JP2022537914A - アポリポタンパク質ｅ断片 - Google Patents

Abstract

本発明は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の新規断片に関する。本ＡｐｏＥ断片は、ワクチン組成物、特にアルツハイマー病などの神経学的障害の予防又は治療用ワクチンの成分としての用途を含め、種々の用途がある。本ＡｐｏＥ断片はまた、スクリーニング方法及び検出方法にも用いられ得る。【選択図】なし

Description

本発明は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の新規断片に関する。本ＡｐｏＥ断片は、ワクチン組成物、特にアルツハイマー病などの神経学的障害の予防又は治療用ワクチンの成分としての用途を含め、種々の用途がある。本ＡｐｏＥ断片はまた、本明細書に記載されるとおりのスクリーニング方法及び検出方法にも用いられ得る。

アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体ファミリーに対するその高親和性結合を介してリポタンパク質代謝の中心的な役割を担うタンパク質である。ＡｐｏＥは血中を循環し、また、脳脊髄液及び中枢神経系間質液中では高密度リポタンパク質と会合して見られる。

完全長ヒトＡｐｏＥは、２つのドメインからなる３４ｋＤａのタンパク質である。Ｎ末端ドメイン（残基１～１９１）は主にＡｐｏＥのＬＤＬ受容体結合活性に関与する一方、Ｃ末端ドメイン（残基２１６～２９９）はリポタンパク質に高親和性で結合する。

ＡｐｏＥは、３つの異なるアイソフォーム、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４で存在し、これらは、それぞれ、ＡＰＯＥ ε２、ε３及びε４アレルによってコードされる。ＡＰＯＥ ε４アレルは、遅発性アルツハイマー病（ＡＤ）の最も強力な公知の遺伝的危険因子である。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性で神経変性性の認知症障害であり、より多く見られる遅発型と、早期発症家族型とがある。ＡＤは、進行性の記憶及び認知機能喪失を特徴とする。現時点では、ＡＤ治療は対症的管理に限られており、ＡＤ患者の予後は不良である。現在、世界中で約１８００万人がＡＤに罹患していると推定され、人口の高齢化が進んでいるため、ＡＤ罹患者数は増加すると見られている。ＡＤの有病率は、６０歳以降では年齢が５歳上がる毎にほぼ倍増し、６５歳の１０％が、８５歳以上では５０％になる（Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ（２００７）１６（６）：８１９－８２８）。

ＡｐｏＥ４がＡＤ及び他の神経学的障害の病変の一因であると考えられる種々の機構について、Ｍａｈｌｅｙ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ（Ｎｅｕｒｏｎ（２０１２）７６：８７１－８８５）にレビューされている。これらの機構には、アミロイドβ（Ａβ）代謝、クリアランス、凝集及び沈着の調節を含め、アミロイド斑形成レベルでの効果が含まれる。ＡｐｏＥ４及びその断片はＡβに結合することが報告されており、従ってＡβ代謝回転及びＡβ原線維の形成に直接影響を及ぼす（Ｇａｒａｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１４）５３：６３２３－６３３１；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１１）６（１）：ｅ１４５８６；Ｍｏｕｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１９）９（１）：３９８９；及びＷｅｌｌｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（２００５）９４：１３５１－１３６０）。

神経学的疾患の進行に関連するＡβ活性の阻害を通じたＡｐｏＥの保護的役割を報告している研究もある。ＡβのＣ末端ドメインは、ウイルスの融合タンパク質の活性と同様の融合特性を示す。Ａβのこうした融合特性が、少なくとも一部には、神経細胞膜を直接不安定化させることによりＡβの細胞毒性に関与することが提唱されてきた（Ｐｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２８７５７－２８７６５）。諸研究によれば、ＡｐｏＥのＣ末端ドメインがＡβのＣ末端ドメインとの相互作用を媒介し、それによってＡβの融合特性を阻害し得ることが示されている。Ｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）７３：７５８－７６９）に報告される研究では、ＡβとＡｐｏＥとのＣ末端ドメイン間の相互作用が、分子モデリング法を用いて研究された。Ｐｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）７２：２３０－２３７）に報告される研究では、これら２つのタンパク質間の相互作用が、ＡｐｏＥのＣ末端脂質結合ドメインの人工的に作成された断片（残基２００～２９９）を用いて研究された。この研究では、ＡｐｏＥのＣ末端断片に、Ａβの融合特性を阻害する能力があることが明らかになり、従ってＡｐｏＥのＣ末端がアルツハイマー病などの神経学的疾患において果たす保護的役割が示唆された。

ＡｐｏＥはまた、神経病変を引き起こす直接的な役割を有するとも報告されている。正常な生理条件下では、脳内のＡｐｏＥは主にアストロサイトによって合成され、脂質輸送及び膜修復過程を支える。しかしながら、神経細胞の損傷又は傷害に応答すると、ＡｐｏＥは神経細胞によって合成される。神経細胞によって産生されるＡｐｏＥはタンパク質分解を起こし易く、諸研究によれば、キモトリプシン様セリンプロテアーゼによって生成される神経毒性のあるＣ末端トランケート型断片の蓄積が明らかになっている（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２００３）１００（１９）：１０９６６－１０９７１）。

こうしたＣ末端断片が更に特徴付けられ、ＡｐｏＥ４（１－２７２）断片がミトコンドリア機能不全を引き起こし、神経毒性があったこと、しかし完全長ＡｐｏＥ４（１－２９９）及び更に短い断片ＡｐｏＥ４（１－２４０）はそのような効果をもたらさなかったことが明らかになった。加えて、ＬＤＬ受容体結合領域（アミノ酸１３５～１５０）を含むＮ末端領域（１～１７０）をトランケートすると、ＡｐｏＥ４（１－２７２）断片で見られた効果が消失したことから、ＡｐｏＥのＮ末端受容体結合領域とＣ末端脂質結合領域とが連携してミトコンドリア機能不全及び神経毒性を引き起こすように働くことが指摘された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（２００５）１０２（５１）：１８６９４－１８６９９）。

諸研究によれば、ＡＤを有するヒトの脳及び脳脊髄液にＡｐｏＥ断片が存在することが明らかになっており、最近になって、ＡｐｏＥ断片がＡＤにおいて果たす役割が、Ｍｕｎｙｏｚ ｅｔ ａｌによってＮｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ（２０１９）４４（６）：１２９７－１３０５でレビューされている。Ｍｕｎｙｏｚ ｅｔ ａｌに記載されるＡｐｏＥ断片の大多数は、このタンパク質のＮ末端断片である。ＡｐｏＥのそれらのＮ末端断片に起因するとされる機能には、（数ある中でも）細胞死の増加、Ａβ４２蓄積の増加、炎症の増加、神経毒性の増加、タウリン酸化の増加及びミトコンドリア機能不全の増加が含まれる。これらの研究が指し示すところは、このタンパク質のＮ末端に由来するＡｐｏＥ断片の原因的役割である。しかしながら、Ｃ末端脂質結合ドメインからのＡｐｏＥ断片については、Ｍｕｎｙｏｚ ｅｔ ａｌの表２及び図２が指摘するところによれば、１つのかかる断片が既に研究されており、Ａβ原線維形成に阻害効果を及ぼし、Ａβペプチドの六量体に安定効果を及ぼすことが示されている。問題の研究は、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（２００５）９４：１３５１－１３６０においてＷｅｌｌｎｉｔｚらによって報告されたもので、Ｎ末端がＡｐｏＥのアミノ酸位置１８７位から始まるＡｐｏＥの１３ｋＤａ断片について記載している。

ごく最近、Ｍｏｕｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｉ Ｒｅｐ（２０１９）９（１）：３９８９）による研究において、ＡＤｅ患者の死後脳におけるＡｐｏＥ断片の同定が報告された。この研究では、ＡＤ患者の皮質に１２ｋＤａ、１６ｋＤａ及び１８ｋＤａ ＡｐｏＥ形態の存在が見られることが報告された。ＡＤ患者では、１８ｋＤａ断片のみが著しく増加していることが認められた。ＡｐｏＥのＮＨ２半分及びＣ端側末端の両方を欠く１６ｋＤａ及び１８ｋＤａ形態のＡｐｏＥはＡβと会合することが認められ、ＡＤ病変のメディエーターとして提唱された。対照的に、ＡｐｏＥの小さい１２ｋＤａ断片については、Ａβへの結合は認められなかった。

種々の神経学的障害、特にアルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性病態の病理においてＡｐｏＥが重要な役割を果たすことは明らかである。従って、有効な治療戦略を組み立てるため、このタンパク質の生物学を理解する必要がある。本願は、ＡＤ患者から入手した脳組織における新規ＡｐｏＥ断片の同定を報告する。本明細書に記載される新規ＡｐｏＥ断片は、ＡｐｏＥタンパク質のＣ末端ドメインからの残基を含む。以上に報告したとおり、これまでの研究からは、ＡｐｏＥのＣ末端ドメインが、例えばＡβの融合特性を阻害し、及びＡβ原線維形成を阻害することにより、神経学的疾患の発症において保護的役割を果たすことが示唆されている。本明細書に記載される結果が示すところによれば、ＡＤ患者の脳に見出された新規ＡｐｏＥ Ｃ末端断片は神経毒活性を持ち得る。これまで神経毒性効果がＡｐｏＥのＮ末端断片に起因するとされていたことを考えると、これは意外である。

従って、第１の態様において、本明細書には、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の断片であって、配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる断片が提供される。

更に、そのＡｐｏＥ断片をコードする単離核酸；その単離核酸を含むベクター；並びにそのベクターを含む宿主細胞及びトランスジェニック非ヒト動物が包含される。

第２の態様において、本明細書には、配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）断片を含むワクチン組成物が提供される。更に、対象の神経学的疾患、特に神経変性疾患を予防又は治療する方法が提供され、この方法は、ＡｐｏＥワクチンを対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、このワクチンは、アルツハイマー病を予防又は治療するために投与される。

更なる態様において、本明細書には、配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ断片の神経細胞毒性を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法が提供され、この方法は、断片の存在下で神経細胞又は非ヒト動物を候補薬理作用物質と接触させること、及び神経細胞毒性又は神経細胞死を検出することを含む。

更なる態様において、本明細書には、配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ断片の産生を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法が提供され、この方法は、アポリポタンパク質Ｅを発現する神経細胞を候補薬理作用物質と接触させること、及び断片の量を検出することを含む。

更なる態様において、本明細書には、対象における配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ断片の存在又は量を検出する方法が提供され、この方法は、対象から入手された試料を、その断片に結合するアプタマーと接触させること、及び試料中の断片の存在又は量を検出することを含む。

実施例１に記載されるとおりのヒト脳抽出物のウエスタンブロット分析結果を示す。 実施例１に記載されるとおりの、個々の低分子量ＡｐｏＥ断片を示すのに十分に高い分解能による遺伝子型ＡＰＯＥ ε４／ε４のＡＤ脳からのヒト脳抽出物のウエスタンブロット分析結果を示す。 実施例１に記載されるとおり定量化した、ＡＤ（黒色の丸）及び対照（白色の四角）における完全長ＡｐｏＥに対する１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片の比率を示す図である。 実施例１に記載されるとおり定量化した、ＡＰＯＥ Ｅ４遺伝子型がないＡＤ（－Ｅ４；黒色の丸）又はＡＰＯＥ Ｅ４遺伝子型があるＡＤ（＋Ｅ４；白色の四角）における完全長ＡｐｏＥに対する１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片の比率を示す図である。 実施例２に記載される免疫沈降実験のワークフローの概略図である。 実施例２に記載されるとおりの免疫沈降処理した試料のウエスタンブロット分析結果を示す。 実施例２に記載されるとおりの免疫沈降処理した試料の銀染色結果を示す。 実施例３に記載されるとおりの、指示されるとおりの１２ｋＤａ、１５ｋＤａ及びｒｈＡｐｏＥ４ゲルのトリプシン消化物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果を示す。 実施例４に記載されるとおりのＡｐｏＥ配列のＬｙｓＣ切断部位解析の結果を示す。 実施例５に記載されるとおりの理論上のＡｐｏＥ切断部位を抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）によって調べた結果を示す。左側：５ｐｐｍ質量精度による可能性のあるペプチドのうちの１つ（２００～２３３）の３つの荷電状態の理論値における抽出イオンクロマトグラム、３つ全てについてピークは同じ保持時間で観察される。右側：各抽出ピークからの質量スペクトル。 実施例５に記載されるとおりの切断部位周辺のペプチドを検出するためのショットガンプロテオミクス法によるｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ結果を示す。同じドナーからの試料のレプリケート分析において（ＡｐｏＥ ε３／ε４、Ａ及びＢ）、ＡｐｏＥの１９８Ｌ、１９９Ａ又は２００ＧにＮ末端を有し、Ｃ末端がインタクトなペプチドが検出された。 実施例６に記載されるとおりの、指示されるとおりのＡｐｏＥ ε４／ε４、ε２／ε３及びε３／ε３保因者からの試料中における１９８Ｌ、１９９Ａ又は２００ＧにＮ末端を有するペプチドのＭＳ強度を示す図である。 （Ａ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞及び（Ｂ）ラット初代海馬ニューロンにおいて、実施例７に記載される実験に従いヒトＡｐｏＥ４及びＡｐｏＥ Ｃ末端断片によって誘導されたミトコンドリア損傷；並びに（Ｃ）ウエスタンブロット分析で測定したときのヒトＡｐｏＥ４又はＡｐｏＥ Ｃ末端断片のタンパク質発現を示す。 （Ａ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞及び（Ｂ）ラット初代海馬ニューロンにおいて、実施例７に記載される実験に従いヒトＡｐｏＥ４及びＡｐｏＥ Ｃ末端断片によって誘導されたミトコンドリア損傷；並びに（Ｃ）ウエスタンブロット分析で測定したときのヒトＡｐｏＥ４又はＡｐｏＥ Ｃ末端断片のタンパク質発現を示す。 （Ａ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞及び（Ｂ）ラット初代海馬ニューロンにおいて、実施例７に記載される実験に従いヒトＡｐｏＥ４及びＡｐｏＥ Ｃ末端断片によって誘導されたミトコンドリア損傷；並びに（Ｃ）ウエスタンブロット分析で測定したときのヒトＡｐｏＥ４又はＡｐｏＥ Ｃ末端断片のタンパク質発現を示す。 実施例８に記載される実験に従うＰＨ－００２治療ラット海馬ニューロンからの試料のウエスタンブロット分析（Ａ）及び細胞毒性分析（Ｂ）の結果を示す。 実施例８に記載される実験に従うＰＨ－００２治療ラット海馬ニューロンからの試料のウエスタンブロット分析（Ａ）及び細胞毒性分析（Ｂ）の結果を示す。

ＡｐｏＥ断片
本開示は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の断片に関する。本明細書に報告されるとおり、アルツハイマー病（ＡＤ）患者、特にＡＰＯＥ ε４アレルを有するＡＤ患者では、ＡｐｏＥ断片が有意に増加する。

本開示のＡｐｏＥ断片は、完全長ヒトＡｐｏＥタンパク質のＣ末端に由来する。完全長ヒトＡｐｏＥタンパク質は、以下の表１に示される（ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４）。表１にはまた、ヒトＡｐｏＥのアミノ酸２００～２９９（配列番号１）、アミノ酸１９９～２９９（配列番号２）及びアミノ酸１９８～２９９（配列番号３）からなるＣ末端断片も示される。異なるＡｐｏＥアイソフォームの完全長配列から明らかなとおり、これらのＣ末端断片（配列番号１～３によって表されるとおり）は、全てのアイソフォームに共通である。従って、本明細書に記載されるＡｐｏＥ断片は、ε２、ε３及びε４から選択されるＡＰＯＥアレルのいずれを有する個体にも産生され、又は見出され得る。本明細書に報告されるとおり、本ＡｐｏＥ断片は、少なくとも１つのε４アレルを有するＡＤ患者に高いレベルで認められる。

一実施形態において、本明細書には、配列番号１のアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の断片が提供される。特定の実施形態において、本明細書には、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片が提供される。一実施形態において、本明細書には、ヒトＡｐｏＥのアミノ酸２００～２９９からなるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の断片が提供される。

一実施形態において、本明細書には、配列番号２のアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の断片が提供される。特定の実施形態において、本明細書には、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片が提供される。一実施形態において、本明細書には、ヒトＡｐｏＥのアミノ酸１９９～２９９からなるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の断片が提供される。

一実施形態において、本明細書には、配列番号３のアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の断片が提供される。特定の実施形態において、本明細書には、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片が提供される。一実施形態において、本明細書には、ヒトＡｐｏＥのアミノ酸１９８～２９９からなるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の断片が提供される。

本明細書に報告されるとおり、ＡｐｏＥ断片は、培養下の神経細胞の呼吸能を決定することによりインビトロで測定したとき、神経毒性を呈する。従って、特定の実施形態において、本明細書に記載されるＡｐｏＥ断片は神経毒性を呈する。神経毒性は、神経細胞における毒性効果の検出に好適な任意のアッセイを用いて測定されてもよい。好適なアッセイは本明細書に例示され（実施例７を参照）、本明細書に記載されるＡｐｏＥ断片の神経毒性特性の評価に用いることができる。

本開示はまた、本明細書に記載されるＡｐｏＥ断片をコードする核酸も包含する。本ＡｐｏＥ断片をコードする核酸には、例えば、組換えＤＮＡ分子が含まれる。用語「核酸」は、本明細書では、「ポリヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド分子」と同義的に使用され、一本鎖又は二本鎖のいずれかの任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指し、一本鎖の場合には、その相補配列の分子を指す。核酸を議論する際、特定の核酸の配列又は構造は、配列を５’から３’方向に提供するという通常の慣習に従い記載され得る。特定の実施形態において、本核酸は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片をコードする。特定の実施形態において、本核酸は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片をコードする。特定の実施形態において、本核酸は、配列番号３のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片をコードする。

一部の実施形態において、核酸又はポリヌクレオチドは「単離」されている。この用語は、核酸に適用されるとき、その由来である生物の天然に存在するゲノム中ではそれが直接隣接している配列から分離されている核酸分子を指す。例えば、「単離核酸」は、プラスミド又はウイルスベクターなど、ベクターに挿入されるか、又は原核細胞若しくは真核細胞又は非ヒト宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。ＲＮＡに適用されるとき、用語「単離ポリヌクレオチド」は、主に、上記に定義するとおりの単離ＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。或いは、この用語は、その自然状態であれば（即ち、細胞又は組織内では）それが結び付いているであろう他の核酸から精製／分離されているＲＮＡ分子を指し得る。単離ポリヌクレオチドとは（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれも）、更に、生物学的又は合成的手段によって直接作製され、その作製中に存在する他の成分から分離された分子を表し得る。

また、本ＡｐｏＥ断片をコードする核酸を含むベクターも包含される。このベクターは、特定の宿主細胞又は無細胞発現系におけるＡｐｏＥ断片の発現に好適な複製可能なベクターであり得る。種々の異なる発現系における使用に好適なベクターが、発現ベクターを含め、当該技術分野で公知である。本明細書に記載されるＡｐｏＥ断片をコードする核酸を取り込んだベクターは、任意の標準的な分子生物学技術を用いて調製し得る。

本ＡｐｏＥ断片をコードする核酸を含むベクターは、宿主細胞に取り込まれてもよい。好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、又は高等真核細胞、具体的には哺乳類細胞であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞又は浮遊培養下での成長用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９７７）３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．（１９８０）２３：２４３－２５１）；マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０－ＡＧ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８２８７）又はＮＳ０（ＨＰＡカルチャーコレクション８５１１０５０３番）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）、並びにＤＳＭのＰＥＲＣ－６細胞株である。

用語「宿主細胞」は、概して培養細胞株を指すことに留意しなければならない。ＡｐｏＥ断片をコードする発現ベクターが導入されたヒト全体は、「宿主細胞」の定義から明示的に除外される。

特定の実施形態において、本ＡｐｏＥ断片をコードする核酸を含むベクターは、トランスジェニック非ヒト動物に取り込まれてもよい。かかる動物としては、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、ブタを挙げることができる。

本開示はまた、本明細書に記載されるＡｐｏＥ断片を作製する方法も包含し、この方法は、本ＡｐｏＥ断片をコードする核酸（例えば発現ベクター）を含む宿主細胞（又は無細胞発現系）を、本断片の発現が許容される条件下で培養すること、及び発現した断片を回収することを含む。この組換え発現方法は、例えば、本明細書の他の部分に記載されるとおりのワクチン又はスクリーニング方法における使用に向けた、ＡｐｏＥ断片の大規模生産に用いることができる。組換えポリペプチドの大規模製造に好適なベクター、細胞株及び作製方法は、概して当該技術分野で利用可能であり、当業者に周知であり得る。

ワクチン
本明細書に記載されるＡｐｏＥ断片は、ワクチン、特に、神経学的障害又は病態、例えばアルツハイマー病の予防又は治療に用いられるワクチンに取り込まれてもよい。

特定の実施形態において、本ワクチンは、１つ以上のＡｐｏＥ断片と、少なくとも１つのアジュバントとを含む。特定の実施形態において、本ワクチンは、配列番号１のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片と、少なくとも１つのアジュバントとを含む。特定の実施形態において、本ワクチンは、配列番号２のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片と、少なくとも１つのアジュバントとを含む。特定の実施形態において、本ワクチンは、配列番号３のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片と、少なくとも１つのアジュバントとを含む。特定の実施形態において、本ワクチンは、配列番号１、２及び３から選択される少なくとも２つ又は少なくとも３つのＡｐｏＥ断片と、少なくとも１つのアジュバントとを含む。

本ワクチン又はワクチン組成物は、２つ以上のアジュバントを含み得る。１つ又は複数のアジュバントの目的は、対象の免疫応答を増加させること、又はそれを刺激することである。当該技術分野においては種々のアジュバントが公知であり、本明細書に記載されるワクチンに使用し得る。利用し得る特定のアジュバントとしては、限定はされないが、数ある中でも水酸化アルミニウム（ミョウバン）及び／又はＣｐＧが挙げられる。

本ワクチンは予防的に使用されてもよく、即ち、本ワクチンは、疾患に関して無症候性の対象に対し、神経学的障害又は病態の発症を予防することを目的とした免疫応答を誘導するために投与されてもよい。本ワクチンは、神経変性疾患又は障害の発症を予防するための対象の免疫化に使用されてもよい。本ワクチンは、認知記憶能力の喪失を特徴とする疾患又は障害の発症を予防するための対象の免疫化に使用されてもよい。かかる疾患又は障害としては、限定はされないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体型認知症、ダウン症候群、及びアミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）が挙げられる。特定の実施形態において、本ワクチンは、脳アミロイドアンギオパチー、パーキンソン病、及びアミロイドβ沈着に起因する白内障など、アミロイド形成タンパク質に関連する疾患又は障害の予防に使用されてもよい。好ましい実施形態において、本ワクチンは、ＭＣＩ又はＡＤ、好ましくはＡＤの予防に使用される。対象は、典型的には哺乳類であり、好ましくはヒトである。

或いは、又は加えて、本ワクチンは治療的に使用されてもよく、即ち、本ワクチンは、神経学的疾患若しくは病態を有するか、又は神経学的疾患若しくは病態を有する疑いがある対象に対し、その疾患に関連する症状を軽減することを目的とした免疫応答を誘導するために投与されてもよい。本ワクチンは、神経変性疾患又は障害の治療に使用されてもよい。本ワクチンは、認知記憶能力の喪失を特徴とする疾患又は障害の治療に使用されてもよい。かかる疾患又は障害としては、限定はされないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体型認知症、ダウン症候群、及びアミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）が挙げられる。特定の実施形態において、本ワクチンは、脳アミロイドアンギオパチー、パーキンソン病、及びアミロイドβ沈着に起因する白内障など、アミロイド形成タンパク質に関連する疾患又は障害の治療に使用されてもよい。好ましい実施形態において、本ワクチンは、ＭＣＩ又はＡＤ、好ましくはＡＤの治療に使用される。対象は、典型的には哺乳類であり、好ましくはヒトである。

以上から、本発明は、それを必要としている対象の神経学的疾患又は病態を予防又は治療する方法であって、本明細書に記載されるとおりのＡｐｏＥ断片を含むワクチンを対象に投与することを含む方法を包含することになる。好ましい実施形態において、本方法は、ＭＣＩ及び／又はＡＤ、好ましくはＡＤの予防又は治療のための方法である。本明細書には更に、それを必要としている対象の神経学的疾患又は病態の予防又は治療における使用のための、記載される実施形態のいずれかに係るワクチンが提供される。好ましい実施形態において、本ワクチンは、ＭＣＩ及び／又はＡＤ、好ましくはＡＤの予防又は治療における使用のためのワクチンである。

本ワクチンは、任意の適切な投与経路によって対象に投与されてもよい。当業者であれば認識しているであろうとおり、ワクチン組成物は、局所、経口、直腸、鼻腔又は非経口（静脈内、皮内、皮下、又は筋肉内など）経路によって投与されてもよい。加えて、ワクチンは、生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスに取り込まれてもよく、こうしたポリマーは、送達が所望されるところの近傍に、又はそれと近接して植え込まれる。好ましい実施形態において、ワクチンは筋肉内又は皮下投与される。

本ワクチンは、対象に単回投与されることで免疫応答を生じ得る。一部の実施形態では、本ワクチンは、同じ対象に複数回投与されてもよい。従って、いわゆるプライム・ブーストレジメンが利用されてもよい。

本明細書には更に、本明細書に記載されるとおりのワクチンを含むキットが提供される。かかるキットには、好適な使用説明書が提供されてもよい。この使用説明書は、ワクチンの投与スケジュールを説明し得る。従って本キットは、対象に投与するための複数の（別個の）用量を含み得る。使用説明書は更に、特にワクチンのそれらの用量を投与する合間の時間におけるワクチンの貯蔵条件を説明し得る。

スクリーニング方法
本明細書には更に、本明細書に記載される新規ＡｐｏＥ断片に基づきスクリーニングする方法が提供される。

一態様において、本明細書には、ＡｐｏＥ断片の神経細胞毒性を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法が提供され、ここでＡｐｏＥ断片は、配列番号１、２又は３のいずれか１つによって表される断片から選択される。特定の実施形態において、本スクリーニング方法は、配列番号２及び配列番号３によって表される断片から選択されるＡｐｏＥ断片の神経細胞毒性を調節する能力のある薬理作用物質の同定に使用される。

好ましい実施形態において、本方法は、配列番号１、２又は３のいずれか１つによって表される断片から選択されるＡｐｏＥ断片の神経細胞毒性を低下させる能力のある薬理作用物質をスクリーニングするために行われる。本方法は、配列番号２及び配列番号３によって表される断片から選択されるＡｐｏＥ断片の神経細胞毒性を低下させる能力のある薬理作用物質をスクリーニングするために行われ得る。

神経細胞毒性を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法は、少なくとも１つのＡｐｏＥ断片の存在下で神経細胞又は非ヒト動物を候補薬理作用物質と接触させるステップ、及び結果として生じた毒性を測定又は検出するステップを含む。

神経毒性を評価するため候補薬理作用物質を神経細胞と接触させる実施形態について、アッセイは、典型的には、神経細胞培養物を使用してインビトロで実施されてもよい。神経細胞は、好ましくはニューロン細胞である。細胞は、初代ニューロン細胞、例えば、ラット海馬細胞培養物を表し得る。或いは、又は加えて、神経細胞又はニューロン細胞は、樹立細胞株、例えばＮｅｕｒｏ２Ａ又はＮ２ａ細胞などの神経芽細胞腫株を表し得る。

ＡｐｏＥ断片は、細胞への外因性投与、例えば細胞培養培地を通じた投与の結果として神経細胞培養物中に存在し得る。或いは、又は加えて、ＡｐｏＥ断片は、培養物の神経細胞によるＡｐｏＥ断片の組換え発現の結果として存在し得る。より具体的には、培養物の神経細胞又はニューロン細胞は、配列番号１～３のいずれか１つによって表されるとおりのＡｐｏ断片を組換え発現するように操作されていてもよく、その断片を発現する細胞を使用して、候補薬理作用物質の効果が評価されてもよい。

候補薬理作用物質がＡｐｏＥ断片の神経毒性効果を調節する能力、例えば低下させる能力は、任意の好適なアッセイ技法によって評価し得る。細胞死をモニタする技法が当業者に公知であり、それを用いて神経細胞毒性の尺度としての神経細胞死が検出されてもよい。神経毒性はまた、本明細書に記載される例示的な技法又はアッセイのいずれかを用いて評価されてもよい。例えば、神経毒性は、細胞代謝を測定することによって間接的に検出又はモニタされてもよい。実施例７に記載される技法に従いミトコンドリア呼吸が測定されてもよい。

候補薬理作用物質がＡｐｏＥ断片の神経細胞毒性を調節する能力を評価する目的で、候補薬理作用物質の存在下で見られる効果が対照と比較されてもよい。対照は、単純に、いかなる候補薬理作用物質も存在しない神経細胞又はニューロン細胞培養物であってもよい。或いは、ＡｐｏＥ断片誘導毒性に何ら効果を及ぼさないことが公知の対照薬理作用物質に曝露したニューロン細胞培養物の神経毒性が測定されてもよい。特定の実施形態において、候補薬理作用物質の効果は、ＡｐｏＥ断片の神経毒性効果を低下させる又は阻害することが公知の対照薬理作用物質と並行して決定されてもよい。かかる実施形態では、候補薬理作用物質は、ＡｐｏＥ断片の神経毒性効果を低下させる又は阻害することが公知の作用物質に対する相対的な有効性に関して評価され得る。

神経毒性を評価するため候補薬理作用物質を非ヒト動物と接触させる実施形態について、薬理作用物質は、任意の好適な投与経路で非ヒト動物に投与されてもよい。非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、又は任意の他の好適な実験動物から選択されてもよい。ＡｐｏＥ断片は、薬理作用物質より前又はそれと同時に非ヒト動物に提供されてもよい。或いは、非ヒト動物は、神経毒性のあるＡｐｏＥ断片を組換え発現するように遺伝子操作されていてもよい。例えば、実験動物が、神経毒性のあるＡｐｏＥ断片を脳内で組換え発現してもよく、従って候補薬理作用物質が神経毒性に及ぼす効果を決定することができるようになる。

候補薬理作用物質が非ヒト動物で試験される実施形態について、候補作用物質の効果は、神経毒性を測定する任意の好適なアッセイ技法によって決定し得る。特定の実施形態において、神経毒性は、動物の脳のインビボイメージングによって評価される。或いは、又は加えて、試験期間の終了時に動物を犠牲死させて、神経毒性効果のエビデンスに関して脳組織を調べてもよい。インビトロアッセイには、上記に記載されるとおりの好適な対照を利用し得る。

本明細書に記載されるスクリーニング方法は、ＡｐｏＥ断片の神経毒性を調節する能力のある特定の薬理作用物質の選択につながり得る。例えば、ある薬理作用物質が、本明細書に記載される１つ以上のＡｐｏＥ断片の神経毒性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％低下させる又は阻害することが分かった場合、それが選択されてもよい。

更なる態様において、本明細書には、ＡｐｏＥ断片の産生を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法が提供され、ここでＡｐｏＥ断片は、配列番号１、２又は３のいずれか１つによって表される断片から選択される。特定の実施形態において、本方法は、配列番号２及び配列番号３によって表される断片から選択されるＡｐｏＥ断片の産生を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングすることを含む。特定の実施形態において、本方法は、配列番号１、２又は３のいずれか１つによって表される断片から選択されるＡｐｏＥ断片の産生を阻害する能力のある薬理作用物質をスクリーニングするために行われる。特定の実施形態において、本方法は、配列番号２及び配列番号３によって表される断片から選択されるＡｐｏＥ断片の産生を阻害する能力のある薬理作用物質をスクリーニングするために行われる。

本方法は、アポリポタンパク質Ｅを発現する神経細胞を候補薬理作用物質と接触させること、及び産生された断片の量を検出することを含む。本方法は、典型的には、アポリポタンパク質Ｅを発現する神経細胞集団を候補薬理作用物質と接触させること、及び集団によって産生されたＡｐｏＥ断片の量を検出することを含む。ＡｐｏＥ断片の量は、典型的には、候補薬理作用物質を神経細胞集団と接触させる決められた期間の後に測定し得る。

特定の実施形態において、アポリポタンパク質Ｅを発現する神経細胞は、候補薬理作用物質とインビトロで接触させる。かかる実施形態において、候補薬理作用物質は神経細胞培養物に適用されてもよい。培養物の神経細胞は、ニューロン細胞であってもよく、初代ニューロン細胞又は上記に記載されるとおりのニューロン細胞株であってもよい。

特定の実施形態において、アポリポタンパク質Ｅを発現する神経細胞は、候補薬理作用物質とインビボで接触させてもよい。かかる実施形態では、候補薬理作用物質は、アポリポタンパク質Ｅを発現する神経細胞を有する動物、好ましくは非ヒト動物に投与されてもよく、インビボで神経細胞によって産生されたＡｐｏＥ断片の量が検出されてもよい。薬理作用物質は、任意の好適な投与経路で動物に投与されてもよい。薬理作用物質の存在下で産生されたＡｐｏＥ断片の量は、動物のインビボイメージング、例えば動物の脳のイメージングによって検出されてもよい。或いは、又は加えて、産生されたＡｐｏＥ断片の量は、動物から入手された試料中で検出されてもよく、これにより検出ステップはインビトロで実施されることになる。動物から入手された試料は、ＡｐｏＥ断片を含有する疑いがある任意の試料、例えば脳組織又は脳脊髄液であってよい。

候補薬理作用物質がＡｐｏＥ断片の産生を調節又は阻害する能力は、対照との比較に基づき決定されてもよい。例えば、候補薬理作用物質の存在下で測定されるＡｐｏＥ断片の量が、アポリポタンパク質Ｅを発現する対照神経細胞集団で測定されるＡｐｏＥ断片の量と比較されてもよく、ここで対照神経細胞集団は、いかなる薬理作用物質にも曝露されていない。或いは、対照神経細胞集団は、ＡｐｏＥ断片の産生に影響を及ぼさないことが公知の対照薬理作用物質で処理されてもよい。

神経細胞集団によって産生されるＡｐｏＥ断片の量は、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルで決定されてもよい。転写産物の検出／定量化に好適な技法及びタンパク質レベルの評価に好適な技法は、当該技術分野において公知である。例えば、ＡｐｏＥ断片のｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロッティング又はマイクロアレイ技術などのハイブリダイゼーション技法、及び／又はＲＴ－ＰＣＲ又は核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などの増幅ベースの技法によって決定されてもよい。ＡｐｏＥ断片のタンパク質レベルは、イムノブロット分析、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、Ｅｌｉｓｐｏｔ等のイムノアッセイ技法によって決定されてもよい。

特定の実施形態において、候補薬理作用物質と接触させる１つ又は複数の神経細胞は、完全長アポリポタンパク質Ｅタンパク質、好ましくは完全長ヒトアポリポタンパク質Ｅタンパク質を発現する。好ましい実施形態において、神経細胞は、完全長ヒトＡｐｏＥ４を発現する。神経細胞は、アポリポタンパク質Ｅタンパク質を組換え発現するように遺伝子修飾されていてもよい。神経細胞が完全長アポリポタンパク質Ｅタンパク質を発現する実施形態について、本明細書に記載される方法を用いると、完全長アポリポタンパク質Ｅの転写、翻訳及び／又は分泌を阻害する能力のある薬理作用物質を、また、アポリポタンパク質Ｅが翻訳後プロセシングを受けて本明細書に記載される神経毒性のあるＡｐｏＥ断片になることを阻害する能力のある薬理作用物質も、スクリーニングすることができる。特定の実施形態において、本明細書に記載されるスクリーニング方法は、完全長アポリポタンパク質Ｅがプロセシング又は切断を受けて神経毒性のあるＡｐｏＥ断片になることを阻害する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする。

特定の実施形態において、候補薬理作用物質と接触させる１つ又は複数の神経細胞は、本明細書に記載されるとおりのアポリポタンパク質Ｅ断片を発現する。神経細胞は、完全長アポリポタンパク質Ｅに加えて、又はその代わりに、組換えＡｐｏＥ断片を発現するように遺伝子修飾されていてもよい。神経細胞がＡｐｏＥ断片を発現する実施形態について、本明細書に記載される方法を用いると、かかる神経毒性のある断片の直接的な発現を阻害する能力のある薬理作用物質をスクリーニングすることができる。

本明細書に記載されるスクリーニング方法のいずれかにおいて試験する薬理作用物質は、任意のクラスの作用物質から選択し得る。本方法において試験され得る薬理作用物質としては、限定はされないが、小分子、有機又は無機分子、抗体及びその抗原結合断片を含む生体分子、天然又は合成ポリペプチド又はペプチド、ＲＮＡ干渉剤として用いられるアンチセンスＲＮＡ種及び二本鎖ＲＮＡ種、例えばｓｉＲＮＡ分子を含めた核酸療法剤が挙げられる。

本明細書に記載されるスクリーニング方法によって同定される薬理作用物質は、本明細書の他の部分で定義するとおりの認知低下を伴う神経学的疾患又は病態を有する対象の予防及び／又は治療用の作用物質として有用であってもよい。薬理作用物質は、神経変性疾患又は障害の治療に使用されてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載されるスクリーニング方法によって同定される薬理作用物質は、軽度認知障害（ＭＣＩ）又はアルツハイマー病（ＡＤ）の予防又は治療に使用されてもよい。

検出方法
更なる態様において、本明細書には、対象における配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）断片の存在又は量を検出する方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片の存在又は量を検出する方法である。特定の実施形態において、本方法は、配列番号２のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片の存在又は量を検出する方法である。特定の実施形態において、本方法は、配列番号３のアミノ酸配列からなるＡｐｏＥ断片の存在又は量を検出する方法である。

本方法は、対象から入手された試料を、その断片に結合するアプタマーと接触させることであって、それによって試料中のＡｐｏＥ断片の存在又は量を検出することを含む。本方法はインビトロで行われる。

対象から入手される試料は、１つ以上のＡｐｏＥ断片を含むと予想される任意の試料であり得る。試料は、血液、例えば、血清、末梢血、全血若しくはヘパリンなどの抗凝固薬で予め処理された全血、血漿又は血清から取られてもよい。試料は、脳脊髄液を含め、対象の脳又は中枢神経系の領域から入手されてもよい。

対象から入手された試料中のＡｐｏＥ断片の存在又は量は、試料をアプタマーと接触させることによって検出される。本明細書で使用されるとき、用語「アプタマー」は、特定の標的、この場合には本明細書に記載されるとおりの１つ以上のＡｐｏＥ断片に対して結合特異性を呈する一本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。本明細書に記載される検出方法に用いられるアプタマーは、任意のオリゴヌクレオチド配列又は三次構造を有してもよく、但し、これらのアプタマーは、本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つのＡｐｏＥ断片に特異的に結合するものとする。本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」とは、分子（アプタマー）が所与の標的に優先的に結合する能力を指す。

試料中のＡｐｏＥ断片の存在又は量を決定するため、任意の好適な技術によってアプタマーと試料中のＡｐｏＥ断片との間の結合が測定されてもよい。

特定の実施形態において、試料は、神経学的疾患又は障害、例えば神経変性性障害を有する又は有する疑いがある対象から入手される。特定の実施形態において、試料は、ＭＣＩ又はＡＤを有する又は有する疑いがある対象から入手される。対象は、以前に神経学的又は神経変性性疾患又は障害、例えばアルツハイマー病と診断されたことがあってもよい。或いは、又は加えて、対象は、神経学的又は神経変性性疾患又は障害、例えばアルツハイマー病に対する治療を受けているところであるか、又は治療を受けたことがあってもよい。

本開示のこの態様に係る方法は、対象の神経学的又は神経変性性疾患を検出し、診断し、又はその診断を支援するために行われ得る。例えば、本方法は、アルツハイマー病を検出し、診断し、又はその診断を支援するために行われ得る。

疾患を診断し、又はその診断を支援するためにＡｐｏＥ断片の量が検出される実施形態について、対象における疾患の可能性を評価するため、試料中のＡｐｏＥ断片の量が所定の閾値又はカットオフと比較されてもよい。例えば、所定の閾値又はカットオフは、健常対象コホートで検出される対応するＡｐｏＥ断片のレベルを基準として決定されたものであってもよく、又はそのように決定されてもよい。対象から入手された試料中のＡｐｏＥ断片の量が健常対象コホートの所定の閾値を超える場合、その対象は、疾患、例えばアルツハイマー病を有すると診断され得る。

特定の実施形態において、対象の治療に対する臨床反応をモニタするため、対象から入手された試料中のＡｐｏＥ断片が検出されてもよい。治療は、任意の神経学的又は神経変性性障害の治療であってよいが、好ましくは、アルツハイマー病の治療である。ある期間、例えば治療過程と重なる期間にわたって対象から入手された複数の試料で測定されるＡｐｏＥ断片レベルの低下が、治療に対する臨床反応を示し得る。

参照による援用
本願には様々な文献が引用され、それらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される。

本発明は、以下の非限定的な例を参照して更に理解されることになる。

実施例１
アルツハイマー病患者及び対照からのヒト脳抽出物におけるＡｐｏＥ断片の分析
本実施例は、ヒト脳組織のホモジナイゼーションと、それに続く２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液中の脳抽出物からのＡｐｏＥ断片のウエスタンブロット分析について記載する。

材料及び方法
脳組織ホモジナイゼーション及び試料調製：様々なＡＰＯＥ遺伝子型を持つアルツハイマー病（ＡＤ）患者（ｎ＝２４）及び対照（ｎ＝１４）からの新鮮凍結ヒト脳組織をＲＩＰＡ ２％ＳＤＳ抽出緩衝液中１：５の重量：体積でホモジナイズし、続いて１６０００×ｇで１時間遠心した。得られた上清は、分析時まで－８０℃で凍結した。

ヒト脳抽出物におけるＡｐｏＥ断片の分析：１０μｇ総タンパク質量を含有するＲＩＰＡ ２％ＳＤＳ脳抽出物を２×レムリ試料緩衝液と混合し、９５℃で５分間煮沸し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｏｌｔ（商標）１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ １０ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にロードした。ゲルを１８０Ｖで３０～４０分間泳動した後、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）システム（ＢｉｏＲａｄ）を使用してタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転写した。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液で膜を１時間ブロックし、次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液で１：２０００希釈したポリクローナル抗ＡｐｏＥ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号＃１７８４７９）と共に室温で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液で１：２５０００希釈した検出抗体抗ヤギ８００ＣＷ（ＬＩ－ＣＯＲ、カタログ番号９２５－３２２１４）と共に室温で１時間インキュベートした。膜を洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＦＣ（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して画像を取得した。Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（バージョン５．２）を使用して、取得されたウエスタンブロット画像上での完全長ＡｐｏＥの量に対する比率としてＡｐｏＥ断片の相対量を定量化した。

結果
ヒト脳ＲＩＰＡ ２％ＳＤＳ抽出物（ｎ＝３８）のウエスタンブロット分析により、完全長ＡｐｏＥ並びに数種の低分子量（ＬＭＷ）ＡｐｏＥ断片が同定された。図１は、ウエスタンブロット分析からの代表し得る膜を示す。ＬＭＷ ＡｐｏＥ断片は、１０、１２、１４～１５及び１７ｋＤａのサイズと推定された（図２）。

完全長（ＦＬ）ＡｐｏＥに対する比率としてＡｐｏＥ断片を分析したところ、対照群（ｎ＝１４）と比較したとき、ＡＤ群（ｎ＝２４）では１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片が有意に増加していることが実証された。図３を参照のこと。加えて、ＡＤ群のＡＰＯＥ ε４保因者で１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片の有意な増加が観察された（図４）。

実施例２
アルツハイマー病患者のヒト脳抽出物からのＡｐｏＥ断片の抽出及び単離
本実施例は、アミノ酸配列分析に十分なタンパク質濃度の高純度ＡｐｏＥ試料を調製するための、ヒト脳抽出物からの完全長ＡｐｏＥ並びに１２及び１５ｋＤａ ＡｐｏＥ断片の単離及び濃縮手順について記載する。

材料及び方法
様々なＡＰＯＥ遺伝子型を持つＡＤ患者のヒト脳抽出物からのＡｐｏＥの単離：ヒト脳抽出物からのＡｐｏＥの免疫沈降（ＩＰ）プロトコルを作成した。プロトコルを最適化したことにより、アミノ酸配列分析に十分なタンパク質濃度の高純度ＡｐｏＥ試料が得られた。このワークフローの概略図については、図５を参照のこと。１．５ｍｇの総タンパク質濃度のヒト脳ＲＩＰＡ ２％ＳＤＳ抽出物をＩＰ緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．１％トリトンＸ－１００、プロテアーゼ阻害薬カクテル）と混合し、アミノ酸２３７～２９９の範囲内に結合エピトープを有する２００μｇの抗ＡｐｏＥ Ｃ末端抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＡ５－２７０８８）を加えることにより、ＡｐｏＥを免疫沈降させた。上下に回転させながら室温で２時間インキュベートする間に、ＩＰ抗体と脳抽出物中のＡｐｏＥとの間で複合体を形成させた。このＩＰ混合物に５００μｌのプロテインＡ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０００２Ｄ）を加え、上下に回転させながら室温で１時間インキュベートした後、プロテインＡ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを洗浄して、ビーズへの非特異的結合を除去した。プロテインＡ Ｄｙｎａｂｅａｄｓに（ＩＰ抗体を介して）結合したＡｐｏＥタンパク質を２５０μｌ溶離緩衝液（１．２５ｍＭトリス ｐＨ６．８、０．００５％ＳＤＳ）で溶離させて、９００ｒｐｍで振盪しながら９５℃で５分間インキュベートした。手早くスピンした後、試料をＤｙｎａＭａｇ（商標）－２磁石上に置き、液体を新しいチューブに移し替えた。

単離されたＡｐｏＥの濃縮と、続くＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析：ＡｐｏＥタンパク質を濃縮するため、溶離したＩＰ試料を回転式真空濃縮機において１３００ｒｐｍ、４０℃で約２時間遠心することにより、容積を２５０μｌから約１５μｌに減少させた。濃縮した試料に２×レムリ緩衝液を加え、試料を９００ｒｐｍ、９５℃で５分間インキュベートした。手早くスピンした後、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｏｌｔ（商標）１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ １０ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＮＷ０４１２０ＢＯＸ）にロードした。ゲルを１８０Ｖで３０～４０分間泳動した後、１つのゲルはウエスタンブロット分析によるＡｐｏＥ断片の確認に使用し、１つのゲルは銀染色して、ＡｐｏＥの切り出しに使用した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロット分析：Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）システム（ＢｉｏＲａｄ）を使用してタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転写した。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液で膜を１時間ブロックし、次に０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液で１：２０００希釈した抗ＡｐｏＥ Ｃ末端抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＡ５－２７０８８）と共に室温で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液で１：２５０００希釈した検出抗体抗ウサギ８００ＣＷ（ＬＩ－ＣＯＲ、カタログ番号９２５－３２２１１）と共に室温で１時間インキュベートした。膜を洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＦＣ（ＬＩ－ＣＯＲ）を使用して画像を取得した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの銀染色：ゲルを固定し、製造者の指示に従い銀染色で染色した（Ｐｉｅｒｃｅ質量分析用銀染色、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２４６００）。銀染色の完了後、停止緩衝液をＭｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ_２Ｏに交換し、１０分間のリンスを２回行った。ゲルから完全長ＡｐｏＥ、並びに１２及び１５ｋＤａ ＡｐｏＥバンドを切り出し、清浄なエッペンドルフ試験管内のＭｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ_２Ｏ中に置いた。

結果
作成したＩＰプロトコル（図５）を用いて、様々なＡＰＯＥ遺伝子型（ε２／ε３、ε３／ε３、ε３／ε４及びε４／ε４）のヒトＡＤ脳からＡｐｏＥを単離し、溶離したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で泳動させた。

ＡｐｏＥの抽出は、ウエスタンブロット分析によって確認した。図６は、ＡｐｏＥ断片、並びに完全長ＡｐｏＥの幾つかのバンドを実証する代表的なウエスタンブロット膜を示す。加えて、図７に示されるとおり、単離及び濃縮したＡｐｏＥタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの銀染色によって染色した。約１２及び１５ｋＤａサイズのＡｐｏＥ断片が可視化され、銀染色したゲルからそれらを切り出した。参照試料として、組換え完全長ＡｐｏＥタンパク質及びヒト脳ＩＰ試料からの完全長ＡｐｏＥもまた、銀染色したゲルから切り出した。

実施例３
１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片におけるトリプシン切断部位の同定
試料調製
組換えヒト完全長ＡｐｏＥ４（ｒｈＡｐｏＥ４）及び／又は免疫沈降からの３４ｋＤａのバンド、免疫沈降からの１５ｋＤａのバンド、及び免疫沈降からの１２ｋＤａのバンドを含む、１．５ｍｌ ＰＰチューブ内にある実施例２からの銀染色したゲルストリップを十分な水で洗浄し、続いて５００μｌアセトニトリル（ＡＣＮ；供給元Ｗａｋｏ）を用いて脱水した。各ゲルが白色になった後、溶媒を全て除去し、続いて５００μｌの水を加えて各ゲルを膨潤させた。水を除去した後、各ゲルに５００μｌのＳｉｌｖｅｒ Ｑｕｅｓｔ脱染剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、室温で１５分間インキュベートした。脱染溶媒を全て除去した後、１０００μｌの水を加え、次に室温で１０分間インキュベートした。水を除去した後、再び１０００μｌの水を加えて各ゲルを洗浄し、次にチューブから溶媒を全て除去した。各ゲルに５００μｌ ＡＣＮを加え、次に各ゲルが白色になった後、過剰のＡＣＮを除去した。

５００μｌの１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ；供給元Ｗａｋｏ）をゲルに加え、続いて５６℃で３０分間インキュベートした。ＤＴＴ溶液を除去した後、５００μｌ ＡＣＮを加えることにより、室温で１０分間穏やかに混合インキュベートしながら各ゲルを収縮させた。ＡＣＮを除去した後、各チューブに５５ｍＭヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔｏａｍｉｄｅ）（ＩＡＡ；供給元Ｗａｋｏ）を加え、次に暗所下室温で３０分間インキュベートした。ＩＡＡ溶液を除去した後、各チューブに再び５００μｌ ＡＣＮを、１０分間、時々ボルテックス混合しながら加えて、収縮したゲルを得た。ＡＣＮを除去した後、１０％ＡＣＮを含有する１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の３００μｌの１３μｇ／ｍｌトリプシンをゲルに加え、次に５℃で６時間インキュベートした。次に、ゲルを３７℃のチャンバに置いて各ゲルにおけるタンパク質消化を促し、続いて一晩インキュベートした。

水／ＡＣＮの１／２（ｖ／ｖ）溶液中にある６００μｌの５％ギ酸を各チューブに加え、ボルテックスしながら十分に混合した。次に、穏やかに回転させながら３７℃でのインキュベーションを行うことにより、各ゲルからのトリプシンペプチドを含む溶液を入手した。入手された溶液をＳｐｅｅｄＶａｃシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって乾燥させ、続いて０．１％ＴＦＡ－水中の３００μｌの５％メタノールを使用して再構成した。この溶液をＭｏｎｏｓｐｉｎ Ｃ１８固体抽出カラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって販売業者の取扱説明書のとおりに脱塩した後、溶離液をＳｐｅｅｄＶａｃシステムによって乾燥させた。各チューブに０．１％ＴＦＡ－水中の３０μｌの５％メタノールを加えて最終的な再構成溶液を入手した。この溶液をＬＣ－ＭＳ分析に供した。

ＬＣ／ＭＳ分析
入手した試料はナノフローＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムで分析し、これにはＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をオンラインＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ Ｒａｐｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ）及びＨＴＣ ＰＡＬ試料インジェクター（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）と結合し、それにマイクロキャピラリーカラム（３６０ｎｍ外径（ＯＤ）×１００μｍ ＩＤ）を装着したものを使用し、カラムは２０ｃｍ未満のＲｅｐｒｏＳｉｌ Ｃ１８－ＡＱ ３μｍビーズ（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ）を充填したもので、集積エレクトロスプレーエミッターチップ（Ｐ－２０００レーザーベースのプラー、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えていた。各試料をキャピラリーカラムに４μｌフルループモード注入によってロードした。ＬＣ分離については、４％ＡＣＮ及び０．５％酢酸（Ｗａｋｏ）の移動相Ａ並びに８０％アセトニトリル及び０．５％酢酸の移動相Ｂを使用して、６０分で１～４０％のＢ、１０分で４０～７０％のＢ、及び５分で７０～９９％のＢ、次に９９％のＢで１０分間保持する５００ｎｌ／分の多重直線グラジエント溶離を行った。各試料の総分析時間は１２０分であった。

各試料はデータ依存解析（ＤＤＡ）モードを用いて分析し、ここでは、フルスキャンＭＳイオン標的を３×１０^６個のイオンとし、ＭＳ／ＭＳイオン標的を２×１０^５個のイオンとして、ｍ／ｚ３００～３０００（分解能６００００）の各フルスキャンＭＳのうち存在量の多い上位１５個のイオンに高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）ＭＳ／ＭＳスキャン（分解能３００００）を使用した。ＭＳ／ＭＳスキャンの最大イオン注入時間は１００ｍｓであった。ＨＣＤ正規化後衝突エネルギーは２７に設定し、ダイナミックエクスクルージョン時間は２０秒に設定し、ペプチドマッチ及びアイソトープエクスクルージョン機能は有効にした。

データ解析
ＤＤＡ質量スペクトルは全て、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ バージョン２．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でヒトＡｐｏＥ４ ＦＡＳＴＡファイルを使用して分析した。データセットのＭＳ／ＭＳ検索には、ＳＥＱＵＥＳＴ－ＨＴアルゴリズムを以下のパラメータで：メチオニンの酸化を可変修飾とし、システインのカルバミドメチル化を固定修飾とし、及びトリプシンを消化酵素として使用した。ペプチド１個当たり２つの切断の見逃しは許容した。プリカーサイオンのマストレランスは１０ｐｐｍに設定し、プロダクトイオンのマストレランスは２０ｍＤａに設定した。ペプチドの同定には１％の最大偽発見率（ＦＤＲ）を適用した。タンパク質の同定には、タンパク質１個当たり２個より多いペプチドが必要であった。次に、ＡｐｏＥ４のみに焦点を置く詳細な分析を行い、１２ｋＤａバンドの切断部位が同定された（ＡｐｏＥ４断片）。

結果
この１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片をトリプシン消化に供して、ＡｐｏＥの切断部位をペプチドベースで調べた。参照としてｒｈＡｐｏＥ４及び１５ｋＤａバンドを分析した。結果（図８）が示すところによれば、１２ｋＤａバンドからのトリプシンペプチドには、ＡｐｏＥのアミノ酸残基１９２～２０６に対応するペプチドとアミノ酸残基２０７～２１３に対応するペプチドとの間に「存在量の崖（ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃｌｉｆｆ）」があった。「２０７～２１３ペプチド」は高いＭＳ強度で明確に検出されたため、これはつまり、アミノ酸残基１９０～アミノ酸残基２０６の領域に少なくとも１つの切断部位があることを意味する。短鎖ペプチド（５残基未満のアミノ酸）は分析から除外しており、そのため、例えば１９０～１９１位のＶＲジペプチドは観察されなかった。

実施例４
１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片におけるＬｙｓＣ切断部位の同定
材料及び方法
試料調製、ＬＣ／ＭＳ分析及びデータ解析は、上記に実施例３について記載するとおり実施した。

結果
１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片の切断部位をアミノ酸ベースで絞り込むため、別の酵素、リシルエンドペプチダーゼ（ＬｙｓＣ）による消化を行った。１２ｋＤａバンドの標準的なＬｙｓＣプロテオーム解析（リジンＣ末端での切断は固定）の結果、検出された唯一のペプチドは、ＡｐｏＥのアミノ酸残基２３４～２９９に対応するペプチドであった（図９）。このことから、１９０～２０６位の間に少なくとも１つの切断部位があるという旨の実施例３の結果が確認される。特に、ｒｈＡｐｏＥ４の切断時にＡｐｏＥのアミノ酸残基１５８～２３３に対応するペプチドが検出されたが（図示せず）、１２ｋＤａバンドを切断したときは検出されなかったことから、１９０～２０６位の間に少なくとも１つの切断部位が存在することが更に裏付けられる。

実施例５
１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片におけるＬｙｓＣ切断部位の更なる特徴付け
材料及び方法
試料調製及びＬＣ／ＭＳ分析は、上記に実施例４について記載するとおり実施した。データ解析は、上記に実施例４について記載するとおり実施したが、但し、予想外の領域で切断された特定のペプチドについては、抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）からのターゲット分析（ピーク及び積分を記述する）を実施した。このピーク適格性評価分析は、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ４．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＱｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒによって行った。

結果
同定された１２ｋＤａ断片を生じさせる予想切断部位の詳細な分析の前に、ｒｈＡｐｏＥ４バンド、免疫沈降からの３４ｋＤａバンド、及び免疫沈降からの１２ｋＤａバンドのいずれかに、ＬｙｓＣ消化によって得られたＡｐｏＥのアミノ酸残基１５８～２３３に対応するペプチド（ＲＬＡＶＹＱＡＧＡＲ ＥＧＡＥＲＧＬＳＡＩＲ ＥＲＬＧＰＬＶＥＱＧ ＲＶＲＡＡＴＶＧＳＬ ＡＧＱＰＬＱＥＲＡＱ ＡＷＧＥＲＬＲＡＲＭ ＥＥＭＧＳＲＴＲＤＲ ＬＤＥＶＫ）が検出されるかどうかを調べた。これは、理論上のｍ／ｚ（ｚ＝１０～１５、５ｐｐｍマストレランス）で各ＸＩＣを記述することにより行った。これらの結果は、ｒｈＡｐｏＥ４及び３４ｋＤａバンドからの溶液に１５８～２３３ペプチドが明確に検出されることを示したが、これはつまり、試料調製ステップにアーチファクトの切断がないことを意味している。他方で、１２ｋＤａバンドからの試料溶液には、１５８～２３３ペプチドは観察されなかった。このことから、１２ｋＤａ ＡｐｏＥ４断片には１５８～２３３の間に少なくとも１つの切断部位があることが指摘された。要約すれば、実施例３に記載されるトリプシン法のＬＣ／ＭＳ結果から、１９０～２０５位の間の予備的な切断部位が解明され、次に、実施例４及び上記に記載されるとおり、その部位がＬｙｓＣ法によって確認された。１９０～２０５の間の可能性のある切断部位をアミノ酸ベースで絞り込むため、１２ｋＤａバンドのＬｙｓＣ消化によって提供されるあらゆる理論上の「非従来型」ペプチド（即ち、１９０～２３３、１９１～２３３、１９２～２３３、１９３～２３３、１９４～２３３、１９５～２３３、１９６～２３３、１９７～２３３、１９８～２３３、１９９～２３３、２００～２３３、２０１～２３３、２０２～２３３、２０３～２３３、２０４～２３３、２０５～２３３、及び２０６～２３３）について、各ＸＩＣを記述してフラグメントピークが検出されるか否かを確かめることにより調べた。図１０は、ＡｐｏＥのアミノ酸残基２００～２３３に対応する「非従来型ＬｙｓＣペプチド」を探したときの、これらの結果の一例を示す（ＧＱＰＬＱＥＲＡＱＡ ＷＧＥＲＬＲＡＲＭＥ ＥＭＧＳＲＴＲＤＲＬ ＤＥＶＫ；［Ｍ］＝４０５４．０４４９０）。２００～２３３ペプチドの理論上のモノアイソトピックｍ／ｚ値（電荷６、７及び８）は、それぞれ、６７６．６８１４３、５８０．１５６５５及び５０７．７６２８９である。各ｍ／ｚ値についての抽出クロマトグラムは、同じ保持時間でシングルピークを提供し、観察される質量は、いずれの場合も２ｐｐｍ未満の質量精度で理論値と合致する。これらの結果は、非従来型ＬｙｓＣペプチドが同定されたことを強力に補強するもので、１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片を生じる具体的な切断部位の肯定的な同定につながった（図１１Ａ）。別の試料（ＡｐｏＥ ｅ３／ｅ４アレル）でデュプリケート実験を行ったところ、再現性のある結果が示され（図１１Ｂ）、切断部位の決定が確認された。

結論として、個別の３ドナー（ＡｐｏＥ ε３／ε４）からの脳試料のナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析により、１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片を生じる主要な切断部位が１９８Ｌ、１９９Ａ及び２００ＧのＮ末端にあることが実証された（図１１）。

実施例６
ε４／ε４、ε２／ε３及びε３／ε３アレルを有するヒト脳の１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片における切断部位の同定
材料及び方法
試料調製、ＬＣ／ＭＳ分析及びデータ解析は、上記に実施例３～５について記載するとおり実施した。

結果
Ｎ末端１９８Ｌ、１９９Ａ及び２００Ｇが、ＡｐｏＥ ε３／ε４からの１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片を生じる主要な切断部位と同定された。これらの切断部位が、ε２又はε３ではなく、ε４アレルのみに特異的かどうかを明らかにするため、前節と同じ方法を用いてＡｐｏＥ ε４／ε４、ε２／ε３及びε３／ε３保因者の脳からの１２ｋＤａバンドを分析した。

結果は図１２に提供し、これにより、ε４／ε４保因者が予想どおりの切断を１９８Ｌ、１９９Ａ及び２００Ｇ（主に１９９Ａ及び２００Ｇ）のＮ末端に呈した一方、ε２／ε３及びε３／ε３保因者は、この部位の切断についてε４／ε４保因者と比べて著しく低いシグナルを示したことが明らかになった。これらの結果から、ε３／ε４及びε４／ｅ４アレル保因者では１９８Ｌ、１９９Ａ及び２００ＧのＮ末端での切断が一層多いことが指摘された。

実施例７
同定されたＡｐｏＥ断片の神経細胞毒性
材料及び方法
細胞培養：２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）にＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（ＡＴＣＣ）を５．０×１０^４細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤ－ＭＥＭ高グルコース（ＷＡＫＯ）で培養した。播種の翌日、リポフェクタミンＬＴＸ及びＰｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ヒトＡｐｏＥ４（完全長）又は同定されたＡｐｏＥ断片（１９８～２９９、１９９～２９９、２００～２９９）をコードするｐＡＡＶ－ＣＭＶベクターのトランスフェクションを行った。２日後、ベクターをトランスフェクトした細胞をウエスタンブロット分析用に回収し、又はミトコンドリア呼吸測定の４時間前にＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６細胞培養マイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に２．０×１０^４細胞／ウェルで再び播種した。

ラット海馬ニューロンを使用したアッセイのため、妊娠時期が調整されたウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの胎生期（Ｅ）１８で入手した胎仔の解剖した海馬をトリプシン処理及び機械的解離を用いて消化した。解離したニューロンをミトコンドリア呼吸測定用にＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６細胞培養マイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１．５×１０^４細胞／ウェルで播種し、又はウエスタンブロット分析用に２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に１．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。７インビトロ日数（ＤＩＶ）で、完全長ヒトＡｐｏＥ４又は同定されたＡｐｏＥ断片（１９８～２９９、１９９～２９９、２００～２９９）のＡＡＶ６感染を実施した。感染７日後（１４ＤＩＶ）に、ミトコンドリア呼吸測定又はウエスタンブロット分析用の試料回収を実施した。

ウエスタンブロット分析：完全（ＥＤＴＡ不含）プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ）及びＰｈｏｓＳＴＯＰタンパク質ホスファターゼ阻害薬（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ＮＰ４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）によって細胞を溶解させて、超音波処理した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ前に、還元試薬含有試料緩衝溶液（６倍）（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を加えた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥには、ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰゲル（ＤＲＣ）１５％を使用した。転写には、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（Ｔｕｒｂｏ）（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用した。イムノブロッティングには、ｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を以下の抗体と共に使用した：抗ＡｐｏＥ ＰＡ５－２７０８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；１７８４７９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。

ミトコンドリア呼吸測定：細胞外フラックスアナライザーＸＦｅ９６（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して酸素消費速度（ＯＣＲ）のリアルタイム測定を実施した。測定前に、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ Ｄ－グルコース（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）を含有する３７℃の予め温めたＸＦ基本培地（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に培養培地を交換した。測定培地のｐＨは７．４に調整した。アッセイ前に、培養プレートを３７℃で６０分間インキュベートした。ミトコンドリア機能の分析には、ＸＦ細胞ミトストレス試験キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。基礎ＯＣＲの測定後、各細胞にミトコンドリア複合体阻害薬を順次注入した。阻害薬は以下の濃度で使用した：オリゴマイシン１μＭ；カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ） Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞には０．２５μＭ、ラット海馬ニューロンには２μＭ；ロテノン／アンチマイシンＡ ０．５μＭ。ＸＦｅ９６ソフトウェアによってＯＣＲ値が自動的に計算され、記録され、プロットされた。予備呼吸能は（ＦＣＣＰ呼吸－基礎呼吸）として測定した。

結果
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞及びラット初代海馬ニューロンの両方で、同定されたＡｐｏＥ断片（１９８～２９９、１９９～２９９、２００～２９９）のいずれか１つを発現する群は予備呼吸能の減少を示したことから（図１３Ａ及び図１３Ｂ）、これらの断片がミトコンドリア損傷を負わせることが示唆される。加えて、これらの断片は、ＡｐｏＥ４完全長と比べてはるかに低い発現レベルでミトコンドリア機能不全を引き起こした（図１３Ａ～図１３Ｃ）。これらの結果は、ヒト脳から同定されたＡｐｏＥのＣ末端断片が神経毒性を持つことを示している。

実施例８
神経毒性のある１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片の産生を調節する化合物を入手するためのスクリーニング方法
材料及び方法
細胞培養：妊娠時期が調整されたウィスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの胎生期（Ｅ）１８で入手した胎仔の解剖した海馬をトリプシン処理及び機械的解離を用いて消化した。解離したニューロンを２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に１．０×１０^５細胞／ウェルで播種した。７インビトロ日数（ＤＩＶ）で、完全長ヒトＡｐｏＥ４のＡＡＶ－ＤＪ感染を実施した。感染４日後（１１ＤＩＶ）に、４－｛４－［２－（３－メチル－４－オキソ－３，４－ジヒドロ－フタラジン－１－イル）－アセチルアミド］－ベンジル｝－ピペラジン－１－カルボン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル（以下、ＰＨ－００２とも称する）（Ｍｅｒｃｋ）を処理した。感染７日後（１４ＤＩＶ）に、ウエスタンブロット及び細胞毒性分析用の試料回収を実施した。

ウエスタンブロット分析：完全（ＥＤＴＡ不含）プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ）及びＰｈｏｓＳＴＯＰタンパク質ホスファターゼ阻害薬（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ＮＰ４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）によって細胞を溶解させて、超音波処理した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ前に、還元試薬含有試料緩衝溶液（６倍）（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を加えた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥには、ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰゲル（ＤＲＣ）１５％を使用した。転写には、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ（Ｔｕｒｂｏ）（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用した。イムノブロッティングには、ｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗ＡｐｏＥ ＰＡ５－２７０８８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に使用した。検出には、Ｆｕｓｉｏｎ ＦＸ７（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）を使用した。

細胞毒性分析：処理した化合物の細胞毒性をＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって評価した。端的には、５０ｕＬの馴化培地と５０ｕＬの調製したＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイ試薬とを９６ウェル白色壁プレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ）中に混合した。室温で１５分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって発光を測定した。

結果
このアッセイでは、細胞毒性を示さないＰＨ－００２による神経毒性１２ｋＤａ ＡｐｏＥ断片の量の減少が濃度依存的に観察されたことから（図１４Ａ及び図１４Ｂ）、この減少がＰＨ－００２の細胞毒性に起因するものではなく、この方法がＡｐｏＥ断片化阻害薬の同定に有効であることが指摘される。

Claims (19)

1. 配列番号２及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、アポリポタンパク質Ｅの断片。
2. 配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の断片。
3. 配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の断片。
4. 神経毒性を呈する、請求項１～３のいずれか一項に記載の断片。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の断片をコードする単離核酸。
6. 請求項５に記載の単離核酸を含むベクター。
7. 請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
8. 請求項６に記載のベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物。
9. 配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ断片を含むワクチン。
10. それを必要としている対象の神経学的疾患を予防又は治療する方法であって、請求項９に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む方法。
11. 配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ断片の神経細胞毒性を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法であって、
    前記断片の存在下で神経細胞又は非ヒト動物を候補薬理作用物質と接触させること、及び神経細胞毒性又は神経細胞死を検出することを含む方法。
12. 配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ断片の産生を調節する能力のある薬理作用物質をスクリーニングする方法であって、
    アポリポタンパク質Ｅを発現する神経細胞を候補薬理作用物質と接触させること、及び前記断片の量を検出することを含む方法。
13. 前記神経細胞が前記アポリポタンパク質Ｅ断片を発現する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記神経細胞が完全長アポリポタンパク質Ｅを発現する、請求項１２に記載の方法。
15. 前記アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記アポリポタンパク質Ｅ断片又は完全長タンパク質を発現する前記神経細胞が、遺伝子修飾された細胞である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
17. 対象における配列番号１～３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるアポリポタンパク質Ｅ断片の存在又は量を検出する方法であって、
    前記対象から入手された試料を、前記断片に結合するアプタマーと接触させること、及び前記試料中の前記断片の存在又は量を検出することを含む方法。
18. 前記試料が、アルツハイマー病（ＡＤ）又は軽度認知障害（ＭＣＩ）を有する又は有する疑いがある対象から入手される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記アポリポタンパク質Ｅ断片の前記存在又は量を用いてＡＤ又はＭＣＩが検出され、診断され、又はその診断が支援される、請求項１７又は１８に記載の方法。
    
    

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