JP2022530652A - ヒト由来のサンプルにおける微生物増殖を決定するための迅速な方法 - Google Patents

Abstract

ｐＨ（又はＣＯ２）ベースの検出プラットフォームを用いる血液培養の連続的モニタリングは、現在の臨床のゴールドスタンダードである。微生物検出は、典型的には１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）より多く存在することを必要とし、敗血症患者血液サンプル中には典型的に１～１０００ＣＦＵのみしか存在しないので、最先端の臨床微生物学実験室におけるこれらの系の偏在性にもかかわらず、結果を得るまでの時間（ＴＴＲ）が遅い。これらのＴＴＲは、統合された病院ネットワークについてのいよいよ一般的となってきたモデルである整理されたハブアンドスポーク実験室モデルにおけるスポーク及び参考実験室から収集されたサンプルについては、典型的には４時間を超えるサンプル輸送時間が費やされるので、さらに延長される。ここで、本発明者らは、スポーク収集場所から中央実験室ハブまでのクーリエ輸送の間のサンプルインキュベーションを可能にする、微生物を１０５ＣＦＵ未満で検出することを可能にする新たな方法を紹介する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／８７６，１４７号（２０１９年７月１９日出願）；米国仮特許出願第６２／８４０，６５７号（２０１９年４月３０日出願）；米国仮特許出願第６２／８５８，８４６号（２０１９年６月７日出願）；米国仮特許出願第６２／９４６，０２３号（２０１９年１２月１０日出願）；及び米国仮特許出願第６２／９７０，６３２号（２０２０年２月５日出願）に対する優先権を主張する。これらの出願の各々は、その全体が、全ての目的のために、本明細書中で参照によって明示的に組み込まれる。

開示の分野
本出願は、臨床微生物学系及び方法に関し、特に、血液及び血液由来サンプルの調製及び分析に関する。

背景
現在の臨床微生物学実験室最先端技術は、ＵＳ５，６２４，８１４に記載のものと類似のプラットフォームを用いる血液培養の連続的モニタリングである。これらのプラットフォームは、改善された再現性、主に夾雑物混入が最小限であること及びヒューマンユーザビリティゆえに、手指法よりも好まれている。典型的には、微生物増殖について陽性である血液培養物は１０％未満であり、また、これはしばしば、手指法よりも陽性の培養物を示すので、このユーザビリティは、特に重要である。

連続的モニタリング血液培養系は、結果を送らせ得る３つの根本的な欠点に悩まされている。第１に、これらの系は、細菌が、細菌増殖を阻害し得る血液由来の因子、例えば、白血球及び血小板、カチオン性ペプチド並びに静脈内抗生物質の存在下で増殖することを必要とする。第２に、主要な系によって使用されるＣＯ_２ベースの検出メカニズムゆえに、多くの場合、１０^７～１０^８ＣＦＵ／ｍＬの細菌レベルに到達するまで、陽性の結果は得られない。第３に、検出モダリティによって連続的モニタリングが必要とされるので、中央臨床実験室から地理的に隔離された場所である整理された健康管理系でボトルが収集され得る場合、このボトルが中央実験室の連続的モニタリングプラットフォームに入れられるまで、そのインキュベーションは開始できない。したがって、待機時間及び輸送時間が浪費され得、この系において多くの培養増殖時間が必要となる。統合健康ネットワークについてのかなりの不利益に加えて、実験室の外でサンプルをインキュベートできないことは、ボトルが充填されてから実験室に直ちに輸送できない場合がある大病院においても、結果を遅延させる場合がある。

連続的モニタリング血液培養系は、２つの主な理由：１）費用及び２）陽性的中率（ＰＰＶ）のため、１９９０年代半ばからゴールドスタンダードのままである。自動化血液培養が全てのサンプルに対して実施される、現行の臨床微生物学実験室パラダイムは、非常に有効なコストフィルターである。このような処理は、医療技師の時間をほとんど必要とせず、典型的には、サンプルの９０％より多くをふるい落とす。次いで、実験室は、陽性サンプルに労力と予算を集中させることができる。さらに、血液ボトルの費用は安価であり、したがって、これらの系は、ほとんどのサンプルを効果的に振るい落とすだけでなく、低コスト消費で行う。

恐らく、血液培養系についての最も重要なパラメーターは、そのＰＰＶである。陽性の血液培養物決定は、臨床医にとっての感染に関する確認情報だけでなく、グラム染色、微生物識別及び抗菌薬感受性試験（及び任意選択の耐性試験）を含む下流の診断試験のためにも必要である。今日の連続的モニタリング系－ＢＡＣＴＥＣ^（Ｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ^ＴＭ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）、及びＶｅｒｓａＴｒｅｋ^ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）－は、全部で８～１０ｃｃのサンプルからの微生物増殖を検出し、そして樹脂又は希釈係数を利用して、血液中に存在する天然の及び外来の抗菌物質の潜在的な阻害効果を最小限にする。

培養ために少なくとも８～１０ｃｃの血液を成人から採取することの重要性は、多くの刊行物、例えば、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ： ｈｏｗ ｍａｎｙ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｒｅ ｎｅｅｄｅｄ？（Ｌｅｅ Ａ，Ｍｉｒｒｅｔｔ Ｓ，Ｒｅｌｌｅｒ ＬＢ，ａｎｄ Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＰＭ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５：３５４６－３４５８，２００７）において実証されている。これは、菌血症患者は、その血液中に循環する生きた生物がごくわずかしか存在しない場合があるという事実に起因する。

米国特許第５６２４８１４号明細書

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ：ｈｏｗ ｍａｎｙ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｒｅ ｎｅｅｄｅｄ？（Ｌｅｅ Ａ，Ｍｉｒｒｅｔｔ Ｓ，Ｒｅｌｌｅｒ ＬＢ，ａｎｄ Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＰＭ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５：３５４６－３４５８，２００７）

したがって、新たな血液培養物系が今日の系と同等のＰＰＶを維持するために、１つの容器あたり８～１０ｃｃの血液の収集を可能にすることが肝要である。

要旨
本開示は、微生物学的血液サンプル収集、処理及び分析のための系及び方法を提供し、これらは、陽性の血液培養決定を達成するために必要な時間を短縮し得る。

１つの局面において、本開示は、微生物について血液サンプルを調べる方法を記載する。本方法は、微生物を第１画分中に濃縮する傾向がある条件下で、血液サンプルを第１画分と第２画分とに分離すること、第１及び第２画分を、微生物増殖に適した条件下でインキュベートすること、並びに第１及び第２画分を、微生物増殖について調べることであって、ここで（ａ）第１画分は、第１時間間隔にわたって第１増殖検出方法を用いて調べられ、そして第２画分は、第２時間間隔の間に第２増殖検出方法を用いて調べられ、（ｂ）第１増殖検出方法は、第２検出方法よりも微生物増殖に対して感受性が高く、（ｃ）第２時間間隔は、第１時間間隔よりも長く、及び（ｄ）増殖が、第１増殖検出方法を用いて第１時間間隔の間に第１画分において検出されなかった場合、第１画分は、第１増殖検出方法以外の増殖検出方法を用い、残りの第２時間間隔にわたって微生物増殖について調べられることを、含んでもよい。

種々の実施形態において、第１増殖検出方法以外の増殖検出方法は、第２増殖検出方法であってもよい。第１増殖方法は、熱量測定法であってもよい。第２増殖検出方法は、ｐＨ、気体、又は光学であってもよく、光学である場合、濁度の光学測定；１以上の波長における吸光度の光学測定、代謝指示染料のシグナルの光学検出；自発蛍光のモニタリング、フローサイトメトリー又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。第１及び第２画分は、微生物懸濁液を含んでもよい。血液サンプルを第１画分と第２画分とに分離する工程は、遠心分離を含んでもよい。血液サンプルは、血液サンプルを第１画分と第２画分とに分離する工程の前に、微生物増殖に好ましい条件下でインキュベートされてもよく、そして、微生物増殖に好ましい条件は、任意に、周囲温度より高い温度、約３７℃の温度、栄養若しくは栄養培地の添加、及び／又は血液サンプル中の抗菌物質を吸収するか若しくは不活性化する物質の添加の、１以上を含む。微生物増殖は、分離工程より前のインキュベーションの間にモニタリングされなくてもよい。

１つの局面において、本開示は、血液サンプルを微生物について調べる方法を、記載する。この方法は、血液サンプルを、抗菌剤を吸収できる樹脂と接触させること、１以上の濃縮工程を行って微生物を：ａ）ペレット及びｂ）上清に濃縮すること、ペレットの少なくとも一部分を含む第１サブサンプルを熱量計に入れること、第１サブサンプルからの熱流量を測定すること、それによって第１サブサンプルの増殖をモニタリングすること、及び上清の一部分を含む第２サブサンプルを保持し、ここで、第２サブサンプルは、（ｉ）熱量測定法以外の方法によって、及び／又は（ｉｉ）第１サブサンプルをモニタリングする間隔よりも長い時間の間隔にわたって、増殖についてモニタリングされることを、含み得る。

種々の実施形態において、本方法は、増殖が測定されなかった場合、第１サブサンプルが約０．５、１、２、３、４、５日間の所定の期間の後に熱量計から取り出され得ることを含んでもよい。第２サブサンプルは、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法によって、増殖についてモニタリングされてもよい。第１及び第２サブサンプルの少なくとも１つの増殖は、絶対シグナルに基づいてモニタリングされてもよい。第１及び第２サブサンプルの少なくとも１つの増殖は、相対シグナルに基づいてモニタリングされてもよい。第２サンプルは、さらに、ペレットの少なくとも一部分を含んでもよい。保持した上清及びペレットの残りは、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法によって、増殖についてモニタリングされてもよい。血液サンプルは、濃縮工程より前に微生物増殖を促進する条件下で、インキュベートされてもよい。熱量計は、示差走査型であっても、又は等温型熱量計であってもよい。第１及び第２サブサンプルは、第１間隔にわたって並行して増殖についてモニタリングされてもよく、ここで、増殖が第１間隔の間に第１サンプル中に検出されない場合、第１サブサンプルは熱量計から取り出され、そして、熱量測定法以外の方法によって、残りの時間間隔にわたって増殖についてモニタリングされ、この残りの時間間隔にわたって、第２サブサンプルが増殖についてモニタリングされる。上清は、実質的な濃縮又は精製を受けなくてもよい。上清の全て又は実質的に全ての容量が、第２サブサンプル中に含まれてもよい。血液サンプルは、収集器中に収集されてもよく、濃縮工程が、収集器中の血液サンプルの遠心分離を含み、そして上清が、遠心分離後に収集器から吸引されるか、又はデカントされ、そしてペレットの除去後に任意に収集器に戻される。第２サブサンプルを保持する工程は、収集器中に上清を保持することを含んでもよい。血液サンプルは、１以上の濃縮工程より前に、微生物増殖に好ましい条件下でインキュベートされてもよく、ここで、微生物増殖に好ましい条件は、任意に、周囲温度より高い温度、約３７℃の温度、栄養若しくは栄養培地の添加、及び／又は血液サンプル中の抗菌物質を吸収するか、若しくは不活性化する物質の添加の１以上を含む。微生物増殖は、１以上の濃縮工程より前のインキュベーションの間にモニタリングされなくてもよい。

１つの局面において、本開示は、血液サンプル中の微生物増殖を検出する方法を記載する。本方法は、血液サンプル中で１以上の吸熱過程を起こす工程、並びにサンプルからの熱流量を検出する工程であって、ここで、熱流量は下降勾配を有さず、それによって微生物増殖を検出する工程を、含んでもよい。

種々の実施形態において、本方法は、吸熱過程は、血液サンプルに加えられた抗凝血薬剤及び溶解薬剤の１以上によって起こされることを、含んでもよい。血液サンプルは、サンプルからの熱流量を検出する工程より前に、微生物増殖に好ましい条件下で事前インキュベートされてもよい。熱流量の検出は、等温型熱量測定法を含んでもよい。吸熱過程は、ミセル形成反応を含んでもよい。吸熱過程を起こす工程は、血液サンプルを溶解試薬、任意にサポニンと接触させることを含んでもよい。吸熱過程を起こす工程は、血液サンプルを抗凝血物質、任意にポリアネトール硫酸ナトリウムと接触させることを含んでもよい。

１つの局面において、本開示は、血液サンプルを、微生物について（例えば、微生物の存在又は増殖について）調べる方法に関する。一般に、本開示のこの局面に従う方法は、血液サンプルを抗菌剤（例えば、採取の時点で血液中に存在する抗菌剤）を吸収することのできる樹脂と接触させること、微生物を（ａ）ペレット（又は他の濃縮画分）と（ｂ）残りの上清（又は比較的枯渇した画分）とに濃縮する１以上の濃縮工程を行うこと、ペレットの少なくとも一部分を等温型熱量計（任意に３１～４０℃に維持される）に入れ、そしてそこからの熱流量を測定し、それにより、微生物増殖（及び、暗に、微生物の存在又は非存在）が、絶対又は相対の熱シグナルに基づいて決定される。上清の少なくとも一部分もまた、「バックアップ」サンプルとして保持され、これもまた、増殖についてモニタリングされる。いくつかの場合において、血液サンプルのペレット／濃縮画分から熱量計測定によって微生物増殖が検出されなかった場合、所定の間隔（固定であっても可変であってもよく、例えば、約０．５、１、２、３、４、５日間）の後、ペレット又は濃縮画分は、熱量計から取り出されて、増殖を決定するために１以上の他の系に移されてもよい（「第２次」増殖決定系と呼び、非限定で、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法を、微生物の存在又は増殖の検出のために用いてもよい）。本開示のこの局面に従う実施形態において使用される血液サンプルは、容積で８ｍｌ以上であってもよく、及び／又は血液培養物ボトルなどの容器中に収集されてもよい。血液サンプルは、代替的に又は加えて、抗凝血剤（例えば、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）及び／又はクエン酸塩の１以上）、栄養又は栄養培地、及び／又は哺乳動物細胞を選択的に溶解できる溶解薬剤（例えば、当該分野で公知の又は本明細書中で記載されるサポニン又は他の薬剤）の１以上と接触されてもよい。熱量計内に置かれた形態である濃縮画分／ペレットは、任意の好適な容量（非限定で０．５、０．７、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬ以上）を有してもよい。いくつかの場合、同じ患者から採取された少なくとも１つのさらなる血液サンプルが、直接的ｐＨ、気体、又は光学方法を用いて、微生物増殖について並行して調べられる。いくつかの場合、血液サンプルの容器への添加の前に、容器中の液体試薬から、吸着性樹脂が単離される；代替的に、又は加えて、溶解薬剤（例えば、サポニン）が、血液サンプルの容器への添加の前に、樹脂、栄養培地、及び抗凝血剤から単離される。；又は、血液サンプルの容器への添加の前に、樹脂が、抗凝血剤及び／又は栄養培地から単離される。樹脂はまた、磁気のものであってもよく、及び／又は固体支持体によって支持されていてもよい。

本開示のこの局面を続けるが、容器は、静脈ＩＶに標準的な接続部品で接続する場合に血液サンプルが容器を満たすような陰圧下にあってもよく、及び／又は好気性増殖に最適化した混合気体を含んでもよい。栄養培地が使用される場合、栄養培地は、任意の好適な培地であってもよく、非限定でトリプシン処理大豆ブロスが挙げられる。いくつかの実施形態において、血液サンプルは、濃縮工程の前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる；明確にするために述べると、これらの場合、インキュベーション条件は、溶解工程及び濃縮工程の条件とは異なっている。このインキュベーションは、いくつかの場合、携帯用サンプルインキュベーション系において行われてもよい。濃縮画分（例えば、ペレット）と希釈画分（又は枯渇画分、例えば、上清）とへの血液サンプルの分画又は分離（分離は、非限定で遠心分離、濾過、フロキュレーション、及び／又は磁気分離が挙げられる任意の好適な手段によって達成され得る）の後、濃縮画分は、微生物増殖を促進する条件下で、さらにインキュベートされる。濃縮画分と枯渇すなわち希釈画分との分離が遠心分離によって達成される場合、これは、１，０００×ｇ～５０，０００×ｇ又は１，０００×ｇ～１０，０００×ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）値で行われる。得られた濃縮画分／ペレットは、２０ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、８ｍｌ以下、６ｍｌ以下、４ｍｌ以下、２ｍｌ以下、１ｍｌ以下、又は０．５ｍｌ以下の容量で、熱量計に入れられ得る。いくつかの場合、新鮮な栄養培地及び／又はアガーが、熱量計に入れる前に、濃縮画分に入れられてもよい。熱量測定法は、一般に、必ずしも必要ではないが、血液サンプルの収集及び／又は処理のために使用される器（ｖｅｓｓｅｌ）又は容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）よりもむしろ、専用の器又は容器において行われる。非限定で、示差走査型熱量計測定及び等温型熱量測定法を含む、任意の好適な熱量測定法様式が、微生物増殖を検出するために使用され得、そして、微生物増殖は、サンプルからの相対熱流量及び／又は絶対熱流量を測定することによって評価され得る。いくつかの場合、熱容量測定の様式及び／又は相対熱流量対絶対熱流量の測定の選択は、患者サンプル又は濃縮画分の特徴に基づいてなされる。例えば、サンプルが、収集後であるが処理よりも前に、例えば、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、又は１０時間以上の間隔にわたって事前インキュベーションに供されている場合、熱流量は、この閾値未満のサンプルとは異なるやり方で決定され得る。サンプルは、所定の間隔後に、サンプルが陽性と検査されようと、又はサンプルが陽性と検査されなかろうと、個別に、又は必要に応じて熱量計にローディングされても、又は取り出されてもよく、又は、サンプルは、バッチに加えられても、及び／又は取り出されてもよい。

本開示のこの局面に留まるが、増殖が、熱量計において１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間以上後に検出されない場合、濃縮画分は、熱量計から取り出され、第２次増殖検出系（例えば、枯渇／希釈／上清画分を調べるために使用されるものと同じ系）に置かれてもよい。任意に、濃縮画分が、熱量計及び第２次増殖検出系の両方で調べられる合計時間は、約４日、５日、６日以上であってもよい。上清及び熱量測定法後のペレットサンプルの両方のために使用され得る第２次増殖決定系は、本明細書中で記載される任意の数の検出様式を利用してよい。これらの様式としては、非限定で、光学吸光度、光学分光法、光学顕微鏡検査、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、又は電気測定が挙げられる。いくつかの場合、濃縮画分／ペレット及び枯渇画分／上清の両方が、並行して調べられ、そして、この画分うちの１つ又は両方において、増殖測定の結果が、微生物陽性サンプルの決定のための基礎として使用され得る。サンプルが陽性とされた後、同じ患者由来の他の採取物、又は元のサンプルの何らかの保存されていた部分が、例えば、微生物同定及び／又は抗菌感受性試験のために使用されてもよい。

別の局面において、本開示は、濃縮（ペレットとも呼ばれる）画分及び枯渇／希釈（上清とも呼ばれる）画分を調製するための、溶解及び／又は遠心分離方法に関する。この局面の種々の実施形態において、全血又は溶解血液若しくは別の血液由来液の遠心分離は、特定種の移動を遅らせるか、又は妨げるが他の種は通す、高密度層又は勾配を有する器において実施される。いくつかの場合、高密度層は、いくつかの、ほとんどの、又は全ての原核細胞及び／又は真核細胞よりも大きな密度を有する水混和性又は非水混和性の液体である「クッション液（ｃｕｓｈｉｏｎｉｎｇ ｆｌｕｉｄ）」を含む。このクッション液は、いくつかの場合、濃縮工程より前に直接添加されてもよく、又は血液サンプルと同時に加えられてもよく、又は血液サンプルが収集される器の中に存在してもよい。

なお別の局面において、本開示は、微生物を含むことが疑われる血液サンプルを培養する方法に関する。これらの方法は、一般に、血液サンプル又は血液由来サンプル（例えば、患者若しくは対象から直接採取されたサンプル、又は１以上の処理工程に供されているサンプル工程）を、血液中に存在する抗菌剤を吸収若しくは不活性化できる物質（例えば、樹脂）と接触させることを含む。濃縮工程は、血液を、微生物を富化したものと微生物を枯渇化させたものである第１画分と第２画分とに分ける。いくつかの場合、これらの画分は、遠心分離によって生み出され、そしてそれぞれペレット及び上清を含む。第１画分の少なくとも一部分が微生物増殖について測定され、他方で、第２画分は「バックアップ」サンプルとして保持される；バックアップサンプルはまた、他の目的で使われていない第１サンプルの一部分を含んでもよい。特定の実施形態において、第１画分は、光学増殖測定を用いてモニタリングされるが、他の実施形態において、このモニタリングは、熱量測定法（例えば、等温型若しくは示差走査型熱量測定法又は任意の他の好適な熱量測定法様式）によって行われる。血液サンプルは、容量において少なくとも８ｍｌを含み得、そして任意に、専用の容器（例えば、血液培養物ボトル）内に収集される。いくつかの場合、血液サンプルは、濃縮工程より前に、栄養若しくは栄養培地、抗凝血剤及び／又は溶解剤（例えば、サポニン）に接触させられる。第１画分は、任意の好適な容量、例えば、２０ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、８ｍｌ以下、６ｍｌ以下、４ｍｌ以下、２ｍｌ以下、１ｍｌ以下、又は０．５ｍｌ以下を有してもよい。第１画分（又はバックアップサンプル）が微生物増殖について測定される間、これは、安定した温度、例えば、３１℃～４０℃の間で維持されていてもよい。同様に、バックアップサンプルは、例えば、光学（光散乱又は吸光度）、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法を用いて、微生物増殖についてモニタリングされてもよい。種々の場合において、溶解薬剤、抗菌吸着性物質、栄養培地及び抗凝血剤を含む事前インキュベーション成分は、血液サンプルが加えられる前に混合されるが、いくつかの場合において、血液サンプルが収集されるまで、１以上の成分を、他から分離して保つことが、望ましいことがある。本開示の他の局面と関連して上で議論したように、血液サンプルが収集される器は、陰圧下にあってもよく、及び／又は好気性微生物増殖のために最適化された混合気体を含んでもよい。栄養培地が使用される場合、栄養培地は、非限定でトリプシン処理大豆ブロスが挙げられる任意の好適な培地であってもよい。いくつかの実施形態において、血液サンプルは、濃縮工程より前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる；明確にするために述べると、これらの場合、インキュベーション条件は、溶解工程及び濃縮工程の条件とは異なっている。このインキュベーションは、いくつかの場合、携帯用サンプルインキュベーション系において行われてもよい。また、本開示の他の局面と関連して上で議論したように、血液サンプルは、濃縮工程より前に微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされてもよい；明確にするために述べると、これらの場合、インキュベーション条件は、溶解工程及び濃縮工程の条件とは異なっている。濃縮工程は、任意の好適な濃縮方法（非限定で、遠心分離、濾過、フロキュレーション、及び／又は磁気分離が挙げられる）を含んでもよく、濃縮画分は、微生物増殖を促進する条件下で、再びインキュベートされる。濃縮画分及び枯渇すなわち希釈画分の分離が遠心分離によって達成される場合、それは、１，０００×ｇ～５０，０００×ｇ又は１，０００×ｇ～１０，０００×ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）値で行われる。得られた濃縮画分／ペレットは、２０ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、８ｍｌ以下、６ｍｌ以下、４ｍｌ以下、２ｍｌ以下、１ｍｌ以下、又は０．５ｍｌ以下の容量で、熱量計に入れられてもよい。いくつかの場合、新鮮な栄養培地及び／又はアガーが、熱量計へ入れるより前に、濃縮画分に入れられてもよい。熱量測定法は、一般に、必ずしも必要ではないが、血液サンプルの収集及び／又は処理のために使用される器又は容器よりもむしろ、専用の器又は容器において行われる。微生物増殖を検出するために、非限定で示差走査型熱量計測定及び等温型熱量測定法が挙げられる、任意の好適な熱量測定法様式が使用されてもよく、そして、微生物増殖サンプルからの相対熱流量及び／又は絶対熱流量を測定することによって評価され得る。いくつかの場合、熱容量測定の様式及び／又は相対熱流量対絶対熱流量の測定の選択は、患者サンプル又は濃縮画分の特徴に基づいてなされる。例えば、サンプルが、収集後であるが処理よりも前に、例えば、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、又は１０時間以上の間隔にわたって事前インキュベーションに供されている場合、熱流量は、この閾値未満のサンプルとは異なるやり方で決定され得る。サンプルは、所定の間隔後に、サンプルが陽性と検査されようと、又はサンプルが陽性と検査されなかろうと、個別に又は必要に応じて熱量計にローディングされても、又は取り出されてもよく、又は、サンプルは、バッチに加えられても及び／又は取り出されてもよい。増殖が、熱量計において１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間以上後に検出されない場合、濃縮画分は、熱量計から取り出され、第２次増殖検出系（例えば、枯渇／希釈／上清画分を調べるために使用されるものと同じ系）に置かれてもよい。任意に、濃縮画分が、熱量計及び第２次増殖検出系の両方で調べられる合計時間は、約４日、５日、６日以上であってもよい。上清及び熱量測定法後のペレットサンプルの両方のために使用され得る第２次増殖決定系は、本明細書中で記載される任意の数の検出様式を利用してよい。これらの様式としては、非限定で、光学吸光度、光学分光法、光学顕微鏡検査、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、又は電気測定が挙げられる。いくつかの場合、濃縮画分／ペレット及び枯渇画分／上清の両方が、並行して調べられ、そして、この画分うちの１つ又は両方において、増殖測定の結果が、微生物陽性サンプルの決定のための基礎として使用され得る。サンプルが陽性とされた後、同じ患者由来の他の採取物、又は元のサンプルの何らかの保存されていた部分が、例えば、微生物同定及び／又は抗菌感受性試験のために使用されてもよい。

本開示の複数の局面に従う実施形態において、新鮮な栄養培地及び／又はアガーが、濃縮工程の完了より前に、及び／又は微生物増殖についての画分又はサンプルのどちらかのモニタリングより前に、サンプルに入れられてもよい。

なお別の局面において、本開示は、微生物を含むことが疑われる血液サンプルを培養する方法に関し、この方法は、血液サンプルを樹脂又は抗菌剤を吸収することのできる他の物質と接触させること、血液サンプルの一部分を等温型熱量計に入れること、及びサンプルからの熱流量を測定して絶対シグナル又は相対シグナルに基づいて陽性の微生物増殖を決定することを含む。増殖が、（例えば、測定間隔の間に）測定されなかった場合、本開示の前記した局面に関して上述したように、サンプルは、熱量計から取り出されて、第２次増殖決定系に移される。本開示のこの局面に従う実施形態において、１２ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、２５ｍｌ、３０ｍｌ、３５ｍｌ、４０ｍｌ、４５ｍｌ、又は５０ｍｌの液体容量が、熱量計に入れられてもよく、及び／又は血液サンプルが専用の器又は容器に収集される場合、約８ｍｌの容量を含んでもよい。この方法の特定の実施形態において、上記の局面に関して記載された通り、血液サンプルは、栄養培地、抗凝血剤及び／又は溶解薬剤に接触されてもよく；熱量計は、３１～４０℃で安定して維持されてもよく；サンプルは、所定の間隔の後に増殖が何ら測定されなかった後で、熱量計から取り出されてもよく、第２次増殖決定系は、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法を含む；同じ患者から採取されたサンプルの少なくとも１つは、直接的にｐＨ、気体、又は光学方法によって、並行して微生物増殖について測定され；溶解薬剤は、サポニンなどである。様々な場合において、溶解薬剤、抗菌吸着性物質、栄養培地及び抗凝血剤を含む事前インキュベーション成分は、血液サンプルが添加されるより前に混合されるが、いくつかの場合、血液サンプルが収集されるまで、１以上の成分を、他から分離して保つことが、望ましいことがある。サンプルは、所定の間隔後に、サンプルが陽性と検査されようと、又はサンプルが陽性と検査されなかろうと、個別に、又は必要に応じて熱量計にローディングされても、又は取り出されてもよく、又は、サンプルは、バッチに加えられても、及び／又は取り出されてもよい。増殖が、熱量計において１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間以上後に検出されない場合、濃縮画分は、熱量計から取り出され、第２次増殖検出系（例えば、枯渇／希釈／上清画分を調べるために使用されるものと同じ系）に置かれてもよい。任意に、濃縮画分が、熱量計及び第２次増殖検出系の両方で調べられる合計時間は、約４日、５日、６日以上であってもよい。上清及び熱量測定法後のペレットサンプルの両方のために使用され得る第２次増殖決定系は、本明細書中で記載される任意の数の検出様式を利用してよい。これらの様式としては、非限定で、光学吸光度、光学分光法、光学顕微鏡検査、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、又は電気測定が挙げられる。いくつかの場合、濃縮画分／ペレット及び枯渇画分／上清の両方が、並行して調べられ、そして、この画分うちの１つ又は両方において、増殖測定の結果が、微生物陽性サンプルの決定のための基礎として使用され得る。サンプルが陽性とされた後、同じ患者由来の他の採取物、又は元のサンプルの何らかの保存されていた部分が、例えば、微生物同定及び／又は抗菌感受性試験のために使用されてもよい。

なお別の局面において、本開示は、微生物について血液サンプルを調べる方法に関し、この方法は、各サンプルをそれぞれ微生物の第１及び第２濃縮物を含む第１及び第２サブサンプルに分離し、次いで種々の時間間隔にわたって第１及び第２サブサンプルを微生物増殖についてモニタリングすることを含む。いくつかの場合、第１サブサンプルは、５日間にわたってモニタリングされ、他方で、第２サブサンプルは、５日間より短い間モニタリングされる。第１サブサンプルは、希釈すなわち枯渇画分すなわち上清を含んでもよく、他方で、第２サブサンプルは、濃縮画分すなわちペレットを含んでもよい。本実施形態に従う特定の実施形態は、実質的に上述の通りである：特定の実施形態において、第１画分は、光学増殖測定を用いてモニタリングされるが、他の実施形態においては、モニタリングは、熱量測定法（例えば、等温型若しくは示差走査型熱量測定法、又は任意の他の好適な熱量測定法様式）によって行われる。血液サンプルは、少なくとも８ｍｌの容量を含んでもよく、そして、任意に、専用の容器（例えば、血液培養物ボトル）中に収集される。いくつかの場合、血液サンプルは、濃縮工程より前に、栄養若しくは栄養培地、抗凝血剤及び／又は溶解薬剤（例えば、サポニン）と接触させられる。第１画分は、任意の好適な容量、例えば、２０ｍｌ以下１０ｍｌ以下８ｍｌ以下６ｍｌ以下４ｍｌ以下２ｍｌ以下１ｍｌ以下又は０．５ｍｌ以下を有してもよい。第１画分（又はバックアップサンプル）が微生物増殖について測定されている間、それは、安定な温度、例えば、３１℃～４０℃の間に維持されていてもよい。同様に、バックアップサンプルは、例えば、光学（光散乱又は吸光度）、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法を用いて、微生物増殖についてモニタリングされてもよい。様々な場合において、溶解薬剤、抗菌吸着性物質、栄養培地及び抗凝血剤を含む事前インキュベーション成分は、血液サンプルが添加されるより前に混合されるが、いくつかの場合、血液サンプルが収集されるまで、１以上の成分を、他から分離して保つことが、望ましいことがある。本開示の他の局面に関して上述されるように、血液サンプルが中に収集される器は、陰圧下であってもよく、及び／又は好気性微生物増殖のために最適化された混合気体を含んでもよい。栄養培地が使用される場合、栄養培地は、非限定でトリプシン処理大豆ブロスが挙げられる、任意の好適な培地であってもよい。いくつかの実施形態において、血液サンプルは、濃縮工程より前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる；明確にするために述べると、これらの場合、インキュベーション条件は、溶解工程及び濃縮工程の条件とは異なっている。このインキュベーションは、いくつかの場合、携帯用サンプルインキュベーション系において行われてもよい。また、本開示の他の局面と関連して上で議論したように、血液サンプルは、濃縮工程より前に微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされてもよい；明確にするために述べると、これらの場合、インキュベーション条件は、溶解工程及び濃縮工程の条件とは異なっている。濃縮工程は、任意の好適な濃縮方法（非限定で、遠心分離、濾過、フロキュレーション、及び／又は磁気分離を含む）を含んでもよく、濃縮画分は、微生物増殖を促進する条件下で再びインキュベートされる。濃縮画分及び枯渇すなわち希釈画分の分離が遠心分離によって達成される場合、１，０００×ｇ～５０，０００×ｇ又は１，０００×ｇ～１０，０００×ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）値で行われる。得られた濃縮画分／ペレットは、２０ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、８ｍｌ以下、６ｍｌ以下、４ｍｌ以下、２ｍｌ以下、１ｍｌ以下、又は０．５ｍｌ以下の容量で、熱量計に入れられてもよい。いくつかの場合、熱量計に入れられるより前に、新鮮な栄養培地及び／又はアガーが、濃縮画分に入れられてもよい。熱量測定法は、一般に、必ずしも必要ではないが、血液サンプルの収集及び／又は処理のために使用される器又は容器よりもむしろ、専用の器又は容器において行われる。非限定で示差走査型熱量計測定及び等温型熱量測定法が挙げられる任意の好適な熱量測定法様式が、微生物増殖を検出するために使用されてもよく、微生物増殖サンプルからの相対熱流量及び／又は絶対熱流量を測定することによって評価され得る。いくつかの場合、熱容量測定の様式及び／又は相対熱流量対絶対熱流量の測定の選択は、患者サンプル又は濃縮画分の特徴に基づいてなされる。例えば、サンプルが、収集後であるが処理よりも前に、例えば、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、又は１０時間以上の間隔にわたって事前インキュベーションに供されている場合、熱流量は、この閾値未満のサンプルとは異なるやり方で決定され得る。サンプルは、所定の間隔後に、サンプルが陽性と検査されようと、又はサンプルが陽性と検査されなかろうと、個別に又は必要に応じて熱量計にローディングされても、又は取り出されてもよく、又は、サンプルは、バッチに加えられても及び／又は取り出されてもよい。増殖が、熱量計において１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間以上後に検出されない場合、濃縮画分は、熱量計から取り出され、第２次増殖検出系（例えば、枯渇／希釈／上清画分を調べるために使用されるものと同じ系）に置かれてもよい。任意に、濃縮画分が、熱量計及び第２次増殖検出系の両方で調べられる合計時間は、約４日、５日、６日以上であってもよい。上清及び熱量測定法後のペレットサンプルの両方のために使用され得る第２次増殖決定系は、本明細書中で記載される任意の数の検出様式を利用してよい。これらの様式としては、非限定で、光学吸光度、光学分光法、光学顕微鏡検査、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、又は電気測定が挙げられる。いくつかの場合、濃縮画分／ペレット及び枯渇画分／上清の両方が、並行して調べられ、そして、この画分うちの１つ又は両方において、増殖測定の結果が、微生物陽性サンプルの決定のための基礎として使用され得る。サンプルが陽性とされた後、同じ患者由来の他の採取物、又は元のサンプルの何らかの保存されていた部分が、例えば、微生物同定及び／又は抗菌感受性試験のために使用されてもよい。

別の局面において、本開示は、微生物について血液サンプルを調べる方法に関し、この方法は、サンプルを、微生物の第１及び第２濃縮物を含む第１及び第２サブサンプルに分離すること、及び異なる時間間隔にわたって、第１及び第２サブサンプルを微生物増殖についてモニタリングすることを含む。この局面に従う実施形態は、上述の方法に実質的に類似する：特定の実施形態において、第１画分は、光学増殖測定を用いてモニタリングされるが、他の実施形態において、モニタリングは、熱量測定法（例えば、等温型若しくは示差走査型熱量測定法又な任意の他の好適な熱量測定法様式）によってなされる。血液サンプルは、容量で少なくとも８ｍｌを含んでもよく、そして任意に、専用の容器（例えば、血液培養物ボトル）中に収集される。いくつかの場合、血液サンプルは、濃縮工程より前に、栄養若しくは栄養培地、抗凝血剤及び／又は溶解薬剤（例えば、サポニン）と接触させられる。第１画分は、任意の好適な容量、例えば、２０ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、８ｍｌ以下、６ｍｌ以下、４ｍｌ以下、２ｍｌ以下、１ｍｌ以下、又は０．５ｍｌ以下を有してもよい。第１画分（又はバックアップサンプル）が微生物増殖について測定されている間、それは、安定な温度、例えば、３１℃～４０℃で維持されていてもよい。同様に、バックアップサンプルは、例えば、光学（光散乱又は吸光度）、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法を用いて、微生物増殖についてモニタリングされてもよい。様々な場合において、溶解薬剤、抗菌吸着性物質、栄養培地及び抗凝血剤を含む事前インキュベーション成分は、血液サンプルが添加されるより前に混合されるが、いくつかの場合血液サンプルが収集されるまで、１以上の成分を、他から分離して保つことが、望ましいことがある。本開示の他の局面に関して上述されるように、血液サンプルが中に収集される器は、陰圧下であってもよく、及び／又は好気性微生物増殖のために最適化された混合気体を含んでもよい。栄養培地が使用される場合、栄養培地は、非限定でトリプシン処理大豆ブロスが挙げられる任意の好適な培地であってもよい。いくつかの実施形態において、血液サンプルは、濃縮工程より前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる；明確にするために述べると、これらの場合、インキュベーション条件は、溶解工程及び濃縮工程の条件とは異なっている。このインキュベーションは、いくつかの場合、携帯用サンプルインキュベーション系において行われてもよい。また、本開示の他の局面と関連して上で議論したように、血液サンプルは、濃縮工程より前に微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされてもよい；明確にするために述べると、これらの場合、インキュベーション条件は、溶解工程及び濃縮工程の条件とは異なっている。濃縮工程は、任意の好適な濃縮方法（非限定で遠心分離、濾過、フロキュレーション、及び／又は磁気分離が挙げられる）を含んでもよく、濃縮画分は、微生物増殖を促進する条件下で、再びインキュベートされる。濃縮画分及び枯渇すなわち希釈画分の分離が遠心分離によって達成される場合、１，０００×ｇ～５０，０００×ｇ又は１，０００×ｇ～１０，０００×ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）値で行われる。得られた濃縮画分／ペレットは、２０ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、８ｍｌ以下、６ｍｌ以下、４ｍｌ以下、２ｍｌ以下、１ｍｌ以下、又は０．５ｍｌ以下の容量で、熱量計に入れられてもよい。いくつかの場合、熱量計に入れられるより前に、新鮮な栄養培地及び／又はアガーが、濃縮画分に入れられてもよい。熱量測定法は、一般に、必ずしも必要ではないが、血液サンプルの収集及び／又は処理のために使用される器又は容器よりもむしろ、専用の器又は容器において行われる。非限定で示差走査型熱量計測定及び等温型熱量測定法が挙げられる任意の好適な熱量測定法様式が、微生物増殖を検出するために使用されてもよく、微生物増殖サンプルからの相対熱流量及び／又は絶対熱流量を測定することによって評価され得る。いくつかの場合、熱容量測定の様式及び／又は相対熱流量対絶対熱流量の測定の選択は、患者サンプル又は濃縮画分の特徴に基づいてなされる。例えば、サンプルが、収集後であるが処理よりも前に、例えば、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、又は１０時間以上の間隔にわたって事前インキュベーションに供されている場合、熱流量は、この閾値未満のサンプルとは異なるやり方で決定され得る。サンプルは、所定の間隔後に、サンプルが陽性と検査されようと、又はサンプルが陽性と検査されなかろうと、個別に又は必要に応じて熱量計にローディングされても、又は取り出されてもよく、又は、サンプルは、バッチに加えられても及び／又は取り出されてもよい。増殖が、熱量計において１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間以上後に検出されない場合、濃縮画分は、熱量計から取り出され、第２次増殖検出系（例えば、枯渇／希釈／上清画分を調べるために使用されるものと同じ系）に置かれてもよい。任意に、濃縮画分が、熱量計及び第２次増殖検出系の両方で調べられる合計時間は、約４日、５日、６日以上であってもよい。上清及び熱量測定法後のペレットサンプルの両方のために使用され得る第２次増殖決定系は、本明細書中で記載される任意の数の検出様式を利用してよい。これらの様式としては、非限定で、光学吸光度、光学分光法、光学顕微鏡検査、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、又は電気測定が挙げられる。いくつかの場合、濃縮画分／ペレット及び枯渇画分／上清の両方が、並行して調べられ、そして、この画分うちの１つ又は両方において、増殖測定の結果が、微生物陽性サンプルの決定のための基礎として使用され得る。サンプルが陽性とされた後、同じ患者由来の他の採取物、又は元のサンプルの何らかの保存されていた部分が、例えば、微生物同定及び／又は抗菌感受性試験のために使用されてもよい。

別の局面において、本開示は、ヒト起源のサンプルにおいて微生物増殖を決定するための自動化方法に関し、この方法は、遠心分離より前に器に以下の成分：ヒト起源のサンプル、例えば、血液、脳脊髄液、滑液、複数の液体（ｐｌｕｒａｌ ｆｌｕｉｄ）、心膜液；真核細胞を溶解することができる１以上の成分；溶解した血液細胞より下を遠心分離の間に区画するような密度及び／又は粘度を有する水混和性又は水非混和性の液体又は溶液と定義される１以上のバリア液（多くの溶解した血液細胞は、それが形成する層に入れない；そして微生物は、遠心分離の間、それが形成する層に入り得る）；任意に、多くの真核細胞及び原核細胞より高い密度を有する水混和性又は水非混和性の液体又は溶液として定義されるクッション液；任意に、１以上の抗凝血剤；及び任意に、１以上の消泡成分を、ヒト起源のサンプルを含む収集管内に入れることを含む。本方法はさらに、この混合物を、微生物がバリア液に入ることを可能にするために好適な条件下で遠心分離すること；血球層を取り出し、そしてそれを、微生物増殖を支持することができる栄養培地に入れて、微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションの間、１以上の別個の又は連続的な、微生物増殖を決定するためのモニタリング方法を行うこと；並びに、遠心分離された器の中に残った多くの微生物を、微生物増殖を支持することができる栄養培地に入れ、微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションの間、１以上の別個の又は連続的な、微生物増殖を決定するためのモニタリング方法を行うことを、含む。

本開示の別の局面は、ヒト起源のサンプルにおける微生物増殖を決定するための自動化方法に関し、この方法は、以下を含む：血液サンプル又は処理した血液サンプルを、液体又は半固体の濾過層を含む器に入れること；微生物が濾過層に入ることを可能にするが多くの血液細胞が濾過層に入ることを妨げるために好適な条件下で、この混合物を遠心分離すること；濾過層の上の血液細胞を含む層を取り出して、微生物増殖を支持することができる栄養培地に入れ、微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションの間に、微生物増殖を決定するための、１以上の、別個の又は連続的なモニタリング方法を行うこと；並びに、遠心分離された器の中に残った多くの微生物を、微生物増殖を支持することができる栄養培地に入れ、微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションの間、１以上の別個の又は連続的な、微生物増殖を決定するためのモニタリング方法を行うこと。

いくつかの実施形態において：血液サンプルは、抗凝血剤としてポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）及び／又はクエン酸塩を含む；血液サンプル処理は、ＳＰＳ及びサポニンと混合することを含む；血液サンプル処理は、ポリプロピレングリコールと混合することを含む；血液サンプル処理は、１以上の栄養培地と混合することを含む；血液サンプル処理は、微生物増殖を促進する条件下でのサンプルインキュベーションを含む；ここで、液体濾過層は、１以上の増粘剤を含む。

１つの実施形態において、増粘剤としては、単糖、糖ポリマー、直鎖状ポリマー、分枝鎖状ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、増粘剤は、ショ糖である。１つの実施形態において、液体濾過層は、１以上の熱応答性ゲル化剤を含む。１つの実施形態において、ゲル化剤は、ゼラチンを含む。１つの実施形態において、液体濾過層は、重水を含む。１つの実施形態において、２以上の液体濾過層が、存在する。１つの実施形態において、液体濾過層は、非水混和性である。１つの実施形態において、液体濾過層は、シリコーンオイル、フッ化界面活性剤、フッ化溶媒、又はフッ化ポリマーを含む。１つの実施形態において、液体濾過層は、１０、２０、３０、３５℃の温度を超える液体としてピペッティングされてもよい。１つの実施形態において、血液サンプルは、上記温度を下回る温度で加えられる。１つの実施形態において、血液サンプルは、遠心分離後に加えられ、血球含有層は、液体濾過層が取り出された温度未満で取り出される。１つの実施形態において、遠心分離は、スインギングバケットローターにおいて行われる。１つの実施形態において、遠心分離は、５００～６，０００×ｇの間で行われる。１つの実施形態において、微生物増殖をモニタリングするための方法は、吸光度、蛍光、蛍光偏光法、時間分解蛍光、比濁分析、発光、前方レーザー散乱（ｆｏｒｗａｒｄ ｌａｓｅｒ ｓｃａｔｔｉｎｇ）、マルチアングル光散乱、動的光散乱、高分解能撮像を含む光学；質量共鳴；音響；インピーダンス、ボルタメトリー、電流測定を含む電気である。１つの実施形態において、２つの異なる層について微生物増殖をモニタリングするために、異なる方法が、使用される。１つの実施形態において、１以上の生化学的プローブが、加えられる。１つの実施形態において、プローブは、微生物の増殖によって改変される蛍光特性を有するプローブ、微生物表面に結合するプローブ、生きているか、又は死んでいる微生物を選択的に投下することができるプローブを、含む。１つの実施形態において、１以上のプローブは、１以上の酵素の機能を検出し、これらとしては、ペプチドグリカン組立、解体、再組立を担う酵素；エステラーゼ；ホスファターゼ；ガラクトシダーゼ；ペプチダーゼ；ウレアーゼ；カタラーゼ；ゼラチナーゼ；ヒドロリザーゼ（ｈｙｄｒｏｌｙｓａｓｅ）；ＤＮアーゼ；リパーゼ；プロテアーゼ；オキシドレダクターゼが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、２つのプローブが、ＦＲＥＴ対を形成する。１つの実施形態において、微生物増殖を促進する条件は、３３～３７℃でのインキュベーション、撹拌及び酸素の有無を含む。

別の局面において、本開示は、微生物を含むことが疑われる血液サンプルを培養するための方法に関し、この方法は、血液サンプルを、抗菌剤を吸収することのできる樹脂と接触させること；少なくとも１つの水混和性高密度層を用いて少なくとも１回の遠心分離工程を行って、より高密度の層中に微生物を区分し、それによってこの層よりも上の上清におけるより低密度の血球成分及びこの層より下のペレット中のより大きな類似の密度の血球成分から微生物を分離すること；インキュベーションの間、より高密度の層中に区分された微生物を、増殖について測定すること；並びに、遠心分離後に、多くの上清、ペレット、及び微生物を含む高密度層の何らかの残りを、「バックアップ」サンプルに保持し、インキュベーションの間、微生物増殖についてモニタリングすることを、含む。１つの実施形態において、増殖測定は、光学的に行われる。１つの実施形態において、増殖測定は、熱量測定法によって行われる。１つの実施形態において、血液サンプルは、容量で少なくとも約８ｍＬを含み、そして、容器中に収集される。１つの実施形態において、血液サンプルは、栄養培地及び抗凝血剤と接触させられる。１つの実施形態において、血液サンプルは、哺乳動物細胞を選択的に溶解できる溶解薬剤と接触させられる。１つの実施形態において、高密度水層は、高濃度の糖、塩、又はポリマーであり、これらとしては、限定されないが、ショ糖、セシウム、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅが挙げられる。１つの実施形態において、高密度の水層栄養培地又は１以上の微生物増殖促進成分を含む。１つの実施形態において、高密度水層は、血液及び培地の容量と、およそ同じ、その半分、４分の１、５分の１、８分の１の容量である。１つの実施形態において、高密度水層は、血液が患者から収集される容器には存在しない。１つの実施形態において、微生物は、増殖決定工程の始まりより前に、高密度水層の一部分から分離される。１つの実施形態において、ペレットは、微生物増殖の測定の間、３１～４０℃で安定に維持される。１つの実施形態において、保持された上清及びペレットの残りは、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法により、増殖についてモニタリングされる。１つの実施形態において、光学方法は、光散乱又は吸光度を含む。１つの実施形態において、熱量測定法は、等温型又は示差走査型熱量測定法を含む。１つの実施形態において、溶解薬剤は、サポニンである。１つの実施形態において、抗凝血剤は、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）及びクエン酸塩の１以上である。１つの実施形態において、血液サンプルの容器への添加より前に、樹脂は、容器中の液体試薬から単離される。１つの実施形態において、血液サンプルの容器への添加より前に、抗菌剤吸収樹脂は、ＳＰＳ及び／又は栄養培地から単離される。１つの実施形態において、静脈ＩＶに標準的な蝶形接続部品で接続する場合に血液サンプルが容器を満たすように、容器は、陰圧下にあってもよい。１つの実施形態において、容器内の混合気体が、好気性微生物増殖のために最適化されていてもよい。１つの実施形態において、栄養培地は、トリプシン処理大豆ブロスである。１つの実施形態において、樹脂は、磁気である。１つの実施形態において、樹脂は、固体支持体上に支持されている。１つの実施形態において、血液サンプルは、濃縮工程より前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる。１つの実施形態において、濃縮工程より前の増殖が、濃縮工程が行われるやり方とは異なって行われる。１つの実施形態において、濃縮工程より前の増殖が、携帯用系において行われる。１つの実施形態において、遠心分離工程の完了後、微生物が、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる。１つの実施形態において、遠心分離は、１，０００×ｇ未満、１，０００×ｇ、１，５００×ｇ、又は２，０００×ｇの速さで行われる。１つの実施形態において、上清と血球ペレットとの組み合わせが、光学吸光度、光学分光法、光学顕微鏡検査、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、又は電気測定の少なくとも１つを用いて、微生物増殖について測定される。１つの実施形態において、上清／ペレット増殖測定が、高密度水層増殖測定とおよそ並行して、行われる。１つの実施形態において、濃縮及び上清サンプルの以上からの増殖測定の結果は、ユーザーに返される。１つの実施形態において、陽性増殖の決定の後で、微生物同定及び／又は抗菌感受性試験及び／又は抗菌耐性決定が、行われる。１つの実施形態において、本方法は、自動化されている。

本開示の別の局面は、患者由来の血液サンプルから、微生物増殖決定のために２以上のサンプルを調製する方法に関し、この方法は、以下を含む：サンプル内の第１血液成分の一部分が、水混和性高密度層の１以上を通り、第２血液成分の一部分は、水混和性高密度層の１以上に入らず、そしてサンプルからの微生物の一部分は、上記水混和性高密度層の１以上によって保持されるように、血液サンプルからの全血を含む液体を１以上の水混和性高密度層に通すこと；並びに微生物を含む水混和性高密度層の少なくとも一部分を、微生物増殖モニタリングのための第１サンプルとして収集すること；サンプルの残りを、微生物増殖モニタリングのための第２サンプルとして収集すること。１つの実施形態において、１つの実施形態において、微生物を含む高密度層の部分は、実質的に血液成分（微生物増殖の光散乱又は吸光度に基づく測定に干渉する）を含まない。１つの実施形態において、本方法は、収集より前に、サンプルの遠心分離を含む。１つの実施形態において、遠心分離１，０００×ｇ未満、１，０００×ｇ、１，５００×ｇ、又は２，０００×ｇの速度で行われる。１つの実施形態において、遠心分離は、３００～８００×ｇの間の速度で行われる。１つの実施形態において、微生物含有部分が、増殖測定のために収集される。１つの実施形態において、増殖測定は、光学的に行われる。１つの実施形態において、収集された高密度層の部分に含まれない全血を含む液体が、増殖測定のために収集される。１つの実施形態において、増殖測定は、熱量測定法によって行われる。

別の局面において、本開示は、本明細書中で開示される方法に従って調製される微生物播種物（ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）に関する。１つの実施形態において、血液サンプルは、樹脂と接触させられる。１つの実施形態において、血液サンプルは、容量で少なくとも約８ｍＬを含み、容器中に収集される。１つの実施形態において、血液サンプルは、栄養培地及び抗凝血剤と接触させられる。１つの実施形態において、血液サンプルは、哺乳動物細胞を選択的に溶解できる溶解薬剤と、接触させられる。１つの実施形態において、高密度水層は、高濃度の糖、塩、又はポリマーであり、ショ糖、セシウム、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、２以上の高密度水層が、互いに積層される。１つの実施形態において、複数の高密度水層は、上から下に向かって、高くなる密度を有する。１つの実施形態において、高密度水層は、栄養培地又は微生物増殖促進成分の１以上を含む。１つの実施形態において、高密度水層は、血液及び培地の容量と、およそ同じ、その半分、４分の１、５分の１、８分の１の容量である。１つの実施形態において、微生物は、増殖決定工程の始まる前に、高密度水層の一部分から分離される。１つの実施形態において、光学方法は、光散乱又は吸光度を含む。１つの実施形態において、熱量測定法は、等温型又は示差走査型の熱量測定法を含む。１つの実施形態において、溶解薬剤は、サポニンである。１つの実施形態において、抗凝血剤は、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）及びクエン酸塩の１以上である。１つの実施形態において、栄養培地は、トリプシン処理大豆ブロスである。１つの実施形態において、樹脂は磁気である。１つの実施形態において、樹脂は、固体支持体上に支持されている。１つの実施形態において、血液サンプルは、血液サンプルからの全血を含む液体を水混和性高密度層に通す工程より前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる。１つの実施形態において、遠心分離工程の完了後に、微生物は、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる。１つの実施形態において、上清／ペレット増殖測定は、高密度水層増殖測定と、およそ並行して行われる。１つの実施形態において、陽性増殖の決定後に、微生物同定及び／又は抗菌感受性試験及び／又は抗菌耐性決定が、行われる。１つの実施形態において、本方法は、自動化されている。

なお別の局面において、本開示は、血液サンプルから微生物播種物を調製するための方法に関し、この方法は、以下を含む：サンプル内の第１血液成分が、水混和性高密度層を通り、第２血液成分は、水混和性高密度層に入らず、そしてサンプルからの微生物は、上記水混和性高密度層によって保持されるように、血液サンプルからの全血を含む液体を水混和性高密度層に通すこと；並びに微生物を含む水混和性高密度層の少なくとも一部分を収集すること。１つの実施形態において、微生物を含む高密度層の部分は、実質的に血液成分（微生物増殖の光散乱又は吸光度に基づく測定に干渉する）を含まない。１つの実施形態において、血液サンプルからの全血を含む液体を水混和性高密度層に通す工程は、サンプルの遠心分離を含む。１つの実施形態において、遠心分離は、１，０００×ｇ未満、１，０００×ｇ、１，５００×ｇ、又は２，０００×ｇの速度で行われる。１つの実施形態において、遠心分離は、３００～８００×ｇの間の速度で行われる。１つの実施形態において、微生物含有部分は、増殖測定のために収集される。１つの実施形態において、増殖測定は、光学的に行われる。１つの実施形態において、収集された高密度層の部分に含まれない全血を含む液体が、増殖測定のために収集される。１つの実施形態において、増殖測定は、熱量測定法によって行われる。１つの実施形態において、血液サンプルは、樹脂に接触させられる。１つの実施形態において、血液サンプルは、容量で少なくとも約８ｍＬを含み、容器中に収集される。１つの実施形態において、血液サンプルは、栄養培地及び抗凝血剤と接触させられる。１つの実施形態において、血液サンプルは、哺乳動物細胞を選択的に溶解できる溶解薬剤と接触させられる。１つの実施形態において、高密度水層は、高濃度の糖、塩、又はポリマーであり、これらに限定されないが、ショ糖、セシウム、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅが挙げられる。１つの実施形態において、２以上の高密度水層が、互いに積層される。１つの実施形態において、複数の高密度水層は、上から下に向かって、高くなる密度を有する。１つの実施形態において、高密度水層は、栄養培地又は微生物増殖促進成分の１以上を含む。１つの実施形態において、高密度水層は、血液及び培地の容量と、およそ同じ、その半分、４分の１、５分の１、８分の１の容量である。１つの実施形態において、増殖決定工程の始まるより前に、微生物は、高密度水層の一部分から分離される。１つの実施形態において、光学方法は、光散乱又は吸光度を含む。１つの実施形態において、熱量測定法は、等温型又は示差走査型熱量測定法を含む。１つの実施形態において、溶解薬剤は、サポニンである。１つの実施形態において、抗凝血剤は、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）、クエン酸塩の１以上である。１つの実施形態において、栄養培地は、トリプシン処理大豆ブロスである。１つの実施形態において、樹脂は、磁気である。１つの実施形態において、樹脂は、固体支持体上に支持されている。１つの実施形態において、血液サンプルからの全血を含む液体を水混和性高密度層に通す工程より前に、血液サンプルは、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる。１つの実施形態において、微生物は、遠心分離工程の完了後、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる。１つの実施形態において、上清／ペレット増殖測定は、高密度水層増殖測定とおよそ並行して、行われる。１つの実施形態において、微生物同定及び／又は抗菌感受性試験及び／又は抗菌耐性決定は、陽性増殖の決定後に、行われる。１つの実施形態において、本方法は、自動化されている。

１つの局面において、本開示は、上述の方法に従って調製された微生物播種物に関する。

上記の列挙は、網羅的であるよりむしろ例示的であることを意図されており、当業者は、上で記載されていない他の局面及び実施形態が、本発明の範囲内であることを理解するであろう。

本開示に提示された図面は、限定よりもむしろ例示を意図される。他に示されない限り、図面は、必ずしも正確な縮尺ではない。

４０％、５０％又は６０％のショ糖高密度層を含むサンプル管を示し、微生物及び赤血球又はヘモグロビンの区分を説明する。 本開示の実施形態に従う遠心分離後の、サンプル管の上清、境界面、及び濾過層を示す。 ４０％、５０％又は６０％ショ糖高密度層を含む遠心分離されたサンプル管の層における微生物の百分率を図示する。 示された細菌種を播種された、遠心分離されたサンプル管を示し、細菌種及び血液成分の区分を図示する。 遠心分離時点の１時間、２時間及び２．５時間後の、微生物、全血又は溶解した血液を播種した、遠心分離されたサンプル管を示す。 本開示の実施形態に従う、遠心分離されたサンプル管。 実施例８で記載した、全血からの微生物播種物サンプル（Ｐ２）、処理した血液（Ｐ１）及びＴＳＢから測定された、熱流量を示す。 実施例８の通りに処理された陰性対照からの熱流量を示す。 実施例９に記載した通りに調製したサンプルの略図である。 血液中にスパイクされ、そして本明細書中で開示される溶解－遠心分離－液体培養方法後に処理された細菌の３つの種の、吸光度（ＯＤ６００）ベースの増殖決定を示す。 血液中にスパイクされ、そして本明細書中で開示される溶解－遠心分離－液体培養方法後に処理された細菌の３つの種の、吸光度（ＯＤ６００）ベースの増殖決定を示し、同じ３つのスパイクされたサンプルについてのＢＡＣＴＥＣ^（Ｒ）９０５０の時間対陽性度を、さらに示す。 本明細書中で記載される方法を実施可能な系の、コンピューター利用設計を示す。 血液中にスパイクされ、そして本明細書中で開示される溶解－遠心分離－液体培養物方法後に処理された細菌の３つの種の、蛍光ベースの増殖決定を、レサズリンを低減するその能力に基づいて示す。 サンプル中の細菌の数に対する血液サンプルの濃縮画分における、少なくとも１つの細菌を捕捉する可能性を、３つの異なる捕捉率にわたって、模式的に示す。 細菌がそれぞれ７５％及び５０％の割合の画分に区分された際の、濃縮画分中に所定の数の細菌を見出す可能性を示す。

詳細な説明
概要
本開示は、一般に、血液サンプル及び血液由来サンプルにおける微生物増殖の迅速検出に関する。本開示に従う特定の方法は、組み合わせても独立して使用されてもよい、２つのコンセプトに基づく。第１のコンセプトは、得られた血液サンプル又は血液由来サンプルを２つの成分に分けること、及びこれらの各成分を増殖についてモニタリングすることに関する。理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、１つの患者血液サンプル（およそ８～１０ｃｃの血液）が、２以上のサブサンプルに分けられてもよく、第１サブサンプルが他より早く増殖を検出し得、他方で第２サブサンプルが非常に少ない数の細菌が存在する増殖の検出に他よりも高い感受性を有し得るようなやり方で、その各々が類似の培地において培養されてもよいことを、見出した。ある種の患者、例えば小児科患者に由来する、より低容量の血液が、同様に処理され得ることに留意しなければならない。

第２コンセプト微生物増殖を決定するための、等温型熱量測定法の使用に関する。本開示の特定の実施形態に従い、等温型熱量測定法は、１以上の処理工程の後、例えば、元のサンプルの一部分のみが、熱量測定法によって微生物増殖について測定されるような、微生物を濃縮する工程の後で、微生物増殖を決定するために使用されてもよい。サンプルの残りは、１以上の異なる微生物増殖検出モダリティ、例えば、光学方法を用いるモニタリングのために、保持されてもよい。

第３のコンセプトは、患者血液サンプルの収集、及びこれらのサンプルがその収集の時点と処理され、そして増殖について調べられる時点との間に置かれる条件に、関する。今日の標準臨床実践は、収集されたサンプルを、処理され、そして微生物増殖開始についてモニタリングされる場所である、臨床実験室に届くまで室温又は周囲温度で維持することである。米国の病院における現在の実践において、これは、サンプルをインキュベートする間に増殖をモニタリングする血液培養機にサンプルをローディングすることによって、達成される。以下でより詳細に説明するように、本開示のいくつかの実施形態において、患者血液サンプルは、微生物増殖を支持する条件下で維持されてもよく、例えば、周囲温度よりも高い温度で、栄養又は栄養培地が添加されて、患者の血液内に存在し得る抗菌剤を吸収するか、又は不活性化する物質（例えば、樹脂）と共に、インキュベートなどされてもよい。これらのアプローチは、一般に、「事前インキュベーション」又は「事前処理」と呼ばれる。

微生物増殖を決定するより前に血液サンプルを濃縮する方法は、ＵＳ ５，０７０，０１４に記載されており、「溶解－遠心分離」技術として公知である。このアプローチは、微生物を濃縮し、選択的に哺乳動物細胞を溶解し、そして微生物増殖に毒性のある物質を取り除くので、急速な検出までの時間（ＴＴＤ）を提供するが、連続的モニタリング系よりも低い陽性的中率（ＰＰＶ）に悩まされる［Ｐｏｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（１９９５）：２５２５－２５２９］。

ＰＰＶを妥協することなく溶解－遠心分離技術によって得られる速度の恩恵を得るために、本発明者らは、遠心分離工程から得られたペレットのみならず、上清を保持することが、有用であると見出している。理論に縛られることを望まないが、初期の血液サンプル中に存在するより多くの微生物が得られることを確実にすること、及び同時に、初期サンプルの濃縮部分が迅速微生物検出のために評価されることを、この設計が助けると考えられる。

患者血液サンプル又は血液由来サンプルを分けることはまた、熱量測定法（収集した血液サンプルに対して直接行われてもよく、又は栄養培地、抗凝血剤、抗菌剤吸収樹脂、溶解成分を含む１以上の添加剤と共に行われてもよい）を行うために有利である場合がある。サンプルを熱量計へ入れるよりも前のサンプルからの微生物の濃縮は、微生物増殖検出までの時間を速めるため、並びに濃縮が、（ａ）調べられる微生物の数を最大化すること及び（ｂ）より少ない容量においてこれらの微生物を濃縮することを、容易にし得る程度に、技術的な制約を緩めるために、有益であり得る。また、より少ない容量はより容易に制御できるので、正確な等温型熱量測定法のための重要な前提条件である温度平衡のために必要な時間を有利に短縮させ得、並びに、熱量計設計に対する技術的制約を緩める。加えて、微生物増殖が検出される場合、より少ない容量は、下流の処理のために有益であり得る。

本発明者らはまた、抗凝血処理及び／又は哺乳動物細胞の選択的溶解が、微生物増殖の熱容量測定の検出において、独特に有益であることを見出している。全ての細菌及び酵母は発熱するように、赤血球は０．０１ｐＷ／細胞、血小板は０．０６ｐＷ／細胞、及び白血球は５ｐＷ／細胞で、血球及び血小板も発熱する［Ｂｉｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｂａｓｔｏｓ，Ｍ．，Ｅｄ．Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２０１６］。理論に縛られることを望まないが、血液又は血液由来サンプルにおける哺乳動物細胞は、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）などの抗凝血剤及び／又はサポニンなどの哺乳動物選択的溶解薬剤に使用を通して、選択的に阻害され得ると考えられる。以下でより詳細に説明するように、本明細書中で記載される溶解－遠心分離方法によって調製された血液サンプルは、熱容量測定によって試験された場合、負の熱流量を示す。理論に縛られることを望まないが、赤血球（ＲＢＣ）を含む哺乳動物細胞の溶解は、哺乳動物細胞膜のミセル形成（ある高い温度での吸熱過程）をもたらすと考えられる［Ｂｉｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｂａｓｔｏｓ，Ｍ．，Ｅｄ．Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２０１６］。このような負の熱流量の背景に逆らって、微生物増殖は、熱流量において何らかの正の傾向を示しやすいとされる。

以下でより詳細に説明するように、陽性血液培養アセスメントのための現在の標準は、ｐＨ又はＣＯ_２などの微生物増殖の代謝指示薬の連続的モニタリングである。例えば、蛍光クエンチングは、血液培養機器及び消耗品のＢａｃｔｅｃ^ＴＭシリーズにおいて実現する（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ ＭＤ）。連続的モニタリング系は、微生物代謝活性の増大を示す経時的な変化を検出するための、時系列測定に依存する。これらのアプローチは、その性質により、サンプルを、１以上の細菌の倍加を可能にするために充分な間隔にわたって測定することを必要とする。対照的に、本明細書中で記載される熱容量測定決定方法は、サンプル中の微生物の存在の非常に迅速な決定を可能にし得る。

迅速培養決定についての可能性の観点からみて、本開示の熱量測定法ベースの方法は、本明細書中で記載される事前インキュベーション方法によって、独特に補足されている。実験室処理及び測定より前の、収集した血液サンプルを室温で維持することの現在の臨床実践は、微生物シグナルを哺乳動物細胞のベースラインから識別するために、連続的モニタリング過程の間の対数増殖を達成することが望ましいことが、ある程度予測されている。サンプルをより低い温度に維持することは、微生物増殖の速度を低下させ、したがって、血液培養系に入る前に微生物が定常期に到達する危険性が低下する。対照的に、本明細書中で記載される「迅速読み取り」熱量測定法方法において、熱量計の中に入れられる場合、サンプル中に存在する微生物の数を最大化することにより、微生物の潜在的熱シグナルを最大化することが、大切である場合がある。したがって、微生物増殖に好ましい条件下での事前インキュベーションは、サンプルが熱量計内に入れられる時までに、正の熱流量の増殖の強さ及び速度の両方を増大し得る。このことは、次に、陽性結果を達成するため及び／又は偽陰性結果の危険を減らすために、必要な時間を短縮し得る。

本開示に従ういくつかの実施形態において、抗菌剤吸収樹脂が、溶解－遠心分離技術に含められる。

本開示の別の局面は、同じ患者からおよそ同じ時間に採取された異なる血液サンプルが、現在の標準のように異なる培地及び気体条件下でインキュベートされ得るのみならず、異なる方法で処理され、及び／又は微生物増殖について評価されてもよいという、観察に関する。例えば、好気性サンプルは、溶解－遠心分離によって処理された後に熱量測定法を行ってもよく、他方で、嫌気性サンプルは、溶解－遠心分離のみによって処理されるか、又は遠心分離による濃縮なしで処理されてもよい。

溶解－遠心分離及びサンプル又はサブサンプルの調製
当業者に公知であるように、抗凝血剤としてのポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）及び溶解薬剤としてのサポニンを用いて、溶解－遠心分離アプローチが全血サンプルに対して行われる場合、主に「サポニンゴースト（ｓａｐｏｎｉｎ ｇｈｏｓｔ）」（文献において名付けられる）からなるおよそ１．５～２ｍＬの容量のペレットが、得られる。この層の有効濃度は、１種の細菌（例えば、採取された１０ｃｃの血液中に１種の細菌しかいなかった場合）が層全体を通して沈殿し、管の底に到達する可能性を下げる。したがって、血液培養を行う際に、この層の少なくとも一部分を取り除く必要がある。

ＵＳ ３，９２８，１３９において、Ｄｏｒｎは、溶解－遠心分離手順の代替を記載し、現在公知であるように、これにおいて、微生物が、遠心分離の間に、サポニンゴーストペレットより下に区分されるより高密度の液体内に集められる。この液体は、細菌を保持するが多くの血球が入ることを妨げる、「液体フィルター」として有効に働く。ＵＳ ３，９２８，１３９における実施例は、中程度の細菌保持を示し、酵母又は真菌についての結果は示されず、このアプローチは商業化されていない。

本開示の実施形態は、血液溶解より前又は後のいずれかの遠心分離によって得られた多層区分の、各層から別個の培養物が調製され得るという、本発明者らの発見に基づく。液体の区分は、液体であっても、又は水より高い粘度及び／若しくは密度を有する半固体ゼラチン層であってもよい。１つの実施形態において、この層は、４０～６０％ショ糖及び０．５～５％ゼラチンを含む、熱感受性層である。熱反応性ゲルは、室温でゼラチン状であり、そして微生物に適合性である、約３５～４０℃のより高い温度を実質的に軽く超える温度で流体であるように、設計されてもよい。理論に縛られることを望まないが、この設計は、遠心分離後に区分液より上の層を除去する間、層間のよりはっきりした分離をもたらすために、有益であり得る。

５００～５，０００×ｇにて５～１２０分間の上述の層区分を含む、管における細菌含有血液サンプルの遠心分離は、層区分への微生物の百分率の区分をもたらす。しかし、この層は、血球の侵入を妨げるように設計されている。したがって、この方法により、遠心分離後、層区分は、微生物を含み、かつ血球の大部分を含まない。この層は、「赤血球（ＲＢＣ）－枯渇」層と呼ばれる。サンプルが、遠心分離の間にサポニンゴースト層に浸透するために充分な数の微生物を含むという条件で、最下層は、微生物を多く含み、かつ、これらの細胞から分離されていてもよい。

遠心分離後、多くのＲＢＣを含む層は、ＲＢＣ枯渇層の上に位置する。非常にわずかな微生物しか含まないサンプルについて、及び最も具体的には酵母又は真菌の場合、これらの細胞は、この「ＲＢＣ層」に位置し得る可能性が高い。

当業者に公知であるように、遠心分離後、さらに血漿層が、ＲＢＣ層の上に位置する。この層は、微生物を含まないはずであり、遠心分離後に捨てられる。

遠心分離の前又は後に、溶解試薬が、加えられてもよい。当業者に公知であるように、これらは、サポニン、ＳＰＳ、及び消泡剤として加えられるポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を、含んでもよい。

加えて、クッション液もまた、当業者に公知であるように、その後の培養において微生物保持率を最大化するために、含められてもよい。遠心分離の間、シリコーンオイル混合物が、多くのサポニンゴーストの下に区分され、そして細菌は、シリコーンオイルの中及び下に区分される。

本発明者らは、微生物保持並びにＲＢＣ保持に関して、層間の相違を観察し、急速な時間での陽性が、ＲＢＣ枯渇層及びＲＢＣ層の両方の個別の培養により、陽性サンプルの数を妥協することなく達成され得ることを発見した。比較的少量のＲＢＣを含むので、ＲＢＣ枯渇層は、微生物増殖の迅速同定を促進し得る。例えば、液体培養における増殖の検出のために光学方法が使用される場合、陽性の微生物増殖は、およそ１０^２～１０^５ＣＦＵ／ｍＬの数で同定され得る。しかし、同時に、ＲＢＣ枯渇層のみからの増殖を測定することは、ＲＢＣ枯渇層に区分されるために充分な微生物（又は十分な密度の微生物）を含まないこれらのサンプルについて、偽陰性をもたらし得る。本開示の実施形態は、ＲＢＣ枯渇層と並行して、微生物増殖についてＲＢＣに富んだ層を調べることによって、この危険に立ち向かう。理論に縛られることを望まないが、サンプルは非常に少ない微生物しか含まない場合、又はサンプル中の微生物が効率的にＲＢＣ枯渇層の区分されない場合、ＲＢＣ富化層が、サンプル中の全微生物の実質的な画分を含み得る。したがって、ＲＢＣ富化層の調査は、わずかな微生物しか含まないサンプルについての陽性増殖を検出することに関して、より高い感度を可能としなければならない。しかし、サンプル中の多数のＲＢＣにより、検出の限界が、例えば、およそ１０^６～１０^８ＣＦＵ／ｍＬまでに下がり得る。

種々の好適な方法が、層を区分するために使用され得る。ショ糖に加えて、水非混和性溶媒、例えば、シリコーンオイル若しくはフッ化炭素、水溶液又は溶媒が、使用され得る。これらとしては、重水又は１０％を超える糖の溶液、Ｆｉｃｏｌｌ、デキストラン、Ｐｅｒｃｏｌｌ、ｈｙｐａｑｕｅナトリウム（３，５－ジアセトアミド－２，４，６－トリヨード安息香酸ナトリウム塩）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

クッション液は、１．０８を超えるか、又は１．１を超える密度を有する、水混和性又は非混和性の液体又は溶液を含み得る。これらとしては、フッ化炭素、重水、及びシリコーンオイルが挙げられ得るが、これらに限定されない。

サンプル調製の上の開示は、血液培養に具体的に着目するが、本明細書中で記載される方法及び系は、非限定で、脳脊髄液及び他の無菌の体液を含む、種々のサンプル型及び任意の起源のサンプルに適用され得る。

サンプル調製及び吸着性物質
本開示の特定の実施形態において、全血は、抗凝血剤、例えば、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）；抗菌剤吸収樹脂；栄養培地；及び溶解薬剤、例えば、サポニンを含む、消耗容器に収集される。加えて、１以上の消泡物質、例えば、ポリプロピレングリコールが、含まれてもよい。消耗容器は、具体的に血液サンプルを採取するように設計されていてもよく、そしてさらに、当業者に公知であるように、微生物増殖を増強するために所定の気体比率を有してもよい。サポニンは、０．３０～０．２６％ｗ／ｖの範囲内の任意の濃度で存在し得る。

本開示の特定のサンプル調製方法は、抗菌化合物を吸収するように設計された樹脂を利用し、例えば、ＵＳ ４，１７４，２７７及びＵＳ ５，６２４，８１４に記載されるが、これらは、参照として本明細書中に完全に援用される。このような樹脂は、連続的モニタリング血液培養消耗調合物の標準成分であり、当業者に公知であるように、これらは、溶解薬剤、例えば、サポニンを、保存の間容易に吸収する。したがって、樹脂の抗菌剤吸収能を最大化するために、消耗容器への血液の添加より前に、サポニン及び１以上の他の消耗構成成分から単離されてもよい。加えて、遠心分離との適合性を最大化するために、樹脂は、固体支持体上に支持されていてもよく、又は磁気捕捉が可能であってもよい。

いくつかの実施形態において、水よりも高い密度を有する非水混和性クッション液が、使用されてもよい。これらは、ＵＳ ４，２１２，９４８に記載されており、本明細書中で全体が参照として援用される。ＵＳ ３，９２８，１３９に記載されるように、調整された粘度を有する水性液体が使用されてもよく、本明細書中で全体が参照として援用される。このような液体は、遠心分離の間及び／又はサンプル分離の間に生じる微生物を最大化するために、有用であり得る。

いくつかの実施形態において水よりも高い密度を有する水混和性の液体、例えば、水中に溶解したショ糖、セシウム塩、又はＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅが、時間を計った遠心分離を使用することによって微生物を血球から分離するために、使用されてもよい。物理的バリア又はフリットが、分離した密度層を保ちながら、遠心分離の間に侵入を可能にするために、使用されてもよい。当業者に公知であるように、より高密度の層の上に微生物を含む血液サンプルを積層することによって、時間を計った遠心分離が、白血球及び血小板よりも高いが赤血球とおよそ同等である密度を有する細菌を、これらの全てから分離するために使用され得る。具体的には、白血球及び血小板が高密度液体層に浸透することを防ぐために充分な遠心分離速度を選択すること、並びにより小さな細菌がより大きな赤血球よりも層をゆっくりと移動するという事実を利用すること、充分に長い高密度層の経路長を作ること、そして最下層で細菌が赤血球ペレットに集まる前に遠心分離を止めることにより、ほとんどの哺乳動物細胞を有さない細菌の部分を、高密度層に保持する。この過程は、溶解しない血液によって行われてもよく、又は、溶解した血液によって行われてもよく、その場合は、赤血球の部分の密度は細菌の密度よりも低いので、遠心分離速度は変更され得る。

いくつかの実施形態において、水混和性の、より高密度の液体は、１以上の栄養培地又は栄養培地の成分を、微生物増殖を促進するために含んでもよい。

１つの実施形態において、血液の消耗容器への導入の後、微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションが行われてもよい。代替的に、混合工程が、インキュベーションの始まる前及び／又は間に、行われてもよい。この工程は、任意の公知の方法によって行われてもよく、これらとしては、環状（ｏｒｂｉｔａｌ）又は回転式（ｒｏｔａｒｙ）振とう機による機械的振とう、機械的ローリング、又は磁気撹拌が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、樹脂は、磁気のものであってもよい。微生物増殖を促進する条件は、３１～３９℃の温度及び／又は混合を含んでもよい。インキュベーション及び／又は混合工程は、専用のインキュベーションデバイスにおいて行われてもよい。代替の実施形態において、サンプルは、遠心分離の前にインキュベートされる必要はない。

１つの実施形態において、サンプルは、次いで、濃縮工程に供される。遠心分離、濾過、フロキュレーション、磁気分離を含むがこれらに限定されない任意の濃縮方法が、使用され得る。血清分離管が、使用されてもよい。遠心分離は、差次的遠心分離を含んでもよい。１つの実施形態において、１０００×ｇより高いか、又は１０００～１０，０００×ｇでの遠心分離が、行われる。遠心分離の後、濃縮物は、上清から分離される。特定のペレットが形成されていない場合があるこの方法の目的のために、「濃縮物」は、上清分離後に残った容量に限定される。濃縮物容量は、熱量計セルの容量以下であるように設定されてもよい。詳細には、これは、６ｍＬ以下、４ｍＬ以下、２ｍＬ以下、１ｍＬ以下、０．５ｍＬ以下であってもよい。この方法の目的のために、「上清」は、全てのサンプル物質が濃縮物中に存在しないとして定義される。上清中の樹脂を保持するために、濾過又は選択的吸引が、使用されてもよい。代替的に、磁気樹脂を保持するために、磁石が使用されてもよい。代替的に、樹脂は、濃縮物中に存在してもよい。

サブサンプルの分離ワークフロー
本開示の実施形態は、微生物について血液サンプルを調べる方法に関する。これらの方法は、一般に、サンプルを微生物の第１及び第２濃縮物を含む第１及び第２サブサンプルに分離し、そして異なる時間間隔にわたって、第１及び第２サブサンプルを微生物増殖についてモニタリングすること及び／又は異なる感度の検出手段を用いることを、含んでもよい。

いくつかの実施形態において、第１サブサンプルは、５日間までモニタリングされてもよく、そして第２サブサンプルは、５日間よりも短い間モニタリングされる。サンプルは、ペレットと上清とに分離され得る。少なくとも１つのサブサンプルは、等温型熱量測定法を用いてモニタリングされ得る。この時間間隔の後で増殖が検出されない場合、サブサンプルは、別のモニタリング方法によってモニタリングされてもよく、任意に、このサブサンプルは、全部で５日間にわたってモニタリングされるまでモニタリングされてもよい。本方法は、サンプル、第１サブサンプル、又は第２サブサンプルの少なくとも１つを、抗菌剤を吸収できる樹脂と接触させることを、さらに含んでもよい。サンプルは、少なくとも８ｍＬを含み得る。

上で議論した通り、サブサンプル調製は、以下の工程の１以上を含み得る：血液サンプルを、抗菌剤を吸収することができる樹脂と接触させること；１以上の濃縮工程を行い、微生物を、ａ）ペレット及びｂ）残りの上清に濃縮すること；ペレットの少なくとも一部分を含むか、又はそれに由来するサブサンプルを、等温型熱量計に入れること；サブサンプルからの熱流量を測定すること；絶対又は相対シグナルに基づき、陽性微生物増殖を測定すること；及び濃縮工程後に、上清の一部分を「バックアップ」又は第２サブサンプルに保持し、これもまた、任意に等温型熱量測定法とは異なる（例えば、より感度の低い）方法を用いて増殖についてモニタリングされ、及び／又は第２サブサンプルは、第１サブサンプルの時間間隔とは異なる時間間隔にわたってモニタリングされること。

最初に血液サンプルについて述べると、本明細書中別所で議論されるように、血液サンプルは、容量で少なくとも約８ｍＬを含んでもよく、容器中に収集される。血液サンプルは、哺乳動物細胞を選択的に溶解できる栄養培地、抗凝血剤、及び溶解薬剤と接触させられてもよい。

第１サブサンプルは、ペレットの全て又は一部分を取り込んでもよく、第１サブサンプルの容量は、約０．５、０．７、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＬであってもよい。これらの比較的低いサンプル容量は、等温型熱量計における使用によく適合しており、これは、３１～４０℃で安定して維持され得る。いくつかの実施形態において、熱量計において、（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６日間以上の固定間隔の間）増殖が測定されなかった場合、サンプルは、熱量計から取り出され、そして１以上の第２次増殖決定系に移されてもよい。

第２次増殖決定系は、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法を含んでもよく、そして、一般に（必ずしもではないが）、熱量測定法以外の技術を組み込む。

保持された上清及びペレットの残りは、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法を含む任意の好適な手段により、増殖についてモニタリングされ得る。しかし、ペレットを含む第１サブサンプルを調べるために使用した方法よりも、より感度が低いか、サンプル当たりの費用が安いか、及び／又はより資源制約が低い、増殖検出技術を用いることが望ましい場合がある。

同じ患者から採取された少なくとも１つのサンプルは、直接的ｐＨ、気体、又は光学方法と並行して、微生物増殖について測定されてもよい。上で議論した通り、このサンプルは、非限定で、溶解薬剤（例えば、サポニン）；ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）などの抗凝血剤及び／又はクエン酸塩を用いることを含む、任意の好適なやり方で、調製されてもよい。

使用される場合、吸着性樹脂は、サンプル調製のための、特別な懸念が挙げられる。これらの中で、本特許の血液サンプル中の何らかの全身投与された抗菌剤の効率的除去（例えば、サンプル中の微生物の低減を避けるため）とサンプル又はサブサンプルからの樹脂の全て又は実質的に全ての除去の必要性（例えば、下流表現型ＡＳＴアッセイにおける混乱した結果を避けるため）とのバランスをとる必要がある。したがって、特定の実施形態において、樹脂は、血液サンプルの容器への添加より前に、容器中の液体試薬から単離されてもよい。代替的に又は加えて、溶解薬剤（例えば、サポニン）は、血液サンプルの容器への添加より前に、樹脂、栄養培地、及び抗凝血剤から単離されてもよい。いくらかの又は全ての抗菌剤吸収樹脂が、血液サンプルの添加より前に、抗凝血剤及び／又は栄養培地から単離されてもよい。容器は、静脈ＩＶに標準的な接続部品で接続する場合に血液サンプルが容器を満たすような陰圧下にあってもよい。容器中の混合気体が、好気性微生物増殖のために最適化されてもよい。栄養培地は、トリプシン処理大豆ブロスであってもよい。樹脂は、磁気のものであってもよい。樹脂は、固体支持体上に支持されていてもよい。血液サンプルは、濃縮工程より前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされてもよい。濃縮工程より前の増殖は、濃縮工程が行われるやり方とは異なって行われてもよい。濃縮工程より前の増殖は、携帯用系において行われてもよい。ペレットは、濃縮工程の後でかつ熱量計内への導入より前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされてもよい。濃縮工程は、遠心分離、濾過、フロキュレーション、又は磁気分離によって行われてもよい。遠心分離は、１，０００×ｇ～５０，０００×ｇ又は１，０００×ｇ～１０，０００×ｇの速度で行われてもよい。熱量計に入れられたペレットは、容量で２０ｍＬ、１０ｍＬ、８ｍＬ、６ｍＬ、４ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬ、０．５ｍＬであってもよい。熱量計内へのサンプルの導入より前に、新鮮な栄養培地及び／又はアガーが、サンプル中に入れられてもよい。濃縮後、ペレットが、血液サンプルが収集された容器から取り出されて、第２容器に移されてもよい。等温型又は示差走査型の熱量測定法が、微生物増殖を決定するために行われてもよい。等温型熱量測定法が、行われてもよい。

熱量測定法による、微生物増殖の迅速アセスメント
上で議論した通り、本開示に従ういくつかの方法は、等温型又は示差走査型の熱量測定法を、微生物増殖の迅速検出のための感受性の高い手段として使用する。陽性増殖は、試験下のサンプルからの絶対及び／又は相対熱流量に基づいて決定され得る。陽性増殖を決定するための熱流量の方法は、サンプルごとに異なっていてもよい。濃縮工程より前に２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間の閾値を超える増殖期を有するサンプルは、この閾値より低い増殖期を有するサンプルとは異なる熱流量決定の方法を有し得る。サンプルは、処理準備の際に、熱量計内にローディングされてもよい。サンプルは、熱量計内へのローディングより前に、バッチ分けされてもよい。陽性増殖を記録するサンプルは、サンプルベースで熱量計から取り出されてもよい。陽性増殖を記録するサンプルは、バッチベースで熱量計から取り出されてもよい。サンプルの取り出し後の第２次増殖決定は、熱量計におけるインキュベーションの２～４８、２～２４、又は２～１２時間後に行われてもよい。熱量計及び第２次増殖方法におけるインキュベーション時間は、合わせて約５日間であってもよい。濃縮後のサンプルの上清は、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされてもよい。上清は、光学吸光度、光学分光法、光学顕微鏡検査、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、又は電気測定の少なくとも１つを用いて、微生物増殖について測定されてもよい。上清増殖測定は、濃縮サンプル増殖測定とおよそ並行して行われてもよい。濃縮サンプル及び上清サンプルの１以上からの増殖測定の結果は、ユーザーに返されてもよい。微生物同定及び／又は抗菌感受性試験及び／又は抗菌耐性決定は、陽性増殖の決定の後に行われてもよい。クッション液は、多くの真核細胞及び原核細胞よりも高い密度を有する水混和性又は水非混和性の液体又は溶液として定義され、濃縮工程より前に容器に添加されてもよい。クッション液は、濃縮工程より前に直接添加されてもよい。クッション液は、血液サンプルと同時に容器に添加されてもよい。クッション液は、血液サンプルが入れられた容器に含まれてもよい。本方法は、自動化されてもよい。

特定の実施形態に従い、微生物を含むことが疑われる血液サンプルを培養するための方法は、抗菌剤を吸収することができる樹脂と血液サンプルを接触させること、少なくとも１つの濃縮工程を行って、残りの上清から分離したペレット中に微生物を濃縮すること、インキュベーションの間、微生物増殖についてペレットを測定すること、並びに濃縮工程後に、上清の一部分及び何らかペレットの残りを、「バックアップ」サンプルにおいて保持することを、含んでもよい。

いくつかの実施形態において、微生物を含むことが疑われる血液サンプルを培養する方法は、抗菌剤を吸収することができる樹脂と血液サンプルを接触させること、サンプルの一部分を等温型熱量計内に入れること、サンプルからの熱流量を測定して、絶対又は相対シグナルに基づき陽性微生物増殖を決定すること、並びに増殖が測定されなかった場合、サンプルを熱量計から取り出して、このサンプルを第２次増殖決定系の少なくとも１つに移すことを、含んでもよい。

代替的に、又は加えて、ヒト起源のサンプルにおいて微生物増殖を決定するための自動化方法は、遠心分離より前に、器に以下の成分：ヒト起源のサンプル（例えば、血液、脳脊髄液、滑液、複数の液体（ｐｌｕｒａｌ ｆｌｕｉｄ）、心膜液）；真核細胞を溶解できる１以上の成分；１以上のバリア液（溶解した血球の下に区分され；バリア液が形成する層に多くの溶解した血球が入れず；かつ、遠心分離の間にバリア液が形成する層に入り得る微生物を遠心分離の間に区分するような、密度及び／又は粘度を有する水混和性又は水非混和性の液体又は溶液として定義される）；任意に、クッション液（多くの真核細胞及び原核細胞よりも高い密度を有する水混和性又は水非混和性の液体又は溶液として定義される）；任意に、１以上の抗凝血剤；並びに任意に、１以上の消泡成分を、ヒト起源のサンプルを含む収集管に入れることを含んでもよい。本方法はさらに、この混合物を、微生物がバリア液に入れるようにするために好適な条件下で遠心分離すること、血球層を取り出して、これを、微生物増殖を支持することができる栄養培地中に入れて、微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションの間の微生物増殖を決定するために１以上の別個の又は連続的なモニタリング方法を行うこと、並びに遠心分離された器の中に残った多くの微生物を、微生物増殖を支持することができる栄養培地に移し、微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションの間の微生物増殖を決定するために１以上の別個の又は連続的なモニタリング方法を行うことを、含んでもよい。

特定の実施形態において、ヒト起源のサンプルにおいて微生物増殖を決定するための自動化方法は、血液サンプル又は処理した血液サンプルを液体又は半固体の濾過層を含む器に入れ、微生物が濾過層に入れるようにするが多くの血球を濾過層に入ることを妨げるために好適な条件下でこの混合物を遠心分離し、濾過層より上の血球を含む層を取り出して微生物増殖を支持することができる栄養培地中に入れ、微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションの間の微生物増殖を決定するために１以上の別個の又は連続的なモニタリング方法を行うこと、並びに遠心分離された器の中に存在する多くの微生物を、微生物増殖を支持することができる栄養培地中に入れ、そして微生物増殖を促進する条件下でのインキュベーションの間の微生物増殖を決定するために１以上の別個の又は連続的なモニタリング方法を行うことを、含んでもよい。

富化サンプル画分及び枯渇サンプル画分の保持
例えば、ＵＳ ５，０７０，０１４に記載されるような、溶解－遠心分離のための現在の実験室標準は、遠心分離後にペレット化した物質のみを保持し、元の血液サンプル由来の微生物を潜在的に捨てていることを、当業者は理解するであろう。このことは、連続的モニタリング系（Ｐｏｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．）と比較して陽性率を低下させ、それにより、溶解－遠心分離技術が、１９９０年代半ばにおいて連続的モニタリング系によって置き換えられる一因となった。

溶解－遠心分離陽性率の低さの原因をよりよく理解するために、表１～２におけるデータは、溶解－遠心分離技術を行った後の管の各容量画分における微生物の数を示す。これらのデータは、微生物の大部分がペレットの中に濃縮されるが、有意な割合が上清中に残り、したがって、元の溶解－遠心分離手順の後で捨てられていたことを実証する。さらに、より希釈されたサンプルについては、捨てられた割合がより多く、これは、栄養培地への希釈は最適な増殖のために重要であるので、収集の時点から微生物増殖が行われている場合に、より不都合である。

まず表１に目を向けると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とともに播種した１０ｍＬの溶解した血液のサンプルを、溶解－遠心分離技術に従って遠心分離した。上清の容量を取り出し、そしてＴＳＢ中で一晩インキュベートして細菌の存在を明らかにするか、又は血液アガープレート上に播いて３５℃で一晩インキュベートした。ＴＳＢ中の細菌増殖又は個々のＣＦＵを計数し、そして記録した。１つの管あたりの回収された総ＣＦＵから、百分率を計算した。表における画分は、ｍＬにおける容量を表し、サンプルの頂上すなわちメニスカスからはじまって下へ降りる。例えば、画分１～５は、上清の最初の５ｍＬを含み、画分６は、次の１ｍＬを含む、などであった。ペレットは、ペレット化した物質をいい、実質的に全ての液相を除く。ＣＦＵ合計は、全ての画分にまたがって観察されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数を表す。

表２は、大腸菌と共に播種された１０ｍｌの溶解した血液のサンプルからのデータを、４０ｍＬのＴＳＢと合わせてまとめる。溶解－遠心分離技術に従って、サンプルを遠心分離した。１０ｍＬ及び１ｍＬの容量の上清を取り出し、そして再び遠心分離して、細菌をペレット化した。容量を、血液アガープレート上に播き、３５℃で一晩インキュベートした。ＣＦＵを計数し、そして記録した。１つの管あたりの回収された総ＣＦＵから、百分率を計算した。

上清中の微生物の存在は、初期サンプル中に非常にわずかな微生物しか存在しない場合に、成績に対して最も不都合となり得る。例えば、１０ｍＬの採取したサンプル中に１つの微生物しか存在しない場合、当業者にはよく見受けられることとして知られるが、微生物がペレット化しない可能性がかなり高い。ペレット又は濃縮物に加えて上清が培養される本開示の実施形態は、非常に低い濃度であってさえ、微生物がサンプルから回収される可能性を、有利に増大させる。例えば、理論に縛られることを望まないが、図１４ａは、血液サンプルの濃縮画分中の少なくとも１つの細菌を捕捉する可能性を、３つの異なる捕捉率にわたるサンプル中の細菌の数に対して図示する。サンプル中の７５％の細菌がペレット中に区分される場合、サンプル中に２又は３の細菌がいるとしても、ペレットが少なくとも１つの細菌を含む確率が比較的高い。しかし、より非効率的に、例えば、５０％又は２５％の割合で、細菌がペレット中に区分される場合、少なくとも１つの細菌がペレット中に捕捉される可能性は比例して低くなり、偽陰性結果の発生の可能性が高くなる。同様に、図１４ｂは、細菌が７５％及び５０％の割合でこの画分に区分される場合に、濃縮画分中に所定の数の細菌を見出す蓋然性をプロットし、所定の百分率の微生物が濃縮画分中に捕捉される可能性が、区分する割合におけるごくわずかな低下によって有意に影響されることを説明する。

わずかな微生物を有するサンプルの偽陰性の可能性に対処するため、本開示のサンプル調製実施形態は様々であり、現在の技術標準の通りに処分するよりもむしろ解析のために非濃縮画分を保持するか、及び／又はサンプル調製の前に微生物増殖を促進する条件に臨床サンプルを曝し、サンプル中の微生物の複製の数を選択的に増加させて濃縮画分中に捕捉される微生物の可能性を上げる。

本開示の種々の実施形態に従い、血液サンプル又は血液由来サンプルは、微生物富化画分と微生物枯渇画分とに分離される。単純にいうと、これらの画分は、典型的に、それぞれ「ペレット」及び「上清」と呼ばれる。この用語は、このような分離を達成するために遠心分離が好適であることを反映するが、分離はまた、濾過、アフィニティ捕捉、サイズ排除法、及びやはり本開示の範囲内である他の方法を用いて達成することもできることを、当業者は理解するであろう。したがって、ペレット、濃縮物、富化画分又は富化部分などの用語は、血液サンプル又は血液由来サンプルの濃縮画分をいうために、相互交換可能に使用され得、他方で、上清、枯渇画分、などの用語は、血液サンプル又は血液由来サンプルの枯渇画分をいうために、相互交換可能に使用され得る。

濃縮物（これに追加の増殖培地が添加されてもよい）は、次いで、熱量測定法による微生物増殖決定に供されてもよい。図７におけるデータは、熱量測定法ベースの微生物増殖検出より前の濃縮のみと比較した、サポニン溶解及び濃縮の利点を実証する。濃縮工程並びに溶解工程を行うことの重要性は、表３におけるデータにおいて、さらに実証される。敗血症患者由来の血液サンプルは、典型的に、１～１０ＣＦＵ／ｍＬの微生物を含むが、１０ｍＬあたり１ＣＦＵの少なさで存在する場合もある。敗血症の経験的症候を示す患者は、典型的に、標準治療によって、血液を採取した後直ちに、薬効範囲の広いグラム陽性薬剤及びグラム陰性薬剤を与えられ、そして薬効範囲の広い薬剤は、典型的に、８時間投薬周期で静脈内投与されるため、８時間ごとに治療を変える機会がある。当業者に公知であるように、実験室から臨床階へ結果を移動させるためには時間が必要であり、したがって、薬効範囲の広い治療を変えるための診断試験結果のために、およそ８時間のウィンドウが存在する。

表３におけるデータは、溶解－遠心分離処理と組み合わせた熱量測定法が、熱量測定法による最大のＴＴＤ（培地のみのものに近い）を達成するために有益であることを実証する。これらのデータは、典型的な１０ＣＦＵ／ｍＬの血液サンプルについて、１０～２０倍の濃縮のサンプルが、経験的治療を変えるための時間枠内に結果を提供するために、重要であることを、さらに実証する。これらのデータは、熱量測定法が、種々の病原性微生物からの増殖を検出することができ、熱量測定法は、標準ＯＤ６６０測定のものより高いか、又は同等である感度のレベルを提供し得る（ＴＴＤによって証明される）ことを示唆する。

１つの実施形態において、濃縮物の少なくとも一部分、典型的には緩いペレットが、別の容器に移され、これは次いで、熱量計内に入れられてもよい。この第２容器は、新鮮な栄養培地及び／又はアガーを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、濃縮サンプルは、光学技術、例えば、光散乱又は吸光度によって、微生物増殖について試験されてもよい。

サンプルは、ランダムアクセスベースで熱量計内にローディングされてもよく、又は別個の時間間隔でのローディングのためにバッチ分けされてもよい。そのような時間間隔は。１、２、３、４、５、６、７、又は８時間ごとであってもよい。１つの実施形態において、熱量計内のサンプルは、微生物増殖を促進する条件下で、３１～３９℃の間で、等温でインキュベートされてもよい。代替の実施形態において、示差走査型熱量測定法は、２０～４０℃の範囲内で使用され得る。サンプル混合もまた、当業者に公知であるように、機械的に行われてもよい。代替の実施形態において、熱量計に入れられたサンプルは、栄養アガーの存在を有してもよく、それにより、固相増殖が起こり得る。代替の実施形態において、熱量計に入れられたサンプルは、栄養アガーの存在並びに栄養ブロスを有してもよく、それにより、微生物は、固相又は液相の両方で増殖し得る。

代替の実施形態において、濃縮サンプルは、熱量計内に入れられるより前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされてもよい。

１つの実施形態において、熱量計における微生物増殖のための試験下のサンプルは、標準臨床実線において血液培養物「陰性」を決定するために、５日間未満の期間にわたり、熱量計内に留まり得る。取り出されたサンプルは、光学、ｐＨ、気体又は電気的などの、１以上のさらなる増殖決定メカニズムに移されてもよい。この方法において、熱量計における空間は、保存され、そして迅速結果のために利用されてもよいが、ゆっくりと増殖するサンプルは、より低コストな方法を用いて測定されてもよい。

１つの実施形態において、微生物増殖が検出される濃縮サンプルは、陽性増殖決定の直後に熱量計から取り出されてもよく、又はサンプルバッチ分け目的のために、所定の期間にわたり熱量計内でインキュベートを続けてもよい。陽性増殖決定は、絶対又は相対熱流量に基づいてもよい。表３におけるデータは、ピーク熱流量と比較した１０％の相対熱流量及びベースラインの上の百分率として表された相対値に基づいて、陽性増殖を決定するための相対ＴＴＤを示す。熱量計に入れるより前に最小限の増殖が起きている場合、ベースラインより上の相対熱流量に基づく陽性増殖の決定は、有益であり得る。熱量計に入れるより前にサンプルがインキュベーションを受けている場合、所定の閾値が使用されてもよい。これらの検出方法論は、どれであろうと最初に満たされる閾値によって陽性増殖が記録されるように、並行して使用されてもよい。

現在のｐＨベースの系の主な欠点は、連続的に変化するｐＨゆえに、安定したベースラインを規定できないことであり、これは、系に入れるより前のサンプルインキュベーションを妨げる。溶解－遠心分離後の熱量測定法の重要な利点は、微生物増殖に対する所定の閾値より上の熱流量に帰する能力として規定される、安定したベースラインである。これは、非微生物含有サンプルが正の熱流量を記録しないことを示す、図８において説明される。

本開示の特定の実施形態はまた、段階的解析ワークフローを取り込み、ここで、標準臨床実線において血液培養物「陰性」を決定するために、熱量計における微生物増殖についての試験下のサンプルが５日間未満の期間にわたって熱量計内に留まり得る。取り出されたサンプルは、光学、ｐＨ、気体又は電気的などの、１以上のさらなる増殖決定メカニズムに移されてもよい。この方法において、熱量計における空間は、保存され、そして迅速結果のために利用されてもよいが、ゆっくりと増殖するサンプルは、より低コストな方法を用いて測定されてもよい。１つの実施形態において、微生物増殖が検出されない濃縮サンプルの場合について、サンプルは、一定時間の後に熱量計から取り出されてもよく、これは、２～４８時間の間又は２～１２時間の間であってもよい。次いで、サンプルは、異なる方法により、微生物増殖のために別個に測定されてもよい。この方法は、微生物増殖を検出する任意の公知の方法であってもよく、光学吸光度、光学光散乱、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、インピーダンス測定などが挙げられるが、これらに限定されない。この設計は、サンプル空間を熱量計内に保存するために、有益であり得る。１つの実施形態において、この第２次増殖決定方法によるベースライン測定は、濃縮サンプルの熱量計内への導入より前に行われる。

１つの実施形態において、熱量測定法によって測定される濃縮物と並行して、上清が、異なる方法により微生物増殖について別個に測定され得る。この方法は、微生物増殖を検出するための任意の公知のものであってもよく、光学吸光度、光学光散乱、ｐＨ測定、気体測定、質量測定、インピーダンス測定などが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、この上清増殖決定方法は、濃縮サンプルについての第２次増殖決定方法と同じである。１つの実施形態において、上清増殖決定方法のためのベースラインは、濃縮工程より前に行われる。

小児科患者又は患者から得られ得る血液がより少ない容量である他の場合について、上で記載されたものと同様の方法が行われてもよいが、上清含有サンプルは、より低い容量を有し得る。

いくつかの実施形態において、光学検出の１以上の方法（例えば、吸光度、透過率及び光散乱）を、微生物増殖を決定するために用いることが、好ましい場合がある。いくつかの実施形態において、これらの検出方法論は、熱量測定法と並行して使用されても、又はその代わりに使用されてもよい。いくつかの実施形態において、検出より前の分離工程は、多くの哺乳動物細胞を取り出すように設計されていてもよい。これは、光学検出についての検出の下限（より高い感度）及び選択的哺乳動物細胞溶解工程によって提供されたベースラインと類似した、熱量測定法についてのより安定したベースラインを達成するために、有益であり得る。これらの場合、分離工程を行う前に必ずしも細胞を溶解しなくてもよく、したがって、選択的哺乳動物細胞溶解工程を行わないことが好ましい場合がある。哺乳動物細胞から微生物をより完全に分離するために、水より高い密度を有する１以上の液体層が、使用されてもよい。

Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ層の上への血液サンプルの積層の後の、遠心分離から得られる分離の例示的な説明が、図９に示される。溶解していない血液サンプルがＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ又は類似の層の上に積層されている遠心分離の後、多くのより密度の低い哺乳動物細胞、例えば、血小板及び白血球が、この層の上に残るが、より密度の高い赤血球はペレット化する。微生物が存在する場合、遠心分離時間は、密度の濃い液体層において懸濁されたままになっているように設定されてもよく、それによって、その一部分が、多くの哺乳動物細胞から分離されることを可能にする。いくつかの微生物は沈殿し得るが、他はＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅ層の上に捕らわれ得るため、得られた赤血球ペレット及び培地／血漿／白血球層が、合わせられて、微生物増殖検出についての「バックアップ」サンプルを形成してもよい。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅ層における微生物は、微生物増殖を決定するための光学検出及び／又は熱量測定法の始まりより前に、例えば、希釈及び／又はその後の遠心分離によって、多くのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅから取り出されてもよい。

代替の実施形態において、異なる密度を有する２以上のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅ層又は類似の層が、互いの上に積層されていてもよい。遠心分離の間に微生物が容易に沈殿して通り抜けることができる上層及び遠心分離の間にその沈殿がゆっくりになる下層を選択することにより、微生物は、好ましくは、遠心分離後に層と層との間の境界面に位置してもよい。これは、上層を通って容易に沈殿できない哺乳動物細胞から微生物を単離するために、有益であり得る。

サンプル収集及び操作
ＵＳ ５，６２４，８１４に記載されるようなプラットフォームを用いる血液培養物の連続的モニタリングは、現在の最先端の臨床微生物学実験室を代表する。ＵＳ ４，１６４，４４９に記載されるＷａｍｐｏｌｅ Ｉｓｏｌａｔｏｒ^（Ｒ）（Ａｌｅｒｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）などのこれらのプラットフォームは、再現性及びヒューマンユーザビリティゆえに、溶解－遠心分離技術よりも好まれている。詳細には、溶解－遠心分離技術に必要な複数の手技工程が、非常に望ましくない夾雑物混入及びユーザー間の変動をもたらした。

しかし、連続的モニタリング血液培養系は、結果を遅らせ得る３つの潜在的な欠点によって特徴づけられる。第１に、これらの系は、細菌が、細菌増殖を阻害し得る血液由来の因子、例えば、白血球及び血小板、カチオン性ペプチド並びに静脈内抗生物質の存在下で増殖することを必要とする。第２に、主要な系によって使用されるＣＯ_２ベースの検出メカニズムゆえに、多くの場合、１０^７～１０^８ＣＦＵ／ｍＬの細菌レベルに到達するまで、陽性の結果は得られない。第３に、連続的モニタリングが必要とされるので、中央臨床実験室から地理的に隔離されたボトルが収集され得る場所である整理された健康管理系において、このボトルが中央実験室の連続的モニタリングプラットフォームに入れられるまで、そのインキュベーションは開始できない。したがって、待機時間及び輸送時間が浪費され得、微生物増殖に好適な条件に保たれる系に一旦サンプルが入ってからのみ、微生物増殖が起こり得る。

本開示の実施形態は、陽性になるまでの時間を速めた血液培養を行うための、複数の新規なアプローチに関する。本開示の方法はさらに、収集の場所でインキュベーションを開始すること及び中央実験室におけるサンプル到着より前の待機時間及び輸送時間の間に進めることを可能にする。

本明細書中で提示されるいくつかの実施形態は、溶解－遠心分離技術によってサンプルから作られたペレットが、その後、その後何ら洗浄又はクッション液の除去なしで、１つの液体培地又は固体培地に移されて、非定量的増殖について観察され得ることの、知見に基づく。これらの知見は、３つの主要な見地において文献の教示と対立するがゆえに、驚くべきことである。第１に、Ｄｏｒｎがサポニンを解毒するための方法（ＵＳ ３，８８３，４２５に開示される）の開発の後に溶解－遠心分離方法を導入したＵＳ ３，９２８，１３９及びＵＳ ４，１４１，５１２は、この方法の２つの主要な目的が、（１）定量的培養を達成すること（２）複数の異なる固体栄養アガー上で１つの採取した血液を培養することであると教示している。第２に、ＵＳ ４，１４１，５１２は、最大の細菌保持を達成するために重要なクッション薬剤が、固相栄養アガー培養の間に蒸発し得るように選択されるべきであると教示している。第３に、ＵＳ ５，０７０，０１４は、溶解－遠心分離技術のための有効な溶解及び分離に必要な成分である、サポニン及びポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）が、遠心分離の後に希釈しなくてはならないほどに、存在する濃度で微生物増殖のために充分に毒性であることを教示している。結果として、ＵＳ ５，０７０，０１４は、溶解－遠心分離処理後に固相培養がなくてはならず、溶解成分をより完全に希釈するために、標準的な３インチのシャーレよりもむしろ６インチのシャーレを用いるべきであると教示している。

本明細書中別所でより詳細に議論するように、抗菌剤吸収樹脂は、血液サンプルが収集され、そして溶解薬剤が任意に存在する器の中に、含められてもよい。結果までの時間を最小化するという文脈からみると、このような樹脂を含めることは、サンプルの臨床実験室への輸送の遅延ゆえにサンプル収集とサンプル処理との間の時間は変動し得、そして抗菌剤が微生物上に存在し得る悪影響を吸収性樹脂の存在は排除し得るので、特に有益であり得る。この遅延は、サテライト病院が中央実験室のための収集場所として機能する場合に、悪化し得る。

本開示の特定の実施形態に従い、微生物増殖を増強する栄養（例えば、増殖培地）が、任意に存在する溶解薬剤及び／又は吸着性樹脂と共に、血液サンプル収集物に含められてもよい。この方法において、微生物増殖は、実験室処理より前（例えば、サンプル処理における遠心分離工程より前）に、達成されてもよい。増殖はさらに、サンプル収集と実験室への到着との間の間隔の全て又は一部の間（例えば、サンプル輸送の間）で、微生物増殖を促進することが当業者に公知である条件（例えば、３３～４０℃の温度及び／又は撹拌）下でのサンプルインキュベーションを通して、容易にされてもよい。サンプルがこれらの条件下で保たれる場合、遠心分離より前に、１以上の溶解成分が、加えられてもよく、及び／又は器における濃度を上昇されてもよい。このような増殖は、遠心分離より前にサンプル中に存在する微生物の数の増大のために有益であり得、そして、サンプル輸送の間、特に中央化ハブアンドスポークネットワーク設計の場合において、増殖を可能にするために、さらに有益であり得る。

ここで、本発明者らは、溶解－遠心分離技術の使用後であり任意にクッション液を含まない、ペレット化した微生物が、何ら追加の希釈工程なしで又は１以上の洗浄工程ありで、液体栄養培地中で直接培養されてもよいことを示す（図１０）。さらに、本発明者らは、吸光度、比濁分析、蛍光、発光の１以上を含むがこれらに限定されない光学検出技術が、これらの液体培養物から微生物増殖を検出するために、使用されてもよいことを示す（図１０）。本発明者らは、さらに、微生物増殖を決定するための方法として使用されてもよいことを開示する。まとめると、これらのアプローチは、連続的血液培養モニタリング系で可能であるよりも陽性までの時間がより速い、増殖同定を提供し得る（図１１）。これらのアプローチはさらに、サンプルインキュベーションが、溶解－遠心分離処理に直接、収集の場所において開始することを可能にし得る。このことは、例えば、検出限界ゆえに、ボトルが機器内にとどまっている間に多くのインキュベーションが起こらなくてはならず、遠隔的に収集されたサンプルのインキュベーションを開始する前に長い待機時間を潜在的に必要とする、ＵＳ ５，６２４，８１４などの、現在の連続的モニタリング系とは対照的である。これらの制限は、これらの機器において使用される検出の性質に起因する。血球からの細菌によって生成されるＣＯ_２／酸性化を識別するために、機器は、ＣＯ_２／酸性化の第２誘導体についてスキャンし、ベースラインの上の勾配における増大が存在することを観察する。このことは、血球ベースラインのものを支配する、細菌ＣＯ_２／酸性化に対応する。この点で、ボトルは、陽性とされた。Ｏ_２／酸性化割合は、サンプル間で変動し、そしてＣＯ_２／酸性化は最大速度に達し、その後ベースラインに戻るので、ボトルがこの時間の間に機械の中に存在することが、必須である。したがって、ＣＯ_２／酸性化の加速の間のウィンドウは失われ（ボトルがこの時間の間に機械の中になかった）、偽陰性が判断され得る。

ユーザー間変動を最小化するために、自動化は重要であるので、本発明者らはさらに、初期溶解－遠心分離バイアルを遠心分離し、遠心分離後に上清を取り出し、そして捨てて、栄養増殖培地を加え、そして任意にペレットを新しい管に移すことが可能な系を、記載する。図１２は、本開示の実施形態に従うサンプルの自動化調製のための、系１００を示す。系１００は、サンプルを約６，０００×ｇまで回すことができる遠心分離１１０；液体を加えたり、そして液体を取り出したりできる、使い捨てピペットチップ１２５を備えた自動化液体ハンドラー１２０；管を把持し、移動させそして離すことができるグリッパー；管の蓋を外すことのできるグリッパー（前述のものと同じであってもよい）；及び液体ハンドラー及びグリッパーを処理のために必要なデッキ上の地点に到達させることが可能な３軸ガントリー１３０ａ、ｂを含む。詳細には、図１２における系は、液体ハンドラー１２０とグリッパーとを、個別に位置指定可能なｚ－ガントリー１２０ｂを各々有するひとつのｘ、ｙ－ガントリー１２０ａ上で合わせ、そしてさらに、蓋を外すことを含めて全ての動きのために、ひとつのグリッパーを使用する。この系はまた、血液培養物から微生物を分離してさらなるサンプル処理（微生物同定又は抗菌感受性試験など）を可能にするためのユーティリティ、並びにサンプル処理の間に使用される消耗容器のための１以上のリザーバー１４０を、有してもよい。

本開示はまた、種々の実施形態において、溶解－遠心分離後に残留する真核細胞及び細胞断片の存在下での、微生物増殖検出のための方法をも含む。これらの方法は、並行して使用されても又は順次使用されてもよく、そして、陽性に加えてグラム型情報を与え得る。さらに、１以上の微生物属又は種が、ＰＣＲ又は類似の遺伝学的方法によって決定されてもよい。

図１０は、溶解－遠心分離後の微生物増殖を決定するために、６００ｎｍでの光学密度の読み取りの使用を示した。微生物によって減らされることが知られている代謝プローブ、例えば、レサズリンもまた使用されてもよく、１以上の電子輸送薬剤（例えば、メチレンブルー及び１－メトキシ－５－メトキシルフェナジニウムメチル硫酸塩）と組み合わせられてもよい（図１３）。１以上の酵素反応を受けた後で蛍光生成物を生成することが公知であるプレフルオロフォア（ｐｒｅ－ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）もまた、使用され得る。これらとしては、カルボキシル化フルオレセインジアセトエート（エステラーゼ）、４－メチルウンベリフェリルホスフェート及び６，８－ジフルオロ－４－メチルウンベリフェリルホスフェート（ホスファターゼ）、４－メチルウンベリフェリル－ベータＤ－グルクロン酸二水和物又はレゾルフィン－β－Ｄ－グルクロン酸メチルエステル（ガラクトシダーゼ）、Ｌ－ロイシン－７－アミド－４－メチルクマリンヒドロクロリド（ペプチダーゼ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、ＤＮＡ又は他の膜に対する特定の結合又はインターカレーションの際に蛍光を増強することが知られるフルオロフォアもまた、使用され得る。これらは、ＳＹＴＯ、Ｈｏｅｓｃｈｔ、ＹＯＹＯ、ＤｉＹＯ、ＴＯＴＯ、ＤｉＴＯ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、７－アミノアクチノマイシン、ＰＭＦ、及び他の生／死染色プローブを含み得るが、これらに限定されない。

細菌に特異的な巨大分子及び巨大分子生合成を検出し得るプローブもまた、特に有益であり得る。ＵＳ２０１５０１９１７６３Ａ１は、微生物増殖の間に細菌ペプチドグリカンに共有結合できる、Ｄアミノ酸結合フルオロフォアを開示した。しかし、測定技術は、組み込まれていないフルオロフォア結合したプローブが取り除かれたことを確実にするために、シグナル調査の前に広範な洗浄を必要とする。ここで、本発明者らは、結合フルオロフォアの伸長中のペプチドグリカン鎖への組み込みを測定するために、蛍光偏光法（異方性）の使用を導入する。この技術は、未結合のプローブは１，０００ダルトン未満であるが、結合プローブは、ペプチドグリカンの架橋の性質ゆえに、実際上１０，０００ダルトンを大きく上回るという事実を利用する。蛍光偏光法はまた、ホモダイマーとして知られる自己クエンチングについて調べ得る。長い寿命を有するフルオロフォアが、蛍光偏光法のために有利であるので、本発明者らはさらに、Ｄ－アミノ酸結合プレフルオロフォアのコンセプトを導入し、これは、微生物の中で複数の反応を受けることができる。酵素反応は、プローブを、その蛍光形態に変換し、そしてそのＤ－アミノ酸結合は、ペプチドグリカンへのその組み込みを可能にする。例えば、カルボキシフルオレセイン二酢酸は、Ｄ－リシンと結合し得る。このスキームは、２つの理由から、特に有益であり得る。第１に、文献は、フルオレセインなどの荷電した分子が、微生物を容易に浸透させることができず、標識効率を低下させることを教示する。第２に、プレフルオロフォアは、蛍光バックグラウンドを低減し得る。２－Ｄ－アミノ酸－プローブ系もまた、ペプチドグリカン測定を遠心分離なしで可能にするために、使用され得る。この場合、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が、使用されてもよい。詳細には、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）を用いることは、有益であり得、ユーロピウム又はテルビウムクリプテートなどのランタニドキレートを用いて達成され得る。この場合、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは、ドナーランタニドキレートが、低分子アクセプター（例えば、ヨーロピウムクリプテート若しくはランス（Ｌａｎｃｅ）テルビウムについてのＣｙ５若しくはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７、又はＬｕｍｉ４－テルビウムについての同じもの若しくはフルオレセイン若しくはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８）のＦｏｒｓｔｅｒ半径（典型的に約１～１０ｎｍ）の範囲内にある場合に、観察される。

同様のＴＲ－ＦＲＥＴ方法論が、表面結合ドナー／アクセプター対を作るために使用され得る。表面結合は、カチオン性ヨーロピウムクリプテートによって達成され得、これは、同様にカチオン性である有機フルオロフォアと対合してＴＲ－ＦＲＥＴを可能にし得る。同様に、表面結合性プローブは、蛍光偏光法によって調べられ得る。

熱量測定法もまた、微生物増殖を検出するために使用され得る。この方法は、プローブが必要なくてもよく、そして細胞及び細胞屑に対しては感受性がより低い場合があるので、光学方法よりも有益であり得る。等温型熱量測定法が、示差走査型熱量測定法よりも好ましい。複数のサンプルを並行して実行可能な系、例えば、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ、ＭＡ）モデルＩＶ－４８、Ｏｍｎｉｃａｌ（Ｓｔａｆｆｏｒｄ、ＴＸ）Ｉｎｓｉｇｈｔ、又はＳｙｍｃｅｌ（Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）ｃｅｌＳｃｒｅｅｎｅｒが、好ましい。

実施例１．
血液サンプルにおける微生物細胞の分離及び／又は富化のために好適な高密度層形状を同定するため、サンプルを、市販の予め作られたショ糖溶液を４０、５０及び６０％にて用いて調製し、その１．５ｍＬを、丸底１０ｍＬ遠心分離管に加えた。次いで、以下の微生物懸濁液のうちの１つの１ｍＬを、ショ糖層の頂上に加えた：６００ｎｍ（ＯＤ６００）にて２．０以上の光学密度であるＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）の生理食塩水中の懸濁液、２．０以上のＯＤ６００のＳ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の生理食塩水中の懸濁液、全血（＋ＳＰＳ）又は溶解緩衝液によって処理した溶解した血液（Ｉｓｏｌａｔｏｒ１０管－Ｗａｍｐｏｌｅ／Ａｌｅｒｅから）。次いで、各管を、ブレイクを０に温度を３０℃に設定したスインギングバケットローターにおいて、２３７０×ｇで、３０分間にわたり遠心分離した。遠心分離後、スマートフォンカメラを用いて各管の写真を撮った。画像を、図１に示す。血球は、４０％ショ糖層に入ったが、５０％及び６０％ショ糖層には入らないことが見いだされた。溶解した血液サンプルについて、溶解したヘモグロビンは、４０％及び５０％ショ糖層に入った。Ｍ．ルテウス及びＳ．マルセッセンスサンプルは、全てのショ糖溶液に入り、浸透深度はショ糖濃度と反比例した。４０％のＭ．ルテウスサンプルはペレット化し、そして６０％のＳ．マルセッセンスサンプルは、ショ糖層の間（上部の境界のすぐ下）に位置するバンドにあることに留意されたい。

実施例２．
溶解した全血サンプルから微生物の種々の密度のショ糖層内への区分けを、ＯＤ６００＝０．１までの別々のＭ．ルテウス及びＳ．マルセッセンスの生理食塩水ストック溶液を調製することによって、さらに調べた。これらの溶液を、Ｉｓｏｌａｔｏｒ１０管（Ｗａｍｐｏｌｅ／Ａｌｅｒｅ）を用いて溶解した、溶解全血中に、１００ＣＦＵ／ｍＬの終濃度まで希釈した。次いで、得られた混合物を、市販の１．５ｍＬショ糖（４０、５０又は６０％）の上に積層し、そしてブレイクを０に温度を３０℃に設定したスインギングバケットローターにおいて２３７０×ｇで３０分間にわたり遠心分離した。定量的な培養を、連続１０倍希釈で、血液アガープレートを用いて一晩行った。各サンプルについて、遠心分離された管の以下の画分を、定量的培養のためにプレートに播種した：１ｍＬ上清（「ｓｕｐ」）、２００μＬ「境界面」層、１．３ｍＬショ糖「濾過」高密度層。層を、図２に図示する。図３の定量的培養データにおいて示されるように、濾過層に入った微生物の百分率は、ショ糖濃度とおよそ反比例する。

実施例３．
５０％ショ糖（ｗ／ｖ、Ｓｉｇｍａ）及び１．５％ゼラチン（ブタ由来、Ｓｉｇｍａ）の溶液を作り、４２℃まで温め、そして１．５ｍＬを１０ｍＬ丸底遠心分離管に加えた。この溶液を、４℃で一晩ゲル化させ、次いで、１ｍＬの以下の懸濁液のうちの１つを、ゲル層の上に加えた：２．０以上の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）のＭ．ルテウスの生理食塩水中懸濁液、２．０以上のＯＤ６００のＳ．マルセッセンスの生理食塩水中懸濁液、全血（＋ＳＰＳ）又は溶解緩衝液で処理した溶解した血液（Ｉｓｏｌａｔｏｒ１０管－Ｗａｍｐｏｌｅ／Ａｌｅｒｅから）。サンプルを、ブレイクを０に温度を３０℃に設定したスインギングバケットローターにおいて２３７０×ｇで３０分間にわたり遠心分離した。遠心分離後、スマートフォンカメラを用いて各管の写真を撮った。画像を、図４に示す。図が示す通り、Ｍ．ルテウス及びＳ．マルセッセンスの菌は、濾過層に入るが、全血及び溶解した血液は入らなかった。

実施例４．
１、２、及び２．５時間の遠心分離を行ったことを除いて、実施例３における手順と同じ手順に従った。図５に示されるように、遠心分離時間がすすむにつれ、Ｓ．マルセッセンスバンドがさらに進むのが見られるが、全血及び溶解した血液は、この層に浸透しないままである。

実施例５．
遠心分離より前にショ糖－ゼラチン溶液を４２℃まで温めることを除いて、実施例３における手順と同じ手順に従った。Ｍ．ルテウス及びＳ．マルセッセンスの菌は、濾過層へ入ることが見られ、赤血球から溶解したヘモグロビンは、そのままであった（図６）。血球は、濾過層の上にとどまることを、観察した。

実施例６．
熱量測定法 対 吸光度ベースの増殖決定の性能を比較するため、全血を、ポリアネトール硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含むバキュテナー管に収集し、次いで、製造業者の指示に従い、溶解遠心分離によって処理した（Ｉｓｏｌａｔｏｒ １０、Ａｌｅｒｅ）。溶解した血液サンプルを、トリプシン処理大豆ブロス（ＴＳＢ；Ｓｉｇｍａ）と合わせ、そして、１００ＣＦＵ／ｍＬの終濃度までの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を播種した。処理した血液サンプルを、プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）又は熱量計（Ｓｙｍｃｅｌ）内に入れ、３７℃でインキュベートした。検出までの時間（ＴＴＤ）を、（６００ｎｍでの）光学密度又はベースラインを超える熱生成における百分率の増大に基づいて決定した。三重のサンプルについての典型的なＴＴＤを、表３に示す（「富化サンプル画分及び枯渇サンプル画分の保持」と上で題された節に提示される）。

実施例７．
１０ｍＬの溶解した血液を、４０ｍＬ ＴＳＢと合わせた大腸菌と共に播種した。サンプルを、溶解－遠心分離技術に従って遠心分離した。１０ｍＬ及び１ｍＬの容量の上清を取り出し、そして再び遠心分離して、細菌をペレットにした。容量を、血液アガープレート上にプレート播種し、３５℃で一晩インキュベートした。ＣＦＵを、計数し、そして記録した。１つの管あたりで回収された総ＣＦＵからの百分率を、計算した。上述の「富化サンプル画分及び枯渇サンプル画分の保持」と題した節において、データを表２に提示した。まとめると、これらのデータは、溶解した血液サンプルの遠心分離の後、微生物は、ペレット中に濃縮されるが、多くの場合、上清全体にも見出され得ることを示す。このデータはまた、十分な数の微生物が上清中に残る場合があり、微生物増殖決定を支持し得ることを示す。

実施例８．
全血を、ＳＰＳを含むバキュテナー管中に収集した。血液の一部分を、溶解遠心分離によって処理した。全血（Ｐ２）及び溶解－遠心分離（Ｐ１）を受けた血液サンプルからのペレットを含む「処理した」サンプルを、トリプシン処理大豆ブロス（ＴＳＢ）と合わせ、そして大腸菌と共に播種して、１００ＣＦＵ／ｍＬの終濃度を達成した。播種した血液サンプル及びＴＳＢ培地サンプルを、熱量計（Ｓｙｍｃｅｌ）内に置き、３７℃でインキュベートした。代表的なサンプルについてのデータを、図７に示す。播種していないＰ１培地の陰性対照を、図８に灰色でプロットする。まとめると、これらのデータは、陽性及び／又は熱流量が増大すると証明された細菌増殖は、全血及び溶解－遠心分離した血液の両方において検出され得る（図７）が、細菌を含まない全血のみ及び処理したサンプルは、陽性である熱流量を有さないことを示す（図７及び図８）。これらのデータはまた、熱量測定法により、陽性の熱流量が、陽性サンプルを陰性サンプルから識別するための基礎として使用され得ることを、示す。

実施例９．
全血を、ＳＰＳを含むバキュテナー管中に収集した。サンプルの２ｍＬアリコートを、１０００ＣＦＵ／ｍＬの大腸菌細菌（ＡＴＣＣ）によってスパイクし、そしてその後、無菌条件下で、ＴＳＢ栄養培地と１：１で混合した。次いでこれを、１２ｍｍ遠心分離において、３ｍＬ容量の無菌Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅの上に、無菌的に積層した。管を、４００×ｇにて３５分間、休憩なしで遠心分離した。次いで、得られた管（図９に模式的に描かれる）を、以下のように、無菌条件下で処理した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅの上の全ての層を含む上清層を、別の管（管Ａ）にピペットで移し、そしてボルテックスした。次いで、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅ層を、赤血球ペレット境界面からおよそ２～３ｍｍ離した場所に留まるように気をつけてピペットで吸い上げ、そして別の管（管Ｂ）移し、そしてボルテックスした。赤血球ペレット境界面を、５００μＬのＴＳＢで２回洗浄し、そして別の管（管Ｃ）に移した。残りのペレットを、１ｍＬのＴＳＢ（管Ｄ）の添加後にボルテックスした。定量的培養のために、５００μＬを各管から吸い上げることにより、全ての管を、ヒツジの血液を含む栄養アガー上にプレートに播種して、一晩増殖させた。二連で行った定量的培養の平均結果から、各層の容量に基づいて計算した細菌数を、表４に示す。細菌の多くは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅ層において見出される。ペレットにおける細菌の数は、より長いＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅ長によって減らすことができるが、上清における細菌の数は、遠心分離時間を延ばすか、又は速度を上げることによって減らすことができる。

実施例１０．
大腸菌によるそのスパイキング及びＴＳＢとの１：１混合より前に、前の実施例と同様に血液をサポニンで溶解した他は、実施例９におけるものと同じ手順を使用した。この同じ手順を、２つのサンプルに対して行った。そのうちの１つは、４００×ｇで遠心分離し（サンプルＡ）、そして他方は８００×ｇ（サンプルＢ）で遠心分離した。サンプルＡについて、遠心分離後に、細菌の３３％のみがＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅ層に存在したが、サンプルＢについては、およそ７０％の細菌が、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｃｑｕｅ層に存在した。

実施例１１
本開示において記載した溶解－遠心分離サンプル調製方法の実現可能性を実証するために、これらの方法を、既知の量の細菌を、正常な血液培養物中に播種し、次いで、本明細書中で記載した溶解－遠心分離方法によって処理する、スパイク－イン実験によってモデル化した。この研究において使用した細菌株は、大腸菌ＡＴＣＣ ２５９２２、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ ２９２１３、及びストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ＳＤ－１２３４であった。細菌を、５％ヒツジ血液（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を加えたトリプシン処理大豆アガー上で３５℃にて培養し、単離コロニーを得た。ＳＰＳバキュテナー管（ＢＤ３６４９６０）中に収集した血液を、１ｘ１０^５ＣＦＵ／ｍＬ（希釈したコロニーのＯＤ６００測定に基づく）の終濃度の細菌生理食塩水懸濁液、又は無菌対照としての生理食塩水と共に、播種した。播種した血液（１０ｍＬ）を、溶解緩衝液（Ａｌｅｒｅ）を含むＩｓｏｌａｔｏｒ １０管に移した。Ｉｓｏｌａｔｏｒ管を、製造業者の指示に従って処理した。簡潔にいうと、管を、５回反転させて内容物を混ぜ、そして３０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離した。ｉｓｏｓｔａｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｅｒｅ）を使用して上清を取り出し、ペレットを滅菌したリザーバーに移した。ペレットを、トリプシン処理大豆ブロス（ＴＳＢ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１：４に希釈し、製造業者の指示に従って、黒色９６ウェル透明平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に調製した。プレートを、３７℃にてＢｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダー内で、環状に（ｏｒｂｉｔａｌ）振とうしながらインキュベートした。細菌増殖を、一定の間隔で、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）吸光度読み取り又は５６０／５９０（ｅｘ／ｅｍ）でのアラマーブルー蛍光によって、測定した。無菌対照と比較した平均ＯＤ６００を、図１０において経時的に（時間）グラフ化した。

実施例１２
本開示の方法が、広く用いられている市販の血液培養物バイアルを用いて、現在の業界標準に類似した、陽性になるまでの時間（ｔｉｍｅ－ｔｏ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ）成績をもたらし得ることを確認するために、並行して、細菌スパイクした血液サンプルをＩｎｏｃｕｌａｔｏｒ １０バイアルに入れ、同じ量の細菌を、ＢＡＣＴＥＣ標準好気性バイアル中に直接収集した１０ｍＬの血液の中に播種したことを除き、サンプルを、実質的に実施例１１に記載の通りに調製した。次いで、これらを、製造業者の指示に従って、ＢＡＣＴＥＣ ９０５０連続的モニタリング系内に置いた。陽性までの時間（ＴＴＰ）を、初期細菌インキュベーションからＢＡＣＴＥＣ ９０５０陽性血液培養物シグナルを記録するまでの時間として定義し、そして図１１において経時的にグラフ化した。

実施例１３
本開示の溶解－遠心分離方法が、微生物増殖をモニタリングするための蛍光ベースの方法に適用可能であることを確認するため、サンプルを、ＴＳＢに増殖指示薬プローブとして働くアラマーブルー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を追加したことを除き、サンプルを、実質的に実施例１１に記載の通りに調製し、そして細菌増殖を５６０／５９０（ｅｘ／ｅｍ）での蛍光読み取りによって一定の間隔で測定して、図１３に提示した。

実施例１４
吸着性樹脂が、本明細書中で記載される溶解－遠心分離及び熱容量測定の増殖測定方法と適合性であるやり方で、サンプル採取した患者血液における抗菌剤を除去するために使用されてもよいことを確認するために、血液を、健康なドナーから採取してＢａｃｔｅｃ Ａｅｒｏｂｉｃ Ｐｌｕｓ樹脂ボトルへ入れ、そしてインキュベートした細菌と共に播種した。一組を、Ｂａｃｔｅｃ慣用的臨床方法による増殖検出のために、Ｂａｃｔｅｃ ９０００シリーズ内に入れた。残りのボトルを、表５において「Ｌ－Ｃ－Ｃ方法」と呼ぶ、本開示の範囲内の方法によって処理した。血液を、溶解培地をボトルに添加することによって溶解した。液体血液培養物を、ニードルシリンジを用いて固体樹脂から分離した。サンプルを、３０００×ｇで１５分間にわたり遠心分離し、そして上清を取り出した。増殖培地を血液ペレットに加え、次いで、サンプルを細菌増殖の検出のために熱量計内に置いた。上清画分もまたインキュベートし、そして本開示に従う方法は、熱量計（迅速）及び上清画分からの増殖検出を含んだ。データを、下の表５に提示し、陽性血液培養物を有する全ボトルの画分として表した。表が示す通り、本開示のＬ－Ｃ－Ｃ方法は、現行の慣用的臨床方法に匹敵し、そしてある場合においては優れているともみえる、陽性結果を提供する。

結果までの時間に対する吸着性樹脂の効果もまた、試験した。表６は、Ｌ－Ｃ－Ｃ方法を用いて達成した大腸菌サンプルについての結果までの時間の平均が、樹脂が存在するか否かにかかわらず類似していることを示す。

実施例１５：
当業者は、臨床血液サンプルの収集とサンプルの処理及び培養との間で時間が経過する場合があることを理解するであろう。これは、収集したサンプルは、一般に、処理が開始する時間まで、微生物増殖を促進する条件で保存されないので、サンプルの収集後に、臨床的に意味のある結果をもたらすために必要とされる時間を引き延ばす場合があり、及び／又は相対的に少ない数の微生物を有するサンプルからの偽陰性の結果の可能性を高くする場合がある。本開示の特定のサンプル収集方法及び処理方法は、微生物増殖を促進する条件下（例えば、周囲温度より高く、制御された雰囲気の中、微生物増殖を支持する栄養及び／又は培地成分を添加すること、及び／又はそのまま置いておくよりむしろ撹拌すること）で、血液サンプルを維持することを含む。これらのアプローチを、まとめて、「事前インキュベーション」と呼ぶ。加えて、本開示の実施形態は、より濃縮されたサンプル（例えば、ペレット）とより濃縮されていないサブサンプルとへの分画を使用する；次いで、（濃縮画分から）陽性度の迅速な評価を行い、そして（より濃縮されていない画分を、より長い時間間隔にわたって調べることにより）偽陰性結果を減らす目的で、両画分を保持する。本明細書中で記載される事前インキュベーション及び分画アプローチが、微生物検出を改善する（偽陰性成績によって及び微生物増殖によって、測定される）ことを実証するために、血液を、健康なドナーからＢａｃｔｅｃボトル中へ採取し、そして、非常に少数（サンプル１つあたり１～３ＣＦＵ）の、表７に示す細菌種を、播種した。血液を、溶解培地を用いて溶解した。サンプルを、３０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離し、そして上清を、新しい管に移した。次いで、サンプルを、２つのサブサンプルに分けた：「迅速画分」ここでは、増殖培地を血液ペレットに加え、次いで処理したサンプルを細菌増殖の検出のために熱量計内に置いた；及び上清を含む「上清画分」もまた、細菌増殖の検出のためにインキュベートした。迅速画分及び上清画分を調べた後、試験サンプル中の細菌の存在を、アガープレート播種によって評価した。

表７が示す通り、試験サンプルは、平均して、１サンプルあたり１～３ＣＦＵしかない（「平均ＣＦＵ」と表示する）。この設定において、迅速画分のみの検査（表において迅速（＋）と表示する）は、偽陰性結果の小さな画分を生じたことは、驚きではない。しかし、迅速画分と上清画分との両方を試験した場合、増殖が、各サンプルの少なくとも１つの画分で検出される（「迅速（＋）又は上清（＋）」と表示する）。これらの結果は、非常に低いＣＦＵサンプルから得られる偽陰性結果の可能性を、本開示の実施形態に従う濃縮画分及び枯渇画分の両方の保持及び調査によって減らすことができることを、示す。

サンプル収集後の事前インキュベーションの、迅速画分における偽陰性結果の割合に対する影響をモデル化するために、血液を、健康なドナーからＢａｃｔｅｃボトル中に採取し、そして上記のように細菌と共に播種した。サンプルを、直接処理（溶解工程を含む）したか、又は処理より前に３時間にわたりインキュベートした。各サンプルを、３０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離し、そして上清を、新しい管に移した。迅速検出のために、増殖培地を、血液ペレットに加え、次いで、迅速検出サンプルを、熱量計内に、細菌増殖の検出のために置いた。上清画分もまた、細菌増殖の検出のためにインキュベートした。熱量計において陰性であったが上清画分において増殖したサンプルの百分率を、迅速検出画分における偽陰性の％として示した。表８が示す通り、迅速検出サンプルのみの中の偽陰性の百分率は、事前インキュベーションを用いた場合、有意に低下した；実際、事前インキュベーションを行った場合には、偽陰性結果は観察されなかった。

実施例１６：
本開示の方法が、臨床サンプル調製及び解析のために実行可能であることを確認するため、本開示の実施形態に従う方法の成績を、市販の産業標準血液培養物処理系の成績と比較した。血液を、健康なドナーからＢａｃｔｅｃ ａｅｒｏｂｉｃボトル中に採取し、そして細菌を、ボトル内に播種した。一組のＢａｃｔｅｃボトルを、増殖のＢａｃｔｅｃ検出のために、Ｂａｃｔｅｃ９０００シリーズ（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ ＭＤ）内に入れた。残りのＢａｃｔｅｃボトルを、本開示の方法に従って処理した：血液を、溶解培地を用いて溶解した。サンプルを、３０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離し、そして上清を取り出した。増殖培地を血液ペレットに加え、次いで、サンプルを、細菌増殖の検出のために熱量計内に入れた。上清画分もまた、インキュベートし、迅速画分及び上清画分の両方からの結果を収集した。本開示の方法に従って調製し、そして解析したサンプルからのデータを、「新」として図９に示し、列挙した微生物についてのＢａｃｔｅｃアナライザーの成績と比較した。表が示す通り、本開示の「新」方法は、Ｂａｃｔｅｃアナライザーによって達成された成績と同等の、ある場合においてはそれより優れた成績を、達成した。

記載の「新」方法の成功が、熱量計の使用がなくても再現され得ることを確認するために、この方法に、微生物増殖の検出のためのｐＨベースの比色分析方法（ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ、ＢｉｏＭｅｒｉｕｘ ＵＳＡ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を適合させた。血液を、健康なドナーからＢａｃＴ Ａｌｅｒｔボトル中に採取し、そして上記の通り、細菌と共に播種した。慣用的臨床標準に従って調製されたボトルを、検出のために、ＢａｃＴ Ａｌｅｒｔに入れた。残りのボトルを、「新」方法に従って、以下の通り処理した。血液を、溶解培地を用いて溶解した。サンプルを、３０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離し、そして上清の大部分を取り出して、検出のためにＢａｃＴ Ａｌｅｒｔに入れた。標準臨床調製及び「新」方法についての結果を、表１０に提示する。表が示す通り、両方法は、２つの複製物にわたって、試験培養物を陽性として正確に同定した。

しかし、表１１が示す通り、「新」非熱容量測定の方法を用いる、検出までの時間は、一般に、標準臨床調製を用いて達成されるものよりも短い。

実施例１７：
異なるＣＦＵ／ｍｌ濃度について、大腸菌の連続希釈物を、ＴＳＢにおいて作った。示されるように、異なる容量のこれらの希釈物を、ＴＡＭ ＩＶ（ＴＡ装置）又はＣａｌｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓｙｍｃｅｌ）熱量計に加えた。ＴＡＭ ＩＶサンプルは、４ｍｌ又は２０ｍｌのいずれかのガラスバイアルであり、Ｃａｌｓｃｒｅｅｎｅｒサンプルは、０．５ｍｌプラスチック挿入物であった。ＴＡ装置及びＳｙｍｃｅｌサンプルは各々、それぞれ計算値で５０ＣＦＵ／サンプル及び５ＣＦＵ／サンプルを含んだ。サンプルを、熱量計において３７℃でインキュベートし、そして経時的な熱流量を記録した。ＴＴＤを、熱流量がベースラインから１０μＷを超えた時間として決定した。

参照としての援用
本明細書中で参照された全ての刊行物は、本明細書中でその全体を全ての目的について援用される。

Claims (31)

1. 微生物について血液サンプルを調べる方法であって、以下：
   微生物を第１画分中に濃縮する傾向がある条件下で、血液サンプルを第１画分と第２画分とに分離すること；
   第１及び第２画分を、微生物増殖に適した条件下でインキュベートすること；及び
   第１及び第２画分を、微生物増殖について調べることを含み、ここで
   （ａ）第１画分は、第１時間間隔にわたって第１増殖検出方法を用いて調べられ、そして第２画分は、第２時間間隔の間に第２増殖検出方法を用いて調べられ、
   （ｂ）第１増殖検出方法は、第２検出方法よりも微生物増殖に対して感受性が高く、
   （ｃ）第２時間間隔は、第１時間間隔よりも長く、及び
   （ｄ）増殖が、第１増殖検出方法を用いて第１時間間隔の間に第１画分において検出されなかった場合、第１画分は、第１増殖検出方法以外の増殖検出方法を用い、残りの第２時間間隔にわたって微生物増殖について調べられる、方法。
2. 第１増殖検出方法以外の増殖検出方法が、第２増殖検出方法である、請求項１に記載の方法。
3. 第１増殖検出方法が、熱量測定法である、請求項２に記載の方法。
4. 第２増殖検出方法が、ｐＨ、気体、又は光学であり、光学である場合、濁度の光学測定；１以上の波長における吸光度の光学測定、代謝指示染料のシグナルの光学検出；自発蛍光のモニタリング、フローサイトメトリー又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 第１及び第２画分は、微生物懸濁液を含む、請求項１に記載の方法。
6. 血液サンプルを第１画分と第２画分とに分離する前記工程が、遠心分離を含む、請求項１に記載の方法。
7. 血液サンプルが、血液サンプルを第１画分と第２画分とに分離する工程の前に、微生物増殖に好ましい条件下でインキュベートされ、そして、微生物増殖に好ましい条件は、任意に、周囲温度より高い温度、約３７℃の温度、栄養若しくは栄養培地の添加、及び／又は血液サンプル中の抗菌物質を吸収するか若しくは不活性化する物質の添加の、１以上を含む、請求項１に記載の方法。
8. 微生物増殖が、分離工程より前のインキュベーションの間にモニタリングされない、請求項７に記載の方法。
9. 血液サンプルを微生物について調べる方法であって、以下：
   血液サンプルを、抗菌剤を吸収することができる樹脂と接触させること；
   １以上の濃縮工程を行い、微生物を：
   ａ）ペレット；及び
   ｂ）上清に濃縮すること；
   ペレットの少なくとも一部分を含む第１サブサンプルを、熱量計に導入すること；
   第１サブサンプルからの熱流量を測定することによって、第１サブサンプルの増殖をモニタリングすること；及び
   上清の一部分を含む第２サブサンプルを保持し、ここで、第２サブサンプルは、（ｉ）熱量測定法以外の方法によって、及び／又は（ｉｉ）第１サブサンプルをモニタリングする間隔よりも長い時間間隔にわたって、増殖についてモニタリングされることを含む、方法。
10. 増殖が測定されない場合、第１サブサンプルは、約０．５、１、２、３、４、５日間の所定の期間の後に、熱量計から取り出される、請求項９に記載の方法。
11. 第２サブサンプルが、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法によって、増殖についてモニタリングされる、請求項９に記載の方法。
12. 第１及び第２サブサンプルの少なくとも１つの増殖が、絶対シグナルに基づいてモニタリングされる、請求項９に記載の方法。
13. 第１及び第２サブサンプルの少なくとも１つの増殖が、相対シグナルに基づいてモニタリングされる、請求項９に記載の方法。
14. 第２サンプルが、ペレットの少なくとも一部分をさらに含む、請求項９に記載の方法。
15. 保持した上清及びペレットの残りが、光学、ｐＨ、気体、又はインピーダンス方法によって、増殖についてモニタリングされる、請求項１４に記載の方法。
16. 血液サンプルが、濃縮工程より前に、微生物増殖を促進する条件下でインキュベートされる、請求項９に記載の方法。
17. 熱量計が、示差走査型又は等温型熱量計である、請求項９に記載の方法。
18. 第１及び第２サブサンプルが、第１間隔にわたって並行して増殖についてモニタリングされ、ここで、増殖が第１間隔の間に第１サンプル中に検出されない場合、第１サブサンプルは熱量計から取り出され、そして、熱量測定法以外の方法によって、残りの時間間隔にわたって増殖についてモニタリングされ、前記残りの時間間隔にわたって、第２サブサンプルが増殖についてモニタリングされる、請求項９に記載の方法。
19. 上清が、実質的な濃縮又は精製を受けない、請求項９に記載の方法。
20. 上清の全て又は実質的に全ての容量が、第２サブサンプル中に含まれる、請求項１９に記載の方法。
21. 血液サンプルが、収集器中に収集され、濃縮工程が、収集器中の血液サンプルの遠心分離を含み、そして上清が、遠心分離後に収集器から吸引されるか、又はデカントされ、そしてペレットの除去後に任意に収集器に戻される、請求項１９に記載の方法。
22. 第２サブサンプルを保持する工程は、収集器中に上清を保持することを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 血液サンプルが、１以上の濃縮工程より前に、微生物増殖に好ましい条件下でインキュベートされ、ここで、微生物増殖に好ましい条件は、任意に、周囲温度より高い温度、約３７℃の温度、栄養若しくは栄養培地の添加、及び／又は血液サンプル中の抗菌物質を吸収するか若しくは不活性化する物質の添加の１以上を含む、請求項９に記載の方法。
24. 微生物増殖が、１以上の濃縮工程より前のインキュベーションの間にモニタリングされない、請求項２３に記載の方法。
25. 血液サンプル中の微生物増殖を検出する方法であって、以下の工程：
    血液サンプル中で１以上の吸熱過程を起こすこと；及び
    サンプルからの熱流量を検出することであって、ここで、熱流量は下降勾配を有さず、それによって微生物増殖を検出することを含む、方法。
26. 吸熱過程は、血液サンプルに加えられた抗凝血薬剤及び溶解薬剤の１以上によって起こされる、請求項２５に記載の方法。
27. 血液サンプルが、サンプルからの熱流量を検出する工程より前に、微生物増殖に好ましい条件下で事前インキュベートされる、請求項２５に記載の方法。
28. 熱流量の検出は、等温型熱量測定法を含む、請求項２５に記載の方法。
29. 吸熱過程は、ミセル形成反応を含む、請求項２５に記載の方法。
30. 吸熱過程を起こす工程が、血液サンプルを溶解試薬、任意にサポニンと接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。
31. 吸熱過程を起こす工程が、血液サンプルを抗凝血物質、任意にポリアネトール硫酸ナトリウムと接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。

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