ、ビオチン－ＡＡ－ｄＮＴＰ、２－アミノ－ｄＡＴＰ、５－メチル－ｄＣＴＰ、５－ヨード－ｄＵＴＰ、５－ブロモ－ｄＵＴＰ、５－フルオロ－ｄＵＴＰ、Ｎ４－メチル－ｄＣＴＰ、２－チオ－ｄＴＴＰ、４－チオ－ｄＴＴＰ、及びアルファ－チオ－ｄＮＴＰが含まれるが、これらに限定されない。標識された類似体、例えば、ＤＥＡＣ－プロピレンジアミン（ＰＤＡ）－ＡＴＰなどの蛍光類似体、モルフォリノヌクレオシド類似体に基づく類似体、及びロックド核酸（ＬＮＡ）類似体も含まれる。
本発明に従って使用するためのプライマーに関連して使用される「標的ｍＲＮＡ配列に特異的な」という文言は、温度及び溶液のイオン強度の適切な条件下で、特にＰＣＲ条件下で、標的ｍＲＮＡ配列のｃＤＮＡにハイブリダイズする（すなわち、アニールする）プライマーの能力を指すことを意味する。温度及び溶液のイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定される。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸（すなわち、プライマー及びＤＮＡ）が相補的な配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが起こり得る。いくつかの実施形態では、「温度及び溶液イオン強度の好適な条件」は、５８℃～６２℃の範囲の温度（好ましくは約６０℃の温度）及びＰＣＲ反応混合物で一般的に使用される溶液のイオン強度を指す。いくつかの実施形態では、プライマーの配列は、当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムによって決定した際に、標的ｍＲＮＡ配列のｃＤＮＡの対応する配列に８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、更により好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％相補的である。
例えば、プライマーは、ストリンジェント又は中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的ｍＲＮＡ配列のｃＤＮＡにハイブリダイズし得る。本明細書に記載の「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中で６８℃でハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で室温で洗浄するか、又は当該技術分野で認めれているその同等物（例えば、ハイブリダイゼーションを２．５×ＳＳＣバッファー中で６０℃で行い、続いて、低バッファー濃度で３７℃で数回の洗浄ステップを行い、安定を維持する条件）を伴い得る。本明細書で規定される「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、３×ＳＳＣで４２℃で洗浄すること、又は当該技術分野で認められているその同等物を含むことを伴う。塩濃度及び温度のパラメーターは、プライマーと標的核酸との間の同一性の最適なレベルを達成するために変動し得る。そのような条件に関する指針は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；（非特許文献１）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ（非特許文献２）で入手可能である。
いくつかの実施形態では、プローブは、上記で規定されたストリンジェントな又は中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的ｍＲＮＡ配列の（増幅された）ｃＤＮＡにハイブリダイズする。
好ましくは、本発明に従って使用するためのプローブは、２０～３５ヌクレオチド、特にデオキシリボヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、プローブは、（１）標的ｍＲＮＡ配列（例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－Ｇ）に特異的である、（２）既知の多型（例えば、一塩基多型、ＳＮＰ）を含まない、及び／又は（３）対応するプライマーの融解温度Ｔｍよりも約５℃～８℃高い融解温度Ｔｍを有するように設計される。
本発明に従って使用するためのプローブに関連して使用される「標的ｍＲＮＡ配列に特異的な」という文言は、プローブが、温度及び溶液のイオン強度の好適な条件下で、特にＰＣＲ条件下で、標的ｍＲＮＡ配列の（増幅された）ｃＤＮＡにハイブリダイズする（すなわち、アニールする）能力を指すことを意味する。温度及び溶液のイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定される。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸（すなわち、プローブ及びｃＤＮＡ）が相補的な配列を含む必要があるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが起こり得る。いくつかの実施形態では、「温度及び溶液イオン強度の好適な条件」は、６３℃～７０℃の範囲の温度及びＰＣＲ反応混合物中で一般的に使用される溶液のイオン強度を指す。いくつかの実施形態では、プローブの配列は、当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムによって決定した際に、標的ｍＲＮＡ配列の（増幅された）ｃＤＮＡの対応する配列に８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、更により好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％相補的である。
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号１、２、３の配列を含むか若しくはそれを有するＨＬＡ－Ａ特異的プライマー、及び／又は配列番号４、５、６の配列を含むか若しくはそれを有するＨＬＡ－Ｂ／Ｃ特異的、及び／又は配列番号７～２７の配列を含むか若しくはそれを有するＨＬＡ－Ｇ特異的プライマー、並びに／或いは配列番号２８～３３の配列を含むか若しくはそれを有するＨＬＡ－Ｈ特異的プライマーの使用を含む。
いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲは、蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲである。
いくつかの実施形態では、プローブの検出は、増幅媒介性プローブ置換に基づく。
いくつかの実施形態では、プローブは、蛍光レポーター部分及び蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
いくつかの実施形態では、キットは、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを更に含む。
いくつかの実施形態では、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、ワンステップ逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を可能にする酵素混合物の形態で提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１対の参照遺伝子特異的プライマー及び少なくとも１つの参照遺伝子特異的プローブを更に含む。
いくつかの実施形態では、参照遺伝子は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、及びＧＡＰＤＨからなる群から選択される１つ以上である。本明細書で使用される場合、ＣＡＬＭ２は、カルモジュリン－２、ホスホリラーゼキナーゼ，デルタ（参照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１７４３）を指し、Ｂ２Ｍは、ベータ－２ミクログロブリン（参照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００４０４８）を指し、ＲＰＬ３７Ａは、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３７ａ（参照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００９９８）を指し、ＧＵＳＢは、ベータ－グルクロニダーゼ（参照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００１８１）を指し、ＨＰＲＴ１は、ヒポキサンチン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ１（参照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００１９４）を指し、ＧＡＰＤＨは、グリセリンアルデヒド－３－リン酸－デヒドロゲナーゼ（参照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００２０４６）を指す。
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの対照ＲＮＡ試料を更に含む。
いくつかの実施形態では、プライマーは、１２０ｂｐ未満のアンプリコンサイズを提供する。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ特異的プライマーは、１５～３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、２、若しくは３の配列のうちの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、及び／又はＨＬＡ－Ｂ／Ｃ特異的プライマーは、１５～３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号４、５、若しくは６の配列うちの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含み、及び／又はＨＬＡ－Ｇ特異的プライマーは、１５～３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号７～２７の配列のうちの１つの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含み、並びに／あるいはＨＬＡ－Ｈ特異的プライマーは、１５～３０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号２８～３３の配列のうちの１つの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、がん適応症は、乳がん、卵巣がん、肺がん、膀胱がん、胃がん、又は結腸がんである。
更なる態様において、本発明は、がんについての予後バイオマーカー又は予測バイオマーカーとして、特に、化学療法に対する耐性を示す又は免疫療法に対する耐性を示す予測バイオマーカーとして、ＨＬＡ－ＥのＲＮＡ転写物の発現レベル、及び／もしくＨＬＡ－ＦのＲＮＡ転写物の発現レベル、並びに／又はＨＬＡ－ＧのＲＮＡ転写物の発現レベルの使用に関する。
「マーカー」又は「バイオマーカー」という用語は、存在又は濃度を検出し、例えば数学的アルゴリズムにより、疾患状態などの既知の状態又はこれらの組み合わせと相関させることができる、生体分子、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、ホルモンなどを指す。
本明細書で使用される「予後マーカー」という用語は、治療された又は治療されていない患者においてそれぞれの疾患（例えば、膀胱がん）の起こり得る経過に関する情報を提供するマーカーを指す。いくつかの実施形態では、予後は、疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）、無再発生存期間（ＲＦＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、及び無遠隔再発生存期間のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、予後は、ＤＳＳを含む。本明細書で使用される「単一の予後バイオマーカー」という用語は、追加の予後マーカーが予後に使用／分析されていないことを意味する。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＥのＲＮＡ転写物の発現レベル又はＨＬＡ－ＦのＲＮＡ転写物の発現レベル又はＨＬＡ－ＧのＲＮＡ転写物の発現レベルは、単一の予後バイオマーカーとして使用される。
いくつかの実施形態では、
－ＨＬＡ－ＧのＲＮＡ転写物の規定された発現閾値よりも低いＨＬＡ－ＥのＲＮＡ転写物の発現レベルは、陽性の予後を示し、及び／若しくは
－ＨＬＡ－ＦのＲＮＡ転写物の規定された発現閾値よりも低いＨＬＡ－ＦのＲＮＡ転写物の発現レベルは、陰性の予後を示し、並びに／又は
－ＨＬＡ－ＧのＲＮＡ転写物の規定された発現閾値よりも低いＨＬＡ－ＦのＲＮＡ転写物の発現レベルは、陽性の予後を示す。
いくつかの実施形態では、陽性の予後は、長期の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）、無再発生存期間（ＲＦＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、及び無遠隔再発生存期間のうちの１つ以上、好ましくはＤＳＳの確率の増加を含む。
いくつかの実施形態では、
－ＨＬＡ－ＥのＲＮＡ転写物の規定された発現閾値よりも高いＨＬＡ－ＥのＲＮＡ転写物の発現レベルは、陰性の予後を示し、及び／若しくは
－ＨＬＡ－ＦのＲＮＡ転写物の規定された発現閾値よりも高いＨＬＡ－ＦのＲＮＡ転写物の発現レベルは、陽性の予後を示し、並びに／又は
－ＨＬＡ－ＦのＲＮＡ転写物の規定された発現閾値よりも高いＨＬＡ－ＧのＲＮＡ転写物の発現レベルは、陰性の予後を示す。
いくつかの実施形態では、陰性の予後は、長期の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）、無再発生存期間（ＲＦＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、及び無遠隔再発生存期間のうちの１つ以上、好ましくはＤＳＳの確率の低下を含む。
別の態様では、本発明は、例えば本明細書で規定される方法において、膀胱がん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するための、本明細書で規定される１対のプライマー及び／又は本明細書で規定されるプローブの使用であって、該プライマーの対及び／又はプローブは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇからなる群から選択される遺伝子に特異的である、使用に関する。
いくつかの実施形態では、プローブは、蛍光レポーター部分及び蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
更に別の態様では、本発明は、逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって膀胱がん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するためのキットを製造するための、本明細書で規定される１対のプライマー及び／又は本明細書で規定されるプローブの使用であって、該プライマーの対及び／又はプローブは、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、又はＨＬＡ－Ｊからなる群から選択された遺伝子に特異的である。
いくつかの実施形態では、プローブは、蛍光レポーター部分及び蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
一態様では、本発明は、がんを有する患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するインビトロ方法であって、ＲＮＡ転写物の発現レベルを決定することと、その後、上記のＨＬＡ発現を決定することと、を含む、方法に関する。
本明細書で使用される「腫瘍の分子サブタイプ」（又は「がんの分子サブタイプ」）という用語は、別個の分子プロファイル、例えば、遺伝子発現プロファイルによって特徴付けられる腫瘍／がんのサブタイプを指す。
いくつかの実施形態では、上記方法は、１つ以上の追加の非参照遺伝子の発現レベル、特に、そのＲＮＡ転写物の発現レベルの決定を含む。
本明細書で使用される「非参照遺伝子」という用語は、検査されているシステム、すなわちがんにおけるＲＮＡ転写物／ｍＲＮＡレベルでの可変レベルの発現を有し、従って、例えば、腫瘍／がんのサブタイピング及び／又はがんの進行の評価のために使用することができる遺伝子を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、非参照遺伝子は、腫瘍マーカー、例えば、先行技術からの既知のものから選択される。本発明に従って使用することができる非参照遺伝子は、膀胱特異的又は非膀胱特異的遺伝子であり得る。
いくつかの実施形態では、上記方法は、４つ以上、３つ以上、又は２つ以上の追加の非参照遺伝子の発現レベル、特に、そのＲＮＡ転写物の発現レベルの決定を含まない。
いくつかの実施形態では、上記方法は、任意の追加の非参照遺伝子の発現レベル、特に、そのＲＮＡ転写物の発現レベルの決定を含まない。言い換えれば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、又はＨＬＡ－Ｊ以外の遺伝子、及び任意選択で、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－Ｄから選択される少なくとも１つの遺伝子、並びに任意選択で、１つ以上の参照遺伝子の発現レベル、特に、そのＲＮＡ転写物の発現レベルは決定されない。
いくつかの実施形態では、最大７つ、好ましくは６つ、より好ましくは５つ、更により好ましくは４つの異なる非参照遺伝子のＲＮＡ転写物の発現レベルが決定される。
いくつかの実施形態では、上記方法は、組織学的等級付け又はリンパ節状態の決定などの任意の他の診断ステップを含まない。いくつかの実施形態では、上記方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を含むいかなるステップも含まない。
本発明のいくつかの実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、膀胱若しくは尿道腫瘍であるか、又は膀胱若しくは尿道腫瘍に由来する（例えば、転移による）。本明細書で使用される「膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）」という用語は、膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ）を指す。
いくつかの実施形態では、腫瘍の試料は、がん患者から単離された腫瘍組織試料（例えば、腫瘍の生検又は切除組織）であり得る。好ましい実施形態では、腫瘍組織試料は、腫瘍組織試料の凍結切片であるか、又は化学的に固定された腫瘍組織試料である。より好ましい実施形態では、腫瘍組織試料は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。いくつかの実施形態において、腫瘍の試料は、腫瘍組織試料から抽出された（トータル）ＲＮＡである。特に好ましい実施形態では、腫瘍の試料は、ＦＦＰＥ腫瘍組織試料から抽出された（トータル）ＲＮＡである。当業者は、ＲＮＡ抽出手順を行うことができる。例えば、５～１０μｍのＦＦＰＥ腫瘍組織巻き状物由来のトータルＲＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡパラフィンキット（Ｒｏｃｈｅ、スイス・バーゼル）、若しくはＸＴＲＡＫＴ ＲＮＡ抽出キットＸＬ（Ｓｔｒａｔｉｆｙｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ドイツ・ケルン）、又はＲＮＸｔｒａｃｔ（登録商標）抽出キット（ＢｉｏＮＴｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ・マインツ）を使用して抽出することができる。使用／検査する試料材料を冷凍庫に保存し、それぞれの試料材料を解凍した後、適切な時点で本発明の方法を行うことも可能である。試料は、療法治療の開始前、療法治療中、及び／又は療法治療後、すなわち、がん治療薬の投与前、投与中、又は投与後に、がん患者から取得し得る。
更なる態様では、本発明は、腫瘍治療のために患者、例えば、膀胱がんの患者を層別化する方法であって、第１のステップとして、上記で規定されたインビトロ方法を使用してがん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定することと、第２のステップとして、インビトロ方法で同定された分子サブタイプに基づいて腫瘍治療レジメンを選択することと、を含む、方法に関する。
いくつかの実施形態では、腫瘍治療のために膀胱がん患者を層別化する上記方法は、上記で規定されたインビトロ方法を使用してがん患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するステップ以外に、組織学的等級付け又はリンパ節状態の決定などの任意の他の診断ステップを含まない。いくつかの実施形態では、上記方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を含むいかなるステップも含まない。
いくつかの実施形態では、分子サブタイプは、ＨＥＲ２陽性、トリプルネガティブ（「基底様」とも称される）、ルミナルＡ、及びルミナルＢからなる群から選択される。「基底様」という用語は、そのような腫瘍は、基底上皮細胞の遺伝子発現と遺伝子発現にいくつかの類似性がある事実を指す。「ルミナル」という用語は、腫瘍とルミナル上皮との間の遺伝子発現の類似性に由来する。
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、及びＫｉ６７のＲＮＡ転写物の発現レベルが決定され、分子サブタイプが、ＨＥＲ２＋、ＨＥＲ２－／ＥＳＲ１＋、ＨＥＲ２－／ＥＳＲ１－／Ｋｉ６７＋、及びＨＥＲ２－／ＥＳＲ１－／Ｋｉ６７－を含む群、好ましくはそれらからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記分子サブタイプは、ＭＩＢＣに関連する。分子サブタイプは、臨床転帰及び治療への反応で大きく異なり得る。
いくつかの実施形態では、
－分子サブタイプはＨＥＲ２陽性であり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び／又はＢＣＧ点滴注入及び／又は化学療法及び／又は抗ＨＥＲ２療法及び／又は免疫チェックポイントを標的化する抗体の投与及び／又は膀胱切除、続いて、抗ＨＥＲ２治療薬及び／又は化学療法薬の投与を含む；
－分子サブタイプはトリプルネガティブであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び／又はＢＣＧ点滴注入及び／又は化学療法、特にネオアジュバント化学療法、及び／又は免疫チェックポイントを標的化する抗体の投与及び／又は膀胱切除を含む；
－分子サブタイプはルミナルＡであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び／又はＢＣＧ点滴注入及び／又は膀胱切除及び／又は化学療法、特にアジュバント化学療法、及び／又は（アジュバント）内分泌療法を含む；並びに／或いは
－分子サブタイプはルミナルＢであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除及び／又はＢＣＧ点滴注入及び／又は内分泌療法及び／又は化学療法、特に、アジュバント化学療法又は周術期における化学療法、及び／又は膀胱切除を含む。
いくつかの実施形態では、
－分子サブタイプはルミナルＡであり、膀胱がんはＮＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、経尿道切除（ＴＵＲ）及び／又は桿菌カルメットゲラン（ＢＣＧ）点滴注入、好ましくはＴＵＲ及びＢＣＧ点滴注入を含む；
－分子サブタイプはルミナルＢであり、膀胱がんはＮＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、アジュバント内分泌療法を伴う又は伴わないアジュバント化学療法を含む；
－分子サブタイプはＨＥＲ２陽性であり、膀胱がんはＮＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、（ネオ）アジュバント抗ＨＥＲ２療法を伴う又は伴わない（ネオ）アジュバント化学療法を含む；
－分子サブタイプはトリプルネガティブであり、膀胱がんはＮＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンはネオアジュバント化学療法を含む；
－分子サブタイプはルミナルＡであり、膀胱がんはＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、（ｉ）膀胱切除及び（ｉｉ）アジュバント化学療法及び／又はアジュバント内分泌療法、好ましくはアジュバント化学療法又はアジュバント内分泌療法を含む；
－分子サブタイプはルミナルＢであり、膀胱がんはＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、（ｉ）膀胱切除及び（ｉｉ）アジュバント化学療法及び／又はアジュバント内分泌療法、好ましくはアジュバント化学療法及びアジュバント内分泌療法を含む；
－分子サブタイプはＨＥＲ２陽性であり、膀胱がんはＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、（ｉ）膀胱切除及び（ｉｉ）アジュバント化学療法及び／又はアジュバント抗ＨＥＲ２療法、好ましくはアジュバント化学療法及びアジュバント抗ＨＥＲ２療法を含む；並びに／或いは
－分子サブタイプはトリプルネガティブであり、膀胱がんはＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、その後の膀胱切除を伴う又は伴わないネオアジュバント化学療法を含む。
いくつかの実施形態では、分子サブタイプはＨＥＲ２陽性であり、がんは好ましくはＮＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、内分泌療法、ホルモン療法、及び／又は化学療法と組み合わせた抗ＨＥＲ２療法を含み、これらはすべて、アジュバント療法又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
別の実施形態では、分子サブタイプはＨＥＲ２陽性であり、がんは好ましくはＮＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、点滴注入療法、例えば、ＢＣＧ点滴注入を含む。
いくつかの実施形態では、分子サブタイプはルミナルＢであり、膀胱がんは好ましくはＮＭＩＢＣであり、腫瘍治療レジメンは、好ましくは内分泌療法と組み合わせた、例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））、又はアロマターゼ阻害剤と組み合わせた、点滴注入療法（例えば、ＢＣＧ点滴注入）及び／又はネオアジュバント／アジュバント化学療法を含む。
「抗ＨＥＲ２療法」という用語の意味は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２療法は、抗ＨＥＲ２抗体、特にモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体の投与を含む。モノクローナル抗ＨＥＲ２抗体には、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））及びペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））が含まれ、これらは単独又は組み合わせて投与され得る。トラスツズマブは、ＨＥＲ２が過剰発現しているがんにのみ有効である。エルツマキソマブ（Ｒｅｘｏｍｕｎ（登録商標））などの他のモノクローナル抗体は、現在、臨床試験が行われている。抗ＨＥＲ２抗体は、細胞毒性剤、薬物（例えば、免疫抑制剤）、化学療法剤もしくは放射性核種、又は放射性同位元素などの治療部分／治療薬を含むように更に改変することができる。従って、腫瘍治療レジメンが抗ＨＥＲ２療法及び化学療法（の組み合わせ）を含む場合、化学療法剤に結合した抗ＨＥＲ２抗体を使用することができる。細胞毒素又は細胞毒性剤には、細胞に有害であり、特に細胞を殺す任意の薬剤が含まれる。例には、メルタンシン又はエムタンシン（ＤＭ１）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は同族体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートは、トラスツズマブ（Ｔ）－ＤＭ１、例えば、トラスツズマブエムタンシンである。抗体コンジュゲートを形成するための他の好適な治療薬には、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに代謝拮抗剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、治療薬は、細胞毒性剤又は放射性毒性剤である。別の実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、治療薬は、ＧＭ－ＣＳＦである。別の好ましい実施形態では、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、又はリシンＡである。更なる治療部分には、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質合成に作用する治療部分が含まれる。いくつかの転写阻害剤が既知である。例えば、転写阻害剤及びＤＮＡ損傷剤の両方であるアクチノマイシンＤは、ＤＮＡ内に入り込み、従って転写の開始段階を阻害する。フラボピリドールは、転写の伸長段階を標的化する。α－アマニチンは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに直接結合し、これにより、開始段階及び伸長段階の両方が阻害される。抗ＨＥＲ２抗体を放射性同位元素、例えばヨウ素－１３１、イットリウム－９０、又はインジウム－１１１に結合させて、細胞毒性放射性医薬品を生成することもできる。抗ＨＥＲ２抗体の投与の代替は、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）又はＴｙｖｅｒｂ（登録商標））、アファチニブ、又はネラチニブなど、ＨＥＲ２を標的化する小さな化合物の投与である。抗ＨＥＲ２療法はまた、内分泌療法（抗ホルモン治療とも称される）、例えばプロゲスチンによるホルモン療法、及び／又は化学療法で補充され得る。
化学療法は、細胞増殖抑制化合物又は細胞毒性化合物などの化学療法剤の投与を含む。従来の化学療法剤は、ほとんどのがん細胞の主要な特性のうちの１つである急速な***を行う細胞を死滅させることによって作用する。「化学療法剤」という用語には、タキサン、白金化合物、ヌクレオシド類似体、カンプトテシン類似体、アントラサイクリン及びアントラサイクリン類似体、エトポシド、ブレオマイシン、ビノレルビン、シクロホスファミド、代謝拮抗薬、抗有糸***薬、及び抗体コンジュゲートに関連して上記で開示された薬剤を含むアルキル化剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、化学療法は、白金系であり、すなわち、白金系化合物、例えば、シスプラチンの投与を含む。化学療法剤への言及は、任意のプロドラッグ、例えば、エステル、塩、又は上記薬剤のコンジュゲートなどの誘導体を含み得る。例は、上記薬剤と担体物質、例えば、アルブミン結合パクリタキセルなどのタンパク質結合パクリタキセルとのコンジュゲートである。好ましくは、上記薬剤の塩は薬学的に許容される。化学療法剤は、通常３～６ヶ月間、組み合わせて投与される場合が多い。最も一般的な治療のうちの１つは、ＡＣとして既知である、シクロホスファミド及びドキソルビシン（アドリアマイシン；アントラサイクリン及びアントラサイクリン類似体の群に属する）である。時々、ドセタキセルなどのタキサン薬が追加され、そのレジメンはＣＡＴとして既知であり、タキサンはがん細胞中の微小管を攻撃する。同等の結果をもたらす別の一般的な治療は、シクロホスファミド、代謝拮抗剤であるメトトレキサート、及びヌクレオシド類似体（ＣＭＦ）であるフルオロウラシルである。別の標準的な化学療法治療には、フルオロウラシル、エピルビシン、及びシクロホスファミド（ＦＥＣ）が含まれ、これらにはドセタキセルなどのタキサン又はビノレルビンを補充することができる。
いくつかの実施形態では、分子サブタイプはルミナルＢであり、腫瘍治療レジメンは、化学療法剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、分子サブタイプはルミナルＢであり、腫瘍治療レジメンは、タキサン、好ましくはドセタキセルの投与を含む。いくつかの実施形態では、タキサンは、白金系の化学療法と組み合わせて投与される。
内分泌療法（抗ホルモン治療とも称される）は、エストロゲン及び／又はプロゲステロン受容体を遮断する／ダウンレギュレートする薬剤、例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））又はフルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））、或いは、アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））又はレトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））によるエストロゲンの生成を妨げる薬剤の投与により、エストロゲンが増え続けることを必要とするがんを標的化する。しかしながら、アロマターゼ阻害剤は、閉経後の患者にのみに好適である。これは、閉経後の女性における活性アロマターゼが閉経前の女性で一般に認められる形態とは異なるため、これらの薬剤は閉経前の女性の優勢なアロマターゼを阻害するのに有効ではないためである。
別の態様では、本発明は、がんの治療に使用され得、方法は、第１のステップとして、上記で規定した方法を使用して腫瘍治療のために膀胱がん患者を層別化し、第２のステップとして、選択された腫瘍治療レジメンを膀胱がん患者に提供することを含む。腫瘍治療レジメンは、上記で規定したインビトロ方法によって同定された分子サブタイプに基づいて選択される。
上記の方法の第１のステップ及び第２のステップは、時間及び／又は場所に関して、互いに別々に行われ得る。第１のステップにより、例えば、異なる時間及び／又は場所において第２のステップを行うために使用される治療指針の発行が付与され得る。第１のステップの直後に第２のステップを行い得る。
いくつかの実施形態では、上記の方法は、アジュバント／ネオアジュバント化学療法に賛成する又は反対する直接的な意思決定のために、上記で規定されたインビトロ方法によって得られた定量的結果を使用することを含む。
別の態様では、本発明は、膀胱がんが本明細書で規定する分子サブタイプによって特徴付けられ、方法が分子サブタイプに基づいて選択される腫瘍治療レジメンを提供することを含む、がんの治療に使用され得る。
別の態様では、本発明は、治療薬を製造する方法であって、上記の方法を使用して個人のＨＬＡパターンを決定することと、決定された個人のＨＬＡパターンに基づいて可溶性ＨＬＡドメイン又は抗体を製造することと、を含む、方法に関する。本発明はまた、がんの治療に使用するための上記に従って製造された治療薬に関する。
図１は、実施例２による、潜在的な翻訳開始部におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。 図２は、エクソン４からエクソン５への接合部におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。 図２は、エクソン４からエクソン５への接合部におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。 図２は、エクソン４からエクソン５への接合部におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。 図２は、エクソン４からエクソン５への接合部におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。 図３は、エクソン８におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。 図３は、エクソン８におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。 図４は、筋層浸潤性膀胱がん患者のＦＦＰＥ組織のＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ルミナル及び基底サブタイプマーカー、チェックポイント標的遺伝子、並びにＦＧＦＲ１～４の遺伝子発現のデータ分布を示す。 図４は、筋層浸潤性膀胱がん患者のＦＦＰＥ組織のＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ルミナル及び基底サブタイプマーカー、チェックポイント標的遺伝子、並びにＦＧＦＲ１～４の遺伝子発現のデータ分布を示す。 図５は、筋層浸潤性膀胱がん患者のＸＸ組織のＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ルミナル及び基底サブタイプマーカー、チェックポイント標的遺伝子、並びにＦＧＦＲ１～４遺伝子ｍＲＮＡ発現の遺伝子間スピアマン相関を示す。 図６は、筋層浸潤性膀胱がん患者のＦＦＰＥ組織のＲＴ－ｑＰＣＲによって決定されたＨＬＡ遺伝子ｍＲＮＡ発現の遺伝子間スピアマン相関を示す。 図７は、ＨＬＡ－Ａエクソン８、ＨＬＡ－Ｇエクソン８、及びＨＬＡ－Ｇエクソン５ｍＲＮＡ発現を組み合わせることによる層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者のＦＦＰＥ組織の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図８は、ＨＬＡ－Ａエクソン８及びＨＬＡ－Ｇエクソン８ｍＲＮＡ発現の遺伝子間組み合わせによる層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者のＦＦＰＥ組織の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図９は、ＨＬＡ－Ｇエクソン８及びエクソン５ｍＲＮＡ発現の遺伝子内組み合わせによる層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者のＦＦＰＥ組織の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図１０は、ＨＬＡ－Ｇエクソン８及びエクソン５ｍＲＮＡ発現のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者（ｎ＝６１）のＦＦＰＥ組織の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図１１は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ＨＬＡ－Ｆアイソフォームの相対的ｍＲＮＡ発現（４０－ＤＣＴ）及びアンチセンスＨＬＡ－Ｆ発現のデータ分布を示す。 図１１は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ＨＬＡ－Ｆアイソフォームの相対的ｍＲＮＡ発現（４０－ＤＣＴ）及びアンチセンスＨＬＡ－Ｆ発現のデータ分布を示す。 図１２は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ＥＳＲ１、ＨＬＡ－Ｆ３、及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１発現の相対的ｍＲＮＡ発現（４０－ＤＣＴ）についてのデータ分布を示す。 図１３は、無増悪生存期間を予測するためにＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ネオアジュバント治療を受けた卵巣がん患者の治療前生検試料におけるＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現の分割検査を示す。 図１４は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｆ３のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく無増悪生存期間（ＰＦＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図１５は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｆ３のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく全生存期間（ＯＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図１６は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現を含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＯＳについての多変量解分析を示す。 図１７は、無増悪生存期間を予測するためにＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ネオアジュバント治療を受けた卵巣がん患者の治療前生検試料におけるＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現の分割検査を示す。 図１８は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、層別化ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現に基づく無増悪生存期間（ＰＦＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図１９は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、層別化ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現に基づく全生存期間（ＯＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図２０は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、並びにＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現の組み合わせを含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＰＦＳの多変量分析を示す。 図２１は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、並びにＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現の組み合わせを含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＯＳについての多変量分析を示す。 図２２は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、層別化ＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１ ｍＲＮＡ発現に基づく全生存期間（ＯＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図２３は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、層別化ＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１ ｍＲＮＡ発現に基づく全生存期間（ＯＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図２４は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、並びにＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１の組み合わせを含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＰＦＳについての多変量分析を示す。 図２５は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、並びにＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１の組み合わせを含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＯＳについての多変量分析を示す。 図２６は、進行性又は転移性尿路上皮がんコホートのコンソート図を示す。 図２７は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２発現による層別化に基づく局所進行又は転移性ＵＢＣ（ｎ＝５５）を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図２８は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２及びＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性ＵＢＣ（ｎ＝５５）を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図２９は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２及びＨＬＡ－Ｂ／Ｃエクソン８ ｍＲＮＡ発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性ＵＢＣ（ｎ＝５５）を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。 図３０は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃエクソン８ ｍＲＮＡ発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性ＵＢＣ（ｎ＝５５）を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。
本発明を以下に詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されず、その理由は、これらが変動し得るためであることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。別段の規定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
以下に、本発明の特定の構成要素を記載する。これらの構成要素は、特定の実施形態とともに列挙され得るが、それらは任意の様式及び任意の数で組み合わされて、追加の実施形態を作り出すことができることを理解されたい。様々に記載された例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。本記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい構成要素と組み合わせる実施形態をサポートし、包含すると理解されるべきである。更に、本出願において記載されるすべての構成要素の任意の順列及び組み合わせは、文脈で別段の指示がない限り、本出願の記載によって開示されているとみなされるべきである。例えば、当業者には明らかであるように、特定の遺伝子のＲＮＡ転写物の発現レベル（特定の遺伝子のＲＮＡ転写物の規定された発現閾値よりも高い又は低い）及びそれに基づく分子サブタイプに関する本明細書に開示される特定の実施形態は、所与の腫瘍の分子サブタイプの同定を可能にするように組み合わせることができる。
実施形態及び実施例の説明に進む前に、用語に関するいくつかの一般的な注釈を以下に示す：好ましくは、本明細書で使用する用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｈ．Ｇ．Ｗ． Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ， ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｌｂｌ， Ｅｄｓ．， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）（非特許文献３）に記載されるように規定される。
本発明の実施は、別段で指示がない限り、化学、生化学、細胞生物学、免疫学、及び当該分野の文献で説明される組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２０００）（非特許文献４）。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通じて、文脈が別段で必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載されたメンバー、整数又はステップ又はメンバーの群、整数（複数）又はステップ（複数）を含むことを意味し、しかしながら、任意の他のメンバー、整数又はステップ又はメンバーの群、整数（複数）又はステップ（複数）を除外することを意味しないと理解されるが、いくつかの実施形態では、そのような他のメンバー、整数又はステップ又はメンバーの群、整数（複数）又はステップ（複数）は除外されてもよく、すなわち、主題は、記載されたメンバー、整数又はステップ又はメンバーの群、整数（複数）又はステップ（複数）を含むことから構成される。本発明を記載する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語並びに同様の言及は、本明細書で別段で指示がない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内にある各々の別個の値について個別に言及する簡便な方法として機能することを目的としている。本明細書に別段で指示がない限り、各値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書に別段で指示がない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書で提供されるすべての例又は例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良く例示することを意図しており、別段で特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる文言も、本発明の実施に必要不可欠である特許請求の範囲に記載されていない構成要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用される患者の「試料の分類」という用語は、少なくとも２つのカテゴリーのうちの少なくとも１つとの該試料の関連に関する。これらのカテゴリーは、例えば、「高リスク」及び「低リスク」、高リスク、中リスク、及び低リスクであり得、リスクは、特定の期間において発生する特定の事象、例えば、転移の発生、無病生存期間などの確率である。それは更に、疾患の好ましい若しくは好ましくない臨床転帰、又は所与の治療などに対する反応若しくは非反応などのカテゴリーを意味し得る。分類は、アルゴリズム、特に識別機能を使用して行い得る。アルゴリズムの簡単な例は、第１の定量的パラメーター、例えば、関心のある遺伝子の発現レベルが特定の閾値を上回っているか又は下回っているかによる分類である。患者の試料の分類は、疾患の転帰を予測するために使用することができる。関心のある１つの遺伝子の発現レベルを使用することに代えて、関心のあるいくつかの遺伝子の組み合わせスコアを使用し得る。更に、追加のデータを第１の定量的パラメーターと組み合わせて使用し得る。そのような追加のデータは、患者の性別、年齢、体重、腫瘍のグレード又はステージなどの患者の臨床データであり得る。
「転移」という用語は、がん細胞が元の部位から体の別の部分に広がることを意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの浸潤、体腔及び血管に入るための内皮基底膜の浸透、次いで、血液によって輸送された後での標的臓器の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新しい腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍細胞又は成分が残存して転移能を発達させ得るため、腫瘍転移は原発腫瘍の除去後でもしばしば発生する。
「判別関数」は、対象物又は事象を分類するために使用される一連の変数の関数である。従って、判別関数により、患者、試料、又は事象を、該患者、試料、又は事象から利用可能なデータ又はパラメーターに従ってカテゴリー又は複数のカテゴリーに分類することが可能となる。そのような分類は、当業者に周知の統計分析の標準的な手段である。例えば、患者は、上記の患者、試料、又は事象から得られたデータに従って、「高リスク」又は「低リスク」、「転移の可能性が高い」又は「転移の可能性が低い」、「治療が必要である」又は「治療が不要である」に分類され得る。分類は、「高い対低い」に限定されるものではなく、複数のカテゴリー、等級付けなどへと行い得る。分類を可能にする判別関数の例には、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ｋ近傍法（ｋＮＮ）、（ナイーブ）ベイズモデル、又は例えばサブグループ発見、決定木、データの論理的分析（ＬＡＤ）などにおける区分定義関数によって規定される判別関数が含まれる。
本明細書で使用される「予測」という用語は、患者が所与の治療に対して有利又は不利に反応する可能性に関する。特に、本明細書で使用される「予測」という用語は、腫瘍を所与の療法で治療した場合の腫瘍の悪性度の個々の評価又は患者の予想生存率（ＤＦＳ、無病生存期間）に関する。それとは対照的に、「予後」という用語は、腫瘍が未治療のままである場合の腫瘍の悪性度の個々の評価又は患者の予想生存率（ＤＦＳ、無病生存期間）に関する。
「反応マーカー」という用語は、所与の治療に対する患者の臨床反応を予測するために使用することができるマーカーに関する。反応には、例えばＣＴスキャン及び／又は血清バイオマーカーによって示されるネオアジュバント療法又は緩和治療の際の腫瘍縮小の直接観察、並びに無病生存期間（ＤＦＳ）、全生存期間（ＯＡＳ）、転移特異的生存期間（ＭＳＳ）、疾患特異的生存期間、及び関連する評価に対する影響が含まれる。
本明細書で使用される患者の「臨床反応」という用語は、全生存期間、無増悪生存期間、無再発生存期間、及び無遠隔再発生存期間などの当該技術分野で通常使用される測定を含む、患者の状態の任意の測定の改善を意味する、患者における特定の治療の有効性に関する。無再発生存期間（ＲＦＳ）とは、手術から最初の局所再発、領域再発、又は遠隔再発までの時間（年単位）を指す。無遠隔再発生存期間（ＤＦＲＳ）とは、手術及び／又は最初の診断から最初の解剖学的に遠隔の再発までの時間（年単位）を指す。実際のこれらの測定値の計算は、打ち切られる又は考慮されない事象の規定に応じて、研究ごとに変動し得る。
「新生物疾患」という用語は、がん組織を指す。これには、がん腫、例えば、上皮内がん、浸潤性がん腫、転移性がん腫、及び前悪性状態、組織学的起源とは無関係の新形態変化が含まれる。「腺がん」という用語は、腺組織に由来する悪性腫瘍を指す。
「がん（ｃａｎｃｅｒ）」及び「がん（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」という用語は、通常、調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか又は説明する。「がん」という用語は、罹患組織又は細胞凝集の任意のステージ、グレード、組織形態学的特徴、侵襲性、攻撃性、又は悪性度に限定されない。特に、ステージ０のがん、ステージＩのがん、ステージＩＩのがん、ステージＩＩＩのがん、ステージＩＶのがん、グレードＩのがん、グレードＩＩのがん、グレードＩＩＩのがん、悪性がん、原発がん、並びに他のすべての種類のがん、悪性腫瘍、及び婦人科がんに特に関連する変質が含まれる。「新生物疾患」又は「がん」という用語は、いかなる組織又は細胞種に限定されない。それらは、がん患者の原発性、続発性、又は転移性病変も含み、局所的に沈着しているか又は患者の体全体に遊離浮遊しているがん細胞又は微小残存疾患細胞によって罹患されたリンパ節も含む。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語には、異常に調節された細胞の成長、増殖、分化、接着、及び／又は移動を特徴とする疾患が含まれる。本明細書で使用される、がんという用語はまた、がん転移を含む。「腫瘍」及び「がん」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、悪性又は良性にかかわらず、すべての新生物細胞成長及び増殖、並びにすべての前がん及びがん細胞及び組織を指す。
本明細書で使用される場合、「肺がん」という用語は、肺で診断されるがん又は悪性腫瘍を指し、肺組織のすべてのがん、新生物の成長、及びがん変質を含むことを意味する。肺がんの例には、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、特に肺扁平上皮がん、腺がん、気管支肺胞がん、大細胞肺がん、並びに胸膜肺芽腫及びカルチノイド腫瘍などの他のものが含まれるが、これらに限定されない。
「新生物細胞」という用語は、細胞増殖の増加、細胞***の対称性の変化、又は細胞死メカニズムの減少により、正常よりも急速に成長する異常な細胞を指す。従って、本発明の新生物細胞は、良性新生物の細胞であり得、又は悪性新生物の細胞であり得る。
更に、新生物疾患又はがんの「状態を特徴付ける」という用語は、以下の状態のうちの１つ以上の測定及び評価に関するが、これらに限定されない：腫瘍の種類、組織形態学的外観、外部シグナル（例えば、ホルモン、成長因子））への依存、侵襲性、運動性、悪性腫瘍のＴＮＭ分類による状態（ＴＮＭ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒによって開発及び管理されているがんステージ分類システム、又は類似性、攻撃性、悪性度、転移の可能性、及び特定の治療に対する反応。
「治療方法」、「治療様式」、「レジメン」、又は「化学レジメン」及び「治療レジメン」という用語は、抗腫瘍剤、及び／若しくは抗血管剤、及び／若しくは免疫刺激剤、及び／若しくは血液細胞増殖剤の適時の連続的若しくは同時投与、並びに／又はがん治療のための放射線療法、及び／若しくは温熱療法、及び／若しくは低体温療法を指す。これらの投与は、アジュバント及び／又はネオアジュバント様式で行われ得る。そのような「プロトコル」の組成は、単剤の用量、適用の時間枠、及び規定された治療ウィンドウ内での投与頻度において変動し得る。現在、様々な薬物及び／又は物理的様式の様々な組み合わせ並びに様々なスケジュールが調べられている。
「内分泌治療」という用語は、ホルモン／ホルモンレベルの変化によって所望の治療効果を生み出す、ホルモン療法又は抗ホルモン療法として既知である様々な治療方法論を指す。治療には、ホルモン若しくはホルモン類似体、合成ホルモン若しくは他の薬物の患者への投与、或いはホルモン拮抗薬、ホルモン受容体拮抗薬、又は卵巣の外科的切除若しくはホルモン合成の化学的抑制のいずれかによるホルモン除去療法の使用による体内のホルモンレベルの低下が含まれ得る。内分泌療法は、選択的エストロゲン再取り込み阻害剤、選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーター、アロマターゼ阻害剤、及び卵巣切除などのホルモン療法を含むように受けるであろう。上記の内分泌治療は、ホルモン若しくはホルモン類似体、合成ホルモン、又は他の薬物、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、及び／又はゴセレリン（商品名Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））の患者への投与を含み得る。好ましい実施形態では、上記の内分泌治療は、タモキシフェン又はタモキシフェン及びゴセレリンの投与を含む。更に、上記の内分泌治療は、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、フルベストラント、トレミフェン、及び酢酸メガステロールを含む群から選択される抗エストロゲン薬の投与を含み得る。上記の内分泌治療はまた、エストロゲン、プロゲスチン、及び／又はゲスターゲンの投与を含み得る。
「非タンパク質ベースで遺伝子の発現レベルを決定する」という用語は、二次遺伝子翻訳産物、すなわち、タンパク質に焦点を合わせた方法ではなく、ＲＮＡ及びＤＮＡ分析に基づく遺伝子発現の他のレベルに焦点を合わせた方法に関する。本発明のいくつかの実施形態では、分析は、ｍＲＮＡの前駆体形態を含む、ｍＲＮＡを使用する。例示的な決定可能な特性は、ＨＬＡ ｍＲＮＡ、すなわち、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊ、又はそれらの一部の量である。
あるいは、本明細書に開示される差次的に発現される遺伝子は、試薬及び化合物を同定するための方法及びがん治療のためのこれらの試薬及び化合物の使用、並びに治療方法において使用され得る。遺伝子の差次的調節は、特定のがん細胞種又はクローンに限定されず、がん細胞、筋肉細胞、間質細胞、結合組織細胞、他の上皮細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、及び免疫系細胞、例えば、リンパ球、マクロファージ、キラー細胞の相互作用を示す。
「ＲＮＡ発現のパターン」という用語は、参照ＲＮＡ又は計算された平均発現値のいずれかと比較した、ＲＮＡ発現の決定されたレベルを指す。パターンは、２つのＲＮＡの比較に限定されず、ＲＮＡと参照ＲＮＡ又は試料との多重比較に関する。特定の「発現レベルのパターン」はまた、いくつかのＲＮＡの比較及び測定によって取得及び決定され、これらの転写物の互いに対する相対的存在量を示し得る。
本発明の意味の範囲内での「発現レベルの参照パターン」は、発現レベルの別のパターンとの比較に使用することができる発現レベルの任意のパターンであると理解されるべきである。本発明の好ましい実施形態では、発現レベルの参照パターンは、例えば、参照群として機能する健常な又は罹患した個体の群において観察される発現レベルの平均的パターンである。
本明細書で使用される「調節された（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）」若しくは「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」又は「調節された（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」若しくは「調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」及び「示差的に調節された（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）」という用語は、アップレギュレーション、すなわち、例えば、作動又は増強による活性化又は刺激、及びダウンレギュレーション、すなわち、例えば、拮抗、軽減、又は阻害による阻害又は抑制の両方を指す。
「反応」、「治療の成功」、又は「治療に対する反応」という句は、ネオアジュバント、アジュバント、及び緩和化学療法の設定において、規定された無腫瘍期間又は無再発期間又は無増悪生存期間（例えば、２年、４年、５年、１０年）の観察を指す。この無病期間、無再発期間、又は無増悪生存期間は、異なる腫瘍実体によって変動し得るが、ほとんどの再発が現れる平均期間よりも十分に長い。ネオアジュバント及び緩和療法方法論では、アポトーシス及び腫瘍塊の壊死又は血管新生事象の変化による血液供給の減少による腫瘍の縮小及び退縮の測定によって、反応を更にモニタリングすることができる。
「再発」又は「再発性疾患」という用語には、腫瘍の最初の診断及び治療から何年も後に現れ得る遠隔転移、若しくは局所リンパ節への腫瘍細胞の浸潤などの局所事象、又は適切な時間内に同じ部位及び元の器官での腫瘍細胞の発生が含まれる。
「再発の予測」又は「治療の成功の予測」は、本発明において記載される方法を指し、腫瘍標本は、例えば、その遺伝子発現、ゲノム状態、及び／若しくは組織病理学的パラメーター（ＴＮＭ及びグレードなど）、並びに／又は画像化データについて分析され、参照試料由来の既知のものとの発現パターンの相関に基づいて更に分類される。この分類は、そのような所与の腫瘍が再発を起こし、従って、所与の治療に対して「無反応」の腫瘍とみなされるという記述となり得るか、又は治療後の無病期間が延長された腫瘍として分類されることになり得る。
本明細書で使用される「マーカー遺伝子」という用語は、発現パターンが、悪性新生物又はがん評価における予測、予後、又は診断プロセスの一部として利用され得るか、あるいは、特に悪性新生物及び婦人科がんの治療又は予防に有用な化合物を同定するための方法において使用され得る、差次的に発現する遺伝子を指す。マーカー遺伝子はまた、標的遺伝子の特徴を有し得る。
本明細書で使用される「標的遺伝子」は、標的遺伝子発現レベル又は標的遺伝子産物活性レベルの調節が悪性新生物の症状を改善するように作用し得る様式でがん、例えば、肺がんに関与する、差次的に発現される遺伝子を指す。標的遺伝子はまた、マーカー遺伝子の特徴を有し得る。
本明細書で使用される「受容体」という用語は、神経伝達物質、ホルモン、又は他の物質、特にエストロゲンのようなホルモンなどの特定の分子（リガンド）に結合し、細胞応答を開始する、細胞膜上又は細胞質若しくは細胞核内のタンパク質に関する。受容体タンパク質の挙動におけるリガンド誘発性の変化は、リガンドの生物学的作用を構成する生理学的変化をもたらす。
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞がある種のシグナル又は刺激を別のものに変換する細胞内又は細胞間プロセスに関し、酵素によって行われ、かつ、ホルモン及び成長因子（細胞間）並びにセカンドメッセンジャー（細胞内）を介して関連付けられる規則正しい順序の細胞内及び細胞外の生化学反応をほとんどの場合に伴い、後者は「セカンドメッセンジャー経路」と考えられているものをもたらす。多くのシグナル伝達経路では、これらの事象に関与するタンパク質及び他の分子の数はプロセスが最初の刺激から生じるに従って増加し、「シグナルカスケード」をもたらし、しばしば比較的小さな刺激をもたらしてこれが大きな応答を誘発する。
本明細書で使用される「小分子」という用語は、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指すことを意味する。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、又は他の有機（炭素含有）若しくは無機分子であり得る。多くの製薬会社は、生物活性を調節する化合物を同定するために本発明のアッセイのいずれかでスクリーニングすることができる化学的及び／又は生物学的混合物、しばしば真菌、細菌、又は藻類の抽出物の広範なライブラリーを有する。
一本鎖核酸配列に関して使用される場合、「実質的に相同」という用語は、上記の低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸配列をハイブリダイズすることができる任意のプローブ（すなわち、それは一本鎖核酸配列の相補体である）を指す。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対形成に関して使用される。
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーションベースの方法」という用語は、相補的な一本鎖核酸又はヌクレオチド類似体を組み合わせて単一の二本鎖分子にするプロセスを付与する方法を指す。ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体は、通常の条件下でそれらの相補体に結合するため、２つの完全に相補的な鎖は互いに容易に結合する。生物分析において、非常に頻繁に標識される一本鎖プローブは、相補的な標的配列を見出すためのものである。そのような配列が試料に存在する場合、プローブは上記の配列にハイブリダイズし、次いで、これを標識によって検出することができる。他のハイブリダイゼーションベースの方法は、マイクロアレイ及び／又はバイオチップ方法を含む。該方法において、プローブは固相に固定化され、次いで、これを試料に曝露する。相補的な核酸が試料に存在する場合、これらはプローブにハイブリダイズし、従って検出することができる。これらの手法は、「アレイベースの方法」としても既知である。更に別のハイブリダイゼーションベースの方法は、以下に記載されるＰＣＲである。発現レベルの決定に関して、ハイブリダイゼーションベースの方法は、例えば、所与の遺伝子のｍＲＮＡの量を決定するために使用することができる。
「アレイ」とは、デバイス上のアドレス可能な場所又は「アドレス」の配置を意味する。場所は、２次元配列、３次元配列、又はその他のマトリックス形式で配置することができる。場所の数は、数個から少なくとも数十万個の範囲であり得る。最も重要なことには、各場所は独立した反応部位を表す。アレイには、核酸アレイ、タンパク質アレイ、及び抗体アレイが含まれるが、これらに限定されない。「核酸アレイ」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は遺伝子のより大きな部分などの核酸プローブを含むアレイを指す。アレイ上の核酸は、好ましくは一本鎖である。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」又は「オリゴヌクレオチドチップ」と称される。本明細書における「マイクロアレイ」は、「バイオチップ」又は「生物学的チップ」とも称され、少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の別個の領域の密度を有する領域のアレイである。マイクロアレイ中の領域は、典型的な寸法、例えば、約１０～２５０μｍの範囲の直径を有し、アレイ中の他の領域からほぼ同じ距離だけ離れている。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖又は二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、及び二本鎖ＤＮＡを含むがこれらに限定されない、比較的短いポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドである。更に、適用可能な検出方法論の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、ＰＮＡ及びモルフォリノなどのヌクレオチド類似体を指す。
本明細書で使用される「ＰＣＲベースの方法」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む方法を指す。これは、生物を使用せずに、酵素複製によってＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を指数関数的に増幅するための手法である。ＰＣＲはインビトロ技術であるので、ＤＮＡの形態に制限なく行うことができ、多様な遺伝子操作を行うように大幅に改変することができる。発現レベルの決定に関して、例えば、ＰＣＲベースの方法は、（１）逆転写酵素を用いて、完全なｍＲＮＡプール（いわゆるトランスクリプトーム）をｃＤＮＡに逆転写し、（２）それぞれのプライマーを用いて、所与のｃＤＮＡの存在を検出することにより、所与のｍＲＮＡの存在を検出するために使用し得る。この手法は、一般に逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）として既知である。「ＰＣＲベースの方法」という用語は、エンドポイントＰＣＲの適用、及び増幅された標的の関数として蛍光シグナルを放出し、標的のモニタリング及び定量化を可能にする特殊なフルオロフォア又はインターカレーティング色素を適用する動的／リアルタイムＰＣＲ技術の両方を含む。定量化方法は、外部標準曲線による絶対的なもの又は比較内部標準に対する相対的なものいずれかであり得る。
「分子の電気化学的検出に基づく方法」という用語は、分子、特にタンパク質、核酸、抗原、抗体などの生体分子が検出可能なシグナルの生成の下で結合する電極システムを利用する方法に関する。そのような方法は、例えば、国際公開第０２／４２７５９号（特許文献１）、国際公開第０２／４１９９２号（特許文献２）、及び国際公開第０２／０９７４１３号（特許文献３）に開示され、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。これらの検出器は、例えばシリコンチップの結晶学的表面によって形成される平面を有する基板、及び例えば櫛型電極又は二次元電極アレイの形状を取り得る電気検出器を含む。これらの電極は、標的分子、例えば、標的核酸分子に特異的に結合することができるプローブ分子、例えば、核酸プローブを担持する。プローブ分子は、例えば、チオール－金結合によって固定化される。この目的のために、プローブは、金の表面を含む電極に結合するチオール基でその５’又は３’末端で修飾されている。これらの標的核酸分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼなどの酵素標識を担持し得る。標的分子がプローブに結合した後、基質が添加される（例えば、特にレドックス反応において上記の酵素によって変換されるα－ナフチルホスフェート又は３，３’５，５’－テトラメチルベンジジン）。次いで、上記反応の生成物又は電子交換によって上記反応で生成した電流は、電気検出器を用いて部位特異的な様式で検出することができる。
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及び／又はモルフォリノを含む、任意の一本鎖又は二本鎖核酸及び／又は類似体分子を示すことを意図している。
「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的サブ配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件に関する。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、異なる状況で異なる。より長い配列は、特に高温でハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおいて特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）である。（標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍではプローブの５０％が平衡状態で占められている）。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のＮａイオンであり、典型的には、ｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０ＭのＮａイオン（又は他の塩）であり、短いプローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）の場合には温度が少なくとも約３０℃であり、より長いプローブの場合には少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによっても達成し得る。
「核酸分子の断片」という用語は、特許請求の範囲に記載された配列のうちの１つによる核酸分子のサブセットを含む核酸を示すことを意図している。同じことが「核酸分子の断片」という用語にも当てはまる。
「核酸分子のバリアント」という用語は、本明細書では、特許請求の範囲に記載された配列のうちの１つによる核酸分子と構造及び生物学的活性が実質的に同様である核酸分子を指す。
「核酸分子の同族体」という用語は、核酸分子の配列が特許請求の範囲に記載された配列のうちの１つによる核酸分子と比較して、付加、欠失、置換、又はその他では化学的に修飾された１つ以上のヌクレオチドを有する、該核酸分子を指すが、同族体は常に後者と実質的に同じ結合特性を保持していることを常に条件とする。
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、特許請求の範囲に記載された配列のうちの１つによる核酸分子と同様の標的核酸配列との結合特性を有する核酸分子を指す。
本明細書で使用される「ハイブリダイズする相手」という用語は、ストリンジェントな条件下で核酸分子にハイブリダイズすることができる核酸分子を指す。
「アナメシス」という用語は、診断の策定及び患者への医療ケアの提供に有用な情報を入手することを目的として、患者又はその人を知っていて適切な情報を提供することができる他の人々のいずれかに特定の質問をすることにより、医師又は他の医療専門家によって得られる患者データに関する（この場合、ヘテロアナメシスと称される場合もある）。この種の情報は症状と称され、直接検査によって確認される臨床徴候とは対照的である。
「病因」という用語は、疾患の経過、すなわち、その持続期間、その臨床症状、及びその転帰に関連している。
本明細書の本文全体を通して、いくつかの文書が引用されている。本明細書で引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書などを含む）は、上記又は下記を問わず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「臨床転帰」という用語は、症状の軽減又は改善などの特に治療後の疾患の臨床結果として規定される。いくつかの実施形態では、不良な臨床転帰は、疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）、無再発生存期間（ＲＦＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、及び無遠隔再発生存期間の相対的な減少又はそれ以上を含む。がんに関する「再発」という用語は、元の疾患の同じ部位及び器官における腫瘍細胞の再発、がんの最初の診断及び治療から何年も後に現れ得る転移、又は領域リンパ節への腫瘍細胞の浸潤などの局所的事象を含む。「遠隔再発」とは、がん細胞が領域リンパ節を越えて身体の遠隔部分（すなわち別の臓器）に広がった（転移した）シナリオを指す。無再発生存期間は、一般に、無作為化から最初の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、二次がん、又は死亡までの時間として規定される。無増悪生存期間は、特定の日付（一般には治療の初日又は患者が臨床検査に登録された日）から疾患が「進行」した日又は何らかの原因で患者が死亡した日までに経過した時間である。「ＤＳＳ」及び「ＣＳＳ」（「がん特異的生存期間」を表す）という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
「（療法的）治療」という用語は、特に本明細書で使用されるがんの治療に関連して、健康状態を改善し、及び／又は患者の寿命を延長する（延ばす）任意の治療に関する。該治療は、がんを排除し、患者における腫瘍のサイズ若しくは数を減らし、患者におけるがんの発生を阻止若しくは遅延させ、患者における新しいがんの発生を抑制若しくは遅延させ、患者における症状の頻度若しくは重症度を低下させ、及び／又は現在がんを有するか若しくは以前にがんを有していた患者における再発を減少させ得る。いくつかの実施形態では、「治療」及び「療法的治療」という用語は、原発腫瘍の外科的除去、化学療法、抗ホルモン療法、放射線療法、及び免疫療法／標的化療法のうちの１つ以上を指すことを意味する。
アジュバント療法は、一次治療、主治療、又は初期治療に加えて行われる治療である。がん治療で使用される手術及び複雑な治療レジメンにより、この用語は主にアジュバントがん治療を説明するために使用されるようになった。アジュバント療法の例は、通常は手術後（術後）に行われる追加治療（化学療法など）であり、すべての検出可能な疾患が取り除かれるが、潜在性疾患による再発の統計的リスクが依然として残る。ネオアジュバント療法は、一次治療、主治療、又は初期治療の前に行われる治療である（例えば、術前化学療法）。
本明細書で使用される「ＲＮＡ転写物の規定された発現閾値」という用語は、いくつかの試料（この試料の数は、いくつかの対象、特にがんを有する対象から得られる）から計算された平均カットオフ値（簡潔にはカットオフ）を指し得る。閾値を得るために、対象の数は、異なる分子サブタイプの腫瘍を有する対象、例えば、ＨＥＲ２陽性腫瘍を有する対象及び／又はトリプルネガティブ腫瘍を有する対象及び／又はルミナルＡ腫瘍を有する対象及び／又はルミナルＢ腫瘍を有する対象を含み得る。閾値は、ＲＮＡ転写物の量又は濃度を表し得る。いくつかの実施形態では、閾値は、ＣＴ（サイクル閾値；定量サイクル、Ｃｑとも称される）値として与えられる（以下を参照）。いくつかの実施形態では、（相対的な）発現レベル及び発現閾値は、４０－ΔＣＴ又は４０－ΔΔＣＴ値として表される（以下を参照）。
本明細書で使用される「対象」という用語は、脊椎動物などの任意の生物、特に、ヒト及び別の哺乳動物の両方を含む任意の哺乳動物、例えば、齧歯類、ウサギ、サルなどの動物に関する。齧歯類は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、又はチンチラであり得る。好ましくは、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書において「患者」とも称される、疾患、特に、がんを有するか又は有することが疑われる対象である。平均カットオフ値を決定するために、少なくとも２つの対象、好ましくは少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、又は少なくとも２０００の対象が検査される。
好ましい実施形態の説明に戻り、いくつかの実施形態では、カットオフ／閾値は、１つ以上の以前の臨床研究に基づいて規定される。更に、カットオフ／閾値の確立及び検証のために、追加の臨床研究が実施され得る。カットオフ／閾値は、当該技術分野で既知である技術によって決定／規定され得る。本発明に従って使用される遺伝子マーカーを用いて、様々な臨床研究がすでに実施されている。トレーニング検査設定における一致研究は、「発現陽性」又は「発現陰性」での定量的結果の二分方法に関する臨床的カットオフ／閾値の規定及び検証に十分であり得る。
いくつかの実施形態では、カットオフ／閾値は、ＩＨＣ－ＩＳＨなどの臨床病理学的パラメーター並びに／又は分割検査（ＳＡＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＪＭＰ（登録商標）９．０．０など）によるトレーニングコホートにおける全生存期間（ＯＳ）、疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）、及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）のデータに基づいて決定／規定される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物の発現レベルは、逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって決定される。ＲＮＡはＰＣＲで直接増幅できないため、酵素逆転写酵素を使用して、それをｃＤＮＡに逆転写する必要がある。この目的のために、逆転写の反応とＰＣＲによるＤＮＡ増幅とを同じ反応において組み合わせたワンステップＲＴ－ｑＰＣＲを利用することができる。ワンステップＲＴ－ｑＰＣＲでは、ＲＮＡ鋳型は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及びプローブ、ｄＮＴＰ、塩、及び界面活性剤を含む反応混合物中で混合される。第１のＰＣＲステップでは、標的ＲＮＡは、標的特異的リバースプライマーを使用して、逆転写酵素によって逆転写される。その後、ｃＤＮＡは、プライマー／プローブ及びＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅される。
例えば、蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲを使用することができる。蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲは、蛍光標識プローブの使用を含む。好ましくは、蛍光標識プローブは、蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる（＝二重標識プローブ）。好適な蛍光レポーター及びクエンチャー色素／部分は、当業者に既知であり、レポーター色素／部分である６－ＦＡＭ（商標）、ＪＯＥ（商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、及びクエンチャー色素／部分であるダブシル、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＢＨＱ（商標）－１、－２、又は３を含むが、これらに限定されない。プローブ特異的産物の増幅は、プローブの切断（＝増幅媒介性プローブ置換）を引き起こし、それによってレポーター蛍光の増加をもたらす。反応における蛍光の増加は、標的増幅産物の増加に正比例する。プローブから発生する蛍光を検出するためのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩシステム（Ｒｏｃｈｅ）、Ｖｅｒｓａｎｔ ｋＰＣＲシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）、Ｍｘ３００５Ｐシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、又は同等のリアルタイム機器を使用して、蛍光の増加をリアルタイムで測定することができる。分析出力は、各標的のＣＴ値である。ＣＴ（サイクル閾値；定量サイクル、Ｃｑとも称される）値はＰＣＲ増幅サイクル数によって決定され、その後、プローブの蛍光シグナルが特定のバックグラウンドシグナルを上回り、ＣＴ値は、ＰＣＲ増幅前の試料中の標的分子の量の尺度である。好ましくは、ＣＴ値は、適切なソフトウェア（例えば、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ（商標））又は統計ソフトウェアパッケージ（例えば、ＳＡＳ ＪＭＰ（登録商標）９．０．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（商標））を使用して更に分析される。ＣＴ値は、既知の標的濃度を用いた標準曲線のＣＴ結果に基づいて、絶対標的分子量（例えば、ｎｇ／μｌ又は分子／μｌ）に変換することができる。あるいは、標的の量は、参照に基づいてｘ倍減少又は増加した量（＝ΔＣＴ）として報告することができる。低いΔＣＴ値（小さな差）は、高いΔＣＴ（大きな差）と比較して、参照に対する標的の量が多いことを示す。固定値（ＰＣＲサイクル数など、例えば４０）からΔＣＴを差し引くことにより、ΔＣＴを再計算するのが好適である。結果は、標的の量と直接相関する値（高い値＝高い量）であり、４０－ΔＣＴ値として表され、ここで、１つの整数は、標的の量の２倍を指す（例えば、３４の値は３３の値の２倍の量を示す）。システムの所望の再現性及び精度に依存して、複数の参照アッセイをパネリングするか、又はキャリブレーターのΔＣＴを使用して試料のΔＣＴを再計算／正規化することができる（１点校正；Ｐｆａｆｆｌ（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２９（９）：ｅ４５（非特許文献５））。特定のプローブについて異なるフルオロフォアを使用することにより、同じ反応において異なる標的アッセイを多重化することも可能である。ＰＣＲの間、多重化における各標的は並行して増幅されるが、異なる蛍光発光を利用して別々に検出される。
いくつかの実施形態では、４０－ΔＣＴ値は、以下のように計算される：４０－［患者試料のそれぞれのバイオマーカー（例えば、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、又はＨＬＡ－Ｇ）のＣＴ－患者試料の参照遺伝子のＣＴ（例えば、ＣＡＬＭ２）］（＝計算方法１）。２つ以上の参照遺伝子を使用する場合、４０－ΔＣＴ値は次のように計算される：４０－（患者試料のそれぞれのバイオマーカーのＣＴ－患者試料の選択された参照遺伝子の平均ＣＴ）（＝計算方法２）。あるいは、４０－ΔΔＣＴ値を使用することもでき、４０－ΔΔＣＴは次のように計算することができる：ΔΔＣＴ＝４０－［（ＣＴ 患者試料のバイオマーカー－ＣＴ 参照試料のバイオマーカー）－（ＣＴ 患者試料の参照遺伝子－ＣＴ 参照試料の参照遺伝子）］（＝計算方法３）；例えば、４０－ΔΔＣＴ＝４０－［（ＣＴ ＨＬＡ－Ｇ 患者試料－ＣＴ ＨＬＡ－Ｇ 参照試料）－（ＣＴ 患者試料のＣＡＬＭ２－ＣＴ 参照試料のＣＡＬＭ２）］。いくつかの実施形態では、ＣＡＬＭ２は、参照遺伝子として使用される。
例えば、バイオマーカーの相対的発現レベルは４０－ΔΔＣＴ値として与えられ、これは次のように計算される：４０－［（ＣＴ 患者試料のバイオマーカー－ＣＴ 患者試料の参照遺伝子）－（ＣＴ 対照試料のバイオマーカー－ＣＴ 対照試料の参照遺伝子）］（＝計算方法４）；例えば、４０－ΔΔＣＴ＝４０－［（ＣＴ ＨＬＡ－Ｇ 患者試料－ＣＴ 平均ＣｏｍｂＲｅｆ 患者試料）－（ＣＴ ＨＬＡ－Ｇ 対照試料－ＣＴ 平均ＣｏｍｂＲｅｆ対照試料）］。いくつかの実施形態では、ＣＴは、ＣＴ中央値である。参照遺伝子のＣＴは、単一の参照遺伝子のＣＴ又は２つ以上の参照遺伝子の平均ＣＴ（平均ＣｏｍｂＲｅｆと称される）であり得る。好ましくは、同じ対照試料（キャリブレーターとも称される）がすべての分析で使用され、同じＲＴ－ｑＰＣＲ又はｑＰＣＲ結果をもたらす。いくつかの実施形態では、対照試料は、細胞株ＲＮＡ、インビトロで転写された人工ＲＮＡ、或いは一定の比率のバイオマーカーｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ又はバイオマーカーアンプリコン若しくはバイオマーカーアンプリコンの一部を示す、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの等モル混合物である。いくつかの実施形態では、ＣＡＬＭ２及び／又はＢ２Ｍは、参照遺伝子として使用され、陽性対照（例えば、インビトロで転写された人工ＲＮＡ）は、対照試料（キャリブレーター）として使用される。
別の例示的な実施形態では、平均カットオフ値は、計算方法４による４０－ΔΔＣＴ値として与えられ、ＨＬＡ－Ｇの平均カットオフ値は、４０．１０の４０－ΔΔＣＴ値である。
いくつかの実施形態では、方法のステップ（例えば、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ））は、ランダムな順序で実施される。好ましい実施形態では、ステップ（ａ）が最初に実施され、すなわち、その後にステップ（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）が実施される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の後に実施される。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）はステップ（ｂ）の前に実施され、ステップ（ｂ）はステップ（ｃ）の前に実施され、ステップ（ｃ）はステップ（ｄ）の前に実施される。
上記で規定されたプローブは、好ましくは、例えば、蛍光標識、蛍光クエンチング標識、発光標識、放射性標識、酵素標識、及びそれらの組み合わせから選択される標識で標識される。好ましくは、上記で規定されたプローブは、蛍光レポーター部分及び蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
本発明の新規性は、膀胱がんにおけるＨＬＡベースのがんバイオマーカーのｍＲＮＡベースの決定だけでなく、サブタイプのアルゴリズム算入も含む。
本発明のこれらの新しい態様はすべて、本発明のＲＴ－ｑＰＣＲベースの手法及びキットの予後値に寄与する。実際、これらの新規性は、特に進行期の患者の分子サブタイプにおいてより正確で意義のあるＨＬＡタイピングを提供し、これは、最終的には、がんのより個別化された治療決定のための予後ツールを提供する。
本発明の範囲を限定すると解釈されない以下の実施例により、本発明を更に例示する。
実施例１：逆転写（ＲＴ）定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によるｍＲＮＡ発現レベルの決定
ＲＮＡをホルマリン固定パラフィン包埋組織（＝ＦＦＰＥ組織）から分離した。より具体的には、５～１０μｍのＦＦＰＥ腫瘍組織巻き状物由来のトータルＲＮＡを、ＲＮＸｔｒａｃｔ（登録商標）抽出キット（ＢｉｏＮＴｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ・マインツ）を使用して抽出し、参照遺伝子ＣＡＬＭ２の断片のリアルタイム蛍光ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量化した。一般に、各々の定量化抽出物（約５０～１００ｎｇ）の２．５μｌ ＲＮＡを、以下に説明するようにＲＴ－ｑＰＣＲによってアッセイした。
ＲＴ－ｑＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な分析のために、関心のある領域に隣接するプライマー及びそれらとの間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。ＮＣＢＩプライマー設計ツール（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ）を使用して、標的特異的プライマー及びプローブを選択した。ＲＮＡ特異的プライマー／プローブ配列を使用して、エクソン／エクソン境界を横切ってプライマー／プローブ配列を位置選定することによってＲＮＡ特異的測定を可能にした。更に、既知の多型（ＳＮＰ）を有する配列領域に結合しないようにプライマー／プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合には、関連するすべてのスプライスバリアントを増幅するようにプライマーを選択した。従来のＰＣＲ反応により、すべてのプライマー対の特異性について調べた。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）検証実験を行い、標的及び対照の増幅の効率がほぼ等しいことが示されたが、これは比較ΔＣＴ法による遺伝子発現の相対的な定量化の前提条件である。生体試料内の関心のある遺伝子の発現分析を行うために、２つの特定のアッセイのそれぞれのプライマー／プローブを混合することによって４つの二重アッセイ混合物を調製した。ＣＴ値を別々に検出するために、アッセイプローブを異なる蛍光プローブで修飾した。各４つのアッセイ混合物は、２μＭの未修飾のフォワード及びリバースプライマー並びに１．２μＭのプローブを含んだ。各反応について、ＦＦＰＥ切片（上記を参照）から抽出した２．５μｌのトータルＲＮＡを、９６ウェル光学反応プレートの１つのウェル中で、２．５μｌのアッセイ混合物、２．５μｌの酵素混合物、及び２．５μｌの水と混合した。製造元の説明書に従ってＶｅｒｓａｎｔ ｋＰＣＲ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）又はＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、適切な条件（５分５０℃、１サイクル：２０秒９５℃、１サイクル；１５秒９５℃；１分６０℃、４０サイクル）で、ＰＣＲ反応の測定を行った。これまで分類されていない生体試料の測定前に、実験条件の標準化のために、例えば細胞株、健常な対照試料、規定された分子腫瘍サブタイプの試料を用いた対照実験の測定を使用することができる。
実施例２：ＤＮＡ配列による古典的及び非古典的なＨＬＡ遺伝子の比較
ゲノム解析及び配列アラインメントを、ＵＣＳＣゲノムブラウザー（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）にアクセスし、ＨＬＡ－Ａ１（ＮＭ＿００２１１６．７）、ＨＬＡ－Ａ２（ＮＭ＿００１２４２７５８．１）、ＨＬＡ－Ｇ（ＮＭ＿００２１２７．５）、ＨＬＡ－Ｆ１（ＮＭ＿００１０９８４７９．１）、ＨＬＡ－Ｆ２（ＮＭ＿０１８９５０．２）、ＨＬＡ－Ｆ３（ＮＭ＿００１０９８４７８．１）、ＨＬＡ－Ｊ（ＮＲ＿０２４２４０．１）のゲノム配列及びＨＬＡ－Ｈの推定配列（ＮＲ＿００１４３４．４）をダウンロードすることによって行った。最初のアラインメント分析は、潜在的な翻訳開始領域及び細胞外アルファドメインから膜貫通領域への潜在的な移行に焦点を合わせた。ＨＬＡ－Ｈは、エクソン４における単一塩基対の欠失がフレームシフトを引き起こし、エクソン４における未成熟終止コドンをもたらすために、偽遺伝子であると考えられている（Ｃｈｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｐｈｙｓｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ， ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２４３－２５３（非特許文献６）及びＺｅｍｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０． ＨＬＡ－ＡＲ，ａｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｌｏｃｕｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＨＬＡ－Ａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３６１９－３６２９（非特許文献７））。変異によるタンパク質コード能力の機能の喪失によって潜在的に規定される偽遺伝子のそのような規定。しかしながら、配列分析により、５’及び３’末端におけるＡＴＧの周囲のヌクレオチドがコザック配列の必要不可欠なものに即していることが明らかになった。
図１は、潜在的な翻訳開始部位におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。潜在的な開始コドンは黒枠で強調表示されている。
図２は、エクソン４からエクソン５への接合部におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。未成熟終止コドンを有する配列は、黄色の背景で示されている。
上記のように、ＨＬＡ－Ｈは、エクソン４の未成熟終止コドンにより、文献では偽遺伝子として規定されている。それらにより、フレーム内シフトを引き起こす配列ＧＡＣ－ＣＡＧ－ＡＣＣ－ＣＡ－－ＣＡＣ（赤色で強調表示された単一ヌクレオチドの欠失）が同定された。Ｃｈｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌの配列（図２に黄色の背景で示されている）と比較すると、研究者らは単一の塩基対の欠失（図２に赤色の背景で示されている）を観察できなかった。この観察は、ＨＬＡ－Ｈも完全長タンパク質であり、従って偽遺伝子ではないという仮定につながる。更に、研究者らは、アルファ３ドメインをコードするエクソン５における配列を特定した。単一塩基対の欠失はエクソン５の末端における未成熟終止コドンをもたらすであろうが、これはＨＬＡ－Ｈが膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠いていることを意味するであろう。ＨＬＡ－Ｇの場合、イントロン５に未成熟終止コドンを有する転写バリアントは可溶性アイソフォームＨＬＡ－Ｇ５の翻訳を引き起こすことが既知である。従って、ＨＬＡ－Ｈは、可溶性ＨＬＡ－Ｇ５の可溶性類縁体であろう。可溶性ＨＬＡ－Ｇ形態は活性タンパク質であり、様々な受容体、例えば、白血球免疫グロブリン様受容体１及び２（ＬＩＬＲＢ１及びＬＩＬＲＢ２）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＬ４（ＫＩＲ２ＤＬ４）、及びＣＤ８（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｓ． ａｎｄ Ｅ． Ｌｏｎｇ，ＫＩＲ２ＤＬ４（ＣＤ１５８ｄ）：Ａｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＨＬＡ－Ｇ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２．３（２５８）（非特許文献８）及びＣａｒｏｓｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ＨＬＡ－Ｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｂｌｏｏｄ，２００８．１１１（１０）：４８６２－７０（非特許文献９））との相互作用によって免疫細胞阻害を引き起こす。
文献は、配列ｃｔｃ－ａｃｇ－ｇｃｇ－ｔｇ－の末端にあるエクソン７における第２の単一のヌクレオチドの欠失を指摘している。研究者らは、エクソン８においてこの配列を同定し、該配列は、非翻訳領域をコードし、タンパク質の翻訳とは関連しない。
図３は、エクソン８におけるＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｇ、及びＨＬＡ－Ｈの配列アラインメントを示す。未成熟終止コドンを有する配列は、黄色の背景で示されている。
研究者らはまた、第２の偽遺伝子である、ＨＬＡ－Ｊのエクソン５における、同様にＣｈｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌからの想定される単一塩基対の欠失を有する配列ＧＡＣ－ＣＡＧ－ＡＣＣ－ＣＡ－を配列アラインメントから同定した。ＨＬＡ－Ｈ及びＨＬＡ－Ｊの配列比較により、これら２つの偽遺伝子は、ＲＮＡに関して６９％の配列相同性を有し、アミノ酸配列間では２０％しか有していないことが明らかになった（表３）。
Figure 2022540090000004
表４は、ＨＬＡ－Ｈ及びＨＬＡクラスＩ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）、非古典的なＨＬＡクラスＩ遺伝子（ＨＬＡ－Ｅ、Ｆ、及びＧ）、並びに更なる偽遺伝子（ＨＬＡ－Ｊ、Ｌ、Ｖ、Ｙ）の間の相同性を纏めたものである。ＨＬＡ－Ｈ ＲＮＡは、ＨＬＡクラスＩ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）、非古典的なＨＬＡクラスＩ遺伝子（ＨＬＡ－Ｅ、Ｆ、及びＧ）と７７．４％相同であり、２２．６％非相同である。タンパク質配列を考慮すると、ＨＬＡ－Ｈは古典的及び非古典的なＨＬＡクラスＩ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｇ）と２７．３％非相同であり、ＨＬＡ－Ｊと５８．８％非相同である。
Figure 2022540090000005
実施例３：免疫療法で治療された尿路上皮がんコホートにおける逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によるＨＬＡ ｍＲＮＡ発現レベルの決定
膀胱がん及び上部尿路上皮がんを含む、組織学的に確認された尿路上皮がんを有する７２人の新たに診断された患者が２０１６年から２０１８年の間に研究に登録された。生検試料が不十分であった６人の患者及びリンパ節転移のために５人の患者を除外した後、７２人の患者の最初の研究集団を６１人に限定した。尿路上皮がん（ＵＣ）コホート内では、４９人の患者が尿路上皮膀胱がん（ＵＢＣ）に罹患し、１２人の患者が上部尿路上皮がんに罹患していた。承認された説明書に従って、ニボルマブ、ペンプロリズマブ、及びアテゾリズマブをファーストライン、セカンドライン、及びサードライン単剤治療として付与した。
生存期間分析では、カプラン・マイヤー生存期間推定及びコックス回帰分析のために、疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）を使用した。完全な生存期間データを６１人の患者から入手することができた。データ取得終了の時点で、ＤＳＳの中央値は４．３２ヶ月であった。
ＨＬＡ遺伝子の発現を評価するための遺伝子特異的ＴａｑＭａｎベースのプライマー／プローブセットを使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な分析のために、関心のある領域に隣接するプライマー及びそれらとの間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。ＮＣＢＩプライマー設計ツール（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ）を使用して、標的特異的プライマー及びプローブを選択した。ＲＮＡ特異的プライマー／プローブ配列を使用して、エクソン／エクソン境界を横切ってプライマー／プローブ配列を位置選定することによってＲＮＡ特異的測定を可能にした。更に、既知の多型（ＳＮＰ）を有する配列領域に結合しないようにプライマー／プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合には、必要に応じて、関連するすべてのスプライスバリアント又は選択されたスプライスバリアントを増幅するようにプライマーを選択した。従来のＰＣＲ反応により、すべてのプライマー対の特異性について調べた。プライマー／プローブを更に最適化した後、表５に列挙されているプライマー及びプローブが最良の結果をもたらした。これらのプライマー／プローブは、例えば特異性及び増幅効率の点で、従来技術から既知となっているプライマー／プローブよりも優れている。ＣＡＬＭ２が分析した試料において差示的に調節されないため、試料ＲＮＡの量を標準化するためにＣＡＬＭ２を参照遺伝子として選択した。治療前生検又は治療後切除物のために、低いＲＮＡ含有量を有する（すなわち、ＣＡＬＭ２の生ＣＴ値が２２未満である）試料対を除外した。
Figure 2022540090000006
Figure 2022540090000007
ＴａｑＭａｎ（登録商標）検証実験を行い、標的及び対照の増幅の効率がほぼ等しいことが示されたが、これは比較ΔＣＴ法による遺伝子発現の相対的な定量化に好ましい。生体試料内の関心のある遺伝子の発現分析を行うために、２つの特定のアッセイのそれぞれのプライマー／プローブを混合することによって４つの二重アッセイ混合物を調製した。ＣＴ値を別々に検出するために、アッセイプローブを異なる蛍光プローブで修飾した。各４つのアッセイ混合物は、２μＭの未修飾のフォワード及びリバースプライマー並びに１．２μＭのプローブを含んだ。各反応について、ＦＦＰＥ切片（上記を参照）から抽出した２．５μｌのトータルＲＮＡを、９６ウェル光学反応プレートの１つのウェル中で、２．５μｌのアッセイ混合物、２．５μｌの酵素混合物、及び２．５μｌの水と混合した。製造元の説明書に従ってＶｅｒｓａｎｔ ｋＰＣＲ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）又はＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、適切な条件（５分５０℃、１サイクル：２０秒９５℃、１サイクル；１５秒９５℃；１分６０℃、４０サイクル）で、ＰＣＲ反応の測定を行った。
ＲＴ－ｑＰＣＲによるＵＣコホートにおけるルミナル及び基底サブタイプの決定により、同様の範囲での１９～４８の４０－ＤＣＴ値の範囲のＫＲＴ５及びＫＲＴ２０ ｍＲＮＡの広いダイナミックレンジが明らかになった。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡ発現のダイナミックレンジは、両方のｍＲＮＡ分析で１９～４１の範囲である。ＦＧＦＲ遺伝子のダイナミックレンジは、ＦＧＦＲファミリー内でかなり個別的である。ＦＧＦＲ１のダイナミックレンジは２９～３７の４０－ＤＣＴ値の範囲であり、ＦＧＦＲ２のダイナミックレンジについては１９～３９の４０－ＤＣＴ値、ＦＧＦＲ３のダイナミックレンジについては１９～４３の４０－ＤＣＴ値、及びＦＧＦＲ４のダイナミックレンジについては１９～３６の４０－ＤＣＴ値の範囲である。
図４は、筋層浸潤性膀胱がん患者（ｎ＝６１）におけるＦＦＰＥ組織のＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ルミナル及び基底サブタイプマーカー、チェックポイント標的遺伝子、並びにＦＧＦＲ１～４の遺伝子発現のデータ分布を示す。
スピアマン相関により、ルミナル尿路上皮がん細胞種（ＫＲＴ２０）内でのＦＧＦＲ受容体２（ｐ＝０．０００８）及び３（ｐ＝０．００６６）の高い有意な共発現が明らかになった。基底様尿路上皮がんの場合、いかなるＦＧＦＲ遺伝子の有意なアップレギュレーションは観察することができなかった。更に、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３の発現は、低いＰＤ－１（ｐ＝０．０２５５４）及びＰＤ－Ｌ１（ｐ＝０．００７４）のｍＲＮＡ発現と有意に関連している。しかしながら、チェックポイントマーカーＰＤ－１（ｐ＝０．０００４）及びＰＤ－Ｌ１（ｐ＝０．０４５２）は、基底様尿路上皮がんサブタイプ（ＫＲＴ５）での高い有意な発現を示した。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡ発現は両方とも、以前に説明されているように（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ２０１８（非特許文献１０））、腫瘍組織への免疫細胞の浸潤に関連している。
図５は、筋層浸潤性膀胱がん患者（ｎ＝６１）由来の組織のＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ルミナル及び基底サブタイプマーカー、チェックポイント標的遺伝子、並びにＦＧＦＲ１～４遺伝子ｍＲＮＡ発現の遺伝子間スピアマン相関を示す。
ルミナル及び基底マーカー、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、並びにＦＧＦＲファミリーのｍＲＮＡ発現分析に加えて、古典的及び非古典的なＨＬＡの発現プロファイルを実施した。
図６は、筋層浸潤性膀胱がん患者（ｎ＝６１）由来のＦＦＰＥ組織のＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ＨＬＡ遺伝子ｍＲＮＡ発現の遺伝子間スピアマン相関を示す。
図６に示すように、多様なＨＬＡ遺伝子の遺伝子間相関は複雑なパターンを示す。一例として、ＨＬＡ－Ｊ発現は、非古典的なＨＬＡ－Ｇ又は古典的なＨＬＡ－Ａ若しくはＨＬＡ－Ｂ／Ｃ遺伝子発現と中程度にしか相関しておらず、スピアマン相関係数はそれぞれ０．３４．０１６、及び０．２７の範囲である。同様に、ＨＬＡ－Ｈエクソン１／２アッセイによって例示される他の偽遺伝子ＨＬＡ－Ｈは、古典的及び非古典的なＨＬＡ、例えば、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃ、ＨＬＡ－Ｊとわずか又は中程度にしか相関していない（ｒ＝０．２３９９３、ｒ＝０．２３７６、ｒ＝０．３３７３、ｒ＝０，１５５０）。重要なことに、他のＨＬＡ遺伝子断片と比較した場合、ＨＬＡ－Ｈエクソン１／２対ＨＬＡ－Ｈエクソン２／３などの１つのＨＬＡの相関係数にはかなりの違いがある。これは、臨床的関連性の遺伝子内及び遺伝子間相互作用をもたらす差示的なスプライシング事象を意味する。
免疫療法を受けているがん患者の疾患特異的生存期間に影響を与えるＨＬＡ遺伝子発現の遺伝子間及び遺伝子内相互作用の一例として、ＨＬＡ－Ａと組み合わせたＨＬＡ－ＧのｍＲＮＡ発現を分析した。エクソン７での翻訳停止後にＨＬＡ遺伝子の比較的異種の部分における特有の領域を決定する非常に特異的なアッセイにより、両方の遺伝子を決定した。
図７は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ａエクソン８、ＨＬＡ－Ｇエクソン８、及びＨＬＡ－Ｇエクソン５ ｍＲＮＡ発現を組み合わせることによる層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者（ｎ＝６１）のＦＦＰＥ組織の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が低いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＜２８．４３）発現及び低いＨＬＡ－Ｇエクソン５ ｍＲＮＡ（＜３７．１１）発現を示した患者は、最も良い生存期間を示した（灰色、実線）。腫瘍が低いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＜２８．４３）発現を示したが、高いＨＬＡ－Ｇエクソン５ ｍＲＮＡ（＞３７．１１）発現を示した患者は、２番目に悪い生存期間を示した（灰色、点線）。腫瘍が高いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＞２８．４３）発現及び高いＨＬＡ－Ａエクソン８ ｍＲＮＡ（＞３５．２６）発現を示した患者は、２番目に良い生存期間を示した（黒色、点線）。腫瘍が高いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＞２８．４３）発現を示したが、低いＨＬＡ－Ａエクソン８ ｍＲＮＡ（＜３５．２６）発現を示した患者は、最も悪い生存生存期間を示した（黒色、実線）。
図７に示すように、先行する化学療法がうまくいかなかった後に免疫腫瘍薬で治療した尿路上皮がん患者は、ＨＬＡ－Ｇエクソン８を発現しているがＨＬＡ－Ａエクソン８を発現していない場合に最も悪い生存期間を有する（青色の曲線と金色の曲線とを比較）。これらのデータは、患者が免疫腫瘍学（「ＩＯ」）治療を受けている場合、古典的なＨＬＡの存在が非古典的なＨＬＡの別段で致命的な発現を補い得ることを示している。これはまた、チェックポイント阻害を標的化する免疫調節薬（抗ＰＤ１／抗ＰＤＬ１など）が、少なくとも部分的に無傷の古典的なＨＬＡ機能を有する腫瘍においてより効率的であると思われることを示している。更に、これらのデータは、免疫療法の有効性を最大化し、かつ、化学療法と免疫療法との組み合わせに関連する潜在的な危険のリスクを低減するための前提条件である、個々のＨＬＡ領域の予後値を特定するための２つ以上のＨＬＡ遺伝子の決定の組み合わせの優位性を実証している。
図８は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ａエクソン８及びＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ発現の遺伝子間組み合わせによる層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者（ｎ＝６１）のＦＦＰＥ組織の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が高いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＞２８．４３）発現及び高いＨＬＡ－Ａエクソン８ ｍＲＮＡ（＞３５．２６）発現を示した患者は、第２番目に良好な生存期間を示した（黒色、点線）。腫瘍が高いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＞２８．４３）発現を示したが、低いＨＬＡ－Ａエクソン８ ｍＲＮＡ（＜３５．２６）発現を示した患者は、最も悪い生存期間を示した（黒色、実線）。
図９は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｇエクソン８及びエクソン５ ｍＲＮＡ発現の遺伝子内組み合わせによる層別化に基づく、筋層浸潤性膀胱がん患者（ｎ＝６１）のＦＦＰＥ組織の疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が低いＨＬＡ－Ｇエクソン８ｍＲＮＡ（＜２８．４３）発現及び低いＨＬＡ－Ｇエクソン５ ｍＲＮＡ（＜３７．１１）発現を示した患者は、最も良い生存期間を示した（灰色、実線）。腫瘍が低いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＜２８．４３）発現を示したが、高いＨＬＡ－Ｇエクソン５ ｍＲＮＡ（＞３７．１１）発現を示した患者は、より悪い生存期間を示した（灰色、点線）。
免疫療法を受けているがん患者の疾患特異的生存に影響を与えるＨＬＡ遺伝子発現の遺伝子内相互作用の例として、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、ＨＬＡ－Ｇエクソン８及びＨＬＡ－Ｇエクソン５のＨＬＡ－Ｇ発現を分析した。ＨＬＡ－Ｇエクソン８を決定することにより、遺伝子の３’末端における未翻訳のエクソン（Ｃ末端の後、細胞質タンパク質末端を定量化する。これにより、例えば多様な細胞外アルファドメイン及び／又は膜貫通領域並びに細胞質部分を含むか又は除外し得る多数のＨＬＡ－Ｇスプライスバリアントの特有の決定が可能になる。この種のＨＬＡ－Ｇ決定は、タンパク質レベルで抗体によっては不可能であり、非常に特異的なＨＬＡ－Ｇ評価を表す。アルファ３ドメインに似ているＨＬＡ－Ｇエクソン５の発現に関連する多数のＨＬＡ－Ｇスプライスバリアント発現を設定した場合、２つのＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡ断片の組み合わせを定量化することにより、免疫腫瘍治療（「ＩＯ」）の開始から死亡までの時間を考慮する場合の優れた又は劣った疾患特異的生存期間を有する患者の異なる予後サブグループを区別できることが明らかになる。ＨＬＡ－Ｇエクソン８を含むスプライスバリアントの発現が低いが、同時にＨＬＡ－Ｇエクソン５を含む断片のレベルが高い患者は、進行した化学療法難治性の状況では、ＩＯ治療を開始したにもかかわらず、疾患特異的死亡のリスクがより高くなる。
組み合わせＨＬＡ診断の優位性を証明するために、単一の遺伝子の決定の予後値を比較した。図１０に示すように、ＨＬＡ－Ｇエクソン８のみの決定もまた、一般的な予後値のものである（ｐ＝０．０３５９）。しかしながら、図７に示すように、ＨＬＡ－Ａエクソン８の高発現を同時に示す高い単一遺伝子ＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ発現の「予後不良」群には多数の患者がいる（ｎ＝２０人はＨＬＡ－Ａエクソン８発現が高いため低リスクである、ｎ＝３３人は高いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ発現に基づいて「高リスク」である）。従って、「予後不良」群における患者のほぼ２／３は、ＨＬＡ遺伝子の組み合わせの診断のためのより正確な組織診断を行う場合に追加の治療を省くことができる。
図１０は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｇエクソン８及びエクソン５ ｍＲＮＡ発現のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく筋層浸潤性膀胱がん患者（ｎ＝６１）のＦＦＰＥ組織の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が高いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＞２８．４３）発現及び高いＨＬＡ－Ａエクソン８ ｍＲＮＡ（＜２８．４３）発現を示した患者は、良好な生存期間を示した（灰色、点線）。腫瘍が高いＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ（＞２８．４３）を示した患者は、より悪い生存期間を示した（黒色、実線）。
実施例４：ネオアジュバント療法で治療された卵巣がん患者コホートにおける逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によるＨＬＡセンス及びＨＬＡアンチセンスｍＲＮＡ発現レベルの決定
更に、本発明者らは、２つ以上のＨＬＡ群遺伝子配列の組み合わせ使用が、婦人科がん、特に卵巣がんなどの膀胱がん以外の他の種類の腫瘍にも適用可能であるかどうかを決定した。更に、本発明者らは、ＨＬＡ群遺伝子とＨＬＡ群アンチセンス発現との組み合わせ使用を、がんの転帰を予測するために決定することができるかどうかを決定した。更に、研究者らは、ＨＬＡセンス及びアンチセンスの組み合わせを使用して、化学療法及び／又はホルモン療法などの免疫腫瘍治療以外の治療レジメンに対する反応／非反応を予測することができるかどうかを評価した。
最適な先行手術及びネオアジュバント化学療法の候補に好適ではない組織学的に確認されたＦＩＧＯステージＩＩＩ～ＩＶの上皮卵巣がん又は腹膜がんを有する４５人の新たに診断された患者（上記がんは、以下、卵巣がんとも称される）が、２００４年９月から２００７年１２月の間に研究に登録された。他の含入基準は、１８歳超の年齢、白金系の化学療法に適した血液学的、腎臓、肝臓、及び心臓の機能であった。除外基準は、７０％未満のカルノフスキーパフォーマンスステータス（ＫＰＳ）、他の悪性腫瘍の病歴、及び手術の禁忌であった。最適な縮小手術の可能性は、開腹腹腔鏡検査によってベースラインで除外した。生検試料がマイクロアレイ分析に十分でなかった９人の患者及び組織学的修正後の腹膜中皮腫の診断のために不適格であることが見出された１人の患者を除外した後、４５人の患者の最初の研究集団を３５人に制限した。カルボプラチンＡＵＣ５及びパクリタキセル１７５ｍｇ／ｍ２ Ｑ３の標準的なレジメンを、３週間ごとに３時間にわたり、６サイクルのネオアジュバント治療として投与した。７５歳以上の３人の患者及びパフォーマンスステータスの悪い１人の患者（ＫＰＳ ７０％）では、併用化学療法よりも単剤のカルボプラチンが好ましいものであった。
手術後、手術試料分析を用いて組織病理学的反応を評価した。現在まで、卵巣がんにおけるネオアジュバント化学療法後の治療反応を説明するための組織病理学的基準は確固たるものとして確立されていない。卵巣がん（Ｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００７（非特許文献１１），Ｓａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００７（非特許文献１２））及び乳がん（Ｏｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００３（非特許文献１３））における一次化学療法への反応に関する文献に従い、手術標本におけるがん細胞の不存在を病理学的完全効奏とみなし、小さなクラスター（＜１ｃｍ）又は個々のがん細胞のみの残留、及び手術後に肉眼で見える残存がないことを非常に良好な部分寛解とみなす。病理学的部分寛解は、手術時の腫瘍量の減少が３０％～９０％であると規定され、安定した疾患は、最初の診断の腹腔鏡検査と比較して、腫瘍量の減少がないか、又は手術時の減少が３０％未満であると規定された。完全寛解及び非常に良好な部分的寛解を有する患者のみを病理学的反応者とみなし、他のすべての症例を病理学的非反応者とみなした。生存分析のために、最初の診断から進行（ＰＦＳ）若しくは死亡（ＯＳ）までの時間、又は進行と死亡との間の時間（ＰＤＴ）を、カプラン・マイヤー生存期間推定及びコックス回帰分析に使用した。完全な生存期間データを４０人の患者から入手することができた。データ取得終了の時点で、ＰＦＳの中央値は１４．７ヶ月であり、ＯＳの中央値は３３．５ヶ月であったが、これは検査開始時における疾患の非常に進行したステージ（切除不能なＦＩＧＯ ＩＩＩ～ＩＶ）を考えると高い。
ｍＲＮＡ検出のために、収集した組織を急速凍結し、分析まで液体窒素中で保存した。約２０～１００ｍｇの凍結した卵巣腫瘍組織を液体窒素中で粉砕した。市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，米国・カリフォルニア州）を使用してＲＮＡの完全性を評価し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用してｃＤＮＡを１ｍｇのトータルＲＮＡから合成し、他で説明されているように（Ｉｈｎｅｎ ｅｔ ａｌ，２００８（非特許文献１４））、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ－Ｕ１３３Ａマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．，米国・カリフォルニア州サンタクララ）で分析した。
検証の目的で、ＲＴ－ｑＰＣＲを上記の同一の新鮮な組織生検から単離されたトータルＲＮＡに適用し、独立した技術的手法によってアレイデータを検証した。ＨＬＡ－Ｆ又はＨＬＡ－ＦＡＳの発現を評価するための遺伝子特異的ＴａｑＭａｎベースのプライマー／プローブセットを使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な分析のために、関心のある領域に隣接するプライマー及びそれらとの間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。ＮＣＢＩプライマー設計ツール（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ）を使用して、標的特異的プライマー及びプローブを選択した。ＲＮＡ特異的プライマー／プローブ配列を使用して、エクソン／エクソン境界を横切ってプライマー／プローブ配列を位置選定することによってＲＮＡ特異的測定を可能にした。更に、既知の多型（ＳＮＰ）を有する配列領域に結合しないようにプライマー／プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合には、必要に応じて、すべての関連する又は選択されたスプライスバリアントを増幅するようにプライマーを選択した。従来のＰＣＲ反応により、すべてのプライマー対の特異性について調べた。プライマー／プローブを更に最適化した後、表６に列挙されているプライマー及びプローブが最良の結果をもたらした。これらのプライマー／プローブは、例えば、特異性及び増幅効率の点で、従来技術から既知であるプライマー／プローブよりも優れている。ＣＡＬＭ２が分析した試料において差示的に調節されないため、試料ＲＮＡの量を標準化するためにＣＡＬＭ２を参照遺伝子として選択した。治療前生検又は治療後切除物のために、低いＲＮＡ含有量を有する（すなわち、ＣＡＬＭ２の生ＣＴ値が２２未満である）試料対を除外した。
Figure 2022540090000008
Figure 2022540090000009
ＴａｑＭａｎ（登録商標）検証実験を行い、標的及び対照の増幅の効率がほぼ等しいことが示されたが、これは比較ΔＣＴ法による遺伝子発現の相対的な定量化に好ましい。生体試料内の関心のある遺伝子の発現分析を行うために、２つの特定のアッセイのそれぞれのプライマー／プローブを混合することによって４つの二重アッセイ混合物を調製した。ＣＴ値を別々に検出するために、アッセイプローブを異なる蛍光プローブで修飾した。各４つのアッセイ混合物は、２μＭの未修飾のフォワード及びリバースプライマー並びに１．２μＭのプローブを含んだ。各反応について、ＦＦＰＥ切片（上記を参照）から抽出した２．５μｌのトータルＲＮＡを、９６ウェル光学反応プレートの１つのウェル中で、２．５μｌのアッセイ混合物、２．５μｌの酵素混合物、及び２．５μｌの水と混合した。製造元の説明書に従ってＶｅｒｓａｎｔ ｋＰＣＲ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）又はＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、適切な条件（５分５０℃、１サイクル：２０秒９５℃、１サイクル；１５秒９５℃；１分６０℃、４０サイクル）で、ＰＣＲ反応の測定を行った。
図１１は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ＨＬＡ－Ｆアイソフォームの相対的ｍＲＮＡ発現（４０－ＤＣＴ）及びアンチセンスＨＬＡ－Ｆ発現のデータ分布を示す。これは、ＨＬＡ－Ｆで例示されているように、ＨＬＡ遺伝子の規定されたセンス及びアンチセンス領域の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す。３つの既知のＨＬＡ－ＦアイソフォームＨＬＡ－Ｆ１、ＨＬＡ－Ｆ２、ＨＬＡ－Ｆ３、及びＨＬＡアンチセンスアイソフォームＡＳ１及びＡＳ２のエクソンを、核酸抽出物のＤＮＡｓｅ消化後にＲＴ－ｑＰＣＲによって決定した。興味深いことに、異なるＨＬＡ－Ｆ ＡＳ領域の発現レベルは著しく異なり、ＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１ エクソン６の発現は最も高く、ネオアジュバント化学療法前の４０－ＤＣＴ中央値が３７．８８であった。更に、アイソフォーム比較のサブトラクティブ分析により、卵巣がん試料の治療前生検において、ＨＬＡ－Ｆ２及びＨＬＡ－Ｆ３の特に高い発現が明らかになった。
ＨＬＡ－Ｆの発現を、以前に発表された（Ｚａｍａｇｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｍＲＮＡ ｉｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｏ－ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ａｒｒａｙ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ＰＣＲ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ． ＥＲＣ ２００９（非特許文献１５））ホルモン依存性ルミナル及びホルモン非依存性卵巣がんへの分子サブタイピングの文脈で設定した。この目的のために、ＥＳＲ１、ＨＬＡ－Ｆ３、及びＨＬＡ＿Ｆ ＡＳ１エクソン６のｍＲＮＡ発現を、決定木モデル、遺伝子比、及び線形結合を構築することによって組み合わせた。
図１２は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって決定されたＥＳＲ１、ＨＬＡ－Ｆ３、及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１発現の相対的ｍＲＮＡ発現（４０－ＤＣＴ）のデータ分布を示す。
ＨＬＡ－Ｆ３は、抗原提示のためのタンパク質溝を提示するペプチドを形成するための細胞外アルファ１及びアルファ２ドメインを有するが、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞の活性化などの免疫細胞との相互作用のためのアルファ３ドメインを欠いている、非古典的なＭＨＣＩ分子である。ＨＬＡ－Ｆアイソフォームのすべての既知のアイソフォームと同様に、ＨＬＡ－Ｆ３も膜貫通ドメインを含み、従って免疫細胞相互作用のために細胞表面に存在すると考えられている。
ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現の予測値を、エンドポイントとしての無増悪生存期間の分割検査によって検査した。
図１３は、無増悪生存期間を予測するためにＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ネオアジュバントで治療した卵巣がん患者の治療前生検試料におけるＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現の分割検査を示す。
図１３に示すように、治療前ＨＬＡ－Ｆ３（ＤＣＴ ３４．９４）の発現中央値に近いカットオフにより、ネオアジュバント卵巣がんコホートを、ＨＬＡ－Ｆ３の低発現時における延長された生存期間（１３９２日の無増悪生存期間）対短縮された生存期間（４００日の無増悪生存期間）に関連する、著しく異なる生存期間中央値及び高いＨＬＡ－Ｆ３の発現を有する２つの同じサイズの群に分けた。
図１４は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｆ３のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく無増悪生存期間（ＰＦＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現（＞＝３４．９４）を示した患者は、良好な生存期間を示した（黒色、実線）。腫瘍が低いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現（＜３４．９４）を示した患者は、より悪い生存期間を示した（黒色、破線）。
カプラン・マイヤー分析により、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現によって生存を予測することの有意性が証明された。図１４に示すように、原発性卵巣がん組織において高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現を示した患者では、無増悪生存期間の中央値が２８．５ヶ月であったが、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現が低い患者では、無増悪生存期間の中央値が１２．５ヶ月であった。
同様に、カプラン・マイヤー法による全生存期間分析により、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡに基づいて層別化した場合に有意な生存期間差異が明らかになった。図１４に示すように、原発性卵巣がん組織において高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現を示した患者は５２．５ヶ月の全生存期間中央値を示したが、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡの発現が低い患者は２２．９ヶ月の全生存期間中央値を示した。
図１５は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、ＨＬＡ－Ｆ３のみの単一の遺伝子の決定による層別化に基づく全生存期間（ＯＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現（＞＝３４．９４）を示した患者は、良好な生存期間を示した（黒色、実線）。腫瘍が低いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現（＜３４．９４）を示した患者は、より悪い生存期間を示した（黒色、破線）。
グレード、ＦＩＧＯステージ、及び原発部位（卵巣対腹膜）などの臨床パラメーターについて調整する際に、高及び低ｍＲＮＡ発現へのｍＲＮＡ層別化は、６．１４（ｐ＝０．０１３２）のＬ－Ｒ Ｃｈｉ２値及び０．２２のハザード比で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、すべての他の臨床的要因は有意ではなかった。
図１５は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現などのｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＰＦＳの多変量分析に基づいている。グレード、ＦＩＧＯステージ、及び原発部位（卵巣対腹膜）などの臨床パラメーターについて全生存期間の予測を調整する際に、高及び低ｍＲＮＡ発現へのｍＲＮＡ層別化は、３．１９のＬ－Ｒ Ｃｈｉ２値（ｐ＝０．０４４１）及び０．３１のハザード比で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままだったが、すべての他の臨床的要因は有意ではなかった。
図１６は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現を含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＯＳの多変量分析を示す。
次のステップとして、ＥＳＲ１ ｍＲＮＡレベルをホルモン依存性及びホルモン非依存性の卵巣がんへと区別することにより、ＨＬＡ－Ｆ３の発現を分子サブタイプの文脈で設定する。３７．７５である場合の４０－ＤＣＴ値を使用したＥＳＲ１ ｍＲＮＡ層別化は、卵巣がんのうちの３７％がＥＲＳ１陰性であり、かつ、約１５．７２ヶ月の無増悪生存期間の中央値を有しており、これらを、３６．４７ヶ月の無増悪生存期間の中央値を有する、全ての卵巣がん患者のうちの６３％を占めるＥＳＲ１陽性卵巣がんから区別した（図１７）。
図１７は、無増悪生存期間を予測するためにＲＴ－ｑＰＣＲによって決定された、ネオアジュバント療法で治療した卵巣がん患者の治療前生検試料におけるＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現の分割検査を示す。
図１８は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、層別化ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現に基づく無増悪生存期間（ＰＦＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が高いＥＳＲ１ ｍＲＮＡ発現（＞＝３７．７５）及び高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現（＞＝３４．９４）を示した患者は、良好な生存期間を示した（黒色、実線）。腫瘍が高いＥＳＲ１ ｍＲＮＡ発現（＞＝３７．７５）及び低いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現（＜３４．９４）を示した患者は、より悪い生存期間を示した（黒色、破線）。ＥＳＲ１ ｍＲＮＡの発現が低い（＜３７．７５）患者はまた、予後不良を示した（灰色、実線）。
カプラン・マイヤー分析により、ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現を組み合わせることによって無増悪生存期間を予測することの有意性が証明された。図１８に示すように、原発性卵巣がん組織において高いＥＳＲ１及び高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現を示した患者では、無増悪生存期間の中央値が３８．７ヶ月であったが、ＥＳＲ１ ｍＲＮＡ発現が高く、かつ、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現が低い患者では、１１．６ヶ月の短縮した無増悪生存期間の中央値であった。ＥＳＲ１ ｍＲＮＡの発現が低い患者は、同様の予後不良を示した。
更に、カプラン・マイヤー分析により、ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現を組み合わせることによって全生存期間を予測することの有意性が証明された。図１８に示すように、原発性卵巣がん組織において高いＥＳＲ１及び高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現を示した患者では、全生存期間の中央値が３８．７ヶ月であったが、ＥＳＲ１ ｍＲＮＡ発現が高く、かつ、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現が低い患者では、１１．６ヶ月の短縮した無増悪生存期間の中央値であった。ＥＳＲ１ ｍＲＮＡの発現が低い患者は、同様の予後不良を示した。
図１９は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、層別化ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現に基づく全生存期間（ＯＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が高いＥＳＲ１ ｍＲＮＡ発現（＞＝３７．７５）及び高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現（＞＝３４．９４）を示した患者は、良好な生存期間を示した（黒色、実線）。腫瘍が高いＥＳＲ１ ｍＲＮＡ発現（＞＝３７．７５）及び低いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現（＜３４．９４）を示した患者は、より悪い生存期間を示した（黒色、破線）。ＥＳＲ１ ｍＲＮＡの発現が低い（＜３７．７５）患者はまた、予後不良を示した（灰色、実線）。
グレード、ＦＩＧＯステージ、及び原発部位（卵巣対腹膜）などの臨床パラメーターについて調整する際に、ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現に基づく組み合わせｍＲＮＡ層別化は、９．５３のＬ－Ｒ Ｃｈｉ２値（ｐ＝０．００９５）で無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、他のすべての臨床的要因は有意ではなかった。高いＥＳＲ１及び高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現のハザード比は、高いＥＳＲ１及び低いＨＬＡ－Ｆ３又は低いＥＳＲ１と比較した場合に０．０９７及び０．１５２のハザード比に達した（それぞれｐ＝０．００４２及びｐ＝０．０１３６）。
図２０は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、並びにＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現の組み合わせを含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＰＦＳの多変量分析を示す。
更に、全生存期間を分析し、臨床パラメーターであるグレード、ＦＩＧＯステージ、及び原発部位（卵巣と腹膜）について調整する際に、ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現に基づく組み合わせｍＲＮＡ層別化は、６．５３（ｐ＝０．０３８３）のＬ－Ｒ Ｃｈｉ２値で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、他のすべての臨床的要因は有意ではなかった。高いＥＳＲ１及び高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現のハザード比は、高いＥＳＲ１及び低いＨＬＡ－Ｆ３又は低いＥＳＲ１と比較した場合に０．１８４及び０．２３０のハザード比に達した（それぞれｐ＝０．０８３２及びｐ＝０．０１８２）。
図２１は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、並びにＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３のｍＲＮＡ発現の組み合わせを含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＯＳの多変量分析を示す。
上記のデータ分析では、４０－ＤＣＴ値として表される正規化された発現レベルを得るために、ハウスキーピング遺伝子に対する個々のＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡレベルの調整が必要である。興味深いことに、ＨＬＡ－Ｆ３のゲノム遺伝子座は、リバース鎖のエクソン８の３ ’ゲノム位置において、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡの遺伝子発現調節及びタンパク質翻訳に重要であり得るＨＬＡ－Ｆ３ ＡＳと称されるアンチセンス遺伝子を含む。推定アンチセンス転写物の関連性を調べて、ハウスキーパーの正規化の必要性を取り除くために、ＨＬＡ－Ｆ３とＨＬＡ－ＦＡＳ１との遺伝子比を調べた。
図２２は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、層別化ＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１ ｍＲＮＡ発現に基づく全生存期間（ＯＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。相対的なｍＲＮＡ発現の代わりに、ハウスキーパー決定のない遺伝子比を、参照遺伝子としてＣＡＬＭ２を使用する４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が高いＨＬＡＦ遺伝子比発現（＞＝２．３５）を示した患者は、良好な生存期間を示した（黒色、実線）。腫瘍が低い遺伝子比（＜２．３５）を示した患者は、より悪い生存期間を示した（黒色、破線）
図２２に示すように、カプラン・マイヤー分析により、ＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１ ｍＲＮＡ発現を組み合わせることによって無増悪生存期間を予測することの有意性が証明された。原発性卵巣がん組織において高いＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現と同時に低レベルのＨＬＡ－ＦＡＳ１ ｍＲＮＡ発現を示す患者では、無増悪生存期間の中央値が３８．７ヶ月であったが（遺伝子比＞＝２．３５）、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現が低く、かつ、ＨＬＡ－ＦＡＳ１ ｍＲＮＡ発現が高い（遺伝子比＜２．３５）患者は、１２．６ヶ月の短縮した無増悪生存期間の中央値を示した。
図２３は、進行性卵巣がん患者（ｎ＝２７）の新鮮な組織のＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化された、層別化ＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１ ｍＲＮＡ発現に基づく全生存期間（ＯＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。相対的なｍＲＮＡ発現の代わりに、ハウスキーパー決定のない遺伝子比を、参照遺伝子としてＣＡＬＭ２を使用する４０－ＤＣＴ法によって決定する。腫瘍が高いＨＬＡＦ遺伝子比発現（＞＝２．３５）を示した患者は、良好な生存期間を示した（黒色、実線）。腫瘍が低い遺伝子比（＜２．３５）を示した患者は、より悪い生存期間を示した（黒色、破線）。
カプラン・マイヤー分析により、遺伝子比によって計算されるようにＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－ＦＡＳ１の組み合わせによって全生存期間を予測することの有意性も証明された。図２３に示すように、原発性卵巣がん組織において高いＨＬＡ－Ｆ遺伝子比（＞＝２．３５）発現を示す患者では、全生存期間の中央値が６１．５ヶ月であったが、ＥＳＲ１ ｍＲＮＡの発現が高く、かつ、ＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡの発現が低い患者は、２３．１ヶ月の短縮した無増悪生存期間の中央値を示した。
グレード、ＦＩＧＯステージ、及び原発部位（卵巣対腹膜）を含む臨床パラメーターについて調整する際に、ＥＳＲ１及びＨＬＡ－Ｆ３ ｍＲＮＡ発現に基づく組み合わせｍＲＮＡ層別化は、４．７１のＬ－Ｒ Ｃｈｉ２値（ｐ＝０．０３０１）で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、原発部位を除く他のすべての臨床的要因は有意ではなかった（ｐ＝０．０４７９）。高いＨＬＡＦ３及び低いＨＬＡ－ＦＡＳ１ ｍＲＮＡ発現のハザード比は、０．２８６６のハザード比に達した（ｐ＝０．０３０１）。
図２４は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、並びにＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－ＦＡＳ１の組み合わせを含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＰＦＳの多変量分析を示す。
更に、全生存期間を分析し、臨床パラメーターのグレード、ＦＩＧＯステージ、及び原発部位（卵巣と腹膜）について調整する際に、ＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１ ｍＲＮＡ発現に基づく組み合わせｍＲＮＡ層別化は、８．４１（ｐ＝０．００３７）のＬ－Ｒ Ｃｈｉ２値で、無増悪生存期間を予測するための独立した要因であるままであったが、他のすべての臨床的要因は有意ではなかった。高いＨＬＡ－Ｆ３／低いＨＬＡ－ＦＡＳ１対低いＨＬＡ－Ｆ３／高いＨＬＡ－ＦＡＳ１のハザード比は、０．１８９のハザード比に達した（ｐ＝０．００３７）。
図２５は、グレード、ＦＩＧＯステージ、原発部位、並びにＨＬＡ－Ｆ３及びＨＬＡ－Ｆ ＡＳ１の組み合わせを含むｃｏｘ比例ハザードモデルを使用したＯＳの多変量分析を示す。
実施例５：進行性の化学療法難治性尿路上皮がんにおけるＨＬＡプロファイリング
化学療法に難治性であり、その後にＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害薬（すなわち、アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブ）によるファーストライン又はセカンドライン免疫腫瘍学（「ＩＯ」）治療を受けた原発腫瘍由来のＴＵＲ生検及び膀胱切除試料をＨＬＡ発現について分析し、組織病理学的及び分子的パラメーター並びにＩＯ治療への反応及びＩＯ後の疾患特異的生存期間に関連させる。
膀胱がん及び上部尿路上皮がんを含む組織学的に確認された尿路上皮がんを有する７２人の新たに診断された患者が２０１６年から２０１８年の間に研究に登録された。ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びアテズマブを、承認された説明書に従って、ファーストライン、セカンドライン、及びサードラインの単剤治療として投与した。コホートの試料由来のすべてのヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色腫瘍組織切片を、ＵＩＣＣのＴＮＭ分類（２０１７）に従って、２人の尿路病理学者によって評価及び分類した。世界保健機関（ＷＨＯ２０１６）の泌尿生殖器腫瘍の分類に従って、希少な組織学的バリアントを分類した。中心の組織病理学的検討の後、腫瘍材料が十分でないか又は尿路上皮がんではないために１８個の組織を除外した。５人の患者からはリンパ節組織のみが利用可能であり、従ってＨＬＡ遺伝子発現の予後及び／又は予測効果の一次分析から除外した（図２６；コンソート図を参照）。
図２６は、進行性又は転移性尿路上皮がんコホートのコンソート図を示す。不十分であるＦＦＰＥブロック及び／又はリンパ節組織を除外した後、５５人の患者の組織を分析のために入手した。
ｍＲＮＡ検出のために、市販のキット（Ｘｔｒａｃｔ、Ｓｔｒａｔｉｆｙｅｒ）を使用して、ＴＵＲ生検、膀胱切除、及び対応するマッピング膀胱組織由来のＦＦＰＥ組織からＲＮＡを抽出した。各反応について、ＦＦＰＥ切片から抽出した２．５μｌのトータルＲＮＡを、９６ウェル光学反応プレートの１つのウェル中で、２．５μｌのアッセイ混合物、２．５μｌの酵素混合物、及び２．５μｌの水と混合した。製造元の説明書に従ってＶｅｒｓａｎｔ ｋＰＣＲ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）又はＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、適切な条件（５分５０℃、１サイクル；２０秒９５℃、１サイクル；１５秒９５℃；１分６０℃、４０サイクル）で、ＰＣＲ反応の測定を行った。相対的なｍＲＮＡ発現は、個々の部位で評価されたＲＥＣＩＳＴ基準に基づいて決定されたＩＯ治療への反応、及びＩＯ治療の開始からがん特異的死亡までで決定された疾患特異的生存期間と関連していた。生物統計学ＪＭＰＳＡＳ ９．０．０（ＳＡＳ，Ｃａｒｙ，米国・ノースカロライナ）を使用した分割検査を行って、ＩＯ治療に反応した可能性のある差異を評価した。
ＲＴ－ｑＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な分析のために、関心のある領域に隣接するプライマー及びそれらとの間でハイブリダイズする蛍光標識プローブを利用した。ＮＣＢＩプライマー設計ツール（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ）を使用して、標的特異的プライマー及びプローブを選択した。ＲＮＡ特異的プライマー／プローブ配列を使用して、エクソン／エクソン境界を横切ってプライマー／プローブ配列を位置選定することによってＲＮＡ特異的測定を可能にした。更に、既知の多型（ＳＮＰ）を有する配列領域に結合しないようにプライマー／プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合には、必要に応じて、すべての関連する又は選択したスプライスバリアントを増幅するようにプライマーを選択した。従来のＰＣＲ反応により、プライマー対の特異性について調べた。プライマー／プローブを更に最適化した後、上記の表に列挙されているプライマー及びプローブが最良の結果をもたらした。これらのプライマー／プローブは、例えば特異性及び増幅効率の点で、従来技術から既知であるプライマー／プローブよりも優れている。ＣＡＬＭ２が分析した試料において差示的に調節されないため、試料ＲＮＡの量を標準化するためにＣＡＬＭ２を参照遺伝子として選択した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）検証実験を行い、標的及び対照の増幅効率がほぼ等しいことが示されたが、これは、比較ΔＣＴ法による遺伝子発現の相対的定量化の前提条件である。
図２７は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化されたＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２発現による層別化に基づいて、局所進行性又は転移性ＵＢＣ（ｎ＝５５）を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。
図２７に示すように、高いＨＬＡ－Ｆ１／２ ｍＲＮＡ発現（＞＝３４．６３）は、より良好な疾患特異的生存期間と有意に関連し、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２陽性患者では生存確率が２年後に６０％であったが、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２エクソン陰性患者では、生存確率が２年後に２０％であった（ｐ＝０．０２４５）。
図２８は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化されたＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２及びＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性ＵＢＣ（ｎ＝５５）を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。
図２８に示すように、高いＨＬＡ－Ｆ１／２ ｍＲＮＡ発現（＞＝３４．６３）とＨＬＡ－Ｇエクソン８ ｍＲＮＡ発現（＞＝３０．１６）とを組み合わせた場合、予測値を改善することができた。興味深いことに、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２ ｍＲＮＡ発現が高く、かつ、ＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡ発現が低いことは、より良好な疾患特異的生存期間と有意に関連しており、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２陽性／ＨＬＡ－Ｇエクソン８陰性患者では、生存確率が２年後に８０％であったのに対し、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２エクソン陰性患者では、生存確率が２年後に２０％であり、ＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２陽性／ＨＬＡ－Ｇエクソン８陽性患者では、生存確率が２年後に４０％であった（ｐ＝０．０２４５）。
図２９は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化されたＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２及びＨＬＡ－Ｂ／Ｃエクソン８ ｍＲＮＡ発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性ＵＢＣ（ｎ＝５５）を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。
図２９に示すように、高いＨＬＡ－Ｆ１／２ ｍＲＮＡ発現（＞＝３４．６３）とＨＬＡ－Ｂ／Ｃ Ｅｘ８ ｍＲＮＡ発現（＞＝３４．２）とを組み合わせた場合、高いＨＬＡ－Ｂ／Ｃは、より良好な疾患特異的生存期間と有意に関連しており、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃエクソン８及びＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２陰性患者では、２年後に１０％の劣った生存確率であり、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃ陰性及びＨＬＡ－Ｆ１／Ｆ２陽性患者では、２年後に６０％の良好な生存確率であった（ｐ＝０．００７１）。
対照的に、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃエクソン８ ｍＲＮＡ発現を見るだけの場合、有意な値を決定できなかった（ｐ＝０．２１２７）。
図３０は、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって定量化されたＨＬＡ－Ｂ／Ｃエクソン８ ｍＲＮＡ発現による層別化に基づく局所進行性又は転移性ＵＢＣ（ｎ＝５５）を有する筋層浸潤性膀胱がん患者の疾患特異的生存（ＤＳＳ）確率を示すカプラン・マイヤープロットを示す。ＣＡＬＭ２を参照遺伝子として使用して、相対的なｍＲＮＡ発現を４０－ＤＣＴ法によって決定する。
図３０に示すように、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃエクソン８ ｍＲＮＡ発現が高い（＞＝３４．２）患者では、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃ発現が低い患者よりも疾患特異的生存期間が有意に高くなく、生存確率が２年後に６０％であったが、ＨＬＡ－Ｂ／Ｃエクソン８陰性患者では、２年後に４０％の低い生存確率であった。これは、ＨＬＡ発現の組み合わせが生存予測に優れていることを示している。

Claims (18)

  1. 腫瘍の個人のＨＬＡパターンを決定する方法であって、
    －第１のＨＬＡ遺伝子の第１の領域をコードするＲＮＡ転写物の第１の発現レベルを決定することと、
    －少なくとも１つの第２のＨＬＡ遺伝子の少なくとも１つの第２の領域のセンス又はアンチセンスＲＮＡ転写物の少なくとも第２の発現レベルを決定することと、
    －前記決定された第１及び第２の発現レベルを比較して、個人のＨＬＡパターンを得ることと、
    を含み、
    前記第１のＨＬＡ遺伝子及び前記第２のＨＬＡ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊをコードする遺伝子からなる群から選択される、方法。
  2. 前記第１のＨＬＡ遺伝子及び前記第２のＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊからなる群から選択される異なるＨＬＡ群をコードする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１のＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃからなる群から選択される第１のＨＬＡ群をコードし、前記第２のＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、並びにＨＬＡ－Ｊからなる群から選択される第２のＨＬＡ群をコードする、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１のＨＬＡ遺伝子及び前記第２のＨＬＡ遺伝子が、同一であるか、又は同じＨＬＡ群をコードする、請求項１に記載の方法。
  5. 前記第１の発現レベルがセンスＲＮＡ転写物に関し、前記第２の発現レベルが前記ＨＬＡ群のアンチセンスＲＮＡ転写物に関する、請求項４に記載の方法。
  6. －前記第１の領域及び前記第２の領域のうちの一方がエクソン－エクソン境界を含み、前記第１の領域及び前記第２の領域のうちのもう一方がエクソン－エクソン境界を含まない、若しくは
    －前記第１の領域がエクソン－エクソン境界を含まず、前記第２の領域がエクソン－エクソン境界を含まない、又は
    －前記第１の領域がエクソン－エクソン境界を含み、前記第２の領域がエクソン－エクソン境界を含む、
    請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. －前記第１の領域及び前記第２の領域のうちの少なくとも１つが、ＨＬＡ群のシグナルペプチド領域をコードし、及び／又は
    －前記第１の領域及び前記第２の領域のうちの少なくとも１つが、ＨＬＡ群の膜貫通領域をコードする、
    請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. －前記第１及び第２の発現レベルの前記比較に基づいて、前記個人のＨＬＡパターンが主に可溶性であるか又は膜結合性であるかを決定すること
    を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. －前記第１及び第２の発現レベルの前記比較に基づいて、ＨＬＡアイソフォームを決定すること
    を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ＨＬＡ群をコードする遺伝子の１つ以上の更なる領域について１つ以上の更なる発現レベルを決定することを更に含み、前記比較は、前記個人のＨＬＡパターンを得るための前記決定された更なる発現レベルに更に基づく請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記比較が発現レベル比の形成を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 特にプライマー及び／又はプローブとして使用するための、配列番号１～６９のうちの１つによる核酸分子。
  13. 請求項１２に記載の核酸分子を含むキット。
  14. 腫瘍の分子サブタイプを同定するための請求項１３に記載のキットの使用。
  15. －請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法を使用して、個人のＨＬＡパターンを決定することと、
    －治療薬が前記決定された個人のＨＬＡパターンに特異的に結合するように、前記決定された個人のＨＬＡパターンに基づいて治療薬を製造することと、ここで、前記治療薬が、タンパク質、タンパク質ドメイン、及び／又はポリペプチドを含む、
    を含む、治療薬を製造する方法。
  16. －請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法を使用して個人のＨＬＡパターンを決定することと、
    －前記決定された個人のＨＬＡパターンに基づいて治療薬を製造することと、ここで、前記治療薬によって免疫系による抗原の合成が可能となるように、前記治療薬が、核酸、特に抗原をコードするＲＮＡを含む、
    を含む、治療薬を製造する方法。
  17. 前記治療薬が、可溶性ＨＬＡドメインを含む、請求項１５又は１６に記載の治療薬。
  18. 悪性腫瘍又は自己免疫疾患の治療に使用するための請求項１５又は１６に記載の治療薬。
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