JP2022530824A - ポンペ病の治療のために有用な組成物 - Google Patents

Abstract

ＩＩ型グリコーゲン蓄積疾患（ポンペ）病を治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、筋肉、心臓、腎臓、および中枢神経系のうちの少なくとも１つの細胞を標的とし、そこにヒト酸性α－グルコシダーゼｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターゲノムを、その発現を指示する調節配列の制御下でパッケージングしているＡＡＶカプシドを含む。また、このｒＡＡＶを作製および使用する方法も提供される。【選択図】

Description

ポンペ病は、ＩＩ型糖原病としても知られており、心臓（心筋症）、筋肉、および運動ニューロン（神経筋疾患）にグリコーゲン蓄積をもたらす酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子における変異によって引き起こされるリソソーム蓄積症である。古典的な乳児ポンペ病では、重度のＧＡＡ活性損失は、特に心臓および筋肉内で多系統および早期発症グリコーゲン蓄積を引き起こし、最初の数年間で心肺不全によって死亡する。乳児ポンペ病はまた、ニューロン（特に運動ニューロン）およびグリア細胞内の顕著なグリコーゲン蓄積を特徴とする。現在の標準治療である酵素補充療法（ＥＲＴ）は、筋肉を矯正するのに最適以下の効率を有し、血液脳関門を通過することができず、古典的な乳児ポンペ病の長期生存者における進行性神経学的悪化につながる。ＥＲＴを受けて、心臓矯正によってより長く生存する患者は、進行性の神経学的表現型を有する新しい自然経過を明らかにする。加えて、組換えヒトＧＡＡは、高い免疫原性であり、骨格筋による取り込み不良のために、非常に大量に投与されなければならない。

ポンペ病の治療のためにいくつかの必要性が満たされておらず、これには、疾患のＣＮＳ成分の矯正のための必要性、改善された筋肉矯正のための必要性、およびより有効であり、免疫原性が低く、かつ／またはより簡便である現在のＥＲＴの代替のための必要性が含まれる。

特定の実施形態では、少なくともｈＧＡＡ７８０Ｉの活性部位を含むヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）をコードする核酸配列を、その発現を指示する調節配列の制御下で含む発現カセットが提供され、７８０位は、配列番号３におけるアミノ酸の位置の番号付けに基づいている。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３（ｈＧＡＡ７８０Ｉ）の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３の少なくともアミノ酸１２３～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復をさらに含み、少なくとも２つのタンデム反復は、同じかまたは異なり得る少なくとも１つの第１のｍｉＲＮＡ標的配列および少なくとも１つの第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質をコードする配列に３’で操作可能に連結される。

特定の実施形態では、本明細書に提供される発現カセットは、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、および組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクターによって担持される。特定の実施形態では、組換えパルボウイルスは、クレードＦアデノ随伴ウイルス、任意選択的にＡＡＶｈｕ６８である。特定の実施形態では、本明細書に提供される発現カセットは、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、またはキトサンベースの配合物から選択される非ウイルスベクターによって担持される。

特定の実施形態では、本明細書に提供されるのは、ＩＩ型グリコーゲン蓄積疾患（ポンペ）病を治療するために有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であり、ｒＡＡＶは、（ａ）筋肉、心臓、および中枢神経系のうちの少なくとも１つの細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、ベクターゲノムが、少なくともｈＧＡＡ７８０Ｉの活性部位を含むヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）をコードする核酸配列を、その発現を指示する調節配列の制御下で含み、７８０位が、配列番号３におけるアミノ酸の位置の番号付けに基づく、ベクターゲノムと、を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３（ｈＧＡＡ７８０Ｉ）の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３の少なくともアミノ酸１２３～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡは、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ｍｉＲ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復をさらに含み、少なくとも２つのタンデム反復は、同じかまたは異なり得る少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列および少なくとも１つの第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質をコードする配列に３’で操作可能に連結される。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質をコードする発現カセット、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または懸濁剤の各々の少なくとも１つを含む組成物が提供される。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質をコードする発現カセットを含むｒＡＡＶ、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または懸濁剤の各々の少なくとも１つを含む組成物が提供される。

特定の実施形態では、ポンペ病を有する患者を治療するための、ならびに／あるいはα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損を有する患者における心筋、呼吸筋、および／または骨格筋機能を改善するための方法が提供される。この方法は、患者に、本明細書に記載される発現カセット、ｒＡＡＶ、または組成物を送達することを含む。発現カセット、ｒＡＡＶ、または組成物は、静脈内および／または髄腔内、大槽内、もしくは脳室内投与を介して送達され得る。追加的または代替的に、かかる遺伝子治療は、心臓への直接送達（心臓）、肺への送達（鼻腔内、吸入、気管内）、および／または筋肉内注入を含み得る。これらのうちの１つは、発現カセット、ベクター、もしくは組成物の単独投与経路、または他の送達経路との同時投与であり得る。

ポンペ病を有する患者を治療するための治療レジメンは、患者に、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶ、または組成物を、単独で、あるいは併用療法と組み合わせて、例えば、免疫調節剤、気管支拡張剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、呼吸筋力トレーニング（ＲＭＳＴ）、酵素補充療法、および／もしくは横隔膜ペーシング療法のうちの１つ以上と組み合わせて、送達することを含み得る。

特定の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットおよび／またはｒＡＡＶの生成のための核酸分子および宿主細胞が提供される。

特定の実施形態では、医薬品の調製における発現カセット、ｒＡＡＶ、および／または組成物の使用が提供される。

特定の実施形態では、ポンペ病を有する患者を治療するために、ならびに／あるいはα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損を有する患者における心筋、呼吸筋、および／もしくは骨格筋機能を改善するために好適である、発現カセット、ｒＡＡＶ、および／または組成物が提供される。

本発明の他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明から、容易に明らかとなるであろう。

ＣＢ６（３番目のカラム）、ＣＡＧ（４番目のカラム）、またはＵｂＣプロモータ（最後のカラム）の指示下で、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ（配列番号４）のために操作されたコード配列を有する種々のＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの静脈内投与後４週のポンペ（－／－）マウスの肝臓におけるｈＧＡＡ活性を示す。（図１Ａ）低用量（１×１０^１１ＧＣ）。（図１Ｂ）高用量（１×１０^１２）。 ＣＢ６（３番目のカラム）、ＣＡＧ（４番目のカラム）、またはＵｂＣプロモータ（最後のカラム）の指示下で、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉのために操作されたコード配列を有する種々のＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの静脈内投与後４週のポンペ（－／－）マウスの心臓におけるｈＧＡＡ活性を示す。（図２Ａ）低用量（１×１０^１１ＧＣ）。（図２Ｂ）高用量（１×１０^１２）。 ＣＢ６（３番目のカラム）、ＣＡＧ（４番目のカラム）、またはＵｂＣプロモータ（最後のカラム）の指示下で、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉのために操作されたコード配列を有する種々のＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの静脈内投与後４週のポンペ（－／－）マウスの骨格筋（四頭筋）におけるｈＧＡＡ活性を示す。（図３Ａ）低用量（１×１０^１１ＧＣ）。（図３Ｂ）高用量（１×１０^１２）。 ＣＢ６（３番目のカラム）、ＣＡＧ（４番目のカラム）、またはＵｂＣプロモータ（最後のカラム）の指示下で、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉのために操作されたコード配列を有する種々のＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの静脈内投与後４週のポンペ（－／－）マウスの脳におけるｈＧＡＡ活性を示す。（図４Ａ）低用量（１×１０^１１ＧＣ）。（図４Ｂ）高用量（１×１０^１２）。ＣＢ７活性下で発現するベクターは、両方の用量で低い活性を有し、一方、ＣＡＧまたはＵｂＣプロモータ下で発現するベクターは、高い用量で同等の活性を有する。 ＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの送達後４週のポンペマウス（グリコーゲン貯蔵を示すＰＡＳ染色）における心臓の組織学を示す。５つの異なるｈＧＡＡ発現カセットを含有するｒＡＡＶｈｕ６８ベクターを生成し、評価した。ビヒクル対照ポンペ（－／－）（図５Ｄ）および野生型（＋／＋）（図５Ａ）マウスは、ＰＢＳ注射を受けた。「ｈＧＡＡ」は、天然シグナルペプチドを有する野生型配列によってコードされる参照天然酵素（ｈＧＡＡＶ７８０）を指す（図５Ｂ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏ」は、最初の３５個のＡＡの欠失を含有し、さらにインスリン受容体に低い親和性を有するＩＧＦ２バリアントとの融合であるＢｉＰシグナルペプチドを有する、参照ｈＧＡＡＶ７８０タンパク質の遺伝子操作されたコード配列を指す（図５Ｃ）。「ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、操作された配列によってコードされ、天然シグナルペプチドを含有する、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図５Ｅ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、最初の３５個のＡＡの欠失を含有し、さらに、インスリン受容体に低い親和性を有するＩＧＦ２バリアントと融合されたＢｉＰシグナルペプチドおよび操作された配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉを有する、ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉを指す（図５Ｆ）。「Ｓｐ７．Δ８．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、前の構築物と同じ操作された配列によってコードされる最初の３５個のＡＡの欠失を有するが、天然シグナルペプチドの代わりにＢ２キモトリプシノゲンシグナルペプチドをコードする配列を含有する、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図５Ｇ）。（図５Ｈ）盲検組織病理学的半定量的重症度スコアリング。委員会認定の獣医病理学者が盲検方式でスライドをレビューし、グリコーゲン貯蔵およびオートファジービルドアップに基づく重症度スコアを確立した。 種々のｈＧＡＡをコードするＡＡＶｈｕ６８（２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の投与後４週のポンペマウスにおける四頭筋の組織学からの結果（ＰＡＳ染色）を示す。対照ポンペ（－／－）（図６Ｄ）および野生型（＋／＋）（図６Ａ）マウスは、ＰＢＳ注射を受けた。「ｈＧＡＡ」は、天然シグナルペプチドを有する野生型配列によってコードされる参照天然酵素（ｈＧＡＡＶ７８０）を指す（図６Ｂ）。「ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、操作された配列によってコードされ、天然シグナルペプチドを含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図６Ｅ）。「Ｓｐ７．Δ８．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、前の構築物と同じ操作された配列によってコードされる最初の３５個のＡＡの欠失を有するが、天然シグナルペプチドの代わりにＢ２キモトリプシノゲンシグナルペプチドをコードする配列を含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図６Ｆ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏ」は、最初の３５個のＡＡの欠失を含有し、さらに、インスリン受容体に低い親和性を有するＩＧＦ２バリアントとの融合であり、操作された配列によってコードされるＢｉｐシグナルペプチドを有する参照ｈＧＡＡＶ７８０を指す（図６Ｃ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、最初の３５個のＡＡの欠失を含有し、さらに、インスリン受容体に低い親和性を有するＩＧＦ２バリアントと融合されたＢｉＰシグナルペプチドおよび操作された配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉを有する、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉを指す（図６Ｇ）。（図６Ｈ）盲検組織病理学的半定量的重症度スコアリング。委員会認定の獣医病理学者が盲検方式でスライドをレビューし、グリコーゲン貯蔵およびオートファジービルドアップに基づく重症度スコアを確立した。０のスコアは、病変なしを意味し、１は、平均で貯蔵によって影響を受ける９％未満の筋線維を意味し、２は、１０～４９％を意味し、３は、５０～７５％を意味し、４は、７６～１００％を意味する。 種々のｈＧＡＡをコードするＡＡＶｈｕ６８の２．５×１０^１２ＧＣ／Ｋｇ（すなわち、図６Ａ～図６Ｈよりも１０倍低い用量）での投与後４週のポンペマウスからの四頭筋の組織学（過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色）の結果を示す。対照ポンペ（－／－）（図７Ｄ）および野生型（＋／＋）（図７Ａ）マウスは、ＰＢＳ注射を受けた。「ｈＧＡＡ」は、天然シグナルペプチドを有する野生型配列によってコードされる参照天然酵素（ｈＧＡＡＶ７８０）を指す（図７Ｂ）。「ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、操作された配列によってコードされ、天然シグナルペプチドを含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図７Ｅ）。「Ｓｐ７．Δ８．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、前の構築物と同じ操作された配列によってコードされる最初の３５個のＡＡの欠失を有するが、天然シグナルペプチドの代わりにＢ２キモトリプシノゲンシグナルペプチドをコードする配列を含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図７Ｆ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏ」は、最初の３５個のＡＡの欠失を含有し、さらに、インスリン受容体に低い親和性を有するＩＧＦ２バリアントとの融合であり、操作された配列によってコードされるＢｉｐシグナルペプチドを有する参照ｈＧＡＡＶ７８０を指す（図７Ｃ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、最初の３５個のＡＡの欠失を含有し、さらに、インスリン受容体に低い親和性を有するＩＧＦ２バリアントと融合されたＢｉＰシグナルペプチドおよび操作された配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉを有する、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉを指す（図７Ｇ）。（図７Ｈ）盲検組織病理学的半定量的重症度スコアリング。委員会認定の獣医病理学者が盲検方式でスライドをレビューし、グリコーゲン貯蔵およびオートファジービルドアップに基づく重症度スコアを確立した。０のスコアは、病変なしを意味し、１は、平均で貯蔵によって影響を受ける９％未満の筋線維を意味し、２は、１０～４９％を意味し、３は、５０～７５％を意味し、４は、７６～１００％を意味する。 天然ｈＧＡＡをコードする配列を有するＡＡＶｈｕ６８、または最初の３５個のＡＡの欠失を含有し、さらに、インスリン受容体に低親和性を有するＩＧＦ２と融合されたＢｉＰシグナルペプチドおよび操作された配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉを有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉ（「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」）の投与（２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）後４週のポンペマウスからの脊髄の組織学（ＰＡＳおよびルクソール－ファストブルー染色）の結果を示す。盲検化した組織病理学的重症度スコアリングが、脊髄切片で実施された。 血漿中のｈＧＡＡ活性を示す。ポンペマウスに、野生型ｈＧＡＡまたはＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡをコードするベクターを低用量（２．５×１０^１２ＧＣ）で投与した。静脈内投与の４週間後、高レベルの野生型および遺伝子操作されたｈＧＡＡ活性が血漿中で検出された。

ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素を、ポンペ病を有する患者に送達するための組成物が提供される。これらの組成物で患者を治療するためのレジメンを含む、その製造および使用方法が本明細書に記載される。

本明細書で使用される場合、「ポンペ病」という用語は、マルターゼ欠損症、グリコーゲン蓄積疾患ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）、または糖原病ＩＩ型とも称され、酸性α－グルコシダーゼをコードするＧＡＡ遺伝子の変異によって引き起こされるリソソーム酵素酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の完全な欠如または部分的な欠損を特徴とする遺伝的リソソーム蓄積障害を指すことが意図されている。本用語には、限定されないが、疾患の早期および遅発形態が含まれ、乳児、若年、および成人発症性ポンペ病が挙げられるが、これらに限定されない。

ギリシャ文字「アルファ」および記号「α」は、本明細書全体を通して互換的に使用されることが理解されるであろう。同様に、ギリシャ文字「デルタ」および「Δ」は、本明細書全体を通して互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「酸性α－グルコシダーゼ」または「ＧＡＡ」という用語は、グリコーゲン、マルトース、およびイソマルトースのＤ－グルコース単位間のα－１，４結合を加水分解するリソソーム酵素を指す。代替的な名称名としては、リソソームα－グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）、グルコアミラーゼ、１，４－α－Ｄ－グルカングルコヒドロラーゼ、アミログルコシダーゼ、ガンマ－アミラーゼ、およびエキソ－１，４－α－グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ヒト酸性α－グルコシダーゼは、ＧＡＡ遺伝子（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｇｅｎｅ ＩＤ ２５４８）によってコードされ、染色体１７の長腕（位置１７ｑ２５．２～ｑ２５．３）にマッピングされている。アミノ酸残基５１６～５２１で保存されたヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥは、酸性α－グルコシダーゼタンパク質の活性に必要である。「ｈＧＡＡ」という用語は、ヒトＧＡＡのコード配列を指す。

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ．ｈＧＡＡ」は、ＧＡＡ酵素（例えば、７８０Ｉバリアント）のコード配列を最低限含むベクターゲノムをパッケージングしているＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶを指す。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡまたはｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡは、ＡＡＶカプシドがＡＡＶｈｕ６８カプシドであるｒＡＡＶを指し、本明細書で定義される。

全長ｈＧＡＡの番号付けに従い、アミノ酸１位～２７位にシグナルペプチドが存在する。さらに、本酵素は、複数の成熟タンパク質、すなわち、アミノ酸７０位～９５２位の成熟タンパク質、アミノ酸１２３位～９５２位に位置する７６ｋＤ成熟タンパク質、および
アミノ酸２０４位～９５２位の７０ｋＤ成熟タンパク質と関連している。「活性触媒部位」は、ヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥ（配列番号３のアミノ酸残基５１６～５２１）を含む。特定の実施形態では、より長い断片、例えば、５１６位～６１６位が選択され得る。他の活性部位はリガンド結合部位を含み、３７６位、４０４位、４０５位、４４１位、４８１位、５１６位、５１８位、５１９位、６００位、６１３位、６１６位、６４９位、６７４位のうちの１つ以上に位置され得る。

別段の定めのない限り、「ｈＧＡＡ７８０Ｉ」または「ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ」という用語は、配列番号３で再現されるアミノ酸配列を有する全長プレプロタンパク質を指す。いくつかの例では、ｈＧＡＡｃｏ７８０ＩまたはｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉという用語は、ｈＧＡＡ７８０Ｉをコードする操作された配列を指すために使用される。前の段落に記載のｈＧＡＡ参照タンパク質と比較して、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、参照ｈＧＡＡがバリン（ＶａｌまたはＶ）を含有する７８０位にイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）を有する。このｈＧＡＡ７８０Ｉは、「参照配列」として文献に広く記載されている７８０位にバリンを有するｈＧＡＡ配列（ｈＧＡＡＶ７８０）よりも優れた効果および改善された安全性プロファイルを有することが意外にも認められている。例えば、図５Ａ～図５Ｈに示されるように、ｈＧＡＡＶ７８０参照配列は、同じ用量のｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素では認められない毒性（線維化心筋炎）を誘発する。したがって、ｈＧＡＡ７８０Ｉの使用は、ｈＧＡＡによる療法を受ける患者における線維化心筋炎を低減または排除し得る。ｈＧＡＡシグナルペプチド、成熟タンパク質、活性触媒部位、および結合部位の位置は、配列番号３で再現されるｈＧＡＡ７８０Ｉ、すなわち、アミノ酸１～２７位のシグナルペプチド、アミノ酸７０位～９５２位の成熟タンパク質、アミノ酸１２３位～９５２位の７６ｋＤ成熟タンパク質およびアミノ酸２０４位～９５２位の７０ｋＤ成熟タンパク質、アミノ酸残基５１６～５２１のヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥ（配列番号２８）を含む「活性触媒部位」、３７６、４０４、４０５、４４１、４８１、５１６、５１８、５１９、６００、６１３、６１６、６４９、６７４位のうちの１つ以上に位置され得るリガンド結合部位を含む他の活性部位における類似の位置に基づいて決定され得る。

特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、ｈＧＡＡ７８０Ｉと少なくとも９５％同一、ｈＧＡＡ７８０Ｉと少なくとも９７％同一、または配列番号３のｈＧＡＡ７８０Ｉと少なくとも９９％同一である配列を有するものから選択され得る。特定の実施形態では、配列番号３の成熟ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質と少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９の同一性である配列が提供される。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉと少なくとも９５％～少なくとも９９％の同一性を有する配列は、いかなる変化もなく保持される活性触媒部位の配列を有する。特定の実施形態では、配列番号３に対するｈＧＡＡ７８０Ｉと少なくとも９５％～少なくとも９９％の同一性を有する配列は、適切な動物モデルで試験した場合、参照ｈＧＡＡＶ７８０よりも改善された生物学的効果および優れた安全性プロファイルを有することを特徴とする。特定の実施形態では、ＧＡＡ活性アッセイは、既に報告されているように（例えば、Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（２１０７）５：６６）、または他の適切な方法を使用して実施され得る。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素は、ｈＧＡＡアミノ酸配列における他の位置に改変を含有する。変異体の例としては、例えば、米国特許第９，９２０，３０７号に記載のものが挙げられ得る。特定の実施形態では、かかる変異体ｈＧＡＡ７８０Ｉは、最低限、活性触媒部位：ＷＩＤＭＮＥ（配列番号２８）および以下に記載される７８０Ｉの領域におけるアミノ酸を保持し得る。

特定の実施形態では、天然ｈＧＡＡシグナルペプチド以外のリーダーペプチドを含む、新規ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質が提供される。特定の実施形態では、かかる外因性リーダーペプチドは、好ましくは、ヒト起源のものであり、例えば、ＩＬ－２リーダーペ
プチドを含み得る。特定の実施形態において作用可能な特定の外因性シグナルペプチドとしては、キモトリプシノゲンＢ２由来のアミノ酸１～２０、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンのシグナルペプチド、イズロン酸－２－スルファターゼ由来のアミノ酸１～２５、およびプロテアーゼＣＩ阻害物質由来のアミノ酸１～２３が挙げられる。例えば、ＷＯ２０１８／０４６７７４を参照されたい。他のシグナル／リーダーペプチドは、とりわけ、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ１８など）、インスリン、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ、またはフィブロネクチン分泌シグナルペプチドに天然に認められ得る。また、例えば、ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａを参照されたい。

かかるキメラｈＧＡＡ７８０Ｉは、全２７個のａａの天然シグナルペプチドの代わりに外来性リーダーを有し得る。任意選択的に、ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素のＮ末端切断は、シグナルペプチドの一部のみ（例えば、約２～約２５個、またはそれらの間の数値のアミノ酸の欠失）、シグナルペプチド全体、またはシグナルペプチドより長い断片（例えば、配列番号３の番号付けに基づいて７０位までのアミノ酸）を欠如し得る。任意選択的に、かかる酵素は、約５、１０、１５、または２０アミノ酸長のＣ末端切断を含有し得る。

特定の実施形態では、成熟ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質（ａａ７０～９５２）、成熟７０ｋＤタンパク質（ａａ１２３～ａａ９５２）、または融合パートナーに結合した成熟７６ｋＤタンパク質（ａａ２０４～９５２）を含む、新規融合タンパク質が提供される。任意選択的に、融合タンパク質は、ｈＧＡＡに対して非天然であるシグナルペプチドをさらに含む。さらに任意選択的に、これらの実施形態のうちの１つは、約５、１０、１５、または２０アミノ酸長のＣ末端切断をさらに含有し得る。

特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質を含む融合タンパク質は、配列番号３（ｈＧＡＡ７８０Ｉ）の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質は、配列番号３の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質は、配列番号３の少なくともアミノ酸１２３～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素は、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質は、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む。

特定の実施形態では、融合タンパク質は、シグナル配列と、リーダー配列と、配列番号３に対して少なくとも９５％同一性、少なくとも９７％同一性、または９９％の同一性を有するｈＧＡＡ７８０Ｉ配列と、を含み、活性部位に変化を有さないか、かつ／またはｈＧＡＡ７８０Ｉに対して３～１２個のアミノ酸のＮ末端および／もしくはＣ末端に変化を有さない。好ましい実施形態では、操作されたｈＧＡＡ発現カセットは、Ｔ－Ｖａｌ（Ｖ）－Ｐ－Ｉｌｅ（７８０Ｉ）－Ｇｌｕ（Ｅ）－Ａｌａ（Ａ）－Ｌｅｕ（Ｌ）（配列番号２９）の少なくともヒトｈＧＡＡ７８０Ｉ断片をコードする。特定の実施形態では、操作されたｈＧＡＡ発現カセットは、より長いヒトｈＧＡＡ７８０Ｉ断片：Ｇｌｎ（Ｑ）－Ｔ－Ｖ－Ｐ－７８０Ｉ－Ｅ－Ａ－Ｌ－Ｇｌｙ（Ｇ）（配列番号３０）をコードする。特定の実施形態では、操作されたｈＧＡＡ発現カセットは、少なくともＰＬＧＴ－Ｔｒｐ（Ｗ）－Ｔｙｒ（Ｙ）－Ａｓｐ（Ｄ）－ＬＱＴＶＰ－７８０Ｉ－ＥＡＬＧ－（ＳｅｒまたはＳ）－Ｌ－ＰＰＰＰＡＡ配列（配列番号３１）に対応する断片をコードする。同様に、好ましい
実施形態では、活性結合部位（配列番号３のａａ５１８～５２１）にアミノ酸変化はない。特定の実施形態では、６００位、６１６位、および／または６７４位における結合部位は、変化しないままである。特定の実施形態では、呼称される融合タンパク質は、シグナルペプチドと、任意選択的なｖＩＧＦ＋２ＧＳ伸長と、任意選択的なＥＲタンパク質分解ペプチドと、ｈＧＡＡの最初の３５個のアミノ酸（すなわち、天然シグナルペプチドおよびアミノ酸２８～３５を欠く）の欠失を有するｈＧＡＡ７８０Ｉバリアントと、を含む。

特定の実施形態では、融合タンパク質は、他の切断されたｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質を使用して（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／０４６７７４１（Ｇｅｎｅｔｈｏｎ）に記載されている切断を使用して）構築され得る。かかる一実施形態は、ｓｐ７－Δ８．ｈＧＡＡ７８０Ｉと称される分泌型ｈＧＡＡであり、キモトリプシンＢ２シグナルペプチド、ＥＲタンパク質分解ペプチド、およびｈＧＡＡ７８０Ｉのアミノ酸５７～９５２（ｈＧＡＡ７８０Ｉのアミノ酸１～５６の欠失を伴う）を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、配列番号３の断片を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、配列番号３の断片は、配列番号４の配列、またはそれと少なくとも９５％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、配列番号３の断片は、配列番号５の配列、またはそれと少なくとも９５％同一の配列によってコードされる。

本明細書全体を通して、様々な発現カセット、ベクターゲノム、ベクター、および組成物が、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列またはｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質を含有するものとして記載される。別途指定されない限り、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、および本明細書に記載されるものなどの融合タンパク質を含む操作されたｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質のいずれか、またはそれらのコード配列は、発現カセット、ベクターゲノム、ベクター、および組成物に、同様に操作され得ることが理解されるであろう。

好適には、本明細書に記載の核酸配列を含む発現カセットが提供される。

発現カセット
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、標的細胞におけるその発現を誘導する調節配列（例えば、プロモータ）に操作可能に連結された、機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列（例えば、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列）を含む核酸分子を指し、それらのために他の調節配列を含み得る。必要な調節配列は、標的細胞におけるその転写、翻訳、および／または発現を可能にする方式で、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列と操作可能に連結される。

特定の実施形態では、発現カセットは、非翻訳領域に１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくなく、かつ／または導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される細胞に存在するｍｉＲＮＡによって特異的に認識されるように設計される。特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節におけるｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質の発現を特異的に低減するｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、および／または３’ＵＴＲと５’ＵＴＲの両方に位置する。特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節（ＤＲＧ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復を含み、少なくとも２つのタンデム反復は、同じかまたは異なり得る少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列および少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも２つのＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質コード配列の３’末端から２０ヌクレオチド以内である。特定の実施形態では、少なくとも２つのＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質コード配列の３’末端から少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡタンデム反復は、２００～１２００ヌクレオチド長を含む。
特定の実施形態では、ｍｉＲ標的の包含は、ｍｉＲ標的配列を欠く発現カセットまたはベクターゲノムと比較して、１つ以上の標的組織における治療用導入遺伝子の発現または有効性を変化させない。

特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８３の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、

を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含有し、ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列に下線が引かれている。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的である配列の２コピー以上（例えば、２または３コピー）含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２６に部分的な相補性を有する配列を含有し、したがって、配列番号２に整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２６に整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続的であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補性の領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、切断された配列番号２６（すなわち、配列番号２６の５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを欠く配列）を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子および１つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。さらに他の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。

特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号２７）を含むｍｉＲ－１８２標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムまたは発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列の２コピー以上（例えば、２または３コピー）を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号２７に部分的な相補性を有する配列を含有し、したがって、配列番号２７に整列させた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２７に整列させた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続的であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、切断された配列番号２７（すなわち、配列番号２７の５’
末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを欠く配列）を含むｍｉＲ－１８２標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、導入遺伝子および１つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。さらに他の実施形態では、発現カセットまたはベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、または４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

「タンデム反復」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であり得、すなわち、一方の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端のすぐ上流にあるように、またはその逆で、互いの後に直接的に配置され得る。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。

本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、またはより長い数値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧまたはＧＣＡＴＧＣである。

特定の実施形態では、タンデム反復は、２つ、３つ、４つ以上の同じｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、タンデム反復は、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、または少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含む。特定の実施形態では、タンデム反復は、２つまたは３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、および異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。

特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデム反復が存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子のすぐ下流のタンデム反復と、ＵＴＲ配列と、ＵＴＲの３’末端に近接する２つ以上のタンデム反復と、を含み得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。別の例では、３’は、タンデム反復を含有し得、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。

特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内で開始する、２つ、３つ、４つ以上のタンデム反復を含有する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドでｍｉＲＮＡタンデム反復を含む。

参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号に対する優先権を主張する、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「操作可能に連結される」配列は、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列と隣接する発現制御配列と、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列を制御するためにトランスで、または離れて作用する発現制御配列と、の両方を含む。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモータ、エンハンサー、イントロン、コザック配列、ポリアデニル化配列、およびＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。

特定の実施形態では、調節エレメントは、ポンペ病によって影響される複数の細胞および組織における発現を指示して、複数の標的細胞を治療するのに好適である単一発現カセットの構築および送達を可能にする。例えば、調節エレメント（例えば、プロモータ）は、肝臓細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、および中枢神経系細胞のうちの２つ以上で発現させるように選択され得る。例えば、調節エレメント（例えば、プロモータ）は、中枢神経系（例えば、脳）細胞、および骨格筋で発現させるように選択され得る。他の実施形態では、調節エレメントは、ＣＮＳ、骨格筋、および心臓で発現させる。他の実施形態では、発現カセットは、肝臓細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、および中枢神経系細胞のすべてにおけるコードされたｈＧＡＡ７８０Ｉの発現を可能にする。他の実施形態では、調節エレメントは、特定の組織を標的化し、特定の細胞または組織内での発現を回避するために（例えば、本明細書に記載のｄｒｇ非標的化システムの使用によって、および／または組織特異的プロモータの選択によって）選択され得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される異なる発現カセットが患者に投与され、異なる組織を優先的に標的とする。

調節配列は、プロモータを含む。好適なプロモータが選択され得、これには、標的細胞においてｈＧＡＡＶ７８０Ｉタンパク質を発現するプロモータが含まれるが、これに限定されない。

特定の実施形態では、構成的プロモータまたは誘導性／調節性プロモータが選択される。構成的プロモータの例は、ニワトリβアクチンプロモータである。様々なニワトリベータアクチンプロモータが、単独で、または様々なエンハンサーエレメントと組み合わせて報告されている（例えば、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリβアクチンプロモータであるＣＢ７、プロモータと、ニワトリβアクチンの第１のエキソンと、および第１のイントロンと、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプターとを含むＣＡＧプロモータ、ＳＪ Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３－１１５３によるＣＢｈプロモータ）。特定の実施形態では、調節可能なプロモータが選択され得る。例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、組織特異的プロモータが選択され得る。組織特異的であるプロモータの例は、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４）、中枢神経系、例えば、ニューロン（神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）、心筋、骨格筋、肺、および他の組織について周知である。別の実施形態では、好適なプロモータとしては、限定されないが、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモータ（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄ
ｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ（例えば、Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ
ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ
２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、またはＣＢ６プロモータ（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９９－５を参照されたい）が挙げられる。組織特異的プロモータを利用する特定の実施形態では、異なる発現カセットと、異なる細胞タイプを標的とする組織特異的プロモータと、を含む併用療法が選択され得る。

一実施形態では、調節配列は、エンハンサーをさらに含む。一実施形態では、調節配列は、１つのエンハンサーを含む。別の実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであり得るか、または異なり得る。例えば、エンハンサーは、Ａｌｐｈａ ｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離される。

一実施形態では、調節配列は、イントロンをさらに含む。さらなる実施形態では、イントロンは、ニワトリβアクチンイントロンである。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、ヒトβ－グロブリンイントロン、および／または市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロン、ならびにＷＯ２０１１／１２６８０８に記載のものであり得る。

一実施形態では、調節配列は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡである。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。代替的には、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、または合成ポリＡが、発現カセットに含まれ得る。

発現カセットは、任意の好適な送達システムを介して送達することができる。好適な非ウイルス送達システムは、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）、当業者によって容易に選択され得、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子またはＬＮＰ）、またはキトサンベースの配合物を含み得る。

一実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、その記載される発現カセット、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡ を含み、様々な組成物およびナノ粒子、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物および他のポリマー、脂質および／またはコレステロール系－核酸コンジュゲート、ならびに本明細書に記載されるなどの他の構築物と結合される。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，
８（３），ｐｐ７７４－７８７、ウェブ公開：Ｍａｒｃｈ ２１，２０１１、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、およびＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、本明細書に記載のｈＧＡＡ７８０Ｉバリアント、融合タンパク質、または切断タンパク質をコードする配列を有する核酸分子が本明細書に提供される。１つの望ましい実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、配列番号４の操作された配列、またはｈＧＡＡ７８０Ｉバリアントをコードする配列と少なくとも９５％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、配列番号４は、７８０Ｉ位置でのＩｌｅをコードするコドンがＡＴＴまたはＡＴＣであるように改変される。特定の実施形態では、配列番号４またはその断片の操作された配列を含む核酸が、融合タンパク質または切断されたｈＧＡＡ７８０Ｉを発現するために使用される。望ましくないが、特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、配列番号５によってコードされる。特定の実施形態では、核酸分子は、プラスミドである。

本明細書に記載の発現カセットにおける組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されることが意図されることを理解されたい。

ベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列の複製または発現のために適切な標的細胞に導入することができる核酸配列を含む、生物学的または化学的部分である。ベクターの例としては、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、またはナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、機能的な遺伝子産物をコードする外因性または異種の操作された核酸を有する核酸分子であり、そのため、適切な標的細胞に導入することができる。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点、および組換えＤＮＡを挿入することができる１つ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を、有さない細胞から選択することができる手段を有しており、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、および「人工染色体」が含まれる。ベクターの生成、産生、特徴付け、または定量化の従来の方法は、当業者にとって利用可能である。

特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、合成または人工ウイルス粒子を指す「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」であり、粒子中では、ウイルスカプシドまたはエンベロープにパッケージングされた機能的なｈＧＡＡ７８０Ｉ遺伝子産物またはｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットは、そこに任意のゲノム配列もウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされて、複製欠損であり、すなわち、それらは、後代ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接してコードされる核酸配列のみを含有する「ガットレス」であるように操作することができる）、これらの遺伝子は、産生の際に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法での使用のために安全であると考えられる。

本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、所望の細胞を標的とする任意の好適なウイルスベクターである。したがって、組換えウイルスベクターは、好ましくは
、中枢神経系（例えば、脳）、骨格筋、心臓、および／または肝臓を含む、ポンペ病に影響を受ける細胞および組織のうちの１つ以上を標的とする。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、少なくとも中枢神経系（例えば、脳）細胞、肺、心臓細胞、または骨格筋を標的とする。他の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳）、骨格筋、および／または心臓を標的とする。他の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、および中枢神経系細胞のすべてを標的とする。実施例は、例示的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。しかしながら、他の好適なウイルスベクターとしては、例えば、組換えアデノウイルス、組換えボカウイルスなどの組換えパルボウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、組換え単純ヘルペスウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えレンチウイルスが挙げられ得る。好ましい実施形態では、これらの組換えウイルスは、複製不能である。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、または酵母）であり得、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合によって細胞に導入される、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡを含有する。宿主細胞の例としては、単離された細胞、細胞培養、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非哺乳類細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系細胞、ニューロン、グリア細胞、または幹細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、宿主細胞は、ｈＧＡＡ７８０Ｉの産生のための発現カセットを含有し、それによってタンパク質が単離または精製のためにインビトロで十分な量で産生される。特定の実施形態では、宿主細胞は、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉまたはその断片をコードする発現カセットを含有する。本明細書で提供されるように、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、治療剤（すなわち、酵素補充療法）として対象に投与される医薬組成物に含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、機能的な遺伝子産物の発現が所望される任意の標的細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルスベクター内にパッケージされる核酸配列を指す。一例では、「ベクターゲノム」は、最低限、５’から３’に向けて、ベクター特異的配列と、標的細胞における発現を指示する調節制御配列に作動可能に連結された機能的遺伝子産物（例えば、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ、融合タンパク質ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ、または別のタンパク質）をコードする核酸配列と、ベクター特異的配列と、任意選択的に、非翻訳領域におけるｍｉＲＮＡ標的配列と、ベクター特異的配列と、を含む。ベクター特異的配列は、ベクターゲノムをウイルスベクターカプシドまたはエンベロープタンパク質に特異的にパッケージングする末端反復配列であり得る。例えば、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶおよび特定の他のパルボウイルスカプシドにパッケージングするために利用される。レンチウイルスの長い末端反復は、レンチウイルスベクターへのパッキングが所望される場合に利用され得る。同様に、他の末端反復（例えば、レトロウイルス長末端反復）等が選択され得る。

本明細書に記載のベクターにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
一態様では、ＡＡＶカプシドと、そこにパッケージングされた本明細書に記載される融合タンパク質を含む、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉタンパク質（酵素）をコードするベクターゲノムと、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が本明細書に提供される。特定の実施形態では、選択されるＡＡＶカプシドは、肝臓細胞型、筋肉細胞型、腎臓細胞型、心臓細胞型、および／または中枢神経系細胞型のうちの２つ以上の細胞を標的とする。特定の実施形態では、肝臓細胞型、骨格筋細胞型、心臓細胞型、腎臓細胞型、および／または少なくとも１つの中枢神経系細胞型のうちの少なくとも２つ以上においてｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質を発現することが望ましい。したがって、一実施形態では、選択されたＡＡＶカプシドは、心臓組織を標的とする。特定の実施形態では、心臓組織を標的とするように選択されるＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、６、８、および９から選択される（例えば、Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７ Ｓｅｐ １；２８（３）：１５７－１６４を参照されたい）。さらに他の実施形態では、選択されるＡＡＶカプシドは、腎臓の細胞を標的とする。一実施形態では、腎細胞を標的とするためのカプシドは、ＡＡＶ１、２、６、８、９、およびＡｎｃ８０から選択される（例えば、Ｉｋｅｄａ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１８ Ｓｅｐ；２９（９）：２２８７－２２９７、およびＡｓｃｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８ Ｆｅｂ ２６；４９７（１）：１９－２４を参照されたい）。

一実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、本明細書に記載の発現カセットと、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、ｒＡＡＶベクターを形成するｒＡＡＶカプシド内にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、発現カセットに隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。一例では、ＡＡＶまたはボカウイルスカプシドにパッケージングするための「ベクターゲノム」は、最低限、５’から３’に向けて、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、標的細胞において発現を指示する調節制御配列に操作可能に連結された本明細書に記載の機能的なｈＧＡＡ７８０Ｉ（例えば、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質）をコードする核酸配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来であり、カプシドは、異なるＡＡＶ由来である。あるいは、他のＩＴＲが使用され得る。特定の実施形態において、ベクターゲノムは、導入遺伝子の発現が望ましくなく、かつ／または導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される、細胞に存在するｍｉＲＮＡによって特異的に認識されるように設計される、非翻訳領域にｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含む。

ＩＴＲは、ベクター生成の際にゲノムの複製およびパッケージングに関与する遺伝子要素であり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルスシス要素である。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するのとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失型（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、および規制承認を速めるために使用され得る。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲと、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列と、任意の調節配列と、ＡＡＶ３’ＩＴＲと、を含む。しかしながら、これらの要素の他の構成も好適であり得る。ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮型が報告されており、Ｄ配列および末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。

本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者に、かつ／または本明細書に記載の組成物および方法の観点において利用可能であるアデノ随伴ウイルス、ならびに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶヌクレアーゼ（例えば、ＤＮ
ａｓｅ）耐性粒子であり、その中にパッケージングされる発現カセットは、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ヌクレアーゼ耐性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶカプシドが完全に構築されていることを示し、これらのパッケージングされたベクターゲノム配列を、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計される、ヌクレアーゼインキュベーション工程の際の分解（消化）から保護する。多くの場合、本明細書に記載のｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ耐性である。

ＡＡＶカプシドの供給源は、天然に存在し、利用可能な何十ものアデノ随伴ウイルス、ならびに操作されたＡＡＶのいずれかのうちの１つであり得る。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中に、標的細胞に送達するための核酸配列がパッケージングされる。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニットであるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３からなり、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比率で二十面体対称に配置される。様々なＡＡＶが、上記で特定されるＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として選択され得る。例えば、米国公開特許出願第２００７／００３６７６０Ａ１号、米国公開特許出願第２００９／０１９７３３８Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号および米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１および米国特許第７，９０６，１１１号（ＡＡＶ９）、ならびにＷＯ２００６／１１０６８９、ＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）およびＷＯ２０１８／１６０５８２（ＡＡＶｈｕ６８）も参照されたい。また、これらの文書は、ＡＡＶを生成するために選択され得、参照により組み込まれる、他のＡＡＶも記載している。特に明記しない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、および他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ１０、およびＡＡＶＰＨＰ．Ｂとして一般に特定されているＡＡＶ、ならびに既知もしくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、または未だ発見されていないＡＡＶもしくはバリアント、あるいはそれらの混合物を含む、任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶ８カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶ９カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶｒｈ．１０カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１カプシドもしくはそのバリアント、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドもしくはそのバリアント、またはＡＡＶ３Ｂもしくはそのバリアントである。一態様では、カプシドは、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドである。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値または数値および文字の組み合わせによって指定される。「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と各々題され、２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４およびＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８６１も参照されたく、それらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

ＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離または操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、または公的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離、操作、または入手することができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献または例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースで利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成または他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、
これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性および粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のためなどに最適化することを可能にする。

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」および「人工ＡＡＶ」という用語は互換的に使用され、限定されないが、カプシドタンパク質およびそこにパッケージングされるベクターゲノムを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、非天然に存在するプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、同じＡＡＶの非隣接部分である異なる選択されたＡＡＶからか、非ＡＡＶウイルス供給源からか、または非ウイルス供給源から得ることができる異種配列と組み合わせて使用して、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、限定されないが、擬似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、天然および操作されたクレードＦアデノ随伴ウイルスの中から選択される。以下の実施例では、クレードＦアデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶｈｕ６８である。ＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。しかしながら、他の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、異なるクレード、例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、もしくはＥから、またはこれらのクレードのいずれかからも外れたＡＡＶ供給源から選択される。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「クレード」という用語は、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指し、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列の整列に基づいて、少なくとも７５％のブートストラップ値（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅ）（少なくとも１０００複製のうち）および０．０５以下のポアソン補正距離測定値（Ｐｏｉｓｓｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）による隣接結合アルゴリズム（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ
Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実行するために使用することができコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実行する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定されるクレードのうちの１つに含まれるか、別の系統群に含まれるか、またはこれらのクレード外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８１０：６３８１－６３８８，ｗｈｉｃｈ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｃｌａｄｅｓ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ ａｎｄ Ｆ，ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ
ｎｏｖｅｌ ＡＡＶ，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＡＹ５
３０５５３ ｔｏ ＡＹ５３０６２９を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、（ａ）参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ登録：ＡＡＳ９９２６４、およびＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質、ならびに／または（ｂ）ＧｅｎＢａｎｋ登録：ＡＹ５３０５７９．１：（ｎｔ１．．２２１１）のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、のアミノ酸配列を有するＡＡＶ９を指す。このコード配列からのいくつかの変化は、本発明によって包含され、ＧｅｎＢａｎｋ登録：ＡＡＳ９９２６４およびＵＳ７９０６１１１（同様に、ＷＯ２００５／０３３３２１）における参照アミノ酸配列と約９９％同一性を有する配列を含み得る（すなわち、参照配列からの約１％未満の変化）。かかるＡＡＶは、例えば、天然単離物（例えば、ｈｕ３１もしくはｈｕ３２）、またはアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するＡＡＶ９のバリアントを含み得、例えば、限定されないが、アミノ酸置換は、ＡＡＶ９カプシドと整列された任意の他のＡＡＶカプシドにおける対応する位置から「補充された」代替的な残基から選択されるアミノ酸置換を含み、例えば、ＵＳ９，１０２，９４９、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／３４９９１１、ＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１、ＵＳ９，６２３，１２０、およびＵＳ９，５８５，９７１に記載されているものなどが挙げられる。しかし、他の実施形態では、ＡＡＶ９の他のバリアント、または上記の参照配列に少なくとも約９５％同一性を有するＡＡＶ９カプシドが選択され得る。例えば、ＵＳ２０１５／００７９０３８を参照されたい。カプシド、したがってコーディング配列を生成する方法、およびｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法が報告されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｃｌａｄｅ Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題されるＷＯ２０１８／１６０５８２に記載される通りであり、参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパクは、配列番号２の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号２から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質；配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質；および／または配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。

ＡＡＶｈｕ６８ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、典型的には、配列番号２の全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる代替的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は単独で使用されて、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を発現する。あ
るいは、この配列は、配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～約ａａ７３６）をｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／もしくはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有さずにコードする核酸配列またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、あるいは配列番号２のａａ２０３～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、ｖｐ１コード配列および／またはｖｐ２コード配列は、配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有さずにコードする核酸配列またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）、または配列番号２の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号１のｎｔ４１２～２２１１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。

本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸、および任意選択的に、追加の核酸配列、例えば、ｖｐ１および／またはｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列、からカプシドを発現する産生システムで産生されるｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られるｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より特定的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の予測アミノ酸残基からの改変を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限、脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対におけるアスパラギンは、高度に脱アミド化される。

一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ｖｐ１核酸配列は、配列番号１の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有さずにコードする核酸配列、あるいはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号２の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）も提供される。特定の実施形態では、配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有さずにコードする核酸配列、またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）も提供される。

しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列が、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号２をコードする配列番号１と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列をする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号１のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ
２０３～７３６）をコードする配列番号１のｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有する。

ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードする核酸配列を設計することは、当該技術分野の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２に提供される。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１の核酸配列、または本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を有する配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、もしくは少なくとも９９％の配列を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号２に再現される。

特定の実施形態では、カプシド脱アミド化が減少しているＡＡＶカプシドが選択され得る。例えば、ともに２０１９年２月２７日に出願され、それらの全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４およびＰＣＴ／ＵＳ１８／１９８６１を参照されたい。

本明細書で使用される場合、ｖｐカプシドタンパク質を指すために使用されるとき、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる改変アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号２は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質（あるいは、アイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列における違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測アミノ酸残基の改変を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含む。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対における少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された特徴を共通して有し、参照群のすべてのメンバーよりも少ない、少なくとも１つの群メンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおける、少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質よりも少ない。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおける１つ（１）ｖｐ３タンパク質～全ｖｐ３タンパク質未満であり得る。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質のさらなる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対における異なる修飾を有する亜集団を含み得る。

別途指定されない限り、高度脱アミド化は、予測アミノ酸配列と参照アミノ酸位置で比較して、参照アミノ酸位置で少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０
％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号２［ＡＡＶｈｕ６８］の番号付けに基づいてアミノ酸５７で少なくとも８０％のアスパラギンが、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化され得、総ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化され得る）。かかる割合は、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。

したがって、ｒＡＡＶは、少なくとも１つの高度脱アミド化アスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を最低限含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド内の亜集団を含む。さらに、他の修飾は、特に、選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。さらに他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも４～少なくとも約２５の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の亜集団を含み、そのうちの少なくとも１～１０％は、ｖｐタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して脱アミド化される。これらの大部分は、Ｎ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基も脱アミド化され得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、実施例１に提供され、参照により本明細書に組み込まれる表に示される位置に、２つ、３つ、４つ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶカプシドを有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、および／または質量分析、および／またはタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、ＰｅｐＭａｐカラムおよびＮａｎｏＦｌｅｘ源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに接続されたＡｃｃｌａｉｍ Ｔｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。ＭＳデータは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、最も豊富な未配列決定前駆体イオンをサーベイスキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から動的に選択する。配列決定は、予測的自動ゲイン制御で決定された１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行い、前駆体の単離を４ｍ／ｚのウィンドウで行った。サーベイスキャンは、ｍ／ｚ２００で１２０，０００の解像度で取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が５０ｍｓ、正規化された衝突エネルギーが３０によるｍ／ｚ２００で３０，０００に設定され得る。Ｓ－レンズＲＦレベルを５０に設定して、消化物からのペプチドによって占められるｍ／ｚ領域の透過率を最適化し得る。前駆体イオンは、単一か、割り当てられていないか、または断片化選択から６以上の電荷状態で除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、取得したデータの分析に使用され得る。ペプチドマッピングのために、検索は、固定変更としてカルバミドメチル化設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド、およびリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルにおける信頼レベル０．８を使用して実施する。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は、脱アミド化がインタクト分子の質量＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨおよび－ＮＨ_２基の質量差）を加えるので、比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化およびネイティブペプチドの面積の合計で除することによって決定される。脱アミド化の可能性がある部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている同重種は、単一のピークで共移動し得る。したがって、脱アミド化の可能性がある複数の部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の脱アミ
ド部位を特定または区別することができる。これらの例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的な量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位に依存しないことを想定する。これらの例示的な方法について多くの変化が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析装置は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０などの四重極飛行型質量分析装置（ＱＴＯＦ）、またはＯｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎもしくはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムには、例えば、ＷａｔｅｒｓのＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムまたはＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００または１２００シリーズ）が含まれる。好適なデータ分析ソフトウェアには、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＰｉｎｐｏｉｎｔおよびＰｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が含まれ得る。さらに他の技法は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ
ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。

脱アミド化に加えて、他の修飾が生じても、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、または酸化を含み得る。

脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対におけるグリシンを変更して、脱アミド化を低減するように改変される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミンに、またはアミド基を欠くアミノ酸（例えば、アミド基を含むグルタミンおよびアスパラギン）、および／またはアミン基を欠くアミノ酸（例えば、アミン基を含むリジン、アルギニン、およびヒスチジン）に変更される。本明細書で使用される場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファン、および／またはプロリンを指す。記載されるような改変は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列に認められるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、または３つであり得る。特定の実施形態では、かかる改変は、アスパラギン－グリシン対の４つすべてでは行われない。したがって、ＡＡＶおよび／または操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法は、より低い脱アミド率を有する。加えて、または代替え的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、ＡＡＶの脱アミド化を低減し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニンまたはセリンに変更されるように、アスパラギン－グリシン対における変異を含む。変異ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、または３つの変異を含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、３つ、または４つのかかる変異を含み得る。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含む。特定の実施形態では、変異ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシド中で構造的に離れて位置する２つの異なるＮＧ対に変異を含む。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異のうちの１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意選択的に、変異ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に改変を含まないが、ＮＧ対から外れて位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミン中の脱アミド化を最小化または排除するために変異を含む。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４つの残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって＞７０％の脱アミド化レベルを日常的に示し、ほ
とんどの場合、＞９０％である。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。

ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の予測アミノ酸残基からの改変を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含む。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、配列番号２におけるアスパラギン－グリシン対に少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。これらおよび他の改変の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、自己相補的ＡＡＶである。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって有されるコーディング領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な片割れが会合して、即時の複製および転写に備える１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、および第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々が参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載のｒＡＡＶにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

医薬組成物
ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質、またはｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質導入遺伝子を含む発現カセットを含む医薬組成物は、液体懸濁液、凍結乾燥組成物もしくは凍結組成物、または別の好適な配合物であり得る。特定の実施形態では、組成物は、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質、または発現カセットと、懸濁液を形成する生理学的に適合する液体（例えば、溶液、希釈剤、担体）と、を含む。かかる液体は、好ましくは水性ベースであり、１つ以上の緩衝剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、または他の好適な賦形剤を含み得る。好適な成分が以下でより詳細に考察される。医薬組成物は、水性懸濁液および任意の選択された賦形剤、ならびにｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質、または発現カセットを含む。

特定の実施形態では、医薬組成物は、導入遺伝子を含む発現カセットおよび非ウイルス送達システムを含む。これには、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質または脂質様粒子、キトサンベースの配合物、および当該技術分野で既知で、例えば、上記で引用されるＲａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒによって記載されている他のものが含まれ得る。他の実施形態では、医薬組成物は、ウイルスベクター系において操作された導入遺伝子を含む発現カセットを含む懸濁液である。特定の実施形態では、医薬組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターには、例えば、組換
えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または別の組換えパルボウイルスなどの任意の好適な送達ベクターが含まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、それを必要とする患者に遺伝子産物を送達するための組換えＡＡＶである。

一実施形態では、医薬組成物は、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質、またはｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質のコード配列を含む発現カセットと、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、または静脈内（ＩＶ）注入を介した送達に好適な製剤緩衝液と、を含む。一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノムパッケージング化組換えウイルスベクター（すなわち、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＡ７８０Ｉ）の一部である。

一実施形態では、医薬組成物は、酵素補充療法（ＥＲＴ）として対象に送達するために、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質またはその機能性断片を含む。かかる医薬組成物は、通常、静脈内投与されるが、いくつかの状況では、皮内、筋肉内、または経口投与も可能である。組成物は、ポンペ病に罹患しているか、またはポンペ病のリスクがある個体の予防的治療のために投与することができる。治療適用のために、医薬組成物は、確立された疾患に罹患している患者に、蓄積した代謝産物の濃度を減少させ、かつ／または代謝産物のさらなる蓄積を防止もしくは阻止するのに十分な量で投与される。リソソーム酵素欠乏症のリスクがある個体について、医薬組成物は、代謝産物の蓄積を防止または阻害するのに十分な量で予防的に投与される。本明細書に記載の改変ＧＡＡ組成物は、治療有効量で投与される。概して、治療有効量は、対象における医学的状態の重症度、ならびに対象の年齢、一般的状態、および性別に応じて変化し得る。投薬量は、医師によって決定され得、観察された治療の効果に適するように、必要に応じて調整することができる。一態様では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質、またはその機能的断片の単位用量を含有するように配合されるＥＲＴのための医薬組成物が、本明細書に提供される。

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終配合物を含み、例えば、生理的に適合するｐＨおよび塩濃度に緩衝化される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が配合物中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構成され得る。

一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、水性懸濁液中に溶解される界面活性剤、防腐剤、賦形剤、および／または緩衝剤を含む。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。別の実施形態では、緩衝液は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、例えば、エリオット製剤緩衝液、またはハーバード装置灌流液（最終イオン濃度（ｍＭ）：Ｎａ １５０、Ｋ
３．０、Ｃａ １．４、Ｍｇ ０．８、Ｐ １．０、Ｃｌ １５５）である。様々な好適な溶液が既知であり、緩衝化生理食塩水、界面活性剤、約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムに相当にイオン強度に調整された生理学的に適合する塩もしくは塩の混合物、または同等のイオン濃度に調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含むものが含まれる。

好適には、配合物は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～８、もしくはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるため、髄腔内送達では、この範囲内のｐＨが望ましいものであり得、一方、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが望ましいものであり得る。しかし、より広範囲にある他のｐＨ、およびこれらの下位範囲が、他の送達経路のために選択され得る。

適切な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、末端が一級ヒドロキシル基の二機能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、配合物は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を示し、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量パーセントを示す。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。

一実施例では、配合物は、例えば、水中に、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化生理食塩水溶液を含有し得る。好適には、髄腔内送達では、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）であり、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達では、商業的に入手可能な希釈剤が懸濁化剤として、または別の懸濁化剤および他の任意選択的な賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。

他の実施形態では、配合物は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例には、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡが含まれ得る。

さらに、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載される核酸配列を含むベクターと、を含む医薬組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的な活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補助的な有効成分を組成物中に組み込むこともできる。リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本明細書に記載の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された送達のために配合され得る。一実施形態では、治療有効量のベクターが、医薬組成物に含まれる。担体の選択は、限定されない。防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学的安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。

「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「投薬量」または「量」という用語は、対象に治療の過程で送達される総投薬量もしくは総量、あるいは単一単位（または複数単位もしくは分割投薬量）投与で送達される投薬量もしくは量を指し得る。

本明細書に記載の水性懸濁液または医薬組成物は、それを必要とする対象に、任意の好適な経路または異なる経路の組み合わせによって送達されるように設計される。一実施形態では、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、または大槽内注入を介した送達のために配合される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象に、静脈内注入によって送達するために設計される。あるいは、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋内、および他の非経口経路）が選択され得る。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」または「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注入、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔内への注入を介した、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内穿刺、後頭下／大槽内穿刺、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺の手段によって、クモ膜下腔全体に拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽へのものであり得る。鼻腔内送達は、ベクター拡散を増加させ、かつ／または投与によって引き起こされる毒性および炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ
ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「大槽内送達」または「大槽内投与」という用語は、脳室の脳脊髄液への、または小脳延髄槽内への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺を介した、または大槽内への直接的な注入もしくは永久的に配置されたチューブを介した薬物の投与経路を指す。

一態様では、本明細書に記載されるベクターを製剤緩衝液中に含む医薬組成物が、本明細書で提供される。特定の実施形態において、複製欠損ウイルス組成物は、投薬量単位で配合され、ヒト患者にとって、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの範囲にある量の複製欠損ウイルス（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）を含み、その範囲内のすべての整数または分数量、および好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲を含む。一実施形態では、組成物は、用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣを含むように配合され、範囲内のすべての整数または分数を含む。別の実施形態では、組成物は、用量当たり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０ＧＣを含むように配合され、範囲内のすべての整数または分数を含む。別の実施形態では、組成物は、用量当たり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、または９×１０^１１ＧＣを含むように配合され、範囲内のすべての整数または分数を含む。別の実施形態では、組成物は、用量当たり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１０、７×１０^１２、８×１
０^１２、または９×１０^１２ＧＣを含むように配合され、範囲内のすべての整数または分数を含む。別の実施形態では、組成物は、用量当たり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、または９×１０^１３ＧＣを含むように配合され、範囲内のすべての整数または分数を含む。別の実施形態では、組成物は、用量当たり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、または９×１０^１４ＧＣを含むように配合され、範囲内のすべての整数または分数を含む。別の実施形態では、組成物は、用量当たり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、または９×１０^１５ＧＣを含むように配合され、範囲内のすべての整数または分数を含む。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、用量当たり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であることができ、範囲内のすべての整数または分数量を含む。

一実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを製剤緩衝液中に含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬで配合される。さらなる一実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬで配合される。またさらなる一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬで配合される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬで配合される。

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。

本明細書に記載の医薬組成物における組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

治療方法
ポンペ病を有する患者を治療するための治療レジメンが提供され、これは、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶ、および／またはｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質を、任意選択的に免疫調節剤と組み合わせて含む。特定の実施形態では、患者は、遅発性ポンペ病を有する。他の実施形態では、患者は、小児発症性ポンペ病を有する。特定の実施形態では、併用治療剤は、免疫調節レジメンなど、発現カセット、ｒＡＡＶ、またはｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質とともに送達される。追加的に、または代替的に、併用療法は、気管支拡張剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、呼吸筋力トレーニング（ＲＭＳＴ）、酵素補充療法、および／または横隔膜ペーシング療法のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、患者は、ｒＡＡＶの単回投与を受ける。特定の実施形態では、患者は、本明細書に記載の発現カセットおよび／またはｒＡＡＶを含む組成物の単回投与を受ける。特定の実施形態では、有効量の発現カセットを含む組成物のこの単回投与は、少なくとも１つの併用治療薬を含む。特定の実施形態では、患者に、発現カセット、ｒＡＡＶ、および／またはｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質もしくは融合タンパク質、あるいは本明細書に記載されるように、実質的に同時に２つの異なる経路を介して投与される。特定の実施形態では、２つの異なる注入経路は、静脈内および髄腔内投与である。一実施形態では、組成物は、懸濁液であり、対象に、脳室内、髄腔内、大槽内、または静脈内に送達される。特定の実施形態では、α－グルコシダーゼの欠損を有する患者は、本明細書に提供される組成物が投与されて、心筋機能、呼吸筋機能、および／または骨格筋機能のうちの１つ以上が改善する。特定の実施形態では、治療の結果として、心臓、ＣＮＳ（脳）、および／または骨格筋のうちの１つ以上における減少したグリコーゲン貯蔵および／またはオートファジービルドアップが存在する。

特定の実施形態では、発現カセット、ｒＡＡＶ、ウイルスまたは非ウイルスベクターが、医薬品の調製に使用される。特定の実施形態では、ポンペ病を治療するための組成物の使用が提供される。

これらの組成物は、他の療法と組み合わせて使用され得、例えば、免疫療法、酵素補充療法（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｓａｎｏｆｉ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって市販され、米国外ではＭｙｏｚｙｍｅとして市販されるＬｕｍｉｚｙｍｅ）が含まれる。ポンペ病の追加の治療は、対症療法であり、支持療法である。例えば、呼吸支援が必要とされ得、物理療法が、呼吸筋を強化するのに役立ち得、一部の患者は、夜間および／または昼間の間、機械的換気（すなわち、バイレベル気道陽圧またはボリューム・ベンチレーター）を介した呼吸補助を必要とし得る。さらに、気道感染の際に追加の支援が必要とされ得る。一部の患者には、固定具を含む整形外科機器が推奨され得る。手術が、拘縮または脊椎変形などの特定の整形外科的症状のために必要とされ得る。一部の乳児は、鼻を通って食道を下って胃の中に流れる栄養チューブ（経鼻胃管）の挿入を必要とし得る。一部の小児では、栄養チューブが、腹壁の小さな外科的開口部を介して胃に直接的に挿入されることが必要とされ得る。遅発性ポンぺ病を有する一部の個体は、軟食を必要とし得るが、栄養チューブを必要とする個体はほとんどいない。

本明細書に記載されるように、用語「増加させる」（例えば、組織、血液等で測定されるとき、ｈＧＡＡ７８０Ｉによる治療後にｈＧＡＡレベルを増加させる）または「減少させる」、「低下させる」、「緩和させる」、「改善する」、「遅延させる」、もしくはその任意の文法的変形、または任意の類似の用語は、別途指定されない限り、対応する参照（例えば、未治療の対照、またはポンペを有さない正常な状態の対象）と比較して、約５倍、約２倍、約１倍、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％の変化を意味する。

本明細書で同義に使用される「患者」または「対象」は、ヒト、獣医学または農業動物、家庭用動物または愛玩動物、ならびに通常臨床研究に使用される動物を含む、雄または雌の哺乳動物を意味する。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、ヒト患者である。一実施形態では、これらの方法および組成物の対象は、男性または女性のヒトである。

一実施形態では、懸濁液は、約７．２８～約７．３２のｐＨを有する。

これらの用量および濃度の送達のために好適な容量は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択され得、成人のためにより高容量が選択される。典型的には、新生児では、好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年齢の高い乳児では、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児では、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択され得る。小児では、最高約３０ｍＬの容量が選択され得る。１０代前および１０代では、最大約５０ｍＬの容量が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者は、選択される約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受け得る。他の適切な容量および投薬量が決定され得る。投薬量を調整して、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとり、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療適用に応じて変化し得る。

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約１×１０^１３ＧＣの用量で全身に同時投与される。

一実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶ、またはｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素（すなわち、タンパク質または融合タンパク質）が送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、発現カセット、ｒＡＡＶ、もしくはｈＧＡＡ７８０Ｉ、またはそれらの組み合わせの量を指す。したがって、特定の実施形態において、方法は、対象に、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード核酸配列の送達のためのｒＡＡＶまたは発現カセットを投与することを、本明細書に提供されるｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素を含む組成物を投与することと組み合わせて含む。

一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノムにおいて、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム（ｇ）当たり約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）の量で送達され、範囲内のすべての整数または分数量およびエンドポイントを含む。別の実施形態では、投薬量は、脳質量１グラム当たり１×^１０１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣである。具体的な実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^９ＧＣ／ｇ、約１．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約１．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．０ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．５ｘ１０^１３ＧＣ／ｇ、または約１．０ｘ１０^１４ＧＣ／ｇ脳質量である。

一実施形態では、治療方法は、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質の送達を酵素補充療法として含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質は、遺伝子療法（本明細書に提供される発現カセットまたはｒＡＡＶを含
むが、これらに限定されない）と組み合わせてＥＲＴとして送達される。特定の実施形態では、本方法は、対象に、２つ以上のＥＲＴ（例えば、ｈａＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質を、別の治療タンパク質、例えばＬｕｍｉｚｙｍｅと組み合わせて含む組成物）を投与することを含む。本明細書に記載のｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質を含む組成物は、対象に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の日ごとに投与され得る。投与は、静脈内注入によって外来患者に、毎週、毎月、または毎月２回の投与が処方され得る。適切な治療有効量の化合物は、治療する臨床医によって選択され、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、および約２０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、好適な治療用量は、例えば、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、および１００ｍｇ／ｋｇから選択される。

特定の実施形態では、本方法は、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質を、患者に対して１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ患者体重またはそれ以上の投薬量で対象に投与することを含む。多くの場合、投薬量は１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇを超える。投薬量レジームは、１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ～１週間当たり少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇの範囲であることができる。典型的には、投薬量レジームは、１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり１５ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり２０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり２５ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり３０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり３５ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり４０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり４５ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり６０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり８０ｍｇ／ｋｇ、および１週間当たり１２０ｍｇ／ｋｇである。好ましいレジームでは、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇが、週に１回、２回、または３回投与される。治療は、典型的には、少なくとも４週間、時には２４週間、時には患者の生涯にわたって継続される。任意選択的に、ヒトα－グルコシダーゼのレベルは、治療後に監視され（例えば、血漿または筋肉中）、検出されたレベルが、正常な人における値より実質的に低くになるとき（例えば、２０％未満）、さらなる投薬量が投与される。一実施形態において、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質は、最初に「高」用量（すなわち、「負荷用量」）で投与され、その後、より低い用量（すなわち、「維持用量」）で投与される。負荷用量の例は、週に１～３回（例えば、１、２、または３週間）、少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。維持用量の例は、少なくとも約５～少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重／週、またはそれ以上、例えば、２０ｍｇ／ｋｇ／週、３０ｍｇ／ｋｇ／週、４０ｍｇ／ｋｇ／週である。特定の実施形態では、投薬量は、投薬期間中に速度を増加させて投与される。そのようなことは、静脈内注入の流速を増加させることによって、または一定の速度で投与されるｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質の濃度を増加させる勾配を使用することによって達成することができる。この手段での投与は、免疫原性反応のリスクを低減させ得る。特定の実施形態では、静脈内注入は、数時間（例えば、１～１０時間、好ましくは２～８時間、より好ましくは３～６時間）にわたって行われ、注入速度は、投与期間中に時々増加させる。

一実施形態では、本方法は、対象が免疫抑制併用療法を受けることをさらに含む。かかる併用療法のための免疫抑制剤は、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシンもしくはラパログ）、およびアルキル化剤を含む細胞***阻害剤、代謝拮抗剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、イムノフィリンに活性のある物質を含むが、これらに限定されない。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体特異的抗体またはＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ
、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－α）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日前、またはそれ以前に開始され得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、遺伝子療法投与後に、同じ用量または調整された用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、またはそれ以上であり得る。

一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットを含む組成物は、必要とする対象に１回投与される。特定の実施形態では、発現カセットは、ｒＡＡＶを介して送達される。本明細書に記載の組成物および方法が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態および方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

本明細書に提供される組成物および方法は、乳児発症性ポンペ病もしくは遅発性ポンペ病および／またはそれらに関連する症状を治療するために使用され得る。特定の実施形態では、有効性は、疾患の１つ以上の症状の改善または疾患進行の遅延によって決定することができる。乳児発症性ポンペ病の症状には、低張、呼吸器／呼吸障害、肝腫大、肥大性心筋症、ならびに心臓、筋肉、ＣＮＳ（特に運動ニューロン）におけるグリコーゲン貯蔵が含まれるが、これらに限定されない。遅発性ポンペ病の症状には、近位筋力低下、呼吸器／呼吸障害、ならびに筋肉および運動ニューロンにおけるグリコーゲン貯蔵が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、患者の状態および／または診断に基づいて決定され得る。特定の実施形態では、乳児発症性ポンペ病または遅発性ポンペ病を有すると診断された患者の治療のための方法が提供され、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質または融合タンパク質の送達のために、ＩＶおよびＩＣＭ経路の組み合わせを介して本明細書に記載されるｒＡＡＶを投与することを含む。いくつかの実施形態では、遅発性ポンペ病を有すると特定された患者は、ｒＡＡＶの全身送達のみ（例えば、ＩＶのみ）を含む治療を投与される。本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶを含む組成物の送達は、酵素補充療法（ＥＲＴ）との組み合わせであることができる。特定の実施形態では、ポンペ病を有すると診断された対象を治療するための方法が提供され、ＥＲＴと組み合わせた本明細書に記載されるｒＡＡＶのＩＣＭ送達を含む。特定の実施形態では、乳児発症性ポンペ病を有すると特定された対象は、ＩＣＭ注入を介して本明細書に記載のｒＡＡＶが投与され、また末梢疾患の態様の治療のためにＥＲＴを受ける。

「核酸」は、本明細書に記載されるとき、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその修飾であり得、一本鎖または二本鎖であり得、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補的ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などを含む群から選択され得る。かかる核酸配列には、例えば、限定されないが、タンパク質をコードする核酸配列、例えば、転写リプレッサーとして作用するもの、アンチセンス分子、リボザイム、小阻害核酸配列、例えば、限定されないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれる。

タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを「逆翻訳する」ための方法は、当業者に既知である。タンパク質の配列が分ると、ウェブベースおよび市販のコンピュータプログラム、ならびにアミノ酸配列を核酸コード配列に逆翻訳するサービスベースの企業が存在する。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔでオンライン入手可能）、Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｓｍｓ＿－ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌでオンライン入手可能）、ＥｘＰａｓｙ（オンライン入手可能なｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。一実施形態では、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡコード配列は、ヒト細胞における最適な発現のために設計される。

核酸配列の文脈において、「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「同一パーセント」という用語は、対応のために整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、所望される場合、少なくとも約５００～５０００ヌクレオチドの断片にわたるものであり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４ヌクレオチド、少なくとも約２８～３２ヌクレオチド、少なくとも約３６ヌクレオチド以上の、より小さい断片間の同一性も所望され得る。

同一性パーセントは、タンパク質の全長、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、もしくはそのペプチドフラグメントにわたるアミノ酸配列、または配列をコードする対応する核酸配列について容易に決定することができる。好適なアミノ酸フラグメントは、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり得、最大で約７００個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列した」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損または追加の塩基またはアミノ酸について修正を含む。

整列は、公共または市販の様々な多重配列整列プログラムのうちのいずれかを使用して実施される。配列整列プログラムは、アミノ酸配列に対して利用可能であり、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが挙げられる。一般に、これらのプログラムのうちのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、当業者は、必要に応じて、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができ、参照されるアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたは整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

多重配列整列プログラムはまた、核酸配列についても利用可能である。かかるプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＣＡＰ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられ、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能である。かかるプログラムの他の資源は、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上記のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用して比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列と検索配列との間の最良の重複領域の整列および配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、Ｆａｓｔａ（商標）を、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスについてＮＯＰＡＭ係数）を参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧバージョン６．１に提供されるように用いて使用して決定することができる。

本明細書で使用される場合、「調節配列」または「発現制御配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、およびプロモータ配列などの核酸配列を指し、それらが操作可能に連結されるタンパク質コード核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、さもなければ制御する。

核酸配列またはタンパク質を説明するために使用される「外因性」という用語は、核酸またはタンパク質が、それが染色体もしくは宿主細胞に存在する位置に天然に存在しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ宿主細胞または対象から引き出されてそこに挿入される配列を指すが、非天然状態、例えば、異なるコピー数、または異なる調節エレメントの制御下で存在する。

核酸配列またはタンパク質を説明するために使用される場合、「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞もしくは対象とは異なる生物または同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。「異種」という用語は、タンパク質、またはプラスミド、発現カセット、もしくはベクターにおける核酸と関連して使用される場合、タンパク質または核酸は、当該タンパク質または核酸が天然には互いに同じ関係で認められない別の配列もしくはサブ配列で存在することを示す。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の構成要素または方法ステップを包含することを意味する用語である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、関連する実施形態は、他の構成要素または方法ステップを除外する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語、および実施形態または発明の性質を実質的に変化させる任意の構成要素または方法ステップを除外する「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を使用する記述を含むことを理解されたい。本明細書における様々な実施形態は、「含む」という言語を用いて示されるが、様々な状況下で、関連する実施形態はまた、「からなる」または「本質的にからなる」という言語を用いて記載されることも理解されたい。

本明細書で使用される場合、「ｅ」の後に数値（ｎｎ）が続く用語は、指数を指し、この用語は、「×１０^ｎｎ」と互換的に使用される。例えば、３ｅ１３は３×１０^１３に相当する。

「Ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」は、１つ以上のベクターを表すと理解されることに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照からプラスまたはマイナス１０％の可変性を意味する。

ここで、以下の実施例を参照しながら、本発明が説明される。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明がこれらの実施例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

実施例１：材料および方法
ベクター産生
７８０位にＶＡＬを有する参照ＧＡＡ配列およびＶ７８０Ｉ変異を有する配列を逆翻訳し、ヌクレオチド配列を操作して、ＣＡＧプロモータ下で発現カセットを有するＡＡＶ産生のためのシスプラスミドを生成した。さらに、天然のｈＧＡＡのｃＤＮＡ配列（参照配列）を、非操作配列との比較のために同じＡＡＶ－シス骨格にクローニングした。ＡＡＶｈｕ６８ベクターを、以前に報告されているＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって作製して力価測定した。（Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ ２１（１０）：１２５９－１２７１）。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を収集して濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、既に報告されているように（Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（２）：１１５－１２５）、ウサギβグロビンポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、液滴デジタルＰＣＲで力価測定した。

動物
マウス
ポンペマウス（Ｇａａノックアウト（－／－）、Ｃ５７ＢＬ／６／１２９バックグラウンド）ファウンダーは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ（ストック番号００４１５４、６^ｎｅｏマウスとしても知られている）から購入した。育種コロニーを遺伝子療法プログラムＡＡＡＬＡＣ認定のバリアマウス施設で維持し、ヘテロ接合体を使用してヘテロ接合体交配させ、同腹子内でヌル対照およびＷＴ対照を産生した。Ｇａａノックアウトマウスは、ポンペ病のために幅広く使用されるモデルである。これらは、心臓、中枢神経系、骨格筋、および横隔膜にリソソームグリコーゲンの進行性蓄積を示し、移動性が低下し、進行性筋力低下を有する。小サイズ、再現可能な表現型、および効率的な育種は、インビボでの前臨床候補スクリーニングに最適である迅速な試験を可能にする。

動物収容室は、３０～７０％の湿度範囲で、６４～７９°Ｆ（１８～２６℃）の温度範囲に維持した。

動物は、離乳するまで、親および同腹子とともに飼育され、次いで、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＴＲＬ） ＧＴＰ動物施設において、１ケージ当たり２～５匹の標準的なケージ内で飼育された。すべてのケージサイズおよび飼育条件は、実験動物の管理および使用に関するガイド（ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に準拠している。ケージ、水ボトル、および床敷は、バリア施設までにオートクレーブ処理される。

自動制御された１２時間の明暗サイクルが維持された。各暗期間は、１９時（±３０分）に開始した。飼料は、自由摂食で提供された（Ｐｕｒｉｎａ、ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）、５０５３、放射線処理済み、ＰｉｃｏＬａｂ（登録商標）、Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０、２５ｌｂ）。水は、各飼育ケージ内に個別に配置された水ボトルを介して、すべての動物が自由にアクセスできた。最低限、水ボトルは、毎週のケージ交換の際、週に１回交換された。上水道はフィラデルフィア市から引かれ、Ｇｅｔｉｎｇｅ浄水器を使用して塩素化された。塩素化レベルは、ＵＬＡＲによって毎日試験され、２～４百万分率（ｐｐｍ）で維持される。Ｎｅｓｔｌｅｔｓ（商標）がエンリッチメントとして各飼育ケージに提供された。

インビボ試験および組織学
マウスに、０．１ｍＬ中の５×１０^１１ＧＣ（約２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の用量、または５×１０^１０ＧＣ（約２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）の用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ｈＧＡＡ（様々なｈＧＡＡ構築物）を側部尾静脈（ＩＶ）を介して投与し、ベクター投与後７日目および２１日目に血清単離のために採血し、注入２８日後、最後に採血して（血漿単離のため）、失血によって安楽死させた。脳から開始して、組織を速やかに収集した。

組織学のための組織をホルマリン固定し、標準的な方法を使用してパラフィン包埋した。脳および脊髄切片を、ルクソールファストブルー染色キット（ルクソールファストブルー染色キット、Ａｂｃａｍ ａｂ１５０６７５）で染色し、末梢器官を、組織中のグリコーゲン等の多糖類を検出するための標準方法を使用して、ＰＡＳ（過ヨウ素酸シッフ）で染色した。ｈＧＡＡの免疫染色を、ホルマリン固定したパラフィン包埋試料について行った。切片を脱パラフィン化し、抗原回収のために１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で沸騰させ、ＰＢＳ＋０．２％トリトン中の１％ロバ血清で１５分間ブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（Ｓｉｇｍａ ＨＰＡ０２９１２６抗ｈＧＡＡ抗体）およびビオチン化二次抗体と連続的にインキュベートし、ＨＲＰベースの比色反応を使用してシグナルを検出した。

スライドは、委員会認定の獣医病理学者によって盲検方式でレビューされた。半定量的スコアリングシステムを確立して、筋肉内のポンペ関連組織学的病変（グリコーゲン貯蔵およびオートファジービルドアップ）の重症度を測定し、貯蔵および／または空胞を提示する細胞の総パーセンテージによって決定した。

適用可能な場合、ベクター関連の組織病理学的病変も評価した。

インビトロにおけるｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素性能の特徴付け
ＧＡＡ活性
血漿または均質化組織の上清を、５．６ｍＭの４－ＭＵ－α－グルコピラノシド、ｐＨ４．０と混合し、３７℃で３時間インキュベートする。反応を０．４Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ１１．５で停止させる。相対蛍光単位、ＲＦＵは、Ｖｉｃｔｏｒ３蛍光計を３５５ｎｍのｅｘおよび４６０ｎｍの発光で使用して測定する。ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間の単位での活性は、４－ＭＵの標準曲線からの補間によって計算される。個々の組織試料中の活性レベルは、ホモジネート上清中の総タンパク質含有量に対して基準化される。等体積が血漿試料について使用される。

実施例２：ポンペマウスにおけるｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡベクターの評価
ＡＡＶベクターを、ポンペマウスへのＩＶ送達のために無菌ＰＢＳ中で希釈した。試験品には、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ｈＧＡＡｃｏ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧ、およびＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ｓｐ７ｃｏ．Δ８．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧが含まれた。ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉについて操作された配列は、配列番号４に提供される）。野生型およびビヒクル対照を試験に含めた。

ｈＧＡＡタンパク質発現および活性は、処置したマウスから収集した様々な組織で測定し、これには、肝臓（図１Ａ、図１Ｂ）、心臓（図２Ａ、図２Ｂ）、四頭筋（図３Ａ、図３Ｂ）、脳（図４Ａ、図４Ｂ）、血漿（図９）が含まれた。すべてのプロモータは、低および高用量の両方で、肝臓において等しく十分に役割を果たした。ＵｂＣプロモータの下で発現するベクターの投与は、両方の用量で骨格筋における低い活性をもたらし、ＣＡＧプロモータを有するベクターは、最高の全体的な活性を有した。ＵｂＣプロモータを有するベクターはまた、両方の用量で心臓における低い活性を有した。

ポンペマウスビヒクル（ＰＢＳ）対照（図５Ｄ）は、心臓内で顕著なグリコーゲン貯蔵（ＰＡＳ染色切片で暗染色）を示した。野生型マウスおよびベクター処理されたすべてのマウスは、貯蔵のほぼ完全から完全までのクリアランスを有した。しかしながら、ｈＧＡＡ参照配列（Ｖ７８０）をコードするベクターを受けた２つの群は、中等度から顕著な線維化リンパ球性心筋炎を示し（図５Ｂおよび図５Ｃ）、これは、ｈＧＡＡ天然導入遺伝子を受けた８匹の動物のうちの７匹、ならびにＢｉＰおよびｖＩＧＦ２改変を伴う操作されたｈＧＡＡを受けた８匹のうちの３匹に存在した。ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ酵素を受けたマウスはいずれも心筋炎を有さなかったため（図５Ｅ、図５Ｆ、および図５Ｇ）、この病変はベクター関連であり、より具体的には、ｈＧＡＡ参照配列特異的であると考えられた。

四頭筋組織の分析によって、野生型マウスおよびさらなる改変の有無に関わらず、Ｖ７８０Ｉバリアントをコードするベクターで処置したすべてのマウスは、貯蔵およびオートファジービルドアップのほぼ完全から完全までのクリアランスを有することが明らかにされた（図６Ａ～図６Ｇ）。しかしながら、ｈＧＡＡＶ７８０の参照配列をコードするベクターを受けた２つの群は、最小から中程度の残存するグリコーゲン貯蔵およびオートファジービルドアップを示し（図１０）、ポンペ病の２つの主要な特徴の最適以下の矯正をともに示した。最良の転帰は、その天然形態またはＢｉＰ－ｖＩＧＦ２改変のいずれかで、Ｖ７８０Ｉバリアントをコードする２つのベクターの送達から観察された。ｓｐ７－デルタ８改変は、ポンペ病に起因する組織学的病変の一貫した修正を引き起こすように見えた。参照ｈＧＡＡＶ７８０配列をコードする両方の構築物は、グリコーゲン貯蔵およびビルドアップを消失させる最適以下だった。

高用量ＩＶ投与（５ｅ１１＝２．５ｅ１３ＧＣ／ｋｇ）において、ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩおよびＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉは、四頭筋において正常なグリコーゲンレベルに近いことを示し、細胞内へのｈＧＡＡ取り込みが顕著に良好であった。前脛骨筋（ＴＡ）および腓腹筋を含む他の骨格筋の評価は、同様の結果を示した（Ｖ７８０Ｉを有するバリアント、ならびにグリコーゲンおよび中心オートファージ空胞の両方をクリアした）。すべての構築物が心臓内のグリコーゲン貯蔵を減少させ、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ投与が最小レベルをもたらした。四頭筋におけるグリコーゲンレベルは正常に近かったが、ＰＡＳ染色はいくらかの差を示し、ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩおよびＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉは最良の結果を示した。

低用量ＩＶ投与（５ｅ１０＝２．５ｅ１２ＧＣ／ｋｇ）において、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉは、ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉよりも優れた心臓および四頭筋におけるグリコーゲン低下を示した。脳および脊髄におけるグリコーゲンレベルは、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉでほぼ正常であり、組織レベルが約１５％であるが、おそらくより優れた標的化によるものであった。ＣＮＳでは、操作された構築物とＶ７８０Ｉバリアントとの間の強力な相乗効果が観察された。ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩのみがＣＮＳグリコーゲンをクリアした。

図８に示されるように、脊髄組織学の評価は、ＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉで処置されたマウスは、グリコーゲン貯蔵のほぼ完全なクリアランスを有するが、一方、参照ｈＧＡＡＶ７８０酵素をコードするベクターで処置されたマウスは、残存するグリコーゲン貯蔵を有したことを示した。

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、識別数字＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。

本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９１３，４０１号、および２０１９年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８４０，９１１号は、それらの配列表とともに、それらの全体が参照により組み込まれる。「１９－８８５６ＰＣＴ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で本明細書とともに提出された配列表、ならびにその中の配列およびテキストは、参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (52)

1. 発現カセットであって、少なくともｈＧＡＡ７８０Ｉの活性部位を含むヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）をコードする核酸配列を、その発現を指示する調節配列の制御下で含み、７８０位が、配列番号３におけるアミノ酸の位置の番号付けに基づいている、発現カセット。
2. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３（ｈＧＡＡ７８０Ｉ）の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
3. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
4. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３の少なくともアミノ酸１２３～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
5. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
6. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
7. 前記ｈＧＡＡ７８０Ｉが、外因性シグナル配列をさらに含むキメラ融合タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の発現カセット。
8. 前記ｈＧＡＡ７８０Ｉが、配列番号３の全長として発現される、請求項１～７のいずれか一項に記載の発現カセット。
9. 前記ｈＧＡＡ７８０Ｉが、配列番号４、またはそれと少なくとも９５％同一の配列によってコードされる、請求項１～８のいずれか一項に記載の発現カセット。
10. 前記ｈＧＡＡ７８０Ｉが、配列番号５、またはそれと少なくとも９５％同一の配列によってコードされる、請求項１～８のいずれか一項に記載の発現カセット。
11. 前記調節エレメントが、複数の標的組織における発現を指示する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の発現カセット。
12. 前記複数の標的組織が、肝臓細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、および中枢神経系細胞のうちの２つ以上を含む、請求項１１に記載の発現カセット。
13. ｍｉＲ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復をさらに含み、前記少なくとも２つのタンデム反復が、同じかまたは異なり得る少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列および少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、前記融合タンパク質をコードする配列に操作可能に３’で連結される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の発現カセット。
14. 前記ｍｉＲ標的配列が、独立して、配列番号２６および配列番号２７から選択される、請求項１３に記載の発現カセット。
15. 前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、スペーサーによって分離され、前記スペーサーのうちの１つ以上が、独立して、（ｉ）ＧＧＡＴ、（ｉｉ）ＣＡＣＧＴＧ、および（ｉｉｉ）ＧＣＡＴＧＣから選択される、請求項１３または１４に記載の発現カセット。
16. 前記発現カセットが、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルスから選択されるウイルスベクターによって担持される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
17. 前記組換えパルボウイルスが、アデノ随伴ウイルスである、請求項１６に記載の発現カセット。
18. 前記アデノ随伴ウイルスが、ＡＡＶｈｕ．６８もしくはそのバリアント、ＡＡＶ９もしくはそのバリアント、またはＡＡＶｒｈ．１０もしくはそのバリアントである、請求項１７に記載の発現カセット。
19. 前記発現カセットが、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、またはキトサンベースの配合物から選択される非ウイルスベクターによって担持される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
20. ＩＩ型グリコーゲン蓄積疾患（ポンペ）病を治療するために有用である組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、ｒＡＡＶが、
    （ａ）筋肉、心臓、および中枢神経系のうちの少なくとも１つの細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、
    （ｂ）前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、前記ベクターゲノムが、少なくともｈＧＡＡ７８０Ｉの活性部位を含むヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）をコードする核酸配列を、その発現を指示する調節配列の制御下で含み、７８０位が、配列番号３におけるアミノ酸の位置の番号付けに基づく、ベクターゲノムと、を含む、ｒＡＡＶ。
21. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３（ｈＧＡＡ７８０Ｉ）の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。
22. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３の少なくともアミノ酸２０４～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。
23. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３の少なくともアミノ酸１２３～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。
24. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸９５２、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。
25. 前記ｈＧＡＡが、配列番号３の少なくともアミノ酸７０～アミノ酸８９０、またはそれと少なくとも９５％同一で７８０位にＩｌｅを有する配列を含む、請求項２０に記載のｒ
    ＡＡＶ。
26. 前記ｈＧＡＡ７８０Ｉが、外因性シグナル配列をさらに含むキメラ融合タンパク質である、請求項２０～２５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
27. 前記ＡＡＶカプシドが、肝臓、筋肉、心臓、および中枢神経系のうちの２つ以上の細胞を標的とする、請求項２０～２６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
28. 前記調節エレメントが、前記標的細胞における発現を指示する、請求項２７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
29. 前記カプシドが、ＡＡＶｈｕ．６８もしくはそのバリアント、ＡＡＶ９もしくはそのバリアント、またはＡＡＶｒｈ．１０もしくはそのバリアントに由来する、請求項２０～２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
30. 前記ｈＧＡＡ７８０Ｉが、配列番号３の全長として発現される、請求項２０～２９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
31. 前記ｈＧＡＡ７８０Ｉが、配列番号４、またはそれと少なくとも９５％同一の配列によってコードされる、請求項２０～３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
32. 前記ｈＧＡＡ７８０Ｉが、配列番号５、またはそれと少なくとも９５％同一の配列によってコードされる、請求項２０～３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
33. 前記ベクターゲノムが、ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復をさらに含み、前記少なくとも２つのタンデム反復が、同じかまたは異なり得る少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列および少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含む、請求項２０～３２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
34. 前記ｍｉＲ標的配列が、独立して、配列番号２６および配列番号２７から選択される、いずれかの請求項３３に記載のｒＡＡＶ。
35. 前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、スペーサーによって分離され、前記スペーサーのうちの１つ以上が、独立して、（ｉ）ＧＧＡＴ、（ｉｉ）ＣＡＣＧＴＧ、および（ｉｉｉ）ＧＣＡＴＧＣから選択される、請求項３３または３４に記載のｒＡＡＶ。
36. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の発現カセットをコードする配列を含む、核酸分子。
37. 前記分子が、プラスミドである、請求項３６に記載の核酸分子。
38. 請求項３６または３７に記載の核酸分子を含有する、宿主細胞。
39. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の発現カセット、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または懸濁剤のうちの少なくとも１つを含む、組成物。
40. 請求項２０～３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または懸濁剤のうちの少なくとも１つを含む、組成物。
41. 静脈内送達のために配合される懸濁液である、請求項３９または４０に記載の組成物。
42. 髄腔内、大槽内、または脳室内投与のために配合される懸濁液である、請求項３９または４０に記載の組成物。
43. ポンペ病を有する患者を治療するための方法であって、前記患者に、請求項１～１９のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項２０～３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを送達することを含む、方法。
44. 前記発現カセットおよび／またはｒＡＡＶが、別々の経路を介して同時送達される、請求項４３に記載の方法。
45. 前記患者が、前記発現カセットおよび／または前記ｒＡＡＶを、静脈内および／または髄腔内送達を介して投与される、請求項４３または４４に記載の方法。
46. α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）に欠損を有する患者における心筋、呼吸筋、および／または骨格筋機能を改善するための方法であって、前記方法が、前記患者に、請求項１～１９のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項２０～３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを送達することを含む、方法。
47. ポンペ病を有する患者を治療するための治療レジメンであって、免疫調節剤と組み合わせた請求項１～１９のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項２０～３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶの使用を含む、治療レジメン。
48. 前記患者が、遅発性ポンペ病を有する、請求項４７に記載の治療レジメン。
49. 前記患者が、乳児発症性ポンペ病を有する、請求項４７に記載の治療レジメン。
50. 前記患者が、気管支拡張剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、呼吸筋力トレーニング（ＲＭＳＴ）、酵素補充療法、および／または横隔膜ペーシング療法との併用療法を受ける、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の治療レジメン。
51. ポンペ病を有する患者を治療するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項２０～３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶの、使用。
52. 医薬品を調製するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項１８～３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶの、使用。

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