JP2022520106A

JP2022520106A - Ｌｙｍ－１およびｌｙｍ－２抗体組成物ならびに改善されたｃａｒ構築物

Info

Publication number: JP2022520106A
Application number: JP2021547416A
Authority: JP
Inventors: アランエル．エプスタイン，; ペイシェンフー，; ロンジェン，
Original assignee: ユニバーシティオブサザンカリフォルニア
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2022-03-28
Also published as: MX2021009744A; CN113710703A; CA3129501A1; WO2020168298A2; US20240150470A1; IL285463A; BR112021015676A2; AU2020221324A1; EP3924387A2; WO2020168298A3; SG11202108655TA; US20220056139A1; US11667715B2; KR20210118945A

Abstract

本明細書において、新規抗体およびこれらの抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞を提供する。同様に、それら、抗体およびＣＡＲをコードするベクターまたはプラスミドを含む組成物、ならびにそれらを産生する方法、またはそれらを使用してがんを検出もしくは処置するための方法、ならびに前記方法を実行するためのキットも提供する。一態様では、本開示は、配列番号２もしくは６のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／あるいは配列番号４もしくは８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる抗体を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年２月１５日、２０１９年３月８日、および２０１９年１０月２１日にそれぞれ提出された米国仮特許出願第６２／８０６，６３２号、第６２／８１５，９６１号、および第６２／９２４，１５１号の優先権を主張し、これら各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、一般に、ヒト免疫学の分野、詳細にはがん免疫療法に関する。

背景技術に関する以下の考察は、単に読者が本開示を理解するのを助けるために提供されており、本開示に対する先行技術を記載または構成すると認めるものではない。本開示を通して、様々な刊行物がアラビア数字によって参照されており、その完全な文献引用は、特許請求の範囲の直前に見出される。これらの参考文献、ならびに本明細書において参照した技術文献および特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２は、ヒトＢ細胞、樹状細胞、ならびにＢ細胞由来リンパ腫および白血病の表面上に主に発現されることが公知であるＭＨＣクラスＩＩＨＬＡ－ＤＲ分子に対するものである。
マウスモノクローナル抗体Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２（Epstein AL, et al., 1987, Cancer Res. 47: 830-840）は当初、大部分のヒトＢ細胞悪性疾患の細胞表面上に発現されるＨＬＡ－Ｄｒ抗原を標的とするように開発された。（Rose et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43(1): 26-30）は後に、ヒトＨＬＡ－Ｄｒの軽鎖上の不連続な部位であるＬｙｍ－１結合エピトープを同定した。Ｌｙｍ－２は、Ｌｙｍ－１とは競合せず、したがってＨＬＡ－Ｄｒ抗原上の異なるエピトープに結合する。Ｌｙｍ－１は、ヒトにおいてびまん性大細胞型リンパ腫の処置のためのＩ－１３１放射標識医薬品およびネイキッド抗体として試験されており、有効かつ安全であることが見出されている（DeNardo SJ et al., 1988, Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals 1:17-33；DeNardo, S.J. et al., 1988, Int. J. Cancer 3:96-101；およびHu E. et al., 1989, Hematologic Oncology 7:155-166）。ＣＤ１９およびＣＤ２０などの他のＢ細胞抗原に対する抗体とは異なり、Ｌｙｍ－１は、ヒトリンパ腫細胞の表面上の脂質ラフトにおける抗原の局在化により、結合すると腫瘍細胞のアポトーシスを生じるが、Ｌｙｍ－２は生じない（Epstein AL, et al., 1987, Cancer Res. 47: 830-840）。加えて、Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２抗原は、いかなる程度にも脱落もインターナライズもされず、正常な循環するＢ細胞およびリンパ節結合Ｂ細胞では、リンパ腫細胞と比較して１／４の濃度で発現されるに過ぎない。

Epstein AL, et al., 1987, Cancer Res. 47: 830-840 Rose et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43(1): 26-30 DeNardo SJ et al., 1988, Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals 1:17-33 DeNardo, S.J. et al., 1988, Int. J. Cancer 3:96-101 Hu E. et al., 1989, Hematologic Oncology 7:155-166 Epstein AL, et al., 1987, Cancer Res. 47: 830-840

上記の特徴のために、Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２は、抗原陽性白血病およびリンパ腫の処置のために使用することができる理想的な標的化抗体である。近年、Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２の両方が、有効なヒトＣＡＲＴ細胞を生成するために使用されており、これらの悪性腫瘍の免疫療法のための重要な新規組成物として特許取得済みである。本開示は、親抗体より抗原に対して低い親和性を有する新たに産生されたヒト化Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２が、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための臨床的に有効なヒトＣＡＲＴ細胞を生成するために使用することができ、およびＮＳＧマウスに異種移植した場合に転移性の抗原陽性腫瘍に対して有効であることを実証する。これらのデータは、Ｂ細胞腫瘍を有する患者を処置することが可能なヒトＣＡＲＴ細胞を生成するために、これらのヒト化抗体構築物を使用する潜在性に関して重要な情報を提供する。

最近、遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞による自家処置を使用してＢ細胞リンパ腫および白血病において前例のない結果が得られたことにより、いくつかの研究所がこのアプローチを固形腫瘍に適用し始めている。ＣＡＲ改変細胞は、モノクローナル抗体のＨＬＡ非依存的標的化特異性と、活性化Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖、およびホーミング特性とを組み合わせるが、チェックポイント抑制には応答しない。抗原発現標的を直接殺滅するそれらの能力のために、ＣＡＲ細胞は、いかなる抗原陽性細胞または組織に対しても非常に毒性であり、非常に特異的な抗体によってＣＡＲを構築することが必要である。一態様では、本明細書において所望の安全性および有効性プロファイルを有する新規抗体、ＣＡＲ、ならびにその診断的および治療的な使用方法を開示する。

一態様では、本開示は、配列番号２もしくは６のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／あるいは配列番号４もしくは８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる抗体を提供する。別の態様では、本明細書において、配列番号１０のアミノ酸配列もしくはその均等物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／または配列番号１２のアミノ酸配列もしくはその均等物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる抗体を開示する。

一態様では、本開示の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ抗体である。抗体の定常領域もまた多様であり得る。例えば抗体は、任意のアイソタイプ：ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、またはＩｇＭのＦｃ領域を備え得る。一実施形態では、本開示の抗体の定常領域は、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇカッパ定常領域である。１つの特定の態様では、本開示の抗体はさらに、検出可能マーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。本明細書においてまた、上記の単離された細胞を培養するステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる本開示の抗体を産生する方法であって、単離された細胞が必要に応じて哺乳動物細胞である、方法も提供する。

本明細書においてさらに、開示される抗体の抗原結合性断片を提供する。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群から選択される。さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示される単離された抗体またはその断片、および検出可能なまたは精製標識を単独で、または抗原もしくはその断片と組み合わせて提供する。さらに本明細書において、この抗原／抗体複合体を含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるｅｘｖｉｖｏの細胞を提供する。

本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるポリペプチドを提供する。さらに、本明細書に開示される抗体またはその断片のアミノ酸配列、およびそれらをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離されたポリペプチドを提供する。

なおさらに、本明細書に開示される抗体およびその断片をコードする単離された核酸を提供する。一態様では、単離された核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、および１１、またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。一態様では、ポリヌクレオチド配列は、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに動作可能に連結される。それらはまた、ベクターもしくは適切な宿主細胞、および／または診断的もしくは治療的使用に適した担体と組み合わせることができる。一態様では、核酸は、ポリペプチドおよびタンパク質の組換え産生のために宿主細胞に含有される。宿主細胞は真核細胞または原核細胞であり得る。

本開示の態様は、（ａ）本明細書に開示される抗体のいずれかの抗原結合ドメイン、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、および（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。一態様では、ＣＡＲはさらに、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。別の態様では、本開示のＣＡＲは、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ、または第４世代ＣＡＲである。

同様に、本明細書において、（ａ）抗原結合ドメイン（例えば、抗Ｌｙｍ抗体の）、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに（ｄ）ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供する。さらなる態様では、ＣＡＲはまた、抗原結合ドメインの後に直接挿入された少なくとも１０アミノ酸のエピトープ「ＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳ」も含む。抗原結合ドメインは、任意の適切な種、例えば哺乳動物、マウス、ラット、または例えばヒトに由来し得る。

本開示は、（ａ）抗体、例えば抗Ｌｙｍ抗体、ヒト化抗Ｌｙｍ抗体、または抗ＣＤ１９抗体の抗原結合ドメイン、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに（ｄ）ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２の膜貫通ドメインの１つまたは複数を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＡＲ構築物を提供する。抗体の非制限的な例としては、任意の適切な種に由来し得る抗Ｌｙｍ－１、抗ｈｕＬｙｍ－１もしくはＬｙｍ２、抗Ｌｙｍ－２抗体、または抗ＣＤ１９抗体が挙げられる。構築物はさらに、上記のエレメント（ａ）～（ｄ）を連結する１つまたは複数のリンカーポリペプチドを含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。さらなる態様では、ＣＡＲはさらに、抗原結合ドメインのアミノ末端に位置するリーダーペプチドを含む、それから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。一実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αまたはＩｇＧ１ヒンジドメインである。別の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。さらなる態様では、ＣＡＲはまた、抗原結合ドメインの後に直接挿入された少なくとも１０アミノ酸のエピトープ「ＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳ」も含む。抗原結合ドメインは、任意の適切な種、例えば哺乳動物、マウス、ラット、または例えばヒトに由来し得る。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、本開示の任意の抗体のいずれかの抗原結合ドメインまたはその断片（例えば、ｓｃＦｖ）、ＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧ１ヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。さらなる態様では、ＣＡＲは、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２膜貫通ドメインを含む。

１つの特定の態様では、本開示の抗体またはＣＡＲはさらに、検出可能なマーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。

別の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ８αまたはＩｇＧ１ヒンジドメインを含み、またはあるいはそれから本質的になり、またはなおさらにそれからなり、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７－Ｈ３から選択され、ならびに細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。

同様に本明細書において、ＣＡＲ（例えば、抗ＬｙｍＣＡＲまたは抗ＣＤ１９）発現細胞を産生する方法であって、本明細書に開示されるＣＡＲをコードする核酸配列を、免疫細胞集団に導入するステップ、およびステップ（ｉ）の前記核酸配列による形質導入が成功しており、それによってＣＡＲ発現細胞を産生する免疫細胞の亜集団を選択するステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法も提供する。

本開示の態様は、本開示のＣＡＲを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離された細胞、およびそのような細胞を産生する方法に関する。

同様に本明細書において、本開示の抗体またはＣＡＲをコードする単離された核酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるベクターも提供する。一態様では、本開示は、前記抗体またはＣＡＲ構築物をコードする単離された核酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるベクターを提供する。

別の態様では、本開示は、担体と、本開示の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、単離された核酸、ベクター、および／または単離された細胞のうちの１つまたは複数とを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組成物を提供する。

本開示のさらに他の方法の態様は、それを必要とする対象における腫瘍の成長を阻害する、および／またはがんを処置する、および／またはがんの再発を防止する方法であって、本明細書に提供される、有効量のＣＡＲ（例えば、抗ＬｙｍまたはＣＤ１９）発現細胞、本明細書に提供される、有効量の抗体、有効量のその抗原結合性断片、および／または有効量のポリペプチドを対象に投与するステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法に関する。一態様では、ＣＡＲは、処置または阻害されるがんまたは腫瘍細胞上に発現された抗原に対する抗原結合ドメインを発現する。一態様では、ＣＡＲ発現細胞は、処置される対象に対して自己または同種であり、必要に応じて、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、第４選択治療、または第５選択治療である。別の態様では、腫瘍またはがん細胞は、ＣＡＲが結合する抗原、例えば、ＣＤ１９、Ｌｙｍ１および／またはＬｙｍ２を発現または過剰発現する。さらなる態様では、がんまたは腫瘍は、癌腫、肉腫、または白血病の群から選択される。１つの特定の態様では、腫瘍またはがんは、Ｂ細胞リンパ腫または白血病である。一実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。固形腫瘍は、黒色腫、大腸癌、乳癌、および／または脳腫瘍であり得る。一態様では、処置されるがんは、癌腫、肉腫、神経芽腫、子宮頸がん、肝細胞がん、中皮腫、神経膠芽腫、骨髄腫、リンパ腫、白血病、腺腫、腺癌、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽腫、星細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、または黒色腫である。

方法は、対象、例えばヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等）、家畜動物（例えば、イヌおよびネコ）、農場動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、および実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を処置するために有用である。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発達段階（例えば、成体、若年、こども、幼体、または子宮内哺乳動物）であり得る。哺乳動物は、雄性または雌性であり得る。ある特定の実施形態では、対象は、新生物障害、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはがんを有するまたは有することが疑われる。

本明細書に開示される方法はさらに、対象にＣＡＲ治療以外の抗腫瘍治療を投与するステップを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。

本開示はまた、がん細胞またはがん幹細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞に、本開示の、有効量のＣＡＲ発現細胞、有効量の抗体、有効量の抗原結合性断片、および／または有効量のポリペプチドを接触させるステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法にも関する。ＣＡＲは、抗Ｌｙｍ－１、抗Ｌｙｍ－２、または抗ＣＤ１９発現ＣＡＲであり得る。

本明細書においてさらに、対象が治療に応答する可能性があるか応答する可能性がないかを決定する方法であって、患者から単離された試料に、本開示の抗体、抗原結合性断片、および／またはポリペプチドを接触させるステップ、ならびに試料中の抗体－細胞複合体、抗原結合性断片－細胞複合体、および／またはポリペプチド－細胞複合体を検出するステップを含み、またはあるいはそれから本質的になり、またはなおさらにそれからなり、複合体が存在すれば、対象が治療に応答する可能性があることを示し、複合体が存在しなければ、対象が治療に応答する可能性がないことを示す、方法を提供する。抗体、抗原結合性断片、および／またはポリペプチドは、検出可能に標識され得る。同様に本明細書において、本開示の、有効量の抗体またはＣＡＲを、治療に応答する可能性があると決定された対象に投与するステップをさらに含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法を開示する。

本開示はさらに、対象における治療をモニタリングする方法であって、対象から単離された試料に、本開示の抗体または抗原結合性断片を接触させるステップ、および試料中の抗体－細胞複合体を検出するステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法に関する。前記方法は、本開示の、有効量のＣＡＲ発現細胞、有効量の抗体、有効量の抗原結合性断片、および／または有効量のポリペプチドを対象に投与する前および／または後に実施することができる。ＣＡＲは、抗Ｌｙｍ－１、抗Ｌｙｍ－２、または抗ＣＤ１９発現ＣＡＲであり得る。一態様では、ＣＡＲ、抗体、またはその抗原結合性断片は、検出可能に標識される。別の態様では、試料は、喀痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水、血液、または組織のうちの１つまたは複数を含む。

同様に、本明細書において、本開示の方法を実行するためのキット、および本開示の方法を実行するための使用説明書も提供される。キットは、本開示の、抗体、ＣＡＲ、抗原結合性断片、ポリペプチド、単離された核酸、ベクター、単離された細胞、および／または組成物のうちの１つまたは複数と、使用説明書とを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

図１は、２つのヒト化Ｌｙｍ－１抗体がエピトープ陽性細胞に対して別個の結合能を有することを示す。５×１０^５個のＲａｊｉ細胞を表記の抗体の０．０１３～１３００ｎＭの増加濃度と共にインキュベートした。（ＡＦ４８８）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧによる検出後、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって定量した。

図２は、ＣＡＲＴ細胞の産生の成功を示す。１０日目に、ＣＡＲＴ細胞調製物をビオチン－抗Ｌｙｍ－１抗体によって標識した後、ＡＰＣ－ストレプトアビジンによって検出した。モックＴ細胞を陰性対照とした。

図３Ａ～３Ｃは、両方のヒト化Ｌｙｍ－１に基づくＣＡＲ－Ｔ細胞がＲａｊｉ異種移植片において完全な寛解を誘導したことを示す。１００万個のＲａｊｉ／Ｌｕｃ－ｅＧＦＰ細胞を、８～１０週齢の雄性ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した（０日目）。ルシフェラーゼ活性を６日目に測定し、処置前の腫瘍負荷を評価した。（図３Ａ）７日目、ＰＢＳ１００ｕｌ中の１０００万個のモックＴ細胞およびＣＡＲＴ細胞（５０％ＣＡＲ陽性）を、無作為に生成した担癌マウスの群（ｎ＝５）にｉ．ｖ．注射した。（図３Ｂ）背側および腹側の画像からの平均生物発光輝度を定量および要約する。（図３Ｃ）対照群および実験群のマウスの生存を示すカプラン－マイヤープロット。

図４は、機能的なヒト化Ｌｙｍ－１抗体の産生を示す。５×１０^５個のＡＲＨ－７７細胞を表記の抗体の２．２１８～２６６ｎＭの増加濃度と共にインキュベートした。（ＡＦ４８８）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧによる検出後、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって定量した。

図５は、ｈｕＬｙｍ－１およびｈｕＬｙｍ－２ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生の成功を示す。１０日目に、ＣＡＲＴ細胞調製物を、ビオチン－プロテイン－Ｌによって標識した後、ＡＰＣ－ストレプトアビジンによって検出した。モックＴ細胞を陰性対照とした。

図６は、ｈｕＬｙｍ－２ＣＡＲがエピトープ陽性細胞株に対して細胞傷害性の増加を示したことを示す。モックＴ細胞またはＣＡＲＴ細胞を、ＡＲＨ－７７ｅＧＦＰ／Ｌｕｃと共にエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比２～０．２５でインキュベートした。細胞傷害性を共培養の１７時間後にルシフェラーゼ活性に基づいて測定した。

図７は、４１ＢＢ３ｚおよびＤＡＰ１０－１２に基づくＣＡＲＴ細胞構築物の概略図を示す。

図８は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生の成功を示す。１０日目に、ＣＡＲＴ細胞調製物を、ビオチン－抗Ｌｙｍ－１抗体によって標識した後、ＡＰＣ－ストレプトアビジンによって検出した。モックＴ細胞を陰性対照とした。

図９Ａ～９Ｂは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ形質導入ＣＡＲＴ細胞の安定な遺伝子発現および細胞増殖を示す。初代ヒトＴ細胞を、０日目に抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓによって活性化し、３日目に各構築物を形質導入した。各群において１００万個のＴ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８によって７日目および１４日目に再刺激した。（図９Ａ）モックＴ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞調製物中の絶対細胞数を、４日目、７日目、８日目、および１２日目に計数した。（図９Ｂ）ＣＡＲ発現を、７日目、１４日目、および２１日目に測定した。

図１０は、Ｒａｊｉ細胞に対するエピトープ駆動性の細胞傷害性を示す。モックＴ細胞またはＣＡＲＴ細胞を、Ｒａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃと共にエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比２～０．２５でインキュベートした。細胞傷害性を、共培養の１７時間後にルシフェラーゼ活性に基づいて測定した。

図１１Ａ～１１Ｄは、モック処置およびＣＡＲ処置マウスにおける腫瘍負荷の背側生物発光イメージングおよび体重変化を示す。１００万個のＲａｊｉ／Ｌｕｃ－ｅＧＦＰ細胞を、８～１０週齢の雄性ＮＳＧマウスにｉ．ｖ．注射した（０日目）。ルシフェラーゼ活性を７日目に測定し、処置前の腫瘍負荷を評価した。８日目に、ＰＢＳ１００ｕｌ中の１００万個のモックＴ細胞およびＣＡＲＴ細胞を、無作為に生成した担癌マウスの群（ｎ＝５）にｉ．ｖ．注射した。（図１１Ａ）例としての生物発光画像。（図１１Ｂ）マウスの生存のカプラン－マイヤープロット。（図１１Ｃ）背側および腹側画像の平均生物発光輝度を定量および要約する。（図１１Ｄ）処置したマウスの経時的な体重のプロット。０日目の各マウスの体重を参照として使用して、パーセント体重変化を計算した。マウスの体重をデジタルスケールによって週に２回測定した。

図１２は、ＤＡＰＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を使用してＮＳＧマウスにおける播種性のＲａｊｉリンパ腫を処置する実験を示す。マウスにＲａｊｉをｉ．ｖ．注射し、８日後、ｈｕＬｙｍ－１ＤＡＰ、ＣＤ１９第２世代、またはＣＤ１９ＤＡＰのＣＡＲＴ細胞１００万個によって処置した。次に、マウスを、生物発光によって毎週撮像し、第２世代構築物を有するＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が全て死滅したが、ＣＤ１９ＤＡＰＣＡＲ構築物を有する細胞は２１日目でもなおも生存していたが、マウスはこの用量ではなおも腫瘍を有することを示している。

図１３Ａ～１３Ｃは、４－１ＢＢ３ｚ細胞内ドメインを有するＬｙｍ－１およびｈｕＬｙｍ－１－ＢＣＡＲがいずれもＲａｊｉ腫瘍をｉｎｖｉｖｏで根絶することを示す。（図１３Ａ）ｉｎｖｉｖｏ研究のスケジュールの概略図。（図１３Ｂ）０日目に１０^６個のＲａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞を接種し、その後６日目に５×１０^６個のモックＴ細胞、Ｌｙｍ－１－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞、またはＰＢＳ１００ｕｌによる処置を行ったＮＳＧマウスの生物発光画像。各ＮＳＧマウスの背側および腹側画像の生物発光シグナルを合計し、経時的にプロットした（マウスｎ＝５匹／群、データは示していない）。（図１３Ｃ）カプラン－マイヤー生存曲線（^＊ｐ＜０．００１、ログランク検定による）。

図１４Ａ～１４Ｆは、ｈｕＬｙｍ－１－ＢＣＡＲＴ細胞増大に及ぼす細胞内シグナル伝達ドメインの影響を示す。（図１４Ａ）形質導入および再刺激後のモックＴ細胞またはＣＡＲ陽性Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増大（ドナー５人のプールした結果）。（図１４Ｂ）表記の日でのＴ細胞調製物におけるＣＡＲ発現。Ｔ細胞を、７日目および１４日目にα－ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体に基づく刺激剤によって再活性化した。（図１４Ｃ）形質導入および再刺激後のモックＴ細胞またはＣＡＲ陽性Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増大（ドナー３人のプールした結果）。（図１４Ｄ）表記の日でのＴ細胞調製物におけるＣＡＲ発現。Ｔ細胞を、７日目および１４日目にα－ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８刺激剤によって再活性化した（ドナー３人からの代表的な結果）。（図１４Ｅ）形質導入および再刺激後のモックＴ細胞またはＣＡＲ陽性Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増大（ドナー３人のプールした結果）。（図１４Ｆ）表記の日でのＴ細胞調製物におけるＣＡＲ発現。Ｔ細胞を、７日目および１４日目にα－ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８刺激剤によって再活性化した（ドナー５人からの代表的な結果）。

図１５Ａ～１５Ｂは、リガンド依存性のトニックシグナル伝達が、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞における増殖障害に関する優勢な機構であることを示す。（図１５Ａ）９日目のモックＴ細胞またはＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、アネキシンＶおよび死細胞（Ｓｙｔｏｘ－Ｇｒｅｅｎ）染色に関して評価した（２人のドナーからの代表的な結果）。（図１５Ｂ）ＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅｆａｒ－ｒｅｄ色素によって予め標識し、その後モックＴ細胞または表記のＣＡＲＴ細胞と１：１の比で一晩共培養した。次にＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞を、アネキシンＶおよびＳｙｔｏｘ－Ｇｒｅｅｎ染色に供し、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚまたはｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞による潜在的な仲間殺しを測定した（２人のドナーからの代表的な結果）。

図１６Ａ～１６Ｂは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞が、活性化誘導細胞死の低減を示したことを示す。モック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞を、ａ－ＣＤ２／３／２８刺激剤の存在下で、またはＫ５６２細胞もしくはＲａｊｉ細胞と共に一晩培養した。モックおよびＣＡＲＴ細胞をアネキシンＶおよびＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎ（死細胞色素）染色に供した。（図１６Ａ）３人のドナーのうち１人からの代表的なプロット。（図１６Ｂ）生存細胞におけるアネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージを以下の式によって定量した：Ｑ３／（Ｑ３＋Ｑ４）（ドナー３人からのプール、^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。棒グラフは平均値±ＳＤを示す）。

図１７Ａ～１７Ｃは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰが、Ｂリンパ球および白血病細胞株のパネルに対してエフェクター機能を示したことを示す。（図１７Ａ）ヒトリンパ腫Ｂ細胞株のパネルと１：１のエフェクターの標的に対する比で一晩共培養した場合の、モック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚから放出されたサイトカイン。分泌されたサイトカインの定量を、ｐｇ／細胞１００００個（ＧＭ－ＣＳＦ）またはｎｇ／細胞１００００個（ＩＬ－２およびＩＮＦ－γ）に正規化する（ｎ＝３のテクニカルレプリケート、ドナー２人からの代表的な結果）。（図１７Ｂ）モック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚの細胞傷害性を測定するために、腫瘍細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅｆａｒ－ｒｅｄ色素によって予め標識した後、エフェクター細胞と１：１の比で共培養した；各時点での生存腫瘍細胞をゲート設定した。（図１７Ｃ）生存腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、プロットした。溶解パーセントを、（１時間での％腫瘍－４８時間での％腫瘍）／（１時間での％腫瘍）として計算する（ｎ＝３のテクニカルレプリケート、２人のドナーからの代表的な結果を示す。棒グラフは平均値±ＳＤを示す）。図１７Ａ～１７Ｃは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰが、Ｂリンパ球および白血病細胞株のパネルに対してエフェクター機能を示したことを示す。（図１７Ａ）ヒトリンパ腫Ｂ細胞株のパネルと１：１のエフェクターの標的に対する比で一晩共培養した場合の、モック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚから放出されたサイトカイン。分泌されたサイトカインの定量を、ｐｇ／細胞１００００個（ＧＭ－ＣＳＦ）またはｎｇ／細胞１００００個（ＩＬ－２およびＩＮＦ－γ）に正規化する（ｎ＝３のテクニカルレプリケート、ドナー２人からの代表的な結果）。（図１７Ｂ）モック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚの細胞傷害性を測定するために、腫瘍細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅｆａｒ－ｒｅｄ色素によって予め標識した後、エフェクター細胞と１：１の比で共培養した；各時点での生存腫瘍細胞をゲート設定した。（図１７Ｃ）生存腫瘍細胞のパーセンテージを定量し、プロットした。溶解パーセントを、（１時間での％腫瘍－４８時間での％腫瘍）／（１時間での％腫瘍）として計算する（ｎ＝３のテクニカルレプリケート、２人のドナーからの代表的な結果を示す。棒グラフは平均値±ＳＤを示す）。

図１８Ａ～１８Ｂは、Ｌｙｍ－１エピトープが、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞の存在下で有意にダウンレギュレートしないことを示す。モックＴ、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、およびＣＤ１９－ＢＢ３ｚを、Ｂリンパ球および白血病細胞株のパネルと共に１：２の比で共培養した。一晩共培養後、Ｂ細胞株を、ＣＤ２２、Ｌｙｍ－１、およびＣＤ１９に対する抗体によって標識した。

図１９Ａ～１９Ｄは、ＣＡＲシグナル伝達ドメインが抗原のモジュレーションに影響を及ぼさないことを示す。（図１９Ａ）モックＴ、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚ、ＣＤ１９－ＤＡＰ、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞を、Ｒａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞と共におよそ１：２の比で一晩共培養した。次に、残存している生存Ｒａｊｉ細胞におけるＣＤ１９抗原およびＬｙｍ－１エピトープ発現を、フルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体によってフローサイトメトリーを介して測定した。（図１９Ｂ）残存Ｒａｊｉ細胞におけるＬｙｍ－１エピトープおよびＣＤ１９抗原発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の散布図。（図１９Ｃ）一晩共培養後の生存Ｒａｊｉ細胞のパーセンテージ、および（図１９Ｄ）濃度（ｎ＝３のテクニカルレプリケート、ドナー２人からの代表）。

図２０Ａ～２０Ｆは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲが、低用量で無腫瘍生存を媒介したことを示す。（図２０Ａ）モックおよびＣＤ１９－ＤＡＰＴ細胞を、Ｒａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞と１：２の比で一晩共培養した。次に、ＣＤ１９抗原およびＬｙｍ－１エピトープ発現を、フルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体によってフローサイトメトリーを介して測定した（３回のレプリケートからの代表）。（図２０Ｂ）ｉｎｖｉｖｏ研究の概略プロトコール。（図２０Ｃ）１０^６個のＲａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃを０日目に接種し、その後８日目に表記の用量でモック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚ、またはＣＤ１９－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞による処置を行ったＮＳＧマウスの生物発光画像（群あたりマウスｎ＝５匹）。（図２０Ｄ）カプラン－マイヤー生存曲線（ｎｓ＝ログランク（マンテル－コックス）検定により有意差なし）。（図２０Ｅ）１０^６個のＲａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃを０日目に接種した後、８日目に１０^６個のモック、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚ、またはＣＤ１９－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞による処置を行ったＮＳＧマウスの生物発光画像（群あたりマウスｎ＝５匹）。この実験は、同じモックＴ細胞対照群の使用を示す図２５Ｅにおける１つとして並べて実施した。（図２０Ｆ）カプラン－マイヤー生存曲線（Ｐ＝０．００２、ログランク（マンテル－コックス）検定による）。

図２１Ａ～２１Ｃは、ＣＡＲ開発の候補体としてのｈｕＬｙｍ－１－Ｂの選択を示す。（図２１Ａ）Ｒａｊｉ細胞に対する１２個のヒト化Ｌｙｍ－１抗体のパネルの結合能。抗体は全て、ヒトＩｇＧ１アイソフォームで発現された。ｈｕＬｙｍ－１－６０は、ｃｈＬｙｍ－１と同じ配列を有する。ｈｕ５１は、施設内で産生されたヒトＩｇＧ１のアイソタイプ対照である。Ｒａｊｉ細胞を、表記の濃度と共に３０分間インキュベートした後、ＡＦ－４８８コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧによって検出した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって評価し、抗体の示差的結合を比較した。（図２１Ｂ）フローサイトメトリーを介した、Ｒａｊｉ細胞における施設内で産生したｈｕＬｙｍ－１－ＢおよびキメラＬｙｍ－１（ｃｈＬｙｍ－１）の結合能。ここで使用した二次抗体は、ＡＰＣコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体であった。（図２１Ｃ）ｃｈＬｙｍ－１陽性および陰性細胞株のパネルに対するｃｈＬｙｍ－１およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂの結合。これらの測定に関して、ＡＰＣコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を二次抗体として使用した。

図２２Ａ～２２Ｈは、ＢＢ３ｚ－ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを有するＬｙｍ－１およびｈｕＬｙｍ－１－ＢＣＡＲＴ細胞が、増殖障害にもかかわらず、培養において細胞傷害性であることを示す。（図２２Ａ）ＣＡＲ構築物の概略図。２６１タグは、ヒト胎盤増殖因子に由来する１０アミノ酸の線状エピトープである。（図２２Ｂ）ＣＡＲ－Ｔ産生および増大のスケジュール。（図２２Ｃ）モックＴ細胞または形質導入した初代ヒトＴ細胞における７日目でのＣＡＲ発現のフローサイトメトリー分析；ＣＡＲ発現を、２６１タグに対するＤｙｌｉｇｈｔ６５０コンジュゲート抗体によって測定した。（図２２Ｄ）表記のエフェクターの標的に対する比（Ｅ：Ｔ）でのＬｙｍ－１エピトープ陰性（Ｋ５６２）および陽性（Ｒａｊｉ）細胞株に対するＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性；９日目のＣＡＲＴ細胞を使用して細胞傷害性を測定した。このアッセイでは７日目に再刺激を実施しなかった（ｎ＝３のテクニカルレプリケート、ドナー３人の代表）。（図２２Ｅ）ｉｎｖｉｔｒｏで培養したモックＴ細胞またはＣＡＲ陽性Ｔ細胞の７～１４日の増大倍率（ドナー６人からのプールした結果。ｎｓ－有意差なし、^＊Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定による）。（図２２Ｆ）９日目でのＣＤ３ζのリン酸化を示す代表的なプロット（７日目で刺激なし；ドナーｎ＝３）。（図２２Ｇ）再刺激前の７日目および１４日目での代表的なＣＡＲおよび阻害性受容体発現。（図２２Ｈ）ドナー３人からプールしたモックＴ細胞またはＣＡＲ陽性Ｔ細胞における阻害性受容体のパーセンテージの定量（^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。散布図および棒グラフは平均値±ＳＤを示す）。

図２３Ａ～２３Ｇは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞の増殖障害が、Ｔ細胞上の弱く発現されたＬｙｍ－１エピトープに関連し、ＩＴＡＭＣＤ３ζによって媒介されることを示す。（図２３Ａ）ｈｕＬｙｍ－１－Ｂの可変重鎖のＣＤＲ３における２つのアミノ酸突然変異の導入は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔ抗体またはｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔ－ＢＢ３ｚＣＡＲを生成する；ＣＡＲにおけるＣＤ３ζ部分の３つ全てのＩＴＡＭにおけるチロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）への突然変異は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚ活性を削除する（ｈｕＬｙｍ－１－ＢＢＢ３ｚＹ－Ｆ）。（図２３Ｂ）Ｒａｊｉ細胞に対するｃｈＬｙｍ－１、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔの結合能。ここで使用した二次抗体は、ＡＦ－４８８コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧであった；ＥＤ５０を各曲線上に注釈する。（図２３Ｃ）５０万個の活性化Ｔ細胞を１０μｇ／１００μｌの表記の抗体によって染色後、ＡＰＣ－抗ｈｕＩｇＧによって検出した。平均蛍光強度を計算してプロットした；散布図は、ＭＦＩの中央値を示す。各カラードットは１人のドナーを表す。（図２３Ｄ）ｉｎｖｉｔｒｏで培養したモックＴ、ｈｕＬｙｍ－１－ＢＢＢ３ｚＹ－Ｆ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔ－ＢＢ３ｚＣＡＲ陽性Ｔ細胞の７日目から１４日目までの増大倍率（ドナー３人からプールした結果。ｎｓ、スチューデントｔ検定による有意差なし、散布図は、平均値±ＳＤを示す）。（図２３Ｅ）９日目でＣＤ３ζのリン酸化を示す代表的なプロット；ＣＡＲ発現をＤｙｌｉｇｈｔ６５０コンジュゲート抗２６１タグ抗体によって検出した（ドナーｎ＝２）。（図２３Ｆ）７日目および１４日目でのＣＡＲならびにＰＤ－１およびＬＡＧ－３発現の代表的なプロット。（図２３Ｇ）ドナー３人からプールしたモックＴ細胞またはＣＡＲ陽性Ｔ細胞におけるＰＤ－１およびＬＡＧ－３のパーセンテージの定量（^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。棒グラフは平均値±ＳＤを示す）。

図２４Ａ～２４Ｇは、ＢＢ３ｚとＤＡＰシグナル伝達との置き換えが、ｈｕＬｙｍ－１－ＢＣＡＲＴ細胞における増殖の問題に取り組んだことを示す。（図２４Ａ）左のパネルは、ＩＴＩＭおよびＩＴＡＭのコンセンサスアミノ酸（ＡＡ）を例証し、右のパネルはＤＡＰ１２およびＣＤ３ζにおけるＩＴＡＭのＡＡを示す。影部分は、ＤＡＰ１２のＩＴＡＭにおけるＩＴＩＭコンセンサスの存在を強調する。（図２４Ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインとしてＢＢ３ｚまたはＤＡＰを有するｈｕＬｙｍ－１－ＢＣＡＲの概略図。（図２４Ｃ）７～１４日目でのモック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲ陽性Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ増大（ドナー５人からプールした結果。ｎｓ、スチューデントｔ検定による有意差なし）。（図２４Ｄ）９日目のＣＤ３ζリン酸化（ｐ－ＣＤ３ζ）を示す代表的なプロット（ドナー３人の代表）。（図２４Ｅ）モックＴ細胞およびＣＡＲ陽性Ｔ細胞におけるｐ－ＣＤ３ζの定量（ドナーｎ＝３）。（図２４Ｆ）７日目および１４日目での代表的なＣＡＲおよび阻害性受容体発現（ドナーｎ＝３、^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による）。（図２４Ｇ）モックＴ細胞およびＣＡＲ陽性Ｔ細胞における阻害性受容体のパーセンテージの定量（ドナー３人からプールした；ｎｓ、有意差なし；^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定による。散布図および棒グラフは平均値±ＳＤを示す）。

図２５Ａ～２５Ｆは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞がｉｎｖｉｖｏでそのＢＢ３ｚ相対物より優れた抗腫瘍有効性を媒介することを示す。（図２５Ａ）Ｌｙｍ－１陽性（Ｒａｊｉ、左のパネル）または陰性（Ｋ５６２、右のパネル）細胞に対するモック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、またはｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚの細胞傷害性。（図２５Ｂ）Ｋ５６２またはＲａｊｉと１：１のエフェクターの標的に対する比で共培養した場合の、モック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、またはｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚのサイトカイン放出。分泌されたサイトカインの定量を、ｐｇ／細胞１０，０００個（ＧＭ－ＣＳＦ）またはｎｇ／細胞１０，０００個（ＩＬ－２およびＩＮＦ－γ）に正規化する（ｎ＝３のテクニカルレプリケート。ドナー３人からの代表的な結果）。（図２５Ｃ）改変プロトコールによるｉｎｖｉｖｏ研究の概略図。（図２５Ｄ、図２５Ｅ）１０^６個のＲａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃを０日目に接種し、その後８日目に１×１０^６個のモック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、またはｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞を処置したＮＳＧマウスの生物発光画像（群あたりマウスｎ＝５匹）。異なるドナーからの２つの独立した研究。（図２５Ｆ）カプラン－マイヤー生存曲線（Ｐ＝０．０００３２５、ログランク（マンテル－コックス）検定による。２つの独立した研究からプールした。棒グラフは平均値±ＳＤを示す）。

図２６Ａ～２６Ｄは、Ｌｙｍ－１エピトープがｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞に応答してダウンレギュレートしないことを示す。（図２６Ａ）モックＴ、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞を、Ｒａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞と共に１：２の比で一晩共培養し、次にＣＤ１９抗原およびＬｙｍ－１エピトープ発現をフルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体によってフローサイトメトリーを介して測定した。（３つのレプリケートからの代表）。（図２６Ｂ）ＲａｊｉにおけるＬｙｍ－１エピトープおよびＣＤ１９抗原発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の散布図（ｎ＝３のテクニカルレプリケート）。（図２６Ｃ）１０^６個のＲａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃを０日目に接種し、その後８日目に１×１０^６個のモック、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚ、またはｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞によって処置したＮＳＧマウス。１６日目に、骨髄試料を収集し、フルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体によってフローサイトメトリーを介してＬｙｍ－１エピトープおよびＣＤ１９抗原発現に関して評価した。（図２６Ｄ）ＲａｊｉにおけるＬｙｍ－１エピトープおよびＣＤ１９抗原発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の散布図（群あたりマウスｎ＝５匹、^＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、クラスカル－ウォリス検定による有意差なし、散布図は平均値±ＳＤを示す）。

本開示は、記載される特定の態様が当然のこととして変化し得ることから、それらに限定されないと理解すべきである。同様に、本明細書で使用される用語は、特定の態様を記載する目的のために過ぎず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることから制限的ではないと意図されると理解すべきである。加えて、本開示の全体におよび本開示内で、様々な技術的および特許刊行物が引用によってまたはアラビア数字によって参照されているが、その完全な引用は特許請求の範囲の直前に見出される。これらの刊行物の開示は、当技術分野の現状をさらに説明するために参照により本明細書に組み込まれる。

特に定義していない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本技術が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または均等な任意の方法および材料を、本技術の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料を以下に記載する。本明細書において引用した全ての技術的および特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなるものも、本技術が先行発明に基づいてそのような開示の日付を早める権利がないと自認したと解釈すべきではない。

本技術の実践は、特に示していない限り、当業者の範囲内である組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術を用いる。例えば、Sambrook and Russell eds.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；the series Ausubel et al. eds.(2007) Current Protocols in Molecular Biology；the series Methods in Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson et al.(1991) PCR 1: A Practical Approach(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al.(1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds.(1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney(2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition；Gait ed.(1984) Oligonucleotide Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号；Hames and Higgins eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds.(1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds.(1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed.(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds.(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press, London)；およびHerzenberg et al. eds(1996) Weir's Handbook of Experimental Immunologyを参照されたい。

全ての数値の指定、例えば範囲を含む、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、概算であり、それらは必要に応じて１．０もしくは０．１の増加によって、またはあるいは±１５％の変動によって、もしくはあるいは１０％、もしくはあるいは５％、もしくはあるいは２％の変動によって（＋）または（－）に変動する。必ずしも明白に述べていないが、全ての数値の指定は、用語「約」がその前にあると理解すべきである。同様に、必ずしも明白に述べていないが、本明細書に記載される試薬は、単なる例示であり、そのようなものの均等物は当技術分野で公知であると理解すべきである。

明白に列挙されておらず、それ以外であると意図されていなければ、本技術がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体について言及する場合、そのようなものの均等物または生物学的均等物は、本技術の範囲内であると意図されると推論される。
定義

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそれ以外であることを明白に示していない限り、複数形を含む。例えば、用語「細胞」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。

本明細書で使用される場合、用語「動物」は、例えば哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーの、生きている多細胞脊椎生物を指す。用語「哺乳動物」は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。

用語「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」は、本明細書において互換的に使用され、動物、典型的に哺乳動物を指す。任意の適した哺乳動物を、本明細書に記載される方法、細胞、または組成物によって処置することができる。哺乳動物の非制限的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等）、家畜動物（例えば、イヌおよびネコ）、農場動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、および実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発達段階（例えば、成体、若年、こども、幼体、または子宮内哺乳動物）であり得る。哺乳動物は、雄性または雌性であり得る。哺乳動物は、妊娠中の雌性であり得る。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、がんまたは新生物障害を有するまたは有することが疑われる。

「真核細胞」は、モネラ界を除く生物界の全てを含む。それらは、膜結合性の核を通して容易に区別することができる。動物、植物、真菌、および原生生物は、その細胞が内部の膜および細胞骨格によって複雑な構造に組織化される真核生物または生物である。最も特徴的な膜結合構造は核である。特に列挙していない限り、用語「宿主」は、例えば酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含む、真核細胞宿主を含む。真核細胞または宿主の非制限的な例としては、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、は虫類、およびヒトが挙げられる。

「原核細胞」は通常、核または他の任意の膜結合オルガネラを欠如し、２つのドメイン、細菌、および古細菌に分類される。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞はまた、エピソームと呼ばれる環状ループに遺伝情報を含有することができる。細菌細胞は非常に小さく、ほぼ動物ミトコンドリアのサイズ（直径約１～２μｍおよび長さ１０μｍ）である。原核細胞は、３つの主要な形状：桿状、球状、およびらせん状を特徴とする。真核細胞のような精巧な複製プロセスを経る代わりに、細菌細胞は二***によって***する。例としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、集合的に免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を指し、これには例として、これらに限定されないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、その組合せ、ならびに任意の脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト、ヤギ、ウサギ、およびマウスにおける免疫応答の際に産生される類似の分子、ならびに非ヒト哺乳動物腫、例えばサメ免疫グロブリンが挙げられる。それ以外であることを特に明記している場合を除き、用語「抗体」は、インタクト免疫グロブリン、ならびに目的の分子（または目的の非常に類似の分子の群）に特異的に結合して、他の分子に対する結合を実質的に排除する（例えば、目的の分子に関する結合定数が、生物試料中の他の分子の結合定数より少なくとも１０^３Ｍ^－１より高い、少なくとも１０^４Ｍ^－１より高い、または少なくとも１０^５Ｍ^－１より高い抗体および抗体断片）「抗体断片」または「抗原結合性断片」を含む。用語「抗体」はまた、遺伝子操作型、例えばキメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二特異性抗体）も含む。同様に、ＰｉｅｒｃｅＣａｔａｌｏｇａｎｄＨａｎｄｂｏｏｋ（１９９４－１９９５）（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）；Kuby, J.(1997) Immunology, 3^rd Ed., W.H. Freeman & Co., New Yorkも参照されたい。抗体の「抗原結合性断片」は、抗体の標的抗原に対して特異的に結合能を保持する抗体の部分である。

抗体構造に関して、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。２つのタイプの軽鎖、すなわちラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）は５つあり、これらは抗体分子の機能的活性を決定する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ。各々の重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域（領域はまた「ドメイン」としても公知である）を含有する。抗体の定常領域もまた多様であり得る。例えば抗体は、任意のアイソタイプ：ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、またはＩｇＭのＦｃ領域を備え得る。定常領域配列の非制限的な例としては、配列番号１９～２７またはその各々の均等物が挙げられる。

組み合わせると、重鎖および軽鎖可変領域は、抗原に特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は定義されている（参照により本明細書に組み込まれる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照されたい）。Ｋａｂａｔのデータベースは現在、オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成成分の軽鎖および重鎖の組合せフレームワーク領域は、大部分がβシート立体構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造を接続する、一部の例ではその一部を形成するループを形成する。このように、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によってＣＤＲの正しい方向への配置を提供する足場を形成するように作用する。Ｌｙｍ１およびＬｙｍ２ＣＤＲの非制限的な例は、米国特許出願第１５／１７３，５３４号に提供される。

ＣＤＲは、抗原のエピトープに対する結合に主に関与する。各々の鎖のＣＤＲは典型的には、Ｎ末端から開始して順に番号を付けられ、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても典型的に同定されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる（重鎖領域はＣＤＨＲと標識され、軽鎖領域はＣＤＬＲと標識される）。このように、ＣＤＨＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインからのＣＤＲ３である一方、ＣＤＬＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。ＴＮＴ抗体は、ＴＮＴ関連抗原に対して一意的な特異的Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域配列を有し、したがって特異的ＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に関して異なる組合せ部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体毎に異なるが、抗原結合に直接関係するのは、ＣＤＲ内のごく限定された数のアミノ酸位置である。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。

用語「ヒト化」は、抗体を参照して使用する場合、抗体のアミノ酸配列が、アクセプターヒト免疫グロブリン分子における所望の抗原に特異的に結合する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）の非ヒトアミノ酸残基（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ等）と、ＣＤＲに隣接するアミノ酸残基であるＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）における１つまたは複数のヒトアミノ酸残基とを有することを意味する。そのような抗体は典型的には、低減された免疫原性を有し、したがって１つまたは複数のＣＤＲが得られたまたはそれに基づく非ヒト親抗体と比較して、ヒトにおいてより長い半減期を有する。

本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、特異的液性免疫または細胞性免疫の産物、例えば抗体分子またはＴ細胞受容体によって特異的に結合され得る化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、例えばハプテン、単純な中間代謝物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモン、ならびに高分子、例えば複合糖質（例えば、多糖類）、リン脂質、およびタンパク質を含む任意のタイプの分子であり得る。一般的なカテゴリーの抗原としては、これらに限定されないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫および他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶に関係する抗原、毒素、ならびに他の雑多な抗原が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「抗原結合ドメイン」は、抗原標的に特異的に結合することができる任意のタンパク質またはポリペプチドドメインを指す。

用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、本明細書で使用される場合、抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、時に「キメラ受容体」、「Ｔボディ」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれる。「抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン」は、ある特定の抗原に結合することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」は、シグナルを伝達して細胞における生物プロセスの活性化または阻害を引き起こすドメインとして機能することが公知の任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、一次シグナル伝達ドメインに加えて１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれを含み得る。「膜貫通ドメイン」は、細胞膜にまたがることが公知であり、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインとを連結するように機能することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体は必要に応じて、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして作用する「ヒンジドメイン」を含み得る。そのようなドメインの非制限的な例を、本明細書において以下に提供し、例えば：

ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジ配列：

CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG

膜貫通ドメイン：ＣＤ２８膜貫通領域：

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG

細胞内ドメイン：４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域：

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

細胞内ドメイン：ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域：

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC

細胞内ドメイン：ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
である。

各々の例示的なドメイン構成要素のさらなる実施形態は、上記で開示された核酸配列によってコードされるタンパク質と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他のタンパク質を含む。さらに、そのようなドメインの非制限的な例を本明細書に提供する。

本明細書で使用される場合、「第１世代ＣＡＲ」は、抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含むＣＡＲを指す。「第２世代ＣＡＲ」は、１つの共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ２８）をさらに含む第１世代ＣＡＲを指す。「第３世代ＣＡＲ」は、２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ、またはＯＸ４０）をさらに含む第１世代ＣＡＲを指す。「第４世代ＣＡＲ」（「ＴＲＵＣＫ」としても公知）は、追加の因子（例えば、炎症促進性サイトカインＩＬ－１２）を分泌するようにさらに操作されたＣＡＲＴ細胞を指す。これらのＣＡＲ技術および細胞治療に関する概説は、Maus, M. et al. Clin. Cancer Res. 22(3): 1875-84(2016)に見出される。

本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、新たに合成された分泌性のまたは膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に通常存在するアミノ酸配列を意図する。これは、ポリペプチドを、細胞膜を超えてまたは細胞膜内に方向付けるように作用し、その後除去される。そのような例は当技術分野で周知である。非制限的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号および第５，９５８，７３６号に記載されるものである。

本明細書で調節ポリヌクレオチドを参照して使用される場合、用語「動作可能に連結された」は、特異的タンパク質が調節ポリヌクレオチドに結合すると、連結されたポリヌクレオチドが転写されるように、調節ポリヌクレオチドと、それが連結されるポリヌクレオチド配列との間の会合を指す。

「組成物」は、典型的に活性剤、例えばＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲＮＫ細胞、抗体、化合物、および不活性（例えば、検出可能な作用剤または標識）または活性な天然に存在するまたは天然に存在しない担体、例えばアジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝液、塩類、親油性溶媒、保存剤、アジュバント等の組合せを意図し、薬学的に許容される担体を含む。担体はまた、薬学的賦形剤、および添加剤タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖、ジ、トリ、テトラオリゴ糖、およびオリゴ糖；誘導体化糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖等、および多糖類、または糖ポリマーを含む糖）も含み、単独でまたは組み合わせて、単独または重量もしくは体積で１～９９．９９％を含んで存在することができる。例示的なタンパク質賦形剤としては、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。緩衝能に関して機能することができる代表的なアミノ酸／抗体構成要素としては、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等が挙げられる。炭水化物賦形剤もまた、この技術の範囲内であると意図され、その例としては、これらに限定されないが、単糖、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース等；二糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等；多糖、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等；ならびにアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、およびミオイノシトールが挙げられる。

細胞、処置、治療、作用剤、薬物、および薬学的製剤を含む、本開示に従って使用される組成物は、投与を容易にするためおよび投薬量を均一にするために単位投薬剤形に包装することができる。用語「単位用量」または「投薬量」は、対象において使用するために適した物理的に個別の単位を指し、各単位はその投与、すなわち適切な経路およびレジメンに関連して所望の応答を生じるように計算された組成物の既定量を含有する。投与される量は、処置の回数および単位用量の両方に従い、所望の結果および／または保護に依存する。組成物の正確な量はまた、医師の判断にも依存し、各個体に対して特異的である。用量に影響を及ぼす要因としては、対象の身体状況および臨床状況、投与経路、意図される処置の目標（症状の軽減または治癒）、ならびに特定の組成物の効力、安定性、および毒性が挙げられる。製剤化されると、溶液は、投薬製剤と適合する様式、および治療的または予防的に有効な量で投与される。製剤は、多様な投薬剤形で、例えば本明細書に記載される注射可能溶液のタイプで容易に投与される。

用語「コンセンサス配列」は、本明細書で使用される場合、複数の配列のシリーズを整列させることによって決定され、その複数の配列の各々の対応する位置でアミノ酸または塩基の優勢な選択を表す理想的な配列を定義するアミノ酸または核酸配列を指す。複数の配列のシリーズの配列に応じて、そのシリーズのコンセンサス配列は、ゼロ、１つ、少数、またはそれより多くの置換によって配列の各々とは異なり得る。同様に、複数の配列のシリーズの配列に応じて、１つより多くのコンセンサス配列がそのシリーズに関して決定され得る。コンセンサス配列の生成は、集中的数理解析に供されている。様々なソフトウェアプログラムを使用してコンセンサス配列を決定することができる。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ８αヒンジドメイン」は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ８αヒンジドメイン配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、またはあるいは少なくとも９０％の配列同一性、またはあるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。ヒト、マウス、および他の種のＣＤ８αヒンジドメインの例としての配列は、Pinto, R.D. et al.(2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177に提供される。ＣＤ８αヒンジドメインに関連する配列は、Pinto, R.D. et al.(2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177に提供される。そのような非制限的な例としては：
ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン；
ＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹ
マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン；
ＫＶＮＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹ
ネコＣＤ８アルファヒンジドメイン；
ＰＶＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＱＡＰＩＴＴＳＱＲＶＳＬＲＰＧＴＣＱＰＳＡＧＳＴＶＥＡＳＧＬＤＬＳＣＤＩＹ、およびその各々の均等物が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ８α膜貫通ドメイン」は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ８α膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、またはあるいは少なくとも９０％の配列同一性、またはあるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸１８３～２０３位、またはマウスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）のアミノ酸１９７～２１７位、およびラットＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１３７２６．１）のアミノ酸１９０～２１０位に関連する断片配列は、ＣＤ８α膜貫通ドメインの追加の例としての配列を提供する。記載のＮＣＢＩの各々に関連する配列は以下のように提供される：
ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ；
マウスＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：ＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩ；
ラットＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：ＩＷＡＰＬＡＧＩＣＡＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＩ、およびその各々の均等物。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ２８膜貫通ドメイン」は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ２８膜貫通ドメイン配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、またはあるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００６７１２８６２．２およびＸＭ＿００９４４４０５６．１に関連する断片配列は、ＣＤ２８膜貫通ドメインの追加の非制限的な例としての配列を提供する。記載の受託番号の各々に関連する配列は本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、用語「４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域」は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書で示される４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、またはあるいは９０％の配列同一性、またはあるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の例示的な配列は、米国特許出願公開第２０１３／０２６６５５１Ａ１号（米国特許出願第１３／８２６，２５８号として提出）に提供される。米国特許出願第１３／８２６，２５８号に開示される関連する４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の配列を以下に開示する：

４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ、およびその各々の均等物。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域」は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、またはあるいは９０％の配列同一性、またはあるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。ＣＤ２８共刺激領域は、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、米国特許第５，６８６，２８１号；Geiger, T.L. et al.(2001) Blood 98:2364-2371；Hombach, A. et al.(2001) J Immunol. 167:6123-6131；Maher, J. et al.(2002) Nat Biotechnol. 20:70-75；Haynes, N.M. et al.(2002) J Immunol. 169:5780-5786；Haynes, N.M. et al.(2002) Blood 100:3155-3163に提供される。非制限的な例としては、以下のＣＤ２８配列の残基１１４～２２０：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS、およびその均等物が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域」は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域の非制限的な例としての配列は、米国特許出願公開第２０１５／００１７１４１Ａ１号に提供され、例示的なポリヌクレオチド配列を以下に提供する。

ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域：

ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA

本明細書で使用される場合、用語「ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域」は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、またはあるいは９０％の配列同一性、またはあるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域の非制限的な例としての配列は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示され、以下に提供される例示的な配列を含む。

ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域：

AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」は、この名称に関連する特定のタンパク質断片、および本明細書で示されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、またはあるいは９０％の配列同一性、またはあるいは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの例としての配列は、米国特許出願第１３／８２６，２５８号（米国特許出願公開第２０１３／０２６６５５１号として公開）に提供される。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに関連する配列は以下：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR、およびその均等物として記載される。

本明細書で使用される場合、用語「Ｔ２Ａ」および「２Ａペプチド」は、互換的に使用され、任意の２Ａペプチドもしくはその断片、任意の２Ａ様ペプチドもしくはその断片、またはＸが一般的に自己切断であると考えられる任意のアミノ酸を指すコンセンサスポリペプチドモチーフＤ－Ｖ／Ｉ－Ｅ－Ｘ－Ｎ－Ｐ－Ｇ－Ｐを含有する比較的短いペプチド配列（起源のウイルスに応じて２０アミノ酸長の次元の）において必須のアミノ酸を含む人工ペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、用語「自殺遺伝子」は、細胞のアポトーシスを誘導することが可能な遺伝子であり、非制限的な例としては、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０またはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ、または誘導型カスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）が挙げられる。自殺遺伝子は、多様な経路に沿って機能し得、一部の例では低分子などの誘導剤によって誘導可能であり得る。例えば、ｉＣａｓｐ自殺遺伝子は、誘導剤に結合するように最適化されたタンパク質に動作可能に連結されたカスパーゼタンパク質の部分を含み、自殺遺伝子を含む誘導剤を細胞に導入すると、カスパーゼの活性化および前記細胞のその後のアポトーシスをもたらす。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチ機構」は、細胞外、膜貫通、および細胞内ドメインを指し、細胞外ドメインは、標的細胞上でまたは標的細胞によって発現される標的抗原以外の分子に対して特異的な標識、結合ドメイン、またはタグを含む標的特異的結合エレメントを含む。ＣＡＲの特異性は、標的抗原結合ドメイン、およびＣＡＲ上の標識、結合ドメイン、またはタグによって認識されるまたはそれらに結合するドメインを含む第２の構築物によって提供される。例えば、ＷＯ２０１３／０４４２２５号、ＷＯ２０１６／０００３０４号、ＷＯ２０１５／０５７８３４号、ＷＯ２０１５／０５７８５２号、ＷＯ２０１６／０７００６１号、米国特許第９，２３３，１２５号、米国特許出願公開第２０１６／０１２９１０９号を参照されたい。このように、ＣＡＲを発現するＴ細胞を対象に投与することができるが、これは特異的結合ドメインを含む第２の組成物が投与されるまでその標的抗原に結合することができない。

本明細書で使用される場合、用語「Ｂ細胞」は、適応免疫系の液性免疫におけるリンパ球のタイプを指す。Ｂ細胞は、主に抗体を作製するように機能し、抗原提示細胞として作用し、サイトカインを放出し、および抗原相互作用による活性化後にメモリーＢ細胞を発達させる。Ｂ細胞は、他のリンパ球、例えばＴ細胞とは、細胞表面上のＢ細胞受容体の存在によって区別することができる。Ｂ細胞は、単離され得るか、または市販の供給源から得ることができる。市販のＢ細胞株の非制限的な例としては、株ＡＨＨ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８１４６（商標））、ＢＣ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２３０（商標））、ＢＣ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２３１（商標））、ＢＣ－３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２７７（商標））、ＣＡ４６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６４８（商標））、ＤＧ－７５［Ｄ．Ｇ．－７５］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６２５（商標））、ＤＳ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１１０２（商標））、ＥＢ－３［ＥＢ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８５（商標））、Ｚ－１３８（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－３００１）、ＤＢ（ＡＴＣＣＣＲＬ－２２８９）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣＣＲＬ－２６３１）、Ｐｆｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣＣＲＬ－２６３２）、ＳＲ（ＡＴＣＣＣＲＬ－２２６２）、ＪＭ－１（ＡＴＣＣＣＲＬ－１０４２１）、ＮＦＳ－５Ｃ－１（ＡＴＣＣＣＲＬ－１６９３）；ＮＦＳ－７０Ｃ１０（ＡＴＣＣＣＲＬ－１６９４）、ＮＦＳ－２５Ｃ－３（ＡＴＣＣＣＲＬ－１６９５）、およびＳＵＰ－Ｂ１５（ＡＴＣＣＣＲＬ－１９２９）が挙げられる。さらなる例としては、これらに限定されないが、未分化および大細胞リンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＬ、ＤＬ－４０、ＦＥ－ＰＤ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９、Ｋｉ－ＪＫ、Ｍａｃ－２ＡＰｌｙ１、ＳＲ－７８６、ＳＵ－ＤＨＬ－１、－２、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、および－１６、ＤＯＨＨ－２、ＮＵ－ＤＨＬ－１、Ｕ－９３７、Ｇｒａｎｄａ５１９、ＵＳＣ－ＤＨＬ－１、ＲＬ；ホジキンリンパ腫、例えば、ＤＥＶ、ＨＤ－７０、ＨＤＬＭ－２、ＨＤ－ＭｙＺ、ＨＫＢ－１、ＫＭ－Ｈ２、Ｌ４２８、Ｌ５４０、Ｌ１２３６、ＳＢＨ－１、ＳＵＰ－ＨＤ１、ＳＵ／ＲＨ－ＨＤ－１が挙げられる。そのような市販の細胞株の非制限的な例示的な供給源としては、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）、およびＧｅｒｍａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟するリンパ球のタイプを指す。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、他のリンパ球、例えばＢ細胞とは細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって区別される。Ｔ細胞は、単離され得るか、または市販の供給源から得ることができる。「Ｔ細胞」は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマ－デルタＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現する全てのタイプの免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を含み、これらの細胞は細胞傷害性応答を媒介することが可能である。市販のＴ細胞株の非制限的な例としては、株ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０１（商標））、ＢＣＬ２Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９９（商標））、ＮｅｏＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９８（商標））、ＴＡＬＬ－１０４細胞傷害性ヒトＴ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１１３８６）が挙げられる。さらなる例としては、これらに限定されないが、成熟Ｔ細胞株、例えばＤｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ－８、ＨＰＢ－ＭＬｐ－Ｗ、ＨＵＴ７８、ＨＵＴ１０２、Ｋａｒｐａｓ３８４、Ｋｉ２２５、Ｍｙ－Ｌａ、Ｓｅ－Ａｘ、ＳＫＷ－３、ＳＭＺ－１、およびＴ３４；ならびに未成熟Ｔ細胞株、例えば、ＡＬＬ－ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＣＭＬ－Ｔ１、ＤＮＤ－４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ－９、ＨＤ－Ｍａｒ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、Ｈ－ＳＢ２、ＨＴ－１、ＪＫ－Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ－３７、ＫＯＰＴ－Ｋ１、Ｋ－Ｔ１、Ｌ－ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ－１、ＭＯＬＴ３、ＭＯＬＴ－４、ＭＯＬＴ１３、ＭＯＬＴ－１６、ＭＴ－１、ＭＴ－ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ－２５５、ＰＦ－３８２、ＰＦＩ－２８５、ＲＰＭＩ－８４０２、ＳＴ－４、ＳＵＰ－Ｔ１～Ｔ１４、ＴＡＬＬ－１、ＴＡＬＬ－１０１、ＴＡＬＬ－１０３／２、ＴＡＬＬ－１０４、ＴＡＬＬ－１０５、ＴＡＬＬ－１０６、ＴＡＬＬ－１０７、ＴＡＬＬ－１９７、ＴＫ－６、ＴＬＢＲ－１、－２、－３、および－４、ＣＣＲＦ－ＨＳＢ－２（ＣＣＬ－１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５（ＡＴＣＣＴＩＢ－１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣＣＲＬ－１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣＣＲＬ－２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣＣＲＬ－１８７３）、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＡＴＣＣＣＲＭ－ＣＣＬ－１１９）；ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣＣＲＭ－ＴＩＢ－１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣＣＲＬ－８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣＴＩＢ－１６２）が挙げられる。ＲＥＨ、ＮＡＬＬ－１、ＫＭ－３、Ｌ９２－２２１を含むがこれらに限定されないヌル細胞型白血病株は、他の白血病およびリンパ腫に由来する細胞株、例えばＫ５６２赤白血病、ＴＨＰ－１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ－１白血病、ＫＧ－１白血病、Ｕ２６６骨髄腫と同様に、免疫細胞の別の市販の供給源である。そのような市販の細胞株の非制限的な例示的な供給源としては、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ＮＫ細胞」は、ナチュラルキラー細胞としても公知であり、骨髄を起源とし、自然免疫系において重要な役割を果たすリンパ球のタイプを指す。ＮＫ細胞は、細胞表面上に抗体および主要組織適合遺伝子複合体が存在しない場合であっても、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、または他のストレスを受けた細胞に対して急速な免疫応答を提供する。ＮＫ細胞は、単離され得るか、または市販の供給源から得ることができる。市販のＮＫ細胞株の非制限的な例としては、株ＮＫ－９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））、ＮＫ－９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０８（商標））が挙げられる。さらなる例としては、これらに限定されないが、ＮＫ株ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ－１、ＮＫＬ、ＮＫ－ＹＳ、ＮＯＩ－９０、およびＹＴが挙げられる。そのような市販の細胞株の非制限的な例示的な供給源としては、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）経路に依存する配列特異的遺伝子操作技術を指す。ＣＲＩＳＰＲを使用して、遺伝子編集および／または遺伝子調節を行うことができ、ならびに単純に特異的ゲノム位置にタンパク質を標的化することができる。「遺伝子編集」は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列に対する欠失、挿入、一本鎖もしくは二本鎖切断、または塩基置換の導入を通して変化する遺伝子操作のタイプを指す。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換えを利用して編集を実施する。遺伝子調節は、タンパク質またはＲＮＡなどの特異的遺伝子産物の産生の増加または減少を指す。

用語「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いる遺伝子編集のために特異的ポリヌクレオチド配列を標的化するために使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性のためにｇＲＮＡおよびドナー治療ポリヌクレオチドを設計する技術は、当技術分野で周知である。例えば、Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7、Mohr, S. et al.(2016) FEBS Journal 283: 3232-38、およびGraham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260を参照されたい。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む融合ポリヌクレオチド；またはＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、ｇＲＮＡは合成である（Kelley, M. et al.(2016) J of Biotechnology 233(2016) 74-83）。

用語「Ｃａｓ９」は、この名称で呼ばれるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを指す。非制限的な例示的なＣａｓ９としては、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９、ヌクレアーゼデッドＣａｓ９、ならびにオルトログおよびその各々の生物学的均等物が挙げられる。オルトログとしては、これらに限定されないが、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（「ｓｐＣａｓ９」）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａからのＣａｓ９；ならびにＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐｐ．およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＵ１１２を含む様々な細菌種からのＣｐｆ１（Ｃａｓ９と類似のカッティング機能を実施する）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。このように、この用語は、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学改変もしくは生化学改変された、非天然の、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。

用語「コードする」は、核酸配列に適用される場合、その天然の状況にある場合または当業者に周知の方法によって操作された場合に、転写および／または翻訳されて、ポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを産生することができる場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コード配列をそこから推定することができる。

本明細書で使用される場合、用語シグナルペプチドまたはシグナルポリペプチドは、新たに合成された分泌性のまたは膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に通常存在するアミノ酸配列を意図する。これは、ポリペプチドを、細胞膜を超えてまたは細胞膜内に方向付けるように作用し、その後除去される。そのような例は当技術分野で周知である。非制限的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号および第５，９５８，７３６号に記載されるものである。

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣ等を含むがこれらに限定されない、異なる宿主間を移動するように設計された核酸構築物を指す。「ウイルスベクター」は、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏ、またはｉｎｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換えにより産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。一部の実施形態では、プラスミドベクターは市販のベクターから調製され得る。他の実施形態では、ウイルスベクターは、当技術分野で公知の技術に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ等から産生され得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が挙げられる。感染性のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に基づくベクターは、タンパク質を製造するために使用することができ、タバコの葉にグリフィスシンを発現することが報告されている（O'Keefe et al.(2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104）。アルファウイルスベクター、例えばセムリキ森林ウイルスに基づくベクターおよびシンドビスウイルスに基づくベクターもまた、遺伝子治療および免疫療法において使用するために開発されている。Schlesinger & Dubensky(1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439およびYing et al.(1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照されたい。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドなどの目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子移入において使用するためにベクターの近代的使用に関するさらなる詳細は、例えば、Kotterman et al.(2015) Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17に見出され得る。プロモーターおよびその中にポリヌクレオチドを動作可能に連結することができるクローニングサイトの両方を含有するベクターは、当技術分野で周知である。そのようなベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでＲＮＡを転写することが可能であり、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＳａｎｔａＣｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などの供給源から市販されている。

本明細書で使用される場合、用語「単離された細胞」は、一般的に組織の他の細胞から実質的に分離されている細胞を指す。用語は、原核細胞および真核細胞を含む。

「免疫細胞」としては、例えば、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（blood cell）（白血球（leukocyte））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が挙げられる。「Ｔ細胞」は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマ－デルタＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現する免疫細胞の全てのタイプを含む。「細胞傷害性細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を含み、これらの細胞は細胞傷害性応答を媒介することが可能である。

本明細書で使用される場合、語句「免疫応答」またはその均等物「免疫学的応答」は、細胞媒介性の応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞またはその分泌産物によって媒介される）の発生を指す。細胞性免疫応答は、ウイルス感染症を処置または防止するため、抗原特異的Ｂ－ｒｅｇ細胞、ＴＣ１、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、および／もしくはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ならびに／または疾患により生成された自己制御性Ｔ細胞およびＢ細胞「メモリー」細胞を増大させるために、クラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ分子に関連するポリペプチドエピトープの提示によって誘発される。応答はまた、他の構成要素の活性化も伴い得る。一部の態様では、用語「免疫応答」は、免疫細胞の制御性ネットワークの形成を包含するために使用され得る。このように、用語「制御性ネットワーク形成」は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくは制御性Ｔ細胞が、例えばＢ細胞またはその非制限的な例が樹状細胞、単球、およびマクロファージである抗原提示細胞などの、しかしこれらに限定されない他の免疫細胞のさらなる分化をトリガするように誘発された免疫応答を指し得る。ある特定の実施形態では、制御性ネットワークの形成は、Ｂ細胞が制御性Ｂ細胞へと分化することを伴う。ある特定の実施形態では、制御性ネットワークの形成は、寛容原性抗原提示細胞の形成を伴う。

用語「形質導入する」または「形質導入」は、キメラ抗原受容体細胞の産生に適用される場合、外来のヌクレオチド配列が細胞に導入されるプロセスを指す。一部の実施形態では、この形質導入はベクターを介して行われる。

本明細書で使用される場合、細胞に関連する場合の用語「自己」は、単離され、同じ対象（レシピエントまたは宿主）に戻すように注入される細胞を指す。「同種」は、非自己細胞を指す。

「有効量」または「有効な量」は、哺乳動物または他の対象を処置するために投与される場合、疾患のそのような処置を行うために十分である作用剤（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＣＡＲ細胞）の量、または２つもしくはそれより多くの作用剤の組み合わせた量を指す。「有効量」は、作用剤、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重等に応じて変化する。

本明細書で使用される場合、「がん」は、異常な制御されない複製を示す細胞が対象に存在することによって特徴付けられる疾患状況であり、用語「腫瘍」と互換的に使用され得る。

「固形腫瘍」は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない異常な組織塊である。固形腫瘍は良性または悪性であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプから名付けられる。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫、およびリンパ腫が挙げられる。

用語「Ｂ細胞リンパ腫または白血病」は、リンパ系または骨髄の組織（issues）において形成し、がん内の細胞を体の他の部分に浸潤するまたは広がる能力によって宿主生物に対して病的にする悪性の形質転換を受けたがんのタイプを指す。

本明細書で使用される場合、用語「含む」は、組成物および方法が列挙されたエレメントを含むが他を排除しないことを意味すると意図される。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、意図される使用の組合せに対して本質的に重要ないかなる他のエレメントも排除することを意味する。例えば、本明細書において定義されるエレメントから本質的になる組成物は、単離および精製方法による微量の夾雑物、ならびに薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝食塩水、保存剤等を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量より多くのエレメントおよび本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法ステップを排除することを意味する。これらの移行句の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内である。

本明細書で使用される場合、用語「検出可能マーカー」は、検出可能なシグナルを直接または間接的に産生することが可能な少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストは、例えば比色測定、蛍光、発光によって検出可能なシグナルを産生する酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、発色団、例えば蛍光、発光色素、電子顕微鏡によってまたは導電率、電流計、電圧計、インピーダンスなどのその電気的特性によって検出される電子密度を有する基、検出可能な基、例えばその分子が、その物理的および／または化学的特性の検出可能な改変を誘導するために十分なサイズである基が挙げられ、そのような検出は、光学的方法、例えば回折、表面プラズモン共鳴、表面変化、接触角変化、または原子力分光法、トンネル効果、もしくは放射活性分子、例えば^３２Ｐ、^３５Ｓ、もしくは^１２５Ｉなどの物理的方法によって達成可能である。

本明細書で使用される場合、用語「精製マーカー」は、精製または同定にとって有用な少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストは、Ｈｉｓ、ｌａｃＺ、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＢＣＣＰ、ｃ－ｍｙｃ、ＣａＭ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、チェリー、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓｎａｐ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、またはＳ－タンパク質を含む。適した直接または間接的蛍光マーカーは、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、チェリー、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｔａｍｒａ、テキサスレッド、ローダミン、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒｓ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、または他の任意の蛍光色素もしくはハプテンを含む。

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／またはそれによって転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定され得る。一態様では、１つの試料からの遺伝子の発現レベルを、対照または参照試料からのその遺伝子の発現レベルと直接比較してもよい。別の態様では、１つの試料からの遺伝子の発現レベルを、化合物を投与後の同じ試料からのその遺伝子の発現レベルと直接比較してもよい。

本明細書で使用される場合、２つまたはそれより多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈において使用される場合の「相同性」または「同一な」、パーセント「同一性」または「類似性」は、明記された領域（例えば、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列）に対して同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の明記されたパーセンテージ、例えば少なくとも６０％同一性、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくそれより高い同一性を有する２つまたはそれより多くの配列または小配列を指す。相同性は、比較目的のために整列させることができる各々の配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列における位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有されるマッチする位置または相同な位置の数の関数である。アライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1に記載されるプログラムを使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメーターをアライメントのために使用する。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメーター：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝配列５０位；選別＝ＨＩＧＨＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見出され得る。用語「相同性」または「同一な」、パーセント「同一性」または「類似性」はまた、試験配列の相補体を指すか、またはそれに適用することができる。これらの用語はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含む。本明細書に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を考慮に入れることができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長またはヌクレオチド長である領域、またはより好ましくは少なくとも５０～１００アミノ酸長またはヌクレオチド長にわたって存在する。「無関係な」または「非相同な」配列は、本明細書に開示される配列の１つと４０％未満の同一性、またはあるいは２５％未満の同一性を共有する。

語句「第１選択」、または「第２選択」、または「第３選択」は、患者が受ける処置の順序を指す。第１選択治療レジメンは、最初に与えられる処置であり、第２または第３選択治療はそれぞれ、第１選択治療の後または第２選択治療の後に与えられる処置である。米国国立がん研究所は、第１選択治療を「疾患または状態の最初の処置」と定義している。がんを有する患者では、一次処置は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの治療の組合せであり得る。第１選択治療はまた、当業者に「一次治療および一次処置」とも呼ばれている。ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイト、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ、最終訪問日２００８年５月１日を参照されたい。典型的には、患者が第１選択治療に対して正の臨床応答または亜臨床応答を示さなかった場合、または第１選択治療を中止した場合に、患者には、その後の化学療法レジメンが与えられる。

一態様では、抗体の「均等物」または「生物学的均等物」という用語は、ＥＬＩＳＡまたは他の適した方法によって測定した場合に、抗体がそのエピトープタンパク質またはその断片に選択的に結合する能力を意味する。生物学的に均等な抗体としては、これらに限定されないが、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、ペプチド、抗体断片、抗体バリアント、抗体誘導体、および抗体模倣体が挙げられる。

明白に列挙されていなくとも、および特に意図されていなくとも、本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、抗体またはその断片に関する場合、そのようなものの均等物または生物学的均等物は、本開示の範囲内であると意図されると推論すべきである。本明細書で使用される場合、用語「その生物学的均等物」は、参照タンパク質、抗体もしくはその断片、ポリペプチド、または核酸に言及する場合の「その均等物」と同義であると意図され、最小の相同性を有するが、なおも所望の構造または機能性を維持する均等物を意図する。本明細書に具体的に列挙されていない限り、上記のいずれもその均等物を含むと企図される。例えば、均等物は、参照タンパク質、ポリペプチド、抗体もしくはその断片、または核酸に対して少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、およびあるいは、または少なくとも約８５％、またはあるいは少なくとも約９０％、またはあるいは少なくとも約９５％、またはあるいは少なくとも９８％のパーセント相同性または同一性を意図する、および／あるいは実質的に均等な生物活性を示す。あるいはポリヌクレオチドを参照する場合、その均等物は、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである。

語句「均等なポリペプチド」または「均等なペプチド断片」は、例証されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは例証されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのその相補体と、高ストリンジェンシーでハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、標準的なまたは対照の生物活性と比較してｉｎｖｉｖｏで類似の生物活性、例えばおよそ１００％、またはあるいは９０％より高い、またはあるいは８５％より高い、またはあるいは７０％より高い活性を示すタンパク質、ポリヌクレオチド、またはペプチド断片を指す。本開示の範囲内の追加の実施形態は、６０％より高い、またはあるいは６５％より高い、またはあるいは７０％より高い、またはあるいは７５％より高い、またはあるいは８０％より高い、またはあるいは８５％より高い、またはあるいは９０％より高い、またはあるいは９５％より高い、またはあるいは９７％より高い、またはあるいは９８％より高い、または９９％の配列相同性を有することによって同定される。パーセンテージ相同性は、適切な条件下でのＢＬＡＳＴ実行などのプログラムを使用して配列比較することによって決定することができる。一態様では、プログラムは、デフォルトパラメーターの下で実行される。

別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、整列させた場合に、塩基（またはアミノ酸）のそのパーセンテージが２つの配列の比較において同じであることを意味する。アライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1に記載されるプログラムによって決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメーターをアライメントのために使用する。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメーター：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝配列５０位；選別＝ＨＩＧＨＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見出され得る。

「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが、ヌクレオチド残基の塩基間での水素結合を介して安定化される複合体を形成するように反応する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対形成、フーグスティーン結合、または他の任意の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれより多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より集中的なプロセスにおけるステップ、例えばＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成し得る。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては：約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中等度のハイブリダイゼーション条件の例としては：約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては：約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。一般的に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分～２４時間であり、洗浄ステップは１、２回、またはそれより多く、および洗浄インキュベーション時間は約１、２、または１５分である。ＳＳＣは、０．１５ＭＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を使用してＳＳＣの均等物を用いることができると理解される。

「腫瘍組織タイプに対応する正常な細胞」は、腫瘍組織と同じ組織タイプからの正常な細胞を指す。非制限的な例は、肺腫瘍を有する患者からの正常な肺細胞、または結腸腫瘍を有する患者からの正常な結腸細胞である。

用語「単離された」は、本明細書で使用される場合、他の材料を実質的に含まない分子または生物材料または細胞材料を指す。一態様では、用語「単離された」は、天然起源に存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞オルガネラ、または組織もしくは臓器からそれぞれ分離された、核酸、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）、または細胞もしくは細胞オルガネラ、または組織もしくは臓器を指す。用語「単離された」はまた、細胞材料、ウイルス材料、または組換えＤＮＡ技術によって産生された場合には培養培地、または化学合成された場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。その上、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、天然の状況で見出されない核酸断片も含むことを意味する。用語「単離された」はまた、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すために使用され、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。用語「単離された」はまた、本明細書において、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すために使用され、培養および操作された細胞または組織の両方を包含することを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされている細胞によって産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば骨髄腫細胞と免疫脾細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって産生される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。

用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、互換的に使用され、その最も広い意味において２つまたはそれより多いサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテル等の結合によって連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチド配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンならびにＤおよびＬ光学異性体の両方、アミノ酸アナログ、ならびにペプチド模倣体を含む天然および／または非天然、または合成アミノ酸のいずれかを指す。

用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を実施し得る。以下はポリヌクレオチドの非制限的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変を、ポリヌクレオチドのアセンブリ前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合化後に例えば標識構成要素とのコンジュゲーションによってさらに改変することができる。用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。特に明記していない場合または必要でない場合、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖型および二本鎖を構成することが公知であるまたは予想される２つの相補的な一本鎖型の各々の両方を包含する。

本明細書で使用される場合、用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的な用語として意図される。このように、例えば精製された核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、タンパク質または他の夾雑物から全体がまたは部分的に単離されたものである。一般的に、本開示内で使用するための実質的に精製されたペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、混合する前の調製物に、またはペプチド、タンパク質、生物学的複合体、もしくは他の活性化合物と医薬担体、賦形剤、緩衝液、吸収増強剤、安定化剤、保存剤、アジュバント、もしくは治療的投与のための完全な医薬製剤中の他の補助成分との製剤に存在する全ての高分子種の８０％より多くを含む。より典型的には、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、他の製剤成分との混合前の精製調製物に存在する全ての高分子種の９０％より多く、しばしば９５％より多くを表すように精製される。他の例では、精製調製物は、本質的に均一であり得、他の高分子種は従来の技術によって検出可能ではない。

本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」は、少なくとも１０^－６Ｍの結合親和性での抗体と抗原との間の接触を意味する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０^－７Ｍ、好ましくは１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、または１０^－１２Ｍの親和性で結合する。

本明細書で使用される場合、用語「組換えタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチドであって、一般的にポリペプチドをコードするＤＮＡが適した発現ベクターに挿入され、次にこれを使用して宿主細胞を形質転換し、異種タンパク質を産生する、ポリペプチドを指す。

本明細書で使用される場合、対象における疾患を「処置する」または「処置」は、（１）疾患の素因を有するもしくはまだ疾患の症状を示していない対象において症状もしくは疾患が起こるのを防止すること；（２）疾患を阻害するもしくはその発生を停止させること；または（３）疾患もしくは疾患の症状を回復させるもしくは退行を引き起こすことを指す。当技術分野で理解されているように、「処置」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術の目的に関して、有益なまたは所望の結果は、これらに限定されないが、１つまたは複数の症状の軽減または回復、状態（疾患を含む）の程度の減少、状態（疾患を含む）の状況の安定化（すなわち、悪化していない）、状態（疾患を含む）の遅延または鈍化、状態（疾患を含む）の進行、回復、または緩和、状況および寛解（部分的であるか全体であるか）、検出可能であるか検出不能であるか、のうちの１つまたは複数を含み得る。疾患ががんである場合、以下の臨床エンドポイントは、処置の非制限的な例である：腫瘍負荷の低減、腫瘍成長の鈍化、より長い全生存、より長い腫瘍無増悪期間、腫瘍の転移の阻害または転移の低減。一態様では、処置は予防を除外する。

本明細書で使用される場合、細胞、組織、または臓器に関して用語「過剰発現する」は、対照細胞、対照組織（issue）、または臓器において産生される量より多くの量までタンパク質を発現する。過剰発現されるタンパク質は、宿主細胞に対して内因性または宿主細胞に対して外因性であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「リンカー配列」は、１～１０アミノ酸、またはあるいは８アミノ酸、またはあるいは６アミノ酸、またはあるいは５アミノ酸を含み、これが１～１０回、またはあるいは１～約８回、またはあるいは１～約６回、またはあるいは約５回、または４回、またはあるいは３回、またはあるいは２回繰り返され得る任意のアミノ酸配列に関する。例えば、リンカーは、３回繰り返されるペンタペプチドからなる最大１５アミノ酸残基を含み得る。リンカー配列の非制限的な例は、当技術分野で公知であり、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（およびその均等物）；トリペプチドＥＦＭ；またはＧｌｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｍｅｔ、およびその各々の均等物である。一態様では、リンカー配列は、ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｓｅｒの３コピーを含む（Ｇｌｙｃｉｎｅ４Ｓｅｒｉｎｅ）３フレキシブルポリペプチドリンカー、およびその均等物である。

本明細書で使用される場合、用語「エンハンサー」は、本明細書で使用される場合、発現される核酸配列に関連してその位置および方向とは無関係に核酸配列の転写を増強する、改善する、または回復する配列エレメントを指す。エンハンサーは、単一のプロモーターからの転写または１つより多くのプロモーターからの同時の転写を増強し得る。転写を改善するこの機能性が保持されるかまたは実質的に保持される（例えば、野生型活性、すなわち全長の配列の活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）限り、野生型エンハンサー配列の任意の切断型、突然変異型、またはそうでなければ改変されたバリアントもまた、上記の定義内である。

用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、コード配列、例えば遺伝子の発現を調節する任意の配列を指す。プロモーターは例えば、構成的、誘導型、抑圧性、または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。これは、調節タンパク質および分子がＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などに結合し得る遺伝子エレメントを含有し得る。

本明細書で使用される場合、用語「ＷＰＲＥ」または「ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント」は、この名称に関連する特定のヌクレオチド断片、および本明細書に示されるＷＰＲＥ配列と少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する類似の生物機能を有する他の任意の分子を指す。例えば、ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０４５１４）に存在するヒトＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）と類似の領域、およびこのゲノム配列の１０９３～１６８４位の５９２ヌクレオチドが転写後調節領域に対応する領域を指す（Donello, J.E. et al.(1998) Journal of Virology 72:5085-5092）。レトロウイルスベクターを使用する分析から、目的の遺伝子の３’末端非翻訳領域に挿入されたＷＰＲＥが、タンパク質の産生量を５～８倍増加させることが明らかとなった。同様に、ＷＰＲＥの導入がｍＲＮＡ分解を抑制することも報告されている（Zufferey, R. et al.(1999) Journal of Virology 73:2886-2892）。広い意味で、ｍＲＮＡを安定化することによってアミノ酸翻訳の効率を増加させるＷＰＲＥなどのエレメントもまた、エンハンサーであると考えられる。

用語「接触させる」は、２つまたはそれより多くの間の直接または間接的な結合または相互作用を意味する。直接相互作用の特定の例は結合である。間接的相互作用の特定の例は、１つの実体が中間分子に作用し、次にこれが、第２の参照実体に作用する場合である。本明細書で使用される場合、接触は、溶液中、固相、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、細胞内、およびｉｎｖｉｖｏを含む。ｉｎｖｉｖｏでの接触は、投与することまたは投与と呼ぶことができる。

用語「導入する」は、キメラ抗原受容体細胞などの改変細胞を産生する方法に適用される場合、それによって外来の（すなわち、外部のまたは細胞外）作用剤が宿主細胞に導入され、それによって外来の作用剤を含む細胞を産生するプロセスを指す。核酸を導入する方法としては、これらに限定されないが、形質導入、レトロウイルス遺伝子移入、トランスフェクション、電気穿孔、形質転換、ウイルス感染、および当技術分野で公知の他の組換えＤＮＡ技術が挙げられる。一部の実施形態では、形質導入は、ベクター（例えば、ウイルスベクター）を介して行われる。一部の実施形態では、トランスフェクションは、化学担体、ＤＮＡ／リポソーム複合体、またはミセル（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を介して行われる。一部の実施形態では、ウイルス感染は、細胞に、目的のポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶ）を含むウイルス粒子を感染させることを介して行われる。一部の実施形態では、導入は、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）媒介遺伝子編集をさらに含む。非核酸の外来の作用剤（例えば、可溶性因子、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、酵素、増殖因子、シグナル伝達分子、低分子阻害剤）を導入する方法は、これらに限定されないが、細胞を外来の作用剤の存在下で培養すること、細胞に作用剤を接触させること、細胞に作用剤および賦形剤を含む組成物を接触させること、ならびに細胞に作用剤を含む小胞またはウイルス粒子を接触させることを含む。

用語「培養する」は、細胞の増大および増殖に都合がよい条件下の培養培地中で細胞を成長させることを指す。用語「培養培地」または「培地」は、当技術分野で認識され、一般的に生きている細胞の培養のために使用される任意の物質または調製物を指す。用語「培地」は、細胞培養に関連して使用される場合、細胞周囲の環境の構成要素を含む。培地は、固体、液体、気体様、または相および材料の混合物であり得る。培地は、液体増殖培地および細胞成長を維持しない液体培地を含む。培地はまた、寒天、アガロース、ゼラチン、およびコラーゲン基質などのゼラチン様培地も含む。例示的な気体様培地としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体支持体上で成長する細胞が曝露される気体様の相を含む。用語「培地」はまた、それがたとえまだ細胞と接触していなくとも、細胞培養において使用するために意図される材料も指す。言い換えれば、培養のために調製された栄養に富む液体も培地である。同様に、水または他の液体と混合すると細胞培養にとって適するようになる粉末混合物も「粉末培地」と名付けられ得る。「合成培地」は、化学的に定義された（通常精製された）構成要素から作製される培地を指す。「合成培地」は、酵母エキスおよびビーフブロスなどの特徴付けが不良な生物学的抽出物を含有しない。「リッチ培地」は、特定の種のほとんどまたは全ての生存形態の成長を支持するように設計された培地を含む。リッチ培地はしばしば、複雑な生物学的抽出物を含む。「高密度培養の成長に適した培地」は、他の条件（例えば、温度および酸素移動速度）がそのような成長を許容する場合に、細胞培養物が３またはそれより高いＯＤ６００に達することを可能にする任意の培地である。用語「基本培地」は、いかなる特定の栄養補助剤も必要としない、多くのタイプの微生物の成長を促進する培地を指す。ほとんどの基本培地は、一般的に４つの基本的な化学基：アミノ酸、炭水化物、無機塩、およびビタミンで構成される。基本培地は一般的に、それに血清、緩衝液、増殖因子、脂質等の補助剤が添加される、より複雑な培地の基礎として役立つ。一態様では、増殖培地は、その自己再生能を維持しながら本開示の細胞の成長および増大を支持するために必要な増殖因子を有する複合培地であり得る。基本培地の例としては、これらに限定されないが、イーグル基本培地、最小基礎培地、ダルベッコ改変イーグル培地、培地１９９、栄養混合物ハムＦ－１０およびハムＦ－１２、マッコイ５Ａ、ダルベッコＭＥＭ／Ｆ－Ｉ２、ＲＰＭＩ１６４０、ならびにイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「細胞集団」は、表現型および／または遺伝子型が同一（クローン性）または非同一である１つより多くの細胞のコレクションを意図する。

本明細書で使用される場合、「実質的に均一な」細胞集団は、予め選択したマーカー、表現型、またはゲノム形質によって測定した場合に少なくとも７０％、またはあるいは少なくとも７５％、またはあるいは少なくとも８０％、またはあるいは少なくとも８５％、またはあるいは少なくとも９０％、またはあるいは少なくとも９５％、またはあるいは少なくとも９８％同一の表現型を有する集団である。一態様では、集団はクローン性集団である。

本明細書で使用される場合、「不均一な」細胞集団は、予め選択したマーカー、表現型、またはゲノム形質によって測定した場合に最大６９％、またはあるいは最大６０％、またはあるいは最大５０％、またはあるいは最大４０％、またはあるいは最大３０％、またはあるいは最大２０％、またはあるいは最大１０％、またはあるいは最大５％、またはあるいは最大４％、またはあるいは最大３％、またはあるいは最大２％、またはあるいは最大６１％、またはあるいは最大０．５％同一の表現型を有する集団である。

「凍結保護剤」は、当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、例えばスクロース、トレハロース、およびグリセロールが挙げられる。生物系において低い毒性を示す凍結保護剤が一般的に使用される。

省略語のリスト
ＣＡＲ：キメラ抗原受容体
ＨＬＡ：組織適合遺伝子リンパ球抗原
Ｉｐ：腹腔内
ＩＲＥＳ：配列内リボソーム進入部位
ＭＦＩ：平均蛍光強度
ＭＯＩ：感染多重度
ＰＢＭＣ：末梢血単核球
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ｓｃＦｖ：一本鎖可変断片
ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント
本開示を実施するための形態

ＣＡＲＴ細胞は、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）またはリガンドが、Ｔ細胞活性化を容易にすることが可能なＴ細胞シグナル伝達ドメインに結合している遺伝子操作された自己Ｔ細胞である（Maher, J.(2012) ISRN Oncol. 2012:278093；Curran, K.J. et al.(2012) J. Gene Med. 14:405-415；Fedorov, V.D. et al.(2014) Cancer J. 20:160-165；Barrett, D.M. et al.(2014) Annu. Rev. Med. 65:333-347）。ＣＡＲは、モノクローナル抗体のＨＬＡ非依存的標的化特異性を、活性化Ｔ細胞の細胞傷害活性およびホーミング特性と組み合わせる。これらの特性によって、腫瘍が宿主免疫応答を回避するために用いる２つの一般的な方法である、低減されたＨＬＡ発現またはダウンレギュレートされた抗原処理経路を有する標的細胞の認識が可能となる（Jakobsen, M.K. et al.(1995) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 17:222-228；Lou, Y. et al.(2008) Clin. Cancer Res. 14:1494-1501；Singh, R. et al.(2007) Cancer Res. 67:1887-1892）。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、がんを含む様々な疾患における新規治療薬として前臨床および臨床の設定で非常に有望であることが示されている。

本開示は、Ｌｙｍ１およびＬｙｍ２に対して特異的な抗体ならびにその使用および産生に関連する方法および組成物を提供する。加えて、本開示は、一部の態様では本開示の抗体の抗原結合ドメインであるＬｙｍ１、Ｌｙｍ２、またはＣＤ１９に対して特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、ならびにその使用および産生に関連する方法および組成物を提供する。

これらの原理および発見と一貫して、本開示は以下の実施形態を提供する。
抗体およびその断片

抗体の全般的構造は、当技術分野で公知であり、ここではごく簡単に要約する。免疫グロブリン単量体は、ジスルフィド結合によって接続された２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各々の重鎖は、それがジスルフィド結合を介して直接結合される軽鎖の１つと対を形成する。各々の重鎖は、定常領域（抗体のアイソタイプに応じて変化する）および可変領域を含む。可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と呼ばれ、フレームワーク領域内で支持される３つの超可変領域（または相補性決定領域）を含む。各軽鎖は、定常領域および可変領域を含み、可変領域は、重鎖の可変領域と類似の様式でフレームワーク領域によって支持される３つの超可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と呼ばれる）を含む。

重鎖および軽鎖の各対の超可変領域は、相互に協調して標的抗原に結合することが可能な抗原結合部位を提供する。重鎖および軽鎖の対の結合特異性は、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列によって定義される。このように、特定の結合特異性を生じるＣＤＲ配列のセット（すなわち、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列）が決定されると、ＣＤＲ配列のセットを基本的に、同じ抗原結合特異性を有する異なる抗体を提供するために、任意の抗体定常領域に連結された任意の他の抗体フレームワーク領域内の適切な位置に挿入することができる。

一実施形態では、本開示は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離された抗体であって、Ｌｙｍ１またはＬｙｍ２のエピトープに結合する単離された抗体を提供する。

これらの原理および発見と一貫して、本開示は、以下の実施形態を提供する。配列番号２もしくは６のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変領域配列、および／あるいは配列番号４もしくは８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる抗体。一態様では、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、またはあるいはそれから本質的になり、またはなおさらにそれからなり、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号４のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。別の態様では、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、またはあるいはそれから本質的になり、またはなおさらにそれからなり、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号８のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。さらなる態様では、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、またはあるいはそれから本質的になり、またはなおさらにそれからなり、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号４のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。なおさらなる態様では、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、またはあるいはそれから本質的になり、またはなおさらにそれからなり、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号８のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。同様に、本明細書において、その配列が本明細書に開示される、ある特定のアミノ酸が突然変異した抗体も提供される。

１つの特定の実施形態では、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列もしくはその均等物を含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／または配列番号１２のアミノ酸配列もしくはその均等物を含む、もしくはあるいはそれから本質的になる、もしくはなおさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一態様では、本開示の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ抗体である。抗体の定常領域もまた多様であり得る。例えば抗体は、任意のアイソタイプ：ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）またはＩｇＭのＦｃ領域を備え得る。定常領域配列の非制限的な例としては、配列番号１９～２７またはその各々の均等物が挙げられる。一実施形態では、本開示の抗体の定常領域は、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇカッパ定常領域である。一部の実施形態では、本技術の免疫グロブリン関連組成物は、配列番号１９～２７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一である重鎖定常領域を含む。

均等物は、ポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

同様に、本明細書において、本明細書に開示される抗体のいずれかと結合に関して競合する抗体も提供される。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。ある特定の態様では、本開示の抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち異なるアミノ酸配列を有する複数のタイプの抗体の混合物である。一態様では、本開示の抗体は、少なくとも１０^－６Ｍの結合親和性を有する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０^－７Ｍの親和性、およびあるいは少なくとも約１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、または１０^－１２Ｍの親和性で結合する。

一部の実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲＨ１配列は、本明細書に開示されるＨＣ配列のいずれか１つのＣＤＨＲ１領域のアミノ酸配列またはその均等物、その後にカルボキシ末端に追加の５０アミノ酸、またはあるいは約４０アミノ酸、またはあるいは約３０アミノ酸、またはあるいは約２０アミノ酸、またはあるいは約１０アミノ酸、またはあるいは約５アミノ酸、またはあるいは約４、または３、または２、または１アミノ酸を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一部の実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲＨ２配列は、本明細書に開示されるＨＣ配列のいずれか１つのＣＤＨＲ２領域のアミノ酸配列またはその均等物、その後にカルボキシ末端に追加の５０アミノ酸、またはあるいは約４０アミノ酸、またはあるいは約３０アミノ酸、またはあるいは約２０アミノ酸、またはあるいは約１０アミノ酸、またはあるいは約５アミノ酸、またはあるいは約４、または３、または２、または１アミノ酸を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一部の実施形態では、重鎖可変領域のＣＤＲＨ３配列は、本明細書に開示されるＨＣ配列のいずれか１つのＣＤＨＲ３領域のアミノ酸配列またはその均等物、その後にカルボキシ末端に追加の５０アミノ酸、またはあるいは約４０アミノ酸、またはあるいは約３０アミノ酸、またはあるいは約２０アミノ酸、またはあるいは約１０アミノ酸、またはあるいは約５アミノ酸、またはあるいは約４、または３、または２、または１アミノ酸を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一部の実施形態では、軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１配列は、本明細書に開示されるＬＣ配列のいずれか１つのＣＤＬＲ１領域のアミノ酸配列またはその均等物、その後にカルボキシ末端に追加の５０アミノ酸、またはあるいは約４０アミノ酸、またはあるいは約３０アミノ酸、またはあるいは約２０アミノ酸、またはあるいは約１０アミノ酸、またはあるいは約５アミノ酸、またはあるいは約４、または３、または２、または１アミノ酸を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一部の実施形態では、軽鎖可変領域のＣＤＲＬ２配列は、本明細書に開示されるＬＣ配列のいずれか１つのＣＤＬＲ２領域のアミノ酸配列またはその均等物、その後にカルボキシ末端に追加の５０アミノ酸、またはあるいは約４０アミノ酸、またはあるいは約３０アミノ酸、またはあるいは約２０アミノ酸、またはあるいは約１０アミノ酸、またはあるいは約５アミノ酸、またはあるいは約４、または３、または２、または１アミノ酸を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一部の実施形態では、軽鎖可変領域のＣＤＲＬ３配列は、本明細書に開示されるＬＣ配列のいずれか１つのＣＤＬＲ３領域のアミノ酸配列またはその均等物、その後にカルボキシ末端に追加の５０アミノ酸、またはあるいは約４０アミノ酸、またはあるいは約３０アミノ酸、またはあるいは約２０アミノ酸、またはあるいは約１０アミノ酸、またはあるいは約５アミノ酸、またはあるいは約４、または３、または２、または１アミノ酸を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

本技術の別の態様では、抗体は以下の特徴の１つまたは複数を含む：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本開示の軽鎖配列のいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つまたは複数のＣＤＲを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本開示の重鎖配列のいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つまたは複数のＣＤＲを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本開示の軽鎖配列のいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一である；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、本開示の軽鎖配列のいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一である；
（ｅ）抗体は、本開示の配列のいずれかによって結合されるエピトープと重複するエピトープに結合する。ＣＤＲが突然変異している一態様では、均等な抗原結合ドメインは、親または野生型版から変化しているアミノ酸を保持しなければならない。

他の態様では、本明細書に提供される抗体のＣＤＲにおける１つまたは複数のアミノ酸残基は、別のアミノ酸に置換される。置換は、アミノ酸の同じファミリー内の置換であるという意味において「保存的」であり得る。天然に存在するアミノ酸は以下の４つのファミリーに分類され得、保存的置換はそれらのファミリー内で起こる：
１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン；
２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；
３）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン；
４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。

別の態様では、１つまたは複数のアミノ酸残基が、抗体の１つまたは複数のＣＤＲに付加され、またはそこから欠失される。そのような付加または欠失は、ＣＤＲのＮ末端もしくはＣ末端で、またはＣＤＲ内の位置で起こる。

アミノ酸の付加、欠失、または置換によって抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を変化させることによって、標的抗原に対する結合親和性の増加などの様々な効果が得られ得る。ＣＤＲが突然変異している一態様では、均等な抗原結合ドメインは、親または野生型版から変化しているアミノ酸を保持しなければならない。

そのような変化したＣＤＲ配列を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる本開示の抗体はなおも、本開示の抗体と類似の特異度および感度プロファイルでＬｙｍ１またはＬｙｍ２に結合すると認識される。これは、結合アッセイによって試験され得る。

本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の構成要素である。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成要素である。

一部の態様では、抗体は、本明細書に開示される抗体のいずれか１つと少なくとも８０％同一である重鎖定常領域を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一部の態様では、抗体は、本明細書に開示される抗体のいずれか１つと少なくとも８０％同一である軽鎖定常領域を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

１つの特定の態様では、本開示の抗体はさらに、検出可能マーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。

本明細書においてさらに、開示される抗体の抗原結合性断片が提供される。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群から選択される。

本明細書に提供される抗体の一部の態様では、抗体は、迅速な結合および細胞取り込みならびに／または遅い放出を容易にするために構造的改変を含有する。一部の態様では、抗体は、迅速な結合および細胞取り込みならびに／または遅い放出を容易にするために抗体のＣＨ２重鎖定常領域に欠失を含有する。一部の態様では、Ｆａｂ断片は、迅速な結合および細胞取り込みならびに／または遅い放出を容易にするために使用される。一部の態様では、Ｆ（ａｂ）’２断片は、迅速な結合および細胞取り込みならびに／または遅い放出を容易にするために使用される。

抗体、その断片および均等物を、使用および／または保存のための製剤を提供するために、担体、例えば薬学的に許容される担体または他の作用剤と組み合わせることができる。
抗体を調製する方法

本明細書において、上記の単離された細胞を培養することを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる本開示の抗体を産生する方法であって、単離された抗体が必要に応じて哺乳動物である方法が提供される。

抗体、その製造、および使用は、周知であり、例えば、Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999に開示されている。抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して生成され得る。抗体の例としては、（これらに限定されないが）モノクローナル抗体、一本鎖抗体、および抗体の機能的断片が挙げられる。そのような抗体を生成する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Collarini et al.(2009) J. Immunol. 183(10):6338-6345、Carter, P. et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA89,4285-4289、およびBaldi L. et al.(2005) Biotechnol. Prog. 21:148-153を参照されたい。

抗体は、広範囲の宿主、例えばヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、およびその他において産生され得る。一態様では、抗体は、例えば本明細書で開示される重鎖および軽鎖のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させること、細胞を成長させること、およびそれらを発現させた後ポリヌクレオチドによって発現された抗体を精製することによって調製される。ポリヌクレオチドは、ベクターに挿入することができ、調節配列、例えば抗ＤＣＫＬ１抗体のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結された発現系に関して選択されるプロモーターおよびエンハンサーをさらに含み得る。

抗体は、免疫原性特性を有する標的抗原またはその断片もしくはオリゴペプチドを注射することによって調製することができる。宿主の種に応じて、免疫学的応答を増加させるために様々なアジュバントを添加し、使用してもよい。そのようなアジュバントとしては、これらに限定されないが、フロイント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、および界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが挙げられる。ヒトにおいて使用されるアジュバントの中で、ＢＣＧ（ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍは、特に有用である。このように（This）、本開示はまた、単離されたポリペプチドおよびアジュバントも提供する。

ある特定の態様では、本開示の抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち異なるアミノ酸配列を有する複数のタイプの抗体の混合物である。一態様では、ポリクローナル抗体は、異なるＣＤＲを有する複数のタイプの抗体の混合物を含む。そのため、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、得られた培養物から精製された抗体を使用することができる（ＷＯ２００４／０６１１０４号を参照されたい）。

モノクローナル抗体の産生：モノクローナル抗体は、培養における連続的な細胞株によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製され得る。そのような技術としては、これらに限定されないが、ハイブリドーマ技術（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497(1975)）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72(1983)を参照されたい）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Cole, et al., Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985)を参照されたい）が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体は、本技術の実践において利用することができ、ヒトハイブリドーマを使用することによって（例えば、Cote, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030(1983)を参照されたい）、またはヒトＢ細胞をエプスタインバーウイルスによってｉｎｖｉｔｒｏで形質転換することによって（例えば、Cole, et al., Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985)を参照されたい）産生することができる。例えば、抗体の領域をコードする核酸集団を単離することができる。抗体の保存された領域をコードする配列に由来するプライマーを利用するＰＣＲを使用して、集団から抗体の一部をコードする配列を増幅し、その後増幅された配列から抗体またはその断片、例えば可変ドメインをコードするＤＮＡを再構築する。そのような増幅された配列をまた、ファージまたは細菌上に融合ポリペプチドを発現および表示させるために、他のタンパク質、例えばバクテリオファージコートタンパク質または細菌細胞表面タンパク質をコードするＤＮＡに融合させることができる。次に、増幅された配列を発現させて、Ｌｙｍ１またはＬｙｍ２ポリペプチド上に存在する抗原またはエピトープに関して、例えば発現された抗体またはその断片の親和性に基づいて、さらに選択または単離することができる。

あるいは、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、例えば本明細書に開示される抗体またはその断片のいずれかのアミノ酸配列を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離されたポリペプチドによって対象を免疫すること、その後ルーチンの方法を使用して対象の脾臓からハイブリドーマを単離することによって調製することができる。例えば、Milstein et al.,(Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46(1981)）を参照されたい。標準的な方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすると、様々な特異性（すなわち、異なるエピトープに対して）および親和性を有するモノクローナル抗体が産生される。所望の特性、例えばＬｙｍ１またはＬｙｍ２結合を有する選択されたモノクローナル抗体を、（ｉ）ハイブリドーマによって発現されるように使用することができ、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子に結合させてその特性を変更することができ、または（ｉｉｉ）モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡを様々な方法で単離、シーケンシング、および操作することができる。一態様では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖トランスジーンおよび軽鎖トランスジーンを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。ハイブリドーマ技術は、当技術分野で公知の技術を含み、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 349(1988)；Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681(1981)において教示されている。

ファージディスプレイ技術：上記のように、本開示の抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイ技術の適用を通して産生することができる。例えば、抗体は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して調製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に表示される。所望の結合特性を有するファージを、抗原、典型的には固相表面またはビーズに結合したまたは捕捉された抗原によって直接選択することによって、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒトまたはマウス）から選択する。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージであり、Ｆａｂ、Ｆ_ｖ、またはジスルフィド安定化Ｆ_ｖ抗体ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合される。加えて、Ｆａｂ発現ライブラリ（例えば、Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989を参照されたい）構築のために方法を適合させて、Ｌｙｍ１またはＬｙｍ２ポリペプチド、例えばポリペプチドまたはその誘導体、断片、アナログ、もしくはホモログに対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ有効に同定することができる。本開示の単離されたヒト化抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の他の例は、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5879-5883(1988)；Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 1066-1070(1990)；Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50(1995)；Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186(1995)；Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958(1994)；Persic et al., Gene 187: 9-18(1997)；Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280(1994)；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９号；ＷＯ９１／１０７３７号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９３／１１２３６号；ＷＯ９５／１５９８２号；ＷＯ９５／２０４０１号；ＷＯ９６／０６２１３号；ＷＯ９２／０１０４７号（ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｕｎｃｉｌｅｔａｌ．）；ＷＯ９７／０８３２０号（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）；ＷＯ９２／０１０４７号（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；ＷＯ９１／１７２７１号（Ａｆｆｙｍａｘ）；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、および第５，７３３，７４３号に開示される方法を含む。

ジスルフィド結合を介してポリペプチドを結合させることによってバクテリオファージ粒子表面上にポリペプチドを表示するために有用な方法は、Ｌｏｈｎｉｎｇの米国特許第６，７５３，１３６号に記載されている。上記の参考文献に記載されているように、ファージの選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、これを使用してヒト抗体を含む抗体全体、または他の任意の所望の抗原結合性断片を生成し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）_２断片を組換えにより産生する技術もまた、ＷＯ９２／２２３２４号；Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869(1992)；Sawai et al., AJRI 34: 26-34(1995)；およびBetter et al., Science 240: 1041-1043(1988)に開示される技術などの当技術分野で公知の方法を使用して用いることができる。

一般的に、ディスプレイベクターにクローニングされるハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片は、抗体または抗体断片がファージまたはファージミド粒子の表面上に存在することから、良好な結合活性を維持するバリアントを同定するために適切な抗原に対して選択することができる。例えば、Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)を参照されたい。しかし、他のベクターフォーマットをこのプロセス、例えば選択および／またはスクリーニングのための溶解ファージベクター（改変Ｔ７またはラムダＺａｐ系）への抗体断片ライブラリのクローニングのために使用することができる。

代替の抗体産生法：抗体はまた、リンパ球集団においてｉｎｖｉｖｏ産生を誘導することによって、または組換え免疫グロブリンライブラリもしくは非常に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって（Orlandi et al., PNAS 86: 3833-3837(1989)；Winter, G. et al., Nature, 349: 293-299(1991)）産生され得る。

あるいは、一本鎖抗体を産生するための技術を使用してもよい。一本鎖抗体（ｓｃＦ_ｖ）は、リンカーペプチド（典型的におよそ５～２５アミノ酸長）によって接続された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。そのような技術の非制限的な例は、Carter, P. et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA89,4285-4289、およびBaldi L. et al.(2005) Biotechnol. Prog. 21:148-153に開示される。ｓｃＦ_ｖでは、重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体または異なる抗体に由来し得る。ｓｃＦ_ｖは、組換え技術、例えばｓｃＦ_ｖをコードするベクターをＥ．ｃｏｌｉなどの宿主生物において発現させることによって合成され得る。ｓｃＦ_ｖをコードするＤＮＡは、上記の抗体の重鎖または重鎖の可変領域をコードするＤＮＡおよび軽鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡから選択されるＤＮＡの完全なまたは所望のアミノ酸配列をコードする部分ＤＮＡを鋳型として使用して、その両方の末端を定義するプライマー対を使用するＰＣＲによって増幅を実施することによって、ならびにリンカーの両方の末端を重鎖および軽鎖にそれぞれライゲーションするために、ポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両方の末端を定義するプライマー対を組み合わせる増幅をさらに実施することによって得ることができる。ｓｃＦ_ｖをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターおよび発現ベクターによって形質転換された宿主は、当技術分野で公知の従来の方法に従って得ることができる。

抗原結合性断片、例えば抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）_２断片およびＦ（ａｂ’）_２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂ断片も同様に生成され得る。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリを構築してもよい（Huse et al., Science, 256: 1275-1281(1989)）。

抗体の改変。本開示の抗体は、抗原の親和性を増加させるために多重化され得る。多重化される抗体は、１つのタイプの抗体または同じ抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であり得る。抗体を多重化する方法として、ＩｇＧＣＨ３ドメインの２つのｓｃＦ_ｖ分子との結合、ストレプトアビジンとの結合、ヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフの導入等を例証することができる。

本明細書に開示される抗体組成物は、これらの抗体のいずれかと別の作用剤との間に形成されたコンジュゲート（イムノコンジュゲート）の形態であり得る。一態様では、本明細書に開示される抗体は、放射活性材料にコンジュゲートされる。別の態様では、本明細書に開示される抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々なタイプの分子に結合し得る。

抗体スクリーニング。所望の特異性を有する抗体を同定するために、様々なイムノアッセイをスクリーニングに使用してもよい。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合的結合または免疫放射測定アッセイのための複数のプロトコールが、当技術分野において周知である。そのようなイムノアッセイは典型的には、Ｌｙｍ１もしくはＬｙｍ２またはその任意の断片もしくはオリゴペプチドと、その特異的抗体との間の複合体形成の測定を伴う。２つの干渉しないＬｙｍ１またはＬｙｍ２エピトープに対して特異的なモノクローナル抗体を利用する２部位のモノクローナル抗体に基づくイムノアッセイを使用してもよいが、競合的結合アッセイもまた用いてもよい（Maddox et al., J. Exp. Med., 158: 1211-1216(1983)）。

潜在的な抗体の自動免疫組織化学（ＩＨＣ）スクリーニングを、ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ（ＶＭＳＩ）ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＸＴおよびスライドガラス上のホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織を使用して実施することができる。組織試料を最初に、脱パラフィン化し、抗原を回収し、その後、潜在的な抗体および検出抗体を添加する。検出抗体を、ＶＭＳＩからの発色団検出試薬を使用して可視化する。染色したスライドガラスを顕微鏡下で手作業によりスクリーニングする。正確な一次抗体染色パターンを有する試料を、潜在的候補体として選択する。

抗体の精製。本明細書に開示される抗体は、均一になるまで精製することができる。抗体の分離および精製は、従来のタンパク質分離および精製方法を用いることによって実施することができる。

単なる例として、抗体を、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等の使用を適切に選択および組み合わせることによって、分離および精製することができる。Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。

クロマトグラフィーの例としては、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが挙げられる。一態様では、クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣまたはＦＰＬＣを用いることによって実施することができる。

一態様では、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを、アフィニティクロマトグラフィーに使用してもよい。他の例示的なカラムとしては、プロテインＡカラム、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、セファロースＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
単離されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド

一態様では、単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドはさらに、標識もしくは選択マーカー、および／または連続するポリペプチド配列（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質）、あるいはポリヌクレオチドの場合には、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに動作可能に連結された配列をコードするポリヌクレオチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、様々な担体、例えばリン酸緩衝食塩水と組み合わせることができる。さらに、単離されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる宿主細胞、例えば原核細胞または真核細胞、例えば細菌、酵母、哺乳動物（ラット、サル、ハムスター、またはヒト）が提供される。宿主細胞を担体と組み合わせることができる。
キメラ抗原受容体

本明細書において、（ａ）本明細書に開示される抗体のいずれかの抗原結合ドメイン、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、および（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。一態様では、ＣＡＲはさらに、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。別の態様では、本開示のＣＡＲは、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ、または第４世代ＣＡＲである。１つの特定の態様では、本開示の抗体はさらに、検出可能マーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。

本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む細胞活性化部分を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、Ｌｙｍ１またはＬｙｍ２に結合するＣＡＲを提供する。細胞外ドメインは、そうでなければ抗体結合ドメインと呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。一態様では、本開示のＣＡＲは、配列番号１４、１６、もしくは１８、またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるアミノ酸配列によってコードされる。別の態様では、本開示のＣＡＲは、配列番号１３、１５、もしくは１７のポリヌクレオチド配列、またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

スペーサードメイン：ＣＡＲは必要に応じてさらに、最大３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、より好ましくは２５～５０アミノ酸のスペーサードメインを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。例えば、スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸であり得る。スペーサードメインは、例えば、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭ、またはそのバリアントのヒトＦｃドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはヒンジ領域の一部を含み得る。例えば、一部の実施形態は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、および／またはＮ２９７Ｑ突然変異（Ｋａｂａｔのナンバリングに従う）を有するまたは有しないＩｇＧ４ヒンジを含み得る。追加のスペーサーとしては、これらに限定されないが、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２８ヒンジ領域が挙げられる。

抗原結合ドメイン：ある特定の態様では、本開示は、本明細書に提供される抗体のいずれかに対して特異的な抗原結合ドメインを含む、それからなる、またはあるいはそれから本質的になるＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、標的特異的抗体（すなわち、抗Ｌｙｍ１または抗Ｌｙｍ２抗体）の断片、例えばｓｃＦｖを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。本開示のＣＡＲはさらに、ＭＵＣ－１６に対する抗体またはメソセリンに対する抗体に由来する抗原結合ドメインを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。

ｓｃＦｖ領域は、短いリンカーペプチドによって接続された免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域を含み得る。リンカーペプチドは、１～５０アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンに富むが、同様にセリンまたはスレオニンも含有し得る。

膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、天然または合成起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示における特定の使用の膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性の残基を主に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各々の末端に見出される。必要に応じて、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適したリンカーを提供する。

細胞質ドメイン。ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが存在している免疫細胞の従来のエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、その特定の機能を実施するように免疫細胞を方向付けるタンパク質の部分を指す。完全なシグナル伝達ドメイン、またはその切断部分は、切断部分がエフェクター機能シグナルを形質導入するために十分である限り、使用してもよい。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにその誘導体またはバリアントは、ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインとして機能することができる。本開示における特定の使用の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲ、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄに由来し得る。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる。

ＴＣＲを通して生成されたシグナルは、単独ではＴ細胞の完全な活性化にとって不十分であることから、二次または共刺激シグナルもまた必要であり得る。このように、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない少なくとも１つの共刺激シグナル伝達分子の細胞内領域もまた、ＣＡＲの細胞質ドメインに含まれ得る。本開示のＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはそれからなり得る。例えば、ＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）に加えて１つ、２つ、またはそれより多くの共刺激ドメインを含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはそれからなり得る。

一実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞活性化部分は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４－１ＢＢタンパク質、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ３－ゼータタンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質またはその断片を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＴ細胞シグナル伝達ドメインである。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、本開示の抗体のいずれかの抗原結合ドメインまたはその断片（例えば、ｓｃＦｖ）、ＣＤ８αまたはＩｇＧ１ヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおそれからなる。さらなる実施形態では、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域のいずれかまたは両方を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおそれからなる。

特定の実施形態では、ＣＡＲはさらに、ＨＣ可変領域とＬＣ可変領域との間に位置するリンカーポリペプチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおそれからなる。一態様では、ＣＡＲのリンカーポリペプチドは、ｎが１～６の整数である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのポリペプチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおそれからなる。

一部の実施形態では、ＣＡＲは、検出可能マーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはそれからなり得る。

スイッチ機構。一部の実施形態では、ＣＡＲはまた、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチ機構も含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはそれからなり得る。例えば、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み得る、それからなり得る、またはそれから本質的になり得、細胞外ドメインは、標的細胞上にまたは標的細胞によって発現される標的抗原以外の分子に対して特異的である標識、結合ドメイン、またはタグを含む標的特異的結合エレメントを含む。そのような実施形態では、ＣＡＲの特異性は、標的抗原結合ドメイン、およびＣＡＲ上の標識、結合ドメイン、またはタグによって認識されるまたはそれらに結合するドメインを含む、それからなる、またはそれから本質的になる第２の構築物によって提供される。例えば、ＷＯ２０１３／０４４２２５号、ＷＯ２０１６／０００３０４号、ＷＯ２０１５／０５７８３４号、ＷＯ２０１５／０５７８５２号、ＷＯ２０１６／０７００６１号、米国特許第９，２３３，１２５号、米国特許出願公開第２０１６／０１２９１０９号を参照されたい。このように、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、対象に投与することができるが、特異的結合ドメインを含む第２の組成物が投与されるまで、その標的抗原に結合することができない。

本開示のＣＡＲは、同様に、そのシグナル伝達機能を活性化するために多量体化（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３６８３４２号、米国特許出願公開第２０１６／０１７５３５９号、米国特許出願公開第２０１５／０３６８３６０号）、および／またはＴ細胞応答を誘発するために外因性のシグナル、例えば低分子薬（米国特許出願公開第２０１６／０１６６６１３号、Yung et al., Science, 2015）も必要とし得る。

さらに、本開示のＣＡＲは、処置後にＣＡＲＴ細胞の細胞死を誘導するための（Buddee et al., PLoS One, 2013）、または標的抗原に結合後のＣＡＲの発現をダウンレギュレートするための（ＷＯ２０１６／０１１２１０号）「自殺スイッチ」を含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはそれからなり得る。
ＤＡＰＣＡＲ細胞

一態様では、本明細書において、エピトープ特異的ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２依存的にエフェクター細胞の機能をリダイレクトする新規キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。Ｌｙｍ－１陽性バーキットリンパ腫異種移植片を有するマウスにおいて、ヒト化Ｌｙｍ－１抗体であるｈｕＬｙｍ－１－Ｂからの認識ドメインを有する新規ＣＡＲを評定した。この新規構築物は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲと呼ばれ、初代ヒトＴ細胞の形質導入後、第２世代Ｌｙｍ－１－４１ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞と比較してｉｎｖｉｔｒｏでの細胞増殖の増加、ｉｎｖｉｖｏでの有意に低い毒性、および優れた腫瘍制御を示すことが見出された。このように、本開示のＣＡＲは、処置の有害な副作用を低減することによって、および抗腫瘍細胞傷害性を改善することによって、多様なヒトがんおよび関連疾患を処置するためにヒトＣＡＲＴ細胞の臨床での使用を改善するように設計される。抗ＬｙｍＣＡＲは例示的であり、他の抗原結合ドメイン、例えば抗ＣＤ１９を、Ｌｙｍ抗原結合ドメインの代わりに置換することができる。他の抗原結合ドメインとしては、例えば、抗ＣＤ－２０、抗ＨＥＲ、抗ＥＧＦＲ、抗ＩＬ１３、抗メソセリン、抗ＣＤ１２３、抗ＢＣＭＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ７０、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ１３３、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ５抗ＧＤ２、抗ＰＳＭＡ、抗黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＨＬＡ、抗ＨＬＡ－Ｇ、ならびにＰＣＴ／米国特許出願公開２０１６／０２４３５７３号；ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２４３６１３号；およびＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２４３５４３号に記載されるドメインが挙げられる。

ＤＡＰＣＡＲＴ細胞構築物の臨床での有用性を実証するために、ｈｕＬｙｍ－１ＤＡＰＣＡＲＴ細胞構築物を、ヒトＢ細胞悪性腫瘍、例えばバーキットリンパ腫、びまん性および濾胞性リンパ腫、ならびにＢ細胞慢性リンパ芽球性白血病のサブセットを標的化することが以前に示されているマウスＬｙｍ－１抗体の一本鎖結合部位を使用して調製した。（Rose LM et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43(1): 26-30）は、マウスＬｙｍ－１が、広く多様なヒトＢ細胞腫瘍において発現されるＨＬＡ－Ｄｒ分子の軽鎖上の不連続なエピトープに結合することを示した。Ｂ細胞悪性腫瘍上で発現される標的と比較して発現する結合部位の数が約１／４である他のＢ細胞標的、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ２２とは異なり、正常なＢ細胞のみがこの抗原を発現することから、これはＣＡＲＴ細胞治療の良好な標的であるように思われた（Epstein AL et al., 1987, Cancer Res. 47:830-840）。加えて、Ｌｙｍ－１によって認識されるＨＬＡ－Ｄｒヒト抗原は、脱落することも、インターナライズされることもなく、ヒトリンパ腫細胞の表面に対する良好かつ安定な結合を可能にする。これはまた、Ｌｙｍ－１陽性腫瘍のイメージングおよび処置のためのＩ－１３１放射標識抗体としてヒトにおいて広範に研究され、Ｉ－１３１の治療用量であっても安全であることが示された（DeNardo SJ et al., 1988, Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals 1:17-33；DeNardo, S.J. et al., 1988, Int. J. Cancer 3:96-101）。最後に、Ｈｕら（Hu E et al., 1989, Hematologic Oncology 7:155-166）がネイキッドＬｙｍ－１を使用して実施した臨床研究は、抗ＣＤ２０（リツキサン）によって現在処置されている患者において見られる低ガンマグロブリン血症などの明白な毒性を示さなかった。

Ｊｕｎｅら（June CH et al., 2018, Science 359:1361-1365）によって最近概説されたように、本出願人のＴ細胞受容体シグナル伝達機構の初期の理解により設計されているＣＡＲＴ細胞は、ヒト造血悪性腫瘍の処置にとって顕著な成功を収めている。ＹｅｓｃａｒｔａおよびＫｙｍｉｒｉａｈなどの抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞産物のＦＤＡ承認を含む初期の成功にもかかわらず、これらの試薬の基本構造および標的化の改善が集中的に研究されている。ＣＡＲＴ細胞治療に関連する主要な毒性により、ある程度その使用が制限されなければならず、注意深い患者の管理を必要とする。最も一般的な毒性であるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、注入したＣＡＲＴ細胞によって放出されたサイトカインによって引き起こされる全身の炎症応答によって引き起こされる。ＣＲＳは、広範な可逆性の臓器機能障害を引き起こし得、低血圧のための初期の介入および同時感染の処置を必要とする。加えて、トシリズマブによるＩＬ－６受容体遮断はなおも、ＣＲＳの主な薬理治療である。加えて、ＣＡＲＴ細胞治療は、全脳症ならびに局在欠陥、例えば失語症、振せん、運動失調、片側不全麻痺、および頭蓋神経麻痺の両方を引き起こし得る（Brudno JN and Kochenderfer JN (2016) Blood 127:3321-3330）。処置の選択肢としては、特にトシリズマブに不応性の患者に関してコルチコステロイドの使用が挙げられる。

ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＲｉｄｄｅｌｌ（Srivastava S and Riddell SR(2015) Trends in Immunology 36(8):494-502）によって概説されるように、何人かの研究者らが有効性および毒性問題に取り組んでいる。具体的には、研究者らは、（Ａ）特異性および安全性を改善するために、ＣＡＲＴ細胞上の２つの認識部位、１つはＣＤ３θに結合し、他方は４１ＢＢモチーフに結合する認識部位を使用する分割トリガ機構の使用、（Ｂ）細胞傷害性Ｔ細胞と腫瘍標的細胞との間の特殊な制約を最適化するためのｓｃＦｖの立体配置の変更、（Ｃ）条件的に発現されたＣＡＲＴ細胞の産生、（Ｄ）ＣＡＲＴ細胞を産生するための異なる細胞タイプ、例えば中でもメモリーＴ細胞およびＮＫ細胞の使用、（Ｄ）ＴＣＲ－ＣＤ３：共受容体複合体を模倣するためのＴ細胞抗原連結体（ＴＡＣ）の使用（Helsen CW et al.(2018) Nature Communications 9(1):3049）、および（Ｅ）ＩＣＯＳなどのシグナル伝達のための他の共刺激モチーフ（Guedan S. et al.,(2018) JCI insight 3(1））を調査している。ＴＡＣ法は有望であるが、ＣＤ３に接続するためにＤａＲＰｉｎ配列の使用を必要とし、その分子生物学を複雑にする。それにもかかわらず、これらの研究および以下に示す研究は、ＣＡＲＴ細胞治療のＣＲＣおよび他の毒性が、ＣＡＲＴ細胞のｉｎｖｉｖｏでの最適な有効性にとって必要ではないことを初めて示している。要約すると、ＣＡＲＴ細胞治療の際に現在見られるＣＲＣおよび他の一般的な毒性を切り離す方法は可能であり得、これらの治療に関する本出願人の認識を、生命を脅かす毒性を欠如するように変更することができる。ＣＡＲＴ細胞に関する今後の研究に関して、キメラ受容体Ｔ細胞治療の安全性および有効性を増加させるための方法およびアプローチは、ＬｉおよびＺｈａｏ（Li H et al.,(2017) Protein & Cell 8(8):573-589）によって概説されている。固形腫瘍の治療に関しては、Ｄ’Ａｌｏｃｉａら（D'Aloia MM et al.,(2018) Cell Death and Disease 9:282-293）によって記載されるように他の問題が起こっており、成功するためには、骨髄ならびに循環する白血病およびリンパ腫の処置にとって必要なパラメーターを超える追加のパラメーターを達成する必要がある。具体的には、腫瘍血管への遊走および腫瘍血管を通しての浸透、抗原に遭遇するまでの増殖の持続、ならびに抑制性の腫瘍の微小環境に対する抵抗性を、静脈内投与されるＣＡＲＴ細胞が最終的に腫瘍に入ると有効に作用するように対処する必要がある。

本明細書に開示されるＤＡＰ構築ＣＡＲＴ細胞は、標準的な刺激方法に応答しないＣＡＲＴ細胞であっても増殖および細胞成長を可能にし、同じ結合エピトープを使用する第２世代構築物より強力な産物（１０分の１の細胞を必要とする）であることが示されており、より少ない毒性（体重減少がほとんどない）を示す。これらの属性により、ＤＡＰＣＡＲＴ細胞は、ヒト造血悪性腫瘍およびおそらく固形腫瘍の両方にとって成功するおよび安全な細胞治療剤の生成において重要な前進であり得る。
キメラ抗原受容体

本明細書において、（ａ）抗原結合ドメイン（例えば、抗Ｌｙｍ抗体（例えば、ヒト化抗Ｌｙｍ抗体）または抗ＣＤ１９抗体の）、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに（ｄ）ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。抗Ｌｙｍヒト化抗Ｌｙｍ抗体は、抗Ｌｙｍ１または抗Ｌｙｍ２抗体、例えばヒト抗Ｌｙｍ１またはヒト抗Ｌｙｍ２抗体であり得る。さらなる態様では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合性断片である。別の態様では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧヒンジドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然または合成起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示における特定の使用の膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各々の末端に見出される。必要に応じて、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適したリンカーを提供する。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。エレメントは、任意の種、例えばヒトまたはマウスのエレメントであり得る。１つの特定の態様では、本開示のＣＡＲはさらに、検出可能マーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。さらなる態様では、ＣＡＲはさらに、シグナルペプチドを含む。

一態様では、本開示のＣＡＲは、以下に示すＣＡＲアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるアミノ酸配列を含む。

ＣＡＲは、必要に応じて最大３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、より好ましくは２５～５０アミノ酸のスペーサードメインをさらに含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。例えば、スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸であり得る。

ある特定の態様では、本開示は、抗ＣＤ１９抗体の、またはＬｙｍ－１もしくはＬｙｍ－２抗体の抗原結合ドメインを含む、それからなる、またはあるいはそれから本質的になるＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、標的特異的抗体（例えば、抗ＣＤ１９、抗Ｌｙｍ１または抗Ｌｙｍ２抗体）の断片、例えばｓｃＦｖを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

一態様では、抗原結合ドメインはｓｃＦＶ領域である。ｓｃＦｖ領域は、短いリンカーペプチドによって接続された免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域を含み得る。リンカーペプチドは、１～５０アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンに富むが、同様にセリンまたはスレオニンも含有し得る。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、本開示の抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ）のいずれかの抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧ１ヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびにＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２ドメインのいずれかを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおそれからなる。さらなる態様では、ＣＡＲは、ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２ドメインを含む。

特定の実施形態では、ＣＡＲはさらに、抗体のＨＣ可変領域とＬＣ可変領域との間に位置するリンカーポリペプチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおそれからなる。一態様では、ＣＡＲのリンカーポリペプチドは、ｎが１～６の整数である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのポリペプチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおそれからなる。

一部の実施形態では、ＣＡＲはさらに、検出可能マーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはそれからなり得る。

本開示のＣＡＲは、同様に、そのシグナル伝達機能を活性化するために多量体化（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３６８３４２号、米国特許出願公開第２０１６／０１７５３５９号、米国特許出願公開第２０１５／０３６８３６０号を参照されたい）、および／またはＴ細胞応答を誘発するために外因性のシグナル、例えば低分子薬（米国特許出願公開第２０１６／０１６６６１３号、Yung et al., Science, 201５）も必要とし得る。

さらに、本開示のＣＡＲは、処置後にＣＡＲＴ細胞の細胞死を誘導するための、または標的抗原に結合後のＣＡＲの発現をダウンレギュレートするための（ＷＯ２０１６／０１１２１０号）「自殺スイッチ」を含み得る、またはそれから本質的になり得る、またはそれからなり得る。
単離された細胞

同様に、本明細書において、本明細書に開示されるＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞集団に導入すること、および核酸配列の形質導入に成功している免疫細胞の亜集団を選択し、それによって抗ＬｙｍＣＡＲ発現細胞を産生することを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる抗ＬｙｍＣＡＲ発現細胞を産生する方法も提供する。

本開示の態様は、本開示のＣＡＲを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離された細胞、およびそのような細胞を産生する方法に関する。細胞は原核細胞または真核細胞である。一態様では、細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である。真核細胞は、任意の好ましい種、例えば動物細胞、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、ネコ、またはイヌ細胞に由来し得る。

本開示の一部の態様では、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入された単離された細胞集団は、ＮＫ前駆細胞集団および／またはＴ細胞前駆細胞集団である。前駆細胞の形質導入は、ＣＡＲＴ細胞および／またはＣＡＲＮＫ細胞へと分化することが可能な長命な細胞集団をもたらす。Ｔ細胞前駆体としては、これらに限定されないが、ＨＳＣ、長期ＨＳＣ、ＭＰＰ、ＣＬＰ、ＬＭＰＰ／ＥＬＰ、ＤＮ１、ＤＮ２、ＤＮ３、ＤＮ４、ＤＰが挙げられる。ＮＫ前駆体としては、これらに限定されないが、ＨＳＣ、長期ＨＳＣ、ＭＰＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、プロ－ＮＫ、プレ－ＮＫ、およびｉＮＫ細胞が挙げられる。特定の態様では、単離された細胞集団は、成熟Ｔ細胞およびＴ細胞前駆体の両方を含み、対象への移植のために、短命なエフェクターＣＡＲＴ細胞および長命なＣＡＲＴ細胞前駆体の両方を提供する。別の態様では、単離された細胞集団は、成熟ＮＫ細胞およびＮＫ前駆体の両方を含み、対象への移植のために、短命なエフェクターＣＡＲＮＫ細胞および長命なＣＡＲＮＫ前駆体の両方を提供する。

特定の実施形態では、単離された細胞は、本明細書に提供される抗体の抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる外因性のＣＡＲを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

別の態様では、ＣＡＲは、（ａ）抗原結合ドメイン（例えば、抗Ｌｙｍ抗体または抗ＣＤ１９抗体の）、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに（ｄ）ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２細胞内シグナル伝達ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。抗Ｌｙｍ抗体は、抗Ｌｙｍ１または抗Ｌｙｍ２抗体、例えば、ヒト抗Ｌｙｍ１またはヒト抗Ｌｙｍ２抗体であり得る。さらなる態様では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合性断片である。別の態様では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧヒンジドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。起源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示における特定の使用のための膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。好ましくはフェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各々の末端に見出される。必要に応じて、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適したリンカーを提供する。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。エレメントは、任意の種、例えばヒトまたはマウスのエレメントであり得る。１つの特定の態様では、本開示のＣＡＲはさらに、検出可能マーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。さらなる態様では、ＣＡＲはさらに、シグナルペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、単離された細胞は、Ｔ細胞、例えば動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコＴ細胞、イヌＴ細胞、またはヒトＴ細胞である。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコＮＫ細胞、イヌＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞である。

一部の実施形態では、本開示のＣＡＲを発現するＴ細胞は、内因性のＴＣＲの発現を低減または削除するようにさらに改変され得る。内因性のＴＣＲの低減または削除は、オフターゲット効果を低減させ、Ｔ細胞の有効性を増加させることができる。機能的ＴＣＲの発現を安定に欠如するＴ細胞は、多様なアプローチを使用して産生され得る。Ｔ細胞は、完全なＴ細胞受容体を複合体としてインターナライズし、選別し、および分解し、半減期は休止期Ｔ細胞で約１０時間であり、刺激されたＴ細胞では３時間である（von Essen, M. et al. 2004. J. Immunol. 173:384-393）。ＴＣＲ複合体が適切に機能するためには、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適切な化学量論比を必要とする。ＴＣＲ機能はまた、ＩＴＡＭモチーフを有する２つの機能するＴＣＲゼータタンパク質も必要とする。そのＭＨＣ－ペプチドリガンドとの係合によるＴＣＲの活性化は、同じＴ細胞上のいくつかのＴＣＲの係合を必要とし、その全てが適切にシグナル伝達をしなければならない。このように、ＴＣＲ複合体が適切に会合しないまたは最適にシグナル伝達をすることができないタンパク質によって脱安定化される場合、Ｔ細胞は、細胞応答を開始するために十分に活性化されない。

したがって、一部の実施形態では、ＴＣＲ発現は、ＲＮＡ干渉（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）、ＣＲＩＳＰＲ、または初代Ｔ細胞において特異的ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β）および／またはＣＤ３鎖をコードする核酸を標的とする他の方法を使用して削除され得る。これらのタンパク質の１つまたは複数の発現を遮断することによって、Ｔ細胞はもはやＴＣＲ複合体の重要な構成要素の１つまたは複数を産生せず、それによってＴＣＲ複合体を脱安定化させ、機能的ＴＣＲの細胞表面発現を防止する。一部のＴＣＲ複合体は、ＲＮＡ干渉を使用する場合、細胞表面にリサイクルすることができるが、ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）は、ＴＣＲタンパク質の新規産生を防止し、完全なＴＣＲ複合体の分解および除去をもたらし、機能的ＴＣＲ発現の安定な欠損を有するＴ細胞の産生をもたらす。

初代Ｔ細胞における阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）の発現は、任意の従来の発現系、例えばレンチウイルス発現系を使用して達成することができる。レンチウイルスは、休止期の初代Ｔ細胞の標的化にとって有用であるが、必ずしも全てのＴ細胞がｓｈＲＮＡを発現するわけではない。これらのＴ細胞の一部は、Ｔ細胞の機能的活性を変更するためにＴＣＲ発現の十分な阻害を可能にするためにＲＮＡの十分量を発現しないことがある。このように、ウイルスの形質導入後に中等度から高いＴＣＲ発現を保持するＴ細胞を、例えば細胞の選別または分離技術によって除去することができ、それによって残存するＴ細胞は、細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３を欠損し、機能的ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損している単離されたＴ細胞集団の増大を可能にする。

初代Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲの発現は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および標的ＴＣＲに対して特異的なガイドＲＮＡを使用して達成することができる。適した発現系、例えばレンチウイルスまたはアデノウイルス発現系が当技術分野で公知である。阻害剤ＲＮＡの送達と同様に、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、休止期初代Ｔ細胞またはＣＡＲ細胞治療にとって適した他の免疫細胞を特異的に標的化することができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ編集が成功しない限りにおいて、細胞を、上記で開示される方法に従って成否に関して選択することができる。例えば、上記のように、ウイルスの形質導入後に中等度から高いＴＣＲ発現を保持するＴ細胞を、例えば細胞選別または分離技術によって除去することができ、それによって残存Ｔ細胞は、細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３を欠損し、機能的ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損している単離されたＴ細胞集団の増大を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ編集構築物は、内因性のＴＣＲのノックアウトおよび本明細書に開示されるＣＡＲ構築物のノックインの両方において有用であり得るとさらに認識される。したがって、ＣＲＩＳＰＲ系は、これらの目的の１つまたは両方を達成するために設計することができると認識される。

上記の技術の多くをＴ細胞に関連して説明しているが、本明細書に記載される使用ならびに生成および改変の方法は、Ｔ細胞に限定されず、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および関連する幹細胞などの免疫細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意の関連する細胞に拡大され得ると認識される。

単離された細胞の起源：本明細書に開示される細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞を、例えば自家細胞治療を伴う実施形態では対象から、または例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な市販の培養物から得てもよい。

細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜浸出液、脾臓組織、および腫瘍を含む、対象における複数の起源から得ることができる。

関連する細胞を単離する方法は、当技術分野で周知であり、本出願に容易に適合させることができる。例示的な方法を以下の実施例に記載する。本開示に関連する使用のための単離方法としては、これらに限定されないが、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム；ＳＴＥＭｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＥａｓｙＳｅｐ（商標）、ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）、ＳｅｐＭａｔｅ（商標）；ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳ（商標）細胞分離キット、ならびに他の市販の細胞分離および単離キットが挙げられる。免疫細胞および前駆体の特定の亜集団は、一意的な細胞表面マーカーに対して特異的なそのようなキットにおいて利用可能な蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ビーズ、または他の結合剤の使用を通して単離され得る。例えば、ＭＡＣＳ（商標）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離してもよい。

あるいは、細胞は、市販の細胞培養物を通して得てもよく、これらとしては、これらに限定されないが、Ｔ細胞に関して、株ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０１（商標））、ＢＣＬ２Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９９（商標））、ＮｅｏＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９８（商標））；およびＮＫ細胞に関して、株ＮＫ－９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））、ＮＫ－９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０８（商標））が挙げられる。

一部の態様では、対象に、対象から細胞を得る前に末梢血への前駆細胞動員を誘導するための条件付けレジメンを投与してもよい。例えば、対象は、有効量の、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ）、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ）、およびモゾビル（Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）のうちの少なくとも１つを、対象から細胞を単離する前または単離と同時に最大２週間投与してもよい。動員された前駆細胞は、例えば、条件付けレジメンの投与後１～１４日後のロイコフェレーシスを含む、当技術分野で公知の方法によって対象から得ることができる。

Ｔ細胞の活性化および増大：所望のＣＡＲを発現するためにＴ細胞を遺伝子改変する前または後によらず、細胞を、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号に記載される方法などの一般的に公知の方法を使用して、活性化および増大させることができる。Ｌｙｍ１またはＬｙｍ２抗原によるｅｘｖｉｖｏでの刺激は、選択されたＣＡＲ発現細胞亜集団を活性化および増大することができる。あるいは、細胞を、Ｌｙｍ１またはＬｙｍ２抗原との相互作用によってｉｎｖｉｖｏで活性化してもよい。

関連する細胞を活性化する方法は当技術分野で周知であり、本出願に容易に適合させることができる。例示的な方法を以下の実施例に記載する。本開示に関連して使用するための単離方法としては、これらに限定されないが、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システムの活性化および増大キット；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰｈｏｓｆｌｏｗ（商標）活性化キット、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳ（商標）活性化／増大キット、ならびに関連する細胞の活性化部分に対して特異的な他の市販の細胞キットが挙げられる。免疫細胞の特定の亜集団を、そのようなキットにおいて利用可能なビーズまたは他の作用剤の使用を通して活性化または増大させてもよい。例えば、α－ＣＤ３／α－ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用して、単離されたＴ細胞集団を活性化および増大させてもよい。

同様に、本明細書において、本開示の抗体、ＣＡＲ、単離された核酸、および／またはベクターを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる単離された細胞を開示する。
ポリヌクレオチドおよびベクター

ＣＡＲは、ベクターを使用して調製され得る。本開示の態様は、本明細書に開示されるＣＡＲをコードする単離された核酸配列、ならびにＣＡＲをコードする単離された核酸配列およびその相補体およびその各々の均等物を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるベクターに関する。

例示的なベクターの調製および前記ベクターを使用するＣＡＲ発現細胞の生成を、以下の実施例に詳細に考察する。要約すると、ＣＡＲをコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結すること、および構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核細胞の複製および組み込みにとって適し得る。

一部の実施形態では、単離された核酸配列は、本明細書に提供される抗体の抗原結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域および／または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなるＣＡＲをコードする。特定の実施形態では、単離された核酸配列は、（ａ）本開示の抗体の抗原結合ドメインの後に（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメインの後に（ｄ）ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域、および／または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の後に（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

別の態様では、ＣＡＲは、（ａ）抗原結合ドメイン（例えば、抗Ｌｙｍ抗体または抗ＣＤ１９抗体の）、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに（ｄ）ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２ドメインを含む、またはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。抗Ｌｙｍ抗体は、抗Ｌｙｍ１または抗Ｌｙｍ２抗体、例えばヒト抗Ｌｙｍ１またはヒト抗Ｌｙｍ２抗体であり得る。さらなる態様では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合性断片である。別の態様では、ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧヒンジドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。一態様では、配列ＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳを含むペプチドが、抗原結合ドメインの後に挿入される。起源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示における特定の使用の膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各々の末端に見出される。必要に応じて、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適したリンカーを提供する。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。エレメントは、任意の種、例えばヒトまたはマウスのエレメントであり得る。１つの特定の態様では、本開示のＣＡＲはさらに、検出可能マーカーまたは精製マーカーを含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。さらなる態様では、ＣＡＲはさらに、シグナルペプチドを含む。

一部の実施形態では、単離された核酸配列は、抗体の抗原結合ドメインをコードする配列またはエンハンサーの上流にコザックコンセンサス配列を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。一部の実施形態では、単離された核酸は、抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。１つの特定の実施形態では、ＣＡＲをコードする単離された核酸はさらに、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチ機構を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一部の実施形態では、単離された核酸配列は、抗体の抗原結合ドメインの上流に位置するポリヌクレオチド配列をコードするシグナルペプチドを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

１つの特定の実施形態では、単離された核酸配列は、抗体の抗原結合ドメインの上流に位置する２Ａ自己切断ペプチド（Ｔ２Ａ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

一部の実施形態では、単離された核酸配列は、ベクターに含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターはプラスミドである。他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。特定の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。

例示的なベクターの調製および前記ベクターを使用するＣＡＲ発現細胞の生成を、以下の実施例に詳細に考察する。要約すると、ＣＡＲをコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結すること、および構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核細胞の複製および組み込みにとって適し得る。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。

いくつかの態様では、ベクターは、野生型ウイルスに由来するまたはそれに基づく。さらなる態様では、ベクターは、野生型レンチウイルスに由来するまたは基づく。そのような例としては、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられる。あるいは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの他のレトロウイルスを、ベクター骨格の基礎として使用することができると企図される。本開示に従うウイルスベクターは、特定のウイルスの構成要素に限定される必要はないことは明白である。ウイルスベクターは、２つまたはそれより多くの異なるウイルスに由来する構成要素を含み得、同様に合成の構成要素も含み得る。ベクター構成要素は、標的細胞特異性などの所望の特徴を得るために操作することができる。

本開示の組換えベクターは、霊長類および非霊長類に由来し得る。霊長類のレンチウイルスの例としては、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイプの「スローウイルス」であるビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ならびに近年記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。先行技術の組換えレンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２４，１２３号；第７，０５６，６９９号；第７，４１９，８２９号および第７，４４２，５５１号を参照されたい。

米国特許第６，９２４，１２３号は、ある特定のレトロウイルス配列が標的細胞ゲノムへの組み込みを容易にすることを開示している。この特許は、各々のレトロウイルスゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含むことを教示している。これらの遺伝子は、両端に長末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が隣接する。ＬＴＲは、プロウイルス組み込みおよび転写に関与する。それらはまた、エンハンサー－プロモーター配列としても作用する。言い換えれば、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのカプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって起こる。ＬＴＲそのものは同一の配列であり、これを、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分割することができる。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に対して一意的な配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両方の末端で反復される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に対して一意的な配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスにおいてかなり異なり得る。ウイルスゲノムの場合、ポリ（Ａ）付加部位（終止）は、右側のＬＴＲにおけるＲとＵ５との間の境界にある。Ｕ３は、細胞タンパク質、および一部の例ではウイルス転写活性化剤タンパク質に応答するプロモーターおよび複数のエンハンサー配列を含む、プロウイルスの転写制御エレメントのほとんどを含有する。

構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖそのものに関して、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解により処理されて成熟タンパク質ＭＡ（基質）、ＣＡ（カプシド）、およびＮＣ（ヌクレオカプシド）となる。ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、これは、ゲノムの複製を媒介するＲＮアーゼＨおよびインテグラーゼ（ＩＮ）に会合したＤＮＡポリメラーゼを含有する。

ウイルスベクター粒子の産生に関して、ベクターＲＮＡゲノムは、宿主細胞においてそれをコードするＤＮＡ構築物から発現される。ベクターゲノムによってコードされない粒子の構成要素は、宿主細胞において発現される追加の核酸配列（通常、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子のいずれかまたは両方を含む「パッケージングシステム」）によってトランスで提供される。ウイルスベクター粒子の産生にとって必要な配列セットを、一過性のトランスフェクションによって宿主細胞に導入してもよく、またはそれらを宿主細胞ゲノムに組み込んでもよく、またはそれらを混合した方法で提供してもよい。関係する技術は当業者に公知である。

本開示において使用するためのレトロウイルスベクターとしては、これらに限定されないが、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬｅｎｔｉシリーズバージョン４、６、および６．２；ＬｅｎｔｉｇｅｎＣｏｒｐ．が製造する「ＶｉｒａＰｏｗｅｒ」システム；ＣｉｔｙｏｆＨｏｐｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅの研究所が生成および使用するｐＨＩＶ－７－ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈが製造する「Ｌｅｎｔｉ－Ｘ」レンチウイルスベクターｐＬＶＸ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈが製造するｐＬＫＯ．１－ｐｕｒｏ；ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓが製造するｐＬｅｍｉＲ；ならびにＣｈａｒｉｔｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ（ＣＢＦ）、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙの研究所が生成および使用するｐＬＶが挙げられる。

外因性の核酸を宿主細胞に導入するためにまたはそうでなければ細胞を本開示の阻害剤に曝露するために使用される方法によらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために多様なアッセイを実施してもよい。そのようなアッセイとしては、例えば当業者に周知の「分子生物学」アッセイ、例えばサザンブロッティングおよびノザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、ならびにＰＣＲ；「生化学」アッセイ、例えば特定のペプチドの存在または非存在を、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）によって、または本開示の範囲内に入る作用剤を同定するために本明細書に記載のアッセイによって検出することが挙げられる。

パッケージングベクターおよび細胞株：ＣＡＲを、パッケージングベクターおよび細胞株を使用することによってレンチウイルスまたはレトロウイルスパッケージングシステムにパッケージングすることができる。パッケージングプラスミドとしては、これらに限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。パッケージングベクターは、遺伝子材料の細胞への送達を容易にするエレメントおよび配列を含有する。例えば、レトロウイルス構築物は、複製インコンピテントレトロウイルスベクターをパッケージングするために、および複製コンピテントヘルパーウイルスを産生することなく高い力価で複製インコンピテントレトロウイルスベクターをパッケージングすることが可能なビリオンタンパク質を産生するために必要な全てのビリオンタンパク質をトランスでコードする複製インコンピテントレトロウイルスゲノムに由来する少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含むパッケージングプラスミドである。レトロウイルスＤＮＡ配列は、ウイルスのウイルス５’ＬＴＲのネイティブエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠如し、ヘルパーゲノムのパッケージングに関与するｐｓｉ機能配列および３’ＬＴＲの両方を欠如するが、外来ポリアデニル化部位、例えばＳＶ４０ポリアデニル化部位、ならびにウイルスの産生が望ましい細胞タイプにおいて効率的な転写を方向付ける外来のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする。レトロウイルスは、白血病ウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）である。外来のエンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、またはネイティブモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に結合したＨＣＭＶＩＥエンハンサーであり得る。レトロウイルスパッケージングプラスミドは、例えば、第１のヘルパー配列が同種指向性ＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有し、第２のヘルパー配列がｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する、プラスミドに基づく発現ベクターによってコードされる２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなり得る。宿主範囲を決定するＥｎｖ遺伝子は、異栄養性、両種指向性、同種指向性、ポリトロピック（ミンクフォーカス形成）もしくは１０Ａ１マウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内炎（Vesicular Stomatitus）ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型ｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子、上記のｅｎｖ遺伝子の１つまたは複数の組合せに由来するキメラエンベロープ遺伝子、あるいは上記のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質および膜貫通ならびに所望の標的細胞上の特異的表面分子に対するモノクローナル抗体をコードするキメラエンベロープ遺伝子に由来し得る。

パッケージングプロセスでは、パッケージングプラスミドおよびレトロウイルスベクターを、ウイルスを産生することが可能な第１の哺乳動物細胞集団、例えばヒト胎児腎細胞、例えば２９３細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１５７３、ＡＴＣＣ，ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＭｄ．）に一過性に同時トランスフェクトして、高い力価の組換えレトロウイルス含有上清を産生する。本開示の別の方法では、この一過性にトランスフェクトされた第１の細胞集団を次に、哺乳動物標的細胞、例えばヒトリンパ球と共培養し、標的細胞に外来遺伝子を高い効率で形質導入する。本開示のなお別の方法では、上記の一過性にトランスフェクトした第１の細胞集団からの上清を、哺乳動物標的細胞、例えばヒトリンパ球または造血幹細胞と共にインキュベートし、標的細胞に外来遺伝子を高い効率で形質導入する。

別の態様では、パッケージングプラスミドを、ウイルスを産生することが可能な第１の哺乳動物細胞集団、例えばヒト胎児腎細胞、例えば２９３細胞において安定に発現させる。レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを、選択可能マーカーとの同時トランスフェクション、またはシュードタイプウイルスによる感染のいずれかによって細胞に導入する。いずれの場合でも、ベクターは組み込まれる。あるいは、ベクターを、エピソームとして維持されるプラスミドに導入することができる。高い力価の組換えレトロウイルス含有上清が産生される。
処置および診断の方法

一態様では、本明細書において、担体と、本開示の抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、ＣＡＲ、単離された核酸、ベクター、および／または単離された細胞のうちの１つまたは複数とを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる組成物を提供する。本開示の抗体およびポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞はまた、多くの異なる担体に結合させることができる。このように、本開示はまた、抗体および活性または不活性である別の物質を含有する組成物も提供する。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本開示の目的に関して可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者は、抗体に結合するための他の適した担体を承知しているか、またはルーチンの実験を使用してそれを確認することができる。腫瘍からの凍結切片を、ｈｕＬｙｍ－１またはｈｕＬｙｍ－２によって染色し、患者にｈｕＬｙｍ－１もしくはｈｕＬｙｍ－２ＣＡＲＴ細胞または抗体による処置を行う前に、腫瘍が抗原陽性であることを実証する。Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２抗原はいずれも、切片のパラフィン包埋によって破壊されることから、凍結切片を実施する必要がある。

本開示の抗体またはその断片を使用して、腫瘍およびがんを処置してもよい。本明細書に提供される抗ＬｙｍＣＡＲ発現細胞、本明細書に提供される抗体、その抗原結合性断片、および／またはポリペプチドは、単独で、または希釈剤、公知の抗がん治療薬、および／もしくは他の構成要素、例えばサイトカイン、もしくは免疫刺激性である他の細胞集団と組み合わせて投与され得る。それらは、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、またはさらなる治療として投与され得る。そのため、本開示の抗体を他の治療（例えば、化学療法、放射線、手術等）と組み合わせてもよい。追加の治療の非制限的な例としては、化学療法または生物療法が挙げられる。本開示のＣＡＲＴ細胞または抗体がより有効となるように腫瘍の微小環境を変更するために、ＣＡＲＴ細胞および／または抗体治療の前またはその間のチェックポイント阻害剤が有用であり得る。追加の治療のさらに非制限的な例としては、サプレッサー細胞、例えば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を欠失または阻害する方法が挙げられ、同様に有用であり得る。Ｔｒｅｇは、低用量シクロホスファミドによって欠失させることができ、ＭＤＳＣは低用量フルオロウラシル（５－ＦＵ）化学療法またはまだ知られていない方法によって欠失させることができる。加えて、追加の治療の他の非制限的な例としては、腫瘍細胞をＣＡＲＴ細胞治療により感受性にすることができる抗原のアップレギュレーションが挙げられる。ＨＬＡ－ＤＲのアップレギュレーションは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＩＬ－１２処置、ＣｐＧ（ＴＬＲ９アゴニスト）、およびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路アゴニストを使用することによって行われ得る。適切な処置レジメンは、処置する医師または獣医師によって決定される。

本明細書に提供される抗ＬｙｍＣＡＲ発現細胞、本開示の抗体、その抗原結合性断片、および／またはポリペプチドは、単独で、または希釈剤、公知の抗がん治療薬、および／もしくは他の構成要素、例えばサイトカインもしくは免疫刺激性である他の細胞集団と組み合わせて投与され得る。

一実施形態では、本明細書において、それを必要とする対象における腫瘍の成長を阻害する、および／またはがんを処置する、および／またはがんの再発を防止する方法であって、本明細書に提供される、有効量のＣＡＲ発現細胞、本明細書に提供される、有効量の抗体、有効量のその抗原結合性断片、および／または有効量のポリペプチドを対象に投与するステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法を開示する。一態様では、ＣＡＲ発現細胞は、処置される対象に対して自己または同種であり、必要に応じて、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、第４選択治療、または第５選択治療である。

別の態様では、腫瘍またはがん細胞は、ＣＤ１９、Ｌｙｍ１、および／またはＬｙｍ２を発現または過剰発現する。さらなる態様では、がんまたは腫瘍は、癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病の群から選択される。１つの特定の態様では、腫瘍またはがんは、Ｂ細胞リンパ腫または白血病である。一実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。固形腫瘍は、黒色腫、大腸癌、乳癌、および／または脳腫瘍であり得る。一態様では、処置されるがんは、癌腫、肉腫、神経芽腫、子宮頸がん、肝細胞がん、中皮腫、神経膠芽腫、骨髄腫、リンパ腫、白血病、腺腫、腺癌、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽腫、星細胞腫、乏突起膠腫、髄膜腫、または黒色腫である。

したがって、本開示の方法の態様は、それを必要とする対象における腫瘍の成長を阻害するための、および／またはそれを必要とする患者におけるがんを処置するための方法に関する。

本開示はまた、がん細胞またはがん幹細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞に、本開示の、有効量の抗ＬｙｍＣＡＲ発現細胞、有効量の抗体、有効量の抗原結合性断片、および／または有効量のポリペプチドを接触させるステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法にも関する。

本明細書においてさらに、対象が治療に応答する可能性があるか応答する可能性がないかを決定する方法であって、患者から単離された試料に、本開示の抗体、抗原結合性断片、および／またはポリペプチドを接触させるステップ、ならびに試料中の抗体－細胞複合体、抗原結合性断片－細胞複合体、および／またはポリペプチド－細胞複合体を検出するステップを含み、またはあるいはそれから本質的になり、またはなおさらにそれからなり、複合体が存在すれば、対象が治療に応答する可能性があることを示し、複合体が存在しなければ、対象が治療に応答する可能性がないことを示す、方法を提供する。抗体、抗原結合性断片、および／またはポリペプチドは、検出可能に標識され得る。

同様に本明細書において、本開示の、有効量の抗体またはＣＡＲを、治療に応答する可能性があると決定された対象に投与するステップをさらに含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法を開示する。

本明細書に開示される治療は、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、第４選択治療、または第５選択治療であり得る。

本開示はさらに、対象における治療をモニタリングする方法であって、対象から単離された試料に、本開示の抗体または抗原結合性断片を接触させるステップ、および試料中の抗体－細胞複合体を検出するステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法に関する。方法は、本開示の、有効量のＣＡＲ発現細胞、有効量の抗体、有効量の抗原結合性断片、および／または有効量のポリペプチドを対象に投与する前および／または後に実施することができる。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能に標識される。別の態様では、試料は、喀痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水、血液、または組織のうちの１つまたは複数を含む。

さらなる態様では、本明細書において、がんまたは腫瘍細胞集団に対する免疫応答を刺激する方法であって、本開示の抗体、その抗原結合性断片、および／またはポリペプチドを、免疫応答を刺激するために有効な量で対象に投与するステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法を提供する。一態様では、対象は、がんまたは腫瘍の処置を受けている、受けたことがある、またはそれを必要としている。別の態様では、がんは、低反応性であると特徴付けられている。さらなる態様では、がんまたは腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激する方法であって、標的細胞集団に本開示の抗体を接触させるステップを含み、またはあるいはそれから本質的になり、またはなおさらにそれからなり、接触させるステップがｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏである、方法を提供する。直接相互作用の特定の例は結合である。間接的相互作用の特定の例は、１つの実体が中間分子に作用し、次に第２の参照実体に作用する場合である。本明細書で使用される場合、接触は、溶液中、固相、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、細胞内、およびｉｎｖｉｖｏを含む。ｉｎｖｉｖｏでの接触は、投与することまたは投与と呼ぶことができる。別の態様では、がんまたは腫瘍は、低反応性であると特徴付けられる。一態様では、抗体は、がんまたは腫瘍細胞に対する特異的結合に関して選択される。細胞は、任意の種の細胞、例えば哺乳動物細胞またはヒト細胞であり得る。それらは、対象（例えば、生検から）または培養細胞から単離することができる。別の態様では、がんまたは腫瘍細胞は、Ｌｙｍ１またはＬｙｍ２を発現または過剰発現する。

同様に、本明細書において、対象において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、本明細書に提供されるＣＡＲ発現細胞、抗体、その抗原結合性断片、および／またはポリペプチドを、対象に免疫を提供するために有効な量で投与するステップを含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる方法を提供する。本明細書に提供されるＣＡＲ発現細胞、抗体、その抗原結合性断片、および／またはポリペプチドは、がんの素因を有するまたはがんの症状をまだ示していない対象において症状またはがんが起こるのを防止するために提供される。

一部の実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲ発現細胞、抗体、その抗原結合性断片、および／またはポリペプチドは、腫瘍組織の切除によって形成された内腔（すなわち、内腔内送達）または切除前の腫瘍に直接（すなわち、腫瘍内送達）送達または投与され得る。一部の実施形態では、本開示の抗体は、静脈内、髄腔内、腹腔内、筋肉内、皮下、または他の適した投与手段によって投与され得る。

本開示の医薬組成物は、処置または防止される疾患に対して適切な方法で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決定されるが、適切な投薬量は臨床試験によって決定され得る。

上記の方法に関して、有効量が投与され、細胞または集団の投与は、任意の症状を減弱させるまたは追加の症状が生じるのを防止するように作用する。投与ががんの再発または転移の可能性を防止または低減することを目的とする場合、細胞または組成物は、任意の目に見えるまたは検出可能な症状の前に投与することができる。投与経路としては、これらに限定されないが、経口（例えば、錠剤、カプセル剤、または懸濁剤）、局所、経皮、鼻腔内、膣、直腸、皮下静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、腹腔内、硬膜外、および髄腔内が挙げられる。

方法は、（１）疾患の素因を有するまたはまだ症状を示していない対象において症状または疾患が起こるのを防止すること；（２）疾患を阻害することまたはその発生を停止させること；あるいは（３）疾患または疾患の症状を回復させるまたはその退行もしくは再発を引き起こすことのうちの１つあるいは複数を提供する。当技術分野で理解されるように、「処置」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術の目的に関して、有益なまたは所望の結果は、これらに限定されないが、１つまたは複数の症状の軽減または回復、状態（疾患を含む）の程度の減少、状態（疾患を含む）の状況の安定化（すなわち、悪化していない）、状態（疾患を含む）の遅延または鈍化、状態（疾患を含む）の進行、回復または緩和、状況および寛解寛解（部分的または全体）、検出可能であるか検出不能であるか、のうちの１つまたは複数を含み得る。本開示の組成物および方法を含有する処置は、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、第４選択治療、第５選択治療であり得、単独の治療として、または他の適切な治療、例えば手術による切除、化学療法、放射線療法と組み合わせて使用されると意図される。一態様では、処置は予防を排除する。
キット

１つの特定の態様では、本開示は、本開示の方法を実行するためのキットおよび本開示の方法を実行するための使用説明書を提供する。キットは、本開示の抗体、ＣＡＲ、抗原結合性断片、ポリペプチド、単離された核酸、ベクター、単離された細胞および／または組成物、ならびに使用説明書のうちの１つまたは複数を含む、またはあるいはそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。

キットは、生物試料、例えば喀痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水、または血液が挙げられるがこれらに限定されない任意の体液、および体組織の生検試料を含む生物試料中にＬｙｍ１またはＬｙｍ２ポリペプチドの存在を検出するために有用である。試験試料はまた、腫瘍細胞、腫瘍に隣接する正常細胞、腫瘍組織タイプに対応する正常細胞、血液細胞、末梢血リンパ球、またはその組合せであり得る。上記の方法において使用される試験試料は、アッセイフォーマット、検出法の性質、およびアッセイされる試料として使用される組織、細胞、または抽出物に基づいて変化する。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製する方法は、当技術分野で公知であり、利用されるシステムと適合性である試料を得るために容易に適合させることができる。

キット構成要素（例えば、試薬）を、適した容器に包装することができる。キットはまた、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤も含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。キットはさらに、検出可能な標識を検出するために必要な構成要素、例えば酵素または基質を含み得る、またはあるいはそれから本質的になり得る、またはなおさらにそれからなり得る。キットはまた、アッセイして試験試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料も含有し得る。キットの各々の構成要素を、個々の容器内に封入することができ、様々な容器の全てが、キットを使用して実施したアッセイの結果を解釈するための使用説明書と共に単一の包装内にあり得る。本開示のキットは、キット容器上またはキット容器内に書面の製品を含有し得る。書面の製品は、キットに含有される試薬を使用する方法を説明する。

したがって、これらの提案されたキットの構成要素は、当業者によって使用するために通常の方法で包装され得る。例えば、これらの提案されたキットの構成要素は、溶液中にまたは液体分散液等として提供され得る。

実験方法
（実験番号１）
ヒト化Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２抗体の特徴付け
２つのヒト化Ｌｙｍ－１抗体および１つのヒト化Ｌｙｍ－２抗体を、ＣＤＲグラフティングによって産生した。ヒト化抗体は、その親キメラ抗体より低い結合能を示した（図１および図４）。
ｈｕＬｙｍ－１－Ａ形質導入初代ヒトＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの発現および機能の評定

ｈｕＬｙｍ－１－Ａ、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ、およびｈｕＬｙｍ－２ＣＡＲは、抗Ｌｙｍ－１イディオタイプ抗体またはプロテイン－Ｌによって検出する場合、初代ヒトＴ細胞において発現させることができる（図２および図５）。ＡＲＨ－７７に対するｈｕＬｙｍ－２ＣＡＲ媒介エピトープ特異的殺滅を図４に示す。
ｈｕＬｙｍ－１ＣＡＲ－Ｔ細胞はＲａｊｉ異種移植片において完全な寛解を誘導した

Ｌｙｍ－１およびｈｕＬｙｍ－１ＣＡＲ－Ｔ細胞によって処置したマウスでは、バックグラウンドの生物発光のみが検出され、抗腫瘍効果は６０日の実験期間を通して持続した（図３Ａ～図３Ｃ）。Ｔ細胞およびＰＢＳをモック形質導入したマウス５匹では、腫瘍負荷が進行し、全てのマウスを後肢麻痺により２７日までに屠殺し、生存期間の中央値は２０日であった（図３Ａ、図３Ｃ）。
細胞株

ＡＲＨ－７７細胞株を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＡＲＨ－７７ｅＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞株は、親ＡＲＨ－７７にｅＧＦＰ／Ｌｕｃウイルスを形質導入することによって研究所内で生成した。Ｒａｊｉ／Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓのＤｒ．ＹｖｏｎｎｅＹ．Ｃｈｅｎから寄贈された。細胞株は全て、１０％透析ＦＣＳ（ｄＦＣＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２％グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。レンチウイルス産生のために使用したＨＥＫ－２９３ＬＴＶ細胞（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）は、１０％ｄＦＣＳ、２％グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ腫細胞は、ＡＴＣＣから得て、１０％ＦＣＳ、１％グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中での培養において維持した。
ヒト化抗体の特徴付け

ヒト化Ｌｙｍ－１およびＬｙｍ－２の結合能をそれぞれ、フローサイトメトリー分析によってＲａｊｉおよびＡＲＨ－７７細胞株に対して評価した。各々の状況で、洗浄緩衝液１００ｕｌ中の５×１０^５個の標的細胞を、抗体の漸増濃度と共に４℃で３０分間インキュベートした。次に細胞を洗浄緩衝液（２％ＦＢＳ、ＰＢＳ）によって２回洗浄した後、（ＡＦ４８８）－コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ）２ｕｇを添加した。次に標識細胞を、４℃でさらに３０分間インキュベートした。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、フローサイトメトリーによって定量した。
ベクターの構築およびレンチウイルスの調製

Ｌｙｍ－１－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、ｈｕＬｙｍ－１－Ａ－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、およびｈｕＬｙｍ－２－４１ＢＢ３ｚＣＡＲのコード遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ制限部位を通してレンチウイルスベクターｐＬＶＸ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－Ｚｓｇｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）にライゲーションした。レンチウイルスは、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）からなるＣＡＲ導入ベクターおよびＨＥＫ－２９３ＬＴＶ細胞株の一過性の同時トランスフェクションによって産生した。ウイルス粒子を含有する上清をトランスフェクションの２４および４８時間後に収集し、合わせて濾過し、超遠心分離によって濃縮した。次いで沈降させたウイルスを、１％ＢＳＡおよび７％トレハロースを補充したＰＢＳ中に再懸濁させて、アリコートにし、－８０℃で保存した。１０^６個のＪｕｒｋａｔＴ細胞にウイルスベクターの１０倍連続希釈液を形質導入することによって、ウイルス価を測定した。形質導入の４８時間後、細胞を、研究所で開発したビオチン標識抗Ｌｙｍ－１イディオタイプ抗体またはビオチン標識プロテインＬ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）によって標識し、ＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって検出した。１０～２０％の範囲で積極的に形質導入された細胞を使用して、ウイルス形質導入単位（ＴＵ）を以下の式によって計算した：
ＴＵ／ｍＬ＝（播種した細胞１０^６個×％陽性細胞×１，０００）／μｌウイルスベクター。
初代Ｔ細胞の単離および形質導入

ヒトバフィーコート調製物をＺｅｎｂｉｏＩｎｃ．（ＲｅｓｅａｒｃｈＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ、ＮＣ）から購入し、使用して、形質導入手順のための初代血液単核球細胞（ＰＢＭＣ）を得た。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を製造元のプロトコールに従って使用してＰＢＭＣを単離した後、Ｔ細胞ネガティブ選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用してＴ細胞単離手順を行った。次に、単離された細胞を、Ｔ細胞培地（４３％Ｃｌｉｃｋｓ、４３％ＲＰＭＩ１６４０、２％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ｄＦＣＳ、１％非必須アミノ酸溶液、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液）中で培養した。形質導入の３日前に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を１：１の比で添加することによってＴ細胞を活性化した後、レンチウイルス（ＭＯＩ＝１５）およびＬｅｎｔｉｂｌａｓｔ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に８００ｇで９０分間遠心分離することによって形質導入した。形質導入を１回実施した後、２４時間後に培地を交換し、その後細胞を、新しいＴ細胞培地を補充した２４ウェルＧ－Ｒｅｘプレート（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ、ＳｔＰａｕｌ、ＭＮ）に移した。形質導入後１０日目に、Ｔ細胞をアッセイのために使用した。ＣＡＲウイルス形質導入効率を、ビオチン化抗Ｌｙｍ－１イディオタイプ抗体を使用した後にＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジンによる検出によって、１０日目にフローサイトメトリーによって評定した。モック形質導入を、上記の通りであるが生存ウイルスベクターの非存在下で陰性対照として実施した。
細胞傷害性

形質導入されたエフェクターＣＡＲＴ細胞調製物を、モックＴ細胞の添加によってＣＡＲＴ細胞が５０％陽性となるように調整した。これらの調整された調整物を、サイトカインを添加せずに平底９６ウェルプレートにおいて各々１０万個のＲａｊｉＬｕｃ／ｅＧＦＰ細胞と共に、ＣＡＲＴ細胞の標的に対する比２：１、１：１、０．５：１、および０．２５：１で２４時間インキュベートした。エフェクター細胞を含まないＲａｊｉ細胞からの発光の読み取りデータを対照として使用した。２０万個のＲａｊｉＬｕｃ／ｅＧＦＰの２倍連続希釈液を使用して検量線を作成し、生存細胞を発光の読み取りデータと相関させた。２４時間インキュベーション後の生存標的細胞数を、発光シグナルの読み取りデータを検量線と相関させることによって計算した。細胞溶解のパーセンテージを以下の式によって計算した：

ＮＯＤＳｃｉｄ－ＩＬ２Ｒガンマヌル（ＮＳＧ）マウスにおけるＲａｊｉ／Ｌｕｃ－ｅＧＦＰ異種移植片の研究

マウス実験は全て、ＵＳＣ動物実験委員会（ＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）（プロトコール番号２０５８５）によって承認された。ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した８週齢の雄性ＮＳＧマウスを、ＵＳＣ動物施設において滅菌ケージに収容した。ＰＢＳ１００μｌ中の１００万個のＲａｊｉ／Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を、インスリンシリンジを使用して側方尾静脈を介して静脈内注射（ｉ．ｖ．）した（０日目とする）。ルシフェラーゼ活性を、生物発光イメージングを介して７日目に測定し、腫瘍負荷を評価した。８日目に、１００万個のモックＴ細胞、Ｌｙｍ－１－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲを、ＰＢＳ１００μｌ中で調製し、インスリンシリンジを使用してｉ．ｖ．注射した。マウスの体重を週に２回測定し、腫瘍の進行を、ＵＳＣＣｏｒｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｉｎｇＣｅｎｔｅｒにおいてＩＶＩＳイメージングシステムを使用する生物発光イメージングによってモニタリングした。
（実験番号２）
細胞株

Ｒａｊｉ／Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓのＤｒ．ＹｖｏｎｎｅＹ．Ｃｈｅｎから寄贈された。細胞株は全て、１０％透析ＦＣＳ（ｄＦＣＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２％グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。レンチウイルス産生のために使用したＨＥＫ－２９３ＬＴＶ細胞（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を、１０％ｄＦＣＳ、２％グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ腫細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ）から得て、１０％ＦＣＳ、１％グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地中での培養において維持した。
ベクターの構築およびレンチウイルスの調製

Ｌｙｍ－１－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲのコード遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ制限部位を通してレンチウイルスベクターｐＬＶＸ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－Ｚｓｇｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）にライゲーションした。レンチウイルスは、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）からなるＣＡＲ導入ベクターおよびＨＥＫ－２９３ＬＴＶ細胞（８）の一過性の同時トランスフェクションによって産生した。ウイルス粒子を含有する上清をトランスフェクションの２４および４８時間後に収集し、合わせて濾過し、超遠心分離によって濃縮した。次いで沈降させたウイルスを、１％ＢＳＡおよび７％トレハロースを補充したＰＢＳ中に再懸濁させて、アリコートにし、－８０℃で保存した。１０^６個のＪｕｒｋａｔＴ細胞にウイルスベクターの１０倍連続希釈液を形質導入することによって、ウイルス価を測定した。形質導入の４８時間後、細胞を、本出願人の研究所で開発したビオチン標識抗Ｌｙｍ－１イディオタイプ抗体によって標識し、ＡＰＣコンジュゲートストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって検出した。１０～２０％の範囲で積極的に形質導入された細胞を使用して、ウイルス形質導入単位（ＴＵ）を以下の式によって計算した：ＴＵ／ｍＬ＝（播種した細胞１０^６個×％陽性細胞×１，０００）／μｌウイルスベクター。
初代Ｔ細胞の単離および形質導入

形質導入されたエフェクターＣＡＲＴ細胞調製物を、モックＴ細胞の添加によってＣＡＲＴ細胞が５０％陽性となるように調整した。これらの調整された調製物を、サイトカインを添加せずに平底９６ウェルプレートにおいて各々１０万個のＲａｊｉＬｕｃ／ｅＧＦＰ細胞と共に、ＣＡＲＴ細胞の標的に対する比２：１、１：１、０．５：１、および０．２５：１で２４時間インキュベートした。エフェクター細胞を含まないＲａｊｉ細胞からの発光の読み取りデータを対照として使用した。２０万個のＲａｊｉＬｕｃ／ｅＧＦＰの２倍連続希釈液を使用して検量線を作成し、生存細胞を発光の読み取りデータと相関させた。２４時間インキュベーション後の生存標的細胞数を、発光シグナルの読み取りデータを検量線と相関させることによって計算した。細胞溶解のパーセンテージを以下の式によって計算した：

マウス実験は全て、ＵＳＣ動物実験委員会（プロトコール番号２０５８５）によって承認された。ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した８週齢の雄性ＮＳＧマウスを、ＵＳＣ動物施設において滅菌ケージに収容した。ＰＢＳ１００μｌ中の１００万個のＲａｊｉ／Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を、インスリンシリンジを使用して側方尾静脈を介して静脈内注射（ｉ．ｖ．）した（０日目とする）。ルシフェラーゼ活性を、生物発光イメージングを介して７日目に測定し、腫瘍負荷を評価した。８日目に、１００万個のモックＴ細胞、Ｌｙｍ－１－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－４１ＢＢ３ｚＣＡＲ、およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲを、ＰＢＳ１００μｌ中で調製し、インスリンシリンジを使用してｉ．ｖ．注射した。マウスの体重を週に２回測定し、腫瘍の進行を、ＵＳＣＣｏｒｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｉｎｇＣｅｎｔｅｒにおいてＩＶＩＳイメージングシステムを使用する生物発光イメージングによってモニタリングした。
ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲ形質導入初代ヒトＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの発現および機能の評定

ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲ構築物は、ＣＤ８ａヒンジおよび細胞膜の固定を可能にする膜貫通ドメイン（ＴＭ）の後に、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２の方向のＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２の細胞質領域で構成された（図７）。ＣＡＲＴ細胞の特異性は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ抗体から得たｓｃＦｖに対するものである。この新規構築物は、抗Ｌｙｍ－１イディオタイプ抗体によって検出した場合に初代ヒトＴ細胞での発現に成功し（図８）、Ｌｙｍ－１陽性細胞株Ｒａｊｉ、ＥＢＶ陽性アフリカバーキットリンパ腫細胞株に対して細胞傷害性を示す（図１０）。より重要なことに、ＤＡＰＣＡＲを形質導入したＴ細胞は、モックＴ細胞と類似の増殖プロファイルを有し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる繰り返し刺激後にトランスジーン発現を保持した（図９Ａ～９Ｂ）。しかし、重要なことは、４１ＢＢ３ｚに基づくＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＡＲ陽性集団中で漸減を示すことであった（図９Ａ～９Ｂ）。
ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞はＲａｊｉ異種移植片において優れた腫瘍制御を示した

異なる構築物の抗腫瘍効果を、ＲａｊｉｅＧＦＰ／Ｌｕｃ異種移植片モデルにおいて評価した。これらの研究では、各群の効力の差をより良好に評価することができるように、１０分の１の数のＣＡＲＴ細胞を使用した。これらのｉｎｖｉｖｏ研究の結果を図１０に示し、以下を示す。モックＴ細胞群におけるマウスは全て、２２日目までに腫瘍進行により死亡した（図１１Ａ～１１Ｄ）。これに対し、ＣＡＲＴ細胞処置群のマウスは、有意な改善および生存率を示した（図１１Ｂ）。しかし、マウスＬｙｍ－１－４１ＢＢ３ｚ群では、腫瘍が２１日目より後に進行し（図１１Ａ）、最終的に後肢の麻痺を引き起こした。この群では、マウス２匹のみが４４日目まで生存した（図１１Ｂ）。ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－４１ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞処置マウスでは、劇的な腫瘍の進行が２１日目より後に認められたが、４２日目で後肢の麻痺を発症したマウスは１匹のみであり、４匹中２匹のマウスは、生物発光イメージングによって証明されるように４４日目までに非常に高い腫瘍負荷を有した（図１１Ａ～１１Ｃ）。対照的に、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞は、より一貫した腫瘍の制御を誘導し、４４日目までに後肢の麻痺を発症したマウスはいなかった（図１１Ａ～１１Ｃ）。加えて、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲでは、４－１ＢＢ－ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを使用する第２世代ＣＡＲＴ細胞によって処置した群と比較して、有意に低い体重減少（体重減少５％対２０％）を有した。これらの結果は、第２世代に基づくＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、この新規ＤＡＰ構築物のより安全かつより有効なプロファイルを示唆する。
（実験番号３）

本実験は、ＣＡＲＴ細胞のＤＡＰシグナル伝達部分の有用性およびＬｙｍ－１陽性腫瘍を処置するための細胞治療モダリティの開発を実証する。
マウス

マウスの実験は、ＵＳＣ動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ２０５８５）によって承認され、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した、またはＵＳＣ動物施設においてＩＡＣＵＣ２０６９７の下で交配させた８～１３週齢のＮＳＧマウス（雌および雄）を伴った。
サイトカインおよび抗体

ｃｈＬｙｍ－１、ＩＬ－７－Ｆｃ、ＩＬ－１５－Ｆｃ、およびＤｙｌｉｇｈｔ６５０抗２６１タグ抗体を、本出願人の研究所において開発し、調製した。使用した市販の抗体は：Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ－１１０１３）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ヒトＩｇＧＦｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０９３２０）、フィコエリスリン（ＰＥ）抗ヒトリン酸化ＣＤ３ζ（ｐＹ１４２）（ＢＤＳｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５８４４８）、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ２２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２５０６）、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２５４）、ＰＥマウス抗ヒトＰＤ－１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９０６）、ＰＥマウス抗ヒトＬＡＧ－３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６９３０６）であった。
試薬

これらの研究を実施するために使用した試薬は：ＲＰＭＩ－１６４０（ＧｅｎｅｓｅｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット番号０５１９１０８）、ＤＭＥＭ（ＧｅｎｅｓｅｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット番号０５１９１０１６）、透析したウシ胎仔血清（ｄＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００７９．０３）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３５０５０－０６１）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ）、非必須アミノ酸（ＧｅｎｅｓｅｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２５－５３６）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｃ５５７２－５００ＭＬ）、ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ３１０１Ｍ）、ＭｌｕＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ３１９８Ｌ）、ｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号１２２６０）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、カタログ番号１２２５９）、Ｘｆｅｃｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１４１８）、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＧＥ１７－１４４０－０２）、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１９０５１）、Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号９０２１０－５０Ｇ）、Ｌｅｎｔｉｂｌａｓｔ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＬＢ０１５００）、２４ウェルＧ－Ｒｅｘプレート（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ、カタログ番号８０２４０Ｍ）、ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１１３１Ｄ）、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化因子（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１０９７０）、ＩＬ－２ＥＬＩＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＨ２ＩＬ２）、ＧＭ－ＣＳＦＥＬＩＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＨＧＭＣＳＦ）、およびＩＮＦ－ガンマＥＬＩＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＥＨＩＦＮ）、細胞内染色透過洗浄緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１００２）、およびＦｌｕｏｒｏＦｉｘ緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２１０１）、ＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｓ７０２０）、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対細胞数計測用ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３６９５０）を含む。
細胞

Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ、Ｋａｒｐａｓ－２９９、Ｂ３５Ｍ、ＢＡＬＬ－１、Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ、およびＲａｊｉ細胞株を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ＳＵ－ＤＨＬ－６（Epstein AL et al, 1974, 1851-72 doi 10.1002/1097-0142(197412)34:6<1851::aid-cncr2820340602>3.0.co;2-4）、ＳＵ－ＤＨＬ－１０（1851-72 doi 10.1002/1097-0142(197412)34:6<1851::aid-cncr2820340602>3.0.co;2-4）、およびＮＵ－ＤＨＬ－１（Epstein AL et al, 1985, 619-27 doi 10.1002/ijc.2910350509）ヒトリンパ腫細胞株は、本出願人の施設内において作製した。Ｒａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓのＤｒＹｖｏｎｎｅＹ．Ｃｈｅｎから寄贈された。リンパ腫株は全て、１０％透析ウシ胎仔血清（ｄＦＣＳ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ－１６４０において培養した。ＨＥＫ－２９３ＬＴＶ細胞（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＬＴＶ－１００）は、１０％ｄＦＣＳ、１％ＧｌｕｔａＭａｘ、１％非必須アミノ酸、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭにおいて培養した。初代ヒトＴ細胞を、ヒトバフィーコート（Ｚｅｎ－Ｂｉｏ、ＣＡＲ＃ＳＥＲ－ＢＣ－ＳＤＳ）から濃縮し、５０ｎｇ／ｍＬＩＬ－７－Ｆｃおよび１００ｎｇ／ｍＬＩＬ－１５－Ｆｃを補充したＴ細胞培地（４３％Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、４３％ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ｄＦＣＳ、２％ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％非必須アミノ酸、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中で培養した。使用した細胞株は全て、ＭｙｃｏＦｌｕｏｒＭｙｃｏｐｌａｓｍａ検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｍ７００６）を使用してマイコプラズマの汚染に関してルーチンに試験した。
ヒト化Ｌｙｍ－１結合研究

図２１Ａ、図２１Ｂ、および図２３Ｂ：１００μｌ中に０．０１３ｎＭ～１３００ｎＭの範囲の濃度の抗体を、２０万個のＲａｊｉ細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした後、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中に２％ＦＢＳ）によって３回洗浄した。次に結合抗体を、濃度５ｕｇ／ｍＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（ＡＦ）４８８コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、または試料あたり５μｌのＡＦ６４７コンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃと共に３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリー分析に供した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を記録し、プロットして抗体結合を評定した。図１ｃおよび３ｃでの染色に関して、抗体１０μｇを１００μｌ中で２０万個の細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。上記のように洗浄後、ＡＦ－６４７コンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃ５μｌを、検出のために洗浄緩衝液残渣中の細胞に添加した。試料を、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して評定し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（ＢＤ）を使用して分析した。
ベクターの構築およびレンチウイルスの調製

ＣＡＲのコード遺伝子は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）が合成し、ＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ制限部位を通してレンチウイルスベクターｐＬＶＸ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－Ｚｓｇｒｅｅｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にライゲーションした。全てのＣＡＲ構築物に関して、ヒト胎盤増殖因子に由来する１０アミノ酸のエピトープ「ＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳ」（２６１－タグ）をｓｃＦｖ配列の直後に挿入した。レンチウイルスを、すでに記載されているように（Zheng L et al, 2017, doi 10.3390/ijms18122773）Ｘｆｅｃｔプロトコールに従ってＨＥＫ－２９３ＬＴＶの一過性のトランスフェクションによって産生した。簡単に説明すると、導入ベクターのみをｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇ（分子比２：１：１）と混合し、ＨＥＫ－２９３ＬＴＶ細胞に同時トランスフェクトした。ウイルス粒子を含有する上清をトランスフェクションの２４および４８時間後に収集し、合わせて濾過し、２０，０００ｇで２時間の超遠心分離によって濃縮した。次に、沈降させたウイルスを、１％ＢＳＡおよび７％トレハロースを補充したＰＢＳ中に再懸濁させ、アリコートにし、－８０℃で保存した。１０^６個のＪｕｒｋａｔＴ細胞にウイルスベクターの１０倍連続希釈液を形質導入することによって、ウイルス価を測定した。形質導入の４８時間後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を洗浄し、トランスジーンの発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。１０～２０％の範囲で積極的に形質導入された細胞を使用して、ウイルス形質導入単位（ＴＵ）を以下の式によって計算した：ＴＵ／ｍＬ＝（播種した細胞１０^６個×％陽性細胞×１，０００）／μｌウイルスベクター。
初代Ｔ細胞の単離、形質導入、および分析

ヒトバフィーコート調製物をＺｅｎｂｉｏＩｎｃ．から購入し、Ｔ細胞濃縮のための初代血液単核球細胞（ＰＢＭＣ）を得た。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを使用してＰＢＭＣを単離した後、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キットを使用するＴ細胞単離を、製造元のプロトコールに従って行った。次に、単離された細胞を、Ｔ細胞培地中で培養した。０日目に、ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８を１：１の比で添加することによってＴ細胞を活性化し、３日目にレンチウイルス（ＭＯＩ＝１０）およびＬｅｎｔｉｂｌａｓｔと共に１２００ｇで４５分間遠心分離することによって形質導入した。形質導入を１回実施した後、２４時間後に培地を交換し、その後細胞を、新しいＴ細胞培地を補充した２４ウェルＧ－Ｒｅｘプレートに移した。形質導入効率を、Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０コンジュゲート抗２６１タグ抗体を使用して７日目にフローサイトメトリーによって評定した。再刺激に関して、７日目にＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化因子２０μｌを、１００万個のＴ細胞と共にＴ細胞培地２ｍｌ中に添加し、９日目にＴ細胞培地５ｍｌを添加した。１２日目に、沈降した細胞の上方のおよそ５ｍｌ培地を除去し、新しいＴ細胞培地５ｍｌを添加した。１４日目に、７日目と同じ手順によって追加の再刺激を行ってもよい。本出願人の実験では、ｄｙｎａｂｅａｄｓＣＤ３／ＣＤ２８刺激因子は主にＣＤ４＋Ｔ細胞の増大を促進したが、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化因子は、バランスのとれたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増大をもたらしたことから、再刺激のためにＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔを使用した。全ての細胞計数に関して、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。モックまたはＣＡＲＴ細胞におけるＰＤ－１およびＬＡＧ－３発現を、再刺激の７および１４日前に評価した。５０万個の細胞を、Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０コンジュゲート抗２６１タグ抗体およびＰＥコンジュゲート抗ヒトＰＤ－１または抗ＬＡＧ－３と共にインキュベートした。次に標識細胞をフロー分析に供した。「モックＴ細胞」は、３日目の形質導入ステップでウイルスを添加しなかったことを除き、上記の手順を通して実行されたＴ細胞を指す。
細胞傷害アッセイ

発光に基づく細胞傷害アッセイ：７日目で再刺激していない９日目からのＣＡＲＴ細胞を、モックＴ細胞の添加によってＣＡＲＴ細胞が５０％陽性となるように調整した。これらの調整された調製物を、サイトカインを添加せずに平底９６ウェルプレートにおいて１０万個の標的細胞とＣＡＲＴ細胞の様々な比で２４時間インキュベートした。エフェクター細胞を含まない標的細胞からの発光の読み取りデータを対照として使用した。２０万個の標的細胞の２倍連続希釈液を使用して検量線を作成し、生存細胞を発光の読み取りデータと相関させた。２４時間インキュベーション後の生存標的細胞数を、発光シグナルの読み取りデータを検量線と相関させることによって計算した。細胞溶解のパーセンテージを以下の式によって計算した：

フローサイトメトリーに基づく細胞傷害アッセイ：２×１０^５個のＣＡＲＴ細胞を、２４ウェルプレートにおいて標的細胞と１：１の比でインキュベートした。混合後１時間および４８時間での生存標的細胞のパーセンテージを記録し、これを使用して以下の式によって溶解％を計算した：

サイトカイン分泌アッセイ

７日目に再刺激していない９日目のモックまたはＣＡＲＴ細胞を、サイトカイン分泌アッセイのために使用した。２×１０^５個のエフェクター細胞および標的細胞を、９６ウェルプレートにおいてサイトカインを添加せずに１：１の比で２４時間共培養した。上清を収集し、製造元の使用説明書に従って酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）に供した。
ＣＤ３－ζリン酸化アッセイ

７日目に再刺激していない９日目のモックまたはＣＡＲＴ細胞５０万個を固定した後、Ｄｙｌｉｇｈｔコンジュゲート抗２６１タグ抗体２μｇによって染色した。標識細胞を、製造元の使用説明書に従って透過処理した。次に、透過処理した細胞を、試料あたりＰＥコンジュゲート抗ヒトリン酸化ＣＤ３ζ抗体５μｌによって染色した。試料を洗浄し、フローサイトメトリー分析に供した。
抗原のダウンレギュレーション実験

ｅｘｖｉｖｏ実験：７日目に再刺激していない９日目のモックまたはＣＡＲＴ細胞を、このアッセイのために使用した。腫瘍細胞（４×１０^５個）を、２×１０^５個のＣＡＲＴ細胞と共に、サイトカインを補充していないＴ細胞培地２ｍｌ中、Ｅ：Ｔ比１：２で２４時間共培養した。細胞を有する培地１００μｌを収集し、ＣＤ２２、Ｌｙｍ－１、ＣＤ１９、およびＳｙｔｏｘＧｒｅｅｎに関して染色した。Ｒａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃでは、ＣＤ２２を使用する代わりにＧＦＰを使用して、腫瘍細胞を同定した。室温で２０分間インキュベーション後、ＰＢＳ４００μｌおよび計数ビーズ２５μｌを各チューブに添加した。次いで、試料をフローサイトメトリー分析に供した。平均蛍光強度をＦｌｏｗｊｏソフトウェアによって定量した。
ＮＯＤＳｃｉｄ－ＩＬ２Ｒ^{ガンマヌル}（ＮＳＧ）マウスにおけるＲａｊｉ／Ｌｕｃ－ｅＧＦＰ異種移植片研究

ＰＢＳ１００μｌ中１００万個のＲａｊｉ／Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞を、側方尾静脈を介してｉ．ｖ．注射した（０日目とする）。ルシフェラーゼ活性を、６日目に生物発光イメージング（ＢＬＩ）を介して測定し、腫瘍負荷を評価した。同じ日に５００万個のモックＴまたはＣＡＲＴ細胞をＰＢＳ１００μｌ中で調製し、インスリンシリンジを使用してｉ．ｖ．注射した。腫瘍の進行を、表記の日にＵＳＣＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｉｎｇＣｅｎｔｅｒでＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ２００を使用することによって、またはＵＳＣＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙでＩＶＩＳＬｕｍｉｎａＳｅｒｉｅｓＩＩＩを使用することによってモニタリングした。マウスを、気化したイソフルランによって麻酔し、イメージングの前にＤ－ルシフェリン（５０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内注射を介して投与した。一部の実験では、図の説明文に明記したように、第１のＢＬＩ測定を７日目に実施した後、様々な量のモックまたはＣＡＲＴ細胞を８日目に注射した。全ての研究において、９日目（７日目で再刺激していない）のモックまたはＣＡＲＴ細胞を使用し、後肢麻痺を安楽死のエンドポイントとして使用した。生存データをカプラン－マイヤープロットによって示し、ログランク検定によって分析する。
統計分析

ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフをプロットした。データを、ＳＰＳＳソフトウェア（ＩＢＭ）を使用して分析した。統計分析法を図の説明文に示す。特に明記していない限り、データは平均値±ＳＤとして表記し、ｐ＜０．０５は有意であると考えられた。
結果
ヒト化Ｌｙｍ－１抗体の選択

本出願人は、Ｌｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞が、播種性のＲａｊｉ腫瘍を有するマウスにおいて完全な寛解を誘導したことを実証した（Zheng L et al, 2017, doi 10.3390/ijms18122773）。これらの有望な結果により、将来の患者の研究のためにＣＡＲＴ細胞において使用する場合のＬｙｍ－１ＳｃＦｖの潜在的免疫原性を低減するために、抗体のヒト化を実施した。ヒト化は、ＯａｋＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅに外注し、１２個のヒト化抗体のパネルが本発明者らに提供された（図２１Ａ）。それらの抗体のＲａｊｉ細胞に対する結合能を、フローサイトメトリーによって測定し、各試験濃度で最高の結合を示したｈｕＬｙｍ－１－Ｂ抗体を、ＣＡＲＴ細胞の開発のために選択した（図２１Ａ）。次に、本出願人は、これらの評定を助けるために施設内で提供された配列による一過性の発現を使用してｈｕＬｙｍ－１－Ｂ抗体を産生した。ｃｈＬｙｍ－１と比較すると、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂは、低減されたＭＦＩおよびおよそ２倍高いＥＤ５０でＲａｊｉ細胞に結合する（図２１Ｂ）。Ｒａｊｉ細胞に対するその結合と同様に、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂは、ほとんどのＬｙｍ－１陽性細胞株においてｃｈＬｙｍ－１よりわずかに低いＭＦＩを示す（図２１Ｃ）。ｃｈＬｙｍ－１およびｈｕＬｙｍ－１－ＢはいずれもＫ５６２細胞に結合せず、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂが親Ｌｙｍ－１抗体の特異性と類似の特異性を保持することを示した（図２１Ｃ）。
ｈｕＬｙｍ－１－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞は非常に機能的であるがなおも増大障害を有する

Ｌｙｍ－１エピトープに対するＣＡＲを生成するために、Ｌｙｍ－１またはｈｕＬｙｍ－１－Ｂに由来するＳｃＦｖを、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する従来の第２世代ＣＡＲフレームワークに融合した（図２２Ａ）。ヒト胎盤増殖因子に由来する１０アミノ酸のエピトープ「ＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳ」（２６１タグ）を、ＳｃＦｖとＣＤ８ａヒンジとの間に挿入し、施設内抗体（Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０コンジュゲート抗２６１タグ抗体）を使用することによるＣＡＲ検出を可能にした（図２２Ａ）。いずれの構築物も、同等の形質導入効率でヒト初代Ｔ細胞において発現に成功した（図２２Ｃ）。本出願人は、次にＬｙｍ－１陰性Ｋ５６２－ｅＧＦＰ／ＬｕｃおよびＬｙｍ－１陽性Ｒａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃ細胞株におけるＬｙｍ－１－およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴのエピトープ特異的細胞傷害性を評価した。Ｌｙｍ－１－またはｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴを発現するＴ細胞は、一晩共培養後Ｒａｊｉを効率的に溶解したが、Ｋ５６２細胞と共培養すると細胞傷害性の増加は観察されず、２つのＣＡＲＴ細胞のエピトープ特異的細胞傷害性を示している（図２２Ｄ）。加えて、Ｌｙｍ－１－およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞はいずれも５００万個の用量で、ＮＳＧマウスにおける播種性のＲａｊｉ－ｅＧＦＰ／Ｌｕｃ腫瘍を根絶し、少なくとも６０日の無腫瘍生存をもたらした（図１３）。しかし、α－ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に対する応答では、Ｌｙｍ－１－およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞は増大の障害を示した（図２２Ｅ）。７～１４日目では、モックＴ細胞はおよそ３０倍増加したが、これに対しＬｙｍ－１－およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞では平均で４倍未満の増加であった（図２２Ｅ）。さらに、ＣＤ３ζリン酸化の増加が、Ｌｙｍ－１－およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲ陽性細胞において観察されたが、同じ調製物における非形質導入Ｔ細胞では観察されず、ＣＡＲ形質導入細胞の活性化が弱いことを示した（図２２Ｆ、図２２Ｇ）。これらの結果と一貫して、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲ陽性Ｔ細胞はまた、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３の発現の増加も明らかにした（図２２Ｈ、図２２Ｉ）。ＣＡＲＴ細胞における増強されたＣＤ３ζリン酸化および阻害性受容体発現は、増殖障害が基礎レベル活性化の増加から生じ、すなわちトニックシグナル伝達から生じることを示唆した。ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで強い活性を示したが、最適な治療用量を生成するためには広範囲のｅｘｖｉｖｏ増大が必要であることから、限定的な増殖は、臨床応用のためのｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞の産生に疑念を抱かせるであろう。
ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞のｅｘｖｉｖｏでの増大障害は抗原依存的である

本出願人の研究所において生成されたＦＭＣ６３ＳｃＦｖからなるＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚと同じＣＡＲフレームワークを有する構築物であるが、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞調製物について認められた増大の障害を示さなかった（Zheng L et al, 2017, doi 10.3390/ijms18122773）。この差は、原因がｈｕＬｙｍ－１－ＢＳｃＦｖに関係することを示唆した。Ｌｙｍ－１は、ＨＬＡ－ＤＲのいくつかのサブタイプにおいてコンフォメーショナルエピトープを認識するが（Rose LM et al, 1999, 789-97）、ヒトＴ細胞上でのＬｙｍ－１の結合は報告されていない。本出願人は、活性化Ｔ細胞上でのこれまで報告されていないまばらなＬｙｍ－１エピトープ発現がリガンド依存的トニックシグナル伝達を誘導するために十分であること、またはそのいずれかがｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞の増大の障害を引き起こし得るＣＡＲ媒介仲間殺しをもたらすと仮定した。この仮説を試験するために、活性化Ｔ細胞に対するＬｙｍ－１およびｈｕＬｙｍ－１－Ｂ結合を注意深く評価したところ、小さいがしかし実際の量の結合が検出された（図２３Ｃ）。この仮説をさらに試験するために、２つのＣＡＲ構築物を生成した。１つの構築物では、２点突然変異を可変重鎖のＣＤＲ３領域に導入し、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂの結合能を破壊し、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔ－ＢＢ３ｚＣＡＲを構築した（図２３Ａ）。ＣＤＲ３において２つの突然変異を有するｈｕＬｙｍ－１－Ｂの抗体版（ｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔ）も同様に産生した。ｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔは、Ｒａｊｉ細胞に対して測定した場合に、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂよりおよそ２５倍高いＥＤ５０を有し（ＥＤ５０、１．４×１０^－７対５．９×１０^－９、図２３Ｂ）、アイソタイプと比較してＴ細胞に対する結合の増強を示さなかった（図２３Ｃ）。ＣＤ３ζリン酸化は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞の約５％において見出され、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３は、７日目に一過性にアップレギュレートされ（図２３Ｅ～２３Ｇ）、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞調製物は増大の障害を示さず、エピトープ認識が障害のために必要であることを示唆した（図２３Ｇ）。

ＣＡＲシグナル伝達が増大の障害にとって必要であるか否かを決定するために、第２の構築物、すなわちＣＡＲ－ＣＤ３ζドメインの３つのＩＴＡＭにおける６つ全てのチロシンがフェニルアラニンに変換されたｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＹ－Ｆを生成した（図２３Ａ）。ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＹ－ＦＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３ζリン酸化の増加もＰＤ－１およびＬＡＧ－３アップレギュレーションも示さず、モックＴ細胞と同程度に効率的に増大され、ＣＡＲ－ＣＤ３ζを伴うシグナル伝達が障害にとって必要であることを示した（図２３Ｇ）。

本出願人は、次に、仲間殺しがｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞の増大の減損の実質的な原因であるか否かを調べた。本出願人は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞が、同じ調製物中のＣＡＲ陰性集団（約１０％）より劇的に増強された自然発生アポトーシス（約５６％）を示すことを見出した（図１４Ａ）。加えて、本出願人は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞と一晩共培養した場合に、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞のアポトーシスの顕著な増加を観察しなかった（図１４Ｂ）。併せて考慮すると、これらの結果は、仲間殺しの代わりに、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲ－Ｔ細胞のｅｘｖｉｖｏ増殖障害の主な原因が、リガンド依存的ＣＡＲトニックシグナル伝達であるという仮説を支持する。
ＢＢ３ｚをＤＡＰに置き換えるとｈｕＬｙｍ－１－ＢＣＡＲＴ細胞の効率的なｅｘｖｉｖｏ増大を可能にする

次に本出願人は、ＤＡＰシグナル伝達ドメインを使用して、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲを構築した（図２４Ａ、図２４Ｂ）。ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲは、ヒト初代Ｔ細胞においてｈｕＬｙｍ－１－ＢＢ３ｚＣＡＲと均等な形質導入効率で発現に成功した（図２４Ｄ）。重要なことに、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞のｅｘｖｉｖｏ増大は障害されなかった（図２４Ｃ）。加えて、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞と比較すると、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞は、培養において自然発生のアネキシンＶ染色の増強を示さず（図１４Ａ）、Ｒａｊｉ細胞と共に培養するとより低いＡＩＣＤを示した（図１５）。本出願人は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲの約３０％という平均値と比較して、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞の約１０％がＣＤ３ζリン酸化を示すことを見出した（図２４Ｄ、図２４Ｅ）。ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞におけるＣＤ３ζリン酸化の基礎レベルと一貫して、１４日目ではＰＤ－１およびＬＡＧ－３発現もまたモックＴ細胞より高かったが、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞より有意に低かった（図２４Ｆ、図２４Ｇ）。併せて考慮すると、これらのデータは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞が、トニックシグナル伝達および正常な増大を減損させたことを実証した。
ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞はｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で高度に機能的である

ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞のエフェクター機能をｉｎｖｉｔｒｏで評定するために、Ｌｙｍ－１エピトープ陰性（Ｋ５６２）および陽性（Ｒａｊｉ）細胞株に応答した細胞傷害性およびサイトカイン放出を評価した。ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞は、エフェクターの標的に対する比の増加に比例してＲａｊｉ細胞を溶解し、２：１の比で一晩共培養後では約８０％の殺滅に達した（図２５Ａ）。Ｋ５６２細胞を標的細胞として使用した場合、細胞傷害性の増強は明白ではなかった（図２５Ａ）。これらの知見と一貫して、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞はまた、Ｒａｊｉ細胞と共培養した場合に複数のサイトカインを分泌したが、Ｋ５６２細胞と共培養した場合では分泌しなかった（図２５Ｂ）。加えて、本出願人は、多様なＬｙｍ－１エピトープ発現を有するヒトリンパ腫および白血病Ｂ細胞株のパネルに対してｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞の機能を評価した。非常に多様なサイトカイン放出にもかかわらず、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞は、均等な細胞傷害性を示した（図１６）。これらのデータは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞が親Ｌｙｍ－１抗体のこの特異性を保持したことを実証した。

本出願人は次に、ＮＳＧマウスにおける播種性Ｒａｊｉ腫瘍に対するｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞のｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を調べた。ＤＡＰシグナル伝達ドメインによって付与される機能の改善をさらに明らかにするために、５００万個ではなくて１００万個のみのＣＡＲＴ細胞を注射し、腫瘍負荷を増加させるために、チャレンジ処置をＲａｊｉ細胞注射後６日目ではなくて８日目に行った。この改変プロトコールを使用して、１００万個のｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞は、Ｒａｊｉ腫瘍を削除することができず、全てのマウスは５１日目までに腫瘍進行のために死亡した（図２５Ｆ、図２５Ｅ、図２５Ｆ）。これに対し、１００万個のｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞による処置は、持続的な腫瘍の制御および有意に良好な生存をもたらした（図２５Ｆ）。
Ｌｙｍ－１エピトープは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲとの係合後急速にダウンレギュレートしない

ＣＤ１９を標的とするＣＡＲＴ細胞（ＣＤ１９ＣＡＲ）によるＢ細胞悪性腫瘍の処置では再発がしばしば観察され、このダウンレギュレーションは、ＣＤ１９ＣＡＲ治療に対する抵抗性を可能にする重要な機構を表す（Majzner RG et al, 2018, 1219-26 doi 10.1158/2159-8290.cd-18-0442）。抗原逃避を補うための１つの戦略は、現在臨床で調査されているＣＤ２２の標的化などの組合せ標的化を使用することである（Fry TJ et al, 2018, 20-8 doi 10.1038/nm.4441）。あるいは、ダウンレギュレートする傾向が低い抗原に対するＣＡＲＴ細胞は、抗原逃避を低減させ、治療有効性を改善することができる。ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞がＬｙｍ－１エピトープのダウンレギュレーションを促進するか否かを決定するために、本出願人は、Ｒａｊｉ細胞をモック、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲ、またはＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞と共培養した。２４時間以内に、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲおよびＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞はいずれも、Ｒａｊｉ細胞の成長を阻害した（図２６Ｃ、図２６Ｄ）。しかし、ＲａｊｉをＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞と共培養すると顕著なＣＤ１９抗原のダウンレギュレーションが起こったが、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞と共培養した場合ではＣＤ１９のダウンレギュレーションもＬｙｍ－１エピトープのダウンレギュレーションも明白ではなかった（図２６Ａ、図２６Ｂ）。類似の結果は、ヒトＢリンパ腫細胞株のパネルについても得られた（図１７）。その差がＢＢ３ｚドメインではなくてＤＡＰシグナル伝達ドメインの使用によるものであるか否かを決定するために、ＣＤ１９－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞を生成し、Ｒａｊｉと共培養した。Ｒａｊｉ細胞におけるＣＤ１９抗原のダウンレギュレーションはなおも起こった（図１８）。これに対し、それらをｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚまたはｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞のいずれかと共培養した場合には、Ｒａｊｉ細胞において有意なＬｙｍ－１エピトープのダウンレギュレーションは観察されなかった（図１８）。これらの結果は、標的のダウンレギュレーションが、ＣＡＲ構築物のシグナル伝達ドメインではなくて抗原の特性に起因することを示している。

エピトープのダウンレギュレーションをｉｎｖｉｖｏで評価するために、ＣＤ１９およびＬｙｍ－１エピトープ発現を、ＣＡＲＴ細胞治療を受けたマウスの骨髄から得たＲａｊｉ細胞において測定した。ｅｘｖｉｖｏで認められるように、Ｒａｊｉ細胞を有するＮＳＧマウスをＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲによって処置した場合、Ｒａｊｉ細胞における有意なＣＤ１９抗原のダウンレギュレーションもまた認められた（図２６Ｂ）。重要なことに、Ｌｙｍ－１エピトープもＣＤ１９抗原も、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞処置の間にダウンレギュレートされなかった（図２６Ｂ）。播種性のＲａｊｉを有するＮＳＧマウスにおけるｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰ、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚ、およびＣＤ１９－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞のｉｎｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性をまた、０日目に１０^６個のＲａｊｉ細胞を静脈内に注射した後、８日目にモックまたはＣＡＲＴ細胞の様々な用量を静脈内注射するプロトコールにおいて特徴付けた。１回用量の２００万個のｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞処置により、少なくとも９０日間の無腫瘍生存期間がもたらされた（図１９Ｂ、図１９Ｃ）。これに対し、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚまたはＣＤ１９－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞によって処置したＮＳＧマウスのほとんどにおいて高い腫瘍負荷が存在し、２００万個の細胞用量の場合、全てのマウスが７９日目までに死亡した（図１９Ｂ、図１９Ｃ）。その上、この実験モデルでは、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の用量を５００万個に増加させても、無腫瘍生存を達成することはできなかった（図１９Ｂ、図１９Ｃ）。要約すると、Ｌｙｍ－１エピトープは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞処置の圧力下でダウンレギュレートしないことが見出され、この特色は、ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞と比較してｈｕＬｙｍ－１－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞の優れたｉｎｖｉｖｏ有効性に寄与している可能性がある。
考察

ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の臨床試験は、再発したおよび抵抗性のＢ細胞悪性腫瘍を処置するためにこの細胞治療モダリティの使用が有望であることを実証した。その高い初回完全奏功率にもかかわらず、ＣＤ１９陰性腫瘍またはＣＤ１９－ｌｏｗ腫瘍を有する処置した実質的な一部の患者が再発し（Majzner RG et al., (2018), 1219-26 doi 10.1158/2159-8290.cd-18-0442）、追加の有効な標的を同定する必要性を示している。本明細書において、本出願人は、ほとんどのヒトＢ細胞リンパ腫および白血病において高度に発現されているＬｙｍ－１エピトープに対する操作されたヒトＣＡＲＴ細胞の設計および開発を記載している（DeNardo GL et al., (1998), 239-54 doi 10.1089/cbr.1998.13.239；DeNardo GL et al., (1999), 1-11 doi 10.1089/hyb.1999.18.1）。従来の４－１ＢＢ３ｚシグナル伝達ドメインをＤＡＰに交換することによって、本出願人は、Ｔ細胞上のｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＣＡＲおよびＬｙｍ－１エピトープの持続的相互作用（トニックシグナル伝達）によって誘導されるｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＣＡＲＴ細胞のｅｘｖｉｖｏでの増殖障害を回避することができた。その上、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性の増加、サイトカイン放出、およびＣＡＲＴ細胞の低減された用量であっても強力なｉｎｖｉｖｏでの腫瘍制御によって証明されるように、エピトープ駆動性のエフェクター機能を示した。さらに、Ｂ細胞株上のＬｙｍ－１エピトープもＣＤ１９抗原も、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞の存在下でダウンレギュレートされなかった。これらの知見は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞が、臨床で探索すべき有望な細胞治療産物であるように思われることを示している。

これらの研究の間に、本出願人は、Ｌｙｍ－１エピトープを標的とするｈＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞の増大の障害を観察したが、そのような限定的な増大は、結合能に障害を有するｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞（ｈｕＬｙｍ－１－Ｂｍｕｔ－ＢＢ３ｚ）でもＣＤ３ζ活性が除去されたｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞（ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＹ－Ｆ）でも見出されなかった。これらのデータは、限定的な増大がｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲ構築物におけるＣＤ３ζＩＴＡＭシグナル伝達部分のリガンド依存的活性化によって媒介されたことを示唆した。この知見は、ＣＤ２８共刺激ドメインを有する第２世代ＣＡＲが、ＧＤ２（Long AH et al., (2015), 581-90 doi 10.1038/nm.3838）およびＥｒｂＢ２（Zhao Y et al., (2009), 5563-74 doi 10.4049/jimmunol.0900447）に向け直され、限定的な増大、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）、進行性の消耗および不良なｉｎｖｉｖｏでの有効性は、非拘束のＣＡＲ－ＣＤ３ζ活性化が原因であるとした過去の報告と一貫する。いずれの場合においても、ＣＤ２８共刺激ドメインを４－１ＢＢからのシグナル伝達ドメインに置き換えると、十分には理解されていない機序を通して慢性的なＣＡＲ－ＣＤ３ζシグナル伝達によって誘導される有害な作用を軽減した。しかし、本出願者らの実験では、４－１ＢＢ共刺激ドメインはなおも、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの増大が不良な調製物をもたらした。

ＩＴＡＭの定性的に異なる機能は、Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら（Combadiere B et al., (1996), 2109-17）によって初めて考証され、彼らはＣＤ３ζにおける第１および第３のＩＴＡＭのリン酸化が、Ｔ細胞において第２のＩＴＡＭのリン酸化より大きいアポトーシスを刺激したことを報告した。この知見と一貫して、マウスＢ細胞リンパ腫モデルにおいて、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒらは、突然変異した第１および第３のＣＡＲ－ＣＤ３ζＩＴＡＭを有する抗マウスＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞が、アポトーシスに対して抵抗性であり、３つの機能的ＩＴＡＭを有するＣＤ１９ＣＡＲより良好な抗リンパ腫有効性を媒介することができることを実証した（Kochenderfer JN et al., (2010), 3875-86 doi 10.1182/blood-2010-01-265041）。Ｆｅｕｃｈｔら（Feucht J et al., (2018), doi 10.1038/s41591-018-0290-5）による最近の研究は、ＣＤ１９ＣＡＲのＣＤ３ζ部分における第２および第３のＩＴＡＭの機能を除去することが、優先的なセントラルメモリーの分化をもたらし、Ｔ細胞消耗を減少させ、ｉｎｖｉｖｏでの持続を増加させたことを見出した。これらのデータは、各々のＩＴＡＭが定性的に異なり、ＣＡＲシグナル伝達ドメインにおけるＩＴＡＭの選択が、ＣＡＲＴ細胞の運命を制御するアプローチであることを示唆している。

他の研究者ら（Long AH et al., (2015), 581-90 doi 10.1038/nm.3838；Zhao Y et al., (2009), 5563-74 doi 10.4049/jimmunol.0900447.）からの証拠および本報告は、慢性的に最適下のＣＡＲ－ＣＤ３ζ ＩＴＡＭ活性化が、ＣＡＲＴ細胞の異常な表現型の原因であるという仮説を支持した。したがって本出願人は、Ｔ細胞活性化能を保持しながらＣＡＲ－ＣＤ３ζ部分を置換するために他のＩＴＡＭ含有モチーフを使用することによって、これらの有害な効果を軽減することを求めた。本出願人は、ＤＡＰ１２が異なる強度の刺激に応答して別個のシグナル出力を提供し得るＩＴＩＭおよびＩＴＡＭモチーフの両方を細胞内ドメインに有することから、ＤＡＰ１２を選択した（Peng Q et al., (2010), ra38 doi 10.1126/scisignal.2000500）。ＤＡＰ１２は、細胞外領域に認識ドメインを有しない。ＫＩＲ２ＤＳ２（Wang E et al., (2015), 815-26 doi 10.1158/2326-6066.cir-15-0054）、ＴＲＥＭ１（Chen B et al., (2019), 1043-55 doi 10.2217/imt-2019-0017）、およびＮＫｐ４４（Campbell KS et al., (2004), 899-906）などのその関連する受容体は、標的認識および細胞溶解の向け直しの原因である。Ｔｅｎｇら（Teng MW et al., (2005), 38235-41 doi 10.1074/jbc.M505331200）およびＷａｎｇら（Wang E et al., (2015), 815-26 doi 10.1158/2326-6066.cir-15-0054）は、マウスまたはヒトＴ細胞のいずれかにおけるＤＡＰ１２とその関連するｓｃＦｖ改変受容体との異所性の同時発現が、腫瘍の根絶を抗原特異的に媒介したことを実証し、ＤＡＰ１２の活性化がＴ細胞の細胞傷害性を駆動するために十分であることを示した。同じ概念はまた、ＤＡＰ１２の共受容体としてｓｃＦｖ改変ＴＲＥＭ１を使用した最近の論文によっても実証された（Chen B et al., (2019), 1043-55 doi 10.2217/imt-2019-0017）。本出願人のＣＡＲ構築物の設計では、多重鎖フォーマットを使用する代わりに、本出願人は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをＤＡＰ１２と直接置換し、ＤＡＰ１０を共刺激として使用した。得られたｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲは、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚにおいて認められたｉｎｖｉｔｒｏ増大問題に取り組み、最も重要なことにｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲは、たとえこの２つがｉｎｖｉｔｒｏで均等な細胞傷害性を示したとしても、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＢＢ３ｚＣＡＲより有意に良好なｉｎｖｉｖｏ有効性を媒介した（図２５）。これらの結果は、ｉｎｖｉｔｒｏでの細胞傷害性がｉｎｖｉｖｏでの有効性を反映するために不十分であるという知見をさらに支持し（Long AH et al., (2015), 581-90 doi 10.1038/nm.3838）、シグナル伝達ドメインがＣＡＲＴ細胞のｉｎｖｉｖｏでの機能に対する影響を強調する。

本出願人の結果は、Ｌｙｍ－１エピトープがＣＤ１９とは異なり、ＣＡＲの係合時に急速にダウンレギュレートしないことを実証する。ＣＡＲＴ細胞トロゴサイトーシスは抗原のダウンレギュレーションにおいて役割を有し得るが（Hamieh M et al., (2019), 112-6 doi 10.1038/s41586-019-1054-1）、本出願人は、ｈｕＬｙｍ－１－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞と共培養した場合にヒトＢリンパ腫細胞株のパネルにおいて均等なＬｙｍ－１エピトープダウンレギュレーションを観察せず、迅速なＣＤ１９抗原ダウンレギュレーションが他の機構を伴い得ることを示唆した（図２６；図１８）。抗ＣＤ１９抗体との架橋は、受容体媒介エンドサイトーシス（Ingle GS et al., (2008), 46-58 doi 10.1111/j.1365-2141.2007.06883.x）を通してＣＤ１９抗原のダウンレギュレーションを誘導することができ、ＣＤ１９ＣＡＲとＣＤ１９抗原との間の相互作用が、表面ＣＤ１９抗原ダウンレギュレーションに寄与し得ることを示している。ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の圧力下での腫瘍細胞におけるＣＤ１９のダウンレギュレーションは可逆的プロセスであるが（Schneider D et al., (2017), 42 doi 10.1186/s40425-017-0246-1）、一過性の抗原ダウンレギュレーションは、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍有効性を減損せず、腫瘍の免疫逃避を促進する（Hamieh M et al., (2019), 112-6 doi 10.1038/s41586-019-1054-1）。この仮説と一貫して、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚもＣＤ１９－ＤＡＰＣＡＲも、改変された動物プロトコールにおいて最大５００万個の用量で無腫瘍生存を誘導することができなかったが、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞は、急速かつ持続的な腫瘍制御を媒介し、より低用量の細胞２００万個で無腫瘍生存をもたらした（図１９Ｂ、図１９Ｃ）。興味深いことに、ＣＤ１９－ＤＡＰＣＡＲによる処置は、細胞１００万個の用量レベルでＣＤ１９－ＢＢ３ｚより有意に良好な生存を誘導したが（図１９Ｄ）、いずれのＣＡＲも、より高い細胞用量（２００万個および５００万個）では均等な有効性を示した（図１９Ｂ、図１９Ｃ）。注目すべきは、ＣＡＲＴ細胞の用量にかかわらず、ＣＤ１９－ＤＡＰＣＡＲでは４１日目より前に後肢麻痺は観察されなかった（図１９）。これに対し、ＣＤ１９－ＢＢ３ｚＣＡＲ処置マウスでは、後肢麻痺のより早期の発症（２０～３０日目）が繰り返し認められた（図１９）。基礎となる機序およびこの差の有意性はなおも調査中である。

要約すると、本出願人の研究は、ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＴ細胞がＬｙｍ－１陽性Ｂ細胞リンパ腫を処置するために有望であることを示している。ＤＡＰシグナル伝達ドメインが、均等なまたはより高い抗腫瘍有効性を保持しながらＣＤ３ζに基づくＣＡＲにおけるリガンド依存的シグナル伝達によって誘導される増殖障害を回避することができるという知見は、ＣＡＲ設計に関する刺激ドメイン選択の重要性を強調し、Ｔ細胞におけるトニックシグナル伝達によって誘導される有害な作用に取り組むための新規ＣＡＲ構造フォーマットを同定する。さらに、ＤＡＰシグナル伝達ドメインは、トニックシグナル伝達が弱いという証拠がなくとも他のＣＡＲＴ細胞調製物の機能を改善し得る。最後に、本出願人の報告は、ＣＡＲが係合しても急速にダウンレギュレートしないエピトープを標的化することがまた、持続的なＣＡＲＴ細胞有効性にも寄与し得ることを示唆している。
実施形態

以下の実施形態は、本開示の様々な態様を具体的に説明する。

ａ．配列番号２もしくは６のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／あるいは
ｂ．配列番号４もしくは８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列
を含む抗体。

重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号４のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、本明細書に記載の抗体。

重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号２のアミノ酸配列を含み、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号８のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、本明細書に記載の抗体。

重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号４のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、本明細書に記載の抗体。

重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号８のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、本明細書に記載の抗体。

ａ．配列番号１０のアミノ酸配列もしくはその均等物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／または
ｂ．配列番号１２のアミノ酸配列もしくはその均等物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列
を含む抗体。

ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ抗体である、本明細書に記載の抗体。

定常領域を含む、本明細書に記載の抗体。

定常領域が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ定常領域を含む、本明細書に記載の抗体。

定常領域が、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇカッパ定常領域である、本明細書に記載の抗体。

本明細書に記載の抗体と結合に関して競合する抗体。

ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはヒト化抗体である、本明細書に記載の抗体。

均等物が、ポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、本明細書に記載の抗体。

本明細書に記載の抗体の抗原結合性断片。

Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群から選択される、本明細書に記載の抗原結合性断片。

配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその各々の均等物を含むポリペプチド。

（ａ）抗体の抗原結合ドメイン、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、および（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインまたはＤＡＰドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

（ａ）抗体の抗原結合ドメイン、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに（ｄ）細胞内ＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。一態様では、（ｄ）は、細胞内ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２ドメインを含む。別の態様では、抗体は、抗Ｌｙｍ１、抗Ｌｙｍ２、または抗ＣＤ１９抗体から選択される。さらなる態様では、抗原結合ドメインは、抗体のＨＣ可変ドメインとＬＣ可変ドメインとの間に位置するリンカーポリペプチド、例えばｎが１～６の整数である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのポリペプチドを含む。ＣＡＲは、（ａ）から（ｄ）の間に位置するリンカーポリペプチドをさらに含み得る。

抗体の抗原結合ドメインのアミン末端に位置するシグナルポリペプチドをさらに含む、本明細書に記載のＣＡＲ。

１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、本明細書に記載のＣＡＲ。

ヒンジドメインが、ＣＤ８αまたはＩｇＧ１ヒンジドメインを含み、膜貫通ドメインがＣＤ２８もしくはＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７－Ｈ３から選択され；ならびに細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、本明細書に記載のＣＡＲ。

ＨＣ可変ドメインとＬＣ可変ドメインとの間に位置するリンカーポリペプチドをさらに含む、本明細書に記載のＣＡＲ。

ＤＡＰドメインがＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２である、本明細書に記載のＣＡＲ。

ＨＣ可変ドメインとＬＣ可変ドメインの後に挿入されたペプチドＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳをさらに含む、本明細書に記載のＣＡＲ。

検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含む、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載のＣＡＲ。

本明細書に開示される配列のいずれか１つ、またはその各々の均等物から選択される配列を含み、必要に応じてプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに動作可能に連結されている、単離された核酸配列。

本明細書に記載の抗体またはＣＡＲをコードする単離された核酸配列。

抗体の抗原結合ドメインの上流に位置するシグナルペプチドポリヌクレオチド配列をさらに含む、本明細書に記載の単離された核酸配列。

ＣＡＲをコードする単離された核酸が、抗体の抗原結合ドメインまたはエンハンサーの上流に位置するコザックコンセンサスポリヌクレオチド配列をさらに含む、本明細書に記載の単離された核酸配列。

ＣＡＲをコードする単離された核酸が、抗体の抗原結合ドメインの上流に位置する２Ａ自己切断ペプチド（Ｔ２Ａ）をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、本明細書に記載の単離された核酸配列。

ＣＡＲをコードする単離された核酸が、抗生物質耐性をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、本明細書に記載の単離された核酸配列。

ＣＡＲをコードする単離された核酸が、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチ機構をさらに含む、本明細書に記載の単離された核酸配列。

本明細書に記載の単離された核酸配列を含むベクター。

プラスミドまたはウイルスベクターである、本明細書に記載のベクター。

レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、本明細書に記載のベクター。

ＣＲＩＳＰＲベクターである、本明細書に記載のベクター。

本明細書に記載の抗体、および／またはＣＡＲ、および／または単離された核酸、および／またはベクターを含む単離された細胞。一態様では、単離された細胞は免疫細胞、例えばである。

担体と、本明細書に記載の抗体、および／または抗原結合性断片、および／またはポリペプチド、および／またはＣＡＲ、および／または単離された核酸、および／またはベクター、および／または単離された細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物。

本明細書に記載の単離された細胞を培養するステップを含む、本明細書に記載の抗体を産生する方法であって、単離された細胞が必要に応じて哺乳動物細胞である、方法。

抗ＬｙｍＣＡＲ発現細胞を産生する方法であって、本明細書に記載の抗Ｌｙｍを発現するＣＡＲをコードする核酸配列を、免疫細胞集団に導入するステップ、および前記核酸配列による形質導入が成功している免疫細胞の亜集団を選択するステップを含む方法。一態様では、免疫細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である。一態様では、免疫細胞集団は、内因性の免疫細胞受容体の発現を低減または削除するように改変されており、例えば免疫細胞集団は、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを用いる方法を使用して改変された。

それを必要とする対象における腫瘍の成長を阻害する、および／またはがんを処置する、および／またはがんの再発を防止する方法であって、本明細書に開示される方法に従って生成された有効量のＣＡＲ発現細胞、本明細書に記載の有効量の抗体、本明細書に記載の有効量の抗原結合性断片、および／または本明細書に記載の有効量のポリペプチドのうちの１つまたは複数を対象に投与するステップを含む方法。これらの方法は、腫瘍の切除または従来の化学療法などの従来の治療と組み合わせることができる。

それを必要とする対象における腫瘍の成長を阻害する、および／またはがんを処置する、および／またはがんの再発を防止する方法であって、本明細書に記載の方法に従って生成された、有効量の１つまたは複数のＣＡＲ発現細胞、本明細書に記載の有効量の抗体、本明細書に記載の有効量の抗原結合性断片、および／または本明細書に記載の有効量のポリペプチドを、抗がん治療薬、チェックポイント阻害剤、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＩＬ－１２処置、ＣｐＧ（ＴＬＲ９アゴニスト）、および／またはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路アゴニストと組み合わせて対象に投与するステップを含む方法。

ＣＡＲ発現細胞が処置される対象に対して自己または同種であり、必要に応じて、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、第４選択治療、または第５選択治療である、本明細書に記載の方法。一態様では、腫瘍またはがん細胞は、ＣＤ１９、Ｌｙｍ１、および／またはＬｙｍ２を発現または過剰発現する。別の態様では、がんまたは腫瘍は、癌腫、肉腫、または白血病の群から選択される。さらなる態様では、腫瘍またはがんは、Ｂ細胞リンパ腫または白血病である。さらなる態様では、腫瘍は固形腫瘍である。別の態様では、固形腫瘍は、黒色腫、大腸癌、乳癌、および／または脳腫瘍である。別の態様では、対象はヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシである。さらなる態様では、方法は、対象にＣＡＲ治療以外の抗腫瘍治療を投与するステップをさらに含む。

がん細胞またはがん幹細胞の増殖を阻害する方法であって、細胞に、本明細書に記載される方法に従って生成された、有効量のＣＡＲ発現細胞、本明細書に記載の有効量の抗体、本明細書に記載の有効量の抗原結合性断片、および／または本明細書に記載の有効量のポリペプチドを接触させるステップを含む方法。

対象が治療に応答する可能性があるか応答する可能性がないかを決定する方法であって、患者から単離された試料に、本明細書に記載の抗体、本明細書に記載の抗原結合性断片、および／または本明細書に記載のポリペプチドを接触させるステップ、ならびに試料中の抗体－細胞複合体、抗原結合性断片－細胞複合体、および／またはポリペプチド－細胞複合体を検出するステップを含み、複合体が存在すれば、対象が治療に応答する可能性があることを示し、複合体が存在しなければ、対象が治療に応答する可能性がないことを示す、方法。一態様では、抗体、抗原結合性断片、および／またはポリペプチドは、検出可能に標識される。

本明細書に記載の、有効量の抗体または本明細書に記載のＣＡＲのうちの１つまたは複数を、治療に応答する可能性があると決定された対象に投与するステップをさらに含む、本明細書に記載の方法。治療は、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、第４選択治療、または第５選択治療である。

対象における治療をモニタリングする方法であって、対象から単離された試料に、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片を接触させるステップ、および試料中の抗体－細胞複合体を検出するステップを含む方法。抗体が抗Ｌｙｍ抗体である場合、方法は、本明細書に記載されるように生成された、有効量の１つまたは複数の抗ＬｙｍＣＡＲ発現細胞、本明細書に記載の有効量の抗体量、本明細書に記載の有効量の抗原結合性断片、および／または本明細書に記載の有効量のポリペプチドを投与する前および／または後に実施される。一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能に標識される。別の態様では、試料は、喀痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水、血液、または組織のうちの１つまたは複数を含む。

本明細書に記載の抗体、本明細書に記載のＣＡＲ、本明細書に記載の抗原結合性断片、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の単離された核酸、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の単離された細胞、および／または本明細書に記載の組成物のうちの１つまたは複数と、使用説明書とを含むキット。使用説明書は、本明細書に記載の方法を実行するための指示を提供する。
均等論

特に定義していない限り、本明細書で使用した全ての科学技術用語は、本技術が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

本明細書に例示的に記載される本技術は適切には、本明細書に具体的に開示されていない任意のエレメント、または複数のエレメント、制限または複数の制限の非存在下で実践され得る。このように、例えば用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」等は、拡大的に制限なく読むべきである。加えて、本明細書で用いた用語および表現は、説明の用語として使用されており、制限の用語ではなく、そのような用語および表現の使用において、示されて記載される特色の任意の均等物またはその一部を排除することを意図しないが、様々な改変が特許請求される本技術の範囲内で可能であることが認識される。

このように、本明細書に提供される材料、方法、および実施例は、好ましい態様の代表であり、例示的であり、本技術の範囲の制限であると意図されないと理解すべきである。

本技術を、本明細書において広く一般的に記載してきた。一般的な開示内に入るより狭い種および亜属分類の各々もまた、本技術の一部を形成する。これは、切除された材料が本明細書において具体的に列挙されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を除去する条件または負の制限を伴う本技術の一般的説明を含む。

加えて、本技術の特色または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、本技術はまた、それによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群の観点で記載されていることを認識するであろう。

本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が個々に参照により本明細書に組み込まれているのと同程度に、その全体が参照により明白に本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。

他の態様は、以下の特許請求の範囲に記載される。
配列表
配列番号１ｈｕＬｙｍ－１－ＡＶＨ

配列番号２ｈｕＬｙｍ－１－ＡＶＨアミノ酸

配列番号３ｈｕＬｙｍ－１－ＡＶＬ

配列番号ｈｕＬｙｍ－１－ＡＶＬアミノ酸

4
配列番号５ｈｕＬｙｍ－１－ＢＶＨ

配列番号６ｈｕＬｙｍ－１－ＢＶＨアミノ酸

配列番号７ｈｕＬｙｍ－１－ＢＶＬ

配列番号８ｈｕＬｙｍ－１－ＢＶＬアミノ酸

配列番号９ｈｕＬｙｍ－２ＶＨ

配列番号１０ｈｕＬｙｍ－２ＶＨアミノ酸

配列番号１１ｈｕＬｙｍ－２ＶＬ

配列番号１２ｈｕＬｙｍ－２ＶＬアミノ酸

配列番号１３ｈｕＬｙｍ－１－ＡＣＡＲ

配列番号１４ｈｕＬｙｍ－１－ＡＣＡＲアミノ酸

配列番号１５ｈｕＬｙｍ－１－ＢＣＡＲ

配列番号１６ｈｕＬｙｍ－１－ＢＣＡＲアミノ酸

配列番号１７ｈｕＬｙｍ－２ＣＡＲ

配列番号１８ｈｕＬｙｍ－２ＣＡＲアミノ酸

配列番号１９ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０

配列番号２０ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７

配列番号２１ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９

配列番号２２ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０

配列番号２３ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１

配列番号２４ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１

配列番号２５ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６

配列番号２６ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７

配列番号２７ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４

配列番号２８ＤＡＰ－ＣＡＲフレームＤＮＡ配列

１～１３５：ＣＤ８ａヒンジ
１３６～２０７：ＣＤ８ａ膜貫通
２０８～２７６：ＤＡＰ１０
２７７～４３５：ＤＡＰ１２
配列番号２９ＤＡＰ－ＣＡＲフレームアミノ酸

１～４５：ＣＤ８ａヒンジ
４６～６９：ＣＤ８ａ膜貫通
７０～９２：ＤＡＰ１０
９３～１４４：ＤＡＰ１２
配列番号３０ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲＤＮＡ配列

１～６３：ＣＤ８ａリーダー配列
６４～７８０：ｈｕＬｙｍ－１－ＢＳｃＦｖ
７８１～９１５：ＣＤ８ａヒンジ
９１６～９８７：ＣＤ８ａ膜貫通
９８８～１０５６：ＤＡＰ１０
１０５７～１２１５：ＤＡＰ１２
配列番号３１ｈｕＬｙｍ－１－Ｂ－ＤＡＰＣＡＲアミノ酸

１～２１：ＣＤ８ａリーダー配列
２２～２６０：ｈｕＬｙｍ－１－ＢＳｃＦｖ
２６１～３０５：ＣＤ８ａヒンジ
３０６～３２９：ＣＤ８ａ膜貫通
３３０～３５２：ＤＡＰ１０
３５３～４０４：ＤＡＰ１２
配列番号３２抗ＣＤ１９－２６１タグ－ＢＢ３ｚＣＡＲ－ＤＮＡ配列

１～６３：ＣＤ８ａリーダー
６４～７８９：ＦＭＣ６３ＳｃＦｖ
７９０～８１９：２６１タグ
８２０～９５４：ＣＤ８ａヒンジ
９５５～１０２６：ＣＤ８ａ膜貫通
１０２７～１１５２：４－１ＢＢ
１１５３～１４８８：ＣＤ３ｚ
配列番号３３抗ＣＤ１９－２６１タグ－ＢＢ３ｚＣＡＲ－ＡＡ

１～２１：ＣＤ８ａリーダー
２２～２６３：ＦＭＣ６３－ＳｃＦｖ
２６４～２７３：２６１タグ
２７４～３１８：ＣＤ８ａヒンジ
３１９～３４２：ＣＤ８ａ膜貫通
３４３～３８４：４－１ＢＢ
３８５～４９５：ＣＤ３ｚ
配列番号３４抗ＣＤ１９－２６１タグ－ＤＡＰＣＡＲＤＮＡ配列

１～６３：ＣＤ８ａリーダー
６４～７８９：ＦＭＣ６３ＳｃＦｖ
７９０～８１９：２６１タグ
８２０～９５４：ＣＤ８ａヒンジ
９５５～１０２６：ＣＤ８ａ膜貫通
１０２７～１０９５：ＤＡＰ１０
１０９６～１２５４：ＤＡＰ１２
配列番号３５抗ＣＤ１９－２６１タグ－ＤＡＰＣＡＲＡＡ配列

１～２１：ＣＤ８ａリーダー
２２～２６３：ＦＭＣ６３－ＳｃＦｖ
２６４～２７３：２６１タグ
２７４～３１８：ＣＤ８ａヒンジ
３１９～３４２：ＣＤ８ａ膜貫通
３４３～３６５：ＤＡＰ１０
３６６～４１７：ＤＡＰ１２

Claims

（ｉ）配列番号２もしくは６のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／あるいは
（ｉｉ）配列番号４もしくは８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列
を含む抗体。
前記重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号４のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、請求項１に記載の抗体。
前記重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号８のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、請求項１に記載の抗体。
前記重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号４のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、請求項１に記載の抗体。
前記重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が配列番号８のアミノ酸配列またはその各々の均等物を含む、請求項１に記載の抗体。
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列もしくはその均等物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／または
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列もしくはその均等物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列
を含む抗体。
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合性断片。
配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２のいずれか１つのアミノ酸配列、またはその各々の均等物を含むポリペプチド。
（ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合ドメイン、（ｂ）ヒンジドメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、および（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインまたはＤＡＰドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項９に記載のＣＡＲ。
前記ＤＡＰドメインがＤＡＰ１０および／またはＤＡＰ１２である、請求項９または１０に記載のＣＡＲ。
前記ＨＣおよびＬＣ可変ドメインの後に挿入されたペプチドＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳをさらに含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
本明細書に開示される配列のいずれか１つまたはその各々の均等物から選択される配列を含み、必要に応じてプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに動作可能に連結されている、単離された核酸配列。
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、請求項７に記載の抗原結合性断片、請求項８に記載のポリペプチド、または請求項９から１２のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする単離された核酸配列。
請求項１４に記載の単離された核酸配列を含むベクター。
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、請求項７に記載の抗原結合性断片、請求項８に記載のポリペプチド、請求項９から１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１３もしくは１４に記載の単離された核酸、および／または請求項１５に記載のベクターを含む単離された細胞。
免疫細胞である、請求項１６に記載の単離された細胞。
前記免疫細胞がＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１７に記載の単離された細胞。
担体と、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、請求項７に記載の抗原結合性断片、請求項８に記載のポリペプチド、請求項９から１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項１３もしくは１４に記載の単離された核酸、請求項１５に記載のベクター、および／または請求項１６から１８のいずれか一項に記載の単離された細胞のうちの１つまたは複数とを含む組成物。
ＣＡＲ発現細胞を産生する方法であって、
（ｉ）請求項９から１２のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を、免疫細胞集団に導入するステップ、および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列による形質導入が成功しており、それによってＣＡＲ発現細胞を産生する免疫細胞の亜集団を選択するステップ
を含む方法。
前記免疫細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項２０に記載の方法。
前記免疫細胞集団が、内因性の免疫細胞受容体の発現を低減または削除するように改変されている、請求項２０または２１に記載の方法。
それを必要とする対象における腫瘍の成長を阻害する、および／またはがんを処置する、および／またはがんの再発を防止する方法であって、有効量の、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、請求項７に記載の抗原結合ドメイン、請求項８に記載のポリペプチド、または請求項９から１２のいずれか一項に記載のＣＡＲを前記対象に投与するステップを含む方法。
１つまたは複数の抗がん治療薬、チェックポイント阻害剤、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＩＬ－１２処置、ＣｐＧ（ＴＬＲ９アゴニスト）、および／またはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）経路アゴニストを投与するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
腫瘍またはがん細胞が、Ｌｙｍ１および／もしくはＬｙｍ２、またはＣＤ１９を発現または過剰発現する、請求項２３または２４に記載の方法。
がん細胞またはがん幹細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞に、有効量の、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、請求項７に記載の抗原結合ドメイン、請求項８に記載のポリペプチド、または請求項９から１２のいずれか一項に記載のＣＡＲを接触させるステップを含む方法。
対象が治療に応答する可能性があるか応答する可能性がないかを決定する方法であって、患者から単離された試料に、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、または請求項７に記載の抗原結合性断片、請求項８に記載のポリペプチドを接触させるステップを含み、前記抗体、抗原結合性断片、またはポリペプチドとの間に複合体が存在すれば、前記対象が前記治療に応答する可能性があることを示し、複合体が存在しなければ、前記対象が前記治療に応答する可能性がないことを示す、方法。
対象における治療をモニタリングする方法であって、前記対象から単離した試料に、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、請求項７に記載の抗原結合性断片、または請求項８に記載のポリペプチドのうちの１つまたは複数を接触させるステップ、および前記試料中の複合体を検出するステップを含む方法。
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体、請求項７に記載の抗原結合性断片、請求項８に記載のポリペプチド、または請求項９から１２のいずれか１つに記載のＣＡＲのうちの１つまたは複数と、使用説明書とを含むキット。