JP2022536668A - 発酵方法を制御するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも１つの微生物の発酵のための発酵方法に関し、ここで、発酵方法は、工程：（ａ）少なくとも１つの微生物を含む発酵ブロスを発酵反応器中に流れさせる；（ｂ）炭素基質を発酵反応器に供給して、気体状炭素基質を発酵ブロスに溶解させるかまたは部分的に溶解させる；（ｃ）窒素基質を発酵反応器に供給して、気体状窒素基質を発酵ブロスに溶解させるかまたは部分的に溶解させる；および（ｄ）発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０３５ｇ／ｌ未満に維持する、および／または発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０１ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満に維持する、を含み、ここで、少なくとも１つのメタノトローフ生物は、少なくとも１つのメタノトローフ微生物を含む。
Description
本発明は、バイオマス生産を改良するための発酵方法および発酵反応器に関する。特に、本発明は、発酵方法を最適化するために硝酸塩の濃度が厳密に制御される、メタノトローフ生物を発酵させるための方法および発酵反応器に関する。
窒素源は、発酵中の微生物の成長に不可欠な炭素源と共にある。微生物がタンパク質、核酸、その他の細胞成分を合成するには、窒素源が必要である。
微生物の酵素能力に応じて、窒素はバルクタンパク質、例えば大豆ミールとして；事前消化されたポリペプチド、例えばペプトンまたはトリプトンとして；またはアンモニアまたは硝酸塩として提供されてもよい。窒素源のコストが重要な要素であるため、窒素源の選択は重要であり、製造される製品によってもよい。
窒素源でさえ微生物の成長に不可欠な成分であるが、メタノトローフ微生物は、窒素源の形態および窒素源の量により影響を受けてもよい窒素の負荷に非常に敏感であることも当技術分野で既知である。
従来技術において、アンモニアおよび亜硝酸塩の耐性のこの違いは、例えばアンモニアまたは亜硝酸塩の毒性作用についての、メタンモノオキシゲナーゼ酵素の異なる親和性に起因してもよいと推測される。
メタンモノオキシゲナーゼ酵素は、メタノトローフ微生物のメタノトロフィー（ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｙ）を与える役割を果たし、同時に、利用可能な窒素源で酸化を実行し、多数の共代謝副産物をもたらす。
メタノトローフ微生物、例えばＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓを成長させる場合、メタンが大過剰でなければ、低細胞外濃度でも、窒素源、例えばアンモニアは、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのメタンモノオキシゲナーゼにより容易に酸化される。
Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ発酵からコスト競争力のある単一細胞タンパク質（ＳＣＰ）製品を作るために、アンモニアは発酵の窒素源としてよく使用される。水性発酵ブロスへのアンモニアの溶解度は、炭素源として使用されてもよいメタンの溶解度より何桁も大きく、例えガスから液体への物質移動の明らかな差し迫った問題が適切な反応器設計を使用することで対処されるとしても、このことはアンモニアの酸化を現実の課題にする。
したがって、改良された発酵方法および／または発酵反応器は有利であり、特に、より効率的および／または制御される発酵方法および／または発酵反応器は、窒素源がメタノトローフバイオマスの生産を改良するために調節される場合に有利である。
したがって、本発明の目的は、メタノトローフ微生物、例えばＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓを発酵させるための改良された発酵方法に関する。
特に、本発明の目的は、メタノトローフバイオマスの生産を改良するために窒素源が調節されるより効率的および／または制御される発酵方法および／または発酵反応器、および発酵中に供給される素源のレベルを制御して、微生物、例えばメタノトローフ微生物の成長のための栄養素を提供するが同時に、メタン消費の競争的阻害剤を生み出すレベルを回避することと共に、先行技術の上記の課題を解決する発酵方法および／または発酵反応器を提供することである。
したがって、本発明の一態様は、発酵反応器中で少なくとも１つの微生物を含む発酵ブロスを発酵させるための発酵方法に関し、発酵方法は、以下の工程：
ａ）炭素基質を発酵反応器に供給して、炭素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；
ｂ）窒素基質を発酵反応器に供給して、窒素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；および
ｃ）発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０３５ｇ／ｌ未満に維持する、および／または発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０１ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満に維持する
を含み、ここで、少なくとも１つの微生物は、少なくとも１つのメタノトローフ微生物を含む。
ａ）炭素基質を発酵反応器に供給して、炭素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；
ｂ）窒素基質を発酵反応器に供給して、窒素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；および
ｃ）発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０３５ｇ／ｌ未満に維持する、および／または発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０１ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満に維持する
を含み、ここで、少なくとも１つの微生物は、少なくとも１つのメタノトローフ微生物を含む。
本発明の別の態様は、ループ部分および上部槽を含む発酵反応器に関し、前記ループ部分は、Ｕ部分を介して上昇流部分に接続される下降流部分を含み、上部槽は、以下：
（ｉ）上部槽をループ部分の下降流部分に接続し、上部槽中に存在する発酵液を上部槽からループ部分に流れさせる第１の出口；
（ｉｉ）上部槽をループ部分の上昇流部分に接続する第１の入口であって、ループ部分中に存在する発酵液をループ部分から上部槽に流れさせる第１の入口；
（ｉｉｉ）上部槽からの排出ガスを排出するためのベントチューブ；および
（ｉｖ）目視検査手段
を含み、ここで、発酵反応器はさらに以下：
（ｖ）アンモニウム化合物を含む基質を供給するための少なくとも１つの入口；および
（ｖｉ）発酵ブロス中の硝酸塩の濃度を決定するための少なくともセンサー
を含む。
（ｉ）上部槽をループ部分の下降流部分に接続し、上部槽中に存在する発酵液を上部槽からループ部分に流れさせる第１の出口；
（ｉｉ）上部槽をループ部分の上昇流部分に接続する第１の入口であって、ループ部分中に存在する発酵液をループ部分から上部槽に流れさせる第１の入口；
（ｉｉｉ）上部槽からの排出ガスを排出するためのベントチューブ；および
（ｉｖ）目視検査手段
を含み、ここで、発酵反応器はさらに以下：
（ｖ）アンモニウム化合物を含む基質を供給するための少なくとも１つの入口；および
（ｖｉ）発酵ブロス中の硝酸塩の濃度を決定するための少なくともセンサー
を含む。
図１は、パイロットプラント（実線）中でのバイオマス生産が時間の経過とともに減少し、硝酸塩生産（破線）が時間の経過とともに増加していることを示す。この傾向は、パイロットプラントならびに生産プラントの両方の実験室試験で見出されている。
次に、本発明について、以下でより詳細に説明する。
発明の詳細な説明
したがって、本発明の発明者らは、発酵方法に提供される窒素源が、微生物、例えばメタノトローフ微生物の成長のための栄養素として、ならびに例えばメタンモノオキシゲナーゼ酵素を阻害することによる、メタン消費の競合的阻害剤としての両方で働いてもよいため、窒素源の濃度はメタノトローフ微生物、例えばｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのバイオマス生産を最適化するために調節および／または制御される必要があることを見出した。
したがって、本発明の発明者らは、発酵方法に提供される窒素源が、微生物、例えばメタノトローフ微生物の成長のための栄養素として、ならびに例えばメタンモノオキシゲナーゼ酵素を阻害することによる、メタン消費の競合的阻害剤としての両方で働いてもよいため、窒素源の濃度はメタノトローフ微生物、例えばｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのバイオマス生産を最適化するために調節および／または制御される必要があることを見出した。
Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓは、アンモニア（ＮＨ３）またはアンモニウム（ＮＨ４
＋）を亜硝酸塩（ＮＯ２
－）に酸化する。必要な酵素は、次の反応によりアンモニアならびにメタンおよびヒドロキシルアミン酸化還元酵素（ＨＡＯ）を酸化できるメタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ）である。この反応は、酸素を必要とする。
本発明の発明者らは、理論に拘束されることなく、独立栄養硝化の第１工程（Ｋ１）において、メタノトローフ微生物、例えばｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓにより産生される亜硝酸塩が、以下の反応に続いて亜硝酸オキシドレダクターゼ（ＮＸＲ）により硝酸塩に酸化されると信じる。
上記の反応（Ｋ１およびＫ２）および可逆反応の速度は、メタノトローフ微生物、例えばＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓを使用した亜硝酸塩形成の痕跡をほとんど伴わずに、アンモニアから実質的に直接硝酸塩を形成することと組み合わせて考えられる。
驚くべきことに、本発明の発明者らは、実験から、バイオマス開発の低減を回避するため、および／または高バイオマス開発を提供するために、硝酸塩濃度を一定のレベル以下に維持するために、メタノトローフ微生物、例えばＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの発酵に窒素源、例えばアンモニアを供給することは制御および調節される必要があることを見出した。
本文脈において、「高バイオマス開発」なる語は、１ｇ／ｌを超える；例えば５ｇ／ｌを超える；例えば１０ｇ／ｌを超える；例えば１５ｇ／ｌを超える；例えば２０ｇ／ｌを超える；例えば２５ｇ／ｌを超える；例えば３０ｇ／ｌを超える；例えば５０ｇ／ｌを超える；例えば７０ｇ／ｌを超える；例えば１～１００ｇ／ｌの範囲；例えば５～９０ｇ／ｌの範囲；例えば１０～８０ｇ／ｌの範囲；例えば２０～７０ｇ／ｌの範囲；例えば３０～６５ｇ／ｌの範囲；例えば４０～６０ｇ／ｌの範囲；例えば４５～５５ｇ／ｌの範囲のバイオマス濃度に関する。
したがって、例えば窒素源としてアンモニアを使用する、メタノトローフ微生物、例えばＭ． ｃａｐｓｕｌａｔｕｓにより培養において形成される硝酸塩は、発酵のストレスの責任ある指標として使用されてもよく、したがって、発酵反応器中で硝酸塩の濃度を調節することによる、例えば窒素源の流れを低減させる、または流れをゼロＬ／分に止めさえすることによる操作により発酵方法は制御されることができる。
本発明者らは、発酵方法をバッチ、流加または連続モードで実行するかどうかに関係なく、発酵方法を制御または調節するこの方法が、メタノトローフバイオマス、例えばＭ． ｃａｐｓｕｌａｔｕｓバイオマスの高い生産性を確保するために不可欠であってもよいことを見出した。
制御および／または調節のこの効果および重要性は、パイロット規模ならびに生産／産業の両方の実験室試験の以下の実験で実証されている。
したがって、驚くべきことに、本発明の発明者らは、メタノトローフバイオマスの生産を改良するために窒素源が制御および／または調節されてもよい発酵方法および発酵反応器を見出した。
本発明の好ましい実施形態において、発酵反応器中で少なくとも１つの微生物を含む発酵ブロスを発酵させるための発酵方法に関し、発酵方法は、以下の工程：
ｄ）炭素基質を発酵反応器に供給して、炭素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；
ｅ）窒素基質を発酵反応器に供給して、窒素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；および
ｆ）発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０３５ｇ／ｌ未満に維持する、および／または発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０１ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満に維持する
を含み、ここで、少なくとも１つの微生物は、少なくとも１つのメタノトローフ微生物を含む。
ｄ）炭素基質を発酵反応器に供給して、炭素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；
ｅ）窒素基質を発酵反応器に供給して、窒素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；および
ｆ）発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０３５ｇ／ｌ未満に維持する、および／または発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０１ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満に維持する
を含み、ここで、少なくとも１つの微生物は、少なくとも１つのメタノトローフ微生物を含む。
発酵中の発酵ブロスの硝酸塩濃度は、０．０３５ｇ／ｌ未満；例えば０．０３３ｇ／ｌ未満；例えば０．０３ｇ／ｌ未満；例えば０．０２８ｇ／ｌ未満；例えば０．０２５ｇ／ｌ未満；例えば０．０２２ｇ／ｌ未満；例えば０．０２ｇ／ｌ未満；例えば０．０１８ｇ／ｌ未満；例えば０．０１５ｇ／ｌ未満；例えば０．０１ｇ／ｌ未満；例えば０．００５ｇ／ｌ未満；例えば０．０１ｇ／ｌ未満；例えば０ｇ／ｌに維持されてもよい。
本発明の一実施形態において、発酵中の発酵ブロスの硝酸塩濃度は、０～０．０３５ｇ／ｌの範囲；例えば０．００１～０．０３３ｇ／ｌの範囲；例えば０．００２～０．０３ｇ／ｌの範囲；例えば０．００３～０．０２５ｇ／ｌの範囲；例えば０．００４～０．０２ｇ／ｌの範囲；例えば０．００５～０．０１５ｇ／ｌの範囲；例えば０．００７～０．０１ｇ／ｌの範囲にある。
窒素源は、気体状窒素基質または水性窒素基質であってもよい。
好ましくは、窒素源は、アンモニア；アンモニウム化合物；および／または分子窒素から選択されてもよい。さらにより好ましくは、窒素源は、アンモニアである。
アンモニウム化合物は、炭酸アンモニウム；塩化アンモニウム；硫酸アンモニウム；水酸化アンモニウム；および／または硝酸アンモニウムから選択されてもよい。好ましくは、アンモニウム化合物は、水酸化アンモニウムである。
本発明の一実施形態において、窒素源は、０．１ｇ／ｌ未満；例えば０．０９ｇ／ｌ未満；例えば０．０８ｇ／ｌ未満；例えば０．０７ｇ／ｌ未満；例えば０．０６ｇ／ｌ未満；例えば０．０５ｇ／ｌ未満；例えば０．０４ｇ／ｌ；例えば０．０３ｇ／ｌ未満；例えば０．０２ｇ／ｌ；例えば０．０１ｇ／ｌ未満；例えば０．００５ｇ／ｌ；例えば０．００１ｇ／ｌ未満の濃度で発酵ブロスに供給されてもよい。
本発明のさらなる実施形態において、窒素源は、０．００１～０．１ｇ／ｌの範囲；例えば０．００５～０．０９ｇ／ｌの範囲；例えば０．０１～０．０８ｇ／ｌの範囲；例えば０．０２～０．０７５ｇ／ｌの範囲；例えば０．０４～０．０７ｇ／ｌの範囲；例えば０．０５～０．０６ｇ／ｌの範囲の濃度で発酵ブロスに供給されてもよい。
本発明のさらに一実施形態において、発酵反応器に供給される窒素源は、硝酸塩でなくてもよい。
発酵ブロス中の硝酸塩濃度は、バイオマス濃度に依存してもよい。したがって、本発明の好ましい実施形態において、発酵ブロス中の硝酸塩濃度は、０．０１ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満；例えば０．００８ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満；例えば０．００６ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満；例えば０．００４ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満；例えば０．００２ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満；例えば０．００１ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満；例えば０．０００５ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満；例えば０ｇ硝酸塩／ｇバイオマスに維持されてもよい。硝酸塩の濃度のこの計算は、生存可能なメタノトローフ微生物を含む発酵ブロスに基づく。
好ましくは、炭素基質は、気体状炭素基質であってもよい。
好ましくは、炭素基質はアルカンから選択されてもよく、好ましくは、アルカンはＣ１化合物である。さらにより好ましくは、炭素基質は、メタン、メタノール、天然ガス、バイオガス、合成ガス、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。さらにより好ましくは、炭素基質は、メタンであってもよい。
上記のように、炭素源および／または窒素源（ならびに発酵ブロスに加えられる他の成分）は、ガスとして加えられてもよく、これらのガスを、バイオマスの開発に利用可能であり、微生物に利用可能であるように、水性発酵ブロスであってもよい発酵ブロスに溶解させる必要がある。
一般に、基質（例えば炭素源；および酸素源）の物質移動に関する産業の課題があり、この物質移動を改良することに継続的な関心および努力がある。Ｕループ発酵槽中の発酵を改良する１つの方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０６９３１および／またはＷＯ２００３／０１６４６０に記載されてもよい。
したがって、本発明において、「発酵ブロスに溶解した、または部分的に溶解した」なる語は、気体状基質を気相から水相に変換することに関する当技術分野で既知の課題に関し、これは少なくとも１つの微生物に使用可能である。
本発明の好ましい実施形態において、決定される硝酸塩濃度は、溶解した硝酸塩濃度であってもよい。
本発明のさらなる実施形態において、発酵ブロスの硝酸塩濃度は、インライン分析により；オンライン分析により；またはオフラインまたはアットライン分析により決定されてもよい。好ましくは、発酵ブロスの硝酸塩濃度は、インライン分析またはオンライン分析により決定されてもよい。
本発明のさらに別の実施形態において、発酵ブロスの硝酸塩濃度は、インライン分析またはオンライン分析により連続的に決定されてもよい。
本発明の文脈において、「インライン分析」なる語は、１つまたは複数の選択された成分の分析を実施するために、方法容器または流動（ｆｌｏｗｉｎｇ）材料の流れに配置されてもよいセンサーに関する。
本発明の文脈において、「オンライン分析」なる語は、方法に接続され、自動サンプリングを実施してもよいセンサーに関する。オンライン分析器は、インライン分析器と呼ばれてもよい。
オンライン分析器およびインライン分析は、継続的な方法制御を可能にする。
本発明の文脈において、「オフライン分析」または「アットライン分析」なる語は、交換可能に使用されてもよく、手動サンプリングおよびそれに続く不連続なサンプル調製、測定、および評価により特徴付けられるセンサーに関する。材料特性は、サンプリングから結果が得られるまでの間に変化することができるため、直接の方法制御は不可能であってもよい。
本発明の一実施形態において、酸素基質は、発酵反応器に供給されてもよい。好ましくは、酸素基質は、発酵ブロスに溶解されるか、または部分的に溶解されてもよい。
本発明のさらなる実施形態において、１つまたは複数の栄養素；１つまたは複数のｐＨ調整成分および／または水は、発酵反応器に供給されてもよい。好ましくは、１つまたは複数の栄養素；１つまたは複数のｐＨ調整成分および／または水は、発酵ブロスに溶解されるか、または部分的に溶解されてもよい。
発酵は、バッチ発酵、流加発酵または連続発酵であってもよい。好ましくは、発酵方法は、連続発酵方法であってもよい。
好ましくは、メタノトローフ生物は、メタノトローフ細菌、例えばＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓと交換可能に使用される）であってもよい。
メタノトローフ細菌は、１つまたは複数の従属栄養細菌と一緒の共発酵で提供されてもよい。
以下の従属栄養細菌は、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ；Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ；Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ；Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄａｎｉｃｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓとの共発酵に特に有用であってもよい。適切な酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよび／またはＣａｎｄｉｄａの種から選択されてもよい。
好ましい従属栄養細菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＮＣＩＭＢ １３２８７）、Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄａｎｉｃｕｓ（ＮＣＩＭＢ １３２８８）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ（ＮＣＩＭＢ １３２８９）およびそれらの組み合わせから選択される。
本発明の一実施形態において、メタノトローフ生物は、遺伝子改変されたメタノトローフ生物であってもよく、および／または従属栄養生物は、遺伝子改変された従属栄養生物であってもよい。
本発明による発酵反応器および／または発酵方法は、例えばＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｃａｐｓｕｌａｔｕｓによる、連続培養発酵方法による単一細胞タンパク質（ＳＣＰ）の生産に特別な関連性を有してもよい。
好ましいメタノトローフ細菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファミリーの種、特にＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓであり、これは炭素源としてメタンまたはメタノールを、タンパク質合成のための窒素源としてアンモニア、硝酸塩または分子窒素を利用する。
本発明の好ましい実施形態は、ループ部分および上部槽を含む発酵反応器に関し、前記ループ部分は、Ｕ部分を介して上昇流部分に接続される下降流部分を含み、上部槽は、以下：
（ｉ）上部槽をループ部分の下降流部分に接続し、上部槽中に存在する発酵液を上部槽からループ部分に流れさせる第１の出口；
（ｉｉ）上部槽をループ部分の上昇流部分に接続する第１の入口であって、ループ部分中に存在する発酵液をループ部分から上部槽に流れさせる第１の入口；
（ｉｉｉ）上部槽からの排出ガスを排出するためのベントチューブ；および
（ｉｖ）目視検査手段
を含み、ここで、発酵反応器はさらに以下：
（ｖ）アンモニウム化合物を含む基質を供給するための少なくとも１つの入口；および
（ｖｉ）発酵ブロス中の硝酸塩の濃度を決定するための少なくともセンサー
を含む。
（ｉ）上部槽をループ部分の下降流部分に接続し、上部槽中に存在する発酵液を上部槽からループ部分に流れさせる第１の出口；
（ｉｉ）上部槽をループ部分の上昇流部分に接続する第１の入口であって、ループ部分中に存在する発酵液をループ部分から上部槽に流れさせる第１の入口；
（ｉｉｉ）上部槽からの排出ガスを排出するためのベントチューブ；および
（ｉｖ）目視検査手段
を含み、ここで、発酵反応器はさらに以下：
（ｖ）アンモニウム化合物を含む基質を供給するための少なくとも１つの入口；および
（ｖｉ）発酵ブロス中の硝酸塩の濃度を決定するための少なくともセンサー
を含む。
好ましくは、発酵反応器は、発酵ブロス中の硝酸塩濃度を自動的に調節するように構成および／または制御される少なくとも１つの供給ポンプを含んでもよい。
本文脈において、「硝酸塩濃度を調節する」なる語は、発酵ブロス中の硝酸塩濃度を低減させるか、または発酵ブロス中の硝酸塩濃度を増加させるかのいずれかの作用に関する。好ましくは、「硝酸塩濃度を調節する」なる語は、硝酸塩濃度を低減させる作用に関する。
本発明の一実施形態において、発酵ブロス中の硝酸塩濃度は、発酵槽への窒素源の流れを調節すること；発酵槽への炭素源の流れを調節すること；酸素の流れを調整すること；栄養素の流れを調節すること；またはその組み合わせにより調節されてもよい。
ループ反応器のＵ部分は、下降流部分の下部を上昇流部分の下部に接続していてもよい。さらに、上昇流部分の上部は、上部槽を上昇流部分の上部に接続する第１の入口に接続されてもよい。第１の出口は、上部槽を下降流部分の上部に接続していてもよい。
本文脈において、「発酵反応器」なる語は、下降流部分および上昇流部分の上端に接続される上部槽を含む反応器に関する。下降流部および上昇流部は、Ｕ部分を介して下端で接続されている。
本文脈において、「ループ反応器」なる語は、発酵反応器の特定の例に関する。
本発明のループ部分は、下降流部分、上昇流部分、ならびにＵ部分により形成される上昇流部分の下端および下降流部分の下端の接続部分に関する。したがって、「ループ部分」は、上部槽のない発酵反応器に関する。
本文脈において、「Ｕ部分」なる語は、上昇流部分の下端および下降流部分の下端を接続する発酵反応器またはループ反応器の底部に提供される屈曲部（ｂｅｎｄ）に関する。好ましくは、上昇流部分および下降流部分は、垂直または実質的に垂直である。
本文脈において、「上部槽」なる語は、発酵反応器の上部に位置し、発酵液からの流出ガスの除去に関与する容器に関する。好ましくは、上部槽は、操作／発酵中、発酵液で部分的にのみ満たされている。本発明の一実施形態において、「発酵液で部分的に満たされた」なる語は、発酵液とガスとの間の９０：１０の比率；例えば８０：２０の比率；例えば７０：３０の比率；例えば６０：４０の比率；例えば５０：５０；例えば４０：６０の比率；例えば３０：７０の比率；例えば２０：８０の比率；例えば１０：９０の比率に関する。
本発明の文脈において、「目視検査手段」は、当業者が上部槽の起泡特性に関する直接の情報を取得することを可能にする１つまたは複数の手段に関する。
本発明の一実施形態において、直接の情報は、上部槽中の起泡特性に関するリアルタイム情報であってもよい。
本発明のさらなる実施形態において、上部槽中の起泡特性は、上部槽中に提供される泡密度、泡高さ、および乱流のレベルを含んでもよい。
上部槽中の乱流は、発酵液が上昇流部分から第１の入口を通って上部槽に押し込まれるときに、上部槽中に存在する発酵液に提供されてもよい。
泡密度は、泡中の気泡のサイズの表現であってもよい。泡中の気泡が大きいほど、泡密度は小さくなり、ｋｇ泡／ｍ３は小さくなる。泡中の気泡が小さいほど、泡密度は大きくなり、ｋｇ泡／ｍ３は大きくなる。
本発明の一実施形態において、目視検査手段は、水平または実質的な水平検査視界（ｖｉｅｗ）と共に配置されてもよい。
本発明のさらなる実施形態において、目視検査手段は、発酵液の表面の上および発酵液の表面の下の組み合わせ視界を可能にするように、上部槽の側面に配置されてもよい。
好ましくは、目視検査手段は、上部槽の端に配置されてもよい。
さらにより好ましくは、目視検査手段は、第１の入口（または上昇流部分）から第１の出口（または下降流部分）に向かっての視界を提供する上部槽の端部に配置されてもよい。
本発明の一実施形態において、目視検査手段は、検査穴、カメラ、または検査穴およびカメラの組み合わせであってもよい。
好ましくは、検査穴はサイトグラスであってもよい。
カメラは、インラインカメラであってもよい。
本発明の一実施形態において、上部槽内の目視検査を改良するために、上部槽は光源と共に提供されてもよい。光源は、周囲の光を上部槽に入らせる窓として、および／または上部槽に組み込まれた人工光源として提供されてもよい。
本発明のさらなる実施形態において、光源は、サイトグラス内の個別の特徴として（例えば、個別の人工光源として）、または統合された特徴として（例えば、統合された人工光源として）提供されてもよい。
目視検査に加えて、上部槽は、上部槽内の少なくとも１つの泡センサーと共に提供されてもよい。
過度の泡の発生を避けるために、消泡剤は、発酵液に加えられてもよい。したがって、上部槽は、消泡入口と共に提供されてもよい。
本発明の実施形態において、発酵反応器、好ましくはループ部分は、発酵液中の１つまたは複数のイオン種の含有量を決定するためのイオンセンサーまたは分析器を含み、好ましくは、１つまたは複数のイオン種は、リン酸塩、カルシウム、水素、硝酸塩、亜硝酸塩および／またはアンモニウム、好ましくは硝酸塩および／または亜硝酸塩から選択される。
本発明のさらなる実施形態において、ループ反応器は、循環ポンプと共に提供されてもよい。
好ましくは、循環ポンプは、下降流部分の上半分部分に配置されてもよい。
本発明の一実施形態において、発酵反応器は、流れ低減装置を含んでもよい。好ましくは、流れ低減装置は、第１の入口から上流に、そして上昇流部分の上半分に挿入されてもよい。
本発明のさらなる実施形態において、好ましくは、発酵反応器のループ部分は、１つまたは複数のガス入口；１つまたは複数の給水口；および／または１つまたは複数の発酵培地入口を含んでもよい。
１つまたは複数のガス入口；１つまたは複数の給水口；および／または１つまたは複数の発酵培地入口は、コンピューターにより制御されてもよい。好ましくは、１つまたは複数のガス入口；１つまたは複数の給水口；および／または１つまたは複数の発酵培地入口は、１つまたは複数のセンサーまたは分析器から得られるデータに基づいてコンピューターにより制御されてもよい。
改良された発酵条件を提供するために、発酵液中の気体状基質、例えばメタンの分布が、重要であってもよい。したがって、発酵反応器のループ部分は、発酵液中にガスを分配するための１つまたは複数の活性装置を含んでもよい。
本発明の一実施形態において、発酵液中にガスを分配するための１つまたは複数の活性装置は、発酵液中にガスを導入および／または分配するためのマイクロまたはナノスパージャー；および／または反応器のループ部分に配置された動的運動装置、例えば動的ミキサーである。
動的ミキサーに加えて、またはその代替として、ループ部分は、１つまたは複数の不活性混合部材を含んでもよい。本発明の一実施形態において、１つまたは複数の不活性混合部材は、静的ミキサーであってもよい。
上部槽中での適切な脱気の重要性に加えて、ガスがエネルギー効率の良い方法で生物触媒（例えば、メタノトローフ生物）に利用可能になる液相への気体状基質の物質移動を改良することは、重要であってもよい。
さらに、前述のように、好ましくは上部槽で行われる、発酵槽から除去するための液相から気相への廃ガスの移動を改良することにより廃ガス除去の効率を改良することも、重要であってもよい。
好ましくは、廃ガス除去におけるこの改良された効率は、ループ部分のＵ部分を増加した圧力下で操作することにより提供されてもよい。
上部槽中の改良されたガス除去と組み合わせたこの改良された物質移動は、実質的に垂直な下降流部分、実質的に垂直な上昇流部分、および実質的に水平な接続部分を有するＵ部分を有するループ部分を含み、Ｕ部分は下降流部分の下端を上昇流部分の下端と接続し、ここで上部槽はループ部分の上に提供されてもよく、そして下降流部分の上端および上昇流部分の上端を接続する本発明によると、発酵反応器、ループ反応器で達成されてもよい。
本発明の一実施形態において、上部槽は、ループ部分、下降流部分、および／または上昇流部分の直径より実質的に大きい直径を有してもよい。
本発明の一実施形態において、発酵槽のＵ部分は、発酵液を回収するために、好ましくは上部槽または発酵反応器のループ部分のＵ部分に配置された、出口を含んでもよい。
発酵反応器は、１つまたは複数のガス注入点を含んでもよく、これは要望および要求に応じて、下降流部分、Ｕ部分および／または上昇流部分に配置される。好ましくは、１つまたは複数のガス注入点は、下降流部分に配置される。
１つまたは複数のガス注入点の直後に、発酵液中に導入されるガス（または複数のガス）の分散のための少なくとも１つの活性混合部材および／または少なくとも１つの非活性混合部材。
Ｕループ、ループ反応器中の圧力を増加させることにより、気相から液相への増加した物質移動は、改良されてもよい。したがって、発酵槽の第２のゾーンの圧力に関連して、発酵槽のＵ部分の少なくとも第１のゾーンの圧力を増加させるために、第１の圧力制御装置は、発酵槽のＵ部分に挿入されてもよい。
本発明の好ましい実施形態において、第１の圧力制御装置は、下降流部分の上端に挿入されてもよく、第２の圧力制御装置は、発酵槽のＵ部分および発酵液の流れ方向から見て第１の圧力制御装置の下流に挿入されてもよい。
第１の圧力制御装置は、バルブ（例えば、市販のバルブタイプ）、ポンプ、例えばプロペラポンプ、ローブポンプ、またはタービンポンプであってもよく、または圧力は、加圧空気または別のガス、例えば不活性ガスの注入により増加してもよい。好ましくは、第１の圧力制御装置は、プロペラポンプであり、これはまた、発酵槽中に液体循環を作り出す。
第２および所望により第３の圧力制御装置は、下降流部分、上昇流部分、またはＵ部分に配置されてもよいが、好ましくは、第２の圧力制御装置は、上昇流部分の上半分部分にある。好ましくは、第３の所望の圧力制御装置は、上昇流部分の上半分部分および、発酵液の流れ方向から見て第２の圧力制御装置の上流に配置される。第２および／または第３の圧力制御装置は、バルブ（例えば、市販のバルブタイプ）、静的ミキサー、液体サイクロン、ポンプ（例えば、プロペラポンプ、ローブポンプまたはタービンポンプ）、圧力制御バルブ、穴、ノズルまたはジェットを有するプレート、またはそれが配置される発酵槽部分の直径または断面の狭小化を含む装置の群の中から選択される。
本発明の実施形態において、気体状基質の改良された物質移動は、本発明による発酵反応器のＵ部分において提供されてもよい。
本発明のさらなる実施形態において、廃ガス除去は、本発明による発酵反応器の上部槽中に提供されてもよい。
本発明の一実施形態において、ヘッドスペースのフラッシングを可能にして、廃ガスの除去を改良し、発酵槽のヘッドスペースで爆発性ガス混合物が形成されるリスクを低減するための手段が、提供される。
このフラッシングは、ガスフラッシング手段、例えばヘッドスペースにおいてガスを追加および／または除去するための装置を上部槽中に配置することにより達成されてもよい。好ましくは、ガスフラッシング手段は、発酵槽の上部の液体流れに対して並流、同時、または横流でフラッシングガスのガス流れを作り出すために、液面の上に配置されてもよい。ガス添加手段はまた、上部の液面の下に配置されてもよい。あるいは、またはさらに、吸引または真空を適用することによりヘッドスペース内の圧力を低減させることにより、したがってヘッドスペース内の圧力を低減させることにより、および／または上部に流れ変更手段を設置することにより、廃ガス除去は増加されてもよい。本発明はまた、圧力を増加させるために適用されるエネルギーが再利用のために回収されるのを可能にする。このことは、第２および所望により第３の圧力制御装置を、プロペラポンプで圧力を減少させるためのブレーキまたは発電機に接続することにより達成されてもよい。発電機が第２および／または第３の圧力制御装置に接続される場合、システムに適用されるエネルギーの一部が収集され、したがってシステムの全体的エネルギー消費を低減してもよい。
本文脈において、「フラッシング」なる語は、上部槽のヘッドスペースおよび／または上部槽中の発酵液からの流出ガスを除去するかまたはその除去を助けるために上部槽で実施される方法に関して使用される。
本発明に従って提供される上部槽は、発酵槽の全体積の１％から９９％の間、しかし好ましくは全発酵槽体積の１０％から６０％の間、さらにより好ましくは全発酵体積の４０～５０％の間を含むように設計されてもよい。本発明の一実施形態において、上部槽の体積は、Ｕ部分の体積未満であってもよい。
上部槽は、発酵反応器中での混合を助けるために、または発酵液からの気泡の放出を助けるために、液体またはガスの流れを変更する手段と共に提供されてもよい。ガスまたは液体の流れを変更する手段は、動的ミキサー、バッフル、または静的ミキサーであってもよい。
発酵槽のサイズ、すなわち直径および高さの両方は、総発酵槽体積の必要性に応じて変化してもよい。
本発明の一実施形態において、本発明による発酵反応器は、駆動ガスが導入されて液相中の二酸化炭素を分離可能な流出気相に駆動してもよい駆動ガス入口と共に提供されてもよい。好ましくは、駆動ガス入口は、上部槽の上流および／または第１の入口の上流に配置されてもよい。
駆動ガス、すなわち二酸化炭素を溶解相から置換するために使用されるガス（通常は窒素だが、所望により別の不活性不燃性ガス）は、例えば、実質的に垂直な上昇流ゾーンの開始から流出ガス除去ゾーンへの参入への１つまたは複数の点で導入されてもよく、しかしながら、特に好ましくは、それは、上昇流ゾーンの垂直部分の上部（例えば、上部２０％、より好ましくは上部１０％）と流出ゾーンの最も平坦な（つまり最も水平な）部分の開始との間の１つまたは複数の点で導入される。
本発明の文脈において、「駆動ガス」なる語は、ループ部分、好ましくは上昇流部分の上端で実施される方法に関して使用され、発酵液から気相への流出ガスの除去を助ける。
本発明の一実施形態において、発酵反応器は、フラッシングガスを上部槽中に導入するための上部槽の入口および、発酵液から気相へ流出ガスを移動させための駆動ガスを導入するためのループ部分の上昇流部分の上端の入口の両方を含む。
本発明の１つの利点は、発酵反応器に加えられる気体状物質の改良された利用が提供されてもよいことであってもよい。
本発明による発酵反応器および／または発酵方法の生産性は、循環する発酵液が発酵槽中での循環中に交互の圧力を経験し、増加した圧力を有するゾーンにおいて液相への基質ガスの増加した物質移動および溶解度を有するという点でさらに最適化されてもよい。生産性は、循環する発酵液からのガス、例えば廃ガスの放出によっても改良されてもよく、この放出は、圧力が低減されるゾーンにおいて増加する。
本発明の一実施形態において、発酵反応器のループ部分における、第１のゾーンにおける、および／または第１の圧力制御装置と第２の圧力制御装置との間の増加した圧力は、大気圧より０．５バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より１バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より１．５バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より２バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より２．５バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より３バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より３．５バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より４バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より４．５バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より５バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より５．５バールを超えて高い圧力例えば大気圧より６バールを超えて高い圧力；例えば大気圧より７バールを超えて高い圧力を適用することにより提供されてもよい。
本発明の別の実施形態において、発酵反応器のループ部分における、第１のゾーンにおける、および／または第１の圧力制御装置と第２の圧力制御装置との間の増加した圧力は、大気圧より０．５～１０バール高い範囲の圧力；例えば大気圧より１～９バール高い範囲の圧力；例えば大気圧より１．５～８バール高い圧力；例えば大気圧より２～７バール高い範囲の圧力；例えば大気圧より３～６バール高い圧力；例えば大気圧より４～５バール高い範囲の圧力を適用することにより提供されてもよい。
本発明のさらに別の実施形態において、上部槽中の圧力は、大気圧より０．５バール未満高い；例えば大気圧より０．２５バール高い；例えば大気圧より０．１バール高い；例えば約大気圧；例えば大気圧より０．７５バール未満低い；例えば大気圧より０．５バール低い；例えば大気圧より０．２５バール未満低い；例えば大気圧より０．１バール低くてもよい。
ループ反応器への適切な変更およびかかるループ反応器を実行する方法に関する特徴、および得られるバイオマスの処理のさらなる詳細は、全て参照により組み込まれるＷＯ２０１０／０６９３１３；ＷＯ２０００／７００１４；ＷＯ２００３／０１６４６０；ＷＯ２０１８／１５８３１９；ＷＯ２０１８／１５８３２２；ＷＯ２０１８／１１５０４２およびＷＯ２０１７／０８０９８７に記載される通りであってもよい。
種々の画分を提供するために得られるバイオマスに適した下流処理の例は、ＷＯ２０１８／１１５０４２に記載される通りであってもよい。
センサーは、バイオセンサー、電気化学センサー、例えば、ＦＩＡ（フローインジェクション分析）および光学測定、例えば分光光度装置に基づくイオン感受性電極またはセンサーを含んでもよい。近赤外線（ＮＩＲ）プローブは、ブロスまたは発酵槽の細胞内のいくつかの異なる成分、例えば細胞、アミノ酸、メタノール、エタノールおよび／または異なるイオンの濃度を測定するためにも使用されてもよい。発酵反応器はまた、ヘッドスペース内の気体状および揮発性成分（例えば、ＣＯ２および／またはＣＨ４）の濃度を決定するための質量分析（ＭＳ）センサーまたは電子ノーズを備えていてもよい。ＭＳセンサーまたは電子ノーズは、発酵槽に適用される圧力および／または気体状成分、例えばメタンおよび／または空気／酸素の添加、および／または気体状アンモニアまたは溶液中のアンモニア／アンモニウムの添加を制御してもよい。ブロス中のガスの気泡サイズを決定するために、好ましくはガス注入に関連して、高速カメラは、発酵反応器のＵ部分に設置されてもよい。気泡サイズは、高速カメラからのデータの画像処理により決定されてもよい。
通常、本発明による発酵反応器は、洗浄および滅菌手順の後に連続運転モードで実行されてもよく、その後、水、必要な栄養塩、および微生物が発酵反応器に加えられる開始期間が続く。発酵液は、主に第１の圧力制御装置により発酵反応器中で循環させてもよい。次いで、気体状基質の添加が開始され、発酵が開始されてもよい。微生物の密度がおよそ０．５～１０％、好ましくは１～５％（乾燥重量で）の濃度に達したとき、発酵液は、発酵反応器から、例えば上部槽またはＵ部分から連続的に回収され、例えばＷＯ２０１８／１１５０４２に記載されるように、下流の処理に供されてもよい。
発酵液の回収は、発酵に使用される微生物に応じて、補給水、水性基質の添加、および／または希釈率での上清の再循環と同時に開始されてもよい。回収されたブロスおよび基質ガスの補給としての溶液中の基質成分、追加の水の添加、上清の再循環は、生物の最適化された成長を得るための各成分の必要量を提供するためのガスセンサーおよび適切な計算からデータを受信するコンピューターにより制御されてもよい。
本発明の一実施形態において、発酵方法および発酵反応器は、実験室規模、パイロットプラントおよび／または生産プラントまたは産業プラントであってもよい。好ましくは、発酵方法および発酵反応器は、生産プラントまたは産業プラントであってもよい。
本発明の態様の１つの文脈で記載される実施形態および特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意されたい。
本出願で引用された全ての特許および非特許の参照は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
次に、本発明は、以下の非限定的な例でさらに詳細に記載される。
実施例
実施例１
この例は、発酵ブロス中の硝酸塩濃度とバイオマス開発との間の相関関係を実証する。
実施例１
この例は、発酵ブロス中の硝酸塩濃度とバイオマス開発との間の相関関係を実証する。
硝酸塩の形成を、１Ｌ ＢＩＯＳＡＴ（登録商標）Ｂ－プラス バイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，ＤＫ）中でのＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの培養の間に決定し、ここで冷却ジャケット水流、モーター周波数、および２Ｍ Ｈ２ＳＯ４または２Ｍ ＮａＯＨの投与量を調整する内部制御ループにより、温度を４２℃に、攪拌を１０ ＲＰＳ－１（１秒あたりのラウンド数）に、およびｐＨを６．７±０．０５に維持した。溶存酸素（ＤＯ）を、ＶｉｓｉＦｅｒｍ ＤＯ ＥＣＳ １２０ Ｈ２光学ＤＯ電極（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＵＳＡ）を使用してモニターした。
バイオリアクターに、９６．８１ｇ・ｈ－１の滅菌空気および４．９５ｇ・ｈ－１の滅菌メタン（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｍｅｔｈａｎｅ ３．５，ＡＧＡ，ＤＫ）を連続的に散布した。
Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの培養を、２ＮＭＳ培地（硝酸塩ミネラル塩培地）中でバッチ相として開始し、硝酸塩が枯渇すると、ＡＭＳ培地（アンモニウムミネラル塩培地）中で定常状態（連続相発酵）で継続した。連続培養中の供給流量は、４８．９５・１０－３Ｌｈ－１であった。共代謝を誘導する試みを開始する前に、培養物を定常状態にした。
定常状態のアンモニアの異なるパルス実験を、硝酸塩濃度とともにパルスの影響の前後のバイオマスが決定された固定条件下で、１Ｌ発酵槽中で実行した。
結果
以下の表１および２は、パルス注入の結果として、アンモニア濃度の増加に伴って硝酸塩の形成が増加することを示す。同じ実験を２４時間維持し、アンモニアパルスの濃度が高くなると、バイオマスが突然減少し、硝酸塩が反応器内に残っている間、ほぼ洗い流し（ｗａｓｈ ｏｕｔ）相に近づく。
以下の表１および２は、パルス注入の結果として、アンモニア濃度の増加に伴って硝酸塩の形成が増加することを示す。同じ実験を２４時間維持し、アンモニアパルスの濃度が高くなると、バイオマスが突然減少し、硝酸塩が反応器内に残っている間、ほぼ洗い流し（ｗａｓｈ ｏｕｔ）相に近づく。
表１および２：異なるアンモニア濃度が定常状態で１Ｌリアクターに供給され、アンモニア注入前、および２つの異なる時点（パルス後２時間（表１）およびパルス後２４時間（表２））でのアンモニア、硝酸塩、およびバイオマス濃度を測定した。
発酵ブロス中のこの高濃度の窒素源の調節は、基質の流量を調節して、硝酸塩が形成されず、同様に亜硝酸塩および／または硝酸塩が蓄積しないように方法を制御することにより解決することができる。これらの調節された条件の間に、過剰な硝酸塩はＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓにより消費されてもよく、発酵ブロスの窒素濃度が低減されてもよい。
図１に示すように、パイロットプラント中でも同じ傾向（バイオマスの減少につながる過度の硝酸塩生産）が観察されている。図１は、パイロットプラントでの硝酸塩生産の増加に伴ってバイオマス生産が減少していることを示す。表１および２に論じられるように、同様の傾向が生産プラントおよび実験室中でも見られる。
参照
Claims (10)
- 発酵反応器中で少なくとも１つの微生物を含む発酵ブロスを発酵させるための発酵方法であって、発酵方法は、以下の工程：
ａ）炭素基質を発酵反応器に供給して、炭素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；
ｂ）窒素基質を発酵反応器に供給して、窒素基質を発酵ブロスに溶解させるか、または部分的に溶解させる；および
ｃ）発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０３５ｇ／ｌ未満に維持する、および／または発酵ブロスの硝酸塩濃度を０．０１ｇ硝酸塩／ｇバイオマス未満に維持する
を含み、ここで、少なくとも１つの微生物は、少なくとも１つのメタノトローフ微生物を含む、発酵方法。 - 発酵中の発酵ブロスの硝酸塩濃度は、０～０．０３５ｇ／ｌの範囲；例えば０．００１～０．０３３ｇ／ｌの範囲；例えば０．００２～０．０３ｇ／ｌの範囲；例えば０．００３～０．０２５ｇ／ｌの範囲；例えば０．００４～０．０２ｇ／ｌの範囲；例えば０．００５～０．０１５ｇ／ｌの範囲；例えば０．００７～０．０１ｇ／ｌの範囲にある、請求項１に記載の発酵方法。
- 窒素源は、アンモニア；アンモニウム化合物；および／または分子窒素から選択され、好ましくは、窒素源はアンモニアである、請求項１～２のいずれか一項に記載の発酵方法。
- 発酵は、バッチ発酵、流加発酵または連続発酵であり、好ましくは、発酵方法は連続発酵方法である、請求項１～３のいずれか一項に記載の発酵方法。
- ループ部分および上部槽を含む発酵反応器であって、前記ループ部分は、Ｕ部分を介して上昇流部分に接続される下降流部分を含み、上部槽は、以下：
（ｉ）上部槽をループ部分の下降流部分に接続し、上部槽中に存在する発酵液を上部槽からループ部分に流れさせる第１の出口；
（ｉｉ）上部槽をループ部分の上昇流部分に接続する第１の入口であって、ループ部分中に存在する発酵液をループ部分から上部槽に流れさせる第１の入口；
（ｉｉｉ）上部槽からの排出ガスを排出するためのベントチューブ；および
（ｉｖ）目視検査手段
を含み、ここで、発酵反応器はさらに以下：
（ｖ）アンモニウム化合物を含む基質を供給するための少なくとも１つの入口；および
（ｖｉ）発酵ブロス中の硝酸塩の濃度を決定するための少なくともセンサー
を含む、発酵反応器。 - 発酵反応器は、発酵ブロス中の硝酸塩濃度を自動的に調節するように構成および／または制御される少なくとも１つの供給ポンプを含む、請求項５に記載の発酵反応器。
- 発酵反応器はメタノトローフ生物の発酵のためのものである、請求項５～６のいずれか一項に記載の発酵反応器。
- 発酵反応器は、発酵液中の１つまたは複数のイオン種の含有量を決定するためのイオンセンサーまたは分析器を含み、好ましくは、１つまたは複数のイオン種は、リン酸塩、カルシウム、水素、亜硝酸塩および／またはアンモニウムから選択される、請求項５～７のいずれか一項に記載の発酵反応器。
- 発酵反応器のループ部分は、１つまたは複数のガス入口；１つまたは複数の給水口；および／または１つまたは複数の発酵培地入口を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の発酵反応器。
- １つまたは複数のガス入口；１つまたは複数の給水口；および／または１つまたは複数の発酵培地入口は、１つまたは複数のセンサーまたは分析器から得られるデータに基づいてコンピューターにより制御される、請求項９に記載の発酵反応器。
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