JP2022524178A

JP2022524178A - タンデム受容体ｃａｒにおける二重特異性と腫瘍マイクロ環境を変調する方法

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Publication number: JP2022524178A
Application number: JP2021539462A
Authority: JP
Inventors: ロゼンチャン，パトリシアボートマン
Original assignee: セルリスパルティシパソエスリミターダ; セルリスゲーエムべーハー
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2019-01-07
Publication date: 2022-04-28
Also published as: EP3908613A4; JP2023089182A; WO2020142815A1; EP3908613A1

Abstract

本発明は、腫瘍性細胞（CD33、CD123、または他の腫瘍標的）上の表面分子を認識してリガンド化するscFvおよびIL-1受容体II型（IL-1R2）を含むRfuCARと呼ばれるタンデム受容体CARにおける二重特異性を指す。これにより、IL1-R2はRfuCAR 構造を構成する理想的な受容体として選択され、高い親和性と特異性でIL-1βを捕捉することができました。これらの特性は、CAR-Tセラピーの神経毒性とCRS効果を低減するための良い候補であることを示している。さらに、この発明は、急性骨髄性白血病などの腫瘍微小環境、または急性のリンブロッカ性白血病、膵臓、肺と卵巣癌に限定されないその他の癌タイプを変調する方法を扱っている。

Description

現在の発明は医学の分野に属し、より正確には免疫学、細胞、生物学、分子生物学の分野に属し、RfuCARと呼ばれるタンデム受容体ＣＡＲの二重特異性を記述しています。これには、腫瘍細胞(CD33, CD123,または他の腫瘍ターゲット，CD19に似ているが限定されない、メソテリンおよび BCMA など、上の表面分子を認識し、ライゲーションする ScFv が含まれます。 IL-1 受容体タイプ 2 （ IL-1R2 ）、および腫瘍の微小環境を調整する方法急性骨髄性白血病の場合など、またはその他のがんタイプ急性リンパ芽球性白血病、膵臓、肺、卵巣がんなどに似ているが限定されない。

インターロイキン -1 （ IL-1αおよび IL-1 β）は、他の部位カインとは異なるプロトタイプ多機能部位カインであり、他の部位カインや小メディエータ分子とほぼすべての細胞型に同時に影響を与えるまたは与えないことができます（ DINARELLO 、 1996 ）。この部位カインは、免疫および炎症メディエータとして多面発言効果を有する。（ DINARELLO 、 1996 ； APTE et al. 、 2002 ）

IL-1 ファミリーの主要メンバーは、 IL-1α、 IL-1β、 IL-1 受容体拮抗薬（ IL-1ra ）、 IL-1 受容体タイプ I （ IL-1RI ）、 IL-1 受容体II型（ IL-1RII ）、および IL-1 受容体アクセサリタンパク質（ IL-1RAcP ）（ DINARELLO 、 1996 、 DUNN et al., 2001） IL-18 、 IL-1F5 、 IL-1F6 、 IL-1F7 、 IL-1F9 などの他の部位カインも IL-1 ファミリーに含まれています（ DUNN et al. 、 2001; DINARELLO 、 et al. 、 2010 ）。

IL-1 ファミリーは、病原体関連の組織損傷や損傷、および・または危険関連の分子パターンに反応して炎症反応を制御する部位カインであり；そのため、生得的免疫反応の主要な仲介役となっています（ Weber 、 et al. 、 2010 ）。

IL-1 のシグナル形質導入と発現は、遺伝子発現制御、合成、分泌、および表面受容体、可溶性受容体、受容体拮抗薬の制御からなる厳密に調整されたイベントです（ DINARELLO 、 1996 ）。この部位カインには、発熱、肝急性期反応の増加、転移の増加、血管新生、抗体およびリンホカイン産生の増加、軟骨破壊、線維芽細胞の増殖、平滑筋および間膜細胞、 HIV-1 遺伝子発現の増加（ AURON 、 1998 ）など、数多くの影響がみられる。

IL-1 は、好中球の組織への移行を促進する内皮接着分子の増加を仲介し、転移性ニッチ（ Vidal-VANACLOCHA et al. 1996）にも影響を及ぼす。この部位カインは、血管新生および血管内皮増殖因子（ VEGF ）産生（ COXON 、 et al. 、 2002 ； VORONOV 、 et al. 2003; SONG et al. 2003））にも関与している。急性骨髄性白血病（ AML ）患者では IL-1 ファミリーの全メンバーのレベルが上昇し、正常な前駆細胞性のクローンジェ二シティおよび疾患進行が有意に抑制される（ Carey 、 et. al 2017 ）。 IL-1 α と IL-1 β （ DUNN et al. 、 2001 ）の間には高い配列類似性があるにもかかわらず、生物学的作用には顕著な違いがある。 IL-1 α は抗腫瘍免疫を誘発することで腫瘍の腫瘍発生を抑え、 IL-1βは宿主の腫瘍血管新生や免疫抑制を含む侵襲性を促進する（ Song 、 et al. 2003 ）。 IL-1βのこの腫瘍形成促進効果はさまざまな癌モデルで観察され、黒色腫、乳腺癌および前立腺癌、ならびに腫瘍細胞およびマクロファージ培養（ VORONOV 、 et al. 2003 ）。

IL-1 受容体の非規制化または過剰な活性化は、危険で有害な局所または全身性炎症反応、および自己免疫またはアレルギー反応（ BONECCHI et al. 2016）の潜在的な原因です。最近では、 CRS における IL-6 と IL-1 の役割と CAR-T 療法によって誘発される神経毒性が示され、 IL-1 がこれらの有害事象の両方を制御するためより良い標的であることが示された（ NORELLI 、 et al. 2018; GIAVRIDIS 、 et al. 2018; TARASEVICIUTE 、 et al. 2018）。骨髄腫患者における IL-1 発現の遮断は IL-6 産生を減少させ、無増悪生存期間を延長させる（ LUST 、 et al. 2009 ）。 IL-1 受容体拮抗薬（ IL1-RA ）は、関節リウマチ、喘息、敗血症性ショック、移植片対宿主疾患、アルツハイマー病、動脈硬化症、多発性骨髄腫、成人 T 細胞白血病（ HALLEGUA 、 2002 ）など、さまざまな疾患の治療に適用されています。人の転移性患者を治療するための優れたアプローチとして IL-1 の閉塞を支持するのに十分な証拠があります（ DINARELLO 、 et al. 1991 ）。

IL-1 受容体
IL-1 には2 番染色体の長いアームに位置し、長さ 552 アミノ酸、長さ 80kDa 、長さ 336 アミノ酸、長さ 68kDa にエンコードされているタイプ I と II の 2 つの主要な受容体があります（ DINARELLO 、 1996 ； DINARELLO 、 et al. 1991 ）。これら 2 つの受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、それぞれ 3 つの IgG 様領域で構成され、相互に有意な相同性を共有しています（ DINARELLO 、 1996 ）。タイプ 1 受容体は主に T 細胞、内皮細胞、ケラチノ部位、肝細胞、線維芽細胞に見られ、タイプ 2 受容体は好中球、 B 細胞、骨髄細胞に見られる。しかし、一部の細胞は両方の型を表現できる可能性があります（ DINARELLO 、 et al 1991 ）。

IL-1R1 と IL-1R2 は、 IL-1 ファミリーの 3 つの主要リガンド（ IL-1 α 、 IL-1 β 、 IL-1Ra ）に対して異なるアフィニティを持っています。 IL-1R1 は IL-1αを高親和性で結合し、逆の IL-1R2 は IL-1 β を高親和性で結合します。また、 IL-1R2 は IL-1Ra 100 を IL-1R1 よりも効率悪く結合します（ MANTOVANI 、 et. al. 1998 COLOTTA, et al. 1993 ）。 IL-1R2 は IL-1R1 の細胞外部分と 28% のアミノ酸相同性を共有しているが、 TIR 領域が存在しないことと、わずか 29 のアミノ酸長細胞質テール（ BONECCHI 、 et al. 2016 ； MCMAHAN 、 et al. 1991 ）。 IL-1R2 は、おとり受容体であるシングナルを形質導入することができません（ AURON 、 1998 ； Thomas 、 et al. 2014）。 IL-1 は IL-1R1 および IL-1R2 を介して骨髄単球細胞に作用し、 IL-1 アゴニストのトラップとして作用するこの部位カイン活性を阻害します（ COLOTTA 、 et al. 1993）。 2 型可溶性 IL-1R は、 2 段階で IL-1 β を阻害し、プロペプチドの処理を防ぐことによって、成熟した IL-1βとタイプ 1 IL-1 受容体との相互作用を遮断します（ SYMONS 、 et al. 1995 ； BOURKE 、 et al. 1995 ）。

IL-1R2 は、糖質コルチコイドホルモン（デキサメタゾン等）、プロスタグランジン、アスピリン、 Th2 部位カイン、 IL-10 および IL-27 の存在により増加し、免疫抑制活動および抗炎症活動に寄与している（ BONECCHI et al. 2016 、RE. et al. 1994）。 IL-1R2 の抗炎症作用は、慢性皮膚炎を含むいくつかの疾患で実証された（ RAUSCHMAYR et al. 1997 ）、関節炎（ BESSIS 、 et al 2000 、 DAWSON, et al. 1999; ATTUR 、 et al. 2000 ）、子宮内膜症（ KHOUFACHE 、 et al 2012; BELLEHUMEUR 、 et al 2005 ； GUAY 、 et al 2007 ）、心臓移植（ SIMEONI 、et al. 2007 ）と、 Th17 細胞による自己免疫性心筋炎（ CHANG et al. 2013）。

スペーサおよびリンＣＡＲ
CARを介した T 細胞認識は抗体領域によって定義され、 MHC の発現とは無関係です。この認識は、抗体が使用可能なあらゆるターゲットにまで拡張されます（ CHMIELEWSKI 、 et al. 2013 ）。この相互作用は、腫瘍上の標的分子の構造と密度、および scFv と T 細胞膜間の配列が重要であり、柔軟性を提供する必要があることを示すエピトープの位置によって強く影響されます (HUDECEK 、 et at. 2015）。スペーサの長さはターゲット分子によって異なる場合があり、この論理的思考はビー固有CARの 2 つの認識部位間の領域にも適用できます（ HUDECEK 、 et at. 2015; GRADA 、 et al. 2013 、 HEGDE 、 et al. 2016 ）。また、スペーサの特性は、トランスジェニック細胞表現型、活性化状態、移動能力、および腫瘍認識の変調において、CARの能力に影響を与える重要な要素となっています（WATANABE, et al. 2016; NORELLI 、 et al. 2016 ）。

スペーサの多くの組み合わせは文献に基づいて試験されており、それぞれの適合性は治療対象の疾患と選択された目標に直接関係しています。（ CHMIELEWSKI et al. 2013）。 GRADA et al.は、 CD19 および Her2 タンデムCARでは、 Her2-scFv をジャス多膜位置に、 CD19-scFv を遠位位置に配置しなければならい、よりリラックスした同時結合を可能にする必要があることを示した（ GRADA 、 et al. 2013 ）。癌胎児性抗原（ CEA ）を標的とするCARは、細胞膜に近いエピトープを標的とした場合に、より高度な T 細胞活性化を示すCD19-ScFv と同じ挙動を示します（ HOMBACH 、 et al. 2000）。これは、他のエピトープを目標とするCARについても報告されています（ GUEST 、 et al. 2005、 James 、 et al. 2008）。

これらの所見は、膜遠位エピトープを標的とする動的分離モデルがCARリガンドクラスターを増加させることを示唆するものであり、これによりシナプス中のホスファターゼ分子の入力がより強くなり、近位エピトープ近位エピトープよりもTCRシグナリング形質導入が抑制されることを可能にする（ DAVIS 、 et al. 2006 ) 。しかし、このモデルでは、アクセス可能で柔軟性のあるエピトープの必要性は除外されません。これは、最適なCAR T 細胞活性化に最適な標的エピトープと結合親和性が、これまでのところ各ケースで経験的に評価されていることを示しています（ CHMIELEWSKI et al. 2013）。

細胞外領域内のCARのスペーサまたは非抗原結合成分の特定の要件は、慎重に選択し、 in vitro および in vivo で実証する必要があります（ HUDECEK 、et at. 2015 ）。 CD8αから得られた短いスペーサ配列が scFv を細胞内シグナル形質導入領域（ PORTER 、 et al. 2011 ； KALOS 、 et al. 2011 ）を超える IgG1 ヒンジおよび Fc （ HUDECEK 、 et at. 2015; SAVOLDO, et al. 2011 ）またはスペーサーなし（ REN-HEIDENREICH 、 et al. 2000 ; Moritz 、 et al. 1995 ）。 Patel （ Patel 、 et al. 1999 ） CD7 または IgG1 由来のスペーサを含むHIVenv を標的としたCARは、 CD8 、 CD4 の切り捨て、または IgG1派生のスペーサの切り捨てを含むCARと比較して最適な細胞溶解を示したことが報告されました。スペーサの選択は疾患であり、標的特異的でなければならないことを強調しました。

これまでの研究では、スペーサ領域が細胞外領域に柔軟性を提供して膜や他の抗原結合領域からの距離を増加させる場合でも、 T 細胞活性化を阻害する可能性があることが示されており、結合の改善が必ずしも CAR シグナリングの増加につながるとは限らないことが示されています（ HOMBACH 、et al. 2000; Hawkins 2014 ）。文献の論争の的になるデータは異なった標的CAR間で強く変化し、 in vitro および in vivo の推定構造テストの要求を示している。

リンカー、スペーサ、ヒンジ Gly - Ser Linker
GRADA （ GRADA 、 et al e 2013 ）は CD19 と HER2 用のタンデムCARを構築しました。 2 つの認識モチーフの間のスペーサ / リンカーは、一連の血糖とセリンアミノ酸であった。タンデムリピートは、残基が 2,000 未満のタンパク質の少なくとも 14% で発生し、 αヘリックスやβシートなどの標準的な二次構造を形成しません（MATSUSHIMA, et al. 2008 ）。 Gly-Ser タンデムリピートは柔軟性が高く、切断可能でないため、CARサブユニットの動きがほぼ自由であることを示しています（ MATSUSHIMA, et al. 2008 ）。タンデムリピートは、金属イオンやその他のタンパク質を含む様々なリガンドとの相互作用を可能にする構造的柔軟性を可能にしているようです(MATSUSHIMA, et al. 2008 ）。

IgG1
IgG1 は最も豊富な免疫グロブリンクラスであり、例えば、CAR構造のスペーサと広く適用されています（ VIDARSSON 、 et al 2014 ）。スペーサは、 IgG1 FC 領域全体（CH2CH3 ）、 FC 領域とヒンジ、またはヒンジのみで構成されます。ヒンジは CH1 領域とCH2 領域間の 15 個のアミノ酸 (VIDARSSON, et al 2014 ）。 Guest et al は、 CD19 CAR の最適な機能に IgG1 Fc 領域スペースが不要であることを示した（ GUEST et al. 2005 ）およびは、鼠における CD19 CAR-T 細胞の有効性を廃止させることができます（ALMASBAK 、 et al 2015 ）。また、 Hombach（ HOMBACH 、 et al 2000 ）は、抗 CD30 モデルにおける細胞外 IgG1 領域が抗原依存性細胞活性化を損なうすることを示しました。一方で、いくつかの著者は IgG1 Fc 領域を用いた効率的なCAR構造を持っています。例えば CAR-PSCA や CAR-MUC1 (ATHAPAN et al. 2014 ）、 NGFR間隔されたCD44v6 、 NGFR間隔されたCD19 、および NGFR間隔されたCEA （ CASUCCI 、 et al 2015 、 CASUCCI 、 et al 2018 ）、 CAR-PSA （ WATANABE et al. 2016 ）。 Moritz （ Moritz 、 et al 1995 ）は、機能CARの領域間でヒンジ領域を使用して、さまざまな構造をテストしました。 IgG1 Fc適応の懸念の 1 つは、この領域が補数カスケード活性化の原因であり、抗体 Fab 領域が削除されると強化されることです（ WANG 、 et al 2016 ）。免疫活性化における FC チェーンの推定効果にもかかわらず、 IgG1 を使用した実験結果は良好なスペーサ候補である可能性があることを示していますが、その影響は実験アッセイでのみ検出される可能性があります。

IgG4
IgG4 クラスは IgG1 よりも豊富ではなく、ヒンジ領域サイズに非常に類似した構造を持っています（ 12aa ）（ VIDARSSON 、 et al 2014 ）。 IgG4 抗体は、非感染性の環境で抗原に繰り返しまたは長期機関暴露された後に形成されることがよくあります。（ VIDARSSON 、 et al 2014 ）。 IgG4 は機能的に一価であり、望ましくない架橋にはあんまり適していないことを示します（ AALBERSE 、 et al 2002 ）。これらの特性により、 IgG4 Fc およびヒンジは既にCAR構造に適用されています。一般的に、 IgG4 配列はヒンジおよび Fc CH2CH3 領域（ Qin 、 et al 2017 ）適用されるかまたは他の IgG からの配列で構成されています。 IgG4 （ APEFLG ）のCH2 領域の最初の 6 つのアミノ酸を、 IgG2 （ APPVA ）の対応する 5 つのアミノ酸に入れ替えることは、 Fc 受容体への結合を無効にし、in vivoでの腫瘍認識に必要である（ HUDECEK 、 et al 2015 ）。 IgG4 CH2 領域の変化の必要性は他の著者から報告され、 2 つの部位（ L235E ； N297Q ）を行うことでCH2 領域を変異させ、また削除が組み込まれているため抗原特異的溶解（JONNALAGADDA et al. 2015）を媒介することなく、Fc受容体結合を低減することができます。 IgG4 CH2 部分の欠失および突然変異は細胞毒性を21026廃止し、IgG4による補体活性化を大幅に減少させた。（ Montano 、 et al 2002 、 DORAI 、 et al 1992 ）。

その他のスペーサ
CD4 、 CD8 および CD28 膜貫通型およびヒンジは、CAR構造に広く適用されている（ NORELLI 、 et al 2016 ）。 CD19 CARでは、 CD8 α または CD28のヒンジ領域および膜貫通型領域は鼠で同様の機能を持ちますが、 CD8 α は炎症性部位カイン産生および活性化誘発細胞死のレベルが低いように思われます（ REN-HEIDENREICH 、 et al 2000 、 ALABANZA 、 et al 2017 ）。これらのモチーフは通常、単一特異的なCARの scFv と T 細胞膜の間にスペーサとして適用されます。

急性骨髄性白血病CARスペーサ試験
上記の情報に基づき、 RfuCAR 構造においてバリエーションを含めてscFv 受容体と IL1-R2 受容体の間にスペーサーとして適用する IgG4 Fc 領域とヒンジ（ヒンジのみ、ヒンジ-CH2CH3 およびCH2CH3 のみ）を選択します。前述のように、このスペーサーは反応性が低く、CARの通常の機能に官署意思ないようです（ JONNALAGADDA 、 et al 2015 、 Montano 、 et al 2002 、 DORAI 、 et al 1992 、 Jena 、 et al 2010 ）。また、 RfuCAR の標的疾患にスペーサーを関連付けることも重要です。そのため、他の腫瘍ターゲットについては、より適切である他のスペーサーによってこのオプションを変更する場合があります。最初に治療される疾患は、抗 CD33 および抗 CD123CARを使用した急性骨髄性白血病（ AML ）である。この点については、 IgG4 Fc およびヒンジの使用も他の構造でテストされています。多くの著者は、 CD33 (KENDERIAN 、 et al 2015 ）、CD123 （ MARDIROS 、 et al 2015 ； THOKALA 、 et al 2016 ）およびその他のターゲット（ LABORDA 、 et al 2017 ） CAR-Ts対 AML （ KENDERIAN 、 et al 2017 ）（ CD33 および CD123 Novartis 特許）。

従来技術
癌の治療に CD33 および/または CD123 抗原を発現する遺伝子組み換えキメラ性 T 細胞受容体抗原が使用されていることは、近年、科学界にとって大きな関心を集めています。例：

US 2013/280220 A1 は、新しい単一CAR分子（ TanCAR ）の設計と構築をガイドする計算モデリングツールを指し、各標的分子を個別に認識し、二分特異的な活性化と T 細胞の標的化を仲介することができます。従って、この文書の第 4 パラグラフと : 現在の発明は細胞療法に関連している方法そして構成に指示される。特に、細胞療法は固形腫瘍を含む癌に対するものである。但し、発明家はリンカーとして Glycine 、 Serine または両方を使用する。今回の発明の構造は、異なるターゲットを持つことに加えて、 scFv 受容体と IL1-R2 受容体と CD8 ヒンジの間のスペーサとして IgG4 FC 領域を使用し、 RfuCAR 構造の scFv と T 細胞膜の間のスペーサとして使用しています。

文書No. WO 2014/186469 A2 は、臨床グレード抗原キメラ（ CAR ）受容体で構成される修飾 T 細胞を用いた免疫療法の方法と組成に関連しており、癌治療に直接投与できます。このような変更により、この発明は腫瘍の微小環境内で効果器機能をリサイクルできるようになります。しかし、発明者はトランスポソ系を使用して T 細胞を形質導入し、レンチウイルスベクターを使用しています。さらに、異なるターゲットに対して同時に 2 つの異なる受容体を使用してCARを製作するのではなく、その代わりに、構造体の中で変異体 IL15 と CD19 受容体を融合させた。

文書No. WO 2014/055442 A2 は、人間癌の治療の組成と方法に関連している。この文書の方法論では、細胞を腫瘍の微小環境に誘導する方法について説明します。この方法には、抗原結合領域、膜貫通領域、共刺激性シグナル形質導入領域、および抗原結合領域が間質細胞抗原に結合するゼータ CD3 シグナル形質導入領域で構成されるキメラ性抗原受容体（ CAR ）が含まれています。この特許の発明者は腫瘍の微小環境に影響を与えようと考えているが、現在の発明の RfuCAR とは異なる方法でこれを達成しようとする。微小環境に存在する IL-1 を削減したいと考えていますが、現在の発明は、 FAP （線維芽細胞活性化タンパク質）などの間質細胞抗原に結合する抗原結合領域で構成されています。

文書 WO 2017/222593 A1 は、キメラ性抗原受容体に関連する組成と方法に関連しています。より正確には、キメラ性抗原受容体が少なくとも 2 つの標的（例えばCD33 や CD123 など）に向けられている遺伝子組み換え細胞に関連している。しかし、このような文書は、CARを組み立てる別の方法を示しています。同じCARの構造では、 2 つの抗原認識部位を挿入し、さらに、その構造体に融合タンパク質を入れてエンハンサーとして機能します。我々のCARはお互いにつながっている 2 つの異なる受容体を提示しています。自殺遺伝子を介してスイッチオフ機構が実現されており、RfuCARにはオン / オフスイッチがあり、反応の微調整も可能である。

米国 9,815,901 B2 は、 CD123 発現に関連する疾患の治療に関連しています。このため、この文書は CD123 結合領域を発現する遺伝子組み換え細胞の投与方法を提案するとともに、 CD123 に特異的なキメラ性抗原受容体に関連している。このような文書は、化学受容体の構造を示唆するものではなく、そのような抗原の発現に関連する疾患の治療に対する CD123 抗原の認識であるとのみ言及しているという点で、現在の発明とは異なります。さらに、この構造体はリンカーとして Glycine/Serine を使用します。また、 CD123 および CD19 の抗原認識部位を追求するCARを建設しました。このCARの活性化は、 2 つの抗原が受容体によって結合されたときに起こる。毒性を制御するために、著者らは二量化スイッチを提案している。このスイッチでは、CARTの認識によって生成されるシグナル形質導入は、 2 つのCART部分の二量化を行う分子が存在する場合にのみ送信される。今回の発明では、 IL-1 の腫瘍微小環境からの隔離を通じた免疫微小環境の規定と、記載されている受容体に向けたペプチドの投与による毒性管理の可能性が提案されている。

文書No. WO 2017/173256 A1 は、癌細胞を殺すことを目的とした抗原（ CAR ）受容体または T 細胞受容体（ CAR-T ）を発現する遺伝子組み換え免疫細胞から構成される組成および方法に関連しています。この文書では CAR-Tによる免疫療法について言及していますが、 CD33 および CD123 抗原の認識に特異的ではなく、現在の発明と同様に遺伝子組み換え細胞を用いたキメラ性受容体の構築を目標としたものではありません。さらに、この文書で構成されている CAR 構造は、単一の抗原部位と切り捨てられたヒンジ領域で構成されています。そのような文書で使用される目標は、現在の発明とは異なります。

文書 WO 2015/164594 A1 は、抗原を発現する細胞に向けられたキメラ抗原受容体と関連しています。この文書では、 T 細胞を修飾した治療を参照していますが、これらは必ずしも CD123 または CD33 抗原の認識には該当しません。さらに、このような文書は、 EGFR 抗原を標的とするCART細胞に関連しています。さらに、 IL15/IL15Ra 融合タンパク質発現のシーケンスである 2 番目の導入遺伝子を挿入します。その構造は目標の密度を通した作業のために作られたものである。

「エンジニアリングキメラ性抗原受容体 - T 細胞による癌治療」と題された文書は、 B 細胞悪性腫瘍の治療に成功したキメラ性抗原受容体（ CAR ）細胞を用いた治療の分析を行い、抗腫瘍療法におけるその偉大可能性を強調している。 CAR-T 細胞は、悪性細胞を特別に殺すか、腫瘍の微小環境を改造するように設計することができます。そのためには、間質細胞や免疫細胞の機能を調節する可溶性因子を放出し、腫瘍生態系の複数の成分を標的とする強力なツールを提供します。このような文書は、CART細胞技術に関する文献のレビューです。腫瘍生態系、がん免疫表現型、免疫回避における T 細胞枯渇機構の概念について説明している。また、CART細胞技術の機能的課題についても説明します。現在の発明で提案されている免疫規足機構を、いつでも引用している。

「固体腫瘍に対するキメラ性抗原受容体 T 細胞免疫療法の展望」と題された文書は、特定のキメラ性抗原受容体CARに関連しており、 T 細胞を堅牢な活性化させて標的腫瘍細胞の死滅を引き起こす可能性があります。この文書では、腫瘍の微小環境に見られる抑制的な影響に戦うための、CAR T細胞の遺伝子再構築に対する最近のアプローチと技術革新について説明します。さらに、固形腫瘍の治療が困難であり、腫瘍の微小環境がこの問題に役立つ可能性があることも言及している。ですから、この出版物は現在の発明を支えています。

「 CD123 特異的なキメラ抗原受容体を発現する T 細胞は、特定の細胞溶解性エフェクター機能と人間急性骨髄性白血病に対する抗腫瘍作用を示す」という文書は、 T 細胞に発現した CD123 に特異的なキメラ抗原受容体に関連しており、特定の細胞溶解性エフェクター機能と急性骨髄性白血病に対する抗腫瘍作用を示しています。前述のように、本書で提案されている受容体は CD123 抗原の認識に特異的です。しかし、このような文書は実験的な記事であり、 CD123 に対して 2 つの特徴的なエピトープを構造体で使用するように設計しています。この記事のCART設計は、当社の IgG4 Fc 受容体ヒンジ、 CD28 を共刺激として使用し、 CD3 ゼータをシグナル形質導入交換機として使用したものと似ていますが、当社のCART設計では、第 2 の共刺激分子 4-1BB の使用も検討しています。当社のCARTのもう 1 つの大きな違いは、当社が提案する免疫微小環境規制機構です。文書のCART設計では、任意機能に関連する機構を考慮していません。

「セルの切り替え」というタイトルの書類： AML ブラストへの T 細胞の再標的化のための新しいモジュラープラットフォーム」は、 CD33 と CD123 が単独で発現されるか、急性骨髄性白血病（ AML ）患者では併用され、その後 CD33 と CD123 の両方を発現するキメラ性 T 細胞抗原受容体を持つ AML に対する治療が提案されたことを示しています。この文書は、急性骨髄性白血病の治療に CD123 や CD33 抗原を認識する遺伝子組み換え T 細胞を使用することを示唆しているため、現在の発明と非常に似ている。そのような論文は、適切な構造によってオン / オフを切り替えることができる、腫瘍抗原に対するデュアルターゲティングモジュールを備えたモジュール式CAR構造を示しています。今回の発明は、腫瘍抗原用と IL-IRA 用の 2 つの非常に異なる受容体を用いて構築されています。

上記のように、現在のアプリケーションで提案されている構造体（ RfuCAR ）は、他の構造体とは異なると結論付けられています。これは、腫瘍微小環境を変調することができ、また両方の受容体エピトープペプチドの投与によってスイッチオフされる機構で構成されているためです。この目的にはまだ使用されていない IL-1R2 を受容体として使用し、腫瘍受容体ターゲット以外の規制安全スイッチを構成する。患者に毒性 CAR-T 効果が検出された場合、 RfuCAR 細胞の作用を一時的にオフにし、 IL-1R2 、 IL-1-IL-1R2 、および/または scFv エピトープにリンクするさまざまなペプチドの投与によって調整することができます。これらのペプチドは、ライゲーションを阻害する 2 つの RfuCAR を腫瘍細胞にリンクしたり、 RfuCAR 活性を阻害または変調するおよび/または IL-1 を結合することができます。 RfuCAR 細胞は、ペプチドの投与が中止された時点で、患者に増殖し、腫瘍細胞を死滅させることができます。このため、今回の発明の構造と機構は、細胞シグナル形質導入経路だけでなく、マクロファージや他の細胞から分泌される分子にも腫瘍微小環境を制御するという新しいアプローチである。

発明の概略
今回の発明は、 RfuCAR と名付けられたタンデム受容体CARの二重得意を提案することを目的としています。これには、腫瘍細胞（ CD33 、 CD123 、または CD19 、 Mesothelin 、 BCMA などの他の腫瘍ターゲット）および IL-1 受容体タイプ 2 （ IL-1R2 ）上の表面分子を認識してリガンド化する scFv と、腫瘍微小環境を変調する方法が含まれます。

RfuCAR
構造体と機構は、細胞シグナル形質導入経路だけでなく、マクロファージやその他の細胞から分泌される分子にも腫瘍微小環境を制御するという新しいアプローチです。 In silico および in vitro 試験は、Celluris RfuCAR アプリケーションの利点を実証するために実施されています。

図１は RfuCAR 構造体の概略図を示しています。ここで、 A はベクタースキーム、 B は Rfu スキームです。図２は、 RfuCAR のスイッチとチューニングを示すスキームを示しています。ペプチドの組み合わせにより、 RfuCAR アクションをオフにしたり、変調したりできます。ペプチドを IL-1R および腫瘍ターゲットに、ペプチドを IL-1R-IL-1 および腫瘍ターゲットに、および両方の三つのペプチドが RfuCARをオフにできます。 1 つのペプチドのみを投与すると、 RfuCAR アクションが調節されます。図３は推定抗 CD33 RfuCAR の概略図を示します。図４は抗 CD33 scFv 領域、 IL1-R2 細胞外領域、および IgG4 Hine-CH2CH3 領域の予測構造（ RaptorX ）を示します。図５は、抗 CD33 RfuCAR の細胞外領域の試験済みシーケンスの予測三次元モデルを示しています。ボックス内の数字は、モデルNo. 1 ～ 6 に対応しています。 IntFold と RaptorX の 2 つのソフトウェアで、各構造に最適なモデルが示されています。図６は CD33-RfuCAR モデル（ 1-6 ）の各モデルに最適なすべての品質プロットを示しています。図７は抗 CD33 RfuCAR 予測モデルの、無秩序プロットを示しています。各プロットは、各モデル 1 ~ 6 の障害予測を表しています。図８は RfuCAR モデル 2 の推定結合部位を示しています。図９は推定抗 CD123RfuCAR の概略図を示しています。図１０は抗 CD123cFv 領域、 IL1-R2 細胞外領域、および IgG4 Hinge-CH2CH3 領域の予測構造（ RaptorX ）を示します。図１１は抗 CD123 RfuCAR の細胞外領域の試験済みシーケンスの予測三次元モデルを示しています。ボックス内の数字は、モデルNo. 7 ～ 12 に対応しています。 IntFold と RaptorX の 2 つのソフトウェアで、各構造に最適なモデルが示されています。図１２は、 CD123-RfuCAR モデル（ 7-12 ）の各モデルに最適なすべての品質プロットを示しています。図１３は、抗 CD123 RfuCAR の予測モデルの無秩序プロットを示します。各プロットはモデル 7 から 12 の無秩序の予測を表す。図１４は、RfuCAR モデル 8 の推定結合部位を示しています。

発明の詳細な説明
今回の発明は、 RfuCAR と名付けられたタンデム受容体CARにおける二重特異性を記述しています。これには、腫瘍細胞（ CD33 、 CD123 、CD19に似ているけど限定されてない、 Mesothelin 、 BCMA などの他の腫瘍ターゲット）および IL-1 受容体タイプ 2 （ IL-1R2 ）上の表面分子を認識してリガンド化する scFv と、腫瘍微小環境を変調する方法が含まれます。さらに、このような機構は、規制安全スイッチを構成する両方の受容体エピトープペプチドの投与によってオフにすることができます（図 1 A および B ）。

scFv のモチーフは腫瘍細胞をリガンド化し、第 3 世代のCARの機能と全く同じアポトーシスに導く。分泌された IL-1 β は、 RfuCAR の IL-1R に結合してトラップされ、 IL-1R1 および IL-1 シグナリング形質導入への結合を阻害します。この抑制により IL-1 経路の活性化が減少し、腫瘍細胞増殖の変調に繋がります。微生物環境における IL-1 含有量の規制は、腫瘍環境における他の部位カイン活性化を変調し、CRS および神経毒性イベントで観察される部位カインの過剰分泌を予防すると考えられる。

患者に毒性 CAR-T 効果が検出された場合、 RfuCAR 細胞の作用を一時的にオフにして、 IL-1R 、 IL-1-IL-1R 、 scFv エピトープにリンクするさまざまなペプチドの投与によって調整することもできます（図 2 ）。これらのペプチドは、ライゲーションを阻害する 2 つの RfuCAR を腫瘍細胞にリンクしおよび/または、 RfuCAR 活性を阻害または変調する IL-1 を結合することができます。 RfuCAR 細胞は、ペプチドの投与が中止された時点で、患者に増殖し、腫瘍細胞を死滅させることができます。

RfuCAR 推定構造体
RfuCAR の細胞外推定構造は、 IntFold の 2 つの構造予測オンライン機能で試験された(MCGUFFIN et al. 2010 ； MCGUFFIN 、 et al 2018 ； MCGUFFIN 、 et al 2015 ； BUENAVISTA、et al 2012 ； Roche 、 et al 2012 ）と RaptorX ( K A LLBERG, et al 2012 、 MA 、 et al. 2012 ； Peng 、 et al. 2011 ； Peng 、 et al 2011 ； MA 、et al. 2013 ）。これらの機能は、 PDB データベース内の 2 次および 3 次構造の特性を持つ提出された一次構造と比較して推定構造を予測し、類似性を示すスコアを与えます。また、無秩序領域と推定的結合部位も提供しています。

データの解釈のため、次の点を考慮する必要があります。
・ RaptorX
- スコア：は位置合わせスコアは 0 から（領域）シーケンス長までの間にあり、 0 は最悪を示します。実際には、スコアは推定エラーのためにシーケンス長をわずかに超えてしまうことがあります。
- uSeqID と SeqID ：はアライメント内の同一の残留物の数です。 SeqID は、タンパク質（または領域）シーケンス長によって正規化されたuSeqID で、 100 を掛けたものです。 uSeqID （ SeqID ）が高いほど、より良い結果が得られます。 SeqID が 30% を超え、タンパク質（または領域）の残基が 200 を超える場合、通常は予測モデルの正しい折り目があることを示します。
- uGDT および GDT ： uGDT は、
1 * N（ 1 ）+ 0.75 * N（ 2 ）+ 0.5 * N（ 4 ）+ 0.25 * N（ 8 ）として定義された正規化されていない GDT （グローバル距離試験）スコアです。 N（ x ）は x より小さいモデリングエラーが予測される残留の数（ Åに）です。 GDT は、 uGDT をタンパク質（または領域）の長さで割って計算され、 100 を掛けた値です。 uGDT （ GDT ）は絶対モデルの品質を測定します。残基が 100 を超えるタンパク質の場合は、 uGDT >50 が良好な指標となります。残基が 100 以下のタンパク質の場合、 GDT >50 は良好な指標です。モデルに適切な uGDT (>50) があっても GDT (<50) が正しくない場合は、モデルの小さい部分だけが適切である可能性があることを示します。
- P 値：は予測モデルがこのタンパク質（または領域）に対してランダムに生成される一連のモデルのベストよりも悪い可能性があるため、 P 値はモデルの相対的な品質を評価します。 P 値が小さいほど、モデルの品質が高くなります。主にαタンパク質の場合、10＾-3 未満の P 値は良好な指標となります。マンリーベータタンパク質の場合、10＾-4 未満の P 値は良好な指標となります。

・イントフォールド（ IntFold）
結果テーブルは、グローバルモデル品質スコアの減少に従ってランク付けされます。グローバルモデル品質スコアの範囲は 0 ～ 1 です。一般的に、 0.2 未満のスコアは領域のモデル化が誤っている可能性があることを示し、 0.4 を超えるスコアは一般に、ネイティブ構造と非常に似た完全で信頼性の高いモデルを示します。各モデルには、 p 値に応じて色分けされた信頼レベルも割り当てられます。

- 信頼度スコアは、局所モデルの品質（残留物ごとのスコア）およびテンプレート/複数テンプレートによるターゲットタンパク質の範囲と併せて考慮する必要があります。残留物ごとのスコアは、モデル内の残留物の CA 原子とネイティブ構造内の同等の残留物の CA 原子の間の予測距離（ Angstroms 単位）を示します。
- RasMol 温度カラーリングスキームに従って、残留誤差で色分けされたモデルの 3D カートゥーンビュー。
- 障害予測 - この画像は、シーケンス内のNo.付きアミノ酸（ x 軸上）ごとに、障害の確率（ y 軸上）のプロットを示しています。無秩序 /秩序確率のしきい値は、プロット上に破線で表示されます。しきい値を超える残留物は、ほとんどが順不同以下であると考えられますが、このしきい値はユーザーを誘導するためにのみ使用されます。
- 領域境界予測 - イメージには、予測される領域を示すように色分けされた予測される最上位 3D モデルが表示されます。
- 色の変化は、領域境界の可能性を示します。
- 結合部位予測 - 画像には、推定上の結合部位の残基を示す注釈が付けられた、予測される最上位 3D モデルが表示されます。モデルのカートゥーンビューは青で表示され、結合部位はラベル付きの残留物が付いた青い棒で表示されます。結合残留物のリストは、最も可能性の高い（多数の）リガンド、予測結合ポケットの中心に最も近いリガンド、相互作用する可能性のあるリガンドのリスト、および関連するテンプレート構造で識別されたリガンドの数とともに提供されます。

RfuCAR 抗 CD33
RfuCAR 抗 CD33 の試験済みモデルを図 3 に示し、使用されるシーケンスを SEQ で表します。 ID. No. 1 ～ 6. 色のスキームは、概略図ビューとシーケンスで同じです。

試験されたシーケンスでは、各領域のみ（図 4 ）および推定構造（図 5 ）について、次の三次元予測構造が生成されました。

明らかに、モデル 2 の構造（ SEQ で表されます。 ID. No.2 ）は、含まれる成分の適切な構造を維持するものです。表 1 （領域のみ）および表 2 （抗 CD33 RfuCAR モデル）にまとめられた各ソフトウェアによって報告された技術データによって裏付けられています。モデル 2 は、他のモデルと比較して、 IntFold で最高品質のスコア（ 0.4465 ）を記録しています。このスコアは高くはありませんが、良好な構造予測を示すには十分です。また、すべてのモデルの品質プロットの解析（図 6 ）は、モデルの一次シーケンスと一致したテンプレートの間の不一致がモデル 2 で軽微であることを示しており、より正確な予測を示しています。

モデル 2 は、両方のソフトウェアで予測される構造の最良の結果を得ます。データベースで一致するテンプレートは、 RfuCAR に期待される関数にも似ています。モデル 2 は IL-1 受容体複合体の構造と scFv モチーフ（表 3 はすべての一致されたテンプレートを報告）と一致しており、このモデルではおそらく抗 CD33 と IL-1R2 受容体の構造が維持されていることを示しています。このモデルで適用されるスペーサは IgG4 のヒンジのみですが、無秩序の割合と領域（表 2 、図 7 ）を考慮すると、モチーフの適切な可動性が可能だと思われます。最も無秩序された領域、通常の二次構造を持たない領域、およびより柔軟性の高い領域は、 IgG4 ヒンジ領域にあり、 scFv （抗 CD33 ）領域の 2 つのチェーン間のリンカーにあります。その他のモデルは、予測モデルの精度が低い、または予測とは異なる 3 次構造のタンパク質を示す、より多くの無秩序領域が存在します。

モデル 2 の予測される結合部位と位置は、部位 50 、 227 、 228 、 229 、 272 、 360です。各部位のリガンドの可能性が最も高い（タイプ）： ILE ； FUL 。各部位の中心点リガンド（ TypeID ）： SER657 、 FUL641 。クラスタ内のすべてのリガンド（タイプ - 周波数）： GLY-1 、 TRP-1 、 GLU-2 、 ILE-3 、 PRO-3 、 SEL-2 、 THR-2 、 TYR-3 、 ASP-1 、 LEU-1 、 ASN-1 、 FUL-1 、 FUC-1 。各部位のリガンド中心点の可能性： ILE650 、 FUL641 。予測される結合部位を図 8に示しています。

RfuCAR 抗 CD123
RfuCAR 抗 CD123 の試験済みモデルを図 9 に示し、使用されるシーケンスを SEQ で表されています。 ID. No. 7 ～ 12 。色のスキームは、概略図ビューとシーケンスで同じです。

試験されたシーケンスでは、各領域のみ（図 10 ）および予測構造（図 11 ）について、次の三次元予測構造が生成されました。

外見上、モデル 8 の構造（ SEQ で表される ID. No. 8）は、含まれている成分の適切な構造を維持するものです。表１（領域のみ）および表 4 （ Anti-CD123 RfuCAR モデル）に収集された各ソフトウェアによって報告された技術データによって裏付けられています。このモデルは、 IntFold 解析で 2 番目に優れた品質スコアを持ちます（ 0.4404 ）。モデル 8 の品質スコアはモデル 11 より小さく、品質プロットは非常に類似した分布を持ちます（図 12 ）。これにもかかわらず、モデル 8 は、すでに機能していることが証明されています抗 CD33 および抗 CD123 CA-TS 用に構築された細胞膜の近くに CD8 ヒンジを保持しており。モデル 11 には CD8 ヒンジ領域がありません。

モデル 8 は、 RaptorX ソフトウェアの最高の結果の 1 つでもあります。データベース内で一致したテンプレートは、 RfuCAR に期待される機能より類似です。モデル 8 は IL-1 受容体複合体の構造と scFv モチーフ（表 3 はすべての一致テンプレートを報告）と一致しており、このモデルではおそらく抗 CD123 と IL-1R2 受容体の構造が維持されていることを示しています。このモデルで適用されるスペーサは IgG4 のヒンジのみですが、無秩序領域と率（表 11 、図 13 ）を考慮すると、モチーフの可動性を可能にするよう思われます。最も無秩序された領域、通常の二次構造を持たない領域、およびより柔軟性の高い領域は、 IgG4 ヒンジ領域にあり、 scFv （抗 CD123 ）領域の 2 つのチェーン間のリンカーにあります。モデル 7 、 9 、 10 、および 12 には、多くの非常に無秩序な領域があり、予測折りが良好でない領域を示しています。

モデル 8 の予測される結合部位と位置は 33 、 235 です。各部位のリガンドの可能性が最も高い（タイプ）： TYR 。各部位＋中心点リガンド（ TypeID ）： PRO656 。クラスタ内の全てのリガンド（タイプ - 周波数）： GLY-3 、 TRP-2 、 GLU-2 、 ILE-3 、 PRO-4 、 SER-3 、 ARG-1 k、 THR-2 、 TYR-5 、 ASP-1 、 LEU-1 、 ASN-4 、 ALA-2 、 CYS-1 。各部位の中心点リガンドの可能性： TYR672 。予測される結合部位を図 14 に示します。

そのため、報告された予測構造によれば、 in vivo での維持の可能性が高いスペーサの最適な選択肢は、抗 CD33 RfuCAR およびモデル 8 （ SEQ ID. No. 8 ）抗 CD123 RfuCAR 用RfuCAR の領域の構造をモデル 2 ( SEQ ID. No. 2 ) にすることです。両方に抗腫瘍 scFv が含まれ、受容体と CD8 ヒンジ間のスペーサとして IgG4 ヒンジを持つ IL1-R2 受容体、細胞膜からのスペーサーとして CD8 ヒンジが含まれます。

発明は十分に説明されているが、熟練した方がそのような変更が発明の範囲外であることなしで設計を増進するために様々な変更および修正がなされるかもしれないこと芸術で巧みなそれらに明らかである。

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Claims

SEQ IDNo.1～6で構成されるRfuCAR抗CD33及び、SEQ IDNo.7～12で構成されるRfuCAR抗CD123であることを特徴とするタンデム受容体CARにおける二重特異性。
SEQ IDNo.2で構成されるRfuCAR抗CD33であることを特徴とする請求項１に記載のタンデム受容体CARにおける二重特異性。
タンデム受容体CARにおける二重特異性は、主にSEQ ID No. 2で表されるモデル2で特徴づけられ、50 、 227 、 228 、 229 、 272 、および 360のRfuCAR抗CD33の推定結合部位と位置であることを特徴とする請求項２に記載のタンデム受容体CARにおける二重特異性。
各部位で最も可能性の高いリガンドはILE, FULである特徴づけられている；各部位の中心点リガンドは SER657 、 FUL641 、でクラスタ内の全てのリガンドはGLY-1 、 TRP-1 、 GLU-2 、 ILE-3 、 PRO-3 、 SEL-2 、 THR-2 、 TYR-3 、 ASP-1 、 LEU-1 、 ASN-1 、 FUL-1 、 FUC-1；そしておそらく中心点リガンドは ILE650 、 FUL641 であることを特徴とする請求項２に記載のタンデム受容体CARにおける二重特異性。
SEQ IDNo.8で構成されるRfuCAR抗CD123であることを特徴とする請求項１に記載のタンデム受容体CARにおける二重特異性。
タンデム受容体CARにおける二重特異性は、主にSEQ ID No. 8で表されるモデル8で特徴づけられ、33 、 235 のRfuCAR抗CD123の推定結合部位と位置であることを特徴とする請求項５に記載のタンデム受容体CARにおける二重特異性。
各部位で最も可能性の高いリガンドは TYR；各部位の中心点リガンドは PRO656 、クラスタ内のすべてのリガンドは GLY-3 、 TRP-2 、 GLU-2 、 ILE-3 、 PRO-4 SER-3 、 ARG-1 、 THR-2 、 TYR-5 、 ASP-1 、 LEU-1 、 ASN-4 、 ALA-2 、 CYS-1であることが特徴づけられ、中心点リガンドは TYR672であることを特徴とする請求項５に記載のタンデム受容体CARにおける二重特異性。
CD33、CD123などの腫瘍細胞上の表面分子や、CD19、Mesothelin、BCMAなどの別の腫瘍標的、IL-1R2などのIL-l受容体2型を認識して結合するscFvを含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のタンデム受容体CARにおける二重特異性。
分泌された IL-1 β が、IL-1R1 および IL-1 シグナリング形質導入への結合を阻害し、このような阻害のIL-1 経路の活性化が減少させ、腫瘍細胞増殖の変調が促進される、RfuCAR の IL-1R に結合を閉じ込められることを特徴とする腫瘍状微小環境を変調する方法。
微小物環境における IL-1 含有量の規制は、腫瘍環境における他の部位カイン活性化を変調し、CRS および神経毒性イベントで観察されるサイトカインの過剰分泌を予防することを特徴とする、請求項９に記載の腫瘍状微小環境を変調する方法。
RfuCAR 細胞の作用は、有毒なCAR-T効果が患者で検出された場合、IL-1R 、 IL-1-IL-1R 、および／または scFv エピトープにリンクする異なるペプチドの投与によって一時的にスイッチオフおよび／または調整できることを特徴とする、請求項９に記載の腫瘍状微小環境を変調する方法。
腫瘍微小環境が急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、膵臓、肺癌、および卵巣癌など主に急性骨髄性白血病のような任意の種類の癌で構成されていることが特徴とする請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。