JP2022532922A - 酵母ベースの経口ワクチン接種 - Google Patents
酵母ベースの経口ワクチン接種 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022532922A JP2022532922A JP2021569052A JP2021569052A JP2022532922A JP 2022532922 A JP2022532922 A JP 2022532922A JP 2021569052 A JP2021569052 A JP 2021569052A JP 2021569052 A JP2021569052 A JP 2021569052A JP 2022532922 A JP2022532922 A JP 2022532922A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- recombinant yeast
- acid sequence
- seq
- yeast cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title abstract description 47
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title abstract description 40
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 391
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 183
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 144
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 97
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 81
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 361
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 249
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 141
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 121
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 121
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 120
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 72
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 65
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 49
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 43
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 40
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 31
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 29
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 28
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 28
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 20
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 18
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 18
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 18
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 claims description 16
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 claims description 16
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 claims description 13
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims description 3
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 108010065667 Viral Matrix Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 57
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 71
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 70
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 44
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 38
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 30
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 24
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 24
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 20
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 19
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 18
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 16
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 16
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 14
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 14
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 14
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 14
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 10
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 10
- 101150036892 VP40 gene Proteins 0.000 description 10
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 10
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 10
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 10
- 108010055059 beta-Mannosidase Proteins 0.000 description 10
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 102100032487 Beta-mannosidase Human genes 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 8
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 7
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 7
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 7
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 7
- 101000763602 Manilkara zapota Thaumatin-like protein 1 Proteins 0.000 description 7
- 101000763586 Manilkara zapota Thaumatin-like protein 1a Proteins 0.000 description 7
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 101000966653 Musa acuminata Glucan endo-1,3-beta-glucosidase Proteins 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 5
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 5
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 5
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 description 5
- 241000723751 Nodamura virus Species 0.000 description 5
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 101150016678 RdRp gene Proteins 0.000 description 5
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108700002673 Coronavirus M Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 4
- 101710186180 Matrix protein VP40 Proteins 0.000 description 4
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 4
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 3
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 3
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 3
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 241000186221 Cellulosimicrobium cellulans Species 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 2
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 2
- 241001529459 Enterovirus A71 Species 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 241001648840 Thosea asigna virus Species 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000235152 Williopsis Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013590 bulk material Substances 0.000 description 2
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 2
- 235000012495 crackers Nutrition 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- -1 glucanase Proteins 0.000 description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 2
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 2
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 2
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 2
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100351811 Caenorhabditis elegans pgal-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100522278 Caenorhabditis elegans ptp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241001515413 Cyberlindnera mrakii Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000010772 Dog disease Diseases 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102100028999 High mobility group protein HMGI-C Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000986379 Homo sapiens High mobility group protein HMGI-C Proteins 0.000 description 1
- 101000785063 Homo sapiens Serine-protein kinase ATM Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710199771 Matrix protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 description 1
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 101710114167 Polyprotein P1234 Proteins 0.000 description 1
- 101710132653 Protein M2 Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101800001758 RNA-directed RNA polymerase nsP4 Proteins 0.000 description 1
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101150006932 RTN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 102100020824 Serine-protein kinase ATM Human genes 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000008618 cell wall macromolecule catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000004034 genetic regulation Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N mannan Chemical class O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
経口ワクチン接種での使用に適した様々な組換え酵母、ワクチン組成物、食品組成物、動物へのワクチン接種方法、ならびに関連する方法、キット、及び核酸分子を記載する。【選択図】図１５
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月２１日に出願された米国仮出願第６２／８５０，６８１号、及び２０２０年３月１８日に出願された米国仮出願第６２／９９１，５３６号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に援用される。
本出願は、２０１９年５月２１日に出願された米国仮出願第６２／８５０，６８１号、及び２０２０年３月１８日に出願された米国仮出願第６２／９９１，５３６号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に援用される。
本開示は、ワクチン接種の分野に関する。より具体的には、本開示は、酵母ベースの経口ワクチン接種の分野に関する。具体的な例は、組換え酵母細胞、ワクチン組成物、食品組成物、ワクチンの製造方法、及び動物へのワクチン接種方法に関する。本開示はまた、様々な他の方法、キット、及び核酸分子に関する。
ワクチン接種は、ヒトの疾患を軽減及び予防するための安価で効果的な方法である。しかし、残念ながら、世界の予防接種率は依然として世界の人口の約１５％が予防可能な疾患にかかりやすいままである。多くの従来のワクチンは、医療専門家によって投与される注射に依存しており、このことが本質的に治療可能な患者の数を制限している。さらに、注射ベースのワクチンは、多くの場合、重要な保管及び取り扱いの要件があり、製造、送達、及び投与の労力のスケーリングを阻害し得る。
酵母ベースのワクチンプラットフォームは、大量のワクチン生産及び／または経口ワクチン接種としての使用について記載されている。Ｕ．Ｓ．１０，１１７，９１５を参照されたい。しかしながら、今日まで、そのようなプラットフォームは、ウイルス様粒子またはエンベロープウイルス様粒子などの複雑な免疫原を効率的に放出することはなかった。
したがって、改善されたワクチン、ワクチン成分、ワクチン組成物、ならびに関連する方法、キット、及び他のワクチン関連技術に対する必要性が存在する。
本発明者らは、免疫原、例えば、ウイルス様粒子またはエンベロープウイルス様粒子を発現する組換え酵母細胞において、細胞壁の透過性を調節することにより、組換え酵母による免疫原放出を有意に向上させることができることを予期せず発見した。理論に拘泥することを望むものではないが、本発明者らは、本明細書に記載の１つ以上の方法を使用して調節された透過処理を誘導することにより、放出される免疫原（例えば、免疫原を含み、及び／または免疫原をコードするパッケージされた核酸配列を含むＶＬＰの形態で）の量を、透過性がない組換え酵母細胞に比べて向上させることができ；組換え酵母細胞の生存率を、以前に記載された透過処理方法に比べて、より高いレベルで維持することができ；得られるワクチン組成物の効力を高めることができ；及び／または免疫原の放出が、前述の方法と比較してより選択的である可能性があるという仮説を立てている。これらの改善の１つ以上により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫原製造法で回収される免疫原の量または純度；酵母によって抗原提示細胞に提供される免疫原の量；及び／または組換え酵母細胞を投与した対象の胃腸管において組換え酵母細胞によって放出される免疫原の量を有意に向上させることができる。
調節された透過性は、細胞壁分解酵素（例えば、マンナーゼ、グルカナーゼ、キチナーゼ、またはそれらの組み合わせ）などの細胞壁透過剤の発現を誘導すること、細胞壁生合成阻害剤の発現を誘導すること、または細胞壁生合成経路の成分の発現を調節された方法で低減もしくは排除することによって誘導される。理論に拘泥することを望むものではないが、本発明者らはさらに、細胞壁分解酵素の調節された誘導が、上記の予想外の利益に加えて、酵母糖タンパク質、βグルカン、またはマンナンなどの細胞壁分解産物の脱落、及び／または提示を増加させることによって、ワクチン組成物中の酵母細胞壁成分によって提供される固有のアジュバント活性を予想外に増加させることができるという仮説を立てている。
好ましい実施形態では、免疫原を送達される抗原提示細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、組換え酵母を経口投与した対象の胃腸管内などに存在する。いくつかの場合では、酵母を、経口ワクチンとして経口投与する。経口ワクチン接種での使用に適した様々な例示的な組換え酵母細胞が本明細書に記載されている。
一態様では、経口ワクチン接種での使用に適した組換え酵母細胞は、野生型酵母細胞に由来する。一般的に、組換え酵母細胞は、少なくとも１つの異種核酸配列を含む宿主細胞である。例えば、異種エレメントは、異種プロモーターを含み得る。異種プロモーターは、宿主細胞と比較して、異なる種または株の細胞に由来するプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、第２の核酸配列に作動可能に連結されている内在性プロモーターのコピーであり、その場合、内在性プロモーター及び第２の核酸配列は、野生型酵母細胞においては作動可能に連結されていない。
いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、内在性プロモーターの野生型位置と比較して、ゲノム内の異なる位置または細胞内位置に存在する内在性プロモーターである。例えば、異種プロモーターは、野生型酵母細胞におけるプロモーターの染色***置と比較して、異なる染色***置にあり得る。別の例として、異種プロモーターを、プラスミドまたはエピソームフラグメント上に存在させることができ、その場合、そのプロモーターは、野生型酵母細胞の宿主細胞染色体に位置する。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、組換え酵母細胞における異種プロモーターの細胞内位置と比較して、異なる細胞小器官に天然に見出されるプロモーターであり得る。例えば、異種プロモーターは、内在性酵母細胞ミトコンドリアゲノム由来のプロモーターであり得、組換え酵母細胞の核内の第２の核酸配列に作動可能に連結させることができる。
一実施形態では、組換え酵母細胞は、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含む。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある。
いくつかの実施形態では、免疫原は、キャプシドタンパク質などのウイルス様粒子（ＶＬＰ）の成分、またはその機能的断片であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、免疫原は、第１の部分及び第２の部分を含む融合タンパク質であるか、またはそれを含み、第１の部分は、キャプシドタンパク質またはその機能的断片を含み、第２の部分は、抗原を含む。いくつかの実施形態では、免疫原は、マトリックスタンパク質などのエンベロープＶＬＰ（ｅＶＬＰ）の成分、またはその機能的断片であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、免疫原は、第１の部分及び第２の部分を含む融合タンパク質であるか、またはそれを含み、第１の部分は、マトリックスタンパク質またはその機能的断片を含み、第２の部分は、抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、第１の部分及び第２の部分を含む融合タンパク質を含み、第１の部分は、ＶＬＰ形成ユニット（例えば、ＨＩＶ－ＧＡＧもしくはキャプシドタンパク質またはその機能的断片）を含み、第２の部分は、免疫原またはレポーターポリペプチドを含む。いくつかの場合では、レポーターポリペプチドは酵素である。いくつかの場合では、レポーターポリペプチドは蛍光タンパク質である。レポータータンパク質を含む実施形態では、そのようなＶＬＰは、対象へのＶＬＰの投与及び／または対象の細胞によるＶＬＰの取り込みを追跡するために有用であり得る。
例示的なＧＡＧ－ＧＦＰ融合体を、配列番号１４に示す。いくつかの場合では、ＧＡＧ－ＧＦＰ融合体は、配列番号１４の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含む。いくつかの場合では、ＧＡＧ－ＧＦＰ融合タンパク質は、配列番号１４の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。いくつかの場合では、ＧＡＧ－ＧＦＰ融合タンパク質は、配列番号１４の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含む。いくつかの場合では、ＧＡＧ－ＧＦＰ融合タンパク質は、配列番号１４の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含む。
いくつかの実施形態では、細胞壁分解酵素は、β－グルカナーゼなどのグルカナーゼである。
一実施形態では、経口ワクチン接種での使用に適した組換え酵母細胞は、野生型酵母細胞に由来し、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、インフルエンザウイルス（またはコロナウイルス）由来の１つ以上のタンパク質をコードする第２の核酸配列；及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含む。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々は、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある。いくつかの実施形態では、細胞壁分解酵素は、β－グルカナーゼまたはβ－１，３－グルカナーゼなどのグルカナーゼである。
いくつかの実施形態では、細胞壁分解酵素は、β－グルカナーゼなどのグルカナーゼである。
いくつかの場合では、インフルエンザウイルス由来のタンパク質は、Ｍ１マトリックスタンパク質（例えば、ヒトインフルエンザＭ１マトリックスタンパク質）またはその機能的断片、ヘマグルチニンまたはその免疫原性断片、及びノイラミニダーゼまたはその免疫原性断片からなる群から選択される。いくつかの場合では、第２の核酸は、Ｍ１マトリックスタンパク質（例えば、ヒトインフルエンザＭ１マトリックスタンパク質）またはその機能的断片、ヘマグルチニンまたはその免疫原性断片、及びノイラミニダーゼまたはその免疫原性断片からなる群から選択されるインフルエンザウイルス由来の少なくとも２つのタンパク質をコードする。いくつかの場合では、第２の核酸は、ヒトインフルエンザＭ１マトリックスタンパク質、ヘマグルチニン、及びノイラミニダーゼをコードする。
いくつかの場合では、コロナウイルス由来のタンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質）、またはその免疫原性断片もしくは機能的断片、及びコロナウイルスＭ１マトリックスタンパク質（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９ Ｍ１マトリックスタンパク質）またはその免疫原性断片もしくは機能的断片からなる群から選択される。いくつかの場合では、第２の核酸は、Ｍ１マトリックスタンパク質またはその免疫原性断片もしくは機能的断片、及びコロナウイルススパイクタンパク質、またはその免疫原性断片もしくは機能的断片からなる群から選択されるコロナウイルス由来の少なくとも２つのタンパク質をコードする。
好適なＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質は、配列番号２２に示す配列を含む免疫原性断片であり得るが、これに限定されない。いくつかの場合では、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質は、配列番号２２の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含む。いくつかの場合では、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質は、配列番号の２２の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のタンパク質を含む。いくつかの場合では、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質は、配列番号２２の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質を含む。いくつかの場合では、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質は、配列番号２２の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含む。
組換え酵母細胞は、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であり得る。
例示的な実施形態では、経口ワクチン接種での使用に適した組換え酵母細胞は、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞に由来し、Ｔｅｔ－ｏｆｆ調節プロモーターをコードする第１の核酸配列、インフルエンザウイルス由来のヒトインフルエンザＭ１マトリックス、ヘマグルチニン、及びノイラミニダーゼタンパク質からなる群から選択される１つ以上の免疫原をコードする第２の核酸配列；ならびに細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含む。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある。
例示的な実施形態では、経口ワクチン接種での使用に適した組換え酵母細胞は、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞に由来し、Ｔｅｔ－ｏｆｆ調節プロモーターをコードする第１の核酸配列、本明細書に記載の１つ以上のコロナウイルス免疫原をコードする第２の核酸配列；及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含む。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある。
別の実施形態では、経口ワクチン接種での使用に適した組換え酵母細胞は、野生型酵母細胞に由来し、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁阻害毒素をコードする第３の核酸配列を含む。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。
一態様では、本発明は、複数の、前述の組換え酵母細胞のいずれか１つ、もしくは本明細書に記載の組換え酵母細胞のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを提供する。複数とは、少なくとも１×１０6～約１×１０15細胞、または少なくとも１×１０7～約１×１０14細胞、または少なくとも１×１０8～約１×１０13細胞の範囲であり得る。
複数の組換え酵母細胞は、約１×１０5細胞／ｍＬ～約２×１０9細胞／ｍＬ、好ましくは約１×１０8細胞／ｍＬ～約２×１０9細胞／ｍＬの密度を有する培養培地中にあり得る。複数の組換え酵母細胞は、約１×１０9細胞／ｍＬ～約１×１０10細胞／ｍＬの密度を有する濃縮液体中に存在し得る。例えば、液体は濃縮培地であり得るか、または複数の組換え酵母細胞は、細胞を培養培地から分離し、細胞を緩衝液に再懸濁することによって濃縮され得る。複数の細胞は、凍結乾燥または噴霧乾燥された組成物であり得る。いくつかの場合では、凍結乾燥された組成物は、少なくとも１×１０6細胞／ｇ～１×１０9細胞／ｇを含む。いくつかの場合では、噴霧乾燥された組成物は、少なくとも１×１０6細胞／ｇ～１×１０9細胞／ｇを含む。
様々な例示的なワクチン組成物もまた、本明細書に記載する。
一実施形態では、ワクチン組成物は、カプセルなどの空洞を画定する摂取可能な容器、及びその空洞内に配置された組換え酵母細胞を含む。空洞内に配置された組換え酵母細胞は、例えば、液体、濃縮液体、または固体（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）製剤中の、例えば、前述の組換え酵母細胞のいずれか１つ、または本明細書に記載の組換え酵母細胞のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、摂取可能な容器は、少なくとも１×１０6個の組換え酵母細胞～約１×１０12個の組換え酵母細胞を含む。いくつかの実施形態では、組換え酵母細胞は、野生型酵母細胞に由来し、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。
別の実施形態では、ワクチン組成物は、空洞を画定する摂取可能な容器、及び空洞内に配置された組換え酵母細胞を含む。組換え酵母細胞は、野生型酵母細胞に由来し、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁阻害毒素をコードする第３の核酸配列を含む。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。
別の例示的なワクチン組成物は、空洞を画定する摂取可能なカプセル、及び空洞内に配置された野生型酵母細胞に由来する凍結乾燥または噴霧乾燥された組換え酵母細胞を含む。組換え酵母細胞は、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み得る。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。
様々な食品組成物もまた、本明細書に記載する。
一実施形態では、食品組成物は、少なくとも１つの食品ならびに空洞を画定する摂取可能な容器及び本明細書に記載の組換え酵母細胞を含む少なくとも１つのワクチン組成物、または空洞内に配置された本明細書に記載の複数の組換え酵母細胞を含む組成物を含む。別の実施形態では、食品組成物は、少なくとも１つの食品；ならびに複数のワクチン組成物（各々が、空洞を画定するポリマーシェル、及び空洞内に配置された本明細書に記載の複数の組換え酵母細胞を含む）を含む。別の実施形態では、食品組成物は、少なくとも１つの食品と、ポリマーシェルによって画定される空洞内に配置された本明細書に記載の複数の組換え酵母細胞を含むワクチン組成物とを含む。別の例では、食品組成物は、少なくとも１つの食品を含むマトリックスと、本明細書に記載の複数の組換え酵母細胞を含むワクチン組成物とを含む。いくつかの場合では、ワクチン組成物を、食品マトリックスと混合する。
別の例示的なワクチン組成物は、アルギン酸塩もしくはキトサン、またはそれらの組み合わせと、１つ以上の賦形剤とを組み合わせて噴霧乾燥させた、本明細書に記載の複数の組換え酵母細胞を含む。好適な賦形剤として、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｚｅｋａｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１８，Ｓｅｐｔ．１１（９）：１５２２；及び米国特許第９，７００，５１９号を参照されたい。組換え酵母細胞は、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素または細胞壁阻害剤毒素をコードする第３の核酸配列を含み得る。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。
ワクチンを製造するための様々な例示的な方法もまた、記載する。
一実施形態では、ワクチンの製造方法は、野生型酵母細胞に、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素または細胞壁阻害剤をコードする第３の核酸配列を導入することにより、本明細書に記載の組換え酵母細胞を作製すること、及び摂取可能な容器によって画定される空洞内に組換え酵母細胞を配置することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、組換え酵母細胞を培養して複数の組換え酵母細胞を産生することを含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の組換え酵母細胞の少なくとも一部を採取すること、及び採取した組換え酵母細胞を摂取可能な容器によって画定された空洞に配置することをさらに含む。
別の実施形態では、ワクチンの製造方法は、野生型酵母細胞に、リプレッサーの存在下で抑制される正の抑制性プロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を導入することにより、本明細書に記載の組換え酵母細胞を作製することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、リプレッサーを含む培養物中でリプレッサーの存在下で抑制される正の抑制性プロモーターを含む複数の組換え酵母細胞を増殖させることを含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、摂取可能な容器によって画定される空洞内に複数の組換え酵母細胞を配置すること、またはアルギン酸塩もしくはキトサンなどの高分子培地で複数の組換え酵母細胞を噴霧乾燥することを含むか、またはさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、第２及び／または第３の核酸配列によってコードされるタンパク質の産生を促進するのに十分な量のリプレッサーを除去することをさらに含む。リプレッサーは、リプレッサーを含む培地を交換、希釈、または除去することによって除去することができる。リプレッサーは、例えば、対象の消化管において、リプレッサーを希釈するか、または希釈できるようにすることによって除去することができる。
別の実施形態では、ワクチンの製造方法は、野生型酵母細胞に、リプレッサーの存在下で抑制される正の抑制性プロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を導入することによって組換え酵母細胞を作製することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、リプレッサーを含む培養物中で正の抑制性プロモーターを含む複数の組換え酵母細胞を増殖させることを含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の組換え酵母細胞を凍結乾燥または噴霧乾燥すること；及び複数の組換え酵母細胞を、摂取可能な容器によって画定される空洞に配置することを含むか、またはさらに含む。第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含む。第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、第２及び／または第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態では、方法は、第２及び／または第３の核酸配列によってコードされるタンパク質の産生を促進するのに十分な量のリプレッサーを除去することをさらに含む。リプレッサーは除去することができ、次いで、複数の組換え酵母細胞を事前に定義された期間インキュベートし、それにより、正の抑制性プロモーターを活性化させ、第２及び／または第３の核酸配列を発現させることができる。プロモーターの活性化は、凍結乾燥の前に達成することができる。追加的または代替的に、プロモーター活性化は、凍結乾燥及び／または複数の凍結乾燥組換え酵母細胞の再構成の後に、またはそれらによって実施することができる。追加的または代替的に、プロモーター活性化は、複数の、例えば、凍結乾燥され、任意選択で再構成された組換え酵母細胞を投与した後、または投与することによって実施することができる。
動物にワクチン接種する様々な例示的な方法もまた、本明細書に記載する。
一実施形態では、動物へのワクチン接種方法は、一実施形態によるワクチン組成物を前記動物に経口送達することを含む。別の実施形態では、動物へのワクチン接種方法は、一実施形態による食品組成物を前記動物に経口送達することを含む。いくつかの実施形態では、動物はヒトであり、方法は、一実施形態によるワクチン組成物を経口摂取するように前記ヒトに指示することを含む。
別の実施形態では、方法は、一実施形態による食品組成物を経口摂取するように前記ヒトに指示することを含む。
ワクチンを供給する様々な方法もまた、本明細書に記載する。
一実施形態では、ワクチンの供給方法は、複数のワクチン組成物を製造すること（複数のワクチン組成物の各ワクチン組成物は、一実施形態によるワクチン組成物を含む）；及び前記複数の動物の個々の動物にワクチン接種する目的で、複数のワクチン組成物の個々のワクチン組成物を前記複数の動物の個々の動物に送達するように指定された個体に複数のワクチン組成物を送達することを含む。
別の実施形態では、ワクチンの供給方法は、複数の食品組成物を製造すること（複数の食品組成物の各食品組成物は、一実施形態による食品組成物を含む）；及び前記複数の動物の個々の動物にワクチン接種する目的で、複数の食品組成物の個々の食品組成物を前記複数の動物の個々の動物に送達するように指定された個体に複数の食品組成物を送達することを含む。
様々な例示的なキットもまた、本明細書に記載する。
一実施形態では、キットは、包装基材、一実施形態によるワクチン組成物、及びワクチン組成物を使用するための指示書を含む。
別の実施形態では、キットは、包装基材、一実施形態による食品組成物、及び食品組成物を使用するための指示書を含む。
様々な例示的な単離された核酸分子もまた、本明細書において提供する。
一実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１を有し、この分子は、本発明の方法、組成物、及びキットにおいて有用な例示的な分泌型βグルカナーゼ細胞壁分解酵素をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２を有し、この分子は、本発明の方法、組成物、及びキットにおいて有用な例示的な分泌型Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡヘマグルチニンをコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号３を有し、この分子は、例示的なＨ１Ｎ１インフルエンザＡマトリックスタンパク質１をコードする。別の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号４を有し、この分子は、本発明の方法、組成物、及びキットにおいて有用な例示的な分泌型キチナーゼ細胞壁分解酵素をコードする。
別の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１５またはその機能的断片もしくは免疫原性断片をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸分子は、配列番号１５の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてをコードする。いくつかの場合では、単離された核酸分子は、配列番号１５の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸は、配列番号１５の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸分子は、配列番号１５の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。
別の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１６またはその機能的断片もしくは免疫原性断片をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸分子は、配列番号１６の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてをコードする。いくつかの場合では、単離された核酸分子は、配列番号１６の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸は、配列番号１６の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸分子は、配列番号１６の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。
別の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１７またはその機能的断片もしくは免疫原性断片をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸分子は、配列番号１７の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてをコードする。いくつかの場合では、単離された核酸分子は、配列番号１７の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸は、配列番号１７の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、単離された核酸は、配列番号１７の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。
別の実施形態では、単離された核酸分子は、細胞壁阻害毒素をコードする。いくつかの場合では、細胞壁阻害毒素は、配列番号２３の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含む。いくつかの場合では、毒素は、配列番号５によってコードされるタンパク質または配列番号２３に記載のポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、または５個以下の単一アミノ酸の置換、欠失、及び／または付加を含む。いくつかの場合では、毒素は、配列番号５によってコードされる分泌タンパク質配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの場合では、β－１－３－グルカナーゼは、配列番号２３の少なくとも２５、５０、１００、もしくは１２５連続アミノ酸、またはすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの場合では、核酸は、配列番号５によってコードされる細胞壁阻害毒素をコードする。いくつかの場合では、例示的な細胞壁阻害毒素は、配列番号２３を有する。
以下の選択した実施例の詳細な説明及び添付の図面を概観することにより、経口ワクチン接種、ワクチン組成物、食品組成物、ワクチンの製造方法、動物へのワクチン接種方法、ならびに関連する方法、キット、及び核酸分子での使用に適した例示的な組換え酵母細胞を含む本発明をさらに理解することができる。
以下の詳細な説明及び添付の図面は、ワクチン免疫原の産生に使用するのに適した様々な例示的な組換え酵母を説明及び例示している。そのような組換え酵母細胞は、例えば、経口ワクチン接種、ワクチン組成物の作製、動物へのワクチン接種方法、ならびに関連する方法、キット、及び核酸分子に使用することができる。説明及び図面は、当業者が、経口ワクチン接種、ワクチン組成物、キット、及び核酸分子での使用に適した１つ以上の組換え酵母を作製及び使用し、例示的な方法を実施できるようにするために提供される。それらは、いかなる意味でも特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。
本明細書中で使用する場合、用語「動物」とは脊椎動物を指す。この用語には、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、及び両生類が含まれる。そのため、この用語には、ヒト、イヌ及びネコなどの家庭用ペット、野生化ネコ、ウマ、ウシ、及び他の脊椎動物が含まれる。この用語には、家畜用ブタ、トリ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ及びシチメンチョウなどの農業上重要な動物も含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「空洞」とは、物体によって画定されるオープンスペースを指す。それ自体では、この用語は特定の構造または物理的特性を必要とせず、例えば、露出した開口部を有するスペース及び囲まれたスペースが含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「共通の遺伝子制御」とは、同じプロモーターによって調節される複数の核酸配列の特性を指す。この用語には、複数の核酸配列が、両方の核酸配列の発現を調節する単一のプロモーターの下流に配置される核酸配列が含まれる。この用語にはまた、複数の核酸配列の１つがプロモーターの第１のコピーの下流に配置され、複数の核酸配列の別のものがプロモーターの第２のコピーの下流に配置される核酸配列が含まれる。プロモーターの複数のコピーが共通の遺伝子制御下のタンパク質の発現のためのスキームで使用される場合、コピーは配列が同一である必要はなく、機能的同等性が維持される限り、プロモーター配列のわずかな変動が許容されることを理解されたい。
本明細書中で使用する場合、用語「摂取可能」とは、参照される要素が動物によって摂取される能力を指す。
本明細書中で使用する場合、用語「調節されたプロモーター」とは、特定の条件下で特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。この用語には、誘導性プロモーター及び抑制性プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例には、正の誘導性プロモーター、すなわち、インデューサーと活性化分子との間の相互作用により、組み合わされた実体が誘導性プロモーターへ結合することを可能にし、誘導性プロモーターによって制御される下流遺伝子の転写に影響を及ぼすことなどによって、インデューサーの存在下で活性化される誘導性プロモーター、及び負の誘導性プロモーター、すなわち、インデューサーとリプレッサーとの間の相互作用により、誘導性プロモーターへのリプレッサーの結合を遮断または無効化し、それにより、誘導性プロモーターによって制御される下流遺伝子の転写の抑制を取り除くことなどによって、インデューサーの存在下で活性化される誘導性プロモーターの両方が含まれる。抑制性プロモーターの例には、正の抑制性プロモーター、すなわち、リプレッサーと活性化分子との間の相互作用により、抑制性プロモーターへの活性化分子の結合を遮断または無効化し、抑制性プロモーターによって制御される下流遺伝子の転写の活性化を除去することなどによって、リプレッサーの存在下で抑制されるプロモーター、及び負の抑制性プロモーター、すなわち、リプレッサーとコリプレッサー分子との間の相互作用により、組み合わされた実体が抑制性プロモーターへ結合することを可能にし、抑制性プロモーターによって制御される下流の遺伝子の転写に影響を及ぼすことなどによって、リプレッサーの存在下で抑制されるプロモーターの両方が含まれる。この用語にはまた、正の誘導性プロモーターと負の誘導性プロモーターの両方として調節することができるプロモーター、及び環境キュー（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｑｕｅｕｅ）、例えば、光の有無、特定の分子の非存在に応答するプロモーター、及び特定の分子または環境キュー（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｑｕｅｕｅ）を提供または除去することによって特異的に調節することができる任意の他のプロモーターも含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「容器」とは、物質を部分的または完全に含むことができる構造、例えば、１つ以上の組換え酵母細胞を指す。それ自体では、この用語は特定の構造または物理的特性を必要とせず、例えば、開放構造、閉鎖構造、単一成分構造、多成分構造、剛性構造、及び可撓性構造を含む。
本明細書中で使用する場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」とは、ウイルス構造タンパク質からなり、ウイルス核酸を欠く非感染性ナノ構造を指す。ウイルス様粒子は形態学的にウイルスに類似しているが、それ以上のものがなければ、宿主細胞に感染する能力を欠いている。ＶＬＰは通常、粒子シェルを形成するキャプシドやマトリックスタンパク質などの少なくとも１つの構造成分からなる。
本明細書中で使用する場合、用語「エンベロープウイルス様粒子」または「ｅＶＬＰ」とは、宿主細胞由来の膜、一般的には、ウイルスが宿主細胞から出現する際の発芽プロセス中に得られる脂質ベースの膜を含むウイルス様粒子を指す。ｅＶＬＰは、一般的には、少なくとも１つのマトリックスタンパク質を含む。いくつかの場合では、ｅＶＬＰは、２つもしくは３つ、またはそれ以上の異なるマトリックスタンパク質を含み得る。いくつかの場合では、１つ以上のマトリックスタンパク質を、ｅＶＬＰのタンパク質シェルの外表面に抗原ペプチド配列が提示されるように設計する。例えば、組み立てられるｅＶＬＰのタンパク質外表面に抗原ペプチド配列が露出するように、１つ以上のマトリックスタンパク質ループ配列に抗原ペプチド配列を挿入してもよい。いくつかの場合では、ｅＶＬＰを、ｅＶＬＰの表面に１つ以上の免疫原性ペプチドが含まれるように設計する。いくつかの場合では、ｅＶＬＰの成分（複数可）を、ｅＶＬＰの脂質二重層エンベロープに埋め込むことができる１つ以上の抗原（例えば、糖ペプチド）をさらに発現する宿主細胞内で発現させる。
本明細書中で使用する場合、用語「非エンベロープウイルス様粒子」とは、宿主細胞由来の膜を含まないＶＬＰを指す。頭字語ｎｅＶＬＰは、用語「非エンベロープウイルス様粒子」を指す。ｎｅＶＬＰは、少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含み得る。いくつかの場合では、ｎｅＶＬＰは２つもしくは３つ、またはそれ以上の異なるキャプシドタンパク質を含み得る。いくつかの場合では、１つ以上のキャプシドタンパク質を、ｎｅＶＬＰの外表面に抗原ペプチド配列が提示されるように設計する。例えば、組み立てられるｎｅＶＬＰのタンパク質外表面に抗原ペプチド配列が露出するように、１つ以上のキャプシドタンパク質ループ配列に抗原ペプチド配列を挿入することができる。
ＶＬＰ（ｎｅＶＬＰ及び／またはｅＶＬＰを含む）を、核酸結合ペプチドを含むように改変することができ、それは、特定の核酸結合部位の配列に結合することができる。以下でさらに説明するように、１つの例示的な核酸結合ペプチドは、ＭＳ２コートタンパク質に見出され、これは、ヘアピンループ構造に折りたたまれるＭＳ２レプリカーゼｍＲＮＡの例えば１９ヌクレオチドのリボソーム結合部位に結合する。一般的には、核酸に局在化させる同族タンパク質の量を高めるために、１つ以上の核酸結合部位を、核酸結合部位の反復アレイとして含ませる。いくつかの場合では、反復配列が組換えコード配列の遺伝的安定性を損なわせ得る。一実施形態では、反復アレイ内の核酸結合部位は、配列は異なっているが、それでも同族タンパク質結合機能を保持している同義の結合部位である。そのような同義の核酸結合部位のアレイは、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１５ Ａｐｒ １５（２９（８）；８７６－８８６に記載されている。
核酸結合ペプチドを含むように改変されたそのようなＶＬＰを使用して、抗原をコードする核酸を抗原提示細胞に送達して、抗原提示細胞内で抗原を発現させることによってワクチン応答を増加させることができる。一実施形態では、ＶＬＰは、核酸結合エレメントに融合した少なくとも１つのキャプシドまたはマトリックスタンパク質を含む。例示的な実施形態では、ＶＬＰは、配列番号１３に記載するＧＡＧ－ＭＳ２融合体などのＨＩＶ－Ｇａｇ－ＭＳ２融合体を含む。いくつかの場合では、ＧＡＧ－ＭＳ２融合タンパク質は、配列番号１３の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含む。いくつかの場合では、ＧＡＧ－ＭＳ２融合タンパク質は、配列番号１３の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である。いくつかの場合では、ＧＡＧ－ＭＳ２融合タンパク質は、配列番号１３の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含む。いくつかの場合では、ＧＡＧ－ＭＳ２融合タンパク質は、配列番号１３の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含む。
核酸を結合するための代替の融合として、インフルエンザまたはコロナウイルスマトリックスタンパク質Ｍ１またはＭ２と核酸結合ペプチドとの融合、コロナウイルススパイクタンパク質と核酸結合ペプチドとの融合、及びＨＢＶヌクレオキャプシドタンパク質と核酸結合ペプチドとの融合が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、または代わりに、そのようなＶＬＰを使用して、レポーターをコードする核酸を送達して、ＶＬＰを取り込む細胞においてレポーターを発現させることにより、レポーターシグナルを増加させることができる。
代替の核酸結合ペプチド及び対応する核酸結合部位の配列として、Ｕ．Ｓ．２０１７／０２３３７６２（その内容は、ＲＮＡリガンド配列及びＲＮＡ結合ペプチド配列ならびにそれらの使用を含むがこれらに限定されないあらゆる目的のためにその全体が参照として本明細書に援用される）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、複数のＲＮＡ結合ペプチド配列（例えば、ＶＬＰ融合タンパク質内の）及びそれらのリガンド（例えば、パッケージングされる標的核酸内の）を組み込んで、同じ核酸の複数のコピーをパッケージングするか、または複数の異なる核酸をパッケージングすることができることを理解するであろう。
ポリペプチド配列が、例えば、配列表によって本明細書に開示される場合、そのようなポリペプチドは、酵母細胞などの宿主生物からの成熟型（例えば、シグナル配列が切断されている）ポリペプチドの分泌をサポートするのに適したＮ末端分泌シグナルを含み得ることが理解される。開示された配列にシグナルペプチドがすでに存在する場合、そのような配列が、シグナルペプチドの切断後のポリペプチドの成熟形態も開示していることを当業者であれば理解するであろう。さらに、当業者であれば、シグナル配列を、本明細書に記載の宿主生物に対して最適化されたシグナル配列に置き換えることができることを理解するであろう。
本明細書において、前記組換え免疫原を産生する組換え酵母細胞の透過処理を調節することによって、組換え免疫原の放出を向上させる方法及び組成物を記載する。本明細書において様々な実施形態に記載するように、この免疫原放出の向上は、細胞壁分解酵素の発現誘導の調節、細胞壁生合成経路の成分の発現抑制の調節、または細胞壁生合成の阻害剤の発現誘導の調節によって提供され得る。
図１は、例示的な組換え酵母細胞１００の概略図である。組換え酵母細胞１００は、調節されたプロモーター１５０をコードする第１の核酸配列１１０；免疫原１６０、好ましくはＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列１１２；及び細胞壁分解酵素１８０をコードする第３の核酸配列１１４を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列１１０、第２の核酸配列１１２、及び第３の核酸配列１１４のうちの少なくとも１つ、または各々が、野生型酵母細胞では天然に存在せず、組換え酵母細胞１００を産生するために野生型酵母細胞に人工的に導入されている核酸配列を含む。いくつかの場合では、第２の核酸配列１１２及び／または第３の核酸配列１１４の発現は、調節されたプロモーター１５０の共通の遺伝子制御下にある。したがって、組換え酵母細胞１００は、少なくとも１つの免疫原遺伝子１１２、少なくとも１つの細胞壁分解酵素遺伝子１１４、及び少なくとも１つの調節されたプロモーター１１０を含むように遺伝子改変されている。第１、第２、及び／または第３の核酸配列は、１つ以上のプラスミド上に存在させることができる。いくつかの場合では、第１、第２、及び第３の核酸配列の少なくとも１つ、またはすべてを、同じか、または異なる遺伝子座で酵母細胞のゲノムに挿入する。好ましい実施形態では、免疫原は、ｅＶＬＰなどのＶＬＰであるか、またはその成分である。
組換え酵母細胞１００は、任意の好適な野生型酵母細胞から生成することができ、当業者は、特定の実施形態で使用する細胞壁、免疫原、及び細胞壁分解酵素の性質、野生型酵母細胞の利用可能性、野生型酵母細胞を、第１、第２、及び第３の核酸配列を含む１つのベクターまたは複数のベクターで比較的容易に形質転換することができること、野生型酵母細胞を生産レベルの量で比較的容易に増殖させることができること、ならびに野生型酵母細胞を凍結乾燥するか、または増殖及び他の活動の停止を達成するために他の技術を使用して処理した後に安定したままである時間の長さを含む、様々な考慮事項に基づいて、特定の実施形態に従って、組換え酵母細胞を産生するための野生型酵母細胞を選択することができる。好適な野生型酵母細胞の例として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、「パン酵母」としても知られる）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａが挙げられる。
本発明者らは、少なくともその容易な入手可能性、十分に特徴付けられた形質転換効果、及び十分に特徴付けられた取り扱い技術により、本発明の実施形態による組換え酵母細胞の生成において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが野生型酵母細胞として有用であると判断した。本発明者らは、本発明の実施形態による組換え酵母細胞の生成における有用な野生型酵母細胞として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓｃ１６０２ ＭＡＴα，ｕｒａ３－，ｌｅｕ－，ｐｅｐ４－，ｏｃｈ１－を同定した。
第１の核酸配列１１０は、調節されたプロモーター１５０をコードする。調節されたプロモーター１５０は、任意の好適な調節されたプロモーターを含むことができ、当業者は、組換え酵母細胞の生成に使用する野生型酵母細胞の性質、免疫原及び／または細胞壁分解酵素の産生に対する任意の所望のタイプの制御、及び特定の誘導性プロモーターを使用して、ＶＬＰ免疫原及び細胞壁分解酵素の発現を制御するのに必要な任意の機器及び／または消耗品を含む様々な考慮事項に基づいて、特定の実施形態に従って、組換え酵母細胞用の調節されたプロモーターを選択することができるであろう。好適な調節プロモーターの例には、正の誘導性プロモーター、負の誘導性プロモーター、及び正の誘導性プロモーターと負の誘導性プロモーターの両方として調節可能な誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーター、ならびに正の抑制性プロモーター、負の抑制性プロモーター、及び正の抑制性プロモーターと負の抑制性プロモーターの両方として調節可能な抑制性プロモーターなどの抑制性プロモーターが含まれる。好適な調節されたプロモーターの例として、ガラクトースの存在下でプロモーターによって制御される遺伝子の転写を活性化するＧａｌ１誘導性プロモーター、及びグルコースの非存在下で転写を活性化するＡＤＨ２プロモーターが挙げられる。好適と考えられる調節されたプロモーターの他の例として、ＰＴｅｔ、ｐＴＰ１、ｐＴＥＦ１、ｐＰＹＫ１、ｐＡＤＨ１、ＦＭＤ１、ｐＨＸＴ７、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ７、ｐＧＡＬ１０、ｐＰＨＯ５、ｐＣＵＰ１、及びｐＤＡＮ１が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明者らは、本発明による組換え酵母細胞における調節プロモーターとして含めることについて、正の抑制性プロモーターであるＴｅｔ－ｏｆｆ調節プロモーターが特に有効であると判断した。Ｔｅｔ－ｏｆｆ系では、テトラサイクリンまたはその誘導体の１つが存在する場合、調節されたプロモーターによって制御される遺伝子の転写がオフになる。本発明者らは、少なくともそれが可能にする産生方法により、この調節されたプロモーターを含めることが特に有効であると考える。例えば、以下で詳細に説明するように、組換え酵母細胞にこの調節されたプロモーターを含めることにより、実験室環境で、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体の存在下で、組換え酵母細胞の培養物を増殖させる方法が可能になる。方法のこの段階の間、培養物中の組換え酵母細胞内でＴｅｔ－ｏｆｆ系によって制御される遺伝子、例えば、免疫原をコードする核酸配列及び／または細胞壁分解酵素などの細胞壁透過性を誘導する核酸配列は転写されない。テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体は、後で除去することができる。例えば、細胞培養物が、培養物中で十分な密度または増殖期を達成した後、十分な量のリプレッサーを所定の期間除去し、それにより、免疫原をコードする核酸配列及び／または細胞壁分解酵素をコードする核酸配列の転写を所定の期間活性化することができる。これにより、培養物中の組換え酵母細胞を回収する前に、所望の量の免疫原及び／または細胞壁分解酵素を産生させることができる。次いで、これにより、凍結乾燥組換え酵母を患者が摂取する経口ワクチン接種中など、ワクチン接種を受ける患者によって組換え酵母細胞が摂取される際に、ある量の免疫原及び／または細胞壁分解酵素がすぐに利用可能であることが保証され、このことはワクチンの効力にプラスの影響を与え得る。
別の例として、正の抑制性プロモーターを使用して、細胞壁生合成経路の抑制を調節することにより、細胞壁の透過性を調節することができる。例えば、細胞壁生合成経路の成分に作動可能に連結された正の抑制性プロモーターを含み、例えば、調節された様式で免疫原を発現するように、組換え酵母細胞を改変することができる。組換え酵母細胞は、細胞壁生合成を可能にする条件下で培養することができ、その後、リプレッサーを除去することによって細胞壁生合成を抑制することができる。いくつかの実施形態では、細胞壁生合成経路の抑制の調節を、プロモーターを置換するか、または細胞壁生合成経路の内在性成分に作動可能に連結された正の抑制性プロモーターを挿入することによって提供する。あるいは、内在性細胞壁生合成経路の成分をノックアウトし、正の抑制性プロモーターに作動可能に連結させた代替成分、例えば、コピーを、組換え酵母細胞に導入することができる。
本明細書に記載するように、いくつかの実施形態では、免疫原及び細胞壁透過剤（例えば、細胞壁分解酵素、細胞壁生合成毒素など）は、調節性プロモーターの共通の遺伝子制御下にある。あるいは、いくつかの実施形態では、免疫原及び細胞壁透過剤を、示差的に調節する。いくつかの実施形態では、調節されたプロモーターを、細胞壁透過剤をコードする核酸配列に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、異なる、例えば、調節されたプロモーターを、免疫原またはその成分をコードする核酸配列に作動可能に連結する。
いくつかの場合では、細胞壁透過剤に作動可能に連結されたプロモーターを、組換え酵母が十分な密度（例えば、１×１０8細胞／ｍＬ、ＯＤ600≧１０、またはＯＤ600≧２０）または増殖期（例えば、対数期、対数増殖期中期、または対数増殖期後期）まで増殖した後に細胞壁透過剤の発現が誘導または抑制解除されるように選択する。いくつかの場合では、細胞壁透過剤に作動可能に連結されたプロモーターを、組換え酵母を採取した後、または組換え酵母を対象に投与した後に、細胞壁透過剤の発現が誘導または抑制解除されるように選択する。
いくつかの場合では、免疫原またはその成分に作動可能に連結されたプロモーターを、組換え酵母を対象に投与する前に、免疫原の発現が誘導または抑制解除されるように選択する。例えば、免疫原の産生を、組換え酵母細胞の培養中に抑制解除または誘導することができる。本発明のいくつかの方法では、免疫原の発現を誘導または抑制解除し、次いで透過剤の発現を誘導または抑制解除する。いくつかの場合では、発現させる免疫原の収率を、免疫原の発現誘導後に細胞壁透過剤の発現を誘導することによって増強することができる。他の場合では、例えば、免疫原の非効率的な放出が宿主細胞の分泌能力を圧倒する場合、免疫原の発現を誘導する前に、または同時に、細胞壁透過剤の発現を誘導することが好ましい場合がある。本明細書に記載するように、免疫原及び細胞壁透過剤の両方を同時に誘導するための１つの例示的な方法は、免疫原と透過剤の両方をコードする核酸配列を調節可能な共通の遺伝子制御エレメントに作動可能に連結することである。
いくつかの実施形態では、細胞壁透過剤をコードする核酸配列は、調節されたプロモーターの制御下にあり、免疫原をコードする核酸配列は、構成的に発現する。
いくつかの場合では、透過処理した酵母での組換えＶＬＰの産生方法は、誘導期の間に細胞複製を阻害することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複製を阻害することにより、複製の代謝負荷を低減することによってＶＬＰ産生を向上させることができる。細胞複製は、細胞壁の生成を阻害するか（例えば、キラートキシンを使用して）、細胞壁の維持を阻害するか（例えば、細胞壁分解酵素を使用して）、またはゲノム複製を阻害し、ＴＥＬ１もしくはＭｐｓ１などのチェックポイント活性化因子の発現を誘導することによって、本質的に阻害され得る。
いくつかの場合では、ゲノム複製は、内在性ＤＮＡポリメラーゼの発現または活性を阻害することによって阻害される。いくつかの場合では、内在性酵母ＤＮＡポリメラーゼをコードするゲノム領域の全部または一部を除去することにより、ＤＮＡポリメラーゼが阻害される。いくつかの場合では、本明細書に記載のＶＬＰの産生方法は、ＣＲＥリコンビナーゼなどの組換えリコンビナーゼの発現を誘導し、それによって、内在性ＤＮＡポリメラーゼをコードするゲノム領域のゲノムの１つ以上、好ましくは２つのｌｏｘＰ部位で組換えを誘導することを含む。通常、ｌｏｘＰ部位は、内在性ＤＮＡポリメラーゼの必須領域に隣接するように配置する。いくつかの実施形態では、ＣＲＥリコンビナーゼは、細胞壁透過剤をコードする核酸配列及び／または免疫原またはその成分（例えば、インフルエンザヘマグルチニンもしくはノイラミニダーゼ、またはコロナウイルススパイクタンパク質）をコードする核酸配列、及び／またはＧＡＧタンパク質（例えば、ＨＩＶ Ｇａｇ）、マトリックスタンパク質（例えば、インフルエンザＭ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（例えば、コロナウイルスＮまたはインフルエンザＮＰ）、エンベロープタンパク質（例えば、コロナウイルスＥ）などのＶＬＰ形成タンパク質配列をコードする核酸配列、またはそれらの組み合わせに対して共通の調節性プロモーターの遺伝子制御下にある。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の酵母宿主細胞は、ＤＮＡポリメラーゼをコードするゲノム領域に存在するかまたは隣接するｌｏｘＰ部位などの１つ以上の組換え部位、及びＣＲＥリコンビナーゼなどの異種リコンビナーゼをコードする核酸を含む。
細胞複製を阻害するための組換えベースのアプローチは、哺乳類対象への投与に適したワクチンを形成するのに特に有効であり得、その場合、ワクチンは、酵母細胞全体の少なくとも一部を含むか、または含む可能性が高く、なぜならそのような細胞は複製されないからである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＶＬＰを、複製を阻害するための同時または連続組換えで、例えば、同時または連続透過処理で誘導し、ＶＬＰを含有する細胞培養上清を回収し、ワクチンを形成するために使用する。いくつかの場合では、ワクチンを形成するために使用する細胞培養上清は、例えば、アジュバント効果を提供することができる酵母細胞成分をさらに含む。さらに、または代わりに、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＶＬＰは細胞培養上清由来であり、複製不可能な酵母細胞も採取し、製剤と混合してワクチンを生成する。
第２の核酸配列１１２は、免疫原１６０、好ましくはＶＬＰ免疫原をコードする。免疫原は、例えば、任意の好適なＶＬＰ免疫原を含み得、当業者は、ワクチンに含めるために組換え酵母細胞が産生している任意の特定の疾患原因物質の同一性及び抗原を含む、様々な考慮事項、例えば、本明細書に記載の様々なワクチン組成物、ＶＬＰ免疫原の全体的なサイズ、及び他の考慮事項に基づいて、特定の実施形態による組換え酵母細胞のためのＶＬＰ免疫原を選択することができる。また、示す実施形態は、単一の免疫原をコードする単一の核酸配列１１２を示すが、一実施形態によれば、それぞれが免疫原、またはその成分をコードする複数の核酸配列を組換え酵母細胞に含めることができることに留意されたい。それぞれが免疫原をコードする核酸配列の好適な数の例として、１つ、少なくとも１つ、１つより多く、２つ、複数、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、及び１０個超が挙げられるが、これらに限定されない。また、第２の核酸配列１１２は、裸のＶＬＰ免疫原またはエンベロープされたＶＬＰ免疫原をコードし得る。
好適なＶＬＰ免疫原の例として、コレラ、デング熱、ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘモフィルスインフルエンザｂ型（ｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ）（Ｈｉｂ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザ、日本脳炎、マラリア、はしか、髄膜炎菌性髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、肺炎球菌疾患、灰白髄炎、狂犬病、ロタウイルス、風疹、破傷風、ダニ媒介脳炎、結核、腸チフス、水痘、黄熱病、カンピロバクター・ジェジュニ、シャーガス病、チクングニア熱、デング熱、毒素原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＧＢＳ）、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶ－１、ヒト鉤虫症、リーシュマニア症、マラリア、ニパウイルス、非チフス性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病、ノロウイルス、パラチフス熱、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、住血吸虫症、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ、結核、及びユニバーサルインフルエンザワクチン由来の１つ以上の免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。
インフルエンザウイルス由来のｅＶＬＰ免疫原ヒトインフルエンザＭ１マトリックス、ヘマグルチニン、及びノイラミニダーゼタンパク質をコードする核酸配列を含めることは、インフルエンザウイルスに対する経口ワクチンでの使用を目的とする本発明による組換え酵母細胞にとって有効であると考えられる。
第３の核酸配列１１４は、細胞壁分解酵素１８０などの細胞壁透過剤をコードし得る。細胞壁分解酵素は、任意の好適な細胞壁分解酵素を含み得、当業者は、第２の核酸配列１１２によってコードされる免疫原の性質及びサイズ、組換え酵母細胞に含まれる免疫原をコードする異なる核酸の数、組換え酵母細胞の細胞壁の性質、及び他の考慮事項を含む、様々な考慮事項に基づいて、特定の実施形態による組換え酵母細胞のための細胞壁分解酵素を選択することができる。好適な細胞壁分解酵素の例として、β－１，３－グルカナーゼなどのグルカナーゼ酵素、マンナナーゼ酵素、キチナーゼ、及び酵母細胞壁を分解することができる他の酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合では、β－１，３－グルカナーゼは、配列番号１０の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含む。いくつかの場合では、β－１，３－グルカナーゼは、配列番号１によってコードされるタンパク質または配列番号１０に記載するポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、または５個以下の単一アミノ酸の置換、欠失、及び／または付加を含む。いくつかの場合では、β－１－３－グルカナーゼは、配列番号１によってコードされる分泌タンパク質配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの場合では、β－１－３－グルカナーゼは、配列番号１０の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの場合では、グルカナーゼは、配列番号１０の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含む。
いくつかの場合では、マンナナーゼは、配列番号１１の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含む。いくつかの場合では、マンナナーゼは、配列番号１１に記載するポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、または５個以下の単一アミノ酸の置換、欠失、及び／または付加を含む。いくつかの場合では、マンナナーゼは、配列番号１１によってコードされる分泌タンパク質配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの場合では、β－１－３－グルカナーゼは、配列番号１１の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの場合では、マンナナーゼは、配列番号１１の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含む。
いくつかの場合では、キチナーゼは、配列番号１２の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含む。いくつかの場合では、キチナーゼは、配列番号４によってコードされるタンパク質または配列番号１２に記載のポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、または５個以下の単一アミノ酸の置換、欠失、及び／または付加を含む。いくつかの場合では、キチナーゼは、配列番号４によってコードされる分泌タンパク質配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの場合では、キチナーゼは、配列番号１２の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの場合では、キチナーゼは、配列番号１２の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含む。
いくつかの実施形態では、組換え酵母細胞壁の主成分はβ－１，３－グルカンであり、細胞壁分解酵素は、β－１，３－グルカナーゼであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、組換え酵母細胞壁の主成分はマンナンであり、細胞壁分解酵素はマンナナーゼであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、組換え酵母細胞壁の主成分はキチンであり、細胞壁分解酵素はキチナーゼであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、１つもしくは２つ、またはそれ以上のグルカナーゼ細胞壁分解酵素、例えば、β－１－３－グルカナーゼとβ－１－６－グルカナーゼの組み合わせの発現を誘導して、調節された様式で細胞壁を透過処理する。いくつかの実施形態では、１つもしくは２つ、またはそれ以上のキチナーゼ細胞壁分解酵素の組み合わせの発現を誘導して、調節された様式で細胞壁を透過処理する。いくつかの実施形態では、１つもしくは２つ、またはそれ以上のマンナナーゼ細胞壁分解酵素の組み合わせの発現を誘導して、調節された様式で細胞壁を透過処理する。いくつかの実施形態では、グルカナーゼ、キチナーゼ、及びマンナーゼの２つ以上、または各々の組み合わせの発現を誘導して、調節された様式で細胞壁を透過処理する。
いくつかの実施形態では、細胞壁透過剤は、宿主細胞の天然の捕食者である酵母由来の細胞壁分解酵素である。例えば、Ｐｉｃｈｉａ属及びＷｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属の特定の胞子形成子嚢菌酵母は、インタクトなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞壁に対して高いグルコシド活性を示す細胞壁分解酵素を発現する。したがって、特定の実施形態では、細胞壁透過剤は、ＰｉｃｈｉａまたはＷｉｌｌｉｏｐｓｉｓ細胞壁分解酵素であり得る。別の例として、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓなどの特定の細菌は、インタクトなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞壁に対して高いグルコシド活性を示す細胞壁分解酵素を発現する。したがって、いくつかの実施形態では、細胞壁透過剤は、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓ由来の細胞壁分解酵素である。
β－１，３－グルカナーゼなどのβ－グルカナーゼをコードする核酸配列を含めることは、少なくともこの特定の細胞壁分解酵素が、組み立てられたｅＶＬＰが組換え酵母細胞からエスケープできるようにするのに十分な程度まで酵母細胞壁を効果的に分解すると予想されることから、上記のように、インフルエンザウイルス由来のｅＶＬＰ免疫原ヒトインフルエンザＭ１マトリックス、ヘマグルチニン、及びノイラミニダーゼタンパク質などの、インフルエンザ系ＶＬＰ免疫原を含む組換え酵母細胞において特に有効であると考えられる。
細胞壁分解酵素をコードする核酸配列を含むことに加えて、またはその代替として、細胞壁阻害毒素をコードする核酸を含めることができる。これらの実施形態では、コードされた毒素は、新たに形成される組換え酵母細胞における細胞壁の形成を阻害または防止する。その結果、新たに形成される組換え酵母細胞は、細胞壁を完全に欠いているか、または部分的に形成された細胞壁しか有していない。いずれのシナリオでも、組換え酵母細胞に含まれる免疫原（複数可）は、細胞壁分解酵素の助けを借りずに、新たに形成される組換え酵母細胞を離れることができる。
一実施形態による組換え酵母細胞に含まれる場合、毒素を阻害する任意の好適な細胞壁をコードする核酸配列を含めることができる。好適な細胞壁阻害毒素の例として、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ Ｍｒａｋｉｉキラートキシンが挙げられるが、これに限定されない。
したがって、第１の核酸配列１１０は、特定の実施形態に従って組換え酵母細胞のために選択された調節されたプロモーターをコードする任意の核酸配列を含み得る。同様に、第２の核酸配列１１２は、特定の実施形態に従って組換え酵母細胞のために選択された１つの免疫原または複数の免疫原をコードする任意の核酸配列を含み得る。最後に、第３の核酸配列１１４は、特定の実施形態に従って組換え酵母細胞のために選択された、細胞壁分解酵素などの細胞壁透過剤をコードする任意の核酸配列を含み得る。
第２の核酸配列１１２及び第３の核酸配列１１４の発現は、調節されたプロモーター１５０の共通の遺伝子制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列の下流に位置する第２の核酸配列１１２及び第３の核酸配列のそれぞれを含む遺伝子構築物を作製する。他の実施形態では、第２の核酸配列１１２は、第１の核酸配列１１０の第１のコピーの下流に位置し、その遺伝子制御下にあり、第３の核酸配列１１４は、第１の核酸配列１１０の第２のコピーの下流に位置し、その遺伝子制御下にある。後者の実施形態では、第１の核酸配列１１０の第１のコピーと第２の核酸配列１１２は、第１の核酸配列１１０の第２のコピーと第３の核酸配列１１４と同じかまたは異なる核酸分子（例えば、ベクター、プラスミド、または染色体）上に配置することができる。例えば、これらの実施形態の１つに従って組換え酵母細胞を作製するために、野生型酵母細胞を、２つの異なる遺伝子ベクター、すなわち、第１の核酸配列１１０の第１のコピーと第２の核酸配列１１２をコードする第１の遺伝子ベクター、及び第１の核酸配列１１０の第２のコピーと第３の核酸配列１１４をコードする第２の遺伝子ベクターで形質転換することができる。
特定の実施形態では、第２の核酸配列１１２は、ウイルス構造エレメントと核酸結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする。これらの実施形態では、組換え酵母細胞１００は、核酸結合タンパク質の結合標的及び目的の抗原または免疫原をコードする第４の核酸配列１１６を含む。第１（１１０）、第２（１１２）、及び第３（１１４）の核酸配列と同様に、これらの実施形態における第４の核酸配列１１６は、野生型酵母細胞では天然に存在せず、組換え酵母細胞１００を生成するために野生型酵母細胞に人工的に導入される核酸配列を含み得る。
これらの実施形態による特定の一実施例では、第２の核酸配列は、Ｇａｇ－ＭＳ２融合タンパク質をコードする。この融合タンパク質のＧａｇ部分はＨＩＶｇａｇタンパク質であり、集合してウイルス粒子を形成する。一方、この融合タンパク質のＭＳ２部分は、ＲＮＡ内の明確に定義された非翻訳ステムループ構造と天然に相互作用するＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質である。これらの実施形態における第２の核酸配列に適した核酸配列の例は、配列番号６を含む。これらの実施形態における第４の核酸配列に適した核酸配列の前駆体の例は、配列番号７を含み、図４０に示す最後の図に概略的に示されている。配列番号７は、ＭＳ２タンパク質が結合することができる一連のステムループ構造を含むＭＳ２アンカー、及び１つ以上の選択された抗原及び／または免疫原を挿入するために使用することができる一連の十分に特徴付けられた制限酵素部位を含むｙｇｆｐをコードする。したがって、ｙＧＦＰレポーターをコードする配列は、インフルエンザヘマグルチニン及び／またはノイラミニダーゼ、またはコロナウイルススパイクタンパク質などのウイルス免疫原をコードするタンパク質を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の抗原及び／または免疫原のいずれか１つに置換され得る。
いくつかの場合では、ＭＳ２結合配列は、ＭＳ２配列の反復アレイの一部であり得る。いくつかの場合では、反復ＭＳ２配列は、組換えコード配列の遺伝的安定性を損なわせ得る。一実施形態では、反復アレイ内の核酸結合部位は、配列が異なるが、それでも同族のタンパク質結合機能を保持している同義の結合部位である。そのような同義の核酸結合部位のアレイは、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２０１５ Ａｐｒ １５（２９（８）；８７６－８８６）に記載されている。いくつかの実施形態では、ＭＳ２配列は、配列番号８（ＮＲＮＤＳＡＳＡＮＣＡＳＳＳＮＮＹＮ）の以下のヘアピンループ形成配列を含み、配列中、Ｓは、ＣまたはＧを表し；Ｄは、Ａ、Ｇ、またはＵを表し；Ｒは、ＡまたはＧを表し；Ｙは、ＣまたはＵを表す。いくつかの実施形態では、核酸結合部位は、ＭＳ２配列、例えば、配列番号８のＭＳ２配列の８～４８回の反復を含む反復アレイ内にある。いくつかの実施形態では、反復アレイは、ＭＳ２配列、例えば、配列番号８のＭＳ配列の８～２４、好ましくは２４回の反復を含む。いくつかの場合では、核酸結合部位の反復アレイは、配列番号９によってコードされる。
これらの実施形態は、少なくとも（例えば、Ｇａｇ）－ＭＳ２融合タンパク質が、第４の核酸配列によってコードされる抗原または免疫原に対応するＲＮＡに結合してパッケージングするように働くため、特に有効であると考えられる。使用においては、これらの実施形態の１つによる組換え酵母細胞は、目的の抗原及び／または免疫原をコードするＲＮＡを含むＶＬＰを放出するであろう。一実施形態に従ってワクチン組成物または食品組成物に含まれる場合、例えば、組換え酵母細胞は、ワクチン組成物または食品組成物を摂取する動物内の樹状細胞または他の抗原提示細胞によって摂取されるＶＬＰを放出するであろう。次いで、これらの細胞はＲＮＡを翻訳し、動物の免疫系の正常な機能において、抗原（複数可）及び／または免疫原（複数可）を提示することができ、これにより、選択した抗原（複数可）及び／または免疫原（複数可）に対する所望の免疫応答が引き起こされ得る。
ＧＡＧタンパク質をコードする配列は、インフルエンザマトリックスタンパク質またはコロナウイルスキャプシドタンパク質などをコードする配列を含むがこれらに限定されない、様々なＶＬＰ形成タンパク質配列で置換され得ることが理解されるであろう。
これらの実施形態では、第４の核酸配列は、第１（１１０）、第２（１１２）、及び／または第３（１１４）の核酸配列とともに、調節されたプロモーター１５０の共通の遺伝子制御下とすることができるが、必ずしも必要ではない。また、これらの実施形態のいくつかでは、第４の核酸配列１１４は、目的の好適な抗原（複数可）または免疫原（複数可）をコードし得る。好適な例として、１つ以上のウイルス抗原及び／または免疫原、１つ以上の細菌抗原及び／または免疫原、ならびに免疫応答を誘発するのに適していると考えられる任意の他の抗原または免疫原が挙げられる。インフルエンザウイルス、ＲＳＶ、ＨＩＶ、及び他のウイルスに由来する抗原は、これらの実施形態に含めるのに特に適していると考えられる。
いくつかの実施形態では、第２の核酸配列１１２は、ウイルス子孫を産生するために必要な１つ以上のウイルス遺伝子を欠損している一方で、ＶＬＰを形成するのに十分な１つ以上のウイルス遺伝子をコードする。これらの実施形態のいくつかでは、組換え酵母細胞１００は、目的の抗原または免疫原をコードする第４の核酸配列１１６を含む。第１（１１０）、第２（１１２）、及び第３（１１４）の核酸配列と同様に、これらの実施形態における第４の核酸配列１１６は、野生型酵母細胞では天然に存在せず、組換え酵母細胞１００を生成するために野生型酵母細胞に人工的に導入される核酸配列を含み得る。
ＶＬＰ（ｎｅＶＬＰ及び／またはｅＶＬＰを含む）は、増幅可能なレプリコン、またはそのようなＶＬＰをコードする構築物を含むように改変することができる。本明細書中で使用する場合、「増幅可能なレプリコン」は、宿主細胞における自己複製をサポートすることができる最小の核酸配列（複数可）を含む。例えば、ＶＬＰは、パッケージされたＲＮＡ核酸またはその一部を少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回複製することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードするＲＮＡ核酸をパッケージングすることができる。いくつかの場合では、パッケージされた核酸は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、好ましくは、パッケージされた核酸は、５’及び３’ＵＴＲを含む。通常、増幅可能なレプリコンは、免疫原をコードする核酸配列などの目的の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、そのような増幅可能なレプリコンは、ＰＩＶ５型（例えば、ＰＩＶ５）ゲノムなどのパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）ゲノムの一部から構築され得る。いくつかの実施形態では、増幅可能なレプリコンは、パラインフルエンザウイルス（例えば、ＰＩＶ５）ＮＰ、Ｖ／Ｐ、及びＬ遺伝子のすべて、その機能的部分、または少なくともその一部、ならびに任意選択で目的の遺伝子、例えば、免疫原、ＭＳ２タンパク質、ＭＳ２結合部位、及び／またはレポーターをコードする核酸配列などを含む核酸である。いくつかの実施形態では、増幅可能なレプリコンは、Ｍ、Ｆ、ＳＨ及びＨＮからなる群から選択される１つ以上のＰＩＶ遺伝子（例えば、ＰＩＶ５遺伝子）を欠損しているか、またはＭ、Ｆ、ＳＨ及びＨＮからなる群から選択される１つ以上のＰＩＶ５タンパク質を発現することができない。いくつかの場合では、増幅可能なレプリコンは、ＰＩＶ５ ＮＰ、Ｖ／Ｐ及びＬ遺伝子を含む。いくつかの場合では、増幅可能なレプリコンは、ＰＩＶ（例えば、ＰＩＶ５）Ｖ／Ｐ及びＬ遺伝子の間に挿入された目的の遺伝子を含む。
好適なＰＩＶベースのレプリコンとして、限定されないが、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，ｎｐｊ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２，３２（２０１７）に記載されているレプリコンが挙げられ、好ましくは、前記レプリコンは、免疫原（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、またはスパイクタンパク質または、レポーター、及び／または本明細書に記載の他の目的の遺伝子、本明細書に記載のＭＳ２または他のアンカー配列、本明細書に記載のＭＳ２タンパク質、または本明細書に記載のＶＬＰ形成ポリペプチド（例えば、マトリックス、ＧＡＧ、もしくはキャプシドタンパク質、またはその機能的断片）を、５’及び３’ＵＴＲの間にコードする核酸を含む。そのようなレプリコンは、プロモーターまたはシスもしくはトランス作用ヘルパーポリペプチドなどの他の遺伝子エレメント、またはＷｅｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第９，０３４，３４３号、及び／またはＷＯ２００２／０７７２１１に記載されているように自己複製をサポートするために不可欠な遺伝子、またはそのオルソログ、例えば、ＷＯ２００２／０７７２１１に開示されているＵＳ９，０３４，３４３のエレメントまたはポリペプチドのオルソログを含むか、またはそれらと組み合わせて使用することができる。
例示的な実施形態では、レプリコンを、ＰＩＶ５融合糖タンパク質（例えば、配列番号１８）、Ｍ、ＳＨ、及び／またはＨＮを目的の遺伝子で置き換えることによって生成し、任意選択で、レプリコンは、選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性マーカー）をさらに含み、好ましくは、選択可能なマーカーをＶ／ＰとＬとの間に挿入する。
例示的な実施形態では、ＰＩＶ５ Ｌ遺伝子は、配列番号１９を有するタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ Ｌ遺伝子は、配列番号１９の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ Ｌ遺伝子は、配列番号１９の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ Ｌ遺伝子は、配列番号１９の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ Ｌ遺伝子は、配列番号１９の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。
例示的な実施形態では、ＰＩＶ５ ＮＰ遺伝子は、配列番号２０を含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ ＮＰ遺伝子は、配列番号２０の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ ＮＰ遺伝子は、配列番号２０の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ ＮＰ遺伝子は、配列番号２０の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ ＮＰ遺伝子は、配列番号２０の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。
例示的な実施形態では、ＰＩＶ５ Ｖ／Ｐ遺伝子は、配列番号２１を含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ Ｖ／Ｐ遺伝子は、配列番号２１の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてを含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ Ｖ／Ｐ遺伝子は、配列番号２１の少なくとも２５、５０、１００、１２５、もしくは１５０連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ Ｖ／Ｐ遺伝子は、配列番号２１の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。いくつかの場合では、ＰＩＶ５ Ｖ／Ｐ遺伝子は、配列番号２１の少なくとも２５、５０、１００、１２５、または１５０アミノ酸長の連続アミノ酸領域の１、２、４、または５個以下の単一アミノ酸の挿入、置換、及び／または欠失を含むタンパク質をコードする。
いくつかの場合では、Ｍ、Ｆ、ＳＨ及びＨＮ ＰＩＶ（例えば、ＰＩＶ５）遺伝子の１つまたはすべてを、目的の遺伝子に置き換える。いくつかの場合では、１つ以上のＮＰ、またはＶ／Ｐを、インフルエンザまたはコロナウイルスマトリックスまたはキャプシドタンパク質遺伝子またはその機能的断片及び／または免疫原性断片に置き換える。いくつかの場合では、増幅可能なレプリコンは、インフルエンザまたはコロナウイルスマトリックスまたはキャプシドタンパク質の免疫原性断片及び／または機能的断片をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、増幅可能なレプリコンは、ＰＩＶ（例えば、ＰＩＶ５）５’及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子及びＲｄＲｐ遺伝子は、５’及び３’ＵＴＲの間にある。いくつかの実施形態では、ＲｄＲｐ遺伝子及び目的の遺伝子は、ＲｄＲｐタンパク質と、目的の遺伝子によってコードされるタンパク質との間の自己切断ペプチド配列を含む単一のポリペプチドとしてコードされる。いくつかの場合では、自己切断ペプチドは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスのＴ２Ａペプチドなどの２Ａ自己切断ペプチドである。増幅可能なＰＩＶ５レプリコンのさらなる実施形態は、例えば、ＷＯ２０１６／１７６５１０に記載されている。
いくつかの実施形態では、増幅可能なレプリコンは、Ｎｏｄａｍｕｒａウイルス（ＮｏＶ）由来のＲｄＲｐ遺伝子の機能的断片、またはそのすべてを含む。例えば、Ｂｉｄｄｌｅｃｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１９；１４（６）：ｅ０２１５０３１を参照されたい。いくつかの場合では、増幅可能なレプリコンは、ＮｏＶ ＲｄＲｐ遺伝子またはその機能的断片と、ＮｏＶ ＲＮＡ１の５’及び３’ＵＴＲ間の目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＲｄＲｐ遺伝子及び目的の遺伝子は、ＲｄＲｐタンパク質と目的の遺伝子によってコードされるタンパク質との間の自己切断ペプチド配列を含む単一のポリペプチドとしてコードされる。いくつかの場合では、自己切断ペプチドは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスのＴ２Ａペプチドなどの２Ａ自己切断ペプチドである。
いくつかの実施形態では、増幅可能なレプリコンは、目的の遺伝子及びアルファウイルスレプリカーゼの機能的断片、またはすべてを含む。アルファウイルスは、初期にポリタンパク質Ｐ１２３４として生成される４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～４）をコードする。ｎｓＰ４はコアＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるが、４つのｎｓＰのすべて、または少なくともその機能的断片がＲＮＡ合成に必要である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼの機能的断片またはそのすべてを含む増幅可能なレプリコンは、アルファウイルス５’シス作用エレメント及び／または３’ＵＴＲ、好ましくは５’シス作用エレメント及び３’ＵＴＲをさらに含む。好適なアルファウイルスレプリコンの実施形態として、限定されないが、ＰｕｓｈｋｏによるＵ．Ｓ．２００６／０１９８８５４に記載されているものが挙げられるが、好ましくは、前記レプリコンは、免疫原（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、またはスパイクタンパク質またはレポーター、及び／または本明細書に記載の他の目的の遺伝子、本明細書に記載のＭＳ２または他のアンカー配列、本明細書に記載のＭＳ２タンパク質、または本明細書に記載のＶＬＰ形成ポリペプチド（例えば、マトリックス、ＧＡＧ、もしくはキャプシドタンパク質、またはそれらの機能的断片）を、５’シス作用エレメント（例えば、５’ＵＴＲ）とレプリコンの３’末端（例えば、３’ＵＴＲ）の間にコードする核酸を含む。そのようなレプリコンは、プロモーターなどの他の遺伝子エレメント、または、Ｕ．Ｓ．２００６／０１９８８５４に記載されているように自己複製をサポートするために不可欠なシスもしくはトランス作用性ヘルパーポリペプチドもしくは遺伝子エレメントを含むか、またはそれらと組み合わせて使用することができる。
１つ以上のＰＩＶ遺伝子及び／または１つ以上のレプリカーゼまたはＲｄＲｐ遺伝子（例えば、ＰＩＶ５またはＮｏＶ ＲｄＲｐまたはアルファウイルスレプリカーゼ）を含むものを含む、本明細書に記載の増幅可能なレプリコンの実施形態は、本明細書に記載のＶＬＰのいずれか１つにパッケージングすることができる。同様に、増幅可能なレプリコンを、本明細書に記載の酵母宿主細胞系のいずれか１つで産生し、パッケージングし、透過処理した酵母宿主細胞からＶＬＰとして放出させることができる。
これらの実施形態による特定の一実施例では、第２の核酸配列１１２は、パラインフルエンザ５（ＰＩＶ５）ＮＰ、Ｖ／Ｐ、及びＬ遺伝子のそれぞれの少なくとも一部を含む。この実施例では、第２の核酸配列１１２は、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、及びＨＮからなる群から選択される１つ以上のＰＩＶ５遺伝子を欠損している。
これらの実施形態では、第４の核酸配列は、第１（１１０）、第２（１１２）、及び第３（１１４）の核酸配列とともに、調節されたプロモーター１５０の共通の遺伝子制御下とすることができるが、必ずしも必要ではない。また、これらの実施形態では、第４の核酸配列１１４は、目的の好適な抗原（複数可）または免疫原（複数可）をコードし得る。好適な例として、１つ以上のウイルス抗原及び／または免疫原、１つ以上の細菌抗原及び／または免疫原、ならびに免疫応答を誘発するのに適していると考えられる任意の他の抗原または免疫原が挙げられる。インフルエンザウイルス、ＲＳＶ、ＨＩＶ、及び他のウイルスに由来する抗原は、これらの実施形態に含めるのに特に適していると考えられる。
形質転換後、一実施形態による組換え酵母細胞を、所望の結果、特徴、または特性に基づく任意の所望の及び／または好適な技術、プロセス、及び／または方法を使用して、さらに処理することができる。例えば、以下で詳細に説明するように、組換え酵母細胞を、ワクチン組成物に使用することができる。これらの実施形態に関して、本発明者らは、脱水された組換え酵母細胞が特に有効であると判断している。したがって、特定の実施形態による組換え酵母細胞は、凍結乾燥などの酵母を脱水するための従来の方法を使用して処理され得る。得られる凍結乾燥された組換え酵母細胞は、望ましい残留水分レベル及び長期安定性を有するため、組換え酵母細胞を凍結乾燥することは、特に有効であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、組換え酵母細胞には、凍結乾燥された組換え酵母細胞が含まれる。さらに、いくつかの実施形態では、組換え酵母細胞を、マイクロカプセル化し、食品中に焼き付けるか、または液体中に入れる。
図２は、例示的なワクチン組成物２００の概略図である。ワクチン組成物２００は、空洞２１２を画定する摂取可能な容器２１０と、空洞２１２内に配置された本発明の実施形態による少なくとも１つの組換え酵母細胞２１４とを含む。例えば、一実施形態では、ワクチン組成物２００は、例えば、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下で免疫原及び細胞壁透過剤を産生するように遺伝子改変された少なくとも１つの組換え酵母細胞を含む。いくつかの場合では、細胞透過剤は細胞壁分解酵素である。別の例として、一実施形態では、ワクチン組成物２００は、例えば、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下で免疫原及び細胞壁阻害毒素を産生するように遺伝子改変された少なくとも１つの組換え酵母細胞を含む。図２中では、免疫原、細胞壁透過剤、調節されたプロモーター、またはこれらのエレメントをコードする核酸配列のいずれも示されていないことに留意されたい。
摂取可能な容器２１０には、任意の好適な摂取可能な容器が含まれ得、当業者であれば、ワクチン組成物に含まれる組換え酵母細胞の性質及び量、任意の保管及び取り扱いの要件、及び他の考慮事項を含む、様々な考慮事項に基づいて、特定の実施形態によるワクチン組成物に含めるための好適な摂取可能な容器を選択することができる。好適な摂取可能な容器の例として、カプセル、耐酸性カプセル、及び細孔を画定するカプセルが挙げられるが、これらに限定されない。
少なくとも１つの組換え酵母細胞２１４には、本明細書に記載の例示的な組換え酵母細胞を含む、本発明の実施形態による任意の組換え酵母細胞が含まれ得る。さらに、少なくとも１つの組換え酵母細胞２１４は、任意の好適な数の組換え酵母細胞を含み得、当業者であれば、組換え酵母細胞に含まれる免疫原の性質、組換え酵母細胞に含まれる免疫原のコピー数、及び他の考慮事項を含む、様々な考慮事項に基づいて、特定の実施形態によるワクチン組成物に含めるための好適な数の組換え酵母細胞を選択することができるであろう。本発明の実施形態によるワクチン組成物に含めるための組換え酵母細胞の好適な数の例として、１つ、少なくとも１つ、１つより多く、２つ、複数、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１０個超、１００個、少なくとも１００個、１００個超、１０００個、少なくとも１０００個、１０００個超、１００万個、少なくとも１００万個、及び１００万個超が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態によるワクチン組成物に含めるための組換え酵母細胞の好適な範囲の数の例として、約１～約１０7、約１～約１０6、約１～約１０5、約１～約１０4、約１～約１０3、約１～約１０2、及び約１～約１０が挙げられるが、これらに限定されない。
図３は、本発明の実施形態によるワクチン組成物３０２及び少なくとも１つの食品３０４を含む食品組成物３００を示す。ワクチン組成物３０２は、実施形態による任意のワクチン組成物を含み得る。したがって、ワクチン組成物は、空洞３１２を画定する摂取可能な容器３１０と、空洞３１２内に配置された、実施形態による少なくとも１つの組換え酵母細胞３１４とを含む。図３に示す食品組成物３００では、摂取可能な容器３１０は、複数の組換え酵母細胞３１４に噴霧されたポリマーシェルを含み、ポリマーシェルによって形成される摂取可能な容器３１０によって画定される空洞３１２内に組換え酵母細胞３１４をマイクロカプセル化する。
食品組成物３００は、少なくとも１つのワクチン組成物３０２を含み、図３に示すように、複数のワクチン組成物を含めることができる。実際、任意の好適な数のワクチン組成物を特定の実施形態による食品組成物に含めることができ、当業者は、食品組成物のサイズ、形状、及び構成、食品組成物に含まれる各ワクチン組成物に含まれる組換え酵母細胞の数を含むワクチン組成物の性質、ならびに他の考慮事項を含む、様々な考慮事項に基づいて、特定の実施形態による食品組成物に含めるための好適な数のワクチン組成物を選択することができる。本発明の実施形態による食品組成物に含めることができるワクチン組成物の好適な数の例として、１つ、少なくとも１つ、１つより多く、２つ、複数、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１０個超、約１～約１０7、約１～約１０6、約１～約１０5、約１～約１０4、約１～約１０3、約１～約１０2、及び約１～約１０が挙げられるが、これらに限定されない。
少なくとも１つの食品３０４には、動物によって食品として消費されることに適していると考えられる任意の物質を含めることができる。例として、小麦粉、小麦、砂糖、バター、パン、パン生地、肉、ヨーグルト、果物またはその一部、野菜またはその一部、水または別の液体、及びこれらの例の組み合わせが挙げられる。
食品組成物は、クッキー、キャンディー、バー、クラッカー、ウエハース、パン、飲料、ヨーグルト、及び望ましいと考えられる他の任意の形態を含むがこれらに限定されない、任意の好適な形態をとることができる。
図４は、ワクチン４００を製造する例示的な方法の概略図である。初期ステップ４１０は、野生型酵母細胞に、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁透過剤（例えば、細胞壁分解酵素）をコードする第３の核酸配列を導入することによって組換え酵母細胞を作成することを含む。組換え酵母細胞は、一実施形態による任意の組換え酵母細胞を含み得る。したがって、第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つまたは各々が、組換え酵母細胞が由来する野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある。導入ステップ４１０は、従来の形質変換技術及び形質転換方法を含む、任意の好適な技術または方法に従って実行することができる。
別のステップ４１２は、摂取可能な容器によって画定される空洞内に組換え酵母細胞を配置して、実施形態によるワクチン組成物を生成することを含む。
図５は、ワクチン５００を製造する別の例示的な方法の概略図である。初期ステップ５１０は、リプレッサーの存在下で抑制される正の抑制性プロモーターをコードする第１の核酸配列、免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁透過剤（例えば、細胞壁分解酵素）をコードする第３の核酸配列を野生型酵母細胞に導入することによって組換え酵母細胞を作成することを含む。組換え酵母細胞は、実施形態による任意の組換え酵母細胞を含み得る。したがって、第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の少なくとも１つまたは各々が、組換え酵母細胞が由来する野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み得る。また、いくつかの場合では、第２及び第３の核酸配列の発現は、調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある。導入ステップ５１０は、従来の形質変換技術及び形質転換方法を含む、任意の好適な技術または方法に従って実行することができる。
正の抑制性プロモーターには、任意の好適な正の抑制性プロモーターが含まれ得る。上記のように、本発明者らは、Ｔｅｔ－ｏｆｆプロモーターが有効であると考えられると判断している。これらの実施形態では、リプレッサーには、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体が含まれる。
別のステップ５１２は、リプレッサーを含む培養物中で、組換え酵母細胞に由来する複数の組換え酵母細胞を増殖させることを含む。
別のステップ５１４は、培養物からリプレッサーを除去することを含む。
別のステップ５１６は、摂取可能な容器によって画定される空洞内に複数の組換え酵母細胞を配置することを含む。
任意選択のステップ５１８は、培養物からリプレッサーを除去するステップ５１４と、摂取可能な容器によって画定される空洞内に複数の組換え酵母細胞を配置するステップ５１６との間に、所定の期間を経過させることを含む。この任意選択のステップ５１８を含めることは、少なくともそれによってプロモーターの活性化が可能となり、その結果、摂取可能な容器によって画定される空洞内に複数の組換え酵母細胞を配置する前に、第２及び第３の核酸配列をある期間にわたって発現させることができることから、有効であると考えられる。
別の任意選択のステップ５２０は、複数の組換え酵母細胞を凍結乾燥することを含む。このステップ５２０を含める場合、摂取可能な容器によって画定される空洞内に複数の組換え酵母細胞を配置するステップ５１６の前、同時、または後に実行することができる。
図６は、動物６００にワクチン接種する例示的な方法の概略図である。ステップ６１０は、ワクチン接種を受ける動物に、実施形態によるワクチン組成物を経口送達することを含む。
図７は、動物７００にワクチン接種する別の例示的な方法の概略図である。ステップ７１０は、ワクチン接種を受ける動物に、実施形態による食品組成物を経口送達することを含む。
図８は、動物８００にワクチン接種する別の例示的な方法の概略図である。ステップ８１０は、ワクチン接種を受ける動物に、実施形態によるワクチン組成物を経口摂取するように指示することを含む。
図９は、動物９００にワクチン接種する別の例示的な方法の概略図である。ステップ９１０は、ワクチン接種を受ける動物に、実施形態による食品組成物を経口摂取するように指示することを含む。
図１０は、ワクチン１０００を供給する例示的な方法の概略図である。初期ステップ１０１０は、複数のワクチン組成物を製造することを含み、複数のワクチン組成物の各ワクチン組成物は、実施形態によるワクチン組成物を含む。後期ステップ１０１２は、前記複数の動物の個々の動物にワクチン接種する目的で、複数のワクチン組成物の個々のワクチン組成物を前記複数の動物の個々の動物に送達するように指定された個体に複数のワクチン組成物を送達することを含む。
図１１は、ワクチン１１００を供給する例示的な方法の概略図である。初期ステップ１１１０は、複数の食品組成物を製造することを含み、複数の食品組成物の各食品組成物は、実施形態による食品組成物を含む。後期ステップ１１１２は、前記複数の動物の個々の動物にワクチン接種する目的で、複数の食品組成物の個々の食品組成物を前記複数の動物の個々の動物に送達するように指定された個体に複数の食品組成物を送達することを含む。
図１２は、例示的なキット１２００の概略図である。キット１２００は、容器または物質のシートなどの包装基材１２１０、必要に応じて包装基材１２１０上または中に配置された、実施形態によるワクチン組成物１２１２、及び指示書１２１４を含む。指示書１３１４は、ワクチン組成物を動物に経口送達するための指示、ワクチン組成物を経口摂取するための指示、またはその両方を含み得る。
図１３は、例示的なキット１３００の概略図である。キット１３００は、容器または物質のシートなどの包装基材１３１０、必要に応じて包装基材１３１０上または中に配置された、実施形態による食品組成物１３１２、及び指示書１３１４を含む。指示書１３１４は、食品組成物を動物に経口送達するための指示、食品組成物を経口摂取するための指示、またはその両方を含み得る。
様々な実施例を図２７～４０に示す。
実施例１：Ｈ１／Ｎ１ ｅＶＬＰの産生
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞を、各々が誘導性プロモーターの制御下にあるヒトインフルエンザＨ１、Ｎ１、及びＭ１タンパク質、組換えβグルカナーゼをコードする核酸で形質転換した。組換え細胞を振盪フラスコ中でおよそＯＤ600＝１０まで培養し、誘導した。組換え細胞を誘導条件下で培養し、十分な時間の後、培養培地と細胞を遠心分離によって分離した。細胞を枯渇させた培地試料を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー中で加熱してタンパク質を変性させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画した。分画されたタンパク質をブロッティングメンブレンに転写し、Ｈ１、Ｎ１、及びＭ１タンパク質の存在について調べた。結果は、培地中の高レベルのＨ１、Ｎ１、及びＭ１タンパク質を示し、培地中のｅＶＬＰの強い分泌が示された。図１４。
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ細胞を、各々が誘導性プロモーターの制御下にあるヒトインフルエンザＨ１、Ｎ１、及びＭ１タンパク質、組換えβグルカナーゼをコードする核酸で形質転換した。組換え細胞を振盪フラスコ中でおよそＯＤ600＝１０まで培養し、誘導した。組換え細胞を誘導条件下で培養し、十分な時間の後、培養培地と細胞を遠心分離によって分離した。細胞を枯渇させた培地試料を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー中で加熱してタンパク質を変性させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画した。分画されたタンパク質をブロッティングメンブレンに転写し、Ｈ１、Ｎ１、及びＭ１タンパク質の存在について調べた。結果は、培地中の高レベルのＨ１、Ｎ１、及びＭ１タンパク質を示し、培地中のｅＶＬＰの強い分泌が示された。図１４。
実施例２：ＨＩＶ ＧＡＧ－ＭＳ２ ｅＶＬＰの産生
図１５は、本実施例で産生された構築物によってコード化されたｅＶＬＰの概略図を示す。酵母細胞を、ＨＩＶ－ＧＡＧ融合タンパク質及びＥＧＦＰ－ＭＳ２ ｍＲＮＡをコードする核酸で形質転換し、振盪フラスコ中でおよそＯＤ600＝１０まで培養し、誘導した。組換え細胞を誘導条件下で培養し、誘導後に培養培地から酵母細胞を回収した。培地も回収してｅＶＬＰを取得した。ＲＴ－ＰＣＲ分析により、ｅＶＬＰ中にＥＧＦＰ ｍＲＮＡが存在することが確認された（図１６）。回収された酵母細胞の顕微鏡検査は、ｅＶＬＰの分泌を示している（図１７）。ｅＶＬＰを精製し、樹状細胞（ＤＣ）とともにインキュベートした。ＤＣとの２４時間のインキュベーション後、蛍光顕微鏡によりＤＣでのＥＧＦＰ産生が確認された（図１８）。これらの結果は、ＤＣがｅＶＬＰを貪食し、機能的なＥＧＦＰの発現のためにＥＧＦＰ ｍＲＮＡを翻訳したことを示している。
図１５は、本実施例で産生された構築物によってコード化されたｅＶＬＰの概略図を示す。酵母細胞を、ＨＩＶ－ＧＡＧ融合タンパク質及びＥＧＦＰ－ＭＳ２ ｍＲＮＡをコードする核酸で形質転換し、振盪フラスコ中でおよそＯＤ600＝１０まで培養し、誘導した。組換え細胞を誘導条件下で培養し、誘導後に培養培地から酵母細胞を回収した。培地も回収してｅＶＬＰを取得した。ＲＴ－ＰＣＲ分析により、ｅＶＬＰ中にＥＧＦＰ ｍＲＮＡが存在することが確認された（図１６）。回収された酵母細胞の顕微鏡検査は、ｅＶＬＰの分泌を示している（図１７）。ｅＶＬＰを精製し、樹状細胞（ＤＣ）とともにインキュベートした。ＤＣとの２４時間のインキュベーション後、蛍光顕微鏡によりＤＣでのＥＧＦＰ産生が確認された（図１８）。これらの結果は、ＤＣがｅＶＬＰを貪食し、機能的なＥＧＦＰの発現のためにＥＧＦＰ ｍＲＮＡを翻訳したことを示している。
また、ｅＶＬＰを、透過型電子顕微鏡法によって、粗培養上清として（図１９、左）、及び超遠心分離後に分析し、精製されたｅＶＬＰを得た（図１９、右）。精製されたｅＶＬＰは、直径がおよそ８０～１２０ｎｍ、エンベロープの厚さが約４．２ｎｍであった。
実施例３：ＨＩＶ ＧＡＧ－ＧＦＰ ｅＶＬＰの製剤化及び経口投与
組換え酵母細胞を、図２３に示すように構築物で形質転換した。組換え細胞を振盪フラスコ中でおよそＯＤ600＝１０まで培養し、誘導し、誘導条件下で培養した。次いで、製剤化するために培地を採取した。
組換え酵母細胞を、図２３に示すように構築物で形質転換した。組換え細胞を振盪フラスコ中でおよそＯＤ600＝１０まで培養し、誘導し、誘導条件下で培養した。次いで、製剤化するために培地を採取した。
図２０は、製剤化戦略の概略図を示す。簡潔に述べると、採取した細胞を１．６％アルギン酸塩溶液に懸濁し、ＣａＣｌ2溶液と混合して、マイクロカプセル化されたｅＶＬＰ産生酵母細胞を形成した。次いで、マイクロカプセル化された物質を、ケイ酸ナトリウム溶液、次いで１．５％アルギン酸塩溶液、最後にＣａＣｌ2溶液に移した。得られた物質は、直径およそ１００μｍの腸溶コーティングされたミクロスフェアを生成した（図２１）。
ミクロスフェアに封入された酵母細胞を、４つのコホート（高用量、中等用量、低用量、及び生理食塩水対照）でＢＡＢＬ／ｃマウスに経口投与した。結果からは、高用量、中等用量、及び低用量を投与したマウスにおいて検出可能なＧＦＰ発現が示されたが、生理食塩水を投与したマウスでは示されなかった。抗ＧＦＰ血清抗体が検出された。誘導された抗ＧＦＰ抗体濃度は、標準的なＨ１注射用ワクチンの投与から２０日後に得られた抗Ｈ１血清レベルと同様であった（図２２）。
前述の詳細な説明は、経口ワクチン接種での使用に適した様々な例示的な組換え酵母、ワクチン組成物、動物へのワクチン接種方法、ならびに関連する方法、キット、及び核酸分子に言及している。これらの様々な実施例を説明する説明及び添付の図面は、発明者が本発明の範囲内にあると考える主題の実施例を提供することのみを意図しており、いかなる意味においても特許請求の範囲を制限することを意図していない。本明細書に開示するすべての刊行物、特許、特許出願、及び特許公報は、その全体が参照により、及びあらゆる目的のために、そして開示された各刊行物、特許、特許出願、または特許公報が、あたかも参照により具体的に援用される場合と同程度に、本明細書に援用される。
本明細書に記載の実施形態には、以下が含まれる：
１．野生型酵母細胞に由来する組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列；及び
細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み、
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
１．野生型酵母細胞に由来する組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列；及び
細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み、
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
３．前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列の第１のコピーの下流に位置し、その遺伝子制御下にあり、前記第３の核酸配列が、前記第１の核酸配列の第２のコピーの下流に位置し、その遺伝子制御下にある、実施形態１に記載の組換え酵母細胞。
４．前記第１の核酸配列の前記第１のコピーと前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列の前記第２のコピーと前記第３の核酸配列と同じ核酸分子上に位置する、実施形態３に記載の組換え酵母細胞。
５．前記第１の核酸配列の前記第１のコピーと前記第２の核酸配列が、第１の核酸分子上に位置し、前記第１の核酸配列の前記第２のコピーと前記第３の核酸配列が、第２の核酸分子上に位置する実施形態３に記載の組換え酵母細胞；または、
前記酵母細胞が、前記細胞壁分解酵素（例えば、グルカナーゼ）、ＶＬＰマトリックスタンパク質、及び免疫原を含み、任意選択で、細胞壁分解酵素、及び／またはＶＬＰマトリックスタンパク質、及び／または細胞壁分解酵素、ＶＬＰマトリックスタンパク質、及び免疫原の各々が、調節可能なプロモーターの制御下にあり、任意選択で、前記調節可能なプロモーター（複数可）の１つ以上、または各々が、同じプロモーター、同じプロモーターの異なるコピー、または異なるプロモーターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の組換え酵母細胞。
前記酵母細胞が、前記細胞壁分解酵素（例えば、グルカナーゼ）、ＶＬＰマトリックスタンパク質、及び免疫原を含み、任意選択で、細胞壁分解酵素、及び／またはＶＬＰマトリックスタンパク質、及び／または細胞壁分解酵素、ＶＬＰマトリックスタンパク質、及び免疫原の各々が、調節可能なプロモーターの制御下にあり、任意選択で、前記調節可能なプロモーター（複数可）の１つ以上、または各々が、同じプロモーター、同じプロモーターの異なるコピー、または異なるプロモーターである、先行実施形態のいずれか１つに記載の組換え酵母細胞。
６．前記調節されたプロモーターが、誘導性プロモーターを含み、好ましくは、前記調節されたプロモーターが抑制性プロモーターを含み、より好ましくは、前記調節されたプロモーターが正の抑制性プロモーターを含む、実施形態１に記載の組換え酵母細胞。
７．前記調節されたプロモーターが、Ｔｅｔ－ｏｆｆで調節されたプロモーターを含む、実施形態２に記載の組換え酵母細胞。
８．前記ＶＬＰ免疫原が、インフルエンザウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含み、好ましくは前記ＶＬＰ免疫原が、インフルエンザウイルス由来のＭ１マトリックスタンパク質、ヘマグルチニンタンパク質、及びノイラミニダーゼタンパク質を含む、実施形態１に記載の組換え酵母細胞。
９．前記ＶＬＰ免疫原が、インフルエンザウイルス由来のヒトインフルエンザＭ１マトリックス、ヘマグルチニン、及びノイラミニダーゼタンパク質を含む、実施形態８に記載の組換え酵母細胞。
１０．前記細胞壁分解酵素が、グルカナーゼを含み、好ましくは、前記細胞壁分解酵素が、β－グルカナーゼを含む、実施形態１に記載の組換え酵母細胞。
１１．前記細胞壁分解酵素が、β－１，３－グルカナーゼを含む、実施形態１０に記載の組換え酵母細胞。
１２．前記細胞壁分解酵素が、マンナナーゼを含む、実施形態１に記載の組換え酵母細胞。
１３．細胞壁阻害毒素をコードする第４の核酸配列をさらに含み；
前記第４の核酸配列が、前記野生型酵母細胞では天然に存在せず；好ましくは、前記第２、第３、及び第４の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、実施形態１に記載の組換え酵母細胞。
前記第４の核酸配列が、前記野生型酵母細胞では天然に存在せず；好ましくは、前記第２、第３、及び第４の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、実施形態１に記載の組換え酵母細胞。
１４．前記野生型酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む、先行実施形態のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
１５．前記組換え酵母細胞が凍結乾燥されている、先行実施形態のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
１６．野生型酵母細胞に由来する組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
インフルエンザウイルス由来の１つ以上のタンパク質をコードする第２の核酸配列；及び、
グルカナーゼをコードする第３の核酸配列；を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
インフルエンザウイルス由来の１つ以上のタンパク質をコードする第２の核酸配列；及び、
グルカナーゼをコードする第３の核酸配列；を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
１７．野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞に由来する組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が：
Ｔｅｔ－ｏｆｆ調節プロモーターをコードする第１の核酸配列；
インフルエンザウイルス由来のヒトインフルエンザＭ１マトリックス、ヘマグルチニン、及びノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２の核酸配列；及び
グルカナーゼをコードする第３の核酸配列；を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
Ｔｅｔ－ｏｆｆ調節プロモーターをコードする第１の核酸配列；
インフルエンザウイルス由来のヒトインフルエンザＭ１マトリックス、ヘマグルチニン、及びノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２の核酸配列；及び
グルカナーゼをコードする第３の核酸配列；を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
１８．野生型酵母細胞に由来する組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が：
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列；及び
細胞壁阻害毒素をコードする第３の核酸配列；を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列；及び
細胞壁阻害毒素をコードする第３の核酸配列；を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
１９．野生型酵母細胞に由来し、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、ＶＬＰ免疫原をコードする核酸配列及び細胞壁分解酵素をコードする核酸配列を含むように形質転換された、凍結乾燥組換え酵母細胞。
２０．空洞を画定する摂取可能な容器；及び
野生型酵母細胞に由来し、前記空洞内に配置される組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み；
前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞；
を含むワクチン組成物。
野生型酵母細胞に由来し、前記空洞内に配置される組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み；
前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞；
を含むワクチン組成物。
２１．前記摂取可能な容器が、カプセルを含む、実施形態２０に記載のワクチン組成物。
２２．前記カプセルが耐酸性であり、経口投与後に対象の腸に実質的に機能的な酵母及び／またはＶＬＰを送達する、実施形態２１に記載のワクチン組成物。
２３．前記カプセルが、１つ以上の細孔、例えば、機械的に誘導可能な細孔などの、細胞及び／またはＶＬＰを放出するように誘導することができる固体カプセル内の細孔を画定する、実施形態２１に記載のワクチン組成物。
２４．前記組換え酵母細胞が、実施形態１～１９のいずれかによる組換え酵母細胞を含む、実施形態２０に記載のワクチン組成物。
２５．空洞を画定する摂取可能なカプセル；及び
野生型酵母細胞に由来し、前記空洞内に配置された凍結乾燥組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み；
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞；
を含むワクチン組成物。
野生型酵母細胞に由来し、前記空洞内に配置された凍結乾燥組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み；
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞；
を含むワクチン組成物。
２６．少なくとも１つの食品と
空洞を画定する摂取可能な容器；ならびに
前記空洞内に配置された組換え酵母細胞、または複数の組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み；
前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み、
前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞、または複数の組換え酵母細胞；
を含む、少なくとも１つのワクチン組成物と
を含む食品組成物。
空洞を画定する摂取可能な容器；ならびに
前記空洞内に配置された組換え酵母細胞、または複数の組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み；
前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み、
前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞、または複数の組換え酵母細胞；
を含む、少なくとも１つのワクチン組成物と
を含む食品組成物。
２７．前記摂取可能な容器が、前記組換え酵母細胞または前記複数の酵母細胞に噴霧されたポリマーシェルを含む、実施形態２６に記載の食品組成物。
２８．前記少なくとも１つのワクチン組成物が、１つより多くのワクチン組成物を含む、実施形態２７に記載の食品組成物。
２９．前記１つより多くのワクチン組成物の各ワクチン組成物の前記摂取可能な容器が、前記組換え酵母細胞に噴霧されたポリマーシェルを含む、実施形態２６に記載の食品組成物。
３０．前記食品が、小麦粉、小麦、砂糖、バター、パン、パン生地、肉、果物またはその一部、及び野菜またはその一部のうちの１つ以上を含む、実施形態２６に記載の食品組成物。
３１．前記食品組成物が、クッキー、キャンディー、バー、クラッカー、ウエハース、パン、または飲料の形態である、実施形態２６に記載の食品組成物。
３２．少なくとも１つの食品と
複数のワクチン組成物であって、前記複数のワクチン組成物の各ワクチン組成物が、
空洞を画定するポリマーシェル；ならびに
前記空洞内に配置された複数の組換え酵母細胞であって、前記複数の組換え酵母細胞の各組換え酵母細胞が、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み；
前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記複数の組換え酵母細胞；
を含む前記複数のワクチン組成物と
を含む食品組成物。
複数のワクチン組成物であって、前記複数のワクチン組成物の各ワクチン組成物が、
空洞を画定するポリマーシェル；ならびに
前記空洞内に配置された複数の組換え酵母細胞であって、前記複数の組換え酵母細胞の各組換え酵母細胞が、調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列、ＶＬＰ免疫原をコードする第２の核酸配列、及び細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列を含み；
前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、及び第３の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記複数の組換え酵母細胞；
を含む前記複数のワクチン組成物と
を含む食品組成物。
３３．少なくとも１つの食品と、ポリマーシェルによって画定される空洞内に配置された複数の組換え酵母細胞を含むワクチン組成物とを含む食品組成物であって、前記複数の組換え酵母細胞の各組換え酵母細胞が、野生型酵母細胞に由来し、前記野生型酵母細胞においては天然に存在しない調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、ＶＬＰ免疫原をコードする核酸配列と、細胞壁分解酵素をコードする核酸配列とを含むように形質転換されている、前記食品組成物。
３４．前記複数の組換え酵母細胞の各組換え酵母細胞が、凍結乾燥されている、実施形態３３に記載の食品組成物。
３５．動物へのワクチン接種方法であって、前記方法が、実施形態によるワクチン組成物を、前記動物に経口送達することを含む、前記ワクチン接種方法。
３６．動物へのワクチン接種方法であって、前記方法が、実施形態による食品組成物を、前記動物に経口送達することを含む、前記ワクチン接種方法。
３７．包装基材；
実施形態２０によるワクチン組成物；
及び前記ワクチン組成物を使用するための指示書
を含むキット。
実施形態２０によるワクチン組成物；
及び前記ワクチン組成物を使用するための指示書
を含むキット。
３８．前記包装基材が、物質のシートを含む、実施形態３７に記載のキット。
３９．前記ワクチン組成物が、前記包装基材上に配置される、実施形態３８に記載のキット。
４０．前記ワクチン組成物が、前記包装基材に固定される、実施形態３９に記載のキット。
４１．前記ワクチン組成物を前記包装基材に固定する収縮包装物質をさらに含む、実施形態４０に記載のキット。
４２．前記包装基材が、容器を含む、実施形態３７に記載のキット。
４３．前記ワクチン組成物を使用するための前記指示書が、前記ワクチン組成物を動物に経口投与するための指示を含む、実施形態３７に記載のキット。
４４．前記ワクチン組成物を使用するための前記指示書が、前記ワクチン組成物を経口摂取するための指示を含む、実施形態３７に記載のキット。
４５．包装基材；
実施形態２６による食品組成物；
及び前記食品組成物を使用するための指示書；
を含むキット。
実施形態２６による食品組成物；
及び前記食品組成物を使用するための指示書；
を含むキット。
４６．前記包装基材が、物質のシートを含む、実施形態４５に記載のキット。
４７．前記食品組成物が、前記包装基材上に配置される、実施形態４６に記載のキット。
４８．前記食品組成物が、前記包装基材に固定される、実施形態４７に記載のキット。
４９．前記食品組成物を前記包装基材に固定する収縮包装物質をさらに含む、実施形態４８に記載のキット。
５０．前記包装基材が、容器を含む、実施形態４５に記載のキット。
５１．前記食品組成物を使用するための前記指示書が、前記食品組成物を動物に経口投与するための指示を含む、実施形態４５に記載のキット。
５２．前記食品組成物を使用するための前記指示書が、前記食品組成物を経口摂取するための指示を含む、実施形態４５に記載のキット。
５３．野生型酵母細胞に由来する組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が、
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
Ｇａｇ－ＭＳ２融合タンパク質をコードする第２の核酸配列；
細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列；及び
非翻訳ＭＳ２結合配列及び抗原をコードする第４の核酸配列を含み；
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、第３の核酸配列、及び前記第４の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
Ｇａｇ－ＭＳ２融合タンパク質をコードする第２の核酸配列；
細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列；及び
非翻訳ＭＳ２結合配列及び抗原をコードする第４の核酸配列を含み；
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、第３の核酸配列、及び前記第４の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
５４．前記第２、第３、及び第４の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、実施形態５３に記載の組換え酵母細胞。
５５．前記第４の核酸配列が、インフルエンザウイルス、ＲＳＶ、及びＨＩＶのうちの１つに由来する、実施形態５３に記載の組換え酵母細胞。
５６．野生型酵母細胞に由来する組換え酵母細胞であって、前記組換え酵母細胞が：
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
パラインフルエンザ５ＮＰ、Ｖ／Ｐ、及びＬ遺伝子のそれぞれの少なくとも一部を含み、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、及びＨＮからなる群から選択されるパラインフルエンザ５遺伝子の１つ以上を欠損する第２の核酸配列；
細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列；及び
抗原をコードする第４の核酸配列；を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、第３の核酸配列、及び前記第４の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
調節されたプロモーターをコードする第１の核酸配列；
パラインフルエンザ５ＮＰ、Ｖ／Ｐ、及びＬ遺伝子のそれぞれの少なくとも一部を含み、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、及びＨＮからなる群から選択されるパラインフルエンザ５遺伝子の１つ以上を欠損する第２の核酸配列；
細胞壁分解酵素をコードする第３の核酸配列；及び
抗原をコードする第４の核酸配列；を含み、
好ましくは、前記第１の核酸配列、第２の核酸配列、第３の核酸配列、及び前記第４の核酸配列の各々が、前記野生型酵母細胞では天然に存在しない核酸配列を含み；
好ましくは、前記第２及び第３の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、前記組換え酵母細胞。
５７．前記第２、第３、及び第４の核酸配列の発現が、前記調節されたプロモーターの共通の遺伝子制御下にある、実施形態５６に記載の組換え酵母細胞。
５８．前記第４の核酸配列が、パラインフルエンザ５以外のウイルスに由来する、実施形態５６に記載の組換え酵母細胞。
５９．前記第４の核酸配列が、インフルエンザウイルス、ＲＳＶ、及びＨＩＶのうちの１つに由来する、実施形態５８に記載の組換え酵母細胞。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月２１日に出願された米国仮出願第６２／８５０，６８１号、及び２０２０年３月１８日に出願された米国仮出願第６２／９９１，５３６号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ESP-001-PCT_SL.txtと称され、サイズは９９，９８６バイトである。
本出願は、２０１９年５月２１日に出願された米国仮出願第６２／８５０，６８１号、及び２０２０年３月１８日に出願された米国仮出願第６２／９９１，５３６号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ESP-001-PCT_SL.txtと称され、サイズは９９，９８６バイトである。
Claims (28)
- 細胞壁透過剤をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節可能な異種プロモーター；及び
免疫原またはその成分をコードする核酸配列に作動可能に連結された異種プロモーターを含み、任意選択でさらに、
ウイルスマトリックスタンパク質もしくはその機能的断片、ウイルスキャプシドタンパク質もしくはその機能的断片、またはウイルス構造タンパク質もしくはその機能的断片をコードする核酸配列に作動可能に連結された異種プロモーター
を含む組換え酵母細胞。 - 前記免疫原が、ＶＬＰの成分を含む、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
- 前記免疫原が、ＶＬＰの構造成分を含む、請求項２に記載の組換え酵母細胞。
- 前記免疫原が、キャプシドタンパク質またはその機能的断片を含む、請求項３に記載の組換え酵母細胞。
- 前記免疫原が、マトリックスタンパク質またはその機能的断片を含む、請求項３に記載の組換え酵母細胞。
- 前記免疫原が、核酸結合ペプチドに融合されたＶＬＰの成分を含み、好ましくは、前記結合ペプチドが、ＭＳ２ペプチド配列を含む、請求項２に記載の組換え酵母細胞。
- 前記組換え酵母細胞が、核酸結合ペプチドリガンド配列を含む領域、及び抗原をコードする領域を含む核酸配列をさらに含み、好ましくは、前記核酸結合ペプチドリガンド配列が、ＭＳ２リガンド配列を含む、請求項６に記載の組換え酵母細胞。
- 前記免疫原が、ｅＶＬＰの脂質二重層に埋め込まれる抗原を含む、請求項２に記載の組換え酵母細胞。
- 前記組換え酵母細胞が、ＶＬＰの構造成分をコードする核酸配列と、前記構造ＶＬＰ成分から形成されるｅＶＬＰの脂質二重層に埋め込まれる抗原をコードする核酸配列とを含む、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
- 前記免疫原及び細胞壁透過剤が、共通の遺伝子制御下にある、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
- 前記細胞壁透過剤がβグルカナーゼである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
- 前記βグルカナーゼがβ－１－３－グルカナーゼである、請求項１１に記載の組換え酵母細胞。
- 前記β－１－３－グルカナーゼが、配列番号１によってコードされる分泌タンパク質配列を有するか、または前記β－１－３－グルカナーゼが、配列番号１０の少なくとも１００連続アミノ酸、またはそのすべてを含む、請求項１２に記載の組換え酵母細胞。
- 前記β－１－３－グルカナーゼが、配列番号１によってコードされる分泌タンパク質配列と、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるか、または前記β－１－３－グルカナーゼが、配列番号１０の少なくとも１００連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも９５％同一である、請求項１２に記載の組換え酵母細胞。
- 前記β－１－３－グルカナーゼが、配列番号１によってコードされるタンパク質または配列番号１０に記載のポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、または５個以下の単一アミノ酸の置換、欠失、及び／または付加を含む、請求項１２に記載の組換え酵母細胞。
- 前記細胞壁透過剤がキチナーゼである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
- 前記キチナーゼが、配列番号４によってコードされる分泌タンパク質配列を有するか、または前記キチナーゼが、配列番号１２の少なくとも１００連続アミノ酸、またはそのすべてを含む、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
- 前記キチナーゼが、配列番号４によってコードされる分泌タンパク質配列と、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるか、または前記キチナーゼが、配列番号１２の少なくとも１００連続アミノ酸、またはそのすべてと、少なくとも９５％同一である、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
- 前記キチナーゼが、配列番号４によってコードされるタンパク質配列、または配列番号１２に記載のポリペプチド配列と比較して、１、２、３、４、または５個以下の単一アミノ酸の置換、欠失、及び／または付加を含む、請求項１６に記載の組換え酵母細胞。
- 前記細胞壁透過剤が、例えば、配列番号５によってコードされるか、配列番号５によってコードされるかもしくは配列番号２３に記載のタンパク質配列を含むか、配列番号５によってコードされるかもしくは配列番号２３に記載の分泌タンパク質配列と少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、または配列番号５によってコードされるかもしくは配列番号２３に記載のタンパク質配列と比較して、１、２、３、４、もしくは５個以下の単一アミノ酸の置換、欠失、及び／または付加を含む細胞壁阻害毒素である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
- ワクチン組成物の製造方法であって、前記方法が：
前記調節されたプロモーターが前記作動可能に連結された核酸配列の発現を抑制する条件下で、培養培地中で請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞を培養すること；及び
前記調節可能な異種プロモーターに作動可能に連結された核酸の発現を誘導し、それにより前記組換え酵母細胞を透過処理することを含む、
前記製造方法。 - 前記方法が、前記培養物の少なくとも一部について、前記調節可能な異種プロモーターに作動可能に連結された核酸の発現を誘導すること；及び
前記培地から前記透過処理した組換え酵母細胞を回収すること；または、
前記培地から前記免疫原を回収することを含む、
請求項２１に記載の方法。 - 前記方法が、前記組換え酵母細胞、透過処理した組換え酵母細胞、または免疫原を回収し、そこからワクチン組成物を形成することを含む、請求項２１～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、回収した組換え酵母細胞または透過処理した組換え酵母細胞を凍結乾燥し、そこから前記ワクチン組成物を形成することを含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記方法が、食品を前記ワクチン組成物と混合することを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 組換え酵母細胞を含むワクチン組成物の作製方法であって、前記方法が：
請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞を提供すること；及び
前記組換え酵母細胞を薬学的に許容される賦形剤または食品と混合することを含む、
前記作製方法。 - 請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞と、薬学的に許容される賦形剤または食品とを含むワクチン組成物。
- 対象へのワクチン投与方法であって、前記方法が：
請求項２７に記載のワクチン組成物を提供すること；及び
前記ワクチン組成物を経口投与することを含む、
前記投与方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962850681P | 2019-05-21 | 2019-05-21 | |
| US62/850,681 | 2019-05-21 | ||
| US202062991536P | 2020-03-18 | 2020-03-18 | |
| US62/991,536 | 2020-03-18 | ||
| PCT/US2020/034094 WO2020237100A1 (en) | 2019-05-21 | 2020-05-21 | Yeast-based oral vaccination |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022532922A true JP2022532922A (ja) | 2022-07-20 |
Family
ID=73458686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021569052A Pending JP2022532922A (ja) | 2019-05-21 | 2020-05-21 | 酵母ベースの経口ワクチン接種 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220145309A1 (ja) |
| EP (1) | EP3972641A4 (ja) |
| JP (1) | JP2022532922A (ja) |
| CN (1) | CN114269374A (ja) |
| AU (1) | AU2020279381A1 (ja) |
| BR (1) | BR112021023348A2 (ja) |
| CA (1) | CA3138174A1 (ja) |
| IL (1) | IL288177A (ja) |
| WO (1) | WO2020237100A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL303190A (en) * | 2020-11-25 | 2023-07-01 | Esperovax Inc | Yeast-based expression of therapeutic proteins IN VIVO |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7145060B2 (en) * | 2001-11-07 | 2006-12-05 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleic acid encoding a chitinase and methods of using it to make fungal resistant plants |
| CN104826102A (zh) * | 2006-02-02 | 2015-08-12 | 全球免疫股份有限公司 | 用于诱导免疫应答的基于酵母的疫苗 |
| US20100143406A1 (en) * | 2006-06-30 | 2010-06-10 | Gale Smith | Methods of enhancing protein incorporation into virus like particles |
| EP2869838B1 (en) * | 2012-07-05 | 2020-09-02 | Children's Medical Center Corporation | The bacterial biofilm matrix as a platform for protein delivery |
| WO2014160747A2 (en) * | 2013-03-26 | 2014-10-02 | Globeimmune, Inc. | Compositions and methods for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection |
| WO2016054106A1 (en) * | 2014-09-29 | 2016-04-07 | The Regents Of The University Of California | SCAFFOLD RNAs |
| US11020470B2 (en) * | 2015-04-13 | 2021-06-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Virus-like particles |
| IT201600116554A1 (it) * | 2016-11-17 | 2018-05-17 | Fond Ri Med | Probiotic yeasts as novel vaccination vectors |
-
2020
- 2020-05-21 US US17/612,179 patent/US20220145309A1/en active Pending
- 2020-05-21 EP EP20809171.0A patent/EP3972641A4/en active Pending
- 2020-05-21 CN CN202080053024.7A patent/CN114269374A/zh active Pending
- 2020-05-21 JP JP2021569052A patent/JP2022532922A/ja active Pending
- 2020-05-21 CA CA3138174A patent/CA3138174A1/en active Pending
- 2020-05-21 BR BR112021023348A patent/BR112021023348A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2020-05-21 AU AU2020279381A patent/AU2020279381A1/en active Pending
- 2020-05-21 WO PCT/US2020/034094 patent/WO2020237100A1/en unknown
-
2021
- 2021-11-16 IL IL288177A patent/IL288177A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20220145309A1 (en) | 2022-05-12 |
| BR112021023348A2 (pt) | 2022-02-01 |
| EP3972641A1 (en) | 2022-03-30 |
| AU2020279381A1 (en) | 2021-12-09 |
| IL288177A (en) | 2022-01-01 |
| CA3138174A1 (en) | 2020-11-26 |
| CN114269374A (zh) | 2022-04-01 |
| WO2020237100A1 (en) | 2020-11-26 |
| EP3972641A4 (en) | 2024-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7465310B2 (ja) | 多用途性且つ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン | |
| CN109328233A (zh) | 反式复制rna | |
| US20230302115A1 (en) | Recombinant rsv with silent mutations, vaccines, and methods related thereto | |
| CN104159609B (zh) | 用于预防锦鲤疱疹病毒(khv)引起的疾病的重组khv和疫苗 | |
| US20130078275A1 (en) | Novel systems, vectors, and methods for delivery of biomolecules to eukaryotic cells | |
| JP6990814B2 (ja) | アヒル腸炎ウイルス及びその使用 | |
| CN102740880A (zh) | 基于重组修饰的安卡拉痘苗（mva）病毒的通用流感疫苗 | |
| JP2016518132A (ja) | 細菌人工染色体 | |
| US20070207167A1 (en) | Immunologically enhanced recombinant vaccines | |
| JP6802813B2 (ja) | アヒル腸炎ウイルス及びその使用 | |
| JP2022532922A (ja) | 酵母ベースの経口ワクチン接種 | |
| CN114276969A (zh) | 一种SARS-CoV-2细菌样颗粒及其在疫苗中的应用 | |
| JP6313215B2 (ja) | 組み換え酵母を用いた、定義された抗原に対する防御的体液性免疫応答の生成による予防接種 | |
| WO2023070873A1 (zh) | SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法及其应用 | |
| Wang et al. | Protection against genotype VII Newcastle disease virus challenge by a minicircle DNA vaccine coexpressing F protein and chicken IL-18 adjuvant | |
| Wang et al. | Innovative translational platforms for rapid developing clinical vaccines against COVID‐19 and other infectious disease | |
| JP2023553341A (ja) | ｉｎ ｖｉｖｏでの治療タンパク質の酵母ベースの発現 | |
| BR112020013245A2 (pt) | sistema hospedeiro/vetor otimizado para a produção de vacinas de subunidades mono- e multivalentes protetoras à base da levedura kluyveromyces lactis | |
| Loessner et al. | Employing live microbes for vaccine delivery | |
| US20230203536A1 (en) | Coronavirus rna replicons and use thereof as vaccines | |
| CN114632148A (zh) | 病原样抗原疫苗及其制备方法 | |
| CN116615551A (zh) | 用于多用途和有效的基因表达的rna复制子 | |
| WO2022115636A9 (en) | Cell viability switch for genetically modified organisms | |
| KR20220041643A (ko) | 조류인플루엔자 뉴라미니다아제를 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 범용 백신 | |
| EA045050B1 (ru) | Оптимизированная система вектор-хозяин для получения защитной моно- и поливалентной субъединичной вакцины на основе дрожжей kluyveromyces lactis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220202 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230519 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240430 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240507 |