JP2022519706A - 細胞質雄性不稔を司る新たな遺伝子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列のＯｒｆ２７９タンパク質をコードする単離核酸に関する。また、本発明は、ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質を検出するための方法、およびｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合可能なタンパク質をコードする機能性Ｒｆ遺伝子を同定するための方法に関する。
Description
２０５０年までには、世界のヒトの人口は、９０億を上回ると予期される（国際連合、２０１７）。同時に、耕作可能地域では、１９７０年の１人あたり０．３８ｈａから２０５０年の１人あたり０．１５ｈａまで縮小すると予想される（ＦＡＯＳＴＡＴ２０１７）。したがって、将来の食糧需要を満たすために、理想的には、水または肥料の使用を増加させずに、１ヘクタールあたりの収率を増加させる必要がある。総作物生産に１１％寄与することにより、コムギは、世界中で栽培される最も重要な小穀物の１つとなっている（ＦＡＯＳＴＡＴ２０１７、Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ２０１７）。１９６０年の緑の革命による作物の導入後、作物、例えば、イネ、トウモロコシおよびソルガムの雑種変種の作製は、生産性を顕著に向上させ、今日、世界の食糧生産の５０％を占めるほど全体的穀物種子生産に非常に寄与した（ＦＡＯＳＴＡＴ２０１７）。効率的な受粉制御系を欠くため、コムギの雑種作製は、化学交雑剤（ＣＨＡ）の使用に主に依存し、わずかに適用されるのみである（Ｗｈｉｔｆｏｒｄら、２０１３）。おそらくこの結果として、コムギ収率の増加の割合は、トウモロコシまたはイネの増加と比較して過去１０年間で緩徐となっている（ＦＡＯＳＴＡＴ２０１７、Ｗｈｉｔｆｏｒｄら、２０１３）。
雑種作製の主な目標は、雑種強勢を利用して、資源およびエネルギー効率的な植物をさらに高く、さらに安定な収率で生産することである。コムギの雑種強勢と関連する収率の向上は、１５％に達し得ることが推定される（Ｌｏｎｇｉｎら、２０１２）。雑種作製は、コムギのような自家生殖植物の自家受粉を遮断する方法を必要とし、この場合、雄および雌の生殖器の手動分別は、労働集約的であり、このため産業規模では適用不可能である（Ｃｈａｓｅら、２００７）。トウモロコシ、イネおよびソルガムを含む、いくつかの作物の雑種の生産に良好に使用されている系は、植物不稔性を生じる遺伝的に調節した形質である細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）に基づく３系統育種系である（ＣｈｅｎおよびＬｉｕ２０１４；Ｂｏｈｒａら、２０１６；ＹａｍａｇｉｓｈｉおよびＢｈａｔ２０１４；Ｓａｘｅｎａら、２０１５）。これは、３種の育種系統：ＣＭＳを担う遺伝子を保有する細胞質雄性不稔系統（Ａ系統）、不稔性を維持しながらＡ系統の繁殖に必要とされる維持系統（Ｂ系統）、およびＦ１植物の稔性を回復させることが可能な稔性回復（Ｒｆ）遺伝子を保有する回復系統（Ｒ系統）を必要とする（ＣｈｅｎおよびＬｉｕ２０１４）。歴史的には、適切なＲｆ遺伝子を欠くことにより補完されたコムギの花のユニークな構造および発達により支配される強力な近親交配の性質は、コムギの雑種種子生産へのＣＭＳの適用を制限する主要な因子である（Ｗｈｉｔｆｏｒｄら、２０１３）。
コムギの栽培におけるＣＭＳは、花粉ドナーとしてのパンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）と、野生コムギ、例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉまたは近縁種、例えば、ＡｅｇｉｌｏｐｓもしくはＨｏｒｄｅｕｍとの間の種間交配、およびパンコムギへの戻し交配に起源を有する（Ｗｈｉｔｆｏｒｄら、２０１３）。コムギにおける雄性不稔の最初の事例は、１９５１年に報告され、この場合、Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｃａｕｄａｔａ細胞の核を、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ由来の核により置換した（Ｋｉｈａｒａ、１９５１）。その後、Ｔ型ＣＭＳコムギ（Ｇ型ＣＭＳとしても知られる）は、雌性親としてのＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉと雄性親としてのパンコムギとの間の交配に由来した（ＷｉｌｓｏｎおよびＲｏｓｓ１９６２）。
Ｔ－ＣＭＳが、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリアゲノムにおけるｏｒｆ２５６と名付けられた単一遺伝子により生じると提唱された（ＲａｔｈｂｕｒｎおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９１）。配列解析により、ｏｒｆ２５６の－２２８から＋３３の領域（開始コドンに対して）は、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍにおけるｃｏｘ１由来の類似の領域（ミトコンドリア複合体ＩＶのサブユニット１をコードする）と同一であるが、３’隣接領域を含む残りのｏｒｆ２５６は、ｃｏｘ１とは関連しないことが明らかとなった（ＲａｔｈｂｕｒｎおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９１；ＳｏｎｇおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９４Ａ）。単一の組換え現象により、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）においてｏｒｆ２５６の形成が生じた可能性が最も高い（ＲａｔｈｂｕｒｎおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９１；ＳｏｎｇおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９４Ａ）。Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ、ＣＭＳ（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍの核、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリア）、および稔性回復系統由来のｏｒｆ２５６断片の遺伝子組織は同一であるが、ｏｒｆ２５６転写物のプロセシングは、核の種々のバックグラウンドにより変化することが考証された（ＲａｔｈｂｕｒｎおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ１９９１；ＳｏｎｇおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９４Ａ）。Ｏｒｆ２５６の名称は、ｏｒｆ２５６コード配列によりコードされる２５６アミノ酸に起源を有する（ＲａｔｈｂｕｒｎおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９１）。ｏｒｆ２５６のコードされたアミノ酸配列の一部に対応するペプチドに対する抗体により、Ｔ－ＣＭＳコムギ由来のミトコンドリアタンパク質のウエスタンブロットにおいて７ｋＤａのタンパク質が検出されるが、稔性回復のための核遺伝子の導入により稔性の回復したＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ、またはＴ－ＣＭＳ植物由来のミトコンドリアタンパク質のブロットでは、検出されなかった（ＳｏｎｇおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ１９９４Ｂ）。その上、Ｏｒｆ２５６が、ミトコンドリアの内膜において固定されることがわかっている（ＳｏｎｇおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ１９９４Ｂ）。Ｈｅｄｇｃｏｔｈらにより実施されたＴ－ＣＭＳについての最初の分子的研究以来、フォローアップ研究は、向こう２５年間は開始されなかった。
稔性回復（Ｒｆ）タンパク質が核においてコードされ、翻訳後にミトコンドリアを標的とし、この場合、これらが、ＣＭＳ特異的ＯＲＦをコードするＲＮＡの蓄積を防ぐことが今日わかっている（Ｋａｚａｍａら、２００８；Ｂｅｎｔｏｌｉａら、２００２）。今日までに同定された高等植物のＲｆ遺伝子の大多数が、ペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）タンパク質をコードする（Ｋｏｔｃｈｏｎｉら、２０１０；ＣｈｅｎおよびＬｉｕ２０１３）。ＰＰＲファミリーは、陸生植物において高度に拡大しており、ＣＭＳに関与し、稔性回復様遺伝子（Ｒｆｌ）と呼ばれるこのファミリーメンバーは、遺伝子クラスターとして２～３つのゲノム位置に存在する傾向を有する（Ｓｃｈｍｉｔｚ－ＬｉｎｎｅｗｅｂｅｒおよびＳｍａｌｌ、２００８；Ｆｕｊｉｉら、２０１１；Ｍｅｌｏｎｅｋら、２０１６）。例えば、いくつかのＲｆ遺伝子は、ＣＭＳ－Ｃｈｉｎｓｕｒａｓｈ ＢｏｒｏＩＩのＲｆ１ａおよびＲｆ１ｂならびにＣＭＳ野生不全型のＲｆ４を含む、イネの１０番染色体上の遺伝子クラスターに位置する（Ａｋａｇｉら、２００４；Ｗａｎｇら、２００４；Ｚｈａｎｇら、２００２）。コムギＲｅｆＳｅｑ ｖ１．０ゲノムにおけるＰＰＲファミリーの最近の世界的解析では、その大多数が１、２および６番染色体上のクラスターにおいて組織化される２０７種のＲｆｌ遺伝子の存在が明らかとなった（Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２０１８）。
Ｔ－ＣＭＳ系において稔性を制御する、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍのいくつかの回復遺伝子、すなわち、Ｒｆ１（ｃｈｒ１Ａ）（Ｄｕら１９９１）、Ｒｆ２（ｃｈｒ７Ｄ）（ＢａｈｌおよびＭａａｎ１９７２；Ｍａａｎら１９８４）、Ｒｆ３（ｃｈｒ１Ｂ）（ＴａｈｉｒおよびＴｓｕｎｅｗａｋ．Ｋ１９６９）、Ｒｆ４（ｃｈｒ６Ｂ）（Ｍａａｎら１９８４）、Ｒｆ５（ｃｈｒ６Ｄ）（ＢａｈｌおよびＭａａｎ１９７２）、Ｒｆ６（ｃｈｒ５Ｄ）（ＢａｈｌおよびＭａａｎ１９７２）、Ｒｆ７（ｃｈｒ７Ｂ）（ＢａｈｌおよびＭａａｎ１９７２）およびＲｆ８（ｃｈｒ２Ｄ）（Ｓｉｎｈａら２０１３）が報告されている。Ｒｆ１座位は、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ遺伝子移入系統Ｒ３において最初に記載され（Ｌｉｖｅｒｓ１９６４；ＢａｈｌおよびＭａａｎ１９７３）、１Ａ染色体上に位置することが後に見出された（ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＣｕｒｔｉｓ１９６７）。また、この染色体上の回復遺伝子座位は、他の３つのＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ遺伝子移入系統である、春コムギ系統Ｒ１１３およびこの子孫においても見出された（ＢａｈｌおよびＭａａｎ１９７３；Ｍａａｎら１９８４；Ｍａａｎ１９８５；Ｄｕら１９９１）。最近、Ｒｆ１座位は、１Ａ染色体上の８．１７Ｍｂｐの領域に遺伝的にマッピングされた（Ｇｒｅｙｅｒら、２０１７）。加えて、Ｒｆ１の修飾遺伝子座位は、１Ｂ染色体上に同定された（Ｇｒｅｙｅｒら、２０１７）。Ｒｆ３は、最も有効な回復遺伝子座位のうちの１つとして報告された（ＭａおよびＳｏｒｒｅｌｌｓ、１９９５；Ｋｏｊｉｍａら、１９９７；Ａｈｍｅｄら２００１；Ｇｅｙｅｒら２０１６）。２つのＳＮＰマーカーは、１Ｂ染色体上の２ｃＭの断片においてＲｆ３座位の位置設定を可能とした（Ｇｅｙｅｒら、２０１７）。Ｒｆ１およびＲｆ３の両方のゲノム位置は、１Ａおよび１Ｂのコムギ染色体上に存在すると記載されるＲＦＬクラスターの位置と重複する（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｈｅａｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２０１８）。
雑種育種プログラムにおけるＣＭＳおよびＲｆ遺伝子の有効な使用のためには、植物ミトコンドリアにこれらを関連付ける分子機構を理解することが極めて重要である。本発明では、Ｔ－ＣＭＳコムギにおける雄性不稔を担う新たな遺伝子ｏｒｆ２７９の同定について、Ｒｆ１およびＲｆ３関連回復機構の分子特性決定により論じる。本発明では、ｏｒｆ２７９遺伝子配列情報から開発した新たな分子および育種ツールについて論じる。
本発明の第１の態様は、配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列のＯｒｆ２７９タンパク質をコードする単離核酸である。
第２の態様では、本出願は、試料中のｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質を検出する方法に関する。
第３の態様では、本発明は、ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合可能なタンパク質をコードする機能性Ｒｆ遺伝子を同定するための方法に関する。
第４の態様では、本発明は、ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合し、その発現を防止することが可能な合成ＰＰＲタンパク質の設計および最適化のための方法に関する。
第５の態様では、本発明は、不稔性植物を得るための方法に関する。
第６の態様では、本発明は、稔性コムギ植物を得るための方法に関する。
定義
「植物（１つまたは複数）」への参照がなされるときは常に、植物部位（細胞、組織または器官、種子の鞘、種子、切断部位、例えば、根、葉、花、花粉等）、親の際立った特性（特に、請求するＲｆ核酸と関連する雄性稔性）を保持する植物の後代、例えば、自家受粉または交配により得られる種子、例えば、雑種種子（２つの同系交配親植物を交配することにより得られる）、雑種植物およびこれらに由来する植物部位を、他に指示しない限り、本明細書において包含することが理解される。
「植物（１つまたは複数）」への参照がなされるときは常に、植物部位（細胞、組織または器官、種子の鞘、種子、切断部位、例えば、根、葉、花、花粉等）、親の際立った特性（特に、請求するＲｆ核酸と関連する雄性稔性）を保持する植物の後代、例えば、自家受粉または交配により得られる種子、例えば、雑種種子（２つの同系交配親植物を交配することにより得られる）、雑種植物およびこれらに由来する植物部位を、他に指示しない限り、本明細書において包含することが理解される。
本明細書において使用する場合、「コムギ植物」は、例えば、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｍ、Ｔ．ａｒａｒａｔｉｃｕｍ、Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ、Ｔ．ｃａｒｔｈｌｉｃｕｍ、Ｔ．ｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｏｎ、Ｔ．ｄｕｒｕｍ、Ｔ．ｉｓｐａｈａｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｋａｒａｍｙｓｃｈｅｖｉｉ、Ｔ．ｍａｃｈａ、Ｔ．ｍｉｌｉｔｉｎａｅ、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔ．ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｓｐｅｌｔａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ、Ｔ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ、Ｔ．ｕｒａｒｔｕ、Ｔ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ、Ｔ．ｚｈｕｋｏｖｓｋｙｉ ＦａｅｇｉのようなＴｒｉｔｉｃｕｍ属の種を指す。また、コムギ植物は、ＡｅｇｉｌｏｐｓおよびＴｒｉｔｉｃａｌｅ属の種を指す。
本明細書において使用する場合、「Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉＣＭＳ細胞質の稔性の回復」の用語は、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉＣＭＳ細胞質を含むコムギ植物における発現が、花粉生成の回復に寄与するタンパク質を指す。
ＣＭＳを司る新たな遺伝子
発明者らは、ｏｒｆ２７９遺伝子が、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ細胞質を含むコムギ植物においてＣＭＳを司ることを発見した。明確には、この細胞質は、本明細書においてＴ－ＣＭＳと呼ぶ。これは、ｏｒｆ２７９を発現する任意の細胞質を指し、代表的細胞質は、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉの細胞質である。例えば、Ｔ－ＣＭＳは、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉに由来するコムギ植物に存在し得る。また、Ｔ－ＣＭＳは、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉが由来するコムギ植物、例えば、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉの栽培品種であるＴ．ａｒａｒａｔｉｃｕｍであり得る。
発明者らは、ｏｒｆ２７９遺伝子が、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ細胞質を含むコムギ植物においてＣＭＳを司ることを発見した。明確には、この細胞質は、本明細書においてＴ－ＣＭＳと呼ぶ。これは、ｏｒｆ２７９を発現する任意の細胞質を指し、代表的細胞質は、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉの細胞質である。例えば、Ｔ－ＣＭＳは、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉに由来するコムギ植物に存在し得る。また、Ｔ－ＣＭＳは、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉが由来するコムギ植物、例えば、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉの栽培品種であるＴ．ａｒａｒａｔｉｃｕｍであり得る。
本発明は、配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列のＯｒｆ２７９タンパク質をコードする単離核酸に関する。
特定の実施形態では、本発明は、配列が配列番号１に示される単離核酸に関する。
実施例において実証されるように、ｏｒｆ２７９は、ゲノムにおける組換え現象から生じる。配列番号２に示す５’部分は、ＡＴＰ合成酵素サブユニット８をコードする遺伝子（ａｔｐ８遺伝子）の５’部分に対応する。反対に、配列番号３に示すｏｒｆ２７９の３’部分は、この遺伝子に特異的であり、本出願において「ｏｒｆ２７９ユニーク領域」と呼ぶ。
また、本発明は、コムギ植物、種子またはバルクの種子においてｏｒｆ２７９ＤＮＡを検出するための方法であって、ＤＮＡ試料をコムギ植物から抽出および単離するステップと、ｏｒｆ２７９ＤＮＡを特定の手段により検出するステップとを含む、方法に関する。
特定の実施形態では、ｏｒｆ２７９ＤＮＡを検出するための方法は、種々の系統または種々の変種において、より詳細には、種々のコムギ系統または変種において、種々の植物または変種間、特に、ＣＭＳを有する植物間のｏｒｆ２７９の存在／非存在を識別するために実施する。
ｏｒｆ２７９ＤＮＡの存在は、系統または植物が、Ｔ－ＣＭＳを誘導することが可能な細胞質を内包していることを意味する。このような細胞質を内包する系統または植物は、不稔性表現型または稔性表現型を有し得る。後者の場合では、このような稔性植物は、機能性稔性回復遺伝子「Ｒｆ」を保有する可能性を有する。
反対に、ｏｒｆ２７９ＤＮＡの非存在は、系統または植物が、Ｔ－ＣＭＳを提示することができないことを意味する。
この特定の実施形態は、コムギ細胞質の多様性のスクリーニングについての研究において、および雑種コムギ系における不稔性雌性遺伝子型の質のスクリーニングのための種子作製においての使用が特に興味深い。ｏｒｆ２７９ＤＮＡの検出は、親系統の作製および繁殖、ならびにＡ系統の維持および雑種作製のための種子作製における興味の対象となり得る。
別の実施形態では、このような方法は、組換えミトコンドリアＤＮＡにおけるｏｒｆ２７９ＤＮＡの同定について興味の対象となる。組換えミトコンドリアＤＮＡは、ある植物から別の植物へのミトコンドリアの移行後に得られ、このような植物は、同一種または異なる種に属する。このような移行は、２つの親植物由来のミトコンドリアの混合を生じる任意の方法（すなわち、原形質融合、移植または２親性遺伝が達成可能な場合の有性的交配）により達成することができる。本発明では、移行は、Ｔ－ＣＭＳ細胞質により特徴づけられる植物から、Ｔ－ＣＭＳ細胞質を有しない別の植物にまで生じる。
「不稔性雌性表現型」の用語は、この表現型を有する植物が、雄性不稔性細胞質を内包することが確かであることを意味する。
また、本発明は、コムギ植物、種子またはバルクの種子においてｏｒｆ２７９ＲＮＡを検出するための方法であって、ＲＮＡ試料をコムギ植物から抽出および単離するステップと、ｏｒｆ２７９ＲＮＡを特定の手段により検出するステップとを含む、方法に関する。
特に、ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ＲＮＡの検出のための一手段は、ａｔｐ８と「ｏｒｆ２７９ユニーク領域」の間の組換え接合部を認識するマーカーである。
別の実施形態では、検出のための手段は、ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ＲＮＡの増幅が可能となるプライマーである。特に、プライマーの少なくとも１つは、ｏｒｆ２７９に特異的な配列である配列番号３に示すｏｒｆ２７９の３’部分にハイブリダイズする。
特に、ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ＲＮＡを増幅するフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、
－ フォワードプライマー：配列番号１２、配列番号６、配列番号１０、および
－ リバースプライマー：配列番号７、配列番号１１、配列番号９
の中から選択されるか、またはフォワードプライマー配列番号８およびリバースプライマー配列番号９で構成される。
－ フォワードプライマー：配列番号１２、配列番号６、配列番号１０、および
－ リバースプライマー：配列番号７、配列番号１１、配列番号９
の中から選択されるか、またはフォワードプライマー配列番号８およびリバースプライマー配列番号９で構成される。
本発明では、ＤＮＡの用語は、ｃＤＮＡを含み得る。
特定の実施形態では、コムギ系統または植物におけるｏｒｆ２７９ＲＮＡの発現レベルまたはパターンは、定量し、参照植物材料のｏｒｆ２７９ＲＮＡの発現レベルおよびパターンと比較することができる。参照は、ｏｒｆ２７９を含む細胞質を有する不稔性コムギ系統もしくは不稔性コムギ系統の群、または稔性系統もしくは稔性植物の群であり得る。稔性系統は、維持系統（ｏｒｆ２７９を含む細胞質を有しないため陰性対照とみなす）、またはｏｒｆ２７９を含む細胞質、および稔性回復遺伝子Ｒｆを含む核遺伝子型を有する回復系統のいずれかであり得る。
不稔性コムギ系統と比較した試験植物におけるｏｒｆ２７９ＲＮＡの類似のレベルおよびパターンは、植物がＣＭＳ表現型を呈する可能性を有することを示す。稔性コムギ参照と比較した試験植物におけるｏｒｆ２７９ＲＮＡの類似のレベルおよびパターンは、植物が稔性表現型を呈する可能性を有することを示す。したがって、例えば、国際公開第２０１９／０８６５１０号に記載するように、遺伝子のスタックにおいて、新たなＲｆ遺伝子をスクリーニングもしくは同定するか、または種々のＲｆ遺伝子の組合せの稔性回復レベルを評価することが可能である。
限定されないが、典型的には、ｏｒｆ２７９ＲＮＡのレベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲまたはＲＮＡ－ｓｅｑにより定量することができる。
また、本発明は、コムギ植物、種子またはバルクの種子においてＯｒｆ２７９タンパク質を検出するための方法であって、タンパク質を抽出および単離するステップと、Ｏｒｆ２７９タンパク質を特定の手段により検出するステップとを含む、方法に関する。
タンパク質抽出物中のタンパク質を検出するための手段は、当業者により周知である。特に、Ｏｒｆ２７９タンパク質は、配列番号５に示すＯｒｆ２７９タンパク質のユニークな部分に位置するエピトープに対する抗体による免疫学的検出を使用して検出および定量することができる。特に、Ｏｒｆ２７９タンパク質の検出は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはイムノストリップアッセイにより行う。
特定の実施形態では、コムギ系統におけるＯｒｆ２７９タンパク質の発現のレベルまたはパターンは、定量し、参照植物材料のＯｒｆ２７９タンパク質のレベルおよびパターンと比較する。参照は、ｏｒｆ２７９を含む細胞質を有する不稔性コムギ系統もしくは不稔性コムギ系統の群、または稔性系統もしくは稔性植物の群であり得る。稔性系統は、維持系統（ｏｒｆ２７９を含む細胞質を有しないため陰性対照とみなす）、またはｏｒｆ２７９を含む細胞質、および稔性回復遺伝子Ｒｆを含む核遺伝子型を有する回復系統のいずれかであり得る。
不稔性コムギ系統と比較した試験植物におけるＯｒｆ２７９タンパク質の類似のレベルおよびパターンは、植物がＣＭＳ表現型を呈する可能性を有することを示す。稔性コムギ参照と比較した試験植物におけるＯｒｆ２７９タンパク質の類似のレベルおよびパターンは、植物が稔性表現型を呈する可能性を有することを示す。
したがって、本発明はまた、コムギ植物、種子またはバルクの種子においてｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質を検出するための方法であって、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質試料を抽出し、ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質を手段により検出するステップとを含む、方法に関する。
特定の実施形態では、前記方法は、
－ ａｔｐ８および配列番号３の間の組換え接合部に、もしくは配列番号３内にマーカーを有する不稔性細胞質を検出するステップ、または
－ 雄性不稔性コムギ植物においてｏｒｆ２７９発現の変動を検出するステップ
を含む。
－ ａｔｐ８および配列番号３の間の組換え接合部に、もしくは配列番号３内にマーカーを有する不稔性細胞質を検出するステップ、または
－ 雄性不稔性コムギ植物においてｏｒｆ２７９発現の変動を検出するステップ
を含む。
また、本発明は、
ａ．ａｔｐ８と配列番号３の間のｏｒｆ２７９組換え接合部を認識する分子マーカーおよびプライマー、例えば、上記のプライマー、もしくは配列番号３を認識するマーカーおよびプライマー、または
ｂ．Ｏｒｆ２７９を認識する抗体、特に、配列番号５に位置するエピトープに対する抗体
を含む、Ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の検出のための手段に関する。
ａ．ａｔｐ８と配列番号３の間のｏｒｆ２７９組換え接合部を認識する分子マーカーおよびプライマー、例えば、上記のプライマー、もしくは配列番号３を認識するマーカーおよびプライマー、または
ｂ．Ｏｒｆ２７９を認識する抗体、特に、配列番号５に位置するエピトープに対する抗体
を含む、Ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の検出のための手段に関する。
また、本発明は、
－ ＲＮＡおよびタンパク質を抽出するステップ、
－ ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質を検出および定量するステップ、
－ ｏｒｆ２７９ＲＮＡレベル（もしくはパターン）またはＯｒｆ２７９タンパク質レベル（もしくはパターン）を、ｏｒｆ２７９を含む不稔性コムギ系統および稔性コムギ系統において定量したレベルと比較するステップ
を含む、コムギ植物、種子またはバルクの種子の不稔性または稔性表現型を検出するための方法に関する。
－ ＲＮＡおよびタンパク質を抽出するステップ、
－ ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質を検出および定量するステップ、
－ ｏｒｆ２７９ＲＮＡレベル（もしくはパターン）またはＯｒｆ２７９タンパク質レベル（もしくはパターン）を、ｏｒｆ２７９を含む不稔性コムギ系統および稔性コムギ系統において定量したレベルと比較するステップ
を含む、コムギ植物、種子またはバルクの種子の不稔性または稔性表現型を検出するための方法に関する。
ｏｒｆ２７９ＲＮＡおよびＯｒｆ２７９タンパク質を検出および定量するための手段は、これまでに記載した手段である。
ｏｒｆ２７９を含む細胞質を有する不稔性コムギ系統と比較したコムギ植物におけるｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質の類似のレベルは、植物がＣＭＳ表現型を呈することを示す。
この方法により、多様なコムギ細胞質のスクリーニング、または雑種コムギ系での種子生産において使用する不稔性雌性遺伝子型の質をスクリーニングすることが可能となる。
また、本発明は、ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合可能なタンパク質をコードする機能性Ｒｆ遺伝子を同定するための方法であって、
ａ．ＰＰＲコードに従ってコムギ植物ゲノムにおいて同定された各Ｒｆ遺伝子によりコードされるタンパク質の標的ＲＮＡ配列を予想するステップ、
ｂ．予想された各標的ＲＮＡ配列を配列番号３とともにアラインメントするステップ、
ｃ．配列番号３との少なくとも９５％の同一性を示す標的ＲＮＡ配列に結合可能なタンパク質をコードするＲｆ遺伝子を同定するステップ、
ｄ．任意選択で、選択されたＰＰＲモチーフの５および３５番目のアミノ酸を変更して、配列番号３とのＰＰＲコードによる適合を向上させることにより、選択されたＲｆタンパク質の配列を最適化するステップ
を含む、方法に関する。
ａ．ＰＰＲコードに従ってコムギ植物ゲノムにおいて同定された各Ｒｆ遺伝子によりコードされるタンパク質の標的ＲＮＡ配列を予想するステップ、
ｂ．予想された各標的ＲＮＡ配列を配列番号３とともにアラインメントするステップ、
ｃ．配列番号３との少なくとも９５％の同一性を示す標的ＲＮＡ配列に結合可能なタンパク質をコードするＲｆ遺伝子を同定するステップ、
ｄ．任意選択で、選択されたＰＰＲモチーフの５および３５番目のアミノ酸を変更して、配列番号３とのＰＰＲコードによる適合を向上させることにより、選択されたＲｆタンパク質の配列を最適化するステップ
を含む、方法に関する。
ステップａでは、あらゆる可能なリボヌクレオチドは、５および３５番目のアミノ酸の各組合せについて、ＰＰＲ ＲＮＡ結合コードに従って判定する。ＲＮＡの対応するＰＰＲへの結合について最も高得点の標的ＲＮＡ配列が選択される。標的ＲＮＡ配列は、５～５０塩基の長さであり、優先的には、１０～２０塩基の長さである。
ステップｂでは、予想した標的ＲＮＡ配列は、配列番号３に示すｏｒｆ２７９ユニーク領域に対してアラインメントする。アラインメントは、配列番号３の完全長または断片の全体に対して行われ得る。このような断片は、５～５０塩基の長さであり、優先的には、１０～２０塩基の長さであり得る。
ステップｃでは、標的ＲＮＡ配列は、配列番号３との少なくとも９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を、アラインメントした領域全体に対して有する。
特定の実施形態では、方法は、ｏｒｆ２７９ＲＮＡへの結合の検証に対応するステップｅを含み、この場合、Ｔ－ＣＭＳ細胞質を有する植物は、Ｒｆタンパク質候補を発現するベクターにより形質転換され、表現型決定および／またはｏｒｆ２７９発現の解析により、稔性回復を解析する。
ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合可能なＰＰＲタンパク質をコードする機能性Ｒｆ遺伝子についてスクリーニングするための代替方法は、
ａ．候補Ｒｆ遺伝子を含む発現カセットを用いてコムギ植物を形質転換するステップであって、このコムギ植物が、Ｏｒｆ２７９タンパク質を発現する不稔性細胞質を有する、ステップ、
ｂ．形質転換植物においてｏｒｆ２７９発現のレベルおよびパターンを検出するステップ、
ｃ．ｏｒｆ２７９発現のレベルまたはパターンが非形質転換植物と比較して変化する植物を選択するステップ
ｄ．機能性Ｒｆ遺伝子を同定するステップ
を含む。
ａ．候補Ｒｆ遺伝子を含む発現カセットを用いてコムギ植物を形質転換するステップであって、このコムギ植物が、Ｏｒｆ２７９タンパク質を発現する不稔性細胞質を有する、ステップ、
ｂ．形質転換植物においてｏｒｆ２７９発現のレベルおよびパターンを検出するステップ、
ｃ．ｏｒｆ２７９発現のレベルまたはパターンが非形質転換植物と比較して変化する植物を選択するステップ
ｄ．機能性Ｒｆ遺伝子を同定するステップ
を含む。
コムギ植物の形質転換方法は、当業者により周知である。例えば、これは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介方法または微粒子銃による方法を使用して行うことができる。
この方法では、Ｒｆ候補遺伝子は、ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質のレベルまたはパターンを、ｏｒｆ２７９を発現する不稔性細胞質を有するコムギ系統と比較して変化させる能力についてスクリーニングする。変化は、１つまたは複数の植物組織におけるＲＮＡまたはタンパク質レベルの低下であり得る。
稔性を回復することが可能なＲｆ候補遺伝子を選択する。
本発明の別の態様は、ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合し、その発現を防止することが可能な合成ＰＰＲタンパク質の設計および最適化のための方法であって、前記合成ＰＰＲタンパク質により稔性が回復する、方法に関する。
本発明によれば、「ｏｒｆ２７９ＲＮＡの発現の防止」の表現は、ＲＮＡ切断、ＲＮＡ分解、または翻訳の阻害の誘導を意味する。
特定の実施形態では、方法は、
ａ．配列番号３における目的の標的ＲＮＡ配列を同定するステップであって、この標的ＲＮＡ配列が、５～５０塩基の長さであり、優先的には、１０～２０塩基の長さである、ステップ、
ｂ．アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む群から選択された各標的ＲＮＡ塩基に１対のアミノ酸をＰＰＲ ＲＮＡ結合コードに従って割り当てるステップ、
ｃ．標的ＲＮＡ配列に結合可能なＰＰＲ ＲＮＡ結合モチーフを含む合成ＰＰＲ配列（ステップｂにおいて定義するアミノ酸対をそれぞれ含む）を設計するステップ
を含む。
ａ．配列番号３における目的の標的ＲＮＡ配列を同定するステップであって、この標的ＲＮＡ配列が、５～５０塩基の長さであり、優先的には、１０～２０塩基の長さである、ステップ、
ｂ．アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む群から選択された各標的ＲＮＡ塩基に１対のアミノ酸をＰＰＲ ＲＮＡ結合コードに従って割り当てるステップ、
ｃ．標的ＲＮＡ配列に結合可能なＰＰＲ ＲＮＡ結合モチーフを含む合成ＰＰＲ配列（ステップｂにおいて定義するアミノ酸対をそれぞれ含む）を設計するステップ
を含む。
別の特定の実施形態では、この方法は、細胞質稔性を回復させることが可能な、より詳細には、これまでに記載のように、または実施例Ｃに記載のように同定された、候補Ｒｆタンパク質の最適化を含む。この最適化は、Ｒｆタンパク質のｏｒｆ２７９ＲＮＡへの結合を向上させることを目標とする。
特定の実施形態では、最適化は、図５に記載のように行う。ＰＰＲの各モチーフの５および３５番目のアミノ酸を列挙して、モチーフの数を示し、下にＲＮＡ配列を示す。ＲＮＡ結合部位とＰＰＲコードに従って完全には適合しない５および／または３５番目のアミノ酸は、このコードに従って変更して、ＲＮＡ配列への結合を向上させる。
ＰＰＲコードは、国際出願の国際公開第２０１３／１５５５５５号Ａ１に記載されている。
また、本発明は、ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合することが可能な、上記の方法により得られる合成ＰＰＲタンパク質に関する。
特定の実施形態では、ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合することが可能なＰＰＲタンパク質は、配列番号２２に示される。
特に、合成ＰＰＲタンパク質は、ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合し、ｏｒｆ２７９の発現を防止し、これにより稔性を回復させることが可能である。
稔性の回復は、合成ＰＰＲを発現するベクターをＴ－ＣＭＳ細胞質を有するコムギ植物に導入し、次いで、実施例のパートＢに記載のように稔性回復表現型決定アッセイまで進めることにより容易に確認することができる。
別の態様では、本発明は、ｏｒｆ２７９に結合し、この発現を防止する合成ＰＰＲを発現するベクターを用いて、植物を形質転換することにより稔性コムギ植物を得るための方法に関する。ベクターは、合成ＰＰＲをコードする核酸配列を、植物において機能性のプロモーターの下流に含む、組換え発現カセットを含む。
特定の実施形態では、このような方法はまた、ｏｒｆ２５６に結合するＰＰＲを発現するベクターを用いて、前記植物を形質転換するステップを含む。
また、本発明は、これまでに記載のように得られるｏｒｆ２７９に結合する合成ＰＰＲを発現する植物に関する。したがって、このような植物は、稔性表現型を有する。
「プロモーター」の用語は、本明細書において使用する場合、コード配列の上流のＤＮＡ領域（開始コドンの上流）を指し、ＲＮＡポリメラーゼ、および転写を開始する他のタンパク質の認識および結合のための、開始コドンの前のＤＮＡ領域を含む。発現に有用な構成的プロモーターの例としては、３５Ｓプロモーターまたは１９Ｓプロモーター（Ｋａｙら、１９８７）、イネアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０）、ｐＣＲＶプロモーター（Ｄｅｐｉｇｎｙ－Ｔｈｉｓら、１９９２）、ＣｓＶＭＶプロモーター（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら１９９６）、トウモロコシのユビキチン１プロモーター（ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＱｕａｉｌ、１９９６）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ－ＤＮＡの調節配列が挙げられ、マンノピン合成酵素、ノパリン合成酵素、オクトピン合成酵素をコードする遺伝子由来の調節配列を含む。
プロモーターは、「組織選択性」、すなわち、特定の組織において転写を開始するか、または「組織特異性」、すなわち、特定の組織においてのみ転写を開始し得る。このようなプロモーターの例は、胚に特異的なＤＨＮ１２、ＬＴＲ１、ＬＴＰ１、師部に特異的なＳＳ１、タペート組織に特異的なＯＳＧ６Ｂである（Ｇｏｔｚら２０１１およびＪｏｎｅｓ２０１５）。
他の適するプロモーターをも使用し得る。これは、誘導性プロモーターまたは発生的調節プロモーターであり得る。「誘導性」プロモーターは、一部の環境制御下で転写を開始するか、または例えば、非生物的ストレス誘導ＲＤ２９、ＣＯＲ１４ｂのようにストレス誘導性であり得る（Ｇｏｔｚら、２０１１）。
典型的には、プロモーターは、核において作動している。
構成的プロモーター、例えば、ＺｍＵｂｉプロモーター、典型的には、配列番号１６のＺｍＵｂｉプロモーター、またはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用し得る。最終的には、ｐＴａＲＦＬ４６、７９および１０４に対応する配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８のプロモーターをも使用することができる。
特に、本出願において使用する構成的プロモーターは、配列番号１４に示すｐｒｏＺｍＵＢＩ＿ｉｎｔＵＢＩ、ｐｒｏＯｓＡｃｔｉｎ＿ｉｎｔＯｓＡｃｔｉｎ、ｐｒｏＶｉｒＣｓＶＭＶ、ｐｒｏＶｉｒ３５Ｓ、ｐｒｏ３５Ｓ＿ｉｎｔＺｍＵＢＩである。
本発明の別の態様は、配列番号１のＯｒｆ２７９をコードする核酸配列を、植物において作動しているプロモーターおよびミトコンドリア輸送ペプチドをコードする配列の下流に含む、組換え発現カセットに関する。
ミトコンドリア輸送ペプチドは、ペプチドをミトコンドリアに方向づけることを可能とする。Ｈｕａｎｇら（２００９）では、植物ミトコンドリア輸送ペプチドの主な特性について記載している。
特に、ミトコンドリア輸送ペプチドは、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来の配列であり、より詳細には、配列番号１９に示すＯｓＰＰＲ＿０２ｇ０２０２０または配列番号２０に示すＯｓ０１ｇ４９１９０に対応する。
このような組換えカセットは、植物の形質転換に使用することができる。したがって、本発明はまた、Ｏｒｆ２７９をコードする核酸配列を、植物において機能するプロモーターおよびミトコンドリア輸送ペプチドの下流に含む、組換え発現カセットを発現する植物に関する。
特定の実施形態では、前記植物は、コムギである。
また、本発明は、Ｏｒｆ２７９をコードする核酸配列を、植物において機能するプロモーターおよびミトコンドリア輸送ペプチドの下流に含む、組換え発現カセットを用いて、植物を形質転換することにより不稔性植物を得るための方法に関する。
特定の実施形態では、この植物はまた、Ｏｒｆ２７９をコードする核酸配列を、植物において機能するプロモーターおよびミトコンドリア輸送ペプチドの下流に含む、組換え発現カセットを用いて形質転換される。より詳細な実施形態では、前記植物は、コムギである。
細胞質雄性不稔性を有しｏｒｆ２７９遺伝子を有する植物から稔性植物、特に、コムギ植物を得るために、遺伝子の転写および／またはｏｒｆ２７９ＲＮＡの翻訳の減少が可能となる公知の手段を使用することが可能である。
別の態様では、本発明は、ｏｒｆ２７９ＤＮＡ／ＲＮＡ結合または編集複合体をコードする遺伝子（複数可）を含む組換え発現カセットを用いてコムギ植物を形質転換することにより稔性コムギ植物を得るための方法であって、前記ｏｒｆ２７９ＤＮＡ／ＲＮＡ結合または編集遺伝子を、植物において機能するプロモーターおよびミトコンドリア輸送ペプチドの下流にクローニングする、方法に関する。
ｏｒｆ２７９ＤＮＡ／ＲＮＡ結合または編集複合体は、（１）ｏｒｆ２７９遺伝子をミトコンドリアゲノムにおいて直接破壊するか、または（２）ｏｒｆ２７９転写物の発現を減少させることが可能な、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集ツールである。
公知のゲノム編集ツールを使用して、コムギ植物の核およびミトコンドリアゲノムにおける対応するｏｒｆ２７９遺伝子を、対応する座位における欠失、挿入または部分的もしくは全体的アレル置換により標的とすることができる。このようなゲノム編集ツールは、２本鎖切断技術、例えば、限定されないが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（国際公開第２０１１／０７２２４６号）、もしくはＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９（国際公開第２０１３／１８１４４０号）およびＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａ、Ｃｐｆ１を含むＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳ系、または改変ヌクレアーゼを使用する２本鎖切断技術に基づくこれらの次世代技術によりもたらされる標的配列修飾を含むが、これらに限定されない。ＲＮＡ編集因子を設計および使用して、コムギミトコンドリアのｏｒｆ２７９転写物のコード配列における終止コドンの導入により翻訳中途終結を導入することができる。
別の態様では、本発明は、ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ細胞質を内包する不稔性植物または正常細胞質を内包する稔性植物を検出するための方法であって、
ａ）植物からＤＮＡまたはＲＮＡ試料を抽出するステップ、
ｂ）ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ配列の存在または非存在を、適するプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により検出するステップ、および任意選択で、正常細胞質配列の存在または非存在を、適するプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により検出するステップ、
ｃ）植物の稔性または不稔性状態を判定するステップ
を含む、方法に関する。
ａ）植物からＤＮＡまたはＲＮＡ試料を抽出するステップ、
ｂ）ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ配列の存在または非存在を、適するプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により検出するステップ、および任意選択で、正常細胞質配列の存在または非存在を、適するプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により検出するステップ、
ｃ）植物の稔性または不稔性状態を判定するステップ
を含む、方法に関する。
ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳの増幅に適するプライマー対は、例えば、配列番号５２および５４、またはこれらのバリアントのプライマー対であり得る。他の適するプライマー対は、配列番号１２、配列番号６、配列番号１０または配列番号８の配列から選択されるフォワードプライマー、および配列番号７、配列番号１１または配列番号９の配列から選択されるリバースプライマーを使用することにより、好ましくは、配列番号８のフォワードプライマーおよび配列番号９のリバースプライマーにより得られるプライマー対を使用することにより得ることができる。
正常細胞質配列の増幅に適するプライマー対は、例えば、配列番号５３および５４、またはこれらのバリアントのプライマー対であり得る。
稔性または不稔性植物状態を判定するステップｃ）は、ＰＣＲ増幅シグナルの存在または非存在を検出することにより実施することができる。特に、不稔性状態は、ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ配列の増幅が可能な特異的プライマーを使用した増幅シグナルの存在に依存し、一方、稔性状態は、この増幅シグナルの非存在により判定する。
任意選択で、適するプライマー対により正常細胞質配列を増幅するステップは、稔性植物状態を確認する陽性対照として実施することができる。
勿論、当業者は、上に特定するバリアントプライマーを使用してもよく、このバリアントプライマーまたは核酸プローブは、上に特定するプライマーのいずれか１つとの、少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する。
配列同一性のパーセントは、本明細書において使用する場合、アラインメントした核酸配列において適合した位置の数を算出し、適合した位置の数をアラインメントしたヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより判定する。適合した位置は、同一のヌクレオチドが、アラインメントした核酸配列の同一の位置に生じるような位置を指す。例えば、核酸配列は、ＢＬＡＳＴ２配列（Ｂｌ２ｓｅｑ）によりＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用してアラインメントし得る（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
さらなる態様では、本発明は、ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ配列を増幅する配列番号５２および５４のプライマー対と、任意選択で、正常細胞質配列を増幅する配列番号５３および５４のプライマー対とを含む、ｏｒｆ２７９の存在または非存在を判定するための診断マーカーに関する。
親系統の作製または転換および増加ならびに雑種作製においてＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｖｉｉ細胞質の存在に従うｏｒｆ２７９診断マーカーは、次の作業に使用することができる。
－ 親系統作製のための育種計画：
ｏ 回復細胞質が異質細胞質である場合、すなわち、Ｒ系統がＴ－ＣＭＳ細胞質を保有する場合、Ａ系統およびＲ系統におけるＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｖｉｉ細胞質の戻し交配による転換。単一の種子、バルクの種子または植物におけるＯｒｆ２７９の存在の制御。
ｏ 回復細胞質が異質細胞質である場合、すなわち、Ｒ系統がＴ－ＣＭＳ細胞質を保有する場合、ＤＨ、ＳＳＤ、系統育種または他の任意の育種計画によるＲ系統の作製。単一の種子、バルクの種子または植物におけるＯｒｆ２７９の存在の制御。
ｏ 回復細胞質が異質細胞質である場合、すなわち、Ｒ系統がＴ－ＣＭＳ細胞質を保有する場合、Ａ系統およびＲ系統におけるＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｖｉｉ細胞質の戻し交配による転換。単一の種子、バルクの種子または植物におけるＯｒｆ２７９の存在の制御。
ｏ 回復細胞質が異質細胞質である場合、すなわち、Ｒ系統がＴ－ＣＭＳ細胞質を保有する場合、ＤＨ、ＳＳＤ、系統育種または他の任意の育種計画によるＲ系統の作製。単一の種子、バルクの種子または植物におけるＯｒｆ２７９の存在の制御。
－ 商業目的の研究のための作製
ｏ 維持、雑種作製またはＤＵＳ評価のための、Ａ系統の単一の種子、バルクの種子または植物の制御。
ｏ 回復細胞質が異質細胞質である場合、すなわち、Ｒ系統がＴ－ＣＭＳ細胞質を保有する場合、Ｒ系統の単一の種子、バルクの種子または植物の制御。
ｏ Ｔ－ＣＭＳ雑種の単一の種子、バルクの種子または植物の制御。マーカーにより、雑種ロットにおける非異質細胞質穀物（コムギ細胞質については任意のコムギ系統）による夾雑の測定が可能となる。これを使用して、雑種種子ロットの純度および雑種性レベルを制御することができる。
ｏ ＤＵＳ試験および公式試験に送られたＦ１種子ロットの制御。マーカーにより、雑種が異質細胞質であるかどうかの検証が可能となる。これは雑種の稔性を確認するのに必須のステップである。
ｏ 維持、雑種作製またはＤＵＳ評価のための、Ａ系統の単一の種子、バルクの種子または植物の制御。
ｏ 回復細胞質が異質細胞質である場合、すなわち、Ｒ系統がＴ－ＣＭＳ細胞質を保有する場合、Ｒ系統の単一の種子、バルクの種子または植物の制御。
ｏ Ｔ－ＣＭＳ雑種の単一の種子、バルクの種子または植物の制御。マーカーにより、雑種ロットにおける非異質細胞質穀物（コムギ細胞質については任意のコムギ系統）による夾雑の測定が可能となる。これを使用して、雑種種子ロットの純度および雑種性レベルを制御することができる。
ｏ ＤＵＳ試験および公式試験に送られたＦ１種子ロットの制御。マーカーにより、雑種が異質細胞質であるかどうかの検証が可能となる。これは雑種の稔性を確認するのに必須のステップである。
Ａ－Ｒｆ１およびＲｆ３形質転換体の作製および表現型決定
コムギのＲｆ１およびＲｆ３回復遺伝子を内包するゲノム領域の微細マッピングを実施し、ＩＷＧＳＣ ＲｅｆＳｅｑｖ１．０参照ゲノムのＲｆ１およびＲｆ３の区間に存在するＲｆｌ遺伝子を同定した。並行して、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉおよびコムギＲｆ１、Ｒｆ３または維持系統に存在するＲｆｌ遺伝子を濃縮し、標的Ｒｆｌを捕捉することによりシーケンシングした。マッピングおよび捕捉解析の両方により、候補Ｒｆ１およびＲｆ３回復遺伝子を予想することが可能となった。Ｒｆ１およびＲｆ３候補遺伝子の回復能を遺伝子導入方法により評価した。
コムギのＲｆ１およびＲｆ３回復遺伝子を内包するゲノム領域の微細マッピングを実施し、ＩＷＧＳＣ ＲｅｆＳｅｑｖ１．０参照ゲノムのＲｆ１およびＲｆ３の区間に存在するＲｆｌ遺伝子を同定した。並行して、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉおよびコムギＲｆ１、Ｒｆ３または維持系統に存在するＲｆｌ遺伝子を濃縮し、標的Ｒｆｌを捕捉することによりシーケンシングした。マッピングおよび捕捉解析の両方により、候補Ｒｆ１およびＲｆ３回復遺伝子を予想することが可能となった。Ｒｆ１およびＲｆ３候補遺伝子の回復能を遺伝子導入方法により評価した。
配列番号１５に示すアミノ酸配列のＴａＲＦＬ７９タンパク質をコードする核酸を、Ｒｆ１回復遺伝子と同定した。配列番号２５に示すアミノ酸配列のＴａＲＦＬ２９ａタンパク質をコードする核酸を、Ｒｆ３回復遺伝子と同定した。それぞれを別々に適応させ、ゴールデンゲート反応によりデスティネーションバイナリープラスミドｐＢＩＯＳ１０７４６にクローニングした。
次の発現エレメント：Ｚｅａ ｍａｙｓユビキチンイントロン（配列番号１７に示すｉｎｔＺｍＵｂｉ）と関連する構成的Ｚｅａ ｍａｙｓユビキチンプロモーター（配列番号１６に示すｐｒｏＺｍＵｂｉ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら１９９２）および配列番号１８に示す、ソルガム熱ショックタンパク質ｔｅｒＳｂＨＳＰ（受託番号：Ｓｂ０３ｇ００６８８０）をコードする遺伝子の３’終結配列を各構築物に使用した。
ＴａＲＦＬ７９およびＴａＲＦＬ２９ａの組換え構築物は、配列番号２９および配列番号３０にそれぞれ示す。
上記のすべてのバイナリープラスミドは、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５株に形質転換した。ＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒコムギならびに従来のＦｉｅｌｄｅｒ品種は、国際公開第２０００／０６３３９８号に記載されているアグロバクテリウム株により形質転換した。コムギの遺伝子導入減少は、構築物のそれぞれについて生じた。
ＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒは、Ｔ－ＣＭＳ細胞質を保有するＦｉｅｌｄｅｒ維持系統である。この系統は、不稔性高形質転換効率および組織再生の両方を組み合わせるために構築した。ＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒ植物は、不稔性である。
稔性回復表現型決定アッセイを、次のように種々の減少について実施した。上記のように作製したすべてのコムギ遺伝子導入植物および対照稔性植物を、ガラス温室において標準的コムギ生育条件下で（２０℃の明期１６時間および１５℃の暗期８時間を６０％の恒湿で）野生型Ｆｉｅｌｄｅｒ品種の対照穀物が成熟期に達するまで生育させた。
遺伝子導入植物の稔性は、各植物について種子および１穂あたりの空穎の数を計数し、野生型ＦｉｅｌｄｅｒおよびＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒ対照植物と比較することにより評価した。また、植物は、葯の突出を観察することにより評価した。
１１回の独立的形質転換現象に由来するＺｍＵｂｉプロモーター下でＴａＲＦＬ７９配列を高発現する形質転換ＣＭＳ－Ｆｉｅｌｄｅｒ植物１６種、および１９回の独立的形質転換現象に由来するＺｍＵｂｉプロモーター下でＴａＲＦＬ２９ａ配列を高発現する形質転換ＣＭＳ－Ｆｉｅｌｄｅｒ植物３６種を解析した。
解析した植物の１００％～９２％がそれぞれ雄性稔性の回復を呈し、一方、並行して生育させた非形質転換ＣＭＳ－Ｆｉｅｌｄｅｒ植物の１００％が完全不稔性であって、葯の突出も種子の生成もなく、ＷＴ－Ｆｉｅｌｄｅｒ植物の１００％が稔性である。
Ｂ－Ｒｆ１およびＲｆ３形質転換体の分子特性決定
１－材料および方法
ＲＮＡ解析
ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて製造者の指示に従って植物からＲＮＡを抽出した。導入遺伝子発現解析では、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）キットを用いてｃＤＮＡを合成し、表１に列挙するプライマーＰ１、Ｐ２およびＰ３を用いて増幅を実施した。
１－材料および方法
ＲＮＡ解析
ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて製造者の指示に従って植物からＲＮＡを抽出した。導入遺伝子発現解析では、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）キットを用いてｃＤＮＡを合成し、表１に列挙するプライマーＰ１、Ｐ２およびＰ３を用いて増幅を実施した。
ノーザンブロット
全ＲＮＡ５～１０μｇを１．２％の変性アガロースゲル上で分離し、ＨｙｂｏｎｄＮ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）上に移した。ノーザンブロットを一晩、１０×ＳＳＣ（１．５Ｍの塩化ナトリウムおよび１５０ｍＭのクエン酸３ナトリウムｐＨ７．０）緩衝液中で実施した。膜は、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（商標）ＰｌｕｓＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ社）中で２時間、６５℃でプレハイブリダイズした。ビオチン標識プローブを一晩、ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズした。ＳＤＳを添加した低下濃度のＳＳＣ緩衝液を含む洗浄溶液による洗浄ステップ３回の後、ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）画像装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用してプローブシグナルを検出した。アクチンおよびｏｒｆ２５６ＲＮＡのプローブ合成では、表１に示すプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。反応産物をｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）ベクターにクローニングし、ＰＣＲおよびＭａｃｒｏｇｅｎ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社、韓国）におけるシーケンシングにより確認した。ＲＮＡプローブは、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６／Ｔ７ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）およびｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙプラスミドを鋳型として、およびシチジン３リン酸（ＣＴＰ）のビオチン標識類似体（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて合成した。
全ＲＮＡ５～１０μｇを１．２％の変性アガロースゲル上で分離し、ＨｙｂｏｎｄＮ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）上に移した。ノーザンブロットを一晩、１０×ＳＳＣ（１．５Ｍの塩化ナトリウムおよび１５０ｍＭのクエン酸３ナトリウムｐＨ７．０）緩衝液中で実施した。膜は、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（商標）ＰｌｕｓＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ社）中で２時間、６５℃でプレハイブリダイズした。ビオチン標識プローブを一晩、ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズした。ＳＤＳを添加した低下濃度のＳＳＣ緩衝液を含む洗浄溶液による洗浄ステップ３回の後、ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）画像装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用してプローブシグナルを検出した。アクチンおよびｏｒｆ２５６ＲＮＡのプローブ合成では、表１に示すプライマーを用いてＤＮＡ断片を増幅した。反応産物をｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）ベクターにクローニングし、ＰＣＲおよびＭａｃｒｏｇｅｎ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社、韓国）におけるシーケンシングにより確認した。ＲＮＡプローブは、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６／Ｔ７ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）およびｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙプラスミドを鋳型として、およびシチジン３リン酸（ＣＴＰ）のビオチン標識類似体（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて合成した。
ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（５’－ＲＡＣＥ）
全ＲＮＡ１μｇをｃＤＮＡ合成、およびＳＭＡＲＴＥＲ＠ＲＡＣＥ５’３’Ｋｉｔを製造者の指示に従って使用した（Ｔａｋａｒａ社）５’末端の増幅に使用した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングし、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）でシーケンシングした。遺伝子特異的プライマー配列（ｏｒｆ２７９ではＧＳＰ１およびｏｒｆ２５６ではＧＰＳ２）を表１に示す。
全ＲＮＡ１μｇをｃＤＮＡ合成、およびＳＭＡＲＴＥＲ＠ＲＡＣＥ５’３’Ｋｉｔを製造者の指示に従って使用した（Ｔａｋａｒａ社）５’末端の増幅に使用した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングし、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）でシーケンシングした。遺伝子特異的プライマー配列（ｏｒｆ２７９ではＧＳＰ１およびｏｒｆ２５６ではＧＰＳ２）を表１に示す。
ミトコンドリアＤＮＡシーケンシングおよび集合
ミトコンドリアＤＮＡの抽出に先行して、２２℃の暗所における生育キャビネット内のバーミキュライト上で生育させた７日齢のコムギ子葉鞘からミトコンドリア断片を濃縮した。ミトコンドリア単離およびＤＮＡ抽出では、これまでに記載したプロトコールを適用した（Ｈｕａｎｇら、２００４、Ｔｒｉｂｏｕｓｈら、１９９８）（図２）。得られたＤＮＡ（５０ｎｇ）をＣｏｖａｒｉｓＳ２２０集中超音波処理装置（Ｃｏｖａｒｉｓ社、米国）により５５０ｂｐの断片に超音波処理した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＮａｎｏＤＮＡ ＬＴ ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔ－ＳｅｔＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国）により作成した。正規化および貯蔵したライブラリーは、ＭｉＳｅｑデスクトップシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国）上でのＭｉＳｅｑ（登録商標）ＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ ｖ３（６００サイクル）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国）を用いたシーケンシングに使用した。重複するペアエンドリードは、ＦＬＡＳＨソフトウェア［バージョン１．２．７］を使用して結合し、結合したリードは、Ｖｅｌｖｅｔ［バージョン１．２．０８］を使用してｋ－ｍｅｒ値９１およびカバレッジカットオフ値２０により構築した。Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリアゲノムにユニークなＯＲＦを同定するために、Ｔ－ＣＭＳ系統のリードを、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍの参照ミトコンドリアゲノム（ＤＮＡデータベース受託番号ＡＰ００８９８２、Ｏｇｉｈａｒａら、２００５）にマッピングして、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉおよびＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍの両ゲノムに共通するリードを除去した。残存する未マッピングリードは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ／）によりコンティグに再構築した。
ミトコンドリアＤＮＡの抽出に先行して、２２℃の暗所における生育キャビネット内のバーミキュライト上で生育させた７日齢のコムギ子葉鞘からミトコンドリア断片を濃縮した。ミトコンドリア単離およびＤＮＡ抽出では、これまでに記載したプロトコールを適用した（Ｈｕａｎｇら、２００４、Ｔｒｉｂｏｕｓｈら、１９９８）（図２）。得られたＤＮＡ（５０ｎｇ）をＣｏｖａｒｉｓＳ２２０集中超音波処理装置（Ｃｏｖａｒｉｓ社、米国）により５５０ｂｐの断片に超音波処理した。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＮａｎｏＤＮＡ ＬＴ ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔ－ＳｅｔＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国）により作成した。正規化および貯蔵したライブラリーは、ＭｉＳｅｑデスクトップシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国）上でのＭｉＳｅｑ（登録商標）ＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ ｖ３（６００サイクル）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国）を用いたシーケンシングに使用した。重複するペアエンドリードは、ＦＬＡＳＨソフトウェア［バージョン１．２．７］を使用して結合し、結合したリードは、Ｖｅｌｖｅｔ［バージョン１．２．０８］を使用してｋ－ｍｅｒ値９１およびカバレッジカットオフ値２０により構築した。Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリアゲノムにユニークなＯＲＦを同定するために、Ｔ－ＣＭＳ系統のリードを、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍの参照ミトコンドリアゲノム（ＤＮＡデータベース受託番号ＡＰ００８９８２、Ｏｇｉｈａｒａら、２００５）にマッピングして、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉおよびＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍの両ゲノムに共通するリードを除去した。残存する未マッピングリードは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ／）によりコンティグに再構築した。
ＢＧＡ ＣＭＳ＊ＦｉｅｌｄｅｒならびにＲｆ１およびＲｆ３形質転換体のＲＮＡｓｅｑ解析
ＲＮＡｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してＢＧＡ ＣＭＳ＊ＦｉｅｌｄｅｒおよびＲｆ１形質転換体からＲＮＡを抽出し、この質をＡｇｉｌｅｎｔ４２００ ｔａｐｅ ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）上で推定した。全ＲＮＡ３μｇをＭａｃｒｏｇｅｎに送ってＮＧＳシーケンシングを行った。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄｅｄＴｏｔａｌ ＲＮＡ ＲｉｂｏＺｅｒｏＳａｍｐｌｅｓＰｒｅｐＫｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて実施し、Ｈｉｓｅｑ４０００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）上で１００ｂｐペアエンドシーケンシングキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてシーケンシングした。リードは、アダプタートリミングし、ＢＢＭａｐ（Ｂｕｓｈｎｅｌｌ Ｂ． ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｂｍａｐ／）によりＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリアゲノム（ＮＣ＿０２２７１４）にマッピングした。複数マッピングされたリードは、最も適合する部位間にランダムに分布され、ｒＲＮＡ領域は、マスクした（ｒＲＮＡ枯渇が試料全体に対して一貫していなかったため）。色素体ＤＮＡと同一の領域は、マスクして色素体リードの交差マッピングを回避し、リード深度は、マスクした領域を除く平均カバレッジ深度で割ることにより正規化した。
ＲＮＡｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してＢＧＡ ＣＭＳ＊ＦｉｅｌｄｅｒおよびＲｆ１形質転換体からＲＮＡを抽出し、この質をＡｇｉｌｅｎｔ４２００ ｔａｐｅ ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）上で推定した。全ＲＮＡ３μｇをＭａｃｒｏｇｅｎに送ってＮＧＳシーケンシングを行った。ライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄｅｄＴｏｔａｌ ＲＮＡ ＲｉｂｏＺｅｒｏＳａｍｐｌｅｓＰｒｅｐＫｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて実施し、Ｈｉｓｅｑ４０００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）上で１００ｂｐペアエンドシーケンシングキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてシーケンシングした。リードは、アダプタートリミングし、ＢＢＭａｐ（Ｂｕｓｈｎｅｌｌ Ｂ． ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｂｂｍａｐ／）によりＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリアゲノム（ＮＣ＿０２２７１４）にマッピングした。複数マッピングされたリードは、最も適合する部位間にランダムに分布され、ｒＲＮＡ領域は、マスクした（ｒＲＮＡ枯渇が試料全体に対して一貫していなかったため）。色素体ＤＮＡと同一の領域は、マスクして色素体リードの交差マッピングを回避し、リード深度は、マスクした領域を除く平均カバレッジ深度で割ることにより正規化した。
２－結果
ａ－ｏｒｆ２５６のプロセシングはＴ－ＣＭＳコムギにおいて稔性回復と相関しない
これまでの研究では、Ｔ－ＣＭＳ植物の稔性回復がＯｒｆ２５６タンパク質の発現と相関し（ＳｏｎｇおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９４Ａ）、核のバックグラウンドが、コムギ系統においてｏｒｆ２５６転写物のレベルに影響した（Ｓｏｎｇら、１９９４Ｂ）ことが示された。Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍまたはＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのいずれかの細胞質を保有し、種々の回復能を有するコムギ遺伝子型におけるｏｒｆ２５６の発現およびプロセシングパターンを解析するために、全ＲＮＡを抽出し、ｏｒｆ２５６特異的プローブを用いたＲＴ－ＰＣＲならびにノーザンブロット解析を実施した（図１）。ＲＴ－ＰＣＲの結果は、ｏｒｆ２５６ＲＮＡが植物系統全体に対して非常に豊富であり、レベルが回復遺伝子の存在に依存しないことを示す（図１Ａ）。ノーザンブロットの結果により、回復遺伝子を保有しないことがわかっているコムギ系統であってもｏｒｆ２５６ＲＮＡのプロセシングが観察されたため、ｏｒｆ２５６のプロセシングが稔性表現型の回復と相関しなかったことが明らかとなった（図１Ｃ）。実際、回復遺伝子を保有しないことがわかっているＡｌｉｘａｎ、Ｋａｌａｈａｒｉ、Ｌｇａｂｒａｈａｍを含むいくつかの系統は、回復遺伝子を保有することがわかっているＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉまたはＬＧＷＲ１６－００２６、ＬＧＷＲ１７－０１５４およびＬＧＷＲ１７－０１５７系統と比較して、切断部位Ｉにおいてｏｒｆ２５６のプロセシングを示す。
ａ－ｏｒｆ２５６のプロセシングはＴ－ＣＭＳコムギにおいて稔性回復と相関しない
これまでの研究では、Ｔ－ＣＭＳ植物の稔性回復がＯｒｆ２５６タンパク質の発現と相関し（ＳｏｎｇおよびＨｅｄｇｃｏｔｈ、１９９４Ａ）、核のバックグラウンドが、コムギ系統においてｏｒｆ２５６転写物のレベルに影響した（Ｓｏｎｇら、１９９４Ｂ）ことが示された。Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍまたはＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのいずれかの細胞質を保有し、種々の回復能を有するコムギ遺伝子型におけるｏｒｆ２５６の発現およびプロセシングパターンを解析するために、全ＲＮＡを抽出し、ｏｒｆ２５６特異的プローブを用いたＲＴ－ＰＣＲならびにノーザンブロット解析を実施した（図１）。ＲＴ－ＰＣＲの結果は、ｏｒｆ２５６ＲＮＡが植物系統全体に対して非常に豊富であり、レベルが回復遺伝子の存在に依存しないことを示す（図１Ａ）。ノーザンブロットの結果により、回復遺伝子を保有しないことがわかっているコムギ系統であってもｏｒｆ２５６ＲＮＡのプロセシングが観察されたため、ｏｒｆ２５６のプロセシングが稔性表現型の回復と相関しなかったことが明らかとなった（図１Ｃ）。実際、回復遺伝子を保有しないことがわかっているＡｌｉｘａｎ、Ｋａｌａｈａｒｉ、Ｌｇａｂｒａｈａｍを含むいくつかの系統は、回復遺伝子を保有することがわかっているＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉまたはＬＧＷＲ１６－００２６、ＬＧＷＲ１７－０１５４およびＬＧＷＲ１７－０１５７系統と比較して、切断部位Ｉにおいてｏｒｆ２５６のプロセシングを示す。
種々の遺伝子型ならびにＲｆ１およびＲｆ３形質転換体におけるｏｒｆ２５６のプロセシングをより詳細に解析するために、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（５’－ＲＡＣＥ）を実施した（図１Ｄ）。ｏｒｆ２５６の切断が、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉおよび維持遺伝子型を有するＴ－ＣＭＳ植物、ＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒ植物において観察される（図１Ｄ）。加えて、ｏｒｆ２５６における第２の切断部位が、ノーザンブロットの結果と一致して、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉにおいて見出された（図１Ｃ）。
ｂ－Ｔ－ＣＭＳコムギにおけるＣＭＳの遺伝的基盤としてのｏｒｆ２７９の同定
Ｔ－ＣＭＳミトコンドリアにおけるｏｒｆ２５６のプロセシング／切断は、Ｒｆ１またはＲｆ３のいずれかの回復遺伝子の存在と相関しないため、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉミトコンドリアＤＮＡを抽出およびシーケンシングして、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉにおけるＣＭＳの分子的基盤となり得る他のキメラｏｒｆの存在を探した。ミトコンドリアＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォーム上でシーケンシングし、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリアゲノムに存在し、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍのミトコンドリアゲノムに存在しないコンティグ１７種を同定した（表２）。２つの終止コドン間に同定された最良のＯＲＦに対応し、１００アミノ酸よりも長いペプチドをコードする候補ＯＲＦ２５種を同定した（表２）。Ｏｒｆ２５６は、コンティグ１１においてＯＲＦ５としてコードされることが見出された（表２）。残存する未特性決定ＯＲＦ２４種は、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉミトコンドリアゲノムまたはシーケンシングした他の植物ゲノム由来の他の遺伝子に対して相同の領域について、ｂｌａｓｔｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用してスクリーニングした（表２）。検索により、２つのＯＲＦが、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（コンティグ１、ｏｒｆ２７＝ｏｒｆ１９４）およびＺｅａ ｍａｙｓ（コンティグ５、ｏｒｆ２１＝ｏｒｆ２９６）のミトコンドリアゲノムにより、それぞれコードされることが既に同定されていたことが明らかとなった。ＢＧＡ ＣＭＳ＊ＦｉｅｌｄｅｒならびにＲｆ１およびＲｆ３形質転換体由来のＲＮＡ試料の後続のＲＮＡｓｅｑ解析では、発現の最大減少率が、１．１ｋｂのコンティグ＿４＿ｏｒｆ１３領域において観察されたことが明らかとなった（図２ＡおよびＢ）。この領域は、２７９アミノ酸からなるタンパク質をコードすることが見出され、これによりｏｒｆ２７９と名付けられた。Ｒｆ１およびＲｆ３形質転換体では、ｏｒｆ２７９転写物を切断し、５’末端は分解する（翻訳の防止）が、３’末端は存続させる（図２Ｃ）。ＯＲＦの５’領域および上流にマッピングするリードのほとんどは、おそらく、ミトコンドリアゲノムに存在するａｔｐ８の他の（完全）コピー由来である（図２Ｃ）。
Ｔ－ＣＭＳミトコンドリアにおけるｏｒｆ２５６のプロセシング／切断は、Ｒｆ１またはＲｆ３のいずれかの回復遺伝子の存在と相関しないため、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉミトコンドリアＤＮＡを抽出およびシーケンシングして、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉにおけるＣＭＳの分子的基盤となり得る他のキメラｏｒｆの存在を探した。ミトコンドリアＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォーム上でシーケンシングし、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉのミトコンドリアゲノムに存在し、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍのミトコンドリアゲノムに存在しないコンティグ１７種を同定した（表２）。２つの終止コドン間に同定された最良のＯＲＦに対応し、１００アミノ酸よりも長いペプチドをコードする候補ＯＲＦ２５種を同定した（表２）。Ｏｒｆ２５６は、コンティグ１１においてＯＲＦ５としてコードされることが見出された（表２）。残存する未特性決定ＯＲＦ２４種は、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉミトコンドリアゲノムまたはシーケンシングした他の植物ゲノム由来の他の遺伝子に対して相同の領域について、ｂｌａｓｔｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用してスクリーニングした（表２）。検索により、２つのＯＲＦが、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（コンティグ１、ｏｒｆ２７＝ｏｒｆ１９４）およびＺｅａ ｍａｙｓ（コンティグ５、ｏｒｆ２１＝ｏｒｆ２９６）のミトコンドリアゲノムにより、それぞれコードされることが既に同定されていたことが明らかとなった。ＢＧＡ ＣＭＳ＊ＦｉｅｌｄｅｒならびにＲｆ１およびＲｆ３形質転換体由来のＲＮＡ試料の後続のＲＮＡｓｅｑ解析では、発現の最大減少率が、１．１ｋｂのコンティグ＿４＿ｏｒｆ１３領域において観察されたことが明らかとなった（図２ＡおよびＢ）。この領域は、２７９アミノ酸からなるタンパク質をコードすることが見出され、これによりｏｒｆ２７９と名付けられた。Ｒｆ１およびＲｆ３形質転換体では、ｏｒｆ２７９転写物を切断し、５’末端は分解する（翻訳の防止）が、３’末端は存続させる（図２Ｃ）。ＯＲＦの５’領域および上流にマッピングするリードのほとんどは、おそらく、ミトコンドリアゲノムに存在するａｔｐ８の他の（完全）コピー由来である（図２Ｃ）。
ｃ－ｏｒｆ２７９のプロセシングはＲｆ１およびＲｆ３形質転換体の稔性回復表現型と相関する
Ｏｒｆ２７９の詳細な解析により、最初の９６アミノ酸が、ＡＴＰ合成酵素サブユニット８のＮ末端と同一であることが明らかとなった（図３Ａ）。加えて、翻訳開始の１７１ｎｔ上流は、ａｔｐ８遺伝子の５’ＵＴＲ領域と同一である（図３Ａ）。
ｏｒｆ２７９転写物のプロセシングを解析するために、５’－ＲＡＣＥ解析を実施した。Ｒｆ１形質転換体では、ＧＳＰ１プライマーを用いて、約３００ｎｔの主要な増幅産物を検出し、一方、Ｒｆ３形質転換体では、約４００ｎｔの主要なアンプリコンを見出した（図３Ｂ）。Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ由来のＲｆ１回復遺伝子およびＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ由来のＲｆ３回復遺伝子の起点と一致して、Ｒｆ１特異的アンプリコンのみがＴ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉにおいて検出され、Ｒｆ３特異的アンプリコンは検出されなかった。このような２つのアンプリコンのいずれも、ＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒ試料においては検出されなかった（図３Ｂ）。このような結果は、（１）ｏｒｆ２７９が、２つの異なる部位においてプロセシングされ－Ｒｆ３により誘導される切断が、Ｒｆ１により誘導されるＲＮＡ切断の上流で一般に生じ、（２）Ｒｆ３により誘引されるエンドヌクレアーゼが、第１の切断部位をスキップして、Ｒｆ１により標的とされる部位を切断し続けることもあり得ることを示す。
Ｃ－ｏｒｆ２７９発現の抑制を向上させるためのＲＦタンパク質最適化
１－合成Ｒｆタンパク質ＳＲ Ｏｒｆ２７９およびＳＲ Ｏｒｆ２５６の設計および入手
コムギ系統５２種からの標的配列の捕捉により同定されたＲＦＬタンパク質２９７３種、ならびにＲｅｆｓｅｑｖ１．１Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇコムギ系統（ＩＷＧＳＣ）において注釈を付けたＲＦＬタンパク質のライブラリーを、Ｂａｒｋａｎら（２０１２）および国際公開第２０１３／１５５５５５号の特許出願に記載のＰＰＲコードに従って、ｏｒｆ２７９またはｏｒｆ２５６におけるＲＮＡ結合について最も高く採点されたＲＦＬ配列をスクリーニングした。最良候補は、Ｐｒｅｄｏｔａｒ（Ｓｍａｌｌら、２００４）およびＴａｒｇｅｔＰ（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら、２００７）を用いて、ミトコンドリア標的配列の存在について解析した。ｏｒｆ２７９に結合する合成回復遺伝子（ＳＲｏｒｆ２７９）またはｏｒｆ２５６に結合する合成回復遺伝子（ＳＲｏｒｆ２５６）のいずれかの最良候補は、ＲＮＡ結合部位と完全な適合を形成しなかったＰＰＲモチーフにおいて５および３５番目のアミノ酸の組合せをＰＰＲコードに従って変更することにより最適化した（図４）。最適化ＳＲｏｒｆ２７９は、配列番号２２に示し、最適化ＳＲｏｒｆ２５６は、配列番号２１に示す。このような最適化配列の発現は、配列番号４０に示すタグ配列の発現と、最適化配列のＣ末端において融合させることができる。
１－合成Ｒｆタンパク質ＳＲ Ｏｒｆ２７９およびＳＲ Ｏｒｆ２５６の設計および入手
コムギ系統５２種からの標的配列の捕捉により同定されたＲＦＬタンパク質２９７３種、ならびにＲｅｆｓｅｑｖ１．１Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇコムギ系統（ＩＷＧＳＣ）において注釈を付けたＲＦＬタンパク質のライブラリーを、Ｂａｒｋａｎら（２０１２）および国際公開第２０１３／１５５５５５号の特許出願に記載のＰＰＲコードに従って、ｏｒｆ２７９またはｏｒｆ２５６におけるＲＮＡ結合について最も高く採点されたＲＦＬ配列をスクリーニングした。最良候補は、Ｐｒｅｄｏｔａｒ（Ｓｍａｌｌら、２００４）およびＴａｒｇｅｔＰ（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら、２００７）を用いて、ミトコンドリア標的配列の存在について解析した。ｏｒｆ２７９に結合する合成回復遺伝子（ＳＲｏｒｆ２７９）またはｏｒｆ２５６に結合する合成回復遺伝子（ＳＲｏｒｆ２５６）のいずれかの最良候補は、ＲＮＡ結合部位と完全な適合を形成しなかったＰＰＲモチーフにおいて５および３５番目のアミノ酸の組合せをＰＰＲコードに従って変更することにより最適化した（図４）。最適化ＳＲｏｒｆ２７９は、配列番号２２に示し、最適化ＳＲｏｒｆ２５６は、配列番号２１に示す。このような最適化配列の発現は、配列番号４０に示すタグ配列の発現と、最適化配列のＣ末端において融合させることができる。
２－最適化ＳＲ Ｏｒｆ２７９およびＳＲ Ｏｒｆ２５６タンパク質のクローニングおよび形質転換
最適化ＳＲｏｒｆ２７９およびＳＲｏｒｆ２５６配列を、Ｚｅａ ｍａｙｓユビキチンイントロン（ｉｎｔＺｍＵｂｉ、配列番号１７に例証）を有する構成的Ｚｅａ ｍａｙｓユビキチンプロモーター（ｐｒｏＺｍＵｂｉ、配列番号１６）（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、ＳｈａｒｒｏｃｋおよびＱｕａｉｌ １９９２）およびソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）３’終結配列（ｔｅｒＳｂＨＳＰ、配列番号１８に示す）の間のゴールデンゲート反応によりクローニングした（未特性決定推定タンパク質Ｓｂ０３ｇ００６８８０）。配列番号２４に示すＳＲｏｒｆ２７９発現カセットおよび配列番号２３に示すＳＲｏｒｆ２５６発現カセットを、デスティネーションバイナリープラスミドｐＢＩＯＳ１０７４６に別々にクローニングした。バイナリーデスティネーションベクターｐＢＩＯＳ１０７４６は、バイナリーベクターｐＭＲＴの誘導体である（国際公開第２００１／０１８１９２号）。
最適化ＳＲｏｒｆ２７９およびＳＲｏｒｆ２５６配列を、Ｚｅａ ｍａｙｓユビキチンイントロン（ｉｎｔＺｍＵｂｉ、配列番号１７に例証）を有する構成的Ｚｅａ ｍａｙｓユビキチンプロモーター（ｐｒｏＺｍＵｂｉ、配列番号１６）（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、ＳｈａｒｒｏｃｋおよびＱｕａｉｌ １９９２）およびソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）３’終結配列（ｔｅｒＳｂＨＳＰ、配列番号１８に示す）の間のゴールデンゲート反応によりクローニングした（未特性決定推定タンパク質Ｓｂ０３ｇ００６８８０）。配列番号２４に示すＳＲｏｒｆ２７９発現カセットおよび配列番号２３に示すＳＲｏｒｆ２５６発現カセットを、デスティネーションバイナリープラスミドｐＢＩＯＳ１０７４６に別々にクローニングした。バイナリーデスティネーションベクターｐＢＩＯＳ１０７４６は、バイナリーベクターｐＭＲＴの誘導体である（国際公開第２００１／０１８１９２号）。
上記の各バイナリープラスミドは、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＥＨＡ１０５に形質転換した。得られた各株は、国際公開第２０００／０６３３９８号に記載のように、ＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒコムギ品種を形質転換するために使用した。コムギ遺伝子導入現象は、上記の各構築物について生じさせた。
３－稔性回復表現型決定アッセイ
上に作製したすべてのコムギ遺伝子導入植物および対照稔性植物を、ガラス温室において標準的コムギ生育条件下で（２０℃の明期１６時間および１５℃の暗期８時間を６０％の恒湿で）野生型Ｆｉｅｌｄｅｒ品種の対照穀物が成熟期に達するまで生育させた。
上に作製したすべてのコムギ遺伝子導入植物および対照稔性植物を、ガラス温室において標準的コムギ生育条件下で（２０℃の明期１６時間および１５℃の暗期８時間を６０％の恒湿で）野生型Ｆｉｅｌｄｅｒ品種の対照穀物が成熟期に達するまで生育させた。
遺伝子導入植物の稔性は、各植物について種子および１穂あたりの空穎の数を計数し、野生型ＦｉｅｌｄｅｒおよびＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒ対照植物と比較することにより評価した。また、植物は、葯の突出を観察することにより評価した。
Ｄ－ｏｒｆ２７９の同定
ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ試料においてｏｒｆ２７９を同定するために、次のプライマー：
－ フォワードプライマー：配列番号１２、配列番号６、配列番号１０、および
－ リバースプライマー：配列番号７、配列番号１１、配列番号９
を使用し得るか、またはフォワードプライマー配列番号８およびリバースプライマー配列番号９で構成される。
ａｔｐ８遺伝子配列と共通する領域を同定するために、次のプライマー：
－ フォワードプライマー：配列番号１２
－ リバースプライマー：配列番号１３
を使用することができる。
ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ試料においてｏｒｆ２７９を同定するために、次のプライマー：
－ フォワードプライマー：配列番号１２、配列番号６、配列番号１０、および
－ リバースプライマー：配列番号７、配列番号１１、配列番号９
を使用し得るか、またはフォワードプライマー配列番号８およびリバースプライマー配列番号９で構成される。
ａｔｐ８遺伝子配列と共通する領域を同定するために、次のプライマー：
－ フォワードプライマー：配列番号１２
－ リバースプライマー：配列番号１３
を使用することができる。
図５は、ｏｒｆ２７９ゲノム配列上のこのようなマーカー配列の位置を示す。
Ｅ－ｏｒｆ２７９発現の抑制を向上させるためのＲＦＬ２９ａタンパク質の最適化
１－合成最適化ＲＦＬ２９ａタンパク質の設計および入手
ｏｒｆ２７９におけるＲＦＬ２９ａ配列のＲＮＡ結合を、Ｂａｒｋａｎら（２０１２）および国際公開第２０１３／１５５５５５号の特許出願に記載するＰＰＲコードに従って解析した。配列番号２５のＲＦＬ２９ａ配列を、対応するＲＮＡ塩基に対する親和性が弱いと（Ｙａｎら２０１９により算出した－ΔＧ値を使用して）予想されるＰＰＲモチーフにおいて５および３５番目のアミノ酸の組合せを変更することにより最適化した（図６）。最適化ＲＦＬ２９ａ配列は、配列番号４４および配列番号４５に示す。
１－合成最適化ＲＦＬ２９ａタンパク質の設計および入手
ｏｒｆ２７９におけるＲＦＬ２９ａ配列のＲＮＡ結合を、Ｂａｒｋａｎら（２０１２）および国際公開第２０１３／１５５５５５号の特許出願に記載するＰＰＲコードに従って解析した。配列番号２５のＲＦＬ２９ａ配列を、対応するＲＮＡ塩基に対する親和性が弱いと（Ｙａｎら２０１９により算出した－ΔＧ値を使用して）予想されるＰＰＲモチーフにおいて５および３５番目のアミノ酸の組合せを変更することにより最適化した（図６）。最適化ＲＦＬ２９ａ配列は、配列番号４４および配列番号４５に示す。
２－最適化ＲＦＬ２９ａタンパク質のクローニングおよび形質転換
配列番号４６および配列番号４７の最適化Ｒｆｌ２９ａ配列を、ＴａＲＦＬ２９ｂプロモーター（ｐｒｏＴａＲＦＬ２９ｂ、配列番号４８）およびＴａＲＦＬ２９ａ終結配列（ｔｅｒＴａＲＦＬ２９ａ、配列番号４９に示す）の間のゴールデンゲート反応により別々にクローニングした。配列番号５０および配列番号５１にそれぞれ示す最適化ＲＦＬ２９ａ発現カセットを、デスティネーションバイナリープラスミドｐＢＩＯＳ１０７４６に別々にクローニングした。バイナリーデスティネーションベクターｐＢＩＯＳ１０７４６は、バイナリーベクターｐＭＲＴの誘導体である（国際公開第２００１／０１８１９２号）。
配列番号４６および配列番号４７の最適化Ｒｆｌ２９ａ配列を、ＴａＲＦＬ２９ｂプロモーター（ｐｒｏＴａＲＦＬ２９ｂ、配列番号４８）およびＴａＲＦＬ２９ａ終結配列（ｔｅｒＴａＲＦＬ２９ａ、配列番号４９に示す）の間のゴールデンゲート反応により別々にクローニングした。配列番号５０および配列番号５１にそれぞれ示す最適化ＲＦＬ２９ａ発現カセットを、デスティネーションバイナリープラスミドｐＢＩＯＳ１０７４６に別々にクローニングした。バイナリーデスティネーションベクターｐＢＩＯＳ１０７４６は、バイナリーベクターｐＭＲＴの誘導体である（国際公開第２００１／０１８１９２号）。
上記のバイナリープラスミドは、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５に形質転換した。得られた各株は、国際公開第２０００／０６３３９８号に記載のように、ＢＧＡ ＣＭＳ＊Ｆｉｅｌｄｅｒコムギ品種を形質転換するために使用した。コムギ遺伝子導入現象は、上記の各構築物について生じさせた。
Ｆ－Ｔ－ＣＭＳ細胞質を内包する植物の同定のためのＯｒｆ２７９診断マーカー
ＫＡＳＰの設計を、植物材料におけるｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳの存在または非存在を判定するために考案した。
ＫＡＳＰの設計を、植物材料におけるｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳの存在または非存在を判定するために考案した。
ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳが材料中に存在するかどうかを判定するために、ＰＣＲに基づくＫＡＳＰ技術に従って３つのプライマーを定義した。
－ オリゴヌクレオチドＡＳ１（配列番号５２）は、ｏｒｆ２７９（稔性）およびＣｈｒＵｎ ＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎｇ由来のゲノム配列（ＩＷＧＳＣ＿Ｖ１）に特異的である。
－ オリゴヌクレオチドＡＳ２（配列番号５３）は、正常細胞質配列（稔性）に特異的である。
－ オリゴヌクレオチドＣ（配列番号５４）は、配列間で共通である。
－ オリゴヌクレオチドＡＳ１（配列番号５２）は、ｏｒｆ２７９（稔性）およびＣｈｒＵｎ ＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎｇ由来のゲノム配列（ＩＷＧＳＣ＿Ｖ１）に特異的である。
－ オリゴヌクレオチドＡＳ２（配列番号５３）は、正常細胞質配列（稔性）に特異的である。
－ オリゴヌクレオチドＣ（配列番号５４）は、配列間で共通である。
ＡＳ２／Ｃの対は、正常細胞質配列（稔性）に特異的である。プライマーの位置は、ゲノムパラログの増幅を除外するように最適化している（稔性細胞質配列由来の１０コピーを超えるゲノムパラログコピーが同定されている）。
ＡＳ１／Ｃの対は、ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ細胞質配列（稔性）に特異的である。
このような３つのプライマーは、ゲノムＤＮＡから開始するＰＣＲ増幅実験（Ｋａｓｐａｒプロトコール、ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）において同時に使用し得る（ハイブリダイゼーション温度＝５７℃）。エンドポイント蛍光リードおよび試料のクラスター解析により、
－ Ｖｉｃ蛍光は不稔性植物
－ Ｆａｍ蛍光は稔性植物
を示すことが明らかとなる。
－ Ｖｉｃ蛍光は不稔性植物
－ Ｆａｍ蛍光は稔性植物
を示すことが明らかとなる。
図７では、右側のクラスターは、稔性植物においてＡＳ２を有する正常細胞質の増幅である。左側のクラスターは、不稔性植物（Ｔ－ＣＭＳ細胞質を内包する植物）においてＡＳ１を有するｏｒｆ２７９の増幅である。
参考文献
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Claims (18)
- 配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列のＯｒｆ２７９タンパク質をコードする単離核酸。
- 配列が配列番号１に示される、請求項１に記載の単離核酸。
- コムギ植物、種子またはバルクの種子においてｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質を検出するための方法であって、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質試料を抽出し、ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質を手段により検出するステップを含む、前記方法。
- ａ．ａｔｐ８と配列番号３の間の組換え接合部に、もしくは配列番号３内にマーカーを有する不稔性細胞質を検出するステップ、または、
ｂ．雄性不稔性コムギ植物においてｏｒｆ２７９発現の変動を検出するステップ、
を含む、請求項３に記載の方法。 - ａ．ＯＲＦ２７９組換え接合部、もしくは配列番号３を認識する分子マーカーおよびプライマー、または、
ｂ．Ｏｒｆ２７９を認識する抗体、
を含む、ｏｒｆ２７９ＤＮＡ、ｏｒｆ２７９ＲＮＡまたはＯｒｆ２７９タンパク質の検出のための手段。 - ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合可能なタンパク質をコードする機能性Ｒｆ遺伝子を同定するための方法であって、
ａ．ＰＰＲコードに従ってコムギ植物ゲノムにおいて同定された各Ｒｆ遺伝子によりコードされるタンパク質の標的ＲＮＡ配列を予想するステップ、
ｂ．予想された各標的ＲＮＡ配列を配列番号３とともにアラインメントするステップ、
ｃ．配列番号３との少なくとも９５％の同一性を示す標的ＲＮＡ配列に結合可能なタンパク質をコードするＲｆ遺伝子を同定するステップ、
ｄ．任意選択で、選択されたＰＰＲモチーフの５および３５番目のアミノ酸を変更して、配列番号３とのＰＰＲコードによる適合を向上させることにより、選択されたＲｆタンパク質の配列を最適化するステップ、または、
ａ．Ｒｆ候補遺伝子を含む発現カセットを用いてコムギ植物を形質転換するステップであって、前記コムギ植物が、ｏｒｆ２７９を発現する不稔性細胞質を含む、前記ステップ、
ｂ．形質転換植物においてｏｒｆ２７９発現のレベルを検出するステップ、
ｃ．ｏｒｆ２７９発現のレベルが非形質転換植物と比較して低下する植物を選択するステップ、
ｄ．機能性Ｒｆ遺伝子を同定するステップ、
を含む、前記方法。 - ｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合し、その発現を防止することが可能な合成ＰＰＲタンパク質の設計および最適化のための方法であって、前記合成ＰＰＲにより稔性が回復している、前記方法。
- 請求項７に記載の方法により得ることが可能な合成ＰＰＲタンパク質。
- 配列番号２２に示される、請求項８に記載の合成ＰＰＲタンパク質。
- 請求項８または９に記載のｏｒｆ２７９ＲＮＡに結合する合成ＰＰＲを発現する植物。
- Ｏｒｆ２７９をコードする核酸配列を、植物において機能するプロモーターおよびミトコンドリア輸送ペプチドの下流に含む、組換え発現カセット。
- 請求項１１に記載の組換えカセットを発現する植物。
- コムギである、請求項１２に記載の植物。
- Ｏｒｆ２７９をコードする核酸配列を、植物において機能するプロモーターおよびミトコンドリア輸送ペプチドの下流に含む、組換え発現カセットを用いて、植物を形質転換することにより不稔性植物を得るための方法。
- ｏｒｆ２７９ＤＮＡ／ＲＮＡ結合または編集複合体をコードする遺伝子を含む組換え発現カセットを用いてコムギ植物を形質転換することにより稔性コムギ植物を得るための方法であって、前記ｏｒｆ２７９ＲＮＡ／ＤＮＡ結合または編集複合体を、植物において機能するプロモーターおよびミトコンドリア輸送ペプチドの下流にクローニングする、前記方法。
- ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ細胞質を内包する不稔性植物または正常細胞質を内包する稔性植物を検出するための方法であって、
ａ）植物からＤＮＡまたはＲＮＡ試料を抽出するステップ、
ｂ）ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ配列の存在または非存在を、適するプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により検出するステップ、
ｃ）任意選択で、正常細胞質配列の存在または非存在を、適するプライマー対を用いたＰＣＲ増幅により検出するステップ、
ｃ）前記植物の稔性または不稔性状態を判定するステップ、
を含む、前記方法。 - ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ配列を増幅するステップｂ）が、配列番号５２および５４のプライマー対を使用して実施され、任意選択で、正常細胞質配列を増幅するステップが、配列番号５３および５４のプライマー対を使用して実施される、請求項１６に記載の方法。
- ｏｒｆ２７９Ｔ－ＣＭＳ配列を増幅する配列番号５２および５４のプライマー対と、任意選択で、正常細胞質配列を増幅する配列番号５３および５４のプライマー対とを含む、ｏｒｆ２７９の存在または非存在を判定するための診断マーカー。
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| CN117844863B (zh) * | 2024-03-06 | 2024-05-17 | 云南师范大学 | 一种马铃薯线粒体靶向表达载体、构建方法及应用 |
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