JP2022532214A - メッセンジャーｒｎａの精製方法 - Google Patents

メッセンジャーｒｎａの精製方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、特に、いかなる苛性または可燃性の溶媒も使用することなく、臨床使用に適した高品質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製するための方法を提供する。本発明は、部分的には、ｍＲＮＡの完全性およびｍＲＮＡの高純度を維持しながら、エタノールを使用することなく、選択的な沈殿および洗浄によってｍＲＮＡを上手く精製することができるという驚くべき発見に基づく。したがって、本発明は、いかなる苛性溶媒または可燃性溶媒も使用することなく、大規模な製造プロセス治療用途からＲＮＡを精製する、効果的で、信頼性があり、かつ安全な方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月１５日に出願された米国仮出願第６２／８４８，４１２号および２０１９年８月２６日に出願された同第６２／８９１，７８１号に対する優先権を主張するものであり、これらのそれぞれは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）療法は、様々な疾患の治療にとってますます重要なアプローチとなりつつある。ｍＲＮＡ療法は、治療を必要とする患者へのインビトロ転写した（ＩＶＴ）および高純度のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む医薬品の投与、および患者の体内のｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生が含まれる。したがって、治療用途に適した高純度のｍＲＮＡ産物の効率的で大規模な生産に対するニーズがある。
従来、インビトロ転写から産生されたｍＲＮＡは、市販のクロマトグラフィーシステム、例えばＨＰＬＣを用いて、および／または有機混合物（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）への抽出およびその後のエタノール沈殿によって精製される。しかしながら、カラムシステムの使用は高価かつ困難であり、ｍＲＮＡの抽出における苛性溶媒または可燃性溶媒の使用は、特に大規模な用途において、安全性およびコスト上の課題を呈することがある。
治療用途に許容可能な高純度のｍＲＮＡを産生する、安全で費用効果の高い方法は、現在のところない。
本発明は、とりわけ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する非常に効率的で費用効果の高い方法を提供する。本発明は、部分的に、少量の揮発性有機化合物を使用してまたは揮発性有機化合物を使用せずにｍＲＮＡを精製する方法の驚くべき発見に基づいており、高完全性および高純度のｍＲＮＡをもたらす。したがって、一態様では、本発明は、いかなる苛性または可燃性の溶媒も使用することなく、大規模な製造プロセスの治療用途に使用することができるｍＲＮＡを精製するより効果的で、信頼性があり、かつ安全な方法を提供する。
一部の態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する方法であって、ａ）高モル塩溶液および両親媒性ポリマーを含む懸濁液中でｍＲＮＡを沈殿させて、沈殿したｍＲＮＡを提供することと、ｂ）沈殿したｍＲＮＡを捕捉することと、ｃ）工程ｂ）で捕捉された沈殿したｍＲＮＡを洗浄溶液で洗浄して、沈殿したｍＲＮＡを精製することと、ｄ）工程ｃ）からの沈殿したｍＲＮＡを可溶化溶液で可溶化して、精製されたｍＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、短鎖不全型（ｓｈｏｒｔ ａｂｏｒｔｉｖｅ）ＲＮＡ種、長鎖不全型（ｌｏｎｇ ａｂｏｒｔｉｖｅ）ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む混入物が実質的に存在しない。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、短鎖不全型ＲＮＡ種を含む混入物を実質的に含まない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物は、約１％未満の短鎖不全型ＲＮＡ種を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、長鎖不全型ＲＮＡ種を含む混入物が実質的に存在しない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物は、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって決定される場合、約５５％以下の長鎖不全型／分解種を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む混入物を実質的に含まない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物は、１％未満の二本鎖ＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、残留プラスミドＤＮＡを含む混入物を実質的に含まない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物は、１０ｐｇ／ｍｇ以下の残留プラスミドＤＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製ｍＲＮＡ組成物は、残留インビトロ転写酵素を含む混入物を実質的に含まない。例えば、精製されたｍＲＮＡ組成物１５μｇに対して、０．３ｎｇ未満のポリメラーゼである。精製されたｍＲＮＡ組成１５μｇに対して、０．３ｎｇ未満のキャップ酵素である。精製されたｍＲＮＡ組成物１５μｇに対して、０．３ｎｇ未満のテール酵素である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、残留溶媒を含む混入物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物は、残留塩を含む混入物を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１０ｐｇ／ｍｇ精製ｍＲＮＡ以下の残留プラスミドＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエーテル、例えばポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）もしくはポリプロピレンオキシド、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、プルロニックである。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドンである。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリビニルアルコールである。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリエーテルである。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）である。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ポリプロピレンオキシドである。
いくつかの実施形態では、懸濁液は有機溶媒を含まない。いくつかの実施形態では、懸濁液中の両親媒性ポリマーは、ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、懸濁液は有機溶媒を含まず、ｍＲＮＡはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して沈殿させる。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ｍＲＮＡを沈殿させるためのＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度でＰＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、約５０重量／体積％の濃度でＰＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、２５重量／体積％未満でＰＥＧの最終濃度を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約５重量／体積％～２０重量／体積％でＰＥＧの最終濃度を含む。特定の実施形態では、懸濁液は、約１０重量／体積％～１５重量／体積％の、例えば１２重量／体積％でＰＥＧの最終濃度を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約２０００～約１００００ｇ／ｍｏｌである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約４０００～約８０００ｇ／ｍｏｌである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）である。実施例に示されるように、約１２重量／体積％の懸濁液中の約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－６０００）の最終濃度が、効果的な精製を確保し、非常に純粋なｍＲＮＡ試料を提供する。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、有機溶媒を含まず、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度でＴＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、約５０重量／体積％の濃度でＴＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、有機溶媒を含まず、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度でＭＴＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、約５０重量／体積％の濃度でＭＴＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、約１５重量／体積％～約４５重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２０重量／体積％～約４０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２５重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約３０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約３５重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、高モル塩溶液は、チオシアン酸グアニジニウム（ＧＳＣＮ）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＣＮは、約２～４Ｍの最終濃度である。いくつかの実施形態では、ＧＳＣＮは、２．５～３Ｍの最終濃度である。特定の実施形態では、ＧＳＣＮは約２．７Ｍの最終濃度である。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエーテル、例えばポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）もしくはポリプロピレンオキシド、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、プルロニックである。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドンである。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、ポリビニルアルコールである。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールエーテル（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、ポリエーテルである。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、ポリプロピレンオキシドである。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、有機溶媒を含まない。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、有機溶媒を含まず、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、９０センチストローク（ｃｅｎｔｉｓｔｒｏｋｅｓ）以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、８０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、７０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、６０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、５０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、４０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、３０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、２０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、１０センチストローク以下の粘度を有する。洗浄溶液での使用に適したＰＥＧは、ＰＥＧ－４００などの２５℃で約９０センチストロークの粘度を有する。したがって、特定の実施形態では、洗浄溶液に使用されるＰＥＧは、ＰＥＧ－４００である。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、有機溶媒を含まず、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、溶媒はＴＨＧを含む。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、有機溶媒を含まず、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、溶媒はＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＧは、洗浄溶液中に約９０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度で存在する。特定の実施形態では、ＭＴＥＧは、洗浄溶液中に約９５重量／体積％の濃度で存在する。
実施例に示されるように、ＭＴＥＧは、洗浄溶液での使用に適しており、沈殿したｍＲＮＡを、沈殿した形態で保持しながら、効果的に洗浄する。ＭＴＥＧは、室温で約７センチストロークの粘度を有する。したがって、ＭＴＥＧは、使用される精製プロセス（例えば、フロー濾過、深層濾過または遠心分離）に関係なく、ｍＲＮＡの非常に効率的な精製および回収を可能にする。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液中の両親媒性ポリマーは、ＰＥＧである。特定の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧの分子量は、約２００ｇ／ｍｏｌ～約６００ｇ／ｍｏｌである。特定の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、約４００ｇ／ｍｏｌの分子量（例えば、ＰＥＧ－４００）を有する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約５０～約９０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約９０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約９０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。特定の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、約４００ｇ／ｍｏｌの分子量（例えば、ＰＥＧ－４００）を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、約４００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－４００）の分子量を有し、約９０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度である。特定の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、約４００ｇ／ｍｏｌの分子量（例えば、ＰＥＧ－４００）を有し、約９０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧの分子量は、約２００～約４０，０００ｇ／ｍｏｌである。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧの分子量は、約２００～約４０，０００ｇ／ｍｏｌである。いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄溶液の両方のＰＥＧの分子量は、約２００～約４０，０００ｇ／ｍｏｌである。特定の実施形態では、懸濁液中のＰＥＧの分子量は、約２，０００ｇ／ｍｏｌ～約１０，０００ｇ／ｍｏｌであり、洗浄溶液中のＰＥＧの分子量は、約２００ｇ／ｍｏｌ～約６００ｇ／ｍｏｌである。特定の実施形態では、懸濁液中のＰＥＧはＰＥＧ－６０００であり、洗浄溶液中のＰＥＧはＰＥＧ－４００である。
いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧは、線状である。いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧは、分岐状である。いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧは、Ｙ字形状である。いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧは、マルチアーム形状である。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、線状である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、分岐状である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、Ｙ字形状である。いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、マルチアーム形状である。
いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄溶液の両方のＰＥＧは、線状である。いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄溶液の両方のＰＥＧは、分岐状である。いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄溶液の両方のＰＥＧは、Ｙ字形状である。いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄溶液の両方のＰＥＧは、マルチアーム形状である。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、およびＰＥＧ４０，０００から選択されるＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、トリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、テトラエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ２００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ３００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ４００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ６００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ１，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ１，５００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ２，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ３，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ３，３５０を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ４，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ６，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ８，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ１０，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ２０，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ３５，０００を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ４０，０００を含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ６，０００を含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ６，０００を含まない。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ４００である。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、ＰＥＧ１５０である。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、１つ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧポリマーの混合物は、別個の分子量を有するポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧポリマーの混合物は、別個の幾何学的形状を有するポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は水性である。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の約５０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。例えば、いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．０１％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。したがって、いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の約５０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の４５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の４０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の３５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の３０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の２５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の２０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の１５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の１０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の２％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の１％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の０．５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、懸濁液の総体積の０．１％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。多くの揮発性有機化合物は当該技術分野で公知であり、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、およびベンジルアルコールを含む。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、揮発性有機化合物を含まない。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、アルコールを含まない。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、エタノールを含まない。いくつかの実施形態では、懸濁液は、イソプロピルアルコールを含まない。いくつかの実施形態では、懸濁液は、ベンジルアルコールを含まない。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、非水性成分を含む。いくつかの実施形態では、懸濁液の非水性成分は、エタノールである。いくつかの実施形態では、懸濁液の非水性成分は、イソプロピルアルコールである。いくつかの実施形態では、懸濁液の非水性成分は、ベンジルアルコールである。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、およびＰＥＧ４０，０００から選択されるＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、トリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、テトラエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ２００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ３００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ４００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ６００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ１，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ１，５００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ２，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ３，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ３，３５０を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ４，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ６，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ８，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ１０，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ２０，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ３５，０００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ４０，０００を含む。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ６，０００を含む。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ６，０００を含まない。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、ＰＥＧ４００である。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、１つ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧポリマーの混合物は、別個の分子量を有するポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧポリマーの混合物は、別個の幾何学的形状を有するポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は水性である。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、揮発性有機化合物を含まない。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液はアルコールを含まない。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の約５０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。例えば、いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．０１％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。したがって、いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の約５０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の４５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の４０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の３５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の３０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の２５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の２０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の１５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の１０％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の２％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の１％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の０．５％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、洗浄溶液の総体積の０．１％未満を構成する揮発性有機化合物を有する。多くの揮発性有機化合物は当該技術分野で公知であり、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、およびベンジルアルコールを含む。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液はエタノールを含まない。いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、イソプロピルアルコールを含まない。いくつかの実施形態では、洗浄溶液はベンジルアルコールを含まない。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、非水性成分を含む。いくつかの実施形態では、洗浄溶液の非水性成分は、エタノールである。いくつかの実施形態では、洗浄溶液の非水性成分は、イソプロピルアルコールである。いくつかの実施形態では、洗浄溶液の非水性成分は、ベンジルアルコールである。
いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄緩衝液の両方が水性である。いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄緩衝液の両方が、ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄緩衝液の両方が、水性であり、同じＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液および洗浄緩衝液の両方が、水性であり、懸濁液は第１のＰＥＧを含み、洗浄緩衝液は第１のＰＥＧとは異なる第２のＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧの分子量は、約２０００～約１００００ｇ／ｍｏｌであり、洗浄緩衝液中のＰＥＧの分子量は、約２００～６００ｇ／ｍｏｌである。いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧの分子量は、約４０００～約８０００ｇ／ｍｏｌであり、洗浄緩衝液中のＰＥＧの分子量は、約３００～５００ｇ／ｍｏｌである。いくつかの実施形態では、懸濁液中のＰＥＧの分子量は、約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）であり、洗浄緩衝液中のＰＥＧの分子量は、約４００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－４００）である。
いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの捕捉は、フィルタ上で起こる。いくつかの実施形態では、フィルタは、精密濾過フィルタまたは限外濾過フィルタから選択される。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．０５μｍ～１．０μｍの細孔サイズを有する。例えば、いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．０５μｍ、０．１０μｍ、０．２０μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、または１．０μｍの細孔サイズを有する。したがって、いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．０５μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．１０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．２０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．３０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、微細濾過フィルタは、０．４０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．５０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．６０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．７０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．８０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、０．９０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、１．０μｍの細孔サイズを有する。
いくつかの実施形態では、フィルタは、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａの公称分子量限界（ｎｏｍｉｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｌｉｍｉｔ）（ＮＭＫＬ）を有することになる。いくつかの実施形態では、フィルタは、２００ｋＤａ～７００ｋＤａのＮＭＷＬを有することになる。いくつかの実施形態では、フィルタは、２００ｋＤａ～５００ｋＤａのＮＭＷＬを有することになる。いくつかの実施形態では、フィルタは、３００ｋＤａのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、フィルタは、５００ｋＤａのＮＭＷＬを有する。
いくつかの実施形態では、精密濾過フィルタは、１，０００キロダルトン（ｋＤａ）を超える公称分子量制限（ＮＭＫＬ）を有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、０．０５μｍ未満の細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、約１ｋＤａ～１，０００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。例えば、いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、１ｋＤＡ、５ｋＤＡ、１０ｋＤＡ、１５ｋＤＡ、２０ｋＤＡ、２５ｋＤＡ、５０ｋＤＡ、１００ｋＤＡ、１５０ｋＤＡ、２００ｋＤＡ、２５０ｋＤＡ、３００ｋＤＡ、３５０ｋＤＡ、４００ｋＤＡ、４５０ｋＤＡ、５００ｋＤＡ、５５０ｋＤＡ、６００ｋＤＡ、６５０ｋＤＡ、７００ｋＤＡ、７５０ｋＤＡ、８００ｋＤＡ、８５０ｋＤＡ、９００ｋＤＡ、９５０ｋＤＡ、または１，０００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。したがって、いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、１ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、５ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、１０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、１５ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、２０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、２５ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、１００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、１５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、２００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、２５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、３００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、３５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、４００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、４５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、５００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、５５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、６００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、６５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、７００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、７５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、８００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、８５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、９００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、９５０ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。いくつかの実施形態では、限外濾過フィルタは、１，０００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する。
いくつかの実施形態では、工程ｃ）で沈殿したｍＲＮＡを精製するために、接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）または透析濾過が使用される。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＦＦは、工程ｃ）で沈殿したｍＲＮＡを精製するために使用される。いくつかの実施形態では、透析濾過を使用して、工程ｃ）で沈殿したｍＲＮＡを精製する。
いくつかの実施形態では、濾過助剤が使用される。
いくつかの実施形態では、濾過助剤はセルロース系である。特定の実施形態では、セルロース系濾過助剤は、１：１０の濾過助剤に対する沈殿したｍＲＮＡの質量比で懸濁液に加えられる。いくつかの実施形態では、セルロース系濾過助剤は、約５～約５００μｍの長さの精製セルロース繊維を含む。いくつかの実施形態では、セルロース繊維の長さは約１０～約１００μｍである。いくつかの実施形態では、セルロース繊維は約２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、または５０μｍの長さである。特定の実施形態では、セルロース系濾過助剤は、約２０μｍの長さの精製セルロース繊維（例えば、Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標）またはＳｉｇｍａｃｅｌｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ２０）を含む。
いくつかの実施形態では、濾過助剤は、珪藻土、および／または火山灰を含む。いくつかの実施形態では、濾過助剤は、珪藻土を含む。いくつかの実施形態では、濾過助剤は、火山灰を含む。いくつかの実施形態では、濾過助剤は、珪藻土および火山灰を含む。
いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、水、トリス－ＥＤＴＡ（ＴＥ）、クエン酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、水である。いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、ＴＥである。いくつかの実施形態では、可溶化溶液は、クエン酸ナトリウムである。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの収率は、約５０％～約１００％である。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの収率は、約７０％～約９９％である。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの収率は、約９０～約９９％である。特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの収率は、約９３％超、例えば、約９４％超、特に約９５％超である。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は、約６０％～約１００％である。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は、約８０％～９９％である。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は、約９０％～約９９％である。
いくつかの実施形態では、方法は、クロマトグラフィー工程を含まない。
いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを遠心分離してｍＲＮＡペレットを得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡペレットは、緩衝液中に再懸濁される。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、ＴＥ、クエン酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、水である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴＥである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、クエン酸ナトリウムである。
いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、１００ｇ、１ｋｇ、１０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトン、または１０メートルトンのｍＲＮＡ、またはそれらの間の任意の量を含む。したがって、いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１００ｍｇを含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１ｇを含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１０ｇを含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１００ｇを含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１０ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１００ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１メートルトンのトンを含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、少なくとも１０メートルトンを含む。
いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、１ｋｇを超えるｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、エタノールを含まない。
いくつかの態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する方法であって、ａ）ＰＥＧを含むチオシアン酸グアニジウム（ＧＳＣＮ）溶液中にｍＲＮＡを沈殿させることと、ｂ）工程ａ）の溶液を遠心分離して、ｍＲＮＡペレットを作製することと、ｃ）ｍＲＮＡペレットを緩衝液中に再懸濁することと、ｄ）ｍＲＮＡをフィルタ上で捕捉することと、ｅ）工程ｄ）のｍＲＮＡをＰＥＧ組成物で洗浄することと、ｆ）洗浄されたｍＲＮＡを可溶化して、混入物を実質的に含まないｍＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法、を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、ｍＲＮＡを作製する方法であって、（ａ）（ｉ）プロモーターを含むＤＮＡ鋳型と、（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼとを混合することによってインビトロ転写（ＩＶＴ）を行い、完全長ｍＲＮＡを含む不純調製物を生成する工程と、（ｂ）高モル塩および両親媒性ポリマーを懸濁液に提供して、完全長ｍＲＮＡを沈殿させ、懸濁液中に沈殿した完全長ｍＲＮＡを提供する工程と、（ｃ）懸濁液をフィルタに適用することによって、沈殿した完全長ｍＲＮＡを捕捉する工程と、（ｄ）工程（ｃ）の沈殿した完全長ｍＲＮＡを水性溶媒で洗浄して、水溶液中に精製された完全長ｍＲＮＡを得る工程と、（ｅ）工程（ｄ）からの沈殿したｍＲＮＡを可溶化して、精製されたｍＲＮＡ組成物を得る工程であって、工程（ｄ）から得られる水溶液中の精製された完全長ｍＲＮＡが、（ｉ）プロモーター含む前記ＤＮＡ鋳型および（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを実質的に含まない、得る工程と、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、工程（ａ）で、ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６ポリメラーゼである。
いくつかの実施形態では、工程（ｅ）から得られる水溶液中の精製された完全長ｍＲＮＡもまた、（ｖ）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、懸濁液は、約５重量／体積％～２０重量／体積％の濃度の最終濃度での約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－６０００）と、約２～４Ｍの最終濃度でのＧＳＣＮとを含む。特定の実施形態では、懸濁液は、約１０重量／体積％、１１重量／体積％、１２重量／体積％、１３重量／体積％、１４重量／体積％、または１５重量／体積％の濃度の最終濃度での約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－６０００）と、約２．５～３Ｍの最終濃度でのＧＳＣＮとを含む。以下の実施例に示されるように、懸濁液中２０％未満のＰＥＧの最終濃度を有するポリマー誘導沈殿は、精製後に高純度のｍＲＮＡ試料をもたらした。さらに、懸濁液中約１２％のＰＥＧの最終濃度（例えば、５０％のＰＥＧ－６０００の１の比率）および２．７Ｍの最終ＧＳＣＮ濃度は、ｍＲＮＡの非常に効果的な精製を達成した。
いくつかの実施形態では、ＭＴＥＧを、ＰＥＧの代わりに使用して、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液を提供することができる。特定の実施形態では、ＭＴＥＧは、約１５重量／体積％～約４５重量／体積％の最終濃度でこの目的に使用される。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２０重量／体積％～約４０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２５重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約３０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約３５重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、３５重量／体積％未満の最終濃度でＭＴＥＧを含む。ＭＴＥＧ誘導沈殿に使用される残りの条件は、ＰＥＧ誘導沈殿で使用される条件と同一である。実施例に示されるように、３５重量／体積％未満の最終濃度でＭＴＥＧを有するｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ、およびＭＴＥＧを含む懸濁液は、プロセス酵素の望ましくない沈殿なしにｍＲＮＡの効率的な回収を確保した。プロセス酵素の望ましくない沈殿を伴わないｍＲＮＡの効率的な回収に特に好適なのは、約１０：１の沈殿したｍＲＮＡとの質量比の濾過助剤（例えば、セルロース系濾過助剤）に加えて、約２５％の最終濃度でＭＴＥＧを有するｍＲＮＡ、ＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを含む懸濁液である。
以下の図面は、説明のみを目的とするものであり、限定するものではない。
５ｍｇのＩＶＴ反応からの異なる沈殿条件で精製されたｍＲＮＡの収量を示す。 異なる沈殿条件で精製されたｍＲＮＡの銀染色ゲルを示す。銀染色ゲルを使用して、混入プロセス酵素の存在を示した。ゲルの左側にある矢印で示されるゲルバンドは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの移動を示す。 様々なＰＥＧ－６０００比を有するポリマー誘導沈殿により精製されたｍＲＮＡの収量を示す。 様々なＰＥＧ－６０００比を有するポリマー誘導沈殿を介して精製されたｍＲＮＡの銀染色ゲルを示す。 使用された異なるポリマー洗浄緩衝液および濃度に対する、ポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄によるエタノールを含まないｍＲＮＡ精製の収量を示す。 ９０％および１００％のＰＥＧ－４００洗浄緩衝液（それぞれレーン３およびレーン４）について、エタノールを含まないｍＲＮＡ精製ポリマーの誘導沈殿およびポリマー洗浄の銀染色ゲルを示す。 ５ｍｇ、１ｇ、および１０ｇのスケールにおける、異なるｍＲＮＡ構築物（ＯＴＣおよびＣＦＴＲ）に対する、ポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄を介したエタノールを含まないｍＲＮＡ精製の回収率を示す。 ５ｍｇ、１ｇ、および１０ｇのスケールにおける、異なるｍＲＮＡ構築物（ＯＴＣおよびＣＦＴＲ）に対するポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄を介して精製されたｍＲＮＡの完全性を示す、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）プロファイルを示す。 同上。 ５ｍｇ、１ｇ、および１０ｇのスケールにおける、異なるｍＲＮＡ構築物（ＯＴＣおよびＣＦＴＲ）に対するポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄を介したエタノールを含まないｍＲＮＡ精製の銀染色ゲルを示す。 １０グラム、５ｍｇ、または１ｇのスケールにおける、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）ｍＲＮＡの精製後のｄｓＲＮＡの有無を示す一連のドットブロットである。精製条件は、ゲルの上に示されており、陽性対照レーン（２ｎｇのｄｓＲＮＡ対照、２５ｎｇのｄｓＲＮＡ対照、陽性対照）、１０ｇのＯＴＣｍＲＮＡのエタノールベースの精製、および１０ｇ、５ｇまたは１ｇのＯＴＣｍＲＮＡのエタノールを含まない精製が含まれる。 ポリマー誘導沈殿および、様々な重量／体積濃度のＭＴＥＧを用いた洗浄により精製されたｍＲＮＡの回収率を示す。 懸濁液中の様々な比のｍＲＮＡ：塩：ＭＴＥＧを使用するＭＴＥＧ誘導沈殿および９５重量／体積％の濃度でのＭＴＥＧで洗浄することを介して精製されたｍＲＮＡの銀染色ゲルを示す。 沈殿および洗浄工程のためのポリマーとしてＭＴＥＧを使用した、深層濾過後の７．５ｇのＯＴＣ ｍＲＮＡ試料のＣＥスメア分析を示す。 沈殿および洗浄工程のためのポリマーとしてＭＴＥＧを使用した、深層濾過後の７．５ｇのＯＴＣ ｍＲＮＡ試料の銀染色ゲルを示す。 沈殿および洗浄工程のためのポリマーとしてＭＴＥＧを使用した、深層濾過後の１５ｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料のＣＥスメア分析を示す。 沈殿および洗浄工程のためのポリマーとしてＭＴＥＧを使用した、深層濾過後の１５ｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料の銀染色ゲルを示す。 沈殿および洗浄工程のためのポリマーとしてＭＴＥＧを使用した、遠心分離濾過後（ｐｏｓｔ－ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の１５ｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料のＣＥスメア分析を示す。 沈殿および洗浄工程のためのポリマーとしてＭＴＥＧを使用した、遠心分離濾過後の１５ｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ試料の銀染色ゲルを示す。
定義
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語が以下で最初に定義される。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して記載される。
用語「以上」、「少なくとも」、「より大きい」等々、例えば、「少なくとも１つ」は、記載された値よりも、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９ ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはそれ以上が含まれるが、これらに限定されないことが理解される。また、その間の任意のより大きな数または分数も含まれる。
逆に、用語「以下」は、指定された値よりも小さい各値が含まれる。例えば、「１００ヌクレオチド以下」には、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、および０ヌクレオチドが含まれる。また、その間の任意のより小さい数または分数も含まれる。
用語「複数」は、「少なくとも２つ」、「２つ以上」、「少なくとも第２の」等々、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９ ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはそれ以上が含まれるが、これらに限定されないことが理解される。また、その間の任意のより大きな数または分数も含まれる。
およそまたは約：本明細書で使用される場合、目的とする１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、提示される参照値と同様の値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、または０．００１％以内にあることを指す。文脈から別途明確でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、用語「およそ」または「約」によって修正される。
バッチ：本明細書で使用される場合、用語「バッチ」は、一度に精製される、例えば、同じ製造サイクル中の単一の製造順序に従って精製される、ｍＲＮＡの量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）または量（ａｍｏｕｎｔ）を指す。バッチは、一回の反応で精製されたｍＲＮＡの量を指し得る。
生物学的に活性：本明細書で使用される「生物学的に活性である」という句は、生物系において、特に生命体において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生命体に投与された時に、その生命体に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。
含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載される要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の包含を暗示するが、他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程の群の除外を暗示するものではないと理解される。
ｄｓＲＮＡ：本明細書で使用される場合、用語「ｄｓＲＮＡ」は、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応中の相補的ＲＮＡ配列の産生を指す。相補的ＲＮＡ配列は、例えば、新生ＲＮＡ鎖の相補的配列にハイブリダイズすることができる短鎖不全型転写物、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写のプライマーとして作用する短鎖不全型転写物、およびＲＮＡポリメラーゼ鋳型逆転の可能性を含む、様々な理由から作製し得る。
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、ｍＲＮＡのポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）への翻訳、複数のポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のインタクトなタンパク質（例えば、抗体）への集合、および／またはポリペプチドもしくは完全に集合したタンパク質（例えば、抗体）の翻訳後修飾を指す。本出願では、「発現」および「産生」という用語、ならびに文法的同義語は、互換的に使用される。
機能性：本明細書で使用される場合、「機能性」生体分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を呈する形態での生体分子である。
改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」、もしくは「減少させる」、または文法的同義語は、ベースライン測定、例えば、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体における測定、または本明細書に記載の治療の不在下での対照対象（または複数の対照対象）における測定と比較した値を示す。「対照対象」とは、治療されている対象と同じ疾患形態に罹患しており、治療されている対象とほぼ同じ年齢の対象である。
不純物：本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、標的物質または化合物の化学組成とは異なる、限定された量の液体、気体、または固体内の物質を指す。不純物は「混入物」とも呼ばれる。
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境下で、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養下等で生じる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物等の多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系との関連で、この用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生きている細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）（自然界および／または実験的環境かにかかわらず）最初に産生されたときに会合していた成分のうちの少なくともいくつかから分離しており、かつ／または（２）人工的に産生、調製、および／または製造された物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体の純度パーセントの計算は、賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水等）を含むべきではない。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾されたＲＮＡおよび修飾されていないＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域および非コード領域を含み得る。
ｍＲＮＡの完全性：本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡの完全性」は、概してｍＲＮＡの品質を指す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの完全性は、精製プロセス後に分解されないｍＲＮＡの割合を指す。ｍＲＮＡの完全性は、当該技術分野で周知の方法、例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｅｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を用いて決定することができる。
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広範な意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当該技術分野で公知であり、骨格中のホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重バージョンである、および／または同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。核酸は、天然源から精製され、組換え発現系を使用して産生され、任意選択的に精製され、化学的に合成等され得る。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾等を有する類似体等のヌクレオシド類似体を含み得る。核酸は、別途指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）、修飾された糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、ならびに／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、送達を促進または達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含むポリヌクレオチドおよび残基）を意味する、「非修飾核酸」に特異的に向けられる。
沈殿物：本明細書で使用される場合、用語「沈殿」（または任意の文法的に同等のもの）は、溶液中の固体の形成を指す。ｍＲＮＡに関連して使用される場合、用語「沈殿」は、液体中のｍＲＮＡの不溶性または固体形態の形成を指す。
早期中止ＲＮＡ配列：本明細書で使用される場合、用語「早期中断ＲＮＡ配列（ｐｒｅｍａｔｕｒｅｌｙ ａｂｏｒｔｅｄ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「短鎖不完全ＲＮＡ種（ｓｈｏｒｔ ａｂｏｒｔｉｖｅ ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ）」、「ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）」、および「長鎖不全型ＲＮＡ種（ｌｏｎｇ ａｂｏｒｔｉｖｅ ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ）」は、ｍＲＮＡ合成反応（例えば、インビトロ合成反応）の不完全な産物を指す。様々な理由から、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型の転写を必ずしも完了しない。例えば、ＲＮＡ合成は早期終了される。ＲＮＡ合成の早期終了の可能性のある原因としては、ＤＮＡ鋳型の品質、鋳型中に存在する特定のポリメラーゼのポリメラーゼ転写終結配列、分解緩衝液、温度、リボヌクレオチドの枯渇、およびｍＲＮＡ二次構造が挙げられる。早期中止ＲＮＡ配列は、所望の転写産物の意図される長さよりも短い任意の長さであり得る。例えば、早期中止ｍＲＮＡ配列は、１０００塩基未満、５００塩基未満、１００塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３０塩基未満、２０塩基未満、１５塩基未満、１０塩基未満であってもよい。
塩：本明細書で使用される場合、用語「塩」は、酸と塩基との間の中和反応から生じるか、または生じ得るイオン性化合物を意味する。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の全てまたはほぼ全ての範囲または程度を呈する質的状態を指す。生物学技術分野の当業者であれば、生物学的および化学的現象が、完了すること、および／または完了に至ること、または絶対的結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解する。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
実質的に含まない：本明細書で使用される場合、用語「実質的に含まない」は、除去される物質（例えば、早期中止ＲＮＡ配列）の量が比較的少ないかまたは全く存在しない状態を指す。例えば、「早期中止ＲＮＡ配列を実質的に含まない」とは、早期中止ＲＮＡ配列が、不純物のおよそ５％、４％、３％、２％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％以下（ｗ／ｗ）のレベル未満で存在することを意味する。あるいは、「早期中止ＲＮＡ配列を実質的に含まない」とは、早期中止ＲＮＡ配列が、約１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７０ｎｇ、６０ｎｇ、５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、１０ｐｇ以下のレベル未満で存在することを意味する。
本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解され、本出願が属する技術分野で一般的に使用されるものと同じ意味を有し、そのような技術は参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。
本発明は、特に、精製プロセスにおいてアルコールを使用することなくｍＲＮＡを精製するための改善された方法を提供する。
本発明の様々な態様が、以下のセクションで詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、別段の記述がない限り、「および／または」を意味する。
精製方法
ｍＲＮＡの精製における苛性溶媒または可燃性溶媒の使用は、特に大規模な調製において、安全性およびコストの課題を呈することがある。本発明は、苛性溶媒または可燃性溶媒を使用することなくｍＲＮＡを精製する方法に関する。本明細書に提供される方法は、ほとんどの臨床的および商業的ニーズを満たすことができる規模で製造されたｍＲＮＡの効率的な捕捉、洗浄、および高収率単離を可能にする。したがって、本開示は、ｍＲＮＡ補充療法の進路を提供し、それが、現在利用可能なより伝統的な酵素補充療法および生物学的療法の実行可能かつ成功した代替物となることを可能にする。
実行可能かつ成功した代替法となるには、ｍＲＮＡ精製の方法は、安全で、費用効果が高く、堅牢で、拡張性があり、あらゆる臨床および商業上のニーズを満たすために大規模な製造能力が整備されていることを確認する必要がある。適切なｍＲＮＡ精製方法は、安全で、費用効果が高く、容易に拡張可能であると同時に、現在利用可能な業界標準のｍＲＮＡ精製方法と比較して、同等またはより優れた産物も提供する。特に、本明細書に提供される方法は、苛性または可燃性の溶媒の使用を排除し、高い精製後のｍＲＮＡ収率、精製後のｍＲＮＡの完全性の維持、およびプロセス関連混入物（例えば、早期中止ＲＮＡ配列（短鎖不全型ＲＮＡ種または「ショートマー」）、長鎖不全型ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、残留溶媒、残留塩、および残留インビトロ転写酵素）の除去をもたらす。
本明細書に提供される方法は、広範囲のスケールで使用可能である。例えば、本明細書でさらに論じるように、提供される方法は、１００ｍｇ以下～１ｋｇ超などの様々なスケールでの精製を可能にする。さらに、本明細書に提供されるデータは、本発明が、ｍＲＮＡの精製のためにアルコールなどの可燃性溶媒の使用に依存する、現在利用可能な方法に代わる、有能な（およびより低コストの）代替物であることを示す。本明細書に提供されるｍＲＮＡ精製方法は、例えば、実験的、臨床的、または商業的使用を含む、様々な使用に適している。さらに、本発明は、業界標準の方法およびキットでは利用できないスケーラビリティの重要な追加利益を有する。最後に、本明細書に開示の方法は、アルコール溶媒および／またはクロマトグラフィーを含む濾過方法などの現在のプロセスと比較して、極めてコスト効率が高い。例えば、ＷＯ２０１１／０６８８１０、ＷＯ２０１２／０７５０４０、ＷＯ２０１４／１５２６５９、ＷＯ２０１４／１５２６７３、ＷＯ２０１４／１５２９６６、ＷＯ２０１５／１６４７７３、ＷＯ２０１６／００４３１８、ＵＳ６２／４２０，４１３、およびＰＣＴ／ＵＳ１６／５７０４４を参照されたい。
したがって、本明細書に記載される方法は、大規模な量のｍＲＮＡ（例えば、本明細書に記載される任意のバッチサイズまたは装填体積）を含む、ｍＲＮＡの精製に有利である。記載される精製方法は、治療用途に許容可能な高レベルの完全性および純度を有し、精製のために全長ｍＲＮＡの損失が最小限であるｍＲＮＡを提供することができる。
本明細書に記載されるｍＲＮＡを精製する方法は、ｍＲＮＡを沈殿させ、沈殿したｍＲＮＡを捕捉し、捕捉した沈殿したｍＲＮＡを洗浄して、混入物を実質的に含まない精製されたｍＲＮＡ組成物を得ることを含む。これらの工程のそれぞれについては、以降のセクションで詳しく説明する。
ｍＲＮＡの沈殿
ｍＲＮＡを精製する方法は、高モル塩溶液と両親媒性ポリマーとを含む懸濁液中でｍＲＮＡを沈殿させる工程とｍＲＮＡを捕捉する工程と、ｍＲＮＡを洗浄する工程と、を含み、それによって、混入物を実質的に含まないｍＲＮＡを得る。
本明細書に記載される方法は、提供されるｍＲＮＡを含む懸濁液中のｍＲＮＡ（例えば、インビトロ合成反応混合物）の精製に適している。懸濁液は、例えばプラスミドＤＮＡおよび酵素などの様々な混入物を有することができる。
一実施形態では、ｍＲＮＡを含む懸濁液に、塩（例えば、チオシアン酸グアニジン（ＧＳＣＮ）などのカオトロピック塩）を加えて、混入タンパク質を変性し、可溶化させる。したがって、一実施形態では、ＧＳＣＮは、懸濁液中の高モル溶液中にある。この後に、両親媒性ポリマーを添加して、ｍＲＮＡを選択的に沈殿させる。ｍＲＮＡ沈殿後、得られた沈殿したｍＲＮＡは、フィルタまたは膜を使用して捕捉され、洗浄されて、混入物、例えば短鎖不完全ＲＮＡ種、長鎖不全型ＲＮＡ種、ｄｓＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留塩、および残留溶媒、のない沈殿物を得る。沈殿したｍＲＮＡの水によるその後の溶解により、精製されたｍＲＮＡ組成物が得られる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つの薬剤は、チオシアン酸グアニジンを含む（例えば、約１～５Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む溶液）。例えば、溶液は、約１Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍ、４．０Ｍ、４．５Ｍ、または約５ＭのＧＳＣＮを含む。好適なＧＳＣＮ緩衝液の例としては、例えば、４Ｍチオシアネートグアニジン、２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．５、０．５％Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム塩を含む水溶液が挙げられる。ＧＳＣＮ緩衝液のさらなる例は、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）緩衝液中に５ＭのＧＳＣＮを含む水溶液である。いくつかの実施形態では、ＧＳＣＮは、最終濃度が２～４Ｍである。いくつかの実施形態では、ＧＳＣＮ（例えば、５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液）は、最終濃度は２．５～３Ｍである。特定の実施形態では、ＧＳＣＮは、約２．７Ｍの最終濃度である。
多くの両親媒性ポリマーは、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、本明細書の方法で使用される両親媒性ポリマーは、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、以下のうちの１つ以上から選択される：ＰＥＧトリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、およびＰＥＧ４０，０００、またはそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、２種類以上の分子量のＰＥＧポリマーの混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の分子量のＰＥＧポリマーが、両親媒性ポリマーを構成する。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＥＧ溶液は、１つ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーの混合物は、別個の分子量を有するポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを懸濁液中に沈殿させるには、１つ以上の両親媒性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを懸濁液中に沈殿させるには、ＰＥＧポリマーを含む。様々な種類のＰＥＧポリマーが当技術分野で認識され、その一部は別個の幾何学的形状を有する。本明細書の方法に適したＰＥＧポリマーには、例えば、線状、分岐状、Ｙ字形状、またはマルチアーム形状を有するＰＥＧポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、別個の幾何学的形状うちの１つ以上のＰＥＧを含む懸濁液中にある。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＰＥＧ－６０００を使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＰＥＧ－４００を使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）を使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ｔｅｒｔ－ブチル－ＴＥＧ－Ｏ－プロピオネートを使用して、ｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－ジメタクリレートを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－ジメチルエーテルを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－ジビニルエーテルを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－モノブチルエーテルを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－メチルエーテルメタクリレートを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－モノデシルエーテルを使用してｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、ＴＥＧ－ジベンゾエートを使用して、ｍＲＮＡを沈殿させることで達成することができる。これらのＰＥＧまたはＴＥＧベースの試薬のうちの任意の１つを、チオシアン酸グアニジニウムと組み合わせて使用して、ｍＲＮＡを沈殿させることができる。これらの試薬のそれぞれの構造を表Ａに示す。
Figure 2022532214000001
いくつかの実施形態では、懸濁液中でｍＲＮＡを沈殿させるには、ＰＥＧポリマーを含み、ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＯＰＡ－ＰＥＧコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ポロキサマー－ＰＥＧコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＯＴＡＰを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、コレステロールを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、両親媒性ポリマーを含む懸濁液中で沈殿する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、前述のＰＥＧ試薬のいずれかを含む懸濁液中で沈殿する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度で懸濁液中にある。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、懸濁液中に、約５重量／体積％、１０重量／体積％、１５重量／体積％、２０重量／体積％、２５重量／体積％、３０重量／体積％、３５重量／体積％、４０重量／体積％、４５重量／体積％、５０重量／体積％、５５重量／体積％、６０重量／体積％、６５重量／体積％、７０重量／体積％、７５重量／体積％、８０重量／体積％、８５重量／体積％、９０重量／体積％、９５重量／体積％、１００重量／体積％の濃度、およびそれらの間の任意の値で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約６重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約７重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約８重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約９重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１２重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１５重量／体積％で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１８重量／体積％で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約３０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約３５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約５０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約５５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約６０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約６５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約７０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約７５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約８０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約８５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約９０重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約９５重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１００重量／体積％の濃度で懸濁液中に存在する。
いくつかの実施形態では、懸濁液中でｍＲＮＡを沈殿させることは、約０．１～約５．０の総ｍＲＮＡ懸濁液体積に対するＰＥＧの体積：体積比を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ｍＲＮＡ懸濁液中に、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０の体積：体積比で存在する。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．１の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．２の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．３の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．４の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．６の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．７の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．８の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．９の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１．０の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１．２５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１．５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１．７５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２．０の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２．２５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２．５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２．７５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約３．０の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約３．２５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約３．５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約３．７５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４．０の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４．２５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４．５０の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４．７５の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約５．０の体積：体積比でｍＲＮＡ懸濁液中に存在する。特定の実施形態では、ＰＥＧは、ｍＲＮＡ懸濁液中に、約１．０、約１．５、または約２．０の体積：体積比で存在する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿の反応体積には、ＧＳＣＮおよびＰＥＧを含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿の反応体積には、約４０００～約８０００ｇ／ｍｏｌ、例えば、約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）の分子量を有するＧＳＣＮおよびＰＥＧを含む。ＧＳＣＮは、典型的には、２Ｍ～４Ｍの最終濃度である。ＰＥＧは典型的には、約１０％～約２０％（重量／体積）の最終濃度である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを精製する方法は、アルコールを含まない。
いくつかの実施形態では、非水性溶媒（例えば、アルコール）は、ｍＲＮＡを沈殿させるために添加される。いくつかの実施形態では、溶媒は、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、エタノール、メタノール、デナトニウム、およびそれらの組み合わせであってもよい。実施形態では、溶媒はアルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）である。実施形態では、溶媒は、ケトン溶媒（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、またはメチルイソブチルケトン）である。いくつかの実施形態では、非水性溶媒は、両親媒性溶液と混合される。
いくつかの実施形態では、水溶液が、ｍＲＮＡを沈殿させるために添加される。いくつかの実施形態では、水溶液は、ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶液は、ＰＥＧポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、タンパク質を変性させ、および／または水性媒体中で可溶性タンパク質を維持する１つ以上の薬剤（例えば、ＤＮＡ鋳型を除去するために転写後に添加されるＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮａｓｅ Ｉ）を添加する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、タンパク質を変性し、および／または水性媒体中で可溶性タンパク質を維持する１つ以上の薬剤は、塩、例えば、カオトロピック塩である。
いくつかの実施形態では、沈殿工程は、カオトロピック塩（例えば、チオシアン酸グアニジン）および／または両親媒性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールの水溶液）および／またはアルコール溶媒（例えば、無水エタノールまたは水性エタノール溶液などのアルコールの水溶液）の使用を含む。したがって、いくつかの実施形態では、沈殿工程は、カオトロピック塩およびそれぞれ、ＧＳＣＮおよびＰＥＧなどの両親媒性ポリマーの使用を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する薬剤は、変性剤を含むか、または変性状態から生じる。本明細書で使用される場合、用語「変性状態」は、変性を引き起こす可能性のある任意の化学的または物理的状態を指す。例示的な変性条件としては、限定されるものではないが、化学試薬、高温、極端なｐＨなどの使用が挙げられる。いくつかの実施形態では、変性状態は、精製されるｍＲＮＡを含有する不純調製物に１つ以上の変性剤を添加することによって達成される。いくつかの実施形態では、本発明に適した変性剤は、タンパク質および／またはＤＮＡ変性剤である。いくつかの実施形態では、変性剤は、１）酵素（セリンプロテイナーゼまたはＤＮａｓｅなど）、２）酸、３）溶媒、４）架橋剤、５）カオトロピック剤、６）還元剤、および／または７）高塩濃度を介した高いイオン強度であり得る。いくつかの実施形態では、特定の薬剤は、これらのカテゴリーのうちの１つ以上に該当し得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ合成で使用されるタンパク質およびＤＮＡテンプレートを分解するための変性剤として、１つ以上の酵素を使用してもよい。いくつかの実施形態では、適切な酵素としては、限定されないが、セリンプロテアーゼ、例えばキモトリプシンおよびキモトリプシン様セリンプロテアーゼ、トリプシンおよびトリプシン様セリンプロテアーゼ、エラスターゼおよびエラスターゼ様セリンプロテアーゼ、サブチリシンおよびサブチリシン様セリンプロテアーゼ、ならびにそれらの組み合わせ、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、例えばデオキシリボヌクレアーゼＩ、ＩＩおよび／またはＩＶ、制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、酸は、変性剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、適切な酸は、酢酸、ギ酸、シュウ酸、クエン酸、安息香酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、アスコルビン酸、スルホサリチル酸、およびそれらの組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態では、溶媒は、変性剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、溶媒は、苛性または可燃性剤を含まない。いくつかの実施形態では、溶媒はエタノールを含まない。いくつかの実施形態では、溶媒は、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、エタノール、メタノール、デナトニウム、およびそれらの組み合わせを含まない。いくつかの実施形態では、溶媒は、アルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）を含まない。いくつかの実施形態では、溶媒は、ケトン溶媒（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、またはメチルイソブチルケトン）を含まない。
いくつかの実施形態では、溶媒は、変性剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、溶媒はエタノールであり得る。いくつかの実施形態では、溶媒は、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、エタノール、メタノール、デナトニウム、およびそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、溶媒は、アルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）である。いくつかの実施形態では、溶媒は、ケトン溶媒（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、またはメチルイソブチルケトン）である。
いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、変性剤として使用され得る。カオトロピック剤は、タンパク質および核酸などの高分子の構造を、水素結合およびファンデルワールス力などの非共有結合力に干渉することによって破壊する物質である。いくつかの実施形態では、カオトロピック剤は、尿素、チオウレア、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、ドデシル硫酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、およびそれらの組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態では、還元剤は、変性剤として使用され得る。還元剤は、電子を別の種に提供し、それ自体が酸化される化合物である。いくつかの実施形態では、還元剤は、水素化アルミニウムリチウム、ナトリウムアマルガム、ジボラン、水素化ホウ素ナトリウム、亜硫酸塩、ジイソブチルアルミニウムヒドリド、亜リン酸エステル、一酸化炭素、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、およびそれらの組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態では、ｐＨ、熱、および／または重金属（鉛、水銀、またはカドミウムなど）のうちの１つ以上もまた、変性状態を提供するための変性剤として使用され得る。極端なｐＨは、タンパク質を変性させることが知られている。タンパク質鎖の骨格は中性であるが、タンパク質を構成するアミノ酸残基は酸性基および塩基性基をしばしば含有する。これらの基は通常、荷電しており、反対の電荷の基を有する塩橋を形成することができる。したがって、極端なｐＨは、これらの酸性基および塩基性基の電荷を変化させ、塩橋を破壊し得る。
いくつかの実施形態では、ｐＨのそれほど急激でない変化も、タンパク質の活性および溶解性に影響を与え得る。個々のアミノ酸と同様に、タンパク質は、負電荷の数が正電荷の数と等しい等電点を有する。これは、最小限の水溶性のポイントであることが多い。等電点ｐＨでは、分子上の正味電荷は存在しない。個々の分子は、互いに接近し、凝固し、溶液から沈殿する傾向がある。等電点ｐＨより上または下のｐＨでは、分子はそれぞれ正味の負電荷または正電荷を有する。したがって、タンパク質分子が互いに接近すると、それらは同じ全体的な電荷を有し、互いに反発する。
いくつかの実施形態では、熱は、変性剤として使用され得る。熱は、タンパク質分子に運動エネルギーを供給することができ、その原子をより速く振動させることができる。いくつかの実施形態では、これは、水素結合および疎水性相互作用などの比較的弱い力を破壊する。熱はまた、細菌中の酵素を変性させて破壊するため、滅菌にも使用される。
いくつかの実施形態では、例えば水銀（ＩＩ）、鉛（ＩＩ）、および銀などの金属イオンの塩は、ジスルフィド基および酸性アミノ酸のカルボン酸イオンとの強い結合を形成する能力のために、変性剤として使用され得る。したがって、ジスルフィド架橋と塩結合の両方を破壊し、不溶性金属タンパク質塩として溶液からタンパク質を沈殿させる。
いくつかの実施形態では、高濃度の塩（高塩分）も、変性剤として使用され得る。高濃度の塩は、タンパク質および核酸の両方を水溶液から沈殿させることが知られている。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、１Ｍ以上１０Ｍ以下であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、２Ｍ以上９Ｍ以下であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、２Ｍ以上８Ｍ以下であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、２Ｍ以上５Ｍ以下であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、１Ｍより高い濃度であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、２Ｍより高い濃度であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、３Ｍより高い濃度であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、４Ｍより高い濃度であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、５Ｍより高い濃度であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、６Ｍより高い濃度であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、７Ｍより高い濃度であってよい。いくつかの実施形態では、高濃度の塩は、８Ｍより高い濃度であってよい。いくつかの実施形態では、単一の塩が変性剤として使用される。いくつかの実施形態では、２以上の塩が変性剤として使用される。
いくつかの実施形態では、変性剤として使用される塩は、カルシウム塩、鉄塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、変性剤としての使用に適した例示的な特定の塩には、以下に限定されないが、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、不純調製物が供される変性剤は、塩化カリウム（ＫＣｌ）である。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、結果として得られるＫＣｌ濃度が約１Ｍ以上となるように添加される。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、得られたＫＣｌ濃度が約２Ｍ以上、３Ｍ以上、４Ｍ以上、または５Ｍ以上であるように添加される。
いくつかの実施形態では、方法は、クロマトグラフィー工程を含まない。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを遠心分離してｍＲＮＡペレットを得る。次いで、ｍＲＮＡペレットを、水、ＴＥ、クエン酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせなどの緩衝液中に再懸濁させる。したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡペレットは、水に再懸濁される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡペレットは、ＴＥに再懸濁される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡペレットは、クエン酸ナトリウムに再懸濁される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約２～４Ｍの最終濃度でＧＳＣＮ、約５％～約２０％（重量／体積）の最終濃度で約４０００～約８０００ｇ／ｍｏｌの分子量、例えば、約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）を有するＰＥＧ、および約２：１、約５：１、約１０：１もしくは約１５：１の沈殿したｍＲＮＡとの質量比で濾過助剤（例えばセルロース系濾過助剤）を含む、懸濁液中で沈殿される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約２．５～３Ｍの最終濃度でＧＳＣＮ、約１０％～約１５％（重量／体積）の最終濃度で約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量（例えば、ＰＥＧ－６０００）を有するＰＥＧ、および約１０：１の沈殿したｍＲＮＡとの質量比で濾過助剤（例えばセルロース系濾過助剤）を含む、懸濁液中で沈殿される。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、約２．７Ｍの最終濃度でＧＳＣＮ、約１２％（重量／体積）の最終濃度で約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量（例えば、ＰＥＧ－６０００）を有するＰＥＧ、および約１０：１の沈殿したｍＲＮＡとの質量比で濾過助剤（例えば、セルロース系濾過助剤、例えば、Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ）を含む、懸濁液中で沈殿される。実施例に示されるように、これらの濃度のｍＲＮＡ、塩およびＰＥＧを含む懸濁液は、プロセス酵素を沈殿させることなく、ｍＲＮＡの非常に効果的な精製を達成する。
いくつかの実施形態では、ＭＴＥＧを、ＰＥＧの代わりに使用して、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液を提供することができる。特定の実施形態では、ＭＴＥＧは、約１５重量／体積％～約４５重量／体積％の最終濃度でこの目的に使用される。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２０重量／体積％～約４０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約２５重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約３０重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約３５重量／体積％の最終濃度でＭＴＥＧを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、３５重量／体積％未満の最終濃度でＭＴＥＧを含む。ＭＴＥＧ誘導沈殿に使用される残りの条件は、ＰＥＧ誘導沈殿で使用される条件と同一である。実施例に示されるように、３５重量／体積％未満の最終濃度でＭＴＥＧを有するｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ、およびＭＴＥＧを含む懸濁液は、プロセス酵素の望ましくない沈殿なしにｍＲＮＡの効率的な回収を確保した。プロセス酵素の望ましくない沈殿を伴わないｍＲＮＡの効率的な回収に特に好適なのは、約１０：１の沈殿したｍＲＮＡとの質量比の濾過助剤（例えば、セルロース系濾過助剤）に加えて、約２５％の最終濃度のＭＴＥＧを有するｍＲＮＡ、ＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを含む懸濁液である。
例えば、ＧＳＣＮは４～８Ｍの溶液（例えば、１０ｍＭのＤＴＴ緩衝液中）として提供することができ、その後、これをｍＲＮＡおよびＭＴＥＧと合わせて、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液を調製する。いくつかの実施形態では、懸濁液は、沈殿したｍＲＮＡ、例えばＧＳＣＮなどのカオトロピック塩、およびＭＴＥＧを１：２～３：１～２の体積比で含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、沈殿したｍＲＮＡ、例えばＧＳＣＮなどのカオトロピック塩、およびＭＴＥＧを１：２～２．５：１～２の体積比で含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、沈殿したｍＲＮＡ、例えばＧＳＣＮなどのカオトロピック塩、およびＭＴＥＧを１：２．３：１～２の体積比で含む。特定の実施形態では、懸濁液は、沈殿したｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ、およびＭＴＥＧを１：２．３：２の比で含む。特定の実施形態では、懸濁液は、沈殿したｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ、およびＭＴＥＧを１：２．３：１．７の体積比で含む。特定の実施形態では、懸濁液は、沈殿したｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ、およびＭＴＥＧを１：２．３：１の比で含む。実施例に示されるように、１：２．３：１、１：２．３：１．７、および１：２．３：２の体積比でｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ、およびＭＴＥＧを含む懸濁液は、約９５％の最終濃度のＭＴＥＧ洗浄溶液と組み合わせたポリマー誘導性精製方法に特に好適であり、この工程の組み合わせにより、プロセスの望ましくない沈殿なしにｍＲＮＡの効率的な回収を確実にする。
ｍＲＮＡの捕捉
本明細書に記載されるｍＲＮＡを精製する方法の別の工程は、ｍＲＮＡを捕捉することを含む。ｍＲＮＡを捕捉する様々な方法が当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを含有する不純調製物は、膜またはフィルタによって沈殿したｍＲＮＡが捕捉または保持されるように、膜濾過を伴う精製プロセスに供される。したがって、いくつかの実施形態では、不純調製物は、不溶性物質を除去するために前処理することなく、沈殿後に膜濾過にかけられる。
沈殿したｍＲＮＡを捕捉または保持するために、様々なタイプの膜濾過を使用してもよい。典型的には、膜濾過は、１つ以上の挿入された浸透性膜を使用して、流体から固体を分離することを含む。膜濾過は、ガス状試料からの粒子を濾過するためにも使用され得る。一般的に言えば、膜濾過には、溶液拡散のみによって進行する受動濾過と、液体または気体を膜に押し通すために陽圧または陰圧（すなわち真空）を使用する能動濾過の二つの主要な形態がある。典型的には、膜濾過は、装填（ｌｏａｄ）、洗浄、および溶出の工程を伴う。
フィルタ上のｍＲＮＡの捕捉は、沈殿したｍＲＮＡを含む溶液を膜またはフィルタ上に装填することを含む。この工程は、通常、装填工程と呼ばれる。装填工程は、膜またはフィルタ上に供給原料（例えば、沈殿したｍＲＮＡを含有する不純な調製物）を装填し、陽圧または陰圧によってそれを強制通過させ、保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が膜上に捕捉または保持されることを含む。本明細書で使用される場合、用語「保持物」は、膜によって保持される任意の非透過性溶質および／または不溶性物質を指す。本発明によると、沈殿したｍＲＮＡは、保持物として膜によって捕捉される。本明細書で使用される場合、用語「膜」または「フィルタ」は、任意の多孔質層またはシートの材料を指す。本出願では、用語「膜」は、フィルタと相互交換可能に使用される。
いくつかの実施形態では、好適な膜は、沈殿したｍＲＮＡを捕捉または保持するのに適切な細孔サイズを有し、一方で不純物（可溶性不純物および／または細孔サイズより小さいサイズの不溶性物質を含む）を透過物として通過させる。いくつかの実施形態では、適切な膜は、約０．１０μｍ、０．２０μｍ、０．２２μｍ、０．２４μｍ、０．２６μｍ、０．２８μｍ、０．３０μｍ、０．４０μｍ、０．５μｍ、または１．０μｍの平均細孔サイズまたはそれ以上を有する。特定の実施形態では、好適な膜は、約０．２２μｍの平均細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、適切な膜は、約１．０μｍ、１．５μｍ、２．０μｍ、２．５μｍ、３．０μｍ、３．５μｍ、４．０μｍ、４．５μｍ、５．０μｍ、５．５μｍ、６．０μｍ、６．５μｍ、７．０μｍ、７．５μｍ、８．０μｍ、８．５μｍ、９．０μｍ、９．５μｍ、および１０μｍの、平均細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、例えば、ノーマルフロー濾過（ＮＦＦ）または深層濾過で使用するための好適な膜は、約５μｍ～約８μｍの平均細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、ＮＦＦまたは深層濾過で使用するための好適な膜は、約７μｍの平均細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、例えば、遠心分離濾過で使用するための好適な膜は、約０．５μｍ～約２．０μｍの平均細孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、遠心分離濾過で使用するための適切な膜は、約１μｍである。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを保持するための適切な細孔サイズは、分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ ｏｆｆ）（ＭＷＣＯ）とも呼ばれる、沈殿したｍＲＮＡの公称分子量限界（ＮＭＫＬ）によって決定されてもよい。典型的には、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬまたはＭＷＣＯよりも細孔サイズが小さい膜が使用される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬまたはＭＷＣＯの２～６（例えば、２、３、４、５、または６）倍未満の細孔サイズを有する膜が使用される。いくつかの実施形態では、本発明に適した膜は、約１００キロダルトン（ｋＤａ）、３００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ、１，５００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ、２，５００ｋＤａ、３，０００ｋＤａ、３，５００ｋＤａ、４，０００ｋＤａ、４，５００ｋＤａ、５，０００ｋＤａ、５，５００ｋＤａ、６，０００ｋＤａ、６，５００ｋＤａ、７，０００ｋＤａ、７，５００ｋＤａ、８，０００ｋＤａ、８，５００ｋＤａ、９，０００ｋＤａ、９，５００ｋＤａ、または１０，０００ｋＤａ以上の細孔サイズを有し得る。いくつかの実施形態では、膜は、ｍＲＮＡのＮＭＷＬおよびＭＷＣＯよりも大きいが、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬおよびＭＷＣＯより小さい細孔サイズを有する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、高モル塩溶液およびＰＥＧポリマーを含む懸濁液中でｍＲＮＡを沈殿させて、懸濁液中で沈殿したｍＲＮＡを提供することと、ｍＲＮＡのＮＭＷＬおよびＭＷＣＯよりも大きいが、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬおよびＭＷＣＯよりも小さい細孔サイズを有するフィルタ上に、前記沈殿したｍＲＮＡを捕捉することと、捕捉および沈殿したｍＲＮＡを洗浄して、混入物を実質的に含まない精製されたｍＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、ｍＲＮＡを精製する方法を提供する。
本発明に適した膜は、任意の材料から作製されてもよい。例示的な膜材料としては、限定されるものではないが、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）（未修飾）、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空繊維膜、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ＭＣＥ（混合セルロースエステル）、超高ＭＷポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、それらの組合せが挙げられる。特定の実施形態では、膜は、約１．０μｍの平均細孔サイズを有するポリプロピレンフィルタである。
本発明に適した膜は、様々な表面積を有してもよい。いくつかの実施形態では、好適な膜は、ｍＲＮＡの大規模な産生を促進するのに十分な表面積を有する。例えば、好適な膜は、約２，０００ｃｍ２、２，５００ｃｍ２、３，０００ｃｍ２、３，５００ｃｍ２、４，０００ｃｍ２、４，５００ｃｍ２、５，０００ｃｍ２、７，５００ｃｍ２、１０，０００ｃｍ２、５ｍ２、１０ｍ２、１２ｍ２、１５ｍ２、２０ｍ２、２４ｍ２、２５ｍ２、３０ｍ２、または５０ｍ２以上の表面積を有し得る。
膜濾過は、沈殿したｍＲＮＡを捕捉するために様々な形式で実行され得る。いくつかの実施形態では、膜濾過は、接線流濾過（ＴＦＦ）の一部として実施される。いくつかの実施形態では、膜濾過は、ノーマルフロー濾過（ＮＦＦ）または深層濾過を含む。いくつかの実施形態では、膜濾過は、遠心分離濾過を含む。
濾過助剤（分散剤を含む）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法では、濾過助剤が使用される。濾過遠心分離機を使用して沈殿したｍＲＮＡを精製する場合に、濾過助剤を使用できる。濾過助剤は、濾過遠心分離機のフィルタ上に沈殿したｍＲＮＡを保持すること、および濾過遠心分離機のフィルタの表面から保持されたｍＲＮＡを取り出すことを可能にするのを補助し得る。
いくつかの実施形態では、濾過助剤は分散剤である。いくつかの実施形態では、濾過助剤は、灰、粘土、珪藻土、パーライト、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、ポリマー、ポリプロピレンビーズ、ポリスチレンビーズ、塩（例えば、セルロース塩）、砂、火山灰、珪藻土および／または糖のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、分散剤はビーズである。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡ組成物は、分散剤を含まない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つ以上の薬剤を添加する工程は、任意の分散剤の非存在下で実施される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つ以上の薬剤を添加する工程は、少なくとも１つの分散剤の存在下で実施される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つ以上の薬剤を添加した後に得られたスラリーに分散剤が添加される。
したがって、いくつかの実施形態では、精製方法は、分散剤を精製されたｍＲＮＡ沈殿物から分散剤を分離するための１つ以上の工程、例えば、ケーキの洗浄および乾燥をさらに含み得る。方法はさらに、分散剤を濾過しながら、水性媒体、例えば、水を使用して、精製されたｍＲＮＡをケーキから可溶化および溶出する工程を含み得る。実施形態では、沈殿工程および乾燥工程は同時に実行することができる。
実施形態では、濾過助剤はセルロースである。実施形態では、セルロース濾過助剤は、粉末セルロース繊維（例えば、Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標）またはＳｉｇｍａｃｅｌｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ２０）である。実施形態では、セルロース濾過助剤は、Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標）２００ＮＦまたはＳｉｇｍａｃｅｌｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｔｙｐｅ ２０（２０μｍ）などの粉末セルロース繊維である。いくつかの実施形態では、濾過助剤は、火山灰である。いくつかの実施形態では、濾過助剤は、珪藻土である。
いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡおよび濾過助剤（例えば、Ｓｏｌｋａ Ｆｌｏｃなどの粉末セルロース繊維）は、１：２、１：５、１：１０または１：１５の質量比である。特定の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡおよび濾過助剤（例えば、Ｓｏｌｋａ Ｆｌｏｃなどの粉末セルロース繊維）は、１：１０の質量比である。
捕捉されたｍＲＮＡの洗浄
ｍＲＮＡを精製する方法はまた、膜上に保持された不純物を取り除くために溶出する前に、捕捉された不溶性ｍＲＮＡを洗浄することを含む。
いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーが洗浄工程で使用される。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＥＧ溶液（「ＰＥＧ洗浄溶液」）が、捕捉されたｍＲＮＡを洗浄するために使用される。ＰＥＧ洗浄溶液は、トリエチルングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、およびＰＥＧ４０，０００、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、トリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、テトラエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ２００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ溶液は、ＰＥＧ３００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ４００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ６００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ１，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ１，５００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ２，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ３，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ３，３５０を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ４，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ６，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ８，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ１０，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ２０，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ３５，０００を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ４０，０００を含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄には、９０センチストローク以下の粘度を有するＰＥＧを含む１回以上の洗浄を含む。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、８０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、７０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、６０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、５０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、４０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、３０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、２０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、１０センチストローク以下の粘度を有する。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）を使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ｔｅｒｔ－ブチル－ＴＥＧ－Ｏ－プロピオネートを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－ジメタクリレートを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－ジメチルエーテルを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－ジビニルエーテルを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－モノブチルを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－メチルエーテルメタクリレートを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－モノデシルエーテルを使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－ジベンゾエートを使用して達成することができる。これらの試薬のそれぞれの構造は上記の表Ａに示されている。
液体溶液の粘度は、当技術分野で周知の方法を使用して、例えば、粘度計を使用して、室温（例えば、約１８～２５℃）で、測定することができる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液中のＰＥＧは、ＰＥＧ修飾脂質（ＰＥＧ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｐｉｄ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液中のＰＥＧは、ＰＥＧ修飾脂質である、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＯＰＡ－ＰＥＧコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ポロキサマー－ＰＥＧコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＯＴＡＰを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、コレステロールを含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、２種以上の分子量ＰＥＧポリマーの混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の分子量のＰＥＧポリマーが、ＰＥＧ洗浄溶液を構成する。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、１つ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーの混合物は、別個の分子量を有するポリマーを含む。
ＰＥＧ洗浄溶液で使用されるＰＥＧは、様々な幾何学的形状を有し得る。例えば、好適なＰＥＧポリマーは、線状、分岐状、Ｙ字形状、またはマルチアーム形状を有するＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、別個の幾何学的形状うちの１つ以上のＰＥＧを含む懸濁液中にある。
いくつかの実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、洗浄溶液中に、約１０重量／体積％、１５重量／体積％、２０重量／体積％、２５重量／体積％、３０重量／体積％、３５重量／体積％、４０重量／体積％、４５重量／体積％、５０重量／体積％、５５重量／体積％、６０重量／体積％、６５重量／体積％、７０重量／体積％、７５重量／体積％、８０重量／体積％、８５重量／体積％、９０重量／体積％、９５重量／体積％、１００重量／体積％の濃度、およびそれらの間の任意の値で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１５重量／体積％で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２５重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約３０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約３５重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約４５重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約５０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約５５重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約６０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約６５重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約７０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約７５重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約８０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約８５重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約９０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約９５重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約１００重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約８０～１００％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。したがって、いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約８０％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約８５％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約９０％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約９５％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約１００％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。
いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、両親媒性ポリマーを含む溶液中で洗浄される。いくつかの実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧである。沈殿したｍＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、または１０回を超えて洗浄することができる。したがって、いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で１回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で２回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で３回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で４回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で５回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で６回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で７回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で８回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で９回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で１０回洗浄される。いくつかの実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、ＰＥＧポリマーを含む溶液で１０回以上洗浄される。
いくつかの実施形態では、捕捉されたｍＲＮＡを洗浄するために使用される洗浄溶液は、水性である。したがって、いくつかの実施形態では、洗浄溶液は、エタノール、イソプロピルアルコール、またはベンジルアルコールなどのアルコールを含まない。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、またはベンジルアルコールなどの非水性成分を含む。
いくつかの実施形態では、洗浄工程は、両親媒性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）を含む溶液を使用した複数の濯ぎサイクルを含む。いくつかの実施形態では、洗浄工程は、１つ以上の別個の両親媒性ポリマーを含む溶液を使用した複数の濯ぎを含む。いくつかの実施形態では、洗浄工程は、約１０％～約１００％の両親媒性ポリマーを含む溶液を使用して、複数の濯ぎサイクルによって行われてもよい。特定の実施形態では、複数の濯ぎサイクルは、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、または１０サイクル超で構成される。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約９０～約１００重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。特定の実施形態では、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４００）は、約９０重量／体積％の濃度で洗浄溶液中に存在する。実施例に示されるように、約９０重量／体積％～約１００重量／体積％の約４００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－４００）の分子量を有するＰＥＧの最終濃度は、この洗浄溶液が高収率かつ高純度のｍＲＮＡ試料をもたらしたため、洗浄工程に特に適している。
いくつかの実施形態では、ＭＴＥＧは、洗浄溶液中に約７５重量／体積％～約９５重量／体積％の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＧは、洗浄溶液中に約７５重量／体積％、約８０重量／体積％、約８５重量／体積％、約９０重量／体積％、または約９５重量／体積％の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＧは、洗浄溶液中に約９０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度で存在する。特定の実施形態では、ＭＴＥＧは、洗浄溶液中に約９５重量／体積％の濃度で存在する。実施例に示されるように、約９０または約９５重量／体積％のＭＴＥＧの最終濃度は、これらの最終濃度がプロセス酵素を沈殿させることなくｍＲＮＡの高効率の回収を達成したため、洗浄工程に特に好適である。
溶出または収集
典型的には、捕捉または保持されたｍＲＮＡは、沈殿したｍＲＮＡを溶液に再可溶化することによって溶出または収集され得る。例えば、捕捉されたｍＲＮＡは、ＲＮＡｓｅを含まない水で溶出されてもよい。特定の実施形態では、捕捉されたｍＲＮＡを溶出することは、ＲＮＡｓｅを含まない水を再循環させることを伴う。例えば、ＲＮＡｓｅを含まない水は、約５～３０分間（例えば、約５～２５分間、約５～２０分間、または約５～１５分間）循環させることができる。特定の実施形態では、ＲＮＡｓｅを含まない水は、約５～１０分間（例えば、約５、６、７、８、９または１０分間）再循環される。ＴＥおよび／またはクエン酸ナトリウムなどの他の緩衝液を使用して、ｍＲＮＡを再可溶化することができる。用語「溶出」は、例えば、深層濾過が関与する精製プロセスに関連して使用され得るが、用語「収集」は、遠心分離が関与する精製プロセスに関連して使用され得る。
いくつかの実施形態では、再可溶化されたｍＲＮＡは、所望の濃度で所望の製剤に透析されてもよい。透析には様々な製剤が使用され得る。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ溶液は、１ｍＭクエン酸ナトリウムで透析される。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ溶液を、酢酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、酢酸ピリジニウム、ギ酸ピリジニウム、酢酸アンモニウム、尿素、塩化カリウムなどで透析する。目的のｍＲＮＡのサイズに応じて、適切な分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する透析膜を使用することができる。例えば、好適な透析膜は、約５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３５０ｋＤａ、４００ｋＤａ、４５０ｋＤａ、または５００ｋＤａのＭＷＣＯを有し得る。
スケールおよび回収量
本発明によって提供される特定の利点は、ｍＲＮＡ、特にインビトロで合成されたｍＲＮＡを、大規模または商業規模で精製する能力である。例えば、いくつかの実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり約１００ミリグラム、１グラム、１０グラム、５０グラム、１００グラム、２００グラム、３００グラム、４００グラム、５００グラム、６００グラム、７００グラム、８００グラム、９００グラム、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトン、１０メートルトンまたはそれ以上のスケールで精製される。実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、約１ｋｇ以上のスケールで精製される。
一つの特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり１０グラムのスケールで精製される。一つの特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり２０グラムのスケールで精製される。一つの特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり２５グラムのスケールで精製される。一つの特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり５０グラムのスケールで精製される。別の特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり１００グラムのスケールで精製される。さらに別の特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり１ｋｇのスケールで精製される。さらに別の特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり１０ｋｇのスケールで精製される。さらに別の特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり１００ｋｇのスケールで精製される。さらに別の特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり１，０００ｋｇのスケールで精製される。さらに別の特定の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、バッチ当たり１０，０００ｋｇのスケールで精製される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、バッチ当たり、１グラム、５グラム、１０グラム、１５グラム、２０グラム、２５グラム、３０グラム、３５グラム、４０グラム、４５グラム、５０グラム、７５グラム、１００グラム、１５０グラム、２００グラム、２５０グラム、３００グラム、３５０グラム、４００グラム、４５０グラム、５００グラム、５５０グラム、６００グラム、６５０グラム、７００グラム、７５０グラム、８００グラム、８５０グラム、９００グラム、９５０グラム、１ｋｇ、２．５ｋｇ、５ｋｇ、７．５ｋｇ、１０ｋｇ、２５ｋｇ、５０ｋｇ、７５ｋｇ、１００ｋｇまたはそれ以上のスケールで精製される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含む溶液は、少なくとも１グラム、１０グラム、１００グラム、１キログラム、１０キログラム、１００キログラム、１メートルトン、１０メートルトン、またはそれ以上のｍＲＮＡ、またはそれらの間の任意の量を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも約２５０ｍｇのｍＲＮＡである量のｍＲＮＡを精製するために使用される。一実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも約２５０ｍｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡ、約７５０ｍｇのｍＲＮＡ、約１０００ｍｇのｍＲＮＡ、約１５００ｍｇのｍＲＮＡ、約２０００ｍｇのｍＲＮＡ、または約２５００ｍｇのｍＲＮＡである量のｍＲＮＡを精製するために使用される。実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも約２５０ｍｇのｍＲＮＡ～約５００ｇのｍＲＮＡである量のｍＲＮＡを精製するために使用される。実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも約５００ｍｇのｍＲＮＡ～約２５０ｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡ～約１００ｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡ～約５０ｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡ～約２５ｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡ～約１０ｇのｍＲＮＡ、または約５００ｍｇのｍＲＮＡ～約５ｇのｍＲＮＡである量のｍＲＮＡを精製するために使用される。実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、少なくとも約１００ｍｇのｍＲＮＡ～約１０ｇのｍＲＮＡ、約１００ｍｇのｍＲＮＡ～約５ｇのｍＲＮＡ、または約１００ｍｇのｍＲＮＡ～約１ｇのｍＲＮＡである量のｍＲＮＡを精製するために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である、精製されたｍＲＮＡの回収量（または収率）を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約４０％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約４５％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約５０％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約５５％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約６０％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約６５％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約７０％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約７５％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約７５％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約８０％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約８５％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９０％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９１％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９２％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９３％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９４％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９５％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９６％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９７％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９８％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約９９％である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約１００％である。
特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は、約８０％超、または約９０％超、例えば、約９０％～１００％である。
精製ｍＲＮＡの特性評価
本明細書に提供されるｍＲＮＡ精製方法は、短鎖不全型ＲＮＡ種、長鎖不全型ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒、および／または残留塩を含む混入物を実質的に含まない精製ｍＲＮＡ組成物をもたらす。
本明細書に記載される方法は、約６０％～約１００％の純度を有する精製ｍＲＮＡをもたらす。したがって、いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約６０％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約６５％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約７０％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約７５％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約８０％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約８５％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９０％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９１％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９２％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９３％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９４％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９５％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９６％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９７％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９８％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約９９％の純度を有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約１００％の純度を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成されるｍＲＮＡは、完全長ｍＲＮＡ以外の１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、および／または０．１％未満の不純物を有する。不純物は、ＩＶＴ混入物、例えば、タンパク質、酵素、ＤＮＡ鋳型、遊離ヌクレオチド、残留溶媒、残留塩、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、早期中止ＲＮＡ配列（「ショートマー」または短鎖不全型ＲＮＡ種）、および／または長鎖不全型ＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、プロセス酵素を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１ｐｇ／ｍｇ未満、約２ｐｇ／ｍｇ未満、約３ｐｇ／ｍｇ未満、約４ｐｇ／ｍｇ未満、約５ｐｇ／ｍｇ未満、約６ｐｇ／ｍｇ未満、約７ｐｇ／ｍｇ未満、約８ｐｇ／ｍｇ未満、約９ｐｇ／ｍｇ未満、約１０ｐｇ／ｍｇ未満、約１１ｐｇ／ｍｇ未満、または約１２ｐｇ／ｍｇ未満である。したがって、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約２ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約３ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約４ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約５ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約６ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約７ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約８ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約９ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１０ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１１ｐｇ／ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の精製方法を使用した精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１２ｐｇ／ｍｇ未満である。
いくつかの実施形態では、本発明は、高度な早期中止ＲＮＡ配列（「ショートマー」としても知られる）を除去または除去する。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、約９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または実質的に全ての早期中止ＲＮＡ配列を除去する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、早期中止ＲＮＡ配列を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）の早期中止ＲＮＡ配列を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、約１％未満（例えば、約０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満）の早期中止ＲＮＡ配列を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、ショルダーまたはセパレートピーク）、臭化エイチジウム（ｅｉｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、クーマシー染色、キャピラリー電気泳動、またはグリオキサールゲル電気泳動（例えば、別個の下部バンドの存在）によって決定される、検出不能な早期中止ＲＮＡ配列を含有する。本明細書で使用される場合、用語「ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）」、「短鎖不全型ＲＮＡ種（ｓｈｏｒｔ ａｂｏｒｔｉｖｅ ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ）」、「早期中止ＲＮＡ配列（ｐｒｅｍａｔｕｒｅｌｙ ａｂｏｒｔｉｖｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、または「長鎖不全型ＲＮＡ種（ｌｏｎｇ ａｂｏｒｔｉｖｅ ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｅｓ）」は、完全長よりも短い任意の転写物を指す。いくつかの実施形態では、「ショートマー」、「短鎖不全型ＲＮＡ種」、または「早期中止ＲＮＡ配列」は、長さが１００ヌクレオチド未満、長さが９０ヌクレオチド未満、長さが８０ヌクレオチド未満、長さが７０ヌクレオチド未満、長さが６０ヌクレオチド未満、長さが５０ヌクレオチド未満、長さが４０ヌクレオチド未満、長さが３０ヌクレオチド未満、長さが２０ヌクレオチド未満、または長さが１０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、５’－キャップ、および／または３’－ポリＡテールを付加した後に、ショートマーを検出または定量化する。いくつかの実施形態では、早期中止ＲＮＡ転写物は、１５塩基未満（例えば、１４塩基、１３塩基、１２塩基、１１塩基、１０塩基、９塩基、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、または３塩基未満）で構成される。いくつかの実施形態では、早期中止ＲＮＡ転写物は、約８～１５塩基、８～１４塩基、８～１３塩基、８～１２塩基、８～１１塩基、または８～１０塩基を含有する。
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含むがこれに限定されない、インビトロ合成で使用される高度な酵素試薬を除去または除去する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを除去するために特に有効である。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、インビトロ合成で使用される約９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または実質的にすべての酵素試薬を除去する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、インビトロ合成で使用される酵素試薬を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、インビトロ合成で使用される酵素試薬の約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、インビトロ合成で使用される酵素試薬の約１％未満（例えば、約０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、または０．１％未満）を含有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、例えば、銀染色、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、および／またはキャピラリー電気泳動、臭化エチジウムおよび／またはクーマシー染色によって決定されるものを含む、インビトロ合成で使用される検出不能な酵素試薬を含有する。
様々な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して精製されたｍＲＮＡは、高度の完全性を維持する。本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡの完全性」は、一般に、精製後のｍＲＮＡの品質を指す。ｍＲＮＡの完全性は、当技術分野で周知の方法、例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動によって決定することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの完全性は、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動のバンドパターンによって決定され得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動の基準バンドと比較して、ほとんどまたは全くバンド化を示さない。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、約９５％を超える完全性（例えば、約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、９８％を超える完全性を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、９９％を超える完全性を有する。いくつかの実施形態では、本発明に従って精製されたｍＲＮＡは、およそ１００％の完全性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、完全長ｍＲＮＡ分子のパーセンテージが低い組成物と比較して、例えば、翻訳されたポリペプチドの少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上、増加した活性を有する組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、外観、同一性、量、濃度、不純物の存在、微生物学的評価、ｐＨレベル、および活性のうちの１つ以上について評価される。いくつかの実施形態では、許容可能な外観は、目に見える粒子を本質的に含まない、透明で無色の溶液を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの同一性は、配列決定方法によって評価される。いくつかの実施形態では、濃度は、ＵＶ分光光度法などの適切な方法によって評価される。いくつかの実施形態では、適切な濃度は、公称で約９０％～１１０％（０．９～１．１ｍｇ／ｍＬ）である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの純度の評価は、ｍＲＮＡの完全性の評価、残留プラスミドＤＮＡの評価、および残留溶媒の評価を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの完全性の許容可能なレベルは、アガロースゲル電気泳動によって評価される。ゲルを分析して、バンドパターンおよび見かけのヌクレオチド長さが分析参照標準と合致するかどうかを判断する。ＲＮＡの完全性を評価するための追加の方法には、例えば、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を使用した精製されたｍＲＮＡの評価が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＧＥによって決定される精製されたｍＲＮＡの許容可能な純度は、精製されたｍＲＮＡ組成物が、約５５％以下の長鎖不全型／分解種（ｌｏｎｇ ａｂｏｒｔｉｖｅ／ｄｅｇｒａｄｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）を有するということである。いくつかの実施形態では、残留プラスミドＤＮＡは、当技術分野の方法、例えば、ｑＰＣＲの使用によって評価される。いくつかの実施形態では、１０ｐｇ／ｍｇ未満（例えば、１０ｐｇ／ｍｇ未満、９ｐｇ／ｍｇ未満、８ｐｇ／ｍｇ未満、７ｐｇ／ｍｇ未満、６ｐｇ／ｍｇ未満、５ｐｇ／ｍｇ未満、４ｐｇ／ｍｇ未満、３ｐｇ／ｍｇ未満、２ｐｇ／ｍｇ未満、または１ｐｇ／ｍｇ未満）が、残留プラスミドＤＮＡの許容可能なレベルである。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、１０，０００ｐｐｍ以下、９，０００ｐｐｍ以下、８，０００ｐｐｍ以下、７，０００ｐｐｍ以下、６，０００ｐｐｍ以下、５，０００ｐｐｍ以下、４，０００ｐｐｍ以下、３，０００ｐｐｍ以下、２，０００ｐｐｍ以下、１，０００ｐｐｍ以下である。したがって、いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、１０，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、９，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、８，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、７，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、６，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、５，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、４，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、３，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、２，０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、許容可能な残留溶媒レベルは、１，０００ｐｐｍ以下である。
いくつかの実施形態では、微生物学的試験は、精製されたｍＲＮＡに対して実施され、これには例えば、細菌エンドトキシンの評価が含まれる。いくつかの実施形態では、細菌エンドトキシンは、＜０．５ＥＵ／ｍＬ、＜０．４ＥＵ／ｍＬ、＜０．３ＥＵ／ｍＬ、＜０．２ＥＵ／ｍＬ、または＜０．１ＥＵ／ｍＬである。したがって、いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．５ＥＵ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．４ＥＵ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．３ＥＵ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．２ＥＵ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．２ＥＵ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．１ＥＵ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＵ／１０ｍＬ以下、１ＣＦＵ／２５ｍＬ以下、１ＣＦＵ／５０ｍＬ以下、１ＣＦＵ／７５ｍＬ以下、または１ＣＦＵ／１００ｍＬ以下である。したがって、いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＵ／１０ｍＬ以下である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＵ／２５ｍＬ以下である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＵ／５０ｍＬ以下である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＲ／７５ｍＬ以下である。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＵ／１００ｍＬを有する。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡのｐＨが評価される。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの許容可能なｐＨは、５～８である。したがって、いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの翻訳忠実度が評価される。翻訳忠実度は、様々な方法によって評価することができ、例えば、トランスフェクションおよびウェスタンブロット分析を含む。精製されたｍＲＮＡの許容可能な特性は、参照標準と類似の分子量で移動するウェスタンブロット上のバンドパターンを含む。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、コンダクタンスについて評価される。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡの許容可能な特性は、参照標準の約５０％～１５０％のコンダクタンスを含む。
精製されたｍＲＮＡは、キャップパーセンテージおよびポリＡテール長についても評価される。いくつかの実施形態では、許容可能なキャップパーセンテージは、Ｃａｐ１、％面積：ＮＬＴ９０を含む。いくつかの実施形態では、許容可能なポリＡテール長は、約１００～１５００ヌクレオチド（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、および１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、または１５００ヌクレオチド）である。したがって、いくつかの実施形態では、許容可能なポリＡテール長は、約１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約２５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約３００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約３５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約４００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約４５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約５００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約５５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約６００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約６５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約７００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約７５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約８００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約８５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約９００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約９５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約１０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約１１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約１２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約１３００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約１４００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテール長は、約１５００ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、任意の残留ＰＥＧについても評価される。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１０ｎｇ未満ＰＥＧ／ｍｇ精製されたｍＲＮＡ～１０００ｎｇ未満ＰＥＧ／ｍｇ ｍＲＮＡを有する。したがって、いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約１０ｎｇ未満ＰＥＧ／ｍｇ精製されたｍＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約１００ｎｇ未満ＰＥＧ／ｍｇ精製されたｍＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約２５０ｎｇ未満ＰＥＧ／ｍｇ精製されたｍＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約５００ｎｇ未満ＰＥＧ／ｍｇ精製されたｍＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約７５０ｎｇ未満ＰＥＧ／ｍｇ精製されたｍＲＮＡを有する。いくつかの実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約１０００ｎｇ未満ＰＥＧ／ｍｇ精製されたｍＲＮＡを有する。
ｍＲＮＡ純度を検出および定量する様々な方法が当技術分野で公知である。例えば、このような方法は、ブロッティング、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）、またはＵＰＬＣ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ゲル電気泳動の前にグリオキサール染料によって最初に変性される（「グリオキサールゲル電気泳動」）。いくつかの実施形態では、合成ｍＲＮＡは、キャッピングまたはテーリング前に特性評価される。いくつかの実施形態では、合成ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング後に特性評価される。
記載方法に適した核酸
任意の種類の核酸を、本明細書に記載される方法を使用して精製することができる。いくつかの実施形態では、核酸は、インビトロ転写された（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである。簡潔には、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、および適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含む線状または環状ＤＮＡ鋳型を用いて実行される。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、２段階プロセスを含み、第１段階は、ｍＲＮＡのインビトロ転写とそれに続く精製工程を含み、第２段階は、インビトロ転写されたｍＲＮＡのキャッピングおよびテーリングとそれに続く第２の精製工程を含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、キャッピングおよびテーリングされたｍＲＮＡのインビトロ転写をもたらす１段階プロセスである。例えば、いくつかの実施形態では、インビトロ転写は、キャップピングおよびテーリングされたｍＲＮＡが産生され、その後精製される。これは、例えば、ポリＴ領域および／またはＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）を含むプラスミドを使用することによって達成される。正確な条件は、特定の用途により異なる。これらの試薬の存在は、いくつかの実施形態による最終産物中では望ましくなく、それ故に、不純物と称され得、これらの不純物のうちの１つ以上を含む調製物は、不純調製物と称され得る。したがって、一態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）プロモーターを含むＤＮＡ鋳型と（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼとを混合することによってインビトロ転写（ＩＶＴ）を行い、完全長ｍＲＮＡを含む不純調製物を生成する工程と、（ｂ）高モル塩および両親媒性ポリマーを懸濁液に提供して、完全長ｍＲＮＡを沈殿させ、懸濁液中に沈殿した完全長ｍＲＮＡを提供する工程と、（ｃ）懸濁液をフィルタに適用することによって、沈殿した完全長ｍＲＮＡを捕捉する工程と、（ｄ）工程（ｃ）の沈殿した完全長ｍＲＮＡを水性溶媒で洗浄して、水溶液中に精製された完全長ｍＲＮＡを得る工程と、（ｅ）工程（ｄ）からの沈殿したｍＲＮＡを可溶化して、精製されたｍＲＮＡ組成物を得る工程であって、工程（ｄ）から得られる水溶液中の精製された完全長ｍＲＮＡが、（ｉ）プロモーターを含む前記ＤＮＡ鋳型および（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを実質的に含まない、得る工程と、を含む、ｍＲＮＡを製造する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、工程（ａ）において、ＤＮＡ鋳型は、線状ＤＮＡ鋳型である。いくつかの実施形態では、工程（ａ）において、ポリメラーゼは、ＳＰ６ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、工程（ａ）において、混合は、リボヌクレオチド三リン酸のプールを混合することをさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）において、混合は、ＲＮａｓｅ阻害剤、例えば、ＲＮａｓｅ Ｉ阻害剤、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｂ、およびＲＮａｓｅ Ｃをさらに含む。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、高モル塩は、ＧＳＣＮである。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、高モル塩は、ＧＳＣＮを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、両親媒性ポリマーは、ＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）において、両親媒性ポリマーは、ＭＴＥＧを含む。特定の実施形態では、工程（ｂ）において、高モル塩はＧＳＣＮを含み、両親媒性ポリマーは約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）の分子量を有するＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む。
いくつかの実施形態では、工程（ｃ）において、フィルタは、沈殿した完全長ｍＲＮＡよりも小さいが完全長ｍＲＮＡよりも大きいＭＷＣＯを有する。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）において、フィルタは深層型フィルタである。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）において、遠心分離と共に使用されるフィルタ。
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、水性溶媒は両親媒性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、水性溶媒中の両親媒性ポリマーは、工程（ｂ）で使用される両親媒性ポリマーと同じである。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、水性溶媒中の両親媒性ポリマーは、工程（ｂ）で使用される両親媒性ポリマーとは異なる。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、両親媒性ポリマーはＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、水性溶媒中のＰＥＧポリマーは、工程（ｂ）で使用されるＰＥＧポリマーと同じである。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）において、水性溶媒中のＰＥＧポリマーは、工程（ｂ）で使用されるＰＥＧポリマーとは異なる。
いくつかの実施形態では、工程（ｅ）から得られる水溶液中の精製された完全長ｍＲＮＡもまた、（ｉｖ）事前中止（ｐｒｅ－ａｂｏｒｔｅｄ）ＲＮＡ配列を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、事前中止ＲＮＡ配列は、ショートマーを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｅ）から得られる水溶液中の精製された完全長ｍＲＮＡもまた、（ｖ）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、工程（ｅ）から得られる水溶液中の精製された完全長ｍＲＮＡもまた、（ｉｖ）事前中止ＲＮＡ配列および（ｖ）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、工程（ａ）において、ＲＮＡポリメラーゼはＳＰ６ポリメラーゼであり、工程（ｅ）から得られる水溶液中の精製された完全長ｍＲＮＡもまた、（ｖ）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。
いくつかの実施形態では、この製造方法は、クロマトグラフィーを使わずに、高純度ｍＲＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、この製造方法は、アルコール系溶媒を使用せずに、高純度ｍＲＮＡを生成する。いくつかの実施形態では、この製造方法は、クロマトグラフィーおよびアルコール系溶媒を使用しないで、高純度ｍＲＮＡを生成する。
様々な実施形態によれば、本発明は、様々な長さのインビトロ合成されたｍＲＮＡを精製するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、または１５ｋｂを超える長さのインビトロ合成されたｍＲＮＡを精製ために使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、典型的には安定性を強化する１つ以上の修飾を含有するｍＲＮＡを精製するために使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸塩骨格、５’および／または３’非翻訳領域から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、修飾されていないインビトロ合成されたｍＲＮＡを精製するために使用される。
通常、ｍＲＮＡは、安定性を強化するために修飾される。ｍＲＮＡの修飾は、たとえばＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。本発明による修飾されたｍＲＮＡは、従って、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体コード化ｍＲＮＡ（例えば、重鎖および軽鎖コード化ｍＲＮＡ）は、天然に存在するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成することができ、これには、これらに限定されないが、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、およびプリンおよびピリミジンの修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として、例えば、１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、プソイドウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－プソイドウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ベータ－Ｄ－マンノシル－クエオシン、ワイブトキソシン、およびホスホロアミダイト、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン、およびイノシン等が含まれる。こうした類似体の調製は、例えば、米国特許 第４，３７３，０７１号、米国特許 第４，４０１，７９６号、米国特許 第４，４１５，７３２号、米国特許 第４，４５８，０６６号、米国特許 第４，５００，７０７号、米国特許 第４，６６８，７７７号、米国特許 第４，９７３，６７９号、米国特許 第５，０４７，５２４号、米国特許 第５，１３２，４１８号、米国特許 第５，１５３，３１９号、米国特許 第５，２６２，５３０号、および第５，７００，６４２号から当業者に既知であり、その開示は参照によりその全範囲において本明細書に含まれる。
典型的には、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ末端（５’）上への「キャップ」の付加、およびＣ末端（３’）上への「テール」の付加を含む。キャップの存在は、大半の真核細胞で見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して精製されるｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、以下のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去して２つの末端リン酸を残し、その後、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’５’５三リン酸結合を生成し、その後、グアニンの７－窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例には、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、およびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、インビトロ転写反応から提供されるｍＲＮＡが、望ましいが、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されるｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの他の供給源が、本発明の範囲内であると意図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における精製のためのｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば、鉄応答性要素、を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞内のｍＲＮＡの位置安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５０～５００ヌクレオチド長またはそれ以上であり得る。
本発明は、任意のタンパク質をコードするｍＲＮＡを精製するために使用することができる。本明細書に記載される方法を使用して精製されたｍＲＮＡの非限定的な実施例を、以下のセクションに提示する。
実施例１．ｍＲＮＡの合成
ＩＶＴ反応条件
以下の実施例では、別段の記載がない限り、Ｔ７ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼのいずれかを使用して、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介してｍＲＮＡを合成した。簡潔に述べると、ＳＰ６ポリメラーゼＩＶＴ反応では、転写されたｍＲＮＡの各グラムについて、ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、５ｍＭ ＮＴＰｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ、および反応緩衝液（１０ｘ－２５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのスピルミジン、５０ｍＭのＮａＣｌ）と、２０ｍｇの線状化二本鎖ＤＮＡプラスミドを含有する反応物をＲＮａｓｅを含まない水で調製し、次いで、３７Ｃで、６０分間でインキュベートした。次に、反応をＤＮａｓｅ ＩおよびＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（１０ｘ－１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．６）の添加によりクエンチして、精製のための調製において二本鎖ＤＮＡ鋳型の消化を促進した。最終反応体積は２０４ｍＬであった。
５’キャップ
別段の記載がない限り、ＩＶＴ転写ｍＲＮＡは、ＩＶＴ反応の一部としてキャップ構造を含めるか、またはその後の酵素的工程で、その５’末端でキャップされた。ＩＶＴ反応の一部としてのキャッピングについては、キャップ類似体を、新生ＲＮＡ鎖の最初の「塩基」として組み込むことができる。キャップ類似体は、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、Ｃａｐ２、ｍ６Ａｍ、または非天然キャップであってもよい。あるいは、キャップのないかつ精製されたインビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡは、ＩＶＴ後に酵素的に修飾されて、例えば、グアニル酸トランスフェラーゼを使用する５’Ｎ７－メチルグアニル酸キャップ０構造の付加により、およびＦｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２００５，８６，１２３９－１２４９に記載されているように、２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼを使用してＣａｐ１構造をもたらす最後から２番目のヌクレオチドの２’Ｏ位置でのメチル基の付加により、キャップを含むことができる。
３’テール
別段の記載がない限り、ＩＶＴ転写されたｍＲＮＡは、その３’末端で、線状化プラスミドにテール鋳型を含めることによってテーリングされ、これは、ＩＶＴ反応の一部として、またはその後の酵素的工程でｍＲＮＡをテーリングする。ＩＶＴ反応の一部としてのテーリングについては、ポリＡテールまたは類似の適切なテールが、ＩＶＴプロセスの一部としてｍＲＮＡ上に形成されるように、ポリＴまたは類似のテーリング機能をｐＤＮＡ鋳型に組み込むことが行われる。あるいは、ポリＡテールは、ＩＶＴ反応の後に、例えば、ポリＡポリメラーゼを使用して、ＩＶＴ産生ｍＲＮＡの３’末端に酵素的に付加することができる。
実施例２．ｍＲＮＡのＶＯＣを含まないポリマー誘導沈殿を介した、ｍＲＮＡの精製
この実施例は、ｍＲＮＡ精製のｍＲＮＡ沈殿工程中に、エタノールなどの揮発性有機化合物（ＶＯＣ）の代わりにポリマーを使用できることを示す。かかるポリマー誘導沈殿法は、治療用途に適した最終収率および純度レベルを提供する。
実施例１に記載されるように、３つの５ｍｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡのバッチをＩＶＴ合成を介して合成し、各バッチを以下に記載される３つの異なる条件で沈殿させた。
条件１：エタノールおよびＧＳＣＮ（実験対照）
１体積のｍＲＮＡを、２．３体積の５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液と混合し、最終濃度を２Ｍ ＧＳＣＮとした。その後、１．７体積の１００％のエタノールを懸濁液に加え、エタノールの最終濃度を３４％とした。
条件２：ＰＥＧ－６０００およびＧＳＣＮ（エタノールを含まないポリマー誘導沈殿）
１体積のｍＲＮＡを、２．３体積の５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液と混合し、最終濃度を２Ｍ ＧＳＣＮとした。その後、１．７体積の５０％のＰＥＧ－６０００を懸濁液に加え、ＰＥＧ－６０００の最終濃度を１７％とした。
条件３：ＰＥＧ－６０００およびＮａＣｌ（エタノール含まないポリマー誘導沈殿）
沈殿工程を、Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｔｅｓ＆Ｔｉｐｓ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００６）３１１－３１３に記載される条件下で行った。１体積のｍＲＮＡを、ＮａＣｌと混合し、ＮａＣｌの最終濃度を５００ｍＭで得た。次いで、５０％のＰＥＧ－６０００を懸濁液に加え、ＰＥＧ－６０００の最終濃度を１９％とした。
各条件で沈殿したｍＲＮＡ試料を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラムで捕捉し、１０ｍｌの８０％エタノールで２回洗浄し、５ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。溶解したｍＲＮＡ試料の濃度を、２６０ｎｍでの吸光度を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計によって定量した。各沈殿条件の収量を図１に示す。さらに、残留プロセス酵素の存在を、以下に記載する銀染色を介して検出し、結果を図２に示す。
データは、３つの沈殿条件が、精製後の同様のｍＲＮＡ収量をもたらしたことを示す。沈殿条件１および２では、図２に示すように、銀染色による観察可能なプロセス酵素がない、非常に純粋なｍＲＮＡ試料が得られた。しかしながら、ＰＥＧ－６０００およびＮａＣｌ（条件３）を介したポリマー誘導沈殿は、プロセス酵素の存在と一致するバンドを示す試料が得られ、これは治療用途に許容可能とするため追加の精製工程を必要とする。本明細書のデータは、条件２によるｍＲＮＡ沈殿が、ｍＲＮＡの精製に使用して治療用途に十分な収量および純度レベルを達成できることを支持する。
ｍＲＮＡ純度－残留プロセス酵素検出（銀染色）
残留ＩＶＴ酵素および任意選択でのキャップおよび／またはテール酵素に関して、ｍＲＮＡ純度を銀染色によって評価した。具体的にいうと、以下の残留プロセス酵素の各々は、このアプローチを使用して検出することができる。ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ阻害剤、ピロホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ（ＧｕａＴ）、２’－ＯＭ、およびポリＡポリメラーゼ、ならびに銀染色ゲル調製物の一部として使用される酵素、ＲＮａｓｅ Ｉ。具体的には、以下の染色前試料調製物を用いて、銀染色ゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎキットに従って実行した。１５．５μｌの１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡを、４μｌのＲＮａｓｅＩ（１００Ｕ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７Ｃで３０分間処理した。試料を、還元試薬を用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＤＳローディング緩衝液中で調製し、最終的に１０％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした。電気泳動を２００Ｖで３５分間行った。ゲルを、Ｓｉｌｖｅｒ Ｑｕｅｓｔ染色キットを使用して染色し、８分間現像した。精製されたｍＲＮＡを含む試料は、特定のプロセス酵素のバンドが見えない場合、特定のプロセス酵素を実質的に含まないと見なされた。
実施例３．ｍＲＮＡのポリマー誘導沈殿におけるポリマー比の範囲を試験する
本実施例は、様々な実施形態によると、治療用途に適したｍＲＮＡを精製するために、異なる比率のポリマーが、ｍＲＮＡのポリマー誘導沈殿に使用できることを示す。
７つの５ｍｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡのバッチを、上述のようにＩＶＴ合成により合成し、各バッチを以下の表１に示す異なる条件で沈殿させた。
Figure 2022532214000002
各条件で沈殿したｍＲＮＡ試料を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラムで捕捉し、１０ｍｌの８０％エタノールで２回洗浄し、５ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。溶解したｍＲＮＡ試料の濃度を、２６０ｎｍでの吸光度を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計によって定量した。各沈殿条件の収量を図３に示す。さらに、残留プロセス酵素の存在は、実施例２に記載される銀染色を介して検出され、結果は図４に示される。
データは、ポリマー誘導性ｍＲＮＡの沈殿を使用した精製ｍＲＮＡの６つの条件すべてが、精製後のｍＲＮＡ収量が高くなったことを示しており、これは従来のエタノール沈殿法と類似していた（図３）。さらに、最終ＰＥＧ濃度が２０％未満の（または５０％のＰＥＧ－６０００の比率が２．０未満の）、ポリマー誘導沈殿を介して精製されたｍＲＮＡ試料は、図４に示す銀染色物による観察可能なプロセス酵素のない、非常に純粋なｍＲＮＡ試料をもたらした（レーン５～８）。しかしながら、２０％を超える最終ＰＥＧ－６０００濃度を有するポリマー誘導沈殿を介して精製されたｍＲＮＡ含む試料は、残留プロセス酵素を示した（レーン９）。興味深いことに、２４％のＰＥＧ－６０００を用いたポリマー誘導沈殿は、２２％のＰＥＧ－６０００ポリマー誘導沈殿を用いた試料よりも、精製された試料において、より多くの残留プロセス酵素をもたらした。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、より高い％のＰＥＧ－６０００は、核酸およびプロセス酵素の両方の沈殿を促進すると考えられる。
総合すると、本明細書でのデータは、ポリマー誘導沈殿を介したｍＲＮＡ精製が、ｍＲＮＡを精製して、治療的使用のための十分な収量および純度レベルを達成するための実行可能な方法であることをさらに支持する。ＰＥＧ－６０００の最終濃度が７～２４％であるポリマー誘導沈殿は、効率的なｍＲＮＡ沈殿および回収をもたらす。残りの実施例については、最終ＰＥＧ－６０００濃度１２％をポリマー誘導沈殿に使用した。
実施例４．洗浄工程におけるｍＲＮＡのエタノール含まない精製および異なるポリマーの効果。
本実施例は、ｍＲＮＡ沈殿工程および洗浄工程の両方で、エタノールなどのＶＯＣを使わずにポリマーを使用して、治療用途に適した収量および純度レベルでｍＲＮＡを精製できることを示す。
実施例１に記載されるように、１２個の５ｍｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡバッチをＩＶＴ合成を介して合成し、５’キャップおよび３’ポリＡテールを付加した。得られた１２個の５ｍｇのＩＶＴ ｍＲＮＡバッチを、ポリマー誘導沈殿を介して各々沈殿させた。各５ｍｇバッチについて、５ＭのＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液を、２．７ＭのＧＳＣＮの最終濃度になるように添加した。次いで、５０％のＰＥＧ－６０００を懸濁液に加えて１２％のＰＥＧ－６０００の最終濃度にした。沈殿したｍＲＮＡ試料を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラムで捕捉し、８０％エタノールの代わりに、１０ｍｌの、以下の表２に列挙された下記ポリマー洗浄緩衝液のうちの１つで２回洗浄した。ＩＶＴ合成されたｍＲＮＡの精製には、ＶＯＣまたはアルコールは全く使用されなかった。具体的には、沈殿工程または洗浄工程では、ＶＯＣまたはアルコールは使用されなかった。
Figure 2022532214000003
１２個の試料を５ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶解し、２６０ｎｍでの吸光度を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計によって濃度を定量した。各沈殿条件の収量を図５に示す。さらに、残留プロセス酵素の存在を、実施例２に記載される銀染色を介して検出し、結果は図６に示される。
図５に示すように、洗浄緩衝液中のポリマーの割合と回収されたｍＲＮＡの量との間に強い相関が観察された。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、これらの洗浄緩衝液への水の追加は、これらの洗浄工程中にｍＲＮＡの可溶化をもたらすと考えられる。
全体的に、驚くべきことに、データは、ｍＲＮＡが、ポリマー誘導沈殿とそれに続くポリマー洗浄を介して、完全にエタノールを含まずに精製でき、治療用途に適した驚くべき収量および純度レベルを達成できることを示す。最終濃度が９０～１００％のＰＥＧ－４００を含む洗浄緩衝液は、図５に示すように高い収量をもたらし、図６に示される銀染色による観察可能なプロセス酵素のない、高純度のｍＲＮＡ試料を得た（レーン３～４）。ＰＥＧ－４００は、試験した緩衝液の粘度が最低であるため、異なるスケールで異なる系で使用するために修正可能である。これらのデータを総合すると、本明細書に記載のポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄を介したエタノールを含まないｍＲＮＡ精製を使用して、エタノールを含むアルコールなどのＶＯＣを用いる業界標準のｍＲＮＡ精製方法と同等またはそれ以上の収量回収率、完全性プロファイル、純度および機能性をもたらす高品質のｍＲＮＡを効率的に精製し得ることを実証した。さらに、本発明は、スケーラビリティおよび安全性の顕著な追加利益を有するが、これは、エタノールを含むアルコールなどのＶＯＣを用いる既存の業界標準の方法では入手できない。
実施例５．ＯＴＣおよびＣＦＴＲｍＲＮＡのエタノールを含まない精製および分析
本実施例は、上述のエタノールを含まないｍＲＮＡ精製方法を使用して、構築物のサイズまたはヌクレオチド組成物に関係なくｍＲＮＡを精製できることを示す。さらに、本明細書に記載の方法による精製ｍＲＮＡは、高収率、純度、および完全性をもたらす。
５ｍｇのバッチのＯＴＣｍＲＮＡ（約１４００ｎｔ）および５ｍｇのＣＦＴＲｍＲＮＡ（約４６００ｎｔ）を、実施例１に記載されるようにＩＶＴ合成を介して合成した。得られたＩＶＴ ｍＲＮＡ試料を、ポリマー誘導沈殿を介して沈殿させた。各５ｍｇバッチについて、５ＭのＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液を、２．７ＭのＧＳＣＮの最終濃度になるように添加した。次いで、５０％のＰＥＧ－６０００を懸濁液に加えて、１２％のＰＥＧ－６０００の最終濃度にした。沈殿したｍＲＮＡ試料をＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラムで捕捉し、１０ｍＬの９０％ＰＥＧ－４００洗浄緩衝液で２回洗浄した。洗浄された試料を、５ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶解し、緩衝液を１００ｋＤのＡｍｉｃｏｎスピンカラムを使用して超純水に交換し、２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
次いで、実施例１に記載される酵素的工程を介して、精製および濃縮されたＩＶＴ ｍＲＮＡをキャッピングし、テーリングした。５’キャップおよび３’テールを有するｍＲＮＡを、エタノールを含まないポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄を介して精製した。具体的には、各バッチの沈殿工程について、５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液を、２．７ＭのＧＳＣＮの最終濃度になるように添加した。次いで、５０％のＰＥＧ－６０００を懸濁液に加えて、１２％のＰＥＧ－６０００の最終濃度とした。沈殿したｍＲＮＡ試料をＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラムで捕捉し、１０ｍＬの９０％ＰＥＧ－４００洗浄緩衝液で２回洗浄した。洗浄された試料を、５ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶解し、緩衝液を１００ｋＤのＡｍｉｃｏｎスピンカラムを使用して超純水に交換し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
図７に示すように、各最終ｍＲＮＡ産物の収率を決定した。データは、５ｍｇスケールのＯＴＣおよびＣＦＴＲｍＲＮＡのｍＲＮＡ収率が、それぞれ８０％および７８％であることを示した。これらの値は、業界標準のｍＲＮＡ精製方法の収率の範囲内またはそれを上回っていた。
最終ｍＲＮＡ産物の純度および完全性を、以下に記載されるように分析した。完全性およびポリＡテール長を、図８に示すように、キャピラリー電気泳動を使用して評価した。結果は、ＯＴＣおよびＣＦＴＲｍＲＮＡの両方の５ｍｇスケールの精製からの最終産物が、対照（現行エタノールの１０グラムのＯＴＣ）のピークと類似した明確なピークを有することを示した。さらに、両方の構築物のテール長は、５００ｎｔの標的範囲内であった（ＯＴＣ＝４６８ｎｔおよびＣＦＴＲ＝６４９ｎｔ）。銀染色を介して評価した残留プロセス酵素の存在は、どちらのｍＲＮＡ構築物の５ｍｇスケールの精製でも検出されなかった。以下に記載されるように、ｄｓＲＮＡ Ｊ２ドットブロットを介して純度をさらに確認した。図１０に示されるように、結果は、ｄｓＲＮＡが、どちらの構築物の最終産物においても検出されなかったことを示した。最後に、ＥＬＩＳＡを使用して、表３に示すように、ＰＥＧが透析工程中に完全に除去されたことを確認した。
Figure 2022532214000004
総合すると、データは、本明細書に記載されたポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄を介したｍＲＮＡのエタノールを含まない精製が、異なる長さおよび構築物のｍＲＮＡの精製に適用できることを示した。本明細書に記載される方法によって精製されたｍＲＮＡは、上述の重要な開示特性に関して、これまでの大規模なｍＲＮＡロットを満たすか、またはそれを超える。したがって、本明細書に記載される方法の高収率、完全性、および純度レベルは、治療的使用に適している。
精製ｍＲＮＡの完全性の分析
ＲＮＡ完全性分析（フラグメントアナライザー－キャピラリー電気泳動）
ＲＮＡの完全性およびテール長は、ＣＥフラグメントアナライザーおよび市販のＲＮＡ検出キットを使用して評価した。完全性のピークプロファイルおよびテール長のサイズシフトの分析を、未加工データならびに正規化データセットに対して行った。
ｍＲＮＡキャップ種分析（ＨＰＬＣ／ＭＳ）
最終精製されたｍＲＮＡ産物中に存在するキャップ種を、米国特許第９，９７０，０４７号に記載されるクロマトグラフィー法を使用して定量化した。この方法は、キャップされていないｍＲＮＡを総ｍＲＮＡのパーセントとして正確に定量化することができる。この方法はまた、ＣａｐＧ、Ｃａｐ０、およびＣａｐ１の量などの特定のキャップ構造の量を定量化することもでき、総ｍＲＮＡのパーセンテージとして報告され得る。
ｄｓＲＮＡ検出（Ｊ２ドットブロット）
個々のｍＲＮＡ試料中のｄｓＲＮＡの存在は、Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１．３９，Ｎｏ．２１によって以前に記述されたＪ２抗ｄｓＲＮＡドットブロットを使用して測定された。簡潔に述べると、２００ｎｇのＲＮＡまたは２５ｎｇのｄｓＲＮＡ対照のいずれかを、超荷電（ｓｕｐｅｒ ｃｈａｒｇｅｄ）Ｎｙｔｒａｎ上にブロットした。ブロットを乾燥させ、５％脱脂粉乳でブロックし、次いでブロット当たり１μｇのＪ２抗体でプローブした。ブロットを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスでプローブしてから、再度洗浄した。ブロットを、ＥＣＬとウェスタンブロット検出試薬とで検出し、画像をフィルムに捕捉した。精製されたｍＲＮＡを含む試料は、それぞれのブロットが、ｄｓＤＮＡを欠いた対照と比較して、目に見えるほど暗い着色を示さなかった場合、ｄｓＲＮＡを実質的に含まないと見なされた。
ＰＥＧ定量／検出ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍキット）
ｍＲＮＡ試料中の様々な分子量ＰＥＧ種の存在を、ＡｂｃａｍからのＰＥＧ－ＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。簡潔に述べると、１０ｎｇ／ｍＬという低い試料中のＰＥＧを検出し、そのレベルで高分子量ＰＥＧを正確に定量できる競合阻害ＥＬＩＳＡを使用した。標準的なエタノールベースの沈殿法、ならびに溶媒なし、１／１０希釈および１／１００希釈での下記のエタノールを含まない方法を用いてｍＲＮＡ試料を精製した。検出限界は、１０ｎｇ／ｍｇのＲＮＡ、１００ｎｇ／ｍｇのＲＮＡ、および１ｕｇ／ｍｇのＲＮＡを、それぞれ、溶媒なしの濃度で、１／１０希釈で、および１／１００希釈で検出する。
実施例６．１グラムおよび１０グラムのスケールでのエタノールを含まないｍＲＮＡの精製
本実施例は、上述のエタノールを含まないｍＲＮＡ精製方法を使用して、治療用途に必要な規模および品質でｍＲＮＡを精製できることを示す。本明細書に記載される方法に従って１グラムおよび１０グラムのスケールで精製されたｍＲＮＡは、高収率、純度、および完全性をもたらし、方法のスケーラビリティを示す。
実施例１に記載されるＩＶＴ合成を介して、ＯＴＣ ｍＲＮＡを１グラムスケールおよび１０グラムスケールで合成し、ＣＦＴＲ ｍＲＮＡを１０グラムスケールで合成した。得られたＩＶＴ ｍＲＮＡ試料を、ポリマー誘導沈殿を介して沈殿させた。各ｍＲＮＡ試料について、５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液を、２．７ＭのＧＳＣＮの最終濃度になるように添加した。次いで、５０％のＰＥＧ－６０００を懸濁液に加えて、１２％のＰＥＧ－６０００の最終濃度にした。Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃセルロース系の濾過助剤を、濾過助剤対ＲＮＡの比率（ｗｔ／ｗｔ）で１０対１の比率で、沈殿したｍＲＮＡに添加し、よく混合した。濾過助剤を用いて、１グラムスケールで沈殿したｍＲＮＡ試料を、０．２２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）真空フィルタフラスコで捕捉した。濾過助剤を用いて、１０グラムスケールで沈殿したｍＲＮＡ試料を、１μｍのポリプロピレンフィルタバッグを備えたＨ３００Ｐ濾過遠心分離機で捕捉した。次いで、１グラムおよび１０グラムのｍＲＮＡ試料を、１Ｌまたは１０Ｌの９０％ＰＥＧ－４００洗浄緩衝液で２回洗浄した。洗浄および沈殿したｍＲＮＡを、手動で、または１μｍのポリプロピレンフィルタバッグを備えたＨ３００Ｐ濾過遠心分離機で濾過することにより、フィルタから除去した。次いで、洗浄および沈殿したｍＲＮＡを、１Ｌまたは１０ＬのＲＮａｓｅを含まない水で可溶化して、緩衝液を１００ｋＤスペクトルＴＦＦカラム（ｍＰＥＳ）を使用して超純水に交換し、２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
次いで、実施例１に記載される酵素反応によって精製および濃縮されたＩＶＴ ｍＲＮＡをキャッピングし、テーリングした。５’キャップおよび３’テールを有するｍＲＮＡを、エタノールを含まないポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄を介して精製した。それぞれについて、５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液を、２．７ＭのＧＳＣＮの最終濃度になるように添加した。次いで、５０％のＰＥＧ－６０００を懸濁液に加えて、１２％のＰＥＧ－６０００の最終濃度にした。Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃセルロース系濾過助剤を、濾過助剤対ＲＮＡの比率（ｗｔ／ｗｔ）で１０対１の比率で、沈殿したｍＲＮＡに添加し、よく混合した。沈殿したｍＲＮＡを、１Ｌまたは１０Ｌの９０％ＰＥＧ－４００洗浄緩衝液で２回洗浄した。洗浄されたｍＲＮＡ試料を、手動で、または１μｍのポリプロピレンフィルタバッグを備えたＨ３００Ｐ濾過遠心分離機で濾過することにより、フィルタから除去した。ｍＲＮＡ試料を、１Ｌまたは１０ＬのＲＮａｓｅ含まない水に溶解し、緩衝液を１００ｋＤスペクトルＴＦＦカラム（ｍＰＥＳ）を使用して超純水に交換し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
図７に示すように、各最終ｍＲＮＡ産物の収率を決定した。データは、ＯＴＣ ｍＲＮＡの１グラムスケールおよび１０グラムスケールとＣＦＴＲ ｍＲＮＡの１０グラムスケールのｍＲＮＡの収率が、すべて８０％超であり、９３％もの高さになることを実証した。これらの値は、業界標準のｍＲＮＡ精製方法の収率の範囲内またはそれを上回っていた。
最終ｍＲＮＡ産物の純度および完全性を、上述のように分析した。完全性およびポリＡテール長を、図８に示すように、キャピラリー電気泳動を使用して評価した。結果は、ＯＴＣおよびＣＦＴＲｍＲＮＡの１グラムおよび１０グラムスケールの精製からの最終産物が、対照（現行エタノール１０グラムのＯＴＣ）のピークと類似した明確なピークを有することを示した。１０グラムスケールの精製されたｍＲＮＡについて、キャップ種を、実施例２に記載されるＨＰＬＣ－ＭＳアッセイを使用して定量化した。さらに、両方の構築物のテール長は、標的範囲内であった（１グラムでのＯＴＣ＝３０６ｎｔ、１０グラムでのＯＣＴ＝１５８ｎｔ、１０グラムでのＣＦＴＲ＝７１２ｎｔ）。銀染色を介して評価した残留プロセス酵素の存在は、図９に示すように、両方のｍＲＮＡ構築物の１グラムスケールおよび１０グラムスケールの精製の両方において検出されなかった。実施例５に記載されるように、ｄｓＲＮＡ Ｊ２ドットブロットを介して純度をさらに確認した。図１０に示されるように、結果は、ｄｓＲＮＡが１グラムスケールおよび１０グラムスケールの両方で最終産物において検出されなかったことを示した。最後に、ＥＬＩＳＡを使用して、ＰＥＧが透析工程中に完全に除去されたことを確認した。
総合すると、データは、臨床治療での使用に必要な、必要規模および品質でｍＲＮＡを精製するための、ポリマー誘導沈殿およびポリマー洗浄を介したｍＲＮＡのエタノールを含まない精製のスケーラビリティを実証する。本明細書に記載される方法によって１グラムおよび１０グラムスケールで精製されたｍＲＮＡは、上述の重要な開示特性に関して、これまでの大規模なｍＲＮＡロットを満たすか、またはそれを超えるものであり、ｍＲＮＡ製造および治療薬における使用方法の適合性を実証している。
本発明は、任意のタンパク質をコードするｍＲＮＡを精製するために使用することができる。方法を使用して精製されたｍＲＮＡの非限定的な例が記載される。
実施例７：洗浄工程におけるエタノールを含まないｍＲＮＡの精製およびＭＴＥＧの効果
本実施例は、両親媒性ポリマーＭＴＥＧを、エタノールなどのＶＯＣを使わずに、洗浄工程中に使用して、治療用途に適した収率および純度レベルでｍＲＮＡを精製できることを示す。
表４は、前述の実施例で試験されたポリマーと比較したＭＴＥＧの特性を示す。ＴＥＧと類似した分子量を有するにもかかわらず、ＭＴＥＧは、メチル基の存在のためにはるかに低い粘度を有する。これは、ＭＴＥＧが水にはるかに近い粘度を有することを意味し、ポンプの使用がより容易であることを意味する。さらに、これは米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって「安全」として分類されているのに対し、ＴＥＧ、ＰＥＧ－４００、およびＰＥＧ－６０００（５０％）は、「一般に安全であると認められている」（ＧＲＡＳ）として分類されている。
Figure 2022532214000005
実施例１に記載されるように、５つの５ｍｇバッチのＣＦＴＲ ｍＲＮＡをＩＶＴ合成を介して合成し、５’キャップおよび３’ポリＡテールを付加した。得られた５個の５ｍｇのＩＶＴ ｍＲＮＡバッチを、ポリマー誘導沈殿を介して各々沈殿させた。沈殿反応におけるｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ（５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液）およびＭＴＥＧ（１００重量／体積％）の体積比は、１：２．３：１であった。沈殿したｍＲＮＡ試料を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラムで捕捉し、８０％エタノールの代わりに２．５ｍｌの、下記の表５に列挙された以下のＭＴＥＧ洗浄緩衝液のうちの１つで、２回洗浄した。ＩＶＴ合成ｍＲＮＡの精製には、ＶＯＣまたはアルコールは使用されなかった。具体的には、沈殿工程または洗浄工程では、ＶＯＣまたはアルコールは使用されなかった。
Figure 2022532214000006
５つの試料を５ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶解し、２６０ｎｍでの吸光度を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計によって濃度を定量した。回収されたＲＮＡの濃度を図１１に示す。
図１１に示すように、洗浄緩衝液中のＭＴＥＧの割合と回収されたｍＲＮＡの量との間に強い相関が観察された。上記に概説したように、いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、これらの洗浄緩衝液への水の追加は、これらの洗浄工程中のｍＲＮＡの可溶化をもたらすと考えられる。図１１に示されるように、最終濃度９０～９５％のＭＴＥＧを含む洗浄緩衝液は、理論的に達成可能な１００％回収率のレベルに唯一近い非常に高い収率をもたらした。純度および回収率は、８０％エタノールを使用する洗浄条件と同等であった。残りの実施例では、洗浄緩衝液として使用するために、９５％のＭＴＥＧ濃度を選択した。
これらのデータはさらに、完全にエタノールを含まないプロセスを使用してｍＲＮＡを精製できることを実証している。
実施例８：洗浄工程におけるエタノールを含まないｍＲＮＡの精製およびＭＴＥＧの効果。
本実施例は、両親媒性ポリマーＭＴＥＧを、エタノールなどのＶＯＣを使わずに、ｍＲＮＡ沈殿工程および洗浄工程の両方で使用して、治療用途に適した収率および純度レベルでｍＲＮＡを精製できることを示す。
実施例１に記載されるように、５つの５ｍｇバッチのＣＦＴＲ ｍＲＮＡを、ＩＶＴ合成を介して合成し、５’キャップおよび３’ポリＡテールを付加した。得られた５ｍｇのＩＶＴ ｍＲＮＡバッチのうち４つを、ポリマー誘導沈殿を介して各々沈殿させた。各５ｍｇバッチについて、ｍＲＮＡ、５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液、およびＭＴＥＧを、以下の表６に提示する体積で組み合わせて、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液を形成した。沈殿したｍＲＮＡ試料をＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍａｘｉカラム上で捕捉し、２．５ｍｌの９５％ＭＴＥＧで２回洗浄した。ＩＶＴ合成ｍＲＮＡの精製には、ＶＯＣまたはアルコールは全く使用されなかった。具体的には、沈殿工程または洗浄工程では、ＶＯＣまたはアルコールは使用されなかった。実験対照として、ｍＲＮＡの１バッチを、実施例２に記載されるようにｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ、およびエタノールの体積比（１００重量／体積％）１：２．３：１．７によるエタノールで沈殿させ、２ｍｌの８０％エタノールを使用して２回洗浄した。
Figure 2022532214000007
５つの試料を５ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶解し、２６０ｎｍでの吸光度を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計によって濃度を定量した。銀染色を使用して観察された沈殿および洗浄工程から生成されたｍＲＮＡ試料の純度を図１２に示す（レーン６～１０）。ＭＴＥＧを使用した沈殿および洗浄は、非常に効率的なｍＲＮＡ回収およびｍＲＮＡの精製を達成した。１体積のｍＲＮＡおよび２．３体積のＧＳＣＮに、１～２体積のＭＴＥＧの添加をすると、同等のレベルの純度および収率を示した。図１２に示すように、１体積のｍＲＮＡと２．３体積のＧＳＣＮに、２．５体積のＭＴＥＧの添加をすると、ゲル上にかすかな追加のバンドが生じた。これは、より高いＭＴＥＧ濃度が、ＩＶＴ反応からのタンパク質の沈殿をもたらすことを示唆している可能性がある。
総合すると、これらのデータは、沈殿中および洗浄緩衝液中の両方でＭＴＥＧを使用したｍＲＮＡ精製が、治療用途に十分な収率および純度レベルを達成するｍＲＮＡを精製するための実行可能な方法であることを裏付けている。
これらのデータを総合すると、ＭＴＥＧ ｍＲＮＡ精製を使用して、エタノールを含むアルコールなどのＶＯＣを用いる業界標準のｍＲＮＡ精製方法と同等またはそれ以上の収量回収率、完全性プロファイル、および純度をもたらす高品質のｍＲＮＡを効率的に精製し得ることを実証した。ＭＴＥＧは、沈殿中にエタノールおよびＰＥＧ－６０００などの高分子量ポリマーの両方を置き換えることができる。さらに、ＭＴＥＧは、洗浄工程でエタノールまたはＰＥＧ－４００などの低分子量ポリマーを置き換えることもでき、エタノールを含まない精製に使用するための最も汎用的なポリマーとなる。さらに、上で概説したように、本明細書に記載の他のポリマーベースのエタノールを含まない方法と同様に、ＭＴＥＧベースの精製は、スケーラビリティおよび安全性の大幅な追加利益を有するが、これは、エタノールを含むアルコールなどのＶＯＣを用いる既存の業界標準の方法では利用できない。
実施例９：深度濾過および遠心分離を使用した精製に適用可能なＭＴＥＧポリマー誘導沈殿およびＭＴＥＧ洗浄緩衝液。
本実施例は、その低粘度および関連する優れた取り扱い特性により、ＭＴＥＧが驚くほど多用途であり、様々なスケールで様々なエタノールを含まないｍＲＮＡ精製方法に利用することができ、収量回収率が９０％を超えることを実証する。
試料を上記の実施例に従って調製し、深度濾過（ＤＦ）または遠心分離のいずれかを使用して精製した。
深層濾過精製
より小さなバッチについては、７．５ｇのＯＴＣ ｍＲＮＡをＩＶＴ合成を介して合成し、５’キャップおよび３’ポリＡテールを、実施例１およびスケーリング反応条件に記載されるように付加した。ｍＲＮＡを、実施例７に示したのと同じＭＴＥＧポリマー誘導沈殿を使用して沈殿させた。したがって、沈殿反応におけるｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ（５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液）およびＭＴＥＧ（１００重量／体積％）の体積比は１：２．３：１であった。懸濁液を、底部に取り付けられたインペラを備えた６０ＬのＬｅｅ容器（Ｌｅｅ ｖｅｓｓｅｌ）内で６０Ｈｚで混合した後、６８ｇ／ｍ２の負荷容量を有する０．１１ｍ２の深層型フィルタ上に６０Ｌ／分／ｍ２の流量でロードした。沈殿した保持されたｍＲＮＡを、流量６０Ｌ／分／ｍ２の９０％のＭＴＥＧを使用して洗浄した。
より大きなバッチについては、１５ｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡをＩＶＴ合成を介して合成し、５’キャップおよび３’ポリＡテールを、実施例１およびスケーリング反応条件に記載されるように付加した。ｍＲＮＡを、実施例７に示したのと同じＭＴＥＧポリマー誘導沈殿を使用して沈殿させた。したがって、沈殿反応におけるｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ（５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液）およびＭＴＥＧ（１００重量／体積％）の体積比は１：２．３：１であった。懸濁液を、底部に取り付けられたインペラを備えた６０ＬのＬｅｅ容器内で６０Ｈｚで混合した後、６８ｇ／ｍ２の負荷容量を有する０．１１ｍ２の深層型フィルタ上に６０Ｌ／分／ｍ２の流量でロードした。沈殿した保持されたｍＲＮＡを、流量６０Ｌ／分／ｍ２の９５％のＭＴＥＧを使用して洗浄した。洗浄中に圧力が上昇すると、流量が３０Ｌ／分／ｍ２に減少した。濾過プロセスを、同じ０．１１ｍ２の深層型フィルタ上で繰り返した。
遠心分離精製
１５ｇのＣＦＴＲ ｍＲＮＡをＩＶＴ合成を介して合成し、５’キャップおよび３’ポリＡテールを、実施例１およびスケーリング反応条件に記載されるように付加した。ｍＲＮＡを、実施例７に示したのと同じＭＴＥＧポリマー誘導沈殿を使用して沈殿させた。したがって、沈殿反応におけるｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ（５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴ緩衝液）およびＭＴＥＧ（１００重量／体積％）の体積比は１：２．３：１であった。懸濁液を、底部に取り付けられたインペラを備えた６０ＬのＬｅｅ容器内で６０Ｈｚで混合し、セルロース濾過助剤を、１：１０のｍＲＮＡ：濾過助剤の質量比で添加した。懸濁液を濾過遠心分離機に装填し、９５％ＭＴＥＧで洗浄した。
両方の精製戦略について、最終的なｍＲＮＡ収量を、２８０ｎｍでの吸光度を使用してＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計により定量した。ＲＮＡの回収率％を以下の表７に示す。さらに、ＣＥスメア分析を使用してｍＲＮＡの完全性を評価し、残留プロセス酵素を検出するために銀染色分析を使用してｍＲＮＡ純度を評価した。
結果
７．５ｇ以上のバッチサイズでは、沈殿ポリマーおよび洗浄緩衝液成分としてのＭＴＥＧの使用により、ｍＲＮＡの非常に高い％回収率を確保した。表７に示すように、同じ沈殿プロトコルを使用して、ＭＴＥＧを、遠心分離機ベースの精製プロセス、ならびに、フィルタ膜またはフィルタカートリッジベースの精製プロセス、例えば、深層濾過（ＤＦ）などの両方で、沈殿緩衝液および洗浄緩衝液の両方として用いることができる。遠心分離の使用により、ｍＲＮＡのほぼ１００％の回収が得られた（以下の表７を参照されたい）。
Figure 2022532214000008
さらに、沈殿工程および洗浄工程の両方でのＭＴＥＧの使用は、ｍＲＮＡの完全性および純度を維持した。図１３に示すように、最終的なＯＴＣの完全性（ＣＥ）は約９２％であった。さらに、銀染色物上では、残留プロセス酵素は検出されなかった（図１４を参照されたい）。深層濾過後の１５ｇのＣＦＴＲ試料については、完全性は約７３％であり（図１５を参照されたい）、銀染色でのプロセス酵素の非存在を考慮すると純度は非常に高かった（図１６）。最後に、遠心分離後の１５ｇのＣＦＴＲ試料については、収率１００％であるだけでなく、完全性も約８２％であり（図１７）、銀染色は残渣プロセス酵素を示さなかった（図１８）。したがって、ＭＴＥＧは、エタノールを使用することなく、ポリマー誘導沈殿を使用してｍＲＮＡを精製するのに非常に好適なポリマーである。
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または日常的な実験作業を越えない手法を使用して確認できるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。

Claims (93)

  1. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する方法であって、
    ａ）高モル塩溶液および両親媒性ポリマーを含む懸濁液中で前記ｍＲＮＡを沈殿させて、沈殿したｍＲＮＡを提供することと、
    ｂ）前記沈殿したｍＲＮＡを捕捉することと、
    ｃ）工程ｂ）で捕捉された前記沈殿したｍＲＮＡを、洗浄溶液で洗浄して、前記沈殿したｍＲＮＡを精製することと、
    ｄ）工程ｃ）からの前記沈殿したｍＲＮＡを可溶化して、精製されたｍＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法。
  2. 前記精製されたｍＲＮＡ組成物が、短鎖不全型（ｓｈｏｒｔ ａｂｏｒｔｉｖｅ）ＲＮＡ種、長鎖不全型（ｌｏｎｇ ａｂｏｒｔｉｖｅ）ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒、および／または残留塩を含む混入物を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
  3. 前記残留プラスミドＤＮＡが、１０ｐｇ／ｍｇ以下である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記両親媒性ポリマーが、プルロニクス、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記両親媒性ポリマーがＰＥＧである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記懸濁液が、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度のＰＥＧを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記懸濁液が、約５０重量／体積％の濃度のＰＥＧを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記高モル塩溶液が、チオシアン酸グアニジニウム（ＧＳＣＮ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  9. 両親媒性ポリマーを含む洗浄溶液が、工程ｃ）で前記ｍＲＮＡを洗浄するために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記両親媒性ポリマーがＰＥＧを含む、請求項９に記載の方法。
  11. ＰＥＧが、約１０重量／体積％～約１００重量／体積％の濃度で前記洗浄溶液中に存在する、請求項１０に記載の方法。
  12. ＰＥＧが、約５０～約９０重量／体積％の濃度で前記洗浄溶液中に存在する、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記ＰＥＧが、約９０重量／体積％の濃度で前記洗浄溶液中に存在する、請求項１２に記載の方法。
  14. ＰＥＧの分子量が、約２００～４０，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項５～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＰＥＧが、線状、分岐状、Ｙ字形状、またはマルチアーム形状である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ＰＥＧが、線状である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＰＥＧ溶液が、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、およびＰＥＧ４０，０００から選択されるＰＥＧを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＰＥＧ溶液が、ＰＥＧ６，０００を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＰＥＧ溶液が、ＰＥＧ６，０００を含まない、請求項５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ＰＥＧが、ＰＥＧ４００である、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記ＰＥＧ溶液が、１つ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む、請求項５～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＰＥＧポリマーの混合物が、別個の分子量を有するポリマーを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＰＥＧポリマーの混合物が、別個の幾何学的形状を有するポリマーを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記洗浄溶液が、水性である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記洗浄溶液が、アルコールを含まない、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記洗浄溶液が、エタノール、イソプロピルアルコール、またはベンジルアルコールを含まない、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ＰＥＧ溶液が、非水性成分を含む、請求項５～２３のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記非水性成分が、エタノール、イソプロピルアルコール、またはベンジルアルコールである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記沈殿したｍＲＮＡを捕捉することが、フィルタ上で起こる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記フィルタが、精密濾過フィルタまたは限外濾過フィルタから選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記精密濾過フィルタが、０．０５μｍ～１．０μｍの細孔サイズを有する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記精密濾過フィルタが、１，０００キロダルトン（ｋＤａ）を超える公称分子量限界（ＮＭＷＬ）を有する、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記限外濾過フィルタが、０．０５μｍ未満の細孔サイズを有する、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記限外濾過フィルタが、約１ｋＤａ～１，０００ｋＤＡのＮＭＷＬを有する、請求項３３に記載の方法。
  35. 接線流濾過（ＴＦＦ）または透析濾過が、工程ｃ）で前記沈殿したｍＲＮＡを精製するために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  36. 濾過助剤が、使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記濾過助剤が、セルロース系である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記濾過助剤が、珪藻土、および／または火山灰を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記方法が、クロマトグラフィー工程を含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記沈殿したｍＲＮＡを遠心分離して、ｍＲＮＡペレットを得る、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ｍＲＮＡペレットが、緩衝液中に再懸濁される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記緩衝液が、水、トリス－ＥＤＴＡ（ＴＥ）、クエン酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記精製されたｍＲＮＡの収率が、約５０％～約１００％である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記精製されたｍＲＮＡの前記収率が、約７０％～約９９％である、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記精製されたｍＲＮＡの前記収率が、約９０～約９９％である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記精製されたｍＲＮＡの純度が、約６０％～約１００％である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記精製されたｍＲＮＡの前記純度が、約８０％～９９％である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記精製されたｍＲＮＡの前記純度が、約９０％～約９９％である、請求項４７に記載の方法。
  49. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する方法であって、
    ａ）高モル塩溶液および両親媒性ポリマーを含む懸濁液中で前記ｍＲＮＡを沈殿させることと、
    ｂ）前記ｍＲＮＡをフィルタ上に捕捉することと、
    ｃ）工程ｂ）の前記ｍＲＮＡをＰＥＧ溶液で洗浄して、混入物を実質的に含まない精製されたｍＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法。
  50. 前記精製されたｍＲＮＡの収率が、約５０％～約１００％である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記精製されたｍＲＮＡの前記収率が、約７０％～約９９％である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記精製されたｍＲＮＡの前記収率が、約９０～約９９％である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記精製されたｍＲＮＡの純度が、約６０％～約１００％である、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記精製されたｍＲＮＡの前記純度が、約８０％～９９％である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記精製されたｍＲＮＡの前記純度が、約９０％～約９９％である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記沈殿したｍＲＮＡが、少なくとも１００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、１００ｇ、１ｋｇ、１０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトン、もしくは１メートルトンのｍＲＮＡ、またはそれらの間の任意の量を含む、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記沈殿したｍＲＮＡが、１ｋｇを超えるｍＲＮＡを含む、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記両親媒性ポリマーが、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項４９～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記両親媒性ポリマーが、ＰＥＧである、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記高モル塩溶液が、グアニジニウムチオシアネート（ＧＳＣＮ）を含む、請求項４９～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記方法が、エタノールを含まない、請求項４９～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記精製されたｍＲＮＡ組成物が、短鎖不全型ＲＮＡ種、長鎖不全型ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒、および／または残留塩を含む混入物を実質的に含まない、請求項４９～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する方法であって、
    ａ）ＰＥＧを含むグアニジンチオシアネート（ＧＳＣＮ）溶液中で前記ｍＲＮＡを沈殿させることと、
    ｂ）工程ａ）の前記溶液を遠心分離して、ｍＲＮＡペレットを作製することと、
    ｃ）前記ｍＲＮＡペレットを緩衝液中に再懸濁することと、
    ｄ）前記ｍＲＮＡをフィルタ上で捕捉することと、
    ｅ）工程ｄ）の前記ｍＲＮＡをＰＥＧ溶液で洗浄することと、
    ｆ）工程ｅ）の前記洗浄されたｍＲＮＡを可溶化して、混入物を実質的に含まないｍＲＮＡ組成物を得ることと、を含む、方法。
  64. 前記精製されたｍＲＮＡ組成物が、短鎖不全型ＲＮＡ種、長鎖不全型ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む混入物を実質的に含まない、請求項６３に記載の方法。
  65. ｍＲＮＡを作製する方法であって、
    ａ）（ｉ）プロモーターを含むＤＮＡ鋳型と、（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼとを混合することによってインビトロ転写（ＩＶＴ）を行い、完全長ｍＲＮＡを含む不純調製物を生成する工程と、
    ｂ）高モル塩および両親媒性ポリマーを懸濁液に提供して、完全長ｍＲＮＡを沈殿させ、前記懸濁液中に沈殿した完全長ｍＲＮＡを提供する工程と、
    ｃ）前記懸濁液をフィルタに適用することによって、前記沈殿した完全長ｍＲＮＡを捕捉する工程と、
    ｄ）工程（ｃ）の前記沈殿した完全長ｍＲＮＡを水性溶媒で洗浄して、水溶液中に精製された完全長ｍＲＮＡを得る工程と、
    ｅ）工程（ｄ）からの前記沈殿したｍＲＮＡを可溶化して、精製されたｍＲＮＡ組成物を得る工程であって、工程（ｄ）から得られる前記水溶液中の前記精製された完全長ｍＲＮＡが、（ｉ）プロモーターを含む前記ＤＮＡ鋳型および（ｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼを実質的に含まない、得る工程と、を含む、方法。
  66. 工程（ａ）における、前記ＲＮＡポリメラーゼが、ＳＰ６ポリメラーゼである、請求項６５に記載の方法。
  67. 工程（ｅ）から得られる前記水溶液中の前記精製された完全長ｍＲＮＡもまた、（ｖ）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない、請求項６５または６６に記載の方法。
  68. 前記両親媒性ポリマーが、ＭＴＥＧを含む、請求項１、４９および６５のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記懸濁液が、沈殿したｍＲＮＡ、前記高モル塩溶液、およびＭＴＥＧを含み、前記ＭＴＥＧが、約１５重量／体積％～約４５重量／体積％の最終濃度である、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記懸濁液が、沈殿したｍＲＮＡ、前記高モル塩溶液、およびＭＴＥＧを含み、前記ＭＴＥＧが、約２０重量／体積％～約４０重量／体積％の最終濃度である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記懸濁液が、沈殿したｍＲＮＡ、前記高モル塩溶液、およびＭＴＥＧを含み、前記ＭＴＥＧが、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５重量／体積％の最終濃度である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記懸濁液が、沈殿したｍＲＮＡ、高モル塩溶液、およびＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む、請求項１、４９および６５のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記高モル塩が、約２～４Ｍの最終濃度であり、ＰＥＧが、約５重量／体積％～約２０重量／体積％の最終濃度である、請求項５、５９、または６５に記載の方法。
  74. 前記高モル塩が、約２．５～３Ｍの最終濃度であり、前記ＰＥＧが、約１０重量／体積％～約１５重量／体積％の最終濃度である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記高モル塩が、約２．７Ｍの最終濃度であり、前記ＰＥＧが、約１２重量／体積％の最終濃度である、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記高モル塩溶液が、ＧＣＳＮを含む、請求項６９～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ＰＥＧが、約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）の分子量を有する、請求項７２～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記懸濁液が、２：１、５：１、１０：１、または１５：１の前記沈殿したｍＲＮＡとの質量比で濾過助剤をさらに含む、請求項６９～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記濾過助剤が、１０：１の前記沈殿したｍＲＮＡとの質量比にある、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記濾過助剤が、セルロース系である、請求項７８または７９に記載の方法。
  81. 前記両親媒性ポリマーが、ＭＴＥＧを含む、請求項９に記載の方法。
  82. ＭＴＥＧが、前記洗浄溶液中に、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５重量／体積％の濃度で存在する、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記ＭＴＥＧが、前記洗浄溶液中に約９０重量／体積％～１００重量／体積％の濃度で存在する、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ＭＴＥＧが、約９５重量／体積％の濃度で前記洗浄溶液中に存在する、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記ＧＳＣＮが、約２～４Ｍの最終濃度であり、ＰＥＧが、約５重量／体積％～約２０重量／体積％の最終濃度である、請求項６３の工程ａ）に記載の方法。
  86. 前記ＧＳＣＮが、約２．７Ｍの最終濃度であり、前記ＰＥＧが、約１２重量／体積％の最終濃度である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記ＰＥＧが、約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）の分子量を有する、請求項８５または８６に記載の方法。
  88. 前記溶液が、２：１、５：１、１０：１、または１５：１の前記沈殿したｍＲＮＡとの質量比で濾過助剤をさらに含む、請求項８５～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記濾過助剤が、１０：１の前記沈殿ｍＲＮＡとの質量比である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記濾過助剤が、セルロース系である、請求項８８または８９に記載の方法。
  91. 前記ＰＥＧ溶液中の前記ＰＥＧが、約５０～約９５重量／体積％の濃度である、請求項６３の工程ｅ）に記載の方法。
  92. 前記ＰＥＧ溶液中の前記ＰＥＧが、約９０～約１００重量／体積％の濃度である、請求項６３の工程ｅ）に記載の方法。
  93. 前記ＰＥＧ溶液中の前記ＰＥＧが、約９０重量／体積％の濃度である、請求項９０に記載の方法。
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