JP2022537555A

JP2022537555A - ウイルスベースの遺伝子療法による治療方法

Info

Publication number: JP2022537555A
Application number: JP2021575397A
Authority: JP
Inventors: イヴァンビリク; バージットライペルト
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-08-26
Also published as: CN114375205A; US20200405883A1; EP3986481A2; WO2020257586A2; WO2020257586A3

Abstract

持続性の導入遺伝子発現を促進するウイルスベースの遺伝子療法による、患者を治療するための方法を提供する。方法は、インターロイキン－６（ＩＬ６）シグナル伝達経路またはＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴヒストン脱アセチル化経路の阻害剤、及び、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを患者に投与することを含む。ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連したＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連したＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む、患者にウイルスベースの遺伝子療法を割り当てるための方法もまた提供する。ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが患者に割り当てられる。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月２０日に出願された、米国仮特許出願第６２／８６４，４０４号、及び、２０１９年６月２６日に出願された同第６２／８６７，１７２号の優先権を主張し、その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。

資金提供の声明
本発明は、国立衛生研究所により認可された補助金番号ＮＩＨＮＨＬＢＩＲＣ３ＨＬ１０３３９６－０１の元で、部分的に政府の援助により行われた。連邦政府は本発明において、一定の権利を有し得る。

背景
いくつかの臨床研究は、血友病Ｂを患う患者などの、遺伝子療法を必要とする患者への導入遺伝子の送達を成功させるための、非病原性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する、ＤＮＡウイルスベクターの使用を示した。ＡＡＶベクター構築物は、ウイルス遺伝子を、プロモーターと、対象の導入遺伝子と、ポリＡ尾部とからなる治療用カセットで置き換えることにより作製される。機能的導入遺伝子の発現は患者で実現しているものの、導入遺伝子由来のタンパク質または酵素の効果的な血漿濃度を維持することは、ＡＡＶベクターに向けられた免疫応答（ＩＲ）により限定されるという仮説が立てられており、形質導入が成功した肝細胞がもたらされない。ＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３７１：１９９４－２００４（２０１４）（非特許文献１）及びＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３６５：２３５７－６５（２０１１）（非特許文献２）を参照されたい。

場合によっては、ＡＡＶベクター注入の６～１０週後に何名かの患者で観察された、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度の無症候性増加は、コルチコステロイドにより上手く治療され、導入遺伝子由来のタンパク質または酵素の、血液中での活性濃度の維持を可能にした。ＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，２８：１００４－１２（２０１７）（非特許文献３），上述のＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，（２０１４）、及び上述のＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，（２０１１）を参照されたい。高トランスアミナーゼ血症、導入遺伝子の発現の不安定さは、ＡＡＶキャプシドを認識する循環細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の、ベクター用量に依存する産生と関連することが発見され、適応性ＣＴＬＩＲが、形質導入した肝細胞のクリアランス、及び導入遺伝子発現の喪失を担い得るという結論を導いた。上述のＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，（２０１７）、上述のＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，（２０１４）、及び上述のＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，（２０１１）。

遺伝子療法による治療の影響を受けやすい状態の１つは、血友病Ｂである。血友病Ｂは、Ｘ染色体のＦ９遺伝子における変異によりもたらされる、血液凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）の活性欠損により引き起こされる出血性疾患である。患者で見られる出血の傾向は、循環ＦＩＸ濃度に関連した可変性の重症度を有する：通常の活性の１％未満（重度の疾患）は、一般的には関節及び筋肉への、自然な出血と関連する一方で、５％より大きく４０％以下の活性（中程度）は、自然出血、及び、関節機能の良好な保護が希少となることと関連する。凝固因子濃度の、１５～２０％までの比較的穏やかな増加は、これらの患者における関節出血、及び、関連する衰弱効果を防ぐのに十分であると考えられている。

血友病Ｂの現在の標準的な治療法は、予防としての、または、出血の発症を治療するための、交換ＦＩＸ凝固因子濃縮物の静脈内注射を伴う。これには、頻繁な予防注入（最大３回／週）のコスト及び不便さ、濃度凝固因子のピーク及びトラフ周辺で身体活動を計画する必要性、ならびに、ブレークスルー出血の可能性を含む、いくつかの不利益がある。代償療法による管理にもかかわらず、血友病Ｂは、苦しむヒトの日常生活に相当の負の影響をもたらし続ける。

遺伝子療法は、機能しているヒトＦＩＸ遺伝子を肝細胞に送達することにより、これらの患者における効果的な循環ＦＩＸ濃度を維持するための、治癒的な潜在的アプローチとして研究され続けている。同様に、持続性の遺伝子発現をもたらすウイルスベースの遺伝子療法による患者の治療方法も研究されている。

ＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３７１：１９９４－２００４（２０１４）ＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，３６５：２３５７－６５（２０１１）ＮａｔｈｗａｎｉＡＣｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，２８：１００４－１２（２０１７）

概要
したがって、従来の遺伝子療法を改善する方法が、当該技術分野において求められている。具体的には、アデノウイルスなどの非統合性ウイルスベクターにおける、一過性の導入遺伝子発現の長さを改善する方法が求められている。本開示は、例えば、ＡＡＶウイルスベースの遺伝子療法の際に、例えば、ＩＬ６シグナル伝達経路、及び／またはＮＣｏＲ２／ＳＭＲＴ脱アセチル化経路の付随抑制により、持続した導入遺伝子発現を促進する方法を提供することにより、当該技術分野のこれらの、及び他の問題を解決する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ウイルスベースの遺伝子療法による患者の治療方法であって、インターロイキン－６（ＩＬ６）経路阻害剤、及びウイルスベースの遺伝子療法ベクターを当該患者に投与することを含む、上記方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＩＬ６経路阻害剤は、ＩＬ６の阻害剤、または、インターロイキン－６受容体（ＩＬ６Ｒ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＩＬ６経路阻害剤は、抗ＩＬ６、または抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体である。

本開示は、遺伝子療法、例えばアデノウイルスベースの遺伝子療法により好ましく応答する可能性のある患者を識別する方法もまた提供する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、持続性のウイルスベースの遺伝子療法に対して患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＩＬ６シグナル伝達経路及び／またはＮＣｏＲ２／ＳＭＲＴ脱アセチル化経路を抑制する変異を対象が有するか否かを評価する。

いくつかの実施形態では、かかる方法は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することと、当該患者が上記遺伝子型を有するという判定に応じて、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを当該患者に投与することと、を含む。

いくつかの実施形態では、上記遺伝子型を患者が有するか否かを判定することは、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を当該患者が有するか否か、及び、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を当該患者が有するか否か、の一方または両方を評価することを含む。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型は、ＩＬ－６Ｒハプロ欠損を引き起こす患者のＩＬ－６Ｒ遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける変異を含む。いくつかの実施形態では、患者のＩＬ－６Ｒ遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける変異は、ＩＬ－６Ｒ遺伝子におけるミスセンス変異である。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型は、野生型のＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能と比較して、コードされたＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質のタンパク質機能を少なくとも７５％低下させる、患者のＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子の両方のコピーにおける変異を含む。

いくつかの実施形態では、患者は、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療を必要とする対象である。

別の態様では、本開示は、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療方法を提供する。方法は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することと、当該患者が上記遺伝子型を有するという判定に応じて、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを当該患者に投与することと、を含む。

いくつかの実施形態では、患者が上記遺伝子型を有しないという判定の際に、方法は、酵素活性を有する治療用タンパク質を患者に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドを含み、治療用タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも１０ＣＧのジヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、患者は血友病Ａを有し、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインが欠失された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、コードされた第ＩＸ因子ポリペプチドは、野生型第ＩＸ因子配列と比較して、Ｒ３３８Ｌアミノ酸変化を有する。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、配列番号Ｘ［ＣＳ０４］の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、配列番号Ｘ［ＣＳ０４＋ＮＧ５＋Ｘ５］の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする第ＩＸ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＩＸ因子子ポリヌクレオチドは、配列番号Ｘ［ＣＳ０６］の核酸配列を含む。

本発明の他の目的、利点、及び実施形態が、以下の詳細の説明から明らかとなろう。

実施例１に記載する研究の基準となる患者特性を示す。実施例１に記載するように、全エクソームシーケンシングによる、患者５におけるＦＩＸ導入遺伝子発現に潜在的に影響を及ぼすバリアントの識別を示す。例示的な第ＩＸ因子遺伝子療法構築物を示す。ＦＩＸ遺伝子療法構築物は、切頭された３２０個の塩基対（ｂｐ）マウストランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター／エンハンサー、続いて、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）に由来する７７ｂｐのイントロンフラグメント、コドン最適化されたＦＩＸＰａｄｕａ（Ｒ３３８Ｌ）ｃＤＮＡ導入遺伝子、及び、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列からなる、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを含有する。この発現カセットには、１つの野生型１４５ｎｔＡＡＶ２反転末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに、ＡＡＶＤＮＡ分解部位及びＤ配列に改変欠失を含む、別のＩＴＲ（修飾反転末端反復［ΔＩＴＲ］）が隣接し、従来の一本鎖ＡＡＶＤＮＡ配列ではなく、自己相補の優先的複製及びパッケージングを指令する。Ａ～Ｎはまとめて、実施例１に示すように、各用量コホートでの患者に関する、ＦＩＸ活性、肝酵素、及びＡＡＶ８ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴデータを示す。患者及び用量コホートによる、ＦＩＸ遺伝子療法構築物注入後の第ＩＸ因子活性を、出血の発症、ＦＩＸ代償療法の投与及びプレドニゾロンの投与（患者６、７、及び８）、加えて、肝毒性の肝酵素ＡＬＴ及びＡＳＴマーカーに対してプロットした。患者６及び７は、ＦＩＸ発現の急速な喪失に対して、救助治療としてプレドニゾロンを受けた。患者８は、プレドニゾロンによる予防的治療を受けた。プレドニゾン治療の期間を青の棒グラフで示し、傾斜は用量の漸減を示す。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を、各患者に対して下のグラフパネルに示す。患者のＰＢＭＣの、ＡＡＶ８キャプシドペプチドへの反応を、対照（赤線）と比較して、１００万個のＰＢＭＣ当たりでの、スポット形成単位の数としてプロットする。患者８は、中間用量のＦＩＸ遺伝子療法構築物、及び、付随する予防用コルチコステロイドのレジメンで治療した。２～３％のＦＩＸ活性レベルが、肝臓アミノ基転移酵素の増加またはＴ細胞の活性化の非存在下における、最初の６ヶ月の研究で得られた。このことは、コホート２における他の患者と一致する。患者では、治療を必要とする７ヶ月の間に扁桃の扁平上皮細胞癌が進行し、規則的な予防用ＦＩＸ注入に戻った。ＡＡＶ８・アデノ随伴ウイルス血清型８；ＡＬＴ・アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＡＳＴ・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＦＩＸ・第ＩＸ因子；ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ・インターフェロン－γ酵素結合免疫吸着スポット；ＰＢＭＣ・末梢血単核球細胞。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。図４Ａの説明を参照のこと。実施例１に示す研究における、患者及び用量コホートによる、ピークＦＩＸ：Ｃを示す。ピークＦＩＸ：Ｃ活性は、３つの用量増加コホートのうちの１つにおいて、ＦＩＸ遺伝子療法構築物の単回注入を受けた後で、各患者で測定した。実施例１に示すように、ＦＩＸ遺伝子療法構築物とＣｐＧ枯渇ベクター構築物で治療したマウスにおける、抗ＡＡＶ８ＮＡｂ応答を示す。ＴＬＲ９を介する免疫活性化のためのサロゲートマーカーとしての抗ＡＡＶ８ＮＡｂ応答は、ＣｐＧ枯渇ベクターによる低い免疫原性を示す。Ｃ５６Ｂｌ／６マウス（８～１０週齢、群当たりｎ＝６～８）を、それぞれが、異なる数のＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧＯＤＮ）：ＦＩＸ遺伝子療法構築物（ＦＩＸＰａｕｄａコード配列中に９９個のＣｐＧＯＤＮ）を含有する、ＦＩＸＰａｕｄａコード配列を有する、同一用量（４×１０１２ｖｇ／ｋｇ）のｓｃＡＡＶ８ベクターで静脈内治療した。血液を４週間後に収集し、抗ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）の得られた力価の規模を、ＣｐＧＯＤＮに対する適応免疫応答のマーカーとしてアッセイした。実施例１に示す研究における、ＦＩＸ遺伝子療法構築物注入の前及び後における、１２ヶ月の期間の、患者によるＦＩＸ消費を示す。実施例１に示す研究における、ＦＩＸ遺伝子療法構築物注入の直前及び直後の期間での、患者６の実験室試験結果を示す。実施例１に示す研究における、患者５における全エクソームシーケンシングバリアント分析を示す。潜在的に影響を及ぼすヘテロ接合及び化合物ヘテロ接合バリアントを、患者５において独自に同定した。いくつかの実施形態に従った第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（完全長コード配列に対する「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。いくつかの実施形態に従った第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（完全長コード配列に対する「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ２変異（Ｉ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ２コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０１－ＦＬ－ＮＡ－ｍ２」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ２変異（Ｉ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ２コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０１－ＦＬ－ＮＡ－ｍ２」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ３アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ３コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ－ｍ３」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ３アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ３コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ－ｍ３」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ２変異セット（Ｉ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））及びｍ３アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ２３コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ－ｍ２３」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ２変異セット（Ｉ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））及びｍ３アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ２３コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ－ｍ２３」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ１（Ｆ３２８Ｓ）アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ１コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ－ｍ１」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ１（Ｆ３２８Ｓ）アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ１コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ－ｍ１」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ１及びｍ３アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ１３コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ－ｍ１３」）を示す。いくつかの実施形態に従った、ｍ１及びｍ３アミノ酸置換を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする、ＣＳ０４ｍ１３コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（「ＣＳ０４－ＦＬ－ＮＡ－ｍ１３」）を示す。いくつかの実施態様に従った、Ｒ３８４Ｌアミノ酸置換を有する第ＩＸ因子バリアントをコードする、ＣＳ０６コドン改変ヌクレオチド配列（配列番号ＸＸ）（ＣＳ０６－ＦＬ－ＮＡ）を示す。ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌベクターが、より高い形質導入効果、及びより高いＦＩＸ発現を示すことを示す。左パネル：細胞当たりの、遺伝子療法構築物のベクターコピーの数。右パネル：ＡＡＶ８－ＦＩＸＲ３３８Ｌ［６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ］またはＡＡＶ８－ＦＩＸＲ３３８ＬＣｐＧ－ｌｅｓｓ［６ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ］で処理した、バイオリアクター培養液内のＦＩＸＲ３３８Ｌコピーの数／μｇＲＮＡ。細胞当たりのベクターコピーを、１μｇのＤＮＡが１５０，０００個の細胞に等しいことに基づき、計算した。２つの例示的ドナー：対照バイオリアクター（黒色の円）、及び、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇ（赤色の正方形）またはＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌ（青色の三角形）で処理したバイオリアクターの選択したサイトカインの、正規化した時間過程を示す。サイトカイン発現は全体的に弱かったが、ＩＰ－１０及びＭｉｐ－１ａ濃度の上昇が、２～３日目に、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇにより誘発された。細胞シーディング後の、ＡＳＴ及びＡＬＴの時間過程：感染なしの対照（円）、及び、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇ（正方形）またはＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌ（三角形）で感染した対照を示す。ウイルス粒子を、２４時間適用した（０日目～１日目）。ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇベクターが、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌベクターよりも高い、抗ＡＡＶ８ＢＡＢ（左パネル）及びＮＡＢ（右パネル）応答を誘発したことを示す。このことは、ＣｐＧによるＴＬＲ９経路のより強力な活性化を示唆する。

発明の詳細な説明
ウイルスベクターを用いるインビボでの導入遺伝子送達により、標的臓器、例えば肝臓内での、強力な応答が誘発される。ＩＬ－６シグナル伝達は、ウイルス性病原体に対する、不可欠なストレス応答経路であるが、これは、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介遺伝子療法などの、ウイルスベースの遺伝子療法スキームの有効性を低下させ得る。本開示は、ＡＡＶ８－ＦＩＸ遺伝子療法で治療した、８名の血友病Ｂ患者における臨床研究からの、遺伝的所見に基づく。８名の患者のコホートにて、１名の患者のみが、５年を超える持続性の導入遺伝子発現を示した。他の全ての患者において、発現は、８～１２週以内の治療閾値を下回った。持続性の導入遺伝子発現を有する１名の患者において、ＩＬ－６受容体α遺伝子内での、ヘテロ接合ミスセンスバリアントが同定された。したがって、この変異は、患者の肝臓内で、ＩＬ－６が媒介するストレス応答を弱めたという仮説が立てられる。したがって、他の態様の中でも、本開示は、遺伝子療法の改善された方法を提供し、本方法は、ウイルスベクターベースの遺伝子療法を受ける対象における、ＩＬ６が媒介するストレス応答の付随的な抑制を含む。

有利には、本明細書に記載する改善された方法は、ウイルスベクターベースの遺伝子療法を改善するための、安全かつより効果的な手段を提供する。ウイルスベクターベースの遺伝子療法を受ける患者で免疫応答を弱めるための以前の試みは、プレドニゾンなどの、非選択性コルチコステロイドの、オンデマンド式、または予防的のいずれかでの使用で構成された。コルチコステロイドは一般に、肝臓での毒性を含む、潜在的な炎症反応に対応するクリニックで用いられる。しかし、高用量コルチコステロイドの使用は、インビボでのＡＡＶ媒介遺伝子導入の際に、深刻な副作用、及び、導入遺伝子発現を救助する単に散在性の有効性と関連する。対照的に、抗ｌＬ－６／抗ｌＬ－６Ｒ治療法は、特に、制限のある時間で用いられるときに、クリニックにおいて安全であることが証明されている。したがって、抗ＩＬ－６／抗ＩＬ－６Ｒ治療法を用いることにより、より具体的で焦点が当てられ、かつ安全な、炎症の抑制が提供され、ウイルスベクターベースの遺伝子療法、例えば、ＡＡＶ媒介遺伝子療法の際に、治療用導入遺伝子の発現の持続を促進する。

しかし、場合によっては、コルチコステロイドの有益な抗炎症性に因り、遺伝子療法中のコルチコステロイド同時治療が依然として望ましい。抗ＩＬ６モノクローナル抗体であるトシリズマブを投与することにより、コルチコステロイドの節約、例えば、コルチコステロイド治療の有効性を低下させることなく、コルチコステロイドの用量を低下させる能力を促進することが見いだされた。ＦｏｒｔｕｎｅｔＣ．ｅｔａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，５４（４）：６７２－７７（２０１５）、その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。有利には、本明細書に記載するように、遺伝子療法の間に、抗ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ経路阻害剤と、低用量のコルチコステロイドとを同時投与することで、肝臓損傷、体液貯留、骨損傷、血糖値の上昇、ならびに、気分、記憶、及び躁病に関する問題などの悪影響が低下した、コルチコステロイド治療の有益な抗炎症効果がもたらされる。

定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別に指示しない限り複数の言及を含む。したがって、例えば、「１つの抗体」への言及は、複数のかかる抗体を含み、「宿主細胞」への言及は、当業者などに既知の１つ以上の宿主細胞、及びその等価物への言及を含む。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して「単に」、「のみ」等の排他的な専門用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として役立つことが意図される。

本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。

本明細書で使用する場合、「ｒＦＩＸ」は、組み換えＦＩＸを意味する。

例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターを参照して使用する場合の用語「組み換え」とは、細胞、核酸、タンパク質もしくはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、もしくは天然核酸もしくはタンパク質の変更により改変されているか、またはその細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）な形態内に見出されない遺伝子を発現するか、または別様では異常発現するか、低度に発現するか、もしくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。

本明細書で使用する場合、「組み換えＦＩＸ」は、組み換えＤＮＡ技術により得られたＦＩＸを含む。本発明でのＦＩＸは、単量体及び多量体形体を含む、可能性のある全ての形体を含むことができる。本発明は、組み合わせで使用可能なＦＩＸの異なる形体を包含することもまた理解されなければならない。例えば、本発明のＦＩＸは、異なる多量体、異なる誘導体、ならびに、生物学的に活性な誘導体及び生物学的に活性でない誘導体の両方を含むことができる。

本発明の文脈では、組み換えＦＩＸは、任意のＦＩＸファミリー形体のメンバー、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、イヌ科動物、ネコ科動物、及び、これらの生物学的に活性な誘導体などの哺乳類を含む。活性を有する変異及びバリアントＦＩＸタンパク質もまた、ＶＷＦタンパク質の機能的断片及び融合タンパク質であるため、含まれる。さらに、本発明のＦＩＸは、精製、検出、またはその両方を促進するタグをさらに含むことができる。本明細書に記載するＦＩＸはさらに、治療用部位、または、インビトロもしくはインビボでのイメージングに好適な部位で修飾することができる。

用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」とは、天然状態で発見される、通常付随する構成成分を実質的に、または本質的に含有しない物質を意味する。純度及び均質性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて測定される。ＶＷＦは、実質的に精製された調製液中に存在する、顕性種である。いくつかの実施形態では、用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルの本質的に１つのバンドにて生じることを意味する。他の実施形態では、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも５０％純粋、より好ましくは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上に純粋であることを意味する。他の実施形態では、「精製する」または「精製」とは、精製される組成物から、少なくとも１つの汚染物質を取り除くことを意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均質である、例えば、１００％純粋である必要はない。

本明細書で使用する場合、「投与すること」（及び、あらゆる文法的な等価物）は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、座薬としての投与、局所接触、腹腔内、病巣内、もしくは経鼻投与、または、徐放性デバイス、例えば、小型浸透圧ポンプを対象に実装することを含む。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、口、鼻、膣、直腸、または経皮）を含む、任意の経路による。非経口的投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、及び頭蓋内が挙げられる。他の送達様式としては、リポソーム製剤、静脈内注射、経皮貼付剤などの使用が挙げられるが、これらに限定されない。

「治療的に有効な量または用量」または「治療的に十分な量または用量」または「有効または十分な量または用量」という用語は、投与される対象に治療効果をもたらす用量を意味する。例えば、血友病の治療に有用な薬物の治療的に有効な量は、血友病に関連する１つ以上の症状を防止または緩和することができる量であり得る。正確な用量は、治療の目的に左右され、当業者であれば公知の技術を使用して確認することができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，ＴｈｅＡｒｔ，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，ＤｏｓａｇｅＣａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。

本明細書で使用する場合、用語「患者」及び「対象」は同じ意味で用いられ、疾患を有する、または、疾患にかかる可能性を有する哺乳類（好ましくはヒト）を意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。したがって、成人及び新生児個体の両方が、対象となる。

本明細書で使用する場合、用語「約」は、明記した値の±１０％のおよその範囲を意味する。例えば、「約２０％」という言葉は、１８～２２％の範囲を包含する。

本明細書で使用する場合、用語「半減期」とは、減衰（または、サンプルもしくは患者からのクリアランス）を受けて、半分に減少する物質量を考慮した期間を意味する。

「生体サンプル」とは、例えば、血液、血漿、血清、糞便物質、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚の外部分泌物、呼吸器、腸管、及び泌尿生殖器、涙、唾液、母乳、血液細胞、臓器、生検、ならびに、培地内での細胞及び組織、例えば、組み換え細胞及び細胞構成成分の増殖により得られる調整培地を含むがこれらに限定されない、インビトロ細胞培養成分のサンプルを含むがこれらに限定されない、対象から単離した組織または流体のサンプルを意味する。

「治療的に有効な用量または量」とは、本明細書に記載するように投与した場合に、所望の治療応答、例えば、出血の低下、または凝固時間の短縮をもたらす量を意味する。

従来の抗体構造単位は典型的には、四量体を含む。各四量体は典型的には、それぞれの対が、１つの「軽」（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）、及び、１つの「重」鎖（典型的には、約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）を有する、ポリペプチド鎖の２つの同一対で構成される。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として分類される。治療用抗体は通常、ＩｇＧクラスをベースにし、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４は、ＩｇＧ３よりも頻繁に用いられる。

各連鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担い、一般に、「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」と、当該技術分野及び本明細書において呼ばれる、約１００～１１０個、またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域において、重鎖及び軽鎖のＶドメインのそれぞれの３つのループが集まり、抗原結合部位を形成する。ループのそれぞれは、相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」と呼ばれる）と呼ばれ、この領域では、アミノ酸配列の変化が最も著しい。「可変性」とは、可変領域の特定のセグメントが、抗体間の配列で大きく異なるという事実を意味する。可変領域内の可変性は、均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれが、９～１５アミノ酸長またはそれ以上の、「超可変領域」と呼ばれる、極端に可変性の、さらに短い領域により分離された、１５～３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、比較的変化のない伸長部で構成される。

それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、以下の順序、すなわちＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で並んだ、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）、及び４つのＦＲで構成されている。

超可変領域は通常、軽鎖可変領域のおよそアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに、重鎖可変領域のおよそ３１～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）あたりの、アミノ酸残基；Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳＯＦＰＲＯＴＥＩＮＳＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、及び／または、超可変ループ（例えば、軽鎖可変領域の残基２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに、重鎖可変領域の残基２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５３～５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６～１０１（ＨＣＤＲ３））を形成するアミノ酸残基；ＣｈｏｔｈｉａａｎｄＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、を包含する。本発明の具体的なＣＤＲについて以下で説明する。

当業者が理解するように、ＣＤＲの厳密なナンバリング及び配置は、個別のナンバリングシステムの間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖配列及び／または可変軽鎖配列の本開示が、会合する（固有の）ＣＤＲの本開示を含むということを理解すべきである。それゆえ、それぞれの可変重鎖領域の本開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、それぞれの可変軽鎖領域の本開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。

ＣＤＲナンバリングの利用可能な比較は以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）を参照されたい。

（表１）

本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全なＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖ＣＤＲ及び３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む。これらはそれぞれ、より大きな可変軽鎖ドメインまたは可変重鎖ドメインの一部であってもよい。加えて、本明細書でより詳細に概要を示すとおり、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、重鎖及び軽鎖が使用されるとき（例えば、Ｆａｂが使用されるとき）は、別々のポリペプチド鎖上、またはｓｃＦｖ配列の場合、単一のポリペプチド鎖上にあってもよい。

ＣＤＲは、抗原結合部位、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域の特定の抗原結合部位と相互作用する決定基のことを意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集合であり、通常、特定の構造特性に加えて特定の荷電特性を有する。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有していてもよい。

各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。Ｋａｂａｔｅｔａｌ．は、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存度に応じて、彼らは、個別の一次配列をＣＤＲ及びフレームワークに分類し、その一覧を作成した（全体が参照により組み込まれている、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳＯＦＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１－３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔｅｔａｌ．を参照されたい）。

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書において、「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明の対象は、定常重鎖（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む、重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体との関係において、ＩｇＧアイソタイプはそれぞれ、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧとの関係における「ＣＨ」ドメインは、以下のとおりである：「ＣＨ１」とは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従った、位置１１８～１２０を意味する。「ＣＨ２」とは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従った、位置２３７～３４０を意味し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従った、位置３４１～４４７を意味する。本明細書に示し、以下で記載するように、ｐＩバリアントは、以下で論じるＣＨ領域、加えて、ヒンジ領域の１つまたはそれ以上に存在することができる。

重鎖の別のタイプのＩｇドメインは、ヒンジ領域である。本明細書における、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間にアミノ酸を含む、柔軟なポリペプチドを意味する。構造上、ＩｇＧＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終了し、ＩｇＧＣＨ２ドメインは、残基ＥＵ位置２３７で開始する。したがって、ＩｇＧに関して、抗体ヒンジは本明細書において、位置２２１（ＩｇＧ１のＤ２２１）～２３６（ＩｇＧ１のＧ２３６）を含むように定義され、ナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従う。例えば、Ｆｃ領域と関係するいくつかの実施形態では、低いヒンジが含まれ、「低いヒンジ」とは一般に、位置２２６または２３０を意味する。本明細書に記載するように、ｐＩバリアントは、ヒンジ領域でも同様に作製されることが可能である。

当業者により理解されるように、重鎖定常領域ドメインの厳密なナンバリング及び配置は、異なるナンバリングシステムの間で異なる場合がある。ＥＵ及びＫａｂａｔに従った、重鎖定常領域ナンバリングの有用な比較は以下のとおりであり、全体が参考により組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎｅｔａｌ．，１９６９，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ６３：７８－８５ａｎｄＫａｂａｔｅｔａｌ．，１９９１，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．，ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａを参照されたい。

（表２）

軽鎖は一般に、２つのドメイン、すなわち、可変軽鎖ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含有し、可変重鎖ドメインと共にＦｖ領域を形成する）、及び、定常軽鎖領域（多くの場合、ＣＬまたはＣＫと呼ばれる）を含む。

「特異的結合」、または特定の抗原もしくはエピトープ、例えば、ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒ「に特異的に結合する」もしくは「に特異的な」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合のことを意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を測定することにより、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合により測定することができる。

特定の抗原またはエピトープ、例えば、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対する少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤ（ＫＤとは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度のことを意味する）を有する抗体により示され得る。一般的に、抗原に特異的に結合する抗体は、対照分子と比較して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれ以上の倍数より大きな、抗原またはエピトープに対するＫＤを有する。

同様に、特定の抗原またはエピトープ、例えばＩＬ６またはＩＬ６Ｒに対する特異的結合は、例えば、対照と比較して、少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれ以上の倍数より大きな、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａ（ＫＡまたはＫａとは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度のことを意味する）を有する抗体により示され得る。結合親和性は一般に、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイを使用して測定される。

本明細書で使用する場合、用語「ヒストン脱アセチル化酵素」または「ＨＤＡＣ」とは、遺伝子発現のエピジェネティック制御において、様々な機能を有する酵素の一種を意味する。いくつかのＨＤＡＣにより示される、かかる機能の１つは、ヒストン上のε－N－アセチルリジンアミノ酸からアセチル基を取り除くことである。ＨＤＡＣ酵素は、他の標的もまた脱アセチル化する。しかし、ヒストンの脱アセチル化は、標的遺伝子発現の持続と直接関連している。ＨＤＡＣタンパク質は、機能及びＤＮＡ配列の類似性に基づき、４つのクラスにグルーピングすることができる。最初の２つのクラスは、活性がトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）により阻害される「古典的」ＨＤＡＣであると考えられ、一方で、３番目のクラスは、ＴＳＡによる影響を受けず、他の３つのクラスに系統学的に関係しない、ＮＡＤ＋依存性タンパク質のファミリーである。４番目のクラスは、他のものに対するＤＮＡ配列の類似性に基づいた、非典型的カテゴリーと考えられる。クラスＩＩをさらに、２つのサブクラスに細分する：クラスＩＩをさらに、２つのサブクラスクラス：ＩＩＡ及びクラスＩＩＢに細分し、後者は、２つの独立したＨＤＡＣドメインで構成される。

「出血性疾患」とは、先天性凝固異常、後天性凝固異常、抗凝血物質の投与、または、外傷誘発性の出血状態などの、過度の出血と関連する任意の疾患を意味する。以下で論ずるとおり、出血性疾患としては、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、特発性血小板減少症、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、プレカリクレイン、及び高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）などの、１つ以上の接触因子の欠損症、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子（低プロトロンビン血症）、及びフォン・ヴィレブランド因子などの、臨床的に深刻な出血と関連する１つ以上の因子の欠損症、ビタミンＫ欠乏症、アフィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症、及びジスフィブリノーゲン血症を含む、フィブリノーゲンの疾患、α２－抗プラスミン欠損症、ならびに、例えば肝疾患、腎疾患、血小板減少症、血小板機能障害、血腫、内出血、関節血腫、手術、外傷、低体温、月経、及び妊娠により引き起こされる、過度の出血を挙げることができるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「血友病」という用語は、凝血または血液凝固の低下を大きな特徴とする病状群を意味する。血友病は、Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型血友病、または３つすべての疾患型の複合を意味し得る。Ａ型血友病（血友病Ａ）は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性の低下または喪失によって生じ、血友病サブタイプの中で最も顕著なものである。Ｂ型血友病（血友病Ｂ）は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）凝血機能の喪失または低下に起因する。Ｃ型血友病（血友病Ｃ）は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）凝血活性の喪失または低下の結果である。血友病Ａ及びＢはＸ連鎖性疾患であり、血友病Ｃは常染色体性である。血友病の従来の治療は、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ（Ｂｅｂｕｌｉｎ（登録商標）－ＶＨを含む）、及びＦＸＩのような凝血因子の予防的及び応需的な投与、ならびにＦＥＩＢＡ－ＶＨ、デスモプレシン、及び血漿注入を含む。

「相同性」とは、２つのポリペプチド部分間でのパーセント同一性を意味する。本明細書において言及される場合、２つのポリペプチド配列は互いに、配列が約５０％以上の配列同一性、例えば６０％以上の配列同一性、例えば７５％以上の配列同一性、例えば８５％以上の配列同一性、例えば９０％以上の配列同一性、例えば、９５％以上の配列同一性を含む、９９％以上の配列同一性を示すときに、「実質的に相同」である。いくつかの実施形態では、実質的に相同なポリペプチドは、明記された配列に対して完全な同一性を有する配列を含む。

「同一性」とは、２つのポリマー配列の、サブユニット同士の厳密な対応を意味する。例えば、同一のポリペプチドは、別のポリペプチドと、アミノ酸同士の厳密な対応を有するものであるか、または、同一のポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと、ヌクレオチド同士の厳密な対応を有するものである。パーセント同一性は、配列をアラインし、２つのアラインした配列間での正確な一致数を計数し、参照配列の長さで除し、結果に１００を掛けることにより、２つの分子（参照配列と、参照配列に対して％同一性が未知である配列）間の配列情報を直接比較することにより測定することができる。例えば、ペプチド分析のためにＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２－４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムを適用する、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ｉｎＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅＭ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆｅｄ．，５Ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，ＮａｔｉｏｎａｌｂｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．などの、任意の便利なプロトコルを用いて、２つのポリマー配列間のパーセント同一性を測定することができる。

用語「バリアント」、「類縁体」、及び「ムテイン」とは、所望の活性、例えば、出血性疾患の治療における凝固活性を保持する、参照分子の生物学的に活性な誘導体を意味する。ポリペプチド（例えば、凝固因子）について言及する用語「バリアント」及び「類似体」とは、修飾が生物活性を破壊せず、以下で定義する参照分子と「実質的に相同」である限り、天然分子と比較して、１つ以上のアミノ酸の付加、置換（一般には本質的に保存的）、及び／または欠失を有する、天然ポリペプチド配列及び構造を有する化合物を意味する。かかる類似体のアミノ酸配列は、２つの配列がアラインされたときに、参照配列に対する高度の配列相同性、例えば、５０％以上、例えば６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば、９９％以上を含む９５％以上のアミノ酸配列相同性を有する。場合によっては、類似体は、同じ数のアミノ酸を含むが、置換を含む。用語「ムテイン」は、アミノ及び／またはイミノ分子のみを含有する化合物、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、合成の非自然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、結合が置換されたポリペプチド、加えて、自然、及び非自然（例えば合成）の両方、環化、分枝鎖分子などの、当該技術分野において公知の他の修飾を含むがこれらに限定されない、１つ以上のアミノ酸様分子を有するポリペプチドをさらに含む。この用語は、１つ以上のＮ置換グリシン残基（「ペプトイド」）、及び他の合成アミノ酸またはペプチドを含む分子もまた含む。（例えば、ペプトイドの記載に関しては、米国特許第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；及び同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０００）７：４６３－４７３；ａｎｄＳｉｍｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：９３６７－９３７１を参照されたい。）本発明の実施形態では、類似体及びムテインは、天然分子と、少なくとも同一の凝固活性を有する。

本明細書で論ずるように、分子量は、数平均分子量または重量平均分子量のいずれかとして表すことができる。特に明記しない限り、本明細書における、分子量へのあらゆる言及は、重量平均分子量を意味する。分子量測定、即ち、数平均及び重量平均の両方は、例えばゲル透過クロマトグラフィー、または他の液体クロマトグラフィー技術を用いて測定することができる。

本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」という用語は、同義に使用され、第ＶＩＩＩ因子活性を有する任意のタンパク質（例えば、しばしばＦＶＩＩＩａと称される活性ＦＶＩＩＩ）、または、特定の条件下で、例えば、欧州薬局方９．０の第２．７．４章に記載されている２ステップ発色第Ｘ因子活性化アッセイを使用して測定した場合に、第ＩＸａ因子補因子活性を有するタンパク質のタンパク質前駆体（例えば、プロタンパク質またはプレプロタンパク質）を意味する。例示的な実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドとは、野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖及び軽鎖と高い配列同一性（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上）を有する配列を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイズを削減するように、欠失しているか、切断されているか、またはリンカーポリペプチドで置換されている。

野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの非限定的な例としては、ヒトプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ５２４８５、ＣＡＡ２５６１９、ＡＡＡ５８４６６、ＡＡＡ５２４８４、ＡＡＡ５２４２０、ＡＡＶ８５９６４、ＢＡＦ８２６３６、ＢＡＧ３６４５２、ＣＡＩ４１６６０、ＣＡＩ４１６６６、ＣＡＩ４１６７２、ＣＡＩ４３２４１、ＣＡＯ０３４０４、ＥＡＷ７２６４５、ＡＡＨ２２５１３、ＡＡＨ６４３８０、ＡＡＨ９８３８９、ＡＡＩ１１９６８、ＡＡＩ１１９７０、またはＡＡＢ６１２６１）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びそれらの天然バリアント；ブタプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｆ１ＲＺ３６またはＫ７ＧＳＺ５）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びそれらの天然バリアント；マウスプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ３７３８５、ＣＡＭ１５５８１、ＣＡＭ２６４９２、またはＥＤＬ２９２２９）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＱ２１５８０）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びそれらの天然バリアント；ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子；ならびに他の哺乳動物の第ＶＩＩＩ因子相同体（例えば、サル、類人猿、ハムスター、モルモットなど）が挙げられる。

概して、第ＶＩＩＩ因子をコードするポリヌクレオチドは、翻訳後プロセシングを受けて活性の第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩａ）を形成する不活性の一本鎖ポリペプチド（例えば、プレプロタンパク質）をコードする。例えば、図１５を参照すると、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子プレプロタンパク質がまず切断されて、コードされるシグナルペプチド（図示せず）を放出し、第１の一本鎖プロタンパク質（「ヒト野生型ＦＶＩＩＩ」として示される）を形成する。プロタンパク質は次いで、ＢドメインとＡ３ドメインとの間で切断されて、第ＶＩＩＩ因子重鎖（例えば、Ａ１ドメイン及びＡ２ドメイン）及びＢドメインを含む第１のポリペプチド、ならびに第ＶＩＩＩ因子軽鎖を含む（例えば、Ａ３、Ｃ１、及びＣ３ドメインを含む）第２のポリペプチドを形成する。第１のポリペプチドはさらに切断されてＢドメインが除去され、また、Ａ１ドメイン及びＡ２ドメインが分離するが、これらは、成熟した第ＶＩＩＩａ因子タンパク質の第ＶＩＩＩ因子軽鎖と関連したままである。第ＶＩＩＩ因子の成熟プロセスの概説については、Ｇｒａｗｅｔａｌ．，ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ．，６（６）：４８８－５０１（２００５）を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用する場合、用語「第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド」及び「第ＦＶＩＩＩポリペプチド」とは、特定の条件下で、第ＶＩＩＩ因子セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、上記の翻訳後処理により活性化されたときに、第ＶＩＩＩ因子セリンプロテアーゼ活性を備える活性第ＶＩＩＩ因子タンパク質になる、一本鎖前駆体ポリペプチド（第ＶＩＩＩ因子プレ－プロポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子プロペプチド、及び、成熟した一本鎖第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド）、加えて、活性第ＶＩＩＩ因子タンパク質自身を含む。例示的実施形態において、ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドとは、軽鎖及び重鎖を含む野生型ヒトアミノ酸配列の部分と、高い配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。

本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＩＸ因子補因子活性を有する天然バリアント及び人工構築物を含む。本開示において使用する場合、第ＶＩＩＩ因子は、いくらかの基礎的な第ＩＸ因子補因子活性（例えば、対応する野生型活性の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれ以上）を保持する、あらゆる天然バリアント、代替的な配列、アイソフォーム、または変異体タンパク質を包含する。「第ＶＩＩＩ因子」の定義には、「バリアントＦＶＩＩＩ」と称される場合もある第ＶＩＩＩ因子バリアントが具体的に含まれる。バリアントＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト野生型ＦＶＩＩＩと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。ヒト集団に見出される第ＶＩＩＩ因子の（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号１９）に対する）アミノ酸変化の例は、限定するものではないが、Ｓ１９Ｒ、Ｒ２２Ｔ、Ｙ２４Ｃ、Ｙ２５Ｃ、Ｌ２６Ｐ／Ｒ、Ｅ３０Ｖ、Ｗ３３Ｇ、Ｙ３５Ｃ／Ｈ、Ｇ４１Ｃ、Ｒ４８Ｃ／Ｋ、Ｋ６７Ｅ／Ｎ、Ｌ６９Ｐ、Ｅ７２Ｋ、Ｄ７５Ｅ／Ｖ／Ｙ、Ｐ８３Ｒ、Ｇ８９Ｄ／Ｖ、Ｇ９２Ａ／Ｖ、Ａ９７Ｐ、Ｅ９８Ｋ、Ｖ９９Ｄ、Ｄ１０１Ｇ／Ｈ／Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｋ１０８Ｔ、Ｍ１１０Ｖ、Ａ１１１Ｔ／Ｖ、Ｈ１１３Ｒ／Ｙ、Ｌ１１７Ｆ／Ｒ、Ｇ１２１Ｓ、Ｅ１２９Ｖ、Ｇ１３０Ｒ、Ｅ１３２Ｄ、Ｙ１３３Ｃ、Ｄ１３５Ｇ／Ｙ、Ｔ１３７Ａ／Ｉ、Ｓ１３８Ｒ、Ｅ１４１Ｋ、Ｄ１４５Ｈ、Ｖ１４７Ｄ、Ｙ１５５Ｈ、Ｖ１５９Ａ、Ｎ１６３Ｋ、Ｇ１６４Ｄ／Ｖ、Ｐ１６５Ｓ、Ｃ１７２Ｗ、Ｓ１７６Ｐ、Ｓ１７９Ｐ、Ｖ１８１Ｅ／Ｍ、Ｋ１８５Ｔ、Ｄ１８６Ｇ／Ｎ／Ｙ、Ｓ１８９Ｌ、Ｌ１９１Ｆ、Ｇ１９３Ｒ、Ｌ１９５Ｐ、Ｃ１９８Ｇ、Ｓ２０２Ｎ／Ｒ、Ｆ２１４Ｖ、Ｌ２１７Ｈ、Ａ２１９Ｄ／Ｔ、Ｖ２２０Ｇ、Ｄ２２２Ｖ、Ｅ２２３Ｋ、Ｇ２２４Ｗ、Ｔ２５２Ｉ、Ｖ２５３Ｆ、Ｎ２５４Ｉ、Ｇ２５５Ｖ、Ｌ２６１Ｐ、Ｐ２６２Ｌ、Ｇ２６３Ｓ、Ｇ２６６Ｆ、Ｃ２６７Ｙ、Ｗ２７４Ｃ、Ｈ２７５Ｌ、Ｇ２７８Ｒ、Ｇ２８０Ｄ、Ｅ２８４Ｋ、Ｖ２８５Ｇ、Ｅ２９１Ｇ／Ｋ、Ｔ２９４Ｉ、Ｆ２９５Ｌ、Ｖ２９７Ａ、Ｎ２９９Ｉ、Ｒ３０１Ｃ／Ｈ／Ｌ、Ａ３０３Ｅ／Ｐ、Ｉ３０７Ｓ、Ｓ３０８Ｌ、Ｆ３１２Ｓ、Ｔ３１４Ａ／Ｉ、Ａ３１５Ｖ、Ｇ３２３Ｅ、Ｌ３２６Ｐ、Ｌ３２７Ｐ／Ｖ、Ｃ３２９Ｆ、Ｉ３３１Ｖ、Ｍ３３９Ｔ、Ｅ３４０Ｋ、Ｖ３４５Ａ／Ｌ、Ｃ３４８Ｒ／Ｓ／Ｙ、Ｙ３６５Ｃ、Ｒ３９１Ｃ／Ｈ／Ｐ、Ｓ３９２Ｌ／Ｐ、Ａ３９４Ｓ、Ｗ４０１Ｇ、Ｉ４０５Ｆ／Ｓ、Ｅ４０９Ｇ、Ｗ４１２Ｇ／Ｒ、Ｋ４２７Ｉ、Ｌ４３１Ｆ／Ｓ、Ｒ４３７Ｐ／Ｗ、Ｉ４３８Ｆ、Ｇ４３９Ｄ／Ｓ／Ｖ、Ｙ４４２Ｃ、Ｋ４４４Ｒ、Ｙ４５０Ｄ／Ｎ、Ｔ４５４Ｉ、Ｆ４５５Ｃ、Ｇ４６６Ｅ、Ｐ４７０Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｇ４７４Ｅ／Ｒ／Ｖ、Ｅ４７５Ｋ、Ｇ４７７Ｖ、Ｄ４７８Ｎ、Ｔ４７９Ｒ、Ｆ４８４Ｃ、Ａ４８８Ｇ、Ｒ４９０Ｇ、Ｙ４９２Ｃ／Ｈ、Ｙ４９２Ｈ、Ｉ４９４Ｔ、Ｐ４９６Ｒ、Ｇ４９８Ｒ、Ｒ５０３Ｈ、Ｇ５１３Ｓ／Ｖ、Ｉ５２２Ｙ、Ｋ５２９Ｅ、Ｗ５３２Ｇ、Ｐ５４０Ｔ、Ｔ５４１Ｓ、Ｄ５４４Ｎ、Ｒ５４６Ｗ、Ｒ５５０Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｓ５５３Ｐ、Ｓ５５４Ｃ／Ｇ、Ｖ５５６Ｄ、Ｒ５６０Ｔ、Ｄ５６１Ｇ／Ｈ／Ｙ、Ｉ５６７Ｔ、Ｐ５６９Ｒ、Ｓ５７７Ｆ、Ｖ５７８Ａ、Ｄ５７９Ａ／Ｈ、Ｎ５８３Ｓ、Ｑ５８４Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｉ５８５Ｒ／Ｔ、Ｍ５８６Ｖ、Ｄ５８８Ｇ／Ｙ、Ｌ５９４Ｑ、Ｓ５９６Ｐ、Ｎ６０１Ｄ／Ｋ、Ｒ６０２Ｇ、Ｓ６０３Ｉ／Ｒ、Ｗ６０４Ｃ、Ｙ６０５Ｈ／Ｓ、Ｎ６０９Ｉ、Ｒ６１２Ｃ、Ｎ６３１Ｋ／Ｓ、Ｍ６３３Ｉ、Ｓ６３５Ｎ、Ｎ６３７Ｄ／Ｉ／Ｓ、Ｙ６３９Ｃ、Ｌ６４４Ｖ、Ｌ６５０Ｆ、Ｖ６５３Ａ／Ｍ、Ｌ６５９Ｐ、Ａ６６３Ｖ、Ｑ６６４Ｐ、Ｆ６７７Ｌ、Ｍ６８１Ｉ、Ｖ６８２Ｆ、Ｙ６８３Ｃ／Ｎ、Ｔ６８６Ｒ、Ｆ６９８Ｌ、Ｍ６９９Ｔ／Ｖ、Ｍ７０１Ｉ、Ｇ７０５Ｖ、Ｇ７１０Ｗ、Ｎ７１３Ｉ、Ｒ７１７Ｌ／Ｗ、Ｇ７２０Ｄ／Ｓ、Ｍ７２１Ｉ／Ｌ、Ａ７２３Ｔ、Ｌ７２５Ｑ、Ｖ７２７Ｆ、Ｅ７３９Ｋ、Ｙ７４２Ｃ、Ｒ７９５Ｇ、Ｐ９４７Ｒ、Ｖ１０１２Ｌ、Ｅ１０５７Ｋ、Ｈ１０６６Ｙ、Ｄ１２６０Ｅ、Ｋ１２８９Ｑ、Ｑ１３３６Ｋ、Ｎ１４６０Ｋ、Ｌ１４８１Ｐ、Ａ１６１０Ｓ、Ｉ１６９８Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ／Ｆ、Ｅ１７０１Ｋ、Ｑ１７０５Ｈ、Ｒ１７０８Ｃ／Ｈ、Ｔ１７１４Ｓ、Ｒ１７１５Ｇ、Ａ１７２０Ｖ、Ｅ１７２３Ｋ、Ｄ１７２７Ｖ、Ｙ１７２８Ｃ、Ｒ１７４０Ｇ、Ｋ１７５１Ｑ、Ｆ１７６２Ｌ、Ｒ１７６８Ｈ、Ｇ１７６９Ｒ、Ｌ１７７１Ｐ、Ｌ１７７５Ｆ／Ｖ、Ｌ１７７７Ｐ、Ｇ１７７９Ｅ／Ｒ、Ｐ１７８０Ｌ、Ｉ１７８２Ｒ、Ｄ１７８８Ｈ、Ｍ１７９１Ｔ、Ａ１７９８Ｐ、Ｓ１７９９Ｈ、Ｒ１８００Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｐ１８０１Ａ、Ｙ１８０２Ｃ、Ｓ１８０３Ｙ、Ｆ１８０４Ｓ、Ｌ１８０８Ｆ、Ｍ１８４２Ｉ、Ｐ１８４４Ｓ、Ｔ１８４５Ｐ、Ｅ１８４８Ｇ、Ａ１８５３Ｔ／Ｖ、Ｓ１８５８Ｃ、Ｋ１８６４Ｅ、Ｄ１８６５Ｎ／Ｙ、Ｈ１８６７Ｐ／Ｒ、Ｇ１８６９Ｄ／Ｖ、Ｇ１８７２Ｅ、Ｐ１８７３Ｒ、Ｌ１８７５Ｐ、Ｖ１８７６Ｌ、Ｃ１８７７Ｒ／Ｙ、Ｌ１８８２Ｐ、Ｒ１８８８Ｉ、Ｅ１８９４Ｇ、Ｉ１９０１Ｆ、Ｅ１９０４Ｄ／Ｋ、Ｓ１９０７Ｃ／Ｒ、Ｗ１９０８Ｌ、Ｙ１９０９Ｃ、Ａ１９３９Ｔ／Ｖ、Ｎ１９４１Ｄ／Ｓ、Ｇ１９４２Ａ、Ｍ１９４５Ｖ、Ｌ１９５１Ｆ、Ｒ１９６０Ｌ／Ｑ、Ｌ１９６３Ｐ、Ｓ１９６５Ｉ、Ｍ１９６６Ｉ／Ｖ、Ｇ１９６７Ｄ、Ｓ１９６８Ｒ、Ｎ１９７１Ｔ、Ｈ１９７３Ｌ、Ｇ１９７９Ｖ、Ｈ１９８０Ｐ／Ｙ、Ｆ１９８２Ｉ、Ｒ１９８５Ｑ、Ｌ１９９４Ｐ、Ｙ１９９８Ｃ、Ｇ２０００Ａ、Ｔ２００４Ｒ、Ｍ２００７Ｉ、Ｇ２０１３Ｒ、Ｗ２０１５Ｃ、Ｒ２０１６Ｐ／Ｗ、Ｅ２０１８Ｇ、Ｇ２０２２Ｄ、Ｇ２０２８Ｒ、Ｓ２０３０Ｎ、Ｖ２０３５Ａ、Ｙ２０３６Ｃ、Ｎ２０３８Ｓ、２０４０Ｙ、Ｇ２０４５Ｅ／Ｖ、Ｉ２０５１Ｓ、Ｉ２０５６Ｎ、Ａ２０５８Ｐ、Ｗ２０６５Ｒ、Ｐ２０６７Ｌ、Ａ２０７０Ｖ、Ｓ２０８２Ｎ、Ｓ２０８８Ｆ、Ｄ２０９３Ｇ／Ｙ、Ｈ２１０１Ｄ、Ｔ２１０５Ｎ、Ｑ２１０６Ｅ／Ｐ／Ｒ、Ｇ２１０７Ｓ、Ｒ２１０９Ｃ、Ｉ２１１７Ｆ／Ｓ、Ｑ２１１９Ｒ、Ｆ２１２０Ｃ／Ｌ、Ｙ２１２４Ｃ、Ｒ２１３５Ｐ、Ｓ２１３８Ｙ、Ｔ２１４１Ｎ、Ｍ２１４３Ｖ、Ｆ２１４５Ｃ、Ｎ２１４８Ｓ、Ｎ２１５７Ｄ、Ｐ２１６２Ｌ、Ｒ２１６９Ｃ／Ｈ、Ｐ２１７２Ｌ／Ｑ／Ｒ、Ｔ２１７３Ａ／Ｉ、Ｈ２１７４Ｄ、Ｒ２１７８Ｃ／Ｈ／Ｌ、Ｒ２１８２Ｃ／Ｈ／Ｐ、Ｍ２１８３Ｒ／Ｖ、Ｌ２１８５Ｓ／Ｗ、Ｓ２１９２Ｉ、Ｃ２１９３Ｇ、Ｐ２１９６Ｒ、Ｇ２１９８Ｖ、Ｅ２２００Ｄ、Ｉ２２０４Ｔ、Ｉ２２０９Ｎ、Ａ２２１１Ｐ、Ａ２２２０Ｐ、Ｐ２２２４Ｌ、Ｒ２２２８Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｌ２２２９Ｆ、Ｖ２２４２Ｍ、Ｗ２２４８Ｃ／Ｓ、Ｖ２２５１Ａ／Ｅ、Ｍ２２５７Ｖ、Ｔ２２６４Ａ、Ｑ２２６５Ｒ、Ｆ２２７９Ｃ／Ｉ、Ｉ２２８１Ｔ、Ｄ２２８６Ｇ、Ｗ２２９０Ｌ、Ｇ２３０４Ｖ、Ｄ２３０７Ａ、Ｐ２３１９Ｌ／Ｓ、Ｒ２３２３Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｒ２３２６Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｑ２３３０Ｐ、Ｗ２３３２Ｒ、Ｉ２３３６Ｆ、Ｒ２３３９Ｔ、Ｇ２３４４Ｃ／Ｄ／Ｓ、及びＣ２３４５Ｓ／Ｙを含む。第ＶＩＩＩ因子タンパク質には、翻訳後修飾を含むポリペプチドも含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド」及び「第ＦＶＩＩＩポリヌクレオチド」とは、例えば、欧州薬局方９．０の２．７．４章で説明されている、２段階色素体第Ｘ因子活性化アッセイを用いて測定する特定の条件下で、第ＩＸａ因子補助因子活性（例えば、多くの場合ＦＶＩＩａと呼ばれる、活性ＦＶＩＩＩ）、または、第ＩＸａ因子補助因子活性を有するタンパク質のタンパク質前駆体（例えば、プロタンパク質またはプレ－プロタンパク質）を有する第ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。

本明細書における「第ＶＩＩＩ因子活性」または「第ＩＸ因子セリン補助因子活性」とは、例えば、野生型第ＩＸ因子内でＡｒｇ１９４－Ｉｌｅ１９５ペプチド結合を加水分解し、故に第Ｘ因子を活性化して第Ｘａ因子にすることにより、第ＩＸａ因子の存在下において、第Ｘ因子ポリペプチドを切断する能力を意味する。活性レベルは、当該技術分野において公知の任意の第ＶＩＩＩ因子活性アッセイを用いて測定することができる。第ＶＩＩＩ因子活性を測定するためのある例示的なアッセイは、欧州薬局方９．０の２．７．４章で説明されている、２段階色素体第Ｘ因子活性化アッセイである。

本明細書で使用する場合、用語「ＦＶＩＩＩ療法」とは、第ＶＩＩＩ因子を患者に供給し、血友病Ａと関連する１つ以上の症状（即ち、臨床的因子）を緩和する、低減する、または再発を防止するための、あらゆる治療的アプローチを含む。この用語は、血友病を有する個体の健康を維持または改善するのに有用な任意の修飾形体の第ＶＩＩＩ因子を含む、第ＶＩＩＩ因子を含む任意の化合物、薬剤、手順、またはレジメンを投与することを包含し、本明細書に記載する治療薬のいずれかを含む。当業者には、ＦＶＩＩＩ療法の過程またはＦＶＩＩＩ療法の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られる結果に基づいて変更され得ることが理解されよう。

本明細書で使用する場合、「バイパス療法」という用語は、血友病に関連する１つ以上の症状（例えば、臨床因子）の緩和、減少、または再発防止のために、第ＶＩＩＩ因子ではない止血剤、化合物、または凝固因子を患者に提供する、任意の治療手法を含む。第ＶＩＩＩ因子ではない、提供可能な化合物及び凝固因子としては、限定するものではないが、第ＶＩＩＩ因子阻害剤バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、組換え活性化型第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮物、及び活性化型プロトロンビン複合体濃縮物が挙げられる。これらの第ＶＩＩＩ因子ではない化合物及び凝固因子は、組換え型であっても血漿由来であってもよい。当業者には、バイパス療法の過程またはバイパス療法の用量はいずれも、例えば、本発明に従って得られる結果に基づいて変更され得ることが理解されよう。バイパス療法で投与される、第ＦＶＩＩＩ因子でない化合物は、本明細書で、「第ＦＶＩＩＩバイパス複合体」または「第ＶＩＩＩ因子バイパス複合体」と呼ばれる。

本明細書で使用する場合、用語「第ＩＸ因子」及び「ＦＩＸ」（「ＩＸ」は、ローマ数字を指して「９」を意味する）は同じ意味で用いられ、例えば、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる、欧州薬局方９．０の２．７．１１章で説明されている、１段階第ＩＸ因子凝固アッセイを用いて測定した、第ＩＸ因子活性、特に、第ＶＩＩＩ因子の存在下での第Ｘ因子切断活性を有する任意のタンパク質（例えば、多くの場合「ＦＩＸａ」と呼ばれる活性ＦＩＸ）、または、第ＩＸ因子活性を有するタンパク質のタンパク質前駆体（例えば、多くの場合ｐＦＩＸ及びｐｐＦＩＸと呼ばれる、プロタンパク質もしくはプレ－プロタンパク質）を意味する。

野生型第ＩＸ因子ポリペプチドの非限定例としては、シグナルペプチド（プレ－プロタンパク質のアミノ酸１～２８）及び／またはプロペプチド（プレ－プロタンパク質のアミノ酸２９～４６）を欠く一本鎖第ＩＸ因子に対応する、ヒトプレ－プロ第ＩＸ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０００１２４．１）及びＮＰ＿００１３００８４２．１（ＦＩＸ２－ＦＬ－ＡＡ）、及びその天然バリアント；シグナルペプチドを欠く一本鎖第ＩＸ因子に対応する、ブタプレ－プロ第ＩＸ因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ００７４１）、及びその天然バリアント；シグナルペプチドを欠く一本鎖第ＩＸ因子に対応する、マウスプレ－プロ第ＩＸ因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１６２９４）、及びその天然バリアント；シグナルペプチドを欠く一本鎖第ＩＸ因子に対応する、ラットプレ－プロ第ＩＸ因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ１６２９６）、及びその天然バリアント；ならびに、他の哺乳類第ＶＩＩＩ因子同族体（例えば、チンパンジー、類人猿、ハムスター、モルモットなど）が挙げられる。

第ＩＸ因子は、多くの場合、第ＩＸ因子プレ－プロポリペプチドと呼ばれる、シグナルペプチド、プロペプチド、軽鎖、活性化ペプチド、及び重鎖を含む、不活性の一本鎖ポリペプチドとして翻訳される。第ＩＸ因子プレ－プロペプチドは、翻訳後処理を受け、活性第ＩＸ因子タンパク質（例えば、ＦＩＸａ）を形成する。この処理は、シグナルペプチドの（例えば、切断による）除去、続いて、プロペプチドの（例えば、切断による）除去により、第ＩＸ因子軽鎖及び第ＩＸ因子重鎖を含有する、依然として不活性な一本鎖成熟第ＩＸ因子ポリペプチドを形成することを含む。成熟第ＩＸ因子ポリペプチドをさらに切断し、第ＩＸ因子軽鎖と第ＩＸ因子重鎖との間の活性化ペプチドを取り除き、活性第ＩＸ因子タンパク質（例えば、ＦＩＸａ）を形成する。第ＩＸ因子軽鎖及び第ＩＸ因子軽鎖は依然として、ジスルフィド結合により会合したままである。第ＩＸ因子の構造、機能、及び活性化についてのさらなる情報については、例えば、これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、ＢｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒＨ．ｅｔａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，９２（２１）：９７９６－８００（１９９５），ＨｏｐｆｎｅｒＫＰｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，７（８）：９８９－９６（１９９９），ＧａｉｌａｎｉＤ．ｅｔａｌ．，ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ．，１３３Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ４８－５１（２０１４）、及び米国特許出願公開公報第２０１８／０３３９０２６号を参照されたい。

本明細書で使用する場合、用語「第ＩＸ因子ポリペプチド」及び「ＦＩＸポリペプチド」とは、例えば、欧州薬局方９．０の２．７．１１章に記載されている、１段階第ＩＸ因子凝固アッセイを使用して測定すると、特定の条件下で第ＩＸ因子セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。第ＩＸ因子ポリペプチドは、上記の翻訳後処理により活性化されたときに、第ＩＸ因子セリンプロテアーゼ活性を備える活性第ＩＸ因子タンパク質になる、一本鎖前駆体ポリペプチド（第ＩＸ因子プレ－プロポリペプチド、第ＩＸ因子プロペプチド、及び、成熟した一本鎖第ＩＸ因子ポリペプチド）、加えて、活性第ＩＸ因子タンパク質自身を含む。Ｒ３３８Ｌバリアントを含む第ＩＸ因子ポリペプチドが、第ＩＸ因子ポリペプチドの定義に具体的には含まれる。例示的実施形態では、ヒト第ＩＸ因子ポリペプチドとは、軽鎖及び重鎖を含む野生型ヒト第ＩＸ因子ポリペプチドの部分、即ちＦＩＸ－ＭＰ－ＡＡ（図ＸＸに示す配列番号ＸＸ）と、または、軽鎖及び重鎖を含むＰａｕｄａヒト第ＩＸ因子ポリペプチドの部分、即ちＦＩＸｐ－ＭＰ－ＡＡ（配列番号ＸＸ）と、高い配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。

本明細書で使用する場合、第ＩＸ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子の存在下にて第Ｘ因子切断活性を有する、天然バリアント及び人工構築物を含む。本開示で使用するように、第ＩＸ因子は、任意の天然バリアント、代替配列、アイソフォーム、または、２．７．１１章におけるＡｓｓａｙｏｆＨｕｍａｎＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＩＸの教示が参照により具体的に本明細書に組み込まれている、欧州薬局方９．０の２．７．１１章に従った１段階凝固アッセイでアッセイすると、対応する野生型活性の、ある程度の基礎第ＩＸ因子切断活性（例えば、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれ以上）を保持する変異タンパク質を包含する。ヒト集団で発見される、（ＦＩＸ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号ＸＸ）に対する）第ＩＸ因子アミノ酸のバリエーションの例としては、Ｉ１７Ｎ、Ｌ２０Ｓ、Ｃ２８Ｒ、Ｃ２８Ｙ、Ｖ３０Ｉ、Ｒ４３Ｌ、Ｒ４３Ｑ、Ｒ４３Ｗ、Ｋ４５Ｎ、Ｒ４６Ｓ、Ｒ４６Ｔ、Ｎ４８Ｉ、Ｓ４９Ｐ、Ｌ５２Ｓ、Ｅ５３Ａ、Ｅ５４Ｄ、Ｅ５４Ｇ、Ｆ５５Ｃ、Ｇ５８Ａ、Ｇ５８Ｅ、Ｇ５８Ｒ、Ｅ６６Ｖ、Ｅ６７Ｋ、Ｆ７１Ｓ、Ｅ７３Ｋ、Ｅ７３Ｖ、Ｒ７５Ｑ、Ｅ７９Ｄ、Ｔ８４Ｒ、Ｙ９１Ｃ、Ｄ９３Ｇ、Ｑ９６Ｐ、Ｃ９７Ｓ、Ｐ１０１Ｒ、Ｃ１０２Ｒ、Ｃ１０２Ｒ、Ｇ１０６Ｄ、Ｇ１０６Ｓ、Ｃ１０８Ｓ、Ｄ１１０Ｎ、Ｉ１１２Ｓ、Ｎ１１３Ｋ、Ｙ１１５Ｃ、Ｃ１１９Ｆ、Ｃ１１９Ｒ、Ｅ１２４Ｋ、Ｇ１２５Ｅ、Ｇ１２５Ｒ、Ｇ１２５Ｖ、Ｃ１３４Ｙ、Ｉ１３６Ｔ、Ｎ１３８Ｈ、Ｇ１３９Ｄ、Ｇ１３９Ｓ、Ｃ１５５Ｆ、Ｇ１６０Ｅ、Ｑ１６７Ｈ、Ｓ１６９Ｃ、Ｃ１７０Ｆ、Ｃ１７８Ｒ、Ｃ１７８Ｗ、Ｒ１９１Ｃ、Ｒ１９１Ｈ、Ｒ２２６Ｇ、Ｒ２２６Ｑ、Ｒ２２６Ｗ、Ｖ２２７Ｄ、Ｖ２２７Ｆ、Ｖ２２８Ｆ、Ｖ２２８Ｌ、Ｑ２４１Ｈ、Ｑ２４１Ｋ、Ｃ２５２Ｓ、Ｃ２５２Ｙ、Ｇ２５３Ｅ、Ｇ２５３Ｒ、Ａ２６５Ｔ、Ｃ２６８Ｗ、Ａ２７９Ｔ、Ｎ２８３Ｄ、Ｅ２９１Ｖ、Ｒ２９４Ｇ、Ｒ２９４Ｑ、Ｖ２９６Ｍ、Ｈ３０２Ｒ、Ｎ３０６Ｓ、Ｉ３１６Ｆ、Ｌ３１８Ｒ、Ｌ３２１Ｑ、Ｎ３２８Ｋ、Ｎ３２８Ｙ、Ｐ３３３Ｈ、Ｐ３３３Ｔ、Ｔ３４２Ｋ、Ｔ３４２Ｍ、Ｉ３４４Ｌ、Ｇ３５１Ｄ、Ｗ３５６Ｃ、Ｇ３５７Ｅ、Ｇ３５７Ｒ、Ｋ３６２Ｅ、Ｇ３６３Ｗ、Ａ３６６Ｄ、Ｒ３７９Ｇ、Ｒ３７９Ｑ、Ｃ３８２Ｙ、Ｌ３９２Ｆ、Ｌ３８３Ｉ、Ｒ３８４Ｌ、Ｋ３８７Ｅ、Ｉ３９０Ｆ、Ｍ３９４Ｋ、Ｆ３９５Ｉ、Ｆ３９５Ｌ、Ｃ３９６Ｆ、Ｃ３９６Ｓ、Ａ３９７Ｐ、Ｒ４０４Ｔ、Ｃ４０７Ｒ、Ｃ４０７Ｓ、Ｄ４１０Ｈ、Ｓ４１１Ｇ、Ｓ４１１Ｉ、Ｇ４１２Ｅ、Ｇ４１３Ｒ、Ｐ４１４Ｔ、Ｖ４１９Ｅ、Ｆ４２４Ｖ、Ｔ４２６Ｐ、Ｓ４３０Ｔ、Ｗ４３１Ｇ、Ｗ４３１Ｒ、Ｇ４３２Ｓ、Ｅ４３３Ａ、Ｇ４３３Ｋ、Ｃ４３５Ｙ、Ａ４３６Ｖ、Ｇ４４２Ｅ、Ｇ４４２Ｒ、Ｉ４４３Ｔ、Ｒ４４９Ｑ、Ｒ４４９Ｗ、Ｙ４５０Ｃ、Ｗ４５３Ｒ、及びＩ４５４Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。以下でより完全に論じるように、このナンバリングは、野生型ヒトＦＩＸに対応する。ヒト集団で同定された他のアミノ酸のバリエーションは既知であり、例えば、国立生物工学情報センター（「ＮＣＢＩ」）バリエーションビューワーを使用して発見することができ、寄託番号ＧＣＦ＿０００００１４０５．２５がある。第ＶＩＩＩ因子タンパク質には、翻訳後修飾を含むポリペプチドも含まれる。

本開示において、いわゆる「Ｐａｕｄａ」変異、即ち、成熟一本鎖第ＩＸ因子タンパク質（Ｒ３３８Ｌ）の位置３３８、第ＩＸ因子プレ－プロポリペプチド（Ｒ３８４Ｌ）の位置３８４における、アルギニンのロイシンへの変化を含むＦＩＸタンパク質が具体的に使用される。この変異により、機能亢進活性がＦＩＸタンパク質に付与される。例えば、「Ｐａｕｄａ」タンパク質（例えば、Ｒ３３８Ｌ変異を含有する第ＩＸ因子）は、野生型第ＩＸ因子よりも、インビボで５倍から１０倍活性であることが示された。米国特許第６，５３１，２９８号；ＳｉｍｉｏｎｉＰ．ｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．３６１（１７）：１６７１－７５（２００９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本開示は、場合によっては、本明細書では「ＦＩＸｐ」または「ｐＦＩＸ」と呼ばれる、Ｐａｕｄａ－ＦＩＸタンパク質をコードするアミノ酸及び核酸構築物を提供する。

本明細書で使用する場合、用語「第ＩＸ因子ポリヌクレオチド」及び「ＦＩＸポリヌクレオチド」とは、例えば、欧州薬局方９．０の２．７．１１章に記載されている、１段階第ＩＸ因子凝固アッセイを使用して測定すると、特定の条件下で第ＩＸ因子セリンプロテアーゼ活性を有する第ＩＸ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。Ｒ３３８Ｌバリアントを含む第ＩＸ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、第ＩＸ因子ポリヌクレオチドの定義に具体的には含まれる。

本明細書における「第ＩＸ因子活性」または「第ＩＸ因子セリンプロテアーゼ活性」とは、例えば、野生型第ＩＸ因子内でＡｒｇ１９４－Ｉｌｅ１９５ペプチド結合を加水分解し、故に第Ｘ因子を活性化して第Ｘａ因子にすることにより、第Ｖｉｌｌａ因子補助因子の存在下において、第Ｘ因子ポリペプチドを切断する能力を意味する。活性レベルは、当該技術分野において公知の任意の第ＩＸ因子活性アッセイを用いて測定することができる。第ＩＸ因子活性を測定するための例示的なアッセイは、欧州薬局方９．０の２．７．１１章に記載されている、１段階第ＩＸ因子凝固アッセイである。

本明細書で使用する場合、用語「ＦＩＸ療法」とは、第ＩＸ因子を患者に供給し、血友病Ｂと関連する１つ以上の症状（即ち、臨床的因子）を緩和する、低減する、または再発を防止するための、あらゆる治療的アプローチを含む。この用語は、血友病を有する個体の健康を維持または改善するのに有用な任意の修飾形体の第ＩＸ因子を含む、第ＩＸ因子を含む任意の化合物、薬剤、手順、またはレジメンを投与することを包含し、本明細書に記載する治療薬のいずれかを含む。当業者には、ＦＩＸ療法の過程またはＦＩＸ療法の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られる結果に基づいて変更され得ることが理解されよう。

本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、治療用タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に転写するために使用する、任意の核酸構築物を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターはレプリコンを含み、レプリコンは、核酸構築物を複製する機能を持つ。遺伝子療法に有用なベクターの非限定的な例としては、インビボで自律的複製単位として機能する、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、及びウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入するためのウイルスベクターである。当該技術分野では、遺伝子療法に有用な、多くの改変された真核生物ウイルスが知られている。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子療法に使用するのに特に適しているが、その理由は、ヒトがこのウイルスの天然の宿主であり、天然のウイルスが何らかの疾患に寄与するとは知られておらず、これらのウイルスは軽度の免疫応答を誘起するからである。

本明細書で使用する場合、用語「ウイルス粒子」とは、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを封入するウイルス粒子を意味し、ウイルス粒子は、好適な動物宿主（例えばヒト）に導入されたときに、治療用タンパク質の発現に対して特異的である。治療用タンパク質をコードするコドン改変ポリヌクレオチドが挿入されたゲノムを封入する、組み換えウイルス粒子が、ウイルス粒子の定義に具体的に含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「ミスセンス変異」とは、単一のヌクレオチドにおける点突然変異から生じる、タンパク質中のあるアミノ酸における変化を意味し、これは、ＤＮＡ配列における非同義的置換の一種である。

本明細書で使用する場合、用語「ハプロ欠損」とは、特定の遺伝子が、非機能的またはほぼ非機能的な遺伝子によりコードされる遺伝子産物の１つのコピーを提供する変異を含む、または、遺伝子の１つのコピーが、二倍体ゲノムから部分的に、もしくは完全になくなった、二倍体ゲノムでのゲノム状態を描写する。したがって、用語「ハプロ不全」とは、遺伝子産物（例えば、特定のタンパク質）の全レベル及び／または活性が、通常レベル及び／または活性の約半分であり、低下した活性が、通常の細胞機能に対して不十分である状態を意味する。いくつかの実施形態では、ハプロ不全は、遺伝子産物の通常のレベル及び／または活性が、ハプロ不全を有しない生体における、野生型レベル及び／または活性の約２５％～約７５％、または約３０％～約７０％、または約３５％～約６５％、または約４０％～約６０％、または約４５％～約５５％である状態を表す。場合によっては、遺伝子の他のコピーから、より多くの遺伝子産物を産生することにより、細胞が、特定の遺伝子のある機能的コピーの喪失を埋め合わせるため、このことは正しい。同様に、場合によっては、遺伝子の他のコピーが欠損されるか、または非機能的になるとき、例えば、ポジティブフィードバックループが機能して、少なくとも部分的には遺伝子の発現を制御する場合に、細胞は、遺伝子の機能的コピーから、より少量の遺伝子産物を産生する。

本明細書の「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」とは、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挿入されている、自然に存在する「野生型」ＡＡＶゲノムに由来するウイルス、自然に存在するＡＡＶキャップ遺伝子によりコードされるキャプシドタンパク質を使用してキャプシド内にパッケージされた治療用タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドに由来する組み換えウイルス、または、非自然のキャプシドキャップ遺伝子によりコードされたキャプシドタンパク質を使用してキャプシド内にパッケージされた治療用タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドに由来する組み換えウイルスを意味する。治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを封入する１つ以上のバリアントＡＡＶキャプシドタンパク質により形成されるウイルスを封入する、血清型ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、及びＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）が、ＡＡＶの定義に含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子療法」は、治療用タンパク質をコードする核酸を患者に提供し、疾患と関連する１つ以上の症状（例えば、臨床的因子）を緩和する、低減する、または再発を防止するための、あらゆる治療的アプローチを含む。この用語は、疾患、例えば、内因性治療用タンパク質の活性の欠損を有する個体の健康を維持または改善するための、治療用タンパク質の任意の修飾形体を含む、治療用タンパク質をコードする核酸を含む任意の化合物、薬剤、手順、またはレジメンを投与することを包含する。当業者には、遺伝子療法の過程または遺伝子療法治療薬の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られる結果に基づいて変更され得ることが理解されよう。

本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子のセグメント（例えば、コード領域）を意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ポリペプチド鎖の生成に関与するコード領域の直前にある領域、直後にある領域、及び／または介在する領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、またはイントロンなどの制御エレメント）によって位置付けられる。

本明細書で使用する場合、「制御エレメント」という用語は、細胞におけるコード配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化配列、イントロンなどのようなヌクレオチド配列を意味する。

本明細書で使用する場合、「プロモーターエレメント」という用語は、コード配列の発現のコントロールを助けるヌクレオチド配列を意味する。概して、プロモーターエレメントは、遺伝子の翻訳開始部位の５’に位置する。しかしながら、特定の実施形態では、プロモーターエレメントは、イントロン配列内、またはコード配列の３’に位置し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターに有用なプロモーターは、標的タンパク質の天然遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターに有用なプロモーターは、標的生物の特定の細胞または組織における発現に特異的である（例えば、肝臓特異的プロモーター）。さらに他の実施形態では、複数の十分に特徴付けられたプロモーターエレメントのうちの１つが、本明細書に記載する遺伝子療法ベクターに使用される。十分に特徴付けられたプロモーターエレメントの非限定的な例としては、ＣＭＶ初期プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、標的タンパク質の実質的に一定の発現を駆動する構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、特定の刺激（例えば、特定の治療または薬剤への曝露）に応答して標的タンパク質の発現を駆動する誘導性プロモーターである。ＡＡＶによる遺伝子療法のためのプロモーターの設計の概説については、Ｇｒａｙｅｔａｌ．（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２２：１１４３－５３（２０１１））を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により明確に組み込まれる。

本明細書で使用する場合、「ＣｐＧ」という用語は、ＤＮＡの一本鎖に沿ったシトシン－グアニンジヌクレオチドを意味し、ここで「ｐ」は、２つの間のリン酸結合を表す。

本明細書で使用する場合、「ＣｐＧアイランド」という用語は、ポリヌクレオチドのうち、統計学的に高い密度のＣｐＧジヌクレオチドを有する領域を意味する。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド（例えば、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の領域は、２００塩基対ウィンドウを超えて、（ｉ）領域が５０％を超えるＣＧ含有量を有し、かつ、（ｉｉ）予想されるＣｐＧジヌクレオチド当たりで観察されるＣｐＧジヌクレオチドの比率が、関係：

により定義すると少なくとも０．６であるである場合に、ＣｐＧアイランドである。ＣｐＧアイランドを同定する方法に関するさらなる情報については、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－ＧａｒｄｅｎＭ．ｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．，１９６（２）：２６１－８２（１９８７）を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により明確に組み込まれる。

本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそれらのポリマー、ならびにそれらの相補体を意味する。この用語には、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは連結を含む核酸であって、合成、天然、及び非天然のものであり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される核酸が包含される。かかる類似体の例としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、及びペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。しかし、患者での遺伝子療法に使用するための、本明細書で特に有用な実施形態は、ホスホジエステル結合を用いる。

用語「アミノ酸」とは、天然、ならびに、天然アミノ酸に類似の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を含む非天然アミノ酸を意味する。天然アミノ酸としては、遺伝暗号によってコードされるものと、それらのアミノ酸が後で修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート及びＯ－ホスホセリンが挙げられる。天然アミノ酸には、例えば、Ｄ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸が含まれ得る。アミノ酸に関して、当業者は、コードされた配列中で、単一のアミノ酸または小さな割合のアミノ酸を改変、付加、または欠失する、核酸またはペプチド配列への個別の置換、欠失、または付加は、「保存的に修飾されたバリアント」であり、ここで改変は、あるアミノ酸の、化学的に同様のアミノ酸での置換をもたらすことを理解するであろう。機能的に同様のアミノ酸をもたらす保存的置換表が、当該技術分野において周知である。かかる保存的に修飾されたバリアントとしては、本開示の多型バリアント、種間同族体、及び対立遺伝子が挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「肝臓特異的発現」とは、他の組織と比較して、肝臓組織における特定の遺伝子の優先的または顕性的なインビボ発現を意味する。いくつかの実施形態では、肝臓特異的発現とは、特定の遺伝子の全発現の少なくとも５０％が対象の肝組織内で生じることを意味する。他の実施形態では、肝臓特異的発現とは、特定の遺伝子の全発現の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％が対象の肝組織内で生じることを意味する。したがって、肝臓特異的制御エレメントは、肝組織における遺伝子の肝臓特異的発現を駆動する制御エレメントである。

本明細書に記載するように、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、制御因子（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化配列、及びイントロン）、加えて、ウイルスパッケージング因子（例えば、反転末端反復（「ＩＴＲ」）、及び／または、非ウイルス性宿主細胞にてポリヌクレオチドの複製を支持する他の要素、例えば、細菌、酵母菌、もしくは哺乳動物宿主細胞におけるポリヌクレオチドの伝播を支持するレプリコンを挙げることができる。

本開示において、治療用タンパク質をコードするコドン改変ポリヌクレオチドが具体的に使用される。本明細書に記載するように、コドン改変ポリヌクレオチドは、自然にコードされる構築物（例えば、野生型ヒトコドンを用いて同一の治療用アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）によりもたらされる治療用タンパク質の発現度合いと比較して、トランスジェニック治療用タンパク質のインビボでの発現の増加をもたらす。本明細書で使用する場合、用語「発現の増加」とは、自然にコードされた構築物を投与された動物の血液中でのトランスジェニック治療用タンパク質の濃度と比較して、コドン改変ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中での、トランスジェニック治療用タンパク質の濃度が増加することを意味する。タンパク質の発現の増加は、タンパク質の活性の増加をもたらす。故に、発現の増加は、活性の増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、発現の増加とは、自然にコードされたポリヌクレオチドを投与された動物の血液中でのトランスジェニック治療用ポリペプチドの濃度と比較して、コドン改変ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中で、トランスジェニック治療用ポリペプチドが少なくとも２５％を超えることを意味する。本開示の目的に関して、発現の増加とは、根底にあるアミノ酸置換、例えば、第ＩＸ因子における「Ｐａｕｄａ」変異により引き起こされる過活性ではなく、コドン配列の改変により生み出される効果を意味する。即ち、「Ｐａｕｄａ」第ＩＸ因子ポリヌクレオチドをコードするコドン最適化配列により得られる発現レベルを、自然にコードされた「Ｐａｕｄａ」変異により得られる発現レベルと比較する。いくつかの実施形態では、発現の増加とは、自然にコードされたポリヌクレオチドを投与された動物の血液中でのトランスジェニック治療用ポリペプチドの濃度と比較して、コドン改変ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中で、少なくとも５０％多い、少なくとも７５％多い、少なくとも１００％多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い、少なくとも１５倍多い、少なくとも２０倍多い、少なくとも２５倍多い、少なくとも３０倍多い、少なくとも４０倍多い、少なくとも５０倍多い、少なくとも６０倍多い、少なくとも７０倍多い、少なくとも８０倍多い、少なくとも９０倍多い、少なくとも１００倍多い、少なくとも１２５倍多い、少なくとも１５０倍多い、少なくとも１７５倍多い、少なくとも２００倍多い、少なくとも２２５倍多い、または少なくとも２５０倍多い、トランスジェニック治療用ポリペプチドを意味する。動物の血液中での治療用ポリペプチドの濃度は、例えば、治療用ポリペプチドに対して特異的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定することができる。

ＩＬ－６は、Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ２）またはインターフェロンβ２とも呼ばれるサイトカインである。ＩＬ－６は、Ｂリンパ球リネージ細胞の活性化に伴う分化因子として発見され（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：７３－７６，１９８６）、その後、ＩＬ－６は、様々な細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが示された（Ａｋｉｒａ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ａｄｖ．ｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５４：１－７８，１９９３）。ＩＬ－６は、Ｔリンパ球リネージ細胞の成熟を誘発することが報告されている（Ｌｏｔｚ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７：１２５３－１２５８，１９８８）。

ＩＬ－６は、細胞上の２種類のタンパク質を介して、その生物活性を伝達する。一方は、約８０ｋＤの分子量を有するリガンド結合タンパク質であるＩＬ－６受容体（本明細書では、ＩＬ－６Ｒとも呼ばれる）であり、これにＩＬ－６が結合する（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６：９６７－９８１，１９８７；Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：８２５－８２８，１９８７）。ＩＬ－６受容体は、細胞膜を貫通し、細胞膜で発現する膜結合種に加えて、細胞外領域で主に構成される可溶性ＩＬ－６受容体としても生じる。

本明細書において言及される場合、「レチノイドまたは甲状腺ホルモン受容体２／核内受容体同時抑制因子２遺伝子のサイレンシングメディエーター」、または「ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ－２遺伝子」とは、ヒストン脱アセチル化酵素及びメチルトランスフェラーゼなどの、クロマチン全体を修飾する酵素の動員により、標的遺伝子の転写サイレンシングを媒介する核内受容体または同時抑制因子複合体の形成に必要な核内受容体同時抑制因子である、レチノイドまたは甲状腺ホルモン受容体２／核内受容体同時抑制因子２のサイレンシングメディエーターをコードする遺伝子を意味する。ＳＭＲＴ複合体はＨＮＦ－４αと直接相互作用することにより、ＨＮＦ４αが媒介するＴＴＲプロモーター発現に、潜在的に直接影響を及ぼす。

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子型」とは、個体の遺伝子構造を意味する。用語「ジェノタイピング」または「遺伝型アッセイ」とは、生物学的アッセイにより、個体の遺伝子型を判定するプロセスを意味する。ジェノタイピングに用いるバイオアッセイとしては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡ断片分析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ、ＤＮＡシーケンシング、ＤＮＡマイクロアレイ法などの技術、またはこれらの組み合わせが挙げられる。一般的なジェノタイピング技術としては、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、末端制限酵素断片長多型（ｔ－ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、ならびに、全エクソームシーケンシング及びバリアント分析が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、ジェノタイピングアッセイは、全エクソームシーケンシング及びバリアント分析を含む。例えば、一実施形態では、患者のゲノムＤＮＡは、ＥＤＴＡで処理された全血液サンプルから抽出される。次に、市販されているキットを用いて、エクソームの濃縮を行う。断片化されたＤＮＡライブラリーをサンプル用に構築し、ハイスループットのシーケンシングを行う。配列読取り値を、例えばＢｕｒｒｏｗｓ－ＷｈｅｅｌｅｒＡｌｉｇｎｅｒを用いてアラインする。患者の全エクソームにおける（他の同様の個体の全ゲノムと比較しての）変化を、ＣｏｍｂｉｎｅｄＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＤｅｐｅｎｄｅｎｔＤｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＣＡＤＤ）を用いて評価し、ヒトゲノムにおける単一ヌクレオチドバリアント及び挿入／欠失の有害性可能性をスコアリングし、対象遺伝子において患者が変異（例えば、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによる、持続する感染に対する感度の増加と関連するもの）を有するか否かを判定する。

序論
ＡＡＶベースのＦＩＸ遺伝子療法により、血友病Ｂを有する患者を治療するための臨床試験において、高トランスアミナーゼ血症及びＦＩＸ発現の不安定性が、ＡＡＶキャプシドを認識する循環細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の、ベクター用量に依存する産生と関連することが発見され、適応性ＣＴＬＩＲが、形質導入した肝細胞のクリアランス、及びＦＩＸ発現の喪失を担い得るという仮説を導いた。

この効果は、ＡＡＶＦＩＸ遺伝子療法による前臨床の動物研究においては以前に観察されておらず、提示された、ＣＴＬが媒介する導入遺伝子喪失モデルは、いくつかの未回答の質問を残した。まず、エビデンスは、ＡＡＶキャプシドの抗原提示が、ＡＡＶ投与の直後に最も効果的であり、その後減少することを示唆しており、このことは、キャプシド特異的ＣＴＬが、初期の時点において、最もＡＡＶを形質導入した肝細胞を取り除くはずである、ということを示唆している。ＣＴＬが媒介する、形質導入した肝細胞の除去の後で、プレドニゾロンがどのようにＦＩＸ活性を回復することができるのかを説明することも、困難である。一本鎖及び自己相補性（ｓｃＡＡＶ）ベクターの両方が、ベクター注入後早期に、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９；病原体関連分子パターン［ＰＡＭＰＳ］の認識に伴う、重要なウイルスセンサーの１つ）を通して、先天性免疫を上方制御することが示された。また、長期のＡＡＶ形質導入に対する、後期の応答の統合における自然免疫系の役割もまた、提示されている。

初期のＡＡＶＦＩＸ遺伝子療法治験で使用するベクターストックは、過剰のＡＡＶ非含有キャプシドを含有し（推定で、約１５％のみがベクターゲノムを含有した）、故に、キャプシドの残りの大部分が潜在的に免疫原性となったが、ＦＩＸ遺伝子を有しなかった。ＡＡＶキャプシド用量依存性Ｔ細胞応答が、観察された高トランスアミナーゼ血症の根底にある唯一のメカニズムである場合、ＡＡＶ非含有キャプシドの装入量を大幅に減少することにより、高トランスアミナーゼ血症と、ＦＩＸ活性の関連する喪失との合併症を潜在的に回避することができる。

ＦＩＸ遺伝子療法に最初に使用した、ＡＡＶベクターの免疫原性を低下させるその後の努力は、ウイルスベクターへの曝露を減らしながら、ＦＩＸ発現を最大化することに焦点を当てた。一本鎖ＤＮＡからｓｃＡＡＶベクターに切り替えること（前臨床試験にてより強力であることが示された）、加えて、ＦＩＸ配列のコドン最適化により、より少量のベクター用量を用いることが容易になった。さらに、ヒトにおける中和抗体（ＮＡｂ）の血清学的有病率の報告が少なかったため、ＡＡＶ２よりも優先して、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８：アカゲザル血清型）を用いた。ＡＡＶ８はまた、肝細胞に対する化学走性の改善とも関連しており、末梢静脈への送達を可能にしながら、ベクター用量を下げるのに役立つ。

ｓｃＡＡＶ８ＦＩＸ発現方法は、機能亢進ＦＩＸバリアント（ＦＩＸＰａｕｄａ）を組み込むように再設計されている。この天然一本鎖アミノ酸バリアントは、野生型ＦＩＸタンパク質と比較して、特定の活性の５～１０倍の増加をもたらす、機能獲得変異（位置３３８における、ロイシンで置換されたアルギニン）を含有する。

ＡＡＶ８ベースのＦＩＸＰａｕｄａ遺伝子療法ＦＩＸ遺伝子治療構築物の開発には、機能亢進ＦＩＸＰａｕｄａバリアントを組み込み、ＦＩＸの発現を最大化し、精製工程を含めて、ＡＡＶ非含有キャプシドの量を約３０％まで低下させ、免疫系活性化の可能性を最小限にした。前臨床試験での有望な結果は、関節での出血を効果的に保護することが予想される程度にまでＦＩＸ活性を改善するように設計された、血友病Ｂの潜在的治療剤としての、ＦＩＸ遺伝子治療構築物のさらなる開発をもたらした。

しかし、導入遺伝子の持続的な発現が、問題として残る。有利には、本開示は、導入遺伝子の持続的な発現の改善により、遺伝子療法を改善する方法を提供する。具体的には、いくつかの実施形態では、持続的な発現の改善は、ＩＬ６シグナル伝達経路、及び／またはＮＣｏＲ２／ＳＭＲＴ脱アセチル化経路の付随抑制により実現する。

本開示はまた、血友病だけでなく、遺伝子療法により潜在的に治療可能な任意の他の疾患にも対する、ウイルスベースの遺伝子療法の患者を同定する方法、及び、投与後に遺伝子療法ベクターの持続的な発現を促進するウイルスベースの遺伝子療法による、患者の治療方法を提供する。

改善されたウイルスベクターベース遺伝子療法の方法
実施例１で記載するように、ＡＡＶベースの第ＩＸ因子遺伝子療法ベクターを投与した８名の血友病Ｂ患者のうち、１名の患者（患者５）のみが、４年以上にわたって、遺伝子療法ベクターからのトランスジェニック第ＩＸ因子の発現を維持した。患者５のゲノム分析により、患者はインターロイキン－６（ＩＬ６）及びＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴ遺伝子に変異を有することが明らかとなった。したがって、一態様では、本開示は、インターロイキン－６（ＩＬ６）シグナル伝達経路またはＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴヒストン脱アセチル化経路の阻害剤と、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターとの同時投与により、本患者で観察される、抑制されたＩＬ６及び／またはＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴ機能を刺激する、改善された遺伝子療法の方法を提供する。

ＩＬ６経路阻害剤の同時投与
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、インターロイキン－６（ＩＬ６）シグナル伝達経路の阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、阻害剤はＩＬ６阻害剤である。例えば、いくつかの実施形態では、ＩＬ６阻害剤は、モノクローナル抗体またはその誘導体、例えば、抗ＩＬ６モノクローナル抗体のＣＤＲ配列をベースにして遺伝子操作された、ＩＬ６特異的結合分子である。いくつかの抗ＩＬ６モノクローナル抗体が、治療用の使用に認可されているか、または前臨床／臨床試験の最中である。これらの抗体としては、シルツキシマブ、オロキズマブ、エルシリモマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、ゲリリムズマブ、ＦＭ１０１、及びＭＥＤＩ５１１７が挙げられる。抗ＩＬ６モノクローナル抗体、そのバリアント、及びその誘導体の非限定例は例えば、米国特許第７，２９１，７２１号、同第７，５６０，１１２号、同第７，６１２，１８２号、同第７，８２０，１５５号、同第７，９１９，０９５号、同第７，９５５，５９７号、同第８，０６２，８６６号、同第８，６３２，７７４号、同第９，２３４，０３４号、米国特許出願公開公報第２０１４／０１２７２０９号、同第２０１１／００５９０８０号、及びＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ２０１９／１０９９４７号に記載されており、これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びシルツキシマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びシルツキシマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びシルツキシマブの誘導体、例えば、シルツキシマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。商品名ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標）にて市販されているシルツキシマブのさらなる情報については、その内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，６１２，１８２号及び同第７，２９１，７２１号を参照されたい。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びオロキズマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びオロキズマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びオロキズマブの誘導体、例えば、オロキズマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びエルシリモマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びエルシリモマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びエルシリモマブの誘導体、例えば、エルシリモマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びクラザキズマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びクラザキズマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びクラザキズマブの誘導体、例えば、クラザキズマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びシルクマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びシルクマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びシルクマブの誘導体、例えば、シルクマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。シルクマブのさらなる情報については、その内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，５６０，１１２号を参照されたい。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びゲリリムズマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びゲリリムズマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びゲリリムズマブの誘導体、例えば、ゲリリムズマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。

同様に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、インターロイキン－６受容体（ＩＬ６Ｒ）の阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ６Ｒ阻害剤は、モノクローナル抗体またはその誘導体、例えば、抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体のＣＤＲ配列をベースにして遺伝子操作された、ＩＬ６Ｒ特異的結合分子である。いくつかの抗ＩＬ６モノクローナル抗体が、治療用の使用に認可されているか、または前臨床／臨床試験の最中である。これらの抗体としては、トシリズマブ、サリルマブ、レビリマブ、ボバリリズマブ、またはサトラリズマブが挙げられる。抗ＩＬ６モノクローナル抗体、そのバリアント、及びその誘導体の非限定例は例えば、米国特許第５，７９５，９６５号、同第７，５８２，２９８号、同第８，３３７，８４９号、同第８，５６２，９９１号、同第９，０１７，６７８号、同第９，１７３，８８０号、同第９，８２８，４３０号、及び同第１０，６１８，９６４号、米国特許出願公開公報第２０１７／０１６６６４６号、ならびに、ＰＣＴ公報番号第ＷＯ２０１８／０２９１８２号、同第ＷＯ２０１８／１１２２３７号、及び同第ＷＯ２０１９／０５２４５７号に記載されており、これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びトシリズマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びトシリズマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びトシリズマブの誘導体、例えば、トシリズマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。商品名ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標）にて市販されているシルツキシマブのさらなる情報については、その内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，７９５，９６５号を参照されたい。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びサリルマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びサリルマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びサリルマブの誘導体、例えば、サリルマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。商品名ＫＥＶＺＡＲＡ（登録商標）にて市販されているサリルマブのさらなる情報については、その内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，５８２，２９８号を参照されたい。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びレビリマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びレビリマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びレビリマブの誘導体、例えば、レビリマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びボバリリズマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びボバリリズマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びボバリリズマブの誘導体、例えば、ボバリリズマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。

同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びサトラリズマブを投与することを含む。関連する実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びサトラリズマブのバリアント、例えば、抗体の定常領域に１つ以上のアミノ酸置換、抗体の可変領域に１つ以上のアミノ酸置換、及び／または、抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を投与すること含む。同様に、いくつかの実施形態では、方法は、患者に、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター、及びサトラリズマブの誘導体、例えば、サトラリズマブのＣＤＲ領域の１つ以上を含有する抗体の誘導体を投与することを含む。サトラリズマブのさらなる情報については、その内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８，５６２，９９１号を参照されたい。

インターロイキン６（ＩＬ－６）は、プロ炎症性サイトカイン及び抗炎症性マイオカインの療法として作用するインターロイキンである。ＩＬ－６の過剰産生は、いくつかの慢性炎症性疾患及びがんを含む様々な疾患の病因において示唆されている。ＩＬ６は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路、Ｒａｓ／ＭＡＫシグナル伝達経路、ＳＨＰ－２／ＥＲＫＭＡＰＫシグナル伝達経路、及び、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の中で作用することが知られている。肝臓内では、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒシグナル伝達系は、２つの細胞間シグナル伝達経路、即ちＳＨＰ－２／ＥＲＫＭＡＰＫ経路及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化するように機能する。内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、ＭｉｈａｒａＭ．ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＳｃｉ（Ｌｏｎｄ），１２２（４）：１４３－５９（２０１２）を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、これらの経路の１つにおいて、例えば、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒ以外の因子の阻害剤を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターと共に、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路における因子の阻害剤を投与することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、ＪＡＫ阻害物質を投与することを含む。ＪＡＫ阻害剤は、Ｊａｎｕｓキナーゼファミリーの酵素（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）の１つ以上の活性を阻害することにより機能し、これにより、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路に干渉する。ＪＡＫ阻害剤の非限定例としては、ルキソリチニブ、トファシチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、ペフィシチニブ、フェドラチニブ、ウパダシチニブ、フィルゴチニブ、セルデュラチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、モメロチニブ、パクリチニブ、アブロシチニブ、ククルビタシンＩ、及びＣＨＺ８６８が挙げられる。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＳＴＡＴ阻害剤の投与を含む。ＳＴＡＴ阻害剤は、転写因子（ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６）のシグナル伝達物質及び活性化因子の１つ以上の活性を阻害することにより機能する。ＳＴＡＴ阻害剤の非限定例としては、ピオグリタゾン、メトトレキサート、シロリムス、タクロリムス、シロリムス、ＡＴ９２８３、クリトタンシノン、カプサイシン、クルクミン、ククルビタシン１、セラストロール、アトリプリモド、及びスルフォラファンが挙げられる。臨床試験におけるＪＡＫ及びＳＴＡＴ阻害剤のさらなる情報については、その内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｈｉｎ－ＹａｐＬ．ｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，９（４８）（２０１９）を参照されたい。

同様に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターと共に、ＳＨＰ－２／ＥＲＫＭＡＰＫシグナル伝達経路における因子の阻害剤を投与することを含む。ＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害剤の非限定例としては、ソマトスタチン類似体（例えば、ＳＯＭ２３０及びオクトレオチド）、ドーパミン及びそのアゴニスト（例えば、ドーパミン、ブロモクリプチン、及びカベルゴリン）、ＴＧＦ－β、１８－β－グリチルレチン酸、ＢＩＭ－２３Ａ７６０、ウソリン酸、ならびにフルベストラントが挙げられる。ＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害剤のさらなる情報については、ＬｕＭｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１０（３３０）（２０１９）を参照されたい。

ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の同時投与
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴヒストン脱アセチル化経路の阻害剤を投与することを含む。ＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴ遺伝子は、特定の標的遺伝子の転写サイレンシングを媒介する、核内受容体同時抑制因子をコードする。コードされたタンパク質は、甲状腺ホルモン及びレチノイン酸受容体関連同時抑制因子のファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ヒストン脱アセチル化酵素を含み、標的遺伝子の基礎となる転写活性を防ぐクロマチン構造を修飾する、マルチサブユニット複合体の一部として作用する。この遺伝子の異常発現は、特定のがんと関連する。選択的スプライシングは、異なるアイソフォームをコードする複数の転写バリアントをもたらす。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、治療的に有効な用量のウイルスベースの遺伝子療法ベクター及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を患者に投与することを含む、改善された遺伝子療法の方法を提供する。

典型的には、ＨＤＡＣの亜鉛含有触媒ドメインに結合することにより、クラスＩ、ＩＩａ、及びＩＩｂＨＤＡＣにて作用する、いくつかのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が同定されている。これらの阻害剤は、ヒドロキサム酸（例、トリコスタチンＡ）、環状テトラペプチド（例、トラポキシンＢ）及びデプシペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、ならびに、脂肪酸化合物（例えば、フェニルブチレート及びバルプロ酸）を含むいくつかのグループに収まる。これらのグループに由来する第２世代の阻害剤としては、ヒドロキサム酸ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ－５８９）、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、ならびに、ベンズアミドエンチノスタット（ＭＳ２７５）、ＣＬ－９９４、及びモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）が挙げられる。一般に、ベンズアミドは、クラスＩＩではなくクラスＩＨＤＡＣを阻害し、ヒドロキサム酸は、クラスＩＩａＨＤＡＣよりも、クラスＩ及びＩＩｂＨＤＡＣの強力な阻害剤である、一方で、クラス内のイソ型選択性は著しく低い。

治療用タンパク質
一般に、本明細書に記載の方法は、提示された作用機序が、ベクターから発現されるタンパク質とは独立しているため、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター、例えば、任意の治療用タンパク質をコードするアデノ随伴遺伝子療法ベクターとともに用いるのに好適である。本明細書に記載の方法で使用するのに十分適した治療用タンパク質の種類の例としては、血液凝固因子、セリンプロテアーゼ、サイトカイン、サイトカイン受容体タンパク質の可溶性部分、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体の可溶性部分、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質の可溶性部分、補体調節タンパク質、増殖因子、ホルモン受容タンパク質の可溶性部分、コレステロール受容タンパク質の可溶性部分、転写因子タンパク質、及び、代謝酵素が挙げられる。

実際に、規制認可が降りているいくつかの遺伝子療法が存在する。例えば、タリモジーンラハーパレプベック（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする）、ボレチジーンネパルボベック－ｒｚｙｌ（レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５））をコードする）、及び、オナセムノジーンアベパルボベック－ｘｉｏｉ（生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）をコードする）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ阻害剤、及び、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチド、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）ポリペプチド、または、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）ポリペプチドをコードするウイルスベースの遺伝子療法ベクターを投与することを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ阻害剤、ならびに、タリモジーンラハーパレプベック、ボレチジーンネパルボベック－ｒｚｙｌ、及びオナセムノジーンアベパルボベック－ｘｉｏｉのうちの１つを投与することを含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、血液因子、例えば凝固因子、例えば第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、または第ＸＩＩ因子をコードする。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ阻害剤、及び、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、または第ＸＩＩ因子をコードするウイルスベースの遺伝子療法ベクターを投与することを含む。

第ＶＩＩＩ因子
いくつかの実施形態では、患者は血友病Ａを有し、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。一実施形態では、コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインが欠失された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン改変ポリヌクレオチドは、ＡＡＶベースの遺伝子療法構築物において投与すると、著しく改善された第ＶＩＩＩ因子の生物作用能（例えば、活性）をもたらす。コドン改変ポリヌクレオチドはまた、従来的にコドン最適化された構築物と比較して改善されたＡＡＶ－ビリオンパッケージングを示す。

野生型第ＶＩＩＩ因子は１９個のアミノ酸シグナルペプチドでコードされ、これは、第ＶＩＩＩ因子の活性化の前に、コードされたポリペプチドから切断される。当業者には理解されるように、第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチドは、シグナルペプチドが細胞プロセシングによって除去された後に残る成熟ポリペプチドの配列に影響を及ぼすことなく、変異させる、他の遺伝子もしくは他の生物の第ＶＩＩＩ因子遺伝子のシグナルペプチドに置換する、または完全に除去することができる。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するコドン改変ポリヌクレオチド（例えば、核酸組成物）は、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖、ならびに短い１４アミノ酸のＢドメイン置換リンカー（例えば、活性ＦＶＩＩＩａタンパク質のインビボでの成熟を促進するフリン切断部位を含む「ＳＱ」リンカー）をコードする部分と高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、これは、５つの「Ｘ５変異」のうちの１つ以上（例えば、完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ変異（ＳＰＩナンバリング；（ＳＰＥナンバリングはそれぞれ、Ｉ８６Ｖ／Ａ１０８Ｓ／Ｇ１３２Ｋ／Ｍ１４７Ｔ／Ｌ１５２Ｐである））のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべて）、及び／またはＢドメイン置換リンカー（例えば、ＳＱリンカー）に挿入された短いグリコシル化ペプチドをさらに含む。

具体的には、Ｘ５変異セットは、Ｂドメイン欠失遺伝子療法構築物において対応するヒトアミノ酸をブタアミノ酸８２～１７６で置換すると、ＨＥＫ２９３細胞で発現させた第ＶＩＩＩ因子の活性が上昇したという事実に基づく（Ｗ．Ｘｉａｏ、短報）。単一ブタアミノ酸のヒトＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ構築物への復帰変異により、この現象に寄与するＡ１ドメイン内の５つのアミノ酸：Ｉ１０５Ｖ、Ａ１２７Ｓ、Ｇ１５１Ｋ、Ｍ１６６Ｔ、及びＬ１７１Ｐ（ＳＰＩ）が同定された。これらの変異の組み合わせをヒト構築物に導入すると、より大きなブタ置換の活性の改善が再現された。したがって、いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｉ１０５Ｖ、Ａ１２７Ｓ、Ｇ１５１Ｋ、Ｍ１６６Ｔ、及びＬ１７１Ｐから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含み、この５アミノ酸セット全体が、多くの実施形態において特に有用である。

いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ドメイン内の１１個のアミノ酸疎水性βシートの中に変異を含み、これがＢｉＰと相互作用して、第ＶＩＩＩ因子の分泌を増加させる。例えば、ポケット内でのＦ３２８Ｓ（ＳＰＩ、Ｆ３０９ＳＳＰＥ）アミノ酸置換が、第ＶＩＩＩ因子分泌を３倍増加させた。バリアントの数は、シグナルペプチド、即ち、「ＳｉｇｎａｌＰｅｐｔｉｄｅＩｎｃｌｕｓｉｖｅ」もしくは「ＳＰＩ」を含んで完了することができるか、または、処理した最終のタンパク質配列、即ち、「ＳｉｇｎａｌＰｅｐｔｉｄｅＥｘｃｌｕｓｉｖｅ」もしくは「ＳＰＥ」から開始することができる。したがって、ＳＰＩナンバリングを用いると、変異Ｆ３２８Ｓは、Ｆ３０９ＳＰＥ変異体と同じである。一般に、本明細書ではＳＰＩナンバリングを用いるが、当業者により理解されるように、いずれのナンバリングシステムでも同じ変異（複数可）がもたらされる。

他の第ＶＩＩＩ因子バリアントが、有利な性質をもたらすことが知られている。例えば、Ａ１ドメインとＣ２ドメインとの界面に位置する、残基Ａ１０８、Ｒ１２１、及びＬ２３０２（ＳＰＥ）の変異は、第ＶＩＩＩ因子の安定性を増加させる。例えば、Ａ１０８Ｉアミノ酸置換は、ドメイン空間の間を良好に満たす疎水性残基を導入し、相互作用を安定化させる。同様に、Ｒ１２１Ｃ／Ｌ２３０２Ｃ（ＳＰＥ）二重アミノ酸置換は、Ａ１－Ｃ２ドメインにわたりジスルフィド結合を導入し、相互作用をさらに安定化させる。これらを合わせると、３つ全てのアミノ酸置換が、第ＶＩＩＩ因子の熱安定性を３～４倍増加させる。確認には、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８６（２９）：２５７４８－５５（２０１１）、及びＷａｋａｂａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．１０（３）：４９２－９５（２０１２）を参照されたい。

同様に、第ＶＩＩＩ因子のカルシウム結合ドメイン内に位置するＥ１１３（ＳＰＥ）の変異は、特異的なＦＶＩＩＩ凝固活性を増加させる。例えば、Ｅ１１３Ａは、第ＩＸａ因子に対するＦＶＩＩＩ親和性の増加により、ＦＸａｓｅ形成を増加させる。具体的には、Ｅ１１３Ａアミノ酸置換は、特異的なＦＶＩＩＩ凝固活性を２倍増加させ、第ＩＸａ因子に対する親和性を４倍増加させる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４８５（２００２）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：１２６７７（２００４）；及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４４：１０２９８（２００５））。

第ＶＩＩＩ因子ＡＰＣ切断部位（残基３３１～３４１（ＳＰＥ））を取り巻く１つ以上のアミノ酸残基における置換は、ＦＶＩＩＩ活性に影響を及ぼすことなく、活性化されたプロテインＣにより、第ＶＩＩＩａ因子の失活を低下させる。例えば、ＰＱＬ３３３－３３５ＶＤＱ（ＳＰＥ）アミノ酸置換は、第ＶＩＩＩ因子の失活を１６分の１に低下させる。同様に、ＭＫＮ３３６－３３９ＧＮＱアミノ酸置換基は、第ＶＩＩＩ因子の失活を９分の１に低下させる。これらを組み合わせると、２つの三重アミノ酸置換（例えば、ＰＱＬＲＭＫＮ３３３－３３９ＶＤＱＲＧＮＱ）（それぞれ、配列番号３４及び３５）が、第ＶＩＩＩ因子の失活を１００分の１に低下させる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２：２０２６４（２００７））。したがって、いくつかの実施形態では、コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ＰＱＬ３３３－３３５ＶＤＱ及び／またはＭＫＮ３３７－３３９ＧＮＱ（ＳＰＥ）アミノ酸置換を含む。

Ａ２ドメイン界面内での変異は、第ＶＩＩＩ因子の安定性もまた増加させる。具体的には、Ａ１－Ａ２及びＡ２－Ａ３ドメイン界面における、荷電した残基を変異させることにより、第ＶＩＩＩａ因子におけるＡ２サブユニットの安定性及び保持が増加する。例えば、Ｄ５１９、Ｅ６６５、及びＥ１９８４を、ＶまたはＡに変異することにより、最大２倍増加した第ＶＩＩＩ因子の安定性、及び、最大５倍の第ＶＩＩＩａ因子の安定性が得られる。具体的には、Ｄ５１９Ａ／Ｅ６６５Ｖアミノ酸置換は、安定性の３倍の増加をもたらし、Ｄ５１９Ｖ／Ｅ６６５Ｖアミノ酸置換は、安定性の２倍の増加、Ａ２解離の８倍の減少、及び、トロンビン生成能力の２～４倍の増加をもたらし、Ｄ５１９Ｖ／Ｅ１９８４Ａアミノ酸置換は、安定性の２倍の増加をもたらし、Ｄ５１９Ｖ／Ｅ６６５Ｖ／Ｅ１９８４Ａアミノ酸置換は、安定性の２倍の増加をもたらす（Ｂｌｏｏｄ１１２：２７６１－６９（２００８）；Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７：４３８－４４（２００９））。

さらなるグリコシル化部位を導入するＨＣ－Ｂドメイン界面にまたがる７個のアミノ酸の、６個への置換を、界面近くに導入した。したがって、いくつかの実施形態では、ｍ３は、ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号１９）（例えば、ＡＩＥＰＲＳＦ７５５－７６１ＴＴＹＶＮＲＳＬ）（配列番号３３として開示されている「ＴＴＹＶＮＲＳＬ」）と比較して、Ｎ７５４の後で、アミノ酸ＡＩＥＰＲＳＦ７５５－７６１を欠失してアミノ酸ＴＴＹＶＮＲＳＬ（配列番号３３）を挿入することである。野生型第ＶＩＩＩ因子配列と比較して、残基ＡＩＥＰＲ７５５－７５９は重鎖の末端に収まる一方で、残基Ｓ７６０及びＦ７６１はＢドメインに収まる。ＦＶＩＩＩＢドメインが欠失、切頭、または置換されるいくつかの実施形態では、残基Ｓ７６０及びＦ７６１は、変異している基本的なアミノ酸配列に存在しない場合がある。

さらなる実施形態では、本開示のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ｍ４変異を含む。第ＶＩＩＩ因子の中のＣ１８９９－Ｃ１９０３ジスルフィド結合を取り除くことにより、分泌もまた増加した。さらに、第ＶＩＩＩ因子分泌の増加は、Ｆ３２８Ｓ（ＳＰＩ、Ｆ３０９ＳＳＰＥ）及びＣ１９１８Ｇ／Ｃ１９２２Ｇアミノ酸置換の組み合わせに対して、付加的なものである（Ｍｉａｏｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３：３４１２－１９（２００４）；Ｓｅｌｖａｒａｊｅｔａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１０：１０７－１５（２０１２））。

いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ重鎖と軽鎖との間の結合（例えば、野生型第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン）をさらに改変する。ＡＡＶパッケージング能力のサイズ制限のため、Ｂドメイン欠失型、切断型、及び／またはリンカー置換型のバリアントは、ＦＶＩＩＩ遺伝子療法構築物の有効性を改善するはずである。従来最も使用されているＢドメイン置換リンカーは、リンカー配列としてＢドメインの１４アミノ酸のみを保持するＳＱＦＶＩＩＩのものである。ブタＶＩＩＩの別のバリアント（米国特許第６，４５８，５６３号に記載されている「ＯＢＩ－１」）は、ＣＨＯ細胞で良好に発現され、わずかに長い２４アミノ酸のリンカーを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物は、ＳＱ型Ｂドメインリンカー配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物は、ＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカー配列を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインのアミノ酸７６０－７６２／１６５７－１６６７を含む、ＳＱ型Ｂドメインリンカーを含む（Ｓａｎｄｂｅｒｇｅｔａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：９３（２００１））。いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して２つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドがＳＱ型Ｂドメインリンカーに挿入されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインのアミノ酸７６０／１５８２－１６６７を含む、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーを含む（Ｏｈｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１７：１９９９（２００１））。いくつかの実施形態では、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して２つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドがＧｒｅｅｎｇｅｎｅ型Ｂドメインリンカーに挿入されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインのアミノ酸７６０－７６９／１６５７－１６６７を含む、伸長したＳＱ型Ｂドメインリンカー（ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ）を含む（Ｔｈｉｍｅｔａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１６：３４９（２０１０））。いくつかの実施形態では、伸長したＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、伸長したＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して２つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドが伸長したＳＱ型Ｂドメインリンカーに挿入されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型のブタ第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインに由来するアミノ酸ＳＦＡＱＮＳＲＰＰＳＡＳＡＰＫＰＰＶＬＲＲＨＱＲ（配列番号３１）を含む、ブタＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーを含む（Ｔｏｓｃｈｉｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：５１７（２０１０））。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して、２つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、ブタＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーに挿入される。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、図１３に示すもの（それぞれ、見える順番で配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、及び７５）から選択される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ：配列番号１９）のアミノ酸７６０－７７２／１６５５－１６６７を含む、ヒトＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して、２つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、ヒトＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーに挿入される。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、図１３に示すもの（それぞれ、見える順番で配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、及び７５）から選択される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型のブタ第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインに由来するアミノ酸ＳＦＳＱＮＳＲＨＱＡＹＲＹＲＲＧ（配列番号３２）を含む、０８型Ｂドメインリンカーを含む（Ｔｏｓｃｈｉｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：５１７（２０１０））。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ブタＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列と比較して、２つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、ブタＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカーに挿入される。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、図１３に示すもの（それぞれ、見える順番で配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、及び７５）から選択される。

第ＶＩＩＩ因子構築物からのＢドメインの除去は、活性化型酵素（例えば、ＦＶＩＩＩａ）の活性に影響を及ぼさないようであるが、これは、Ｂドメインが活性化中に除去されるためだと考えられる。しかし、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは、例えば、ＮまたはＯ結合グリコシル化により、翻訳後に修飾されたいくつかの残基を含有する。野生型第ＶＩＩＩ因子ＢドメインのＩｎｓｉｌｉｃｏ分析（ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＮ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｓｉｎｈｕｍａｎｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｒ．Ｇｕｐｔａ，Ｅ．ＪｕｎｇａｎｄＳ．Ｂｒｕｎａｋ，ｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（２００４））は、これらの部位のうちの少なくとも４つがインビボでグリコシル化されることを予測する（図１４）。Ｂドメイン内のこれらの修飾は、インビボの第ＶＩＩＩ因子の翻訳後制御及び／または半減期に寄与すると考えられている。

第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインは成熟した第ＶＩＩＩａ因子タンパク質には存在しないが、前駆体第ＶＩＩＩ因子分子のＢドメイン内でのグリコシル化は、活性化前にタンパク質の循環半減期を増加させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物のポリペプチドリンカーは、インビボのグリコシル化を可能にするために、１つ以上のグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも１つのコンセンサスグリコシル化配列（例えば、Ｎ－結合型またはＯ－結合型グリコシル化コンセンサス配列）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも２つのコンセンサスグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも３つのコンセンサスグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも４つのコンセンサスグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも５つのコンセンサスグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のコンセンサスグリコシル化配列を含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも１つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも２つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも３つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも４つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも５つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。

第ＶＩＩＩ因子
いくつかの実施形態では、患者は血友病Ａを有し、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは第ＶＩＸ因子ポリペプチドをコードする。一実施形態では、コードされた第ＩＸ因子ポリペプチドは、野生型第ＩＸ因子配列と比較して、Ｒ３３８Ｌアミノ酸変化を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、第ＩＸ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン改変ポリヌクレオチドは、ＡＡＶベースの遺伝子療法構築物において投与すると、著しく改善された第ＩＸ因子の生物作用能（例えば、活性）をもたらす。コドン改変ポリヌクレオチドはまた、従来的にコドン最適化された構築物と比較して改善されたＡＡＶ－ビリオンパッケージングを示す。

コルチコステロイドの同時投与
いくつかの実施形態では、改善された遺伝子療法に関する上述の方法は、患者に、例えば、当該患者のサイトカイン及び／またはケモカインの産生を低下させることにより、炎症反応のレベルを低下させるために、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒシグナル伝達経路及び／もしくはＮＣｏＲ２／ＳＭＲＴ脱アセチル化経路の阻害剤とともに、一連のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与することもまた含む。プレドニゾロンまたはプレドニゾンを遺伝子療法とともに同時投与する例示的な方法は例えば、その内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０６９９４２号に記載されている。

いくつかの実施形態では、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子）を投与する前に、ヒト患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばＡＡＶ粒子）が患者に投与される前に、約１週間、または約１もしくは２日間投与される。いくつかの実施形態では、一連のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばＡＡＶ粒子）が投与される前に、約１週間から、または約１もしくは２日から投与が開始され、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばＡＡＶ粒子）の投与後も継続される。

いくつかの実施形態では、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子）を投与するときに、ヒト対象に同時投与される。例えば、いくつかの実施形態では、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、例えば、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばＡＡＶ粒子）の投与の直前または直後に、同日に投与される。いくつかの実施形態では、一連のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばＡＡＶ粒子）が投与されると同日に投与され、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばＡＡＶ粒子）の投与後も継続される。

いくつかの実施形態では、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子）が投与された後に患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）はまず、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばＡＡＶ粒子）が患者に投与された１または２日後に投与される。

コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、（静脈内投与も可能であるものの）経口投与される低分子薬剤であるため、本文脈では「同時投与」とは必ずしも、単一の溶液が両方の薬剤を含有する必要がないことに留意すべきである。

いくつかの実施形態では、一連のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、少なくとも２週間、例えば毎日、または２日に１回の期間にわたって、患者に投与される。いくつかの実施形態では、一連のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、少なくとも３週間の期間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）の用量は経過中に低下する。例えば、一実施形態では、過程は、１日当たり約６０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）の投与で開始し、過程が進行するにつれ低下する。

一実施形態では、過程は、過程の第１週の間に、ヒト患者に１日当たり約６０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、過程の第２週の間に、患者に１日当たり約４０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、及び、ＡＡＶ粒子の注入直後の第３週の間に、患者に１日当たり約３０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、過程は、第３週の後に、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を漸減投与すること、例えば、漸減用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与することを含む。一実施形態では、漸減用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、１日当たり約２０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）、１日当たり約１５ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）、１日当たり約１０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）、及び、１日当たり約５ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）の用量を連続して投与すること（例えば、各濃度における１つ以上の用量）を含む。

一実施形態では、漸減用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）の最初の過程の完了（例えば直）後の連続した５日間、患者に１日当たり約２０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、患者に２０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）が投与された５日間の（例えば直）後の連続した３日間、患者に１日当たり約１５ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、患者に１５ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）が投与された３日間の（例えば直）後の連続した３日間、患者に１日当たり約１０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、及び、患者に１０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）が投与された３日間の（例えば直）後の連続した３日間、患者に１日当たり約５ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与することを含む。

一実施形態では、漸減用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）は、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）の最初の過程の完了直後の連続した７日間、患者に１日当たり約３０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、患者に３０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）が投与された７日間の直後の連続した７日間、患者に１日当たり約２０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、ヒト対象に２０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）が投与された７日間の直後の連続した５日間、患者に１日当たり約１５ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、患者に１５ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）が投与された５日間の直後の連続した５日間、患者に１日当たり約１０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与すること、及び、患者に１０ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）が投与された５日間の直後の連続した５日間、患者に１日当たり約５ｍｇのコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、患者に投与される漸減用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）の長さは、例えば、導入遺伝子の発現の低下、発現した治療用タンパク質の活性における発現の低下、または、肝酵素での増加により示されるように、患者が依然として、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）の最初の過程の終了時に肝炎の徴候を示しているか否かに基づき決定される。

いくつかの実施形態では、患者における肝酵素の濃度の増加は、対象における肝炎を示す。例えば、いくつかの実施形態では、患者における肝酵素の濃度は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクター（例えばＡＡＶ粒子）の投与後に監視され、肝酵素の濃度の増加が検出された（例えば、ベクター投与前、または、ベクター投与直後における、患者の肝酵素の基準濃度と比較して、肝酵素の量の閾値増加を超える）場合、患者には、一連のプレドニゾロンまたはプレドニゾンが投与される。コルチコステロイドをウイルスベースの遺伝子療法ベクターと同時投与するための様々なレジメンの詳細については、その内容が、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれている、２０１９年７月１９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／４１８０２号を参照されたい。

トシリズマブによるコルチコステロイド節約に関する臨床的証拠を考慮すると、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ経路阻害剤及び低用量のコルチコステロイドレジメンを投与することを含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり３０ｍｇ以下の用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり２５ｍｇ以下の用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり２０ｍｇ以下の用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１５ｍｇ以下の用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１０ｍｇ以下の用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり７．５ｍｇ以下の用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり５ｍｇ以下の用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり２．５ｍｇ以下の用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１ｍｇ～１日当たり３０ｍｇの用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１ｍｇ～１日当たり２０ｍｇの用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。

いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１ｍｇ～１日当たり１５ｍｇの用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１ｍｇ～１日当たり１０ｍｇの用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１ｍｇ～１日当たり７．５ｍｇの用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１ｍｇ～１日当たり５ｍｇの用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり１ｍｇ～１日当たり３０ｍｇの用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。いくつかの実施形態では、低用量コルチコステロイド療法は、１日当たり、約１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、７．５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、または３０ｍｇの用量のコルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはプレドニゾン）を含む。

上述に記載したのと同様に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ経路阻害剤を投与したときに、最初に低用量コルチコステロイド、続いて、用量の低下、及び／または用量の漸減の過程を含む。いくつかの実施形態では、さらに低用量を、長時間にわたり投与する。しかし、いくつかの実施形態では、さらなる低用量は毎日ではなく、むしろ２日に１回、３日に１回、週に２回、週に１回、２週に１回、月に１回、３ヶ月に１回、半年に１回、年に１回などで投与される。いくつかの実施形態では、低用量のコルチコステロイドは、オンデマンド様式で投与される。

好適な患者を特定する方法
一態様では、本開示は、投与後に遺伝子療法ベクターの持続的な発現を促進するまたは確実にするウイルスベースの遺伝子療法による、患者の治療方法に関する。方法は、（ｉ）ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を患者が有するか否かを評価すること、及び、（ｉｉ）インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を患者が有するか否かを評価すること、の一方または両方により、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが当該患者に割り当てられる。

一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することは、例えば、患者から生体サンプルを入手することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによる、持続する感染に対する感度の増加と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２またはＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、当該患者が有するか否かを判定することと、生体サンプルで表現型アッセイを行い、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２またはＩＬ－６Ｒ遺伝子に当該患者が変異を有するか否かを判定することと、を含む。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型は、ＩＬ－６Ｒハプロ欠損を引き起こす患者のＩＬ－６Ｒ遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける変異を含む。一実施形態では、患者のＩＬ－６Ｒ遺伝子の少なくとも１つのコピーにおける変異は、ＩＬ－６Ｒ遺伝子におけるミスセンス変異である。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターは血清型８ＡＡＶ（ＡＡＶ８）ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドを含み、治療用タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも１０ＣＧのジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質をコードする核酸配列は、少なくとも２５ＣＧのジヌクレオチド、少なくとも３０ＣＧのジヌクレオチド、少なくとも３５ＣＧのジヌクレオチド、少なくとも４０ＣＧのジヌクレオチド、少なくとも５０ＣＧのジヌクレオチド、または、これらの数値のいずれか２つの間の、任意の他の数のＣＧのジヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、患者は血友病Ａを有し、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。一実施形態では、コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインが欠失された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、核酸配列ＣＳ０４を含む。一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、核酸配列ＣＳ０４＋ＮＧ５＋Ｘ５を含む。

いくつかの実施形態では、患者は血友病Ｂを有し、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする。一実施形態では、コードされた第ＩＸ因子ポリペプチドは、野生型第ＩＸ因子配列と比較して、Ｒ３３８Ｌアミノ酸変化を有する。一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする第ＩＸ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＩＸ因子ポリヌクレオチドは核酸配列ＣＳ０６を含む。

本開示の別の態様では、ウイルスベースの遺伝子療法による、患者の治療方法は、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。患者が、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが当該患者に投与される。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することは、例えば、患者から生体サンプルを入手することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによる、持続する感染に対する感度の増加と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、当該患者が有するか否かを判定することと、生体サンプルで表現型アッセイを行い、ＩＬ－６Ｒ遺伝子に当該患者が変異を有するか否かを判定することと、を含む。

本開示の別の態様では、ウイルスベースの遺伝子療法による、患者の治療方法は、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。患者が、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが当該患者に投与される。

いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することは、例えば、患者から生体サンプルを入手することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによる、持続する感染に対する感度の増加と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、当該患者が有するか否かを判定することと、生体サンプルで表現型アッセイを行い、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子に当該患者が変異を有するか否かを判定することと、を含む。

いくつかの実施形態では、患者は血友病Ａを有し、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。一実施形態では、治療用タンパク質は第ＶＩＩＩ因子を含む。一実施形態では、治療用タンパク質は第ＶＩＩＩ因子バイパス複合体を含む。一実施形態では、コードされた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインが欠失された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、核酸配列ＣＳ０４を含む。一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、核酸配列ＣＳ０４＋ＮＧ５＋Ｘ５を含む。

いくつかの実施形態では、患者は血友病Ｂを有し、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする。一実施形態では、治療用タンパク質は第ＩＸ因子を含む。一実施形態では、コードされた第ＩＸ因子ポリペプチドは、野生型第ＩＸ因子配列と比較して、Ｒ３３８Ｌアミノ酸変化を有する。一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターは、第ＩＸ因子ポリペプチドをコードする第ＩＸ因子ポリヌクレオチドを含み、第ＩＸ因子ポリヌクレオチドは核酸配列ＣＳ０６を含む。

本開示の別の態様では、患者における、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療方法は、（ｉ）ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、当該患者が有するか否かを評価すること、及び、（ｉｉ）インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、当該患者が有するか否かを評価すること、の一方または両方により、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが当該患者に投与される。ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異、のいずれもまたはいずれかを患者が有しない場合、酵素活性を有する治療用タンパク質を当該患者に投与する。

本開示の別の態様では、患者における、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療方法は、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。患者が、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが当該患者に投与される。患者が、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を有しない場合、酵素活性を有する治療用タンパク質を当該患者に投与する。

一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することは、例えば、患者から生体サンプルを入手することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによる、持続する感染に対する感度の増加と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、当該患者が有するか否かを判定することと、生体サンプルで表現型アッセイを行い、ＩＬ－６Ｒ遺伝子に当該患者が変異を有するか否かを判定することと、を含む。

本開示の別の態様では、患者における、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療方法は、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。患者が、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異のいずれかを有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが当該患者に投与される。患者が、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を有しない場合、酵素活性を有する治療用タンパク質を当該患者に投与する。

一実施形態では、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することは、例えば、患者から生体サンプルを入手することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによる、持続する感染に対する感度の増加と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、当該患者が有するか否かを判定することと、生体サンプルで表現型アッセイを行い、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子に当該患者が変異を有するか否かを判定することと、を含む。

本開示の別の態様では、ウイルスベースの遺伝子療法を患者に割り当てる方法は、（ｉ）ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価すること、及び、（ｉｉ）インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価すること、の一方または両方により、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法を当該患者に割り当てる。

本開示の別の態様では、ウイルスベースの遺伝子療法を患者に割り当てる方法は、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。患者が、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法を当該患者に割り当てる。

本開示の別の態様では、ウイルスベースの遺伝子療法を患者に割り当てる方法は、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。患者が、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法を当該患者に割り当てる。

本開示の別の態様では、患者に、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患用の治療を割り当てる方法は、（ｉ）ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価すること、及び、（ｉｉ）インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価すること、の一方または両方により、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法を当該患者に割り当てる。ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異、のいずれもまたはいずれかを患者が有しない場合、酵素活性を有するポリペプチドを投与することによる治療を当該患者に割り当てる。

本開示の別の態様では、患者に、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患用の治療を割り当てる方法は、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。患者が、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法を当該患者に割り当てる。患者が、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を有しない場合、酵素活性を有するポリペプチドを投与することによる治療を当該患者に割り当てる。

本開示の別の態様では、患者に、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患用の治療を割り当てる方法は、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を当該患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該患者を増感させる遺伝子型を、当該患者が有するか否かを判定することを含む。患者が、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異のいずれかを有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法を当該患者に割り当てる。患者が、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を有しない場合、酵素活性を有するポリペプチドを投与することによる治療を当該患者に割り当てる。

実施例１－アデノ随伴ウイルス血清型８第ＩＸ因子（ＡＡＶ８－ＦＩＸ）遺伝子療法で治療した患者の全エクソームシーケンシングは、持続した導入遺伝子発現の潜在的な決定因子を明らかにする
血友病Ｂの患者における、ＦＩＸ遺伝子療法の安全性及び動態を、第Ｉ／ＩＩ相臨床治験で研究し、ＦＩＸ活性レベル及び出血速度への治療の影響を評価し、患者を監視した。

第Ｉ／ＩＩ相の前向き・多中心・非盲検ＦｉｒｓｔｉｎＨｕｍａｎ研究（ＮＣＴ０１６８７６０８）にて、非無作為化（非標識単群研究）・単回投与漸増設計を用い、血友病Ｂの患者における、ＦＩＸ遺伝子治療構築物ＦＩＸＰａｕｄａ遺伝子療法の安全性及び動態を評価した。本研究は、医薬品の臨床試験の実施の基準（ＧｏｏｄＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ）の規格、及びヘルシンキ宣言の原理に従い実施した。倫理的認可は、全ての臨床現場の施設内治験審査委員会から得た。研究手順は、アメリカ国立衛生研究所の組み換えＤＮＡ諮問委員会、アメリカ食品医薬品局、及び、アメリカ国立心肺血液研究所により確認された。研究準備及び全エクソームシーケンシングのための、書面にされたインフォームドコンセントが、全患者から提供された。

研究は、血友病Ｂの男性患者（１８～７５歳の年齢）（ＦＩＸ≦２％；最初のコホートに対しては＜１％）、外因性ＦＩＸ濃縮物への１５０日を超える曝露、及び、ＦＩＸの交換を必要とする、１年当たり３回を超える出血または出血を防止するためのＦＩＸ予防の規則的な使用のいずれか一方を含んだ。肝疾患、肝炎もしくは制御が不十分なＨＩＶによる活性のウイルス感染症、または、ＡＡＶ８に対する中和抗体（抗体力価が＜１：５）のエビデンスを有する場合に、患者を除外した（適格性基準の完全なリストに関しては、表３を参照されたい）。的確な患者を、２０１３年１月から２０１６年７月の間に登録し、スクリーニングに通した（血清、サイトカイン、ＡＡＶ８及びＡＡＶ２ＮＡｂ、及び、抗原特異的ＩＦＮ－γ酵素結合イムノスポット［ＥＬＩＳＰＯＴ］アッセイに対する方法論の詳細を含む、実験スクリーニング評価の完全なリストについては追加のマテリアル［表Ｓ２］を参照されたい）。

（表３）研究の選択基準及び除外基準

ＦＩＸ遺伝子療法発現カセットは、ＡＡＶ由来の反転末端反復（ＩＴＲ）、肝臓特異的トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター／エンハンサー、及び、機能亢進ＦＩＸ（Ｒ３３８Ｌ）Ｐａｕｄａバリアントに隣接する自己相補性導入遺伝子で構成された（図１）。グッドマニュファクチャリングプラクティスのＦＩＸ遺伝子治療構築物を、ＷＡＶＥバイオリアクターシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）で増殖する懸濁ＨＥＫ２９３細胞の３重プラスミドトランスフェクションプロトコルを使用して、ノースカロライナ州大学のＣｈａｐｅｌＨｉｌｌＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ（ＵＮＣ）のベクターコア施設にて製造した。ベクター力価をＱ－ＰＣＲ及びドットプロットアッセイにより測定した。

登録した患者を、３つの投与漸増コホート：１）２．０×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ；２）１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ；３）３．０×１０１２ｖｇ／ｋｇのうちの１つにて、ＦＩＸ遺伝子治療構築物の単回静脈内注入を受けるように割り当てた。患者には、研究中に必要に応じて、標準的なケア血友病Ｂ治療（出血の発症及び／または予防のオンデマンド治療のための、外因性ＦＩＸタンパク質を含む）を受けさせた。

主たるアウトカムの測定は、用量コホートによる有害事象の評価、及び基準からの実験室評価の変化であった。二次アウトカムの測定には、体液（血液、唾液、尿、大便、及び***）において減少するベクターの監視、加えて、注入後の特定の時点における、全身性ＩＲ（体液性、及び細胞性）の、ＦＩＸＰａｕｄａ（Ｒ３３８Ｌ）導入遺伝子生成物への、及び、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質への評価を含んだ。ｗｔＦＩＸ及びＦＩＸＰａｕｄａに対するＩｇ抗体の結合もまた、アッセイした。さらに、血液中での、循環腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）及びインターロイキン－６（ＩＬ－６）の濃度を、ＦＩＸ遺伝子治療構築物注入（追加の材料にてさらに詳述）の前、及び２４時間後に測定した。

二次的な有効性アウトカムは、注入前基準からの、ＦＩＸ活性及びＦＩＸタンパク質濃度の変化を含んだ。ＦＩＸ活性を、中央実験室（Ｅｓｏｔｅｒｉｘ，Ｉｎｃ．Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）にて行われる、ＳｉｅｍｅｎｓＢＣＳ－ＸＰ自動分析器、及び、ａＰＴＴアクティベーターとしてのエラグ酸を使用して、標準的な１段階ＦＩＸ活性アッセイで測定した。このアッセイは、ベセスタ阻害剤アッセイに基づいても行い、これを使用して、ｗｔＦＩＸ含有血漿、及び、ＦＩＸＰａｕｄａ含有血漿における凝固阻害を調査した。導入遺伝子生成物特異的ＥＬＩＳＡを開発して、患者の血漿のサンプル由来のＦＩＸＰａｕｄａタンパク質を定量化することは、以前に説明した。出血の発症頻度及び深刻度、ならびに、研究中での、外因性ＦＩＸ生成物の使用もまた、研究前１２ヶ月の期間で収集したデータと比較した。

ＨｕｍａｎＬｕｍｉｎｅｘキットを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりカスタム設計した。キットは、アッセイに対する規格としての、対応する検体のすぐに使えるカクテルを提供した。アッセイを、メーカーのプロトコルに従い行った。簡単に言うと、規格を２５０μＬの脱イオン水で再構築し、全サイトカインに対して１００００ｐｇ／ｍＬの濃度を得た。バイアルを混合のために複数回反転し、使用するまで氷上で保管した。品質管理（低及び高）はキットの構成要素であり、それぞれの品質管理範囲は、メーカーにより提供された。２つの品質管理（低及び高）を、２５０μＬの脱イオン水（低及び高）で再構築した。サンプルを、懸濁アレイ多重システム（Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ（登録商標）２００Ｓｙｓｔｅｍ，ＢｉｏＲａｄ（登録商標））で測定した。以下のパラメーターを分析した：サイトカイン（インターフェロン［ＩＦＮ］ａ２、ＩＦＮγ、インターロイキン［ＩＬ］－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８単核細胞化学遊走因子タンパク質－１［ＭＣＰ－１］、マクロファージ炎症性タンパク質－１ａ［ＭＩＰ－１ａ］、腫瘍壊死因子ａ［ＴＮＦａ］、トランスフォーミング増殖因子－βＩ［ＴＧＦ－βＩ］、可溶性ＣＤ４０リガンド［ｓＣＤ４０Ｌ］及びインターフェロンγ誘導タンパク質１０［ＩＰ－１０］）；肝臓パラメーター（γ－グルタミルトランスフェラーゼ［ＧＧＴ］、アルカリホスファターゼ、鉄、フェリチン、全タンパク質、アルブミン、ａ－１グロブリン、ａ－２－グロブリン、β－グロブリン、β－１グロブリン、β－２グロブリン、γ－グロブリン、ａ－１－フェトプロテイン、及びＣ反応性タンパク質［ＣＲＰ］）。

Ｃ５７ＢＬ６マウス（チャールズリバーラボラトリー）を、４×１０１２ｖｇ／ｋｇを使用して、ＦＩＸ遺伝子治療構築物ベクター、及び、次世代ＣｐＧ枯渇ベクターで免疫付与した。抗原投与の４週間後に、マウスに適合した、上述の中和抗体アッセイを使用して、抗ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）を評価した。

何名かの患者での導入遺伝子発現の喪失を調査する、根本的原因の分析は、ＣｐＧリッチＡＡＶ８ベクターと、ＣｐＧ枯渇したＡＡＶ８ベクターを注入したマウスにおける、ＡＡＶ８中和抗体力価（Ｎａｂ）の比較を含んだ。

ＡＡＶ８及びＡＡＶ２に対する、中和Ａｂのアッセイ（インビトロ形質導入阻害アッセイ）
血清を、スクリーニング中、及び、その後の規則的なＦＩＸ遺伝子治療構築物注入における、ＡＡＶ８キャプシドに対する中和抗体（ＮＡｂ）の存在についてアッセイした。各時点において、ＡＡＶ２に対するＮＡｂもまたアッセイした。ヒトはＡＡＶ２の自然宿主であり、スクリーニングした約半分の成人が、以前から存在する抗ＡＡＶ２Ｎａｂを有することが予想された。以前に記載したとおりに、インビトロ形質導入阻害アッセイを使用し、研究対象に由来する血清が、ＡＡＶにより、細胞培養液中でのルシフェラーゼマーカー遺伝子移動を阻害する能力についてアッセイした。対象血清の連続２倍希釈液に、ＡＡＶ・ルシフェラーゼを１：１で混合し、３７℃で２時間インキュベートし、その後、これを使用して、組織培養液中で、（ＡＡＶ２及びＡＡＶ８の両方による感染を受ける）Ｈｕｈ７細胞を感染させた。感染から２４時間後に、ルシフェリンを、発現したルシフェラーゼ、及び、照度計により定量化されたルシフェラーゼ活性に対する基質として細胞に添加した。（血清なしの対照と比較して）≧５０％のルシフェラーゼ活性阻害をもたらした対象の血清の最も高い希釈を、ＮＡｂ力価として記録した。

ＡＡＶ８キャプシド及びＦＩＸＰａｕｄａに対して向けられるＴ細胞応答の評価を、末梢血単核球細胞（末梢血Ｔリンパ球、ＰＢＭＣ）のＩＦＮｙ放出酵素結合イムノスポットアッセイを使用して、基準にて、及びＦＩＸ遺伝子治療構築物注入の後に連続して評価した。配列中で、１０個のアミノ酸までが重複する１５量体ペプチドのライブラリーを生成し（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）て、ＡＡＶ８キャプシドＶＰ１タンパク質の全体まで伸ばし、３つのプールに組織化した（ＡＡＶ８抗原プール１～３）。また、配列中で、１０個のアミノ酸までが重複する１５量体ペプチドのライブラリーを生成し（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）て、ＦＩＸＲ３３８Ｌタンパク質の全体まで伸ばし、２つのプールに組織化した（ＦＩＸＲ３３８Ｌ抗原プール１及び２）。細胞の生存能の陽性対照として、１ｐｇ／ｍＬの終濃度にて、レウコアグルチニン（ｌｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）ＰＨＡ－Ｌを試験した。ポリクローナル活性化の陽性対照として、５ｎｇ／ｍＬＰＭＡ及び２ｍＭイオノマイシンの終濃度にて、ＰＭＡ－イオノマイシンを試験した。各プレートに関して、ＣＭＶ、ＥＢＶ、及びインフルエンザウイルス由来のエピトープのプールを含むＣＥＦ（ＣｅｌｌｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｉｍｉｔｅｄ）を参照対照に対しても行った。完全なリンパ球培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ）を、陰性反応性対照として試験した。細胞培養の予定日に先立ち、マルチウェルプレートを、滅菌したＰＢＳ中で一晩、ヒトＩＦＮｙコーティング抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）でコーティングした。細胞培養の日に、プレートをＰＢＳで洗浄し、完全培地でブロックした。研究対象由来の新鮮なＰＢＭＣを、リンパ球培地中で２×１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調節し、等体積の１００μＬの細胞懸濁液を、抗原（または対照）含有ウェルに添加した。３７℃で１８～２４時間刺激（インキュベーション）した後、細胞培養プレートを洗浄し、ヒトＩＦＮｙＨＲＰ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）でインキュベートし、続いてＡｖｉｄｅｎ－ＨＲＰでインキュベートし、その後ＡＥＣ色素体試薬でインキュベートした。発色を、インキュベーションの５分後に停止し、プレートを乾燥させ、ヒトＩＦＮγ活性化計数を、ＡＩＤＥｌｉｓｐｏｔＲｅａｄｅｒＥＬＲ０３を用いて定量化した。

定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、治療後の研究１日目に、及び、２個の逐次サンプルが検出限界を下回るまで、１週間の間隔で、全血、唾液、***、尿、及び大便中のＦＩＸ遺伝子治療構築物ベクターゲノムを検出した。

書面にされたインフォームドコンセントにより、ＦＩＸ遺伝子治療構築物を受ける８名の患者のゲノムＤＮＡを、全エクソームシーケンシングのために抽出した。研究中、及び４年を超える追跡のために、高レベルのＦＩＸ発現を維持した患者（患者５）を、指標対象として使用した。バリアント分析を行い、指標患者５由来のエクソーム配列を含むＦＩＸ遺伝子治療構築物の注入後に、ＦＩＸ導入遺伝子の維持ができなかった７名の患者由来のエクソーム配列を比較した。ＱＩＡａｍｐＤＳＰＤＮＡＢｌｏｏｄＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＥＤＴＡ処理した全血サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。メーカーの取扱説明書に従い、各サンプルに対して、ＴｒｕＳｅｑＲａｐｉｄＣａｐｔｕｒｅＥｘｏｍｅＬｉｂｒａｒｙｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してエクソーム濃縮を行った。各サンプルに対して、断片化したＤＮＡライブラリーを構築し、１００ｂｐの対形成したエンドモードで、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００シーケンシングプラットフォームを用いて、ハイスループットシーケンシングを行った。塩基当たり１２５～１８０個の読取り値を有する平均シーケンシング深さは、信頼されたバリアント同定のために推奨されるシーケンシング深さを満たした。シーケンシングした読取り値を、Ｂｕｒｒｏｗｓ－ＷｈｅｅｌｅｒＡｌｉｇｎｅｒを用いてＧＲＣｈ３７にアラインした。重複した読取り値は、ＰｉｃａｒｄＴｏｏｌｓ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）でマークした一方、挿入／欠失のリアラインメント及び塩基品質スコアの再較正を、ＧＡＴＫを用いて行った。ＧＡＴＫパッケージ内でＳｎｐＥｆｆツールを用いて、バリアントコーリングを行った。バリアントの優先順位付けを、ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＶａｒｉａｎｔＡｎａｌｙｓｉｓツール（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。患者５の全エクソーム配列と、他の対象の全エクソーム配列とにおける変化を、ヒトゲノムにおける単一ヌクレオチドバリアント及び挿入／欠失の有害性可能性をスコアリングする方法として、ＣｏｍｂｉｎｅｄＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＤｅｐｅｎｄｅｎｔＤｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＣＡＤＤ）を用いて評価した。ＣＡＤＤは、シミュレーションされた変異により自然淘汰を生き延びたバリアントを対比することにより、複数のバリアントアノテーションツールを単一のメトリックに組み込むフレームワークをもたらす。観察される可能性が低い（自然淘汰を生き延びていない）バリアントはより高いスコアを受け、これは、バリアントがどれほど有害であるかに相関する。

適応性抗ＡＡＶ免疫応答を増強可能な、推定される先天性免疫シグナルとしての役割を果たす、ＦＩＸ遺伝子治療構築物ベクター内でのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド配列の可能性を評価するために、コドン最適化ＦＩＸｃＤＮＡを発現するさらなる遺伝子療法ベクターを生成した。これら全てが、同一のＡＡＶ２ＩＴＲ配列に隣接するＦＩＸＰａｕｄａコード配列をパッケージングするｓｃＡＡＶ８ベクターであり、同一のＴＴＲプロモーター／エンハンサー及び転写制御因子により駆動される発現を伴った。ベクターは、以下で詳述するように、ＦＩＸＰａｕｄａ発現カセット内のＣｐＧエレメントの数のみが異なった：ＦＩＸ遺伝子治療構築物において９９個のＣｐＧ；ベクターＯＤＮＯ（Ｂｌｕｅ０２）においてゼロ個のＣｐＧ；ベクターＯＤＮ３において３個のＣｐＧ。さらに、ＧｒａｙＯ１遺伝子配列を、Ｎａｔｈｗａｎｉｅｔａｌ．により報告される、コドン最適化ＦＩＸ遺伝子配列を用いて合成した（Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｏｖｅｌｌｉｖｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｕｍａｎｆａｃｔｏｒＩＸｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｅｎａｂｌｅｈｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅａｎｄｎｏｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｔｅｌｉｖｅｒ．Ｂｌｏｏｄ２００６；１０７：２６５３－６１）。

全ての動物実験は、動物ケア機関及び使用委員会により認可された。動物実験は全て、止血して通常のオスＣ５６Ｂｌ／６マウスで行った。８～１０週齢の年齢で、マウスは、ＦＩＸ遺伝子治療構築物、または、ＣｐＧ減少ｓｃＡＡＶ８ＦＩＸ発現ベクターのうちの１つのいずれかの、４×１０１２ｖｇ／ｋｇの単回尾静脈注射を受けた（ｎ＝６～８匹のマウス／治療群／実験）。ＦＩＸ遺伝子治療構築物の３つの別個の臨床生産ロットを実験した。マウスを、ベクター注入の２６日後に犠牲にした。血液を収集し、適応免疫（抗体産生）が、遺伝子療法ベクター内でのＴＬＲ９リガンドＣｐＧの濃縮によりブーストされたか否かのマーカーとして、抗ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）の形成を調査した。

結果
２０～６９歳の８名の男性（平均［ＳＤ］年齢は３０．５［１５．９８］歳；６／８名が３０歳未満）が、スクリーニングにおける研究参加に適格であり、３つの用量コホートのうちの１つに登録された（図１）。７名の患者がコーカサス人であり、１名が黒人／アフリカ系米国人であった。３名が、ＦＩＸ抗原交差反応性物質（ＣＲＭ）に対して陽性であった。いずれの患者も、活性ＨＩＶまたはＨＣＶの血清学的エビデンスを有しなかった（２名は抗ＨＣＶ抗体を有したが、ＰＣＲにより、全員が活性ＨＣＶＲＮＡに対して陰性であった）。全員が未検出レベルのＡＡＶ８ＮＡｂを有したが、ＡＡＶ２に対するＮＡｂは２名の患者で検出された（それぞれ、力価１：１０、及び１：５）（図１）。ＡＡＶ８に対する循環末梢血単核球（ＰＢＭＣ）応答が、スクリーニング時に７名の患者で検出された。

全身へのＦＩＸ遺伝子治療構築物注入の間、または注入後８時間の期間において、生命徴候または血清／血液学的パラメーターにおける異常は報告されなかった。最も低い用量コホートの１名の患者がグレード１の過敏性反応を有したが、これは３０分以内に回復した。注入が中断した患者はいなかった。血清ＩＬ－６の無症候性上昇が、注入後４～８時間の間に、最も高い用量コホートの１名の患者で報告されたが、注入後２４時間で基準に戻った（図８）。

４つのＳＡＥ：横紋筋融解症、扁桃の細菌感染、扁桃出血、及び、扁桃の扁平上皮細胞癌が、３名の患者で報告された（この最後の事象における説明情報は、追加情報にて提供される）。全てが、ＦＩＸ遺伝子治療構築物とは無関係であるとみなされた。（４名の患者における）１０個のＡＥが、研究治療に関係する可能性があるとみなされた。これらのうち、７つは重症度が軽度であり（倦怠感、顔面紅潮、頭痛、インフルエンザのような症状、足首の腫れ、肝酵素の上昇、及び高血圧）、３つが中度であった（肝酵素の上昇、膿瘍、及び倦怠感）。

ベクターゲノムを尿、***、唾液、大便、及び全血で測定し、ピーク濃度及び減少期間は幅広く、３つのコホートにまたがる用量依存性を示す（表４）。全血の例外はあれど、いずれの患者も、４週間（***、大便）から５週間（唾液、尿）後において、体液の減少を示さなかった。血液からのベクターシグナルは、コホート１及び２で失われたが、最も用量の多いコホートにおいては、１２ヶ月の来診時に検出限界を上回ったままであった。

（表４）体液中でのｗｔＦＩＸベクターゲノムの減少

ＮＲ、未到達

投薬コホートにより体液でＷＴＦＩＸゲノムが検出された、平均日数。最も高い投薬コホートの患者から採取した全血サンプルに関して、ＷＴＦＩＸゲノムは、１２ヶ月の来診時に検出レベルを上回ったままであった。

コホート１で治療した第１の患者の例外はあれど、患者は全員、ベクター由来のｈＦＩＸ発現を示した。これは、最も高い用量コホートにおける、ＦＩＸ遺伝子治療構築物注入の１～２週間後に明らかとなり（図２）、血栓形成性、またはＦＩＸＰａｕｄａへの細胞性及び体液性ＩＲのいずれのエビデンスもなしに生じた。ＦＩＸ遺伝子治療構築物由来のＦＩＸ発現は、用量依存性であった（図２及び３）。平均（範囲）ピークＦＩＸ活性は、コホート１で３．５％（３～４％）、コホート２で１３％（３～２５％）、及びコホート３で４５％（３２～５８％）であった。ピーク発現時において、（野生型ＦＩＸではなく）機能獲得ＦＩＸＰａｕｄａ由来の循環凝固活性は、基準にてＦＩＸＣＲＭ陰性であった患者において、ＦＩＸ特異的活性により示された（図２）。ＦＩＸＰａｕｄａ抗原レベルは、標準的なＦＩＸＥＬＩＳＡアッセイで測定したＦＩＸ抗原レベルではなく、測定したＦＩＸ活性と相関したため、ＦＩＸＰａｕｄａ特異的ＥＬＩＳＡを用いることで、全（ＣＲＭ＋及びＣＲＩＭ－）患者において、導入遺伝子特異的発現が実証された（図２）。

コホート１では、患者２は、４週目に２～３％のＦＩＸ活性を実現し、一時的に予防を中断した。コホート２の４名の患者全員が、著しいレベルのＦＩＸ活性を経験したが、患者間の変動性は相当であった。患者３は、１１週目に１６．９％のピークを有するＦＩＸ活性を示したが、１２週目にＦＩＸ発現の急性喪失を経験し、その後予防治療を再開した。患者４は、約７％の初期ピークＦＩＸ活性レベルを有し、これはその後、６週目と７週目の間に下がった。彼もまた、代償療法を再開した。患者８は、予防コルチコステロイドを受けた。２～３％のＦＩＸ活性は、最初の６ヶ月の間に達成された。患者５は、７週目に約２０％のＦＩＸ活性を達成し、４年を超える追跡の間に活性を維持した唯一の患者であり、出血またはＦＩＸタンパク質注入なしを達成した（図２）。患者３及び患者４の両方が、８０％を超えるピーク発現を急に（約２週間にわたって）喪失したものの、いずれの患者も、肝臓アミノ基転移酵素の増加、ベクターまたは導入遺伝子に応答したＴ細胞の活性化（抗原特異的ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ）、この喪失と同時発生する、ＦＩＸ、またはＦＩＸＰａｕｄａ、または他の症状／実験室摂動に対する、阻害剤または非中和抗体の発達を示さなかった。

最高用量コホートでは、患者６が、６週目までに５８．５％のピークＦＩＸ活性を実現し、これは、ＡＡＶキャプシドが指示するＴ細胞の活性化の増加と一致した。７週目にＦＩＸ活性の急速な低下が生じ、これに、肝臓アミノ基転移酵素の増加及びさらなるＴ細胞の活性化が付随した。プロトコルに従い、プレドニゾンでの治療を７２時間以内に開始すると、肝酵素及びＥＬＩＳＰＯＴ結果の急激な正規化が得られた。ＦＩＸ活性は回復せず、患者は予防ＦＩＸ注入を再開した。患者７は、５週目までに３０％、ＦＩＸ活性が超過した。６週目に、ＦＩＸの急激な喪失と共に、肝酵素のわずかな上昇を経験した後、彼はプレドニゾンを開始したが、ＦＩＸ活性は低下し続けた（図２）。

ピーク因子発現の期間を含む、ＦＩＸ遺伝子治療構築物注入後の１２ヶ月の追跡の間に、外因性ＦＩＸの消費は、前年と比較して減少したようである（ＦＩＸの年換算した使用は、６／８名の患者で減少し、７／８名の患者で、１ヶ月当たりのＦＩＸ注入回数が減少した）。因子消費での最も大きな減少は、最高用量コホートの患者で生じたようであった（図５）。

ベクターに対するＡＡＶ８特異的Ｔ細胞応答
ＡＡＶ８特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、形質導入した肝細胞を殺傷すると考えられる。しかし、最高用量コホートの中の２名の患者のみが、ＡＡＶ８キャプシド反応性Ｔ細胞に対する強力なＥＬＩＳＰＯＴシグナルを有し、これらの知見は、ＡＥを伴わなかった（図２）。コルチコステロイド療法の開始は、患者６におけるＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴの即座の正規化と関連したが、このシグナルは、患者７においては、プレドニゾンの開始後数週間の間上昇したままであった。

患者６及び７におけるＡＬＴ上昇に応答して、ならびに、患者８における予防として開始した、全身コルチコステロイド投与は、これらの患者においてＦＩＸ活性レベルを維持する役割を果たさなかった（図２）。

投薬後に、最大５～８ヶ月にわたり、患者の血漿サンプルの、１８個のサイトカイン、及び１５個の肝臓パラメーターをアッセイすると、患者５の１名のみがなぜ、４年超にわたり選択的に、安定したＦＩＸＰａｕｄａ発現を示したのかについての何らかの、確証的なヒントは明らかとならなかった（データは図示せず）。

ＣｐＧクラスターを有するベクター化した発現カセットは、導入遺伝子発現に負の影響を及ぼし得る、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）を介して自然免疫系を活性化し得る。ＦＩＸ遺伝子治療構築物内のＦＩＸＰａｕｄａ導入遺伝子が９９個のＣｐＧモチーフを含有するため、ＣｐＧジヌクレオチド密度が上昇したＣｐＧアイランドが生じる。この仮説は、自然免疫系のベクター依存性活性化が、ＡＡＶ８に対するＮＡｂの力価を測定することにより間接的に分析された動物モデルで試験した。動物に、ＦＩＸ遺伝子治療構築物、または、ＣｐＧ枯渇ＦＩＸＰａｕｄａ導入遺伝子を有するＦＩＸ遺伝子治療構築物様構築物を抗原投与したとき、ＡＡＶ８に対するＮＡｂ力価は、ＦＩＸ遺伝子治療構築物で治療した動物において増加した（図４）。ＣｐＧモチーフの数が増加することにより実際、ベクターにより標的化された適応免疫を増強可能な先天性免疫シグナル伝達を駆動することができることを、これらのデータは示唆している。

ベクターの潜在的な免疫原性がどのように、患者５の安定した発現に変換されたのかを理解するために、遺伝変化が患者５の、示された長期間の導入遺伝子発現を容易にする抗ＡＡＶ８免疫応答をマウントできないことに寄与した可能性があるという仮説が立てられた。したがって、全エクソームシーケンシングによる、全患者のゲノムのコード領域内での潜在的な遺伝変化を調査した。

同定されたバリアントを、同定された遺伝子、変異内での、既知のバリアントの表現型の出現についての以前の知識に基づき、加えて、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ－２、及び、ＣｏｍｂｉｎｅｄＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＤｅｐｅｎｄｅｎｔＤｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＣＡＤＤ）アルゴリズム値に従い、評価した。３つの方法は全て、ヒトゲノムでの単一ヌクレオチドバリアント及び挿入／欠失の有害性を予言する。患者５のゲノムに固有のホモ接合遺伝子バリアントは存在しなかったものの、いくつかの固有のヘテロ接合及び化合物ヘテロ接合バリアントが発見された（図９）。現在の知識に基づき、本明細書に記載の、同定されたバリアントのうちの２つは、潜在的に、より高い確率で、導入遺伝子発現に影響を及ぼし得る（図２）。

一方は、化合物ヘテロ接合遺伝子バリアントであり、これは、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２（「レチノイドまたは甲状腺ホルモン受容体２／核内受容体同時抑制因子２のサイレンシング媒介因子」）遺伝子の両方の対立遺伝子における複製、具体的には、ｐ．Ｑ５０８－５０９ｄｕｐ、及びｐ．Ｑ５０７－５０９ｄｕｐを伴う。同定したバリアントのＣＡＤＤスコアは、有害性の中度のリスクを示した（図２及び９）。ＳＭＲＴ／ＮＣｏＲ２は、核内受容体同時抑制因子複合体の形成に必要であり、これは、一般的なクロマチン修飾酵素の動員による中度の転写サイレンシングに対する部位特異的転写因子との相互作用により、一連の標的遺伝子に動員される。

エクソームシーケンシングにより同定された別のバリアントは、インターロイキン－６に対する受容体をコードするＩＬ－６Ｒ遺伝子内での、ヘテロ接合ミスセンス変異バリアントｃ．３４４Ａ＞Ｃ、ｐ．Ａ１１５Ｅであった。ＩＬ－６結合ドメイン内で、グルタミン酸塩をアラニンで置換することにより、２６．１のＣＡＤＤスコアが生成され、これは、ＩＬ－６受容体機能に対する有害性の確率が非常に高いことの特徴である（図２及び９）。さらに、ヒト及びマウスにおけるＩＬ－６Ｒのハプロ不全は以前に記録されており、このことは、患者５で同定された遺伝変化が、高負荷のＡＡＶ８キャプシドにより引き起こされる、ＩＬ－６が媒介する炎症性ストレスに対する感度を下げ、標的化された肝細胞を、ストレス誘発性の死から守る可能性があることを示唆している。

血友病Ｂの８名の成人男性患者の、この第Ｉ／ＩＩ相臨床用量漸増研究において、ＡＡＶ８ベースのＦＩＸＰａｕｄａＦＩＸ遺伝子治療構築物遺伝子療法は、患者全員で十分に耐容性を示した。１年間の研究の間、またはその後の追跡の間に、著しい、注入に関連する安全性異常、またはその後の安全性異常はなく、阻害剤または他のＦＩＸＰａｕｄａにより指示される免疫による血栓症及びエビデンスも存在しなかった。免疫原性のＡＡＶ非含有キャプシド汚染物質を減少させるように設計された、ＦＩＸ遺伝子治療構築物ベクター構築物による治療は、８名の患者のうち７名において、コドン最適化ＦＩＸＰａｕｄａ遺伝子の形質導入の成功、及びＦＩＸ発現の増加をもたらした。ＦＩＸ遺伝子治療構築物の投与は、ＦＩＸＰａｕｄａ特異的ＥＬＩＳＡにより示されるように、導入遺伝子生成物の発現により明確に引き起こされる、ピークＦＩＸ：Ｃ活性における用量依存性の増加と関連した。ＦＩＸ遺伝子治療構築物遺伝子療法の後での、患者における機能的ＦＩＸＰａｕｄａ発現により、因子消費の低下がもたらされ、これは、動物研究、及び、異なるＡＡＶ８ベースのＦＩＸＰａｕｄａ因子を受ける、血友病Ｂの患者におけるこの実現と一致した。

１名の患者は、出血を伴う、または４年超にわたるＦＩＸ代償療法を用いることなく、約２０％の治療ＦＩＸ活性を有するＦＩＸ発現の持続を実現した。しかし、ＦＩＸ活性は、測定可能なＦＩＸＰａｕｄａ発現を伴う他の患者においては、５～１１週を超えて維持されなかった。

多くの場合、（患者６の結果により例示されるように）肝酵素の上昇が付随する、注入後の最初の数ヶ月以内での、導入遺伝子発現レベルの急速な喪失は、他のＡＡＶベクター血友病遺伝子療法治験でもまた報告されている。遺伝子発現の急速な喪失と一致する、この臨床上の無症候性肝毒性（自己免疫肝炎に類似する）は、ベクター用量依存性の、キャプシドにより指示される細胞ＩＲに属している。実際、最も強いＥＬＩＳＰＯＴ及びアミノ基転移酵素シグナルを、本研究の最高用量コホートで測定すると、以前の治験から明らかな、ベクター用量との関係を支持する。

キャプシドにより指示される、ＦＩＸ発現を制限する適応性ＩＲが免疫抑制により管理され得る、他のＡＡＶＦＩＸ遺伝子療法研究とは対照的に、ＦＩＸ活性は、本研究では、コルチコステロイド予防または動員により維持されることができない。フィラデルフィアの小児病院での、ＡＡＶ８ＦＩＸ遺伝子療法研究でも同様に、免疫抑制により同院不可能なベクターキャプシドＩＲを有する３名の患者が報告され、ＡＬＴ正規化と、ステロイド免疫抑制と、因子発現の安定化との明確な関係は、血友病のＡＡＶ遺伝子療法を受ける患者全員において、示されていなかった。

ＦＩＸ遺伝子治療構築物によるＦＩＸ発現の免疫原性喪失に対する代わりの説明を調査するために行った分析では、マウスで刺激されたＮＡｂ力価から、ＮＡｂ力価が下がると、ＦＩＸ遺伝子治療構築物と比較して、ＣｐＧが低下したベクター構築物に対する応答が発生したため、（コドン最適化により導入された）ＦＩＸ遺伝子治療構築物中でのＦＩＸｃＤＮＡコード配列の、最も高いＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）含有量が、ベクターの免疫原性の増加に寄与し得るというエビデンスがもたらされた。肝臓に向けられるＡＡＶ遺伝子療法の動物モデルは、臨床的に観察されるＡＡＶに対して向けられるＣＴＬＩＲを予想または再生産せず、これにより、これらの応答のモデリングが難しくなる。したがって、同様のＦＩＸ発現ベクターの比較免疫原性を評価するための、これらのモデルの妥当性は、不明瞭である。

ＴＬＲ９を介するＰＡＭＰシグナル伝達として、先天性ＩＰを刺激するＣｐＧの免疫原性を示す確固たるエビデンスが存在し、これは次いで、強力な適応性ＩＲの発達を補助する。この知識は、トランスジェニックＤＮＡワクチンの開発に応用されており、ここでは、ＣｐＧＯＤＮモチーフが配列に計画的に遺伝子操作され、アジュバント効果が付与された。さらに、ＡＡＶベクターは、ＴＬＲ９－ＭｙＤ８８経路により、先天性免疫シグナル伝達を上方制御し、適応性ＩＲを開始することが示されている。自然免疫系の活性化及びＡＡＶ抗原提示は、ＡＡＶベクター投与の直後に生じるものと考えられているものの、初代ヒト肝細胞、及びヒトキメラマウスモデルにおける近年の研究では、ＡＡＶ形質導入を加速させるために活性化可能なＩＦＮ－βを介して、長期間のＡＡＶ形質導入が後の初期ＩＲをトリガーするメカニズムが示された。まとめると、このエビデンスは、ＣｐＧ濃縮されたＦＩＸ遺伝子治療構築物ベクターは、ベクター標的化適応免疫を増強し、観察されるＦＩＸ発現の急速な喪失を引き起こすことが可能な先天性免疫シグナル伝達を駆動可能であることを示唆している。ＴＬＲ９を介する、ＣｐＧＯＤＮにより刺激される先天性免疫シグナル伝達は、ＣｐＧ－ＯＤＮ含有量が少ない、他のＡＡＶＦＩＸＰａｕｄａベクターと比較して、よりロバストな様式で、ＡＡＶに対する適応免疫を開始し維持することが予想され得る。

本研究での、（ＰＢＭＣのＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴにより測定される）抗ＡＡＶＣＴＬ活性化の高トランスアミナーゼ血症またはエビデンスは、特に低用量コホートにおいて、常にＦＩＸ活性の喪失を予想するとは限らないが、肝臓に局在化するベクターに対する、比較的弱いＩＲは、常に末梢血のアッセイで検出可能であるわけでもない場合がある。最高用量のＦＩＸ遺伝子治療構築物を受ける患者６の、６週目における５８．５％の活性のＦＩＸ発現ピークの急激な喪失は、ＡＡＶ８に対して反応性である肝酵素及びＰＢＭＣの増加と一致した。

自然免疫系活性化の指標としての、ＩＬ－６の一過性の上昇は、ｓｃＡＡＶベクターをマウスの肝臓に注入した後で、ＮＦ－κＢのＴＬＲ９依存性の活性化、及び、一過性のプロ炎症性サイトカイン導入をマッピングする２つの異なる研究にて記載されていた。ヒトにおける先天性免疫応答をトリガーするＦＩＸ遺伝子治療構築物の、直接的な実験エビデンスは得られなかったものの、配列分析により同定された、患者５のＩＬ－６Ｒ遺伝子におけるバリアントは、この患者が、ＩＬ－６により駆動される先天性免疫シグナル伝達の影響をさほど受けないことを示唆している。患者５で同定された具体的なｐ．Ａ１１５Ｅバリアントは研究されていないが、低下した機能と関連する、非同義的なＩＬ－６ＲＳＮＰの先例が存在する。微小な対立遺伝子バリアントであるＩＬ－６Ｒ３５８Ａｌａの発現は特に、細胞表面ＩＬ－６Ｒ発現の低下、ＩＬ－６シグナル伝達に対する感度の低下、ならびに、関節リウマチ、１型糖尿病、及び冠状動脈性心疾患を含む、確立された炎症性成分を伴う多数の病状の進行からの保護と関連している。この特異的なＩＬ－６Ｒ（遺伝子）バリアントの例は、患者５は、恒常性条件下では臨床表現型を示し得ないものの、強力な免疫アジュバントと共に提示された場合、免疫応答は不完全となり得るという見解を支持する。さらに、ＩＬ－６を含む炎症性サイトカインは、転写因子ＨＮＦ４ａと、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターとの相互作用の度合いにも影響を及ぼし得、これにより、遺伝子発現を制御する。

現在までに、核内受容体同時抑制因子をコードするＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子の、同定された複合ヘテロ接合体バリアントの臨床的影響についての情報は存在しない。ヒストン脱アセチル化酵素及びメチルトランスフェラーゼなどの、クロマチン全体を修飾する酵素の動員により、標的遺伝子の転写サイレンシングを媒介する核内受容体または同時抑制因子複合体を形成するために、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２は必要である。ＳＭＲＴ複合体はＨＮＦ－４ａと直接相互作用することにより、ＨＮＦ４ａが媒介するＴＴＲプロモーター発現に、潜在的に直接影響を及ぼす。クロマチン化されたエピソームＡＡＶベクターゲノムがヒストン修飾により制御可能であることを考慮すると、オープンクロマチン状態を維持することが、持続的な導入遺伝子発現に寄与するということが妥当である。

まとめると、ＩＬ－６Ｒバリアントは、ＡＡＶに向けられるＩＲのエビデンスがない中で、本患者で固有に観察されるＦＩＸ発現の維持についての、信頼できる可能性のある説明を付与する。この患者では、さらなる研究を保証する、ＡＡＶベースの遺伝子療法の成功における、患者間の変動性の影響もまた強調される。

以前の臨床治験の経験では、ＡＡＶベクターからの発現の持続を主に制限する因子としての、キャプシドに向けられた適応性ＩＲが示唆された。ＦＩＸ遺伝子治療構築物のＣｐＧデオキシリボヌクレオチド含有量により潜在的に駆動される、先天性免疫刺激が、ＡＡＶベクターからの遺伝子発現の喪失において示唆されるのはこれが初めてである。これらの知見は、遺伝子療法のための、ＣｐＧが減少したベクターの開発をもたらし、さらなる臨床研究に重要な示唆を有する。ベクター設計の間に導入された免疫活性化成分の覚度を増加させることだけでなく、先天性免疫を初期に制御することもまた、ベクターの免疫原性を低下させ、ＡＡＶ形質導入の効率を改善するのに役立ち得る。機能障害ＩＬ－６受容体シグナリングと関連することが推定される、患者５における、４年を超える治療ＦＩＸ発現の維持は、どの患者に関連する変数が、現在の遺伝子導入技術の成功を予想する可能性が高いかを理解する必要性もまた、強調する。

ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異、または、ＳＭＲＴ／ＮＯＣＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、のいずれかまたは両方が、ウイルスベースの導入遺伝子ベクターによる、持続性感染に対する患者の感度の増加を示し、また、これらの変異の一方または両方を有する対象が、これらの変異を有しない対象よりも、遺伝子療法により応答性であり得ることを、患者５における遺伝子療法ベクターの持続的な発現は示す。

したがって、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療を必要とする対象の治療計画を決定する前に、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異、または、ＳＭＲＴ／ＮＯＣＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、の一方または両方を対象が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該対象を増感させる遺伝子型を、当該対象が有するか否かを判定するのが有用であり得る。

対象が、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異、または、ＳＭＲＴ／ＮＯＣＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、の一方または両方を有するという判定がされた場合、対象は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該対象を増感させる遺伝子型を有し得、それ故、より高い、ウイルスベースの遺伝子療法の成功確率を有し得る。したがって、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異、または、ＳＭＲＴ／ＮＯＣＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、の一方または両方を有すると判定された対象には、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを用いる遺伝子療法が割り当てられ得る。

他方、対象が、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異、または、ＳＭＲＴ／ＮＯＣＲ２タンパク質機能の低下と関連した、ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異のいずれも有しないと判定された場合、対象は、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して当該対象を増感させる遺伝子型を有し得ず、それ故、ウイルスベースの遺伝子療法の成功確率は比較的低い可能性がある。対象はそれ故、ウイルスベースの遺伝子療法が割り当てられ得ず、代わりに、例えば、対象で欠いている酵素活性を有する治療用タンパク質を投与することによる酵素補充療法などの、代替療法が割り当てられ得る。

実施例２－アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）構築物を含有するＣｐＧの免疫原性の増加は、導入遺伝子発現の低下に寄与し得る
ＡＡＶ８遺伝子療法は、臨床試験で有効性を示した。しかし、導入遺伝子発現の初期における自然な低下が、数名の患者で観察された。抗ＡＡＶ８特異的Ｔ細胞応答は、形質導入した肝細胞を殺傷し、導入遺伝子発現の低下、ならびに、ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの増加をもたらしたという仮説が立てられた。従来、動物モデルは、導入遺伝子発現の自然な低下を示してこず、導入遺伝子活性の低下におけるベクター免疫原性の分析を困難なものとしてきた。したがって、一次ヒト肝細胞を用いるマウスモデル及び３Ｄバイオリアクターモデルを開発し、ＡＡＶ８ベクターの免疫原性を評価した。最初に用いるモデルとして、ベクターの免疫原性への、ヒトＦＩＸ（ｈｕＦＩＸ）ＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ）における免疫活性化ＣｐＧアイランドの影響を評価した。

３Ｄバイオリアクターシステムは、一次ヒト肝細胞を培養するのに最適なシステムである。したがって、これを、体外肝臓支持のために院内で使用した。簡潔に述べると、Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．，１０３（４）：８１７－２７（２００９）、及びＨｏｆｆｍａｎｎＳＡ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．，１０９（１２）：３１７２－８１（２０１２）（その内容が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているように、一次ヒト肝臓細胞をヒトの部分的な肝除去により単離し、－３日目からバイオリアクターで培養した。３日後、即ち０日目にて、例えばクッパー細胞を含む一次肝臓細胞を、９９ＣｐＧアイランドを含有するＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇ構築物、及び、ＣｐＧ非含有のＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌ構築物で処理した。培養を１０日後、即ち１０日目に終了し、次いでサイトカイン産生、肝臓特異的酵素の濃度、及びＦＩＸ遺伝子発現を評価した。

図１７に示すように、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌベクターは、より高い形質導入効果（左パネル）、及びより高いＦＩＸ発現（右パネル）を示す。両方のグラフで、ドナーＡの結果をバーの対の左に示し、ドナーＢの結果をバーの対の右に示す。

さらに、図１８に示すように、Ｔｈ１様サイトカインＩＰ－１０及びＭｉｐ－ｌａの導入の増加は、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌベクターの低い免疫原性を示唆する。図１８は、２つの例示的なドナー：対照バイオリアクター（円）、及びＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇ（正方形）またはＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌ（三角形）で処理したバイオリアクターの、選択したサイトカインの正規化した時間過程を示す。サイトカイン発現は全体的に弱かったが、ＩＰ－１０及びＭｉｐ－ｌａ濃度の上昇が、２～３日目に、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇにより誘発された。

しかし、図１９に示すように、肝細胞のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）パラメーターは、ベクター適用後のバイオリアクター培養の間に、変化しなかった。図１９は、細胞シーディング後の、ＡＳＴ及びＡＬＴの時間過程：感染なしの対照（円）、及び、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇ（正方形）またはＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌ（三角形）で感染した対照を示す。ウイルス粒子を、２４時間適用した（０日目～１日目）。

この現象をインビボでさらに調査するために、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇ及びＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌベクターの比較免疫原性評価を、マウスで行った。先天性免疫活性化により、抗ＡＡＶ８結合（ＢＡＢ）及び中和抗体（ＮＡＢ）が誘発できる能力を、読み出しとして使用した。ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌベクターは、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇベクターよりも低い免疫原性を有することが発見された。具体的には、図２０は、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｃｐｇベクターが、ＡＡＶ８－ｈｕＦＩＸ－ｎｕｌｌベクターよりも高い、抗ＡＡＶ８ＢＡＢ（左パネル）及びＮＡｂ（右パネル）応答を誘発したことを示す。このことは、ＣｐＧによるＴＬＲ９経路のより強力な活性化を示唆する。

まとめると、これらの結果は、ＣｐＧリッチＡＡＶ８－ＦＩＸ構築物は、免疫系をより活性化する傾向にあり、ＡＡＶ８ベクターで処理した数名の患者で観察された導入遺伝子発現の低下に寄与し得たことを示唆している。

上述の例は、当業者に、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態を作製して用いるかについての完全な開示及び説明を行うために提供され、発明者らが発明として認識するものの範囲を限定することを意図するものではない。当業者には自明である、本発明を実施するための上述のモデルの変更は、以下の特許請求の範囲内であると意図される。明細書内で述べられている全ての特許出願及び刊行物は、本発明が関係する当業者の技術のレベルを示している。本開示で引用される全ての参考文献は、各参考文献がその全体が個別に参照により組み込まれた場合と同じ程度に、参照により組み込まれる。

全ての見出し及び章の表記は、明確性及び参照のためだけに用いられ、いかなる方法でも限定を行うものとみなされるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載する本発明の趣旨及び範囲に従い、異なる見出し及び章での様々な態様を組み合わせることの有用性が適切であると理解するであろう。

本明細書で引用される全ての参考文献は、各個別の刊行物又は特許又は特許出願が、全体として、あらゆる目的のために、参照により組み込まれるように特異的かつ個別に示された場合と同一の程度に、その全体があらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。

本出願の多くの修正及び変形は、当業者には明らかであるように、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載する特定の実施形態及び実施例は、単に例として提供され、出願は、添付の特許請求の範囲、加えて、特許請求の範囲の表題が付いた等価物の完全な範囲によってのみ限定されるべきである。

Claims

ウイルスベースの遺伝子療法による、患者を治療するための方法であって、
前記患者に、
（１）インターロイキン－６（ＩＬ６）経路阻害剤と、
（２）ウイルスベースの遺伝子療法ベクターと
を投与する段階
を含む、前記方法。
前記ＩＬ６経路阻害剤が、インターロイキン－６（ＩＬ６）の阻害剤、またはインターロイキン－６受容体（ＩＬ６Ｒ）の阻害剤である、請求項１に記載の方法。
前記ＩＬ６の阻害剤が、抗ＩＬ６モノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
前記抗ＩＬ６モノクローナル抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ、エルシリモマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、ゲリリムズマブ、ＦＭ１０１、ＭＥＤＩ５１１７である、請求項３に記載の方法。
前記ＩＬ６Ｒの阻害剤が、抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
前記抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体が、トシリズマブ、サリルマブ、レビリマブ、ボバリリズマブ、またはサトラリズマブである、請求項５に記載の方法。
前記ＩＬ６経路阻害剤が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路の阻害剤である、請求項１に記載の方法。
前記インターロイキン－６（ＩＬ６）経路阻害剤が、前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターの投与の少なくとも２日前に投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
前記インターロイキン－６（ＩＬ６）経路阻害剤が、前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターの投与後に少なくとも１回投与される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
ウイルスベースの遺伝子療法による、患者を治療するための方法であって、
前記患者に、
（１）ＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴヒストン脱アセチル化経路の阻害剤と、
（２）ウイルスベースの遺伝子療法ベクターと
を投与する段階
を含む、前記方法。
前記ＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴヒストン脱アセチル化経路の前記阻害剤が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、ボリノスタット、ロミデプシン、ベリノスタット、及びパノビンスタットからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
前記ＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴヒストン脱アセチル化経路の前記阻害剤が、ＮＣＯＲ２／ＳＭＲＴ遺伝子サイレンサーである、請求項１０に記載の方法。
前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが、遺伝子操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶベクターが、血清型８ＡＡＶ（ＡＡＶ８）ベクターである、請求項１４に記載の方法。
前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが、血液凝固因子、セリンプロテアーゼ、サイトカイン、サイトカイン受容体タンパク質の可溶性部分、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体の可溶性部分、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質の可溶性部分、補体調節タンパク質、増殖因子、ホルモン受容体タンパク質の可溶性部分、コレステロール受容体タンパク質の可溶性部分、転写因子タンパク質、及び代謝酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが、第ＶＩＩ因子ポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、第ＩＸ因子ポリペプチド、及び第Ｘ因子ポリペプチドからなる群から選択される血液凝固因子をコードする、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子構築物である、請求項１７に記載の方法。
前記Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子構築物が、配列番号Ｘ［ＦＶＩＩＩ－ＣＳ０１］、配列番号４［ＦＶＩＩＩ－ＣＳ０４］、及び配列番号Ｘ［ＦＶＩＩＩ－ＣＳ２３］からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含む核酸配列によりコードされる、請求項１８に記載の方法。
前記第ＩＸ因子ポリペプチドが、Ｒ３３８Ｌアミノ酸置換を有する、請求項１７に記載の方法。
前記第ＩＸ因子ポリペプチドが、配列番号Ｘ［ＦＸＩ－ＣＳ０２］、配列番号Ｘ［ＦＸＩ－ＣＳ０３］、配列番号Ｘ［ＦＸＩ－ＣＳ０４］、配列番号Ｘ［ＦＸＩ－ＣＳ０５］、及び配列番号Ｘ［ＦＸＩ－ＣＳ０６］から選択される核酸配列によりコードされる、請求項２０に記載の方法。
前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターが、タリモジーンラハーパレプベック、ボレチジーンネパルボベック－ｒｚｙｌ、及びオナセムノジーンアベパルボベック－ｘｉｏｉからなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
一連のコルチコステロイドを前記患者に投与する段階
をさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
前記一連の前記コルチコステロイドが、前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与した後に投与される、請求項２４に記載の方法。
前記一連の前記コルチコステロイドが、漸減用量の前記コルチコステロイドである、請求項２５に記載の方法。
前記コルチコステロイドが、プレドニゾロンまたはプレドニゾンである、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
前記一連のプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与する段階が、
前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与した直後の最初の週の間に、前記患者に、１日当たり４０～８０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することと；
前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与した直後の第２の週の間に、前記患者に、１日当たり２０～６０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することと；
前記ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与した直後の第３の週の間に、前記患者に、１日当たり１０～５０ｍｇのプレドニゾロンまたはプレドニゾンを投与することと
を含む、請求項２７に記載の方法。
前記コルチコステロイドステロイドが低用量で投与される、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。
前記コルチコステロイドが、前記患者に、１日当たり２０ｍｇ以下の投与量で投与される、請求項２９に記載の方法。
前記コルチコステロイドが、前記患者に、１日当たり１０ｍｇ以下の投与量で投与される、請求項２９に記載の方法。
前記コルチコステロイドが、前記患者に、１日当たり５ｍｇ以下の投与量で投与される、請求項２９に記載の方法。
ウイルスベースの遺伝子療法による、患者を治療するための方法であって、
前記患者に、
（１）インターロイキン－６（ＩＬ６）経路阻害剤と、
（２）ウイルスベースの遺伝子療法ベクターと、
（３）１日当たり２０ｍｇ以下の用量のコルチコステロイドと
を投与する段階
を含む、前記方法。
前記コルチコステロイドが、１日当たり１０ｍｇ以下の用量で投与される、請求項３３に記載の方法。
前記コルチコステロイドが、１日当たり５ｍｇ以下の用量で投与される、請求項３３に記載の方法。
ウイルスベースの遺伝子療法による、患者を治療するための方法であって、
以下：
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価すること、及び、
インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価すること
の一方または両方により、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与する段階と
を含む、前記方法。
ウイルスベースの遺伝子療法による、患者を治療するための方法であって、
インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与する段階と
を含む、前記方法。
ウイルスベースの遺伝子療法による、患者を治療するための方法であって、
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与する段階と
を含む、前記方法。
患者における不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患を治療するための方法であって、
以下：
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価すること、及び、
インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価すること
の一方または両方により、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれも前記患者が有しない場合、前記酵素活性を有する治療用タンパク質を前記患者に投与する段階と
を含む、前記方法。
患者における不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患を治療するための方法であって、
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子におけるいずれかの変異を、前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異のいずれも前記患者が有しない場合、前記酵素活性を有する治療用タンパク質を前記患者に投与する段階と
を含む、前記方法。
ウイルスベースの遺伝子療法を患者に割り当てるための方法であって、
インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に割り当てる段階と
を含む、前記方法。
患者における不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患を治療するための方法であって、
インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に投与する段階と；
ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有しない場合、前記酵素活性を有する治療用タンパク質を前記患者に投与する段階と
を含む、前記方法。
ウイルスベースの遺伝子療法を患者に割り当てるための方法であって、
以下：
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価すること、及び
インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価すること
の一方または両方により、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に割り当てる段階と
を含む、前記方法。
ウイルスベースの遺伝子療法を患者に割り当てるための方法であって、
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に割り当てる段階と
を含む、前記方法。
患者に、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療を割り当てるための方法であって、
以下：
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価すること、及び
インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価すること
の一方または両方により、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれかを前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に割り当てる段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異、または、ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異のいずれも前記患者が有しない場合、前記酵素活性を有するポリペプチドを前記患者に割り当てる段階と
を含む、前記方法。
患者に、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療を割り当てるための方法であって、
インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に割り当てる段階と；
ＩＬ－６Ｒ機能の低下と関連した、前記ＩＬ－６Ｒ遺伝子における変異を、前記患者が有しない場合、前記酵素活性を有するポリペプチドを前記患者に割り当てる段階と
を含む、前記方法。
患者に、不十分なレベルの酵素活性と関連する疾患の治療を割り当てるための方法であって、
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有するか否かを評価することにより、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターによって持続性感染に対して前記患者を増感させる遺伝子型を、前記患者が有するか否かを判定する段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有する場合、ウイルスベースの遺伝子療法ベクターを前記患者に割り当てる段階と；
ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２タンパク質機能の低下と関連した、前記ＳＭＲＴ／ＮＣＯＲ２遺伝子における変異を、前記患者が有しない場合、前記酵素活性を有するポリペプチドを前記患者に割り当てる段階と
を含む、前記方法。