JP2022523050A - 合理的設計により増強された新規なａａｖウイルスによる網膜における高効率の形質導入および側方への広がり - Google Patents

Abstract

本開示は、新しいカプシドバリアントAAV44.9(E531D)を含むrAAV粒子を提供する。本開示は、網膜障害の処置を包含する眼の処置のためのAAV44.9(E531D)を含むrAAV粒子もまた提供する。具体的な態様において、本開示は、対象の中心窩への網膜下注射の後、増強された側方への広がり（lateral spread）を呈する、ここで、中心窩の剥離が最小限に抑えられる、AAV44.9(E531D)カプシドを含むrAAV粒子を提供する。本開示はさらに、AAV44.9(E531D)カプシド、および異種核酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、rAAV粒子を提供する。rAAV粒子を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む処置の方法、および、rAAV粒子で光受容器細胞およびＲＰＥ細胞を形質導入させる方法もまた、提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年１月２３日に出願された米国仮出願第62/795,695号の出願日の利益を主張し、その内容全体は、参照により援用される。

連邦政府による資金提供を受けた研究
この発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号R01 EY024280の下、政府の支援によりなされた。政府は発明において一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、一般的には分子生物学およびウイルス学の分野に、および具体的に言うと、網膜疾患の処置のための遺伝子治療ベクターおよび方法の開発に関する。

発明の背景
治療用遺伝子素材を送達するためにウイルスを使用することによって、遺伝子治療の分野における大きな前進が達成された。アデノ随伴ウイルスは、その低い免疫原性、および、非***細胞を効果的に形質導入させる能力に起因して、遺伝子治療に効果の高いウイルスベクターとして多大な注目を引きつけている。AAVは、様々な細胞および組織型を感染させることが示されており、および、このウイルス系をヒト遺伝子治療における使用のために適応させることに対して最近１０年間にわたって有意な進歩が遂げられている。

AAV ＤＮＡは、その正常な「野生型」の形態では、長さ約４６００ヌクレオチド（ｎｔ）の一本鎖分子としてウイルスカプシド中へとパッケージングされている。ウイルスによる細胞の感染の後に続いて、細胞の分子機構は、一本鎖ＤＮＡを二本鎖形態へと変換する。この二本鎖ＤＮＡ型のみが、ＲＮＡ中へと細胞酵素により転写され得、これは次いでさらなる細胞経路によってポリペプチドへと翻訳される。

組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、数多くのヒト疾患前臨床動物モデルにおいてin vivo遺伝子導入のために首尾よく用いられており、および、多種多様な治療遺伝子の長期発現のために首尾よく用いられている（DayaおよびBerns, 2008；Niemeyer et al., 2009；Owen et al., 2002；Keen-Rhinehart et al., 2005；Scallan et al., 2003；Song et al., 2004）。AAVベクターはまた、免疫特権が備わった部位を標的とするときにも、例として、レーバー先天性黒内障のための眼送達においても、ヒトにおける長期の臨床的利益を生成している（Bainbridge et al., 2008；Maguire et al., 2008；Cideciyan et al., 2008）。このベクターの大きな利点は、その比較的低い免疫プロファイルであり、これは限られた炎症応答のみを引き出し、および、場合によっては、導入遺伝子産物に対する免疫寛容を指揮することさえある（LoDuca et al., 2009）。ところが、治療効率は、免疫特権が備わっていない器官を標的とするとき、ウイルスカプシドに対する抗体およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答に起因してヒトにおいては限られており、一方で、動物モデルにおいては、導入遺伝子産物に対する適応応答もまた報告されている（Manno et al., 2006；Mingozzi et al., 2007；Muruve et al., 2008；VandenbergheおよびWilson, 2007；MingozziおよびHigh, 2007）。

網膜色素上皮（ＲＰＥ）または光受容器（ＰＲ）における導入遺伝子発現が要求されるとき、AAVの網膜下注射が一般的に使用される。網膜下注射は、光受容器外節をＲＰＥ層から分離させる一時的な水疱性剥離を生み出す。典型的には、網膜下注射ブレブは、対象において後に続く数日間をかけて解消する。網膜下注射は、光受容器に対していくらかの有害な効果を有するらしく、かかる効果は、既に疾患によって損なわれた網膜においてより重症になると考えられる。具体的に言うと、網膜遺伝子治療を受けているRPE65-LCA患者において中心窩を剥離させることは有害であり得るということが示唆されている（Jacobson et al., Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years, Arch Ophthalmol. 2012; 130(1):9-24を参照）。

網膜形質導入効率を増加させ、かつ、網膜下注射の間、中心窩の剥離を最小限に抑えるための、AAVカプシドの必要性が依然としてある。

発明の概要
AAVは、治療遺伝子を網膜へ標的化するための第一選択ベクターになっている。網膜指向性を発揮する天然由来と合成との両方のAAVが同定されている。近年、新規なAAVカプシド血清型44.9が、正常なアカゲザル腎臓細胞培養から取ったサルアデノウイルスSV15の研究所ストックから単離された。２０１６年１１月１７日に発行されたWO 2016/183297；２０１８年１２月１３日に発行された米国特許出願公開第2018/0355376号；およびNovel Adeno-Associated Virus for Gene Therapy, Fed. Reg. 80, 149 （Aug. 4, 2015）が参照され、それらの各々の全体が本明細書に援用される。AAV44.9は、唾液腺細胞、肝細胞、および多種のニューロン（例として、大脳皮質の細胞、嗅球、脳幹、および小脳のプルキンエ細胞）を包含する数多の細胞型を効率的に形質導入させる。

AAV44.9は、AAV9に引けを取らないin vivo生体内分布を呈する。このカプシドの脳室内注射は、AAV9を用いて観察されるものに似た、大脳皮質、嗅球、小脳、脈絡叢および脳幹における形質導入レベルを示している。加えて、抗体中和研究は、AAV2と比較してAAV44.9に対する抗体の中和のより低い頻度を示唆する。そして、AAV44.9のグリカンアレイ研究は、カプシドの、末端グルコース含有分子への結合を示唆している。

AAV44.9のカプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列は、最も近いものとして報告された分離株AAVrh.8Rカプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列（Vandenberghe LH et al., Naturally occurring singleton residues in AAV capsid impact vector performance and illustrate structural constraints, Gene Ther. 16:1416-1418 (2009)；Vandenberghe LH, et al., AAV9 targets cone photoreceptors in the nonhuman primate retina, PLoS One 8(1):e53463 (2013)を参照）と数か所で異なり、これらのうちの２つは可変ドメイン３におけるセリン残基である。具体的に言うと、AAV44.9のカプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列は、AAVrh.8Rのカプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列に対して相対的に位置１７９、４７３および４８３で異なる。

AAV44.9のカプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列は、近いものとして報告された分離株AAVrh.8カプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列（Gao et al., J. Virol. 78(12): 6381-6388 (2004)を参照）と数か所で異なり、これらのうちの２つは可変ドメイン３におけるセリン残基である。具体的に言うと、AAV44.9のカプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列は、AAVrh.8のカプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列に対して相対的に位置１７９、４７３、４８３および５３１で異なる。

カプシドタンパク質におけるアミノ酸の合理的突然変異生成研究は、いくつかの突然変異がベクターの遺伝子導入活性の阻害効果を有するということを示唆しており、具体的に言うと可変領域におけるセリンおよびトレオニン残基の存在がそうである。報告は、これらのアミノ酸が粒子の表面電荷を増加させてそれらをリソソーム中での分解のために標的化し、および、他の非荷電のアミノ酸での置換は形質導入活性を改善させることができるということを示す。加えて、受容体相互作用に関係している残基の突然変異もまた、網膜形質導入および指向性への大きな効果を有する。網膜の文脈において、表面が露出したチロシンからフェニルアラニンへの（Y-F）変異を含有するAAV2およびAAV8カプシドは、改良されていないカプシドに対して相対的に増加した網膜形質導入を表出させるということが示されている。

AAV44.9は、AAVrh.8のカプシドタンパク質VP1に対して相対的にAAV44.9のカプシドタンパク質VP1の可変ドメイン３におけるさらなるセリン残基の包含を与えられたことで数多の細胞型において高い遺伝子導入活性を有する。位置４７０のセリンのアスパラギンでの置換を伴うAAV44.9のカプシドタンパク質VP1がWO 2016/183297に開示されている。類似のセリン残基がAAV2カプシドにおいて改変させられたとき、それは製造されたベクターの力価の実質的な増加に至らしめたが、しかしそれは形質導入効率を改変させなかった（Aslanidi et al., High-efficiency Transduction of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Capsid-modified Recombinant AAV2 Vectors, Vaccine, 30(26): 3908-3917 (2012)を参照）。それでもなお、AAV44.9におけるS470R置換は、AAV44.9カプシドの形質導入および結合親和性を変化させるものと考えられる。

本開示の発明者らは、残基５３１でのグルタミン酸をアスパラギン酸へと突然変異誘発させることによって新規なバリアントを作製するために、合理的設計アプローチを使用した。この新しい血清型バリアントAAV44.9(E531D)は、網膜下注射されたマウスおよびマカクにおいて評価された。AAVrh.8およびAAV44.9における位置５３１などの、AAV2カプシドにおけるE530位置に対応する位置でのアミノ酸置換は、形質導入効率を改変するものとして仮説が立てられている。２０１８年８月３０日に発行された国際特許出願公開第WO 2018/156654号を参照、その内容は本明細書に参照により援用される。

本明細書に記載のとおり、AAV44.9(E531D)カプシドバリアントを組み込んだrAAV粒子は、驚くべきことに、網膜下注射の後に続いて桿体、錐体、および網膜色素上皮（「ＲＰＥ」）の高効率の形質導入を可能とすることが見いだされた。加えて、AAV44.9(E531D)は、増加した側方への広がりを呈し、網膜下注射ブレブの外側の光受容器および網膜色素上皮を形質導入させる。AAV44.9(E531D)の、増加した効力および側方への広がりは、このバリアントを、網膜を標的とする遺伝子治療のための有望なベクターにする。

錐体が豊富な中心窩下の網膜下注射は、一部の処置された患者において、網膜中心厚の損失ならびに視力の損失を促進させることが示されている（RPE65-LCA2についてのＩ／ＩＩ相試験）。Jacobson et al., Arch Ophthalmol. 2012; 130(1):9-24を参照。しかしながら、中心窩外網膜における網膜下注射は、良好な耐容性を示す。したがって、中心窩外網膜下注射の後に続いて効果的に中心窩錐体を標的としたベクターを使用することが有利であり得、すなわち、手術の間に中心窩が剥離しない。色覚異常および他の先天性網膜疾患の臨床試験に現在使用されているベクターは、この基準を満たさない。網膜下ブレブの当初の境界を越えての導入遺伝子発現が、有益な遺伝子治療効果を最大化させながら網膜剥離の有害な効果の一部を回避し得る可能性があることから、注射の部位への網膜の形質導入は、より新しい世代のAAVベクターの望ましい特徴である。例えば、ヒト対象において、形質導入の側方への広がりは、傍中心窩領域における網膜下注射が中心窩剥離の誘発の有害な効果を避けながら中心窩細胞の形質導入を生じさせるということを可能にできた。近年、EGFP発現AAVベクターが、正常なイヌにおいてAAVベクターの網膜下での送達の後に続いて、網膜下注射部位を越えた導入遺伝子発現の側方への広がりを呈した。Breuwer et al., Evaluation of Lateral Spread of Transgene Expression following Subretinal AAV-Mediated Gene Delivery in Dogs, PLoS One, 2013; 8(4): e60218を参照。

傍中心窩領域は、中央固定点からおよそ４度偏心して中心窩の周囲に境界線をなす眼のゾーンである。傍中心窩は、最も高い桿体の密度を有しながら、それでもなお多くの数の錐体をも含有する。それは、錐体優位網膜と桿体優位網膜との間の移行ゾーンであり、および、網膜色素変性症（ＲＰ）などの網膜外側から内網膜へと変性が進む疾患の文脈において重要である。周中心窩領域は、傍中心窩の周囲に境界線をなすゾーンであり、黄斑の最も外側の帯に相当する。傍中心窩のように、周中心窩は、網膜変性が周囲で始まって中心網膜まで進行するＲＰのような疾患の進行において重要な役割を有する。周中心窩は、ＲＰにおける変性を受ける最初の黄斑のゾーンである。

この開示の側面は、眼の処置のための改良されたAAV44.9カプシドを含むrAAV粒子およびベクターに関する。具体的に言うと、この開示は、いくつかの態様において、網膜障害の処置のためのE531D突然変異を有するAAV44.9カプシドを含む粒子を提供する。いくつかの態様において、本開示は、中心窩への網膜下注射の後、増強された側方への広がりを呈する、ここで、中心窩の剥離が最小限に抑えられる、AAV44.9(E531D)カプシドを含む粒子を提供する。いくつかの態様において、本開示は、カプシドタンパク質、例として、それぞれ配列番号１、２または３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むVP1、VP2またはVP3カプシドタンパク質を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、VP1、VP2、および／またはVP3タンパク質を含むカプシドを含むrAAV粒子であって、異種核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含むrAAV粒子を提供する。
いくつかの態様において、rAAV粒子中の異種核酸配列は、診断または治療剤、例として、ポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合フラグメント、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする。

具体的な態様において、治療剤は、ａ）１以上の光受容（ＰＲ）細胞または１以上の網膜色素上皮（「ＲＰＥ」）細胞を保存する、ｂ）桿体および／もしくは錐体に媒介される１以上の機能を修復する、ｃ）片目または両目において視覚挙動を完全にまたは部分的に修復する、またはｄ）これらのいずれかの組み合わせとなる。いくつかの態様において、哺乳動物の片目または両目へのrAAV粒子の初回投与の後に続いて実質的に少なくとも３か月の期間の間、１以上の光受容細胞または１以上のＲＰＥ細胞において治療剤の生産が持続する。

いくつかの態様において、異種核酸配列は、優性錐体ジストロフィー、優性錐体桿体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、劣性錐体ジストロフィー、劣性錐体桿体ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、パターンジストロフィー、卵黄状黄斑ジストロフィー、中心性脈絡膜ジストロフィー、スターガルト病、常染色体優性、常染色体劣性およびＸ連鎖網膜色素変性症、バルデー・ビードル症候群に関連する網膜色素変性症、Ｘ連鎖若年性網膜分離症、色覚異常、青錐体１色型色覚、およびアッシャー症候群タイプＩ、IIおよびIIIなどの、疾患、障害、もしくは状態に関連する配列（例として、標的コード配列に対し少なくとも８０％同一性を有する配列）を含む。いくつかの態様において、異種核酸配列（例として、標的コード配列に対し少なくとも８０％同一性を有する配列）は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、ポンペ病、フリードライヒ運動失調症、ムコ多糖症（ＭＰＳ）（全ての型）、リソソーム蓄積病（ＬＳＤ）（全ての型）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびアルツハイマー病などの、疾患、障害、もしくは状態に関連する配列を含む。

いくつかの態様において、異種核酸配列は、標的コード配列に対し少なくとも８０％同一性を有する。いくつかの態様において、異種核酸配列は、標的コード配列に対し少なくとも９５％同一性を有する。いくつかの態様において、異種核酸配列は、標的コード配列に対し少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有する。いくつかの態様において、異種核酸配列は、標的コード配列に対し１００％同一性を有する。いくつかの態様において、異種核酸配列は、GUCY2D配列を含む。

いくつかの態様において、異種核酸配列は、置換コード配列（replacement coding sequence）である。具体的な態様において、置換コード配列は、対象（例として、ヒト）に対し、例として、完全にまたは部分的に、光受容機能を修復すべく、機能性タンパク質、例として、GUCY2Dを提供するために対象に投与される。いくつかの態様において、対象に（例として、優性錐体桿体ジストロフィーを有するヒトに）本明細書に開示された異種核酸配列を含むrAAV粒子を投与することによって、対象の標的コード配列の、一方または両方の対立遺伝子がサイレンシングされる。

例示の標的コード配列は、優性錐体ジストロフィー、優性錐体桿体ジストロフィーおよびレーバー先天性黒内障に関連するGUCY2DおよびGucy2e；レーバー先天性黒内障に関連するSPATA7；レーバー先天性黒内障および常染色体優性網膜疾患(例として、網膜色素変性症、パターンジストロフィー、卵黄状黄斑ジストロフィー、中心性脈絡膜ジストロフィー、および黄斑ジストロフィー)に関連するPRPH2を包含する。GUCY2Dは、グアニル酸シクラーゼ２Ｄとしてもまた知られる網膜グアニリルシクラーゼ１（retGC1）酵素をコードする。この遺伝子における突然変異は、レーバー先天性黒内障および錐体桿体ジストロフィー－６障害を結果としてもたらす。Gucy2eは、GUCY2Dのマウスホモログであるグアニル酸シクラーゼ２Ｅをコードする。

さらなる標的コード配列は、AIPL1、LCA5、RPGRIP1、CRX、CRB1、NMNAT1、CEP290、IMPDH1、RD3、RDH12、TULP1、KCNJ13、GDF6、およびIQCB1（全てレーバー先天性黒内障に関連する）；BBS1、BBS2、ARL6/BBS3、BBS4、BBS5、BBS7、TTC8/BBS8、BBS10、TRIM32/BBS11、BBS12、CCDCC28B、CEP290、TMEM67、MKS1およびMKKS（全てバルデー・ビードル症候群（ＢＢＳ）に関連する）；RHO、PRPF31、RP1、NRLおよびNR2E3（全て常染色体優性網膜色素変性症に関連する）；RPGRおよびRP2（両方ともＸ連鎖網膜色素変性症に関連する）；PDE6A、PDE6B、PDE6G、RP25、CNGA1、CNGB1およびMAK（全て常染色体劣性網膜色素変性症に関連する）；RS1（Ｘ連鎖若年性網膜分離症（ＸＬＲＳ）に関連する）；CNGB3、CNGA3およびGNAT2（全て色覚異常に関連する）；OPN1LWおよびOPN1MW（両方とも青錐体１色型色覚（ＢＣＭ）に関連する）；CRX、GUCA1A（GCAP1）およびGUCA1B（GCAP2）（全て優性錐体ジストロフィーおよび優性錐体桿体ジストロフィーに関連する）；ABCA4（劣性錐体ジストロフィー、劣性錐体桿体ジストロフィー黄斑ジストロフィーおよびスターガルト病に関連する）；PROM1およびELOVL4（両方ともスターガルト病に関連する）；MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15およびUSH1G（全てアッシャー症候群タイプＩに関連する）；USH2AおよびDFNB31（両方ともアッシャー症候群タイプIIに関連する）；およびCLRN1（アッシャー症候群タイプIIIに関連する）を含んでもよい。

いくつかの態様において、異種核酸配列は、青錐体１色型色覚などの、疾患、障害、または状態に関連する標的ゲノム調節配列（例として、遺伝子座制御領域）を含む。例示の標的調節配列は、青錐体１色型色覚に関連するＬ／Ｍオプシンの遺伝子座制御領域である。

いくつかの側面において、本開示は、rAAV粒子と、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤および／または緩衝液とを含む組成物を提供する。

いくつかの側面において、本開示は、対象において異種核酸配列（または導入遺伝子）の発現をモジュレートするようにＲＰＥおよび光受容細胞を形質導入させる方法であって、本明細書に記載のとおりのrAAV粒子と薬学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤および／または緩衝液とをヒト対象などの対象に投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの側面において、本開示は、対象において網膜疾患を処置する方法であって、組成物を対象の眼に投与することを含む、前記方法を提供する。

いくつかの側面において、本開示は、網膜疾患を処置することにおける使用のための組成物、および、網膜疾患を処置するための医薬の製造における使用のための組成物を提供する。いくつかの側面において、本開示は、哺乳動物の片目または両目に網膜下もしくは硝子体内投与することによる処置における使用のための、本明細書に記載のとおりのrAAV粒子を含む組成物を提供する。

いくつかの側面において、本開示は、哺乳動物の１以上の光受容細胞またはＲＰＥ細胞において核酸セグメントを発現させるための方法であって、以下を含む、前記方法を提供する：哺乳動物の１以上のＰＲ細胞またはＲＰＥ細胞において治療剤を生産するのに有効な時間の間、本明細書に記載のとおりのrAAV粒子を哺乳動物の片目または両目に網膜下もしくは硝子体内投与すること、ここでrAAV粒子は、少なくとも治療剤をコードする第１の異種核酸配列に作動可能に連結しているＰＲもしくはＲＰＥ細胞特異的プロモーターを含む少なくとも第１のポリヌクレオチドを含んだポリヌクレオチドを含む。

rAAV粒子は、複数の（２の、３の、４の、５の、６の、７の、８の、９の、または１０の）異種核酸配列を含んでもよい。ある態様において、複数の異種核酸配列が、単一のポリヌクレオチド分子上に含まれる。複数の異種核酸配列は、例えば、マルチサブユニットタンパク質によって引き起こされた遺伝子欠損を正すかまたは和らげるために使用され得る。様々な態様において、異なる異種核酸配列は、タンパク質の各サブユニットをコードするためまたは異なるペプチドもしくはタンパク質をコードするために使用され得る。これは、タンパク質サブユニットをコードする核酸のサイズが大きいとき、例として、免疫グロブリン、血小板由来増殖因子、またはジストロフィンタンパク質のために望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を生産するために、細胞は、異なるサブユニットの各々を含有するrAAV粒子で感染させられる。代替的に、タンパク質の、異なるサブユニットは、同じ核酸配列によってコードされてもよい。様々な態様において、単一の異種核酸配列は、サブユニットの各々をコードする核酸を包含し、各サブユニットについての核酸は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられる。これは、サブユニットの各々をコードする核酸のサイズが小さいとき、例として、サブユニットをコードする核酸とＩＲＥＳとの合計サイズが５キロベースよりも少ないときに望ましい。

ＩＲＥＳに対する代替として、核酸は、２Ａペプチドをコードする配列によって隔てられていてもよく、これは翻訳後イベントにおいて自己切断される。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも有意に小さく、空間が限定要因であるときの使用のために良好に適している。より頻繁には、異種核酸配列が大きいとき、マルチサブユニットからなるとき、または２つの異種核酸配列が共送達されるとき、または所望の異種核酸配列（単数または複数）もしくはサブユニットを抱えたrAAV粒子がそれらをin vivoでコンカテマー化させることで単一のベクターゲノムを形成するために共投与されるときである。かかる態様において、第１のrAAV粒子は、単一の異種核酸配列を発現させる発現カセットを抱えていてもよく、および、第２のrAAV粒子は、宿主細胞における共発現のための異なる異種核酸配列を発現させる発現カセットを抱えていてもよい。しかしながら、選択された異種核酸配列は、あらゆる生物学的に活性な産物または他の産物、例として、研究のために望ましい産物を、コードしてもよい。

いくつかの態様において、rAAV粒子の中にあるポリヌクレオチドは、rAAV粒子が導入される宿主のタイプ（例として、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的である転写および翻訳開始および終止コドンなどの調節配列を含む。好ましくは、rAAV粒子の中にある核酸は、宿主の属に特異的である調節配列を含む。最も好ましくは、該分子は、宿主の種に特異的である調節配列を含む。

rAAV粒子の中にあるポリヌクレオチドは、好ましくは、宿主細胞における異種核酸配列（単数または）複数の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（IRES）等々といった発現制御配列を含む。例示の発現制御配列は、当該技術分野において知られており、および、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990)に記載されている。

図面の簡単な記載
以下の図面は、本願明細書の一部を形成し、および、本発明のある側面をさらに示すために包含される。本発明は、似たような参照数字が似たような要素を同定する、添付の図面と併せて、以下の記載を参照することによって、より良く理解され得る：

図１は、VP1に基づくAAV系統発生（AAV44.9は太字で示される）およびベクター生産のためのAAVコンストラクトの詳細を伴う表を示す。

図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅは、網膜下注射の４週間でのAAV44.9、AAV5およびAAV8(Y733F)の質的および量的分析を示す。図２Ａは、露光長さ２５での眼底像を示す。 図２Ｂ～２Ｄは、フローサイトメトリー散乱プロットを示し、および、図２Ｅは、２×１０^９ベクターゲノム（ｖｇ）での網膜下注射の後に続いてAAV5およびAAV8(Y733F)よりもAAV44.9の方がより効率的に桿体を形質導入させたということを示した量的分析を示す。 図２Ｂ～２Ｄは、フローサイトメトリー散乱プロットを示し、および、図２Ｅは、２×１０^９ベクターゲノム（ｖｇ）での網膜下注射の後に続いてAAV5およびAAV8(Y733F)よりもAAV44.9の方がより効率的に桿体を形質導入させたということを示した量的分析を示す。 図２Ｂ～２Ｄは、フローサイトメトリー散乱プロットを示し、および、図２Ｅは、２×１０^９ベクターゲノム（ｖｇ）での網膜下注射の後に続いてAAV5およびAAV8(Y733F)よりもAAV44.9の方がより効率的に桿体を形質導入させたということを示した量的分析を示す。

図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、AAV5（上側のパネル、図３Ａ）、AAV8(Y733F)（上側のパネル、図３Ｂ）、およびAAV44.9（上側のパネル、図３Ｃ）を注射されたNrl-GFPトランスジェニックマウス網膜における光受容器および網膜色素上皮（「ＲＰＥ」）における、網膜下注射の４週間後での、mCherry発現を示す代表的な網膜横断面像を示す。図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃの下側のパネルは、矢印で示されるとおり、核DAPI染色、桿体細胞における内因性GFP発現および光受容細胞におけるmCherry発現の、重なり合った像を示す。

図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、AAV44.9(Y733F)およびAAV44.9(E531D)の質的および量的分析を示す。図４Ａは、露光長さ２５での眼底像を示し、図４Ｂは、フローサイトメトリー散乱プロットを示し、および、図４Ｃは、２×１０^９ｖｇでの網膜下注射の後に続いてAAV44.9およびAAV44.9(Y733F)よりもAAV44.9(E531D)の方がより効率的に桿体細胞を形質導入させたということを示したことによる量的分析を示す。 図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、AAV44.9(Y733F)およびAAV44.9(E531D)の質的および量的分析を示す。図４Ａは、露光長さ２５での眼底像を示し、図４Ｂは、フローサイトメトリー散乱プロットを示し、および、図４Ｃは、２×１０^９ｖｇでの網膜下注射の後に続いてAAV44.9およびAAV44.9(Y733F)よりもAAV44.9(E531D)の方がより効率的に桿体細胞を形質導入させたということを示したことによる量的分析を示す。 図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、AAV44.9(Y733F)およびAAV44.9(E531D)の質的および量的分析を示す。図４Ａは、露光長さ２５での眼底像を示し、図４Ｂは、フローサイトメトリー散乱プロットを示し、および、図４Ｃは、２×１０^９ｖｇでの網膜下注射の後に続いてAAV44.9およびAAV44.9(Y733F)よりもAAV44.9(E531D)の方がより効率的に桿体細胞を形質導入させたということを示したことによる量的分析を示す。

図５Ａおよび５Ｂは、AAV44.9(Y733F)（上側のパネル、図５Ａ）およびAAV44.9(E531D)（上側のパネル、図５Ｂ）を注射されたNrl-GFPマウス網膜においての主に光受容器およびＲＰＥにおける、網膜下注射の４週間後での、mCherry発現を示す代表的な網膜横断面像を示す。図５Ａおよび５Ｂの下側のパネルは、核DAPI染色（青色）、桿体細胞における内因性GFP（緑色）発現および光受容細胞におけるmCherry発現（赤色）の、重なり合った像を示す。

図６Ａおよび６Ｂは、眼細胞株におけるAAV44.9およびAAV44.9(Y733F)の形質導入効率を示す。AAV44.9(Y733F)は、マウス錐体光受容細胞株においてAAV44.9に対して相対的に増加した形質導入を見せた（図６Ａ）。しかしながら、AAV44.9は、ヒトＲＰＥ細胞株においてAAV9(Y733F)よりもより効率的であった（図６Ｂ）。

図７Ａおよび７Ｂは、硝子体内注射の後に続く、AAVの質的分析を示す。２×１０^９ｖｇでの硝子体内注射の４週間で、図７Ａは、AAV2、AAV5、AAV8(Y733F)、AAV44.9、AAV44.9(Y733F)およびAAV44.9(E531D)の眼底像（long 25 integrationでのもの）を示し、図７Ｂは、バリアントの眼底像（long 100 integrationでのもの）を示す。

図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、錐体優先的な（cone preferential）キメラIRBPエンハンサー・錐体トランスデューシンプロモーター（IRBP/GNAT2）プロモーターおよびGFPレポーターを含有するAAV44.9を示し、図８Ａは、ＳＲ注射の４週間後での錐体細胞におけるGFP発現を示す。図８Ｂおよび８Ｃは、錐体アレスチン抗体を用いた共染色がGFP蛍光とともに共局在化することを示す。

図９Ａは、AAV44.9またはAAV44.9(E531D)での網膜下注射４週間後に取られたNrl-GFPマウスの代表的な眼底像（赤色蛍光フィルター）を示す。ベクターは、１μＬ中の２×１０^９ｖｇで送達された。露光およびゲインの設定は、実験の間にわたって一貫していた。 図９Ａは、AAV44.9またはAAV44.9(E531D)での網膜下注射４週間後に取られたNrl-GFPマウスの代表的な眼底像（赤色蛍光フィルター）を示す。ベクターは、１μＬ中の２×１０^９ｖｇで送達された。露光およびゲインの設定は、実験の間にわたって一貫していた。

図９Ｂは、注射４週間後に取られた、各細胞集団の形質導入百分率および対応する値を示す。Nrl-GFPマウスの網膜（図９Ａから）をパパインで解離させ、および、Boye et al., Impact of Heparan Sulfate Binding on Transduction of Retina by Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors, J. Virol. 2016, 90(8):4215-4231（その内容全体は、本明細書に参照により援用される）に以前に記載されたとおり、形質導入された桿体（GFP＋mCherry陽性）または非桿体細胞（mCherry陽性）の割合を定量化するためにフローサイトメトリーを行った。

図１０Ａは、AAVrh.8-mCherryでの網膜下注射４週間後に取られたNrl-GFPマウスの代表的な眼底像を示す。ベクターは、１μＬ中の２×１０^９ｖｇで送達された。露光およびゲインの設定は、実験の間にわたって一貫していた。

図１０Ｂは、注射４週間後に取られた、各細胞集団の形質導入百分率および対応する値を示す。Nrl-GFPマウスの網膜（図９Ａおよび１０Ａから）をパパインで解離させ、および、形質導入された桿体（GFP＋mCherry陽性）または非桿体細胞（mCherry陽性）の割合を定量化するためにフローサイトメトリーを行った。

図１１Ａは、より低い力価の自己相補的AAV44.9（「scAAV44.9」）、AAV44.9(E531D)、またはscAAVrh.8での網膜下注射４週間後に取られたNrl-GFPマウスの代表的な眼底像を示す。ベクターは、１μＬ中の２×１０^８ｖｇで送達された。露光およびゲインの設定は、実験の間にわたって一貫していた。

図１１Ｂは、注射４週間後に取られた、各細胞集団の形質導入百分率および対応する値を示す。Nrl-GFPマウスの網膜（図１１Ａから）をパパインで解離させ、および、形質導入された桿体（GFP＋mCherry陽性）または非桿体細胞（mCherry陽性）の割合を定量化するためにフローサイトメトリーを行った。

図１２は、網膜下注射の６週間後の、錐体特異的なIRBPe-GNAT2キメラプロモーターの文脈における、AAV44.9(E531D)および改良されていないAAV44.9の質的分析を示す。２×１０^１２ｖｇでの網膜下注射の後に続くAAV44.9(E531D)-IRBP/GNAT2-hGFPおよびAAV44.9-IRBP/GNAT2-hGFPについての眼底像が示される。

図１３は、AAV44.9(E531D)-IRBP/GNAT2-hGFPでの網膜下注射６週間後に取られたＷＴマウスの代表的な網膜横断面を示す。ベクターは、１μＬ中の２×１０^１２ｖｇで送達された。断面は、GFP（緑色）および錐体アレスチン（赤色）に対して産生された抗体で免疫染色された。

図１４は、AAV44.9-IRBP/GNAT2-hGFPでの網膜下注射６週間後に取られたＷＴマウスの代表的な網膜横断面を示す。ベクターは、１μＬ中の２×１０^１２ｖｇで送達された。断面は、矢印で示されるとおり、GFPおよび錐体アレスチンに対して産生された抗体で免疫染色された。

図１５は、AAV44.9-hGRK1-GFPおよびAAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPが、網膜下注射されたマカクにおいて増強された側方への広がりおよび効力を呈したことを示す。ベクターは１×１０^１２ｖｇ ｖｇ／ｍＬで送達された。投薬の日のブレブの当初の境界および結果としてもたらされたGFP発現の境界が、白い点線で概説されている。同一の脈管構造は、参考のために太い濃い線でハイライトされている。

図１６は、マカクにおけるAAV44.9-hGRK1-GFP（１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ）の中心窩外網膜下注射の後に続いて作り出された３つの網膜下注射ブレブの光干渉断層撮影（ＯＣＴ）スキャン（左のネガティブコントラスト眼底像を参照）を示す。

図１７は、AAV44.9-hGRK1-GFPの中心窩外網膜下注射の後に続く、マカク網膜のＯＣＴ像を示す。ＳＬＯ像（上部左）の中の矢印は、図の下の部分におけるスキャンに示される網膜断面の場所を示す。断面は、錐体アレスチンおよびDAPIについて染色された。GFPを発現している桿体／錐体の割合が、各ゾーンにおいてプロットされている。ONL、外核層；INL、内核層；GCL、神経節細胞層。

図１８Ａおよび１８Ｂは、AAV44.9(E531D)-hGRK1-GUCY2eまたはAAV8(Y733F)-hGRK1-GUCY2eでの網膜下注射の後に続く、網膜グアニル酸シクラーゼ１／２ダブルノックアウト（GCdko）マウスにおけるＥＲＧ記録を示す。図１８Ａは、暗所視（左）および明所視（右）の両方の設定下での、平均の最大のａおよびｂ波の振幅を示す。図１８Ｂは、ベクターで処置した眼または反対側の未処置（「Ｔｘなし」）の眼からの錐体の代表的なＥＲＧトレースを示す。

図１９は、AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPの中心窩外網膜下注射の後に続く、マカク網膜のＯＣＴ像を示す。ＳＬＯ像（上の左）中の矢印は、図の下の部分におけるスキャンに示される網膜断面の場所を示す。断面は、錐体アレスチンおよびDAPIについて染色された。GFPを発現している桿体／錐体の割合が、各ゾーンにおいてプロットされている。

図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、および２０Ｄは、AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPおよびAAV44.9-hGRK1-GFPの中心窩外網膜下注射の後に続く、マカク網膜の傍中心窩領域の代表的なＯＣＴ画像を示す。スケールバーは、Ａ＝４０ミクロン、Ｂ＝２０ミクロンにおけるものである。 図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ、および２０Ｄは、AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPおよびAAV44.9-hGRK1-GFPの中心窩外網膜下注射の後に続く、マカク網膜の傍中心窩領域の代表的なＯＣＴ画像を示す。スケールバーは、Ａ＝４０ミクロン、Ｂ＝２０ミクロンにおけるものである。

図２１Ａおよび２１Ｂは、これらの注射の後に続く、マカク網膜の周中心窩領域の代表的なＯＣＴ画像を示す。 図２１Ａおよび２１Ｂは、これらの注射の後に続く、マカク網膜の周中心窩領域の代表的なＯＣＴ画像を示す。

詳細な記載
本開示は、カプシド血清型AAV44.9の新規なバリアントであるAAV44.9(E531D)、ならびに、このプラスミドを組み込んだベクターおよび粒子の、ベンチマークのベクター（密接に関連するAAVrh.8および改良されていないAAV44.9）に対して相対的な、網膜下注射されたマウスおよびマカクにおけるベクターの性能の評価を提供する。本明細書に記載のとおり、両方の種において、AAV44.9(E531D)は、改良されていないAAV44.9およびAAVrh.8に対して相対的により高い網膜形質導入、および、ベンチマークのカプシド（例として、AAV5およびAAV8に基づいたベクター）よりも有意に高い形質導入を媒介するということが見いだされた。

したがって、本開示は、AAV44.9(E531D)のカプシドタンパク質を含むrAAV粒子ならびに関連する組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、rAAV粒子は、異種核酸配列、例として、治療または診断剤をコードするものを含む。異種核酸配列は、一本鎖または自己相補的組換えウイルスゲノムなどの、一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｃ）AAV核酸ベクターの形態であってもよい。

本開示は、AAV44.9(Y733F)のカプシドタンパク質を含むrAAV粒子ならびに関連する組成物および方法を、さらに提供する。このAAV44.9カプシドバリアントは、残基７７３でのＹ－Ｆ突然変異を有する。いくつかの態様において、rAAV粒子は、異種核酸配列、例として、治療または診断剤をコードするものを含む。異種核酸配列は、一本鎖または自己相補的組換えウイルスゲノムなどの、一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｃ）AAV核酸ベクターの形態であってもよい。

本開示の側面は、中心窩への網膜下注射の後、増強された側方への広がりを呈する、ここで、中心窩の剥離（例として、一時的な水疱性剥離）が最小限に抑えられる、AAV44.9(E531D)カプシドを含むベクターに関する。いくつかの態様において、本開示は、カプシドタンパク質、例として、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含むVP1、VP2またはVP3カプシドタンパク質を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、VP1、VP2、および／またはVP3タンパク質を含むカプシドを含むrAAV粒子を提供し、ここで、rAAV粒子は、異種核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの態様において、rAAV粒子は、VP1、VP2、および／またはVP3タンパク質を含むカプシドを含み、ここで、VP1タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、VP2タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、および／または、VP3タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ならびに、ここで、AAVは、異種核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。異種核酸配列は、１以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接していてもよい。

いくつかの態様において、本開示は、配列番号１、２、および／または３のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を提供する。

いくつかの態様において、本開示は、配列番号４の核酸配列（AAV44.9(E531D) VP1をコードするもの）を含む核酸、例として、プラスミドまたはウイルスベクターを提供する。いくつかの態様において、本開示は、配列番号５の核酸配列（AAV44.9(E531D) VP2をコードするもの）を含む核酸、例として、プラスミドまたはウイルスベクターを提供する。いくつかの態様において、本開示は、配列番号６の核酸配列（AAV44.9(E531D) VP3をコードするもの）を含む核酸、例として、プラスミドまたはウイルスベクターを提供する。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの態様において、rAAVベクターは、自己相補的である。いくつかの態様において、核酸は、細胞、例として哺乳動物または昆虫細胞、の中に含まれている。

配列番号１～８の配列は、以下に提供される。

配列番号１ － AAV44.9(E531D) VP1アミノ酸配列
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPLGEPPAAPSGLGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMASQARNWVPGPSYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号２ － AAV44.9(E531D) VP2アミノ酸配列
MAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPLGEPPAAPSGLGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMASQARNWVPGPSYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号３ － AAV44.9(E531D) VP3アミノ酸配列
MASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMASQARNWVPGPSYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号４ － AAV44.9(E531D) VP1核酸配列
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAGTCACCCCAAGAACCAGACTCCTCATCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCCCCCTCAGGTCTGGGACCTAATACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGCACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAAGTCACGACGAACGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAATCTCACCAGCACCGTGCAGGTCTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTACCGTACGTGCTAGGATCAGCTCACCAGGGATGTCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGGTTCCTCAGTACGGTTATCTAACTCTGAACAATGGCAGCCAGGCCCTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTTCAGTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAAAGCCTGGACAGGCTGATGAATCCCCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGGTCAGAACGCAGACAACCGGGACTGGAGGGACGCAGACTCTGGCATTCAGCCAAGCAGGCCCTAGCTCAATGGCCAGCCAGGCTAGAAACTGGGTGCCCGGACCGAGCTACCGGCAGCAGCGCGTCTCCACGACAACCAACCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGAGCTGCCAAATTTAAACTGAACGGCCGAGACTCTCTAATGAACCCCGGCGTGGCCATGGCTTCACACAAGGATGACGATGACCGGTTCTTCCCTTCTAGCGGGGTCCTGATTTTCGGCAAGCAAGGAGCCGGGAATGATGGAGTGGATTACAGCCAAGTGCTGATTACAGATGAGGAAGAAATCAAGGCTACCAACCCCGTGGCAACAGAGGAATATGGAGCAGTGGCCATCAACAACCAGGCCGCTAATACGCAGGCGCAGACCGGACTCGTGCACAACCAGGGGGTGATTCCCGGCATGGTGTGGCAGAACAGAGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCGTCTCCCCTGATGGGCGGCTTTGGACTGAAGCACCCGCCTCCTCAAATTCTCATCAAGAACACACCGGTTCCAGCGGACCCGCCGCTTACCTTCAACCAGGCCAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATCGAGTGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAACACGGAAGGAGTGTATAGCGAGCCTCGCCCCATTGGCACGCGCTACCTCACCCGTAATCTGTAA

配列番号５ － AAV44.9(E531D) VP2核酸配列
ACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAGTCACCCCAAGAACCAGACTCCTCATCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCCCCCTCAGGTCTGGGACCTAATACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGCACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAAGTCACGACGAACGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAATCTCACCAGCACCGTGCAGGTCTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTACCGTACGTGCTAGGATCAGCTCACCAGGGATGTCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGGTTCCTCAGTACGGTTATCTAACTCTGAACAATGGCAGCCAGGCCCTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTTCAGTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAAAGCCTGGACAGGCTGATGAATCCCCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGGTCAGAACGCAGACAACCGGGACTGGAGGGACGCAGACTCTGGCATTCAGCCAAGCAGGCCCTAGCTCAATGGCCAGCCAGGCTAGAAACTGGGTGCCCGGACCGAGCTACCGGCAGCAGCGCGTCTCCACGACAACCAACCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGAGCTGCCAAATTTAAACTGAACGGCCGAGACTCTCTAATGAACCCCGGCGTGGCCATGGCTTCACACAAGGATGACGATGACCGGTTCTTCCCTTCTAGCGGGGTCCTGATTTTCGGCAAGCAAGGAGCCGGGAATGATGGAGTGGATTACAGCCAAGTGCTGATTACAGATGAGGAAGAAATCAAGGCTACCAACCCCGTGGCAACAGAGGAATATGGAGCAGTGGCCATCAACAACCAGGCCGCTAATACGCAGGCGCAGACCGGACTCGTGCACAACCAGGGGGTGATTCCCGGCATGGTGTGGCAGAACAGAGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCGTCTCCCCTGATGGGCGGCTTTGGACTGAAGCACCCGCCTCCTCAAATTCTCATCAAGAACACACCGGTTCCAGCGGACCCGCCGCTTACCTTCAACCAGGCCAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATCGAGTGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAACACGGAAGGAGTGTATAGCGAGCCTCGCCCCATTGGCACGCGCTACCTCACCCGTAATCTGTAA

配列番号６ － AAV44.9(E531D) VP3核酸配列

ATGGCTTCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGCACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAAGTCACGACGAACGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAATCTCACCAGCACCGTGCAGGTCTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTACCGTACGTGCTAGGATCAGCTCACCAGGGATGTCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGGTTCCTCAGTACGGTTATCTAACTCTGAACAATGGCAGCCAGGCCCTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTTCAGTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAAAGCCTGGACAGGCTGATGAATCCCCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGGTCAGAACGCAGACAACCGGGACTGGAGGGACGCAGACTCTGGCATTCAGCCAAGCAGGCCCTAGCTCAATGGCCAGCCAGGCTAGAAACTGGGTGCCCGGACCGAGCTACCGGCAGCAGCGCGTCTCCACGACAACCAACCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGAGCTGCCAAATTTAAACTGAACGGCCGAGACTCTCTAATGAACCCCGGCGTGGCCATGGCTTCACACAAGGATGACGATGACCGGTTCTTCCCTTCTAGCGGGGTCCTGATTTTCGGCAAGCAAGGAGCCGGGAATGATGGAGTGGATTACAGCCAAGTGCTGATTACAGATGAGGAAGAAATCAAGGCTACCAACCCCGTGGCAACAGAGGAATATGGAGCAGTGGCCATCAACAACCAGGCCGCTAATACGCAGGCGCAGACCGGACTCGTGCACAACCAGGGGGTGATTCCCGGCATGGTGTGGCAGAACAGAGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCGTCTCCCCTGATGGGCGGCTTTGGACTGAAGCACCCGCCTCCTCAAATTCTCATCAAGAACACACCGGTTCCAGCGGACCCGCCGCTTACCTTCAACCAGGCCAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATCGAGTGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAACACGGAAGGAGTGTATAGCGAGCCTCGCCCCATTGGCACGCGCTACCTCACCCGTAATCTGTAA

配列番号７ － AAV44.9野生型VP1アミノ酸配列

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPLGEPPAAPSGLGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMASQARNWVPGPSYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

配列番号８ － AAV44.9野生型VP1核酸配列

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAGTCACCCCAAGAACCAGACTCCTCATCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCCCCCTCAGGTCTGGGACCTAATACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGCACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAAGTCACGACGAACGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAATCTCACCAGCACCGTGCAGGTCTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTACCGTACGTGCTAGGATCAGCTCACCAGGGATGTCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGGTTCCTCAGTACGGTTATCTAACTCTGAACAATGGCAGCCAGGCCCTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTTCAGTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAAAGCCTGGACAGGCTGATGAATCCCCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGGTCAGAACGCAGACAACCGGGACTGGAGGGACGCAGACTCTGGCATTCAGCCAAGCAGGCCCTAGCTCAATGGCCAGCCAGGCTAGAAACTGGGTGCCCGGACCGAGCTACCGGCAGCAGCGCGTCTCCACGACAACCAACCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGAGCTGCCAAATTTAAACTGAACGGCCGAGACTCTCTAATGAACCCCGGCGTGGCCATGGCTTCACACAAGGATGACGAGGACCGCTTCTTCCCTTCTAGCGGGGTCCTGATTTTCGGCAAGCAAGGAGCCGGGAATGATGGAGTGGATTACAGCCAAGTGCTGATTACAGATGAGGAAGAAATCAAGGCTACCAACCCCGTGGCAACAGAGGAATATGGAGCAGTGGCCATCAACAACCAGGCCGCTAATACGCAGGCGCAGACCGGACTCGTGCACAACCAGGGGGTGATTCCCGGCATGGTGTGGCAGAACAGAGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCGTCTCCCCTGATGGGCGGCTTTGGACTGAAGCACCCGCCTCCTCAAATTCTCATCAAGAACACACCGGTTCCAGCGGACCCGCCGCTTACCTTCAACCAGGCCAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATCGAGTGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAACACGGAAGGAGTGTATAGCGAGCCTCGCCCCATTGGCACGCGCTACCTCACCCGTAATCTGTAA

偽型rAAV粒子を生産および使用するための方法が、当該技術分野において知られている（例として、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001；Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000；Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002；およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照）。rAAV粒子および異種核酸を生産する方法もまた当該技術分野において知られており、および市販されている（例として、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；および米国特許出願公開第US 2007/0015238および第US 2012/0322861号を参照、これらはその全体が本明細書に参照により援用される；ならびに、プラスミドおよびキットはATCCおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能である）。例えば、異種核酸配列を含有するプラスミドは、１以上のヘルパープラスミド、例として、rep遺伝子（例として、Rep78、Rep68、Rep52およびRep40をコードする）およびcap遺伝子（VP1、VP2、およびVP3（本明細書に記載のとおり改良されたVP3領域を包含する）をコードする）を含むもの、と組み合わせられてもよく、および、rAAV粒子がパッケージングされおよびその後精製されるように、生産細胞株中へとトランスフェクトまたは永久的に統合されてもよい。

いくつかの態様において、１以上のヘルパープラスミドは、rep遺伝子およびcap遺伝子を含む第１のヘルパープラスミド（例として、本明細書に記載のとおりのrAAVカプシドタンパク質をコードするもの）、および、E1a遺伝子、E1b遺伝子、E4遺伝子、E2a遺伝子、およびVA遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドを包含する。いくつかの態様において、rep遺伝子はAAV2に由来するrep遺伝子であり、およびcap遺伝子はAAV44.9に由来し、および、本明細書に記載の改良されたカプシドタンパク質を生産するために遺伝子への改良を包含してもよい。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作る方法は、当該技術分野において知られており、および市販されている（例として、PlasmidFactory, Bielefeld, GermanyからのpDM、pDG、pDP1rs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)、およびpDP8.apeプラスミド；Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MA、から入手可能な他の製品およびサービス；pxx6；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850；Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照）。

例示の非限定的な、rAAV粒子産生方法は、次に記載される。所望のAAV血清型についてのrepおよびcapのＯＲＦ、およびそれらのネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスVA、E2A（DBP）、およびE4遺伝子を含む、１以上のヘルパープラスミドが生産されるかまたは得られる。capのＯＲＦはまた、本明細書に記載のとおりの改良カプシドタンパク質を生産するための１以上の改良を含んでもよい。HEK293細胞（ATCC（登録商標）から入手可能）が、CaPO4に媒介されるトランスフェクション、脂質、または、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー分子を介して、ヘルパープラスミド（単数または複数）、および本明細書に記載の核酸ベクターを含有するプラスミドでトランスフェクトされる。HEK293細胞は、次いで、rAAV粒子生産を可能にするために少なくとも６０時間インキュベートされる。代替的に、別の例では、Sf9に基づいたプロデューサー安定細胞株が、異種核酸配列を含有する単一の組換えバキュロウイルスに感染させられる。さらに代替として、別の例では、HEK293またはBHK細胞株が、異種核酸配列を含有するHSVに、ならびに任意に、本明細書に記載のとおりのrepおよびcapのＯＲＦ、およびそれらのネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスVA、E2A（DBP）、およびE4遺伝子を含有する１以上のヘルパーHSVに、感染させられる。HEK293、BHK、またはSf9細胞は、次いで、rAAV粒子生産を可能にするために少なくとも６０時間インキュベートされる。rAAV粒子は、次いで、当該技術分野において知られているかまたは本明細書に記載されているいずれかの方法を使用して、例として、イオジキサノールステップ勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって、精製されることができる。

本開示はまた、AAV44.9(E531D)カプシドを組み込んだ粒子、AAV44.9(E531D)カプシドをコードする核酸、または本明細書に記載に記載のとおりのrAAV粒子、を含む宿主細胞をも企図する。かかる宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞を包含し、ヒト宿主細胞が好ましく、および、例として、細胞または組織培養中で単離され得る。いくつかの態様において、宿主細胞は、眼の細胞である。

いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのrAAV粒子（例として、AAV44.9(E531D)カプシドを含む）、および任意に、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤および／または緩衝液を含む、組成物が提供される。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、処置を必要とする哺乳動物（または対象）に投与されることができる。いくつかの態様において、対象は、網膜障害、網膜疾患、または網膜ジストロフィーの１以上を有するか、またはそれを有する疑いがある。いくつかの態様において、対象は、本明細書に開示された網膜の状態、疾患、または障害（例として、錐体桿体ジストロフィー）の１以上を有するか、またはそれを有する疑いがある。いくつかの態様において、対象は、１以上の内因性変異対立遺伝子（例として、錐体桿体ジストロフィーなどの、眼または網膜の疾患、障害もしくは状態に関連するかまたはそれを引き起こすもの）を有する。

いくつかの態様において、哺乳動物の光受容細胞または網膜色素上皮細胞を形質導入させるために方法が提供され、該方法は、本明細書に記載のrAAV粒子を哺乳動物の片目または両目に投与することを含む。具体的な態様において、哺乳動物の１以上の光受容細胞またはＲＰＥ細胞においてポリヌクレオチドを発現させるために方法が提供され、該方法は、哺乳動物の１以上のＰＲ細胞またはＲＰＥ細胞において治療剤を生産するのに有効な時間の間、本明細書に記載のrAAV粒子またはその組成物を哺乳動物の片目または両目に網膜下もしくは硝子体内投与することを含み、ここでrAAV粒子は、少なくとも治療剤をコードする第１の異種核酸配列に作動可能に連結しているＰＲもしくはＲＰＥ細胞特異的プロモーターを含む少なくとも第１のポリヌクレオチドを含んだポリヌクレオチドを含む。

具体的な態様において、本開示は、少なくとも治療剤をコードする第１の異種核酸配列に、作動可能に連結している、ＰＲもしくはＲＰＥ細胞特異的プロモーターを提供する。例示のＰＲまたはＲＰＥ細胞特異的プロモーターは、ａ）光受容器特異的プロモーター（桿体および錐体細胞において活性である）、例として、IRBPプロモーター（hIRPB、IRBP、IRBP241)、ロドプシンキナーゼプロモーター（hGRK1、GRK1、GRK、RK）、および／またはキメラのヒトレチノスキシン－IRBPエンハンサー（RS/IRPB）；錐体特異的プロモーター、例として、赤／緑錐体オプシンプロモーター（これは２．１ｋｂ（PR2.1）バージョンまたは１．７ｋｂ（PR1.7）バージョンを含み得る（本明細書に参照により援用される米国特許出願公開第2018/0112231号を参照））、錐体アレスチンプロモーター（hCAR、CAR）、キメラIRBPエンハンサー・錐体トランスデューシンプロモーター（IRBP/GNAT2、IRBPe-GNAT2）；桿体特異的プロモーター、例として、ヒトロドプシンプロモーター(RHO、RHOP、等)、ヒトＮＲＬプロモーター（ＮＲＬ）；または、RPE65もしくはBestrophin／VMD2（BEST1、BEST、VMD2）などのＲＰＥ特異的プロモーターを含み得る。

いくつかの態様において、開示されたrAAVベクターのいずれかのプロモーターは、配列番号１１に規定されたとおりのhGRK1プロモーターの配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む：
GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGC （配列番号１１）

したがって、本開示に記載の例示のrAAVベクターは、AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFP、AAV44.9(Y733F)-hGRK1-GFP、AAV44.9(E531D)-IRBP/GNAT2-hGFP、AAV44.9(Y733F)-IRBP/GNAT2-hGFP、AAV44.9(E531D)-hGRK1-GUCY2E、およびAAV44.9(Y733F)-hGRK1-GUCY2Eを含む。

具体的な態様において、本開示は、CMV、CBA、CB、smCBA、CBh、またはEF1－アルファを含み得る少なくとも第１の核酸配列に作動可能に連結している構成的プロモーターを提供する。

いくつかの態様において、選択された治療剤の治療有効量を、それを必要とする哺乳動物に提供することが関与する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載のrAAV粒子を、該選択された治療剤の治療有効量を該哺乳動物に提供するのに有効な量および時間にて、哺乳動物の片目または両目に投与することを含む。

ある態様において、哺乳動物は、優性錐体ジストロフィー、優性錐体桿体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、劣性錐体ジストロフィー、劣性錐体桿体ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、パターンジストロフィー、卵黄状黄斑ジストロフィー、中心性脈絡膜ジストロフィー、スターガルト病、常染色体優性、常染色体劣性およびＸ連鎖網膜色素変性症、バルデー・ビードル症候群に関連する網膜色素変性症、Ｘ連鎖若年性網膜分離症、色覚異常、青錐体１色型色覚、アッシャー症候群タイプＩ、IIおよびIII、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、ポンペ病、フリードライヒ運動失調症、ムコ多糖症（ＭＰＳ）（全ての型）、リソソーム蓄積病（ＬＳＤ）（全ての型）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびアルツハイマー病などの疾患、障害、もしくは状態などの、しかしこれに限られない、疾患、障害、もしくは状態を有する疑いがあるか、それを発症するリスクがあるか、またはそれと診断されている。いくつかの態様において、対象は、遺伝子GUCY2D、GUCY2E、SPATA7、PRPH2、ABCA4、AIPL1、LCA5、RPGRIP1、CRX、CRB1、NMNAT1、CEP290、IMPDH1、RD3、RDH12、TULP1、KCNJ13、GDF6、IQCB1、BBS1、BBS2、ARL6/BBS3、BBS4、BBS5、BBS7、TTC8/BBS8、BBS10、TRIM32/BBS11、BBS12、CCDCC28B、CEP290、TMEM67、MKS1 MKKS、RHO、PRPF31、RP1、NRL、NR2E3、RPGR、RP2、PDE6A、PDE6B、PDE6G、RP25、CNGA1、CNGB1、MAK、RS1、CNGB3、CNGA3、GNAT2、OPN1LW、OPN1MW、CRX、GUCA1A（GCAP1）、GUCA1B（GCAP2）、ABCA4、PROM1およびELOVL4、MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15、USH1G、USH2A、DFNB31またはCLRN1における変異対立遺伝子などの、眼または網膜の疾患、障害もしくは状態に関連するかまたはそれを引き起こす１以上の内因性変異対立遺伝子を有する。

具体的な態様において、置換コード配列が、対象（例として、ヒト）に対し、例として、完全にまたは部分的に、光受容機能を修復すべく、機能性タンパク質、例として、GUCY2DまたはGucy2eを提供するために対象に投与される。いくつかの態様において、対象に（例として、優性錐体桿体ジストロフィーを有するヒトに）本明細書に開示された異種核酸配列を含むrAAV粒子を投与することによって、対象の標的コード配列の、一方または両方の対立遺伝子がサイレンシングされる。具体的な態様において、本明細書に開示されたrAAV粒子を投与することによって、１以上の標的コード配列の内因性変異対立遺伝子がサイレンシングされるかまたは抑制される。

いくつかの態様において、本開示のrAAV核酸ベクターのいずれかの異種核酸配列は、配列番号９または１０から選択されるヌクレオチド配列に対し少なくとも９５％同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一性、または１００％同一性を有する配列を有する。ヒトGUCY2D遺伝子（配列番号９）およびマウスGucy2e遺伝子（配列番号１０）をコードするヌクレオチド配列は、以下に示される。

GUCY2D：
ATGACCGCCTGCGCCCGCCGAGCGGGTGGGCTTCCGGACCCCGGGCTCTGCGGTCCCGCGTGGTGGGCTCCGTCCCTGCCCCGCCTCCCCCGGGCCCTGCCCCGGCTCCCGCTCCTGCTGCTCCTGCTTCTGCTGCAGCCCCCCGCCCTCTCCGCCGTGTTCACGGTGGGGGTCCTGGGCCCCTGGGCTTGCGACCCCATCTTCTCTCGGGCTCGCCCGGACCTGGCCGCCCGCCTGGCCGCCGCCCGCCTGAACCGCGACCCCGGCCTGGCAGGCGGTCCCCGCTTCGAGGTAGCGCTGCTGCCCGAGCCTTGCCGGACGCCGGGCTCGCTGGGGGCCGTGTCCTCCGCGCTGGCCCGCGTGTCGGGCCTCGTGGGTCCGGTGAACCCTGCGGCCTGCCGGCCAGCCGAGCTGCTCGCCGAAGAAGCCGGGATCGCGCTGGTGCCCTGGGGCTGCCCCTGGACGCAGGCGGAGGGCACCACGGCCCCTGCCGTGACCCCCGCCGCGGATGCCCTCTACGCCCTGCTTCGCGCATTCGGCTGGGCGCGCGTGGCCCTGGTCACCGCCCCCCAGGACCTGTGGGTGGAGGCGGGACGCTCACTGTCCACGGCACTCAGGGCCCGGGGCCTGCCTGTCGCCTCCGTGACTTCCATGGAGCCCTTGGACCTGTCTGGAGCCCGGGAGGCCCTGAGGAAGGTTCGGGACGGGCCCAGGGTCACAGCAGTGATCATGGTGATGCACTCGGTGCTGCTGGGTGGCGAGGAGCAGCGCTACCTCCTGGAGGCCGCAGAGGAGCTGGGCCTGACCGATGGCTCCCTGGTCTTCCTGCCCTTCGACACGATCCACTACGCCTTGTCCCCAGGCCCGGAGGCCTTGGCCGCACTCGCCAACAGCTCCCAGCTTCGCAGGGCCCACGATGCCGTGCTCACCCTCACGCGCCACTGTCCCTCTGAAGGCAGCGTGCTGGACAGCCTGCGCAGGGCTCAAGAGCGCCGCGAGCTGCCCTCTGACCTCAATCTGCAGCAGGTCTCCCCACTCTTTGGCACCATCTATGACGCGGTCTTCTTGCTGGCAAGGGGCGTGGCAGAAGCGCGGGCTGCCGCAGGTGGCAGATGGGTGTCCGGAGCAGCTGTGGCCCGCCACATCCGGGATGCGCAGGTCCCTGGCTTCTGCGGGGACCTAGGAGGAGACGAGGAGCCCCCATTCGTGCTGCTAGACACGGACGCGGCGGGAGACCGGCTTTTTGCCACATACATGCTGGATCCTGCCCGGGGCTCCTTCCTCTCCGCCGGTACCCGGATGCACTTCCCGCGTGGGGGATCAGCACCCGGACCTGACCCCTCGTGCTGGTTCGATCCAAACAACATCTGCGGTGGAGGACTGGAGCCGGGCCTCGTCTTTCTTGGCTTCCTCCTGGTGGTTGGGATGGGGCTGGCTGGGGCCTTCCTGGCCCATTATGTGAGGCACCGGCTACTTCACATGCAAATGGTCTCCGGCCCCAACAAGATCATCCTGACCGTGGACGACATCACCTTTCTCCACCCACATGGGGGCACCTCTCGAAAGGTGGCCCAGGGGAGTCGATCAAGTCTGGGTGCCCGCAGCATGTCAGACATTCGCAGCGGCCCCAGCCAACACTTGGACAGCCCCAACATTGGTGTCTATGAGGGAGACAGGGTTTGGCTGAAGAAATTCCCAGGGGATCAGCACATAGCTATCCGCCCAGCAACCAAGACGGCCTTCTCCAAGCTCCAGGAGCTCCGGCATGAGAACGTGGCCCTCTACCTGGGGCTTTTCCTGGCTCGGGGAGCAGAAGGCCCTGCGGCCCTCTGGGAGGGCAACCTGGCTGTGGTCTCAGAGCACTGCACGCGGGGCTCTCTTCAGGACCTCCTCGCTCAGAGAGAAATAAAGCTGGACTGGATGTTCAAGTCCTCCCTCCTGCTGGACCTTATCAAGGGAATAAGGTATCTGCACCATCGAGGCGTGGCTCATGGGCGGCTGAAGTCACGGAACTGCATAGTGGATGGCAGATTCGTACTCAAGATCACTGACCACGGCCACGGGAGACTGCTGGAAGCACAGAAGGTGCTACCGGAGCCTCCCAGAGCGGAGGACCAGCTGTGGACAGCCCCGGAGCTGCTTAGGGACCCAGCCCTGGAGCGCCGGGGAACGCTGGCCGGCGACGTCTTTAGCTTGGCCATCATCATGCAAGAAGTAGTGTGCCGCAGTGCCCCTTATGCCATGCTGGAGCTCACTCCCGAGGAAGTGGTGCAGAGGGTGCGGAGCCCCCCTCCACTGTGTCGGCCCTTGGTGTCCATGGACCAGGCACCTGTCGAGTGTATCCTCCTGATGAAGCAGTGCTGGGCAGAGCAGCCGGAACTTCGGCCCTCCATGGACCACACCTTCGACCTGTTCAAGAACATCAACAAGGGCCGGAAGACGAACATCATTGACTCGATGCTTCGGATGCTGGAGCAGTACTCTAGTAACCTGGAGGATCTGATCCGGGAGCGCACGGAGGAGCTGGAGCTGGAAAAGCAGAAGACAGACCGGCTGCTTACACAGATGCTGCCTCCGTCTGTGGCTGAGGCCTTGAAGACGGGGACACCAGTGGAGCCCGAGTACTTTGAGCAAGTGACACTGTACTTTAGTGACATTGTGGGCTTCACCACCATCTCTGCCATGAGTGAGCCCATTGAGGTTGTGGACCTGCTCAACGATCTCTACACACTCTTTGATGCCATCATTGGTTCCCACGATGTCTACAAGGTGGAGACAATAGGGGACGCCTATATGGTGGCCTCGGGGCTGCCCCAGCGGAATGGGCAGCGACACGCGGCAGAGATCGCCAACATGTCACTGGACATCCTCAGTGCCGTGGGCACTTTCCGCATGCGCCATATGCCTGAGGTTCCCGTGCGCATCCGCATAGGCCTGCACTCGGGTCCATGCGTGGCAGGCGTGGTGGGCCTCACCATGCCGCGGTACTGCCTGTTTGGGGACACGGTCAACACCGCCTCGCGCATGGAGTCCACCGGGCTGCCTTACCGCATCCACGTGAACTTGAGCACTGTGGGGATTCTCCGTGCTCTGGACTCGGGCTACCAGGTGGAGCTGCGAGGCCGCACGGAGCTGAAGGGCAAGGGCGCCGAGGACACTTTCTGGCTAGTGGGCAGACGCGGCTTCAACAAGCCCATCCCCAAACCGCCTGACCTGCAACCGGGGTCCAGCAACCACGGCATCAGCCTGCAGGAGATCCCACCCGAGCGGCGACGGAAGCTGGAGAAGGCGCGGCCGGGCCAGTTCTCTTGA （配列番号９）

Gucy2e：
ATGAGCGCTTGGCTCCTGCCAGCCGGAGGGCTTCCCGGCGCCGGGTTCTGTGTCCCTGCGCGGCAGTCTCCGTCCAGTTTCTCGCGGGTCCTGCGCTGGCCAAGGCCTGGGCTACCGGGACTCCTGCTACTGCTACTGCTCCCATCTCCTTCTGCCCTCTCTGCTGTGTTCAAAGTGGGGGTGCTGGGCCCCTGGGCTTGCGACCCCATCTTTGCACGGGCCCGACCAGACCTGGCTGCGCGTCTGGCCGCCAACCGCCTGAATCGTGACTTTGCTTTAGACGGCGGCCCCCGGTTCGAGGTTGCGCTGCTCCCAGAGCCCTGCCTGACTCCGGGCTCACTAGGGGCTGTGTCCTCTGCGCTGTCTCGAGTCTCTGGCCTGGTGGGTCCGGTGAACCCCGCAGCCTGTCGGCCAGCCGAACTGTTGGCTCAAGAAGCTGGAGTAGCGCTGGTGCCCTGGGGCTGCCCTGGCACGCGGGCGGCGGGTACTACAGCCCCGGCGGTGACCCCCGCTGCAGATGCTCTCTACGTCCTCCTTAGAGCATTCCGCTGGGCGCGCGTGGCCCTGATCACTGCACCCCAAGACCTGTGGGTGGAGGCGGGACGCGCTCTGTCCACAGCACTCAGGGCCCGGGGTTTGCCAGTTGCCCTAGTGACTTCCATGGAGACTTCAGACCGGTCTGGAGCCCGGGAGGCCCTCGGGAGGATCCGAGATGGGCCTAGAGTTAGAGTAGTGATCATGGTGATGCACTCGGTGCTGCTGGGCGGCGAGGAGCAGCGCTACCTACTGGAAGCTGCAGAAGAACTGGCTCTGACTGATGGCTCCCTGGTTTTCCTGCCCTTCGACACGCTTCACTACGCTTTGTCTCCAGGCCCGGAGGCTCTGGCTGCATTTGTCAACAGCTCCCAGCTCCGCAGGGCTCACGATGCGGTGCTCACACTCACGCGCCGCTGTCCTCCTGGAGGCAGCGTGCAAGACAGCCTGCGCAGGGCTCAAGAACACCAGGAACTGCCCCTTGACCTCAACCTGAAGCAGGTCTCTCCGCTGTTTGGCACCATCTATGATGCTGTCTTCCTGTTGGCTGGGGGCGTGAAGAGAGCAAGAACAGCGGTGGGTGGTGGCTGGGTGTCAGGTGCATCTGTAGCCCGCCAAGTACGGGAAGCACAAGTCTCTGGCTTTTGTGGGGTCCTGGGAAGAACCGAGGAGCCCTCCTTTGTGCTGCTGGACACAGATGCATCCGGAGAACAGTTGTTCGCAACACACCTGCTAGATCCTGTCTTAGGCTCCCTGCGTTCTGCAGGGACCCCCATGCACTTCCCTAGAGGTGGACCTGCCCCGGGACCAGACCCTTCCTGCTGGTTCGATCCAGATGTGATCTGCAACGGAGGGGTGGAGCCAGGCCTGGTCTTTGTTGGCTTCCTCCTGGTGATAGGGATGGGACTGACTGGAGCCTTCTTGGCTCATTACTTGAGGCACAGGCTGCTACACATGCAGATGGCTTCCGGCCCCAACAAGATCATCTTGACGTTGGAAGATGTTACTTTCCTCCACCCACCGGGAGGCAGCTCTCGAAAGGTGGTCCAGGGAAGTAGATCCAGTCTGGCTACCCGGAGCGCATCAGACATTCGCAGTGTCCCCAGCCAGCCCCAAGAGAGCACCAACGTTGGCCTCTATGAGGGGGACTGGGTTTGGCTGAAGAAGTTCCCAGGGGAACATCATATGGCTATCAGGCCAGCAACAAAGACAGCCTTCTCCAAGCTTCGAGAGCTCCGGCATGAGAATGTGGCTCTCTACTTGGGACTCTTCCTGGCGGGTACAGCAGACAGCCCTGCCACCCCTGGGGAGGGCATCTTGGCTGTGGTCTCAGAGCACTGTGCTCGGGGTTCCCTCCATGACCTCCTGGCCCAGAGAGAAATAAAGCTGGACTGGATGTTCAAGTCTTCCCTCCTGCTGGACCTCATCAAGGGAATGAGATATCTGCACCATCGCGGTGTGGCCCACGGGAGGCTCAAGTCACGGAATTGCGTGGTGGACGGGAGGTTCGTGCTCAAGGTGACAGATCATGGCCATGGGCGACTGCTGGAAGCGCAAAGGGTGTTACCGGAACCTCCCAGTGCAGAGGATCAGCTATGGACAGCCCCAGAGCTTCTTCGGGACCCCTCCCTGGAGCGCCGGGGAACTCTAGCTGGTGATGTCTTTAGTCTGGCCATCATCATGCAGGAGGTCGTGTGCCGCAGCACCCCTTATGCCATGCTGGAACTAACGCCCGAGGAAGTAATACAGAGGGTGCGGAGCCCTCCTCCACTGTGTCGGCCCTTGGTGTCCATGGACCAGGCACCCATGGAGTGCATCCAGCTGATGACACAATGCTGGGCAGAGCATCCAGAACTTCGGCCTTCCATGGACCTCACCTTTGACCTGTTCAAGAGCATCAACAAGGGCCGGAAGACCAACATCATCGACTCCATGCTTCGGATGCTGGAGCAGTACTCTAGTAACCTGGAGGATCTGATCCGAGAACGCACAGAGGAGTTAGAGCAGGAGAAGCAGAAGACAGACAGGCTGCTCACACAGATGCTGCCTCCATCTGTGGCTGAGGCCCTGAAGATGGGGACATCTGTGGAGCCTGAGTACTTTGAAGAGGTGACACTCTACTTCAGTGACATCGTGGGCTTTACCACCATTTCAGCCATGAGCGAGCCTATTGAGGTGGTAGACCTGCTTAATGACCTCTATACTCTCTTCGATGCCATCATCGGTGCCCATGATGTCTATAAGGTGGAAACAATTGGAGATGCATATATGGTGGCCTCCGGGCTGCCGCAGAGGAACGGGCAGCGGCACGCTGCAGAGATTGCCAACATGTCACTGGACATCCTCAGTGCAGTCGGCTCCTTCCGCATGCGCCATATGCCCGAGGTACCGGTGCGCATCCGCATTGGTTTGCACTCAGGCCCGTGCGTGGCGGGTGTGGTGGGCCTCACCATGCCTCGGTACTGCCTGTTCGGGGACACGGTCAACACTGCCTCGAGAATGGAGTCCACTGGACTGCCTTACCGCATCCACGTTAACATGAGCACTGTTCGGATTCTTCGCGCTCTGGACCAAGGCTTCCAGATGGAGTGTCGAGGCCGCACGGAGCTGAAGGGCAAGGGTATTGAGGACACGTACTGGCTTGTGGGCAGACTTGGCTTCAACAAGCCCATTCCCAAACCACCTGATCTGCAGCCAGGGGCCAGCAACCATGGTATCAGCCTGCAGGAGATTCCCCCAGAGAGACGCAAGAAGCTGGAGAAAGCCAGGCCAGGCCAGTTTACTGGGAAGTGA （配列番号１０）

いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒト対象である。いくつかの態様において、哺乳動物は、非ヒト霊長類対象である。非ヒト霊長類対象の非限定例は、マカク（例として、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、ベルベットモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンを包含する。他の例示の対象は、イヌおよびネコなどの飼育された動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜；ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を包含する。

ある態様において、本明細書に記載のrAAV粒子またはその組成物を哺乳動物の中心窩(例として、中心窩錐体細胞)に網膜下投与するために、方法が提供される。具体的な態様において、網膜下投与の間および／または後に、中心窩の剥離が最小限に抑えられる。具体的な態様において、rAAV粒子の網膜下投与は、中心窩の剥離が全く存在しない中で行われる。

いくつかの態様において、対象に投与されるrAAV粒子の用量は、１０^６～１０^１４粒子／ｍＬまたは１０^３～１０^１３粒子／ｍＬの範囲のオーダー、または、いずれかの範囲についてのその間のあらゆる値、例えば、約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、もしくは１０^１４粒子／ｍＬなどであり得る。一態様において、１０^１３粒子／ｍＬを上回るrAAV粒子が投与される。いくつかの態様において、対象に投与されるrAAV粒子の数は、１０^６～１０^１４ベクターゲノム（ｖｇｓ）／ｍＬまたは１０^３～１０^１５ｖｇｓ／ｍＬの範囲のオーダー、または、いずれかの範囲についてのその間のあらゆる値、例えば、約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、もしくは１０^１４ｖｇｓ／ｍＬなどであり得る。一態様において、１０^１３ｖｇｓ／ｍＬを上回るrAAV粒子が投与される。rAAV粒子は、単回用量として投与することができ、または処置される具体的な疾患または障害の治療を達成するために要求され得るとおり、２以上の投与に分けることができる。いくつかの態様において、０．０００１ｍＬ～１０ｍＬ（例として、０．０００１ｍＬ、０．００１ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．１ｍＬ、１ｍＬ、１０ｍＬ）が、１回用量で対象に送達される。

いくつかの態様において、rAAV粒子力価は、１×１０^１０～５×１０^１３ｖｇ／ｍｌの範囲にわたる。いくつかの態様において、rAAV粒子力価は、１×１０^１０、２．５×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、２．５×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、２．５×１０^１２、５×１０^１２、１×１０^１３、２．５×１０^１３、または５×１０^１３ｖｇ／ｍＬであり得る。いくつかの態様において、粒子力価は、１×１０^１０ｖｇ／ｍＬよりも小さい。いくつかの態様において、rAAV粒子力価は、１×１０^１５ｖｇ／ｍＬよりも大きい。一態様において、rAAV粒子力価は、５×１０^１３ｖｇｓ／ｍＬよりも大きい。いくつかの態様において、rAAV粒子は、本明細書に記載の方法を介して（例として、網膜下または硝子体内に）投与される。

rAAV粒子は、単回用量として投与されることができ、または、具体的な疾患、障害もしくは状態の治療を達成するために要求され得るように、２以上の投与に分けることができる。いくつかの態様において、１～５００マイクロリットルの、この出願に記載の組成物（例として、rAAV粒子を含むもの）が、対象の片目または両目に投与される。例えば、いくつかの態様において、約１、約１０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００または約５００マイクロリットルを各々の眼に投与することができる。しかしながら、いくつかの態様においては、より小さいかまたはより大きい体積が投与されることもあるということが当然理解されるべきである。

いくつかの態様において、本開示は、単独でまたは1以上の他の治療の様式と組み合わせての、および具体的に言うとヒト細胞、組織、およびヒトが罹患する疾患の治療のための、細胞へまたは動物への投与のための薬学的に許容し得る溶液中の本明細書に開示された１以上のrAAVに基づいた組成物の製剤（formulations）を提供する。

所望される場合、本明細書に記載のrAAV粒子は、治療用ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、またはそのバリアントの１以上の全身または局所投与を包含する、例として、タンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な薬剤などの、他の薬剤と組み合わせて、同様に投与され得る。追加の薬剤が標的細胞または宿主組織と接触した際に有意な弊害を引き起こさないことを前提とすれば、事実上は包含され得る他の構成要素に制限はない。rAAV粒子は、よって、具体的な場合に必要に応じて様々な他の薬剤と一緒に送達され得る。かかる組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製されてもよく、または代替的に、本明細書に記載のとおり、化学的に合成されてもよい。

薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の製剤は、例として、網膜下、硝子体内、非経口、静脈内、鼻腔内、関節内、および筋肉内の投与および製剤化を包含する様々な処置計画において、本明細書に記載の具体的な組成物を使用するための好適な投薬および処置計画の開発と同様に、当業者に周知である。

典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％またはそれ以上の治療剤（例として、rAAV粒子）を含有してもよいが、活性成分（単数または複数）のパーセンテージは、もちろん、全製剤の重量または体積の約１または２％と、約７０％または８０％またはそれ以上との間で便宜上変化してもよい。当然ながら、各治療上有用な組成物中の治療剤（単数または複数）（例として、rAAV粒子）の量は、好適な投薬量がいずれかの所定の単位用量の化合物で得られるであろう様式で、調製され得る。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、製品貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的な考慮は、かかる医薬製剤を調製する技術分野における当業者に企図され、および、ひいては、様々な投薬量および処置計画が望ましいものであり得る。

ある状況において、網膜下に、眼内に、硝子体内に、非経口的に、皮下に、静脈内に、脳室内に、筋肉内に、髄腔内に、経口的に、腹腔内に、経口または経鼻吸入によって、または１以上の細胞、組織、または器官への直接注射によってのいずれかで、本明細書に開示された好適に製剤化された医薬組成物中で、本明細書に記載のrAAV粒子（例として、AAV44_9(E531D)カプシドを含むもの）を送達することが望ましいであろう。

注射可能な用途に好適な組成物（例として、本明細書に記載のrAAVを含むもの）の医薬品形態は、滅菌水性溶液または分散体を包含する。いくつかの態様において、形態は、滅菌され、および容易な通針性（syringability）が存在する程度に流動性である。いくつかの態様において、形態は、製造及び保管の条件下で安定であり、および、細菌および真菌などの微生物の混入作用に抗して保存されている。担体は、例えば、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、好適なそれらの混合物、および／または植物油を含有する、溶媒または分散媒体とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合の要求される粒子サイズの維持によって、および、界面活性剤の使用によって、維持され得る。

用語「担体」は、本明細書に記載のとおりのrAAV粒子と一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は、水および油などの滅菌された液体（鉱油などの石油、落花生油、大豆油、およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成起源の油のそれらを包含する）とすることができる。生理食塩水溶液および水性のデキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として採用することができる。

本開示の組成物は、種々のルートを通じて眼に送達されることができる。それらは、眼への局所投与により、または、例えば、硝子体（硝子体内注射）もしくは網膜下（網膜下注射）光受容器間空間内への眼内注射により、眼内送達されてもよい。いくつかの態様において、それらは桿体光受容細胞に送達される。代替的に、それらは、眼を取り囲む組織中へと挿入または注射により局部的に送達されてもよい。それらは、経口ルートを通じてまたは皮下、静脈内もしくは筋肉内注射によって、全身的に送達されてもよい。代替的に、それらは、カテーテルの手段によって、またはインプラントの手段によって送達されてもよく、ここで、かかるインプラントは、シラスティック膜などの膜または繊維、生分解性ポリマー、またはタンパク性材料を包含する、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の材料から作られる。それらは、状態の発症に先立ってその発生を予防するために、例えば、眼の手術の間に、投与されることができ、あるいは、病的状態の発症の直後に、または急性のもしくは長引いた状態の発生の間に投与されることができる。

注射可能な水性溶液の投与のために、例えば、溶液は、好適に緩衝化され得、必要ならば、液体希釈剤が、充分な生理食塩水またはグルコースを用いて、最初に等張性にされる。これらの具体的な水性溶液は、静脈内、筋肉内、硝子体内、皮下および腹腔内の投与にとくに好適である。この文脈では、使用され得る滅菌された水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知であろう。例えば、１投薬量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、および、１０００ｍｌの皮下注入液に添加されるか、または、注入の提案部位において注射されるか、のいずれかである（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035～1038頁および1570～1580頁を参照）。投薬量におけるいくつかのバリエーションは、処置される対象の状態に応じて、必然的に発生するだろう。投与を担う人は、いずれの事象においても、個々の対象について適切な用量を決定するだろう。その上、ヒト投与のために、調製物は、無菌状態、発熱性、ならびに例として、ＦＤＡの生物製剤規格室（Office of Biologics standards）によって要求される、一般的な安全性および純度標準を満たすべきである。

滅菌された注射可能な溶液は、本明細書に記載のとおりのrAAV粒子を、上に列挙された他の成分のいくつかと共に、要求される量で、適切な溶媒中に組み込み、これに続きフィルター滅菌ことによって調製され得る。一般に、分散体は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体と上に列挙されたものからの要求される他の成分とを含有する滅菌されたビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技法であり、これは、これまでに滅菌ろ過されたそれらの溶液からの、活性成分およびいずれかの追加の所望される成分の粉末を生産する。

組成物（例として、本明細書に記載のrAAVを含むもの）の量、ならびにかかる組成物の投与の時間は、本発明の教示の利益を有する当業者のプレビューの範囲内であろう。しかしながら、治療的に有効量の、開示された組成物の投与は、単一の投与、例えば、かかる処置を受ける患者に治療上の利益を提供するのに充分な数のrAAV粒子の単一の注射によって達成され得るであろう。代替的に、いくつかの状況において、組成物の複数回のまたは連続する投与を、かかる組成物の投与を監視する医師によって決定され得るように、相対的に短い期間、または相対的に長い期間のいずれかで提供することが望ましいことであり得る。

いくつかの態様において、この出願に記載された１以上の組成物を投与した後、視力を維持または修復することができる（例として、部分的にまたは完全に）。いくつかの態様において、この出願に記載された１以上の組成物を投与した後、１以上の光受容細胞または１以上のＲＰＥ細胞が部分的にまたは完全に保存され得、および／または、桿体および／もしくは錐体に媒介される１以上の機能が部分的にまたは完全に修復され得る。

用語として、疾患を「処置する」とは、対象によって経験される疾患、障害もしくは状態（例として、錐体桿体ジストロフィー）の兆候または症状の少なくとも１つの頻度または重症度を低減させることを意味する。上に記載の組成物は、典型的には、有効量、つまり、望ましい結果を生じることができる量で対象に投与される。望ましい結果は、投与される活性な薬剤に依存することになる。例えば、有効量のrAAV粒子は、異種核酸を宿主の器官、組織または細胞に移入させることができる粒子の量であり得る。

本開示の方法において利用される組成物の毒性および有効性は、ＬＤ_５０（集団の５０％に致死的な用量）を決定するために、培養細胞または実験動物のいずれかを使用して、標準的な医薬手順によって決定することができる。毒性と有効性との間の用量比率は、治療的指標であり、およびそれは、比率ＬＤ_５０／ＥＤ_５０によって表すことができる。大きい治療的指標を示す組成物が好ましい。毒性の副作用を示すものを使用してもよいが、かかる副作用の潜在的な損傷を最小化する送達系を設計するように注意すべきである。本明細書に記載の組成物の投薬量は、一般に、毒性がほとんどないかまたは毒性が全くないＥＤ５０を包含する範囲内である。投薬量は、使用される剤形および利用される投与ルートに依存して、この範囲内で変化し得る。

例
以下の例は、本発明の好ましい態様を実証するために包含される。当業者には、以下の例に開示される技法が、本発明の実施において良好に機能するものとして本発明者に発見された技法を表し、および、よって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えてよいということが当然理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の態様には多くの変更がなされ、およびそれでもなお似たようなまたは類似の結果が本発明の精神および範囲から逸脱することなく得られてもよいということを当然理解すべきである。

例１ － AAVに基づいた網膜遺伝子治療のための治療用分子
硝子体内（Ivt）または網膜下（SR）注射の後に続いて、AAV44.9の網膜形質導入および指向性を評価した。全ての桿体光受容器におけるGFPの構成的発現を伴うマウスモデル（Nrl-GFP Ｓマウス）を利用することによって、AAV44.9ならびにベンチマークのカプシドAAV5およびAAV8(Y733F)について光受容器形質導入効率を定量化した。

残基７３３でのＹ－Ｆ突然変異（Y733F）、および別途の位置５３１でのグルタミン酸からアスパラギン酸への置換（E531D）を加えることによってAAV44.9の形質導入を改善させることができたかどうかを決定することを探求した。錐体光受容器が多くの網膜遺伝子治療（例として、色覚異常および錐体桿体ジストロフィー）の標的であることから、AAV44.9の錐体光受容器において導入遺伝子を発現させる能力を評価した。

実験方法
AAVカプシド系統樹が、図１に示される。AAVについてのVP1アミノ酸配列を、ClustalW (AlignX-Vector NTI)を使用してアラインメントした。アラインメントを、次いで、EMBL-EBI Simple Phylogenyプログラム（ebi.ac.uk/Tools/phylogeny/simple_phylogeny/）を使用した近隣結合法を介して系統樹を生成するために使用した。結果としてもたらされたツリーを、TreeViewプログラムを使用して視覚化し、および、AAV5を外群として指定した。

ベクター生産
二段積みセルファクトリー中に播種された接着性HEK293T（１，２７２ｃｍ2細胞増殖面積）においてトリプルトランスフェクションプラスミドに基づいた系を使用して、短縮キメラＣＭＶ－ニワトリベータアクチン（smCBA）プロモーター駆動mCherryを含有する自己相補的AAVコンストラクト（sc-smCBA-mCherry）をAAV44.9、AAV5およびAAV8(Y733F)中へとパッケージングさせた。細胞を収穫し、および連続的な凍結融解サイクルによって溶解させた。溶解物中のウイルスをイオジキサノール密度勾配によって精製し、および、Tween 20（０．０１４％）添加Alcon BSSへと緩衝液交換した。ウイルスを、標準に対して相対的にｑＰＣＲによって力価決定し、および－８０℃で保管した。Y733FおよびE531D置換を加えることは、AAV2rep-44.9capプラスミドの部位指定突然変異誘発によって成し遂げられ、およびサンガーシーケンシングによって確認された。錐体特異的なRBPe-GNAT2キメラプロモーター駆動緑色蛍光タンパク質（GFP）を含有するさらなるコンストラクトを、AAV44.9中にパッケージングさせた。

In-vitro形質導入アッセイ
ARPE-19（ヒト網膜色素上皮細胞株）および661W（マウス錐体細胞株）細胞を、９６ウェルプレート中に１．０×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種した。翌日、細胞を、１０，０００ｐ／細胞で感染させた。感染３日後、固定された露光での蛍光顕微鏡検査を行い、細胞を切り離し、および、蛍光を介してレポータータンパク質発現（mCherry）を定量化するためにフローサイトメトリーを使用した。平均mCherry蛍光に陽性細胞の数を乗算することによってmCherry発現を算出した。グラフは、発現レベルから細胞のみのレベルを差し引いたものを表す。

注射
１μｌ中の２×１０^９ｖｇのベクター含有溶液を、硝子体内または網膜下のいずれかで４～５週齢Nrl-GFPおよびC57BL/6Jマウスに送達させた。各実験において、成功した注射を受けた最低６つの眼を分析した。

眼底検査
注射４週間後に、Micron IIIカメラ（Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA）を使用した眼底検査を行った。明視野および赤色蛍光像を、それぞれ網膜の健康状態およびmCherry発現を視覚化するために取った。露光設定は実験間で一定であり、および図の凡例に示される。

フローサイトメトリーを介した網膜形質導入の測定
コホートあたり４～６のNrl-GFPの眼から神経網膜（網膜から手作業でＲＰＥを剥ぎ取った）を収穫し、および、パパインで解離させた。処置され解離させられた網膜および未処置の対照について、GFPに対して陽性であった細胞（桿体光受容器）、mCherryに対して陽性であった細胞（rAAVによって形質導入された非桿体網膜ニューロン）、または両方に対して陽性であった細胞（rAAVによって形質導入された桿体光受容器）の割合を定量化するためにフローサイトメトリーを行った。各ベクターによって形質導入された桿体および非桿体神経網膜細胞の割合を、別々に平均した。

組織標本および免疫染色
注射４週間後、眼を除核し、新たに調製したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で終夜４℃にて固定した。角膜と水晶体を除去し、および、眼杯（eye cup）を３０％スクロース溶液中で終夜４℃にてインキュベートした。眼をクライオスタットコンパウンド中に埋め込み、および－８０℃にて凍結させた。クライオスタット（Leica Microsystem, Buffalo Grove, IL）を使用して切片（厚さ１２μｍ）を切り取り、およびガラススライドへ移した。網膜凍結切片を１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い流し、０．５％Triton-X100および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて各１時間ブロッキングし、および次いでマウスモノクローナル抗錐体アレスチン抗体（１：１０００、Dr Clay Smithによりご厚意で提供された）を用いて終夜４℃にてインキュベートした。翌日、スライドを１×ＰＢＳで洗い流し、および次いで１×ＰＢＳ中のAlexa Fluorロバ抗マウス二次抗体（１：５００）を用いて１時間室温にてインキュベートし、およびDAPIで対比染色した。共焦点レーザー顕微鏡（Leica TCS SP8）および蛍光顕微鏡（EVOS）を使用して画像を取得した。

結果
AAV44.9による桿体の形質導入は、ベンチマークのベクターAAV5およびAAV8(Y733F)のそれよりも大きい
網膜下注射の４週間でのAAV44.9、AAV5およびAAV8(Y733F)の質的および量的分析が、図２Ａ～２Ｅに示される。図２Ｅに描かれたＦＡＣＳデータは、２×１０^９ｖｇでの網膜下注射の後に続いてAAV5およびAAV8(Y733F)よりもAAV44.9の方がより効率的に桿体を形質導入させたということを示す。AAV5、AAV8(Y733F)、およびAAV44.9を注射されたNrl-GFPマウス網膜における光受容器およびＲＰＥにおけるmCherry発現を示す代表的な網膜横断面像が、網膜下注射の４週間後での図３Ａ～３Ｃに示される。

AAV44.9(Y733F)およびAAV44.9(E531D)の質的および量的分析が、図４Ａ～４Ｃに示される。図４Ｃに描かれたＦＡＣＳデータは、２×１０^９ｖｇでの網膜下注射の後に続いてAAV44.9およびAAV44.9(Y733F)よりもAAV44.9(E531D)の方がより効率的に桿体を形質導入させたということを示す。AAV44.9(Y733F)およびAAV44.9(E531D)を注射されたNrl-GFPマウス網膜においての主に光受容器およびＲＰＥにおけるmCherry発現を示す代表的な網膜横断面像が、網膜下注射の４週間後での図５Ａおよび図５Ｂに示される。

眼細胞株における改良されていないAAV44.9およびAAV44.9(Y733F)の形質導入効率が、図６Ａおよび６Ｂに示される。AAV44.9(Y733F)は、マウス錐体光受容細胞株においてAAV44.9に対して相対的に形質導入増加を見せたが（図６Ａ）、その一方で、AAV44.9は、ヒトＲＰＥ細胞株においてAAV9(Y733F)よりもより効率的であった（図６Ｂ）。

硝子体内注射の後に続くAAVカプシドの質的分析が、図７Ａおよび７Ｂに示される。AAV5およびAAV8(Y733F)に似て、AAV44.9およびその誘導体は、Ivt注射の後に続いて効率的な網膜形質導入に導くことはない。

錐体優先的なIRBP/GNAT2プロモーターおよびGFPレポーターを含有するAAV44.9は、ＳＲ注射の４週間後、図８Ａにおける錐体細胞中のGFP発現を示す。図８Ｂおよび８Ｃもまた、錐体アレスチン抗体を用いた共染色がGFP蛍光とともに共局在化するということを示す。

上で議論された結果は、AAV44.9による桿体の形質導入が、ベンチマークのベクターである改良されていないAAV5およびAAV8(Y733F)のそれよりも大きかったということを示す。AAV44.9にY733Fを加えることは、in vivoで光受容器の形質導入を改善しなかった。結果はまた、改良されていないAAV44.9についての６１％の形質導入と比較してAAV44.9(E531D)が８２％の桿体形質導入を見せており、E531D突然変異が光受容器形質導入を大きく増加させたということも示す。AAV44.9-IRBPe/GNAT2-GFPの網膜下送達によって示されるとおり、AAV44.9は、錐体細胞を効率的に形質導入させる。AAV5およびAAV8(Y733F)に似て、AAV44.9およびその誘導体は、Ivt送達の後に続いて網膜を効率的に形質導入させることはない。

AAV44.9(E531D)は、網膜下注射の後に続いてマウス網膜において、改良されていないAAV44.9およびAAVrh.8をしのぐ
Nrl-GFPマウスの代表的な眼底像（赤色蛍光フィルター）を、AAV44.9またはAAV44.9(E531D)での網膜下注射４週間後に取った（図９Ａを参照）。ベクターは、１μＬ中の２×１０^９ｖｇで送達された。露光およびゲインの設定は、実験の間にわたって一貫していた。実験は、結果を確認するために２回繰り返された。「繰り返し」実験は異なるロットのウイルスを用いて行われたということに留意されたい。

注射４週間後に、Nrl-GFPマウス（図９Ａにおける実験からの同じマウス）の網膜をパパインで解離させ、および、Boye et al., Impact of Heparan Sulfate Binding on Transduction of Retina by Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors, J. Virol. 2016, 90(8):4215-4231に記載されているとおり、形質導入された桿体（GFP＋mCherry陽性）または非桿体細胞（mCherry陽性）の割合を定量化するためにフローサイトメトリーを行った。各細胞集団の形質導入百分率および対応する値が、図９Ｂに示される。AAV44.9(E531D)は、改良されていないAAV44.9に対して相対的により高い割合の桿体光受容器を形質導入させた。「繰り返し」実験は異なるロットのウイルスを用いて行われたということに留意されたい。

Nrl-GFPマウスの代表的な眼底像を、AAVrh.8-mCherryでの網膜下注射４週間後に取った（図１０Ａを参照）。ベクターは、１μＬ中の２×１０^９ｖｇで送達された。GFPおよびmCherryでフィルターされた両方の像が包含される。AAVrh.8が、そのAAV44.9およびAAV44.9(E531D)の両方との構造類似性に起因して評価された。

注射４週間後に、Nrl-GFPマウス（図９Ａおよび１０Ａにおける実験からの同じマウス）の網膜をパパインで解離させ、および、形質導入された桿体（GFP＋mCherry陽性）または非桿体細胞（mCherry陽性）の割合を定量化するためにフローサイトメトリーを行った。各細胞集団の形質導入百分率および対応する値が、図１０Ｂに示される。AAV44.9(E531D)は、改良されていないAAV44.9またはAAVrh.8に対して相対的により高い割合の錐体光受容器を形質導入させた。

Nrl-GFPマウスの代表的な眼底像を、より低い力価のscAAV44.9、scAAV44.9(E531D)、またはscAAVrh.8での網膜下注射４週間後に取った（図１１Ａを参照）。ベクターは、１μＬ中の２×１０^８ｖｇで送達された。露光およびゲインの設定は、実験の間にわたって一貫していた。

注射４週間後に、Nrl-GFPマウス（図１１Ａにおける実験からの同じマウス)の網膜をパパインで解離させ、および、形質導入された桿体（GFP＋mCherry陽性）または非桿体細胞（mCherry陽性）の割合を定量化するためにフローサイトメトリーを行った。各細胞集団の形質導入百分率および対応する値が、図１１Ｂに示される。AAV44.9(E531D)は、改良されていないAAV44.9またはAAVrh.8に対して相対的により高い割合の錐体光受容器を形質導入させた。

網膜下注射の４週間後のAAVrh.8、AAV44.9およびAAV44.9(E531D)の質的および量的分析が、図９Ａおよび９Ｂに示される。図９Ｂは、２×１０^１２ｖｇでの網膜下注射の後に続いてAAV44.9よりもAAV44.9(E531D)の方がより効率的に桿体細胞を形質導入させたということを示すFACSプロットを描く。

網膜下注射の４週間後の、より低い力価でのAAV44.9、AAV44.9(E531D)、およびAAVrh.8の質的および量的分析が、図１１Ａおよび１１Ｂに示される。図１１Ｂは２×１０^１１ｖｇでの網膜下注射の後に続いてAAV44.9(E531D)およびAAVrh.8よりもAAV44.9(E531D)の方がより効率的に桿体細胞を形質導入させたということを示すFACSプロットを描く。網膜下注射の６週間後の、錐体特異的なIRBPe-GNAT2キメラプロモーターの文脈における、AAV44.9(E531D)およびAAV44.9の質的分析が、図１２に示される。

AAV44.9(E531D)-IRBP/GNAT2-hGFPでの網膜下注射６週間後に取られたＷＴマウスの代表的な網膜横断面が、図１３に示される。IRBP/GNAT2プロモーターは、錐体特異的なプロモーターである。ベクターは、１μＬ中の２×１０^１２ｖｇで送達された。断面は、GFP（緑色）および錐体アレスチン（赤色）に対して産生された抗体で免疫染色された。AAVに媒介されるGFP発現は、錐体アレスチン（錐体特異的マーカー）とともに共局在化しており、このベクターが効率的に錐体を形質導入させたということが確認された。図１３における代表的な網膜横断面像は、AAV44.9(E531D)を注射されたNrl-GFPマウス網膜における光受容器およびＲＰＥにおける錐体アレスチン発現を示し、および、AAV44.9(E531D)が錐体を極めて効果的に形質導入させるということを示す。

WTマウスの代表的な網膜横断面を、AAV44.9-IRBP/GNAT2-hGFPでの網膜下注射６週間後に取った（図１４を参照）。IRBP/GNAT2プロモーターは、錐体特異的なプロモーターである。ベクターは、１μＬ中の２×１０^１２ｖｇで送達された。断面は、GFP（緑色）および錐体アレスチン（赤色）に対して産生された抗体で免疫染色された。AAVに媒介されるGFP発現は、錐体アレスチン（錐体特異的マーカー）とともに共局在化し、このベクターが効率的に錐体を形質導入させるということが確認される。

例２ － マカクにおけるAAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPの網膜下投与の後に続く増強された側方への広がりおよび中心窩形質導入
ヒトロドプシンキナーゼ（hGRK1）プロモーターが、非ヒト霊長類の錐体および桿体において専用の活性を有するということが、以前に決定された。ひいては、改善されたAAV44.9(E531D)ベクターにおいて、マカクの眼におけるGFPレポーター発現を駆り立てるその能力についてhGRK1プロモーターを評価した。当初のブレブ境界からの側方への広がりの度合いもまた評価した。

２つのrAAVベクター、AAV44.9-hGRK1-GFPおよびAAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPを、マカクの眼に網膜下投与した。ベクターは、１×１０^１２ｖｇ／ｍＬの濃度で送達された。対照ベクターのAAV5-hGRK1-GFPもまた、眼に投与された。

改良されたおよび改良されていないAAV44.9ベクターの両方とも、組み込んだ粒子が、網膜下注射されたマカク対象における増強された側方への広がりおよび効力を呈した（図１５を参照）。ブレブの当初の境界および結果としてもたらされたGFP発現の境界が、図１５において白い点線で概説されている。同一の脈管構造は、参考のために太い濃い線でハイライトされている。注射１週間後に、AAV44.9(E531D)によって媒介されるGFP発現が視認可能であった。AAV44.9およびAAV44.9(E531D)は両方とも、１×１０^１２ｖｇ／ｍＬの用量で霊長類の網膜において良好な耐容性を示した。対照ベクターであるAAV5は、元々の注射ブレブ内に閉じ込められたままであったGFPの制限を媒介した。

AAV44.9-hGRK1-GFP（１×１０^１２ｖｇ／ｍＬの濃度）の中心窩外網膜下注射をマカク対象において行った。OCTスキャンは、注射の間に中心窩が剥離されなかったということを明らかにした（図１６）。この中心窩外網膜下注射では、中心窩が剥離しなかったものの、中心窩錐体の９８％を一様に、および、中央の桿体の１００％を、形質導入させた（図１７の上部右を参照）。ブレブ境界が当初の境界に対して相対的に広がったことから、カプシドは、増強された側方への広がりを呈した。

AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPを注射されたマカクの眼からもまた、像を撮った。単一の眼における質的分析は、AAV44.9(E531D)によって媒介された、およそ５０％の中心窩錐体形質導入を明らかにした。

AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPの３つの網膜下注射（各３０μＬ）を、マカクの眼の中心窩の外部の上部網膜、側頭網膜、および下部網膜において行った。錐体アレスチンに対して向けられた抗体で網膜断面を染色し、および、３人の盲検化されたオブザーバーが、中心窩の窪みを横切る単一平面にわたる５つの網膜領域の中のGFP陽性の錐体および桿体の数を数えた。この投与の結果は、図１９に示される。OCTスキャンは、注射の間に中心窩が剥離されなかったということを明らかにした（図１９の右のパネルを参照）。

これらの結果は、AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFPのマカクにおける中心窩外網膜下注射が、中心窩の剥離の存在しない中で、中央の錐体および桿体細胞の顕著な形質導入を呈したということを示す。周中心窩の桿体および錐体もまた、極めて効率よく形質導入された。したがって、中心窩外網膜下注射は、中心窩領域にわたる高効率の形質導入を結果としてもたらした。

図２０Ａ～２０Ｄに示されるとおり、この注射の後に続く傍中心窩の検査は、AAV44.9(E531D)粒子が、中心窩の窪みに対し鼻側および側頭側の両方の場所の傍中心窩錐体を形質導入させた、ということを明らかにした。注目すべきことに、しかしながら、傍中心窩錐体形質導入は、改良されていないAAV44.9では達成されなかった。この知見は、少なくとも、ｉ）傍中心窩錐体は種々のAAVカプシドバリアントによる形質導入に反応しないため、およびii）加齢および先天性網膜疾患に起因する最も早い構造及び機能の損失はしばしば傍中心窩領域において起こるため、という理由で興味深い。この領域における錐体を形質導入させるそれらの能力の非類似性にもかかわらず、改良されたおよび改良されていないAAV44.9ベクターは、実質的に同等の程度まで傍中心窩桿体を効率的に形質導入させた。

図２１Ａ～２１Ｂに示されるとおり、周中心窩の検査は類似のパターンを明らかにした：AAV44.9(E531D)カプシドを組み込んだ粒子は周中心窩錐体を形質導入させたが、しかし改良されていないAAV44.9はそうしなかった。周中心窩桿体はこの領域において両方のカプシドによって効率的に形質導入された。周中心窩領域は、傍中心窩の周囲に境界線をなす。

これらの結果は、改善されたAAV44.9(E531D)カプシドバリアントベクターによって提供される、形質導入の増強された側方への広がりによって、傍中心窩領域における網膜下注射がヒト対象における中心窩剥離の誘発の有害な効果を避けながら中心窩細胞の形質導入を生じさせることを可能にし得るということをさらに実証する。

例３ － マウスにおけるAAV44.9-Gucy2e-GFPの網膜下投与の後に続く増強された側方への広がり
以前の例は、改善されたAAV44.9(E531D)ベクターによって送達されたレポーター遺伝子の中心窩形質導入を実証した。興味の対象の治療用ペプチドをコードする改善されたAAV44.9(E531D)ベクターの投与の後に続く、側方への広がりの度合いを、次に決定した。選択された興味の対象の治療用ペプチドは、ヒトグアニル酸シクラーゼ２ＤであるGUCY2Dのマウスホモログ、Gucy2eであった。

２つのベクター、AAV44.9(E531D)-hGRK1-GUCY2eおよびAAV8(Y733F)-hGRK1-GUCY2e、を、網膜グアニル酸シクラーゼ１／２ダブルノックアウト（GCdko）マウスの眼に網膜下投与した。GCdkoマウスには、網膜機能の完全な欠如がある。これらの光受容器においては、機能している網膜グアニル酸シクラーゼが全く存在しないことに起因して、桿体も錐体も光に応答することができない。GCdkoマウスにおいて行われた遺伝子置換療法は、したがって、遺伝子置換／補充が桿体および錐体細胞において同時に成功するかどうかを評価することができる。ベクターは、１×１０^１３ｖｇ／ｍＬの濃度で送達された。処置されたおよび未処置の眼の応答機能を、網膜電位（ＥＲＧ）測定によって評価した。網膜の光受容細胞からのＥＲＧ応答は「ａ波」と称され、および網膜の双極細胞からの電気的応答は「ｂ波」と称される。

図１８Ｂに示されるとおり、AAVベクターで処置された眼からの錐体細胞の光応答機能は、未処置の眼のそれらに対して相対的に改善された。これらの結果は、両方のクラスの光受容器が、AAV44.9(E531D)カプシドおよびAAV44.9(Y733F)カプシドを組み込んだrAAV粒子によって効率的に標的化されたということを示す。図１８Ａに示されるとおり、最大のａおよびｂ波の振幅は、AAV44.9(E531D)ベクターよりもAAV(Y733F)ベクターの投与の後の方が大きかった。

この実験のもう一つの主要な意義は、AAV44.9(E531D)を組み込んだ先天性網膜疾患を処置するために設計された治療用ペプチドを発現させる臨床候補rAAVベクター（例として、ヒトGUCY2D導入遺伝子の送達のためのベクター）が、それぞれの該疾患のマウスモデル（例として、マウスGucy2eの送達のためのベクター）において働く確率が高いということである。これは、製造の様々な段階もしくはフェーズの間における様々な多くの候補薬物の前臨床開発および評価の文脈において有利である。

他の態様
本明細書に記載の例および態様は例証目的のためのみのものであり、ならびに、それらに照らして様々な改良または変更が当業者に示唆され得、そして本出願および添付の請求の範囲の精神および視野の内に包含されることとなる、ということが理解されるべきである。本明細書に引用されている出版物、特許出願および出願を含む全ての参考文献は、各参考文献が参照により援用されることが個別かつ具体的に示されかつ本明細書中にそれら全体が規定されたとした場合と同程度に参照により本明細書に援用される。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書に別様に示されていない限り、該範囲内にある各々の別々の値に個別に言及する簡単な方法としての役割を果たすことを意図したものにすぎず、および、各々の別々の値は、それが個別に本明細書に記述されていたかのように明細書中へと援用される。

要素もしくは複数の要素を参照した「含む」、「有する」、「包含する」または「含有する」などの用語を使用する、発明のあらゆる側面または態様の本明細書の記載は、別様に述べられていない限りまたは文脈により明らかに矛盾していない限り、具体的な要素もしくは複数の要素「からなる」、「から本質的になる」または「実質的に含む」発明の類似の側面または態様のためのサポートを提供することが意図される（例として、具体的な要素を含むものとして本明細書に記載された組成物は、別様に述べられていない限りまたは文脈により明らかに矛盾していない限り、その要素からなる組成物をもまた記載しているものとして理解されるべきである）。

本明細書に開示されおよびクレームされる全ての組成物および方法は、本開示に照らして過度の実験がなくとも成し得および実行し得る。この発明の組成物および方法は、好ましい態様の観点で記載されているが、発明の構想、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法に、および方法の一連のステップにおけるステップ中に変形が適用され得ることが当業者には明白である。より具体的に言うと、化学的におよび／または生理学的に関連しているある剤が、本明細書に記載の剤に置き換えられつつそれと同じかまたは類似の結果を達成してもよいことは明白である。当業者に明白な全てのかかる類似の置き換えおよび改良は、添付の請求項によって定義されたとおりの発明の精神、範囲および構想の範囲内であると見なされる。

Claims (25)

1. 配列番号３のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）粒子であって、異種核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、前記rAAV粒子。
2. 異種核酸配列が、光受容細胞または網膜色素上皮細胞における該異種核酸配列の発現を指揮する調節配列に作動可能に連結している、請求項１に記載のrAAV粒子。
3. 異種核酸配列が、１以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接している、請求項１または２に記載のrAAV粒子。
4. VP1、VP2、およびVP3カプシドタンパク質を含み、ここで、VP1タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、VP2タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、および／または、VP3タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のrAAV粒子。
5. ポリヌクレオチドが、哺乳動物の目の１以上の光受容細胞または網膜色素上皮細胞において核酸配列を発現させることを可能とするプロモーターに作動可能に連結している診断または治療剤をコードする異種核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のrAAV粒子。
6. 異種核酸配列が、ポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合フラグメント、またはそれらのいずれかの組み合わせをコードする、請求項５に記載のrAAV粒子。
7. 異種核酸配列が、ヒトロドプシンキナーゼ（hGRK1）プロモーターに作動可能に連結している、請求項１～６のいずれか一項に記載のrAAV粒子。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のrAAV粒子を含み、１以上の薬学的に許容し得る担体、緩衝液、希釈剤または賦形剤をさらに含む、組成物。
9. 配列番号１、２、および／または３のアミノ酸配列を含む、カプシドタンパク質。
10. 配列番号４、５、および／または６の核酸配列を含む、核酸。
11. プラスミドまたはウイルスベクターの中に含まれている、請求項１０に記載の核酸。
12. 請求項９に記載のカプシドタンパク質または請求項１０に記載の核酸を含む、細胞。
13. 哺乳動物または昆虫の細胞である、請求項１２に記載の細胞。
14. 哺乳動物の光受容細胞または網膜色素上皮細胞を形質導入させるための方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載のrAAV粒子または請求項８に記載の組成物を哺乳動物の片目または両目に投与することを含む、前記方法。
15. 選択された治療剤の治療有効量を、それを必要とする哺乳動物に提供するための方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載のrAAV粒子または請求項８に記載の組成物を、該選択された治療剤の治療有効量を該哺乳動物に提供するのに有効な量および時間にて、哺乳動物の片目または両目に投与することを含む、前記方法。
16. 哺乳動物における疾患、障害、機能不全、損傷、状態、または外傷の症状を処置するかまたは和らげるための方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載のrAAV粒子または請求項８に記載の組成物を、哺乳動物における疾患、障害、機能不全、損傷、状態、または外傷の症状を処置するかまたは和らげるのに十分な量および時間にて、それを必要とする哺乳動物の片目または両目に網膜下もしくは硝子体内投与することを含む、前記方法。
17. 哺乳動物の１以上の光受容細胞またはＲＰＥ細胞において核酸セグメントを発現させるための方法であって：哺乳動物の１以上のＰＲ細胞またはＲＰＥ細胞において治療剤を生産するのに有効な時間の間、請求項１～７のいずれか一項に記載のrAAV粒子または請求項８に記載の組成物を哺乳動物の片目または両目に網膜下もしくは硝子体内投与することを含む、ここでrAAV粒子は、少なくとも治療剤をコードする第１の異種核酸配列に作動可能に連結しているＰＲもしくはＲＰＥ細胞特異的プロモーターを含む少なくとも第１のポリヌクレオチドを含んだポリヌクレオチドを含む、前記方法。
18. 哺乳動物が、ヒトである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ヒトが、網膜障害、網膜疾患、網膜ジストロフィー、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するか、それを有する疑いがあるか、それを発症するリスクがあるか、またはそれと診断されている、請求項１８に記載の方法。
20. 治療剤の生産が、ａ）１以上の光受容細胞または１以上のＲＰＥ細胞を保存する、ｂ）桿体および／もしくは錐体に媒介される１以上の機能を修復する、ｃ）片目または両目において視覚挙動を修復する、またはｄ）これらのいずれかの組み合わせとなる、請求項１９に記載の方法。
21. 哺乳動物の片目または両目へのrAAV粒子の初回投与の後に続いて実質的に少なくとも３か月の期間の間、１以上の光受容細胞または１以上のＲＰＥ細胞において治療剤の生産が持続する、請求項２０に記載の方法。
22. 請求項１～７のいずれか一項に記載のrAAV粒子または請求項８に記載の組成物を哺乳動物の中心窩に網膜下投与することを含む、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 中心窩の剥離が最小限に抑えられる、請求項２２に記載の方法。
24. 異種核酸配列が、GUCY2Dを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のrAAVベクター。
25. 異種核酸配列が、配列番号９に規定された配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のrAAVベクター。

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