JP2022531233A - がんの処置に使用するための乳酸脱水素酵素阻害剤ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、ネイティブな四量体の乳酸脱水素酵素の少なくとも１つのアイソフォームの活性を調節するポリペプチド、およびがんの処置のための医薬品としてのその使用に関する。より具体的には、本発明は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化を阻害する直鎖状ポリペプチドおよび環状ポリペプチドに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ネイティブな四量体の乳酸脱水素酵素の活性を調節するポリペプチド、およびがんの処置のための医薬品としてのその使用に関する。より具体的には、本発明は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化を阻害する直鎖状ポリペプチドおよび環状ポリペプチドに関する。

がん細胞は、それらの同化増殖および増殖の意図を持続するために驚異的な代謝の適応を経る。この代謝の柔軟性の最も典型的な特性は、酸素の利用可能性に関係のない、増幅された解糖活性および乳酸の産生である。Ｗａｒｂｕｒｇ効果として知られている、この解糖の増強により、がん細胞はエネルギー産生由来の糖のフラックスのフラクションを同化経路へ再度方向付け、これにより細胞増殖を強化する。他方で、解糖系の最終産物である、乳酸の細胞内および細胞外での増加は、血管新生（ｄｅ Ｓａｅｄｅｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１２）； Ｂｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （２００６）； Ｖｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１１））、侵襲性（Ｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （２０１１）； Ｃｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１１））および炎症（Ｃｏｌｅｇｉｏ ｅｔ ａｌ． （２０１４）； Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ （２０１３））などのいくつかの現象を促進させることにより病態形成を駆動する。乳酸の代謝の中心にある、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ、ＥＣ：１．１．１．２７）は、ＮＡＤ^＋依存性酵素であり、ピルビン酸の乳酸への転換を触媒する。言及した（ｓｕｂ－ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ）病態発症経路に直接関与することに加え、ＬＤＨは、酸化的がん細胞および解糖系のがん細胞の間の代謝の共生を可能にし（Ｓｏｎｖｅａｕｘ ｅｔ ａｌ． （２００８））、リソソームの酸性化を介してオートファジーを促進し（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０１６））、ＮＡＤ^＋を再産生することにより細胞内のレドックスの均衡を安定化させる。さらに、ＬＤＨＡは、がん組織でのアセチル化により調節されると思われる。中国特許公開公報第１０２８０５８６１号（ＦＵＤＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ）は、アミノ酸残基Ｋ５でのＬＤＨＡのアセチル化の活性化因子を提供する。よってこれは、近年のがんの病態形成におけるＬＤＨの幅広い関与の発見により、がん療法にとって好ましい標的となった。

ＬＤＨは、２つの主要なサブユニット、すなわちＬＤＨＡ（ＬＤＨ－Ｍサブユニットとも呼ばれる）およびＬＤＨＢ（ＬＤＨ－Ｈサブユニットとも呼ばれる）であって、５つのアイソフォーム、すなわちＬＤＨ１、ＬＤＨ２、ＬＤＨ３、ＬＤＨ４、およびＬＤＨ５をもたらす機能的なホモまたはヘテロの四量体にアセンブリできる、ＬＤＨＡおよびＬＤＨＢから構成される四量体の酵素である。これら５つのアイソフォームのうち、ホモ四量体のＬＤＨ１（４つのＬＤＨＢサブユニット）およびＬＤＨ５（４つのＬＤＨＡサブユニット）は、最も詳細に研究されており、上述した機構を介してがん細胞の増殖および生存におけるそれらの関与に関してよく知られている。

著しい構造上の同一性を共有するにも関わらず、ＬＤＨ１およびＬＤＨ５は、その局在性およびその触媒の特性において異なっている。ＬＤＨ５は、主に骨格筋などの解糖組織で見出されており、ＬＤＨ１サブユニットは、主に心臓、ニューロン、および赤血球で発現している。またＬＤＨ５は、ＬＤＨＢサブユニットと比較して高いピルビン酸の親和性および高いピルビン酸の還元の最大反応速度（Ｖｍａｘ）を呈する（Ｅｓｚｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６）； Ｈｅｗｉｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９９））。反対に、ＬＤＨ１サブユニットは、乳酸をピルビン酸に酸化するための生理的および病理的な条件で良好な性質を示し、これにより酸化的細胞は、酸化的リン酸化の栄養源としておよび細胞内シグナリング作用物質としての乳酸を使用することが可能となる。

がん細胞の増殖および生存におけるＬＤＨの病態発症的な広い関与により、ＬＤＨ活性を選択的に阻害できる小分子を開発することに過去何年も多大な努力が払われた（Ｒａｎｉ ａｎｄ Ｋｕｍａｒ （２０１６））。たとえば、Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９８２）は、触媒上不活性な単量体の活性な四量体酵素単位へのアセンブリを妨げるヒト尿由来の２つのペプチドを単離し、Ｊａｆａｒｙ ｅｔ ａｌ． （２０１９）は、酵素の四量体化の妨害を介して乳酸脱水素酵素の阻害性ペプチドを設計するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの方法を使用した。ＬＤＨ１とＬＤＨ５との間の異なる触媒特性にも関わらず、２つの四量体酵素の触媒部位は、著しい構造上の相同性を共有する。結果として、あるアイソフォームよりも他のアイソフォームに対して高い選択性を達成することは、結果が軽減する困難なタスクであることが見出された（Ｌａｂａｄｉｅ ｅｔ ａｌ． （２０１５）； Ｂｉｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ． （２０１３）； Ｒａｉ ｅｔ ａｌ． （２０１７））。さらに、アイソフォーム間で選択性を達成することが望ましいかどうかは、未だ議論の下にある（Ｚｄｒａｌｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ． （２０１８））。実際に、いくつかのグループは、選択的な阻害剤を開発することに焦点を当てているが、他のグループは、非選択的なｐａｎ－ＬＤＨ阻害剤の見込みのあるさらなる治療上の価値を論じている（Ｐｕｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ． （２０１６）； Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （２０１２））。これまで、ＬＤＨを阻害するために開発された全ての分子は、触媒部位での相互作用に焦点を当てており、よってＬＤＨ活性部位の固有の構造上の特性により共通する欠点に悩まされていた。実際に、ＬＤＨ触媒部位は、極性が高く、主に補因子結合部位により構成されている（Ｆｉｕｍｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４））。結果として、ＬＤＨの活性部位と相互作用するほとんどの分子は、ＮＡＤ＋競合性であり、よってＬＤＨの「ロスマンフォールド」と相互作用する（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （２０１２）； Ｋｏｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （２０１３））。「ロスマンフォールド」は、多くのジヌクレオチド結合酵素が共有する構造上のモチーフである（Ｒａｏ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ （１９７３））。結果として、ほとんどのＬＤＨ阻害剤は、全般的に、他のＮＡＤ^＋依存性酵素に対する選択性の欠如に直面している（Ｆｉｕｍｅ ｅｔ ａｌ． （２０１４））。他方で、ＬＤＨ１またはＬＤＨ５の触媒部位と強力な相互作用を達成する分子は、通常、それらの著しい極性の性質、よって、多くの場合不十分な臨床的価値をもたらす非「薬物様の」性質により妨げられている（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （２０１２）； Ｋｏｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （２０１３））。まとめると、ＬＤＨは、依然として非常に見込みがあり検証されている標的ではあるが、ＬＤＨ阻害剤は、その可能性を臨床試験でさらに示す必要がある。

ＬＤＨ阻害剤は、本発明の主題である。

よって本発明は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化を阻害するポリペプチドであって、式（Ｉ）：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（Ｉ）（配列番号５）のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド：
（式中、
Ｘ１は、好ましくはアミノ酸残基Ａ、Ｇ、Ｋ、およびＣからなる群から選択される、いずれかのアミノ酸残基を表し、
Ｘ２は、Ｃ、Ｔ、またはＳを表し、
Ｘ３は、Ｃ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ｃｐＡ（シクロプロピル－Ｌ－アラニン）、ｃｈＧ（Ｌ－シクロヘキシルグリシン）、ｃｈＡ（シクロヘキシル－Ｌ－アラニン）、またはｍｌＬ（γ－メチル－Ｌ－ロイシン）を表し、
Ｘ４は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｋ、Ｃ、Ａ、およびＡｉｂ（２－アミノイソ酪酸）からなる群から選択される、好ましくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｋを表し、
Ｘ５は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ａ、およびＣからなる群から選択される、好ましくは負もしくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｅを表し、
Ｘ６は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ａｉｂ（２－アミノイソ酪酸）、およびＣからなる群から選択される、好ましくは負もしくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｋを表し、
Ｘ７は、Ｃ、Ｌ、Ｉ、ｃｐＡ（シクロプロピル－Ｌ－アラニン）、ｃｈＧ（Ｌ－シクロヘキシルグリシン）、ｃｈＡ（シクロヘキシル－Ｌ－アラニン）、またはｍｌＬ（γ－メチル－Ｌ－ロイシン）を表し、
Ｘ８はＣ、Ｉ、またはＧを表す）
に関する。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、好ましくは配列番号６～配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、直鎖状ポリペプチドである。一部の他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、好ましくは配列番号３０～配列番号３５、配列番号５５～配列番号５８、配列番号６１～配列番号６５、配列番号６７、および配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、環状ポリペプチドである。特定の実施形態では、上記環状ポリペプチドは、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６７、および配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記環状ポリペプチドは、配列番号６１、配列番号６７、または配列番号６８により表されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記乳酸脱水素酵素のサブユニットは、乳酸脱水素酵素Ｂ（ＬＤＨＢ）のサブユニットである。一部の実施形態では、本ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸残基の遊離－ＣＯＯＨ基の－ＯＨ基が、－Ｏ－アルキル基、－Ｏ－アリール基、－ＮＨ_２基、－Ｎ－アルキルアミン基、－Ｎ－アリールアミン基、または－Ｎ－アルキル／アリール基から選択される基で置き換えられている。

さらに本発明は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

さらに本発明は、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物に関する。

さらに本発明は、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、または医薬組成物と、任意選択で少なくとも１つの抗がん剤とを含む、がんを予防および／または処置するためのキットに関する。

さらに本発明は、医薬品として使用するための、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または医薬組成物に関する。

さらに本発明は、がんを予防および／または処置するための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、または医薬組成物に関する。

また本発明は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化に影響する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ．トランケートされた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨｔｒ）のサブユニットを含む系を準備するステップと、
ｂ．ネイティブな四量体ＬＤＨの活性を調節する候補化合物を伴う系を準備するステップと、
ｃ．本発明に係るポリペプチドの存在下または非存在下で前記候補化合物のＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合のレベルを測定するステップと
を含み、
ＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合に関する前記ポリペプチドと前記候補化合物との間の競合の観察が、前期候補化合物が乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化の阻害剤であることを表す、
方法に関する。

一実施形態では、ＬＤＨＢｔｒサブユニットの二量体に対する結合に関する前記ポリペプチドと前記候補化合物との間の競合の観察が、乳酸脱水素酵素のサブユニット上での四量体化部位に対する前記候補化合物の結合の特異性を表す。

本発明のさらなる態様は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化に影響する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ．トランケートされた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨｔｒ）のサブユニットを含む系（１）およびネイティブな四量体ＬＤＨを含む系（２）を準備するステップと、
ｂ．ネイティブな四量体ＬＤＨの活性を調節する候補化合物を含む系（１）および（２）を準備するステップと、
ｃ．系（１）におけるＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体および系（２）におけるネイティブな四量体ＬＤＨに対する前記候補化合物の結合レベル（Ｋｄ）を測定するステップと
を含み、
系（１）におけるＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する前記候補化合物の結合の観察および系（２）におけるネイティブな四量体ＬＤＨに対する前記候補化合物の結合の変更の観察は、前記候補化合物が、ＬＤＨサブユニットの表面で相互作用することにより、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化の阻害剤となることを表す、
方法に関する。

定義
本発明では、他の意味が定義されない限り、以下の用語は以下の意味を有する。

用語「約」は、ある数字に先行する場合、上記数字の±１０％を意味する。

用語「アミノ酸の置換」は、ポリペプチドにおける１つのアミノ酸の別のアミノ酸での置き換えを表す。一実施形態では、アミノ酸は、たとえば保存的アミノ酸の置き換えといった、同様の構造上および／または化学的な特性を有する別のアミノ酸と置き換えられる。「保存的アミノ酸の置換」は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づきなされ得る。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ；負に荷電した（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。非保存的な置換は、これらクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。たとえば、アミノ酸の置換はまた、１つのアミノ酸を、異なる構造上および／または化学的な特性を有する別のアミノ酸と置き換えること、たとえば１つの基に由来するアミノ酸（たとえば極性）を異なる基に由来する別のアミノ酸（たとえば塩基性）で置き換えることをもたらし得る。アミノ酸の置換は、当該分野でよく知られている遺伝子に関するかまたは化学的な方法を使用してもたらされ得る。遺伝子に関する方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。化学的修飾などの遺伝子操作以外の方法によりアミノ酸の側鎖基を変える方法もまた有用であり得ることが企図されている。

用語「ポリヌクレオチド」は、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、いずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。「ポリヌクレオチド」として、限定するものではないが、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖もしくは一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三重鎖の領域を表す。また用語ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性または他の理由のため修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾された」塩基は、たとえばトリチル化された塩基およびイノシンなどの希な塩基を含む。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して様々な修飾がなされており；よって「ポリヌクレオチド」は、通常天然で見出されるポリヌクレオチドの化学的であるか、酵素によるか、または代謝により修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な形態を包含する。また「ポリヌクレオチド」は、多くの場合オリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドを包含する。

用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわちペプチドイソスターにより、互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含むいずれかのペプチドまたはタンパク質を表す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと呼ばれる短い鎖、および一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方を表す。ポリペプチドは、２０の遺伝子によりコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。

「がんを予防する」との用言は、がんの少なくとも１つの有害な作用または症状を発生させないことを意味するように意図されている。

用語「対象」は、哺乳類、好ましくはヒトを表す。一実施形態では、対象は雄性である。別の実施形態では、対象は雌性である。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち医療の受診を待機しているか、または医療を受診しているか、または過去／現在／将来医療の対象であった／ある／あり得るか、または炎症の発症に関してモニタリングされている温血動物、より好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は、成年（たとえば１８歳超の対象）である。別の実施形態では、対象は、小児（たとえば１８歳未満の対象）である。

用語「治療上有効量」は、対象に有意な負のまたは有害な副作用をもたらすことなく、（１）がんの発症を遅延もしくは予防するか；（２）がんの１つ以上の症状の進行、憎悪、もしくは悪化を遅延もしくは停止するか；（３）がんの症状の寛解をもたらすか；（４）がんの重症度もしくは発症頻度を低減するか；または、（５）がんの形成を予防することを目的とする作用物質のレベルまたは量を意味する。一実施形態では、治療上有効量は、防止的または予防的作用のため、がん形成の発症の前に投与される。

用語「がんを処置すること」または「処置」または「軽減」は、治療上の処置および防止的または予防的な手段の両方を意味し、ここでの目的は、がんを予防または遅延（減弱）することである。処置を必要とするものは、すでにがんを有するもの、およびがんを有する傾向のあるもの、またはがんを予防すべきものを含む。本発明に係るポリペプチドの治療量を投与された後に、患者が以下：病原性細胞の数の低下；病原性である細胞の合計のパーセントの低下；および／またはがんに関連する１つ以上の症状のある程度までの軽減；罹患率および死亡率の低下、ならびにクオリティオブライフの問題の改善のうちの１つ以上の観察可能かつ／または測定可能な低減または非存在を示す場合、対象または哺乳類のがんに関する「処置」は成功している。処置の成功および疾患の改善を評価するための上記のパラメータは、医師に知られている規定の手法により容易に測定可能である。

詳細な説明
ＬＤＨ阻害に対する新規の手法に着手するために、この標的化がこの問題に着手するために前例のない方法をもたらし得るＬＤＨのアロステリック部位の解明に焦点があてられた。四量体が最小機能単位であるとすると、ＬＤＨの活性は、その触媒部位およびオリゴマー形成の状態の両方に依存する。ＬＤＨに関しては、サブユニットは、１つのサブユニットから伸長し、２つの隣接するサブユニットの周りに巻き付き、よって全体的な四量体の接着を促進する、それらのＮ末端アームによりまとめて保持されている。興味深いことに、ＬＤＨの３２のＮ末端のアミノ酸フラグメントは、ＬＤＨの四量体化のプロセスをｉｎ ｖｉｔｒｏで妨げることが知られている（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７））。まとめると、これらの知見を鑑み、本発明者らは、ＬＤＨの四量体化を妨げる分子の設計および開発のための開始点としてこのＮ末端アームを評価することとした。

本発明は、ネイティブな四量体の乳酸脱水素酵素の少なくとも１つのアイソフォームの活性を調節するポリペプチドに関する。

「乳酸脱水素酵素」または「ＬＤＨ」は、ピルビン酸および乳酸の相互変換、および同時に起こるＮＡＤＨおよびＮＡＤ^＋の相互変換を触媒できる四量体の酵素を意味する。

今日までに、乳酸脱水素酵素の５つのアイソフォーム、すなわちＬＤＨ１、ＬＤＨ２、ＬＤＨ３、ＬＤＨ４、およびＬＤＨ５が同定されており、これは、２つのサブユニット、すなわちＬＤＨＡサブユニットおよびＬＤＨＢサブユニットの固有の組み合わせを構成している。

本発明の文脈では、「調節すること（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」は、本発明のポリペプチドが、乳酸脱水素酵素の５つのアイソフォーム、すなわちＬＤＨ１、ＬＤＨ２、ＬＤＨ３、ＬＤＨ４、およびＬＤＨ５のいずれか１つの生体活性、ならびに／または１つ以上のサブユニット、すなわちＬＤＨＡサブユニットおよび／もしくはＬＤＨＢサブユニットの生体活性を有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートする生物学的な作用を有することを意味する。

「ネイティブな」は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の配列が、本出願に記載される場合、たとえばいずれかの種に由来する、天然物に由来することを意味する。さらに、このような乳酸脱水素酵素のネイティブな配列は、天然物から単離されてもよく、またはサブユニットのＬＤＨＡおよび／もしくはＬＤＨＢから組み換えまたは合成の手段により産生され得る。

一部の実施形態では、ＬＤＨＡサブユニットは、アミノ酸配列番号１により表されており、ＬＤＨＢサブユニットは、アミノ酸配列番号２により表されている。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ネイティブな四量体の乳酸脱水素酵素の少なくとも１つのアイソフォームまたはその少なくとも１つのサブユニットの活性を阻害する。

「阻害剤」または「阻害すること」は、本発明のポリペプチドが、生体作用に関して、乳酸脱水素酵素の５つのアイソフォームのいずれか１つの生体活性を阻害または有意に低減またはダウンレギュレートする必要があることを意味する。特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、ネイティブな乳酸脱水素酵素の活性を、最大約１０％、好ましくは最大約２５％、好ましくは最大約５０％、好ましくは最大約７５％、８０％、９０％、９５％、より好ましくは最大約９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％阻害できる。

一実施形態では、本発明のポリペプチドは、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化を阻害する。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、４つのＬＤＨＡサブユニットのうちの少なくとも１つの四量体化を阻害し、よってＬＤＨ５のアイソフォームの活性を阻害する。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、３つのＬＤＨＡサブユニットのうちの少なくとも１つおよび／またはＬＤＨＢサブユニットの四量体化を阻害し、よってアイソフォームＬＤＨ４の活性を阻害する。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、２つのＬＤＨＡサブユニットのうちの少なくとも１つおよび／または２つのＬＤＨＢサブユニットのうちの少なくとも１つの四量体化を阻害し、よってアイソフォームＬＤＨ３の活性を阻害する。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＬＤＨＡサブユニットおよび／または３つのＬＤＨＢサブユニットのうちの少なくとも１つの四量体化を阻害し、よってアイソフォームＬＤＨ２の活性を阻害する。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、４つのＬＤＨＢサブユニットのうちの少なくとも１つの四量体化を阻害し、よってアイソフォームＬＤＨ１の活性を阻害する。

乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化の阻害が、当該分野の状態で利用可能ないずれかの適切な手段、特にいずれかの適切な生化学的または生物物理学的な方法により評価され得ることは、言うまでもない。

例として、生化学的な方法、たとえばアフィニティー電気泳動、ＢｉＦＣ（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、共免疫沈降法、タンデムアフィニティ精製、内因性トリプトファン蛍光、分子ふるいクロマトグラフィー、遠心分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、架橋（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）電気泳動など；または生物物理学的な方法、たとえばビアコア、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）、ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ、飽和移動差（ＳＴＤ）分光法、ＣＰＭＧ（Ｃａｒｒ Ｐｕｒｃｅｌｌ Ｍｅｉｂｏｏｍ Ｇｉｌｌ）パルスシーケンスおよび／もしくは静的光散乱（ＳＬＳ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などが使用され得る。

一部の実施形態では、乳酸脱水素酵素のサブユニットの少なくとも１つの四量体化の阻害は、Ｎ末端の２０アミノ酸の残基を欠いている１つ以上のＬＤＨサブユニット、すなわちトランケートされているＬＤＨＡまたはＬＤＨＡｔｒ、およびトランケートされているＬＤＨＢまたはＬＤＨＢｔｒに結合する目的のポリペプチドの特性により評価され得る。

一部の実施形態では、ＬＤＨＡｔｒは、アミノ酸配列番号３により表される。

一部の実施形態では、ＬＤＨＢｔｒは、アミノ酸配列番号４により表される。

一部の実施形態では、ＭＳＴ法が行われる場合、ＬＤＨＡｔｒ（配列番号３）またはＬＤＨＢｔｒ（配列番号４）、好ましくはＬＤＨＢｔｒ（配列番号４）に対する本発明に係るポリペプチドの有意な結合が、１μＭ～５ｍＭ、好ましくは５０μＭ～３．５ｍＭに含まれる解離定数（Ｋｄ）をもたらし得る。

１μＭ～５ｍＭは、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、および５ｍＭを含む。

一部の態様では、本発明は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化を阻害するポリペプチドであって、式（Ｉ）：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（Ｉ）（配列番号５）の配列のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド：
（式中、
Ｘ１は、好ましくはアミノ酸残基Ａ、Ｇ、Ｋ、およびＣからなる群から選択される、いずれかのアミノ酸残基を表し、
Ｘ２は、Ｃ、Ｔ、またはＳを表し、
Ｘ３は、Ｃ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ｃｐＡ（シクロプロピル－Ｌ－アラニン）、ｃｈＧ（Ｌ－シクロヘキシルグリシン）、ｃｈＡ（シクロヘキシル－Ｌ－アラニン）、またはｍｌＬ（γ－メチル－Ｌ－ロイシン）を表し、
Ｘ４は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｋ、Ｃ、Ａ、およびＡｉｂ（２－アミノイソ酪酸）からなる群から選択される、好ましくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｋを表し、
Ｘ５は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ａ、およびＣからなる群から選択される、好ましくは負もしくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｅを表し、
Ｘ６は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ａｉｂ（２－アミノイソ酪酸）、およびＣからなる群から選択される、好ましくは負もしくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｋを表し、
Ｘ７は、Ｃ、Ｌ、Ｉ、ｃｐＡ（シクロプロピル－Ｌ－アラニン）、ｃｈＧ（Ｌ－シクロヘキシルグリシン）、ｃｈＡ（シクロヘキシル－Ｌ－アラニン）、またはｍｌＬ（γ－メチル－Ｌ－ロイシン）を表し、
Ｘ８はＣ、Ｉ、またはＧを表す）
に関する。

一実施形態では、上記ポリペプチドは、上述の配列番号５のアミノ酸配列を含むが、ただし上記アミノ酸配列番号５は、アルファヘリックスの立体構造を有する。

本発明の範囲内では、「正に荷電した」アミノ酸残基は、アミノ酸Ｒ、Ｈ、またはＫを表すように意図されている。

本発明の範囲内では、「負に荷電した」アミノ酸残基は、アミノ酸ＤまたはＥを表すように意図されている。

本発明の範囲内では、「中性の」アミノ酸残基は、アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｃ、Ａｉｂ（２－アミノイソ酪酸）、Ｓ、またはＴを表すように意図されている。

本発明の範囲内では、「Ａｉｂ」は、α－アミノイソ酪酸、２－メチルアラニン、または
α－メチルアラニンとも呼ばれる、２－アミノイソ酪酸のアミノ酸残基を表すように意図されている。

一部の実施形態では、本ポリペプチドの第１のアミノ酸残基は、さらにアセチル化されている。特定の実施形態では、配列番号５のアミノ酸残基Ｘ１は、アセチル化されている。

一部の実施形態では、本ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸残基は、さらにアミド化されており、これにより、本発明に係るポリペプチドのＮｔ末端およびＣｔ末端は、ＮＨ_２基を呈する。一部の実施形態では、本ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸残基は、さらにＮ－アルキルアミド化またはＮ－アリールアミド化されている。一部の実施形態では、本ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸残基は、さらにエステル化されている。

特定の実施形態では、本ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸残基の遊離－ＣＯＯＨ基の－ＯＨ基は、－Ｏ－アルキル基、－Ｏ－アリール基、－ＮＨ_２基、－Ｎ－アルキルアミン基、－Ｎ－アリールアミン基、または－Ｎ－アルキル／アリール基から選択される基で置き換えられている。

適切なアルキル基の非限定的な例として、Ｃ_１－Ｃ_１２のアルキルが挙げられる。アリール基の非限定的な例として、フェニル、トリル、キシリル、またはナフチル基が挙げられ、これは、Ｏ、Ｎ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル基、およびハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）に由来する１つ以上の原子または基で置換され得る。－Ｎ－アルキルアミン基の非限定的な例として、－ＮＲ^１Ｒ^２基（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキル基を表す）が挙げられる。－Ｎ－アリールアミン基の非限定的な例として、－ＮＨＲ^３（式中Ｒ^３は、Ｏ、Ｎ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル基、およびハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）由来の１つ以上の原子または基で置換されてもよい、フェニル、トリル、キシリル、またはナフチル基を表す）が挙げられる。－Ｎ－アルキル／アリール基の非限定的な例として、－ＮＲ^４Ｒ^５（式中、Ｒ^４は、Ｃ_１－Ｃ_１２のアルキルを表し、Ｒ^５は、Ｏ、Ｎ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキル基、およびハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）由来の１つ以上の原子または基で置換されてもよい、フェニル、トリル、キシリル、またはナフチル基を表す）が挙げられる。

実際に、遊離－ＣＯＯＨ基の－ＯＨ基の置き換えは、当該分野の状態で知られているいずれかの適切な方法またはそれらに由来する適合した方法により、行われ得る。

一部の実施形態では、配列番号５のアミノ酸配列に由来するアミノ酸残基Ｌは、非天然のロイシンアミノ酸残基類縁体で置換され得る。

本発明の範囲内では、非天然のロイシンアミノ酸残基類縁体は、ｃｐＡ（シクロプロピル－Ｌ－アラニン）、ｃｈＧ（Ｌ－シクロヘキシルグリシン）、ｃｈＡ（シクロヘキシル－Ｌ－アラニン）、およびｍｌＬ（γ－メチル－Ｌ－ロイシン）を含む群から選択されるアミノ酸残基を表すように意図されている。

本発明に係るポリペプチドはαヘリックスの立体構造を有するため、上記立体構造を妨げることが知られているアミノ酸残基の数は、本発明に係るポリペプチドの配列の中で限定されるものである。

例として、ＰおよびＹなどのアミノ酸残基は、αヘリックスの形成の発生に好ましくないことが当該分野で知られている。

一部の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、最大３アミノ酸残基のＰおよび／またはＹ、最大２アミノ酸残基のＰおよび／またはＹ、最大１アミノ酸残基のＰおよび／またはＹを含む。

一部の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸残基Ｐおよび／またはＹを全く含まない。

一部の実施形態では、本発明に係るポリペプチドのＮ末端のアミノ酸残基は、アミド化されていない。

目的のペプチドにおけるαヘリックスの存在を予測および／またはモニタリングするための手段は、当該分野でよく知られている。

目的のペプチドにおけるαヘリックスの存在を予測するためのいくつかのソフトウェア、たとえばＡｇａｄｉｒ（Ｍｕｎｏｚ ａｎｄ Ｓｅｒｒａｎｏ （１９９４ａ， ｂ， ｃ， １９９７）； Ｌａｃｒｏｉｘ ｅｔ ａｌ． １９９８））、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（Ｙａｃｈｄａｖ ｅｔ ａｌ． （２０１４））などが、当該分野で利用可能である。

一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、直鎖状ポリペプチドである。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号６～配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、本発明に係る直鎖状ポリペプチドは、配列番号６（ＬＢ１９）、配列番号７（ＬＢ１３）、配列番号８（ＬＢ８）、配列番号２１（ＬＡ１９）、および配列番号２２（ＬＡ８）からなる群から選択される。

一部の他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、環状ポリペプチドである。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号３０～配列番号３５、配列番号５５～配列番号５８、配列番号６１～配列番号６５、配列番号６７、および配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、環状ポリペプチドは、ＣＸＸＸＣモチーフ（式中、Ｘは、上記の配列番号５のポリペプチドの定義と一致するアミノ酸残基を表す）を含む。

一部の実施形態では、ＣＸＸＸＣモチーフに由来するアミノ酸残基Ｃは、両方とも、好ましくはα，α’－ビスブロモキシレン、ヘキサフルオロベンゼン、２，２’－ビス（ブロモメチル）－１，１’－ビフェニル、１，２－ビス（ブロモメチル）ベンゼン、１，４－ビス（ブロモメチル）ベンゼン、３，３’－ビス（ブロモメチル）－１，１’－ビフェニル、および４，４’－ビス（ブロモメチル）－１，１’－ビフェニルを含む群で選択されるアルキル化剤によりアルキル化されている。

一部の実施形態では、環状ポリペプチドは、ラクタム架橋（ｌａｃｔａｍ ｂｒｉｄｇｅ）により得られる。本発明の範囲内では、用語「ラクタム架橋」は、グルタミン酸またはアスパラギン酸のアミノ酸残基の側鎖とアミド結合を形成するためのリジンアミノ酸残基の側鎖のポリペプチドの中での共有結合を表すように意図されている。例として、たとえばＴａｙｌｏｒ （２００２）およびＡｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ． （２０１５）において、ラクタム架橋の形成が開示されている。

特定の実施形態では、本発明の環状ポリペプチドは、配列番号３０（ＶＳ－１４２－ＢｉｓＡｌｋ）、配列番号３１（ＬＴ０１８）、および配列番号３２（ＬＴ０２０）からなる群から選択される。特定の実施形態では、本発明の環状ポリペプチドは、配列番号５５（ＭＰ１）、配列番号５６（ＭＰ２）、配列番号５７（ＭＰ３）、配列番号５８（ＭＰ４）、配列番号６１（ＭＰ７）、配列番号６２（ＭＰ８）、配列番号６３（ＭＰ９）、配列番号６４（ＭＰ１０）、配列番号６５（ＭＰ１１）、配列番号６７（ＣＴ－４４）、および配列番号６８（ＣＴ－４５）からなる群から選択される。

一部の実施形態では、上記環状ポリペプチドは、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６７、および配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、本発明の環状ポリペプチドは、配列番号５５（ＭＰ１）により表されるアミノ酸配列、すなわちＣＴＬＫＣＫＬＩにより表されるアミノ酸配列（式中システイン残基は、ｍ－ベンジルにより結合している）を含むか、またはこれから構成される。一部の実施形態では、本発明の環状ポリペプチドは、配列番号６１（ＭＰ７）により表されるアミノ酸配列、すなわちＣＴＬＫＣＫＬＩにより表されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は、ｐ－テトラフルオロフェニルにより結合している）を含むかまたはこれから構成される。一部の実施形態では、本発明の環状ポリペプチドは、配列番号６２（ＭＰ８）により表されるアミノ酸配列、すなわちＣＴＬＫＣＫＬＩにより表されるアミノ酸配列（式中システイン残基は、ｏ－ベンジルにより結合している）を含むかまたはこれから構成される。一部の実施形態では、本発明の環状ポリペプチドは、配列番号６３（ＭＰ９）により表されるアミノ酸配列、すなわちＣＴＬＫＣＫＬＩにより表されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は、ｐ－ベンジルにより結合している）を含むかまたはこれから構成される。一部の実施形態では、本発明の環状ポリペプチドは、配列番号６７（ＣＴ－４４）により表されるアミノ酸配列、すなわちＣＴ（ｍｌＬ）ＫＣＫＬＩにより表されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は、ｐ－テトラフルオロフェニルにより結合している）を含むかまたはこれから構成される。一部の実施形態では、本発明の環状ポリペプチドは、配列番号６８（ＣＴ－４５）により表されるアミノ酸配列、すなわちＣＴＬＫＣＫ（ｃｐＡ）Ｉにより表されるアミノ酸配列（式中、システイン残基は、ｐ－テトラフルオロフェニルにより結合している）を含むかまたはこれから構成される。

特定の実施形態では、上記環状ポリペプチドは、配列番号６１、配列番号６７、または配列番号６８により表されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記環状ポリペプチドは、配列番号６１により表されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記環状ポリペプチドは、配列番号６７により表されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、上記環状ポリペプチドは、配列番号６８により表されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、上記乳酸脱水素酵素のサブユニットは、乳酸脱水素酵素Ｂ（ＬＤＨＢ）のサブユニットである。

一部の実施形態では、上記乳酸脱水素酵素のサブユニットは、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）のサブユニットである。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２の完全長のＬＤＨＢサブユニットのアミノ酸残基Ｌ１７８、Ｖ２０６、Ｖ２０９、Ｌ２１１、およびＷ２２７と相互作用することにより、ＬＤＨＢサブユニットの機能的な四量体（アイソフォームのＬＤＨ１に対応）の形成を防ぐことができる。さらなる実施形態では、本発明のポリペプチドはまた、配列番号２のＬＤＨＢサブユニットのアミノ酸残基Ｌ３００およびＶ３０３と相互作用することができる。

さらに、本発明に係るポリペプチドは、第１のαヘリックスを形成する、配列番号２のＬＤＨＢサブユニットのアミノ酸残基Ｌ１７８、Ｖ２０６、Ｖ２０９、Ｌ２１１、およびＷ２２７と、および任意選択で第２のαヘリックスを形成する、配列番号２のＬＤＨＢサブユニットのアミノ酸残基Ｌ３００およびＶ３０３と、相互作用し得る。

また本発明は、本明細書中定義されるポリペプチドの誘導体に関する。

実際に、本発明はまた、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入により、本明細書中具体的に開示されるポリペプチド、たとえばアミノ酸配列番号５のポリペプチドとは異なるいずれかのポリペプチドを包有する。このような誘導体は、天然に存在していてもよく、またはたとえば上記本発明のポリペプチド配列の１つ以上を修飾し、本発明のポリペプチドの１つ以上の阻害活性を評価し、かつ／もしくは当該分野でよく知られている多くの技術のいずれかを使用することにより、合成的に作製され得る。

本発明のポリペプチドの構造において修飾がなされてもよく、さらには望ましい特徴を伴う派生的なポリペプチドをコードする機能的な分子を得てもよい。均等物またはさらには改善したバリアントまたは一部を作製するために本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を変えることが望ましい場合、当業者は、通常、コードしたポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）配列のコドンの１つ以上を変える。

たとえば、特定のアミノ酸残基は、他のポリペプチド（たとえばＬＤＨＢｔｒ）に結合するその特性の明らかな喪失を伴うことなくタンパク質構造において他のアミノ酸残基で置換され得る。タンパク質の生体での機能的な活性を定義するものはタンパク質の結合能および性質であるため、特定のアミノ酸配列の置換が、タンパク質配列、および当然その根底にあるＤＮＡをコードする配列においてなされてよく、にもかかわらず、類似する性質を有するタンパク質を得ることができる。

よって、本発明のポリペプチド配列または、それらの阻害活性の明らかな喪失を伴うことなく上記ポリペプチドをコードする対応するポリヌクレオチド配列（たとえばＤＮＡ配列）において様々な変更がなされ得ることが企図される。多くの場合、本発明に係るペプチドまたはポリペプチドのバリアントは、１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸残基が、類似する特性を有する別のアミノ酸残基で置換される置換であり、これによりペプチド化学の当業者は、ポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変化しないと予測する。

したがって上述されるように、アミノ酸の置換は、全般的に、アミノ酸の側鎖の置換基、たとえばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどの相対的な類似性に基づく。様々な前述の特徴を考慮する例示的な置換は、当業者によく知られており、アミノ酸残基ＲおよびＫ；アミノ酸残基ＤおよびＥ；アミノ酸残基ＳおよびＴ；アミノ酸残基ＱおよびＮ；ならびにアミノ酸残基Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩを含む。

アミノ酸の置換は、アミノ酸残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づきさらになされ得る。たとえば、負に荷電したアミノ酸として、アミノ酸残基ＤおよびＥが挙げられ；正に荷電したアミノ酸として、アミノ酸残基ＫおよびＲが挙げられ、類似する親水性の値を有する荷電していない極性頭部基を有するアミノ酸として、アミノ酸残基Ａ、Ｌ、Ｉ、およびＶ；アミノ酸残基ＧおよびＡ；アミノ酸残基ＮおよびＱ；ならびにアミノ酸残基Ｓ、Ｔ、Ｆ、およびＹが挙げられる。保存的な変化を表し得るアミノ酸の他の基として、（１）アミノ酸残基Ａ、Ｐ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｔ；（２）アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｙ、Ｔ；（３）アミノ酸残基Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｆ；（４）アミノ酸残基Ｋ、Ｒ、Ｈ；および（５）アミノ酸残基Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈが挙げられる。

本発明に係るポリペプチドの誘導体は、同様にまたはあるいは、非保存的な変更を含み得る。別の実施形態では、誘導体は、５つ以下のアミノ酸残基の置換、欠失、または付加によりポリペプチド配列と異なる。同様に（またはあるいは）、誘導体は、たとえば本発明に係るポリペプチドの阻害特性に最小限の影響を有するアミノ酸残基の欠失または付加により、修飾され得る。

別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、乳酸脱水素酵素のサブユニット、より具体的には乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）または乳酸脱水素酵素Ｂ（ＬＤＨＢ）のサブユニットの四量体化ドメインの全体または一部を含む。上記実施形態では、本ポリペプチドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号２１、または配列番号２２を含む。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）または乳酸脱水素酵素Ｂ（ＬＤＨＢ）のサブユニットのＮ末端の少なくとも８、好ましくは少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、または１６０のアミノ酸残基により表され得る。

にもかかわらず、本発明に係るポリペプチドは、ＬＤＨＡまたはＬＤＨＢなどのいずれかのネイティブな乳酸脱水素酵素のサブユニットのアミノ酸配列を含まない。

一実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９のアミノ酸を含む。

一実施形態では、本発明のポリペプチドは、８～１５０アミノ酸、好ましくは８～１２５アミノ酸、より好ましくは８～１００アミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、８～７５アミノ酸、好ましくは８～５０アミノ酸、８～４０アミノ酸、または８～３０アミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、８～２５アミノ酸、８～２０アミノ酸、または８～１９アミノ酸を含む。

別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、１３～１５０アミノ酸、好ましくは１３～１２５アミノ酸、より好ましくは１３～１００アミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、１３～７５アミノ酸、好ましくは１３～５０アミノ酸、１３～４０アミノ酸、または１３～３０アミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、１３～２５アミノ酸、１３～２０アミノ酸、または１３～１９アミノ酸を含む。

別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、１９～１５０アミノ酸、好ましくは１９～１２５アミノ酸、より好ましくは１９～１００アミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、１９～７５アミノ酸、好ましくは１９～５０アミノ酸、１９～４０アミノ酸、または１９～３０アミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、１９～２５アミノ酸、または１９～２０アミノ酸を含む。

一実施形態では、本発明のポリペプチドは、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、または２０のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、最大１９のアミノ酸を含む。

一実施形態では、本発明のポリペプチドは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９、またはそれ以上のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、８つのアミノ酸を含む。別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、１３アミノ酸を含む。別の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、１９アミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸を含む。

一部の実施形態では、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２ではない。

特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドを精製もしくは検出のためエピトープで特異的に標識させるか、または本発明に係るポリペプチドを対象の特定の細胞、特定の組織、または特定の臓器、すなわち特定の身体の位置に標的化させる、本明細書中以下で「タグポリペプチド」と呼ばれる、少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列をさらに含む。上記実施形態では、上記ポリペプチドは、少なくとも１つのタグポリペプチドをさらに含む。

さらに、特定の実施形態では、タグポリペプチドによりさらに、本発明のポリペプチドは、標的細胞、より好ましくはがん細胞の細胞質、核、またはオルガネラにおいて標的化される。

本発明の特定の実施形態では、上記タグポリペプチドは、本発明のポリペプチドの阻害活性を妨げないように十分に短い。例として、適切なタグポリペプチドは、全般的に、少なくとも６つのアミノ酸残基、好ましくは約８～約５０アミノ酸残基、より好ましくは約１０～約２０アミノ酸残基を有する。

本発明で使用するためのタグポリペプチドは、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを提供し得るか、または抗タグ抗体もしくはエピトープタグに結合する別の種類のアフィニティマトリックスを使用するアフィニティー精製により本発明のペプチドまたはポリペプチドを容易に精製できてもよい。

様々なタグポリペプチドが、当該分野でよく知られている。例として、ポリ－ヒスチジン（ｐｏｌｙ－ｈｉｓ）またはポリ－ヒスチジン－グリシン（ｐｏｌｙ－ｈｉｓ－ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド、ｃ－ｍｙｃタグ、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ、Ｆｌａｇペプチド、ＫＴ３エピトープペプチド；αチューブリンエピトープペプチド；ならびにＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグが挙げられる。

本発明に係るポリペプチドはまた、たとえばビオチン化によるか、または放射標識、蛍光標識、もしくは酵素標識などの当該分野で知られているいずれかの検出可能な標識の組み込みにより、より容易に検出できるように修飾され得る。よって、特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドをより容易に精製または検出させるいずれかのアミノ酸配列（たとえばヒスタグ、ビオチンタグ、またはストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ）タグ）をさらに含み得る。

よって、特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、細胞への進入を容易にするタンパク質伝達ドメインとしても知られている、膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ：ＣＰＰ）から構成される少なくとも１つのタグポリペプチドをさらに含み得る。当該分野でよく知られているように、膜透過性ペプチドは、全般的に正味の正の電荷を有する最大３０の残基の短いペプチドであり、レセプターとは無関係でありエネルギーに依存しない方法で作用する。

よって、本発明に係るポリペプチドは、１つ以上の膜透過性ペプチドを含み得る。含む場合、膜透過性ペプチドは、細胞の中で切断可能であり得る。ＣＰＰの例として、親水性ＣＰＰおよび両親媒性ＣＰＰからなる群で選択されるＣＰＰが挙げられる。親水性ＣＰＰは、通常アミノ酸残基ＲおよびＫを多く含む親水性アミノ酸により主に構成されているペプチドである。

親水性ＣＰＰの例として、アンテナペディアペネトラチン（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号３６）、ＴＡＴ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号３７）、ＳｙｎＢ１（ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ、配列番号３８）、ＳｙｎＢ３（ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ 配列番号３９）、ＰＴＤ－４（ＰＩＲＲＲＫＫＬＲＲＬＫ、配列番号４０）、ＰＴＤ－５（ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ 配列番号４１）、ＦＨＶ Ｃｏａｔ－（３５－４９）（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ、配列番号４２）、ＢＭＶ Ｇａｇ－（７－２５）（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ、配列番号４３）、ＨＴＬＶ－ＩＩ Ｒｅｘ－（４－１６）（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ、配列番号４４）、Ｄ－Ｔａｔ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、配列番号４５）、およびＲ９－Ｔａｔ（ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＰＰＱ、配列番号４６）が挙げられる。

両親媒性ＣＰＰは、通常アミノ酸残基Ｋを多く含むペプチドである。両親媒性ＣＰＰの例として、抗菌ペプチド、たとえばＭＡＰまたはトランスポータン：トランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号４７）、ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬＡＬＫＬＡ、配列番号４８）、ＳＢＰ（ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号４９）、ＦＢＰ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号５０）、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号５１）、ＭＰＧ^{（ΔＮＬＳ）}（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ、配列番号５２）、Ｐｅｐ－１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号５３）、およびＰｅｐ－２（ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号５４）が挙げられる。

アンテナペディア由来のペネトラチン（Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４））およびＴａｔペプチド（Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９７））またはそれらの誘導体は、細胞内へのペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドなどのカーゴ分子（ｃａｒｇｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の送達のため、特に広く使用されているツールである（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１））。別の実施形態では、本発明のポリペプチドはまた、国際特許公開公報第２０１１／１５７７１３号および同第２０１１／１５７７１５号（Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ（登録商標））に記載されるものなどの膜透過性ペプチドまたはその誘導体を含み得る。

本発明の特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、リンカーにより少なくとも１つの膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）に結合している。本発明の意味の範囲内で、「リンカー」は、単一の共有結合または安定した一連の共有結合を含む部分であって、多くの場合、本発明のリガンドにカップリング官能基または生体活性基を共有結合するＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰからなる群から選択される１～４０の複数の原子価の原子を組み込んでいる、部分を意味する。リンカーの複数の原子価の原子の数は、たとえば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、または３０、または最大４０以上のより大きな数であり得る。リンカーは、直鎖状または非直鎖状であってよく；一部のリンカーは、ペンダント側鎖またはペンダント官能基（またはその両方）を有し得る。

本発明のポリペプチドは、望ましいポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換もしくはトランスフェクトした細胞を培養するかまたは別の方法、たとえば固相技術を使用した直接的なペプチド合成もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成などの、当業者によく知られている方法により調製され得る。

さらに本発明は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ核酸配列を含む。

また本開示は、本発明に係る少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む核酸ベクターに関する。

本発明の中で、「少なくとも１つのポリヌクレオチド」との表現は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のポリヌクレオチドを含むように意図されている。

一部の実施形態では、ベクターは、上記少なくとも１つのポリペプチドの制御された発現を可能にする。

特定の実施形態では、ベクターは、好ましくはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、非統合型レンチウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびバキュロウイルスを含む群で選択される、ウイルスベクターである。

一部の実施形態では、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、または核酸ベクターは、特に他の天然または合成の化合物、たとえば脂質、タンパク質、ペプチド、またはポリマーと組み合わせて、送達粒子に含まれ得る。

本発明の範囲内で、上記送達粒子は、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、または核酸ベクターを伴う標的の細胞、組織、または臓器を提供または「送達」するように意図されている。

一部の実施形態では、送達粒子は、陽イオン性脂質を含むリポプレックス；脂質ナノエマルジョン；固体脂質ナノ粒子；ペプチドベースの粒子；特に天然および／または合成のポリマーを含む、ポリマーベースの粒子；ならびにそれらの混合物の形態であり得る。

一部の実施形態では、ポリマーベースの粒子は、合成ポリマー、特にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、デンドリマー、ポリ（ＤＬ－ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ－ラクチド－ｃｏ－グリコシド）（ＰＬＧＡ）、ポリメタクリレート、およびポリホスホエステルを含み得る。

一部の実施形態では、送達粒子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または核酸ベクターを標的の細胞、組織、または臓器に向けるために適した１つ以上のリガンドをその表面にさらに含む。

さらに本発明は、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または送達粒子と、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物に関する。一部の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物に関する。

一部の実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは、溶媒、希釈剤、担体、賦形剤、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、およびそれらの組み合わせを含む群で選択される。担体、希釈剤、溶媒、または賦形剤は、本ポリペプチドまたはその誘導体と適合可能である意味で「許容」されなければならないが、これと共に投与される対象に有害であってはならない。通常、ビヒクルは、対象、好ましくはヒト対象に投与される場合に、有害な反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない。

ヒト投与の特定の目的のため、本医薬組成物は、たとえばＦＤＡ局またはＥＭＡなどの規制局が要求する無菌性、発熱性、全般的な安全性、および純度の基準を満たすべきである。

一部の実施形態では、担体は、無菌性かつパイロジェンフリーである、水または食塩水（ｓａｌｉｎｅ）（たとえば生理食塩水（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｌｉｎｅ）であり得る。適切な賦形剤として、マンニトール、ブドウ糖、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。

治療上の使用に許容される担体、溶媒、希釈剤、および賦形剤は、医薬の分野でよく知られており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． （Ａ． Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ． １９８５）に記載されている。適切な薬学的な担体、溶媒、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬学的な実務でなされ得る。本医薬組成物は、担体、賦形剤、溶媒、または希釈剤としてまたはこれに加えて、いずれかの適切な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、または可溶化剤を含み得る。保存剤、安定剤、色素、およびさらには香料が、本医薬組成物に提供され得る。

本製剤は、単位剤形で簡便に提示されてもよく、薬学の分野でよく知られている方法および良好な実務のいずれかにより、調製され得る。このような方法は、１つ以上の副成分を構成する担体と本ペプチドまたは本ポリペプチドの結合をもたらすステップを含む。

経口投与に適した本発明に係る製剤は、それぞれが所定の量の本発明に係るポリペプチドを含む、カプセル、カシェー、もしくは錠剤などの別々の単位として；散剤もしくは顆粒剤として；水系の液体もしくは非水系の液体の液剤もしくは懸濁剤として；または水中油型の液体のエマルジョンもしくは油中水型の液体のエマルジョンとして、提示され得る。また本発明のポリペプチドは、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提示され得る。

非経口投与に適した製剤として、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、および本製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水系および非水系の無菌注射液剤；ならびに懸濁化剤および増ちょう剤を含み得る水系および非水系の無菌性の懸濁剤が挙げられる。本製剤は、単位用量または複数回投与用の容器、たとえば密閉されたアンプルおよびバイアルに提示されてもよく、使用の直前に無菌性の液体の担体、たとえば注射用の水の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ：ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）した状態で保存され得る。即時注射用の液剤および懸濁剤は、無菌性の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。本発明で使用するための製剤は、問題となる製剤の種類を考慮した当該分野で従来よりある他の作用物質をさらに含んでよく、たとえば経口投与に適切な作用物質は、香料を含み得る。

本発明の医薬組成物または医薬品は、経口的に、非経口的に、局所的に、吸入スプレーにより、直腸に、経鼻的に、頬に、膣に、または埋め込まれたリザーバーを介して投与され得る。本明細書中使用される用語投与は、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入技術を含む。

好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物または医薬品は、非経口的に、皮下に、静脈内に、または埋め込まれたリザーバーを介して投与される。

一実施形態では、本発明の医薬組成物または医薬品は、眼内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、または静脈内注射または注入などの注射に適した形態である。

注射に適した形態の例として、限定するものではないが、液剤、たとえば無菌性水系液剤、分散剤、エマルジョン、懸濁剤、使用前に液体を添加して液剤または懸濁剤を調製するための使用に適した固体の形態、たとえば散剤、リポソーム形態などが挙げられる。

処置は、ある期間にわたる単回の投与または複数回投与からなり得る。本ポリペプチドまたはその誘導体は、長期間、たとえば少なくとも２または４または６または８週間にわたる徐放を提供するための徐放製剤に製剤化され得る。好ましくは、徐放は、少なくとも４週間にわたり提供される。

特定の実施形態では、投与されるポリペプチドの有効量は、投与のため選択される物質、投与が単回投与または複数回投与であるかどうか、ならびに年齢、身体状態、大きさ、体重、性別、および処置される疾患の重症度を含む対象のパラメータを含む様々なパラメータに応じて変化し得る。

特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチドの有効量は、用量単位あたり約０．００１ｍｇ～約３，０００ｍｇ、好ましくは用量単位あたり約０．０５ｍｇ～約１，０００ｍｇを含み得る。

本発明の範囲内では、約０．００１ｍｇ～約３０００ｍｇは、用量単位あたり約０．００１ｍｇ、０．００２ｍｇ、０．００３ｍｇ、０．００４ｍｇ、０．００５ｍｇ、０．００６ｍｇ、０．００７ｍｇ、０．００８ｍｇ、０．００９ｍｇ、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ、１，０００ｍｇ、１，１００ｍｇ、１，１５０ｍｇ、１，２００ｍｇ、１，２５０ｍｇ、１，３００ｍｇ、１，３５０ｍｇ、１，４００ｍｇ、１，４５０ｍｇ、１，５００ｍｇ、１，５５０ｍｇ、１，６００ｍｇ、１，６５０ｍｇ、１，７００ｍｇ、１，７５０ｍｇ、１，８００ｍｇ、１，８５０ｍｇ、１，９００ｍｇ、１，９５０ｍｇ、２，０００ｍｇ、２，１００ｍｇ、２，１５０ｍｇ、２，２００ｍｇ、２，２５０ｍｇ、２，３００ｍｇ、２，３５０ｍｇ、２，４００ｍｇ、２，４５０ｍｇ、２，５００ｍｇ、２，５５０ｍｇ、２，６００ｍｇ、２，６５０ｍｇ、２，７００ｍｇ、２，７５０ｍｇ、２，８００ｍｇ、２，８５０ｍｇ、２，９００ｍｇ、２，９５０ｍｇ、および３，０００ｍｇを含む。

特定の実施形態では、投与されるポリペプチドは、１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）～約５０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）～約４０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）～約３０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）、約０．１ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）～約１０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）～約２５ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）を送達するために十分な投与レベルであり得る。

一部の特定の実施形態では、投与されるポリヌクレオチドまたは核酸ベクターの有効量は、用量単位あたり約１×１０^５～約１×１０^１５コピーを含み得る。

本発明の範囲内では、約１×１０^５～約１×１０^１５コピーは、用量単位あたり１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、９×１０^１３、１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、９×１０^１４、および１×１０^１５のコピーを含む。

さらに本発明は、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または送達粒子を含む医薬品に関する。

さらに本発明は、医薬品として使用するための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または送達粒子、または医薬組成物に関する。さらに本発明は、医薬品として使用するための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、または医薬組成物に関する。

一部の実施形態では、本発明はまた、医薬品の製造または調製のための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターもしくは送達粒子、または医薬組成物に関する。

さらに本発明は、がんの予防および／または処置に使用するための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、送達粒子、医薬組成物、または医薬品に関する。さらに本発明は、がんの予防および／または処置に使用するための本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、または医薬組成物に関する。

さらに本発明は、それを必要とする対象の基底オートファジーの阻止に使用するための本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、送達粒子、医薬組成物、または医薬品に関する。

また本発明は、それを必要とする対象のがん細胞の増殖の阻害に使用するための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、送達粒子、医薬組成物、または医薬品に関する。

また本発明は、がんを有する対象の全生存の改善に使用するための、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、送達粒子、医薬組成物、または医薬品に関する。

一部の他の実施形態では、本発明はまた、がんを予防および／または処置するための方法であって、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、送達粒子、医薬組成物、または医薬品の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法に関する。

「がん」は、本明細書中使用される場合、悪性または良性であるかにかかわらず、全ての新生物の細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈおよびｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、ならびに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を包有する。用語「がん」および「がん性」は、通常無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類の生理的状態を表すかまたはこれを説明するように意図されている。がんの例として、限定するものではないが、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このようながんのより特定の例として、乳がん、前立腺がん、結腸がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化器がん、膵がん、グリオブラストーマ、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、大腸がん、子宮内膜がん、唾液腺癌、腎がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、および様々な種類の頭頚部がんが挙げられる。

特定の実施形態では、さらに本発明は、酸化的がん性細胞および／または解糖系のがん性細胞を含むがんを予防および／または処置するための本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、送達粒子、医薬組成物、または医薬品に関する。

本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはその誘導体に加えて、さらなる抗がん性治療用作用物質を、処置される対象に投与する。たとえば、特定のがんを予防または処置するために本ポリペプチドを投与する場合、このがんの予防または処置に有用であることが知られているさらなる治療用作用物質が投与され得る。

例として、乳がんを予防または処置する場合、さらなる治療用作用物質は、乳がんを予防または処置することが知られている作用物質であり得る。

同様に、子宮がんを予防または処置する場合、さらなる治療用作用物質は、子宮がんを予防または処置することが知られている作用物質であり得る。

例として、さらなる治療用作用物質は、当該分野で知られているいずれかの抗がん剤であり得る。さらなる抗がん性治療用作用物質の例として、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソイド、たとえばパクリタキセル（タキソール、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、およびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴａｘｏｔｅｒｅＤＤ， Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， Ａｎｔｏｎｙ， Ｆｒａｎｃｅ）、トキソテレ（ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン、および他の関連するナイトロジェンマスタードが挙げられる。また、腫瘍でのホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン剤、たとえばタモキシフェンおよびオナプリストンなどもこの定義に含まれる。

さらなる治療用作用物質が、本発明のポリペプチドと同時に（すなわち任意選択で共製剤での同時投与）または本ポリペプチドと異なる時間で（すなわち、さらなる治療用作用物質が本ポリペプチドを投与する前または後に投与される連続投与）投与され得ることが認識される。さらなる治療用作用物質は、本発明のポリペプチドと同じ方法で、またはさらなる治療用作用物質にとって通常の投与経路を使用することにより、投与され得る。

特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、治療上有効量でそれを必要とする対象に投与される。

「治療上有効量」は、対象に有意な負または有害な副作用をもたらすことなく、がんの１つ以上の症状の進行、憎悪、もしくは悪化の遅延もしくは停止；またはがんの症状の軽減；またはがんの治癒に必要かつ十分である、ポリペプチドまたは医薬組成物のレベルまたは量を意味する。

特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチドの有効量は、用量単位あたり約０．００１ｍｇ～約３，０００ｍｇ、好ましくは用量単位あたり約０．０５ｍｇ～約１，０００ｍｇを含み得る。

「対象」は、哺乳類または非哺乳類の動物、好ましくはヒトを表すように意図されている。

一部の実施形態では、非ヒトの動物は、イヌ、ネコ、ラット、マウス、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびウマを含む、有用な経済的な動物またはペット用動物の群で選択され得る。

一部の実施形態では、「それを必要とする対象」は、がんおよび／または転移を有すると診断されたことがある。一実施形態では、対象は、がんおよび／または転移を発症しやすい。一部の実施形態では、「それを必要とする対象」は、がんおよび／または転移を発症するリスクがある。別の実施形態では、「それを必要とする対象」は、がんおよび／または転移に関してすでに処置されている。

また本発明は、それを必要とする対象の基底オートファジーを阻止するための方法であって、本発明に係るポリペプチドまたは医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法に関する。

さらに本発明は、それを必要とする対象におけるがん細胞の増殖を阻害するための方法であって、本発明に係るポリペプチドまたは医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法に関する。

一部の実施形態では、がん細胞は、解糖系のがん細胞である。一部の代替的な実施形態では、がん細胞は、酸化的がん細胞である。

さらに本発明は、がんを有する対象の全生存を改善するための方法であって、本発明に係るポリペプチドまたは医薬組成物の有効量を上記対象に投与するステップを含む、方法に関する。

また本発明は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化に影響する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ．トランケートされた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨｔｒ）のサブユニットを含む系を準備するステップと、
ｂ．ネイティブな四量体ＬＤＨの活性を調節する候補化合物を伴う系を準備するステップと、
ｃ．本発明に係るポリペプチドの存在下または非存在下で前記候補化合物のＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合のレベルを測定するステップと
を含み、
ＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合に関する前記ポリペプチドと前記候補化合物との間の競合の観察が、前期候補化合物が乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化の阻害剤であることを表す、
方法に関する。

一実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合に関する前記ポリペプチドと前記候補化合物との間の競合の観察が、乳酸脱水素酵素のサブユニット上の四量体化部位に対する候補化合物の結合の特異性を表す。

一部の実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットは、トランケートされているＬＤＨＡサブユニット、特に四量体化ドメインを欠いているＬＤＨＡサブユニットに関する。

一部の実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットは、トランケートされているＬＤＨＢサブユニット、特に四量体化ドメインを欠いているＬＤＨＢサブユニットに関する。

一部の実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットは、ＬＤＨＡサブユニットおよびＬＤＨＢサブユニットの両方を含む。

一部の実施形態では、候補化合物のＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合のレベルを測定するステップは、本発明に係るポリペプチドの増大する量の存在下で行われ得る。

また本発明は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化に影響する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ．トランケートされた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨｔｒ）のサブユニットを含む系を準備するステップと、
ｂ．ネイティブな四量体ＬＤＨの活性を調節する候補化合物を伴う系を準備するステップと、
ｃ．前記候補化合物のＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合のレベルを測定するステップと
を含み、
ＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する候補化合物の結合の観察が、候補化合物が乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化の阻害剤であることを表す、
方法に関する。

一部の実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットに対する本発明に係るポリペプチド、特に式（Ｉ）のポリペプチドの結合のレベルを測定するステップは、陽性対照として行われる。

一部の実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットは、トランケートされているＬＤＨＡサブユニット、特に四量体化ドメインを欠いているＬＤＨＡサブユニットである。

一部の実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットは、トランケートされているＬＤＨＢサブユニット、特に四量体化ドメインを欠いているＬＤＨＢサブユニットである。

一部の実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットは、ＬＤＨＡサブユニットおよびＬＤＨＢサブユニットの両方を含む。

また本発明は、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化に影響する化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ．トランケートされた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨｔｒ）のサブユニットを含む系（１）およびネイティブな四量体ＬＤＨを含む系（２）を準備するステップと、
ｂ．ネイティブな四量体ＬＤＨの活性を調節する候補化合物を含む系（１）および（２）を準備するステップと、
ｃ．系（１）におけるＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体および系（２）におけるネイティブな四量体ＬＤＨに対する前記候補化合物の結合レベル（Ｋｄ）を測定するステップと
を含み、
系（１）におけるＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する前記候補化合物の結合の観察および系（２）におけるネイティブな四量体ＬＤＨに対する前記候補化合物の結合の変更の観察は、前記候補化合物が、ＬＤＨサブユニットの表面で相互作用することにより、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化の阻害剤となることを表す、
方法に関する。

本発明の範囲内では、ネイティブな四量体ＬＤＨに対する前記候補化合物の結合の変更は、ＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する上記候補化合物の結合レベル（Ｋｄ）と比較して少なくとも５０％減少しているネイティブな四量体ＬＤＨに対する前記候補化合物の結合レベル（Ｋｄ）を表すように意図されている。本明細書中使用される場合、用語「少なくとも５０％」は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１，０００％、１，５００％、２，０００％、２，５００％、３，０００％、３，５００％、４，０００％、４，５００％、５，０００％、７，５００％、１０，０００％、またはそれ以上を含む。

本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、医薬組成物、送達粒子、または医薬品は、経口的、非経口的、局所的、吸入スプレーによるか、直腸に、経鼻的、頬に、膣に、または埋め込まれたリザーバーを介して投与され得る。本明細書中使用される用語投与は、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。

好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、医薬組成物、送達粒子、または医薬品は、非経口的、皮下、静脈内、または埋め込まれたリザーバーを介して投与される。

一実施形態では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、医薬組成物、送達粒子、または医薬品は、眼内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、または静脈内注射または注入などの注射に適した形態である。

さらに本発明は、がんを予防および／または処置するためのキットであって、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチドと、任意選択で少なくとも１つの抗がん剤とを含む、キットに関する。さらに本発明は、がんを予防および／または処置するためのキットであって、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチド、ポリペプチド、または医薬組成物と、任意選択で少なくとも１つの抗がん剤とを含む、キットに関する。

本発明の範囲内で、「少なくとも１つの抗がん剤」との表現は、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチドと併用または連続して投与され得る、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種の抗がん剤を含むように意図されている。

また本開示は、乳酸脱水素酵素ＬＤＨＢおよび／またはＬＤＨＡサブユニットの四量体化を調節する化合物をスクリーニングするためのキットであって、
ＬＤＨｔｒのサブユニットと、
本発明に係るポリペプチドと
を含む、キットに関する。

本発明に係るポリペプチドは、陽性対照として後者のキットで使用され得ることを理解されたい。

一部の実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットは、ＬＤＨＡサブユニット、特に四量体化ドメインを欠いているＬＤＨＡサブユニットである。

代替的な実施形態では、ＬＤＨｔｒのサブユニットは、ＬＤＨＢサブユニット、特に四量体化ドメインを欠いているＬＤＨＢサブユニットである。

また本開示は、乳酸脱水素酵素ＬＤＨＢおよび／またはＬＤＨＡサブユニットの四量体化を調節する化合物をスクリーニングするためのキットであって、
ＬＤＨｔｒのサブユニットと、
ネイティブな四量体ＬＤＨと、
本発明に係るポリペプチドと
を含む、キットに関する。

図１Ａ～Ｄは、（Ａ）透かし絵により示される１９のＮ末端のアミノ酸を有する単量体毎に色付けされた完全長のＬＤＨＢ四量体（（ＰＤＢ ｃｏｄｅ １Ｉ０Ｚ）；（Ｂ）単量体Ａ、Ｂ、およびＣにより形成される三量体に重ね合わされた１つの単量体の１９のＮ末端のペプチド（鎖Ｄ）、ならびに（（Ｃ）および（Ｄ））１９のＮ末端のペプチドと単量体ＢおよびＣとの間の主な相互作用の３Ｄ図である（Ｄｅｌａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＰｙｍｏｌ（登録商標）を使用して作成した画像）。 図２Ａ～Ｄは、（Ａ）完全長のＬＤＨＢおよび（Ｂ）トランケートされているＬＤＨＢの保持体積を決定するために使用される分子ふるいクロマトグラム、（Ｃ）補因子ＮＡＤＨを用いたＬＤＨＢおよびＬＤＨＢｔｒ結合アッセイの重ね合わせ；（Ｄ）トランケートされているＬＤＨＢ（左）および完全長のＬＤＨＢ（右）のサーマルシフト（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ）アッセイを示すグラフのセットである。示される温度は、生の蛍光の導関数により計算されたサーマルシフトに対応する。 図３Ａ～Ｃは、（Ａ）ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシーケンスを使用したＬＤＨＢｔｒ（１５μＭ）に対する８００μＭのＬＢ８類縁体のスクリーニング；破線は、対照実験と比較した場合のＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルの１０％の増加に対応する、０．１の任意の閾値を表す；（Ｂ）ＬＤＨＢ四量体化部位と相互作用するＬＢ８のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのモデル；（Ｃ）ＬＢ８残基の構造活性の関係を示すグラフのセットである。 図４Ａ～Ｃは、（Ａ）らせん度を促進させるために使用されるシステイン架橋戦略の概略図；（Ｂ）最良に相互作用する環状ペプチドの構造；（Ｃ）完全長のＬＤＨＢ（上部）およびトランケートされているＬＤＨＢ（下部）に対するこの環状ペプチドの結合の比較を示すグラフのセットである。 図５Ａ～Ｄは、（Ａ）完全長のＬＤＨＢ（ＬＤＨＢｆｌ）およびトランケートされているＬＤＨＢ（ＬＤＨＢｔｒ）の蛍光スペクトル；（Ｂ）中性およびわずかに酸性の条件でのＬＤＨ－Ｍの蛍光スペクトルを表すグラフ；（Ｃ）中性条件における復元後のＬＤＨ－Ｍの蛍光スペクトルを表すグラフ；（Ｄ）復元後の経時的なＬＤＨ－Ｍの蛍光強度の回復を表すグラフを示すグラフのセットである。 図６Ａ～Ｄは、ＬＢ８（Ａ）およびＬＢｃ（Ｂ）での変性後の蛍光強度の回復；（Ｃ）１完全長のＬＤＨＢおよび２トランケートされているＬＤＨＢのトリプトファンの蛍光スペクトル；（Ｄ）ＬＴ０１８での変性後の蛍光強度の回復を示すグラフのセットである。 図７は、ＬＤＨＢの利用可能なＸ線構造（ＰＤＢ ＩＤ １Ｉ０Ｚ）を使用してＭＯＥソフトウェアから計算した全体的なＬＢ１９側鎖結合エネルギー（Ｈ結合、Ｖｄｗ、イオン性）を示すグラフである。自由エネルギーの計算は、８つのＮ末端のアミノ酸を有するＬＢ１９の全体的なＳＡＲが全般的な結合に最も重要であることを良好に予測している。 図８Ａ～Ｂは、以下のグラフのセットである。（Ａ）二量体のＬＤＨＢｔｒ（ｐｌｏｔ１）、四量体のＬＤＨ１（ｐｌｏｔ ２）およびＬＤＨ５（ｐｌｏｔ ３）での大環状ペプチドＭＰ７のＭＳＴ結合曲線を示すグラフ。結合曲線は、赤色色素の生の蛍光から抽出したＬＤＨ５での結合曲線（ｎ＝３）を除き、１０～２０ｓのＭＳＴ ｏｎ時間でＭＳＴトレースから抽出した（ｎ＝３）。（Ｂ）大環状ペプチドＭＰ７に曝露した様々な濃度のヒトＬＤＨ５のＮａｎｏＤＳＦ（ｎ＝６）を示すグラフ。３５０／３３０ｎｍの蛍光発光の変化は、青色または赤色のシフトを表し、フォールディングされていない事象を表す；Ｐｌｏｔ １－３：４００μＭ ＭＰ ７；Ｐｌｏｔ １：３００ｎＭ ＬＤＨ５；Ｐｌｏｔ ２：５００ｎＭ ＬＤＨ５；Ｐｌｏｔ ３：１，２００ｎＭ ＬＤＨ５；Ｐｌｏｔ ４：１，２００ｎＭ ＬＤＨ５。 図９Ａ～Ｄは、酸への曝露後のウサギＬＤＨ５の蛍光の回復に及ぼすＭＰ１およびＭＰ７の影響を示すグラフのセットである（ｎ＝６）。（Ａ）２００ｎＭのｒＬＤＨ５は、５０μＭのＭＰ７の非存在下（ｐｌｏｔ １）または存在下（ｐｌｏｔ ２）で復元した；（Ｂ）２００ｎＭのｒＬＤＨ５は、５０μＭのＭＰ１の非存在下（ｐｌｏｔ １）または存在下（ｐｌｏｔ ２）で復元した；（Ｃ）２００ｎＭのｒＬＤＨ５は、５０μＭのＬＢ８の非存在下（ｐｌｏｔ １）または存在下（ｐｌｏｔ ２）で復元した；（Ｄ）２００ｎＭのｒＬＤＨ５は、５０μＭのＬＢｃの非存在下（ｐｌｏｔ １）または存在下（ｐｌｏｔ ２）で復元した。 図１０は、ＭＳＴから得られたＬＤＨ５でのＭＰ７の結合曲線（ｐｌｏｔ ２、結合の割合（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｂｏｕｎｄ））と重なった増大する濃度のＭＰ７（ｐｌｏｔ １；四量体（％））でのＬＤＨ５の四量体の状態を示すグラフである。四量体の状態は、ＬＤＨ５（１００％の四量体として企図）およびＬＤＨＢｔｒ（０％との四量体として企図）のスペクトルに関して正規化された３５０ｎｍの蛍光強度を使用して推定する。 図１１Ａ～Ｅは、大環状ペプチドＭＰ７（７）または対照ビヒクル（対照）の添加後のＭｉａ Ｐａｃａ－２細胞の細胞外酸性化速度（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ：ＥＣＡＲ）および酸素消費速度（ＯＣＲ）の変化を示すグラフのセットである。（Ａ）基底ミトコンドリアＯＣＲ（ｐｍｏｌ／分／１０^４個の細胞）。（Ｂ）最大ミトコンドリアＯＣＲ（ｐｍｏｌ／分／１０^４個の細胞）。（Ｃ）ＯＣＲ依存性のＡＴＰの産生。（Ｄ）解糖に関連するＥＣＡＲ、および（Ｅ）解糖能ＥＣＡＲ（ｍｐＨ／分）。Ｎ＝２、ｎ＝１５－１６。＊（ｐ＜０．０５）；＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）。

実施例
さらに本発明を、以下の実施例により示す。

実施例１
１－実験の手法
１．１－ペプチド合成
本明細書中使用する全てのポリペプチドは、ＧｅｎｅＣｕｓｔ（登録商標）（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｃｕｓｔ．ｃｏｍ）から購入した。ペプチドの純度のレベルは、９５％超であった。構造の一致および純度のグレードは、分析用ＨＰＬＣ分析および質量分析により確認した。全てのペプチドは、他の記載がない限り、それらのＣ末端でアミド化した。

１．２－核磁気共鳴（ＮＭＲ）
６Ｈｉｓ Ｔａｇでタグ付与した完全長のヒトＬＤＨＢ（ＬＤＨＢ；配列番号２）およびトランケートされているＬＤＨＢ、すなわち最初のＮ末端の１９アミノ酸残基を欠いているＬＤＨＢサブユニット（ＬＤＨＢｔｒ；配列番号４）を、上述のように大腸菌細胞から発現させ、精製した。全ての実験は、ｂｒｏａｄｂａｎｄ ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ（Ｂｒｕｋｅｒ（登録商標）ＧｍＢＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を搭載したＢｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００ ＭＨｚで得た。

１．３－ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験
ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹを、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）および１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０％のＤ_２Ｏバッファーで調製したサンプルで行った。ＬＤＨサブユニットの濃度は、１５～２０μＭであった。リガンド結合は、１秒の混合時間でＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ ｅｐｈｏｇｓｙｇｐｎｏ．２ ａｄｖａｎｃｅ－ｖｅｒｓｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅを使用して検出した。水シグナルの抑制は、励起スカルプティングスキーム（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）を使用して達成し、タンパク質のバックグラウンドシグナルを抑制するために、５０ｍｓのスピンロックを使用した。各実験で、５１２のスキャンを回収して、１６ＫポイントのＦＩＤを得た。ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ強度は、タンパク質の存在下および非存在下で記録されるリガンドのＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルの強度の差異をプロットすることにより補正した。

ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスクリーニング実験では、補正係数を、サンプル間のわずかな濃度のバリエーションを補正するために適用した。これを行うために、５０ｍｓのスピンロックで８つのスキャンの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを記録した後、ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験を行った。タンパク質を伴う脂肪族領域および伴わない脂肪族領域（０．７００ｐｐｍ～０．９５５ｐｐｍ）の強度比率を、ＬＤＨサブユニットを伴う目的のポリペプチドおよび伴わない目的のポリペプチドのＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ強度を比較するための補正係数として使用した。タンパク質を伴うスペクトルとタンパク質を伴わないスペクトルとの間のＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナル強度の１０％の減少に対応する、０．１の任意の閾値を、バインダーと非バインダーとの間を区別するために設定した。

１．４－２Ｄ実験
ポリペプチドを、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＴＳＰ、および１０％のＤ_２Ｏを含む５０ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。全ての実験で、水の抑制を、励起スカルプティングスキームを使用して達成した。４Ｋの時間領域ポイントおよび２５６のインクリメントが、全ての２Ｄスペクトルに適用された。

ＴＯＣＳＹの実験は、８０秒の混合時間にてｄｉｐｓｉ２シーケンスで等核のハートマンハーン（Ｈａｒｔｍａｎ－Ｈａｈｎ）伝達を使用して行った。スペクトルあたり８つのスキャン、４Ｋの時間領域ポイント、および２５６のインクリメントを記録した。

ＲＯＥＳＹ実験を、混合のためのｃｗスピンロックを伴う２Ｄ ＲＯＥＳＹシーケンスを使用して行い、４００秒の混合時間を使用し、記録したスキャンの数は３２であった。

１．５－分子ふるい実験
分子ふるいクロマトグラフィーを、０．７ｍｌ／分で、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬを搭載したＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））を使用して行った。ＬＤＨＢｆｌ（配列番号２）およびＬＤＨＢｔｒ（配列番号４）を、アッセイバッファーで３μＭに希釈した。最終的な注入容量は、１００μｌであった。実験前に、カラムを、蒸留およびろ過したＨ_２Ｏで２倍のカラム容量で、次に３倍のカラム容量のろ過されたバッファーにより、平衡化した。分子量は、製造社の説明に従い同じアッセイバッファーにおいてＢｉｏｒａｄのゲルろ過標準物質を使用して決定した。

１．６－蛍光ベースのサーマルシフト
サーマルシフトアッセイを、９６ウェルの白色のプレート（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））においてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））で行った。各ウェルは、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、１００ｍＭのＮａＣｌにおいて５μＭのタンパク質および５×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ２０μｌを含んでいた。各プレートを、光学的に透明なホイルで密閉し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、アッセイを行った。プレートを、約４℃／分^－１、２０～９９℃で加熱した。蛍光強度を、λｅｘ＝４８０ｎｍおよびλｅｍ＝５８０ｎｍで測定した。融解温度（Ｔｍ）を、融解曲線の一次導関数の曲線の最小値を決定することにより得た。

１．７－マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）
ＭＳＴの測定を、赤色色素－ＮＨＳ蛍光標識を使用してＮａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）， ＧｍｂＨ）で行った。均一となるまで精製した、各ＬＤＨ（ＷＴまたはトランケート済みの）サンプルを、供給されたプロトコルによりＭｏｎｏｌｉｔｈ ＲＥＤ－ＮＨＳ第２世代の標識色素（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）， ＧｍｂＨ）で標識した。測定を、ｐｒｅｍｉｕｍ ｔｒｅａｔｅｄ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）， ＧｍｂＨ）において、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）および１００ｍＭのＮａＣｌで行った。このアッセイにおけるいずれかの標識したタンパク質の最終濃度は１００ｎＭであった。リガンド（ＮＡＤＨおよびペプチド）を、製造社の推奨により１：１希釈で滴定した。全ての結合反応物を、毛細管に充填した後室温で５’インキュベートした。実験を、４０％のＬＥＤ ｐｏｗｅｒおよび中程度のＭＳＴ ｐｏｗｅｒを使用して三連で行った。ＬａｓｅｒＯｎ時間は２０秒であり、Ｌａｓｅｒ Ｏｆｆ時間は３秒であった。直鎖状のオクタペプチドを、それらの熱泳動パターンについて評価した。より長い環状ペプチドが標識色素と相互作用することが見出され、よって、熱泳動パターンの代わりに生の蛍光を使用して、製造社の説明により解離定数を抽出した。

１．８－６Ｈｉｓでタグ付与したヒトＬＤＨポリペプチドの精製
ｐＥＴ－２８ａ発現ベクター内にクローニングしたｈＬＤＨ（ｗｔおよびトランケート済み）の配列は、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ（登録商標）， Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇからオーダーした。次に、組み換えプラスミドを宿主細菌の大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ株（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で、光学密度が０．６に達するまで３７℃で培養した。ＬＤＨ発現を、１ｍＭのイソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により、２０℃で２０時間誘導した。次に、細胞を、５，０００ｒｐｍ、４℃で２５分間の遠心分離により回収した。ペレットを、溶解バッファーに懸濁し、次に超音波処置により破壊し、次いで４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。不溶性のフラクションを廃棄し、可溶性フラクション１ｍｌあたり１μｌのβ－メルカプトエタノールを添加した。組み換えポリペプチドの精製を、１ｍｌのＨｉｓ－ｔｒａｐ ＦＦ粗製カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））を使用して製造社の説明により行った。最後に、濃度を、Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法を使用して測定し、サンプルの均一性を、染色剤としてクーマシーブリリアントブルーを用いる硫酸塩－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を使用して評価した。

１．９－分光光度法による実験
全ての分光光度法による実験を、ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｍ２ｅ分光光度計を使用して透明または不透明な９６ウェルプレートで行った。

１．１０－酵素アッセイ
デヒドロゲナーゼ反応を、ＬＤＨ１（ＬＤＨＢの四量体）の生理的に関連する乳酸からピルビン酸への方向で、乳酸の酸化の間に産生されたＮＡＤＨ蛍光を経過観察することにより行った。反応の進行を、３４０／４６０ｎｍでの蛍光の増大としてモニタリングした。

ミカエリスメンテン定数の決定を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。酵素反応を、乳酸からピルビン酸への酸化を高めるためのリン酸塩バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．３）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、およびＤＴＴ（１ｍＭ）を含む溶液において行った。最終的なタンパク質濃度は、完全長のＬＤＨＢサブユニットで７．７ｎＭであり、トランケートされているＬＤＨＢサブユニット（ＬＤＨＢｔｒ）で１３．５ｎＭであった。ＮＡＤ^＋Ｋｍの決定のため、乳酸の濃度は、２０ｍＭに設定され、補因子の濃度は、完全長の酵素では１μＭ～５ｍＭの範囲にあり、トランケートされている形態では５０μＭ～１０ｍＭの範囲にあった。乳酸のＫｍの決定では、ＮＡＤ^＋の濃度は、１ｍＭに設定し、基質濃度は、完全長の酵素では１μＭ～４０ｍＭの範囲、トランケートされている形態では１ｍＭ～４０ｍＭの範囲にあった。

１．１１－内因性蛍光アッセイ
記載される手法により；ウサギＬＤＨＡの市販の溶液を含む硫酸アンモニウム懸濁液（ｐＨ約７．０、３．２Ｍ）を、まずＮａＣｌ（２００ｍＭ）の溶液で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、次に、２００ｍＭのＮａＣｌに対して４℃で２回×２時間透析した。次に、１ｍｇ／ｍｌの原液を、ＮａＣｌ（２００ｍＭ）で３０μｇ／ｍｌに希釈し、アッセイ溶液を得た。

アッセイ溶液を、酢酸塩－塩化物バッファー（２０ｍＭの酢酸／酢酸塩、１８０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）、またはリン酸塩バッファー（２５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．６））と１：１で混合した。４℃で３０’保存した後、サンプルを取り出し、２５０ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ７．６）で１：１に希釈して、７．５μｇ／ｍｌの再結合したＬＤＨ－Ｍの最終濃度を得た。

次に、得られた溶液のサンプルを、内因性蛍光の回復の動態実験に供した（Ｅｘｃ＝２８６ｎｍ、Ｅｍ＝３５０ｎｍ、１０’、ｒｔ）。後に、完全なトリプトファンの蛍光スペクトルを記録した（Ｅｘｃ＝２８６ｎｍ、Ｅｍ＝３２０－４００ｎｍ、ｒｔ）。

１．１２－ポリペプチドの環化
ＮＨ_４ＨＣＯ_３バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ＝８．０）における凍結乾燥した粗製ペプチド溶液（約３ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍＭ）を、ＴＣＥＰ（１．５当量）（同じＮＨ_４ＨＣＯ_３バッファーにおいて１Ｍの溶液から２．２５μｌ）で処置し、１時間（７００ｒｐｍ）撹拌した。ＤＭＦにおけるアルキル化剤（約３当量）（５０ｍＭ溶液から１００μｌ）を溶液に添加し、２時間（７００ｒｐｍ）撹拌した。反応を、混合物のｐＨを０．５ＮのＨＣｌまたはＴＦＡ（１５０μｌ／ｍｌ）の添加を介してわずかに酸性の条件に調節することによりクエンチした。次に、粗製混合物を１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。次に、この上清を、ＨＰＬＣ／ＭＳにより分析および精製した。

１．１３－ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの評価
自由結合エネルギーの計算を、利用可能なＬＤＨＢ（配列番号２）の結晶構造を用いてＭＯＥソフトウェアを使用して行った。計算前に極小化は行わなかった。

２－結果
２．１－ＬＤＨ四量体化部位のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの試験
ＬＤＨＡおよびＬＤＨＢのサブユニットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでハイブリダイズしてヘテロ四量体のＬＤＨ２－３－４を提供できるため、ＬＤＨＡおよびＬＤＨＢの四量体化部位およびＮ末端アームは、構造上非常に類似している。よって、１つのサブユニットに対する選択性は、企図した手法を使用して達成されるとは予測されない。まず、ＬＤＨ１（四量体ＬＤＨＢ）およびそのＮ末端アームを試験した。利用可能なＬＤＨＢの結晶構造の分析は、２つの他のサブユニットと各サブユニットの１９のＮ末端のアミノ酸ポリペプチドの相互作用による、４つのアームが四量体を包含するような四量体の安定化を明確に示している（図１Ａおよび１Ｂ）。これらペプチドアームは、ループを介して、サブユニットに結合したＮ末端のαヘリックス、次いで短いβシートを伴う特定の伸長した立体構造を採用している。４つの１９のＮ末端のアミノ酸を比較する場合、側鎖の配向に関するわずかな差異が恐らくはペプチドの柔軟性のため観察され得ることが強調される。しかしながら、全ての事例において、１９のＮ末端のアミノ酸ペプチドは、アミノ酸残基Ｌ３およびＬ７とＡポケットのＬ１７８、Ｖ２０６、Ｖ２０９、Ｖ２１１、およびＷ２２７との間の非極性相互作用、ならびにアミノ酸残基Ｖ１１とＢポケットのＬ３００およびＶ３０３との間の非極性相互作用を主に介して２つの異なるサブユニット上の２つの隣接するポケット（ＡおよびＢ）に結合する（図１Ｃおよび１Ｄ）。水素結合などの極性相互作用（Ｉ７とＮ３０５、Ａ９とＶ３０３、Ａ１２／Ｅ１４とＲ２９８）もまた、ＡポケットおよびＢポケットの中のペプチドの安定化に寄与している。

この構造解析に基づき、完全長のＬＤＨ１酵素上のＬＤＨＢの１９のＮ末端のアミノ酸ペプチド（ＡＴＬＫＥＫＬＩＡＰＶＡＥＥＥＡＴＶＰ、すなわちＬＢ１９、配列番号６）の薬理学的な性質を評価した。残念なことに、生化学的評価および生物物理学的な評価は、ＬＢ１９とＬＤＨ１との間の相互作用を示さなかった。この作用の欠如は、四量体化部位に関するＬＤＨＢのＮ末端の１９ｍｅｒペプチドアームとＬＢ１９との間の「アンフェアな」競合から生じたとの仮説を立てた。この仮説により、この相互作用の評価を可能とする新たなタンパク質モデルの設計および評価を行うこととした。

２．２－二量体のＬＤＨの設計および評価
四量体化部位でのツール化合物の評価の課題に取り組むために、１９のＮ末端のアミノ酸残基のトランケートされている第２のＬＤＨＢ（ＬＤＨＢｔｒ）を産生させた。この四量体化アームを欠いているトランケートされているタンパク質は、恐らくはネイティブな二量体の状態にあり、よってＬＤＨＢの四量体化部位へのアクセス可能性を得ることを可能にするであろうとの仮説を立てた。

組み換え型のＬＤＨＢｔｒ（配列番号４）の形態を、大腸菌で産生させ、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）、拡散光散乱（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＤＬＳ）、および内因性蛍光によりネイティブな二量体の状態にあることが示された。さらに、その補因子に対するｒＬＤＨＢｔｒの親和性を、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用して評価し、完全長のＬＤＨＢ（Ｋｄ＝２４μＭ＋／－８μＭ）と同様な２１μＭ＋／－５μＭのＫｄ値が得られ、よって、タンパク質の「ロスマンドメイン」が正しくフォールドしていることが示された。またｒＬＤＨＢｔｒの触媒の性質が、標準的な生化学的アッセイを使用して評価され（図１）、基質および補因子の両方でミカエリスメンテン定数Ｋｍが５倍増加し、最大速度Ｖｍａｘが１０倍減少すると完全長のＬＤＨＢと比較して非常に弱い活性が示された（表１）。

最後に、ＬＤＨＢｔｒの安定性を、サーマルシフトアッセイおよびＴＹＣＨＯ ＮＴ．６を使用して評価した。二量体のＬＤＨＢは、それぞれ、融解温度において１８℃および２４℃のシフトで四量体のＬＤＨＢと比較した場合に非常に不安定化していることが見出された（図２）。結論として、これら結果は、トランケートされているＬＤＨＢが良好にフォールディングされているが、活性が不十分な二量体のタンパク質であることを表している。さらに、ＬＤＨの四量体化の標的化は、酵素を不安定にし、その活性を弱くし得ることが示されている。

２．３－ＬＢ１９およびＬＤＨＢｔｒの四量体化部位の間の相互作用の試験および最適化
ＬＤＨＢｔｒ（配列番号４）およびＬＢ１９（配列番号６）の間の相互作用の生物物理学的な評価を、２つの生物物理学的な直交する方法：ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹおよびマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用して行った。ＭＳＴ分析によると、ＬＢ１９は２７０μＭ［＋／－７０μＭ］のＫｄでＬＤＨＢｔｒと相互作用する。ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ分析は、ＬＢ１９とＬＤＨＢｔｒとの間の相互作用から生じる正のシグナルを示した。ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルの分析は、２つの分子の間の相互作用のエピトープマッピングを可能にしていた。興味深いことに、ＬＢ１９のＮ末端の残基は、そのＣ末端の対応物よりも飽和移動を経ており、ＬＢ１９のＮ末端の残基が、結合強度の大部分に寄与している可能性があることを意味している。よって、ＬＤＨＢのネイティブなアームの全体的な結合エネルギーの計算は、同様の結果を示した。

これらの知見により、一部のＣ末端のアミノ酸は、ＬＤＨＢｔｒとの結合に寄与するＮ末端由来のアミノ酸のみを保持するために、ＬＢ１９から除去された。これに基づき、ＬＤＨＢｔｒ（配列番号４）に対するポリペプチドＬＢ１３（配列番号７）の結合を評価することとした。ＬＢ１３は、残基の相互作用が以前の結果と一致して全て再現され、よって、ＬＢ１９と正確に同じＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを提示した。さらに、ＭＳＴ分析により、相互作用の減弱がＫｄ＝６０５μＭ［＋／－２９０μＭ］とわずかに留まったことが確認された。ＬＢ１３からのさらなる大きさの減少のため、バリン残基を除き、ＬＢ１３中と同じ相互作用残基をまとめた、ＬＢ８（ＡＴＬＫＥＫＬＩ；配列番号８）の評価をすることとした。繰り返すが、相互作用の強度（Ｋｄ＝１．４ｍＭ［＋／－０．４ｍＭ］）の小さな低下とは別に、ＬＢ８は、ＬＤＨＢのＮ末端アームのＮ末端のαヘリックスと正確に一致しており、よって、ＬＤＨＢ四量体化部位とそのＮ末端アームとの間の相互作用の「ホットスポット」と予測することができる。ＬＢ１９の中心にあたるフラグメント（ＬＩＡＰＶＡＥ、すなわちＬＢｃ；配列番号２６）もまた、陰性対照として評価され、これら条件下で明らかな飽和移動を全く示さないことが見出された。

２．４－ＬＢ８ ＳＡＲ
ＬＢ８（配列番号８）とＬＤＨＢ四量体化部位との間の構造活性の関係の評価を、さらに試験した。ＬＢ８の活性な立体構造はαヘリックスであることが予想されるため、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏおよび実験の評価の組み合わせを、ＬＢ８ ＳＡＲを解明するために使用した。１５個のＬＢ８の構造上の類縁体のセットを構築し、８００μＭの単一の濃度でＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ実験によりさらに分析して、飽和移動の喪失をもたらす構造上の修飾を同定した（表２および図３）。まとめると、これら結果は、ＬＢ８の構造活性の関係に知見をもたらした。

結晶のデータの分析と一致して、２つのＬアミノ酸残基およびＣ末端のイソロイシンが、結合に必要であることが見出された。ＬＤＨＢ ３Ｄ構造から抽出したｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのモデルは、これら脂肪族側鎖が四量体化部位の疎水性キャビティに向けて突き出ることを表した。飽和移動強度のＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹマッピングにより、親油性残基が他のいずれかよりも多くの飽和移動を経ており、よって、四量体化部位でより密接に相互作用することが確認された。

ＬＢ８（配列番号８）では、アミノ酸残基のＴからＡへの切り替え、および末端残基のいずれかの除去はまた、相互作用の解消をもたらした（表２および図３Ａ）。このｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのモデルおよびＡｇａｄｉｒらせん度の計算に基づき、これら修飾が、活性のαヘリックスの立体構造を不安定化させるとの仮説を立てた。他の側鎖の残基の修飾は、ＬＤＨＢの四量体化部位とのペプチドの相互作用に対して影響しなかった。

２．５－環化
ＬＢ８の弱い結合は、結合前に多大なエントロピーコストをもたらす不十分ならせんの傾向により説明され得ることが予想された。実際に、２Ｄ ＮＯＥＳＹおよびＲＯＥＳＹの分析により、Ｎ末端領域においてαヘリックスに特徴的なクロスカップリングの不存在が確認された。さらに、以前の研究は、ペプチドの立体構造の自由を制限することによりエントロピーを介した有効性の増加を示していた。よってＬＢ８の側鎖間の環化が、そのらせん度を促進するように行われた。ペプチドの大環状化に関する多くの戦略が記載されている（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ． （２０１４））。その中で、αヘリックス促進剤を用いたシステインアルキル化は、すでに、小分子ペプチドのらせん度、よって親和性の増強を強力にもたらすことが示されている（図４Ａ）（Ｊｏ ｅｔ ａｌ． （２０１２））。よって、ＬＢ８ ＳＡＲに基づき、本発明者らは、様々なｉおよびｉ＋４位でシステインを導入し、α，α’ビスブロモキシレンを使用してこれらペプチドをアルキル化した。次に、得られた環状ペプチドを、ＮＭＲ ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹおよび直交の方法のＭＳＴ実験を使用してその結合に関してアッセイした。

これらのうち、ＬＴ０１８ポリペプチド（配列番号３１）は、ＬＢ８（配列番号８）と比較して明らかな３０倍の有効性の増加（Ｋｄ＝６６μＭ＋／－３２μＭ）および強力な飽和移動を有する最も見込みのある１つであることが明らかとなった。しかしながら、この親和性の増大にも関わらず、ＬＴ０１８ポリペプチド（配列番号３１）は、依然として、ＬＤＨＢのネイティブなアームと競合することができなかった（図４）。にもかかわらず、これは、さらなるＬＤＨの四量体化部位の評価にとって見込みのあるツールを構成していた。

２．６－ＶＳ－１４２－ＢｉｓＡｌｋポリペプチドは、ＬＤＨの四量体化を阻害する
ＬＴ０１８ポリペプチド（配列番号３１）がＬＤＨＢのネイティブなアームと競合することができず、よって、すでに形成されたＬＤＨＢ四量体を破壊することができなかったという知見を受けて、これは恐らくは事前の解離に依存する方法で四量体化部位に結合し得ることが推論された。よって、この仮説を確認するために、わずかに酸性の条件で開始される事前の解離の後のＬＤＨ四量体の形態の回復を経過観察するための実験を設計した。簡潔に述べると、ＬＤＨ構造において６つのトリプトファンが見出されており、これらのうち３つは、二量体間の界面に位置している。トリプトファンの量子収率は極性環境で減少するため、二量体のＬＤＨは、四量体のＬＤＨと比較して非常に弱いトリプトファンの蛍光を示す。よって、酸性条件（ｐＨ５．０）では、ＬＤＨは、四量体の解離と相関しているトリプトファンの蛍光の減少を示す（Ｒｕｄｏｌｐｈ ａｎｄ Ｊａｅｎｉｃｋｅ （１９７６）；図５）。よって、ｐＨの中和後の蛍光の回復は、四量体の再結合の直接的な評価基準である。

ＬＢ８は、１００μＭまで影響を及ぼさなかった（図６Ａ）が、驚くべきことに、ＬＴ０１８ポリペプチド（配列番号３１）は、５０μＭで蛍光の回復を良好に妨げた（図６Ｄ）。またＬＢｃ（配列番号２６）は、陰性対照として使用され、ＬＤＨの再結合時に影響を及ぼさなかった（図６Ｂ）。結論として、これら結果は、ＬＴ０１８ポリペプチド（配列番号３１）が、ＬＤＨの四量体化のプロセスを妨げることができることを表している。

実施例２
１－材料および方法
１．１－化学物質およびペプチド
全ての試薬は、化学物質の製造業者から購入し、精製することなく使用した。ウサギＬＤＨＡおよび組み換え型ヒトＬＤＨＡは、それぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）およびＡｂｎｏｖａ（登録商標）から購入した。生物物理学の実験で直接使用した直鎖状ペプチドは、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ（登録商標）から購入し、システインのステープリング（ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｔａｐｌｉｎｇ）に使用される直鎖状ペプチドは、固相ペプチド合成により合成した。ラクタム環状ペプチドは、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ（登録商標）から購入した。構造の一致および純度のグレード（＞９５％）は、市販のペプチドおよび合成ペプチドの両方で、分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析および質量分析（ＭＳ）により評価した。全てのペプチドは、そのＣ末端でアミド化した。

１．２－ペプチドの合成
システインの架橋の手法に使用した全てのペプチドは、Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＡＭ ｒｅｓｉｎ（Ｂａｃｈｅｍ（登録商標））（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ０．５～１．２ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して０．０５または０．１ｍｍｏｌのスケールで合成した。フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護したアミノ酸（５倍過剰）を、１当量のヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）および２当量のジイソプロピルエタノールアミン（ＤＩＰＥＡ）（アミノ酸と比較して同等）で活性化した。室温で６０分間、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）においてカップリングを行った。Ｆｍｏｃ脱保護を、ＮＭＰにおいて２０％のピペリジンを使用して、室温で１０分間行った。側鎖の脱保護および同時にレジンからの切断を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン／水／チオアニソール（９０／２．５／２．５／５）の混合物を使用して、室温、２時間で達成した。次に、ＴＦＡを窒素フラックス下で蒸発させ、粗製ペプチドを、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させた。次に、粗製ペプチドを、ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ ＥＶＯ Ｃ１８（１５０×４，６ｍｍ）を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）（１１００シリーズ）ＨＰＬＣのシングル四重極（ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ， ＥＳＩ＋）システムを使用して分析し、その後さらに使用するため凍結乾燥した。

１．３－架橋したペプチドの合成
ヘキサフルオロベンゼンを使用したステープリングを、Ｓｐｏｋｏｙｎｙ ｅｔ ａｌ． （２０１３）により記載される以下の手法により行った。ペプチド（約７．５μモル）の凍結乾燥したサンプルに、ＤＭＦにおいて１００ｍＭのヘキサフルオロベンゼンの溶液（約２５当量）１．９ｍＬおよびＤＭＦにおいて５０ｍＭのトリス塩基の溶液１．５ｍＬを添加した。溶液を室温で５時間撹拌させた。得られた混合物を、２倍容量の０．１％のＴＦＡ水溶液で希釈し、上述のＨＰＬＣでの分析および精製に供した。

１．４－マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）
ＭＳＴの測定を、赤色色素－ＮＨＳ蛍光標識を使用してＮａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））で行った。均一となるまで精製した各ＬＤＨサンプルは、製造社の指示に従い、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｒｅｄ－ｄｙｅ－ＮＨＳ第２世代の標識色素（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））で標識した。測定は、ｐｒｅｍｉｕｍ－ｔｒｅａｔｅｄ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））において、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）および１００ｍＭのＮａＣｌで行った。このアッセイにおけるいずれかの標識したタンパク質の最終濃度は１００ｎＭであった。リガンド（ＮＡＤＨおよびペプチド）を、製造社の推奨により１：１希釈で滴定した。全ての結合反応物を、毛細管に充填した後室温で５分間インキュベートした。実験を、４０％のＬＥＤ ｐｏｗｅｒおよび中程度のＭＳＴ ｐｏｗｅｒ、２０ｓのＬａｓｅｒ Ｏｎ時間、および３ｓのＬａｓｅｒ Ｏｆｆ時間を使用して三連で行った。ペプチドを、それらの熱泳動パターンについて評価し、Ｋｄは、製造社の説明にしたがい１０～２０ｓのＭＳＴ ｏｎ時間で生のデータから抽出した。ＬＤＨ５と７の相互作用に関しては、Ｋｄは、生の蛍光から抽出した。変性試験は、製造社の推奨にしたがい行い、７と赤色色素との間の非特異的なスペクトルの相互作用を排除した。相互作用する大環状分子およびペプチドの全てのＫｄは、三連で入手し、ＴＦＡ対イオンの分子量を考慮することにより補正した。ペプチドＡＴＧＫＥＫＬＩ（ＬＢ８－Ｇ３；配列番号２９）は、陰性対照として使用し、ＬＢ８（配列番号８）と比較して明らかな結合を呈さなかった。

１．５－分光光度法の実験
全ての分光光度法の実験は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｍ２ｅ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して不透明な９６ウェルプレートで行った。

ａ）動態アッセイ
デヒドロゲナーゼ反応を、乳酸のピルビン酸への酸化の間に産生されたＮＡＤＨ蛍光を受けてＬＤＨ１の生理的に関連する乳酸からピルビン酸への方向で行った。反応の進行を、３４０／４６０ｎｍでの蛍光の増大としてモニタリングした。ミカエリスメンテン定数Ｋｍの決定を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアを使用して行った。酵素反応を、乳酸からピルビン酸への酸化を高めるためのリン酸塩バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む溶液において行った。最終的なタンパク質濃度は、ＬＤＨＢで７．７ｎＭ、ＬＤＨＢｔｒで１３．５ｎＭであった。ＮＡＤ＋Ｋｍの決定のため、乳酸の濃度は、ＬＤＨＢで２０ｍＭ、ＬＤＨＢｔｒで１５０ｍＭに設定され、補因子の濃度は、ＬＤＨＢで１μＭ～５ｍＭ、ＬＤＨＢｔｒで５０μＭ～１０ｍＭの範囲であった。乳酸のＫｍの決定のため、ＮＡＤ＋の濃度は１ｍＭに設定され、基質濃度は、ＬＤＨＢで１μＭ～３０ｍＭ、ＬＤＨＢｔｒで１ｍＭ～４０ｍＭであった。

ｂ）内因性蛍光アッセイ
完全なトリプトファンの蛍光スペクトルを、２８６ｎｍの励起波長を使用し、室温で３２０ｎｍ～４００ｎｍの励起スペクトルを記録して、記録した。さらに、各実験の生の蛍光を、タンパク質を伴わない対応する対照実験に対して減算した。実験を、５０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．６）のバッファーにおいて行った。ＬＤＨのサブユニットへの解離のため、増大する量のグアニジウム／ＨＣｌを、試験タンパク質（１．３μＭ）と接触させ、その後蛍光スペクトルを記録した。グアニジウム／ＨＣｌの濃度は、０．３Ｍ～２Ｍの範囲であった。

ｃ）変性アッセイ
ウサギのＬＤＨＡの市販の溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含む硫酸アンモニウム懸濁液（ｐＨ約７、３．２Ｍ）を、まずＮａＣｌ（２００ｍＭ）の溶液で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、次に、２００ｍＭのＮａＣｌに対して４℃で２回×２時間透析した。次に、１ｍｇ／ｍｌの原液を、ＮａＣｌ（２００ｍＭ）で３０μｇ／ｍｌ（８００ｎＭ）に希釈し、アッセイ溶液を得た。アッセイ溶液を、酢酸塩－塩化物バッファー（２０ｍＭの酢酸／酢酸塩、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ５）で１：１に混合し、３０分間氷上で保存した。次に、サンプルを氷から取り出し、２分間温めた。次に、酸性溶液を、阻害性ペプチドを含むかまたは含まない２５０ｍＭのリン酸塩バッファー（ｐＨ７．６）で１：１に希釈し、７．５μｇ／ｍｌ（２００ｎＭ）の最終濃度の再結合しているＬＤＨＡを回収した。次に、得られた溶液のサンプルを、内因性蛍光の回復の動態実験に供した（Ｅｘｃ＝２８６ｎｍ、Ｅｍ＝３５０ｎｍ、１０’、ｒｔ）。

１．６－統計
全ての定量的なデータは、平均値±ＳＥＭとして表した。場合により、エラーバーは、記号よりも小さい。ｎは、グループあたりのレプリケートの総数を表す。全ての実験は、独立して少なくとも２回反復した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアを使用して分析した。適切な場合、スチューデントｔ検定、１元ＡＮＯＶＡ、および２元ＡＮＯＶＡを使用した。Ｐ＜０．０５を、統計上有意とみなした。

２－結果
２．１－トランケートされているＬＤＨＢ（ＬＤＨＢｔｒ）に対する大環状ペプチド（ＭＰ）の結合
ＬＢ８ポリペプチドの環化に最適なｉおよびｉ＋４位の同定の後、ｐ－テトラフルオロフェニル（ＭＰ７）、ｏ－ベンジル（ＭＰ８）、ｐ－ベンジル（ＭＰ９）、ならびにＫ_１残基およびＤ_５残基の側鎖の間のリジンからアスパラギン酸までのラクタム架橋（ＭＰ１０）を含む、他のリンカーを有する大環状ペプチド（ＭＰ）を調査した（表４参照）。

＊Ｋ_ｄは、ｏｎ時間１０ｓ～２０ｓでＭＳＴトレースから抽出した（大環状ペプチドＭＰ１－ＭＰ４およびＭＰ７－ＭＰ１１ではｎ＝３、大環状ペプチドＭＰ５－ＭＰ６およびＭＰ１２ではｎ＝２）。ＮＤ、決定せず。１ ｍｌＬは、γ－メチル－Ｌ－ロイシンを表す。２ ｃｐＡは、シクロプロピル－Ｌ－アラニンを表す。

驚くべきことに、これら大環状ペプチドのＫ_ｄの評価は、評価された親和性に及ぼすリンカーにより課される全体的な制約の影響を明らかにした。実際に、ｐ－テトラフルオロフェニル（ＭＰ７；配列番号６１）およびｏ－ベンジル（ＭＰ８；配列番号６２）類縁体は、大環状ペプチドＭＰ１（配列番号５５）と比較した場合に、それぞれ１１μＭおよび２５μＭのＫ_ｄで、親和性の補足的な２倍～６倍の改善をもたらした。比較すると、制約の少ないリンカーの、ｐ－ベンジル（ＭＰ９；配列番号６３）およびＫ_１－Ｄ_５ラクタム架橋（ＭＰ１０；配列番号６４）は、それぞれ１１３μＭおよび１４２μＭのＫ_ｄとやや強力な誘導体をもたらした。大環状ペプチドＭＰ７（配列番号６１）と比較した場合、大環状ペプチドＣＴ－４４（配列番号６７）などにおいて、アミノ酸の３位のロイシンのγ－メチル－Ｌ－ロイシンでの置換は、結合特性に影響しなかった。同様に、大環状ペプチドＣＴ－４５（配列番号４５）などにおいて、アミノ酸７位のロイシンのシクロプロピル－Ｌ－アラニンでの置換は、Ｋ_ｄ値が変わらないか、あるいはさらにＫ_ｄ値がわずかに改善した。

Ｅ_５残基の側鎖上のＮ末端のアミノ基とカルボン酸との間のラクタム架橋の影響を、これら２つの部分がＬＢ８のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのモデルにおいて互いに近いことが見出され得るため、さらに調査した。結果得られた大環状ペプチドＭＰ１１（配列番号６５）は、４６５μＭのＫ_ｄでＬＢ８よりもわずかに強力であることが見出された（表４参照）。比較のため、Ｋ_６側鎖のＮＨ_２とＣ末端のカルボキシラート基との間のラクタム架橋の影響を同様に評価した。得られたペプチドＭＰ１２（配列番号６６）は、ＮＭＲまたはＭＳＴのいずれかを使用した場合、明らかな結合をもたらさなかった（表４参照）。

２．２－設計された大環状ペプチドでのＬＤＨ四量体化の不安定化および破壊
大環状ペプチドＭＰ１およびＭＰ７がネイティブなＬＤＨＢのＮ末端のドメインと競合できるかどうかをさらに試験した。この目的のため、四量体ＬＤＨ１およびＬＤＨ５と相互作用するこれらの特性を、最初にＭＳＴを使用して調査した。興味深いことに、最も強力な類縁体である、大環状ペプチドＭＰ７は、高濃度で、ＬＤＨ１およびＬＤＨ５との、それぞれ３８０μＭ（ＣＩ_９５％：［３１５μＭ～４５７μＭ］）および１１７μＭ（ＣＩ_９５％：［９４μＭ～１４４μＭ］の推定Ｋ_ｄでの相互作用を呈した（図８Ａ）。比較して、大環状ペプチドＭＰ１は、同様の条件で結合を全く示さなかった。よって、ＭＰ７と四量体タンパク質との間のこの相互作用は、四量体化部位に達するための環状ペプチドによるＬＤＨのＮ末端アームの置換を示唆するものであった。

四量体のＬＤＨ１およびＬＤＨ５を不安定化させる大環状ペプチドＭＰ１およびＭＰ７の特性をさらに調査した。実際に、オリゴマーの界面で相互作用する分子は、複合体の総合的な安定性の撹乱により、試験したオリゴマーの融解温度を低減し得る。よって、ＬＤＨ１およびＬＤＨ５の熱的変性に及ぼす大環状ペプチドＭＰ１およびＭＰ７の影響を、ｎａｎｏＤＳＦを使用して評価した。ＭＰ１は、５００μＭまでヒトＬＤＨ１およびＬＤＨ５の両方の安定性に影響を及ぼさなかったが、大環状ペプチドＭＰ７は、４００μＭで両方のアイソフォームの立体構造を不安定化させる変化を誘導した（図８Ｂ）。ＬＤＨ－５はＬＤＨ１より不安定であるため、不安定化は、ＬＤＨ１（ΔＴｍ＝－１．５°Ｃ）よりもＬＤＨ－５四量体（ΔＴｍ＝－５°Ｃ）で強力であった。この２つのアイソザイムの安定性の差異は、ＭＳＴにより観察されるＬＤＨ５に対して高いＭＰ７の親和性をさらに説明することができる。さらに、この効果の強度は、タンパク質濃度に依存しており、単量体の増大する量が四量体の複合体の形成に対する平衡のシフトをもたらすとの仮説と一致している。注目すべきことに、大環状ペプチドＭＰ７は、ＬＤＨの二量体モデルに対してこのような不安定化を誘導しなかった。

次に、これら大環状ペプチドがＬＤＨ四量体形成の間に四量体化部位にも結合できるかどうかを評価した。このような手法は、たとえばヒトグルタチオンレダクターゼの界面で相互作用するペプチドの事例で、すでに報告されていた。

よって、酸性条件により開始する解離ステップ後のＬＤＨ四量体の回復をフォローするための実験を設計した。これら実験は、ＬＤＨ１よりも安定性が少なくよってより解離する傾向があるため、ＬＤＨ５で行った。強力な酸性条件（ｐＨ２．３）が、ヒトＬＤＨ５（ｈＬＤＨ５）ホモ四量体を破壊するために必要であり、部分的なタンパク質の変性をもたらすため、このアッセイを、酸性度の少ない条件（ｐＨ５）で解離し、変性せず、再現可能なデータを提供するウサギＬＤＨ５（ｒＬＤＨ５）で行った。ｒＬＤＨ５は、同様のｎａｎｏＤＳＦ変性パターンで、ｈＬＤＨ５と９４％の配列同一性および９８％の相同性を共有する。ｒＬＤＨ５四量体の状態のモニタリングを、以下の内因性トリプトファン蛍光により行った：６つのトリプトファン残基は、各ｒＬＤＨＡ単量体で見出すことができ、これらのうち３つは、二量体間の界面に位置している。トリプトファンの量子収率は極性環境で減少するため、二量体のＬＤＨは、四量体形態と比較して非常に弱いトリプトファン蛍光を示す。よって、二量体のｒＬＤＨＡは、ｐＨ７．６の四量体ｒＬＤＨ５の高い蛍光と比較する場合ｐＨ５で非常に弱いトリプトファン蛍光を示した。このような低下は、四量体ＬＤＨ１と二量体ＬＤＨＢｔｒとの間のトリプトファン蛍光の差異と比較され得る。

酸性化の後に中性のｐＨに回復させる場合、大環状ペプチドＭＰ１およびＭＰ７は、ＬＤＨ５の蛍光の回復を有意に妨げた（それぞれ図９Ａおよび９Ｂ）が、ＬＢ８はこれに影響しなかった（図９Ｃ）。陰性対照のＬＢｃは、ＬＤＨの再結合に影響を示さなかった（図９Ｄ）。

最後に、事前に解離することなくＬＤＨのオリゴマー化状態を破壊する大環状ペプチドＭＰ７の特性を調査した。よって、タンパク質のネイティブな蛍光に及ぼす大環状ペプチドＭＰ７の影響を、直接評価した。驚くべきことに、大環状ペプチドＭＰ ７にＬＤＨ１を曝露することは、ＬＤＨ１蛍光スペクトルの二量体モデルＬＤＨＢｔｒのスペクトルへの濃度依存的な変換をもたらした。蛍光強度の正規化は、増大する量の大環状ペプチドＭＰ７への曝露時のＬＤＨ１の破壊率（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）を推定することを可能にした（図１０）。この破壊作用は、ＭＳＴを使用して以前に観察された相互作用と一貫して一致し（ＥＣ_５０＝１７２μＭ、ＣＩ_９５％：［１４２μＭ～２０７μＭ］））、ＬＤＨ四量体化部位に対する大環状ペプチドＭＰ７の結合の後に、タンパク質のオリゴマー状態が破壊されることが示唆される。注目すべきことに、大環状ペプチドＭＰ７は、ＬＤＨＢｔｒの蛍光スペクトルにおいて匹敵する低下を誘導しなかった。

まとめると、これら結果は、設計された環状ペプチドが、ＬＤＨＢおよびＬＤＨＡの単量体のＮ末端ドメインと競合することによりＬＤＨの四量体化部位を標的とすることができ、これにより四量体複合体の不安定化および破壊をもたらし得ることを示している。さらに、これら大環状ペプチドはまた、ＬＤＨ四量体の形成を妨げることができる。またこれらデータは、ＬＤＨの高度に保存された四量体化部位の標的化がタンパク質の両方のアイソフォームに相互作用する分子をもたらし得ることを立証するものである。

実施例３
１－材料および方法
大環状ペプチドＭＰ７（配列番号６１）を、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２ヒト膵がん細胞（ＡＴＣＣ（登録商標））に対して２００μＭで評価した。

酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を、ＸＦ ｃｅｌｌ ｍｉｔｏ ｓｔｒｅｓｓ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標））および２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２ＤＧ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の組み合わせを用いてＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ９６ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標））で測定した。Ｓｅａｈｏｒｓｅでの実験を、１０ｍｍｏｌ／ＬのＤ－グルコースおよび１ｍｍｏｌ／ＬのＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ培地において１０，０００個の細胞／ウェルを使用して行った。分析前に、細胞を、ＣＯ_２フリーのインキュベーターにおいて１時間インキュベートした。Ｓｅａｈｏｒｓｅ ａｎａｌｙｚｅｒで、ＸＦ ｃｅｌｌ ｍｉｔｏ ｓｔｒｅｓｓ ｋｉｔの成分、すなわちＡＴＰ－シンターゼを阻害するオリゴマイシン、ミトコンドリアの電位を乱すイオノフォアカルボニルシアニド－４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、ならびにミトコンドリアの電子伝達系（ＥＴＣ）の複合体ＩおよびＩＩＩを同時に阻害するアンチマイシンＡを伴うロテノンを連続的に添加した後、酸素測定を、閉鎖されたウェルにて反復して行った。いずれかの作用物質を添加する前の酸素測定は、細胞の基底呼吸速度を提供し；ＡＴＰに関連する回復（ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、１μＭのオリゴマイシンの添加の後に決定し、細胞の最大呼吸速度は、１μＭのＦＣＣＰの添加の後に決定した。全てのデータは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｍｉｎｉＭａｘ ３００ ｉｍａｇｉｎｇ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標））を使用して酸素測定の直前に測定した細胞数に対して正規化した。大環状ペプチドＭＰ７を含むＰＢＳまたはＰＢＳ単独（対照実験）を、培地に直接添加し、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２細胞と４時間インキュベートした後、大環状ペプチドＭＰ７を伴うかまたは伴わないＭｉａ Ｐａｃａ－２細胞を含む培地でＳｅａｈｏｒｓｅの実験を行った。

２－結果
Ｓｅａｈｏｒｓｅによる評価は、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２ヒト膵がん細胞のミトコンドリアの酸素消費速度（ＯＣＲ）の強力な減少および解糖流量の増大を明らかにした（図１１）。図１１Ａにおいて、基底ミトコンドリアＯＣＲは、大環状ペプチドＭＰ７の存在下または非存在下（対照）でのＭｉａ Ｐａｃａ－２細胞におけるミトコンドリアの自然な酸素消費速度を表す。図１１Ｂでは、最大ミトコンドリアＯＣＲは、大環状ペプチドＭＰ７の存在下または非存在下（対照）でのＭｉａ Ｐａｃａ－２細胞におけるミトコンドリアの最大可能酸素消費速度（最大能）を表す。図１１Ｃでは、ＯＣＲに関連したＡＴＰ産生は、大環状ペプチドＭＰ７の存在下または非存在下（対照）でのＭｉａ Ｐａｃａ－２細胞におけるミトコンドリアのＡＴＰ産生に直接関連した酸素消費速度を表す。まとめると、図１１Ａ～Ｃは、大環状ペプチドＭＰ７が、ミトコンドリアがＡＴＰを産生できなくなるような方法で、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２細胞の呼吸を大きく阻害することを示す。ＡＴＰは、がん細胞の生存に必要な化学エネルギーを提供するため、図１１Ａ～Ｃは、大環状ペプチドＭＰ７が、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２ヒト膵がん細胞において抗がん作用を有することを示している。これは、ＬＤＨ－１が乳酸＋ＮＡＤ^＋のピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋への変換を触媒し、このピルビン酸およびＮＡＤＨは両方ともミトコンドリアの燃料であるという事実により機構的に説明できる。大環状ペプチドＭＰ７がＬＤＨ－１を阻害すると、ミトコンドリアの呼吸およびミトコンドリアのＡＴＰ産生は減少する。これは、正に図１１Ａ～Ｃで観察されていることである。図１１Ｄでは、ＥＣＡＲは、乳酸発酵、すなわち、１：１の分子比率でプロトンと共に乳酸の細胞の排出で終了する、グルコースのピルビン酸、次に乳酸への変換に関連する場合の、解糖に関連した細胞外酸性化速度を表す。よって、ＥＣＡＲは、細胞の解糖速度に直接比例する。図１１Ｅは、細胞の最大解糖能を示す。がん細胞は、ミトコンドリアの呼吸を使用してＡＴＰを産生することが困難である場合、細胞質での乳酸発酵に関連する解糖を使用してＡＴＰを産生することにより補償しようとする。図１１Ａ～Ｃは、大環状ペプチドＭＰ７が、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２がん細胞によるＡＴＰを産生するための酸素の使用を阻害することを示した。図１１Ｄ～Ｅは、この場合に、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２細胞が、解糖の速度の増大、よって、解糖によるＡＴＰの産生を増大させることにより、呼吸の変更をある程度まで補償することにより自身を救出しようと試みていることを示している。まとめると、図１１は、大環状ペプチドＭＰ７が、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２ヒト膵がん細胞のエネルギー代謝を大いに変更し、ＭＰ７の抗がん作用に関与する代謝上のクライシスを誘導し得ることを示している。

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Claims (15)

1. 乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化を阻害するポリペプチドであって、式（Ｉ）：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（Ｉ）（配列番号５）のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド：
   （式中、
   Ｘ１は、好ましくはアミノ酸残基Ａ、Ｇ、Ｋ、およびＣからなる群から選択される、いずれかのアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２は、Ｃ、Ｔ、またはＳを表し、
   Ｘ３は、Ｃ、Ｌ、Ａ、Ｔ、ｃｐＡ（シクロプロピル－Ｌ－アラニン）、ｃｈＧ（Ｌ－シクロヘキシルグリシン）、ｃｈＡ（シクロヘキシル－Ｌ－アラニン）、またはｍｌＬ（γ－メチル－Ｌ－ロイシン）を表し、
   Ｘ４は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｋ、Ｃ、Ａ、およびＡｉｂ（２－アミノイソ酪酸）からなる群から選択される、好ましくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｋを表し、
   Ｘ５は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ａ、およびＣからなる群から選択される、好ましくは負もしくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｅを表し、
   Ｘ６は、いずれかのアミノ酸残基、好ましくはアミノ酸残基Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ａｉｂ（２－アミノイソ酪酸）、およびＣからなる群から選択される、好ましくは負もしくは正に荷電しているかまたは中性のアミノ酸残基、より好ましくはアミノ酸Ｋを表し、
   Ｘ７は、Ｃ、Ｌ、Ｉ、ｃｐＡ（シクロプロピル－Ｌ－アラニン）、ｃｈＧ（Ｌ－シクロヘキシルグリシン）、ｃｈＡ（シクロヘキシル－Ｌ－アラニン）、またはｍｌＬ（γ－メチル－Ｌ－ロイシン）を表し、
   Ｘ８はＣ、Ｉ、またはＧを表す）。
2. 前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号６～配列番号２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、直鎖状ポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号３０～配列番号３５、配列番号５５～配列番号５８、配列番号６１～配列番号６５、配列番号６７、および配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、環状ポリペプチドである、請求項１または２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
4. 前記環状ポリペプチドが、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６２、および配列番号６３、配列番号６７、および配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
5. 前記環状ポリペプチドが、配列番号６１、配列番号６７、または配列番号６８により表されるアミノ酸配列を含む、請求項３または４に記載のポリペプチド。
6. 前記乳酸脱水素酵素のサブユニットが、乳酸脱水素酵素Ｂ（ＬＤＨＢ）のサブユニットである、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
7. 前記ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸残基の遊離－ＣＯＯＨ基の－ＯＨ基が、－Ｏ－アルキル基、－Ｏ－アリール基、－ＮＨ_２基、－Ｎ－アルキルアミン基、－Ｎ－アリールアミン基、または－Ｎ－アルキル／アリール基から選択される基で置き換えられている、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
9. 少なくとも１つの請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物。
10. 少なくとも１つの請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチド、または請求項９に記載の医薬組成物と、任意選択で抗がん剤とを含むがんを予防および／または処置するためのキット。
11. 医薬品として使用するための、請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチド、または請求項９に記載の医薬組成物。
12. がんの予防および／または処置に使用するための、請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチド、または請求項９に記載の医薬組成物。
13. 乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化に影響する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ．トランケートされた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨｔｒ）のサブユニットを含む系を準備するステップと、
    ｂ．ネイティブな四量体ＬＤＨの活性を調節する候補化合物を伴う系を準備するステップと、
    ｃ．請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチドの存在下または非存在下で前記候補化合物のＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合のレベルを測定するステップと
    を含み、
    ＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する結合に関する前記ポリペプチドと前記候補化合物との間の競合の観察が、前期候補化合物が乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化の阻害剤であることを表す、
    方法。
14. ＬＤＨｔｒのサブユニットに対する結合に関する前記ポリペプチドと前記候補化合物との間の競合の観察が、乳酸脱水素酵素のサブユニット上での四量体化部位に対する前記候補化合物の結合の特異性を表す、請求項１３に記載の方法。
15. 乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化に影響する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ．トランケートされた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨｔｒ）のサブユニットを含む系（１）およびネイティブな四量体ＬＤＨを含む系（２）を準備するステップと、
    ｂ．ネイティブな四量体ＬＤＨの活性を調節する候補化合物を含む系（１）および（２）を準備するステップと、
    ｃ．系（１）におけるＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体および系（２）におけるネイティブな四量体ＬＤＨに対する前記候補化合物の結合レベル（Ｋｄ）を測定するステップと
    を含み、
    系（１）におけるＬＤＨｔｒのサブユニットの二量体に対する前記候補化合物の結合の観察および系（２）におけるネイティブな四量体ＬＤＨに対する前記候補化合物の結合の変更の観察は、前記候補化合物が、ＬＤＨサブユニットの表面で相互作用することにより、乳酸脱水素酵素のサブユニットの四量体化の阻害剤となることを表す、
    方法。

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