JP2022519345A - 癌、アテローム硬化症、糖尿病およびｃｎｓの疾患の将来の発症に対する早期マーカーとしてならびにこれらの疾患の治療および予防のための標的としてのｃｍｉ配列 - Google Patents

癌、アテローム硬化症、糖尿病およびｃｎｓの疾患の将来の発症に対する早期マーカーとしてならびにこれらの疾患の治療および予防のための標的としてのｃｍｉ配列 Download PDF

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Abstract

CMI(牛乳単離物)ヌクレオチド配列ならびに該ヌクレオチド配列の一部を含むプローブおよびプライマーならびに該ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対する抗体が記載される。該化合物は、癌、糖尿病、アテローム硬化症およびCNSの疾患(多発性硬化症MS、プリオン関連疾患、筋萎縮性側索硬化症、伝染性海綿状脳症、パーキンソン病、アルツハイマー病)の将来の発症のための早期マーカーとして有用であり、治療および予防のための標的を示すはずである。

Description

本発明は、CMI(牛乳単離物(Cow Milk Isolate))ヌクレオチド配列ならびに該ヌクレオチド配列の一部を含むプローブおよびプライマーならびに該ヌクレオチド配列にコートされるポリペプチドに対する抗体に関する。最終的に、本発明は、癌、アテローム硬化症、糖尿病およびCNSの疾患などの疾患の将来の発症に対するの早期マーカーならびにこれらの疾患の治療および予防のための標的としての該化合物の使用に関する。
背景
新規のウイルスおよびファージのゲノムの多数のセットは過去数年間に同定されている。これらは、ヒトマイクロバイオーム(Kowarsky et al., 2017; Fernandes et al., 2018)または他の供給物由来の試料の分析を通じて同定された。メタゲノミック(metagenomic)分析が一般的に適用される(Rosario et al., 2012; Gronenborn et al., 2018; Wang et al., 2018; Kazlauskas et al., 2018; Kraberger et al., 2015; Varsani et al., 2018)が、より伝統的な技術の適用も、いくつかの新規の感染性因子の同定をもたらした(de Villiers et al., 2009; Peretti et al., 2015; zur Hausen and de Villiers, 2015)。分析はほとんど、他の公知の薬剤との比較または集合したゲノム中の複製遺伝子の同定に頼った。不運にも、いくつかの試験は、まだ未知であるかまたは推定の新規の感染性因子を同定するためにはより少ない注意を払いながら、公知の感染性実体の存在のみに集中した(Moustafa et al., 2017; Sadeghi et al., 2017; Legoff et al., 2017)。キメラゲノムの発見は、感染性因子の特定の種類または群の間の厳密な境界を弱め、その系統発生的な起源を調べる試験をもたらした(Kurpovic, 2013; Krupovic et al., 2015; Roux et al., 2013; Wawrzyniak et al., 2017; Kazlauskas et al., 2017)。
結腸癌および乳癌の疫学に対して公開されたデータは、乳牛由来の製品の消費の後にこれらの癌についての恐らくは種特異的なリスクとして、これらの動物由来の牛乳および牛肉因子(milk and meat factor)(BMMF)を示唆した(zur Hausen, 2012; 2015; zur Hausen and de Villiers, 2015; zur Hausen et al., 2017; 2018)。推定Rep遺伝子は、利用可能な配列に対するインシリコ(in silico)の比較により得られたBMMFのDNA配列の一部として同定された。rep遺伝子中の隣接するプライマーを使用した増幅により、ウシ血清から完全および部分的環状DNAゲノムの単離がもたらされた(Funk et al., 2014)。これは、特定の環状一本鎖DNAゲノムの存在について、市販の乳製品由来の試料にまで拡大された。(約1100～3000ヌクレオチド)の14の異なる単離物の全長環状一本鎖DNA分子がクローニングされて配列決定された(Whitley et al., 2014; Gunst et al., 2014; Funk et al., 2014; Lamberto et al., 2014)。ヒトの脳および血清(全ては多発性硬化症を有する患者由来)から、4つのさらなる単離物が得られた(Whitley et al., 2014; Gunst et al., 2014; Lamberto et al., 2014)。18個の単離物を、それらの分子的特徴に従って、BMMF1～BMMF4の4つの異なる群に分けた(zur Hausen et al., 2017)。これらの群の3つは、アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii)およびサイクロバクター(Psychrobacter)プラスミドとの顕著な程度の類似性を明らかにした。4つの群は、ジェミシルラーウイルス属(Gemycirularviridae)の代表である3個の単離物を含んだ。全ての4つのBMMF群の代表を、遺伝子活性の発現およびヒト細胞における複製について分析した(zur Hausen et al., 2017; Eilebrecht et al., 2018)。
したがって、本発明の基礎にある技術的な課題は、癌、アテローム硬化症、糖尿病またはCNSの疾患などの疾患に関連し得る特定のヌクレオチド配列を同定すること、したがって診断および治療のための手段を提供することである。
本発明の簡単な説明
前記の技術的な課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる態様を提供することにより達成される。
最近、環状DNAゲノム(健常な畜牛血液単離物(Healthy Cattle Blood Isolate)：HCBI1、HCBI2およびHCBI7)が、健常な畜牛からの血清から単離された(Funk et al., 2014)。これらの単離物は、以前に記載されたSphinx2.36 (acc. no HQ444405, Manuelidis et al., 2011, zur Hausen et al., 2017)に対するそれらのヌクレオチド同一性に基づいて、BMMF2としてグループ分けされた。これらの構成要素のいくつかのDNA配列およびオープンリーディングフレームは、ヒツジおよびヒトの伝染性海綿状脳症(spongiform encephalopathies)(TSE)疾患についてのTSEにおいて既に記載された2つの配列に対する認識可能な関係を示した。
TSE単離物はまた、癌の誘導において役割を果たすように仮説が立てられている(Manuelidis, 2011)。本発明の発明者らは、具体的に、結腸癌、乳癌および前立腺癌さらに、ホジキン病および他のもの、ならびにCNSの疾患、例えば多発性硬化症MS、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病における感染の役割を仮定した(zur Hausen, 2012, zur Hausen et al., 2017, 2018)。
本発明者らはその後、それらのRep遺伝子の高度に保存された領域中で重なる、隣接するPCRプライマーの2つの組を使用して、全長環状DNA分子を増幅した。本発明者らは、この群のさらなるメンバーの存在について、16個の牛乳生成物、主に牛乳試料を分析した。2102～3090の範囲のヌクレオチドのサイズのBMMF2群に属する97個の単離物(16個の牛乳生成物、81個の牛乳)の全長環状ゲノムを作製し、本願において特許請求される23個の配列(全ては牛乳試料に由来し、全てはBMMF2群に属する(all from cow milk samples and all belonging to the BMMF2 group)；C2MI)はそれらの代表的なメンバーである。本発明によると、用語「牛乳試料」は、牛乳および牛乳生成物(例えばヨーグルト、チーズ、ケフィア、クリームチーズ、クリーム、カテージチーズ、粉乳、サワークリーム等)を含む。全ての利用可能なDNAデータバンクに対するBLASTN比較により、主にアシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumanii)のプラスミド、(アシネトバクター・バウマンニ株AYEプラスミドp4ABAYE、acc. no CU459139、アシネトバクター・バウマンニ株A85プラスミドpA85-1, acc. no CP021783およびアシネトバクター・バウマンニ株DS002プラスミドpTS236 acc. no JN872565, Longkumar et al., 2013)、さらにラット腸由来ssDNA単離物(pRGRH0103 acc. no LN852793およびpRGRH0636 acc. no. LN853262)に対する類似性が明らかになった。p4ABAYEのヌクレオチド配列は、66の位置でpA85-1と異なる(Hamidian et al., 2014)。
代替的な開始コドンを使用してそれぞれのゲノムに対して推定オープンリーディングフレーム(ORF、>50aa)のインシリコ分析を行った(Kearse and Wilusz, 2017)。これは、プラスのDNA鎖上で、主に2つのさらなる主要なORFを有するそれぞれの単離物において複製遺伝子の同定を生じた。コードされた推定タンパク質は、それぞれ101～138アミノ酸および96～148アミノ酸のサイズの範囲であった。さらなるより小さなORFはランダムに存在した。複数のORF(平均数2～10、125アミノ酸のサイズまで)はリバース鎖上で同定された。後者の推定タンパク質のBLASTP分析により、既知のタンパク質に対して全くないかまたは非常に弱い類似性が明らかにされた。
BMMF2 Repタンパク質の特徴付け
細菌性プラスミドは、それらのレプリカーゼ遺伝子のヌクレオチド相同性に基づいて分類される(Bertini et al., 2010)。本発明者らは、全てのBMMF2およびBMMF1単離物の推定Repタンパク質を比較した。系統発生的分析においてコア保存領域(329aa)を使用した。BMMF2 repタンパク質は2つのクレード(AおよびB)にグループ分けされたが、BMMF1 repタンパク質は第3のクレード(C)を形成した。クレードAおよびBは60～65%の類似性を共有した。クレードAにおけるrepタンパク質は、クレード内で69～90%の類似性を共有し、p4ABAYE repに対して70～82%を共有した。同様に、クレードB repタンパク質は、クレード内で80～90%を共有し、p4ABAYE repに対して59～62%を共有した。BMMF1のrepタンパク質(クレードC)は、より多様であり、クレードAおよびBに対して類似性をほとんど共有しなかった(10～12%)。
いくつかのBMMF2単離物の推定repタンパク質は、1つのORFのみからは生じなかったが、1つより多くの切断ORFから集められた。これらの中断されたBMMF2ゲノム中に潜在的なイントロンが存在するかどうかを確かめるために、本発明者らは、GENSCAN分析(Burge and Karlin, 1997)を行った。このツールは、原核生物、真核生物および植物における遺伝子を同定するために開発された。本発明者らは、これらの遺伝子をそれぞれの全長ゲノムと整列した。プラスミドp4ABAYEを含むほとんど全ての単離物におけるポリアデノシンテイル(ポリA)の存在がGENSCAN生成物において非常に顕著である。ポリAは、細胞質への輸送のためおよびその後の翻訳のためにmRNAを安定化することにより、ほとんど全ての真核生物のRNA転写産物の成熟において重要な役割を果たす(Curinha et al., 2014)。
図面の簡単な説明
略語：
Rep=複製タンパク質；
CMI：畜牛乳単離物
C2MI：BMMF2群に属する畜牛乳単離物
HCBI：健常な畜牛血液単離物
Sphinx：可変(X)潜伏期の遅進行性隠れ感染(slow progressive hidden infection of variable (X) latency)
図1～22：C2MI.1A.2 (図1)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.3A.2 (図2)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.4B.3 (図3)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.5A.4 (図4)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.5B.6 (図5)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.7A.5 (図6)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.7A.8 (図7)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.7B.17 (図8)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.8B.4 (図9)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.8B.6 (図10)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.8B.7 (図11)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.9A.1 (図12)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.9A.3 (図13)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.9B.4 (図14)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.9B.10 (図15)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.9B.11 (図16)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.9B.14 (図17)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.9B.15 (図18)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.10A.1 (図19)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.15B.9 (図20)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.15B.17 (図21)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。 C2MI.16B.10 (図22)のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
本発明の詳細な説明
本願において、CNSの疾患(例えば多発性硬化症MS、筋萎縮性側索硬化症、伝染性海綿状脳症/プリオン関連疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病)、糖尿病、アテローム硬化症ならびに結腸癌、乳癌および前立腺癌の病因についての新しい概念が提示される。
CNSの疾患について、ウイルスを増幅することおよび牛肉および牛乳因子(Bovine Meat and Milk Factor)(BMMF)の増幅されたDNAの相互作用は、それらの発症に役割を果たす(zur Hausen et al., 2017)。
2つのリスク因子：異なる、優先的なヘルペス群のウイルスのあり得る役割を指し示す比較的一貫した結果、および潜在的に他の乳製品を含む新鮮な牛乳の消費が、特に注意する価値があるように思われる。また、ビタミンD欠乏はリスク因子としての役割を果たす。
-ウイルスリスク因子
明らかに全てのヘルペスウイルス型は、以下の議論に関連があると思われる2つの特性を共有する：
潜伏期におけるそれらの残存の間、特定の遺伝子機能により、また部分的に後成的な機構によっても部分的に制御される自発的な再活性化が起こり得る。再活性化はまた、トランスホーミング成長因子βなどの細胞外サイトカインとの相互作用により引き起こされ得る。
溶解サイクルの自発的な誘導は、事実上全てのヒト病理学的ヘルペスウイルス型について観察されている。エプスタインバーウイルス陽性バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌におけるEBV構造タンパク質に対する高い抗体力価は、本明細書において一例となり得る。ヒトヘルペスウイルス6型、水痘-帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルスおよび他のものの再活性化は、まれな事象ではなく、いくつかの異なる細胞型に影響を及ぼし得る。
ヘルペスウイルス感染の第2の顕著な特性は、潜伏期におけるかかるDNAを含む細胞の感染の際の種々の二本鎖または一本鎖小DNAウイルスゲノムの増幅である。これは、ヒトおよびサルポリオーマウイルス、JCおよびSV40について、ヒトおよびウシパピローマウイルスについて、ならびに一本鎖アデノ随伴(AAV)およびAnello-/TTウイルスについて注意されている。
ヘルペス群ウイルスの自発的誘導および潜伏性の小ウイルスDNAの増幅は、CNSの疾患の下にある機構のその後の推定のための基礎を形成する。
-牛肉および牛乳因子(BMMF)
低温殺菌されていない牛乳の消費とMS発症の間の相関は、特に低温殺菌されていない牛乳を人生の初期に消費した場合に観察される(zur Hausen, 2017; zur Hausen, 2018)。
-ビタミンD欠乏
ビタミンD欠乏の役割は、MSの開始について繰り返し影響を与えている。
ビタミンD欠乏とエプスタインバーウイルス再活性化の間の説得力のある関係は、トランスホーミング成長因子β(TGF-β)によるEBV再活性化についての初期の研究から始まる。エプスタインバーウイルス誘導因子(EIF)として精製されて命名される血清因子は、後述されるTGF-β分子と同一であることが報告されている。TGF-βも、活性化されたビタミンD受容体により負に制御される。これは、MSおよび悪化の季節に関連する優先的な開始を非常に良く説明し得た。
したがって、ビタミンD欠乏および種々のヘルペス群ウイルス、主にエプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス6型および水痘-帯状疱疹ウイルスの再活性化の少なくとも2つの要因が、CNSの疾患(例えばMS)および癌(例えば結腸癌および乳癌)の両方についての潜在的な病因論的な一因として影響を与える。
したがって、本発明者らにより、CNSの疾患、特に多発性硬化症(MS)、パーキンソン病、ALSまたはアルツハイマー病は、以下のことにより生じると考えられる。
・2つの異なる感染性因子による同じ細胞の潜伏的な感染、ここでそのうちの1つはヘルペス型ウイルス(特に、EBV、HHV-6、VZV、さらにHSV、HHV-7)が最も可能性があり、他の1つは第1の事象として牛乳消費(牛乳因子(bovine milk factor)-BMF)により獲得される。それらのそれぞれは、潜在的に個々の細胞に感染するが、場合によっては両方の因子のゲノムが同じ細胞内に生じる。
・第2の前提条件として、最も頻繁にはヘルペス型ウイルスであるがそれだけではなくエプスタインバーウイルス(EBV)の、溶解サイクルへの再活性。EBVについて、これはおそらくは、活性化されたビタミンD受容体により負に制御されるトランスホーミング成長因子β(TGFβ)のレベルの増加に関連がある；
・第3の事象として、ヘルペス型DNA合成の部分的な抑制およびBMF粒子の形成またはその核酸の神経相互連結を介した隣接する細胞への拡散を生じるBMMFの増幅；
・この後に、隣接する細胞の、BMMFタンパク質の発現による感染が続く；
・最終的に、BMMFに対するT細胞応答は、罹患した細胞の破壊およびMSの場合はプラーク形成をもたらす。これは、一般的に早期の病変において中心静脈および強い局在化した免疫応答から始まる、病変の病巣出現の臨床的な観察を支持する。
インスリン依存型真正糖尿病またはアテローム硬化症のリスクも、牛乳消費およびビタミンD欠乏に繰り返し関連付けられている。後者の系は、MSの状況に特に近くなると思われる。
この考えはまた、ビタミンD欠乏の条件下で高い頻度で起こる他のありそうな自己免疫疾患および特定の癌にも適用され得る。癌が考えられる限り、これは特に結腸癌および乳癌の原因、おそらくは卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌および肺癌の原因である。
結腸癌に関して、本発明者らは、離乳の間の***栄養補給を牛乳生成物または牛乳生成物の摂取と置き換えることのいずれかによる人生の最初の数か月以内のBMMF(牛肉および牛乳因子)剤の摂取は、一般的に、結腸でBMMF抗原による新生児の早期の感染を引き起こすことを見出した。人生の非常に初期の間の母性抗体の衰えおよび新生児の免疫耐性の誘導にしばしば関連付けられる頻繁に観察される免疫系の弱さに基づいて、これらの因子は、結腸免疫応答を直接回避し得るかまたはこれらの因子に対する免疫耐性の状況が誘導され得るかのいずれかである。次の数年または数十年以内に、宿主の免疫系に依存して、ますますのBMMF抗原が、粘膜固有層の間葉領域内に蓄積する。この蓄積は、BMMFの受容体であり得る特定の分子の摂取によっても引き起こされ得る。これらの分子は、ウシ生成物の消費によっても摂取され、宿主細胞の表面上で受容体へと代謝される。感染の病巣拡散と組み合わせてBMMFの連続的な摂取によりあるレベルの抗原が達成される場合、宿主免疫応答は、反応性酸素種(ROS)およびシクロオキシゲナーゼ2(Cox-2)の安定な増加を生じる慢性および局所的な炎症の状態を誘導し、これは、ROSにより誘導される周囲の細胞におけるランダム変異の同時発生的な固定を伴う制御されない細胞増殖の可能性を劇的に増加させる。
Ki67 (Ki67：増殖マーカー)IHC染色に基づく利用可能な結果は、特に、陰窩の終点の近くに位置し、陰窩の遠位管腔部へと移動する上皮幹細胞由来の基底上皮細胞は、腫瘍形成のための基本的な要件としての変異および結腸癌の発症の確率論的表示を可能にする、固有の高い増殖を特徴とすることを示す。したがって、BMMFは、間葉組織内の慢性炎症の誘導のための特異的かつ局所的な誘発因子であり、これは周囲の上皮細胞の増殖および変異を誘導するROSの増加をもたらし、最終的に、結腸癌の供給源としてのポリープの形成をもたらす。
したがって、本発明は：
(a)図1(A)～22(A)のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
(b) (a)のヌクレオチド配列に対して少なくとも93%の同一性を有するヌクレオチド配列；
(c) (a)もしくは(b)のヌクレオチド配列の断片；
(d) (a)、(b)もしくは(c)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；または
(e)上述のヌクレオチド配列のいずれかと比較して遺伝子コードの縮重の結果として重複するヌクレオチド配列
を含む、C2MIポリ核酸に関する。
用語「ポリ核酸」は、一本鎖または二本鎖の核酸配列をいう。ポリ核酸は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログもしくは改変されたヌクレオチドからなり得るか、または診断もしくは治療目的に適合され得る。ポリ核酸はまた、例えばクローニング目的で使用され得る二本鎖cDNAクローンを含み得る。
本発明のC2MIポリ核酸は、例えば(a)試料から全DNAまたはRNAを単離すること、(b)ハイブリダイゼーションまたはPCRによりCMI配列を検出することおよび(c) C2MI配列をベクターにクローニングすることにより、周知の常套的な方法に従って調製され得る。
主にオリゴヌクレオチドの最終末端(3'または5'のいずれか)でさらにオリゴヌクレオチド内で1つ以上のヌクレオチドの欠失および/または挿入のいずれか、特に1つ以上のコドンの挿入または欠失を含み、本発明の該ポリ核酸配列に対して少なくとも93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性ならびに組換えを示す、本発明の配列バリアントおよびポリ核酸の組換え体も本発明に含まれる。図1～22に示される配列に類似する本発明によるポリ核酸配列は、配列特異的プライマーによる増幅、よりストリンジェントであるかまたはそうではない条件下で配列特異的プローブを用いたハイブリダイゼーション、C2MIの遺伝子情報の配列決定などの当該技術分野で公知の技術のいずれかに従って特徴付けられ得、単離され得る。
本発明はまた、複製タンパク質をコードする複製遺伝子を有する上述の本発明のヌクレオチド配列の機能的断片を提供する。自律複製ヌクレオチド配列は、自律複製を誘導し得る複製遺伝子またはその断片のヌクレオチド配列を含む。複製タンパク質は、複製の起点でまたはその近位で一本鎖切断を誘導する一本鎖DNAに結合するエンドヌクレアーゼである(Wolds, 1997)。当業者は、過度の実験無しで、自律複製を誘導し得るかかる断片を誘導し得る。かかる断片は、少なくとも45、少なくとも55または少なくとも65ntの長さを有し得る。
当業者は、どの核酸配列が、図1～22のヌクレオチド配列に関連するかまたはその断片であり、全長配列と同じ機能を依然として有するかを標準的なアッセイを使用して、容易に決定し得る。
本発明はまた、上述のヌクレオチド配列のいずれかと比較して、遺伝コードの縮重の結果として重複するポリ核酸配列を提供する。したがって、これらのバリアントポリ核酸配列は、それらが由来するポリ核酸と同じアミノ酸配列をコードする。
本発明のC2MIポリ核酸は、染色体外エピソームとして存在し得、宿主のゲノムに組み込まれ得るかおよび/または宿主細胞DNAに連結され得る。
本発明はまた、上で定義されるポリ核酸の一部を含むかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドプライマーに関し、該プライマーは、本発明のC2MIポリ核酸を配列決定するかまたは特異的に増幅するためのプライマーとして働き得る。
用語「プライマー」は、コピーされる核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成のための開始点として働き得る一本鎖DNAオリゴヌクレオチド配列をいう。プライマーの長さおよび配列は、それらが伸長産物の合成を準備することを可能にするようなものでなければならない。好ましくは、プライマーは約5～50ヌクレオチドである。特定の長さおよび配列は、必要とされるDNAまたはRNA標的の複雑さ、ならびに温度およびイオン強度などのプライマー使用の条件に依存する。
増幅プライマーは、適切な増幅を保証するために、対応する鋳型配列と正確に適合する必要はないという事実は、許容される原理である。使用される増幅方法は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、核酸配列ベース増幅(nucleic acid sequence-based amplification) (NASBA)、転写ベース増幅系(transcription-based amplification system) (TAS)、鎖置換増幅(strand displacement amplification) (SDA)もしくはQbレプリカーゼによる増幅またはプライマー伸長を使用して核酸分子を増幅するための任意の他の適切な方法であり得る。増幅の間に、増幅された産物は、標識されたプライマーを使用して、または標識されたヌクレオチドを組み込むことのいずれかで標識され得る。特定の好ましい態様において、本発明のC2MI配列は、全長環状DNA分子を増幅するためのそれらのRep遺伝子の高度に保存された領域中で重なる二組の隣接するPCRプライマーを使用して得られている。本発明の全てのC2MI単離物は、バック-対-バックプライマーペアAまたはB(5p->3p)を使用して単離された。配列名中の「A」または「B」は、これらの2つのプライマーペアを示す。
プライマーペアA:
>LSconAfwd
aaggcagatcaacacagg
>LSconArev
agcagattgcaaagcctg
プライマーペアB:
>LSconBfwd
caacacagggatagaataac
>LSconBrev
atctgccttagcagattgc
標識は、同位体(32P、35S等)または非同位体(ビオチン、ジゴキシゲニン等)であり得る。増幅反応は、20～70回、有利には25～45回反復される。
当該技術分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、遺伝子情報を直接配列決定し得、試料の配列を対応するアミノ酸配列に翻訳することによりORFを決定し得る。例示的な配列決定反応としては、サンガーまたはマキサムおよびギルバートにより開発された技術に基づくものが挙げられる。質量分析による配列決定を含む目的のアッセイを行う場合に、種々の自動化された配列決定手順が使用され得ることも企図される(例えばPCT公報WO 94/16101参照)。例えば、配列決定反応において2つまたは3つのみの核酸塩基の出現が決定される必要があることが当業者に明らかである。
好ましくは、これらのプライマーは、約5～50ヌクレオチド長、より好ましくは約10～25ヌクレオチドである。少なくとも13塩基の長さを有するプライマーが最も好ましい。
本発明はまた、上で定義されたC2MIポリ核酸の一部を含むかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドプローブに関し、該プローブは、本発明によるC2MIポリ核酸の特異的な検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして働き得る。
該プローブは、標識され得るかまたは固相支持体に取り付けられ得る。
用語「プローブ」は、検出されるC2MIポリ核酸の標的配列に相補的な配列を有する一本鎖の配列特異的オリゴヌクレオチドをいう。
好ましくは、これらのプローブは約5～50ヌクレオチド長、より好ましくは約10～25ヌクレオチドである。少なくとも13塩基の長さを有するプローブが最も好ましい。
用語「固相支持体」は、オリゴヌクレオチドプローブが連結され得る任意の基材をいい得るが、ただし、プローブはそのハイブリダイゼーション特性を保持し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルは低いままである。通常、固体基材は、マイクロタイタープレート、膜(例えばナイロンまたはニトロセルロース)またはマイクロスフィア(ビーズ)である。膜に適用するかまたは固定の前に、固定を容易にするためまたはハイブリダイゼーション効率を向上するために、核酸プローブを修飾することが都合よくあり得る。かかる修飾は、ホモポリマーテイリング、脂肪族基、NH2基、SH基、カルボキシル基などの異なる反応性基とのカップリング、またはビオチンもしくはハプテンとのカップリングを含み得る。
プライマーまたはプローブとして使用される本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート(alkylphosphoriates)もしくはペプチド核酸などのヌクレオチドアナログを含み得るかまたはそれらからなり得、あるいはインターカレート剤を含み得る。これらの修飾は、必要とされる特異性および感度を得るためにオリゴヌクレオチドが使用されるべき条件に関して、適合を必要とする。しかしながら、最終的な結果は、修飾されないオリゴヌクレオチドを用いて得られるものと本質的に同じである。
これらの修飾の導入は、例えばハイブリダイゼーション速度論、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性などの特性に正に影響を及ぼすために、有利であり得る。
本発明のポリ核酸は、任意の種類の組成物に含まれ得る。該組成物は、診断的、治療的または予防的な使用のためのものであり得る。
本発明はまた、原核生物、真核生物またはウイルスの転写および翻訳制御因子に操作可能に連結される、上で定義された本発明のC2MIポリ核酸を含む組換え発現ベクターならびにかかるベクターを含む宿主細胞に関する。
用語「ベクター」は、プラスミド、コスミド、人工染色体、ファージまたはウイルスもしくはトランスジェニック非ヒト動物を含み得る。例は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはレトロウイルスなどのRNAウイルスである。
本発明の文脈内で使用される用語「組換え発現」は、本発明のポリペプチドが、原核生物、または以下に詳細に議論される下等もしくは高等真核生物内にある場合に組換え発現方法により産生される事実をいう。
用語「宿主細胞」は、組換えベクターもしくは他の転移ポリヌクレオチドのレシピエントとして使用され得るかまたは使用されている、およびトランスフェクトされた起源細胞の子孫を含む細胞をいう。
単一の親細胞の子孫は、形態もしくはゲノム的にまたは全DNA相補物において、自然の、偶然のもしくは意図的な変異または組み換えのために、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。
用語「下等真核生物」は、例えば酵母、真菌などの宿主細胞をいう。下等真核生物は一般的に(必ずしもそうではないが)、単細胞である。好ましい下等真核生物は、酵母、特にサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、クルイウェロミセス属(Kluiveromyces)、ピキア属(Pichia)(例えばピキア・パストリス(Pichia pastoris))、ハンゼヌラ属(Hansenula)(例えばハンゼヌラポリモルフ(Hansenula polymorph))、シュワニオミセス属(Schwaniomyces)、シゾサッカロミセス属、ヤロウイア属(Yarowia)、ジゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)等内の種である。サッカロミセス・セレビシエ、S.カールスベルゲンシス(S. carlsbergensis)およびK.ラクティス(K. lactis)は、最も一般的に使用される酵母宿主であり、都合の良い真菌宿主である。
用語「高等真核生物」は、例えば哺乳動物、爬虫類、昆虫などの高等動物由来の宿主細胞をいう。本発明の好ましい高等真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター(例えばCHO)、サル(例えばCOSおよびベロ(Vero)細胞)、新生児ハムスター腎臓(BHK)、ブタ腎臓(PK15)、ウサギ腎臓13細胞(RK13)、ヒト骨肉腫細胞株143 B、ヒト細胞株HeLaおよびHep G2などのヒト肝癌細胞株、293TT細胞株(Buck et al., 2004)ならびに昆虫細胞株(例えばツマジロクサヨトウ)由来である。宿主細胞は、懸濁またはフラスコ培養、組織培養、臓器培養等中で提供され得る。代替的に、宿主細胞はまた、トランスジェニック非ヒト動物であり得る。
用語「原核生物」は、大腸菌、乳酸桿菌属、ラクトコッカス属、サルモネラ属、連鎖球菌、枯草菌、アシネトバクター属またはストレプトミセス属などの宿主をいう。これらの宿主も本発明において企図される。
ベクター配列に挿入される所望の配列をコードするC2MI DNAの断片は、シグナル配列に連結され得る。該シグナル配列は、非C2MI供給源由来のものであり得るが、本発明による特に好ましい構築物は、タンパク質のそれぞれの開始点の前にC2MIゲノム内に現れるシグナル配列を含む。
高等真核生物は、ベクターで形質転換され得るか、または組み換えウイルス、例えば組み換えワクシニアウイルスで感染され得る。外来DNAのワクシニアウイルスへの挿入のための技術およびベクターは、当該技術分野で周知であり、例えば相同組換えを使用する。種々のウイルス性プロモーター配列、おそらくはターミネーター配列およびポリ(A)付加配列、おそらくはエンハンサー配列およびおそらくは増幅配列は、全てが哺乳動物発現に必要とされるが、当該技術分野で利用可能である。ワクシニアは、宿主細胞タンパク質の発現を停止するので、ワクシニアは特に好ましい。ヒトの予防接種のために、アビポックス(avipox)およびアンカラ改変ウイルス(Ankara Modified Virus)(AMV)が特に有用なベクターである。
ヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターであるバキュロウイルス オートグラファカリフォルニア(baculovirus Autographa californica)核多角体ウイルス(AcNPV)由来の昆虫発現転移ベクターも公知である。この系由来の発現ベクターは通常、強力なウイルス性ポリヘドリン(polyhedrin)遺伝子プロモーターを使用して、異種遺伝子の発現を駆動する。異種DNAのバキュロウイルスの所望の部位への導入のための異なるベクターおよび方法は、バキュロウイルス発現のために当業者に利用可能である。昆虫細胞により認識される翻訳後修飾のための異なるシグナルも当該技術分野で公知である。
本発明はまた、上に定義されるC2MIポリ核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは実質的に同様で生物学的に同等であるその一部もしくはアナログに関する。図1～22(B)および(und)(C)を参照する。
用語「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマーをいい、特定の長さの産物をいわない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等をいわないかまたは排除しない。例えばアミノ酸の1つ以上のアナログ(例えば非天然のアミノ酸、ペプチド核酸(PNA)等を含む)を含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方の当該技術分野で公知の他の改変が定義に含まれる。
本発明によるポリペプチドは、好ましくは少なくとも3、好ましくは4または5個の連続したC2MIアミノ酸、6または7、しかしながら好ましくは少なくとも8個の連続したC2MIアミノ酸、少なくとも10または少なくとも15個を含む。
本発明のポリペプチド、および特に断片は、古典的な化学合成により調製され得る。合成は均一な溶液中または固相中で行われ得る。本発明によるポリペプチドはまた、組換えDNA技術により調製され得る。本発明はまた、上で定義される組換えポリペプチドの産生のための方法に関し、該方法は：(a)適切な細胞性宿主の、上で定義されるポリ核酸またはその一部が適切な制御因子の制御下に挿入された組換えベクターでの形質転換、(b)該形質転換された細胞性宿主を、該挿入物の発現を可能にする条件下で培養することおよび(c)該ポリペプチドを採取することを含む。
本発明はまた、上で定義される少なくとも1つのポリペプチドでの免疫の際に生じる抗体に関し、該抗体は、該ポリペプチドのいずれかと特異的に反応性であり、該抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。用語「抗体」は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体、および別のモノクローナル抗体調製物に関する。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、例えば本発明のC2MIポリ核酸によりコードされるポリペプチドまたはその断片を含む抗原から作製される。本明細書で使用する場合、用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(Mab)は、タンパク質に特異的に結合し得る完全な分子および抗体断片(例えばFabおよびF(ab')2断片など)を含むことを意味する。FabおよびF(ab')2断片は、完全な抗体のFc断片を欠き、循環からより迅速に除去され、完全な抗体よりも低い非特異的組織結合を有し得る。したがって、これらの断片およびFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の目的に有用な抗体は、キメラ、一本鎖およびヒト化の抗体を含む。
本発明はまた、細胞媒介免疫応答を使用する診断的および治療的アプローチに関する。
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識を保有する。抗体/断片は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素により、直接または間接的に検出可能に標識され得る。当業者は、抗体に結合するための他の適切な標識のことを知っているか、または常套的な実験を使用してこのことを確認し得る。
本発明はまた、本発明のC2MIポリ核酸またはポリペプチドの存在の決定における使用のための診断キットに関し、該キットは、本発明のプライマー、プローブおよび/または抗体を含む。該キットは、当業者に周知の任意の形式を有し得、例えばELISA系キットであり得る。
本発明はまた、生物学的試料中に存在する本発明によるC2MIポリ核酸の検出のための方法に関し、該方法は：(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)上述のポリ核酸を、上で定義される少なくとも1つのプライマー、任意に標識されたプライマーで増幅する工程、および(c)増幅されたポリ核酸を検出する工程を含む。
用語「ポリ核酸」は、分析物鎖とも称され得、一本鎖または二本鎖ポリ核酸分子に対応する。
用語「標識された(labelled)」は、標識された核酸の使用をいう。これは、増幅のポリメラーゼ工程もしくは標識されたプライマーの間に、または当業者に公知の任意の他の方法による組み込まれる標識されたヌクレオチドの使用を含み得る。
本発明はまた、生物学的試料中に存在する本発明によるC2MIポリ核酸の検出のための方法に関し、該方法は：(a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)上述のポリ核酸と上で定義される少なくとも1つのプローブをハイブリダイズさせる工程、および(c)ハイブリダイズしたポリ核酸を検出する工程を含む。
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、ストリンジェントであると理解され、一般的に当該技術分野で公知である。しかしながら、ハイブリダイゼーション溶液(SSC、SSPE等)により、これらのプローブは、十分な特異性を達成するためにそれらの適切な温度でハイブリダイズされるべきである。
ハイブリダイゼーション溶液(SSC、SSPE等)により、これらのプローブは、十分な特異性を達成するために、それらの適切な温度でストリンジェントにハイブリダイズされるべきである。しかしながら、DNAプローブをわずかに改変することにより、プローブの末端(3'または5'のいずれか)で1つもしくはいくつかのヌクレオチドを付加もしくは欠失させることまたはいくつかの本質的でないヌクレオチド(すなわち型の間を識別するために必須ではないヌクレオチド)を他のもの(改変されたヌクレオチドまたはイノシンを含む)で置換することのいずれかにより、これらのプローブまたはそのバリアントは、同じハイブリダイゼーション条件(すなわち同じ温度および同じハイブリダイゼーション溶液)で特異的にハイブリダイズするようになり得る。使用されるプローブの量(濃度)を変えることも、より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るために有益であり得る。この文脈において、そのGC含有率に関係なく同じ長さのプローブは、TMACI溶液中適切に同じ温度で特異的にハイブリダイズすることに注意すべきである。
オリゴヌクレオチドプローブと試料中のC2MIポリ核酸配列の間で形成されたハイブリッドを検出するための本発明の目的のための適切なアッセイ方法は、従来のドットブロット形式、サンドイッチハイブリダイゼーションまたはリバースハイブリダイゼーションなどの当該技術分野で公知のアッセイ形式のいずれかを含み得る。例えば、検出は、ドットブロット形式、膜に結合した標識されない増幅された試料、適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で少なくとも1つの標識されたプローブと一体化された膜、ならびにモニタリングされている結合したプローブの存在を使用して達成され得る。
代替的で好ましい方法は、増幅された配列が標識を含む「リバース」ドットブロット形式である。この形式において、標識されないオリゴヌクレオチドプローブは、固相支持体に結合され、適切なストリンジェントなハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件下で標識された試料に暴露される。試料のポリ核酸と本発明のオリゴヌクレオチドプローブの間のハイブリッドの形成に頼る任意の他のアッセイ方法も使用され得ることが理解される。
本発明はまた、本発明のC2MIポリ核酸によりコードされるポリペプチドまたは生物学的試料中に存在する該ポリペプチドに対する抗体を検出するための方法に関し、該方法は：(a)上で定義されるかかるポリペプチドまたは抗体の存在について生物学的試料を接触させる工程、および(b)該抗体と該ポリペプチドの間で形成される免疫学的複合体を検出する工程を含む。
本発明によるイムノアッセイ方法は、本発明の新規で特有のポリペプチド配列の異なるドメイン由来の抗原を使用し得る。例えば単一または特異的なオリゴマー抗原、ダイマー抗原、ならびに単一または特異的なオリゴマー抗原の組合せを使用することは本発明の範囲内にある。本発明のC2MI抗原は、抗体または細胞媒介免疫応答を検出するために、公知の抗原を使用する実際に任意のアッセイ形式において使用され得る。したがって、本発明はまた、C2MI抗原に対する細胞媒介免疫応答の検出およびC2MI抗原に対する細胞媒介免疫応答に基づく治療干渉の適用を含む。
当然ながら、C2MIのコンホメーション的エピトープを変性させるアッセイ形式は、回避または適合されるべきである。これらのアッセイの全ての一般的な特徴は、抗原が構成要素中に存在する任意のかかる抗体に結合することを可能にする条件下で、抗原を、C2MI抗体を含むことが疑われる身体構成要素と接触させることである。かかる条件は、典型的に、過剰な抗原を使用した、生理学的な温度、pHおよびイオン強度である。抗原と検体とのインキュベーションの後に、抗原で構成される免疫複合体の検出が続く。
イムノアッセイの設計は多くの変形に供され、多くの形式は当該技術分野で公知である。プロトコルは、例えば固相支持体または免疫沈降を使用し得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、標識は、例えば酵素的、蛍光的、化学発光、放射性または色素の分子であり得る。免疫複合体からシグナルを増幅するアッセイも公知であり、その例は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンならびに酵素標識および媒介イムノアッセイ、例えばELISAアッセイを使用するアッセイである。
イムノアッセイは、不均一または均一な形式であり得、標準的または競合的な型であり得る。不均一な形式において、ポリペプチドは典型的に、固相マトリックスまたは支持体に結合して、インキュベーション後のポリペプチドからの試料の分離を容易にする。使用され得る固相支持体の例は、ニトロセルロース(例えば膜またはマイクロタイターウェル形態中)、ポリ塩化ビニル(例えばシートまたはマイクロタイターウェル中)、ポリスチレンラテックス(例えばビーズまたはマイクロタイタープレート中、ポリフッ化ビニリデン(polyvinylidine fluoride)(Immunolonとして公知)、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズおよびプロテインAビーズである。抗原性ポリペプチドを含む固相支持体は典型的に、該固相支持体を試験試料から分離した後で結合した抗体の検出前に洗浄される。標準的および競合的の両方の形式が当該技術分野で公知である。
均一な形式において、試験試料は、溶液中の抗原の組合せとインキュベートされる。例えば、これは、形成される任意の抗原-抗体複合体を沈殿させる条件下であり得る。これらのアッセイについての標準的および競合的の両方の形式が当該技術分野で公知である。
標準的な形式において、抗体-抗原複合体中のC2MI抗体の量は、直接モニタリングされる。これは、抗C2MI抗体上のエピトープを認識する(標識された)抗異種(例えば抗ヒト)抗体が複合体形成のために結合するかどうか決定することにより達成され得る。競合的な形式において、試料中のC2MI抗体の量は、複合体中の既知の量の標識された抗体(または他の競合するリガンド)の結合に対する競合的な効果をモニタリングすることにより推定される。
抗C2MI抗体(または競合アッセイの場合は競合抗体の量)を含む形成された複合体は、形式に応じて、いくつかの公知のもののいずれかにより検出される。例えば、複合体中の標識されないC2MI抗体は、標識(例えば酵素標識)と複合体化された抗異種Igのコンジュゲートを使用して検出され得る。
免疫沈降または凝集アッセイ形式において、C2MI抗原と抗体の間の反応は、溶液または懸濁液から沈殿するネットワークを形成し、沈殿物の可視的な層またはフィルムを形成する。試験検体中に抗C2MI抗体が存在しない場合、可視的な沈殿物は形成されない。
現在、3種類の特定の粒子凝集(PA)アッセイが存在する。これらのアッセイは、支持体に被覆される場合に、種々の抗原に対する抗体の検出のために使用される。このアッセイの1つの型は、抗原(または抗体)を赤血球(RBC)に受動的に吸着させることにより感作されるRBCを使用した血球凝集アッセイである。身体構成要素中に存在する特定の抗原/抗体の付加は、もしあれば、精製された抗原で被覆されたRBCを凝集させる。
血球凝集アッセイにおいてあり得る非特異的な反応を排除するために、PAにおいてRBCの代わりに2つの人工の担体を使用し得る。これらの最も一般的なものはラテックス粒子である。
選択される固相としては、ポリマー性またはガラスのビーズ、ニトロセルロース、微小粒子、反応トレイのマイクロウェル、試験管および磁性ビーズが挙げられ得る。シグナル発生化合物としては、酵素、発光化合物、色原体、放射性要素および化学発光化合物が挙げられ得る。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびβガラクトシダーゼが挙げられる。エンハンサー化合物の例としては、ビオチン、抗ビオチンおよびアビジンが挙げられる。エンハンサー化合物結合メンバーの例としてはビオチン、抗ビオチンおよびアビジンが挙げられる。
上述の方法は、サブゲノム(subgenomic)C2MIポリヌクレオチド配列自体または患者の細胞中の特定の宿主遺伝子もしくは遺伝子断片に連結された配列の存在の有害な効果のため、疾患、例えば癌もしくはCNSの疾患の発症のリスクを評価するために有用であり、適切な対策をとることを可能にする。
したがって、本発明はまた、本発明のC2MIウイルスポリ核酸に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはiRNAに関する。
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはiRNAの生成は、所望の効果、例えばポリペプチドの発現の阻害が生じるようにアンチセンス干渉を起こすためのC2MIポリ核酸内の部位(1つまたは複数)の決定を含む。好ましい遺伝子内部位は、(a)遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始もしくは停止コドンを含む領域または(b)「ループ」もしくは「バルジ(bulge)」である、すなわち二次構造の一部ではないmRNAの領域である。一旦1つ以上の標的部位が同定されたら、標的に対して十分に相補的である、すなわち十分良好におよび十分な特異性を伴ってハイブリダイズして所望の効果を生じるオリゴヌクレオチドが選択される。本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間でワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーンの水素結合があり得る水素結合を意味する。本明細書で使用する場合「相補的」は、2つのヌクレオチド間の正確な対形成のための能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドが、DNAまたはRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合し得る場合、該オリゴヌクレオチドと該DNAまたはRNAは、その位置で互いに対して相補的であるとみなされる。それぞれの分子内で十分な数の対応する位置が互いと水素結合し得るヌクレオチドにより占められる場合、オリゴヌクレオチドとDNAまたはRNAは互いに対して相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的の間で安定かつ特異的な結合が生じるように、十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的核酸の配列に対して100%相補的である必要はないことが当該技術分野において理解される。標的DNAまたはRNA分子への化合物の結合が標的DNAまたはRNAの正常な機能に干渉して、有用性の喪失を引き起こし、特異的な結合が望まれる条件下、すなわち治療的処置の場合、アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズ可能である。
(特にアンチセンス化合物の文脈において)「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーをいう。この用語は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖およびヌクレオシド間(骨格)共有結合ならびに同様に機能する天然には存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドを含む。例えば細胞性取込みの強化、核酸標的に対する親和性の強化およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの所望の特性のために、このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドはしばしば、天然の形態よりも好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、限定されないが、下記のものなどのオリゴヌクレオチド模倣物を含む他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合物は、約6～約50ヌクレオ塩基(すなわち約6～約50の連結したヌクレオシド)を含む。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、約15～約25ヌクレオ塩基を含むものがさらにより好ましい。アンチセンス化合物は、標的核酸にハイブリダイズしてその発現を阻害するリボザイム、外部ガイド配列(external guide sequences)(EGS)、オリゴヌクレオチド(オリゴザイム(oligozymes))、および他の短い触媒性RNAまたは触媒性オリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス化合物はまた、センス配列およびアンチセンス配列を含むiRNAを含み、ここでセンスおよびアンチセンス配列は、RNA二本鎖を形成し、アンチセンス配列は、本発明のC2MIポリ核酸のヌクレオチド配列に十分に相補的なヌクレオチド配列を含む。
代替的に、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを例えば哺乳動物宿主内で転写させるベクターを提供する。好ましくは、かかるベクターは、遺伝子治療に有用なベクターである。遺伝子治療に有用な好ましいベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはレトロウイルスなどのRNAウイルスである。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。本発明で使用し得るかかるレトロウイルスベクターの例は：モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)である。最も好ましくは、マウスベクターと比較してより広範囲の宿主を提供するテナガザル白血病ウイルス(GaLV)などの非ヒト霊長類レトロウイルスベクターが使用される。組換えレトロウイルスは欠損性であるので、感染性粒子を産生するために補助が必要である。例えば、LTR内の制御配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を使用して、かかる補助を提供し得る。適切なヘルパー細胞株は当業者に周知である。該ベクターは、選択可能マーカーをコードする遺伝子をさらに含み得るので、形質導入された細胞は同定され得る。さらに、レトロウイルスベクターは、それらが標的特異的になるような様式で改変され得る。これは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより達成され得る。当業者は、標的特異的ベクターを作製するためのさらなる方法を知っている。インビトロまたはインビボの遺伝子療法のためのさらに適切なベクターおよび方法は、文献に記載され、当業者に公知であり；例えばWO 94/29469またはWO 97/00957を参照。本発明のC2MIポリヌクレオチド配列はまた、再配列されたC2MI配列またはキメラC2MI宿主細胞DNA配列のいずれか単独で構成される、適切なベクター自体として働き得る。また、本発明のヌクレオチド配列は、人工染色体の構築に使用され得る。
標的臓器のみでの発現を達成するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写のためのDNA配列は、組織特異的プロモーターに連結されて遺伝子療法に使用され得る。かかるプロモーターは当業者に周知である。
オリゴヌクレオチド構造において、リン酸基は一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するように称される。RNAおよびDNAの通常の結合または骨格は3'～5'ホスホジエステル結合である。本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例としては、改変された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、リン原子を骨格内に保持するものおよび骨格内にリン原子を有さないものが挙げられる。安定性の増加を生じ得る改変されたオリゴヌクレオチド骨格は当業者に公知であり、好ましくはかかる改変はホスホロチオエート結合である。
好ましいオリゴヌクレオチド模倣物は、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されるオリゴヌクレオチド模倣物であり、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。ヌクレオ塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。
改変されたオリゴヌクレオチドはまた、1つ以上の置換または改変される糖部分を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に、以下：OH；F；O-、S-もしくはN-アルキル；O-、S-もしくはN-アルケニル；O-、S-もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキルの1つを含み、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは非置換のC1～Cl0アルキルまたはC2～Cl0アルケニルおよびアルキニルであり得る。特に好ましい改変される糖部分は2'-O-メトキシエチル糖部分である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオ塩基の改変または置換を含み得る。改変されるヌクレオ塩基としては、他の合成および天然のヌクレオ塩基、例えば5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン等が挙げられ、5-メチルシトシン置換は、これらの改変が核酸二本鎖安定性を増加することが示されているので好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変は、オリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞性分布または細胞性取込みを高める1つ以上の部分またはコンジュゲートを化学的に結合させることを含む。かかる部分としては、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が挙げられる。
本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。「キメラ性(chimeric)」アンチセンス化合物または「キメラ(chimera)」は、本発明の文脈において、それぞれが少なくとも1つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで構成される2つ以上の化学的に異なる領域を含む、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的に、少なくとも1つの領域を含み、ここで該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞性取込みの増加、および/または標的核酸に対する結合親和性の増加を付与するように改変される。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断し得る酵素についての基質として働き得る。例として、RNase Hは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、RNase Hの活性化は、RNA標的の切断を生じ、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく高める。結果的に、キメラ性オリゴヌクレオチドを使用する場合に、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドにより、しばしば同等の結果が得られ得る。本発明のキメラ性アンチセンス化合物は、上記の2つ以上のオリゴヌクレオチド、改変されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成され得る。かかる化合物は、当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーとも称されている。
本発明はまた、本発明の抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび適切な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物に関する。好ましくは、医薬組成物において、上記のかかる化合物は、薬学的に許容され得る担体と合わされる。「薬学的に許容され得る」は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、有効成分を投与される宿主に対して毒性ではない任意の担体を含むことを意味する。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸塩緩衝化食塩水溶液、水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液等を含む。かかる担体は、従来の方法により製剤化され得、活性化合物は有効用量で被験体に投与され得る。
「有効用量」は、疾患を予防してまたは疾患の経過および重症度に影響を及ぼして、かかる病状の低減または寛解をもたらすのに十分な有効成分の量をいう。これらの疾患または障害を治療および/または予防するのに有用な「有効用量」は、当業者に公知の方法を使用して決定され得る。
適切な組成物の投与は、異なる方法により、例えば静脈内、腹腔内、経口、皮下、筋内、局所または皮内の投与によりなされ得る。当然のことながら投与経路は、治療の種類および医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与養生法は、かかりつけの医師および他の臨床的要因により決定される。医学の分野で周知なように、任意の一患者についての投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される具体的な化合物、投与の時間および経路、治療の種類、一般的な健康状態および同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。
本発明の好ましい態様において、予防/治療され得る疾患は癌、好ましくは乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、ホジキン病、結腸直腸癌もしくは結腸癌またはCNSの疾患、好ましくはアルツハイマー病もしくは多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、または伝染性海綿状脳症/プリオン関連疾患である。また、MSと真正糖尿病の間のリスク要因の類似性のために、後者の状態も含まれる。さらに、アテローム硬化症が含まれる。用語「癌」および「CNSの疾患」は該疾患の早期の病期も含む。
本発明はまた、薬学的に許容され得る担体中に、少なくとも1つの上で定義されるC2MIポリペプチドまたはC2MIポリ核酸または対応するVLP(ウイルス様粒子)またはペプチド/タンパク質/DNA複合体を含むC2MI感染体に対して哺乳動物を免疫するためのワクチンに関する。本発明はまた、動物(特に畜牛)ならびにそれらの生成物(例えば牛乳および乳製品)における分子的および免疫学的試験を含む。
本発明はまた、これらの因子の構造的構成要素の分析由来の標的化された治療のための小さな化学物質を含み得る。
「ワクチン」は、部分的または完全のいずれにせよC2MIに対する保護を誘起し得る免疫原性組成物である。ワクチンは、既に感染した個体の治療にも有用であり得、この場合は治療ワクチンと称される。
用語「治療(therapeutic)」は、C2MI感染またはこの感染に関連のある疾患を治療し得る組成物をいう。用語「有効量」は、投与される個体において免疫原性応答を誘導する、またはそうでない場合はその意図する系(例えばイムノアッセイ)において検出可能に免疫反応させるのに十分なエピトープ保有ポリペプチドの量をいう。好ましくは、有効量は、上で定義される治療を行うのに十分である。必要とされる正確な量は用途に応じて変化する。ワクチン適用についてまたはポリクローナル抗血清/抗体の作製について、例えば、有効量は、個体の種、齢および一般的な状態、治療されている状態の重症度、選択される具体的なポリペプチドおよびその投与の形態等に応じて変化し得る。有効量は、比較的大きな危険ではない範囲内に見られる。適切な有効量は、常套的な実験を使用して容易に決定され得る。C2MIが引き起こす疾患の予防のためのタンパク質の好ましい範囲は、0.01～100μg/用量、好ましくは0.1～50μg/用量である。十分な免疫応答ならびにその後のC2MI感染およびC2MIに関連する疾患に対する保護のそれぞれを達成するために、1個体あたりいくつかの用量が必要となることがある。
薬学的に許容され得る担体は、それ自体がワクチンを受ける個体に対し有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体を含む。適切な担体は、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸およびアミノ酸コポリマーなどの典型的に大きく、ゆっくり代謝される巨大分子である。かかる担体は、当業者に周知である。
組成物の有効性を高めるための好ましいアジュバントとしては、限定されないが：水酸化アルミニウム(alum)、米国特許第4,606,918号に見られるN-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(nor-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイルsn-グリセロ-3-ヒドロキシ-ホスホリルオキシ)-エチルアミン(MTP-PE)およびRIBIが挙げられ、2%スクアレン/Tween 80エマルジョン中に、細菌から抽出される3つの構成要素、モノホスホリルリピドA、トレハロースジミコール酸(trehalose dimycolate)および細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)を含む。3つの構成要素MPL、TDMまたはCWSのいずれかはまた、単独でまたは2つずつ合わせて使用され得る。さらに、Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA)またはSAF-1 (Syntex)などのアジュバントが使用され得る。さらに、非ヒト適用および研究目的のために、完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)が使用され得る。
免疫原性組成物は典型的に、薬学的に許容され得るビヒクル、例えば水、食塩水、グリセロール、エタノール等を含む。さらに、湿潤剤または乳化剤などの補助物質、pH緩衝化物質、保存剤等がかかるビヒクルに含まれ得る。
典型的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能物として調製される。注射の前に、液体ビヒクル中の溶解または懸濁に適切な固形も調製され得る。調製物はまた、高められたアジュバント効果のために、乳化またはリポソームに封入され得る。タンパク質はまた、サポニン、例えばQuil A (ISCOMS)と共に免疫刺激複合体に組み込まれ得る。
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、「十分な量」または「免疫学的有効量」の本発明のタンパク質、ならびに必要に応じて上述の構成要素のいずれか他のものを含む。「免疫学的有効量」は、個体へのかかる量の投与が、単独用量または一連のものの一部としてのいずれかで、上で定義されるように治療に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康および身体的な状態、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤化、医学的状況の治療する医師の評価、ならびに他の関連のある要因に応じて変化する。この量は、常套的な試験を通じて決定され得る比較的広い範囲に該当することが予想される。通常、この量は、0.01～1000g/用量、より好ましくは0.1～100μg/用量で変化する。
以下の実施例は例示を意図するが、本発明を限定することを意図しない。かかる実施例は、使用され得るものの典型であり、当業者に公知の他の方法が代替的に使用されてもよい。
実施例
材料
市販のアッセイ
-NucleoSpin(登録商標)ゲルおよびPCRクリーンアップ(Clean up) Macherey-Nagel
-InvitrogenTM TA CloningTMキット、pCRTM 2.1ベクター有り、コンピテント細胞無し Invitrogen
-InvitrogenTM TA CloningTMキット、pCRTM2.1ベクターおよびOne ShotTM TOP10F' 化学的にコンピテントな大腸菌有り Invitrogen
-InvitrogenTM One ShotTM TOP10F' 化学的にコンピテントな大腸菌 Invitrogen
-AccuPrepプラスミドミニ抽出キット Bioneer
-JeneJetプラスミドMiniprepキット Thermo Scientific
-プラスミドmaxiキット Qiagen
化学物質：
-TaKaRa LA Taq(登録商標)DNAポリメラーゼ、GCバッファ有り TaKaRa
-塩化ナトリウム Sigma-Aldrich
-酵母抽出物 Gerbu
-カゼイン由来のトリプトン/ペプトン Roth
-phi29 DNAポリメラーゼ New England Biolabs M02695
-dNTP Takara '4030
-Exo-耐性ランダムプライマー Thermo Fisher Scientific S0181
実施例1：DNA抽出
DNA(牛乳および牛乳生成物由来の16試料)を、以前に記載されるように(Whitley et al., 2014)フェノール/クロロホルムで抽出した。試料を、プロテイナーゼKバッファ(0.2M Tris-HCL、pH7.5、25mM EDTA、0.3M NaCl、2%SDS)で1:1に希釈し、プロテイナーゼK(終濃度1mg/ml、Sigma-Aldrich P6556)を用いて37℃で一晩消化した。フェノール/クロロホルム抽出の後にエタノール沈殿を続けた。その後、試料5～16を、製造業者のプロトコル(Machery and Nagel, 740.609.250)に従ってNucleospin GelおよびPCRクリーンアップキットを使用したさらなる精製に供した。最終的にDNAを、5mM Tris-HCl、pH8.0に溶出した。
実施例2：ローリングサークル増幅
ローリングサークル増幅を、Funk et al, 2014に記載されるように行った。鋳型DNA(50ng)を、10μlの総体積(1x phi29 DNAポリメラーゼバッファ)中、25μM Exo-耐性ランダムプライマーと共に95℃で3分インキュベートし、次いで氷上で冷却した。BSA(0.4mg/ml)、0.75mM dNTPそれぞれおよび1x phi29 DNAポリメラーゼバッファ中10U phi29 DNAポリメラーゼを添加して、この試料を20μlに希釈した。30℃で18時間および65℃で10分のインキュベーション後、15℃で反応を停止した。
実施例3：ポリメラーゼ連鎖反応
RCA増幅されたDNA由来の3μlの鋳型を、TAKARA Taq酵素および添付の溶液を使用して、製造業者のプロトコル(LA TAKARA RR02AG)に従ってポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に使用した。それぞれの隣接するプライマーを、それぞれ0.2mMの終濃度で添加した。プライマーは、BMMF2群についてHCBI1、HCBI2およびHCBI7を整列した後に保存された領域に基づいて、ならびにBMMF1群については複製遺伝子の保存された領域に基づいて設計された。
PCRは、それぞれのプライマーペア：
BMMF1群についてMBB2プライマー：
Mbb2(MSBI1.176bbF296フォワード)-5'-TGCAGAAATTGCCCCTCGACT-3'および
Mbb2(MSBI1.176bbR295リバース)-5'-AACAATGGGGAAGAAGTCAAAGG-3'
に特異的なタッチダウン(touchdown)プロトコルを使用して行った。
5サイクル増幅の第1ラウンドは、94℃で30秒の融解、64℃で1分のアニーリングおよび72℃で2分の伸長で行い、62℃のアニーリングを使用した5サイクルの第2ラウンドおよびアニーリングについて60℃を使用した30サイクルの第3ラウンドを続けた。72℃で10分の最終ラウンドを続けた。
BMMF2群についての増幅は、タッチダウン温度を、LSconAプライマーについて58℃、56℃および54℃、ならびにLSconBプライマーについて56℃、54℃および52℃にして、伸張時間を、1サイクル当たり72℃で3分に延長した以外は、MBB2プライマーを使用したBMMF1群について記載されるものと同様に行った。
BMMF2群について使用される隣接するプライマーペアは：
LSConA5p(フォワード)-5'-AAGGCAGATCAACACAGG-3'およびLSconA3p(リバース)-5'-AGCAGATTGCAAAGCCTG-3'、
LSconB5p(フォワード)-5'-CAACACAGGGATAGAATAAC-3'およびLSconB3p(リバース)-5'-ATCTGCCTTAGCAGATTGC-3'
であった。
PCR産物をゲル電気泳動により分離して、目に見える断片を切り出し、製造業者のプロトコル(Machery and Nagel, 740.609.250)に従ってNucleospin GelおよびPCRクリーンアップキットを使用してDNAを抽出した。最終的に、DNAを、5mM Tris-HCl、pH8.0に溶出した。
溶出したDNAをライゲーションして、TA-クローニングキットを使用してpCR2.1にクローニングし、大腸菌を形質転換した-全ては、製造業者のプロトコル(InvitrogenTM TA CloningTMキット、pCRTM2.1ベクターおよびOne ShotTM TOP10F'化学的にコンピテントな大腸菌(Invitrogen K203040)有り、に従った。
GATCにより全てのクローンの配列決定を行った。
実施例4：インシリコ分析
得られた全ての配列をGenbankにおいて利用可能な配列と比較して、推定タンパク質配列をswissprotおよびswissprot_splicevarと比較した。
Stanford UniversityのChris Burgeにより開発された遺伝子同定プログラムGENSCAN(Burge and Karlin, 1997)を用いて予想される遺伝子を得た。これは、ヒト、他の脊椎動物、無脊椎動物および植物由来のゲノムDNA配列を分析する。
整列された(MUSCLEアルゴリズム)配列-全長ヌクレオチドゲノムとRepのコア領域の両方に基づいて最尤を使用して、系統樹を作成した。
参照文献
Figure 2022519345000001
Figure 2022519345000002
Figure 2022519345000003
Figure 2022519345000004
Figure 2022519345000005
Figure 2022519345000006

Claims (15)

  1. (a)牛乳試料由来のDNAのフェノール-クロロホルム抽出、その後エタノール沈殿、
    (b)工程(a)で抽出されたDNAを用いてローリングサークル増幅(RCA)を行う工程、
    (c)プライマーペアA：
    >LSconAfwd:
    aaggcagatcaacacagg
    >LSconArev:
    Agcagattgcaaagcctg
    プライマーペアB：
    >LSconBfwd:
    caacacagggatagaataac
    >LSconBrev:
    atctgccttagcagattgc
    から選択される2つの隣接するプライマーペアAおよびBを用いた逆(inverted)PCR
    の工程を含む、牛乳試料からDNAを単離するための方法。
  2. (a)図1(A)～22(A)のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
    (b)(a)のヌクレオチド配列に対して少なくとも93%の同一性を有するヌクレオチド配列；
    (c) (a)もしくは(b)のヌクレオチド配列の断片；
    (d) (a)、(b)もしくは(c)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；または
    (e)上記のヌクレオチド配列のいずれかと比較した遺伝コードの縮重の結果として重複している(redundant)ヌクレオチド配列
    を含む、請求項１記載の方法により入手可能なC2MIポリ核酸。
  3. 請求項２記載のC2MIポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブが、請求項２記載のヌクレオチド配列を含む特定のC2MI単離物の核酸の特異的検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして働き得る、オリゴヌクレオチドプローブ。
  4. 原核生物、真核生物またはウイルスの転写および翻訳制御因子に操作可能に連結される請求項２または３記載のC2MIポリ核酸を含む、発現ベクター。
  5. 請求項４記載の発現ベクターで形質転換されるかまたは改変される宿主細胞。
  6. 請求項２記載のC2MIポリ核酸によりコードされるポリペプチド。
  7. 請求項６記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
  8. 癌、CNSの疾患、アテローム硬化症または糖尿病の素因または初期段階の診断のための診断組成物の調製のための、請求項３記載のプローブ、請求項６記載のポリペプチドまたは請求項７記載の抗体もしくはその断片の使用。
  9. 癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌または結腸癌であり、CNSの疾患が、多発性硬化症MS、筋萎縮性側索硬化症、伝染性海綿状脳症(spongiforme encephalopathies)/プリオン関連疾患、パーキンソン病またはアルツハイマー病である、請求項８記載の使用。
  10. (a)任意に試料ポリ核酸を抽出する工程、(b)上述のポリ核酸と、少なくとも1つの請求項３記載のプローブ、任意に標識されたプローブをハイブリダイズさせる工程、および(c)ハイブリダイズしたポリ核酸を検出する工程を含む、生物学的試料における請求項２記載のC2MIポリ核酸の検出のための方法。
  11. 生物学的試料中に存在する請求項６記載のポリペプチドまたは請求項７記載の抗体を検出するための方法であって、(a)上で定義されるかかるポリペプチドまたは抗体の存在および/または濃度について生物学的試料を接触させる工程、ならびに(b)該抗体および/または該ポリペプチドの間で形成される免疫学的複合体を検出する工程を含む、方法。
  12. 請求項２記載のC2MIポリ核酸の発現を低減もしくは阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むベクター。
  13. 請求項７記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび適切な薬学的担体を含む、医薬組成物。
  14. 請求項２記載のC2MIポリ核酸または請求項６記載のポリペプチドを含むワクチンであって、好ましくは該ワクチンが、VLPまたはタンパク質/DNAもしくはポリペプチド/DNAの複合体または特異的タンパク質または弱められた感染性因子を含む、ワクチン。
  15. 癌、CNSの疾患、アテローム硬化症または糖尿病の予防または治療のための医薬の開発のためのリード構成要素としての請求項２記載のC2MIポリ核酸の使用であって、好ましくは癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌または結腸癌であり、CNSの疾患が、多発性硬化症MS、筋萎縮性側索硬化症、伝染性海綿状脳症(spongiforme encephalopathies)/プリオン関連疾患、パーキンソン病またはアルツハイマー病である、使用。
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