JP2022533191A - 拡大した幹細胞生成物を使用して、血液悪性腫瘍を有する患者の処置転帰を改善するための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、化学療法レジメンと組み合わせて拡大された造血幹細胞生成物で血液悪性腫瘍を処置するための方法および組成物に関する。本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または別の血液悪性腫瘍を有する患者の処置転帰を改善するための方法および組成物に関する。上記拡大した幹細胞生成物は、臍帯血ユニットのＨＬＡ型を互いに対しても、上記患者のＨＬＡ型に対しても適合させることなく（すなわち、関係なく）組み合わせた（例えば、プールした）多数のドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含む。上記拡大した幹細胞生成物は、化学療法レジメン（例えば、種々の強度の導入レジメン、救援レジメンまたは強化レジメン）の後に投与され得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月１７日出願の米国仮出願第６２／８４９，５８８号および２０１９年５月２３日出願の米国仮出願第６２／８５２，１４７号（これらの開示は、それらの全体において本明細書に参考として援用される）に基づく利益を主張する。
発明の分野
本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または別の血液悪性腫瘍を有する患者の処置転帰を改善するための方法および組成物に関する。上記拡大した幹細胞生成物は、臍帯血ユニットのＨＬＡ型を互いに対しても、上記患者のＨＬＡ型に対しても適合させることなく（すなわち、関係なく）組み合わせた（例えば、プールした）多数のドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含む。上記拡大した幹細胞生成物は、化学療法レジメン（例えば、種々の強度の導入レジメン、救援レジメンまたは強化レジメン）の後に投与され得る。
背景
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成人の急性白血病の原因第１位であり、全ての成人白血病のうちの大部分を占める。広範な研究がなされているにもかかわらず、ＡＭＬは低い長期生存と関連し；５年全生存率は、全患者の約２８．３％であり（ＳＥＥＲ）、２０歳齢以上の患者に対しては約２４％である。対照的に、２０歳齢より若い患者に関しては、５年全生存率は約６７％である。従来の化学療法は、いくらかのＡＭＬ患者ではその疾患の最初の寛解を効果的に達成し得る。しかし、その疾患の高度に不均一な性質に起因して、ＡＭＬ患者のうちの約３０％は化学療法に応答しない。化学療法が、大部分の患者においてその疾患の完全なクリアランスを達成せず、寛解状態の患者のうちの７０％超が、最初の処置後２年以内にＡＭＬの再発を被ることを注記することは、重要である。
再発性ＡＭＬ（これは、予後不良と関連する）を有する患者のための標準処置レジメンは、現在存在しない。再発性ＡＭＬは、微小残存病変（ＭＲＤ）と称される現象によって引きおこされ得、これは、化学療法に対して抵抗性を有するＡＭＬ細胞集団によって媒介される。ＭＲＤは、白血病幹細胞（ＬＳＣ）集団によって媒介されると提唱されている。なぜならこの細胞集団は、化学療法および他の処置に耐える能力を有するからである。従って、ＡＭＬを標的化しかつＭＲＤに対処して、その疾患の無再発のクリアランスを達成する処置の開発は、活発な研究分野になっている。
同種異系造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）は、ＡＭＬ患者の治療的処置選択肢として調査されており、従来の化学療法より高い無再発生存率と関連している。これらの移植片は、骨髄、末梢血、および／または臍帯血に一般に由来し、特に、例えば、ＧＭ－ＣＳＦを投与することによって、ドナーにおける幹細胞動員に続く末梢血移植片に関する。上記移植片の細胞は、血球および免疫細胞の異種ミックス（幹細胞、赤血球、白血球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞などが挙げられる）、および血小板を含む）である。造血幹細胞は、造血幹細胞移植片の非常に少数の細胞、全細胞集団の概して１％未満を構成する。ドナー由来のＴ細胞媒介性抗白血病効果は、患者における生存の増大に寄与する。なぜなら自家のかつＴ細胞枯渇移植片は、より高い再発率と関連することが報告されているからである。臨床におけるａｌｌｏ－ＨＳＣＴの使用は、適切にＨＬＡを適合させたドナーが不足していることによって制限されており、毒性および他の関連する合併症と関連している。免疫応答は、通常の組織損傷（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））を引きおこすことが報告されている。
微量移植片（ｍｉｃｒｏ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ）（生着しない幹細胞移植片の注入）および／または生着しないドナーリンパ球注入は、ＡＭＬ患者に関する潜在的な治療的処置として調査されている。単一のドナーから動員したＰＢＳＣの非血縁者ドナー不適合微量移植は、患者にある種の利益を提供することが報告されたが、その患者は、再発に至った（Ｐｕｎｗａｎｉら， ２０１８， Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ． Ｒｅｐ． ９：１８－２０）。ＨＬＡ不適合同種異系細胞療法はまた、部分適合させた末梢血細胞の動員を使用して、ＡＭＬの処置に関して調査されている（Ｍｏｈｒｂａｃｈｅｒら， ２０１４， Ｂｌｏｏｄ １２４：５９４４）。８名の患者のうちの５名は、３～１０ヶ月間＋継続する完全寛解／血液の回復不完全を伴う完全寛解（ＣＲ／Ｃｒｉ）を達成することが報告されたが、その著者らは、移植片の部分的適合にもかかわらず、その応答が期待していたほど継続しないことを報告した。
従って、ＡＭＬ、および他の血液悪性腫瘍を標的化して、その疾患の無再発のクリアランスを達成する処置の開発が未だに必要である。毒性の少ない治療を開発し、ＡＭＬ（再発／難治性ＡＭＬ、初発ＡＭＬ、および処置関連ＡＭＬを含む）、および他の血液悪性腫瘍（例えば、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））を有する患者に関して、既存の処置レジメンを使用して処置転帰を改善する必要性が、当該分野には未だに存在する。
Ｐｕｎｗａｎｉら， ２０１８， Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ． Ｒｅｐ． ９：１８－２０ Ｍｏｈｒｂａｃｈｅｒら， ２０１４， Ｂｌｏｏｄ １２４：５９４４
要旨
この要旨は、以下の詳細な説明においてさらに記載される、単純化した形態の概念の選択を導入するために提供される。この要旨は、特許請求した主題の重要な特徴を特定することが意図されるのではなく、特許請求した主題の範囲を決定することにおける補助として使用されることが意図されるのでもない。
本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または他の血液悪性腫瘍を有する患者の処置転帰を改善するための方法であって、化学療法レジメン、またはそのサイクルを、処置の必要性のある患者に投与する工程、および次いで、拡大した幹細胞生成物の固定用量を上記患者に投与する工程であって、ここで上記投与する工程は、上記拡大した幹細胞生成物のＨＬＡ型を上記患者のＨＬＡ型に適合させることなく行われることによる方法を提供する。上記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも２名のヒトドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞をプールしたものに由来する細胞ベースの生成物であり、ここで上記ドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、上記他のドナーのＨＬＡ型に適合させることなくかつ上記患者のＨＬＡ型に適合させることなく組み合わされる。上記拡大した幹細胞生成物は、Ｔ細胞および赤血球が枯渇されている。
ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有するヒト患者の処置転帰を改善するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記患者への投与のための拡大した造血幹細胞生成物を選択する工程であって、ここで上記選択する工程は、上記拡大した幹細胞生成物のＨＬＡ型も上記患者のＨＬＡ型も考慮に入れない（すなわち、適合させることをしない）工程；（ｂ）化学療法レジメン、またはそのサイクルを、上記患者に投与する工程；および（ｃ）上記選択した、拡大した幹細胞生成物の固定用量を上記患者に投与する工程を包含する方法がまた、提供される。上記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも２名のヒトドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞をプールしたものに由来する細胞ベースの生成物であり、ここで上記ドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、上記他のドナーのＨＬＡ型に適合させることなくかつ上記患者のＨＬＡ型に適合させることなくプールされる。上記のように、上記拡大した幹細胞生成物は、Ｔ細胞および赤血球が枯渇されている。
本発明は、ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有する患者を処置するための方法であって、上記方法は、化学療法レジメン、またはそのサイクルを、上記患者に投与する工程、および次いで、拡大した幹細胞生成物の固定用量を上記患者に投与する工程であって、ここで上記投与する工程は、上記拡大した幹細胞生成物のＨＬＡ型を上記患者のＨＬＡ型に適合させることなく行われることによる方法をさらに提供する。上記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも２名のヒトドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞をプールしたものに由来する細胞ベースの生成物であって、ここで上記ドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、上記他のドナーのＨＬＡ型に適合させることなくかつ上記患者のＨＬＡ型に適合させることなくプールされる。上記のように、上記拡大した幹細胞生成物は、Ｔ細胞および赤血球が枯渇される。
ある特定の実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の固定用量は、約５０００万個～約４億個の生きているＣＤ３４＋ 細胞を含む。ある特定の実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の固定用量は、約５０００万個、約７５００万個、約１億個、約２億個、約３億個、または約４億個の生きているＣＤ３４＋ 細胞を含む。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、「いつでも入手できる（ｏｆｆ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ）」製品として後に使用するために、調製、凍結保存および貯蔵される。凍結保存された、拡大した幹細胞生成物は、上記患者に投与する前に融解される。
上記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも２つの拡大した造血幹細胞集団および／または少なくとも２つの拡大した造血幹・前駆細胞集団のプールであって、ここで各細胞集団は、別個のドナーに由来するものである。いくつかの実施形態において、各細胞集団は、別個の臍帯血ユニットまたは胎盤血ユニットから（すなわち、出産時に異なるヒトから）得られる。上記プール中の少なくとも２つの細胞集団のＨＬＡ型は、互いに対してＨＬＡ適合されていない。必要に応じて、上記拡大した幹細胞生成物は、拡大する前にプールされた２つまたはこれより多くの造血幹細胞集団または造血幹・前駆細胞集団のプール（このプールは、次いで、拡大される）であるか、または上記細胞集団は、拡大後にプールされる。必要に応じて、上記拡大した幹細胞生成物は、拡大する前にプールされた２つまたはこれより多くのヒト臍帯血または胎盤血の幹細胞集団または幹・前駆細胞集団のプール（このプールは、次いで、拡大される）であるか、または上記細胞集団は、拡大後にプールされる。１つの実施形態において、上記プール中の細胞集団は、全て同じ人種（例えば、アフリカ系アメリカ人、白色人種、アジア人、ラテンアメリカ人、北米先住民、オーストラリア先住民、イヌイット、太平洋諸島民）の個体の臍帯血および／もしくは胎盤血に由来するか、または全て同じ民族性（例えば、アイルランド系、イタリア系、インド系、日系、中国系、ロシア系など）の個体の臍帯血および／もしくは胎盤血に由来する。別の実施形態において、上記プール中の造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、人種または民族性のいずれにも関することなしに組み合わされる。
さらに別の実施形態において、上記ＡＭＬまたは別の血液悪性腫瘍を有する患者の処置転帰を改善する方法は、上記投与する工程の前に、出産時に少なくとも２名のヒトの臍帯血および／または胎盤血から得られる、エキソビボで単離されたヒト臍帯血幹細胞、または幹・前駆細胞を拡大する工程を包含する。好ましくは、上記拡大する工程は、上記ヒト臍帯血幹細胞、または幹・前駆細胞と、Ｎｏｔｃｈ機能のアゴニストとを接触させることを包含する。上記アゴニストは、Ｄｅｌｔａタンパク質もしくはＳｅｒｒａｔｅタンパク質、またはＤｅｌｔａタンパク質もしくはＳｅｒｒａｔｅタンパク質のフラグメントであり得、そのフラグメントは、Ｎｏｔｃｈタンパク質を結合し得る。別の実施形態において、上記拡大する工程は、上記造血幹細胞、または幹・前駆細胞と、Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ－ＩｇＧ（ＤＸＩ）とを接触させることを包含する。
別の実施形態において、血液悪性腫瘍を有するヒト患者の処置転帰を改善するための方法であって、上記方法は、（ａ）出産時に少なくとも２名のヒトの臍帯血および／または胎盤血から得られ、単離されたヒト臍帯血幹細胞または幹・前駆細胞から、造血幹細胞、または造血幹・前駆細胞を富化して、造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を富化した細胞集団を生成する工程；（ｂ）造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を富化した上記細胞集団をエキソビボで拡大して、拡大した幹細胞生成物を生成する工程；（ｃ）化学療法レジメンまたはそのサイクルを、上記患者に投与する工程；ならびに（ｄ）上記拡大した幹細胞生成物の固定用量を、その必要性のあるヒト患者に投与する工程であって、ここで上記投与する工程は、上記拡大した幹細胞生成物の上記拡大した造血幹細胞または拡大した造血幹・前駆細胞のＨＬＡ型を上記患者のＨＬＡ型に適合させることなく、かつ上記拡大した幹細胞生成物の上記拡大した造血幹細胞または拡大した造血幹・前駆細胞のＨＬＡ型を互いに適合させることなく行われることを包含する方法が提供される。好ましい実施形態において、上記拡大した造血幹細胞は、ＣＤ３４＋ 細胞である。この方法は、工程（ｂ）の後に、上記拡大した幹細胞生成物を凍結および貯蔵する工程、ならびに工程（ｃ）の前に、上記拡大した幹細胞生成物を融解する工程をさらに包含し得る。ある特定の実施形態において、上記患者は、ＡＭＬ（例えば、初発ＡＭＬ、再発／難治性ＡＭＬまたは処置関連性ＡＭＬ）、または他の血液悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）または骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ））に罹患している。
定義
本明細書で記載されるものに類似または等価な任意の材料および方法が本発明の実施または試験において使用され得るが、その好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的のために、以下の用語が、以下に定義される。
本明細書で使用される場合、「拡大した幹細胞生成物（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）」とは、造血幹細胞または幹・前駆細胞を富化した細胞集団であって、上記細胞集団の造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を拡大するための技術に供されたものに言及し、この技術は、上記拡大技術に供されていない細胞のアリコートで認められるものと比較して、（ｉ）そのようにして拡大した細胞のアリコートにおいて造血幹細胞、もしくは造血幹・前駆細胞の数の増大、または（ｉｉ）そのようにして拡大した上記細胞のアリコートを注入した非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスにおいて生着の増強によって示される場合に、限界希釈分析によって決定される重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）再構築細胞の数の増大を生じることが示されている（米国特許公開番号２０１３／００９５０７９； Ｄｅｌａｎｅｙら， ２０１０， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １６（２）：２３２－２３６を参照のこと）。代表的には、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、ヒト臍帯血および／またはヒト胎盤血に由来する。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、Ｎｏｔｃｈアゴニスト拡大法を使用して調製される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、ＤＸＩ拡大法を使用して調製される。上記拡大した幹細胞生成物は、Ｔ細胞および赤血球が枯渇されている。
本明細書で使用される場合、「化学療法レジメン（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｇｉｍｅｎ）」とは、使用されるべき薬物、それらの投与量、処置の頻度および継続時間、ならびに他の考慮事項を定義する、化学療法に関するレジメンに言及する。このようなレジメンは、いくつかの化学療法薬を、併用化学療法において組み合わせ得る。化学療法において使用される薬物の大部分は、細胞増殖抑制性または細胞傷害性である。
本発明の前述の局面および付随する利点の多くは、添付の図面とともに理解される場合、以下の詳細な説明を参照することによってそれらがよりよく理解されることになることから、より容易に認識される。
図１は、ＣＤ３４＋ 細胞の集団を富化し、その富化した細胞集団を拡大するための例示的手順を示すフローチャートを図示する。
図２は、実施例３に記載される臨床試験の間の被験体内訳を示す。
詳細な説明
例証的実施形態が、例証および記載されている一方で、種々の変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、その中で行われ得ることが認識される。
造血幹／前駆細胞移植、特に、自家造血幹／前駆細胞移植は一般に、固形腫瘍または多発性骨髄腫のための高用量化学療法後の骨髄形成不全（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｐｌａｓｉａ）を救済するために行われる。同種異系造血幹細胞移植片は、病的な血液および免疫系を根絶し、健常ドナー造血幹細胞移植片を注入することによって、血液のホメオスタシスを回復させることによって、白血病および他の造血器悪性腫瘍を治癒するにあたって有用であることが見出されている。同種異系造血幹細胞移植におけるいつまでも残る問題のうちの１つは、成功裡の処置のために患者と適合する十分なＨＬＡ抗原および／またはアレルを有する、応じられる同種異系ドナーが欠如していることである。より近年になって、拡大したヒト臍帯血幹／前駆細胞サンプルのＨＬＡ型または上記患者のＨＬＡ型を考慮に入れることなく、上記拡大した造血幹／前駆細胞を選択することによって、免疫無防備状態のヒト患者において造血機能を提供するための方法および組成物が、考案された。上記造血幹／前駆細胞サンプルは、造血幹細胞移植または高用量化学療法を受けた後に病的状態および死亡の高リスクにあるヒト患者において、一過性に、造血機能を置き換えるかもしくは補充する、または生命を脅かす感染症の率を低減するために使用され得る。予測外なことに、ＨＬＡ型決定が行われずかつ細胞生成物がＴ細胞を含まない、拡大した造血幹細胞または造血幹・前駆細胞生成物は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または特定の他の血液悪性腫瘍を有するヒト患者を処置するおよび／またはその転帰を改善する機会を増大させることにおいて有用であることが見出された。
本発明は、ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有する患者を処置する、およびその処置転帰を改善するための方法であって、上記方法は、化学療法レジメンを上記患者に投与し、続いて、拡大した幹細胞生成物の固定用量を、その必要性のある患者に投与する工程であって、ここで上記投与する工程は、上記拡大した幹細胞生成物のＨＬＡ型を上記患者のＨＬＡ型に適合させることなく行われることによる方法を提供する。上記拡大した幹細胞生成物は、互いにも、上記患者のＨＬＡ型にもＨＬＡ適合させていない造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含む細胞ベースの生成物である。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも２名の異なるヒトドナーの臍帯血ユニットまたは胎盤血ユニットに由来し、互いにも、上記患者のＨＬＡ型にもＨＬＡ型適合されていない造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含む、造血幹細胞または造血幹・前駆細胞をプールしたものに由来するプールした生成物である。語句「ＨＬＡ型を適合させることなく（ｗｉｔｈｏｕｔ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｈｅ ＨＬＡ－ｔｙｐｅ）」、「適合されていない（ｕｎｍａｔｃｈｅｄ）」などは、上記患者と上記拡大した幹細胞生成物中の造血幹細胞または造血幹・前駆細胞との間で、ＨＬＡ抗原またはアレル（ＨＬＡ型）のいずれかを適合させる手段がとられていないことを意味する。上記拡大した幹細胞生成物の選択は、上記拡大した幹細胞生成物が投与される上記患者のＨＬＡ型を適合させることなく行われる。同様に、例えば、臍帯血ユニットまたは胎盤血ユニットに由来する、上記拡大した幹細胞生成物が由来する、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の供給源に関して、語句「ＨＬＡ型を適合させることなく」とは、拡大した幹細胞生成物中の上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の間で、ＨＬＡ抗原またはアレル（ＨＬＡ型）のうちのいずれかを適合させる手段がとられていないことを意味する。上記拡大した幹細胞生成物はＴ細胞および赤血球が枯渇されていることがまた、注記されるべきである。
上記拡大した幹細胞生成物は、代表的には、化学療法レジメンの後に投与される。上記化学療法レジメンは、単剤または多剤レジメンであり得る。いくつかの実施形態において、上記化学療法レジメンは、導入レジメンまたは強化レジメンである。導入レジメンは、代替の処置が存在しない進行がんを提示する患者のための一次処置としての化学療法の使用を包含する。強化レジメンは、白血病において本質的には使用される、寛解直後期の間の反復処置サイクルを含む。いくつかの実施形態において、上記化学療法レジメンは、救援レジメンである。救援レジメンは、治癒または延命を期待して、初期処置後の悪性腫瘍の再発を有する患者のおける化学療法の使用を包含する。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、上記化学療法レジメンの約１２～約４８時間後に、または好ましくは上記化学療法レジメンの約２４～３６時間後に投与される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、上記化学療法レジメンの各サイクルの約１２～約４８時間後に、または好ましくは各サイクルの約２４～３６時間後に投与され、ここで上記化学療法レジメンは、１回より多くのサイクルで投与される。
いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、化学療法レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、上記患者に投与される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、導入レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、上記患者に投与される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、強化レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、上記患者に投与される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、救援レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、上記患者に投与される。いくつかの実施形態において、上記化学療法レジメン（例えば、導入レジメン、救済レジメン、または強化レジメン）が、１より多くのサイクルにおいて投与される場合、上記拡大した幹細胞生成物は、上記レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、サイクルまたは各サイクル後に上記患者に投与される。本明細書で使用される場合、「．．．レジメンおよびその活性代謝産物が患者の血液から消失した後に（ａｆｔｅｒ ．．． ｒｅｇｉｍｅｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｃｌｅａｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ ｂｌｏｏｄ）」とは、患者の血液中のＣＤ３４＋ 幹細胞の生存性に、例えば、ＣＤ３４＋ 幹細胞または前駆細胞の生存性を、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも２０％減少させることによって影響を及ぼす上記レジメン（例えば、導入レジメン、救援レジメンまたは強化レジメン）の構成要素およびそれらの構成要素の活性代謝産物のクリアランスに言及する。
各レジメンまたはそのサイクル後の上記拡大した幹細胞生成物の投与は、ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有する患者の処置転帰を、例えば、患者が寛解（例えば、完全寛解（ＣＲ）または血液の回復不完全を伴う完全寛解（Ｃｒｉ）（Complete Remission without an incomplete hematologic recovery））を達成する機会を改善することによって改善し得る。いくつかの実施形態において、上記改善した処置転帰は、上記拡大した幹細胞生成物の投与後に、上記患者におけるＩＬ－２レベルの増大と関連する。増大したＩＬ－２レベルは、上記患者において増大した免疫応答の誘導である。いかなる特定の理論によっても拘束されることは意図しないが、上記拡大した幹細胞生成物は、多数のヒトドナーの適合されていない臍帯血ユニットに由来することから、上記拡大した造血幹細胞生成物は、異なるＨＬＡ型および／またはアレルを有する造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含む。上記患者への投与後の上記拡大した幹細胞生成物の多くのミスマッチのＨＬＡ型またはアレルの存在は、増大した抗原負荷に潜在的に起因して、上記患者の免疫応答を活性化および／または増大させる。上記患者の免疫応答の得られた活性化または刺激は、部分的には、上記患者自身のＴ細胞および／またはＮＫ細胞の活性化に起因し得る。
上記拡大した幹細胞生成物は、生着して、患者に治療利益を提供することは要求も予測もされない。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、上記患者において一過性にも恒久的にも生着しない。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、上記患者において一過性に生着しない。生着は、代表的には、上記患者における混合キメラ現象として検出され、上記拡大した幹細胞生成物に由来する細胞が、上記拡大した幹細胞生成物の投与の約７～約１４日後に、上記患者の血液中で検出されることを意味する。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、一過性にまたは長期間のいずれでも、造血の再構成を測定可能に増大させない。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、患者における感染率を減少させない。
頻繁な感染は、血液悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）の処置において使用される化学療法レジメンの一般的な合併症であり、処置の失敗の重大な原因である。化学療法剤はまた、大いに免疫抑制性および／または高度に骨髄抑制性であり得、これは、長期間の好中球減少症をもたらし得る。化学療法レジメン後の上記拡大した幹細胞生成物の投与は、必ずしも化学療法後の感染性の合併症を防止することも一過性の造血回復を促進することもなく、しかし、白血病に対する宿主免疫応答をむしろ誘導することによって、処置転帰を改善し得る。
拡大した幹細胞生成物の調製
上記拡大した幹細胞生成物は、造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含み、Ｔ細胞および赤血球が実質的に枯渇しているので、通常は、ＣＤ３４＋ 造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の富化された数を含む。上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、多数のＨＬＡ型を含む。なぜなら上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、プールする前に互いに対して適合されておらず、上記患者に対しても適合されていないからである。本明細書で使用される場合、Ｔ細胞が実質的に枯渇しているとは、上記拡大した幹細胞生成物中で１％未満のＣＤ３＋ 細胞、または０．５％未満のＣＤ３＋ 細胞、または０．１％未満のＣＤ３＋ 細胞に言及する。
いくつかの実施形態において、上記ＣＤ３４＋ 造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、臍帯血または胎盤血に由来する。ヒト臍帯血および／またはヒト胎盤血は、臍帯血幹細胞の代表的な供給源である。このような血液は、当該分野で公知の方法によって得られ得る。ヒトの出産時に臍帯血および胎盤血を集めることの考察に関して、例えば、米国特許第５，００４，６８１号および同第７，１４７，６２６号、ならびに米国特許公開番号２０１３／００９５０７９（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。臍帯血および／またはヒト胎盤血の収集は、無菌条件下で行われる。収集の際に、臍帯血または胎盤血は、抗凝固剤（例えば、ＣＰＤ（クエン酸－リン酸－デキストロース）、ＡＣＤ（クエン酸－デキストロース）、アルセバー溶液（Ａｌｓｅｖｅｒら， １９４１， Ｎ． Ｙ． Ｓｔ． Ｊ． Ｍｅｄ． ４１：１２６）、Ｄｅ Ｇｏｗｉｎの溶液（Ｄｅ Ｇｏｗｉｎ，ら， １９４０， Ｊ． Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓ． １１４：８５０）、Ｅｄｇｌｕｇａｔｅ－Ｍｇ（Ｓｍｉｔｈ，ら， １９５９， Ｊ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． ３８：５７３）、Ｒｏｕｓ－Ｔｕｒｎｅｒ溶液（Ｒｏｕｓ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ， １９１６， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２３：２１９）、他のグルコース混合物、ヘパリン、ビスクマ酢酸エチルなど）と混合される。一般には、Ｈｕｒｎ， １９６８， Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６－１６０）を参照のこと。１つの実施形態において、ＡＣＤが使用され得る。
臍帯血は、好ましくは、臍帯からの直接排液によって、および／または娩出された胎盤から、臍帯静脈および膨張した静脈における針吸引によって、得られ得る。好ましくは、その集められたヒト臍帯血および／または胎盤血は、汚染がなく、特に、ウイルス汚染がない。
ある特定の実施形態において、以下の試験を、慣用的にまたは臨床上示される場合のいずれかで、その集めた血液に対して行い得る：
細菌培養： 微生物汚染が存在しないことを担保するために、確立されたアッセイが行われ得る（例えば、好気的条件および嫌気的条件下での細菌の慣用的な病院での培養）。
病原性微生物に関する診断スクリーニング： 特定病原微生物が存在しないことを担保するために、種々の診断試験が使用され得る。血液を通じで伝播する多くの病原体のうちのいずれかに関する診断スクリーニングは、標準的手順によって行われ得る。１つの例として、その集められた血液サンプル（または母体血液サンプル）は、ウイルスの存在に関する診断スクリーニングに供され得る。多くの公知のアッセイシステムのうちのいずれかが、ビリオン、ウイルスによってコードされるタンパク質、ウイルス特異的核酸、ウイルスタンパク質に対する抗体などの検出に基づいて使用され得る。その集められた血液はまた、感染性疾患（ヒト免疫不全ウイルス－１または２（ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルスＩおよびＩＩ（ＨＴＬＶ－ＩおよびＨＴＬＶ－ＩＩ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、サイトメガロウイルス、梅毒、コロナウイルス、ウェストナイルウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない）に関して試験され得る。
好ましくは、臍帯血を収集する前に、母体の健康歴は、臍帯血細胞が例えば、遺伝性疾患または感染性疾患（例えば、がん、白血病、免疫障害、神経学的障害、肝炎、またはＡＩＤＳ）を伝播することを引きおこし得るリスクを同定するために決定される。その集めた臍帯血は、細胞生存性、ＨＬＡ型決定、ＡＢＯ／Ｒｈ型決定、ＣＤ３４＋ 細胞計数、および全有核細胞計数のうちの１またはこれより多くに関して試験を受けている可能性がある。
上記臍帯血および／または胎盤血がいったん、出産時にヒトドナーから収集されると、その血液は、富化した造血幹細胞集団、または富化した造血幹・前駆細胞集団を生成するために処理される。好ましくは、上記造血幹細胞、または造血幹・前駆細胞は、ＣＤ３４＋ 細胞または主にＣＤ３４＋ 細胞である。好ましくは、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団は、Ｔ細胞および赤血球が実質的に枯渇しており、ＣＤ３４＋ 幹細胞および／またはＣＤ３４＋ 幹・前駆細胞を富化した細胞集団を生じる。富化は、従って、上記細胞集団中の造血幹細胞、または造血幹・前駆細胞のパーセンテージが（上記富化手順前の集団中のパーセンテージと比較して）増大されるプロセスに言及する。精製は、富化の１つの例である。ある特定の実施形態において、上記富化手順前の集団と比較して、上記拡大した幹細胞生成物中の細胞のパーセンテージとしてのＣＤ３４＋ 細胞（または他の適切な抗原陽性細胞）の数の増大は、少なくとも２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、または少なくとも３５０倍であり、好ましくは、１００～２００倍または１００～４００倍である。
富化のために処理する前に、その集められた臍帯血および／または胎盤血は、新鮮であり得るか、または事前に凍結保存されている可能性がある。細胞分離／選択に関して当該分野で公知の任意の適切な技術は、造血幹細胞、または造血幹・前駆細胞の富化を行うために使用され得る。細胞表面マーカーの差次的発現に依拠する方法が、使用され得る。例えば、細胞表面マーカーＣＤ３４を発現する細胞は、ＣＤ３４を発現する細胞が保持され、ＣＤ３４を発現しない細胞が保持されないように、ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体を使用して陽性選択され得る。さらに、使用される分離技術は、選択される細胞集団の生存性を最大化するべきである。使用される特定の技術は、分離効率、方法論の細胞傷害性、実行の容易さおよび速度、ならびに精巧な装置および／または技術的熟練の必要性に依存する。
分離のための手順としては、抗体をコーティングした磁性ビーズを使用する磁性分離、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリクス（例えば、プレート）に付着させた抗体での「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、または他の便利な技術が挙げられ得る。正確な分離／選択を提供する技術としては、種々の程度の精巧化（例えば、複数のカラーチャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど）を有し得る蛍光活性化セルソーターが挙げられる。
選択プロセスにおいて使用される抗体は、特定の細胞タイプの分離の容易さを可能にするために、磁性ビーズ（これは、直接分離を可能にする）、ビオチン（これは、支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンで除去され得る）、蛍光色素（これは、蛍光活性化セルソーターとともに使用され得る）などのようなマーカーと結合体化されてもよい。その残りの細胞の生存性に過度に有害でない任意の技術が使用されてもよい。例としては、例えば、ｔｈｅ ＦＤＡ承認のＣｌｅｎｉＭＡＣｓ（登録商標）処理システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ）、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ ＣＤ３４単離システム（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）、ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）などが挙げられる。
好ましい実施形態において、新鮮な臍帯血ユニットは、磁性セルセパレーター（例えば、酸化鉄および特異的モノクローナル抗体にカップリングしたデキストランから構成されるナノサイズの超常磁性粒子を使用するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに、磁性粒子に直接的にまたは間接的に結合体化した抗ＣＤ３４抗体を使用して、ＣＤ３４＋ 細胞を選択する（すなわち、富化する）ために処理される。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒは、１回使い切りの使い捨てチューブセットを供給した閉じた無菌システムである。その使い捨てチューブセットは、ＣＤ３４＋ 細胞を富化するために、集めた臍帯血および／または胎盤血の単一ユニットを処理するために使用され得、後に廃棄され得る。
一実施形態において、２またはこれより多くの臍帯血および／または胎盤血ユニットが、造血幹細胞、または造血幹・前駆細胞を富化する前に、プールされ得る。別の実施形態において、ＣＤ３４＋ 幹細胞またはＣＤ３４＋ 幹・前駆細胞の個々の集団は、造血幹細胞、または造血幹・前駆細胞を富化した後にプールされ得る。具体的実施形態において、プールされる臍帯血および／もしくは胎盤血ユニット、または造血幹細胞もしくは造血幹・前駆細胞の集団の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０、または前述の数のうちの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、上記プールは、２～８、２～１０、４～８、４～１０、２～２０、４～２０、２～２５もしくは４～２５、および２０もしくは２５以下の、臍帯血および／もしくは胎盤血ユニット、またはＣＤ３４＋ 造血幹細胞もしくは造血幹・前駆細胞集団を含む。上記臍帯血および／もしくは胎盤血ユニットまたは造血幹細胞もしくは造血幹・前駆細胞集団は、上記造血幹細胞もしくは造血幹・前駆細胞のＨＬＡ型にかかわらずプールされる。ある特定の実施形態において、上記プール中の細胞は、同じ人種（例えば、アフリカ系アメリカ人、白色人種、アジア人、ラテンアメリカ人、北米先住民、オーストラリア先住民、イヌイット、太平洋諸島民）の個体の臍帯血および／もしくは胎盤血に由来するか、または同じ民族性（例えば、アイルランド系、イタリア系、インド系、日系、中国系、ロシア系など）の個体の臍帯血および／もしくは胎盤血に由来する。他の実施形態において、上記プール中の細胞は、人種にも民族性にもかかわらず組み合わされる。
必要に応じて、造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を富化する前に、上記臍帯血または胎盤血の赤血球および白血球は、分離され得る。その赤血球および白血球の分離がいったん行われた後、その赤血球画分は廃棄され得、その白血球画分は、ＣＤ３４＋ 造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を富化するために、上記のように磁性セルセパレーターにおいて処理され得る。白血球および赤血球画分の分離は、当該分野で公知の任意の方法（遠心分離技術が挙げられる）によって行われ得る。使用され得る他の分離法としては、例えば、市販の製品ＦＩＣＯＬＬＴＭまたはＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥＴＭまたはＰＥＲＣＯＬＬＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）の使用が挙げられる。ＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥＴＭは、通常はコニカルチューブの底に配置され、全血が上に重層される。遠心分離後、以下の層が、上から下に、コニカルチューブの中に見える：血漿および他の構成要素、末梢血単核細胞（白血球）を含むバフィーコートといわれる単核細胞の層、ＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥＴＭ、ならびに赤血球および顆粒球（これは、ペレットの形態で存在するはずである）。この分離技術は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の容易な採取を可能にする。
必要に応じて、ＣＤ３４＋ 細胞選択の前に、臍帯血または胎盤血ユニットのアリコートは、全有核細胞計数および／またはＣＤ３４＋ 細胞含有量に関してチェックされ得る。具体的実施形態において、上記ＣＤ３４＋ 細胞分離の後に、ＣＤ３４＋ 細胞およびＣＤ３４－ 細胞両方の画分が回収される。必要に応じて、ＤＮＡは、たとえ上記患者に対するまたは他の臍帯血もしくは胎盤血ユニットに対するＣＤ３４＋ 細胞画分のＨＬＡ適合が行われないとしても、初期ＨＬＡ型決定および将来的なキメラ現象研究のためにＣＤ３４－ 細胞画分のサンプルから抽出され得る。
上記ＣＤ３４＋ 富化した幹細胞または幹・前駆細胞集団は、例えば、貯蔵または輸送のために適した細胞培養培地中に懸濁することによって、拡大する前に、引き続いて処理され得る。好ましい実施形態において、上記細胞培養培地は、ＣＤ３４＋ 造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の生存性の維持に適した細胞培養培地である。例えば、上記細胞培養培地は、増殖因子の存在下での（例えば、以下の濃度： ５０～３００ ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、５０～３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３レセプターリガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、５０～１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、５０～１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６（ＩＬ－６）、および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３（ＩＬ－３）において存在する）ＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍまたはＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）であり得る。より具体的な実施形態においては、３００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３レセプターリガンド、１００ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン、１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３、または５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３レセプターリガンド、５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－３が使用される。別の好ましい実施形態において、上記細胞培養培地は、１０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトインターロイキン－３（ｒｈＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトインターロイキン－６（ｒｈＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＦｌｔ－３リガンド（ｒｈＦｌｔ－３Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）を補充した、ＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍまたはＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）からなる。別の好ましい実施形態において、上記細胞培養培地は、組換えヒトｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｌｔ－３Ｌ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＩＬ－６（各々、５０ｎｇ／ｍｌ 最終濃度）、およびｒｈＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ 最終濃度）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ ＩＩ， ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）からなる。
具体的実施形態において、上記臍帯血および／または胎盤血ユニットは、赤血球が枯渇しており、赤血球枯渇画分中のＣＤ３４＋ 細胞の数が決定される。好ましくは、３５０万個より多くのＣＤ３４＋ 細胞を含む上記臍帯血および／または胎盤血サンプルは、上記の富化方法に従う。
上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞が、上記の富化方法または当該分野で公知の他の方法に従って（例えば、出産時にヒトから集めたヒト臍帯血および／またはヒト胎盤血から）単離された後、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、造血幹細胞または造血幹・前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ 細胞）の数を増大させるために拡大される。造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の拡大された（すなわち、その数が増大された）集団を生じる、造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の数を拡大させるための当該分野で公知の任意の方法が、使用され得る。好ましくは、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、細胞成長条件（例えば、有糸***を促進する）下で培養され、その結果、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、成長および***して（増殖して）、ＣＤ３４＋ 造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の拡大された集団を得る。１つの実施形態において、出産時に１人のヒトの臍帯血および／または胎盤血に由来する造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の個々の集団は、他の造血幹細胞または造血幹・前駆細胞のＨＬＡ型に適合させることなく、拡大前または拡大後に、プールされ得る。別の実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、プールする前に拡大される。好ましくは、拡大のために使用される技術は、（ｉ）造血幹細胞または幹・前駆細胞の拡大されていない集団と比較して、拡大した幹細胞生成物中の造血幹細胞、または造血幹・前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ 細胞）の数の増大を生じる（ここで拡大されていない細胞集団および拡大された細胞集団は、幹細胞または幹・前駆細胞の同じ供給源の異なるアリコートに由来し、拡大されていない細胞ではなく拡大された細胞が、拡大技術に供される）ことが示されたものである。
拡大技術としては、米国特許第７，３９９，６３３ Ｂ２号； 米国特許公開番号２０１３／００９５０７９； Ｄｅｌａｎｅｙら， ２０１０， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １６（２）： ２３２－２３６； Ｚｈａｎｇら， ２００８， Ｂｌｏｏｄ １１１：３４１５－３４２３；またはＨｉｍｂｕｒｇら， ２０１０， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６（４）：４７５－８２（各々本明細書に参考として援用される）、ならびに以下に記載されるものに記載される技術が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、増殖因子の存在下で、培養培地中で培養され、細胞増殖培地（例えば、有糸***を促進する）に曝され、その結果、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は増殖して、造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の拡大された集団を得る。好ましい実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、分化を阻害するために有効な量のＮｏｔｃｈ機能のアゴニスト（代表的には、固定化されたＮｏｔｃｈ機能のアゴニスト）の存在下で培養され、細胞増殖条件（例えば、有糸***を促進する）に曝され、その結果、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は増殖して、拡大された造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団を生じる。より好ましい実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、分化を阻害するために有効な量のＮｏｔｃｈ機能のアゴニストとともに、および増殖因子の存在下で培養され、細胞増殖条件（例えば、有糸***を促進する）に曝され、その結果、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は増殖して、拡大された造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団を得る。そのように得られた拡大された造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団は、「いつでも入手できる製品」として後に使用するために、凍結および保存され得る。必要に応じて、上記Ｎｏｔｃｈ経路アゴニストは、患者への移植の前に、上記拡大された造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団から（例えば、分離または希釈によって）不活性化または除去される。
具体的実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、もしくは２５日間、またはより長く培養されるか；あるいは、好ましくは、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、少なくとも１０日間または約７～約１４日間培養される。
上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を拡大するための例示的な培養条件は、以下のヒト増殖因子： 幹細胞因子、Ｆｌｔ－３レセプターリガンド、トロンボポエチン、インターロイキン－６およびインターロイキン－３を補充した無血清培地中、フィブロネクチンフラグメントおよびヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合されたＤｅｌｔａタンパク質の細胞外ドメイン（Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ－ＩｇＧ）の存在下で、７～１４日間細胞を培養することを含む。好ましくは、前述の増殖因子は、以下の濃度で存在する： ５０～３００ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子、５０～３００ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ－３レセプターリガンド、５０～１００ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン、５０～１００ｎｇ／ｍｌ インターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌ インターロイキン－３。より具体的な実施形態においては、３００ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子、３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３レセプターリガンド、１００ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン、１００ｎｇ／ｍｌ インターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌ インターロイキン－３、または５０ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３レセプターリガンド、５０ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン、５０ｎｇ／ｍｌ インターロイキン－６および１０ｎｇ／ｍｌ インターロイキン－３が、使用される。より好ましい実施形態において、上記細胞培養培地は、１０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトインターロイキン－３（ｒｈＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトインターロイキン－６（ｒｈＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＦｌｔ－３リガンド（ｒｈＦｌｔ－３Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）を補充したＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）からなる。別のより好ましい実施形態においては、上記細胞培養培地は、組換えヒトｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｌｔ－３Ｌ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＩＬ－６（各々、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、およびｒｈＩＬ－３（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ ＩＩ， ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）からなる。
いくつかの実施形態において、ＤＸＩ媒介性拡大は、以下のように行われる： Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ－ＩｇＧ（ＤＸＩ）は、細胞培養ディッシュの表面に固定化される。具体的実施形態において、上記細胞培養ディッシュは、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を添加する前に、４℃において一晩（または３７℃において最低２時間）、リン酸緩衝化生理食塩水中の２．５μｇ／ｍｌ Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ－ＩｇＧおよび５μｇ／ｍｌ ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（組換えヒトフィブロネクチンフラグメント（ｒＦＮ－ＣＨ－２９６ともいわれる））でコーティングされる。好ましくは、上記細胞培養培地は、１０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトインターロイキン－３（ｒｈＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトインターロイキン－６（ｒｈＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＦｌｔ－３リガンド（ｒｈＦｌｔ－３Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）を補充したＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、または組換えヒトｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｌｔ－３Ｌ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＩＬ－６（各々、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、およびｒｈＩＬ－３（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ ＩＩ， ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）からなる。
造血幹細胞または幹・前駆細胞を拡大するための他の例示的な培養条件は、Ｚｈａｎｇら， ２００８， Ｂｌｏｏｄ １１１：３４１５－３４２３（本明細書に参考として援用される）に示される。具体的実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、ヘパリン、幹細胞因子、トロンボポエチン、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、線維芽細胞増殖因子－１（ＦＧＦ－１）、およびＡｎｇｐｔｌ３またはＡｎｇｐｔｌ５を補充した無血清培地中で培養され得る。具体的実施形態において、上記培地は、１０μｇ／ｍｌ ヘパリン、１０ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ－２、および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－１、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ３またはＡｎｇｐｔｌ５が補充され、細胞は、約１９～２３日間培養される。別の具体的実施形態においては、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、１０μｇ／ｍｌ ヘパリン、１０ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－１、および１００ ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ５を補充した無血清培地中で約１１～１９日間上記細胞を培養することによって拡大され得る。別の具体的実施形態においては、上記造血幹細胞または幹・前駆細胞は、５０ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子、１０ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン、５０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ－３レセプターリガンド、および１００ｎｇ／ｍｌ インスリン様増殖因子結合タンパク質－２（ＩＧＦＢＰ２）または５００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ５を補充した無血清培地中で約１０日間上記細胞を培養することによって拡大され得る。さらに別の実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、１０μｇ／ｍｌ ヘパリン、１０ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－１、５００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇｐｔｌ５、および５００ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦＢＰ２を補充した無血清培地中で約１１日間上記細胞を培養することによって拡大され得る。Ｚｈａｎｇら， ２００８， Ｂｌｏｏｄ １１１：３４１５－３４２３（本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を拡大するための別の例示的培養条件は、Ｈｉｍｂｕｒｇら， ２０１０， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６（４）：４７５－４８２（本明細書に参考として援用される）に示される。具体的実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、トロンボポエチン、幹細胞因子、Ｆｌｔ－３レセプターリガンド、およびプレイオトロフィンを補充した液体懸濁培養物中で培養され得る。具体的実施形態において、上記液体懸濁培養物は、２０ｎｇ／ｍｌ トロンボポエチン、１２５ｎｇ／ｍｌ 幹細胞因子、５０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ－３レセプターリガンド、および１０、１００、５００、または１０００ｎｇ／ｍｌ プレイオトロフィンが補充され、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、約７日間培養される。
上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞の拡大後、細胞および生きているＣＤ３４＋ 細胞の総数が、決定される。例えば、拡大中の１４日目に、生きている総有核細胞計数を決定するために、サンプルが採取され得る。さらに、ＣＤ３４＋ 細胞の総数が、マルチパラメーターフローサイトメトリー、および従って、サンプル中のＣＤ３４＋ 細胞のパーセンテージによって決定され得る。好ましくは、ＣＤ３４＋ 細胞の絶対数における少なくとも１０倍の増大を生じなかった培養物は、中止される。同様に、凍結保存前または融解後に、上記拡大した造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団のアリコートが、上記拡大された集団中の生きている全ＣＤ３４＋ 細胞数を計算するために、全有核細胞および生きているＣＤ３４＋ 細胞のパーセンテージの決定のために採取され得る。好ましい実施形態において、５０００万個未満のＣＤ３４＋ 生細胞を含むそれらの集団は、廃棄され得る。
具体的実施形態において、生きている全ＣＤ３４＋（または他の抗原陽性）細胞数は、治療的使用のための最終生成物を発売するための効力アッセイと見做され得る。生存性は、当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、トリパンブルー排除または７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）排除によって、決定され得る。好ましくは、全有核細胞数（ＴＮＣ）および他のデータは、上記生成物の効力を計算するために使用される。生きているＣＤ３４＋ 細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーおよび生きている細胞によって排除される染料の使用によって評価され得る。生きているＣＤ３４＋ 細胞のパーセンテージ＝サンプルのアリコート中の７－ＡＡＤ（または他の適切な染料）を排除するＣＤ３４＋ 細胞の数を、そのアリコートのＴＮＣ（生きているおよび生きていない両方）で除算したもの。上記サンプル中の生きているＣＤ３４＋ 細胞は、以下のように計算され得る： 生きているＣＤ３４＋ 細胞＝サンプルのＴＮＣ×サンプル中の生きているＣＤ３４＋ 細胞の％。生きているＣＤ３４＋ 細胞における富化または拡大中の比例した増大は、以下のように計算され得る： 培養後の生きている全ＣＤ３４＋ 細胞／培養前の生きている全ＣＤ３４＋ 細胞。
いくつかの実施形態において、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、上記のように、所定の期間中のＮｏｔｃｈ機能のアゴニストおよび増殖因子またはサイトカインのうちの１またはこれより多くの存在下で上記細胞を培養することによって拡大される。Ｎｏｔｃｈ機能のアゴニスト（Ｎｏｔｃｈアゴニストともいわれる）は、Ｎｏｔｃｈ経路機能の活性化を促進する、すなわち、引きおこすまたは増大させる薬剤である。本明細書で使用される場合、「Ｎｏｔｃｈ機能（Ｎｏｔｃｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」とは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）（シグナル伝達（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ））経路によって媒介される機能（Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインの核移行、ＲＢＰ－ＪκもしくはそのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓの核移行；Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ ｃｏｍｐｌｅｘ、例えば、ＭａｓｔｅｒｍｉｎｄのｂＨＬＨ遺伝子の活性化；ＨＥＳ－１遺伝子もしくはＫＢＦ２（ＣＢＦ１ともいわれる）遺伝子の活性化；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ神経芽細胞分離の阻害；およびＤｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ／Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｆｒｉｎｇｅ、ＤｅｌｔｅｘもしくはＲＢＰ－Ｊκ／Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ、またはそれらのホモログもしくはアナログへのＮｏｔｃｈの結合が挙げられるが、これらに限定されない）を意味する。概して、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路および活性化の際のその効果の考察に関してはＫｏｐａｎら， ２００９， Ｃｅｌｌ １３７：２１６－２３３による総説記事を参照のこと；Ｊａｒｒｉａｕｌｔら， １９９８， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８：７４２３－７４３１（ともにそれらの全体において本明細書に参考として援用される）もまた参照のこと。
Ｎｏｔｃｈ活性化は、Ｎｏｔｃｈアゴニストに細胞を曝すことによって行われる。上記Ｎｏｔｃｈ機能のアゴニストは、可溶性分子、細胞表面上に組換え発現される分子、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞が曝露される細胞単層上の分子、または固相上に固定化される分子であり得るが、これらに限定されない。例示的なＮｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する細胞外結合リガンドＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ、またはＮｏｔｃｈの細胞外ドメインに結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化するＤｅｌｔａもしくはＳｅｒｒａｔｅのフラグメントである。ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅの核酸配列およびアミノ酸配列は、いくつかの種（ヒトを含む）から単離されており、当該分野で公知であり、国際特許公開番号ＷＯ ９３／１２１４１、ＷＯ ９６／２７６１０、ＷＯ ９７／０１５７１、およびＧｒａｙら， １９９９， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １５４：７８５－７９４において開示される。好ましい実施形態において、上記Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ｍｙｃエピトープタグに融合されたＤｅｌｔａもしくはＳｅｒｒａｔｅタンパク質の細胞外ドメインからなるＤｅｌｔａもしくはＳｅｒｒａｔｅタンパク質（それぞれ、Ｄｅｌｔａｅｘｔ－ｍｙｃまたはＳｅｒｒａｔｅｅｘｔ－ｍｙｃ）の固定化されたフラグメント、またはＩｇＧのＦｃ部分に融合されたＤｅｌｔａもしくはＳｅｒｒａｔｅタンパク質の細胞外ドメインからなるＤｅｌｔａもしくはＳｅｒｒａｔｅタンパク質（それぞれ、Ｄｅｌｔａｅｘｔ－ＩｇＧまたはＳｅｒｒａｔｅｅｘｔ－ＩｇＧ）の固定化されたフラグメントである。Ｎｏｔｃｈアゴニストとしては、Ｎｏｔｃｈタンパク質ならびにそれらのアナログおよび誘導体（フラグメントを含む）；Ｎｏｔｃｈ経路の他のエレメントであるタンパク質、ならびにそのアナログおよび誘導体（フラグメントを含む）；これらに対する抗体、ならびにその結合領域を含むそのような抗体のフラグメントまたは他の誘導体；上記タンパク質および誘導体もしくはアナログをコードする核酸；ならびにＮｏｔｃｈタンパク質もしくはＮｏｔｃｈ経路における他のタンパク質に結合するかまたは別の方法で相互作用し、その結果、Ｎｏｔｃｈ経路活性が促進されるようにされるタンパク質およびそのアナログおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアゴニストとしては、細胞内ドメインを含むＮｏｔｃｈタンパク質およびその誘導体、前述をコードするＮｏｔｃｈ核酸、ならびにＮｏｔｃｈリガンドのＮｏｔｃｈ相互作用ドメイン（例えば、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅの細胞外ドメイン）を含むタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。他のアゴニストとしては、ＲＢＰＪκ／Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ＨａｉｒｌｅｓｓまたはＤｅｌｔｅｘが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｒｉｎｇｅは、例えば、Ｄｅｌｔａタンパク質とともに、Ｎｏｔｃｈ活性を増強するために使用され得る。これらのタンパク質、そのフラグメントおよび誘導体は、組換え発発現され得、単離され得るか、または化学合成され得る。
別の具体的実施形態においては、上記Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈをアゴナイズするタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を組換え発現する細胞である。上記細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が活性化されるべき造血幹細胞または幹・前駆細胞に利用可能である（例えば、それが、分泌される、細胞表面上で発現されるなど）ような様式で、Ｎｏｔｃｈアゴニストを発現する。
なお別の具体的実施形態において、Ｎｏｔｃｈのアゴニストは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバーに結合するペプチド模倣物またはペプチドアナログまたは有機分子である。このようなアゴニストは、当該分野で公知のものから選択される結合アッセイ（例えば、Ｒｅｂａｙら， １９９１， Ｃｅｌｌ ６７：６８７－６９９および国際特許公開番号ＷＯ ９２／１９７３４（ともに本明細書に参考として援用される）に記載される細胞凝集アッセイ）によって同定され得る。
好ましい実施形態において、上記アゴニストは、少なくとも、Ｎｏｔｃｈタンパク質またはＮｏｔｃｈのフラグメント（そのＮｏｔｃｈのフラグメントは、アゴニストタンパク質への結合を担うＮｏｔｃｈの領域、例えば、Ｎｏｔｃｈの上皮増殖因子要反復１１および１２を含む）への結合を媒介するＮｏｔｃｈ相互作用遺伝子によってコードされるタンパク質のフラグメントからなるタンパク質である。Ｎｏｔｃｈ相互作用遺伝子は、本明細書で使用される場合、Ｎｏｔｃｈ遺伝子、Ｄｅｌｔａ遺伝子、Ｓｅｒｒａｔｅ遺伝子、ＲＢＰＪκ遺伝子、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ遺伝子およびＤｅｌｔｅｘ遺伝子、ならびにＤｅｌｔａ／ＳｅｒｒａｔｅファミリーまたはＤｅｌｔｅｘファミリーの他のメンバーを意味するものとする。これら遺伝子は、配列相同性または遺伝的相互作用、およびより一般には、分子相互作用（例えば、インビトロでの結合、または遺伝的相互作用（表現型的に、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて示されるとおり））によって同定される、遺伝子の「Ｎｏｔｃｈカスケード」または「Ｎｏｔｃｈグループ」のメンバーによって同定され得る。Ｎｏｔｃｈへの結合を担う領域を含むＮｏｔｃｈ結合タンパク質の例示的フラグメントは、米国特許第５，６４８，４６４号；同第５，８４９，８６９号；および同第５，８５６，４４１号（本明細書に参考として援用される）に記載される。
本明細書で記載される方法によって利用されるＮｏｔｃｈアゴニストは、商業上得られ得るか、組換え発現によって生成され得るか、または化学合成され得る。
具体的実施形態において、Ｎｏｔｃｈアゴニストへの上記細胞の曝露は、細胞表面上にＮｏｔｃｈリガンドを組換え発現する他の細胞とのインキュベーションによって行われない（しかし他の実施形態では、この方法が使用され得る）がむしろ、無細胞Ｎｏｔｃｈリガンドへの曝露、例えば、Ｎｏｔｃｈの無細胞リガンドとのインキュベーションによるものであり、そのリガンドは、固相の表面に固定化される（例えば、組織培養基材、ディッシュ、フラスコ、ボトル、バッグなどの表面に固定化される）。
具体的実施形態において、Ｎｏｔｃｈ活性は、Ｎｏｔｃｈレセプターの細胞外部分へのＮｏｔｃｈリガンド（例えば、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ）の結合によって促進される。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインと、隣接する細胞上で膜結合されるか、または固体表面上に固定化されるかのいずれかであるそのリガンドとの間の物理的相互作用によって誘発されるようである。全長リガンドは、１個の細胞上でのそれらの発現がＮｏｔｃｈレセプターを発現する隣り合う細胞における経路の活性化を誘発することから、Ｎｏｔｃｈのアゴニストである。そのタンパク質の細胞外ドメインまたはそのＮｏｔｃｈ結合部分を含み、固体表面（例えば、組織培養プレート）上に固定化されている可溶性の短縮型ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ分子は、特に好ましいＮｏｔｃｈ経路アゴニストである。このような可溶性タンパク質は、抗体または相互作用タンパク質（例えば、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅが、一緒に融合タンパク質として発現されるエピトープタグ（例えば、抗体９Ｅ１０によって認識されるｍｙｃエピトープタグ）に対する抗体）またはＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅが、一緒に融合タンパク質として発現されるエピトープタグ（例えば、プロテインＡによって結合される免疫グロブリンエピトープタグ）と相互作用するタンパク質によって、固体表面上に固定化され得る。
別の具体的実施形態においては、および米国特許第５，７８０，３００号（Ａｒｔａｖａｎｉｓ－Ｔｓａｋｏｎａｓら）に記載されるように、Ｎｏｔｃｈアゴニストとしては、ＮｏｔｃｈもしくはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバー（例えば、Ｎｏｔｃｈプロセシングに必要とされるフリン様コンベルターゼ）の活性化のために必要とされる成熟工程もしくはプロセシング工程を媒介する細胞プロセスを促進もしくは活性化する試薬、Ｋｕｚｂａｎｉａｎ（Ｎｏｔｃｈの上流でもしくは平行してＮｏｔｃｈ経路の活性化のために必要とされると考えられるメタロプロテイナーゼ－ディスインテグリン（ＡＤＡＭ））（Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ ａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ， １９９９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１２：３６０３－３６１７）、またはより一般には、細胞輸送および処理タンパク質（例えば、細胞区画の間の移動のために必要とされるＧＴＰａｓｅのｒａｂファミリー）（Ｒａｂ ＧＴＰａｓｅに関する総説については、Ｏｌｋｋｏｎｅｎ ａｎｄ Ｓｔｅｎｍａｒｋ， １９９７， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １７６：１－８５を参照のこと）が挙げられる。上記アゴニストは、上記のプロセスのうちの１つの活性を増大させる任意の分子（例えば、フリン、Ｋｕｚｂａｎｉａｎもしくはｒａｂタンパク質をコードする核酸、またはこれらのフラグメントもしくは誘導体もしくはドミナントアクティブ変異体、または上記のタンパク質に結合するかもしくはその機能を活性化するペプチド模倣物もしくはペプチドアナログもしくは有機分子）であり得る。
米国特許第５，７８０，３００号（本明細書に参考として援用される）は、Ｎｏｔｃｈ経路を活性化するために使用され得るＮｏｔｃｈアゴニスト分子のクラス（およびそれらの同定方法）、例えば、Ｎｏｔｃｈ ａｎｋｙｒｉｎ反復とＲＢＰ－Ｊκとの解離を誘発し、それによって、細胞質から核へのＲＢＰ－Ｊκの移行を促進する分子をさらに開示する。
いくつかの好ましい実施形態において、ＤＸＩ発現方法が使用される。上記Ｎｏｔｃｈアゴニストは、米国特許第７，３９９，６３３号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ部分に融合したそのタンパク質の細胞外ドメインからなるＤｅｌｔａの固定化フラグメント（Ｄｅｌｔａｅｘｔ－ＩｇＧまたはＤＸＩ）、または米国特許第１０，２０８，２８６号に記載されるように、固定化されたＮｏｔｃｈ－１もしくはＮｏｔｃｈ－２特異的抗体である（ともに本明細書に参考として援用される）。好ましくは、Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ－ＩｇＧは、細胞培養ディッシュの表面に固定化される。具体的実施形態において、細胞培養ディッシュは、上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を添加する前に、４℃において一晩（または３７℃において最低２時間）、リン酸緩衝化生理食塩水中の２．５μｇ／ｍｌ Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ－ＩｇＧおよび５μｇ／ｍｌ ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（組換えヒトフィブロネクチンフラグメント（ｒＦＮ－ＣＨ－２９６ともいわれる））でコーティングされる。好ましくは、上記細胞培養培地は、１０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトインターロイキン－３（ｒｈＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトインターロイキン－６（ｒｈＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒトＦｌｔ－３リガンド（ｒｈＦｌｔ－３Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍｌ 組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、または組換えヒトｒｈＳＣＦ、ｒｈＦｌｔ－３Ｌ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＩＬ－６（各々、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、およびｒｈＩＬ－３（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ ＩＩ， ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）からなる。上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、約７～約１４日間培養される。
上記拡大した造血幹細胞または造血幹・前駆細胞が、拡大した幹細胞生成物を形成するために一旦得られた後、上記拡大した造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団は、例えば、「いつでも入手できる」生成物を調製するために、収集および凍結保存され得る。１つの実施形態において、拡大した造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団は、１またはこれより多くのバッグ（またはユニット）の中に分割され得、凍結され得る。別の実施形態において、２またはこれより多くの拡大した造血幹細胞または造血幹・前駆細胞集団は、プールされ得、別個のアリコートに分割され得、各アリコートが凍結される。好ましい実施形態において、約５０００万個～約４億個のＣＤ３４＋ 細胞が、拡大した幹細胞生成物の１つのバッグ（またはユニット）の中で凍結される。別の好ましい実施形態において、約１億～約３億個のＣＤ３４＋ 細胞が、拡大した幹細胞生成物の１つのバッグ（またはユニット）の中で凍結される。他の好ましい実施形態において、約１億個、２億個、３億個、または４億個のＣＤ３４＋ 細胞が、拡大した幹細胞生成物の１つのバッグ（またはユニット）の中で凍結される。
好ましい実施形態において、その拡大した幹生成物は、新鮮であり、すなわち、それは、拡大または凍結保存の前には、以前に凍結されたことがない。用語「凍結された／凍結する（ｆｒｏｚｅｎ／ｆｒｅｅｚｉｎｇ）」および「凍結保存された／凍結保存する（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ／ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）」は、本出願において交換可能に使用される。凍結保存は、生きている形態において細胞を凍結する当該分野で公知の任意の方法によるものであり得る。細胞の凍結は、通常は破壊的である。冷却時に、細胞内の水が凍結する。すると、細胞膜、細胞脱水、溶質濃度、および氷の結晶形成に対する浸透圧効果によって傷害が起こる。氷が細胞の外側に形成するにつれて、利用可能な水が溶液から除去され、細胞から引き抜かれ、浸透圧による脱水および溶質濃度の上昇を引きおこし、これらは最終的に細胞を破壊する。考察については、Ｍａｚｕｒ， Ｐ．， １９７７， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：２５１－２７２を参照のこと。
これらの傷害の影響は、（ａ）凍結保護剤の使用、（ｂ）凍結速度の制御、および（ｃ）崩壊反応（ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を最小限にするために十分低い温度での貯蔵によって回避され得る。
使用され得る凍結保護剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ， １９５９， Ｎａｔｕｒｅ １８３：１３９４－１３９５； Ａｓｈｗｏｏｄ－Ｓｍｉｔｈ， １９６１， Ｎａｔｕｒｅ １９０：１２０４－１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ， １９６０， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：５７６）、ポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ ａｎｄ Ｒａｖｄｉｎ， １９６２， Ｎａｔｕｒｅ １９６：５４８）、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ－エリスリトール、Ｄ－リビトール、Ｄ－マンニトール（Ｒｏｗｅら， １９６２， Ｆｅｄ． Ｐｒｏｃ． ２１：１５７）、Ｄ－ソルビトール、ｉ－イノシトール、Ｄ－ラクトース、塩化コリン（Ｂｅｎｄｅｒら， １９６０， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １５：５２０）、アミノ酸（Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ， １９６０， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０：６５１）、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ， １９５４， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ５６：２６５）、無機塩（Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ， １９６０， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １０４：３８８； Ｐｈａｎ Ｔｈｅ Ｔｒａｎ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ， １９６１， ｉｎ Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｉｌｂｅｒｙ編， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ， Ｌｏｎｄｏｎ， ｐ． ５９）、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標） ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ）。好ましい実施形態において、ＤＭＳＯが使用される。その液体は、低濃度では細胞に対して非毒性である。血漿の添加（例えば、約２０～２５％の濃度へ）は、ＤＭＳＯの保護効果を増強し得る。ＤＭＳＯを添加した後、細胞は、凍結するまで０℃で維持されるべきである。なぜなら約１％のＤＭＳＯ濃度は、４℃を上回る温度で毒性であるからである。
制御されたゆっくりとした冷却速度は、重要であり得る。凍結保護剤が異なり（Ｒａｐａｔｚら， １９６８， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（１）：１８－２５）、細胞タイプが異なれば、最適な冷却速度も異なる（骨髄幹細胞の生存に対する、およびそれらの移植能力に対する冷却速度の影響については、例えば、Ｒｏｗｅ ａｎｄ Ｒｉｎｆｒｅｔ， １９６２， Ｂｌｏｏｄ ２０：６３６； Ｒｏｗｅ， １９６６， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ３（１）：１２－１８； Ｌｅｗｉｓ，ら， １９６７， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ７（１）：１７－３２；およびＭａｚｕｒ， １９７０， Ｓｃｉｅｎｃｅ １６８：９３９－９４９を参照のこと）。水が氷に変化する融合相の熱は、最小限でなければならない。冷却手順は、例えば、プログラム可能な凍結デバイスまたはメタノールバス手順の使用によって行われ得る。
プログラム可能な凍結装置は、最適な冷却速度の決定を可能にし、標準的な再現性のある冷却を容易にする。プログラム可能な速度制御冷凍庫（例えば、ＣｒｙｏｍｅｄまたはＰｌａｎａｒ）は、凍結レジメンを所望の冷却速度曲線に調整することを可能にする。例えば、１０％ ＤＭＳＯおよび２０％ 血漿中の骨髄細胞に関しては、その最適速度は」、０℃から－８０℃へ、１℃～３℃／分である。好ましい実施形態において、この冷却速度が使用され得る。上記細胞を保持する容器は、超低温で安定でなければならず、凍結および融解両方の効果的な制御のために急速な伝熱を可能にしなければならない。シールされたプラスチックバイアル（例えば、Ｎｕｎｃ， Ｗｈｅａｔｏｎ ｃｒｙｕｌｅｓ）またはガラスアンプルは、少量（１～２ｍｌ）を多数に使用できるが、より大きな容積（１００～２００ｍｌ）は、冷却中により良好な伝熱のために金属プレート間で保持されたポリオレフィンバッグ（例えば、Ｄｅｌｍｅｄ）の中で凍結され得る。骨髄細胞のバッグは、幸運なことに、およそ３℃／分）の冷却速度を与える－８０℃冷凍庫の中にそれらを入れることによって、成功裡に凍結された。
代替の実施形態において、メタノールバス冷却法が使用され得る。そのメタノールバス法は、大規模に多数の小さな品目を慣用的に凍結保存するために十分適している。その方法は、凍結速度の手動での制御も、その速度をモニターするためのレコーダーも必要としない。好ましい実施形態において、ＤＭＳＯ処理した細胞は、氷上で予め冷却され、冷却メタノールを含むトレイに移され、次に、そのトレイは、－８０℃の機械冷蔵庫（例えば、ＨａｒｒｉｓまたはＲｅｖｃｏ）の中に入れられる。メタノールバスおよびサンプルの熱電対測定は、１℃～３℃／分の所望の冷却速度を示す。少なくとも２時間後、標本は、－８０℃の温度に達しており、恒久的な貯蔵のために液体窒素（－１９６℃）中に直接入れられ得る。
完全に凍結した後、上記拡大した幹細胞生成物は、長期凍結貯蔵容器へと迅速に移され得る。好ましい実施形態において、サンプルは、液体窒素（－１９６℃）またはその蒸気（－１６５℃）の中で低温貯蔵され得る。このような貯蔵は、極めて低い真空および内部の超断熱を備える大きなＴｈｅｒｍｏｓコンテナに似た高度に効率的な液体窒素冷却器の利用可能性によって大きく促進され、その結果、熱の漏れおよび窒素喪失は、最小限にまで抑えられる。
適切な保管システム（ｒａｃｋｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）が、市販されており、目録作業、貯蔵、および個々の標本の検索のために使用され得る。
上記造血幹細胞（特に骨髄または末梢血に由来する）の操作、凍結保存、および長期貯蔵に関する考慮事項および手順は、拡大した造血幹細胞または幹・前駆細胞に大いに適用可能である。このような考察は、例えば、以下の参考文献（本明細書に参考として援用される）に見出され得る： Ｇｏｒｉｎ， １９８６， Ｃｌｉｎｉｃｓ Ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １５（１）：１９－４８； Ｂｏｎｅ－Ｍａｒｒｏｗ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ Ｐａｎｅｌ， Ｍｏｓｃｏｗ， Ｊｕｌｙ ２２－２６， １９６８， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｇｅｎｃｙ， Ｖｉｅｎｎａ， ｐｐ． １０７－１８６。
生きている細胞の凍結保存の他の方法、またはその改変が利用可能であり、使用が想定される（例えば、コールドメタルミラー技術（ｃｏｌｄ ｍｅｔａｌ－ｍｉｒｒｏｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）； Ｌｉｖｅｓｅｙ ａｎｄ Ｌｉｎｎｅｒ， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２７：２５５； Ｌｉｎｎｅｒら， １９８６， Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３４（９）：１１２３－１１３５；米国特許第４，１９９，０２２号（Ｓｅｎｋａｎら）、米国特許第３，７５３，３５７号（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）、米国特許第４，５５９，２９８号（Ｆａｈｙ）もまた参照のこと。
低温貯蔵または凍結した細胞は、好ましくは迅速に融解され（例えば、３７℃～４１℃に維持されたウォーターバスの中で）、融解時に迅速に冷却される。具体的実施形態において、その凍結した細胞を含むバイアルは、その首まで温かいウォーターバスの中に浸けられ得る；穏やかに回転させることによって、それが融解し、温かい水から内部の氷の塊への伝熱が増大するにつれて、細胞懸濁物の混合を確実にする。氷が完全に融解したら直ぐに、そのバイアルは、直ぐに氷の中に置かれ得る。
本発明の一実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は融解されるか、またはその一部は、その必要性のある（例えば、ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有する）ヒト患者に注入され得る。融解した細胞の処理に関するいくつかの手順が利用可能であり、望ましいと見做される場合には使用され得る。
融解の際に細胞の集塊化を防止するために細胞を処理することは、望ましいことであり得る。集塊化を防止するために、種々の手順が使用され得る（凍結の前および／または後の、ＤＮａｓｅ（Ｓｐｉｔｚｅｒら， １９８０， Ｃａｎｃｅｒ ４５：３０７５－３０８５）、低分子量デキストランおよびシトレート、ヒドロキシエチルデンプン（Ｓｔｉｆｆら， １９８３， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：１７－２４）の添加などが挙げられるが、これらに限定されない）。
上記凍結保護剤は、ヒトにおいて毒性である場合、融解した、拡大した幹細胞生成物を治療上使用する前に除去されるべきである。ＤＭＳＯを凍結保護剤として使用する一実施形態において、この工程を省略して細胞喪失を回避することは好ましい。しかし、凍結保護剤の除去が望ましい場合、その除去は、好ましくは、融解時に達成される。
凍結保護剤を除去する１つの方法は、わずかな濃度への希釈によるものである。これは、培地の添加、続いて、必要であれば、細胞をペレット化するための１またはこれより多くの遠心分離サイクル、上清の除去、および細胞の再懸濁によって達成され得る。例えば、融解した細胞中の細胞内ＤＭＳＯは、回収した細胞に有害に影響を及ぼさないレベル（１％未満）へと低減され得る。これは、好ましくは、ＤＭＳＯを除去する間に起こる、潜在的に損傷を与える浸透圧勾配を最小限にするために、ゆっくり行われる。
凍結保護剤の除去後に、細胞計数（例えば、血球計算板の使用による）および生存性試験（例えば、トリパンブルー排除による； Ｋｕｃｈｌｅｒ， １９７７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｄｏｗｄｅｎ， Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ＆ Ｒｏｓｓ， Ｓｔｒｏｕｄｓｂｕｒｇ， Ｐａ．， ｐｐ． １８－１９； １９６４， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｅｉｓｅｎら編， Ｖｏｌ． １０， Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｈｉｃａｇｏ， ｐｐ． ３９－４７）は、細胞生存を確認するために行われ得る。生きている抗原（例えば、ＣＤ３４）陽性細胞のパーセンテージは、細胞のアリコート中の７－ＡＡＤ（または生きている細胞によって排除される他の適切な色素）を排除する抗原陽性細胞の数を、細胞のアリコート中の有核細胞（ＴＮＣ）（生きているおよび生きていない細胞の両方）の総数で除算することで計算することによって、決定され得る。そうすると、生きている抗原陽性細胞の数は、生きている抗原陽性細胞のパーセンテージにＴＮＣを乗算することによって決定され得る。
凍結保存の前および／または融解の後、有核細胞の総数が、または具体的実施形態においては、ＣＤ３４＋ 細胞の総数が、決定され得る。例えば、全有核細胞計数が、血球計算板およびトリパンブルー色素の排除を使用することによって行われ得る。細胞充実度が高い標本は、手動計数に適切な濃度範囲へと希釈され得る。生成物の最終的な細胞計数は、任意の希釈率で較正される。全有核細胞計数＝生きている有核細胞／ｍＬ×生成物体積（ｍＬ単位）。サンプル中のＣＤ３４＋ 陽性細胞数は、例えば、蛍光色素に結合体化した抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーの使用によって決定され得る。
ある特定の実施形態において、凍結保存前の出発造血幹細胞もしくは幹・前駆細胞集団、臍帯血および／または胎盤血、または拡大した幹細胞生成物の同一性および純度、あるいは融解後の拡大した幹細胞生成物は、マルチパラメーターフローサイトメトリー免疫表現型決定に供され得る。これは、サンプル中に存在する、生きている抗原陽性細胞のパーセンテージを提供する。各サンプルは、以下の細胞表現型のうちの１またはこれより多くに対して、蛍光色素に直接結合体化したモノクローナル抗体のパネルを使用して試験され得る：
１． ＣＤ３４＋ ＨＰＣ
２． Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋両方のサブセットを含む）
３． Ｂ細胞（ＣＤ１９＋またはＣＤ２０＋）
４． ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）
５． 単球（ＣＤ１４＋）
６． 骨髄単球（ＣＤ１５＋）
７． 巨核球（ＣＤ４１＋）
８． 樹状細胞（系統陰性／ＨＬＡ－ＤＲｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ１２３ｂｒｉｇｈｔ、または系統陰性／ＨＬＡ－ＤＲｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ１１ｃｂｒｉｇｈｔ）。
治療方法
本発明によれば、ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有する患者の処置転帰を改善するための方法が、提供される。ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有する患者を処置するための方法がまた、提供される。上記患者は、化学療法レジメン、またはそのサイクルを投与する工程、次いで、拡大した幹細胞生成物の固定用量を上記患者に投与する工程であって、ここで上記投与する工程は、上記拡大した幹細胞生成物のＨＬＡ型を上記患者のＨＬＡ型に適合させることなく行われる工程によって処置される。上記拡大した幹細胞生成物は、上記ドナーのＨＬＡ型を互いに適合させることなくかつ上記患者のＨＬＡ型に適合させることもなく、少なくとも２名または少なくとも４名のヒトドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞に由来する、プールされた生成物である。語句「ＨＬＡ型に適合させることなく（ｗｉｔｈｏｕｔ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｈｅ ＨＬＡ－ｔｙｐｅ）」とは、上記患者の間でおよび／または上記拡大した幹細胞生成物（または上記拡大した幹細胞生成物中の造血幹細胞もしくは造血幹・前駆細胞）に寄与するドナー間で、ＨＬＡ抗原またはアレルのいずれかを適合させる手段がとられていないことを意味する。
いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の固定用量は、化学療法レジメンまたはそのサイクル（例えば、導入レジメン）後に投与され得る。上記拡大した幹細胞生成物の固定用量はまた、強化レジメンまたはそのサイクル後に投与され得る。上記拡大した幹細胞生成物の固定用量はまた、救援レジメンまたはそのサイクル後に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の固定用量は、第２の導入レジメンもしくはそのサイクル、または望ましいもしくは必要である場合には、第２のサイクルの導入レジメン後に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の固定用量は、第２の強化レジメンもしくはそのサイクル、または望ましいもしくは必要である場合には、第２のサイクルの強化レジメン後に投与され得る。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の固定用量は、第２の救援レジメンもしくはそのサイクル、または望ましいもしくは必要である場合には、第２のサイクルの救援レジメン後に投与され得る。
上記で考察されるように、上記拡大した幹細胞生成物は、代表的には、レジメンの最後の用量が投与された後に、または１より多くのサイクルを有するレジメンに関してはレジメンの各サイクルの最後の用量が投与された後に、投与される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、レジメンの完了の約１２～約４８時間後に、または好ましくはレジメンの完了の約２４～約３６時間後に、投与される。
いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、化学療法レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、上記患者に投与される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、導入レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、上記患者に投与される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、強化レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、上記患者に投与される。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物は、救援レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、上記患者に投与される。いくつかの実施形態において、上記化学療法レジメン（例えば、導入レジメン、救済レジメンまたは強化レジメン）が１より多くのサイクルにおいて投与される場合、上記拡大した幹細胞生成物は、上記レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が上記患者の血液から消失した後に、各サイクル後に上記患者に投与される。本明細書で使用される場合、「．．．レジメンおよびその活性代謝産物が患者の血液から消失した後に」とは、患者の血液中のＣＤ３４＋ 幹細胞の生存性に、例えば、ＣＤ３４＋ 幹細胞または前駆細胞の生存性を、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも２０％減少させることによって影響を及ぼす上記レジメン（例えば、化学療法レジメン、導入レジメン、救援レジメンまたは強化レジメン）の構成要素およびそれらの構成要素の活性代謝産物のクリアランスに言及する。
いくつかの実施形態において、上記化学療法レジメンは、導入レジメンである。いくつかの実施形態において、上記導入レジメンは、シタラビンおよびアントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンまたはイダルビシン）の投与である。いくつかの実施形態において、上記化学療法レジメンは、シタラビンおよびダウノルビシンまたはイダルビシンの「７＋３」レジメンである。約４～約７日間にわたって与えられるシタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標））、約３日間与えられるアントラサイクリン薬物（例えば、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））またはイダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）））の組み合わせは、最も頻繁に使用される。患者はまた、白血球計数を低減させることを助けるために、ヒドロキシウレア（Ｄｒｏｘｉａ（登録商標）、Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））を与えられ得る。
いくつかの実施形態において、いくらかより高齢の成人に関しては、デシタビン（ＤａｃｏｇｅｎＴＭ）、アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ（登録商標））、および低用量シタラビンが、導入レジメンにおいて代わりに使用されてもよい。
いくつかの実施形態において、上記導入レジメンは、ＧＣＬＡＣ、Ｇ－ＣＳＦ・クロファラビン・高用量シタラビンの投与である。
いくつかの実施形態において、上記化学療法レジメンは、強化レジメンである。いくつかの実施形態において、上記強化レジメンは、高用量シタラビンの投与である。いくつかの実施形態において、上記強化レジメンは、中用量シタラビンである。いくつかの実施形態において、高用量または中間用量シタラビンの２－４サイクル（ラウンド）が投与される。上記拡大した幹細胞生成物は、各サイクル後に投与され得る。
いくつかの実施形態において、上記化学療法レジメンは、救援レジメンである。いくつかの実施形態において、上記救援レジメンは、クラドリビン・高用量シタラビン・Ｇ－ＣＳＦ（ＣＬＡＧ）の投与である。いくつかの実施形態において、上記救援レジメンは、エトポシド・シタラビン・ミトキサントロン（ＭＥＣ）の組み合わせである。上記拡大した幹細胞生成物は、各サイクル後に投与され得る。
他の実施形態において、上記化学療法レジメンは、以下であり得る： ７＋３（７日間のＡｒａ－Ｃ（シタラビン）＋３日間のアントラサイクリン抗生物質（ダウノルビシン（ＤＡまたはＤＡＣ改変体）またはイダルビシン（ＩＡまたはＩＡＣ改変体）のいずれか）； ５＋２（５日間のＡｒａ－Ｃ（シタラビン）＋２日間のイダルビシン（ＩＡまたはＩＡＣ改変体）； ＢＡＣＯＤ（ブレオマイシン・ドキソルビシン・シクロホスファミド・ビンクリスチン・デキサメタゾン）； ＣＢＶ（シクロホスファミド・ＢＣＮＵ（カルムスチン）・ＶＰ－１６（エトポシド））； ＣＨＯＥＰ（シクロホスファミド・ヒドロキシダウノルビシン（ドキソルビシン）・エトポシド・ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））・プレドニゾン）； ＣＥＰＰ（シクロホスファミド・エトポシド・プロカルバジン・プレドニゾン）； ＣＨＯＰ（シクロホスファミド・ヒドロキシダウノルビシン（ドキソルビシン）・ビンクリスチン・プレドニゾン）； ＣＨＯＰ－ＲまたはＲ－ＣＨＯＰ（ＣＨＯＰ＋リツキシマブ）； ＣＶＡＤおよびＨｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ（シクロホスファミド・ビンクリスチン・ドキソルビシン・デキサメタゾン）； ＤＡまたはＤＡＣ（ダウノルビシン×３日間＋ａｒａ－Ｃ（シタラビン）×７日間、７＋３レジメンの変法）； ＤＡＴ（ダウノルビシン・シタラビン（ａｒａ－Ｃ）・チオグアニン）； ＤＨＡＰ（デキサメタゾン・シタラビン（ａｒａ－Ｃ）・白金薬剤）； ＤＨＡＰ－ＲまたはＲ－ＤＨＡＰ（デキサメタゾン・シタラビン（ａｒａ－Ｃ）・白金薬剤＋リツキシマブ）； ＤＩＣＥ（デキサメタゾン・イホスファミド・シスプラチン・エトポシド（ＶＰ－１６））； ＥＰＯＣＨ（エトポシド・プレドニゾン・ビンクリスチン・シクロホスファミド・ヒドロキシダウノルビシン）； ＥＰＯＣＨ－ＲまたはＲ－ＥＰＯＣＨ（エトポシド・プレドニゾン・ビンクリスチン・シクロホスファミド・ヒドロキシダウノルビシン＋リツキシマブ）； ＥＳＨＡＰ（エトポシド・メチルプレドニゾロン・シタラビン（ａｒａ－Ｃ）・白金薬剤）； ＦＣＭまたはＦＭＣ（フルダラビン・シクロホスファミド・ミトキサントロン）； ＦＣＭ－ＲまたはＲ－ＦＣＭまたはＲ－ＦＭＣまたはＦＭＣ－Ｒ（フルダラビン・シクロホスファミド・ミトキサントロン＋リツキシマブ）； ＦＣＲ（フルダラビン・シクロホスファミド・リツキシマブ）； ＦＭ（フルダラビン・ミトキサントロン）； ＦＭ－ＲまたはＲ－ＦＭまたはＲＦＭまたはＦＭＲ（フルダラビン・ミトキサントロン・リツキシマブ）； ＦＬＡＧ（フルダラビン・シタラビン・Ｇ－ＣＳＦ）； ＦＬＡＧ－ＩｄａまたはＦＬＡＧ－ＩＤＡまたはＩＤＡ－ＦＬＡＧまたはＩｄａ－ＦＬＡＧ（フルダラビン・シタラビン・イダルビシン・Ｇ－ＣＳＦ）； ＦＬＡＧ－ＭｉｔｏまたはＦＬＡＧ－ＭＩＴＯまたはＭｉｔｏ－ＦＬＡＧまたはＭＩＴＯ－ＦＬＡＧまたはＦＬＡＮＧ（ミトキサントロン・フルダラビン・シタラビン・Ｇ－ＣＳＦ）； ＦＬＡＭＳＡ（フルダラビン・シタラビン・アムサクリン）； ＦＬＡＭＳＡ－ＢＵまたはＦＬＡＭＳＡ－Ｂｕ（フルダラビン・シタラビン・アムサクリン・ブスルファン）； ＦＬＡＭＳＡ－ＭＥＬまたはＦＬＡＭＳＡ－Ｍｅｌ（フルダラビン・シタラビン・アムサクリン・メルファラン）； ＧＤＰ（ゲムシタビン・デキサメタゾン・シスプラチン）； ＧｅｍＯｘまたはＧＥＭＯＸ（ゲムシタビン・オキサリプラチン）； ＧｅｍＯｘ－ＲまたはＧＥＭＯＸ－ＲまたはＲ－ＧｅｍＯｘまたはＲ－ＧＥＭＯＸ（ゲムシタビン・オキサリプラチン・リツキシマブ）； ＧＣＬＡＣ（Ｇ－ＣＳＦ・クロファラビン・高用量シタラビン）； ＩＡまたはＩＡＣ（イダルビシン×３日間＋Ａｒａ－Ｃ（シタラビン）×７日間）； ＩＣＥ（イホスファミド・カルボプラチン・エトポシド（ＶＰ－１６））； ＩＣＥ－ＲまたはＲ－ＩＣＥまたはＲＩＣＥ（ＩＣＥ＋リツキシマブ）； ｍ－ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート・ブレオマイシン・ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））・シクロホスファミド・ビンクリスチン・デキサメタゾン）； ＭＡＣＯＰ－Ｂ（メトトレキサート・ロイコボリン（フォリン酸）・ドキソルビシン・シクロホスファミド・ビンクリスチン・プレドニゾン・ブレオマイシン）； ＭＩＮＥ（メスナ・イホスファミド・ノバントロン・エトポシド）； ＭＩＮＥ－ＲまたはＲ－ＭＩＮＥ（メスナ・イホスファミド・ノバントロン・エトポシド＋リツキシマブ）； ＰｒｏＭＡＣＥ－ＭＯＰＰ（メトトレキサート・ドキソルビシン・シクロホスファミド・エトポシド・ＭＯＰＰ）； Ｒ－Ｂｅｎｄａ（リツキシマブ＋ベンダムスチン）； Ｒ－ＤＨＡＰまたはＤＨＡＰ－Ｒ（リツキシマブ＋ＤＨＡＰ）； Ｒ－ＦＣＭまたはＦＣＭ－Ｒ（リツキシマブ＋ＦＣＭ）； Ｒ－ＩＣＥまたはＩＣＥ－ＲまたはＲＩＣＥ（リツキシマブ＋ＩＣＥ）；あるいはＴＡＤ（チオグアニン・シタラビン（ａｒａ－Ｃ）・ダウノルビシン）。
いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の投与は、ＡＭＬを有する患者の処置転帰を、上記患者が寛解を達成する機会を改善することによって、改善し得る。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の投与は、ＡＭＬを有する患者の処置転帰を、上記患者が完全寛解／寛解（ＣＲ）、例えば、形態的ＣＲ、細胞遺伝学的ＣＲ、または分子的ＣＲ、または血液計数の回復不完全を伴う完全寛解／寛解（ＣＲｉ）を達成する機会を改善することによって改善し得る。いくつかの実施形態において、改善された処置転帰は、形態学的な白血病無病状態、部分寛解または病状安定化以外である。いくつかの実施形態において、上記改善された処置転帰は、上記拡大した幹細胞生成物の投与後の上記患者におけるＩＬ－２レベルの増大と関連する。
いくつかの実施形態において、上記ＡＭＬを有する患者は、約２０歳齢～約６０歳齢の間である。いくつかの実施形態において、上記ＡＭＬを有する患者は、２０歳齢未満である。いくつかの実施形態において、上記ＡＭＬを有する患者は、６０歳齢より高齢であるかまたは７０歳齢より高齢である。いくつかの実施形態において、上記ＡＭＬを有する患者は、６０歳齢より高齢または７０歳齢より高齢でありかつ低減された強度の化学療法レジメンを受けている最中である、
上記拡大した幹細胞生成物は、固定用量として、その必要性のある、ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有するヒト患者に、上記患者の処置転帰を改善するために投与される。好ましくは、上記拡大した幹細胞生成物は、注入（例えば、静脈内注入）によって投与される。上記拡大した幹細胞生成物の他の適切な投与方法は、本発明によって包含される。上記拡大した幹細胞生成物は、任意の便利な経路によって、例えば、ボーラス注射によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。
投与される上記拡大した幹細胞生成物の固定用量は、特定の障害または状態（例えば、ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍（例えば、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））の処置において有効である。いくつかの実施形態において、上記患者は、ＡＭＬ（例えば、再発／難治性ＡＭＬ、初発ＡＭＬ、または処置関連ＡＭＬ）を有する。いくつかの実施形態において、上記患者は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、例えば、多系統異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＭＬＤ）；単一系統異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＳＬＤ）；環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）；芽球増加を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＥＢ）；単離された欠失（５ｑ）を伴うＭＤＳ、または分類不能型ＭＤＳ（ＭＤＳ－Ｕ）を有する。いくつかの実施形態において、上記患者は、骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）、例えば、慢性骨髄性白血病、真性多血症（ｐ． ｖｅｒａ）、原発性骨髄線維症、本態性血小板血症、慢性好中球性白血病、または慢性好酸球性白血病を有する。
具体的実施形態において、投与のための上記拡大した幹細胞生成物の適切な固定投与量は、１用量あたり、約５０００万個、７５００万個、１億個、２億個、３億個、または４億個のＣＤ３４＋ 細胞であり、必要なだけ頻繁に、間隔を伴って１回、２回、３回またはこれより多くの回数、患者に投与され得る。上記拡大した幹細胞生成物が、凍結または低温凍結された生成物である場合、ＣＤ３４＋ 細胞の数は、凍結または凍結保存する前に、それらの細胞の数に言及する。具体的実施形態において、患者は、１レジメンあたりまたは適用可能である場合には（例えば、マルチサイクルレジメンに関しては）レジメンのサイクルあたり、上記拡大した幹細胞生成物の単一の固定用量を受容する。具体的実施形態において、患者は、レジメンのサイクルあたり、上記拡大した幹細胞生成物の固定用量を受容する。その投与は、上記サイクルの完了後に起こる。具体的実施形態において、患者は、レジメンあたり上記拡大した幹細胞生成物の固定用量を受容し、その投与は、上記レジメンの完了後に起こる。
薬学的組成物
上記拡大した幹細胞生成物は、患者に、固定用量（これは、拡大した幹細胞生成物の治療上有効な量である）を含む薬学的（治療用）組成物として投与され得、ここで投与は、上記拡大した幹細胞生成物のＨＬＡ型を上記患者にも、互いに対して上記拡大した幹細胞生成物中の造血幹細胞または造血幹・前駆細胞にも適合させることなく行われる。
本発明は、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、上記拡大した幹細胞生成物の治療上有効な量である固定用量、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。上記キャリアおよび組成物は、好ましくは無菌である。上記製剤は、投与様式に合わされるべきである。上記薬学的組成物は、ヒトにおける治療上の使用に受容可能である。上記組成物はまた、望ましい場合、ｐＨ緩衝化剤を含み得る。
好ましい実施形態において、上記組成物は、ヒトへの幹細胞の静脈内投与に適合した薬学的組成物として、慣用的手順に従って製剤化される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張性水性緩衝液中の液剤である。必要な場合、上記組成物はまた、注射部位における疼痛を緩和するために、可溶化剤および局所麻酔薬（例えば、リドカイン）を含み得る。
本発明はまた、上記拡大した幹細胞生成物の１またはこれより多くの用量および希釈剤（例えば、無菌の等張性水性緩衝液）で満たされた１またはこれより多くの容器またはバッグを含む薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じて、薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定される形態の通知が、このような容器またはバッグと関連付けられ得る。その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の機関による承認を示す。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＡＭＬまたは他の血液悪性腫瘍を有する患者の処置転帰を改善するための拡大した幹細胞生成物の固定用量の使用であって、上記拡大した幹細胞生成物は、多数のドナーの拡大した造血幹細胞または造血幹・前駆細胞のプールを含み、ここで上記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、互いに対しても上記患者に対してもＨＬＡ適合されていない使用を提供する。いくつかの実施形態において、上記拡大した造血幹細胞または幹・前駆細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態において、上記拡大した幹細胞生成物の適切な固定用量は、約５０００万個、７５００万個、１億個、２億個、３億個、または４億個のＣＤ３４＋ 細胞である。
実施例１： ヒト臍帯血ユニットからのヒトの拡大した幹細胞生成物の生成
以下の節は、図１におけるフローチャートとして示されるとおりの、拡大した幹細胞生成物の生成および貯蔵を記載する。
臍帯血／胎盤血ユニットを、出産時にヒトドナーから集めた。次いで、その集めた血液を、抗凝固剤と混合して凝固を防止した。その血液を、モニター付き冷蔵庫の中で４℃において隔離下で貯蔵した。その受容したユニットを評価し、拡大のために処理されるべきユニットを決定した。以下の情報を、そのユニットに関して集めた：受容した日、そのユニットの年齢（時間単位）、そのドナーの在胎期間（週数単位）、そのドナーの性別、およびそのユニットの容積。さらに、各ユニットの全有核細胞計数および全ＣＤ３４＋ 細胞計数を決定し、パーセントＣＤ３４＋ 細胞を計算した。そのユニットが３５０万個未満のＣＤ３４＋ 細胞を有する場合、そのユニットを廃棄した。拡大のためにユニットを選択した場合、それを隔離から外し、固有のロット番号識別子を割り当て、それを製造プロセスの間中、保持した。
計画された拡大培養の開始前に、組織培養容器に先ず、４℃で一晩または３７℃で最低２時間、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中、２．５μｇ／ｍｌのＤｅｌｔａ１ｅｘｔ－ＩｇＧおよび５μｇ／ｍｌのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（組換えヒトフィブロネクチンフラグメント）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）をコーティングした。次いで、そのフラスコをＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ－２％ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でブロッキングした。新鮮な臍帯血ユニットを処理して、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してＣＤ３４＋ 細胞を選択した。ＣＤ３４＋ 細胞選択の前に、その新鮮な臍帯血ユニットのアリコートを、全細胞計数およびＣＤ３４＋ 細胞含有量に関してチェックした。ＣＤ３４＋ およびＣＤ３４－ 両方の細胞画分を、処理後に回収した。富化後、ＣＤ３４＋ 細胞のパーセンテージは、富化前のサンプル中のＣＤ３４＋ 細胞のパーセンテージと比較して、８８倍～４００倍増大した。その富化したＣＤ３４＋ 細胞画分を、最終培養培地中に再懸濁した。この培地は、ｒｈＩＬ－３（１０ ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ－６（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＦｌｔ－３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）からなる。
多数のドナーのＣＤ３４＋ 富化した細胞を、≦１．８×１０４ 全有核細胞／ｃｍ２ 容器表面積の濃度で、具体的に表示しかつ準備した組織培養容器に添加し、次いで、その生成物ロット専用の個々にモニターされかつアラームを設定したインキュベーターの中に入れた。そのＣＤ３４＋ 富化した細胞は、互いに対してＨＬＡ適合させなかった。約２～約４日間の培養の後、新鮮な培養培地（上記のとおり）の元の容積の５０％を、その容易に添加した。その細胞培養容器を、定期的に（１～３日間ごと）インキュベーターから外し、細胞増殖および汚染の徴候に関して倒立顕微鏡で調べた。約５日目～８日目に、その容器を穏やかに撹拌して、細胞を混合し、１ｍｌ サンプルを、プロセス試験のために取り出した。細胞のサンプルを計数し、ＣＤ３４、ＣＤ７、ＣＤ１４、ＣＤ１５およびＣＤ５６の発現に関して表現型決定した。培養期間全体を通じて、細胞を、細胞密度が≧８×１０５ 細胞／ｍｌに増大する場合に、必要に応じてさらなるフラスコに移した。凍結保存のために細胞を採取する前日に、新鮮な培地を添加した。
１４日目に、その拡大した幹細胞集団を、凍結保存のために採取した。容器を撹拌し、内容物全体を滅菌５００ｍｌ 遠心分離チューブに移した。その採取した細胞を遠心分離し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中での遠心分離によって１回洗浄し、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、水中の平衡化電解質の滅菌発熱物質非含有等張性溶液（Ｎｏｒｍｏｓｏｌ－Ｒ（登録商標）； Ｈｏｓｐｉｒａ， Ｌａｋｅ Ｆｏｒｒｅｓｔ， ＩＬ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保存溶液、または１０％ ＤＭＳＯを含むＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標） ＣＳ１０ 凍結保存培地中に再懸濁した。サンプルを、出荷試験を完了させるために採取した。その拡大した幹細胞生成物を、速度制御した冷凍庫の中で凍結し、気相液体窒素（ＬＮ２）冷凍庫の中で貯蔵するために移した。
培養期の終了時に、その得られた細胞集団は不均一であり、ＣＤ３４、ＣＤ７、ＣＤ１４、ＣＤ１５およびＣＤ５６抗原の存在に関するフローサイトメトリー分析によって証明されるように、ＣＤ３４＋ 幹・前駆細胞およびより成熟した骨髄前駆体およびリンパ系前駆体からなった。培養期間中のＣＤ３４＋ 細胞数および全細胞数が顕著に増大した（ＣＤ３４＋ 細胞の約１００倍～約４００倍の拡大および全細胞数の６１７倍～３３３７倍の拡大の範囲に及ぶ（Ｎ＝９ 個々の臍帯血ユニット。上記のとおりの最終拡大手順に従って処理）。免疫表現型決定によって測定した場合に、本質的にＴ細胞が完全に欠如していた。機能的には、これらの細胞は、以前に記載される（米国特許公開番号２０１３／００９５０７９を参照のこと）とおりのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおいて多系統ヒト造血生着の能力がある。
実施例２： 凍結したヒト臍帯血ユニットからのヒトの拡大した幹細胞生成物の生成
プールしたヒト臍帯血ユニット（４～２０名の個々のユニットのプール）から選択した、富化した ＣＤ３４＋ 細胞から生成した全細胞子孫を含む拡大した幹細胞生成物を、調製した。そのプールしたヒト臍帯血ユニットを、以下のように、Ｎｏｔｃｈリガンド Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ－ＩｇＧ（ＤＸＩ）および組換えサイトカインの存在下で培養した。
約２００万個～２０００万個の間の細胞を有する臍帯血ユニットを、使用のために選択した。その臍帯血ユニットを融解し、続いて、遠心分離して、凍結保護剤を除去し、選択緩衝液中で再懸濁し、１個の容器の中にプールした。その選択緩衝液は、代表的には、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび他の構成要素を有するＰＢＳであった。その臍帯血ユニットを、代表的には、ペアで融解した。その細胞を、選択した緩衝液中で２回洗浄した。その細胞を、ＨＬＡ抗原もアレルも考慮に入れずに（すなわち、適合させない）プールした。そのプールした臍帯血ユニットを、常磁性ビーズとともにプレインキュベートし、次いで、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳによって処理して、１回使い切りのチューブセットを使用してＣＤ３４＋ 細胞に関して富化した。選択後に、その細胞を遠心分離し、その集めたＣＤ３４＋ 細胞を、細胞培養培地（５種の組換えヒトサイトカイン、ＩＬ－３（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ－６、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＦｌｔ－３Ｌ（各々５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭＩＩ）培地）中に懸濁した。次いで、その富化したＣＤ３４＋ 細胞をサンプル採取して、組成物中の生きている細胞の収量およびＣＤ３４＋ 細胞のパーセンテージを決定した。ＣＤ３４＋ 細胞を、５種の組換えヒトサイトカイン（ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ－３Ｌ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭＩＩ培地を使用して適切な目標播種密度で、コーティングしたフラスコに入れた。使用前に、そのフラスコを、組換えタンパク質ＤＸＩ（２．５マイクログラム／ｍｌ）およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）組換えヒトフィブロネクチンフラグメント（ｒＦＮ－ＣＨ－２０６）（５マイクログラム／ｍｌ）でコーティングした；結合していないタンパク質を、使用前にそのフラスコから洗浄した。そのフラスコに、必要な場合に、新鮮なＳＦＥＭＩＩ培地およびサイトカインを供給した。細胞が十分な細胞数に達した場合、その細胞を採取し、プールし、その同じＳＦＥＭＩＩ培地および５種のサイトカインを使用して、適切な目標播種密度でより大きな容器の中に継代した。その容器にまた、上記のように、ＤＸＩおよびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）組換えヒトフィブロネクチンフラグメント（ｒＦＮ－ＣＨ－２０６）を一晩プレコーティングした。その容器を、細胞密度および生存性に関してモニターし、必要な場合に、新鮮なＳＦＥＭＩＩ培地およびサイトカインの全容積までを供給した。その細胞が、所望の細胞密度に達した場合、その細胞を、わずかに撹拌することによって採取し、遠心分離によって濃縮し、その培地を除去し、その細胞を洗浄緩衝液に再懸濁した。その生きているＣＤ３４＋ 細胞計数を決定した。洗浄および採取後、その細胞ペレットを、アルブミンを有する平衡化電解質溶液中に再懸濁した。最終の幹細胞生成物は、代表的には、約５０００万個～約１億個の細胞／ｍｌを含んだ。
次いで、最終の細胞生成物を、凍結保護培地に添加し、続いて、ラベル付きのＣｒｙｏＳｔｏｒｅバッグの中に無菌的に満たし、速度制御冷凍庫の中で凍結保存し、＜－１５０℃の気相液体窒素（ＬＮ２）冷凍庫の中で貯蔵した。そのバッグに、約２０ｍｌ／バッグの容積において約５０００万個～約４億個のＣＤ３４＋ 細胞を満たした。上記凍結保護培地は、記載されるように、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ－ＲまたはＣｙｒｏＳｔｏｒ（登録商標） ＣＳ１０中に約４％ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、１０％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んだ。
実施例３： 拡大した幹細胞生成物でのＡＭＬを有する患者の処置
集中的な骨髄抑制化学療法レジメンを受けている急性骨髄性白血病を有する患者は、処置転帰全体に影響を与える、生命を脅かす感染症のリスクにある。重篤な細菌感染または真菌感染の率に対する非ＨＬＡ適合のプールした臍帯血由来エキソビボ拡大したＣＤ３４＋ 幹細胞生成物（ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌまたはＮＬＡ１０１）の使用を、第Ｉ相および第２相試験において調査した。Ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌを、導入化学療法および強化化学療法とともに投与した。国際共同第２相無作為化非盲検試験に、計画した２２０名の被験体のうちの１４６名が、４つの処置アームのうちの１つに登録された： 標準治療（ＳＯＣ）単独またはＳＯＣ＋低用量、中間用量または高用量のｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌ（それぞれ、１００×１０６、３００×１０６、または８００×１０６ ＣＤ３４＋ 細胞）。３用量までのｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌを、化学療法の各ラウンドとともに与えることができ、被験体を、化学療法またはｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌの最後の用量の８４日後または３０日後まで追跡した。その試験を休止した場合、感染率に対して特定の効果は認められず、驚くべきことに、ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌ処置した被験体は、化学療法単独を受けたコントロールアームの患者と比較して、より高い完全寛解（ＣＲ）率を経験した。さらに、ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌでの処置は、血清インターロイキン－２（ＩＬ－２）レベルにおける一過性の用量依存性増大と関連した。Ｄａｔａ Ｓａｆｅｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｏａｒｄ関連の安全性の考慮事項は存在しなかったが、少数の予測外の重篤な有害事象（ＳＡＥｓ）が観察された。しかし、移植片対宿主病もサイトカイン放出症候群も観察されなかった。
材料および方法
治験デザイン： この治験は、ＡＭＬを有する成人被験体において化学療法誘導性好中球減少症と関連する感染症率を低減するための、ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌの安全性および有効性の第２相非盲検多施設無作為化対象比較用量設定試験であった。この試験を、米国（ＵＳ）、韓国（ＳＫ）、およびオーストラリア（ＡＵ）において３６箇所で行った。登録後、被験体を、コントロールアーム（標準治療（ＳＯＣ）化学療法）または３種の調査アーム（ＳＯＣ化学療法＋低用量、中間用量、または高用量のｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌ）のうちの１つのいずれかへと１：１：１：１に無作為化した。無作為化を、地域（ＵＳ 対 ＳＫ／ＡＵ）によって階層化した。
調査アームに無作為化された被験体は、化学療法の第１サイクル後にｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌの単一の固定された割り当て用量、およびその後の化学療法サイクル後に２回までのさらなる用量（１回の注入／サイクル）を受容する資格があった。ＳＯＣアームに無作為化された被験体を、同等に、しかし３回までの化学療法サイクルにわたって、ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌの注入なしで処置した。全被験体を、無作為化の後８４日間、またはｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌの最後の注入後３０日間、またはＳＯＣアームに関しては最後の化学療法注入後の３０日間にわたるかの、いずれか長い方で追跡した。その試験を、計画されていない中間分析の完了後に、１４６名の被験体（６６％）の登録後に休止した。
上記プロトコールおよびその修正は、関連する施設内倫理委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄｓ）および倫理委員会（ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認され、いかなる試験手順の前にも書面によるインフォームド・コンセントを要求した。安全性を、独立したＤａｔａ Ｓａｆｅｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）が監督した。
患者： 資格のある被験体は、処置していない初発のまたは二次的ＡＭＬを有していなければならず、地方の施設内基準に従って、治癒目的で少なくとも２サイクルの化学療法を受けるように計画しなければならない。導入化学療法は、アントラサイクリンおよびシタラビンの主力（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含み、中程度から重篤の骨髄抑制をもたらすことが予測されることが要求された。被験体はまた、カルノフスキースコア≧５０またはＥａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス ０、１、または２を有することが要求され、適切な腎機能、肝機能、肺機能および心機能を有し、スクリーニング時に活発な制御されない感染症の証拠がないことが要求された。顆粒球輸血、免疫療法、他の試験薬の同時使用は、排除した。
試験処置： Ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌは、上記で記載されるとおりのプールし、適合されていない臍帯血由来のＣＤ３４＋ 細胞に由来するエキソビボで拡大した造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）生成物である。ＣＤ３４＋ 細胞を、適格なスクリーニング済みの臍帯血ドナーから単離し、固定化したＮｏｔｃｈリガンドおよび組換えサイトカイン（概して上記で記載されるとおり）の存在下で１６日間培養した。その拡大した幹細胞生成物を、注入するまで凍結保存し、およそ２０ｍｌの容積において、およそ１億個（低用量）、３億個（中間用量）、および８億個（高用量）のＣＤ３４＋ 細胞／バッグの固定用量において試験部位に提供した。Ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌを、所定のサイクルの化学療法の最後の用量のおよそ２４～３６時間後に、５～１０分間かけて静脈内に与えた。投与の直前に、経口アセトアミノフェンおよび静脈内抗ヒスタミン剤を投与した。
エンドポイントおよび統計分析： 上記試験の主要エンドポイントは、８４日間の試験期間の過程にわたる重篤な（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）のグレード３またはこれより高い）細菌感染または真菌感染の率であった。分析を、被験体内の特有のグレード≧３ 感染の数を計数し、試験に接した日数で正規化することによって行った。その正規化した感染率を、負の二項分布回帰を使用して、処置アーム（参照としてのＳＯＣ）および地域に対して回帰させて、処置アーム感の感染率を比較した。試験１日目からの試験に接した日数を、死亡または追跡不能に起因する、差次的な追跡を説明するためのオフセット変数として使用した。事象発生率（ｅｖｅｎｔ ｒａｔｅ ｒａｔｉｏ）および９５％ 信頼区間を、それぞれ、関連強度および精度の尺度として計算した。
重要な二次エンドポイントは、最良の全処置応答（ｂｅｓｔ ｏｖｅｒａｌｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、フィルグラスチムの使用、ならびに発熱性好中球減少症の発生率および継続時間、ならびに安全性を含んだ。処置応答を、Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ基準に従って、完全寛解（ＣＲ）または数の不完全回復を伴う完全寛解（ＣＲｉ）として定義し、処置アームを、Ｃｏｃｈｒａｎ－Ｍａｎｔｅｌ－Ｈａｎｓｅｌ試験を使用して比較し、地域によって階層化した。
結果
登録締め切りの前にこの試験のためにスクリーニングした１６２名の被験体のうち、１４６名を登録し、無作為化して試験処置を受けた： 低用量アームに３７名、中間用量アームに３８名、高用量アームに３５名、およびＳＯＣアームに３６名を無作為化した。試験を休止したときに、低用量アームにおいて１８名の被験体（４８．６％）、中間用量アームにおいて１７名の被験体（４４．７％）、高用量アームにおいて１０名の被験体（２８．６％）、対してＳＯＣアームにおいて６名の被験体（１６．７％）が、プロトコールに従って試験を完了した。被験体内訳のまとめを、図２に提供する。ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌで処置した被験体数は、低用量アームにおいて３３（８９．２％）、中間用量アームにおいて３４（８９．５％）、および高用量アームにおいて３４（９７．１％）であった。被験体１名あたり受容したｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌ用量のメジアン数は、全３アームにおいて２であった。
無作為化した被験体の全体のメジアン年齢は、６０歳齢（範囲、１９～７７）であった。被験体の性別は、男性（７５名の被験体； ５１．４％） 対 女性（７１名の被験体， ４８．６％）で等分に分かれていた。被験体のうちの大部分は、白色人種（１１０名の被験体； ７５．３％）であった。大部分の基礎疾患特徴は、群間で比較的バランスがとれていたが、ＳＯＣアームにおいてより高いパーセンテージの被験体が、ＡＭＬの中リスク（ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ ｒｉｓｋ）を有した。
試験期間の間に起こったグレード≧３の細菌感染または真菌感染の総数は、低用量アームにおいて２３、中間用量アームにおいて２２、および高用量アームにおいて２５、ならびにＳＯＣアームにおいて２０であった。全てのｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌ 対 ＳＯＣの試験は、統計的に有意でなかった（ｐ＝０．９６０４）。ＳＯＣアームに対する各処置アームの発生率および関連した９５％ ＣＩは、０．８８（０．４４， １．７７； ｐ＝０．７２９１）低用量、０．９３（０．４６， １．８８； ｐ＝０．８４７１）中間用量、および１．０５（０．５３， ２．０９； ｐ＝０．８８６８）高用量であった。
表１は、試験の過程にわたって処置アームによる完全寛解（ＣＲ）（形態的ＣＲ、細胞遺伝学的ＣＲ、分子的ＣｒまたはＣＲｉを含む）の最良の全体応答率 対 非ＣＲ（全ての他の非ＣＲ応答評価）をまとめる。各処置アームは、ＳＯＣアームと比較して、数的に有利なＣＲ率を有し、これは、中間用量アーム（ｐ＝０．００２４）および全処置群（ｐ＝０．００８６）において統計的に有意であった。この観察は、特に、単一ドナーの適合されていない、拡大した臍帯血生成物を使用する以前の試験（Ｄｅｌａｎｅｙら， ２０１６， Ｌａｎｃｅｔ ３（７）：ＰＥ３３０－３３９）に照らせば予測外であった。ＣＲ率は、以前の試験の主要エンドポイントではなかったが、ＣＲ率の増大は、報告されなかった。
Figure 2022533191000002
 注：ＣＲ＝形態的ＣＲ、細胞遺伝学的ＣＲ、分子的ＣＲ、または血液計数の回復不完全を伴うＣＲ（ＣＲｉ）；非ＣＲ＝形態学的な白血病無病状態、部分寛解（ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ／ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、初期評価、処置失敗
地域によって階層化したＣＭＨからのｐ値
全体的なｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌは、関連事象において用量依存性増大を伴って概して十分に寛容されたが、高用量アームにおける安全性事象の全体の発生率は、ＳＯＣアームにおけるより中程度にのみ高かった。ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌに関連すると評価された最も一般的な有害事象は、発熱／発熱性好中球減少症、輸液反応、ならびに炎症徴候および症状であった。その試験における死亡の発生は、ＳＯＣアームと比較して、いかなる拡大した幹細胞生成物においても上昇しなかった。ＤＳＭＢは試験全体を通じて安全性をモニターし、安全性の考慮事項を提起しなかった。ＳＯＣアームと比較して各処置アームにおける数的に有利なＣＲ率は、予測外であった。
実施例４： 拡大した幹細胞生成物での血液悪性腫瘍を有する患者の処置
血液悪性腫瘍を有しかつ集中的な化学療法レジメンを受けている患者を、標準治療（ＳＯＣ）＋低用量、中間用量、または高用量ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌ（それぞれ、１００×１０６、３００×１０６、または８００×１０６ ＣＤ３４＋ 細胞）で処置する。Ｄｉｌａｎｕｂｉｃｅｌを、上記化学療法の各サイクル後に投与する。上記患者を、標準実務に従って追跡し、完全寛解（ＣＲ）（形態的ＣＲ、細胞遺伝学的ＣＲ、分子的ＣｒまたはＣＲｉを含む） 対 非ＣＲ（全ての他の非ＣＲ応答評価）の最良の全応答率を、試験の過程にわたって評価した。
本発明は、本明細書で記載される具体的実施形態によってその範囲が限定されるべきではない、実際に、本発明の種々の改変は、本明細書で記載されるものに加えて、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになる。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
種々の刊行物（特許、特許出願公開、および科学文献を含む）が、本明細書で引用され、これらの開示は、全ての目的のために、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
網羅的な特性または利益が特許請求される本発明の実施形態は、以下のとおり定義される。

Claims (47)

  1. 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有するヒト患者の処置転帰を改善する方法であって、前記方法は、
    導入化学療法レジメンを前記患者に投与する工程；
    前記導入レジメンの投与後に、ＣＤ３４＋ 富化、Ｔ細胞枯渇、拡大した幹細胞生成物の固定用量を前記患者に投与する工程であって；ここで前記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも２名の異なるヒトドナーの臍帯血ユニットに由来する造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含み、ここで前記臍帯血ユニットは、前記ドナーのＨＬＡ型に適合させることなくかつ前記ヒト患者のＨＬＡ型に適合させることなく選択される、工程；
    前記患者の状態をモニターする工程であって、前記患者が寛解を達成しているか否かを決定する工程；および
    前記患者が寛解を達成していない場合に、第２の導入化学療法レジメンを投与し、続いて、前記拡大した幹細胞生成物の第２の固定用量を前記患者に投与する工程、
    を包含する方法。
  2. 強化化学療法レジメンを、寛解を達成している前記患者に投与し、続いて、前記拡大した幹細胞生成物の固定用量を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記拡大した幹細胞生成物の各用量は、前記導入化学療法レジメンの約１２～４８時間後に、または好ましくは約２４～３６時間後に投与される、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 前記拡大した幹細胞生成物の各用量は、前記導入化学療法レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が前記患者の血液から消失した後に、前記患者に投与される。請求項１に記載の方法。
  5. 前記拡大した幹細胞生成物の用量は、前記強化化学療法レジメンの約１２～４８時間後に、または好ましくは約２４～３６時間後に投与される、請求項２に記載の方法。
  6. 前記拡大した幹細胞生成物の用量は、前記強化化学療法レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が前記患者の血液から消失した後に投与される、請求項２に記載の方法。
  7. 前記導入化学療法レジメンは、シタラビンおよびアントラサイクリンの組み合わせの投与を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記アントラサイクリンは、ダウノルビシンまたはイダルビシンである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記導入レジメンは、７＋３レジメンである、請求項７に記載の方法。
  10. 前記導入化学療法レジメンは、シタラビンおよびダウノルビシンの投与を含む、請求項７に記載の方法。
  11. 前記強化化学療法レジメンは、中用量または高用量シタラビンの投与を含む、請求項２に記載の方法。
  12. 救援化学療法レジメンを投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記救援化学療法レジメンは、クラドリビン・高用量シタラビン・Ｇ－ＣＳＦ（ＣＬＡＧ）またはエトポシド・シタラビン・ミトキサントロン（ＭＥＣ）を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記拡大した幹細胞生成物の各固定用量は、約５０００万個のＣＤ３４＋ 細胞～約４億個のＣＤ３４＋ 細胞を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  15. 前記拡大した幹細胞生成物の各固定用量は、約１億個～約３億個のＣＤ３４＋ 細胞を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  16. ａ．前記拡大した幹細胞生成物の各固定用量は、同じである；
    ｂ．前記導入化学療法レジメン後に投与した前記拡大した幹細胞生成物の各固定用量は、同じである；または
    ｃ．前記導入化学療法レジメン後に投与した前記拡大した幹細胞生成物の各固定用量は、前記強化化学療法レジメン後に投与した前記固定用量とは異なる、
    前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  17. 前記拡大した幹細胞生成物は、凍結保護剤をさらに含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  18. 前記拡大した幹細胞生成物は、ＣＤ３４＋ ヒト臍帯血幹・前駆細胞を富化することおよび前記ＣＤ３４＋ 富化ヒト臍帯血幹・前駆細胞をＮｏｔｃｈアゴニストで拡大することを包含する工程によって生成される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  19. 前記Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ＩｇＧのＦｃ部分に融合したＤｅｌｔａの細胞外ドメイン（Ｄｅｌｔａｅｘｔ－ＩｇＧ）である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも４名の異なるヒトドナー、少なくとも６名の異なるヒトドナー、または少なくとも８名の異なるヒトドナーの臍帯血ユニットに由来する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  21. 前記拡大した幹細胞生成物は、投与後１４日目に、前記患者において一過性に生着しない、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  22. 前記モニターする工程は、患者が、形態学によって＜５％ 骨髄芽球を有するか否かを決定することを包含する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  23. 前記導入レジメンの後かつ前記強化レジメンの前に、前記患者は、前記ＨＬＡ型患者に少なくとも部分的に適合した臍帯血ユニットを受容しない、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  24. 前記少なくとも部分的に適合した臍帯血ユニットは、自家移植片、ハプロタイプ一致移植片、適合した血縁者ドナー移植片、適合した非血縁者ドナー移植片、またはミスマッチ非血縁者ドナー移植片である、請求項２３に記載の方法。
  25. 血液悪性腫瘍を有するヒト患者の処置転帰を改善する方法であって、前記方法は、
    化学療法レジメンを前記患者に投与する工程；
    前記化学療法レジメンの投与後に、拡大した幹細胞生成物の固定用量を前記患者に投与する工程であって；ここで前記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも２名の異なるヒトドナーの造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含み、ここで前記造血幹細胞または造血幹・前駆細胞は、前記ドナーのＨＬＡ型に適合させることなくかつ前記ヒト患者のＨＬＡ型に適合させることなく選択される工程；
    前記患者の状態をモニターする工程であって、前記患者が寛解を達成しているか否かを決定する工程；および
    前記患者が寛解を達成していない場合に、必要に応じて、第２の化学療法レジメンを投与し、続いて、前記拡大した幹細胞生成物の別の固定用量を前記患者に投与する工程、
    を包含する方法。
  26. 前記拡大した幹細胞生成物の各用量は、前記化学療法レジメンの約１２～４８時間後に、または好ましくは約２４～３６時間後に投与される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記拡大した幹細胞生成物の各用量は、前記化学療法レジメンの構成要素およびその活性代謝産物が前記患者の血液から消失した後に、前記患者に投与される、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）から選択される、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ＡＭＬは、初発急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、再発／難治性ＡＭＬまたは処置関連ＡＭＬである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＭＤＳは、多系統異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＭＬＤ）；単一系統異形成を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＳＬＤ）；環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）；芽球増加を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＥＢ）；単離された欠失（５ｑ）を伴うＭＤＳ；および分類不能型ＭＤＳ（ＭＤＳ－Ｕ）から選択される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記ＭＰＮは、慢性骨髄性白血病、真性多血症（ｐ． ｖｅｒａ）、原発性骨髄線維症、本態性血小板血症、慢性好中球性白血病、または慢性好酸球性白血病から選択される、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも２名の異なるヒトドナーの臍帯血ユニットに由来する造血幹細胞または造血幹・前駆細胞を含む、請求項２５～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記化学療法レジメンは、導入レジメン、救援レジメン、および強化レジメンから選択される、請求項２５～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記化学療法レジメンは、シタラビンおよびアントラサイクリンの投与を含む導入レジメンである、請求項２５～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記アントラサイクリンは、ダウノルビシンまたはイダルビシンである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記導入レジメンは、７＋３レジメンである、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記化学療法レジメンは、中用量または高用量シタラビンの投与を含む、強化レジメンである、請求項２５～３３のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記化学療法レジメンは、救援レジメンである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記救援レジメンは、クラドリビン・高用量シタラビン・Ｇ－ＣＳＦ（ＣＬＡＧ）またはエトポシド・シタラビン・ミトキサントロン（ＭＥＣ）である、請求項２５～３３のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記拡大した幹細胞生成物の各固定用量は、約５０００万個のＣＤ３４＋ 細胞～約４億個のＣＤ３４＋ 細胞を含む、請求項２５～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記拡大した幹細胞生成物の各固定用量は、約１億個～約３億個のＣＤ３４＋ 細胞を含む、請求項２５～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記拡大した幹細胞生成物の各固定用量は同じである、請求項２５～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記拡大した幹細胞生成物は、凍結保護剤をさらに含む、請求項２５～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記拡大した幹細胞生成物は、ＣＤ３４＋ ヒト臍帯血幹・前駆細胞を富化することおよび前記ＣＤ３４＋ 富化ヒト臍帯血幹・前駆細胞をＮｏｔｃｈアゴニストで拡大することを包含する工程によって生成される、請求項２５～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記Ｎｏｔｃｈアゴニストは、ＩｇＧのＦｃ部分に融合したＤｅｌｔａの細胞外ドメイン（Ｄｅｌｔａｅｘｔ－ＩｇＧ）である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記拡大した幹細胞生成物は、少なくとも４名の異なるヒトドナー、少なくとも６名の異なるヒトドナー、または少なくとも８名の異なるヒトドナーの臍帯血ユニットに由来する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
  47. 前記拡大した幹細胞生成物は、投与後１４日目に決定される場合に、前記患者において一過性に生着しない、請求項２５～４６のいずれか１項に記載の方法。

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