JP2022530224A - アルキル側鎖を有するカチオン性ポリマー - Google Patents

アルキル側鎖を有するカチオン性ポリマー Download PDF

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Abstract

加水分解性ポリマー主鎖を含むポリマーであって、該ポリマー主鎖が（ｉ）疎水性基を含む側鎖を有するモノマー単位、（ｉｉ）オリゴアミンまたはポリアミンを含む側鎖を有するモノマー単位；および任意に（ｉｉｉ）イオン化可能な基を含む側鎖を有するモノマー単位を含むポリマー、並びに前記ポリマーを製造する方法、および該ポリマーを使用して核酸および／またはポリペプチドを細胞に送達する方法が提供される。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本特許出願は、２０１９年４月２３日付で出願された米国仮特許出願６２／８３７，６５８号、および２０１９年５月２８日付で出願された米国仮特許出願６２／８５３，６５８号の優先権を主張し、その全体の開示が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
ペプチド、タンパク質、および核酸ベースの技術は、疾患を予防、治癒および治療するための無数の用途を有する。しかしながら、それらの標的組織への大きな分子（例えばポリペプチドおよび核酸）の安全かつ効果的な送達は、依然として問題がある。従って、治療用分子を送達するために有用な新しい組成物および方法の必要性が、引き続き存在する。
本明細書において提供されるのは、加水分解性ポリマー主鎖を含むポリマーであって、該ポリマー主鎖が（ｉ）疎水性基を含む側鎖を有するモノマー単位；（ｉｉ）オリゴアミンまたはポリアミンを含む側鎖を有するモノマー単位；および任意に（ｉｉｉ）イオン化可能な基を含む側鎖を有し、任意に７未満のｐＫａを有するモノマー単位を含む、ポリマーである。
本明細書において提供されるのはまた、式１：
Figure 2022530224000001
（式中：
ｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４の合計は５より大きく；
ｎ１およびｎ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｎ１＋ｎ２の合計は２より大きく；
記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示し；
Ｒ３ａの各事例は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
Ｒ３ｂの各事例は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
各Ｘ１は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合であり；
Ｒ１３の各事例は、独立して水素、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基であり、それらのいずれも任意に１つ以上の置換基で置換され得；
Ｘ２の各事例は、独立して、任意に１つ以上の第一級、第二級、若しくは第三級アミンを含む、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せであり；それらのいずれも１つ以上の置換基で置換され得；
Ａ１およびＡ２は、独立してそれぞれ式
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
の基であり、Ｂ１およびＢ２は、独立してそれぞれ
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ４－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ４－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ４－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２、
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；または
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５
である（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、ｒ１およびｒ２、並びにｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、若しくはシクロアルケニル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；Ｒ４の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｃ－、－Ｏ－、または－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－であり；Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである））の構造を含むポリマーである。
前述の式１のポリマーは、イオン化可能な基をさらに含み得る。いくつかの実施態様においては、イオン化可能な基は、式１のＲ５によって提供される。他の実施態様においては、ポリマーは、イオン化可能な基を含む側鎖を有するモノマーをさらに含む。
本開示はまた、式１の構造を含むポリマー並びに核酸および／またはポリペプチドを含む組成物を提供する。さらに提供されるのは、式１の構造を含むポリマーを製造する方法、並びに例えば、核酸またはタンパク質を細胞に送達するために該ポリマーおよびそれを含む組成物を使用する方法である。
図１は、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９のアミノ酸配列（配列番号１）を提供する。 図２は、野兎病菌亜種Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１のアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。 図３は、反応混合物中に加えた疎水性部分の当量数の結果としてのポリマーＡの疎水性部分の置換度のグラフである。 図４は、反応混合物中に加えた疎水性部分の当量数の結果としてのポリマーＢの疎水性部分の置換度のグラフである。 図５は、実施例３において記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるポリマーＡナノ粒子のトランスフェクション効率をＲＦＰ蛍光の関数として例示するグラフである。 図６は、実施例４において記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるポリマーＡナノ粒子のトランスフェクション効率をＲＦＰ蛍光の関数として例示するグラフである。 図７は、実施例４において記載される、ＨｅｐＧ２細胞におけるポリマーＡナノ粒子のトランスフェクション効率をＲＦＰ蛍光の関数として例示するグラフである。 図８は、実施例４において記載される、一次筋芽細胞におけるポリマーＡナノ粒子のトランスフェクション効率をＲＦＰ蛍光の関数として例示するグラフである。 図９は、実施例４において記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるポリマーＡナノ粒子およびポリマーＢナノ粒子のトランスフェクション効率をＲＦＰ蛍光の関数として例示するグラフである。 図１０は、実施例５において記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣａｓ９を含有するポリマーＡおよびポリマーＢナノ粒子のトランスフェクション効率をＧＦＰノックアウトの関数として例示するグラフである。 図１１は、実施例５において記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣｐｆ１を含有するポリマーＡおよびポリマーＢナノ粒子のトランスフェクション効率をＧＦＰノックアウトの関数として例示するグラフである。 図１２は、実施例６において記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるポリマーＡナノ粒子のトランスフェクション効率をＲＦＰ蛍光の関数として例示するグラフである。 図１３は、実施例７において記載される、ポリマーＡナノ粒子での細胞の処理後のＨｅｐ３Ｂ細胞の細胞生存率を例示するグラフである。 図１４は、ＡｓＣｐｆ１の配列（配列番号１９）を提供する。 図１５は、ＬｂＣｐｆ１の配列（配列番号２０）を提供する。 図１６は、実施例９において記載される、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡおよびポリマーＨ２７Ｎを含有する粒子の動的光散乱を示す。 図１７は、実施例１０において記載される、Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびポリマーＨ２７Ｎを含有する粒子の動的光散乱を示す。 図１８は、実施例１２において記載される、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるポリマーＨ２７Ｎナノ粒子のトランスフェクション効率をＲＦＰ蛍光の関数として例示するグラフである。 図１９は、実施例１３において記載される、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるポリマーＨ２７Ｎナノ粒子のトランスフェクション効率を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率の関数として例示するグラフである。 図２０は、実施例１４において記載される、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるポリマーＨ２７Ｎナノ粒子のトランスフェクション効率を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率の関数として例示するグラフである。 図２１は、マウスＬｏｘｐ－ルシフェラーゼレポーター機能の概略図である。 図２２Ａ～２２Ｃは、実施例１５において記載される組成物で処理したルシフェラーゼ発現マウスの生物発光イメージングを示す。 図２３は、マウスａｉ９レポーター機能の概略図である。 図２４は、実施例１７において記載される組成物で処理したルシフェラーゼ発現マウスの脳の吻側および尾側切片へのＣｒｅ ｍＲＮＡの送達の生物発光イメージングを示す。 図２５は、実施例２３において記載される、ポリマーナノ粒子のトランスフェクション効率をＲＦＰ蛍光の関数として例示するグラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、加水分解性ポリマー主鎖を含むポリマーであって、該ポリマー主鎖が（ｉ）疎水性基を含む側鎖を有するモノマー単位；（ｉｉ）オリゴアミンまたはポリアミンを含む側鎖を有するモノマー単位；および任意に（ｉｉｉ）イオン化可能な基を含む側鎖を有し、任意に７未満のｐＫａを有するモノマー単位を含むポリマーを提供する。
本明細書において使用される句である加水分解性ポリマー主鎖は、生理学的条件（例えば、生理学的ｐＨ、生理学的温度下で、または血液、血清などの所与のインビボ組織において、天然に存在する因子（例えば、酵素）のため切断されやすい結合を有するポリマー主鎖を指す。一般に、加水分解性ポリマー主鎖は、ポリアミド、ポリ－Ｎ－アルキルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリカーバメート、またはそれらの組合せを含む。特定の実施態様においては、加水分解性ポリマー主鎖は、ポリアミドを含む。
疎水性基を含む側鎖を有するモノマー単位は、任意の疎水性基を含み得る。疎水性基の例は、例えば、Ｃ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ１２、Ｃ２－Ｃ１０、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、Ｃ３－Ｃ１２、Ｃ３－Ｃ１０、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、Ｃ４－Ｃ１２、Ｃ４－Ｃ１０、Ｃ４－Ｃ８、Ｃ４－Ｃ６、Ｃ６－Ｃ１２、Ｃ６－Ｃ８、Ｃ８－Ｃ１２、Ｃ８－Ｃ１０、）アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ６、Ｃ３－Ｃ１２、Ｃ３－Ｃ１０、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、Ｃ４－Ｃ１２、Ｃ４－Ｃ１０、Ｃ４－Ｃ８、Ｃ４－Ｃ６、Ｃ６－Ｃ１２、Ｃ６－Ｃ８、Ｃ８－Ｃ１２、Ｃ８－Ｃ１０、）アルケニル基、またはＣ３－Ｃ１２（Ｃ３－Ｃ１０、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、Ｃ４－Ｃ１２、Ｃ４－Ｃ１０、Ｃ４－Ｃ８、Ｃ４－Ｃ６、Ｃ６－Ｃ１２、Ｃ６－Ｃ８、Ｃ８－Ｃ１２、Ｃ８－Ｃ１０、）シクロアルキル基またはシクロアルケニル基を含む。特定の実施態様においては、疎水性基は、Ｃ４－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基を含む。いくつかの実施態様においては、疎水性基は、８個未満の炭素または６個未満の炭素を含む。例えば、疎水性基は、Ｃ２－Ｃ８またはＣ２－Ｃ６（例えば、Ｃ３－Ｃ８またはＣ３－Ｃ６）アルキル基を含み得る。アルキルまたはアルケニル基は、分岐または直鎖であり得る。前述の実施態様のいずれにおいても、疎水性基は、ポリマー主鎖に直接または、例えば、エステル、アミド、若しくはエーテル基を含み、任意にさらにアルキレンリンカー（例えば、メチレンまたはエチレンリンカー）を含むリンケージを介して連結し得る。
ポリマーはまた、オリゴアミンまたはポリアミンを含む側鎖を有するモノマー単位を含む。本明細書において使用される用語「オリゴアミン」は、２つまたは３つのアミン基を有する任意の化学部分を指し、用語「ポリアミン」は、４つ以上の（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個等の）アミン基を有する任意の化学部分を指す。アミン基は、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの任意の組合せであり得る。特定の実施態様においては、オリゴアミンまたはポリアミンは、式：
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２，
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ４－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ４－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ４－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２、
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；または
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５
（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、ｒ１およびｒ２、並びにｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、若しくはシクロアルケニル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；Ｒ４の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｃ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ－Ｏ－、または－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－であり：Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである）である。
いくつかの実施態様においては、オリゴアミンまたはポリアミンは、式：
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、並びにｒ１およびｒ２は、独立してそれぞれ１から５の整数（例えば、１、２、または３）であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ６、Ｃ１－Ｃ３、Ｃ２、またはＣ１）アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、若しくはシクロアルケニル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成する）である。アルケニル基は、少なくとも２つの炭素（例えば、Ｃ２－Ｃ１２、Ｃ２－Ｃ６等）を有さなければならず、シクロアルキルおよびシクロアルケニル基は、少なくとも３つの炭素（例えば、Ｃ３－Ｃ１２、Ｃ３－Ｃ６等）を有さなければならないことが理解される。いくつかの実施態様においては、ポリアミンは、－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２であり、ここで、任意にＲ２は、独立して水素またはＣ１－Ｃ３アルキル（例えば、メチルまたはエチル）である。
いくつかの実施態様においては、ポリマーは、イオン化可能な基を含む側鎖を有するモノマー単位をさらに含む。本明細書において使用される句「イオン化可能な基」は、荷電種に容易に変換し得る置換基を有する任意の化学部分を指す。例えば、イオン化可能な基は、プロトン供与体またはプロトン受容体である基であることができる。該基は、生理学的条件下でプロトン化または脱プロトン化し得る。特定の実施態様においては、イオン化可能な基は、７未満のｐＫａを有する（２５℃の水中で）。例えば、本明細書において記載されるイオン化可能な基は、６未満のｐＫａ、５未満のｐＫａ、４未満のｐＫａ、３未満のｐＫａ、２未満のｐＫａ、または１未満のｐＫａを有し得る。あるいは、またはさらに、本明細書において記載されるイオン化可能な基は、－２より大きいｐＫａ、－１より大きいｐＫａ、０より大きいｐＫａ、１より大きいｐＫａ、２より大きいｐＫａ、３より大きいｐＫａ、４より大きいｐＫａ、５より大きいｐＫａ、または６より大きいｐＫａを有し得る。従って、本明細書において記載されるイオン化可能な基は、－２から７のｐＫａ、例えば、－１から７のｐＫａ、０から７のｐＫａ、１から７のｐＫａ、２から７のｐＫａ、３から７のｐＫａ、４から７のｐＫａ、５から７のｐＫａ、６から７のｐＫａ、０から６のｐＫａ、２から６のｐＫａ、４から６のｐＫａ、０から５のｐＫａ、２から５のｐＫａ、または４から５のｐＫａを有し得る。イオン化可能な基の例は、例えば、スルホン酸、スルホンアミド、カルボン酸、チオール、フェノール、アミン塩、イミド、およびアミド基を含む。
いくつかの実施態様においては、ポリマーは、７未満の全体に渡るｐＫａを有する（２５℃の水中で）。例えば、本明細書において記載されるポリマーは、６未満のｐＫａ、５未満のｐＫａ、４未満のｐＫａ、３未満のｐＫａ、２未満のｐＫａ、または１未満のｐＫａを有し得る。あるいは、またはさらに、本明細書において記載されるポリマーは、－２より大きいｐＫａ、－１より大きいｐＫａ、０より大きいｐＫａ、１より大きいｐＫａ、２より大きいｐＫａ、３より大きいｐＫａ、４より大きいｐＫａ、５より大きいｐＫａ、または６より大きいｐＫａを有し得る。従って、本明細書において記載されるポリマーは、－２から７のｐＫａ、例えば、－１から７のｐＫａ、０から７のｐＫａ、１から７のｐＫａ、２から７のｐＫａ、３から７のｐＫａ、４から７のｐＫａ、５から７のｐＫａ、６から７のｐＫａ、０から６のｐＫａ、２から６のｐＫａ、４から６のｐＫａ、０から５のｐＫａ、２から５のｐＫａ、または４から５のｐＫａを有し得る。
ポリマーは、疎水性基を含む側鎖を有するモノマー単位、オリゴアミン若しくはポリアミンを含む側鎖を有するモノマー単位、および、存在するときは、イオン化可能な基を含む側鎖を有するモノマー単位の任意の適切な数または量（例えば、重量または数パーセント組成）を含み得る。いくつかの実施態様においては、ポリマーは、約１から約８０モル％（例えば、約５から約８０モル％、約１０から約８０モル％、約２０から約８０モル％、約４０から約８０モル％、約１から約６０モル％、約１から約４０モル％、約１から約２０モル％、または約１から約１０モル％）の疎水性基を有するモノマー単位、約１から約８０モル％（例えば、約５から約８０モル％、約１０から約８０モル％、約２０から約８０モル％、約４０から約８０モル％、約１から約６０モル％、約１から約４０モル％、約１から約２０モル％、または約１から約１０モル％）のオリゴアミンまたはポリアミンを有するモノマー単位、および０から約８０モル％（例えば、約５から約８０モル％、約１０から約８０モル％、約２０から約８０モル％、約４０から約８０モル％、約１から約６０モル％、約１から約４０モル％、約１から約２０モル％、または約１から約１０モル％）のイオン化可能な基を有するモノマー単位を含む。
本明細書において提供されるのは、式１：
Figure 2022530224000002
（式中：
ｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４の合計は５より大きく；
ｎ１およびｎ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｎ１＋ｎ２の合計は２より大きく；
記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示し；
Ｒ３ａの各事例は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
Ｒ３ｂの各事例は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
各Ｘ１は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合であり；
Ｒ１３の各事例は、独立して水素、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、またはＣ３－Ｃ１２シクロアルケニル基であり、それらのいずれも任意に１つ以上の置換基で置換され得；
Ｘ２の各事例は、独立して、任意に１つ以上の第一級、第二級、若しくは第三級アミンを含む、Ｃ１－Ｃ１２アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルケニル基、アリール基、複素環基、またはそれらの組合せであり；それらのいずれも任意に１つ以上の置換基で置換されており；
Ａ１およびＡ２は、独立してそれぞれ式
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
の基であり、Ｂ１およびＢ２は、独立してそれぞれ
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ４－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ４－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ４－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２、
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；または
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５
である（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、ｒ１およびｒ２、並びにｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、若しくはシクロアルケニル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；Ｒ４の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｃ－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｃ－Ｏ－、または－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－であり；Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである））の構造を含むポリマーである。
本明細書において使用される「アルキル」または「アルキレン」は、置換または非置換の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ１－Ｃ１００アルキル、Ｃ１－Ｃ５０アルキル、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、Ｃ１－Ｃ８アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ４アルキル、Ｃ１－Ｃ２アルキル等）を有し得る。アルキルまたはアルキレンは、飽和であり得、または不飽和であり得（例えば、アルケニルまたはアルキニルを提供するために）、かつ線状（ｌｉｎｅａｒ）、分岐、直鎖（ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｃｈａｉｎｅｄ）、環状（例えば、シクロアルキルまたはシクロアルケニル）、またはそれらの組合せであり得る。環状基は、単環式であり得、縮合して二環式若しくは三環式基を形成し得、結合によって連結し得、またはスピロ環式であり得る。いくつかの実施態様においては、アルキル置換基は、１つ以上のヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、および硫黄）が割り込み得、それによりヘテロアルキル、ヘテロアルキレン、またはヘテロシクリル（すなわち、複素環基）を提供する。いくつかの実施態様においては、アルキルは、１つ以上の置換基で置換されている。
用語「アリール」は、任意の適切な数の環原子および任意の適切な数の環を有する芳香環系を指す。アリール基は、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の環原子、並びに６から１０、６から１２、または６から１４個の環メンバーを含み得る。アリール基は、単環式であり得、縮合して二環式若しくは三環式基を形成し得、または結合によって連結してビアリール基を形成し得る。代表的なアリール基は、フェニル、ナフチルおよびビフェニルを含む。いくつかの実施態様においては、アリール基は、アリールアルキル基（例えば、ベンジル基）を形成するようにアルキレン連結基を含む。いくつかのアリール基は、フェニル、ナフチルまたはビフェニルなどの６から１２個の環メンバーを有する。他のアリール基は、フェニルまたはナフチルなどの６から１０個の環メンバーを有する。いくつかの実施態様においては、アリール置換基は、１つ以上のヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、および硫黄）が割り込み得、それによりヘテロシクリル（すなわち、複素環またはヘテロアリール基）を提供する。いくつかの実施態様においては、アリールは、１つ以上の置換基で置換されている。
用語「ヘテロシクリル」または「複素環基」は、１つ以上のヘテロ原子（例えば、酸素、窒素、および硫黄）を有する、例えば、芳香族（例えば、ヘテロアリール）または非芳香族の環状基を指す。いくつかの実施態様においては、ヘテロシクリルまたは複素環基（すなわち、１つ以上のヘテロ原子を有する、例えば、芳香族（例えば、ヘテロアリール）または非芳香族の環状基）は、１つ以上の置換基で置換されている。
本明細書において使用される用語「置換され（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」は、指定された原子の通常の原子価を超えないという条件で、指定された原子または基上の１つ以上の水素が別の基で置き換えられることを意味し得る（例えば、置換アルキル基）。例えば、置換基がオキソ（すなわち、＝Ｏ）のとき、そのときは原子上の２つの水素が置き換えられる。置換基は、1つ以上の、ヒドロキシル、アミノ（例えば、第一級、第二級、または第三級）、アルデヒド、カルボン酸、エステル、アミド、ケトン、ニトロ、尿素、グアニジン、シアノ、フルオロアルキル（例えば、トリフルオロメタン）、ハロ（例えば、フルオロ）、アリール（例えば、フェニル）、ヘテロシクリル若しくは複素環基（すなわち、１つ以上のヘテロ原子を有する、例えば、芳香族（例えば、ヘテロアリール）または非芳香族の環状基）、オキソ、またはそれらの組合せを含み得る。置換基および／または変数の組合せは、置換が化合物の合成または使用に重大な悪影響を及ぼさないという条件で許容される。
式１によれば、ｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４のそれぞれは、ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４の合計が５～５０００、５～２０００、５～１０００、５～５００、５～１００、または５～５０などの５より大きいという条件で、０から１０００（例えば、０から５００、０から２００、０から１００、または０から５０）の整数である。いくつかの実施態様においては、ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４の合計は、１０より大きいかまたは２０より大きい（例えば、１０～５０００、１０～２０００、１０～１０００、１０～５００、１０～１００、若しくは１０～５０；または２０～５０００、２０～２０００、２０～１０００、２０～５００、２０～１００、若しくは２０～５０）。さらに、ｎ１およびｎ２のそれぞれは、ｎ１＋ｎ２の合計が２より大きい（例えば、２～２０００、２～１０００、２～５００、２～２００、２～１００、２～５０、または２～２５）という条件で、０から１０００（例えば、０から５００、０から２００、０から１００、０から５０、または０から２５）の整数である。いくつかの実施態様においては、ｎ１＋ｎ２の合計は、５より大きいかまたは１０より大きい（例えば、５～２０００、５～１０００、５～５００、５～２００、５～１００、５～５０、若しくは５～２５；または１０～２０００、１０～１０００、１０～５００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、若しくは１０～２５）。換言すると、ポリマーは、本明細書においてそれぞれ「Ａモノマー」および「Ｂモノマー」として総称される、基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、および／またはＢ２を含む少なくともいくつかのモノマー単位を含む。同様に、ポリマーは、本明細書において「Ｘモノマー」として総称される、基Ｘ１および／またはＸ２を含む少なくともいくつかのモノマー単位を含む。いくつかの実施態様においては、ｍ１およびｍ２は、ゼロであり、ポリマーがＡ１またはＡ２基を何も含まない。いくつかの実施態様においては、ｍ３およびｍ４は、ゼロであり、ポリマーがＢ１またはＢ２基を何も含まない。
ポリマーは、Ｘモノマーに対して任意の適切な比率のＡおよびＢモノマーを含み得る。いくつかの実施態様においては、ポリマーは、約２５以下、かつ任意に約１以上のＸモノマーに対するＡおよびＢモノマーの比率（例えば、（ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４）／（ｎ１＋ｎ２）の比率）を含む。例えば、Ｘモノマーに対するＡおよびＢモノマーの比率は、約１から約２５、約１から約２０、約１から約１０、約１から約５、約５から約２５、約１０から約２５、または約１５から約２５であり得る。
ポリマーがＡモノマーおよびＢモノマーの両方を含む実施態様においては、ポリマーは、Ｂモノマーに対して任意の適切な比率のＡモノマーを含み得る。いくつかの実施態様においては、Ｂモノマーに対するＡモノマーの比率（例えば、（ｍ１＋ｍ２）／（ｍ３＋ｍ４））は、約２０以下（例えば、約１０以下、約５以下、約２以下、または約１以下でさえ）であり得る。いくつかの実施態様においては、（ｍ１＋ｍ２）／（ｍ３＋ｍ４）の比率は、約０．５以上などの約０．２以上である。
ポリマーは、任意の適切な構造タイプとして存在し得る。例えば、ポリマーは、交互ポリマー、ランダムポリマー、ブロックポリマー、グラフトポリマー、線状ポリマー、分岐ポリマー、環状ポリマー、またはそれらの組合せとして存在し得る。特定の実施態様においては、ポリマーは、ランダムポリマー、ブロックポリマー、グラフトポリマー、またはそれらの組合せである。
すなわち、式１の構造において、モノマー（それらのそれぞれの側鎖Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｘ１、およびＸ２によって参照し得る）は、ランダムにまたは任意の順序で配置することができる。整数ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４、ｎ１、およびｎ２は、単に鎖全体中に現れるそれぞれのモノマーの数を示すだけであり、いくつかの実施態様においては所与のモノマーのブロックまたはストレッチが存在し得るであろうが、必ずしもそれらのモノマーの特定の順序またはブロックを意味しまたは表すわけではない。例えば、式１の構造は、－Ａ１－Ａ２－Ｂ１－Ｂ２－、－Ａ２－Ａ１－Ｂ２－Ｂ１－、－Ａ１－Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－等の順序でモノマーを含み得る。さらに、ポリマーは、Ａおよび／またはＢポリマーのブロック（例えば、任意の順序での［Ａモノマー］ｍ１＋ｍ２－［Ｂモノマー］ｍ３＋ｍ４）を含み得る。ポリマーは、ＡおよびＢモノマーが散在する個々のＸモノマー（例えば、－Ａ－Ｘ－Ｂ－、－Ａ－Ｂ－Ｘ－、－Ｂ－Ｘ－Ａ等）を含み得、またはポリマーは、ポリマーの一端または両端で１つ以上のＸモノマー（例えば、Ｘモノマーのブロック）で「キャップ」することができる。同様に、ポリマーがＡおよび／またはＢモノマーのブロックを含むとき、ポリマーは、Ａおよび／またはＢモノマーのブロックの間に散在するＸモノマーのブロックを含み得、またはポリマーは、ポリマーの一端または両端で１つ以上のＸモノマー（例えば、Ｘモノマーのブロック）で「キャップ」することができる。いくつかの実施態様においては、ポリペプチド（例えば、ポリアスパルタミド）主鎖は、アルファ／ベータ構成で配置され、「１」および「２」モノマーが交互（例えば、－Ａ１－Ａ２－Ｂ１－Ｂ２－、－Ａ２－Ａ１－Ｂ２－Ｂ１－、－Ａ１－Ｂ２－Ｂ１－Ａ２－、－Ａ２－Ｂ１－Ｂ２－Ａ１－、－Ｂ１－Ａ２－Ｂ１－Ａ２－等）（ここで、ポリマーはＸモノマーでキャップされているかまたはＸモノマーが全体に散在している）であろう。しかしながら、「Ａ」および「Ｂ」側鎖（例えば、Ａ１／Ａ２およびＢ１／Ｂ２）は、ポリマー主鎖全体にランダムに分散させることができる。
ポリマー構造においては、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、独立してそれぞれメチレンまたはエチレン基である。いくつかの実施態様においては、Ｒ３ａは、エチレン基であり、Ｒ３ｂは、メチレン基であるか；または、Ｒ３ａは、メチレン基であり、Ｒ３ｂは、エチレン基である。特定の実施態様においては、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、それぞれエチレン基である。いくつかの実施態様においては、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、それぞれメチレン基である。
本明細書において記載されるポリマーにおいては、各Ｘ１基は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合である。各Ｘ１基は、互いに同じまたは異なり得る。いくつかの実施態様においては、Ｘ１は、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－である。いくつかの実施態様においては、Ｘ１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。
Ｒ１３の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基、アリール基、若しくは複素環基（例えば、１つ、２つ、または３つのヘテロ原子を含む３～１２、３～１０、３～８、または３～６員の複素環基）であり、それらのいずれも１つ以上の置換基で置換され得る。いくつかの実施態様においては、Ｒ１３は、直鎖または分岐であり得るＣ１－Ｃ１２アルキル基（例えば、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基；Ｃ１－Ｃ８アルキル基；Ｃ１－Ｃ６アルキル基；Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、またはＣ１若しくはＣ２アルキル基）である。特定の実施態様においては、各Ｒ１３は、メチルまたは水素である。いくつかの実施態様においては、Ｒ１３は、メチルであり；他の実施態様においては、Ｒ１３は、水素である。各Ｒ１３は、独立して選択され、同じまたは異なり得；しかしながら、いくつかの実施態様においては、各Ｒ１３は、同じである（例えば、全てメチルまたは全て水素）。
Ｘ２の各事例は、独立してＣ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基、アリール基、または複素環基（例えば、１つ、２つ、または３つのヘテロ原子を含む３～１２、３～１０、３～８、または３～６員の複素環基）またはそれらの組合せであり、それらのいずれも１つ以上の置換基で置換され得る。いくつかの実施態様においては、Ｘ２は任意に、１つ以上の第一級、第二級、または第三級アミンを含み得る。従って、各Ｘ２は、独立して選択され、従って、互いに同じまたは異なり得る。特定の実施態様においては、Ｘ２の各事例は、独立して、任意に１つ以上の第一級、第二級、または第三級アミンを含む、Ｃ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基、またはそれらの組合せである。いくつかの実施態様においては、１つ以上の（または全ての）Ｘ２基は、独立してＣ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ１２、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、Ｃ４－Ｃ１２、Ｃ４－Ｃ６、Ｃ６－Ｃ１２、またはＣ８－Ｃ１２）アルキル基若しくはアルケニル基、またはＣ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、Ｃ４－Ｃ１２、Ｃ４－Ｃ６、Ｃ６－Ｃ１２、またはＣ８－Ｃ１２）シクロアルケニル基であり得る。他の実施態様においては、１つ以上の（または全ての）Ｘ２基は、独立してＣ１－Ｃ８（例えば、Ｃ１－Ｃ６、Ｃ１－Ｃ４、Ｃ１－Ｃ３、Ｃ２－Ｃ８、またはＣ２－Ｃ６）アルキル基であり得る。前述のアルキルまたはアルケニル基のいずれも、直鎖または分岐であり得る。
基Ａ１およびＡ２は、独立して選択され、従って、互いに同じまたは異なり得る。同様に、基Ｂ１およびＢ２は、独立して選択され、互いに同じまたは異なり得る。しかしながら、いくつかの実施態様においては、Ａ１およびＡ２は同じであり並びに／またはＢ１およびＢ２は同じである。
基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、およびＢ２において、整数ｐ１からｐ４（すなわち、ｐ１、ｐ２、ｐ３、およびｐ４）、ｑ１からｑ６（すなわち、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、およびｑ６）、ｒ１、ｒ２、およびｓ１からｓ４（すなわち、ｓ１、ｓ２、ｓ３、およびｓ４）は、独立してそれぞれ１から５の整数（例えば、１、２、３、４、または５）である。いくつかの実施態様においては、ｐ１からｐ４（すなわち、ｐ１、ｐ２、ｐ３、およびｐ４）、ｑ１からｑ６（すなわち、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、およびｑ６）、ｒ１、ｒ２、および／またはｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から３の整数（例えば、１、２、または３）である。特定の実施態様においては、ｐ１からｐ４（すなわち、ｐ１、ｐ２、ｐ３、およびｐ４）、ｑ１からｑ６（すなわち、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、およびｑ６）、および／またはｓ１からｓ４（すなわち、ｓ１、ｓ２、ｓ３、およびｓ４）は、それぞれ２である。いくつかの実施態様においては、ｐ１からｐ４（すなわち、ｐ１、ｐ２、ｐ３、およびｐ４）および／またはｑ１からｑ６（すなわち、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、およびｑ６）は、それぞれ２であり、ｒ１、ｒ２、およびｓ１からｓ４（すなわち、ｓ１、ｓ２、ｓ３、およびｓ４）は、それぞれ１である。
Ｒ２の各事例は、水素若しくはＣ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基であり得るか、またはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成する。いくつかの実施態様においては、Ｒ２は、水素または直鎖若しくは分岐であり得るＣ１－Ｃ１２アルキル（例えば、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基；Ｃ１－Ｃ８アルキル基；Ｃ１－Ｃ６アルキル基；Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、またはＣ１若しくはＣ２アルキル基）である。特定の実施態様においては、Ｒ２は、メチルである。他の実施態様においては、Ｒ２は、水素であり得る。各Ｒ２は、独立して選択され、同じまたは異なり得る。いくつかの実施態様においては、所与の各Ｒ２は、同じである（例えば、全てメチルまたは全て水素）。
Ｒ４の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－である。いくつかの実施態様においては、Ｒ４の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－である。特定の実施態様においては、Ｒ４の各事例は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。特定の実施態様においては、Ｒ４の各事例は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－である。
Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである。Ｒ５は、約２から約５０個の炭素原子（例えば、約２から約４０個の炭素原子、約２から約３０個の炭素原子、約２から約２０個の炭素原子、約２から約１６個の炭素原子、約２から約１２個の炭素原子、約２から約１０個の炭素原子、または約２から約８個の炭素原子）を含み得る。いくつかの実施態様においては、Ｒ５は、２から８個の（すなわち、２、３、４、５、６、７、または８個の）第三級アミンを含むヘテロアルキル基である。第三級アミンは、ヘテロアルキル主鎖（すなわち、ヘテロアルキル基における原子の最長の連続鎖の一部、またはペンダント置換基であり得る。すなわち、例えば、第三級アミンを含むヘテロアルキル基は、２～８個の第三級アミンを含むアルキルアミノ基、アミノアルキル基、アルキルアミノアルキル基、アミノアルキルアミノ基等を提供し得る。
いくつかの実施態様においては、各Ｒ５は、独立して：
Figure 2022530224000003
Figure 2022530224000004
（式中、
Ｒ２の各事例は、上記のとおりであり；
Ｒ７は、任意に１つ以上のアミンで置換された、Ｃ１－Ｃ５０アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基であり；
ｚは、１から５の整数であり；
ｃは、０から５０の整数であり；
Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
ｎは、０から５０の整数であり；
Ｒ８は、組織特異的若しくは細胞特異的なターゲッティング部分。Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基である）から選択される。
Ｒ７は、任意に１つ以上のアミンで置換された、Ｃ１－Ｃ５０（例えば、Ｃ１－Ｃ４０、Ｃ１－Ｃ３０、Ｃ１－Ｃ２０、Ｃ１－Ｃ１０、Ｃ４－Ｃ１２、またはＣ６－Ｃ８）アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基であり得る。いくつかの実施態様においては、Ｒ７は、任意に１つ以上のアミンで置換された、Ｃ６－Ｃ８などのＣ４－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基である。いくつかの実施態様においては、Ｒ７は、１つ以上のアミンで置換されている。特定の実施態様においては、Ｒ７は、２から８個の（すなわち、２、３、４、５、６、７、または８個の）第三級アミンで置換されている。第三級アミンは、アルキル基の一部（すなわち、アルキル基主鎖中に包含される）またはペンダント置換基であり得る。
Ｙの各事例は、任意に存在する。本明細書において使用される句「任意に存在する」は、任意に存在するとして指定された置換基が存在するまたは存在しないこともあり得、その置換基が存在しないときは、隣接する置換基が互いに直接結合することを意味する。Ｙが存在するとき、Ｙは、切断可能なリンカーである。本明細書において使用される句「切断可能なリンカー」は、切断して２つの種を分離することができる、該２つの種を接続する任意の化学要素を指す。例えば、切断可能なリンカーは、加水分解プロセス、光化学プロセス、ラジカルプロセス、酵素プロセス、電気化学プロセス、またはそれらの組合せによって切断することができる。例示的な切断可能なリンカーは、
Figure 2022530224000005
（式中、Ｒ１４の各場合は独立して、Ｃ１－Ｃ４アルキル基であり、Ｒ１５の各場合は独立して、水素、アリール基、複素環基（例えば、芳香族または非芳香族）、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基であり、Ｒ１６は、任意に１つ以上の－ＯＣＨ３、－ＮＨＣＨ３、－Ｎ（ＣＨ３）２、－ＳＣＨ３、－ＯＨ、若しくはそれらの組合せで置換された６員の芳香族またはヘテロ芳香族基である）を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様においては、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、独立して式－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＨ－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＨ２若しくは－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＨ－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＨＣＨ３の基、または基－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２若しくは－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨＣＨ３若しくは－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２である。いくつかの実施態様においては、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、独立して式－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ（Ｒ２））－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１Ｎ（Ｒ２）２若しくは－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ（Ｒ２）－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＨ（Ｒ２）（式中、Ｒ２は、メチルまたはエチルである）の基；または基－（ＣＨ２）２－Ｎ（ＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、若しくは－（ＣＨ２）２－Ｎ（ＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＮＨＣＨ３、若しくは－（ＣＨ２）２－Ｎ（ＣＨ３）－（ＣＨ２）２－Ｎ（ＣＨ３）２である。
さらに、またはあるいは、Ｂ１およびＢ２のそれぞれは、基－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－Ｒ４－Ｒ５、または基－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ５などの式－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＨ－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＨ－（ＣＨ２）２－Ｒ４－Ｒ５（式中、Ｒ４およびＲ５は、上記のとおりである）の基である。
いくつかの実施態様においては、式１のポリマーは、いかなるＢモノマーも有しない（例えば、ｍ３およびｍ４は、両方とも０である）。すなわち、提供されるのはまた、式４：
Figure 2022530224000006
（式中：
ｍ１およびｍ２のそれぞれは、ｍ１＋ｍ２の合計が５より大きい（例えば、５～２０００、５～１０００、５～５００、５～１００、または５～５０）という条件で、０から１０００（例えば、０から５００、０から２００、０から１００、または０から５０）の整数である）の構造を有するポリマーである。いくつかの実施態様においては、ｍ１＋ｍ２の合計は、１０より大きいかまたは２０より大きい（例えば、１０～５０００、１０～２０００、１０～１０００、１０～５００、１０～１００、若しくは１０～５０；または２０～５０００、２０～２０００、２０～１０００、２０～５００、２０～１００、若しくは２０～５０）。さらに、ｎ１およびｎ２のそれぞれは、ｎ１＋ｎ２の合計が２より大きい（例えば、２～２０００、２～１０００、２～５００、２～２００、２～１００、２～５０、または２～２５）という条件で、０から１０００（例えば、０から５００、０から２００、０から１００、０から５０、または０～２５）の整数である。いくつかの実施態様においては、ｎ１＋ｎ２の合計は、５より大きいかまたは１０より大きい（例えば、５～２０００、５～１０００、５～５００、５～２００、５～１００、５～５０、若しくは５～２５；または１０～２０００、１０～１０００、１０～５００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、若しくは１０～２５）。
式４のポリマーのいくつかの実施態様においては、Ａ１およびＡ２は、独立してそれぞれ式
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、並びにｒ１およびｒ２は、独立してそれぞれ１から５の整数（例えば、１～３の整数）であり、Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基である）の基である。いくつかの実施態様においては、Ｒ２置換基を含有する基Ａ１およびＡ２における各窒素は、末端アミンが第一級、第二級、若しくは第三級アミンであり得るか、またはいくつかの実施態様においては、第二級若しくは第三級アミンであり得ることを除いて、第三級アミンである。さらなる例示として、Ａ１およびＡ２のそれぞれは、－（ＣＨ２）２－ＮＲ２－（ＣＨ２）２－ＮＲ２ ２であり得、ここで、Ｒ２の各事例は、独立して上記した水素、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、特にメチルまたはエチルなどのアルキルであり、ここで、任意に各アミンは、末端アミンが第二級または第三級アミンであることを除いて、第三級アミンである。
基Ａ１およびＡ２の特定の非限定的な例は、例えば、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２；－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２；－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２；－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２；－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ（ＣＨ３）；－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ（ＣＨ３）；－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ（ＣＨ３）；－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ（ＣＨ３）を含む。
式４のポリマーの全ての他の一面は、式４の置換基に関するその全ての実施態様を含めて、式１に関して記載したとおりである。すなわち、例えば、式４のいくつかの実施態様においては、Ｒ１３の各事例は、Ｒ１３が水素またはメチルである特定の実施態様を含めて、式１に関して記載した任意の基であり得、Ｒ３ａおよびＲ３ｂの各事例は、Ｒ３ａおよびＲ３ｂがメチレンまたはエチレンである実施態様を含めて、式１に関して記載した任意の基であり得る。同様に、Ｘ１およびＸ２は、Ｘ１が－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－でありおよび／または１つ以上の（または全ての）Ｘ２基が独立してＣ１－Ｃ８（例えば、Ｃ１－Ｃ６、Ｃ１－Ｃ４、Ｃ１－Ｃ３、Ｃ２－Ｃ８、またはＣ２－Ｃ６）アルキル基であり得る実施態様を含めて、式１に関して記載した任意の基であり得る。
いくつかの実施態様においては、ポリマーは、式１Ａ：
Figure 2022530224000007
（式中、Ｑは、式：
Figure 2022530224000008
であり
ｃは、０から５０の整数であり；
Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
ｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４の合計は５より大きく；
ｎ１およびｎ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｎ１＋ｎ２の合計は２より大きく；
記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示し；
Ｒ１は、水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、またはＣ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基であり；
Ｒ６は、水素、アミノ基、任意に１つ以上のアミンで置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、若しくはＣ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基であるか；または組織特異的若しくは細胞特異的なターゲッティング部分である）の構造を有する。
式１Ａの全ての他の一面は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、式１に関して記載したとおりである。
いくつかの実施態様においては、ポリマーは、式１Ｂ：
Figure 2022530224000009
（式中、
ｃは、０から５０の整数であり；
Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
ｍ１およびｍ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｍ１＋ｍ２の合計は５より大きく；
ｎ１およびｎ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｎ１＋ｎ２の合計は２より大きく；
記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示し；
Ｒ１は、水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、またはＣ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基であり；
Ｒ６は、水素、アミノ基、任意に１つ以上のアミンで置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、若しくはＣ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基であるか；または組織特異的若しくは細胞特異的なターゲッティング部分である）の構造を有する。
式１Ｂの全ての他の一面は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、式１および式４に関して記載したとおりである。
いくつかの実施態様においては、ポリマーは、式１Ｃ：
Figure 2022530224000010
（式中、
ｍ１およびｍ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｍ１＋ｍ２の合計は５より大きく；
ｎ１およびｎ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｎ１＋ｎ２の合計は２より大きく；
記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示し；
Ｒ１は、水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、またはＣ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基であり；
Ｒ６は、水素、アミノ基、任意に１つ以上のアミンで置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２（例えば、Ｃ１－Ｃ８、Ｃ１－Ｃ６、またはＣ１－Ｃ３）アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２（例えば、Ｃ２－Ｃ８、Ｃ２－Ｃ６、またはＣ２－Ｃ３）アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルキル基、若しくはＣ３－Ｃ１２（例えば、Ｃ３－Ｃ８、Ｃ３－Ｃ６、またはＣ３－Ｃ５）シクロアルケニル基であるか；または組織特異的若しくは細胞特異的なターゲッティング部分である）の構造を有する。式１Ｃの全ての他の一面は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、式１および式４に関して記載したとおりである。
いくつかの実施態様においては、Ｒ１および／またはＲ６は、直鎖または分岐であり得、任意に１つ以上の置換基で置換された、Ｃ１－Ｃ１２アルキル（例えば、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基；Ｃ１－Ｃ８アルキル基；Ｃ１－Ｃ６アルキル基；Ｃ１－Ｃ４アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、またはＣ１若しくはＣ２アルキル基）である。特定の実施態様においては、ヘテロアルキルまたはアルキル基は、１つ以上のアミン、例えば、２から８個の（すなわち、２、３、４、５、６、７、または８個の）第三級アミンを含むか、またはそれらで置換されている。第三級アミンは、ヘテロアルキル主鎖の一部またはペンダント置換基であり得る。
ポリマーは、該ポリマーが前述のポリマー構造を含むという条件で、任意の適切なポリマーであり得る。いくつかの実施態様においては、ポリマーは、式１の構造を有するポリマーブロックおよび１つ以上の他のポリマーブロック（例えば、エチレンオキシドサブユニット、またはプロピレンオキシドサブユニット）を含むブロックコポリマーである。他の実施態様においては、式１の構造は、任意の適切な末端基を含み得る、ポリマーの唯一のポリマー単位である。特定の実施態様においては、ポリマーは、組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基をさらに含む。
いくつかの実施態様においては、ポリマーは、式５Ａ：
Figure 2022530224000011
（式中、Ｑは、式：
Figure 2022530224000012
であり
ｃは、２から２００（例えば、２から１５０、２から１００、２から５０、１０から２００、１０から１５０、１０から１００、１０から５０、２５から２００、２５から１５０、２５から１００、２５から５０、５０から２００、５０から１５０、または５０から１００）の整数であり；
Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
全ての他の置換基は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、式１、１Ａ～１Ｃ、および４に関して記載したとおりである）の構造を有する。
いくつかの実施態様においては、ポリマーは、式５Ｂ：
Figure 2022530224000013
（式中、
ｃは、２から２００（例えば、２から１５０、２から１００、２から５０、１０から２００、１０から１５０、１０から１００、１０から５０、２５から２００、２５から１５０、２５から１００、２５から５０、５０から２００、５０から１５０、または５０から１００）の整数であり；
Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
全ての他の置換基は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、式１、１Ａ～１Ｃ、および４に関して記載したとおりである）の構造を有する。
本明細書において提供されるポリマーの非限定的な例は、例えば：
Figure 2022530224000014
Figure 2022530224000015
Figure 2022530224000016
Figure 2022530224000017
Figure 2022530224000018
Figure 2022530224000019
Figure 2022530224000020
Figure 2022530224000021
Figure 2022530224000022
Figure 2022530224000023
Figure 2022530224000024
Figure 2022530224000025
（式中、（ａ＋ｂ）は、約５から約６５（例えば、約５から約５０、約５から約４０、約５から約３０、約５から約２０、または約５から約１０）であり、（ｃ＋ｄ）は、約２から約６０（例えば、約２から約５０、約２から約４０、約２から約３０、約２から約２０、または約２から約１０）である）を含む。他の実施態様においては、（ａ＋ｂ）は、約４５であり、（ｃ＋ｄ）は、約２０である。繰り返すが、これらの例示的なポリマーにおける単位の数（「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、および「ｄ」）の表示は、ブロックコポリマー構造を意味するのではなく；むしろ、これらの数字は、全体に渡る単位の数を示し、その単位は、式における「／」記号によって示されるようにランダムに配置することができる。
本開示によって提供されるポリマー（例えば、イオン性のまたはイオン化可能な基を有するポリマー）の追加の特定の例はさらに、以下を含む。
Figure 2022530224000026
Figure 2022530224000027
Figure 2022530224000028
Figure 2022530224000029
Figure 2022530224000030
Figure 2022530224000031
Figure 2022530224000032
Figure 2022530224000033
Figure 2022530224000034
Figure 2022530224000035
Figure 2022530224000036
ＰＥＧ末端基を含む本明細書において提供されるポリマーのさらなる例は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000037
これらの例示的なポリマーにおける単位の数（「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、および「ｄ」）の表示は、ブロックコポリマー構造を意味するのではなく；むしろ、これらの数は、全体に渡る特定のモノマー単位の数を示し、その単位は、ポリマー全体にランダムに配置されるモノマーのブロックまたはモノマーを含めて、任意の順序で配置することができる。全てではないが、いくつかの事例においては、これは、式における「／」記号によってさらに示され；しかしながら、「／」の不在は、ポリマーが特定の順序で結合していることを意味すると捉えるべきでない。前述のポリマー１～６９のいくつかの実施態様においては、括弧および整数（「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、または「ｄ」）によって指定されるモノマーは、ポリマー全体にランダムに配置されまたは分散されている。
前述のポリマーのいずれにおいても、（ａ＋ｂ）は、約５から約６５（例えば、約５から約５０、約５から約４０、約５から約３０、約５から約２０、または約５から約１０）であり、（ｃ＋ｄ）は、約２から約６０（例えば、約２から約５０、約２から約４０、約２から約３０、約２から約２０、または約２から約１０）である。特定の実施態様においては、（ａ＋ｂ）は、約５５であり、（ｃ＋ｄ）は、約１０である。他の実施態様においては、（ａ＋ｂ）は、約４５であり、（ｃ＋ｄ）は、約２０である。特定の実施態様においては、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）は、約１０～４００、約１０～２００、または約１０～１００（例えば、約２５～１００または約５０～７５）などの約１０～５００である。
ポリマーは、（ｃ＋ｄ）に対する任意の適切な比率の（ａ＋ｂ）を含み得る。他の実施態様においては、（ａ＋ｂ）は、ポリマー単位の総数（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）の１０～９５％（例えば、１０～７５％、１０～６５％、１０～５０％、２０～９５％、２０～７５％、２０～６５％、２０～５０％、３０～９５％、３０～７５％、３０～６５％、または３０～５０％）の範囲である。他の実施態様においては、（ｃ＋ｄ）は、ポリマー単位の総数（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）の５～９０％（例えば、５～７５％、５～６５％、５～５０％、５～４０％、５～３０％、１０～９０％、１０～７５％、１０～６５％、１０～５０％、１０～４０％、または１０～３０％）の範囲である。さらに他の実施態様においては、（ａ＋ｂ）：（ｃ＋ｄ）の比率は、約１から約２５、約１から約２０、約１から約１０、約１から約５、約５から約２５、約１０から約２５、または約１５から約２５であり得る。
上記のポリマーのいくつかは、イオン化可能な側鎖「ｅ」および「ｆ」を有するモノマーを含み、その場合、ａ、ｂ、ｃ、およびｄは上記のとおりであり、（ｅ＋ｆ）は、約２から約６０（例えば、約２から約５０、約２から約４０、約２から約３０、約２から約２０、または約２から約１０）である。さらに、ｐの各事例は、独立して２から２００（例えば、２から１５０、２から１００、２から５０、１０から２００、１０から１５０、１０から１００、１０から５０、２５から２００、２５から１５０、２５から１００、２５から５０、５０から２００、５０から１５０、または５０から１００）の整数である。さらに、（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ＋ｆ）は、約１０～４００、約１０～２００、または約１０～１００（例えば、約２５～１００または約５０～７５）などの約１０～５００である。繰り返すが、これらの例示的なポリマーにおける単位の数（「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、および「ｆ」）の表示は、ブロックコポリマー構造を意味するのではなく；むしろ、これらの数字は、全体に渡る単位の数を示し、その単位は、ランダムに配置することができる。
本開示によって提供されるポリマーの上記の特定の例のいくつかは、特定の末端基（例えば、アルキルアミノ、水素、またはＰＥＧ）とともに示され；しかしながら、前述の特定の構造のいずれも、異なる末端基を含み得る。例えば、前述の構造のいずれも、ポリマー主鎖のいずれかまたは両方の末端に、本明細書において記載されるＲ１、Ｒ６、またはＱの基を含む。
前述のポリマーのいずれも、記載された式において示される位置に組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含み得るか、またはさもなければ該ポリマーは、組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含むように修飾することができる。例えば、該部分は、ポリマーの末端に付加することができ、または基Ａ１、Ａ２、Ｂ１、および／またはＢ２の末端アミンは、組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を付け加えるように修飾することができる（例えば、マイケル付加反応、エポキシド開環、置換反応、または他の適切な技術によって）。組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、所与の標的組織または細胞を認識する（例えば、特異的に結合する）（例えば、特定のリガンド、受容体、またはターゲッティング部分が標的組織若しくは細胞と他の非標的組織若しくは細胞との間を判別することを可能にする他のタンパク質若しくは分子に特異的に結合する）ことができる任意の小分子、タンパク質（例えば、抗体または抗原）、アミノ酸配列、糖、オリゴヌクレオチド、金属ベースのナノ粒子、またはそれらの組合せであり得る。いくつかの実施態様においては、組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、リガンドの受容体である。いくつかの実施態様においては、組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、受容体のリガンドである。
組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、任意の所望の組織または細胞型を標的とするために使用することができる。いくつかの実施態様においては、組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、ポリマーを対象の末梢神経系、中枢神経系、肝臓、筋肉（例えば、心筋）、肺、骨（例えば、造血細胞）、または眼の組織に局在化させる。特定の実施態様においては、組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、ポリマーを腫瘍細胞に局在化させる。例えば、組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、特定の組織または細胞上の受容体に結合する糖であり得る。
いくつかの実施態様においては、組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、
Figure 2022530224000038
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは、独立して水素、ハロゲン、任意に１つ以上のアミノ基で置換された、Ｃ１－Ｃ４アルキル、またはＣ１－Ｃ４アルコキシである）である。特定の組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分は、ポリマーを本明細書において記載される組織に局在化させるために選択することができる。例えば、ポリマーを末梢神経系、中枢神経系、または免疫細胞に局在化させるためにα－ｄ－マンノースを使用することができ、ポリマーを肝臓肝細胞に局在化させるためにα－ｄ－ガラクトースおよびＮ－アセチルガラクトサミンを使用することができ、ポリマーを腫瘍細胞に局在化させるために葉酸を使用することができる。
典型的には、ポリマーは、カチオン性である（すなわち、ｐＨ７および２３℃で正に帯電している）。本明細書において使用される「カチオン性」ポリマーは、ポリマーがカチオン性モノマー単位のみを含むか、またはカチオン性モノマー単位および非イオン性若しくはアニオン性モノマー単位の組合せを含むかにかかわらず、全体に渡る正味の正電荷を有するポリマーを指す。
特定の実施態様においては、ポリマーは、約５ｋＤａから約２，０００ｋＤａの重量平均分子量を有する。ポリマーは、約２，０００ｋＤａ以下、例えば、約１，８００ｋＤａ以下、約１，６００ｋＤａ以下、約１，４００ｋＤａ以下、約１，２００ｋＤａ以下、約１，０００ｋＤａ以下、約９００ｋＤａ以下、約８００ｋＤａ以下、約７００ｋＤａ以下、約６００ｋＤａ以下、約５００ｋＤａ以下、約１００ｋＤａ以下、または約５０ｋＤａ以下の重量平均分子量を有し得る。あるいは、またはさらに、ポリマーは、約１０ｋＤａ以上、例えば、約５０ｋＤａ以上、約１００ｋＤａ以上、約２００ｋＤａ以上、約３００ｋＤａ以上、または約４００ｋＤａ以上の重量平均分子量を有し得る。すなわち、ポリマーは、前述のエンドポイントの任意の２つによって囲まれる重量平均分子量を有し得る。例えば、ポリマーは、約１０ｋＤａから約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約１００ｋＤａ、約１０ｋＤａから約５００ｋＤａ、約５０ｋＤａから約５００ｋＤａ、約１００ｋＤａから約５００ｋＤａ、約２００ｋＤａから約５００ｋＤａ、約３００ｋＤａから約５００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約５００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約６００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約７００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約８００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約９００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約１，０００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約１，２００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約１，４００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約１，６００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約１，８００ｋＤａ、約４００ｋＤａから約２，０００ｋＤａ、約２００ｋＤａから約２，０００ｋＤａ、約５００ｋＤａから約２，０００ｋＤａ、または約８００ｋＤａから約２，０００ｋＤａの重量平均分子量を有し得る。
重量平均分子量は、任意の適切な技術によって決定することができる。一般に、重量平均分子量は、ＴＳＫｇｅｌ Ｇｕａｒｄ、ＧＭＰＷ、ＧＭＰＷ、Ｇ１０００ＰＷ、およびＷａｔｅｒｓ ２４１４（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）屈折率検出器から選択されるカラムを備えるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して決定する。さらに、重量平均分子量は、１５０～８７５，０００ダルトンの範囲のポリエチレンオキシド／ポリエチレングリコール標準を用いた較正から決定する。
製造方法
本発明はまた、本明細書において記載されるポリマーを製造する方法を提供する。いくつかの実施態様においては、該方法は、本明細書において記載されたとおりである式４：
Figure 2022530224000039
のポリマーを、式２または式３：
Figure 2022530224000040
（式中、
ｐ１は、１から２０００（例えば、１から１０００、１から５００、１から２００、１から１００、５から２０００、５から１０００、５から５００、５から２００、または５から１００）の整数であり；
ｐ２は、１から２０００（例えば、１から１０００、１から５００、１から２００、１から１００、２から２０００、２から１０００、２から５００、２から２００、または２から１００）の整数であり；
各Ｒ３は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
Ｘ１およびＸ２は、式１、１Ａ～１Ｃ、および４に関して前記したとおりである）の構造を含むポリマーから製造することを含む。
すなわち、例えば、各Ｘ１は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合であり；Ｘ２の各事例は、独立して、任意に１つ以上の置換基で置換された、Ｃ１－Ｃ１２アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルケニル基、アリール基、複素環基、またはそれらの組合せである。式１、１Ａ～１Ｃ、および４に関して前記したＸ１およびＸ２の全ての他の実施態様はまた、式２および３のＸ１およびＸ２にも適用される。
該方法は、式２または式３の構造を、式ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物、および任意に式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物と化合させることを含む。より具体的には、式２の構造は、（ａ）式ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物、並びに（ｂ）式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物と、同時にまたは順次任意の順序で化合させて（反応させて）、式４の化合物を提供することができる。同様に、すでにＸ２基を含む式３の化合物は、式ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物と化合させて（反応させて）、式４の化合物を提供することができる。
ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物において、Ｒ１３の各事例は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、式１、１Ａ～１Ｃ、および４のポリマーに関して前記したとおりである。すなわち、例えば、Ｒ１３の各事例は、独立して水素、アリール基、複素環基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基であり得、それらのいずれも任意に１つ以上の置換基で置換され得る。
同様に、Ａ１およびＡ２は、式１、１Ａ～１Ｃ、および４のポリマーに関して前記したとおりである。すなわち、例えば、Ａ１およびＡ２は、独立してそれぞれ式
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、並びにｒ１およびｒ２は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、またはＣ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成する）の基である。いくつかの実施態様においては、Ａ１およびＡ２は、同じである。
式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物の基Ｘ２は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、式１、１Ａ～１Ｃ、３、および４に関して記載したとおりである。
式２、３、および４の全ての他の置換基および一面は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、本発明のポリマー（例えば、式１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および４）に関して本明細書において記載したとおりである。
ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の並びに式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物は、所望の置換度に依存して、任意の適切な方法および量で式２または３の化合物に加えることができる。いくつかの実施態様においては、約１～４００当量（例えば、約１～３５０、１～３００、１～２５０、１～２００、１～１５０、１～１００、１～５０、１０～４００、１０～３５０、１０～３００、１０～２５０、１０～２００、１０～１５０、１０～１００、１０～５０、２０～４００、２０～３５０、２０～３００、２０～２５０、２０～２００、２０～１５０、２０～１００、２０～５０、３０～４００、３０～３５０、３０～３００、３０～２５０、３０～２００、３０～１５０、３０～１００、３０～５０、４０～４００、４０～３５０、４０～３００、４０～２５０、４０～２００、４０～１５０、４０～１００、４０～５０、５０～４００、５０～３５０、５０～３００、５０～２５０、５０～２００、５０～１５０、または５０～１００当量）の式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物を、式２のポリマーに加える。また、いくつかの実施態様においては、約１～４００当量（例えば、約１～３５０、１～３００、１～２５０、１～２００、１～１５０、１～１００、１～５０、１０～４００、１０～３５０、１０～３００、１０～２５０、１０～２００、１０～１５０、１０～１００、１０～５０、２０～４００、２０～３５０、２０～３００、２０～２５０、２０～２００、２０～１５０、２０～１００、２０～５０、３０～４００、３０～３５０、３０～３００、３０～２５０、３０～２００、３０～１５０、３０～１００、３０～５０、４０～４００、４０～３５０、４０～３００、４０～２５０、４０～２００、４０～１５０、４０～１００、４０～５０、５０～４００、５０～３５０、５０～３００、５０～２５０、５０～２００、５０～１５０、または５０～１００当量）の式ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物を、式２または式３のポリマーに加える。
該方法が式ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物並びに式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物を式２のポリマーに加えることを含む実施態様においては、式ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物並びに式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物は、反応混合物中において任意の適切な比率で存在し得る。例えば、式ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物並びに式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物は、約１５０：１から約１：１５０のモル比で存在し得る。いくつかの実施態様においては、約５０：１から約１：１（例えば、約２５：１から約１：１、約１０：１から約１：１、約５：１から約１：１、または約２．５：１から約１：１）などの約１５０：１から約１：１の比率が使用される。他の実施態様においては、比率は、約１：５０から約１：１（例えば、約１：２５から約１：１、約１：１０から約１：１、約１：５から約１：１、または約１：２．５から約１：１）などの約１：１５０から約１：１である。さらに他の実施態様においては、比率は、約１：１０から約１：１５０、約１：４０から約１：１５０、または約１：８０から約１：１５０である。
いくつかの実施態様においては、式２または式３の構造を含むポリマーは、それぞれ、式２Ａまたは式３Ａ：
Figure 2022530224000041
（式中、ｃ、Ｙ、Ｒ１、およびＲ６は、その任意のおよび全ての実施態様を含めて、式１Ａおよび１Ｂのポリマーに関して前記したとおりであり；ｐ１、ｐ２、Ｒ３、Ｘ１、およびＸ２は、式２および３に関して上記したとおりである）のポリマーである。すなわち、例えば：
ｐ１は、１から２０００の整数であり；
ｐ２は、１から２０００の整数であり；
各Ｒ３は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
各Ｘ１は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合であり；
Ｘ２の各事例は、独立して、任意に１つ以上の置換基で置換された、Ｃ１－Ｃ１２アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルケニル基、アリール基、複素環基、またはそれらの組合せであるか、あるいは、式１、１Ａ～１Ｃ、２、３、および４に関して前記したＸ１およびＸ２の任意の他の実施態様であり；
記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示し；
ｃは、０から５０の整数であり；
Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
Ｒ１は、水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、またはＣ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であり；
Ｒ６は、水素、アミノ基、任意に１つ以上のアミンで置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ１－Ｃ１２ヘテロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、Ｃ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であるか；あるいは組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分である。式２Ａおよび３Ａの全ての一面は、それ以外は、本発明のポリマー（例えば、式１、２、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、３、および４）に関して本明細書において記載したとおりである。
特定の実施態様においては、式２または式３の構造を含むポリマーは、それぞれ、式２Ｂまたは式３Ｂ：
Figure 2022530224000042
（式中、ｐ１、ｐ２、Ｒ３、Ｘ１、およびＸ２は、式２、２Ａ、３、および３Ａに関して上記したとおりである）のポリマーである。すなわち、例えば、
ｐ１は、１から２０００の整数であり；
ｐ２は、１から２０００の整数であり；
各Ｒ３は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
各Ｘ１は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合であり；
Ｘ２の各事例は、独立して、任意に１つ以上の置換基で置換された、Ｃ１－Ｃ１２アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルケニル基、アリール基、複素環基、またはそれらの組合せであるか、あるいは、式１、１Ａ～１Ｃ、２、３、および４に関して前記したＸ１およびＸ２の任意の他の実施態様であり；
記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示す。式２Ｂおよび３Ｂの全ての一面は、それ以外は、本発明のポリマー（例えば、式１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、２Ａ、３、３Ａ、および４）に関して本明細書において記載したとおりである。
いくつかの実施態様においては、該方法はまた、式１：
Figure 2022530224000043
のポリマーを製造する方法であって、式４：
Figure 2022530224000044
の構造を含むポリマーの基Ａ１および／またはＡ２の少なくとも一部を修飾して、式１の構造を含むポリマーを生成する、該方法を提供する。
式１および４のポリマーの全ての一面は、本明細書において前記したとおりである。すなわち、例えば：
ｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４の合計は５より大きく；
ｎ１およびｎ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｎ１＋ｎ２の合計は２より大きく；
記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示し；
Ｒ３ａの各事例は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
Ｒ３ｂの各事例は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
各Ｘ１は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合であり；
Ｒ１３の各事例は、独立して水素、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基であり、それらのいずれも任意に１つ以上の置換基で置換され得；
Ｘ２の各事例は、独立して、任意に１つ以上の置換基で置換された、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せであり；
Ａ１およびＡ２は、独立してそれぞれ式
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
の基であり、Ｂ１およびＢ２は、独立してそれぞれ
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ４－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ４－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ４－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ５］２｝２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２、
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；または
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５
である（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、ｒ１およびｒ２、並びにｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、若しくはシクロアルケニル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；Ｒ４の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－であり；Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである）。式１、１Ａ～１Ｃ、および４の全ての一面は、それ以外は、本明細書において記載される式１、１Ａ～１Ｃ、および４の構造の任意のおよび全ての実施態様を含めて、本発明のポリマーに関して本明細書において記載したとおりである。
式１または式４の構造を含むポリマーは、式１Ａ、１Ｂ、および１Ｃを含む本明細書において記載される任意のポリマー、並びに本発明のポリマーに関して記載されるその任意のおよび全ての実施態様であり得る。
式４のポリマーのＡ１および／またはＡ２と指定される基は、Ｂ１および／またはＢ２と指定される基を生成するのに任意の適切な手段によって修飾することができる。例えば、Ａ１および／またはＡ２と指定される基は、マイケル付加反応、エポキシド開環、または置換反応によって修飾することができる。好ましい実施態様においては、Ａ１および／またはＡ２と指定される基は、マイケル付加反応によって修飾する。
一つの実施態様においては、式４の構造を含むポリマーの基Ａ１および／またはＡ２は、式４の構造を含むポリマーとα，β－不飽和カルボニル化合物との間のマイケル付加反応によって修飾する。本明細書において使用される用語「マイケル付加」は、ポリマーの求核試薬（例えば、カルバニオン、酸素アニオン、窒素アニオン、酸素原子、窒素原子、またはそれらの組合せ）のα，β－不飽和カルボニル化合物への求核付加を指す。従って、マイケル付加反応は、式４の構造を含むポリマーとα，β－不飽和カルボニル化合物との間である。いくつかの実施態様においては、ポリマーの求核試薬は、窒素アニオン、窒素原子、またはそれらの組合せである。
α，β－不飽和カルボニル化合物は、求核試薬からのマイケル付加を受け入れることができる任意のα，β－不飽和カルボニル化合物であり得る。いくつかの実施態様においては、α，β－不飽和カルボニル化合物は、アクリレート、アクリルアミド、ビニルスルホン、またはそれらの組合せである。従って、マイケル付加反応は、式４の構造を含むポリマーと、アクリレート、アクリルアミド、ビニルスルホン、またはそれらの組合せとの間であり得る。すなわち、いくつかの実施態様においては、該方法は、式４の構造を含むポリマーおよびアクリレートを接触させること；式４の構造を含むポリマーおよびアクリルアミドを接触させること；または式４の構造を含むポリマーおよびビニルスルホンを接触させることを含む。
Ａ１および／またはＡ２と指定される基をマイケル付加反応によって修飾する実施態様においては、それらは、式：
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ４－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ４－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ４－Ｒ５］２｝２；または
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２
（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、ｒ１およびｒ２、並びにｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、またはＣ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；Ｒ４の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－であり；Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである）のＢ１および／またはＢ２と指定される基を生成する。
使用に適したアクリレート、アクリルアミド、およびビニルスルホンの例は、式：
Figure 2022530224000045
（式中、Ｒ５は、式１、１Ａ、１Ｂ、または１Ｃのいずれかに関して記載したとおりである）のアクリレートを含む。
いくつかの実施態様においては、マイケル付加反応は、酸および／または塩基によって促進される。酸および／または塩基は、任意の適切なｐＫａを有する任意の適切な酸および／または塩基であり得る。酸および／または塩基は、有機酸（例えば、ｐ－トルエンスルホン酸）、有機塩基（例えば、トリエチルアミン）、無機酸（例えば、四塩化チタン）、無機塩基（例えば、炭酸カリウム）、またはそれらの組合せであり得る。
いくつかの実施態様においては、マイケル付加反応は、酸によって促進される。酸は、ブレンステッド酸またはルイス酸であり得る。酸がブレンステッド酸である実施態様においては、酸は、弱酸（すなわち、約４から約７のｐＫａ）または強酸（すなわち、約－２から約４のｐＫａ）であり得る。典型的には、酸は、弱酸である。特定の実施態様においては、酸は、ルイス酸である。例えば、酸は、ビス（トリフルオロメタンスルホン）イミドまたはｐ－トルエンスルホン酸であり得る。
いくつかの実施態様においては、マイケル付加反応は、塩基によって促進される。塩基は、弱塩基（すなわち、約７から約１２のｐＫａ）または強塩基（すなわち、約１２から約５０のｐＫａ）であり得る。典型的には、塩基は、弱塩基である。例えば、塩基は、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ－メチルモルホリン、若しくはＮ，Ｎ－ジメチル－ピペラジン、またはそれらの誘導体であり得る。
いくつかの実施態様においては、マイケル付加反応は、溶媒中で実施される。溶媒は、反応するポリマーおよびα，β－不飽和カルボニル化合物を溶解することができる、任意の適切な溶媒または溶媒の混合物であり得る。例えば、溶媒は、水、プロトン性有機溶媒、および／または非プロトン性有機溶媒を含み得る。溶媒の例示的なリストは、水、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノール、およびエタノールを含む。
一つの実施態様においては、ポリマーの基Ａ１および／またはＡ２は、ポリマーとエポキシド化合物との間のエポキシド開環反応によって修飾する。本明細書において使用される用語「エポキシド開環」は、ポリマーの求核試薬（例えば、カルバニオン、酸素アニオン、窒素アニオン、酸素原子、窒素原子、またはそれらの組合せ）のエポキシド化合物への求核付加を指し、それによってエポキシドを開環させる。従って、エポキシド開環反応は、ポリマーとエポキシド化合物との間である。いくつかの実施態様においては、ポリマーの求核試薬は、窒素アニオン、窒素原子、またはそれらの組合せである。
Ａ１および／またはＡ２と指定される基をエポキシド開環反応によって修飾する実施態様においては、それらは、式：
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５］２｝２
（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、並びにｒ１およびｒ２は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、またはＣ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである）のＢ１および／またはＢ２と指定される基を生成する。
使用に適したエポキシドの例は、式：
Figure 2022530224000046
（式中、Ｒ５は、式１、１Ａ、１Ｂ、または１Ｃのいずれかに関して記載したとおりである）のエポキシドを含む。
いくつかの実施態様においては、エポキシド開環反応は、酸および／または塩基によって促進される。酸および／または塩基は、任意の適切なｐＫａを有する任意の適切な酸および／または塩基であり得る。酸および／または塩基は、有機酸（例えば、ｐ－トルエンスルホン酸）、有機塩基（例えば、トリエチルアミン）、無機酸（例えば、四塩化チタン）、無機塩基（例えば、炭酸カリウム）、またはそれらの組合せであり得る。
いくつかの実施態様においては、エポキシド開環反応は、酸によって促進される。酸は、ブレンステッド酸またはルイス酸であり得る。酸がブレンステッド酸である実施態様においては、酸は、弱酸（すなわち、約４から約７のｐＫａ）または強酸（すなわち、約－２から約４のｐＫａ）であり得る。典型的には、酸は、弱酸である。特定の実施態様においては、酸は、ルイス酸である。例えば、酸は、ビス（トリフルオロメタンスルホン）イミドまたはｐ－トルエンスルホン酸であり得る。
いくつかの実施態様においては、エポキシド開環反応は、塩基によって促進される。塩基は、弱塩基（すなわち、約７から約１２のｐＫａ）または強塩基（すなわち、約１２から約５０のｐＫａ）であり得る。典型的には、塩基は、弱塩基である。例えば、塩基は、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ－メチルモルホリン、若しくはＮ，Ｎ－ジメチル－ピペラジン、またはそれらの誘導体であり得る。
いくつかの実施態様においては、エポキシド開環反応は、溶媒中で実施される。溶媒は、反応するポリマーおよびエポキシド化合物を溶解することができる、任意の適切な溶媒または溶媒の混合物であり得る。例えば、溶媒は、水、プロトン性有機溶媒、および／または非プロトン性有機溶媒を含み得る。溶媒の例示的なリストは、水、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノール、およびエタノールを含む。
一つの実施態様においては、ポリマーの基Ａ１および／またはＡ２は、ポリマーと脱離基（例えば、塩化物原子、臭化物原子、ヨウ化物原子、トシレート、トリフレート、メシレート等）を含む化合物との間の置換反応によって修飾する。本明細書において使用される「置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」は、ポリマーの求核試薬（例えば、カルバニオン、酸素アニオン、窒素アニオン、酸素原子、窒素原子、またはそれらの組合せ）の脱離基を含む化合物への求核付加を指す。従って、置換反応は、ポリマーと脱離基を含む化合物との間である。いくつかの実施態様においては、ポリマーの求核試薬は、窒素アニオン、窒素原子、またはそれらの組合せである。
Ａ１および／またはＡ２と指定される基を置換反応によって修飾する実施態様においては、それらは、式：
－（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；
－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ５］２；
－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ５｝；
－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ５］２｝２；または
－（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２
（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、ｒ１およびｒ２、並びにｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、またはＣ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである）のＢ１および／またはＢ２と指定される基を生成する。
使用に適した脱離基を含有する化合物の例は、式：
Figure 2022530224000047
（式中、ＬＧは、脱離基（例えば、塩化物原子、臭化物原子、ヨウ化物原子、トシレート、トリフレート、メシレート等）であり、Ｒ５は、式１、１Ａ、１Ｂ、または１Ｃのいずれかに関して記載したとおりである）の化合物を含む。
いくつかの実施態様においては、置換反応は、酸および／または塩基によって促進される。酸および／または塩基は、任意の適切なｐＫａを有する任意の適切な酸および／または塩基であり得る。酸および／または塩基は、有機酸（例えば、ｐ－トルエンスルホン酸）、有機塩基（例えば、トリエチルアミン）、無機酸（例えば、四塩化チタン）、無機塩基（例えば、炭酸カリウム）、またはそれらの組合せであり得る。
いくつかの実施態様においては、置換反応は、酸によって促進される。酸は、ブレンステッド酸またはルイス酸であり得る。酸がブレンステッド酸である実施態様においては、酸は、弱酸（すなわち、約４から約７のｐＫａ）または強酸（すなわち、約－２から約４のｐＫａ）であり得る。典型的には、酸は、弱酸である。特定の実施態様においては、酸は、ルイス酸である。例えば、酸は、ビス（トリフルオロメタンスルホン）イミドまたはｐ－トルエンスルホン酸であり得る。
いくつかの実施態様においては、置換反応は、塩基によって促進される。塩基は、弱塩基（すなわち、約７から約１２のｐＫａ）または強塩基（すなわち、約１２から約５０のｐＫａ）であり得る。典型的には、塩基は、弱塩基である。例えば、塩基は、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ－メチルモルホリン、若しくはＮ，Ｎ－ジメチル－ピペラジン、またはそれらの誘導体であり得る。
いくつかの実施態様においては、置換反応は、溶媒中で実施される。溶媒は、反応するポリマーおよび脱離基を含む化合物を溶解することができる、任意の適切な溶媒または溶媒の混合物であり得る。例えば、溶媒は、水、プロトン性有機溶媒、および／または非プロトン性有機溶媒を含み得る。溶媒の例示的なリストは、水、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、メタノール、およびエタノールを含む。
いくつかの実施態様においては、該方法は、式１の構造を含むポリマーを単離することをさらに含む。式１の構造を含むポリマーは、任意の適切な手段によって単離することができる。例えば、式１の構造を含むポリマーは、抽出、結晶化、再結晶、カラムクロマトグラフィー、濾過、またはそれらの任意の組合せによって単離することができる。
組成物
本明細書において提供されるポリマーは、任意の目的に使用することができる。しかしながら、ポリマーは、核酸および／またはポリペプチド（例えば、タンパク質）を細胞に送達するために特に有用であると考えられる。すなわち、本明細書において提供されるのは、本明細書において記載されるポリマー並びに核酸および／またはポリペプチド（例えば、タンパク質）を含む組成物である。
いくつかの実施態様においては、組成物は、核酸を含む。任意の核酸を、使用することができる。核酸の例示的なリストは、ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドおよび／またはドナー核酸、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、干渉ＲＮＡ若しくはＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡベクター、リボザイム、アンチセンスポリヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンス核酸をコードするＤＮＡ発現カセットを含む。ｓｉＲＮＡは、典型的には１５～５０塩基対および好ましくは１９～２５塩基対を含有し、細胞内の発現された標的遺伝子若しくはＲＮＡと同一のまたはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。ｓｉＲＮＡは、ヘアピン構造を形成する２つのアニーリングされたポリヌクレオチドまたは単一のポリヌクレオチドから構成され得る。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、そのｍＲＮＡ標的の破壊または翻訳抑制を指示する、長さが約２２ヌクレオチドの小さな非コードポリヌクレオチドである。アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子またはｍＲＮＡに相補的な配列を含む。アンチセンスポリヌクレオチドは、モルフォリノ、２’－Ｏ－メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドベースの発現阻害剤は、インビトロで重合され得、組換体であり得、キメラ配列を含有し得、またはこれらの群の誘導体であり得る。ポリヌクレオチドベースの発現阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または標的ＲＮＡおよび／若しくは遺伝子が阻害されるような任意の適切な組合せを含有し得る。
組成物はまた、核酸に加えてまたはその代わりに、送達のための任意のタンパク質を含み得る。ポリペプチドは、任意の適切なポリペプチドであり得る。例えば、ポリペプチドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（「ＴＡＬＥＮ」）、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組合せであり得る。いくつかの実施態様においては、ポリペプチドは、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド、Ｃｐｆ１ポリペプチド、またはそれらの変異体）またはＤＮＡリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅポリペプチド）である。
本明細書において提供されるポリマーは、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の構成要素を送達するために特に有用であると考えられる。すなわち、いくつかの実施態様においては、組成物は、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ若しくはそれをコードする核酸、および／またはドナー核酸を含む。組成物は、本明細書において記載されるポリマーと共に、１つ、２つ、または３つ全ての成分を含み得る。さらに、組成物は、複数のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ若しくはそれをコードする核酸、および／またはドナー核酸を含み得る。例えば、異なる標的部位に対する複数の異なるガイドＲＮＡを、任意に複数の異なるドナー核酸およびさらには複数の異なるＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸とともに含み得るであろう。
さらに、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、任意の特定の方法または順序で（複数の構成要素が存在するとき）互いにおよびポリマーと組み合わせることができる。いくつかの実施態様においては、ガイドＲＮＡは、ポリマーと組み合わせる前に、ＲＮＡエンドヌクレアーゼと複合体化される。さらに、またはその代わりに、ガイドＲＮＡは、ポリマーと組み合わせる前に、ドナー核酸に（共有結合または非共有結合で）連結し得る。
組成物は、それらの多くは既知である、いずれの特定のＣＲＩＳＰＲシステム（すなわち、いずれの特定のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ、またはドナー核酸）に関しても限定されない。それにもかかわらず、さらなる説明のために、いくつかのそのようなシステムの構成要素を、以下に説明する。
ドナー核酸
ドナー核酸（または「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」または「ドナーＤＮＡ」）は、ＲＮＡ指向性エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはＣｐｆ１ポリペプチド）によって引き起こされる切断部位に挿入される核酸配列である。ドナーポリヌクレオチドは、それとそれが相同性を有するゲノム配列との間の相同組換え修復をサポートするように、切断部位での標的ゲノム配列に対する十分な相同性、例えば切断部位から約５０塩基以下以内で、例えば約３０塩基以内で、約１５塩基以内で、約１０塩基以内で、約５塩基以内で、または切断部位に直接隣接して、例えば切断部位に隣接するヌクレオチド配列との７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を含有するであろう。約２５、５０、１００、または２００ヌクレオチド、または２００を超えるヌクレオチド（または１０と２００との間の任意の整数値のヌクレオチド、またはそれ以上）のドナーとゲノム配列との間の配列相同性は、相同組換え修復をサポートするであろう。ドナー配列は、任意の長さ、例えば１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上等であり得る。
ドナー配列は、典型的にはそれが置き換えるゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同組換え修復をサポートするのに十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して１つ以上の一塩基の変更、挿入、欠失、反転または再配列を含有し得る。いくつかの実施態様においては、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の相同組換え修復が標的領域での非相同配列の挿入をもたらすように、２つの相同性領域に隣接する非相同配列を含む。ドナー配列はまた、目的のＤＮＡ領域と相同ではなく、目的のＤＮＡ領域への挿入を意図されていない配列を含有するベクター骨格を含み得る。一般に、ドナー配列の相同領域（複数可）は、組換えが望まれるゲノム配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。特定の実施態様においては、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに依存して、１％と１００％との間の任意の値の配列同一性が存在し得る。
ドナー配列は、ゲノム配列と比較して、切断部位でのドナー配列の挿入の成功を評価するために使用され得るか、またはいくつかの実施態様においては他の目的のために（例えば、標的ゲノム遺伝子座での発現を示すために）使用され得る、特定の配列の違い、例えば制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素等）等を含み得る。いくつかの実施態様においては、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列の違いは、アミノ酸配列を変更させないか、またはサイレントアミノ酸変更（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響しない変更）を行うであろう。あるいは、これらの配列の違いは、マーカー配列の除去のために後に活性化することができる、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などの隣接する組換え配列を含み得る。
ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＲＮＡとして細胞に提供され得る。それは、線状または円形の形態で細胞中に導入され得る。線状の形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に知られている方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が、線状分子の３’末端に付加されおよび／または自己相補的オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端に結合される。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。本明細書において例示されるように、ローリングサークル増幅などの増幅手順もまた、有利に使用することができる。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法は、末端アミノ基（複数可）の付加並びに例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、およびＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用を含むが、これらに限定されない。
線状のドナー配列の末端を保護することの代替として、追加の長さの配列を、組換えに影響を与えることなく分解することができる相同性領域の外側に含め得る。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞中に導入することができる。さらに、ドナー配列は、裸の核酸として、リポソームまたはポリマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として導入することができ、またはＣａｓ９ガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ９融合ポリヌクレオチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について本明細書において記載されるようにウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達することができる。
ガイド核酸
いくつかの実施態様においては、組成物は、ガイド核酸を含む。本開示の組成物中に含めるために適切なガイド核酸は、シングル分子ガイドＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」／「ｓｇＲＮＡ」）およびダブル分子ガイド核酸（「ダブルガイドＲＮＡ」／「ｄｇＲＮＡ」）を含む。
本開示の複合体中に含めるために適切なガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ポリペプチド）の活性を、標的核酸内の特定の標的配列に向ける。ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は：第１のセグメント（本明細書においては「核酸ターゲッティングセグメント」、または単に「ターゲッティングセグメント」とも呼ぶ）；および第２のセグメント（本明細書においては「タンパク質結合セグメント」とも呼ぶ）を含む。用語「第１の」および「第２の」は、セグメントがガイドＲＮＡにおいて発生する順序を意味するものではない。互いに対する要素の順序は、使用される特定のＲＮＡ誘導ポリペプチドに依存する。例えば、Ｃａｓ９のガイドＲＮＡは典型的には、ターゲッティングセグメントの３’に位置するタンパク質結合セグメントを有するが、Ｃｐｆ１のガイドＲＮＡは典型的には、ターゲティングセグメントの５’に位置するタンパク質結合セグメントを有する。
ガイドＲＮＡは、線状または円形の形態で細胞中に導入され得る。線状の形態で導入される場合、ガイドＲＮＡの末端は、当業者に知られている方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。本明細書において例示される、ローリングサークル増幅などの増幅手順もまた、有利に使用することができる。
第１のセグメント：ターゲッティングセグメント
ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）の第１のセグメントは、標的核酸中の配列（標的部位）に相補的なヌクレオチド配列を含む。換言すると、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）のターゲッティングセグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的に標的核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ）と相互作用することができる。そのように、ターゲッティングセグメントのヌクレオチド配列は、変化し得、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）および標的核酸が相互作用するであろう標的核酸内の位置を決定することができる。ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）のターゲッティングセグメントは、標的核酸内の任意の所望の配列（標的部位）にハイブリダイズするように（例えば、遺伝子工学によって）修飾することができる。
ターゲッティングセグメントは、１２ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さを有し得る。標的核酸のヌクレオチド配列（標的部位）に相補的なターゲッティングセグメントのヌクレオチド配列（ターゲッティング配列、ガイド配列とも呼ばれる）は、１２ｎｔ以上の長さを有し得る。例えば、標的核酸の標的部位に相補的であるターゲッティングセグメントのターゲッティング配列は、１２ｎｔ以上、１５ｎｔ以上、１７ｎｔ以上、１８ｎｔ以上、１９ｎｔ以上、２０ｎｔ以上、２５ｎｔ以上、３０ｎｔ以上、３５ｎｔ以上または４０ｎｔの長さを有し得る。
ターゲッティングセグメントのターゲッティング配列（すなわち、ガイド配列）と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）であり得る。いくつかの実施態様においては、ターゲッティングセグメントのターゲッティング配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、標的核酸の標的部位の７つの隣接する５’－末端のヌクレオチドにわたって１００％である。いくつかの実施態様においては、ターゲッティングセグメントのターゲッティング配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、２０個の隣接するヌクレオチドにわたって６０％以上である。いくつかの実施態様においては、ターゲッティングセグメントのターゲッティング配列と標的核酸の標的部位との間の相補性パーセントは、標的核酸の標的部位の１７、１８、１９または２０個の連続する５’－末端のヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにおいては０％以上と低い。そのような場合においては、ターゲッティング配列は、それぞれ長さが１７、１８、１９または２０ヌクレオチドであると考えることができる。
第２のセグメント：タンパク質結合セグメント
ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）のタンパク質結合セグメントは、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼと相互作用（結合）する。ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、上述のターゲッティングセグメント／ターゲッティング配列／ガイド配列を介して、結合したエンドヌクレアーゼを標的核酸（標的部位）内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）のタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチを含む。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）（ｄｓＲＮＡ）を形成する。
シングルおよびデュアルガイド核酸
デュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、２つの別個の核酸分子を含む。対象のデュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）の２つの分子のそれぞれは、２つの分子の相補的ヌクレオチドがハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成するように、互いに相補的であるヌクレオチドのストレッチを含む。
いくつかの実施態様においては、活性化因子の二重鎖形成セグメントは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されている活性化因子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つ、またはその相補体と、８個以上の連続するヌクレオチド（例えば、８個以上の連続するヌクレオチド、１０個以上の連続するヌクレオチド、１２個以上の連続するヌクレオチド、１５個以上の連続するヌクレオチド、または２０個以上の連続するヌクレオチド）にわたって６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上同一または１００％同一である。
いくつかの実施態様においては、ターゲッターの二重鎖形成セグメントは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されているターゲッター（ｃｒＲＮＡ）配列の１つ、またはその相補体と、８個以上の連続するヌクレオチド（例えば、８個以上の連続するヌクレオチド、１０個以上の連続するヌクレオチド、１２個以上の連続するヌクレオチド、１５個以上の連続するヌクレオチド、または２０個以上の連続するヌクレオチド）にわたって６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上同一または１００％同一である。
デュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、ターゲッターの活性化因子との制御された（すなわち、条件付きの）結合を可能にするように設計することができる。デュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、活性化因子およびタ－ゲッターの両方がＣａｓ９と機能的複合体において結合しなければ機能しないので、デュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、活性化因子とターゲッターとの間の結合を誘導可能にすることによって、誘導性（例えば、薬物誘導性）であり得る。１つの非限定的な例として、ＲＮＡアプタマーを使用して、活性化因子のターゲッターとの結合を調節（すなわち、制御）することができる。従って、活性化因子および／またはターゲッターは、ＲＮＡアプタマー配列を含み得る。
アプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマー）は、当技術分野において知られており、一般にリボスイッチの合成バージョンである。用語「ＲＮＡアプタマー」および「リボスイッチ」は、それらがその一部である核酸分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド等）の構造の誘導性調節（および従って特定の配列の利用可能性）を提供する合成および天然の両方の核酸配列を包含するために、本明細書においては交換可能に使用される。ＲＮＡアプタマーは通常、特定の薬物（例えば、小分子）に特異的に結合する特定の構造（例えば、ヘアピン）中に折り畳まれる配列を含む。薬物の結合は、ＲＮＡの折り畳みにおける構造変化を引き起こし、それはアプタマーがその一部である核酸の特徴を変化させる。非限定的な例として：（ｉ）アプタマーを有する活性化因子は、アプタマーが適切な薬物によって結合されなければ、同族のターゲッターに結合することができない可能性があり；（ｉｉ）アプタマーを有するターゲッターは、アプタマーが適切な薬物によって結合されなければ、同族の活性化因子に結合することができない可能性があり；（ｉｉｉ）それぞれが異なる薬物を結合させる異なるアプタマーを含むターゲッターおよび活性化因子は、両方の薬物が存在しなければ、互いに結合することができない可能性がある。これらの例によって例示されるように、デュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、誘導可能であるように設計することができる。
アプタマーおよびリボスイッチの例は、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ． ２０１２ Ｍａｙ；１７（５）：３４４－６４；Ｖａｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０１２ Ｍａｙ；８（３）：３７１－８２；Ｃｉｔａｒｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ． ２０１２ Ａｐｒ １５；３４（１）：１－１１；およびＬｉｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ． ２０１２ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；３（３）：３６９－８４中に見出すことができ、それらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントを形成することができる、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７中に含まれるデュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）中に含めることができるヌクレオチド配列、またはそれらの相補体の非限定的な例。
対象のシングルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、互いに相補的であり、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成し（すなわちステムループ構造をもたらす）、介在するヌクレオチド（「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」）によって共有結合される、ヌクレオチド（デュアルガイド核酸の「タ－ゲッター」および「活性化因子」によく似ている）の２つのストレッチを含む。すなわち、対象のシングルガイド核酸（例えば、シングルガイドＲＮＡ）は、それぞれが二重鎖形成セグメントを有するターゲッターおよび活性化因子を含み得、ここで、ターゲッターおよび活性化因子の二重鎖形成セグメントは、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。ターゲッターおよび活性化因子は、ターゲッターの３’末端および活性化因子の５’末端を介して共有結合することができる。あるいは、ターゲッターおよび活性化因子は、ターゲッターの５’末端および活性化因子の３’末端を介して共有結合することができる。
シングルガイド核酸のリンカーは、３ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの実施態様においては、シングルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）のリンカーは、４ｎｔである。
例示的なシングルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドの２つの相補的なストレッチを含む。いくつかの実施態様においては、シングルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）（またはストレッチをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的ストレッチの１つは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されている活性化因子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つ、またはその相補体と、８個以上の連続するヌクレオチド（例えば、８個以上の連続するヌクレオチド、１０個以上の連続するヌクレオチド、１２個以上の連続するヌクレオチド、１５個以上の連続するヌクレオチド、または２０個以上の連続するヌクレオチド）にわたって６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上同一または１００％同一である。
いくつかの実施態様においては、シングルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）（またはストレッチをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的ストレッチの１つは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されているターゲッター（ｃｒＲＮＡ）配列の１つ、またはその相補体と、８個以上の連続するヌクレオチド（例えば、８個以上の連続するヌクレオチド、１０個以上の連続するヌクレオチド、１２個以上の連続するヌクレオチド、１５個以上の連続するヌクレオチド、または２０個以上の連続するヌクレオチド）にわたって６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上同一または１００％同一である。
いくつかの実施態様においては、シングルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）（またはストレッチをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的ストレッチの１つは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されているターゲッター（ｃｒＲＮＡ）配列若しくは活性化因子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列の１つ、またはその相補体と、８個以上の連続するヌクレオチド（例えば、８個以上の連続するヌクレオチド、１０個以上の連続するヌクレオチド、１２個以上の連続するヌクレオチド、１５個以上の連続するヌクレオチド、または２０個以上の連続するヌクレオチド）にわたって６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上同一または１００％同一である。
ターゲッターおよび活性化因子の適切な同族ペアは、種名および塩基対形成（タンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖について）を考慮することによって日常的に決定することができる。任意の活性化因子／ターゲッター対を、デュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）の一部としてまたはシングルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）の一部として使用することができる。
いくつかの実施態様においては、デュアルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）（例えば、デュアルガイドＲＮＡ）またはシングルガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）（例えば、シングルガイドＲＮＡ）の活性化因子（例えば、ｔｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ様分子等）は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されている活性化因子（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子、またはその相補体と、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上の、または１００％の配列同一性を有する分子のストレッチを含む。
いくつかの実施態様においては、デュアルガイド核酸（例えば、デュアルガイドＲＮＡ）またはシングルガイド核酸（例えば、シングルガイドＲＮＡ）の活性化因子（例えば、ｔｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ様分子等）は、３０以上のヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、７５以上のｎｔ）を含む。いくつかの実施態様においては、デュアルガイド核酸（例えば、デュアルガイドＲＮＡ）またはシングルガイド核酸（例えば、シングルガイドＲＮＡ）の活性化因子（例えば、ｔｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ様分子等）は、３０から２００ヌクレオチド（ｎｔ）の範囲の長さを有する。
タンパク質結合セグメントは、１０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの長さを有し得る。
また、対象のシングルガイド核酸（例えば、シングルガイドＲＮＡ）および対象のデュアルガイド核酸（例えば、デュアルガイドＲＮＡ）の両方に関して、タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖は、６塩基対（ｂｐ）から５０ｂｐの長さを有し得る。ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、６０％以上であり得る。例えば、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上（例えば、いくつかの実施態様においては、ハイブリダイズせず、従ってｄｓＲＮＡ二重鎖内にバルジを作成するいくつかのヌクレオチドがあるであり得る。いくつかの実施態様においては、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、１００％である。
ハイブリッドガイド核酸
いくつかの実施態様においては、ガイド核酸は、２つのＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ）である。いくつかの実施態様においては、ガイド核酸は、１つのＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ）である。いくつかの実施態様においては、ガイド核酸は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子である。そのような実施態様においては、ガイド核酸のタンパク質結合セグメントは、ＲＮＡであり、ＲＮＡ二重鎖を形成する。すなわち、活性化因子およびターゲッターの二重鎖形成セグメントは、ＲＮＡである。しかしながら、ガイド核酸のターゲッティングセグメントは、ＤＮＡであり得る。すなわち、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドガイド核酸がデュアルガイド核酸である場合、「ターゲッター」分子は、ハイブリッド分子（例えば、ターゲティングセグメントは、ＤＮＡであることができ、二重鎖形成セグメントは、ＲＮＡであり得る）である。そのような実施態様においては、「活性化因子」分子の二重鎖形成セグメントは、ＲＮＡであり得る（例えば、ターゲッター分子の二重鎖形成セグメントとＲＮＡ二重鎖を形成するために）が、一方、二重鎖形成セグメントの外側にある「活性化因子」分子のヌクレオチドは、ＤＮＡ（この場合、活性化因子分子は、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子である）またはＲＮＡ（この場合、活性化因子分子は、ＲＮＡである）であり得る。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドガイド核酸がシングルガイド核酸である場合、その場合は、ターゲティングセグメントは、ＤＮＡであり得、（シングルガイド核酸のタンパク質結合セグメントを構成する）二重鎖形成セグメントは、ＲＮＡであり得、ターゲッティングおよび二重鎖形成セグメントの外側のヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドガイド核酸は、いくつかの実施態様においては、例えば、標的核酸がＲＮＡであるとき、有用であり得る。Ｃａｓ９は通常、標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイドＲＮＡと連携し、すなわちターゲット部位でＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を形成する。従って、標的核酸がＲＮＡであるとき、ＲＮＡの代わりにＤＮＡである（ガイド核酸の）ターゲッティングセグメントを使用することによって、標的部位でＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を繰り返すことがときどき有利である。しかしながら、ガイド核酸のタンパク質結合セグメントはＲＮＡ二重鎖であるため、ターゲッター分子は、ターゲティングセグメントにおいてはＤＮＡであり二重鎖形成セグメントにおいてはＲＮＡである。ハイブリッドガイド核酸は、二本鎖標的核酸と比較して、一本鎖標的核酸へのＣａｓ９結合にバイアスをかけることができる。
例示的なガイド核酸
任意のガイド核酸を、使用することができる。多くの異なるタイプのガイド核酸が、当技術分野において知られている。選択されたガイド核酸は、使用されている特定のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、使用されている特定のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ）に適切にペアリングされるであろう。すなわち、ガイド核酸は、例えば、本明細書において記載されているかまたは当技術分野において知られている任意のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼに対応するガイド核酸であり得る。ガイド核酸およびＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼは、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されている。
いくつかの実施態様においては、適切なガイド核酸は、２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施態様においては、２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子（活性化因子）の第１は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されているヌクレオチド配列の任意の１つ、またはその相補体に対して、８個以上の連続するヌクレオチド（例えば、８個以上の連続するヌクレオチド、１０個以上の連続するヌクレオチド、１２個以上の連続するヌクレオチド、１５個以上の連続するヌクレオチド、または２０個以上の連続するヌクレオチド）のストレッチにわたって６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様においては、２つの別個のＲＮＡポリヌクレオチド分子（ターゲッター）の第２は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されているヌクレオチド配列の任意の１つ、またはその相補体に対して、８個以上の連続するヌクレオチド（例えば、８個以上の連続するヌクレオチド、１０個以上の連続するヌクレオチド、１２個以上の連続するヌクレオチド、１５個以上の連続するヌクレオチド、または２０個以上の連続するヌクレオチド）のストレッチにわたって６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施態様においては、適切なガイド核酸は、シングルＲＮＡポリヌクレオチドであり、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７に記載されているヌクレオチド配列の任意の１つ、またはその相補体に対して、８個以上の連続するヌクレオチド（例えば、８個以上の連続するヌクレオチド、１０個以上の連続するヌクレオチド、１２個以上の連続するヌクレオチド、１５個以上の連続するヌクレオチド、または２０個以上の連続するヌクレオチド）のストレッチにわたって６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を有する第１のおよび第２のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施態様においては、ガイドＲＮＡは、Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９ガイドＲＮＡである。Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９ガイドＲＮＡは、３０ヌクレオチド（ｎｔ）から１００ｎｔ、例えば、３０ｎｔから４０ｎｔ、４０ｎｔから４５ｎｔ、４５ｎｔから５０ｎｔ、５０ｎｔから６０ｎｔ、６０ｎｔから７０ｎｔ、７０ｎｔから８０ｎｔ、８０ｎｔから９０ｎｔ、または９０ｎｔから１００ｎｔの全長を有し得る。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９ガイドＲＮＡは、３５ｎｔ、３６ｎｔ、３７ｎｔ、３８ｔｔ、３９ｎｔ、４０ｎｔ、４１ｎｔ、４２ｎｔ、４３ｎｔ、４４ｎｔ、４５ｎｔ、４６ｎｔ、４７ｎｔ、４８ｎｔ、４９ｎｔ、または５０ｎｔの全長を有する。Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９ガイドＲＮＡは、標的核酸結合セグメントおよび二重鎖形成セグメントを含み得る。
Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９ガイドＲＮＡの標的核酸結合セグメントは、１５ｎｔから３０ｎｔ、例えば、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、または３０ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施態様においては、標的核酸結合セグメントは、２３ｎｔの長さを有する。いくつかの実施態様においては、標的核酸結合セグメントは、２４ｎｔの長さを有する。いくつかの実施態様においては、標的核酸結合セグメントは、２５ｎｔの長さを有する。
Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９ガイドＲＮＡの標的核酸結合セグメントは、対応する長さの標的核酸配列と１００％の相補性を有し得る。ターゲッティングセグメントは、対応する長さの標的核酸配列と１００％未満の相補性を有し得る。例えば、Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９ガイドＲＮＡの標的核酸結合セグメントは、標的核酸配列に相補的ではない１、２、３、４、または５ヌクレオチドを有し得る。例えば、標的核酸結合セグメントが２５ヌクレオチドの長さを有し、標的核酸配列が２５ヌクレオチドの長さを有するいくつかの実施態様においては、いくつかの実施態様においては、標的核酸結合セグメントは、標的核酸配列に対して１００％の相補性を有する。別の例として、標的核酸結合セグメントが２５ヌクレオチドの長さを有し、標的核酸配列が２５ヌクレオチドの長さを有するいくつかの実施態様においては、いくつかの実施態様においては、標的核酸結合セグメントは、１つの非－相補的ヌクレオチドおよび標的核酸配列を有する２４個の相補的ヌクレオチドを有する。
Ｃｐｆ１および／またはＣａｓ９ガイドＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、１５ｎｔから２５ｎｔ、例えば、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、または２５ｎｔの長さを有し得る。
いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡの二重鎖形成セグメントは、ヌクレオチド配列５’－ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ－３’を含み得る。
追加の要素
いくつかの実施態様においては、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、追加のセグメントまたは複数のセグメントを（いくつかの実施態様においては５’末端に、いくつかの実施態様においては３’末端に、いくつかの実施態様においては５’または３’末端のいずれかに、いくつかの実施態様においては配列内に埋め込まれて（すなわち、５’および／または３’末端ではない）、いくつかの実施態様においては５’末端および３’末端の両方に、いくつかの実施態様においては埋め込まれて並びに５’末端および／または３’末端に等）含む。例えば、適切な追加のセグメントは、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）；リボザイム配列（例えばガイド核酸およびガイド核酸の成分、例えば、ターゲッター、活性化因子等の自己切断を可能にするための）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質およびタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス可能性を可能にするための）；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化する配列；追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子（すなわち、蛍光色素）などの標識、蛍光検出を促進する配列または他の部分；タンパク質の結合部位を提供する配列または他の修飾（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ＲＮＡを結合させるタンパク質（例えば、ＲＮＡアプタマー）、標識タンパク質、蛍光標識タンパク質等を含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）；増加した、減少した、および／若しくは制御可能な安定性を提供する修飾または配列；およびそれらの組合せを含む。
ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ
ガイド核酸に加えて、またはその代わりに、組成物は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼタンパク質またはそれをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはベクター）を含み得る。任意のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼを、使用することができる。使用されるＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼの選択は、少なくとも部分的には、使用されるＣＲＩＳＰＲシステムの意図された最終用途に依存するであろう。
いくつかの実施態様においては、ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。本開示の組成物中に含めるために適切なＣａｓ９ポリペプチドは、天然に発生するＣａｓ９ポリペプチド（例えば、細菌および／または古細菌細胞において天然に発生する）、または以下に記載する非天然に発生するＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドは、変異型Ｃａｓ９ポリペプチド、以下に議論されるキメラポリペプチド等である）を含む。いくつかの実施態様においては、当業者は、本明細書において開示されるＣａｓ９ポリペプチドが、任意の供給源に由来するまたは任意の供給源から単離される任意の変異体であり得ることを理解することができる。他の実施態様においては、本開示のＣａｓ９ペプチドは、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１４ Ｆｅｂ；４２（４）：２５７７－９０；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． ２０１４ Ｆｅｂ ２７；１５６（５）：９３５－４９；Ｊｉｎｅｋ Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１２ ３３７：８１６－２１；およびＪｉｎｅｋ Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１４ Ｍａｒ １４；３４３（６１７６）に記載される機能的突然変異を含むがこれらに限定されない、文献中に記載される１つ以上の突然変異を含み得；参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８４２，８５９号も参照されたく；さらに参照により全て本明細書に組み込まれる米国特許第８，６９７，３５９；８，７７１，９４５；８，７９５，９６５；８，８６５，４０６；８，８７１，４４５；８，８８９，３５６；８，８９５，３０８；８，９０６，６１６；８，９３２，８１４；８，９４５，８３９；８，９９３，２３３；および８，９９９，６４１号を参照されたい。すなわち、いくつかの実施態様においては、本明細書において開示されるシステムおよび方法は、二本鎖ヌクレアーゼ活性を有する野生型Ｃａｓ９タンパク質、一本鎖ニッカーゼとして作用するＣａｓ９突然変異体、または修飾ヌクレアーゼ活性を有する他の突然変異体と使用することができる。そのように、本開示の組成物中に含めるために適切なＣａｓ９ポリペプチドは、酵素的に活性なＣａｓ９ポリペプチドであり得、例えば、標的核酸において一本または二本鎖切断を行うことができるか、あるいは野生型Ｃａｓ９ポリペプチドと比較して低下した酵素活性を有し得る。
天然に発生するＣａｓ９ポリペプチドは、ガイド核酸を結合させ、それにより、標的核酸（標的部位）内の特定の配列に向けられ、標的核酸を切断する（例えば、二本鎖切断を生成するためにｄｓＤＮＡを切断する、ｓｓＤＮＡを切断する、ｓｓＲＮＡを切断する等）。対象のＣａｓ９ポリペプチドは、ＲＮＡ結合部分および活性部分の２つの部分を含む。ＲＮＡ結合部分は、対象のガイド核酸と相互作用し、活性部分は、部位特異的酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡメチル化についての活性、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ切断についての活性、ヒストンアセチル化についての活性、ヒストンメチル化についての活性、ＲＮＡ修飾についての活性、ＲＮＡ結合についての活性、ＲＮＡスプライシングについての活性等を示す。いくつかの実施態様においては、活性部分は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドの対応する部分と比較して低下したヌクレアーゼ活性を示す。いくつかの実施態様においては、活性部分は、酵素的に不活性である。
タンパク質が対象のガイド核酸と相互作用するＲＮＡ結合部分を有するかどうかを決定するためのアッセイは、タンパク質と核酸との間の結合を試験する任意の便利な結合アッセイであり得る。例示的な結合アッセイは、ガイド核酸およびＣａｓ９ポリペプチドを標的核酸に添加することを含む結合アッセイ（例えば、ゲルシフトアッセイ）を含む。
タンパク質が活性部分を有するかどうかを決定するための（例えば、ポリペプチドが標的核酸を切断するヌクレアーゼ活性を有するかどうかを決定するための）アッセイは、核酸切断を試験する任意の便利な核酸切断アッセイであり得る。例示的な切断アッセイは、ガイド核酸およびＣａｓ９ポリペプチドを標的核酸に添加することを含む。
いくつかの実施態様においては、本開示の組成物中に含めるために適切なＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸を修飾する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する。
他の実施態様においては、本開示の組成物中に含めるために適切なＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸に関連するポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する。
多種多様な種からの多くのＣａｓ９オルソログが同定されており、いくつかの実施態様においては、タンパク質は、少数の同一のアミノ酸のみを共有する。全ての同定されたＣａｓ９オルソログは、中央のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよび分割されたＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅＨドメインを有する同じドメインアーキテクチャを有する。Ｃａｓ９タンパク質は、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４は、ＲｕｖＣの様のモチーフであり、一方、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。
いくつかの実施態様においては、適切なＣａｓ９ポリペプチドは、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１～４のそれぞれは、図１中に示されるＣａｓ９アミノ酸配列（配列番号１）に対して；またはあるいは、以下の表１中に示されるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１～４に対して；またはあるいは、図１中に示されるＣａｓ９アミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸７～１６６若しくは７３１～１００３に対して６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ９ポリペプチドは、図１に示され、配列番号１中に記載されるアミノ酸配列に対して７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか；配列番号１中に記載されるアミノ酸配列に関連するＮ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、およびＱ９２６のアミノ酸置換を含むか；または、配列番号１中に記載されるアミノ酸配列に関連するＫ８５５のアミノ酸置換を含むか；または、配列番号１中に記載されるアミノ酸配列に関連するＫ８１０、Ｋ１００３、およびＲ１０６０のアミノ酸置換を含むか；または、配列番号１中に記載されるアミノ酸配列に関連するＫ８４８、Ｋ１００３、およびＲ１０６０のアミノ酸置換を含む。
本明細書において使用される用語「Ｃａｓ９ポリペプチド」は、用語「変異型Ｃａｓ９ポリペプチド」を包含し；用語「変異型Ｃａｓ９ポリペプチド」は、用語「キメラＣａｓ９ポリペプチド」を包含する。
変異型Ｃａｓ９ポリペプチド
本開示の組成物中に含めるための適切なＣａｓ９ポリペプチドは、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドを含む。変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、上記のような、天然に発生するＣａｓ９ポリペプチド）のアミノ酸配列と比較したとき、１つのアミノ酸によって異なる（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）（すなわち、少なくとも１つのアミノ酸によって異なる）アミノ酸配列を有する。いくつかの事例においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドのヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を有する。例えば、いくつかの事例においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有する。いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、実質的なヌクレアーゼ活性を何ら有さない。Ｃａｓ９ポリペプチドが実質的なヌクレアーゼ活性を何ら有さない変異型Ｃａｓ９ポリペプチドであるとき、それは「ｄＣａｓ９」と呼ぶことができる。
いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、低下したヌクレアーゼ活性を有する。例えば、本開示の結合方法における使用に適した変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド、例えば、図１中に示されるアミノ酸配列（配列番号１）を含む野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ活性の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満を示す。
いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、標的核酸の相補鎖を切断することができるが、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断するための低下した能力を有する。例えば、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン（例えば、図１の「ドメイン１」）の機能を低下させる突然変異（アミノ酸置換）を有し得る。非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｄ１０Ａ突然変異（例えば、配列番号１の位置１０に対応するアミノ酸位置でのアスパラギン酸からアラニンへの）を有し、従って、二本鎖標的核酸の相補鎖を切断することができるが、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断するための低下した能力を有する（すなわち変異型Ｃａｓ９ポリペプチドが二本鎖標的核酸を切断するときに二本鎖切断（ＤＳＢ）の代わりに一本鎖切断（ＳＳＢ）をもたらす）（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１を参照）。
いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、二本鎖標的核酸の非相補鎖を切断することができるが、標的核酸の相補鎖を切断するための低下した能力を有する。例えば、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ＨＮＨドメイン（ＲｕｖＣ／ＨＮＨ／ＲｕｖＣドメインモチーフ、図１の「ドメイン２」）の機能を低下させる突然変異（アミノ酸置換）を有し得る。非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｈ８４０Ａ突然変異（例えば、配列番号１の位置８４０に対応するアミノ酸位置でのヒスチジンからアラニンへの）を有することができ（図１）、従って、標的核酸の非相補鎖を切断することができるが、標的核酸の相補鎖を切断するための低下した能力を有する（すなわち変異型Ｃａｓ９ポリペプチドが二本鎖標的核酸を切断するとき、ＤＳＢの代わりにＳＳＢをもたらす）。そのようなＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸（例えば、一本鎖標的核酸）を切断するための低下した能力を有するが、標的核酸（例えば、一本鎖または二本鎖標的核酸）を結合させる能力を保持する。
いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、二本鎖標的核酸の相補および非相補鎖の両方を切断するための低下した能力を有する。非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ポリペプチドが二本鎖標的核酸の相補および非相補鎖の両方を切断するための低下した能力を有するように、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ突然変異の両方（例えば、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの両方における突然変異）を有する。そのようなＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸（例えば、一本鎖標的核酸または二本鎖標的核酸）を切断するための低下した能力を有するが、標的核酸（例えば、一本鎖標的核酸または二本鎖標的核酸）を結合させる能力を保持する。
別の非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ポリペプチドが標的核酸を切断するための低下した能力を有するように、Ｗ４７６ＡおよびＷ１１２６Ａ突然変異を有する。そのようなＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸を切断するための低下した能力を有するが、標的核酸を結合させる能力を保持する。
別の非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ポリペプチドが標的核酸を切断するための低下した能力を有するように、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ突然変異を有する。そのようなＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸を切断するための低下した能力を有するが、標的核酸を結合させる能力を保持する。
別の非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ポリペプチドが標的核酸を切断するための低下した能力を有するように、Ｈ８４０Ａ、Ｗ４７６Ａ、およびＷ１１２６Ａ、突然変異を有する。そのようなＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸を切断するための低下した能力を有するが、標的核酸を結合させる能力を保持する。
別の非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ポリペプチドが標的核酸を切断するための低下した能力を有するように、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｗ４７６Ａ、およびＷ１１２６Ａ、突然変異を有する。そのようなＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸を切断するための低下した能力を有するが、標的核酸を結合させる能力を保持する。
別の非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ポリペプチドが標的核酸を切断するための低下した能力を有するように、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ突然変異を有する。そのようなＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸を切断するための低下した能力を有するが、標的核酸を結合させる能力を保持する。
別の非限定的な例として、いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、ポリペプチドが標的核酸を切断するための低下した能力を有するように、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、およびＤ１１２７Ａ突然変異を有する。そのようなＣａｓ９ポリペプチドは、標的核酸を切断するための低下した能力を有するが、標的核酸を結合させる能力を保持する。
上記の効果を達成する（すなわち一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する）ために、他の残基を変異させることができる。非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７を変更する（すなわち、置換する）ことができる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存に関するさらなる情報については表１を参照）。また、アラニン置換以外の突然変異も、適切である。
いくつかの実施態様においては、低下した触媒活性を有する変異型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＤ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａを有するとき）、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、それがガイド核酸と相互作用する能力を保持する限り、依然として部位特異的に標的核酸に結合することができる（それが依然としてガイド核酸によって標的核酸配列に導かれるからである）。
Figure 2022530224000048
上記に加えて、変異型Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ポリペプチドについて上記したのと同じ配列同一性のパラメーターを有し得る。すなわち、いくつかの実施態様においては、適切な変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含み、モチーフ１～４のそれぞれは、図１中に示されるＣａｓ９アミノ酸配列（配列番号１）の、またはあるいはモチーフ１～４（表１中に示されるように、配列番号１のモチーフ１～４は、それぞれ配列番号３～６である）に対して；またはあるいは図１中に示されるＣａｓ９アミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸７～１６６若しくは７３１～１００３に対して６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。上記で定義された任意のＣａｓ９タンパク質は、本開示の組成物において、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７において具体的に参照されているものを含めて、Ｃａｓ９ポリペプチドとして、またはキメラＣａｓ９ポリペプチドの一部として使用することができる。
いくつかの実施態様においては、適切な変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、図１に示されるＣａｓ９アミノ酸配列（配列番号１）に対して６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。上記で定義された任意のＣａｓ９タンパク質は、本開示の組成物において、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２６１７において具体的に参照されているものを含めて、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドまたはキメラ変異型Ｃａｓ９ポリペプチドの一部として使用することができる。
キメラポリペプチド（融合ポリペプチド）
いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、キメラＣａｓ９ポリペプチド（本明細書においては、融合ポリペプチド、例えば、「Ｃａｓ９融合ポリペプチド」とも呼ばれる）である。Ｃａｓ９融合ポリペプチドは、標的核酸（例えば、切断、メチル化、脱メチル化等）および／若しくは標的核酸に関連するポリペプチド（例えば、例えばヒストンテールのメチル化、アセチル化等）を結合させる並びに／またはそれらを修飾することができる。
Ｃａｓ９融合ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、天然に発生するＣａｓ９ポリペプチド）と配列において異なるために、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｃａｓ９融合ポリペプチドは、共有結合された異種ポリペプチド（また「融合パートナー」とも呼ばれる）に融合したＣａｓ９ポリペプチド（例えば、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド、変異型Ｃａｓ９ポリペプチド、（上記したような）低下したヌクレアーゼ活性を有する変異型Ｃａｓ９ポリペプチド等）である。いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ９融合ポリペプチドは、共有結合された異種ポリペプチドに融合した、低下したヌクレアーゼ活性を有する変異型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、ｄＣａｓ９）である。いくつかの実施態様においては、異種ポリペプチドは、Ｃａｓ９融合ポリペプチドによっても示されるであろう活性（例えば、酵素活性）（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性等）を示す（従って提供する）。いくつかのそのような実施態様においては、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドが、標的核酸を修飾する活性（例えば、酵素活性）を有する融合パートナーを有する（すなわち、異種ポリペプチドを有する）変異型Ｃａｓ９ポリペプチドであるときの結合する方法、該方法はまた、標的核酸を修飾する方法であると考えることができる。いくつかの実施態様においては、標的核酸（例えば、一本鎖標的核酸）を結合させる方法は、標的核酸の修飾をもたらすことができる。すなわち、いくつかの実施態様においては、標的核酸（例えば、一本鎖標的核酸）を結合させる方法は、標的核酸を修飾する方法であり得る。
いくつかの実施態様においては、異種配列は、細胞内局在化を提供し、すなわち、異種配列は、細胞内局在化配列（例えば、核を標的とする核局在化シグナル（ＮＬＳ）、融合タンパク質を核から遠ざける配列、例えば、核輸出配列（ＮＥＳ）、融合タンパク質を細胞質中に保持する配列、ミトコンドリアを標的とするミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体を標的とする葉緑体局在化シグナル、小胞体（ＥＲ）保持シグナル等）である。いくつかの実施態様においては、変異型Ｃａｓ９は、タンパク質が核を標的としない（これは、例えば、標的核酸が細胞質ゾル中に存在するＲＮＡであるときに有利であり得る）ように、ＮＬＳを含まない。いくつかの実施態様においては、異種配列は、追跡および／または精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ等）を提供することができる（すなわち、異種配列は検出可能な標識である）。いくつかの実施態様においては、異種配列は、増加したまたは減少した安定性を提供することができる（すなわち、異種配列は、いくつかの実施態様においては、制御可能である（例えば、温度感受性または薬物制御可能なデグロン配列、下記参照 安定性制御ペプチド、例えば、デグロンである）。いくつかの実施態様においては、異種配列は、標的核酸からの増加したまたは減少した転写を提供することができる（すなわち、異種配列は、転写調節配列、例えば、転写因子／活性化因子またはそのフラグメント、転写因子／活性化因子を動員するタンパク質若しくはそのフラグメント、転写リプレッサー若しくはそのフラグメント、転写リプレッサーを動員するタンパク質若しくはそのフラグメント、小分子／薬物応答性転写レギュレーター等である）。いくつかの実施態様においては、異種配列は、結合ドメインを提供することができる（すなわち、異種配列は、例えば、目的の別のタンパク質、例えば、ＤＮＡまたはヒストン修飾タンパク質、転写因子または転写リプレッサー、動員タンパク質、ＲＮＡ修飾酵素、ＲＮＡ結合タンパク質、翻訳開始因子、ＲＮＡスプライシング因子等に結合するＣａｓ９融合ポリペプチドの能力を提供するための、タンパク質結合配列である）。異種核酸配列は、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成するために、（例えば、遺伝子工学によって）別の核酸配列に連結され得る。
対象のＣａｓ９融合ポリペプチド（Ｃａｓ９融合タンパク質）は、上記の任意の組合せで複数の（１つ以上、２つ以上、３つ以上等）の融合パートナーを有し得る。例示的な例として、Ｃａｓ９融合タンパク質は、活性（例えば、転写調節、標的修飾、標的核酸に関連するタンパク質の修飾等）を提供する異種配列を有することができ、細胞内局在化配列を有することもできる。いくつかの実施態様においては、そのようなＣａｓ９融合タンパク質はまた、追跡および／または精製を容易にするためのタグ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ、血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ等）を有し得るであろう。別の例示的な例として、Ｃａｓ９タンパク質は、１つまたは複数のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１、２、３、４、または５つのＮＬＳ）を有し得る。いくつかの実施態様においては、融合パートナー（または複数の融合パートナー）（例えば、ＮＬＳ、タグ、活性を提供する融合パートナー等）は、Ｃａｓ９のＣ－末端にまたはその近くに位置する。いくつかの実施態様においては、融合パートナー（または複数の融合パートナー）（例えば、ＮＬＳ、タグ、活性を提供する融合パートナー等）は、Ｃａｓ９のＮ－末端に位置する。いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ９は、Ｎ－末端およびＣ－末端の両方に融合パートナー（または複数の融合パートナー）（例えば、ＮＬＳ、タグ、活性を提供する融合パートナー等）を有する。
増加または減少した安定性を提供する適切な融合パートナーは、デグロン配列を含むが、これに限定されない。デグロンは、それらがその一部であるタンパク質の安定性を制御するアミノ酸配列であることが当業者によって容易に理解される。例えば、デグロン配列を含むタンパク質の安定性は、デグロン配列によって部分的に制御されている。いくつかの実施態様においては、適切なデグロンは、デグロンが実験的制御とは独立してタンパク質の安定性にその影響を与えるように構成的である（すなわち、デグロンは、薬物誘導性、温度誘導性等ではない）。いくつかの実施態様においては、デグロンは、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドが所望の条件に依存して「オン」（すなわち、安定）または「オフ」（すなわち、不安定、分解）になることができるように、制御可能な安定性を有する変異型Ｃａｓ９ポリペプチドを提供する。例えば、デグロンが温度感受性デグロンである場合、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、閾値温度（例えば、４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃等）未満では機能的（すなわち、「オン」、安定）であり得るが、閾値温度超では機能しない（すなわち、「オフ」、分解）。別の例として、デグロンが薬物誘導性デグロンである場合、薬物の存在または不在は、タンパク質を「オフ」（すなわち、不安定）状態から「オン」（すなわち、安定）状態に、またはその逆に切り替えることができる。例示的な薬物誘導性デグロンは、ＦＫＢＰ１２タンパク質に由来する。デグロンの安定性は、デグロンに結合する小分子の存在または不在によって制御される。
適切なデグロンの例は、Ｓｈｉｅｌｄ－１、ＤＨＦＲ、オーキシン、および／または温度によって制御されるデグロンを含むが、これらに限定されない。適切なデグロンの非限定的な例は、当技術分野において知られている（例えば、それらの全てが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる；Ｄｏｈｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４． ２６３（５１５１）：ｐ．１２７３－１２７６：Ｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔｓ；Ｓｃｈｏｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００９ Ｊａｎ；２９６（１）：Ｆ２０４－１１：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｆａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ＴＲＰＶ５ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｓｈｉｅｌｄ－１；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ． ２００８ Ｎｏｖ １５；１８（２２）：５９４１－４：Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｗｉｔｈ ＦＫＢＰ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ；Ｋａｎｅｍａｋｉ，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ． ２０１２ Ｄｅｃ ２８：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｅｇｒｏｎｓ；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ２０１２ Ｎｏｖ ３０；４８（４）：４８７－８：Ｔｉｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌ ｄｅｇｒｏｎ；Ｂａｒｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１３ Ｊａｎ １８；３３（１）．：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｄｅｇｒｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；およびＧｒｅｕｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ． ２０１２ Ｎｏｖ １０；（６９）：Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｄｅｇｒｏｎ（ｄｇｎ）－ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）－ｂａｓｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）。
例示的なデグロン配列は、細胞および動物の両方において十分に特徴付けられ、試験されてきた。すなわち、Ｃａｓ９（例えば、野生型Ｃａｓ９；変異型Ｃａｓ９；低下したヌクレアーゼ活性を有する変異型Ｃａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９等）をデグロン配列に融合すると、「調整可能な」および「誘導性の」Ｃａｓ９ポリペプチドが生成する。本明細書において記載される融合パートナーのいずれも、任意の望ましい組合せで使用することができる。この点を例示するための１つの非限定的な例として、Ｃａｓ９融合タンパク質（すなわち、キメラＣａｓ９ポリペプチド）は、検出のためのＹＦＰ配列、安定性のためのデグロン配列、および標的核酸の転写を増加させるための転写活性化因子配列を含み得る。Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、野生型Ｃａｓ９、変異型Ｃａｓ９、低下したヌクレアーゼ機能を有する変異型Ｃａｓ９等）にとっての融合パートナーとしての使用に適切なレポータータンパク質は、以下の例示的なタンパク質（またはそれらの機能性断片）を含むが、これらに限定されない：ｈｉｓ３、β－ガラクトシダーゼ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、チェリー、トマト等、およびそれらのさまざまな誘導体）、ルシフェラーゼ、β－グルクロニダーゼ、およびアルカリホスファターゼ。さらに、Ｃａｓ９融合タンパク質において使用することができる融合パートナーの数は無制限である。いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ９融合タンパク質は、１つ以上の（例えば２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、または５つ以上の）異種配列を含む。
適切な融合パートナーは、それらのいずれもが、核酸を直接修飾すること（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのメチル化）または核酸関連ポリペプチドを修飾すること（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質、およびＲＮＡ結合タンパク質等）に向けることができる、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。さらに適切な融合パートナーは、境界要素（例えば、ＣＴＣＦ）、末梢動員を提供するタンパク質およびそのフラグメント（例えば、ラミンＡ、ラミンＢ等）、およびタンパク質ドッキング要素（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ１等）を含むが、これらに限定されない。
対象の変異型Ｃａｓ９ポリペプチドにとってのさまざまな追加の適切な融合パートナー（またはそれらのフラグメント）の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許出願：ＷＯ２０１０／０７５３０３、ＷＯ２０１２／０６８６２７、およびＷＯ２０１３／１５５５５５中に記載されているものを含むが、これらに限定されない。
適切な融合パートナーは、標的核酸上にまたは標的核酸に関連するポリペプチド（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ編集タンパク質等）上に直接作用することによって間接的に転写を増加させる活性を提供するポリペプチドを含むが、これに限定されない。適切な融合パートナーは、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドを含むが、これに限定されない。
追加の適切な融合パートナーは、標的核酸の増加した転写および／または翻訳を直接提供するポリペプチド（例えば、転写活性化因子またはそのフラグメント、転写活性化因子を動員するタンパク質またはそのフラグメント、小分子／薬物応答性転写および／または翻訳調節因子、翻訳調節タンパク質等）を含むが、これに限定されない。
増加または減少した転写を達成するための融合パートナーの非限定的な例は、転写活性化因子および転写リプレッサードメイン（例えば、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）等）を含む。いくつかのそのような実施態様においては、Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸によって標的核酸における特定の位置（すなわち、配列）に標的化され、プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼ結合を遮断すること（これは、転写活性化因子機能を選択的に阻害する）、および／または局所クロマチン状態を修飾すること（例えば、標的核酸を修飾するかまたは標的核酸に関連するポリペプチドを修飾する融合配列が使用されるとき）などの遺伝子座特異的調節を発揮する。いくつかの実施態様においては、変化は、一過性である（例えば、転写抑制または活性化）。いくつかの実施態様においては、変化は、遺伝性である（例えば、エピジェネティックな修飾が、標的核酸または標的核酸に関連するタンパク質、例えば、ヌクレオソームヒストンに対して行われるとき）。
ｓｓＲＮＡ標的核酸を標的化するときの使用のための融合パートナーの非限定的な例は、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）；タンパク質翻訳成分（例えば、翻訳開始、伸長、および／または放出因子；例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡメチラーゼ；ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＲＮＡデアミナーゼ、例えば、ＡからＩおよび／またはＣからＵへの編集酵素を含む、ＲＮＡ上に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ））；ヘリインボディメント（ｈｅｌｉｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）；ＲＮＡ結合タンパク質；等を含む（が、これらに限定されない）。融合パートナーは、タンパク質全体を含み得、またはいくつかの実施態様においてはタンパク質のフラグメント（例えば、機能性ドメイン）を含み得ることが理解される。
いくつかの実施態様においては、異種配列は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＣ末端に融合することができる。いくつかの実施態様においては、異種配列は、Ｃａｓ９ポリペプチドのＮ末端に融合することができる。いくつかの実施態様においては、異種配列は、Ｃａｓ９ポリペプチドの内部部分（すなわち、Ｎ－またはＣ－末端以外の部分）に融合することができる。
さらに、キメラＣａｓ９ポリペプチドの融合パートナーは、一過性または不可逆的、直接または間接的を問わず、エンドヌクレアーゼ（例えばＳＭＧ５およびＳＭＧ６などのタンパク質由来のＲＮａｓｅ Ｉ、ＣＲＲ２２ ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、およびＰＩＮ（ＰｉｌＴ Ｎ－末端）ドメイン）；ＲＮＡ切断を刺激することに関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＣＦＩｍおよびＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えばＸＲＮ－１またはエキソヌクレアーゼＴ）；脱アデニラーゼ（例えばＨＮＴ３）；ナンセンス変異依存ＲＮＡ崩壊に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰ Ｓ１、Ｙ１４、ＤＥＫ、ＲＥＦ２、およびＳＲｍ１６０）；ＲＮＡを安定化することに関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＰＡＢＰ）；翻訳を抑制することに関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＡｇｏ２およびＡｇｏ４）；翻訳を刺激することに関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＳｔａｕｆｅｎ）；翻訳を調節することに関与する（例えば、できる）タンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、伸長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＰＡＰ１、ＧＬＤ－２、およびＳｔａｒ－ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジニル化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＣＩ Ｄ１および末端ウリジル酸トランスフェラーゼ）；ＲＮＡの局在化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＩＭＰ１、ＺＢＰ１、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、およびＢｉｃａｕｄａｌ－Ｄからの）；ＲＮＡの核内保持に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＲｒｐ６）；ＲＮＡの核外輸送に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＴＡＰ、ＮＸＦ１、ＴＨＯ、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、およびＡｌｙ）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＰＴＢ、Ｓａｍ６８、およびｈｎＲＮＰ Ａ１）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばセリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）ドメイン）；転写の効率を低下させることに関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＦＵＳ（ＴＬＳ））；転写を刺激することに関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えばＣＤＫ７およびＨＩＶ Ｔａｔ）を含む群から選択されるエフェクタードメインを含むがこれに限定されない、ｓｓＲＮＡ（これは、本開示の目的のために、分子内および／または分子間二次構造、例えば、ヘアピン、ステムループなどの二本鎖ＲＮＡ二重鎖等を含む）と相互作用することができる任意のドメインであり得る。あるいは、エフェクタードメインは、エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；脱アデニラーゼ；ナンセンス変異依存ＲＮＡ崩壊活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を調節することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、伸長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡのポリアデニル化が可能なタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡのポリウリジニル化が可能なタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡ局在化活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡの核内保持が可能なタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外輸送活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングの抑制が可能なタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングの刺激が可能なタンパク質およびタンパク質ドメイン；転写の効率を低下させることができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；転写を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメインを含む群から選択し得る。別の適切な融合パートナーは、ＷＯ２０１２０６８６２７においてより詳細に記載されているＰＵＦ ＲＮＡ結合ドメインである。
Ｃａｓ９ポリペプチドにとっての融合パートナーとして（全体としてまたはその断片として）使用することができるいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的ＲＮＡ結合モジュールおよびスプライシングエフェクタードメインを有するモジュラー構成を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、プレｍＲＮＡにおけるエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に結合するＮ－末端ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）およびエクソンの含有を促進するＣ－末端ＲＳドメインを含有する。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａｌは、そのＲＲＭドメインを通してエキソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に結合し、Ｃ－末端のグリシンリッチドメインを通してエクソンの含有を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの代替部位間の調節配列に結合することによって、スプライス部位（ｓｓ）の代替使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＥＳＥを認識し、イントロン近位部位の使用を促進することができるが、一方、ｈｎＲＮＰ Ａｌは、ＥＳＳに結合し、スプライシングをイントロン遠位部位の使用にシフトすることができる。そのような要因の１つの用途は、内因性遺伝子、特に疾患関連遺伝子の代替スプライシングを調節するＥＳＦを生成することである。例えば、Ｂｃｌ－ｘ ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、反対の機能のタンパク質をコードする２つの代替５’スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを生成する。ロングスプライシングアイソフォームＢｃｌ－ｘＬは、長寿命の有糸***後細胞において発現する強力なアポトーシス阻害剤であり、多くの癌細胞においてアップレギュレートされ、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。ショートアイソフォームＢｃｌ－ｘＳは、アポトーシス促進性アイソフォームであり、高い回転率を有する細胞（例えば、発達するリンパ球）において高レベルで発現する。２つのＢｃｌ－ｘスプライシングアイソフォームの比率は、コアエクソン領域またはエクソン伸長領域のいずれか中に（すなわち、２つの代替５’スプライス部位の間に）位置する複数のシスエレメント（ｃω－エレメント）によって調節される。さらなる例については、ＷＯ２０１００７５３０３を参照されたい。
いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、野生型Ｃａｓ９、変異型Ｃａｓ９、低下したヌクレアーゼ活性を有する変異型Ｃａｓ９等）は、ペプチドスペーサーを介して融合パートナーに連結し得る。
いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ９ポリペプチドは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜を通過することを促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機若しくは無機化合物を指し得る、「タンパク質伝達ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ－細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含む。小さな極性分子から大きな高分子および／またはナノ粒子に及ぶことができる別の分子に付着したＰＴＤは、分子が膜を通過する、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、または細胞質ゾルから細胞小器官内に移動するのを促進する。いくつかの実施態様においては、別の分子に付着したＰＴＤは、分子の核中への進入を促進する（例えば、いくつかの実施態様においては、ＰＴＤは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む）。いくつかの実施態様においては、Ｃａｓ９ポリペプチドは、２つ以上のＮＬＳ、例えば、２つ以上のＮＬＳをタンデムに含む。いくつかの実施態様においては、ＰＴＤは、Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ末端に共有結合している。いくつかの実施態様においては、ＰＴＤは、Ｃａｓ９ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合している。いくつかの実施態様においては、ＰＴＤは、Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端に共有結合している。いくつかの実施態様においては、ＰＴＤは、核酸（例えば、ガイド核酸、ガイド核酸をコードするポリヌクレオチド、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド等）に共有結合している。例示的なＰＴＤは、最小のウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７～５７に対応する；配列番号７）；細胞への進入を指示するのに十分なアルギニンの数（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０～５０個のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９（６）：４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；短縮型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号８）；Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号９）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号：１０）；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１１）を含むが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）；３アルギニン残基から５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーを含むがこれらに限定されず；例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列は、以下の：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１５）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１６）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１７）；およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１８）のいずれも含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様においては、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ） Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、正味電荷をほぼゼロに低下させ、それにより細胞中への接着および取込みを阻害する、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含む。リンカーの切断によって、ポリアニオンは、放出され、局所的にポリアルギニンおよびその固有の接着性を明らかにし、すなわちＡＣＰＰを膜を通過するように「活性化する」。
いくつかの実施態様においては、組成物は、その例が図２、１６、または１７において提供されるＣｐｆ１ ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼを含み得る。Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼの別名は、Ｃａｓ１２ａである。本開示のＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｉ）シングルエンドヌクレアーゼタンパク質、およびｉｉ）ｃｒＲＮＡを含み、ここで、ｃｒＲＮＡの３’末端の一部は、標的核酸に相補的なガイド配列を含有する。このシステムにおいては、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡによって標的ＤＮＡに直接動員される。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１のガイド配列は、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために少なくとも１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、または１６ｎｔでなければならず、効率的なＤＮＡ切断を達成するために最低１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、または１８ｎｔでなければならない。
本開示のＣｐｆ１システムは、さまざまな点においてＣａｓ９とは異なる。まず、Ｃａｓ９と異なり、Ｃｐｆ１は、切断のために別個のｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、約４２～４４塩基長と短くあり得－その２３～２５ｎｔはガイド配列であり、１９ｎｔは構成的直接反復配列である。対照的に、組み合わされたＣａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの合成配列は、約１００塩基長であり得る。
第２に、Ｃｐｆ１は、その標的の５’上流に位置する「ＴＴＮ」ＰＡＭモチーフを好む。これは、Ｃａｓ９システムについての標的ＤＮＡの３’上に位置する「ＮＧＧ」ＰＡＭモチーフとは対照的である。いくつかの実施態様においては、ガイド配列の直前のウラシル塩基は、置換することができない（全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＺｅｔｓｃｈｅ，Ｂ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． “Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ”）。
第３に、Ｃｐｆ１の切断部位は、「粘着末端」を作り出す約３～５塩基によってずらされている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６． “Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ” ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｊｕｎｅ ０６， ２０１６）。３～５ｂｐのオーバーハングを有するこれらの粘着末端は、ＮＨＥＪを介したライゲーションを促進し、一致する末端を有するＤＮＡフラグメントの遺伝子編集を改善すると考えられる。切断部位は、ＰＡＭがある５’末端の遠位である、標的ＤＮＡの３’末端中にある。切断位置は通常、ハイブリダイズしていない鎖上の１８番目の塩基およびｃｒＲＮＡにハイブリダイズした相補鎖上の対応する２３番目の塩基に続く。
第４に、Ｃｐｆ１複合体において、「シード」領域は、ガイド配列の最初の５ｎｔ内に位置する。Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡシード領域は、突然変異に非常に感受性が高く、この領域における単一塩基置換でさえ、切断活性を大幅に低下させることができる（Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ． ｅｔ ａｌ． ２０１５ “Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ” Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７７１参照）。重要なことに、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ標的と異なり、Ｃｐｆ１システムの切断部位およびシード領域は、重複しない。Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡターゲッティングオリゴを設計することに関する追加のガイダンスは、（Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ． ｅｔ ａｌ． ２０１５ “Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ” Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７７１）上で入手可能である。
当業者は、本明細書において開示されるＣｐｆ１が、その多くが当技術分野において知られている任意の供給源から誘導または単離される任意の変異体であり得ることを理解するであろう。例えば、いくつかの実施態様においては、本開示のＣｐｆ１ペプチドは、図２において記載されるＦｎＣＰＦ１（例えば、配列番号２）、ＡｓＣｐｆ１（例えば、図１４）、ＬｂＣｐｆ１（例えば、図１５）またはさまざまな他の微生物種由来の多くの既知のＣｐｆ１タンパク質の任意の他のもの、およびそれらの合成変異体を含み得る。
いくつかの実施態様においては、組成物は、Ｃｐｆ１ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、酵素的に活性であり、例えば、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合するとき、標的核酸を切断する。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、野生型Ｃｐｆ１ポリペプチドと比較して（例えば、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列を含むＣｐｆ１ポリペプチドと比較して）低下した酵素活性を示し、ＤＮＡ結合活性を保持する。
いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列の１００アミノ酸から２００アミノ酸（ａａ）、２００ａａから４００ａａ、４００ａａから６００ａａ、６００ａａから８００ａａ、８００ａａから１０００ａａ、１０００ａａから１１００ａａ、１１００ａａから１２００ａａ、または１２００ａａから１３００ａａの連続したストレッチに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列のＣｐｆ１ポリペプチドのＲｕｖＣＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列のＣｐｆ１ポリペプチドのＲｕｖＣＩＩドメインに対に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列のＣｐｆ１ポリペプチドのＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、野生型Ｃｐｆ１ポリペプチドと比較して（例えば、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列を含むＣｐｆ１ポリペプチドと比較して）減少した酵素活性を示し、ＤＮＡ結合活性を保持する。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列のアミノ酸９１７に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換（例えば、Ｄ→Ａ置換）を含む。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列のアミノ酸１００６に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換（例えば、Ｅ→Ａ置換）を含む。いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図２、１６、または１７において示されるアミノ酸配列のアミノ酸１２５５に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換（例えば、Ｄ→Ａ置換）を含む。
いくつかの実施態様においては、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、融合ポリペプチドであり、例えば、ここで、Ｃｐｆ１融合ポリペプチドは：ａ）Ｃｐｆ１ポリペプチド；およびｂ）異種融合パートナーを含む。いくつかの実施態様においては、異種融合パートナーは、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＮ－末端に融合する。いくつかの実施態様においては、異種融合パートナーは、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＣ－末端に融合する。いくつかの実施態様においては、異種融合パートナーは、Ｃｐｆ１ポリペプチドのＮ－末端およびＣ－末端の両方に融合する。いくつかの実施態様においては、異種融合パートナーは、Ｃｐｆ１ポリペプチド内に内部的に挿入される。
適切な異種融合パートナーは、ＮＬＳ、エピトープタグ、蛍光ポリペプチド等を含む。
リンクされたガイドＲＮＡおよびドナー核酸
一つの一面においては、本発明は、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ポリヌクレオチド）、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲシステムを含む複合体を提供し、ここで、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドは、連結している。本明細書において例示されるように、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドは、共有結合または非共有結合のいずれかで連結し得る。一つの実施態様においては、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドは、化学的に結合している。別の実施態様においては、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドは、酵素的に結合している。一つの実施態様においては、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズする。別の実施態様においては、ガイドＲＮＡおよびドナーポリヌクレオチドは両方とも、ブリッジ配列にハイブリダイズする。任意の数のそのようなハイブリダイゼーションスキームが、可能である。
デアミナーゼ
いくつかの実施態様においては、複合体または組成物は、デアミナーゼ（例えば、アデニン塩基エディター）をさらに含む。本明細書において使用される用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」は、分子からのアミン基の除去、または脱アミノ化を触媒する酵素を指す。いくつかの実施態様においては、デアミナーゼは、シチジンまたはデオキシシチジンの、それぞれウリジンまたはデオキシウリジンへの加水分解性脱アミノ化を触媒する、シチジンデアミナーゼである。いくつかの実施態様においては、デアミナーゼは、シトシンのウラシル（例えば、ＲＮＡ中）またはチミン（例えば、ＤＮＡ中）への加水分解性脱アミノ化を触媒する、シトシンデアミナーゼである。
いくつかの実施態様においては、デアミナーゼは、アデニンまたはアデノシンの加水分解性脱アミノ化を触媒する、アデノシンデアミナーゼである。いくつかの実施態様においては、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、アデノシンまたはデオキシアデノシンの、それぞれイノシンまたはデオキシイノシンへの加水分解性脱アミノ化を触媒する、アデノシンデアミナーゼである。いくつかの実施態様においては、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンまたはアデノシンの加水分解性脱アミノ化を触媒する。本明細書において提供されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化したアデノシンデアミナーゼ）は、細菌などの任意の生物由来であり得る。いくつかの実施態様においては、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスなどの生物由来の天然に発生するデアミナーゼの変異体である。
いくつかの実施態様においては、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、自然界において発生しない。例えば、いくつかの実施態様においては、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％は天然に発生するデアミナーゼと同一である。いくつかの実施態様においては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌、黄色ブドウ球菌、腸チフス菌、プトレファシエンス菌、インフルエンザ菌、またはカウロバクタークレセントスなどの細菌由来である。いくつかの実施態様においては、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡデアミナーゼである。いくつかの実施態様においては、ＴａｄＡデアミナーゼは、大腸菌ＴａｄＡデアミナーゼ（ｅｃＴａｄＡ）である。いくつかの実施態様においては、ＴａｄＡデアミナーゼは、短縮型大腸菌ＴａｄＡデアミナーゼである。例えば、短縮型ｅｃＴａｄＡは、完全長ｅｃＴａｄＡと比較して１つ以上のＮ－末端アミノ酸が欠落している可能性がある。いくつかの実施態様においては、短縮型ｅｃＴａｄＡは、完全長ｅｃＴａｄＡと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＮ－末端アミノ酸残基が欠落している可能性がある。いくつかの実施態様においては、短縮型ｅｃＴａｄＡは、完全長ｅｃＴａｄＡと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９、または２０個のＣ－末端アミノ酸残基が欠落している可能性がある。いくつかの実施態様においては、ｅｃＴａｄＡデアミナーゼは、Ｎ－末端メチオニンを含まない。いくつかの実施態様においては、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１またはその変異体である。
デアミナーゼは、本明細書において記載される他のＣＲＩＳＰＲ要素のいずれとも組み合わせて使用することができ（すなわち、組成物として）、またはデアミナーゼは、本明細書において記載される他のＣＲＩＳＰＲ要素（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）のいずれにも融合することができる（すなわち、複合体として）。特定の実施態様においては、デアミナーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはそれらの変異体に融合する。
他の成分
組成物は、核酸またはタンパク質送達製剤において典型的に使用される任意の他の成分をさらに含み得る。例えば、組成物は、脂質、リポタンパク質（例えば、コレステロールおよび誘導体）、リン脂質、ポリマーまたはリポソーム若しくはミセル送達ビヒクルの他の成分をさらに含み得る。組成物はまた、哺乳動物またはヒトなどの細胞または宿主への投与に適した溶媒または担体を含み得る。
いくつかの実施態様においては、組成物は、１つ以上の界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤および／または双性イオン性界面活性剤であり得る。いくつかの実施態様においては、界面活性剤は、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、ブチレンオキシド（ＢＯ）、グリコール酸（ＧＡ）、乳酸（ＬＡ）、またはそれらの組合せのポリマーまたはコポリマーである。例えば、界面活性剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸、またはそれらの混合物であり得る。例示的な界面活性剤のリストは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にトゥイーンと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの、ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名のもとで販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；繰り返しエトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数において異なり得、オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である、オクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０１ＮＰ－４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られている）；ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（一般にＳｐａｎとして知られている）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様においては、界面活性剤は、抗凝固剤（例えば、ヘパリン等）である。いくつかの実施態様においては、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む。
いくつかの事例においては、成分（例えば、核酸成分（例えば、ガイド核酸等）；タンパク質成分（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ポリペプチド、変異型Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ポリペプチド）等）は、標識部分を含む。本明細書において使用される用語「標識」、「検出可能な標識」、または「標識部分」は、シグナル検出を提供し、アッセイの特定の性質に依存して大きく変化し得る任意の部分を指す。目的の標識部分は、直接検出可能な標識（直接標識）（例えば、蛍光標識）および間接的に検出可能な標識（間接標識）（例えば、結合対メンバー）の両方を含む。蛍光標識は、任意の蛍光標識（例えば、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（登録商標）標識等）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強されたＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、チェリー、トマト、タンジェリン、およびそれらの蛍光誘導体）等）であり得る。該方法における使用のための適切な検出可能な（直接または間接的に）標識部分は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的、または他の手段によって検出可能な任意の部分を含む。例えば、適切な間接標識は、（それ自体が直接または間接的に標識することができる）ストレプトアビジンによって結合することができるビオチン（結合対メンバー）を含む。標識はまた、放射性標識（直接標識）（例：３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）；酵素（間接標識）（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ等）；蛍光タンパク質（直接標識）（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、およびそれらの任意の便利な誘導体）；金属標識（直接標識）；比色標識；結合対メンバー等を含む。「結合対のパートナー」または「結合対メンバー」によって、第１のおよび第２の部分の１つが意味され、ここで、第１のおよび第２の部分は、互いに特異的な結合親和性を有する。適切な結合対は、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル－Ｘ－抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエロー、およびローダミン抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンを含むが、これらに限定されない。任意の結合対メンバーは、間接的に検出可能な標識部分としての使用に適し得る。
任意の所与の成分、または成分の組合せは、標識しないでおくことができ、または標識部分で検出可能に標識することができる。いくつかの実施態様においては、２つ以上の成分が標識されるとき、それらは、互いに区別可能な標識部分で標識することができる。
カプセル化およびナノ粒子
組成物のいくつかの実施態様においては、ポリマーは、核酸および／またはポリペプチドと組み合わさり、核酸および／またはポリペプチドを部分的にまたは完全にカプセル化する。組成物は、いくつかの製剤においては、ポリマー並びに核酸および／またはポリペプチドを含むナノ粒子を提供することができる。
いくつかの実施態様においては、組成物は、本明細書において記載されるポリマーおよび核酸またはポリペプチドに加えて、コアナノ粒子を含み得る。金属（例えば、金）ナノ粒子またはポリマーナノ粒子を含む、任意の適切なナノ粒子を、使用することができる。
本明細書において記載されるポリマーおよび核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ドナーポリヌクレオチド、または両方）またはポリペプチドは、ナノ粒子表面に直接または間接的に接合することができる。例えば、本明細書において記載されるポリマーおよび核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ドナーポリヌクレオチド、または両方）またはポリペプチドは、ナノ粒子の表面に直接、または介在するリンカーを通して間接的に接合することができる。
任意のタイプの分子を、リンカーとして使用することができる。例えば、リンカーは、少なくとも２つの炭素原子（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の炭素原子）を含む脂肪族鎖であり得、ケトン、エーテル、エステル、アミド、アルコール、アミン、尿素、チオ尿素、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、およびジスルフィド官能基を含む１つ以上の官能基で置換することができる。ナノ粒子が金を含む実施態様においては、リンカーは、任意のチオール含有分子であり得る。チオール基の金との反応は、硫化物（－Ｓ－）共有結合をもたらす。リンカーの設計および合成は、当技術分野においてよく知られている。
いくつかの実施態様においては、ナノ粒子に接合した核酸は、本明細書において記載される１つ以上の要素（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド、およびガイドＲＮＡ、ドナーポリヌクレオチド、およびＣｐｆ１ポリヌクレオチド）をナノ粒子－核酸接合体に非共有結合させるのに役立つリンカー核酸である。例えば、リンカー核酸は、ガイドＲＮＡまたはドナーポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を有し得る。
ナノ粒子（例えば、コロイド金属（例えば、金）ナノ粒子；生体適合性ポリマーを含むナノ粒子）に接合した核酸は、任意の適切な長さを有し得る。核酸がガイドＲＮＡまたはドナーポリヌクレオチドであるとき、長さは、本明細書において論じられ、当技術分野において知られているように、そのような分子に適しているであろう。核酸がリンカー核酸であるとき、それは、リンカーについての任意の適切な長さ、例えば、１０ヌクレオチド（ｎｔ）から１０００ｎｔ、例えば、約１ｎｔから約２５ｎｔ、約２５ｎｔから約５０ｎｔ、約５０ｎｔから約１００ｎｔ、約１００ｎｔから約２５０ｎｔ、約２５０ｎｔから約５００ｎｔ、または約５００ｎｔから約１０００ｎｔの長さを有し得る。いくつかの事例においては、ナノ粒子（例えば、コロイド金属（例えば、金）ナノ粒子；生体適合性ポリマーを含むナノ粒子）ナノ粒子に接合した核酸は、１０００ｎｔを超える長さを有し得る。
ナノ粒子に連結した（例えば、共有結合で連結した；非共有結合で連結した）核酸が、本開示の複合体中に存在するガイドＲＮＡまたはドナーポリヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むとき、ハイブリダイゼーションを促進するのに十分なガイドＲＮＡまたはドナーポリヌクレオチド配列の相補体の領域に対して配列同一性を有する領域を有する。いくつかの実施態様においては、本開示の複合体においてナノ粒子に連結した核酸は、複合体中に存在するガイドＲＮＡまたはドナーポリヌクレオチドの１０から５０ヌクレオチド（例えば、１０ヌクレオチド（ｎｔ）から１５ｎｔ、１５ｎｔから２０ｎｔ、２０ｎｔから２５ｎｔ、２５ｎｔから３０ｎｔ、３０ｎｔから４０ｎｔ、または４０ｎｔから５０ｎｔ）の相補体に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。
いくつかの実施態様においては、ナノ粒子に連結した（例えば、共有結合で連結した；非共有結合で連結した）核酸は、ドナーポリヌクレオチドであるか、またはドナーポリヌクレオチドと同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施態様においては、ナノ粒子に連結した（例えば、共有結合で連結した；非共有結合で連結した）核酸は、ドナーＤＮＡテンプレートに相補的なヌクレオチド配列を含む。
使用方法
本明細書において提供されるのはまた、核酸および／またはポリペプチドを細胞に送達する方法であり、ここで、細胞は、インビトロまたはインビボであり得る。該方法は、本明細書において記載されるポリマー並びに核酸および／またはポリペプチドを含む組成物を、細胞にまたは細胞を含有する対象に投与することを含む。該方法は、任意のタイプの細胞または対象に関して使用することができるが、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に特に有用である。いくつかの実施態様においては、ポリマーは、核酸および／またはポリペプチドが主にまたは排他的に標的細胞または組織（例えば、末梢神経系、中枢神経系、対象の眼、肝臓、筋肉、肺、骨（例えば、造血細胞）、または腫瘍細胞若しくは組織）に送達されるように、ターゲッティング剤を含む。
タンパク質または核酸を対象における細胞に送達するために使用するとき（すなわち、インビボ）、ポリマーが血清中で安定であることが望ましい。血清中の安定性は、ポリマーがタンパク質または核酸のペイロードを血清中の細胞に送達する効率の関数として評価することができる（例えば、インビトロまたはインビボ）。すなわち、いくつかの実施態様においては、ポリマーは、同じ条件下で、ｐＡｓｐ［ＤＥＴ］よりも高い効率で、所与のタンパク質または核酸を血清中の細胞に送達する。
ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の成分を含む組成物と使用するとき、該方法は、標的核酸または遺伝子を編集するために使用し得る。いくつかの実施態様においては、標的核酸を修飾する方法は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を含む。いくつかの実施態様においては、ＨＤＲを行うための本開示の複合体の使用は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または２５％以上のＨＤＲの効率を提供する。いくつかの実施態様においては、標的核酸を修飾する方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含む。いくつかの実施態様においては、ＨＤＲを行うための本開示の複合体の使用は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または２５％以上のＮＨＥＪの効率を提供する。
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、もちろん、決してその範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。
実施例１
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをアミンおよびＮ－（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン（「ＤＥＴ」）で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000049
凍結乾燥したＰＢＬＡ（５０ｍｇ、０．００３７ｍＭｏｌ）をフラスコ中に入れ、テトラヒドロフラン／Ｎ－メチル－２－ピロリジン（各１ｍＬ）中に溶解した。透明な溶液にｎ－ヘキシルアミン（５８．８μＬ、０．４４ｍＭｏｌ、１２０当量）を加え、透明な反応混合物を室温で２４時間撹拌した。約２４時間後、穏やかな無水条件下で、ジエチレントリアミン（ＰＢＬＡセグメントのベンジル基に対して５０当量、１．０ｇ）を透明な混合物に加えた。室温で約１８時間後、反応混合物をジエチルエーテル（１０～１２Ｘ容量、３５ｍＬ）中に沈殿させた。次いで、白色の沈殿物を遠心分離し、ジエチルエーテルで２回洗浄した。白色のポリマーを１Ｍ ＨＣｌ（３ｍＬ）中に溶解し、３．５～５ＫＤのカットオフメンブランで過剰の脱イオン水中で透析した。溶液のｐＨが５～６の間になったとき、透析を停止し、溶液を凍結乾燥して、約６０ｍｇのポリマー生成物を得た。同様の手順をＰＢＬＡに対する異なる比率のｎ－ヘキシルアミンを使用して実施し、ポリマーＡ１～Ａ６を提供した。濃度比およびそれから得られたポリマーを表２中に記載し、値ｘおよびｙを平均として報告する。置換度は、１Ｈ ＮＭＲ分光法によって確認した。結果はまた、図３中にプロットする。
Figure 2022530224000050
表２および図３によって実証されるように、疎水性部分の置換度は、反応混合物中に加えられる疎水性部分の当量によって制御することができる。
実施例２
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをアミンおよびＮ－（２－アミノエチル）エタン－１，２－ジアミン（「ＤＥＴ」）で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000051
凍結乾燥したＰＢＬＡ（５０ｍｇ、０．００３７ｍＭｏｌ）をフラスコ中に入れ、テトラヒドロフラン／Ｎ－メチル－２－ピロリジン（各１ｍＬ）中に溶解した。透明な溶液に１－（４－ブチルシクロヘキシル）メタンアミン（７５ｍｇ、０．４４ｍＭｏｌ、１２０当量）を加え、透明な反応混合物を室温で２４時間撹拌した。約２４時間後、穏やかな無水条件下で、ジエチレントリアミン（ＰＢＬＡセグメントのベンジル基に対して５０当量）を透明な混合物に加えた。室温で約１８時間後、反応混合物をジエチルエーテル（１０～１２Ｘ容量、３５ｍＬ）中に沈殿させた。次いで、白色の沈殿物を遠心分離し、ジエチルエーテルで２回洗浄した。白色のポリマーを１Ｍ ＨＣｌ（３ｍＬ）中に溶解し、３．５～５ＫＤのカットオフメンブランで過剰の脱イオン水中で透析した。溶液のｐＨが５～６の間になったとき、透析を停止し、溶液を凍結乾燥して、ポリマー生成物を得た。同様の手順をＰＢＬＡに対する異なる比率の１－（４－ブチルシクロヘキシル）メタンアミンを使用して実施し、ポリマーＢ１～Ｂ３を提供した。濃度比、およびそれから得られたポリマーを表３中に記載し、値ｘおよびｙを平均として報告する。置換度は、１Ｈ ＮＭＲ分光法によって確認した。結果はまた、図４にプロットする。
Figure 2022530224000052
表３および図４によって実証されるように、疎水性部分の置換度は、反応混合物中に加えられる疎水性部分の当量によって制御することができる。
実施例３
以下の実施例は、細胞へのｍＲＮＡの送達に対する、本明細書において記載されるポリマーへの漸増する疎水性側鎖置換の効果を例示する。
実施例１のポリマーＡ１、Ａ２、およびＡ３を、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードするｍＲＮＡとともに処方し、血清および無血清の両方の条件中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞とともに培養した。ｐＡｓｐ［ＤＥＴ］を、ポジティブコントロールとして使用した。結果（図５）は、全ての無血清サンプルにおいていくらかのトランスフェクションを示し、より高いヘキシルアミン置換度を有するポリマーを使用するとトランスフェクション効率が増加した。ポリマーＡ３を使用すると、はるかに高いトランスフェクションが観察された。
実施例４
以下の実施例は、さまざまな細胞にｍＲＮＡを送達するための本発明のポリマーの使用を例示する。
実施例１のポリマーＡ４およびＡ５を、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡとともに処方し、血清および無血清の両方の条件下でＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅｐＧ２と、並びに血清条件下でＭｄｘマウスからの一次筋芽細胞ととともに培養した。結果を、全てのサンプルにおいて良好なトランスフェクションを示す図６～８に示す。最高のトランスフェクションレベルは、より高いレベルのヘキシルアミン置換を有するポリマーＡ５を使用して得られた。
実施例１のポリマーＡ５（ヘキシルアミン置換）および実施例２のポリマーＢ３（（４－ブチルシクロヘキシル）メタンアミン置換）を、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡに処方し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とともに培養した。結果を、図９に示す。両方のポリマーとも、優れたトランスフェクション効率を示した。
実施例５
以下の実施例は、ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質およびシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を細胞に送達するための本発明のポリマーの使用を例示する。
実施例１のポリマーＡ４およびＡ５（ヘキシルアミン置換）並びに実施例２のポリマーＢ３（（４－ブチルシクロヘキシル）メタンアミン置換）を、本実験に使用した。各ポリマーを、（ａ）ＧＦＰターゲッティングｓｇＲＮＡ（６００ｎｇ）およびＣａｓ９（３μｇ）、または（ｂ）ＧＦＰターゲッティングｃｒＲＮＡ（３００ｎｇ）およびＣｐｆ１（３μｇ）のいずれかと混合して、ロードされたポリマーナノ粒子を提供した。血清中に２０，０００細胞密度で播種したＧＦＰ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧＦＰ－ＨＥＫ細胞）を、ロードされたポリマーナノ粒子で処理し、トランスフェクションの２日後にドキシサイクリン誘導を行った。誘導の４８時間後にフローサイトメトリーを行い、ＧＦＰ－であった細胞のパーセンテージを定量した。結果を、図１０（Ｃａｓ９をロードしたポリマー；ｎ＝３およびエラーバー＝ＳＥＭ）および図１１（Ｃｐｆ１をロードしたポリマー；ｎ＝３およびエラーバー＝ＳＥＭ）中に示す。３つのポリマー全てが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のいずれかを使用して有意なＧＦＰノックアウトを示した。
実施例６
以下の実施例は、本発明のポリマーを含むナノ粒子の安定性を例示する。
ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを、実施例１のポリマーＡ５と混合して、ロードされたナノ粒子を提供した。ナノ粒子の１つのサンプルを室温で１分から２時間インキュベートした。別のサンプルを、摂氏４度で２時間保管した。第３のサンプルを、摂氏－８０度で２時間凍結した。ナノ粒子を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞を処理し、ｍＣｈｅｒｒｙの発現をフローサイトメトリーで定量した。結果を、図１２中に示す（ｎ＝２、エラーバー＝ＳＥＭ）。示されるように、ナノ粒子は、ほとんど全てのトランスフェクション効率を保持し、ナノ粒子が試験条件下で安定であったことを実証した。
実施例７
以下の実施例は、ｍＲＮＡを細胞に送達するための、ＰＥＧ化ポリマーと共混合した本明細書において提供されるポリマーの使用を例示する。
実施例１のポリマーＡ５を、漸増する量のＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐまたはＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ－Ｃ６と混合し（すなわち、全組成物の１０重量％、２０重量％、４０重量％および６０重量％）、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをＨｅｐ３Ｂ細胞に送達するために使用した。
Figure 2022530224000053
細胞生存率を、細胞計数キット－８（ＣＣＫ－８）アッセイによって測定し、ＲＦＰ＋パーセントを、フローサイトメトリーで測定した。結果を、図１３中に示す（ｎ＝２、エラーバー＝ＳＥＭ）。ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐまたはＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ－Ｃ６のいずれかと混合した実施例１のポリマーＡ５は、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐまたはＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ－Ｃ６を全組成物の１０重量％、２０重量％、４０重量％および６０重量％の量で含有する組成物について非常に効率的な送達を示した。ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐおよびＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ－Ｃ６は、全組成物の４０重量％から６０重量％に移行するときに、トランスフェクション効率のわずかな低下を示したが、これは予想されていた。ＰＥＧの高い組成は細胞への取り込みを妨げ得ることが、知られている。ＣＣＫ－８アッセイは、試験したポリマーが使用した用量で細胞毒性を引き起こさないことを示した。６０％を超えるｍＲＮＡトランスフェクションを生じた用量では、細胞毒性は何ら観察されなかった。
トランスフェクション効率および細胞生存率の結果の両方は、本明細書において提供されるポリマーがＰＥＧ－ポリマーと共処方することができることを示す。
実施例８
ポリマーＨ２７Ｎを製造し、本明細書において提供される実施例９、１０、１２～１４、１６～２１、２３において使用した。
Figure 2022530224000054
Ｈ２７Ｎは、ＰＢＬＡをＮ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１，Ｎ２，Ｎ２－トリメチルエタン－１，２－ジアミンおよびヘキシルアミンで修飾することによって製造することができる。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000055
凍結乾燥したＰＢＬＡ（５０ｍｇ、０．００３７ｍｍｏｌ；重合度（「ＤＰ」）６５）をフラスコ中に入れ、テトラヒドロフラン／Ｎ－メチル－２－ピロリジン（各１ｍＬ）中に溶解した。透明な溶液にｎ－ヘキシルアミン（１６０当量）を加え、透明な反応混合物を室温で２４時間撹拌した。約２４時間後、穏やかな無水条件下で、Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１，Ｎ２，Ｎ２－トリメチルエタン－１，２－ジアミン（ＰＢＬＡセグメントのベンジル基に対して５０当量）を透明な混合物に加えた。室温で約１８時間後、反応混合物をジエチルエーテル（１０～１２Ｘ容量、３５ｍＬ）中に沈殿させた。次いで、沈殿物を遠心分離し、ジエチルエーテルで２回洗浄した。ポリマーを１Ｍ ＨＣｌ（３ｍＬ）中に溶解し、３．５～５ＫＤのカットオフメンブランで過剰の脱イオン水中で透析した。溶液のｐＨが５～６の間になったとき、透析を停止し、溶液を凍結乾燥して、ポリマー生成物を得た。
実施例９
以下の実施例は、実施例８のポリマーＨ２７Ｎの、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡと組み合わせたときのナノ粒子を形成する能力を示す。
ポリマーＨ２７Ｎを、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡと組み合わせ、得られた混合物を、動的光散乱を使用して分析した。結果を、図１６中にプロットする。
図１６の動的光散乱プロットによって実証されるように、Ｈ２７ＮおよびｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡの組合せは、明確なナノ粒子形成をもたらす。得られたナノ粒子は、１９５ｎｍの平均直径および０．１６の多分散度指数を有していた。
実施例１０
以下の実施例は、実施例８のポリマーＨ２７Ｎの、Ｃａｓ９ ＲＮＰと組み合わせたときのナノ粒子を形成する能力を示す。
ポリマーＨ２７Ｎを、Ｃａｓ９ ＲＮＰと組み合わせ、得られた混合物を、動的光散乱を使用して分析した。結果を、図１７にプロットする。
図１７の動的光散乱プロットによって実証されるように、Ｈ２７ＮおよびＣａｓ９ ＲＮＰの組合せは、明確なナノ粒子形成をもたらす。得られたナノ粒子は、９２ｎｍの平均直径および０．２１の多分散度指数を有していた。
実施例１１
４つのポリマーを、実施例８において記載されたものと同様の合成手順を使用して製造した。得られたポリマーを、本明細書において提供される実施例１２～１４において使用した。製造方法から明らかなように、以下の構造における括弧書きは、ブロックコポリマー構造を意味しない。
Figure 2022530224000056
実施例１２
以下の実施例は、ｍＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達するためのポリマーＨ２７ＮおよびＰＥＧ－ポリマー２～４の使用を例示する。
ＲＦＰ ｍＲＮＡを、Ｈ２７Ｎ並びにＨ２７ＮおよびＰＥＧ－ポリマー２～４の共混合物と、Ｈ２７Ｎに対するＰＥＧ－ポリマーの２０：８０または４０：６０重量％の比率で送達した）。Ｈ２７ＮおよびＰＥＧ－ポリマー２～４の共混合物（Ｈ２７Ｎに対するＰＥＧ－ポリマーの２０：８０または４０：６０重量％の比率）を、ＲＦＰ ｍＲＮＡの添加前に調製した。得られたナノ粒子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で処理し、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクションの２４時間後にＲＦＰ＋細胞を定量した。結果を、図１８中にプロットする。
図１８によって実証されるように、ポリマーＨ２７Ｎは、単独でおよびＰＥＧ－ポリマー２～４と組み合わせて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にｍＲＮＡを送達するのに効率的であり、これらの組合せは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において同等またはわずかに低下したトランスフェクション効率を示した。
実施例１３
以下の実施例は、ポリマーＨ２７ＮのＣａｓ９ ＲＮＰをＨｅｐ３Ｂ細胞に送達する能力に対するＰＥＧ－ポリマー１～３の効果を例示する。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）から構成される培養培地中に５０，０００細胞／ウェルで播種して、４０ρｍｏｌのＣａｓ９ ＲＮＰを形成した。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを調製し、Ｃａｓ９タンパク質をゆっくり加え、ピペッティングによって完全に混合した。別途、Ｈ２７ＮポリマーおよびＰＥＧ－ポリマー１～３を含有する組成物を、１：１の比率を使用して調製した。ナノ粒子を、ポリマーのｓｇＲＮＡに対する４：１の質量比を使用して、得られた組成物をｓｇＲＮＡと混合することによって形成した。得られたナノ粒子を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中で処理し、トランスフェクションの７２時間後にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して抽出した。実験は、生物学的複製およびアッセイ複製で実施し、ｄｄＰＣＲを使用して非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率を定量した。結果を、図１９中にプロットする。
図１９によって実証されるように、ポリマーＨ２７Ｎのみが、Ｈｅｐ３Ｂ細胞における遺伝子編集に効果的であった。ＰＥＧ－ポリマー１～３は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において同等またはわずかに低下した遺伝子編集効率を示した。
実施例１４
以下の実施例は、ポリマーＨ２７ＮのＣａｓ９ ＲＮＰをＨｅｐ３Ｂ細胞に送達する能力に対するＰＥＧ－ポリマー１～３の効果を例示する。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）から構成される培養培地中に５０，０００細胞／ウェルで播種して、４０ρｍｏｌのＣａｓ９ ＲＮＰを形成した。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを調製し、Ｃａｓ９タンパク質をゆっくり加え、ピペッティングによって完全に混合した。別途、Ｈ２７ＮポリマーおよびＰＥＧ－ポリマー１～３を含有する組成物を、１：１の比率を使用して調製した。ナノ粒子を、ポリマーのｓｇＲＮＡに対する８：１の質量比を使用して、得られた組成物をｓｇＲＮＡと混合することによって形成した。得られたナノ粒子を、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中で処理し、トランスフェクションの７２時間後にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して抽出した。実験は、生物学的複製およびアッセイ複製で実施し、ｄｄＰＣＲを使用して非相同末端結合（ＮＨＥＪ）効率を定量した。結果を、図２０中にプロットする。
図２０によって実証されるように、ポリマーＨ２７Ｎのみが、Ｈｅｐ３Ｂ細胞における遺伝子編集に効果的であった。ＰＥＧ－ポリマー１～３は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において同等またはわずかに低下した遺伝子編集効率を示した。
実施例１５
以下の実施例は、Ｌｏｘｐ－ルシフェラーゼマウスによって示される、Ｃｒｅ ｍＲＮＡをマウスに送達するための本発明のポリマーの使用を例示する。
図２１中に記載されるレポーター配列を有するＬｏｘｐ－ルシフェラーゼマウスを、Ｈ２７ＮおよびＣｒｅ ｍＲＮＡで処方したナノ粒子で処理した。コントロールは、未処理のマウスを表す。投与は、髄腔内（ＩＴ）注射を介した。Ｃｒｅ ｍＲＮＡ送達を、生物発光を介して評価し、得られた画像を、図２２Ａ～２２Ｃ中に記載する。
ナノ粒子組成物で処理したマウスは、Ｃｒｅ ｍＲＮＡマウスの有意な送達を示した。
実施例１６
ポリマーＣは、ＰＢＬＡをＮ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１，Ｎ２，Ｎ２－トリメチルエタン－１，２－ジアミンおよび４－メチルペンタン－１－アミンで修飾することによって製造することができる。例示的な手順は、以下のとおりである。
スキーム４。
Figure 2022530224000057
凍結乾燥したＰＢＬＡ（５０ｍｇ、０．００３７ｍＭｏｌ）をフラスコ中に入れ、テトラヒドロフラン／Ｎ－メチル－２－ピロリジン（各１ｍＬ）中に溶解した。透明な溶液にｎ－４－メチルペンタン－１－アミン（１６０当量）を加え、透明な反応混合物を室温で２４時間撹拌した。約２４時間後、穏やかな無水条件下で、Ｎ１－（２－アミノエチル）－Ｎ１，Ｎ２，Ｎ２－トリメチルエタン－１，２－ジアミン（ＰＢＬＡセグメントのベンジル基に対して５０当量）を透明な混合物に加えた。室温で約１８時間後、反応混合物をジエチルエーテル（１０～１２Ｘ容量、３５ｍＬ）中に沈殿させた。次いで、沈殿物を遠心分離し、ジエチルエーテルで２回洗浄した。ポリマーを１Ｍ ＨＣｌ（３ｍＬ）中に溶解し、３．５～５ＫＤのカットオフメンブランで過剰の脱イオン水中で透析した。溶液のｐＨが５～６の間になったとき、透析を停止し、溶液を凍結乾燥して、ポリマー生成物を得た。
実施例１７
以下の実施例は、ａｉ９マウスによって示される、Ｃｒｅ ｍＲＮＡをマウスに送達するための本発明のポリマーの使用を例示する。
図２３において例示されるのと同じレポーター構築物を有するａｉ９マウスを、２つのナノ粒子組成物：（ｉ）ＰＧＡ－ＰＥＧ：ｍＲＮＡの４：１比を有するＨ２７ＮおよびＰＧＡ－ＰＥＧおよびＣｒｅ ｍＲＮＡの混合物（「Ｈ２７Ｎ＋ＰＧＡ－ＰＥＧ（「４：１ＰＧＡ－ＰＥＧ：ｍＲＮＡ比率」）で処方したナノ粒子および（ｉｉ）ＰＧＡ－ＰＥＧ：ｍＲＮＡの６：１比を有するＨ２７ＮおよびＰＧＡ－ＰＥＧおよびＣｒｅ ｍＲＮＡの混合物（「Ｈ２７Ｎ＋ＰＧＡ－ＰＥＧ（「６：１ＰＧＡ－ＰＥＧ：ｍＲＮＡ比率」）で処方したナノ粒子の１つで処理した。コントロールは、未処理のマウスを表す。ナノ粒子の特性を、表４中に要約する。
Figure 2022530224000058
得られたナノ粒子製剤を、髄腔内（ＩＴ）注射を介してマウスに投与した。処理の１０日後、マウスをＣＯ２窒息を介して犠牲にし、左心室を通して１％ヘパリン化生理食塩水、続いてＰＢＳで灌流して、血液を除去した。次いで、脳および脊髄を採取した。マウスの脳を、冠状面において１００μｍの厚さで切断し、１つおきの切片を収集して画像化した。
インビボＣｒｅ ｍＲＮＡ送達を、生物発光を介して脳の吻側および尾側部分について評価し、得られた画像を、図２４中に記載する。
図２４において、ナノ粒子組成物（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれは、未処理のマウス（ネガティブコントロール）と比較して、Ｃｒｅ ｍＲＮＡの脳幹および小脳の尾側部分（すなわち、脳脊髄液（ＣＳＦ）によって囲まれる脳の領域）への増加した送達を示した。さらに、ＰＧＡ－ＰＥＧを含有するナノ粒子組成物（ｉ）および（ｉｉ）は、有意な可視ＲＦＰ発現を定性的に示し、これは、ＰＧＡ－ＰＥＧナノ粒子が脳の尾側領域の脳幹の周りをトランスフェクトする増強された能力を有することを示唆する。
実施例１８
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーＤの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをヘキシルアミンおよびアミン化合物１０で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000059
アミン化合物１０は、スキーム５において記載されるプロトコルを使用して合成した。
Figure 2022530224000060
ＰＢＬＡ（２５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を、５００μＬのＮＭＰおよび５００μＬのＴＨＦの混合物中に溶解した。次いで、この反応混合物にヘキシルアミン（２１．８５ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２３時間撹拌した。次いで、この溶液に、５００μＬのＮＭＰ、５００μＬのＴＨＦおよび５００μＬのトリエチルアミン中に溶解した遊離アミン形態としてのアミン化合物１０（６０７ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌し、粗反応混合物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）中に沈殿させて、粗ポリマーを得た。粗ポリマーを２ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液中に溶解し、３．５～５ＫＤカットオフメンブラン透析バッグを使用して４℃で４８時間透析した。精製したポリマーを凍結乾燥して、ポリマーＤ（１７ｍｇ）を白色の固体として得た。 １Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：４．５３（６５Ｈ）、３．６３－２．２９（ｍ）、２．１７－２．００（ｓ）、１．４１－０．５２（ｍ）．
実施例１９
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーＥの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをヘキシルアミンおよびアミン化合物１３で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000061
アミン化合物１３は、スキーム７において記載されるプロトコルを使用して合成した。
Figure 2022530224000062
ＰＢＬＡ（２５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を、５００μＬのＮＭＰおよび５００μＬのＴＨＦの混合物中に溶解した。次いで、この反応混合物にヘキシルアミン（２１．８５ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２３時間撹拌した。次いで、この溶液に、５００μＬのＮＭＰ、５００μＬのＴＨＦおよび５００μＬのトリエチルアミン中に溶解した遊離アミン形態としてのアミン化合物１３（３７１．７１ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌し、粗反応混合物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）中に沈殿させて、粗ポリマーを得た。粗ポリマーを２ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液中に溶解し、３．５～５ＫＤカットオフメンブラン透析バッグを使用して４℃で４８時間透析した。精製したポリマーを凍結乾燥して、ポリマーＥ（２０ｍｇ）を白色の固体として得た。 １Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：４．５３（ｂｒ ｓ）、３．６３－２．２９（ｍ）、２．１７－２．００（ｓ）、１．５４（ｍ）、１．４１－０．５２（ｍ）．
実施例２０
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーＦの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをシクロヘキシルエチルアミンおよびアミン化合物１３で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
アミン化合物１３は、実施例１９のスキーム７において記載されるプロトコルを使用して合成した。
Figure 2022530224000063
ＰＢＬＡ（２５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を、５００μＬのＮＭＰおよび５００μＬのＴＨＦの混合物中に溶解した。次いで、この反応混合物にシクロヘキシルエチルアミン（２７．４８ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２３時間撹拌した。次いで、この溶液に、５００μＬのＮＭＰ、５００μＬのＴＨＦおよび５００μＬのトリエチルアミン中に溶解した遊離アミン形態としてのアミン化合物１３（３７１．７１ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌し、粗反応混合物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）中に沈殿させて、粗ポリマーを得た。粗ポリマーを２ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液中に溶解し、３．５～５ＫＤカットオフメンブラン透析バッグを使用して４℃で４８時間透析した。精製したポリマーを凍結乾燥して、ポリマーＦ（２０ｍｇ）を白色の固体として得た。 １Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：４．５３（ｂｒ ｓ）、３．６３－２．２９（ｍ）、２．１７－２．００（ｓ）、１．５５－１．１５（ｍ）．
実施例２１
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーＧの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをヘキシルアミンおよびアミン化合物２０で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000064
アミン化合物２０は、スキーム１０において記載されるプロトコルを使用して合成した。
Figure 2022530224000065
ＰＢＬＡ（２５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を、５００μＬのＮＭＰおよび５００μＬのＴＨＦの混合物中に溶解した。次いで、この反応混合物にヘキシルアミン（２１．８５ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２３時間撹拌した。次いで、この溶液に、５００μＬのＮＭＰ、５００μＬのＴＨＦおよび５００μＬのトリエチルアミン中に溶解した遊離アミン形態としてのアミン化合物２０（４０７．８ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌し、粗反応混合物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）中に沈殿させて、粗ポリマーを得た。粗ポリマーを２ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液中に溶解し、３．５～５ＫＤカットオフメンブラン透析バッグを使用して４℃で４８時間透析した。精製したポリマーを凍結乾燥して、ポリマーＧ（２０ｍｇ）を白色の固体として得た。 １Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：４．５３（ｂｒ ｓ）、３．６３－２．２９（ｍ）、２．１７－２．００（ｓ）、１．５４（ｍ）、１．４１－０．５２（ｍ）．
実施例２２
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーＨの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをヘキシルアミンおよびアミン化合物２２で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000066
アミン化合物２２は、スキーム１２において記載されるプロトコルを使用して合成した。
Figure 2022530224000067
ＰＢＬＡ（２５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を、５００μＬのＮＭＰおよび５００μＬのＴＨＦの混合物中に溶解した。次いで、この反応混合物にヘキシルアミン（２１．８５ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２３時間撹拌した。次いで、この溶液に、５００μＬのＮＭＰ、５００μＬのＴＨＦおよび５００μＬのトリエチルアミン中に溶解した遊離アミン形態としてのアミン化合物２２（５４１．５ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌し、粗反応混合物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）中に沈殿させて、粗ポリマーを得た。粗ポリマーを２ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液中に溶解し、３．５～５ＫＤカットオフメンブラン透析バッグを使用して４℃で４８時間透析した。精製したポリマーを凍結乾燥して、ポリマーＨ（２０ｍｇ）を白色の固体として得た。 １Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：４．５３（ｂｒ ｓ）、３．６３－２．２９（ｍ）、２．１７－２．００（ｓ）、１．５４（ｍ）、１．４１－０．５２（ｍ）．
実施例２３
以下の実施例は、本発明のポリマーを含むナノ粒子の、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞に送達する能力を例示する。
ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをポリマーＤ～Ｈのそれぞれと混合して、ロードされたナノ粒子を提供した。得られたナノ粒子を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞を処理し、ｍＣｈｅｒｒｙの発現をフローサイトメトリーで定量した。結果を、図２５（ｎ＝２、エラーバー＝ＳＥＭ）中に示す。
図２５によって実証されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞をポリマーＥ、Ｆ、およびＧから形成したナノ粒子で処理する処理は、ポリマーＤおよびＨから形成したナノ粒子と比較して、比較的高いトランスフェクション効率をもたらした。
実施例２４
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーＩの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをヘキシルアミンおよびアミン化合物１５で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000068
アミン化合物１５は、スキーム１４において記載されるプロトコルを使用して合成した。
Figure 2022530224000069
ＰＢＬＡ（２５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を、５００μＬのＮＭＰおよび５００μＬのＴＨＦの混合物中に溶解した。次いで、この反応混合物にヘキシルアミン（２１．８５ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２３時間撹拌した。次いで、この溶液に、５００μＬのＮＭＰ、５００μＬのＴＨＦおよび５００μＬのトリエチルアミン中に溶解した遊離アミン形態としてのアミン化合物１５（４７３．．５ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌し、粗反応混合物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）中に沈殿させて、粗ポリマーを得た。粗ポリマーを２ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液中に溶解し、３．５～５ＫＤカットオフメンブラン透析バッグを使用して４℃で４８時間透析した。精製したポリマーを凍結乾燥して、ポリマーＩを得た。
実施例２５
本実施例は、本明細書において記載されるポリマーＪの合成のためのガイダンスを提供する。該合成は、ＰＢＬＡをヘキシルアミンおよびアミン化合物１８で修飾することを含む。例示的な手順は、以下のとおりである。
Figure 2022530224000070
アミン化合物１８は、スキーム１６において記載されるプロトコルを使用して合成した。
Figure 2022530224000071
ＰＢＬＡ（２５ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を、５００μＬのＮＭＰおよび５００μＬのＴＨＦの混合物中に溶解した。次いで、この反応混合物にヘキシルアミン（２１．８５ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２３時間撹拌した。次いで、この溶液に、５００μＬのＮＭＰ、５００μＬのＴＨＦおよび５００μＬのトリエチルアミン中に溶解した遊離アミン形態としてのアミン化合物１８（６０７ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間撹拌し、粗反応混合物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）中に沈殿させて、粗ポリマーを得た。粗ポリマーを２ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液中に溶解し、３．５～５ＫＤカットオフメンブラン透析バッグを使用して４℃で４８時間透析した。精製したポリマーを凍結乾燥して、ポリマーＪを得た。
本発明の好ましい実施態様は、本発明を行うために発明者らに知られている最良のモードを含めて、本明細書において記載されている。それらの好ましい実施態様の変形は、前述の説明を読むと、当業者には明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待し、本発明者らは、本明細書において具体的に記載されているのとは別の方法で本発明を実施することを意図する。従って、本発明は、適用法によって許可される、本明細書に添付される特許請求の範囲において列挙される主題の全ての修正および同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上記の要素の任意の組合せは、本明細書において別途示されなければ、またはそうでなければ文脈によって明らかに矛盾しなければ、本発明によって包含される。
値の範囲が提供される場合、間にある各値は、文脈が別途明確に指示しなければ下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間および他の記載されるまたはその記載された範囲中の間にある値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲に含まれ得、また、記載された範囲における任意の特に除外される制限に従い、本発明内に包含される。記載される範囲が制限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる制限のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明中に含まれる。
別途定義されなければ、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様のまたは同等の任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書において言及される全ての刊行物は、それに関連して刊行物が引用される方法および／または材料を開示し説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しなければ、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。すなわち、例えば、「（ａ）複合体」への言及は、複数のそのような複合体を含み、「（ｔｈｅ）Ｃａｓ９ポリペプチド」への言及は、１つ以上のＣａｓ９ポリペプチドおよび当業者に知られているそれらの同等物への言及などを含む等。特許請求の範囲は、いかなる任意の要素をも除外するために起草され得ることがさらに留意される。そのようなものとして、この陳述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単独で」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基礎として機能することを意図する。
明確化のために別個の実施態様の文脈において説明される本発明の特定の特徴が、単一の実施態様において組み合わせて提供されることもあり得ることが理解される。逆に、簡潔化のために単一の実施態様の文脈において説明される本発明のさまざまな特徴は、別個にまたは任意の適切なサブコンビネーションでも提供され得る。本発明に関連する実施態様の全ての組合せは、本発明によって具体的に包含され、ちょうどどの組合せも個別に明示的に開示されているかのように、本明細書において開示される。さらに、さまざまな実施態様およびそれらの要素の全てのサブコンビネーションもまた、本発明によって具体的に包含され、ちょうどどのそのようなサブコンビネーションも個別に明示的に本明細書において開示されているかのように、本明細書において開示される。
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきでない。さらに、提供される発行日は、独立して確認する必要があり得る実際の発行日とは異なり得る。

Claims (47)

  1. 加水分解性ポリマー主鎖を含むポリマーであって、該ポリマー主鎖が：
    （ｉ）疎水性基を含む側鎖を有するモノマー単位；
    （ｉｉ）オリゴアミンまたはポリアミンを含む側鎖を有するモノマー単位；および任意に
    （ｉｉｉ）イオン化可能な基を含む側鎖を有し、任意に７未満のｐＫａを有するモノマー単位
    を含む、ポリマー。
  2. 疎水性基がアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基を含む、請求項１のポリマー。
  3. 疎水性基がＣ３－Ｃ１２直鎖または分岐アルキル基、任意にＣ３－Ｃ６直鎖または分岐アルキル基を含む、請求項１のポリマー。
  4. オリゴアミンまたはポリアミンが式：
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２，
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ４－Ｒ５］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ４－Ｒ５｝；
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ４－Ｒ５］２｝２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５］２｝２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ５］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ５｝；
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ５］２｝２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２、
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；または
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５
    （式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、ｒ１およびｒ２、並びにｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、若しくはシクロアルケニル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－であり：Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである）の基である、請求項１～３のいずれかのポリマー。
  5. ポリアミンが
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
    を含み；
    各Ｒ２が独立して水素またはＣ１－Ｃ３アルキル基であり；
    任意にポリアミンが
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２
    を含む、請求項１～４のいずれか一項のポリマー。
  6. 加水分解性ポリマー主鎖が約１から約８０モル％の疎水性基を有するモノマー単位、約１から約８０モル％のオリゴアミンまたはポリアミンを有するモノマー単位、および０から約８０モル％のイオン化可能な基を有するモノマー単位を含む、請求項１～５のいずれか一項のポリマー。
  7. 加水分解性ポリマー主鎖が７未満のｐＫａを有するイオン化可能な基を含む側鎖を有するモノマー単位を含む、請求項１～６のいずれか一項のポリマー。
  8. 加水分解性ポリマー主鎖がポリアミド、ポリ－Ｎ－アルキルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリカーバメート、またはそれらの組合せを含む、請求項１～７のいずれか一項のポリマー。
  9. 加水分解性ポリマー主鎖がポリアミドを含む、請求項８のポリマー。
  10. 式１：
    Figure 2022530224000072
     （式中：
    ｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４の合計は５より大きく；
    ｎ１およびｎ２のそれぞれは、０から１０００の整数であり、ただし、ｎ１＋ｎ２の合計は２より大きく；
    記号「／」は、それによって分離される単位がランダムにまたは任意の順序で連結されていることを示し；
    Ｒ３ａの各事例は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
    Ｒ３ｂの各事例は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
    各Ｘ１は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合であり；
    Ｒ１３の各事例は、独立して水素、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、またはＣ３－Ｃ１２シクロアルケニル基であり、それらのいずれも任意に１つ以上の置換基で置換され得；
    Ｘ２の各事例は、独立してＣ１－Ｃ１２アルキル若しくはヘテロアルキル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルケニル基、アリール基、複素環基、またはそれらの組合せであり、それらのいずれも１つ以上の置換基で置換され得；
    Ａ１およびＡ２は、独立してそれぞれ式
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
    の基であり、Ｂ１およびＢ２は、独立してそれぞれ
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ４－Ｒ５］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ４－Ｒ５｝；
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ４－Ｒ５］２｝２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－Ｒ５］２｝２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ５］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ５｝；
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ５］２｝２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２、
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ５；または
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５
    である（式中、ｐ１からｐ４、ｑ１からｑ６、ｒ１およびｒ２、並びにｓ１からｓ４は、独立してそれぞれ１から５の整数であり；Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、若しくはＣ３－Ｃ１２シクロアルケニル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；Ｒ４の各事例は、独立して－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－であり；Ｒ５の各事例は、独立して、任意に２から８個の第三級アミン、または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分を含む置換基を含む、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せである））の構造を含む、請求項１のポリマー。
  11. 式１Ａ：
    Figure 2022530224000073
     （式中、Ｑは、式：
    Figure 2022530224000074
    であり
    ｃは、０から５０の整数であり；
    Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
    Ｒ１は、水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、またはＣ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であり；
    Ｒ６は、水素、アミノ基、任意に１つ以上のアミンで置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ１－Ｃ１２ヘテロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、Ｃ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であるか；あるいは組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分であり；
    ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４、ｎ１、ｎ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ１３、Ｘ１、Ｘ２、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、およびＢ２は、１０において定義されているとおりである）の構造を有する、請求項１０のポリマー。
  12. Ｂ１およびＢ２のそれぞれが式－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－Ｒ４－Ｒ５の基である、請求項１０または１１のポリマー。
  13. 各Ｒ５が独立して
    Figure 2022530224000075
    Figure 2022530224000076
    （式中、Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、若しくはシクロアルケニル基であるか、あるいはＲ２が第２のＲ２と結合して複素環基を形成し；
    Ｒ７は、任意に１つ以上のアミンで置換された、Ｃ１－Ｃ５０アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基であり；
    ｚは、１から５の整数であり；
    ｃは、０から５０の整数であり；
    Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
    ｎは、０から５０の整数であり；
    Ｒ８は、組織特異的または細胞特異的なターゲッティング部分である）である、請求項１０～１２のいずれかのポリマー。
  14. Ｒ４が－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である、請求項１０～１３のいずれかのポリマー。
  15. Ｒ５が
    Figure 2022530224000077
    である、請求項１０～１４のいずれかのポリマー。
  16. （ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＋ｍ４）／（ｎ１＋ｎ２）の比率が約２５以下、かつ任意に約１以上である、請求項１０～１５のいずれかのポリマー。
  17. 組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分が：
    Figure 2022530224000078
    （式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは、独立して水素、ハロゲン、任意に１つ以上のアミノ基で置換された、Ｃ１－Ｃ４アルキル、またはＣ１－Ｃ４アルコキシである）である、請求項１０～１６のいずれか一項のポリマー。
  18. 式４：
    Figure 2022530224000079
    （式中、ｍ１、ｍ２、ｎ１、ｎ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ１３、Ｘ１、Ｘ２、Ａ１、およびＡ２は、請求項１０において定義されているとおりである）の構造を有する請求項１０のポリマー。
  19. 式１Ｂ：
    Figure 2022530224000080
    （式中、
    ｃは、０から５０の整数であり；
    Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
    Ｒ１は、水素、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、またはＣ３－Ｃ１２シクロアルケニル基であり、それらのいずれも任意に１つ以上の置換基で置換されており；
    Ｒ２の各事例は、独立して水素またはＣ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、若しくはＣ３－Ｃ１２シクロアルケニル基であり；
    Ｒ６は、水素、アミノ基、任意に１つ以上のアミンで置換されているアリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ１－Ｃ１２ヘテロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、若しくはＣ３－Ｃ１２シクロアルケニル基であるか；または組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分であり；
    ｍ１、ｍ２、ｎ１、ｎ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ１３、Ｘ１、Ｘ２、Ａ１、およびＡ２は、請求項１０において定義されているとおりである）の構造を有する、請求項１０のポリマー。
  20. 式１Ｃ：
    Figure 2022530224000081
    （式中、
    Ｒ１は、水素、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、またはＣ３－Ｃ１２シクロアルケニル基であり、それらのいずれも任意に１つ以上の置換基で置換されており；
    Ｒ６は、水素、アミノ基、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ１－Ｃ１２ヘテロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１２アルケニル基、Ｃ３－Ｃ１２シクロアルキル基、若しくはＣ３－Ｃ１２シクロアルケニル基であり、それらのいずれも任意に１つ以上のアミンで置換されており；または組織特異的または細胞特異的ターゲッティング部分であり；
    ｍ１、ｍ２、ｎ１、ｎ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ１３、Ｘ１、Ｘ２、Ａ１、およびＡ２は、８において定義されているとおりである）の構造を有する、請求項１０のポリマー。
  21. 式：
    Figure 2022530224000082
    Figure 2022530224000083
    Figure 2022530224000084
    Figure 2022530224000085
    Figure 2022530224000086
    Figure 2022530224000087
    Figure 2022530224000088
    Figure 2022530224000089
    Figure 2022530224000090
    Figure 2022530224000091
    Figure 2022530224000092
    Figure 2022530224000093
    Figure 2022530224000094
    Figure 2022530224000095
    Figure 2022530224000096
    Figure 2022530224000097
    Figure 2022530224000098
    Figure 2022530224000099
    Figure 2022530224000100
    Figure 2022530224000101
    Figure 2022530224000102
    Figure 2022530224000103
    （式中、（ａ＋ｂ）は、約５から約６５であり、（ｃ＋ｄ）は、約２から約６０であり、（ｅ＋ｆ）は、約２から約６０である）を有する、請求項１０のポリマー。
  22. 式：
    Figure 2022530224000104
    （式中、（ａ＋ｂ）は、約５から約６５であり、（ｃ＋ｄ）は、約２から約６０であり、ｐの各事例は、独立して２から２００の整数である）を有する、請求項１０のポリマー。
  23. ポリマーがカチオン性ポリマーである、請求項１～２２のいずれかのポリマー。
  24. 請求項１０に記載の式１のポリマーを製造する方法であって、該方法が
    （ａ）式４：
    Figure 2022530224000105
    のポリマーを提供すること
    および
    （ｂ）式４のポリマーの基Ａ１および／またはＡ２の一部を修飾して式１：
    Figure 2022530224000106
     のポリマーを提供することを含む、方法（式中、式１および４のｍ１、ｍ２、ｍ３、ｍ４、ｎ１、ｎ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ１３、Ｘ１、Ｘ２、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、およびＢ２は、請求項１０において定義されているとおりである）。
  25. 式４のポリマーの基Ａ１および／またはＡ２の一部を修飾することが基の一部を構造：
    Figure 2022530224000107
    を有する化合物と反応させて式１のポリマーを提供することを含む、請求項２１の方法（式中、Ａ１およびＡ２は、独立してそれぞれ式
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２ ２］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２Ｒ２｝；または
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２ ２］２｝２
    の基であり、Ｂ１およびＢ２は、
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５；
    －（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ２－Ｒ４－Ｒ５］２；
    －（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛［－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＲ２ ２］［－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＲ２－］ｒ２（ＣＨ２）ｓ３－Ｒ４－Ｒ５｝；
    －（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ［－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ４－Ｒ４－Ｒ５］２｝２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［Ｎ｛（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５｝－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２；
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－ＣＨ（ＣＯＮＨ２）－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５
    である）。
  26. Ａ１およびＡ２が両方とも：
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２ ２
    であり；
    Ｂ１およびＢ２が両方とも：
    －（ＣＨ２）ｐ１－［ＮＲ２－（ＣＨ２）ｑ１－］ｒ１ＮＲ２－（ＣＨ２）ｓ１－Ｒ４－Ｒ５
    である、請求項２５の方法。
  27. 請求項１８に記載の式４：
    Figure 2022530224000108
    のポリマーを製造する方法であって、該方法が
    （Ｉ）式２：
    Figure 2022530224000109
    のポリマーを（ａ）式ＨＮＲ１３Ａ１および／若しくはＨＮＲ１３Ａ２の化合物；並びに（ｂ）式Ｈ２ＮＸ２若しくはＨＯＸ２の化合物と、同時に若しくは任意の順序で反応させること；
    または
    （ＩＩ）式３
    Figure 2022530224000110
    のポリマーを式ＨＮＲ１３Ａ１および／若しくはＨＮＲ１３Ａ２の化合物と反応させることを含む、方法（式中、
    ｐ１は、１から２０００の整数であり；
    ｐ２は、１から２０００の整数であり；
    各Ｒ３は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
    ｍ１、ｍ２、ｎ１、ｎ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ１３、Ｘ１、Ｘ２、Ａ１、およびＡ２は、請求項１０において定義されているとおりである）。
  28. 式２または式３の構造を含むポリマーがそれぞれ式２Ａまたは式３Ａ：
    Figure 2022530224000111
    （式中、
    ｐ１は、１から２０００の整数であり；
    ｐ２は、１から２０００の整数であり；
    各Ｒ３は、独立してメチレンまたはエチレン基であり；
    各Ｘ１は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ１３－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）（Ｏ）－、または結合であり；
    Ｘ２の各事例は、独立して、任意に１つ以上の第一級、第二級、若しくは第三級アミンを含む、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアルキル基、複素環基、またはそれらの組合せであり；それらのいずれも１つ以上の置換基で置換され得；
    ｃは、０から５０の整数であり；
    Ｙは、任意に存在して、切断可能なリンカーであり；
    Ｒ１は、水素、任意に１つ以上の置換基で置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、またはＣ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であり；
    Ｒ６は、水素、アミノ基、任意に１つ以上のアミンで置換された、アリール基、複素環基、Ｃ１－Ｃ１２アルキル基、Ｃ１－Ｃ１２ヘテロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、またはシクロアルケニル基、Ｃ１－Ｃ１２直鎖若しくは分岐アルキル基であるか；あるいは組織特異的若しくは細胞特異的ターゲッティング部分であり；
    ｐ１、ｐ２、Ｒ３、Ｘ１、およびＸ２は、請求項２７において定義されているとおりである）のポリマーである、請求項２７の方法。
  29. 式２または式３の構造を含むポリマーがそれぞれ式２Ｂまたは式３Ｂ：
    Figure 2022530224000112
    （式中、
    およびｐ１、ｐ２、Ｒ３、Ｘ１、およびＸ２は、請求項２７において定義されているとおりである）のポリマーである、請求項２７の方法。
  30. 式２の化合物を、（ａ）ＨＮＲ１３Ａ１および／またはＨＮＲ１３Ａ２の化合物、並びに（ｂ）式Ｈ２ＮＸ２またはＨＯＸ２の化合物と化合させることを含み、（ａ）および（ｂ）が約１：１０から約１：１５０、任意に約１：４０から約１：１５０、または約１：８０から約１：１５０のモル比で存在する、請求項２７の方法。。
  31. 請求項１～２２のいずれか一項のポリマーならびに核酸および／またはポリペプチドを含む組成物。
  32. 組成物がガイド核酸および／またはドナー核酸を含む、請求項３１の組成物。
  33. 組成物がエンドヌクレアーゼを含む、請求項３１または３２の組成物。
  34. 組成物が、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸を含む、請求項３３の組成物。
  35. ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼがＣａｓ９、Ｃｐｆ１、またはそれらの組合せである、請求項３４の組成物。
  36. 組成物がＤＮＡリコンビナーゼを含む、請求項３１～３５のいずれか一項の組成物。
  37. ＤＮＡリコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項３６の組成物。
  38. 組成物がジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、請求項３１～３７のいずれか一項の組成物。
  39. 組成物が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを含む、請求項３１～３８のいずれか一項の組成物。
  40. 組成物が、請求項１～２０のいずれかのポリマーおよび核酸またはポリペプチドを含むナノ粒子を含む、請求項３１～３９のいずれか一項の組成物。
  41. 組成物が、ポリエチレンオキシドを含む第２のポリマーを含む、請求項３１～４０のいずれか一項の組成物。
  42. 核酸および／またはポリペプチドを細胞に送達する方法であって、該方法が請求項３１～４１のいずれか一項の組成物を該細胞に投与することを含む、方法。
  43. 細胞が対象中にあり、請求項３０～４０のいずれか一項の組成物が該対象に投与される、請求項４２の方法。
  44. ポリマーが該ポリマーを対象の末梢神経系、中枢神経系、肝臓、筋肉、肺、骨、または眼の組織に局在化させる組織特異的ターゲッティング部分を含む、請求項４２または４３の方法。
  45. ポリマーが腫瘍細胞に優先的に結合するターゲッティング部分を含む、請求項４４の方法。
  46. 組成物がＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸、ガイド核酸、およびドナー核酸の１つ以上を含み、組成物が細胞における標的遺伝子の編集を促進する、請求項４２～４５のいずれかの方法。
  47. 細胞が宿主、任意にヒト中にあり、組成物が該組成物を該宿主に投与することによって細胞に送達される、請求項４２～４６のいずれかの方法。
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