JP2022532802A - 乳児性悪性大理石骨病に対する遺伝子療法ベクター - Google Patents

Abstract

本開示は、ＴＣＩＲＧ１ポリペプチドまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む改善された遺伝子療法ベクター、その使用方法、医薬組成物、およびその他の様々を提供する。特に、本開示は、乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）の治療のためのレンチウイルスベクターを提供する。TIFF2022532802000004.tif128140

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８５２，２１６号の優先利益を主張するものであり、本出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＲＯＰＡ＿００３＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、２０２０年５月２２日に作成された約６２ＫＢで、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

分野
本開示は、概して、Ｔ細胞免疫調節因子１，ＡＴＰａｓｅ Ｈ＋輸送Ｖ０サブユニットａ３遺伝子（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ １，ＡＴＰａｓｅ Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ Ｖ０ ｓｕｂｕｎｉｔ ａ３）（ＴＣＩＲＧ１）の変異に関連する疾患のための遺伝子療法に関する。特に本開示は、ＴＣＩＲＧ１タンパク質（ＴＣＩＲＧ１）をコードする発現カセットを含む遺伝子療法ベクターおよびプラスミドを提供する。

乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）は、機能不全性破骨細胞によって引き起こされる骨量の増加を特徴とする希少な劣性疾患である。この疾患は、ほとんどの場合、Ｔ細胞免疫調節因子１，ＡＴＰａｓｅ Ｈ＋輸送Ｖ０サブユニットａ３（ＴＣＩＲＧ１）の変異によって引き起こされる。ＴＣＩＲＧ１は、破骨細胞が骨を再吸収する能力に関与する。

破骨細胞機能は、ＴＣＩＲＧ１のレンチウイルスベクター介在性発現によって回復することができる。Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ５７：１－９（２０１３）（非特許文献1）。さらなる研究は、構成的生理学的プロモーターを有するレンチウイルスベクターによって発現されているにもかかわらず、ＴＣＩＲＧ１のレンチウイルス介在性発現が、内因性遺伝子産物と同じ様式で調節されていることを示す。Ｔｈｕｄｉｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．９９：６３８－６４８（２０１６）（非特許文献2）。さらに、彼らは、天然のＴＣＩＲＧ１遺伝子配列が、遺伝子のコドン最適化ｃＤＮＡからのｍＲＮＡレベルがかなり高いにもかかわらず、遺伝子のコドン最適化ｃＤＮＡよりも、破骨細胞における高レベルのタンパク質発現および機能的救済につながることを立証した。さらに、データは、機能的ＴＣＩＲＧ１を有するヒト前破骨細胞のごく一部のみが、インビトロで、吸収機能を大幅に増加させるために必要であることを示し、これは、大理石骨病のｏｃ／ｏｃマウスモデルからの以前の結果と一致して、吸収性破骨細胞および非吸収性破骨細胞が融合している可能性が高い。有効性と安全性の両方の観点から、この発見は、大理石骨病に対する遺伝子療法のさらなる開発を後押しするものである。

ＴＣＩＲＧ１の遺伝子療法ベクターおよびそのようなベクターを使用する治療方法に対する当技術分野のニーズが依然として存在する。さらに、こうした遺伝子療法ベクターを産生するための信頼できる方法に対するニーズがある。本開示は、そのような遺伝子療法ベクター、その製造方法、その使用方法、医薬組成物などを提供する。

Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ５７：１－９（２０１３） Ｔｈｕｄｉｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．９９：６３８－６４８（２０１６）

本開示は、ＴＣＩＲＧ１ポリペプチドまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含む改善された遺伝子療法ベクター、その使用方法、医薬組成物などを提供する。

一態様では、本開示は、Ｔ細胞免疫調節因子１（ＴＣＩＲＧ１）のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするコードポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む発現カセットを含む、トランスファープラスミドを提供し、ポリヌクレオチドはプロモーターに動作可能に連結されており、トランスファープラスミドはＲＮＡ－ＯＵＴリプレッサーおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターを含む。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－ＯＵＴリプレッサーは、配列番号３２と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９９％の同一性を共有する。

いくつかの実施形態において、ＣＭＶ ＩＥプロモーターは、配列番号３３と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９９％の同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、ｐＣＣＬ骨格を含む。

いくつかの実施形態では、ｐＣＣＬ骨格は、ＲＮＡ－ＯＵＴリプレッサーを含む。

いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号３９と少なくとも９５％の同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号３９を含む。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦＳプロモーターである。

いくつかの実施形態において、ＥＦＳプロモーターは、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を共有する。

いくつかの実施形態において、ＥＦＳプロモーターは、配列番号２である。

いくつかの実施形態において、コードポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する。

いくつかの実施形態において、コードポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも９９％の同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、コードポリヌクレオチドは、配列番号３である。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）を含む。

いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号４である。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、５’長末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）および３’ＬＴＲに隣接している。

いくつかの実施形態では、５’ＬＴＲは配列番号３４であり、かつ／または３’ＬＴＲは配列番号２８である。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号１である。

別の態様では、本開示は、Ｔ細胞免疫調節因子１（ＴＣＩＲＧ１）のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドと、ＥＦＳプロモーターとを含む発現カセットであって、任意選択的にポリヌクレオチドがＥＦＳプロモーターに動作可能に連結されている、発現カセットを提供する。

いくつかの実施形態では、コードポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コードポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも９９％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コードポリヌクレオチドは、配列番号３である。いくつかの実施形態において、ＥＦＳプロモーターは、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＥＦＳプロモーターは、配列番号２である。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号４である。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号１である。

別の態様では、本開示は、組換えレンチウイルスゲノムであって、５’から３’の順序で、レンチウイルス５’長末端反復配列（ＬＴＲ）と、本明細書に開示される発現カセットと、レンチウイルス３’ＬＴＲとを含み、前記組換えレンチウイルスゲノムが複製能力を有しない、組換えレンチウイルスゲノムを提供する。

別の態様では、本開示は、こうした組換えレンチウイルスゲノムを含むレンチウイルス粒子を提供する。

別の態様では、本開示は、こうした組換えレンチウイルスゲノムを含むトランスファープラスミドを提供する。特定の実施形態では、トランスファープラスミドは、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列は、配列番号２２である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列は、トランスファープラスミドがパッケージング細胞株において安定的な増殖をすることができるように構成されている。

特定の実施形態では、トランスファープラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まないか、またはＡｍｐＲなどのアンピシリン耐性遺伝子を含まない。

特定の実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２３に記載される配列を含む。

別の態様では、本開示は、本開示の任意のトランスファープラスミドおよび任意選択的に１つ以上の追加のプラスミドをパッケージング細胞株にトランスフェクトすることと、パッケージング細胞株を培養することと、を含む、レンチウイルス粒子を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、振とうフラスコまたは少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間発酵を使用して、細菌宿主内で３０～３７℃で安定的に増殖する。

関連の態様では、本開示は、本明細書に開示されるトランスファープラスミドを使用して産生されるレンチウイルス粒子を提供する。

別の態様では、本開示は、本開示の任意のレンチウイルス粒子を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本開示は、本開示の任意の発現カセットを含む改変細胞を提供する。

別の態様では、本開示は、本開示の任意の組換えレンチウイルスゲノムを含む改変細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、内因性機能性ＴＣＩＲＧ１遺伝子を欠く。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）を有するか、または有することが疑われる対象に由来する。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、機能性ＴＣＩＲＧ１遺伝子を有する破骨細胞において観察されるＴＣＩＲＧ１の発現レベルに類似したレベルで、ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＩＭＯを有していないかまたは有する疑いのない対象に由来する破骨細胞において観察されるＴＣＩＲＧ１の発現レベルに類似したレベルで、ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＣＤ３４＋前駆細胞である。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＩＭＯを有するかまたは有する疑いがある対象からアフェレーシスによって単離されたＨＳＣに由来する。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、Ｇ－ＣＳＦ、プレリキサホル（ｐｌｅｒｉｆａｘｏｒ）、またはＧ－ＣＳＦとプレリキサホルの組み合わせの投与によるＨＳＣの動員後に、ＩＭＯを有するかまたは有する疑いがある対象からアフェレーシスにより単離された、ＨＳＣに由来する。

いくつかの実施形態では、改変細胞は、磁気捕捉によりＣＤ３４＋細胞が濃縮された細胞の集団に由来する。

別の態様では、本開示は、本開示の任意の改変細胞を含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本開示は、ＩＭＯを有するかまたは有する疑いがある対象の１つ以上の細胞を改変するインビトロでの方法であって、Ｇ－ＣＳＦ、プレリキサホル、またはＧ－ＣＳＦとプレリキサホルの組み合わせを含む組成物を対象に投与することによって対象から動員された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を提供することと、磁気分離によって前記ＰＢＭＣからＣＤ３４＋細胞を濃縮し、ＣＤ３４に富む（ＣＤ３４－ｅｎｒｉｃｈｅｄ）細胞の集団を生成することと、前記ＣＤ３４に富む細胞を、組換えレンチウイルスゲノムであって、５’から３’の順序で、レンチウイルス５’長末端反復配列（ＬＴＲ）と、本開示の任意の発現カセットと、レンチウイルス３’ＬＴＲと、を含む組換えレンチウイルスゲノム、を含む、レンチウイルス粒子と、接触させることと、を含み、組換えレンチウイルスゲノムが複製能力を有しない、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）を有するか、またはＩＭＯを有すると疑われる対象においてＩＭＯを治療する方法を提供し、本開示の任意の改変細胞または本開示の任意の医薬組成物を対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する改変細胞をＨＳＣニッチに再配置させる。

いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する改変細胞を破骨細胞ニッチに再配置させる。

いくつかの実施形態では、本方法は、ＩＭＯを治療する、改善する、予防する、減少させる、抑制する、または緩和する。

いくつかの実施形態において、本方法は、治療された対象の平均全生存期間を、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、またはそれ以上、延長する。

いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＭＯによる対象の死を予防する。

いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

いくつかの実施形態では、対象は、治療前にＩＭＯの症状を呈した。

いくつかの実施形態では、対象は、治療前にＴＣＩＲＧ１の発現の減少または検出不能な発現を有するとして特定された。

一実施形態では、対象は、変異ＴＣＩＲＧ１遺伝子を有すると特定された。

いくつかの実施形態では、対象は乳児である。

いくつかの実施形態では、方法は、自家治療を含む。

いくつかの実施形態では、投与は、静脈内注入を介して行われる。

別の態様では、本開示は、乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）を治療または予防するための薬剤の調製における使用のための組換えレンチウイルスゲノムを提供し、レンチウイルスゲノムは、５’から３’の順序で、レンチウイルス５’長末端反復配列（ＬＴＲ）と、本開示の任意の発現カセットと、レンチウイルス３’ＬＴＲとを含み、組換えレンチウイルスゲノムは複製能力を有しない。

別の態様では、本開示は、組換えレンチウイルスゲノムを含む、乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）を治療または予防するための薬剤の調製における使用のためのレンチウイルス粒子を提供し、レンチウイルスゲノムは、５’から３’の順序で、レンチウイルス５’長末端反復配列（ＬＴＲ）と、本開示の任意の発現カセットと、レンチウイルス３’ＬＴＲとを含み、組換えレンチウイルスゲノムは複製能力を有しない。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、それらによって包含される。

図１は、ＴＣＩＲＧ１（ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅ）をコードするレンチウイルス遺伝子療法ベクターを産生するためのトランスファープラスミドの図を提供する。 図２は、５’から３’の順番で、伸長因子１－αショート（ＥＦＳ）プロモーター（下線、配列番号２）、ＴＣＩＲＧ１をコードするポリヌクレオチド（黒地に白の文字、配列番号３）、およびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（下線および太字、配列番号４）を含む、発現カセット（配列番号１）の遺伝子配列を示す。 図３Ａ～３Ｂは、２つの異なるレンチウイルスプラスミドの安定性の比較を提供する。図３Ａは、制限酵素で消化されていないか（「アンカット（Ｕｎｃｕｔ）」）、またはＡｆｌＩＩＩ（「ＡｆｌＩＩＩ」）またはＡｆｌＩＩＩおよびＮａｒＩ（「ＡｆｌＩＩＩ／ＮａｒＩ」）で消化されたプラスミドｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅを示す臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルの写真を示す。図３Ｂは、制限酵素で消化されていないか（「アンカット」）、またはＡｆｌＩＩＩ（「ＡｆｌＩＩＩ」）またはＡｆｌＩＩＩおよびＮａｒＩ（ＡｆｌＩＩＩ／ＮａｒＩ」）で消化されたプラスミドｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅを示す臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルの写真を示す。図３Ｃは、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅおよびｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅプラスミドの概略図を示す。 図４は、レンチウイルス粒子製造のための例示的なプロセスを示す。 図５Ａ～５Ｂは、形質導入の６日後（図５Ａ）および１２日後（図５Ｂ）のバルクＣＤ３４＋細胞液体培養中のベクターコピー数（ＶＣＮ）を示す。ＶＣＮは、形質導入されたＣＤ３４＋細胞をＳＣＧＭ完全培地中で培養した後に抽出されたｇＤＮＡのｑＰＣＲにより評価した。各ドナーに対するＶＣＮおよび平均は、各形質導入条件について表される。

詳細な説明
本発明者らは、ＴＣＩＲＧ１をコードするレンチウイルスベクターで形質導入された自家細胞の移植が、乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）の治療に効果的であることを示した。さらに、ＴＣＩＲＧ１をコードする遺伝子療法ベクターの発現カセット配列に特定の配列要素を含めることにより、ＩＭＯに対する安全かつ有効な遺伝子療法がもたらされる。本開示は、レンチウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターを産生するのに有利な安定的トランスファープラスミドを含む、ＴＣＩＲＧ１をコードするプラスミドを提供する。

ベクターおよびプラスミド
発明者らは驚くべきことに、ＴＣＩＲＧ１遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの大規模な産生が、（ｉ）ｐＲＲＬベクター骨格をｐＣＣＬベクター骨格に置き換えることおよび、（ｉｉ）ｐＣＣＬ骨格の従来の抗生物質耐性カセットをＲＮＡ－ＯＵＴ選択マーカーに置き換えること、の２つの方法で所望の発現カセットを含有するｐＲＲＬプラスミドを改変することによって、改善されることを発見した。次に、改善されたプラスミドを、ヘルパープラスミドと共にレンチウイルス粒子産生系にトランスフェクトして、所望のレンチウイルスベクターを産生する。

結果として得られるＴＣＩＲＧ１遺伝子療法のためのｐＣＣＬ／ＲＮＡ－ＯＵＴベクター（例えば、図１に図示されたベクター）は、安定性を改善し、Ｅ．ｃｏｌｉベースのプラスミド産生からのプラスミド収率の向上に反映され、精製プラスミド中の望ましくない組み換え産物のレベルが低減される（実施例１および図３Ａ～３Ｃに示される）。トランスファープラスミドに対するこの改善により、臨床試験および使用に十分な収率で、ＴＣＩＲＧ１発現カセットを含むレンチウイルス粒子の製造が可能となる。本明細書に提供されるさらなるデータは、本明細書に開示される方法および組成物を使用して産生されたレンチウイルス粒子が、臨床的に意義のあるベクターコピー数（ＶＣＮ）レベルに達するのに十分な効率でＣＤ３４^＋細胞に形質導入されることを示す。

いくつかの実施形態では、本開示は、第三世代のレンチウイルスベクター系で使用されるｐＣＣＬトランスファープラスミドに基づくレンチウイルスベクターであるトランスファープラスミドを提供する。ｐＣＣＬトランスファープラスミドは、キメラサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）－ＨＩＶ ５’ＬＴＲおよびベクター骨格を含有し、この中で、シミアンウイルス４０ポリアデニル化および（エンハンサーを欠く）複製起点配列は、ＨＩＶ ３’ＬＴＲの下流に含まれ、ＨＩＶ組込み部位から残っているヒト配列の大部分を置き換える。ＣＣＬ ５’ハイブリッド長末端反復配列（ＬＴＲ）は、ＨＩＶ－１ ＬＴＲのＲ領域に結合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（転写開始部位に対してヌクレオチド－６７３～－１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 Ｋ０３１０４）である。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、上流のＲＲＥおよびｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントと下流のＷＰＲＥエレメントとを有するＴＣＩＲＧ１遺伝子に連結されたＥＦＳプロモーターを含む（図１）。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、上流のＲＲＥおよびｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントと下流ＷＰＲＥエレメントとを有するＴＣＩＲＧ１遺伝子に連結されたＰＧＫプロモーター（配列番号２４）を含む。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、ＲＮＡ－ＯＵＴエレメントを含む。有利なことに、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列は、パッキング細胞株におけるトランスファープラスミドの安定的な増殖に寄与する。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ＡｍｐＲを含まない。

いくつかの実施形態において、ＰＧＫプロモーターは、配列番号２４と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＰＧＫプロモーターは、配列番号２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＰＧＫプロモーターは、配列番号２４の配列を有する。
ＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＧＣＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＧＡＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＡＣＡＴＴＣＴＴＣＡＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＴＴＧＴＧＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＧＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＣＧＧＡＡＧＣＣＧＣＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＧＡＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＴＴＣＣＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＧＣＡＣＧＴＣＧＧＣＡＧＴＣＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＧ（配列番号２４）

特定の実施形態では、トランスファープラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で培養または増殖されたとき、同じ発現カセットを含む別のプラスミドよりも安定的であり、したがって、プラスミドの収率が高くなり、これはベクターの産生における使用に有利である。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅトランスファープラスミドよりも安定している。特定の実施形態では、同じ培養条件下で産生されるｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅトランスファープラスミドの量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍多くトランスファープラスミドが産生される。

特定の実施形態では、トランスファープラスミドは、ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅまたはその機能的バリアント、例えば、本明細書に開示されるものである。本開示は、特定の実施形態では、トランスファープラスミドｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｒｐｅまたはその機能的バリアントを提供する。トランスファープラスミドｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｒｐｅは、配列番号２３の配列を有してもよい。

あるいは、トランスファープラスミドｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｒｐｅは、配列番号２５の配列を有してもよく、配列ＧＡＴＣＡＣＧＡＧＡＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣ（配列番号２６）が削除される。

配列番号２５の配列は、環状プラスミドを表す。塩基対１でのＥＦＳプロモーターで始まるように置換された同じ配列が、配列番号２７として提供される。

いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２３と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２３の配列を有する。

いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２５と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２５の配列を有する。

いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２７と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、配列番号２７の配列を有する。

いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドは、表１に列挙されるベクター要素のうちの１つ以上を含む。

（表１）ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅベクター要素

いくつかの実施形態では、レンチウイルス粒子は、ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅを含む第三世代のレンチウイルスベクターシステムの一過性トランスフェクションによって生成される。

いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号１と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号１の配列を有する。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、５’から３’の順序で、ＥＦＳプロモーター、Ｔ細胞免疫調節因子１，ＡＴＰａｓｅ Ｈ＋輸送Ｖ０サブユニットａ３（ＴＣＩＲＧ１）またはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド、およびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＥＦＳプロモーターは、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結される。関連する実施形態は、発現カセットを含むトランスファープラスミド、およびトランスファープラスミドを使用して産生されたベクターを含む。

いくつかの実施形態では、ＥＦＳプロモーターは、配列番号２と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＥＦＳプロモーターは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＥＦＳプロモーターは、配列番号２の配列を有する。
ＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＣ（配列番号２）

いくつかの実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３の配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号４と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥは、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥは、配列番号４の配列を有する。
ＡＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＣＡＴＴＴＡＴＡＣＣＣＡＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＧＧＧＡＴＡＴＧＴＡＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧＴＡＴＴＧＣＣＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡＴＴＴＡＣＧＣＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＣＧＧＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＡＴＣＧＣＣＡＣＧＧＣＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＴＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号４）

いくつかの実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントは、配列番号５の配列を有する。
ＭＧＳＭＦＲＳＥＥＶＡＬＶＱＬＦＬＰＴＡＡＡＹＴＣＶＳＲＬＧＥＬＧＬＶＥＦＲＤＬＮＡＳＶＳＡＦＱＲＲＦＶＶＤＶＲＲＣＥＥＬＥＫＴＦＴＦＬＱＥＥＶＲＲＡＧＬＶＬＰＰＰＫＧＲＬＰＡＰＰＰＲＤＬＬＲＩＱＥＥＴＥＲＬＡＱＥＬＲＤＶＲＧＮＱＱＡＬＲＡＱＬＨＱＬＱＬＨＡＡＶＬＲＱＧＨＥＰＱＬＡＡＡＨＴＤＧＡＳＥＲＴＰＬＬＱＡＰＧＧＰＨＱＤＬＲＶＮＦＶＡＧＡＶＥＰＨＫＡＰＡＬＥＲＬＬＷＲＡＣＲＧＦＬＩＡＳＦＲＥＬＥＱＰＬＥＨＰＶＴＧＥＰＡＴＷＭＴＦＬＩＳＹＷＧＥＱＩＧＱＫＩＲＫＩＴＤＣＦＨＣＨＶＦＰＦＬＱＱＥＥＡＲＬＧＡＬＱＱＬＱＱＱＳＱＥＬＱＥＶＬＧＥＴＥＲＦＬＳＱＶＬＧＲＶＬＱＬＬＰＰＧＱＶＱＶＨＫＭＫＡＶＹＬＡＬＮＱＣＳＶＳＴＴＨＫＣＬＩＡＥＡＷＣＳＶＲＤＬＰＡＬＱＥＡＬＲＤＳＳＭＥＥＧＶＳＡＶＡＨＲＩＰＣＲＤＭＰＰＴＬＩＲＴＮＲＦＴＡＳＦＱＧＩＶＤＡＹＧＶＧＲＹＱＥＶＮＰＡＰＹＴＩＩＴＦＰＦＬＦＡＶＭＦＧＤＶＧＨＧＬＬＭＦＬＦＡＬＡＭＶＬＡＥＮＲＰＡＶＫＡＡＱＮＥＩＷＱＴＦＦＲＧＲＹＬＬＬＬＭＧＬＦＳＩＹＴＧＦＩＹＮＥＣＦＳＲＡＴＳＩＦＰＳＧＷＳＶＡＡＭＡＮＱＳＧＷＳＤＡＦＬＡＱＨＴＭＬＴＬＤＰＮＶＴＧＶＦＬＧＰＹＰＦＧＩＤＰＩＷＳＬＡＡＮＨＬＳＦＬＮＳＦＫＭＫＭＳＶＩＬＧＶＶＨＭＡＦＧＶＶＬＧＶＦＮＨＶＨＦＧＱＲＨＲＬＬＬＥＴＬＰＥＬＴＦＬＬＧＬＦＧＹＬＶＦＬＶＩＹＫＷＬＣＶＷＡＡＲＡＡＳＡＰＳＩＬＩＨＦＩＮＭＦＬＦＳＨＳＰＳＮＲＬＬＹＰＲＱＥＶＶＱＡＴＬＶＶＬＡＬＡＭＶＰＩＬＬＬＧＴＰＬＨＬＬＨＲＨＲＲＲＬＲＲＲＰＡＤＲＱＥＥＮＫＡＧＬＬＤＬＰＤＡＳＶＮＧＷＳＳＤＥＥＫＡＧＧＬＤＤＥＥＥＡＥＬＶＰＳＥＶＬＭＨＱＡＩＨＴＩＥＦＣＬＧＣＶＳＮＴＡＳＹＬＲＬＷＡＬＳＬＡＨＡＱＬＳＥＶＬＷＡＭＶＭＲＩＧＬＧＬＧＲＥＶＧＶＡＡＶＶＬＶＰＩＦＡＡＦＡＶＭＴＶＡＩＬＬＶＭＥＧＬＳＡＦＬＨＡＬＲＬＨＷＶＥＦＱＮＫＦＹＳＧＴＧＹＫＬＳＰＦＴＦＡＡＴＤＤ（配列番号５）

一実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、ヒト宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、まれに表されるコドンをより頻繁に表されるコドンで置き換えることによって発現を増強するように、改変されるか、または「コドン最適化」される。一実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化されていない。一実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、改変されていない。一実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化されていない。一実施形態では、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、天然ポリヌクレオチド配列である。

本明細書で使用される場合、用語「導入遺伝子」は、ＴＣＩＲＧ１のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドを指す。

コード配列は、翻訳のためのアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列の一部である。翻訳中、６１個のトリヌクレオチドコドンの各々が、２０個のアミノ酸のうちの一つに翻訳され、遺伝コードにおいて縮重性または冗長性をもたらす。しかしながら、異なる細胞タイプ、および異なる動物種は、異なる頻度で同じアミノ酸をコードするｔＲＮＡ（各々、アンチコドンを有する）を利用する。遺伝子配列が、対応するｔＲＮＡによってまれに表されるコドンを含有する場合、リボソーム翻訳機構は速度を緩め、効率的な翻訳を妨げる場合がある。特定の種について「コドン最適化」を介して、発現を改善することができ、コード配列は、同じタンパク質配列をコードするように改変されるが、高度に発現されたヒトタンパク質によって高度に表され、および／または利用されるコドンを利用する（Ｃｉｄ－Ａｒｒｅｇｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４９２８）。

いくつかの実施形態では、導入遺伝子のコード配列は、哺乳類または霊長類においてまれに発現されるコドンを、霊長類において頻繁に発現されるコドンで置換するように改変される。例えば、いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、参照ポリペプチド（例えば、野生型ＴＣＩＲＧ１、配列番号３）と少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードし、コード配列の少なくとも１つのコドンは、上記または本明細書に開示される配列において、対応するコドンよりも高いヒトにおけるｔＲＮＡ頻度を有する。

一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３よりも少ない代替のオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、導入遺伝子は、所望の導入遺伝子をコードしないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の終了または除去によって発現を増強するように改変される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンに続く核酸配列であり、終止コドンを含有しない。ＯＲＦは、順方向または逆方向であってもよく、対象となる遺伝子と比較して、「インフレーム」または「アウトオブフレーム」であってもよい。こうしたオープンリーディングフレームは、対象となる遺伝子と共に発現カセットに発現される可能性を有し、望ましくない有害作用をもたらす可能性がある。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、コドン使用をさらに変更することによってオープンリーディングフレームを除去するために改変されている。これは、１つ以上の開始コドン（ＡＴＧ）を除去すること、および／または１つ以上の終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡ）を所望のＯＲＦに対して逆方向またはアウトオブフレームに導入することによって行われるが、一方で、対象となる遺伝子においてコードされたアミノ酸配列を保持し、任意選択的に、高度に利用されるコドンを維持する（すなわち、頻度＜２０％を有するコドンを回避する）。

本開示の変形では、導入遺伝子コード配列は、コドン最適化および非導入遺伝子ＯＲＦの除去のいずれかによって、または両方の技術を使用して最適化されてもよい。いくつかの事例では、コドン最適化中に導入されたＯＲＦを除去するために、コドン最適化後に非導入遺伝子ＯＲＦを除去または最小化する。

一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３よりも少ないＣｐＧ部位を含有する。理論に拘束されるものではないが、ポリヌクレオチド配列中のＣｐＧ部位の存在は、ポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターに対する宿主の望ましくない免疫反応と関連すると考えられる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＣｐＧ部位の数を減少させるよう設計される。例示的な方法は、米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００６５２３６Ａ１号に提示されている。

一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３よりも少ないクリプティックスプライス部位（ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ）を含有する。最適化のために、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ソフトウェアを使用して、例えば、転写サイレンシングを回避するため、ＧＣ含量を増加させ、および／またはクリプティックスプライス部位を除去し、したがって導入遺伝子の発現を増加させることができる。あるいは、当技術分野で周知の任意の最適化方法を使用してもよい。クリプティックスプライス部位の除去は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０１５１０６Ａ１号に記載されている。

また、本明細書では、ＴＣＩＲＧ１、例えば、本明細書に開示されるＴＣＩＲＧ１配列をコードする発現カセットおよび遺伝子療法ベクターも開示されており、この配列は、コンセンサス最適コザック配列、全長ポリアデニル化（ポリＡ）配列（または切断されたポリＡの全長ポリＡでの置換）、および最小または上流のない（すなわち、５’）開始コドン（すなわち、ＡＴＧ部位）を含む。

いくつかの実施形態では、発現カセットは、５’長末端反復配列（ＬＴＲ）、エンハンサー／プロモーター領域、コンセンサス最適コザック配列、導入遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＴＣＩＲＧ１をコードする導入遺伝子）、全長ポリＡ配列を含む３’非翻訳領域、および３’ＬＴＲのうちの２つ以上を含有する。

一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に動作可能に連結されたコザック配列を含む。一実施形態では、コザック配列は、配列番号６を含むか、または配列番号６からなるコンセンサス最適コザック配列である。
ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号６）

様々な実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に動作可能に連結された代替のコザック配列を含む。一実施形態では、コザック配列は、配列番号１４～１８のうちのいずれか１つを含むか、またはそれらからなる、代替のコザック配列である。
（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号１４）
ＡＧＮＮＡＵＧＮ（配列番号１５）
ＡＮＮＡＵＧＧ（配列番号１６）
ＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１７）
ＧＡＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１８）

配列番号１４では、小文字は、塩基がやはり変化し得る位置の最も一般的な塩基を示し、大文字は、高度に保存された塩基を示し、アデニンまたはグアニンを示す。配列番号１４では、括弧内の配列（ｇｃｃ）は任意である。配列番号１５～１７では、「Ｎ」は任意の塩基を示す。

様々な配列を、このコンセンサス最適コザック配列の代わりに、翻訳開始部位として使用することができるが、他の配列を特定し、試験することは、当業者の範囲内である。Ｋｏｚａｋ Ｍ．Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｉｎｔｉｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１５（４）：８８７－９０３（１９９１）を参照されたい。

一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に動作可能に連結された全長ポリＡ配列を含む。一実施形態では、全長ポリＡ配列は配列番号７を含む。
ＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＡＧＡＴＣ（配列番号７）

限定されるものではないが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）（配列番号１９）、ＳＶ４０初期／後期ポリアデニル化シグナル（配列番号２０）、およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号２１）を含む、本開示の発現カセットに様々な代替のポリＡ配列を使用してもよい。
ＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号１９）
ＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡ（配列番号２０）
ＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＡＡＧＴＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＧＡＣＴＡＧＧＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＧＴＧＧＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＣＡＡＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＣＴＧＣ（配列番号２１）

いくつかの実施形態では、発現カセットは、ポリＡ配列の活性断片を含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列の活性断片は、例えば、本明細書に開示されるポリＡ配列のいずれかの２０塩基対（ｂｐ）未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、または１５０ｂｐ未満を含むか、またはそれからなる。

いくつかの事例では、発現カセットが競合するＯＲＦを含有しないことを保証することによって、導入遺伝子の発現が増加する。一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５’から２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００塩基対内に開始コドンを含まない。一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５’に開始コドンを含まない。

一実施形態では、発現カセットは、５’から３’の方向に、動作可能に連結された、第１の逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｓｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、エンハンサー／プロモーター領域、イントロン、コンセンサス最適コザック配列、導入遺伝子、全長ポリＡ配列を含む３’非翻訳領域、および第２の逆末端反復配列を含み、発現カセットは導入遺伝子の開始コドンの５’に開始コドンを含まない。

一実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、５’から３’の方向に、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーおよびニワトリベータ－アクチンプロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、ＣＡＧプロモーターを含む。本明細書で使用される場合、「ＣＡＧプロモーター」は、ＣＭＶ初期エンハンサー要素、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含むポリヌクレオチド配列を指す。

一実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、伸長因子１αショートプロモーター（ＥＦＳプロモーター）を含み、より短いイントロンなしバージョンの伸長因子１αプロモーターである。本明細書で使用される場合、「ＥＦＳプロモーター」は、ＥＦ１ａｌｐｈａの短いイントロンなし形態を含むポリヌクレオチド配列を指す。ＥＦＳプロモーターは最近多くの臨床試験で使用されている。これは、近くのプロモーターの交差活性化（ｃｒｏｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）が減少した細胞由来エンハンサー／プロモーターであり、そのため仮説的に、遺伝毒性のリスクを減少させる。

一実施形態では、発現カセットは、配列番号１から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、発現カセットは、配列番号１から選択される配列に完全な同一性を共有するか、または配列番号１から選択される配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有する。特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号１から選択される配列と比較して、１つ以上の修飾を含む。特定の実施形態では、１つ以上の修飾は、１つ以上（例えば、全て）の上流ＡＴＧ配列の除去、本明細書に開示するもののいずれかを含むがこれに限定されない最適化されたコンセンサスコザック配列もしくは別のコザック配列によるコザック配列の置換、および／または本明細書に開示するもののいずれかを含むがこれに限定されない全長ポリアデニル化配列または別のポリアデニル化配列によるポリアデニル化配列の置換のうちの１つ以上を含む。これらの例示的な発現カセット内の遺伝要素の例示的な構成を図１に記載する。

関連の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法ベクターを提供する。概して、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、ＴＣＩＲＧ１の１つ以上のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、これによりＴＣＩＲＧ１の発現が、欠損ＴＣＩＲＧ１タンパク質発現レベルおよび／またはそれを必要とする対象（例えば、ＴＣＩＲＧ１発現の欠損により少なくとも部分的に破骨細胞形成の欠損を特徴とする、乳児性悪性大理石骨病または別の障害を有する対象）における破骨細胞形成の欠損を部分的または完全に回復させることを可能にする。特定の実施形態では、発現カセットは、本明細書に開示されるＴＣＩＲＧ１をコードするポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号３または配列番号３のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。例示的な非ウイルスベクターとして、例えば、ネイキッドＤＮＡ、カチオン性リポソーム複合体、カチオン性ポリマー複合体、カチオン性リポソームポリマー複合体、およびエクソソームが挙げられる。ウイルスベクターの例として、限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。

本発明の実施に有用な遺伝子送達ウイルスベクターは、分子生物学の技術分野で周知の方法論を利用して構築され得る。典型的には、導入遺伝子を担持するウイルスベクターは、導入遺伝子、適切な調節因子、およびウイルスタンパク質の産生に必要な要素をコードするポリヌクレオチドから構築され、これは細胞形質導入を媒介する。かかる組換えウイルスは、当技術分野で周知の技術によって、例えば、パッケージング細胞にトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性トランスフェクションによって生成され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ９細胞（任意選択的にバキュロウイルスヘルパーベクターを有する）、２９３細胞などが含まれるが、これらに限定されない。ＵＳ２０１７／０２１８３９５Ａ１に記載されるように、ヘルペスウイルス系システムを使用してＡＡＶベクターを産生することができる。かかる複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、Ｗ０９５／１４７８５、Ｗ０９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号およびＷ０９４／１９４７８に見出すことができ、それぞれの完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、またはより具体的には、レンチウイルスベクターである。本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルス」または「レトロウイルスの」は、そのゲノムＲＮＡを線状二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５－４６０）。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、それは“プロウイルス”と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として機能し、ウイルスによってコードされるＲＮＡ分子の発現を指示する。

例示的レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科）には、限定されないが、（１）モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、およびネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）などのガンマレトロウイルス属、（２）サル泡沫状ウイルスなどのスプーマウイルス属、（３）ヒト免疫不全ウイルス１型およびサル免疫不全ウイルスなどのレンチウイルス、が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルスの」または「レンチウイルス」は、複雑なレトロウイルスの群（または属）を指す。例示的レンチウイルスには、以下に限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。一つの実施形態では、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列要素）が好ましい。

レトロウイルスベクター、より具体的には、レンチウイルスベクターは、本発明を実施するために使用され得る。したがって、本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルスベクター」は、「レンチウイルスベクター」を含むことを意味し、本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルス」は、レンチウイルスを含むことを意味する。

ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に導入することができるベクターまたはウイルス粒子、あるいは導入された核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクターは、主にウイルスに由来する構造的および／または機能的遺伝的要素を含有する。用語「レトロウイルスベクター」は、主にレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝的要素、またはその一部分を含有するウイルスベクターを指す。用語「レンチウイルスベクター」は、主にレンチウイルスに由来する、ＬＴＲを含む、構造的および機能的遺伝的要素、またはその一部分を含有するウイルスベクターを指す。用語「ハイブリッド」は、ベクター、ＬＴＲ、またはレトロウイルス配列、例えばレンチウイルス配列、および非レンチウイルスウイルス配列の両方を含有する他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組込みおよび／またはパッケージングのためのレトロウイルス配列、例えばレンチウイルス配列を含むベクターまたはトランスファープラスミドを指す。

特定の実施形態では、用語「レンチウイルスベクター」および「レンチウイルス発現ベクター」は、レンチウイルストランスファープラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すように使用され得る。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などの要素に言及する場合、これらの要素の配列は、本発明のレンチウイルス粒子中にＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミド中にＤＮＡ形態で存在することが理解されるべきである。

ある特定の実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ－１に由来する。しかしながら、レンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用することができ、特定のレンチウイルス配列における多数の置換および改変が、本明細書に記載される機能を実施するトランスファーベクターの能力を損なうことなく、対応され得ることが理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ，１９９６ｂ，ａｎｄ １９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，米国特許第６，０１３，５１６号、および第５，９９４，１３６号を参照されたく、その多くは、本発明のウイルスベクターまたはトランスファープラスミドを産生するように適合され得る。

レンチウイルスベクターを調製する際に、例えば哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を含む、レンチウイルスベクターを産生するための任意の宿主細胞を用いることができる。宿主細胞はまた、レンチウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｒｅｖ遺伝子が、レンチウイルスベクターゲノムが安定的に維持されパッケージされている宿主細胞または産生細胞において安定的に維持されるパッケージング細胞であってもよい。レンチウイルスベクターは、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して精製および製剤化される。

ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される遺伝子発現カセット、遺伝子導入カセット、または組換えレンチウイルスベクターを含む細胞を含む。関連する実施形態では、細胞は、本明細書に開示される発現カセットを含む組換えレンチウイルスベクターを形質導入されているか、または本明細書に開示される発現カセットが細胞のゲノム内に組み込まれている。特定の実施形態では、細胞は、組換えレトロウイルスベクター、例えば、パッケージング細胞を産生するために使用される細胞である。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、シュードタイプ化されている。例えば、異種ｅｎｖ遺伝子を含むプラスミドを、シュードタイプ化に使用することができる。適切なｅｎｖ遺伝子には、限定されるものではないが、ＶＳＶ－Ｇが含まれる。

いくつかの実施形態では、トランスファープラスミドの骨格は、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列を含む。ＲＮＡ－ＯＵＴは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１０９，０１２号および第９，７３７，６２０号に記載されるように、抗生物質の使用の範囲内でトランスファープラスミドを保有する細胞の選択を容易する選択マーカーシステムである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列は、以下のものである。
ＧＴＡＧＡＡＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧＴＣＧＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＣＧＡＧＴＴＣＧＣＡＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＣＴＡＣＣＴＴＡＡＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＧＧ（配列番号２２）

有利なことに、ＲＮＡ－ＯＵＴ配列は、パッキング細胞株におけるトランスファープラスミドの安定的な増殖に寄与する。

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む、トランスファー発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号１の配列を有する。

ＡＡＶは４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶは非病原性であり、既知の疾患との病因との関連がないため、ＡＡＶに基づく組み換えベクターは優れた臨床安全性と関連している。さらに、ＡＡＶは、多数の組織において、非常に効率的な遺伝子送達および持続的導入遺伝子発現の能力を提供する。「ＡＡＶベクター」とは、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味し、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４等を含む。ＡＡＶベクターは、全体的にまたは部分的に削除された１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子、例えば、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を有することができるが、機能的に隣接している末端逆位反復（ＩＴＲ）配列を保持することができる。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの救出、複製およびパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージング（例えば、機能性ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる少なくともそれらの配列を含むように本明細書に定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的救済、複製およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって、改変され得る。ＡＡＶベクターは、限定されるものではないが、１つ以上の改変キャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）を含む、他の改変を含み得る。例えば、キャプシドタンパク質は、指向性を変化させ、および／または免疫原性を減少させるように改変されてもよい。ＡＡＶ発現ベクターは、周知の技術を使用して構築されて、転写の方向に動作可能に連結された構成要素として、転写開始領域、対象のＤＮＡ（すなわち、ＴＣＩＲＧ１遺伝子）および転写終結領域を含む制御要素を少なくとも提供する。

医薬組成物および使用方法
本開示はまた、本明細書に開示される発現カセットまたはベクター（例えば、遺伝子療法ベクター）、および１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される発現カセットを含むレンチウイルス粒子を含み、例えば、発現カセットは、ＴＣＩＲＧ１をコードするコドン導入遺伝子、例えば配列番号３を含む。例えば、破骨細胞形成の欠乏を特徴とする障害（例えば、乳児性悪性大理石骨病）の予防または治療に使用するために、ＴＣＩＲＧ１の１つ以上のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含む治療有効量のレンチウイルス粒子を含む、医薬組成物を提供する。

特定の実施形態では、本明細書に開示されるレンチウイルス粒子は、対象に由来する自家ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）に形質導入するために使用され、したがって遺伝的欠損を補完する。形質導入は、インビボまたはエクスビボで起こりうる。ＣＤ３４＋に富む細胞集団は、いくつかの実施形態では、組換えヒトサイトカインを含むＣｅｌｌＧｅｎｉｘ幹細胞増殖培地（ＳＣＧＭ）中で培養され、５％ＣＯ_２および５％Ｏ_２中、３７℃でインキュベートされる。ＣＤ３４＋に富む細胞集団は、いくつかの実施形態では、前刺激に使用されるのと同じ添加剤と共にインキュベートされ、任意選択的に形質導入エンハンサー、および発現カセットＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥを含むレンチウイルス粒子（例えば、ＭＯＩ５０で）の添加と共にインキュベートされる。形質導入後、細胞懸濁液は、いくつかの実施形態では、細胞の一部を洗浄し、上清を放出試験のために取り出し、製剤を注入準備のために凍結させる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、患者をＧ－ＣＳＦ、プレリキサホル、またはＧ－ＣＳＦとプレリキサホルの組み合わせで治療することによって動員される。次いで、ＨＳＣは、アフェレーシスにより患者の末梢血から収集される。ＣＤ３４＋細胞は、例えば、磁気捕捉（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムで）を使用して濃縮され、ＣＤ３４＋に富む細胞は、レンチウイルス粒子を用いてｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される。いくつかの実施形態では、形質導入プロセスは、ポリアキサマー（ｐｏｌｙａｘａｍｅｒ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などの形質導入エンハンサーの使用を組み入れるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、形質導入されたＨＳＣは、次いで、少なくとも２．０×１０^６個のＣＤ３４＋細胞／ｋｇを注入することによって、対象、例えば、ヒト対象に移植される。いくつかの実施形態では、それらは、ＴＣＩＲＧ１発現細胞をＨＳＣニッチに再配置（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）させる。いくつかの実施形態では、それらは、ＴＣＩＲＧ１発現細胞を破骨細胞ニッチに再配置させる。

例えば、破骨細胞形成の欠乏を特徴とする障害（例えば、乳児性悪性大理石骨病）の予防または治療に使用するための、ＴＣＩＲＧ１の１つ以上のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含む治療有効量の改変細胞を含む、医薬組成物もまた提供する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、機能性ＴＣＩＲＧ１遺伝子を有する破骨細胞において観察されるＴＣＩＲＧ１の発現レベルに類似したレベルで、ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＩＭＯを有していないかまたは有する疑いのない対象に由来する破骨細胞において観察されるＴＣＩＲＧ１の発現レベルに類似したレベルで、ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＣＤ３４＋前駆細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、ＩＭＯを有するかまたは有する疑いがある対象からアフェレーシスによって単離されたＨＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、対象にとって自家のものである。いくつかの実施形態では、改変細胞は、Ｇ－ＣＳＦ、プレリキサホル、またはＧ－ＣＳＦとプレリキサホルの組み合わせの投与によるＨＳＣの動員後に、ＩＭＯを有するかまたは有する疑いがある対象からアフェレーシスにより単離された、ＨＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、磁気捕捉によりＣＤ３４＋細胞が濃縮された細胞の集団に由来する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、本明細書に開示されるベクター、例えば、本明細書に開示されるトランスファープラスミドを使用して産生されるレンチウイルスベクターを使用して形質導入された。

発現カセットまたはレンチウイルス粒子もしくは改変細胞を含有する医薬組成物は、例えば、脳室内、心筋内、冠動脈内、静脈内、動脈内、腎内、尿道内、硬膜外、または筋肉内投与のための選択された投与モードに好適な任意の形態であってもよい。１つ以上のＴＣＩＲＧ１アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子改変細胞は、単独の活性剤として、または他の活性剤と組み合わせて、単位投与形態で、従来の医薬支持体との混合物として、動物およびヒトに投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本開示の遺伝子療法ベクターのいずれかを用いてエクスビボで形質導入された細胞を含む。

様々な実施形態において、医薬組成物は、注射され得る製剤に薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体、希釈剤、および賦形剤）を含有する。これらは、特に、等張性の滅菌生理食塩水溶液（リン酸ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）であってもよく、または場合に応じて、滅菌水もしくは生理食塩水を添加すると注射用溶液の構成を可能にする乾燥、特に凍結乾燥組成物であってもよい。注射用に好適な例示的な医薬品形態として、例えば、滅菌水溶液または分散液、ゴマ油、落花生油、または水性プロピレングリコールを含む配合物、および滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において、乳児性悪性大理石骨病または別の障害の１つ以上の症状を予防する、軽減させる、改善する、低減させる、抑制する、排除する、および／または逆転させる方法を提供し、本開示の遺伝子療法ベクターを対象に投与することを含む。用語「乳児性悪性大理石骨病」または「悪性乳児性大理石骨病」または「乳児常染色体劣性大理石骨病」または「乳児性大理石骨病」または「ＩＭＯ」は、典型的には乳児期に現れる希少な骨硬化症型の骨格異形成症を指し、全身型骨化過剰症の独特のＸ線写真的外観－骨の過剰増殖を特徴とする。骨密度の全身的増加は、皮質の相対的な温存を伴う髄質部分に関する、特別な偏向を有する。骨髄腔の閉塞およびそれに続く細胞機能の低下は、重篤な血液学的合併症を引き起こす可能性がある。骨増殖に続発する視神経萎縮および脳神経損傷は、著しい病的状態をもたらす可能性がある。未治療の症例では、予後が非常に悪い単純Ｘ線写真は診断に重要な情報を提供する。また、臨床的相関と放射線学的相関は、診断プロセスに不可欠であり、追加の遺伝子検査は確認的である。

一実施形態では、改変細胞、例えば、本開示のレンチウイルス粒子を形質導入された自家細胞は、非経口、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、および筋肉内からなる群から選択される経路を介して投与される。いくつかの実施形態では、改変細胞は、注入、例えば、静脈内注入によって投与される。一実施形態では、改変細胞は、複数回投与される。一実施形態では、改変細胞は、注入によって投与される。

一実施形態では、本開示は、疾患または障害、任意選択的にＩＭＯを治療する方法をそれを必要とする対象に提供し、本開示に従って細胞を遺伝子療法ベクターと接触させ、細胞を対象に投与することを含む。一実施形態では、細胞は幹細胞であり、任意選択的に多能性幹細胞である。一実施形態では、幹細胞は骨細胞に分化することができる。一実施形態では、幹細胞は破骨細胞に分化することができる。一実施形態では、幹細胞は自家性である。一実施形態では、幹細胞はＣＤ３４＋幹細胞である。

一実施形態では、対象は、ＩＭＯまたは別の障害の症状を呈している。一実施形態では、対象は、減少したまたは検出不能なＴＣＩＲＧ１発現を有するとして特定されている。一実施形態では、対象は、変異ＴＣＩＲＧ１遺伝子を有すると特定されている。

本明細書に記載される方法を使用した治療に適している対象／患者は、破骨細胞が不十分であることを特徴とする疾患または障害（例えば、ＩＭＯ、ならびに破骨細胞形成の他の既知の障害のリスクを有する個人が含まれる。いくつかの実施形態では、対象は症状を示さない。いくつかの実施形態では、対象は、現在、症状を示している。そのような対象は、変異ＴＣＩＲＧ１遺伝子を有するか、またはＴＣＩＲＧ１発現のレベルが減少したかまたは検出不能であるとして同定されている可能性がある。症状は、活発に現れていてもよく、または抑制もしくは制御されてもよく（例えば、投薬により）、または寛解にあってもよい。対象は、例えば、資格を有する医師によって、障害と診断されても、診断されていなくてもよい。

定義
「Ｔ細胞免疫調節因子１，ＡＴＰａｓｅ Ｈ＋輸送Ｖ０サブユニットａ３遺伝子」という用語は、互換的に核酸およびポリペプチド多型バリアント、対立遺伝子、変異体、および種間相同体を指し、（１）ＴＣＩＲＧ１核酸によってコードされるアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６０１９．４（バリアント１）、ＮＭ＿００６０５３．３（バリアント２）、ＮＭ＿００１３５１０５９．１（バリアント３）を参照されたい）と、またはＴＣＩＲＧ１ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００６０４４．１（アイソフォームＡ）、ＮＰ＿００６０４４．１（アイソフォームＢ）、ＮＰ＿００１３３７９８８．１（アイソフォームＣ）を参照されたい）と、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、または全長にわたって、約９０％を超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、（２）ＴＣＩＲＧ１ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるＴＣＩＲＧ１ポリペプチド）、またはＴＣＩＲＧ１核酸（例えば、本明細書に記載されるＴＣＩＲＧ１ポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列、およびその保存的に修飾されたバリアント、を含む免疫原に対して産生される抗体、例えばポリクローナル抗体に結合し、（３）厳格なハイブリダイゼーション条件下で、ＴＣＩＲＧ１タンパク質をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖、およびその保存的に修飾されたバリアントに特異的にハイブリダイズし、（４）ＴＣＩＲＧ１核酸（例えば、本明細書に記載のＴＣＩＲＧ１ポリヌクレオチド、および本明細書に記載のＴＣＩＲＧ１ポリペプチドをコードするＴＣＩＲＧ１ポリヌクレオチド）と、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、または全長にわたって、約９０％超の、好ましくは約９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列、を有する。

ＴＣＩＲＧ１遺伝子は、２つの主要なアイソフォームを含むいくつかのタンパク質アイソフォームをコードする。全長アイソフォームａ（ＯＣ１１６）は、破骨細胞の細胞内コンパートメントおよび小器官のｐＨを含む、真核細胞の細胞内コンパートメントおよび小器官のｐＨの調節に関与する、液胞型Ｈ（＋）－ＡＴＰａｓｅのＡ３サブユニットをコードする。短いアイソフォームｂ（ＴＩＲＣ７）は、Ｔリンパ球の活性化および免疫反応において重要な役割を果たすＴ細胞特異的膜タンパク質をコードする。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連する「同一の」または「同一性」割合という用語は、以下の配列比較アルゴリズムを使用して、または手動のアライメントおよび目視検査を使用して測定される、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大相関性（ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）について比較および配列比較を行う場合、同じであるか、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する（すなわち参照配列、例えば、本明細書に記載のＴＣＩＲＧ１ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と、特定の領域にわたり、少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。その場合、そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の補完を指す。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域、例えば、５０、１００、２００、３００、４００アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域、または参照配列の全長にわたって存在する。

配列比較については、典型的には、一つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを使用する、または代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の割合を計算する。ＴＣＩＲＧ１核酸およびタンパク質に対する核酸およびタンパク質の配列比較については、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムおよびデフォルトパラメータが使用される。

本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２０～６００、通常では約５０～約２００、より通常では約１００～約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントへの参照を含み、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続位置の参照配列と比較されてもよい。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎの類似法の検索、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｌにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動のアライメントおよび目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照のこと）によって、実施することができる。配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）にそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて公開されている。

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、第２のポリペプチドに対し実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、二つの分子またはその相補体が、厳しい条件下で互いにハイブリダイズすることである。さらに、二つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅することができることである。

本明細書で使用される場合、「投与」は、局所投与および全身投与を指し、例えば、経腸投与、非経口投与、肺投与、および局所／経皮投与を含む。本明細書に記載の方法における使用を見出す化合物（例えば、１つ以上のＴＣＩＲＧ１アイソフォームをコードするポリヌクレオチド）の投与経路としては、対象に対して、例えば、経口（ｐｅｒ ｏｓ（Ｐ．Ｏ．））投与、経鼻または吸入投与、坐薬としての投与、局所接触、経皮的送達（例えば、経皮パッチを介して）、くも膜下腔内（ＩＴ）投与、静脈内（「ｉｖ」）投与、腹腔内（「ｉｐ」）投与、筋肉内（「ｉｍ」）投与、病巣内投与、または皮下（「ｓｃ」）投与、または徐放装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプの埋め込み、デポー製剤の投与等が挙げられる。投与は、非経口および経粘膜的（例えば、経口、鼻腔、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路によってもよい。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腎内、尿道内、心臓内、冠動脈内、心筋内、皮内、硬膜外、皮下、腹腔内、脳室内、イオン泳動（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）、および頭蓋内が含まれる。他の送達様式としては、限定されるものではないが、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が挙げられる。

用語「全身投与」および「全身投与される」は、化合物または組成物が循環系を介して、薬学的作用の標的部位を含む体内の部位に送達されるように、化合物または組成物を哺乳類に投与する方法を指す。全身投与には、限定されないが、経口、鼻腔内、直腸および非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮、および皮下などの消化管以外の）投与が含まれる。

用語「共投与」または「同時投与」は、例えば、化合物（例えば、ＴＣＩＲＧ１ポリヌクレオチド）および／またはその類似体ならびに別の活性剤に関して使用される場合、両方が生理学的効果を同時に達成できるように、化合物および／または類似体ならびに活性剤を投与することを指す。しかしながら、二つの薬剤は一緒に投与される必要はない。特定の実施形態では、一つの薬剤の投与は、他方の投与に先行することができる。同時生理学的効果は、必ずしも循環中の両方の薬剤の存在を同時に必要としない。しかしながら、特定の実施形態では、共投与は、典型的には、任意の所与の用量についてそれらの最大血清濃度のかなりの割合（例えば、２０％以上、例えば、３０％もしくは４０％以上、例えば、５０％もしくは６０％以上、例えば、７０％もしくは８０％もしくは９０％以上）で、両方の薬剤が体内（例えば、血漿中）に同時に存在する結果となる。

用語「有効量」または「医薬有効量」は、所望の結果、例えば、オートファジーの障害または欠乏を特徴とする疾患（例えば、ＩＭＯ）の最終的な重症度を低減させるのに十分な量の１つ以上のＴＣＩＲＧ１アイソフォームの発現の増加、をもたらすために必要な１つ以上の組成物（例えば、遺伝子療法ベクター、改変細胞）の量および／または投与量、および／または投与レジメンを指す。

「投与させること」という語句は、医療従事者（例えば、医師）、または対象の医療を管理する者が、対象に問題となる薬剤／化合物の投与を管理および／または許可する行為を指す。投与させることには、適切な治療または予防レジメンの診断および／または決定、ならびに／または対象に対する特定の薬剤／化合物の処方を伴いうる。こうした処方には、例えば、処方書の草案作成、医療記録の注釈付けなどが含まれうる。

本明細書で使用される場合、用語「治療する」および「治療」は、当該用語が適用される疾患もしくは病態、または当該疾患もしくは病態の１つ以上の症状のいずれかの発症を遅らせること、進行を遅らせることもしくは逆転させること、重症度を減少させること、または軽減する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）もしくは予防することを指す。用語「治療する」および「治療」はまた、疾患または病態の１つ以上の症状を予防する、軽減させる（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）、改善する、低減させる、抑制する、排除する、および／または逆転させることを含む。

用語「軽減させる」は、その病理または疾患の１つ以上の症状の低減または排除、および／またはその病理または疾患の１つ以上の症状の発症率の減少または発症もしくは重症度の遅延、および／またはその病理または疾患の予防を指す。特定の実施形態では、病理または疾患の１つ以上の症状の低減または排除は、例えば、ＴＣＩＲＧ１の１つ以上のアイソフォームの発現レベルの測定可能かつ持続的な増加を含み得る。

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という語句は、方法または組成物に列挙された活性医薬品の属または種を指し、さらに、それ自体は、列挙された表示または目的に対して実質的な活性を有しない他の薬剤を含み得る。

用語「対象」、「個体」、および「患者」は、哺乳類、好ましくはヒトまたは非ヒト霊長類であるが、家畜化された哺乳類（例えば、イヌまたはネコ）、実験哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）、および農業哺乳類（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）を互換的に指す。様々な実施形態において、対象は、ヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年男性、青年女性、男性子供、女性子供）であってもよい。

用語「遺伝子導入」または「遺伝子送達」は、外来ＤＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法またはシステムを指す。こうした方法は、組み込まれていない導入されたＤＮＡの一過性の発現、染色体外複製および導入されたレプリコン（例えばエピソーム）の発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡへの導入された遺伝物質の組み込みをもたらし得る。

用語「ベクター」は、本明細書において、別の核酸分子を導入または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。導入された核酸は、一般にベクター核酸分子に連結され、例えば、挿入される。ベクターは、細胞内の自律的複製または逆転写を方向付ける配列を含んでもよく、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。「ベクター」は遺伝子療法ベクターを含む。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法ベクター」は、例えば、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を対象に送達する、遺伝子療法の実施に使用できるベクターを指す。遺伝子療法ベクターは、治療的に活性なポリペプチド、例えば、ＴＣＩＲＧ１、または対象に導入された場合に置換遺伝子療法に有用な他の遺伝子をコードする核酸分子（「導入遺伝子」）を含み得る。有用なベクターには、ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「発現カセット」は、該発現カセットに組み込まれる治療的に活性なポリペプチド（例えば、ＴＣＩＲＧ１）をコードするポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の発現を駆動する適切な設定において能力を有するＤＮＡセグメントを指す。宿主細胞に導入されると、発現カセットは特に、導入遺伝子をＲＮＡに転写するように細胞の機構に指示することができ、その後ＲＮＡは、通常さらにプロセシングされ、最終的に治療活性ポリペプチドに翻訳される。発現カセットは、遺伝子療法ベクター内に含まれてもよい。一般に、発現カセットという用語は、５’から５’ＬＴＲおよび３’から３’ＬＴＲのポリヌクレオチド配列を除外する。

本明細書において参照および特定される全ての特許、特許刊行物、およびその他の刊行物は、参照によりその全体がすべての目的に対して個別におよび明示的に本明細書に組み込まれる。

実施例１：トランスファープラスミドの安定的増殖
最小限のＴＣＩＲＧ１発現カセットであるＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥ（配列番号１）を含む異なるプラスミドの安定性を試験した。アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）を有するプラスミド構築物ｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅ（図３Ｃ）は、プラスミドの低収率および不安定性を示す分解されたＤＮＡの一般的なスメア（ｓｍｅａｒ）によって示されるように（図３Ａ）、パッケージング細胞株へトランスフェクションする前にプラスミドを増殖させるために使用されるＥ．ｃｏｌｉ細胞における培養中に、予想外に不十分な増殖および不安定性を示した。様々な他のプラスミド骨格も不安定性を示した（データは示さず）。しかしながら、最小発現カセットＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥ（配列番号１）が、ｐＲＲＬベクターからＲＮＡ－ＯＵＴ配列を有するｐＣＣＬベクターにクローン化された場合（図３Ｃ）、得られたプラスミド構築物、ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅ（配列番号２７）は、Ｅ．ｃｏｌｉで増殖させた場合、予想外に良好な増殖および安定性を示した。これは、高収率のプラスミドおよび観察された制限消化パターンによって示された（図３Ｂ）。完全ベクター配列は、配列番号２７として提供され、各ベクター要素の位置は表２に提供される。

（表２）ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅベクター要素

レンチウイルスベクターは、パッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ ΔＲ８．９１）、およびエンベローププラスミド（ＶＳＶ－Ｇ ｐＭＤＧ）と共に、２９３Ｔ細胞へのｐＣＣＬ／ＲＮＡ－ＯＵＴベクターの一過性トランスフェクションによって産生され、図４に示されるプロトコルによって産生された。

実施例２：ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅを用いたＩＭＯ患者からの破骨細胞の骨吸収機能の回復
本実施例は、患者由来ＨＳＣにおけるレンチウイルス介在性ＴＣＩＲＧ１遺伝子導入のためのｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅの使用を示す。ＨＳＣは、実施例１に記載されるｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅを担持するレンチウイルス粒子を用いて取得され、増殖し、および形質導入されて、遺伝子改変ＨＳＣが取得される。注入後、遺伝子改変されたＨＳＣは破骨細胞に分化する。使用される方法は、基本的にＭｏｓｃａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２９：９３８～９４９（２０１７）に記載されている。

ＩＭＯ患者由来の末梢血または正常分娩由来の臍帯血（ＣＢ）の試料が取得される。これらの供給源由来の単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心分離を使用して単離され、ＣＤ３４＋細胞は、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単核細胞画分から分離される。増殖のために、細胞を、ヒト組換えサイトカインＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦｌｔ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）を含むＳＦＥＭ ＳｔｅｍＳｐａｎ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）中で培養する。ＣＤ３４＋細胞は、２４ウェルの細菌学的プレートを使用して１ｍｌの培地中に５×１０^４細胞の密度で播種し、３７℃で１週間インキュベートした後、収集し、１×１０^５／ウェルの密度で再播種する。７日目から、培地を、２～３日ごとに半枯渇（ｄｅｍｉ－ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）により交換する。移植については、ＣＤ３４＋細胞を、ヒト組換えサイトカインであるＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびＴＰＯ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）を含むＳＦＥＭ ＳｔｅｍＳｐａｎ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バンクーバー、ＢＣ）中で３０時間培養する。

形質導入は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（タカラバイオ、大津、日本）で被覆された２４ウェルプレートで実施される。インビトロ実験では、３日目にＣＤ３４＋細胞を、３０の感染多重度（ＭＯＩ）での第１回目のヒットで６時間形質導入し、および７日目にＭＯＩ ３０での２回目のヒットで６時間形質導入し、続いて骨髄性サイトカインカクテルで１週間培養し、その後に破骨細胞に分化させた。インビボ実験では、ＣＤ３４＋集団の幹／前駆細胞の性質を維持しながら効率的な形質導入を可能するため、短い形質導入プロトコルが使用される。単核細胞は単離され、１回目のヒット（ＭＯＩ３０または１００）を一晩、形質導入され、その後、２回目のヒット（ＭＯＩ３０または１００）で６時間、翌日に形質導入され、その後、細胞を対象（マウスまたはヒト患者）に移植する準備が整う。

破骨細胞形成は、５０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬの存在下で約１０日間、分化させた後、細胞のさらなる分析のため４％ホルムアルデヒドによる細胞の固定またはウェスタンブロット分析のための細胞の溶解することによって評価できる。吸収は、ｃ末端Ｉ型コラーゲン断片（ＣＴＸ－Ｉ）の放出、およびＣａ２＋の培地への放出に対するアッセイ、および固定細胞のヘマトキシリン染色を使用した吸収ピットの形成の可視化によって評価される。

動物試験では、形質導入された破骨細胞がＮＳＧマウスに移植される。８～１５週齢のＮＳＧマウスを、３００ｃＧｙで亜致死的に照射し、６時間後に、尾静脈注射により、ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅに由来するレンチウイルス粒子を形質導入された１×１０^５個の非形質導入ＣＢ ＣＤ３４＋細胞またはＩＭＯ ＣＤ３４＋細胞を移植する。マウスは、移植後感染を避けるために、２週間、飲料水を介してシプロフロキサシンを投与される。末梢血は、異なる時点で採取されて、骨髄細胞は、マウスの終了後、大腿骨を乳鉢で粉砕することによって採取される。

ベクターコピー数解析は、移植の９～１９週間後にマウスから採取されたサンプルからの全骨髄ゲノムＤＮＡに対して実施される。移植されたＮＳＧマウスの末梢血および骨髄は、ｈｕＣＤ４５－ＡＰＣ陽性細胞の割合を決定することによってヒト再構成について分析される。系統解析については、細胞を、ＣＤ３３－ＰｅＣｙ７、ＣＤ１５－ＰｅＣｙ７、ＣＤ１９－ＢＶ６０５、およびＣＤ３－ＰＥに対する抗体で染色した。

上述の方法は、レンチウイルス介在性ＴＣＩＲＧ１遺伝子導入および形質導入されたＣＤ３４＋細胞の長期生着後のＩＭＯ患者からの破骨細胞の吸収機能の回復を確認するために使用される。

実施例３：臨床的に確立された遺伝子導入プロトコルを使用したヒトＣＤ３４＋に富む細胞のインビトロ遺伝子導入
本実施例は、（１）生存ＣＤ３４^＋細胞％および多系統分化能による形質導入ＣＤ３４^＋細胞の表現型の特徴付け、および（２）ベクターコピー数（液体培養およびコロニーの両方におけるＶＣＮ決定）による、実施例１に記載のプラスミドを使用した、ＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥ（配列番号２５または２７）のＧＭＰ前（ｐｒｅ－ＧＭＰ）バッチの適合性を示す。

ＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥを用いた形質導入後のｍＰＢ ＣＤ３４＋細胞の保存された表現型および多系統能力
ＧＭＰ前のＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥバッチの性能を、他の障害の治療のために産生されたＬＶ（４つのバッチ）と比較した。動員されたＰＢ ＣＤ３４^＋細胞を、想定されたＩＭＯ臨床試験で同様に標的細胞として使用した。様々なＭＯＩを試験した。形質導入の２０時間後に高細胞生存率（＞９５％）、すべてのベクターおよび試験されたＭＯＩにわたって得られ、短期毒性がないことを示した。ＣＤ３４^＋細胞の割合は、形質導入の直後に試験されたすべての条件で非常に高く（＞９７％）、液体培養の２日後、このタイプの培養で予想されるように、すべての条件において同等のレベルで時間の経過と共に次第に失われた。

形質導入されたＣＤ３４^＋細胞の多系統能力を、半固体メチルセルロース培地培養物中の分化ＣＦＵの定量化によって評価した。赤血球系および骨髄系を説明する、総ＣＦＵならびにＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、およびＣＦＵ－ＧＥＭＭを評価した。ＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥの存在は、モック対照と比較して、実験条件間でそれらの総数に有意差が観察されなかったため、ＣＦＵ増殖に影響を与えなかった。いずれのコロニー型においてもモックと比較して差異は観察されなかったため、高いＭＯＩ値であってもＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥを用いた形質導入後のインビトロでの多系統能力の維持が確認された。

ＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥは、ｍＰＢ ＣＤ３４^＋細胞の高い形質導入効率を示す
治療の使用に適した形質導入効率を提供するために必要なＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥのベクター用量を決定するために、確立された臨床形質導入プロトコルを使用してレンチウイルスベクターを試験した。形質導入されたＣＤ３４^＋細胞を、ＶＣＮ評価前にエピソームＬＶゲノムコピーの細胞クリアランスを可能にするため、最大１２日間液体培養中で維持した。高いＶＣＮ／細胞値は、用量依存性のＩＭＯベクターで得られた。用量増加の効果は、試験されたすべてのベクターにわたって一貫しており、同じＭＯＩで形質導入すると、ＬＡＤ－ＩおよびＦＡベクターよりもＩＭＯベクターのＶＣＮ／細胞値が高く、（図５Ａ－５Ｂ）を示す。ＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥの高い形質導入効果を示す。

また、ＶＣＮ／細胞は、表現型に応じて単離されたＣＦＵ（ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、またはＣＦＵ－ＧＥＭＭ）でも評価され、さまざまな前駆細胞における形質導入を確認した。ＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥは、両方のドナーからの細胞においてより高いコロニーＶＣＮ値を示した。液体培養の結果と同様に、ＩＭＯベクターを用いた形質導入の結果と同様に、高い形質導入効率をもたらし、およびメチルセルロース培地中で培養されたコロニーのＶＣＮ／細胞をもたらした。

さまざまなＣＦＵタイプ（ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、およびＣＦＵ－ＧＥＭＭ）におけるＶＣＮパターンは、他のベクターと類似しており、Ｃｈａｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：４７９－４８７（２０１１）で以前に説明されているように、赤血球コロニーで通常みられる最も高い値であることがわかった。

ＩＭＯベクターＥＦＳ－ＴＣＩＲＧ１－ＷＰＲＥは、レンチウイルスの臨床ロットと同等のレベルでヒトＣＤ３４^＋細胞に形質導入される。高い形質導入効率が達成されている間に、ＣＤ３４^＋細胞の表現型および多系列の能力は保存された。ＩＭＯベクターは、対照ベクターよりも低いＭＯＩで成功裏に実行され、ＩＭＯ患者の遺伝子療法での使用に対するその適合性が実証された。

これらの研究は、ＶＣＮおよび形質導入効率が、インビボ遺伝子改変造血細胞の補正レベルに匹敵する効率を達成し、ＴＣＩＲＧ１の変異による乳児性悪性大理石骨病の治療においてこの遺伝子療法の使用を可能にすることを実証した。

Claims (70)

1. Ｔ細胞免疫調節因子１（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ １）（ＴＣＩＲＧ１）のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするコードポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む発現カセットを含む、トランスファープラスミドであって、前記ポリヌクレオチドが、前記プロモーターに動作可能に連結されており、前記トランスファープラスミドが、ＲＮＡ－ＯＵＴリプレッサーおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターを含む、トランスファープラスミド。
2. 前記ＲＮＡ－ＯＵＴリプレッサーが、配列番号３２と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項１に記載のトランスファープラスミド。
3. 前記ＣＭＶ ＩＥプロモーターが、配列番号３３と少なくとも９５％の同一性または少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項１または請求項２に記載のトランスファープラスミド。
4. ｐＣＣＬ骨格を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のトランスファープラスミド。
5. 前記ｐＣＣＬ骨格が、前記ＲＮＡ－ＯＵＴリプレッサーを含む、請求項４に記載のトランスファープラスミド。
6. 配列番号３９と少なくとも９５％または１００％の同一性を共有する、請求項５に記載のトランスファープラスミド。
7. 前記プロモーターがＥＦＳプロモーターである、請求項１～７のいずれか一項に記載のトランスファープラスミド。
8. 前記ＥＦＳプロモーターが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項７に記載のトランスファープラスミド。
9. 前記ＥＦＳプロモーターが配列番号２である、請求項８に記載のトランスファープラスミド。
10. 前記コードポリヌクレオチドが、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のトランスファープラスミド。
11. 前記コードポリヌクレオチドが、配列番号３と少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項１０に記載のトランスファープラスミド。
12. 前記コードポリヌクレオチドが配列番号３である、請求項１１に記載のトランスファープラスミド。
13. 前記発現カセットが、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のトランスファープラスミド。
14. 前記ＷＰＲＥが配列番号４である、請求項１３に記載のトランスファープラスミド。
15. 前記発現カセットが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のトランスファープラスミド。
16. 前記発現カセットが、５’長末端反復配列（ＬＴＲ）および３’ＬＴＲと隣接している、請求項１～１５のいずれか一項に記載のトランスファープラスミド。
17. 前記５’ＬＴＲが配列番号３４であり、かつ／または前記３’ＬＴＲが配列番号２８である、請求項１６に記載のトランスファープラスミド。
18. 発現カセットが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のトランスファープラスミド。
19. 発現カセットが配列番号１である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のトランスファープラスミド。
20. 請求項１～２０のいずれか一項に記載のトランスファープラスミドを宿主細胞にトランスフェクトすることによって産生された、レンチウイルス粒子。
21. Ｔ細胞免疫調節因子１（ＴＣＩＲＧ１）のアイソフォームまたはその機能的バリアントをコードするコードポリヌクレオチドと、ＥＦＳプロモーターとを含む、発現カセットであって、前記ポリヌクレオチドが前記ＥＦＳプロモーターに動作可能に連結されている、発現カセット。
22. 前記コードポリヌクレオチドが、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１に記載の発現カセット。
23. 前記コードポリヌクレオチドが、配列番号３と少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項２に記載の発現カセット。
24. 前記コードポリヌクレオチドが配列番号３である、請求項３に記載の発現カセット。
25. 前記ＥＦＳプロモーターが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の発現カセット。
26. 前記ＥＦＳプロモーターが配列番号２である、請求項２５に記載の発現カセット。
27. ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の発現カセット。
28. 前記ＷＰＲＥが配列番号４である、請求項２７に記載の発現カセット。
29. 配列番号１と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の発現カセット。
30. 配列番号１である、請求項２９に記載の発現カセット。
31. 組換えレンチウイルスゲノムであって、５’から３’の順序で、
    （ａ）レンチウイルス５’長末端反復配列（ＬＴＲ）と、
    （ｂ）請求項２１～３０のいずれか一項に記載の発現カセットと、
    （ｃ）レンチウイルス３’ＬＴＲと
    を含み、複製能力を有しない、組換えレンチウイルスゲノム。
32. 請求項３１に記載の組換えレンチウイルスゲノムを含む、トランスファープラスミド。
33. 請求項３１に記載の組換えレンチウイルスゲノムを含む、レンチウイルス粒子。
34. 請求項３３に記載のレンチウイルス粒子を含む、医薬組成物。
35. 請求項２１～３０のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、改変細胞。
36. 請求項３１に記載の組換えレンチウイルスゲノムを含む、改変細胞。
37. 内因性機能性ＴＣＩＲＧ１遺伝子を欠く、請求項３６に記載の改変細胞。
38. 乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）を有するかまたは有する疑いがある対象に由来する、請求項３６または３７に記載の改変細胞。
39. 機能性ＴＣＩＲＧ１遺伝子を有する破骨細胞において観察されるＴＣＩＲＧ１の発現レベルに類似したレベルで、ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の改変細胞。
40. ＩＭＯを有していないかまたは有する疑いのない対象に由来する破骨細胞において観察されるＴＣＩＲＧ１の発現レベルに類似したレベルで、ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の改変細胞。
41. 造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の改変細胞。
42. ＣＤ３４＋前駆細胞である、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の改変細胞。
43. 任意選択的にＧ－ＣＳＦ、プレリキサホル（ｐｌｅｒｉｆａｘｏｒ）、またはＧ－ＣＳＦとプレリキサホルの組み合わせの投与によるＨＳＣの動員後に、ＩＭＯを有するかまたは有する疑いがある対象からアフェレーシスによって単離されたＨＳＣに由来する、請求項４１または４２のいずれかに記載の改変細胞。
44. 磁気捕捉によりＣＤ３４＋細胞が濃縮された細胞の集団に由来する、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の改変細胞。
45. 請求項３５～４４のいずれか一項に記載の改変細胞を含む、医薬組成物。
46. ＩＭＯを有するかまたは有する疑いがある対象の１つ以上の細胞を改変するインビトロでの方法であって、
    （ａ）Ｇ－ＣＳＦ、プレリキサホル、またはＧ－ＣＳＦとプレリキサホルの組み合わせを含む組成物を前記対象に投与することによって前記対象から動員された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を提供することと、
    （ｂ）磁気分離によって前記ＰＢＭＣからＣＤ３４＋細胞を濃縮し、ＣＤ３４に富む細胞の集団を生成することと、
    （ｃ）前記ＣＤ３４に富む細胞を、５’から３’の順序で
    （ｉ）レンチウイルス５’長末端反復配列（ＬＴＲ）、
    （ｉｉ）請求項２１～３０のいずれか一項に記載の発現カセット、および
    （ｉｉｉ）レンチウイルス３’ＬＴＲ
    を含む組換えレンチウイルスゲノムを含むレンチウイルス粒子と接触させることと
    を含み、前記組換えレンチウイルスゲノムが複製能力を有しない、方法。
47. 乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）を有するかまたは有する疑いがある対象においてＩＭＯを治療する方法であって、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の改変細胞または請求項４５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
48. ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する改変細胞をＨＳＣニッチに再配置させる、請求項４７に記載の方法。
49. ＴＣＩＲＧ１またはその機能的バリアントを発現する改変細胞を破骨細胞ニッチに再配置させる、請求項４７または４８に記載の方法。
50. ＩＭＯを治療する、改善する、予防する、低減させる、阻害する、または緩和する、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 治療された対象の平均全生存期間を、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、またはそれ以上、延長させる、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. ＩＭＯによる前記対象の死を予防する、請求項４７～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記対象がヒトである、請求項４７～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記対象が、治療前にＩＭＯの症状を呈した、請求項４７～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記対象が、治療前にＴＣＩＲＧ１の発現の減少または検出不能な発現を有すると特定された、請求項４７～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記対象が、変異ＴＣＩＲＧ１遺伝子を有すると特定された、請求項４７～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記対象が、乳児である、請求項４７～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 自家治療を含む、請求項４７～５７のいずれか一項に記載の方法。
59. 投与が、静脈内注入を介して実施される、請求項４７～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）を治療または予防するための薬剤の調製における使用のための組換えレンチウイルスゲノムであって、前記レンチウイルスゲノムが、５’から３’の順序で、
    （ｉ）レンチウイルス５’長末端反復配列（ＬＴＲ）と、
    （ｉｉ）請求項２１～３０のいずれか一項に記載の発現カセットと、
    （ｉｉｉ）レンチウイルス３’ＬＴＲと
    を含み、前記組換えレンチウイルスゲノムが複製能力を有しない、組換えレンチウイルスゲノム。
61. 組換えレンチウイルスゲノムを含む、乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）を治療または予防するための薬剤の調製における使用のためのレンチウイルス粒子であって、
    前記レンチウイルスゲノムが、５’から３’の順序で、
    （ｉ）レンチウイルス５’長末端反復配列（ＬＴＲ）と、
    （ｉｉ）請求項２１～５０のいずれか一項に記載の前記発現カセットと、
    （ｉｉｉ）レンチウイルス３’ＬＴＲと
    を含み、前記組換えレンチウイルスゲノムが複製能力を有しない、レンチウイルス粒子。
62. 請求項２４～３０のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、トランスファープラスミド。
63. ＲＮＡ－ＯＵＴ配列をさらに含む、請求項６２に記載のトランスファープラスミド。
64. 前記ＲＮＡ－ＯＵＴ配列が配列番号２２である、請求項６３に記載のトランスファープラスミド。
65. 前記ＲＮＡ－ＯＵＴ配列が、前記トランスファープラスミドがパッケージング細胞株において安定的に増殖することができるように構成されている、請求項６２または請求項６３に記載のトランスファープラスミド。
66. レンチウイルス粒子を産生する方法であって、トランスファープラスミドが複製するように、請求項１～１９または請求項６２～６５のいずれか一項に記載のトランスファープラスミドを用いて細菌細胞を形質転換することと、複製した前記トランスファープラスミドを単離することと、複製した前記トランスファープラスミドおよび任意選択的に１つ以上の追加のプラスミドをパッケージング細胞株に形質導入ことと、を含み、それによって前記レンチウイルス粒子が産生される、方法。
67. 請求項１～１９または請求項６２～６５のいずれか一項に記載のトランスファープラスミドおよび任意選択的に１つ以上の追加のプラスミドをパッケージング細胞株にトランスフェクトすることと、前記パッケージング細胞株を培養することと、を含む、レンチウイルス粒子を産生する方法。
68. 前記トランスファープラスミドが安定的に増殖する、請求項６７に記載の方法。
69. 前記トランスファープラスミドが、振とうフラスコまたは少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日間の発酵を使用して、細菌宿主において３０～３７℃で安定的に増殖する、請求項６８に記載の方法。
70. 請求項６６～６９のいずれか一項に記載の方法に従って産生された、レンチウイルス粒子。

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