JP2022521079A - 止血酵素及びカルボキシメチルキトサンを含む血液凝固検査用組成物及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
大韓民国特許第10-1801150号に開示された方法で組換えバトロキソビン発現ベクターを構築して分離及び精製した後、冷蔵庫(2~8℃)に保管して後の分析に活用した。
2-1.血漿凝塊時間の確認
ヒト血漿(Innovative Reserch,米国)を購入して1mlずつ分注して凍結しておいた。測定時に37℃で迅速に溶かして用いた。
フィブリノゲン(Sigma,米国)を購入し、2mg/ml濃度で溶かした。
ヒトフィブリノゲンを2mg/mLの濃度に溶かし、バッファー又はCMCSを入れてよく混ぜた後、rTLHを入れて反応させた。反応時間は10~30秒までにし、反応が終わると直ちに5X SDS-PAGE試料バッファーを入れ、100℃で5分間加熱して反応を終えた。サンプルは、12%SDS-PAGEゲルにローディングして2時間電気泳動し、ゲルはクマシーブルー(coomassie blue)で染色した。
トロンビン基質であるS-2238(hyphen,米国)を購入し、20mMの濃度に溶かした。rTLH活性測定時の最終濃度を25、50、100、200、400uMにして測定し、希釈するために100mM Tris-Hcl、pH6.8を添加した。
ラット全血(Rat whole blood)を購入して使用した。
実施例1で製造した組換えバトロキソビン2.5BU/ml又は5BU/mlを含み、カルボキシメチルキトサン10mg/mlを含む試薬を用いて、濃度別フィブリノゲンの検出をACL10000FIB_Cプロトコルを用いて試みた。
異常血液及び抗凝固剤を含む血液において測定値の干渉があるかどうか確認するために、干渉性能を確認した。キャリブレーション血漿(Calibration plasma)をACL TOP300装備のFIB-Cプロトコルに合わせて機械に装着した後、プログラムによって測定して検量線(calibration curve)を作った。干渉物質としては、ヘモグロビン、ビリルビン、ヘパリンを使用して、各試薬を高濃度で溶かし、血漿に濃度に合わせて添加して測定した。
製造された試薬を用いてフィブリノゲンの濃度試験測定値と真値との一致度を確認する試験であり、公認された参考値を有する国際標準物質を使用する。標準物質は、NIBSCの3rd international standard for fibrinogen plasma(09/264)を使用した。標準物質と試薬をACL TOP装備のプロトコルに合わせて装着した後、プログラムによって測定した。
Claims (12)
- 止血酵素(hemostatic enzyme)及びカルボキシメチルキトサン(carboxymethyl chitosan,CMCS)を含む、血液凝固検査用組成物。
- 前記血液凝固検査は、トロンビン時間(Thrombin time,TT)測定、レプチラーゼ時間(Reptilase time)測定及びフィブリノゲン(fibrinogen)濃度測定よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の血液凝固検査用組成物。
- 前記止血酵素(hemostatic enzyme)は、トロンビン、組換えバトロキソビン、天然型バトロキソビン、ボトロパーゼ(Botropase)、アンクロド(ancrod)及びスリング(Suling)よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項1に記載の血液凝固検査用組成物。
- 前記止血酵素は、0.1~100BU/ml濃度で含むことを特徴とする、請求項1に記載の血液凝固検査用組成物。
- 前記カルボキシメチルキトサンは、0.1~100mg/ml濃度で含むことを特徴とする、請求項1に記載の血液凝固検査用組成物。
- 0~100mMの塩化カルシウム(CaCl2)をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の血液凝固検査用組成物。
- 1~100mMのバッファーをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の血液凝固検査用組成物。
- 前記バッファーは、2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MES)、マレイン酸塩(Maleate)、クエン酸塩(Citrate)、ビス-トリス(BIS-Tris)、リン酸塩(Phosphate)、N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸(N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid,ADA)、炭酸塩(Carbonate)、ピペラジン-N,N’-ビス(2-エタンスルホン酸)(piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid),PIPES)、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid,ACES)、3-モルフォリノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(3-Morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid,MOPSO)、イミダゾール(Imidazole)、ビス-トリス-プロパン(BIS-Tris-Propane)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid,BES)、3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid,MOPS)、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid,TES)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid,HEPES)、3-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ-2-ヒドロキシプロパン-1-スルホン酸(3-Bis(2-hydroxyethyl)amino-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid,DIPSO)、3-[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(3-[Tris-(Hydroxymethyl)Methylamino]-2-Hydroxypropane Sulphonic Acid,TAPSO)、トリエタノールアミン(triethanolamine,TEA)、N-(2-ヒドロキシエチル)-ピペラジン-N’-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(N-(2-Hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-hydroxypropanesulfonic acid,HEPPSO)、ピペラジンー-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸(Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3propanesulfonic acid),POPSO)、トリシン(Tricine)、グリシルグリシン(Glycylglycine)、トリス(Tris)、3-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]プロパン-1-スルホン酸(3-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]propane-1-sulfonic acid,HEPPS,EPPS)、ビシン(Bicine)、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-3-アミノプロパンスルホン酸(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid,TAPS)、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(2-Amino-2-methyl-1,3-propanediol,AMPD)、N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(N-(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)-3-amino-2-hydroxypropanesulfonic acid,AMPSO)、タウリン(Taurine)及びホウ酸(Boric acid)よりなる群から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項7に記載の血液凝固検査用組成物。
- 0.1~10mg/mlの安定化剤をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の血液凝固検査用組成物。
- 前記安定化剤は、糖アルコール、マルトース、ソルビトール、マンノース、グルコース、トレハロース、アルブミン、リシン、グリシン、ゼラチン(gelatin)、PEG及びTween 80から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項9に記載の血液凝固検査用組成物。
- 下記の段階を含むフィブリノゲン濃度測定方法:
a)請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物を血清含有サンプルに添加し、凝塊(clot)形成速度を測定する段階;及び
b)凝塊形成速度からフィブリノゲン濃度を導出する段階。 - 下記の段階を含む抗凝固物質のスクリーニング方法:
a)フィブリノゲンを含む血清含有サンプルに止血酵素及びカルボキメチルキトサンを添加する段階;
b)前記混合物に候補物質を添加する段階;
c)凝塊(clot)形成時間を測定する段階;及び
d)凝塊形成時間が候補物質を添加していない対照群に比べて増加する候補物質を抗凝固物質として選別する段階。
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