JP2022515229A - グルカゴン、ｇｌｐ－１及びｇｉｐ受容体の全てに活性を有する三重活性体と、インスリンとを含む薬学組成物 - Google Patents

グルカゴン、ｇｌｐ－１及びｇｉｐ受容体の全てに活性を有する三重活性体と、インスリンとを含む薬学組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体の全てに活性を有する三重活性体と、インスリンとを含む組成物、並びにそれを含む複合製剤に関する。

Description

本発明は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体の全てに活性を有する三重活性体と、インスリンとを含む組成物、並びにそれを含む複合製剤に関する。
インスリンは、人体の膵臓から分泌される血糖調節ホルモンであり、血液中の余剰グルコースを細胞に送り、細胞にエネルギー源を供給すると共に、血糖を正常レベルに維持する役割を果たす。しかし、糖尿病患者においては、このようなインスリンの不足や、インスリン抵抗性及びβ細胞の機能喪失により、インスリンが正常な機能を果たせない。よって、糖尿病患者は、血液中のグルコースをエネルギー源として用いることができず、血中グルコースレベルが高くなる高血糖症状を起こし、結局は尿により糖を排出することになり、様々な合併症を引き起こすこともある。よって、インスリン分泌に異常がある糖尿病患者（Type I）や、インスリン耐性による糖尿病患者（Type II）にはインスリン治療が必須であり、インスリンを投与すると正常レベルに血糖を調節することができる。
現在、１型糖尿病の２５％及び２型糖尿病の８０％以上は、高血糖だけでなく、肥満状態であることが多く、インスリンの単独投与は、血糖調節に優れるが、体重が増加する副作用があることが知られている。よって、インスリンの血糖減少効果を発揮しながらも、その副作用である体重増加を効果的に減少させることのできる治療剤の開発が求められている。
一方、本出願人は、インスリン活性を有する様々なインスリンアナログを開発し（特許文献１及び２）、また、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体の全てに活性を有する三重活性体を開発した（特許文献３及び４）。しかし、それらを組み合わせた併用製剤として用いられてはいない。
国際公開第２０１４／１３３３２４号 国際公開第２０１７／０３９２６７号 国際公開第２０１７／１１６２０４号 国際公開第２０１７／１１６２０５号 韓国公開特許第１０－２０１４－０１０６４５２号公報 韓国公開特許第１０－２０１７－００２６２８４号公報 国際公開第９７／０３４６３１号 国際公開第９６／０３２４７８号
H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
本願は、インスリンと三重活性体を共に用いると、それぞれの単独投与群に比べて血糖調節能力が著しく向上し、かつインスリンによる体重増加が効果的に改善されることが確認された。
本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１（Glucagon-like peptide-1）受容体、及びＧＩＰ（Glucose-dependent insulinotropic polypeptide）受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む組成物を提供することを目的とする。
具体的には、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与による体重増加を減少させるための薬学的組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与患者における体重減少のための複合製剤を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むキットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、薬剤の製造における、前記組成物の用途を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法を提供することを目的とする。
具体的には、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法を提供する。
本発明のインスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを含む組成物又は複合製剤は、インスリン関連疾患、例えば糖尿病に対する予防又は治療効果を発揮すると共に、体重増加などのインスリン投与による副作用を緩和する新規な併用療法を提供する。
インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与による２型糖尿病モデルマウスにおける血糖調節効果を示す図である。 インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与による２型糖尿病モデルマウスにおける体重変化を示す図である。
本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１（Glucagon-like peptide-1）受容体、及びＧＩＰ（Glucose-dependent insulinotropic polypeptide）受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む組成物である。
一具体例として、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
他の具体例として、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与による体重増加を減少させるための薬学的組成物である。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であり、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、インスリン投与が求められる個体に投与されるものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリン関連疾患は、インスリン抵抗性疾患、糖尿病、過血糖症及び肥満からなる群から選択されるものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、血糖降下効力及びインスリン単独投与の際に現れる体重増加を抑制する効力をどちらも有することを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、ここで、インスリン又はその結合体：グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が１：１～１００：１のモル比となるように含むか、インスリン又はその結合体：グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が１：１～１：１００のモル比となるように含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、天然グルカゴン配列の少なくとも１つのアミノ酸の置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた、天然グルカゴンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、付加されるアミノ酸配列は、天然ＧＬＰ－１、天然ＧＩＰ又は天然エキセンジン－４のアミノ酸配列に由来するものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、一般式１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｘａａ７－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｘａａ１６－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｘａａ２０－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２７－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１，配列番号１０３）
一般式１において、Ｘａａ１はヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）又はチロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）であり、Ｘａａ２はグリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）であり、Ｘａａ３はグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）又はグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）であり、Ｘａａ７はトレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）であり、Ｘａａ１０はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）又はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）であり、Ｘａａ１２はリシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）であり、Ｘａａ１３はグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、アラニン（Ａｌａ，Ａ）又はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）であり、Ｘａａ１４はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）又はチロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）であり、Ｘａａ１５はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）又はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）であり、Ｘａａ１６はグリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）又はセリン（Ｓｅｒ，Ｓ）であり、Ｘａａ１７はグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）又はリシン（Ｌｙｓ，Ｋ）であり、Ｘａａ１８はアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）であり、Ｘａａ１９はアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）又はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）であり、Ｘａａ２０はリシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）又はアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）であり、Ｘａａ２１はグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）であり、Ｘａａ２３はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）又はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）であり、Ｘａａ２４はアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）であり、Ｘａａ２７はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）又はメチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）であり、Ｘａａ２８はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、アラニン（Ａｌａ，Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）であり、Ｘａａ２９はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）であり、Ｘａａ３０はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）もしくはヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）であるか、又は存在せず、Ｒ１はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、ＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴ（配列番号１０６）、ｍ－ＳＳＧＡＰＰＰＳ－ｎ（配列番号１０７）もしくはｍ－ＳＳＧＱＰＰＰＳ－ｎ（配列番号１０８）であるか、又は存在せず、ここで、ｍはＣｙｓ、Ｐｒｏ又はＧｌｙ－Ｐｒｏであり、ｎはＣｙｓ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＨｉｓ－Ｇｌｙであるか、又は存在しない。
上記具体例のいずれかによる組成物において、Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン、アスパラギン酸又はロイシンであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式１にて、Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、グルタミン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン、システイン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン、ロイシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン、グルタミン酸又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、バリン又はシステインであり、Ｘａａ２０はリシン、アルギニン又はグルタミンであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、Ｘａａ２４はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はロイシン又はリシンであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記ペプチドは、一般式２で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｘａａ１６－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｘａａ２０－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｘａａ３１－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｘａａ４０（一般式２，配列番号１０４）
一般式２において、Ｘａａ１は４－イミダゾアセチル、ヒスチジン又はチロシンであり、Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ１０はチロシン又はシステインであり、Ｘａａ１３はアラニン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン、メチオニン又はチロシンであり、Ｘａａ１５はアスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシンであり、Ｘａａ１６はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ２０はリシン、グルタミン又はアルギニンであり、Ｘａａ２１はシステイン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、Ｘａａ２４はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン又はグルタミン酸であり、Ｘａａ２８はリシン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２９はグリシン、グルタミン、システイン又はヒスチジンであり、Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン又はヒスチジンであり、Ｘａａ３１はプロリン又はシステインであり、Ｘａａ４０はシステインであるか、又は存在しない。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式１にて、Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はチロシン、アラニン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Ｘａａ２０はリシン又はグルタミンであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸、システイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はバリンであり、Ｘａａ２４はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はロイシン又はリシンであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式２にて、Ｘａａ１３はアラニン、チロシン又はシステインであり、Ｘａａ１５はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ２１はシステイン、グルタミン酸、グルタミン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、Ｘａａ２４はシステイン、グルタミン又はアスパラギンであり、Ｘａａ２８はシステイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２９はグルタミン、システイン又はヒスチジンであり、Ｘａａ３０はシステイン、リシン又はヒスチジンであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式１にて、Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシン又はシステインであり、Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はチロシン、アラニン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Ｘａａ２０はリシン又はグルタミンであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はバリンであり、Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はロイシンであり、Ｘａａ２８はシステイン、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式１にて、Ｘａａ１はヒスチジン又は４－イミダゾアセチルであり、Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ３はグルタミンであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシンであり、Ｘａａ１２はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はアラニン又はシステインであり、Ｘａａ１４はメチオニンであり、Ｘａａ１５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ１７はイソロイシン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はグルタミン又はシステインであり、Ｘａａ２０はリシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はバリンであり、Ｘａａ２４はアスパラギンであり、Ｘａａ２７はロイシンであり、Ｘａａ２８はアラニン又はアスパラギンであり、Ｘａａ２９はグルタミン又はトレオニンであり、Ｘａａ３０はシステインもしくはリシンであるか、又は存在しないことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記ペプチドは、一般式３のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｘａａ１３－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｘａａ３１－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｘａａ４０（一般式３，配列番号１０５）
一般式３において、Ｘａａ１はヒスチジン又はチロシンであり、Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ１３はアラニン、チロシン又はシステインであり、Ｘａａ１７はアルギニン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン又はアルギニンであり、Ｘａａ１９はアラニン又はシステインであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２４はグルタミン又はアスパラギンであり、Ｘａａ２８はシステイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２９はシステイン、ヒスチジン又はグルタミンであり、Ｘａａ３０はシステイン又はヒスチジンであり、Ｘａａ３１はプロリン又はシステインであり、Ｘａａ４０はシステインであるか、又は存在しない。
上記具体例のいずれかによる組成物において、Ｒ１は、システイン、ＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴ（配列番号１０６）、ＣＳＳＧＱＰＰＰＳ（配列番号１０９）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１１０）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ（配列番号１１１）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１１２）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧ（配列番号１１３）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＨＧ（配列番号１１４）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＳ（配列番号１１５）、ＰＳＳＧＱＰＰＰＳ（配列番号１１６）もしくはＰＳＳＧＱＰＰＰＳＣ（配列番号１１７）であるか、又は存在しないことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、配列番号１～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記一般式にて、Ｎ末端から１６番目のアミノ酸と２０番目のアミノ酸は、互いに環を形成することを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、そのＣ末端がアミド化したものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンは、天然インスリン、又は天然インスリンの少なくとも１つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が生じたインスリンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、３番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、２６番目のアミノ酸、２７番目のアミノ酸、２８番目のアミノ酸、２９番目のアミノ酸、３０番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、１８番目のアミノ酸、１９番目のアミノ酸、及び２１番目のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているか、欠失しているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、一般式４で表される配列番号１１９のＡ鎖と、一般式５で表される配列番号１２０のＢ鎖とを含むことを特徴とする。
［一般式４］
Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｘａａ５－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｘａａ１２－Ｌｅｕ－Ｘａａ１４－Ｇｌｎ－Ｘａａ１６－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｘａａ１９－Ｃｙｓ－Ｘａａ２１（配列番号１１９）
一般式４において、Ｘａａ１はアラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Ｘａａ２はアラニン又はイソロイシンであり、Ｘａａ５はアラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン又はアスパラギンであり、Ｘａａ１２はアラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン又はアスパラギンであり、Ｘａａ１４はアラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｘａａ１６はアラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Ｘａａ１９はアラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニン又はアスパラギンであり、Ｘａａ２１はアスパラギン、グリシン、ヒスチジン又はアラニンである。
［一般式５］
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｘａａ８－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｘａａ１６－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｘａａ２５－Ｔｙｒ－Ｘａａ２７－Ｘａａ２８－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ（配列番号１２０）
一般式５において、Ｘａａ８はアラニン又はグリシンであり、Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸であるか、又は存在せず、Ｘａａ２３はグリシン又はアラニンであり、Ｘａａ２４はアラニン又はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２５はアラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であるか、又は存在せず、Ｘａａ２７はトレオニンであるか、又は存在せず、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸であるか、又は存在しない（ここで、配列番号１２１のＡ鎖及び配列番号１２２のＢ鎖を含むペプチドは除く）。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択される１つのアミノ酸がアラニンに置換されているか、Ａ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンに置換されているものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８及び１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の１６番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換されているか、２５番目のアミノ酸が欠失しているか、天然インスリンのＡ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸もしくはアラニンに置換されているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、配列番号１４２又は１４４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の１６番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸に置換されているか、天然インスリンのＢ鎖の２５番目のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸に置換されているか、天然インスリンのＡ鎖の１４番目のアミノ酸がヒスチジン、リシン、アラニンもしくはアスパラギン酸に置換されているか、天然インスリンのＡ鎖の１９番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリンもしくはトレオニンに置換されているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８及び１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、一般式４で表される配列番号１１９のＡ鎖と、一般式５で表される配列番号１２０のＢ鎖とからなる二重鎖の形態であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Ａ鎖及びＢ鎖は、ジスルフィド結合により連結されるものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記結合体は、化学式１で表されるものであることを特徴とする。
［化学式１］
Ｘ－Ｌａ－Ｆ
ここで、Ｘは前記インスリン、又はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドであり、Ｌはリンカーであり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質であり、前記「－」は共有又は非共有結合である。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択されることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール－プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Ｆは、ＩｇＧ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されたものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、（ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ、並びに（ｆ）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体からなる群から選択されるものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたか、天然ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が欠失されたか、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されたか、補体結合部位が除去されたか、又はＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されたものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する免疫グロブリンＦｃフラグメントであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Ｌは、ペプチド、脂肪酸、サッカライド、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール－プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Ｌは、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。
本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与患者における体重減少のための複合製剤である。
本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むキットである。
本発明を実現する一態様は、薬剤の製造における、前記組成物の用途である。
本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療方法である。
本発明を実現する一態様は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法である。
具体的には、本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法である。
以下、本発明をより詳細に説明する。
なお、本願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明の範囲が制限されるものではない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本発明に含まれることが意図されている。
本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソブチル酸）、Ｓａｒ（N-methylglycine）、α－メチルグルタミン酸（α-methyl-glutamic acid）などの他のアミノ酸に対して一般に許容される３文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載したものである。
アラニン Ａｌａ，Ａ
アルギニン Ａｒｇ，Ｒ
アスパラギン Ａｓｎ，Ｎ
アスパラギン酸 Ａｓｐ，Ｄ
システイン Ｃｙｓ，Ｃ
グルタミン酸 Ｇｌｕ，Ｅ
グルタミン Ｇｌｎ，Ｑ
グリシン Ｇｌｙ，Ｇ
ヒスチジン Ｈｉｓ，Ｈ
イソロイシン Ｉｌｅ，Ｉ
ロイシン Ｌｅｕ，Ｌ
リシン Ｌｙｓ，Ｋ
メチオニン Ｍｅｔ，Ｍ
フェニルアラニン Ｐｈｅ，Ｆ
プロリン Ｐｒｏ，Ｐ
セリン Ｓｅｒ，Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ，Ｔ
トリプトファン Ｔｒｐ，Ｗ
チロシン Ｔｙｒ，Ｙ
バリン Ｖａｌ，Ｖ
本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１（Glucagon-like peptide-1）受容体、及びＧＩＰ（Glucose-dependent insulinotropic polypeptide）受容体に対して活性を有する分離されたペプチド（「三重活性体」ともいう）とを含む組成物を提供する。
一具体例として、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
他の具体例として、本発明は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与による体重増加を減少させるための薬学的組成物を提供する。
具体的には、前記組成物は、（ａ）インスリンと、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むものであってもよく、（ｂ）インスリンとその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、インスリンの持続型結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むものであってもよく、（ｃ）インスリンと、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、（ｄ）インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよい。
本発明のインスリン関連疾患の予防又は治療用薬学組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを含むものであり、インスリンの欠乏、不足又は機能低下により発生するインスリン関連疾患の予防又は治療効果を有するインスリンの薬効を示すと共に、インスリン投与による副作用（例えば、体重増加）を緩和することができる。
本発明の実施例においては、前記インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを含む組成物を投与したｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖降下効果が確認されただけでなく、体重増加抑制効果が確認されたので、本発明による薬学組成物がインスリンの薬効を維持しつつ、その副作用を改善できることが確認された。
本発明における「インスリン関連疾患」とは、インスリンの欠乏、不足、機能低下など、インスリン固有の血糖調節機能に異常が生じて発症する疾患を意味し、インスリンの投与により予防又は治療効果が期待される疾患であればいかなるものでもよい。具体的には、前記インスリン関連疾患は、インスリン抵抗性疾患、糖尿病、過血糖症及び肥満からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
インスリン関連疾患の治療のためにインスリンを投与する場合、所望の治療効果が得られる一方で、意図しない副作用、例えば体重増加が生じるので、患者にさらなる疾病や苦痛をもたらすという問題がある。本発明による薬学組成物は、インスリン及び三重活性体の併用使用により、インスリンの副作用である体重増加を抑制しつつ、インスリン関連疾患に対する治療効果を発揮することができる。
本発明の組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体を、インスリン関連疾患に対する治療効果を発揮すると共に、副作用、特に体重増加を緩和できる含有量比で含むものである。
具体的には、前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを全て含み、ここで、インスリン：三重活性体を１：１～１００：１のモル比で含むものであるか、又は１：１～１：１００のモル比で含むものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一具体例として、前記組成物は、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質又はその結合体を併用する治療学的用途を提供するものであってもよい。「インスリン」については前述した通りである。
本発明における「組成物」は、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質とを含む「併用物」と併用される。前記組成物は、キットの形態で提供されてもよい。
本発明における「併用物（combination）」とは、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質又はその結合体の併用投与用途を有するものであり、「併用用途（combined used）」と同義である。前記併用物は、ａ）（ｉ）インスリンもしくはその結合体と、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が混合された１つの混合物（mixture）で投与されるものであるか、又はｂ）（ｉ）インスリンもしくはその結合体と、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が分離された形態で投与されるものであるが、これらに限定されるものではない。
インスリンもしくはその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が分離された形態の場合、インスリンもしくはその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が別個の製剤に製剤化され、同時、個別、順次又は逆順に投与されてもよい。
本発明における併用投与とは、単に同時の投与を意味するだけでなく、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質又はその結合体が個体に共に作用し、各物質が本然の機能と同等又はそれ以上のレベルの機能を果たす投与形態であると理解されるべきである。よって、本願における「併用」とは、同時、個別、順次又は逆順の投与を意味するものと理解されるべきである。前記投与が順次、逆順又は個別の場合、投与の順序は、特に限定されるものではないが、２次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないものでなければならない。
本発明における「組成物（composition）」とは、前記インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質又はその結合体とを含む併用物自体、又はそれらを含み、治療学的用途を有するものであるが、これらに限定されるものではない。例えば、インスリン関連疾患の予防又は治療用途を有するものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明による組成物は、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質又はその結合体を併用投与するためのものであり、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質又はその結合体が一つの製剤に製剤化されたものであってもよく、個別に製剤化されたものであってもよい。具体的には、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質又はその結合体を同時、個別、順次又は逆順に投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明における「キット」は、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質又はその結合体を併用投与するために、本発明による併用物又は組成物を含むものであってもよい。具体的には、本発明によるキットは、インスリンもしくはその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が１つの製剤に製剤化されたもの、又はインスリンもしくはその結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が個別に製剤化されたものを含むものであってもよく、２つの物質の併用投与に必要な物質をさらに含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記インスリン、並びにグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する物質には、インスリン、並びにグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して有意なレベルの活性を示す様々な物質、例えば化合物又はペプチドの形態の物質が含まれる。
本発明における前記「グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド」は、三重活性体と混用される。一方、三重活性体及びその持続型結合体に関して、特許文献３及び４の全文が本発明に参考資料として援用される。
このような三重活性体には、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ受容体に対して有意なレベルの活性を有する様々な物質、例えば様々なペプチドが含まれる。
特に、これらに限定されるものではないが、前記グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ受容体に対して有意なレベルの活性を有する三重活性体は、グルカゴン、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ受容体の少なくとも１つの受容体、具体的には少なくとも２つの受容体、より具体的には３つの受容体の全てに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が、当該受容体の天然リガンド（天然グルカゴン、天然ＧＬＰ－１及び天然ＧＩＰ）に比べて、０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上である。
このような三重活性体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定する方法は、本願明細書の実験例１に示すが、特にこれに限定されるものではない。
一方、前記三重活性体は、ｉ）ＧＬＰ－１受容体の活性化、ｉｉ）グルカゴン受容体の活性化、ｉｉｉ）ＧＩＰ受容体の活性化の少なくとも１つ、少なくとも２つ、具体的には３つの活性化を有すること、より具体的には有意な活性化を有することを特徴とする。
ここで、受容体を活性化するとは、例えば、天然のものに比べて、受容体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上になることを意味する。しかし、これらに限定されるものではない。
また、前記三重活性体は、天然ＧＬＰ－１、天然グルカゴン及び天然ＧＩＰのいずれかに比べて体内半減期が延長されたものであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
特に、これに限定されるものではないが、このような前記ペプチドは、非自然発生（non-naturally occurring）のものである。
具体的には、前記三重活性体は、天然グルカゴンアナログであるが、特にこれに限定されるものではない。
本発明による天然グルカゴンアナログには、天然グルカゴンと比較してアミノ酸配列に少なくとも１つの差異のあるペプチド、天然グルカゴン配列を修飾（modification）することにより改変されたペプチド、天然グルカゴンの模倣体が含まれる。
一方、特にこれに限定されるものではないが、天然グルカゴンは次のアミノ酸配列を有する。
Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ（配列番号１１８）
具体的には、前記三重活性体は、天然グルカゴン配列の少なくとも１つのアミノ酸の置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた、天然グルカゴンのアナログであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
また、前記アミノ酸の置換には、アミノ酸への置換や、非天然化合物への置換が全て含まれる。
さらに、付加は、三重活性体のＮ末端及び／又はＣ末端において行われうる。一方、付加されるアミノ酸の長さは、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上であるが、特にこれらに限定されるものではなく、広義ではポリペプチドの付加が含まれるが、特にこれに限定されるものではない。
前記天然グルカゴンに導入されるアミノ酸は、チロシン、α－メチルグルタミン酸、Ａｉｂ、メチオニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン、グリシン、アラニン、システイン、セリン、アスパラギン酸及びアルギニンからなる群から選択されるが、特にこれらに限定されるものではない。
例えば、前記付加されるアミノ酸配列は、天然ＧＬＰ－１、天然ＧＩＰ又は天然エキセンジン－４のアミノ酸配列に由来する１つ以上のアミノ酸配列であってもよい。
このような三重活性体は、分子内架橋（intramolecular bridge）を含み（例えば、共有結合的架橋又は非共有結合的架橋）、具体的には環を含む形態であってもよく、例えば三重活性体の１６番目のアミノ酸と２０番目のアミノ酸間に環が形成された形態であるが、特にこれらに限定されるものではない。
前記環の例として、ラクタム架橋（又はラクタム環）が挙げられるが、特にこれに限定されるものではない。
また、前記三重活性体には、目的とする位置に環を形成するアミノ酸を含むことにより環を含むように改変されたものが全て含まれる。
例えば、三重活性体の１６番目と２０番目のアミノ酸対がそれぞれ環を形成するグルタミン酸又はリシンに置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。
このような環は、前記三重活性体内のアミノ酸側鎖間に形成されてもよく、例えばリシンの側鎖とグルタミン酸の側鎖間にラクタム環が形成される形態であるが、特にこれらに限定されるものではない。
上記方法の組み合わせにより作製される三重活性体の例として、天然グルカゴンとアミノ酸配列が少なくとも１つ異なり、Ｎ末端のアミノ酸残基のα炭素が除去された、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、アナログ作製のための様々な方法の組み合わせにより、本発明に用いられる三重活性体を作製することができる。
また、特にこれらに限定されるものではないが、本発明の三重活性体は、体内半減期の延長のために、活性体の分解酵素の認識作用を回避するように、一部のアミノ酸を他のアミノ酸又は非天然化合物に置換することができる。
具体的には、前記三重活性体のアミノ酸配列のうち２番目のアミノ酸配列の置換により分解酵素の認識作用を回避し、体内半減期を延長させたペプチドであってもよいが、体内の分解酵素の認識作用を回避するためのアミノ酸の置換又は変更であればいかなるものでもよい。
また、天然グルカゴンのアナログの作製のためのこのような改変には、Ｌ型もしくはＤ型アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を用いた改変、並びに／又は天然配列の修飾、例えば側鎖官能基の改変、分子内の共有結合、一例として側鎖間の環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などの修飾による改変が全て含まれる。
さらに、天然グルカゴンのＮ及び／又はＣ末端に少なくとも１つのアミノ酸が付加されたものが全て含まれる。
前記置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができる。
アミノ酸誘導体も同じ方式で入手することができ、一例として４－イミダゾ酢酸（4-imidazoacetic acid）などが挙げられる。
また、本発明によるグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドは、生体内のタンパク質切断酵素から保護して安定性を増加させるために、そのＮ末端及び／又はＣ末端などが化学的に修飾された形態、有機基により保護された形態、又はペプチド末端などにアミノ酸が付加されて改変された形態であってもよい。
特に、化学的に合成したペプチドの場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているので、その電荷を除去するために、Ｎ末端のアセチル化（acetylation）及び／又はＣ末端のアミド化（amidation）を行ってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。また、Ｃ末端が改変されていない形態、すなわちカルボキシ基を有する形態も含まれる。
また、本発明によるグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド、すなわち三重活性体は、ペプチド自体、その塩（例えば、前記ペプチドの薬学的に許容される塩）又はその溶媒和物の形態が全て含まれる概念である。さらに、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドは、薬学的に許容されるものであれば、いかなる形態であってもよい。
前記塩の種類は、特に限定されるものではない。もっとも、個体、例えば哺乳類に安全かつ効果的な形態であることが好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。
前記「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用できる物質を意味する。
本発明における「薬学的に許容される塩」には、薬学的に許容される無機酸、有機酸又は塩基から誘導された塩が含まれる。好適な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸，マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。好適な塩基から誘導された塩には、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムなどが含まれる。
また、本発明における「溶媒和物」とは、本発明によるペプチド又はその塩が溶媒分子と複合体を形成したものを意味する。
なお、後述するインスリンには、前述した内容が全て適用される。
具体的な一態様として、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドは、一般式１で表されたアミノ酸配列を含む。
Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｘａａ７－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｘａａ１６－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｘａａ２０－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２７－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１，配列番号１０３）
一般式１において、Ｘａａ１はヒスチジン、４－イミダゾアセチル又はチロシンであり、Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ３はグルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘａａ７はトレオニン又はイソロイシンであり、Ｘａａ１０はロイシン、チロシン、リシン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ１２はリシン、セリン又はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はグルタミン、チロシン、アラニン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン、メチオニン又はチロシンであり、Ｘａａ１５はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシンであり、Ｘａａ１６はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ２０はリシン、グルタミン又はアルギニンであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、Ｘａａ２４はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘａａ２７はバリン、ロイシン、リシン又はメチオニンであり、Ｘａａ２８はシステイン、リシン、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸又はヒスチジンであり、Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシンもしくはヒスチジンであるか、又は存在せず、Ｒ１はシステイン、ＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴ（配列番号：１０６）、ｍ－ＳＳＧＡＰＰＰＳ－ｎ（配列番号１０７）もしくはｍ－ＳＳＧＱＰＰＰＳ－ｎ（配列番号１０８）であるか、又は存在せず、ここで、ｍはＣｙｓ、Ｐｒｏ又はＧｌｙ－Ｐｒｏであり、ｎはＣｙｓ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＨｉｓ－Ｇｌｙであるか、又は存在しない。
前記三重活性体の例として、配列番号１～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、配列番号１～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列（必須）からなるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本願に「特定配列番号で表されるペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、このような配列付加又は突然変異を有するものも本願に含まれることは言うまでもない。
以上の内容は、本発明の他の具体例又は他の態様にも適用されるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、一般式１において、Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン、アスパラギン酸又はロイシンであってもよい。ここで、一般式１において、Ｘａａ１４及びＸａａ１５を除く他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
このようなペプチドの例として、配列番号１～１２、１４～１７、及び２１～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドや、それら（必須）からなるペプチドが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
これらのペプチドは、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体の少なくとも１つを有意に活性化させることができるが、特にこれらに限定されるものではない。具体的には、ＧＬＰ－１を有意に活性化させるものであるか、さらにグルカゴン受容体及び／又はＧＩＰ受容体を有意に活性化させるものであるが、特にこれらに限定されるものではない。
より具体的には、一般式１において、Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、グルタミン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン、システイン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン、ロイシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン、グルタミン酸又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、バリン又はシステインであり、Ｘａａ２０はリシン、アルギニン又はグルタミンであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、Ｘａａ２４はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はロイシン又はリシンであるペプチドであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本態様における変数以外の一般式１の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
より具体的には、一般式１において、Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はチロシン、アラニン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Ｘａａ２０はリシン又はグルタミンであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸、システイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はバリンであり、Ｘａａ２４はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はロイシン又はリシンであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本態様における変数以外の一般式１の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
より具体的には、一般式１において、Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシン又はシステインであり、Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はチロシン、アラニン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Ｘａａ２０はリシン又はグルタミンであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はバリンであり、Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２７はロイシンであり、Ｘａａ２８はシステイン、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸であってもよい。
本態様における変数以外の一般式１の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
具体的には、一般式１において、Ｘａａ１はヒスチジン又は４－イミダゾアセチルであり、Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ３はグルタミンであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシンであり、Ｘａａ１２はイソロイシンであり、Ｘａａ１３はアラニン又はシステインであり、Ｘａａ１４はメチオニンであり、Ｘａａ１５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、Ｘａａ１７はイソロイシン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はグルタミン又はシステインであり、Ｘａａ２０はリシンであり、Ｘａａ２１はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はバリンであり、Ｘａａ２４はアスパラギンであり、Ｘａａ２７はロイシンであり、Ｘａａ２８はアラニン又はアスパラギンであり、Ｘａａ２９はグルタミン又はトレオニンであり、Ｘａａ３０はシステインもしくはリシンであるか、又は存在しない。
本態様における変数以外の一般式１の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
より具体的には、一般式１において、Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ３はグルタミンであり、Ｘａａ７はトレオニンであり、Ｘａａ１０はチロシン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ１２はリシンであり、Ｘａａ１３はチロシンであり、Ｘａａ１４はロイシンであり、Ｘａａ１５はアスパラギン酸であり、Ｘａａ１６はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン又はグルタミンであり、Ｘａａ２０はリシン又はグルタミンであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸、システイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はバリンであり、Ｘａａ２４はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Ｘａａ２７はロイシン又はリシンであり、Ｘａａ２９はグリシン、グルタミン、トレオニン又はヒスチジンであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本態様における変数以外の一般式１の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
このようなグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドは、ＧＬＰ－１受容体及びグルカゴン受容体の活性化の程度が有意であり、ＧＩＰ受容体の活性化の程度に比べて高くてもよく、ＧＬＰ－１受容体、グルカゴン受容体及びＧＩＰ受容体の活性化の程度が全て有意であってもよく、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体の活性化の程度が有意であり、グルカゴン受容体の活性化の程度に比べて高くてもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体の活性化の程度が有意であり、グルカゴン受容体の活性化の程度に比べて高い場合、体重減少効力を有すると共に血糖調節能力が向上したペプチドを提供することができ、ＧＬＰ－１受容体、グルカゴン受容体及びＧＩＰ受容体の活性化の程度が全て有意である場合、体重減少効果を最大化できるという利点がある。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
このようなペプチドの例として、配列番号８、９、２１～３７、３９、４２、４３、４９～６１、６４～８３、８５、８６、８８、８９、９１～９３、９５～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドや、それら（必須）からなるペプチドが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
具体的な態様として、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドは、一般式２で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｘａａ１６－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｘａａ２０－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｘａａ３１－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｘａａ４０（一般式２，配列番号１０４）
上記式において、Ｘａａ１は４－イミダゾアセチル、ヒスチジン又はチロシンであり、Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ１０はチロシン又はシステインであり、Ｘａａ１３はアラニン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、Ｘａａ１４はロイシン、メチオニン又はチロシンであり、Ｘａａ１５はアスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシンであり、Ｘａａ１６はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、システイン又はバリンであり、Ｘａａ２０はリシン、グルタミン又はアルギニンであり、Ｘａａ２１はシステイン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、Ｘａａ２４はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン又はグルタミン酸であり、Ｘａａ２８はリシン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２９はグリシン、グルタミン、システイン又はヒスチジンであり、Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン又はヒスチジンであり、Ｘａａ３１はプロリン又はシステインであり、Ｘａａ４０はシステインであるか、又は存在しない。
より具体的には、一般式２において、Ｘａａ１３はアラニン、チロシン又はシステインであり、Ｘａａ１５はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘａａ２１はシステイン、グルタミン酸、グルタミン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、Ｘａａ２４はシステイン、グルタミン又はアスパラギンであり、Ｘａａ２８はシステイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２９はグルタミン、システイン又はヒスチジンであり、Ｘａａ３０はシステイン、リシン又はヒスチジンであってもよい。
本態様における変数以外の一般式２の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
このようなグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの例として、配列番号２１、２２、４２、４３、５０、６４～７７、及び９５～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列、より具体的には、配列番号２１、２２、４２、４３、５０、６４～７７、及び９６～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドや、それら（必須）からなるペプチドが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
具体的な態様として、前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドは、一般式３のアミノ酸配列を含んでもよい。
Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｘａａ１３－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｘａａ３１－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｘａａ４０（一般式３，配列番号１０５）
一般式３において、Ｘａａ１はヒスチジン又はチロシンであり、Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、Ｘａａ１３はアラニン、チロシン又はシステインであり、Ｘａａ１７はアルギニン、システイン又はリシンであり、Ｘａａ１８はアラニン又はアルギニンであり、Ｘａａ１９はアラニン又はシステインであり、Ｘａａ２１はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２４はグルタミン又はアスパラギンであり、Ｘａａ２８はシステイン又はアスパラギン酸であり、Ｘａａ２９はシステイン、ヒスチジン又はグルタミンであり、Ｘａａ３０はシステイン又はヒスチジンであり、Ｘａａ３１はプロリン又はシステインであり、Ｘａａ４０はシステインであるか、又は存在しない。
このようなグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチドの例として、配列番号２１、２２、４２、４３、５０、６４～７１、７５～７７、及び９６～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドや、それら（必須）からなるペプチドが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
また、一般式１において、Ｒ１はシステイン、ＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴ（配列番号１０６）、ＣＳＳＧＱＰＰＰＳ（配列番号１０９）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１１０）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ（配列番号１１１）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１１２）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧ（配列番号１１３）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＨＧ（配列番号１１４）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＳ（配列番号１１５）、ＰＳＳＧＱＰＰＰＳ（配列番号１１６）もしくはＰＳＳＧＱＰＰＰＳＣ（配列番号１１７）であるか、又は存在しないが、特にこれらに限定されるものではない。
さらに、本発明のペプチドは、その長さに応じてこの分野で周知の方法、例えば自動ペプチド合成機により合成することができ、遺伝子操作技術により産生することができる。
具体的には、本発明のペプチドは、標準合成方法、組換え発現システム又は任意の他の当該分野の方法により作製することができる。よって、本発明によるペプチドは、例えば（ａ）ペプチドを固相もしくは液相法で段階的に又はフラグメント組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離及び精製する方法、（ｂ）ペプチドをコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法、（ｃ）ペプチドをコードする核酸作製物を無細胞試験管内で発現させ、発現生成物を回収する方法、又は（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の任意の組み合わせによりペプチドのフラグメントを得て、次にフラグメントを連結してペプチドを得ることにより当該ペプチドを回収する方法が含まれる多くの方法で合成することができる。
本発明における「インスリン」とは、膵臓のβ細胞から分泌されるホルモンの一種であり、一般に細胞内へのグルコース取り込みを促進し、脂肪の分解を抑制し、体内の血糖を調節する役割を果たす。インスリンは、血糖調節機能のないプロインスリン（proinsulin）前駆体の形態からプロセシングを経て血糖調節機能を有するインスリンとなる。インスリンは２つのポリペプチド鎖、すなわちそれぞれ２１個及び３０個のアミノ酸残基を含むＡ鎖及びＢ鎖からなり、それらは２つのジスルフィド架橋により互いに連結されている。前記インスリンは、ヒトインスリンであってもよい。天然ヒトインスリンのＡ鎖及びＢ鎖は、それぞれ配列番号１２１及び１２２で表示されるアミノ酸配列を含む。
Ａ鎖：
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１２１）
Ｂ鎖：
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ（配列番号１２２）
本発明における「プロインスリン（proinsulin）」とは、インスリンの前駆体分子を意味する。前記プロインスリンは、インスリンＡ鎖及びＢ鎖、並びにその間にＣ－ペプチドを含んでもよい。前記プロインスリンは、ヒトプロインスリンであってもよい。
本発明におけるインスリンは、天然インスリンであってもよく、天然インスリンの少なくとも１つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が生じたアナログ、誘導体又はフラグメントであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明における「インスリンアナログ（insulin analog）」とは、天然インスリンとは異なる非天然インスリンを意味する。
このインスリンアナログには、天然インスリンの一部のアミノ酸が付加、欠失又は置換により改変されたアナログが含まれる。例えば、天然インスリンのＢ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、３番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、２６番目のアミノ酸、２７番目のアミノ酸、２８番目のアミノ酸、２９番目のアミノ酸、３０番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、１８番目のアミノ酸、１９番目のアミノ酸、及び２１番目のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているか、又は欠失しているインスリンアナログであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明のインスリンアナログについては、特許文献５又は６（又は特許文献１及び２）に開示されており、それらの明細書の全文が本願に参考資料として援用される。
本発明に用いられるインスリンアナログは、単鎖であってもよく、二重鎖（two polypeptide chains）の形態であってもよく、二重鎖の形態がより好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。前記二重鎖は、天然インスリンのＡ鎖に対応するポリペプチドと、天然インスリンのＢ鎖に対応するポリペプチドの２つのポリペプチドからなるものであってもよい。ここで、前記天然インスリンのＡ鎖又はＢ鎖に対応するものとは、前記二重鎖のポリペプチドのいずれか一方の鎖と天然インスリンのＡ鎖又はＢ鎖の配列同一性を比較した場合に、少なくとも６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上又は９５％以上の配列同一性を有するものであるが、特にこれらに限定されるものではなく、二重鎖を構成する配列と天然インスリンのＡ鎖又はＢ鎖の配列との比較により当業者が容易に把握することができる。
本発明における「相同性（homology）」とは、野生型（wild type）タンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列と類似する程度を示すものであり、本発明のアミノ酸配列又は塩基配列と上記パーセント以上同一である配列を有する配列を含む。このような相同性は、２つの配列を肉眼で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析するバイオインフォマティクスアルゴリズム（bioinformatic algorithm）を用いて決定することもできる。上記２つのアミノ酸配列間の相同性は百分率で表される。有用な自動化されたアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group, Madison, W, USA）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで用いることができる。前記モジュールで自動化された配列アルゴリズムには、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ及びＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ配列配列アルゴリズムが含まれる。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬ Ｗが含まれるソフトウェアで自動化されている。
本発明に用いられるインスリンの配列及びそれをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩなどの公知のデータベースから得られる。
具体的な一実施例において、本発明のインスリンアナログは、一般式４で表される配列番号１１９のＡ鎖と、一般式５で表される配列番号１２０のＢ鎖とを含む組成物である。
［一般式４］
Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｘａａ５－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｘａａ１２－Ｌｅｕ－Ｘａａ１４－Ｇｌｎ－Ｘａａ１６－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｘａａ１９－Ｃｙｓ－Ｘａａ２１（配列番号１１９）
一般式４において、Ｘａａ１はアラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Ｘａａ２はアラニン又はイソロイシンであり、Ｘａａ５はアラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン又はアスパラギンであり、Ｘａａ１２はアラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン又はアスパラギンであり、Ｘａａ１４はアラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｘａａ１６はアラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Ｘａａ１９はアラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニン又はアスパラギンであり、Ｘａａ２１はアスパラギン、グリシン、ヒスチジン又はアラニンである。
［一般式５］
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｘａａ８－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｘａａ１６－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｘａａ２５－Ｔｙｒ－Ｘａａ２７－Ｘａａ２８－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ（配列番号１２０）
一般式５において、Ｘａａ８はアラニン又はグリシンであり、Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸であるか、又は存在せず、Ｘａａ２３はグリシン又はアラニンであり、Ｘａａ２４はアラニン又はフェニルアラニンであり、Ｘａａ２５はアラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であるか、又は存在せず、Ｘａａ２７はトレオニンであるか、又は存在せず、Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸であるか、又は存在しない（ここで、配列番号１２１のＡ鎖及び配列番号１２２のＢ鎖を含むペプチドは除く）。
より具体的には、前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択される１つのアミノ酸がアラニンに置換されたものであり、かつ／又はＡ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸もしくはアスパラギンに置換されたものであってもよく、特に配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８及び１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであるか、又は上記アミノ酸配列からなるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
また、前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の１６番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換されたものであり、かつ／又は２５番目のアミノ酸が欠失したものであり、かつ／又は天然インスリンのＡ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸もしくはアラニンに置換されたものであり、特に配列番号１４２もしくは１４４のアミノ酸配列を含むものであるか、又は前記アミノ酸配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。
また、前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の１６番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸に置換されたものであり、かつ／又は２５番目のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸に置換されたものであり、かつ／又は天然インスリンのＡ鎖の１４番目のアミノ酸がヒスチジン、リシン、アラニンもしくはアスパラギン酸に置換されたものであり、かつ／又は１９番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリンもしくはトレオニンに置換されたものであり、特に配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８及び１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであるか、又は前記アミノ酸配列からなるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
なお、本発明のインスリンアナログは、Ｃ－ペプチドが除去されていない単鎖インスリンの形態であり、一般式４で表される配列番号１１９のＡ鎖と、一般式５で表される配列番号１２０のＢ鎖とを含み、インスリンの活性及び機能を有する物質であってもよい。
また、本発明のインスリンアナログは、Ａ鎖とＢ鎖間にＣ－ペプチドを含むプロインスリンから前記Ｃ－ペプチドを除去して作製したものであってもよい。前記Ｃ－ペプチドの除去は、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、具体的にはトリプシン（Trypsin）とカルボキシペプチダーゼＢ（Carboxypeptidase B）の処理により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、本発明のインスリンアナログは、一般式４で表される配列番号１１９のＡ鎖と、一般式５で表される配列番号１２０のＢ鎖とからなるものであってもよく、より具体的には、前記Ａ鎖及びＢ鎖が互いに２つのジスルフィド架橋により連結された二重鎖インスリンの形態であるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、特定配列番号で表される、プロインスリン形態のインスリンアナログからＣ－ペプチドを除去して二重鎖の形態に作製したインスリンアナログも本発明に含まれることは言うまでもない。
具体的には、前記インスリンアナログは、天然インスリン、特に天然ヒトインスリン配列に次のアミノ酸改変を有するものであり、表４のアナログ１～２４から選択されるものである。
Figure 2022515229000002
本発明における「インスリン誘導体」には、天然インスリンと比較してアミノ酸配列に少なくとも１つの差異のあるペプチド、天然インスリン配列を修飾（modification）することにより改変されたペプチド、天然インスリンのように生体内の血糖調節機能を調節する天然インスリン模倣体が含まれる。この天然インスリンの誘導体は、生体内血糖調節機能を有するものであってもよい。
具体的には、インスリン誘導体は、天然インスリンの一部のアミノ酸が置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）及び修飾（modification）のいずれかの方法又はそれらの方法の組み合わせにより改変されたものであってもよい。
具体的には、天然インスリンのＡ鎖、Ｂ鎖とそれぞれ少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を示し、かつ／又はインスリンのアミノ酸の１つの残基の一部の基が化学的に置換（例えば、alpha-methylation、alpha-hydroxylation）、除去（例えば、deamination）もしくは修飾（例えば、N-methylation）された形態であってもよいが、これらに限定されるものではない。
誘導体作製のための様々な方法の組み合わせにより、本発明に用いられる天然インスリンの誘導体を作製することができる。
また、インスリン誘導体の作製のためのこのような改変には、Ｌ型もしくはＤ型アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸を用いた改変、並びに／あるいは天然配列を修飾又は翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内の共有結合など）することによる改変が全て含まれる。
さらに、インスリンのＮ及び／又はＣ末端に１つ又は１つ以上のアミノ酸が付加されたものが全て含まれる。
前記置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される２０種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐ、Ｇｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成及び購入することができるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明における「天然インスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体のフラグメント」とは、天然インスリン、インスリンアナログ又は天然インスリンの誘導体のＮ末端又はＣ末端の少なくとも１つのアミノ酸が欠失した形態を意味する。このようなフラグメントは、体内で血糖調節機能を有する。
また、本発明のインスリンアナログは、前記天然インスリンの誘導体及びフラグメントの作製に用いる各作製方法を単独で用いるか、組み合わせて用いて作製したものであってもよい。
具体的には、本発明によるインスリンアナログは、このような天然インスリンのＡ鎖及びＢ鎖の特定アミノ酸残基が改変されたものを含み、より具体的には、天然インスリンのＡ鎖の特定アミノ酸残基が改変され、かつ／又はＢ鎖の特定アミノ酸残基が改変されたものであってもよい。
本発明による薬学組成物は、インスリンの血糖調節能力を有するものであれば、（ａ）天然インスリン、（ｂ）インスリンアナログ、（ｃ）インスリン誘導体、（ｄ）それらのフラグメント、又は（ｅ）それらの組み合わせを有効成分の１つであるインスリンとして含むものであってもよい。
一具体例において、本発明のインスリン、又はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であってもよい。
本発明における、インスリン、又はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドの「持続型結合体」又は「結合体」とは、インスリン、又はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドと生体適合性物質が結合された構造を有し、前記生体適合性物質が結合されていないインスリン、又はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドより効力の持続性が向上したものを意味する。
前記持続型結合体における生体適合性物質は、インスリン、又はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドに共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明において、前記結合体の一構成要素であるインスリンは、天然配列を有するインスリンであるか、又は天然配列の少なくとも１つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾もしくはそれらの組み合わせの変異が生じたインスリンのアナログ、誘導体又はフラグメントであってもよいが、天然インスリンの血糖降下／上昇効果を有するものであれば、いかなるものでも本発明の結合体の一構成要素として用いられる。
本発明における「生体適合性物質」とは、生理活性物質（例えば、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド、インスリンなど）に結合され、生体適合性物質部又はキャリアに結合されていない生理活性物質より生理活性物質の効果の持続性を向上させることのできる物質を意味する。前記生体適合性物質は、生理活性物質に共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
具体的には、前記結合体は、化学式１で表される結合体である。
［化学式１］
Ｘ－Ｌａ－Ｆ
ここで、Ｘは前記インスリン、又はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド（すなわち、三重活性体）であり、Ｌはリンカーであり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの半減期を延長させることのできる物質である。
本発明の組成物は、（ａ）インスリンと、三重活性体とを含むものであってもよく、（ｂ）インスリンの持続型結合体と、三重活性体とを含むものであってもよく（ｃ）インスリンと、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、（ｄ）インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、前記持続型結合体の形態のインスリン又は三重活性体は、向上した体内持続性に基づいて優れた血糖調節効果を発揮すると共に、インスリンの副作用を改善することができる。
前記結合体におけるＦは、Ｘ、すなわちインスリン又は三重活性体の半減期を延長させることのできる物質であり、本発明の前記結合体の一部をなす構成である。
前記Ｆは、Ｘに共有化学結合又は非共有化学結合により互いに結合されたものであってもよく、Ｌを介して、Ｘに共有化学結合、非共有化学結合又はそれらの組み合わせにより互いに結合されたものであってもよい。
前記Ｘの半減期を延長させることのできる物質は、生体適合性物質であってもよく、例えば高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択されるものであるが、特にこれらに限定されるものではない。
前記エラスチンの場合、水溶性前駆体であるヒトトロポエラスチン（tropoelastin）であってもよく、それらの一部の配列又は一部の繰り返し単位の重合体であってもよく、例えばエラスチン様ポリペプチドであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
前記高分子重合体の例として、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール－プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される高分子重合体が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
前記ポリエチレングリコールとは、エチレングリコール同種重合体、ＰＥＧ共重合体、又はモノメチル置換ＰＥＧ重合体（ｍＰＥＧ）の形態を包括するものであるが、特にこれらに限定されるものではない。
また、前記生体適合性物質には、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸などのポリアミノ酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
さらに、脂肪酸は、生体内アルブミンとの結合力を有するものであるが、特にこれに限定されるものではない。
より具体的な例として、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ領域であり、さらに具体的にはＩｇＧ Ｆｃ領域であるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明のペプチド内の少なくとも１つのアミノ酸側鎖は、生体内で可溶性及び／又は半減期を向上させ、かつ／又はバイオアベイラビリティを増加させるために、このような生体適合性物質に接合されてもよい。また、このような改変は、治療学的タンパク質及びペプチドのクリアランス（clearance）を減少させる。
前述した生体適合性物質は、水溶性（両親媒性又は親水性）のもの及び／又は無毒性のもの及び／又は薬学的に許容されるものであってもよい。
前記Ｆは、Ｘに直接連結されたもの（すなわち、化学式１において、ａが０である）であってもよく、リンカーＬを介して連結されたものであってもよい。
本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び／又は重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の結合体の一部をなす構成である。
このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）領域を含んでもよいが、これに限定されるものではない。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が欠失した領域であってもよい。
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体である。しかし、これらに限定されるものではない。
また、一具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体形態（dimeric form）であってもよく、二量体形態の１つのＦｃ領域にＸ１分子が共有結合的に連結されたものであってもよく、ここで前記免疫グロブリンＦｃとＸは非ペプチド性重合体により互いに連結されたものであってもよい。一方、二量体形態の１つのＦｃ領域にＸ２分子が対称に結合されたものであってもよい。ここで、前記免疫グロブリンＦｃとＸは、非ペプチド性リンカーにより互いに連結されてもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。
例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２又は３２７～３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられてもよい。
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が欠失された誘導体、又は天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な種類の誘導体が用いられる。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献７、８などに開示されている。
分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知である（非特許文献１）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミド化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させたものであってもよい。
また、このようなＦｃ領域は、ヒトや、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得る方法であってもよい。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）2に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態において、ヒト由来のＦｃ領域は、微生物から得られた組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する。
本発明における「糖鎖の除去（Deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化（Aglycosylation）とは、原核動物、より具体的な実施形態においては大腸菌で産生されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、より具体的な実施形態においてはヒト起源である。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来であるか、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃ領域である。より具体的な実施形態においては、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であり、さらに具体的な実施形態においては、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることと知られているＩｇＧ由来である。一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域であるが、これらに限定されるものではない。
一方、本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。
また、前述した結合体は、天然インスリンもしくは三重活性体、又はＦが修飾されていないＸに比べて、効力の持続性が向上したものであってもよく、そのような結合体には、前述した形態だけでなく、生分解性ナノパーティクルに封入された形態などが全て含まれる。
また、前記Ｌは、ペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーであってもよい。
前記Ｌがペプチド性リンカーである場合、１つ以上のアミノ酸を含み、例えば１個～１０００個のアミノ酸を含むが、特にこれらに限定されるものではない。本発明において、ＦとＸを連結するために、公知の様々なペプチドリンカーが用いられ、例えば［ＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＧＳ］ｘリンカーなどが挙げられ、ここでｘは１以上の自然数である。しかし、上記例に限定されるものではない。
本発明における「非ペプチド性リンカー」には、繰り返し単位が少なくとも２つ結合された生体適合性重合体が含まれる。前記繰り返し単位は、ペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。前記非ペプチド性リンカーは、本発明の結合体の一部をなす構成であり、化学式１のＬに該当する。本発明における前記非ペプチド性リンカーは、非ペプチド性重合体と混用される。
本発明における非ペプチド性リンカーは、末端に反応基を含み、結合体を構成する他の構成要素との反応により結合体を形成することができる。両末端に反応性官能基を有する非ペプチド性リンカーが各反応基を介して化学式１のＸ及びＦに結合することにより結合体を形成する場合、前記非ペプチド性リンカー又は非ペプチド性重合体を非ペプチド性リンカー連結部又は非ペプチド性重合体連結部（linker moiety）ともいう。
前記Ｌａにおいて、ａは１以上であってもよく、ａが２以上であればそれぞれのＬは独立したものであってもよい。
また、具体的な一実施形態における前記結合体は、Ｆ、具体的には免疫グロブリンＦｃ領域、及びＸ、具体的にはペプチド薬物に結合される反応基を両末端に含む非ペプチド性リンカーを介して、ＦとＸが互いに共有結合的に連結されたものであってもよい。
具体的には、前記非ペプチド性リンカーは、脂肪酸、サッカライド（saccharide）、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。
本発明における前記高分子重合体は、０超、約１００ｋＤａ以下の範囲、具体的には約１～約１００ｋＤａの範囲、より具体的には約１～約２０ｋＤａの範囲であるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明における「約」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値が全て含まれるが、これらに限定されるものではない。
前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール－プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。より具体的な実施形態における前記Ｌは、ポリエチレングリコールであるが、これに限定されるものではない。また、当該分野で公知のそれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明に含まれる。
本発明に用いられる非ペプチド性リンカーは、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であればいかなるものでもよい。非ペプチド性重合体の分子量は、約１～約１００ｋＤａの範囲、具体的には約１～約２０ｋＤａの範囲であるが、これらに限定されるものではない。また、前記Ｆに該当するポリペプチドに結合される本発明の非ペプチド性リンカーは、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
具体的な一実施形態における前記非ペプチド性リンカーの両末端は、それぞれＦ、例えば免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ基又はチオール基、及びＸのアミノ基又はチオール基に結合することができる。
具体的には、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれＦ（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）とＸに結合される反応基、具体的には、Ｘ、あるいはＦ（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域）のＮ末端もしくはリシンに位置するアミノ基、又はシステインのチオール基に結合される反応基を含むが、これらに限定されるものではない。
また、Ｆ、例えば免疫グロブリンＦｃ領域、及びＸに結合される前記非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
上記において、アルデヒド基の例として、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられるが、これらに限定されるものではない。
非ペプチド性リンカーは、このような反応基を介してＸとＦに連結されるが、特にこれに限定されるものではない。
また、アルデヒド結合による還元性アミン化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりはるかに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
また、前記非ペプチド性リンカーの両末端の反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有してもよい。しかし、非ペプチド性リンカーの各末端にＦ、具体的には免疫グロブリンＦｃ領域とＸが結合されるものであれば、特にこれらに限定されるものではない。
例えば、前記非ペプチド性リンカーの一末端には反応基としてマレイミド基を含み、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などを含んでもよい。
両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応基として活性化するか、市販されている修飾された反応基を有するポリエチレングリコールを用いることにより、本発明の持続型タンパク質結合体を作製することができる。
具体的な一実施形態において、前記非ペプチド性重合体は、三重活性体のシステイン残基、より具体的にはシステインの－ＳＨ基に連結されたものであるが、これらに限定されるものではない。
例えば、前記三重活性体において、１０番目のシステイン残基、１３番目のシステイン残基、１５番目のシステイン残基、１７番目のシステイン残基、１９番目のシステイン残基、２１番目のシステイン残基、２４番目のシステイン残基、２８番目のシステイン残基、２９番目のシステイン残基、３０番目のシステイン残基、３１番目のシステイン残基、４０番目のシステイン残基、又は４１番目のシステイン残基に前記非ペプチド性重合体が連結されたものが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
具体的には、前記システイン残基の－ＳＨ基に非ペプチド性重合体の反応基が連結されてもよい。反応基については前述した通りである。マレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドを用いる場合、マレイミド基はＸの－ＳＨ基にチオエーテル（thioether）結合で連結することができ、アルデヒド基はＦ、具体的には免疫グロブリンＦｃの－ＮＨ2基に還元的アミン化反応により連結することができるが、これらに限定されるものではなく、これらは一例にすぎない。
具体的な一実施形態における前記非ペプチド性重合体は、インスリン又はそのアナログのアミノ基、より具体的にはＮ末端に位置するアミノ基、又はリシンの側鎖に位置するアミノ基に連結されたものであってもよいが、これらに限定されるものではなく、これらは一例にすぎない。
また、前記結合体において、非ペプチド性重合体の反応基が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置する－ＮＨ2に連結されたものであってもよいが、これは一例にすぎない。
本発明における「予防」とは、前記組成物の投与によりインスリン関連疾患の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、前記組成物の投与によりインスリン関連疾患の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、特にこれらに限定されるものではないが、前記組成物を生体内標的に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路で投与することができ、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。
本発明による薬学組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
本発明における「薬学的に許容される」とは、治療効果を発揮する程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。
薬学的に許容される担体は、経口投与の場合は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを用いることができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して様々に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。
なお、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
さらに、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有してもよい。
さらに、前記結合体は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容される様々な担体（carrier）と混合して用いることができ、安定性や吸水性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）、グルタチオンなどの抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤、低分子タンパク質、他の安定化剤（stabilizers）などを薬剤として用いることができる。
本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。
本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与してもよく、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。具体的には、本発明の結合体の総用量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ～５００ｍｇであることが好ましい。しかし、前記結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、***率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。
また、本発明の前記薬学的組成物は、上記併用剤、すなわち三重活性体又はその持続型結合体、及びインスリン又はその持続型結合体（又は上記併用剤の各成分）を０．０１～９９％（ｗ／ｖ）含有してもよい。
本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与患者における体重減少のための複合製剤を提供する。
前記インスリン、並びにグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドと共に組成物に含まれる成分については前述した通りである。
具体的には、前記複合製剤は、（ａ）インスリンと、三重活性体とを含むものであってもよく、（ｂ）インスリンとその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、インスリンの持続型結合体と、三重活性体とを含むものであってもよく、（ｃ）インスリンと、三重活性体とその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、（ｄ）インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよい。
具体的には、前記複合製剤は、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを全て含み、ここでインスリン：三重活性体が１：１～１００：１のモル比となるように含むものであるか、インスリン：三重活性体が１：１～１：１００のモル比となるように含むものであり、また、インスリン又はその持続型結合体：三重活性体又はその持続型結合体が１：１～１００：１のモル比となるように含むものであるか、インスリン又はその持続型結合体：三重活性体又はその持続型結合体が１：１～１：１００のモル比となるように含むものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むキットを提供する。
前記インスリン、並びにグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドについては前述した通りである。
前記キットは、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドの投与のための指示書を含んでもよい。
具体的には、前記キットは、（ａ）インスリンと、三重活性体とを含むものであってもよく、（ｂ）インスリンとその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、インスリンの持続型結合体と、三重活性体とを含むものであってもよく、（ｃ）インスリンと、三重活性体とその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、（ｄ）インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよい。
具体的には、前記キットは、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを全て含み、ここでインスリン：三重活性体を１：１～１００：１のモル比、又は１：１～１：１００のモル比で個体に投与させる指示書を含むものであってもよく、インスリン又はその持続型結合体：三重活性体又はその持続型結合体を１：１～１００：１のモル比、又は１：１～１：１００のモル比で個体に投与させる指示書を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明を実現する一態様は、薬剤の製造における、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む組成物又は複合製剤の用途を提供する。
前記組成物又は複合製剤については前述した通りである。前記薬剤は、前述した全ての用途に用いられる。
本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療方法を提供する。
本発明を実現する一態様は、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法を提供する。
具体的には、本発明を実現する一態様は、（ｉ）インスリンと、（ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法を提供する。
前記個体は、インスリン関連疾患を発症するリスクのある個体であってもよく、発症した個体であってもよい。また、インスリン投与が必要な個体であってもよく、インスリン投与が必要な個体であって、体重減少が必要な個体であってもよい。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
前記投与するステップは、（ａ）インスリンと、三重活性体を併用投与することにより行ってもよく、（ｂ）インスリンの持続型結合体と、三重活性体を併用投与することにより行ってもよく、（ｃ）インスリンと、三重活性体の持続型結合体を併用投与することにより行ってもよく、（ｄ）インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体を併用投与することにより行ってもよい。
本願における「併用」とは、同時、順次又は個別投与を意味するものと理解されるべきである。前記投与が順次又は個別の場合、２次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないものでなければならない。
前記物質は、それぞれ同時、順次又は逆順に投与してもよく、適切な有効量の組み合わせで同時に投与してもよいが、特定の投与方法又は順序に限定されるものではない。
また、本発明の予防又は治療方法は、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかを含む組成物又は複合製剤を個体に投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを含む本発明の組成物又は複合製剤は、インスリンの活性又は機能を補充し、血糖を著しく低下させると共に、体重増加などのインスリンの副作用を抑制するので、インスリン関連疾患治療に優れた効果を発揮する。
また、前記組成物又は複合製剤は、薬学的分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単回投与型の製剤、具体的にはタンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化し、当該技術分野で通常用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内もしくは直腸経路が含まれる非経口投与経路で投与することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法は、前記有効成分を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。好適な総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否か、具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に又は同時に投与される薬物をはじめとする様々な因子や、医薬分野で周知の類似の因子に応じて異なる量であることが好ましい。
具体的には、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体は、インスリン：三重活性体を１：１～１００：１のモル比、又は１：１～１：１００のモル比で個体に投与してもよく、インスリン又はその持続型結合体：三重活性体又はその持続型結合体を１：１～１００：１のモル比、又は１：１～１：１００のモル比で個体に投与してもよいが、これらに限定されるものではない。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
三重活性体及びその持続型結合体の作製
（１）三重活性体の作製
グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体の全てに活性を有する三重活性体を作製した。表１にその配列を示す。
Figure 2022515229000003

Figure 2022515229000004


Figure 2022515229000005


Figure 2022515229000006


Figure 2022515229000007


Figure 2022515229000008


Figure 2022515229000009


Figure 2022515229000010
表１の配列において、Ｘで表記したアミノ酸は非天然アミノ酸であるＡｉｂ（aminoisobutyric acid）を意味し、下線を引いたアミノ酸は当該アミノ酸が互いに環を形成することを意味する。また、表１の配列において、ＣＡは４－イミダゾアセチル（4-imidazoacetyl）を意味し、Ｙはチロシンを意味する。
（２）三重活性体の持続型結合体の作製
両末端にそれぞれマレイミド基及びアルデヒド基を有する１０ｋＤａのＰＥＧ、すなわちマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒド（１０ｋＤａ，NOF，日本）を実施例１の三重活性体（配列番号２１、２２、４２、４３、５０、７７及び９６）のシステイン残基にペグ化するために、三重活性体とマレイミド－ＰＥＧ－アルデヒドのモル比を１：１～３とし、タンパク質の濃度を１～５ｍｇ／ｍｌとし、低温で０．５～３時間反応させた。ここで、反応は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に２０～６０％イソプロパノールを添加した環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をＳＰセファロースＨＰ（GE healthcare, 米国）に適用し、システインにモノペグ化された三重活性体を精製した。
次に、前記精製したモノペグ化三重活性体と免疫グロブリンＦｃのモル比を１：１～５とし、タンパク質の濃度を１０～５０ｍｇ／ｍｌとし、４～８℃で１２～１８時間反応させた。反応は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に還元剤である１０～５０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムと１０～３０％イソプロパノールを添加した環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をブチルセファロースＦＦ精製カラム（GE healthcare, 米国）とＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ精製カラム（GE healthcare, 米国）に適用し、三重活性体と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体を精製した。
作製後に逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーで分析した純度は９５％以上であった。
ここで、配列番号２１の三重活性体及び免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを介して連結された結合体を「配列番号２１と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体」、「配列番号２１の持続型結合体」又は「配列番号２１持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号２２の三重活性体及び免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを介して連結された結合体を「配列番号２２と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体」、「配列番号２２の持続型結合体」又は「配列番号２２持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号４２の三重活性体及び免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを介して連結された結合体を「配列番号４２と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体」、「配列番号４２の持続型結合体」又は「配列番号４２持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号４３の三重活性体及び免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを介して連結された結合体を「配列番号４３と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体」、「配列番号４３の持続型結合体」又は「配列番号４３持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号５０の三重活性体及び免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを介して連結された結合体を「配列番号５０と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体」、「配列番号５０の持続型結合体」又は「配列番号５０持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号７７の三重活性体及び免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを介して連結された結合体を「配列番号７７と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体」、「配列番号７７の持続型結合体」又は「配列番号７７持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号９６の三重活性体及び免疫グロブリンＦｃがＰＥＧを介して連結された結合体を「配列番号９６と免疫グロブリンＦｃとを含む結合体」、「配列番号９６の持続型結合体」又は「配列番号９６持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
天然インスリンの持続型結合体の作製
天然ヒトインスリン（インド，Biocon社）のＢ鎖のＮ末端に３．４Ｋ ｐｒｏｐｉｏｎ－ＡＬＤ（２） ＰＥＧ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基を１つずつ有する３．４ｋＤａのＰＥＧ，米国，NOF社）をペグ化するために、天然インスリン：ＰＥＧのモル比を１： ４とし、天然インスリンの濃度を５ｍｇ／ｍｌとし、４℃で約２時間反応させた。ここで、反応は、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と４５％イソプロパノールの混合溶媒において、３ｍＭの濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride （ＮａＣＮＢＨ3））還元剤を添加して行った。反応液は、クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、４５％ＥｔＯＨを含むバッファとＫＣｌの濃度勾配を用いたＳＰ－ＨＰ（GE Healthcare）カラムで精製した。
次に、前記天然インスリンが結合されたＰＥＧを免疫グロブリンＦｃフラグメントのＮ末端に結合させるために、前記精製したモノペグ化（mono-PEGylated）インスリンと免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比を１：１．２とし、総タンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、２５℃で１５時間反応させた。ここで、反応液は、１００ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ８．２）と塩化ナトリウムに、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。
反応終了後に、反応液は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーとＮａＣｌの濃度勾配を用いてＱ－ＨＰ（GE, 米国）カラムに適用し、硫酸アンモニウム（ammoniumsulfate）とＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の濃度勾配を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（GE, 米国）に適用し、天然インスリン－３．４Ｋ ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃ結合体を精製した。
実験例１：三重活性体及びその持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定
実施例１で製造した三重活性体及びその持続型結合体の活性を測定するために、ＧＬＰ－１受容体、グルカゴン（ＧＣＧ）受容体及びＧＩＰ受容体がそれぞれ形質転換された細胞株を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞活性を測定する方法を行った。
前記各細胞株は、ＣＨＯ（chinese hamster ovary）にヒトＧＬＰ－１受容体、ヒトＧＣＧ受容体及びヒトＧＩＰ受容体遺伝子をそれぞれ発現するように形質転換されたものであり、ＧＬＰ－１、ＧＣＧ及びＧＩＰの活性を測定するのに適している。よって、各部分の活性を各形質転換細胞株を用いて測定した。
実施例１及び２で作製した三重活性体及びその持続型結合体のＧＬＰ－１活性の測定のために、ヒトＧＬＰ－１を連続的に希釈し、実施例１及び２で作製した三重活性体及びその持続型結合体を連続的に希釈した。前記培養したヒトＧＬＰ－１受容体が発現したＣＨＯ細胞から培養液を除去し、連続的に希釈した各物質を５μｌずつ前記細胞に添加し、次いでｃＡＭＰ抗体を含む緩衝液を５μｌずつ追加し、その後常温で１５分間培養した。次に、細胞溶解緩衝液（cell lysis buffer）を含むｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘを１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、常温で９０分間反応させた。前記反応が終了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ｋｉｔ（PerkinElmer, USA）に適用し、蓄積されたｃＡＭＰからＥＣ50値を算出し、相互比較した。ヒトＧＬＰ－１に対する相対力価を表２及び表３に示す。
実施例１及び２で作製した三重活性体及びその持続型結合体のＧＣＧ活性の測定のために、ヒトＧＣＧを連続的に希釈し、実施例１及び２で作製した三重活性体及びその持続型結合体を連続的に希釈した。前記培養したヒトＧＣＧ受容体が発現したＣＨＯ細胞から培養液を除去し、連続的に希釈した各物質を５μｌずつ前記細胞に添加し、次いでｃＡＭＰ抗体を含む緩衝液を５μｌずつ追加し、その後常温で１５分間培養した。次に、細胞溶解緩衝液（cell lysis buffer）を含むｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘを１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、常温で９０分間反応させた。前記反応が終了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ｋｉｔ（PerkinElmer, USA）に適用し、蓄積されたｃＡＭＰからＥＣ50値を算出し、相互比較した。ヒトＧＣＧに対する相対力価を表２及び表３に示す。
実施例１及び２で作製した三重活性体及びその持続型結合体のＧＩＰ活性の測定のために、ヒトＧＩＰを連続的に希釈し、実施例１及び２で作製した三重活性体及びその持続型結合体を連続的に希釈した。前記培養したヒトＧＩＰ受容体が発現したＣＨＯ細胞から培養液を除去し、連続的に希釈した各物質を５μｌずつ前記細胞に添加し、次いでｃＡＭＰ抗体を含む緩衝液を５μｌずつ追加し、その後常温で１５分間培養した。次に、細胞溶解緩衝液（cell lysis buffer）を含むｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘを１０μｌずつ加えて細胞を溶解させ、常温で９０分間反応させた。前記反応が終了した細胞溶解物をＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ ｋｉｔ（PerkinElmer, USA）に適用し、蓄積されたｃＡＭＰからＥＣ50値を算出し、相互比較した。ヒトＧＩＰに対する相対力価を表２及び表３に示す。
三重活性体の相対力価
Figure 2022515229000011

Figure 2022515229000012


Figure 2022515229000013
三重活性体持続型結合体の相対力価
Figure 2022515229000014
実験例２：インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与による２型糖尿病モデルマウスにおける血糖調節効果及び体重変化（△Body weight）の確認
実施例１で作製した三重活性体（配列番号４２）の持続型結合体、もしくは実施例２で作製した天然インスリンの持続型結合体を含む組成物の投与、又は三重活性体（配列番号４２）の持続型結合体及び天然インスリンの持続型結合体の併用投与によるインビボ（in vivo）効力を測定するために、２型糖尿病モデルであるｄｂ／ｄｂマウス（Charles River, Japan）を用いた。ｄｂ／ｄｂマウス（BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd mouse）は、レプチン（leptin）受容体の除去により糖尿病症状を示すので本実験例に用いた。
８週齢のｄｂ／ｄｂマウスの尾静脈から２６Ｇ注射器で得た１～２滴の血液を用いて、血糖分析器（OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., USA）で血糖を測定した。測定された血糖に基づいて糖尿病が誘発されたか否かを判断した（３５０～６００ｍｇ／ｄｌの範囲）。糖尿病が誘導されたマウスを血糖に応じて１群当たり７匹ずつ、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４の４つの群に分けた。
上記群を、それぞれ対照群（Vehicle）、天然インスリンの持続型結合体（１５．８ｎｍｏｌ／ｋｇ／Ｑ２Ｄ）を投与した群、三重活性体の持続型結合体（１．４ｎｍｏｌ／ｋｇ／Ｑ２Ｄ）投与した群、天然インスリンの持続型結合体（１５．８ｎｍｏｌ／ｋｇ／Ｑ２Ｄ）及び三重活性体の持続型結合体（１．４ｎｍｏｌ／ｋｇ／Ｑ２Ｄ）を併用投与した群に分けた。そして、上記試験物質を２週間にわたって繰り返し投与し、その後上記各群に対してグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を測定した。グリコヘモグロビンは赤血球に正常に存在する血色素に糖が結合した形態であり、血糖が高く維持されるとグリコヘモグロビン値も高くなる。また、薬物投与前と試験最終日に試験動物の体重変化値（△Body weight）を計算した。
その結果、天然インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与群においてグリコヘモグロビン値が低下することが確認された（図１）。具体的には、図１において、対照群と比較したグリコヘモグロビン値の変化は、インスリンの持続型結合体投与群は－０．１であり、三重活性体の持続型結合体投与群は－０．３であり、インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与群は－０．５である。
これは、天然インスリンの持続型結合体又は三重活性体の持続型結合体をそれぞれ投与した群に比べて著しく改善された結果である。
△Ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ測定の結果、天然インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体を併用投与した群は、天然インスリンの持続型結合体の単独投与群より体重増加効果が改善されるだけでなく、対照群と比べても著しい体重減少効果を示す（図２）。具体的には、図２に示すように、対照群は＋１５．８％であり、インスリンの持続型結合体投与群は＋２３．１％であり、三重活性体の持続型結合体投与群は－９．３％であり、インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与群は－３．８％である。
これらの結果は、本発明のインスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体を併用投与すると、それぞれの単独投与に比べて優れた血糖調節効果を示すことを意味し、また、インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与は、インスリン単独投与による体重増加の副作用を大幅に減少させることを示唆するものである。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims (60)

  1. （ｉ）インスリンと、
    （ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１（Glucagon-like peptide-1）受容体、及びＧＩＰ（Glucose-dependent insulinotropic polypeptide）受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用薬学組成物。
  2. 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であり、
    前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記組成物は、インスリン投与が求められる個体に投与されるものである、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記インスリン関連疾患は、インスリン抵抗性疾患、糖尿病、過血糖症及び肥満からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記組成物は、血糖降下効力及びインスリン単独投与の際に現れる体重増加を抑制する効力をどちらも有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、
    ここで、インスリン又はその結合体：グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が１：１～１００：１のモル比となるように含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、
    ここで、インスリン又はその結合体：グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が１：１～１：１００のモル比となるように含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、天然グルカゴン配列の少なくとも１つのアミノ酸の置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた、天然グルカゴンのアナログである、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 付加されるアミノ酸配列は、天然ＧＬＰ－１、天然ＧＩＰ又は天然エキセンジン－４のアミノ酸配列に由来するものである、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、下記一般式１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の組成物。
    Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｘａａ７－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｘａａ１２－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｘａａ１６－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｘａａ２０－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２７－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｒ１（一般式１，配列番号１０３）
    前記一般式１において、
    Ｘａａ１はヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、４－イミダゾアセチル（ＣＡ）又はチロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）であり、
    Ｘａａ２はグリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂ（aminoisobutyric acid）であり、
    Ｘａａ３はグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）又はグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）であり、
    Ｘａａ７はトレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）であり、
    Ｘａａ１０はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）又はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）であり、
    Ｘａａ１２はリシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）又はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）であり、
    Ｘａａ１３はグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）、アラニン（Ａｌａ，Ａ）又はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）であり、
    Ｘａａ１４はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）又はチロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）であり、
    Ｘａａ１５はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）又はロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）であり、
    Ｘａａ１６はグリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）又はセリン（Ｓｅｒ，Ｓ）であり、
    Ｘａａ１７はグルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）又はリシン（Ｌｙｓ，Ｋ）であり、
    Ｘａａ１８はアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）であり、
    Ｘａａ１９はアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）又はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）であり、
    Ｘａａ２０はリシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）又はアルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）であり、
    Ｘａａ２１はグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）であり、
    Ｘａａ２３はイソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）又はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）であり、
    Ｘａａ２４はアラニン（Ａｌａ，Ａ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）であり、
    Ｘａａ２７はバリン（Ｖａｌ，Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）又はメチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）であり、
    Ｘａａ２８はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）、アラニン（Ａｌａ，Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）であり、
    Ｘａａ２９はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）であり、
    Ｘａａ３０はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、リシン（Ｌｙｓ，Ｋ）もしくはヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）であるか、又は存在せず、
    Ｒ１はシステイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、ＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴ（配列番号１０６）、ｍ－ＳＳＧＡＰＰＰＳ－ｎ（配列番号１０７）もしくはｍ－ＳＳＧＱＰＰＰＳ－ｎ（配列番号１０８）であるか、又は存在せず、
    ここで、
    ｍはＣｙｓ、Ｐｒｏ又はＧｌｙ－Ｐｒｏであり、
    ｎはＣｙｓ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＨｉｓ－Ｇｌｙであるか、又は存在しない。
  13. Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、Ｘａａ１５はシステイン、アスパラギン酸又はロイシンである、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記一般式１において、
    Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、
    Ｘａａ７はトレオニンであり、
    Ｘａａ１０はチロシン、システイン又はバリンであり、
    Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、
    Ｘａａ１３はチロシン、アラニン、グルタミン又はシステインであり、
    Ｘａａ１４はロイシン、システイン又はメチオニンであり、
    Ｘａａ１５はシステイン、ロイシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン、グルタミン酸又はリシンであり、
    Ｘａａ１８はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、バリン又はシステインであり、
    Ｘａａ２０はリシン、アルギニン又はグルタミンであり、
    Ｘａａ２１はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、
    Ｘａａ２４はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２７はロイシン又はリシンである、請求項１２に記載の組成物。
  15. 前記ペプチドは、下記一般式２で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１２に記載の組成物。
    Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ１０－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｘａａ１３－Ｘａａ１４－Ｘａａ１５－Ｘａａ１６－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｘａａ２０－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｘａａ３１－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｘａａ４０（一般式２，配列番号１０４）
    前記一般式２において、
    Ｘａａ１は４－イミダゾアセチル、ヒスチジン又はチロシンであり、
    Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、
    Ｘａａ１０はチロシン又はシステインであり、
    Ｘａａ１３はアラニン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、
    Ｘａａ１４はロイシン、メチオニン又はチロシンであり、
    Ｘａａ１５はアスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシンであり、
    Ｘａａ１６はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、
    Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン又はリシンであり、
    Ｘａａ１８はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、システイン又はバリンであり、
    Ｘａａ２０はリシン、グルタミン又はアルギニンであり、
    Ｘａａ２１はシステイン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、
    Ｘａａ２４はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン又はグルタミン酸であり、
    Ｘａａ２８はリシン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２９はグリシン、グルタミン、システイン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リシン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ３１はプロリン又はシステインであり、
    Ｘａａ４０はシステインであるか、又は存在しない。
  16. 前記一般式１において、
    Ｘａａ２はグリシン、α－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、
    Ｘａａ７はトレオニンであり、
    Ｘａａ１０はチロシン、システイン又はバリンであり、
    Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、
    Ｘａａ１３はチロシン、アラニン又はシステインであり、
    Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、
    Ｘａａ１５はシステイン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、
    Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン又はシステインであり、
    Ｘａａ２０はリシン又はグルタミンであり、
    Ｘａａ２１はグルタミン酸、システイン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２３はバリンであり、
    Ｘａａ２４はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２７はロイシン又はリシンである、請求項１２に記載の組成物。
  17. 前記一般式２において、
    Ｘａａ１３はアラニン、チロシン又はシステインであり、
    Ｘａａ１５はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
    Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、システイン又はリシンであり、
    Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ２１はシステイン、グルタミン酸、グルタミン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２３はイソロイシン又はバリンであり、
    Ｘａａ２４はシステイン、グルタミン又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ２８はシステイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２９はグルタミン、システイン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ３０はシステイン、リシン又はヒスチジンである、請求項１５に記載の組成物。
  18. 前記一般式１において、
    Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、
    Ｘａａ７はトレオニンであり、
    Ｘａａ１０はチロシン又はシステインであり、
    Ｘａａ１２はリシン又はイソロイシンであり、
    Ｘａａ１３はチロシン、アラニン又はシステインであり、
    Ｘａａ１４はロイシン又はメチオニンであり、
    Ｘａａ１５はシステイン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、
    Ｘａａ１７はアルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、
    Ｘａａ１８はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン又はシステインであり、
    Ｘａａ２０はリシン又はグルタミンであり、
    Ｘａａ２１はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２３はバリンであり、
    Ｘａａ２４はグルタミン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２７はロイシンであり、
    Ｘａａ２８はシステイン、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸である、請求項１２に記載の組成物。
  19. 前記一般式１において、
    Ｘａａ１はヒスチジン又は４－イミダゾアセチルであり、
    Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、
    Ｘａａ３はグルタミンであり、
    Ｘａａ７はトレオニンであり、
    Ｘａａ１０はチロシンであり、
    Ｘａａ１２はイソロイシンであり、
    Ｘａａ１３はアラニン又はシステインであり、
    Ｘａａ１４はメチオニンであり、
    Ｘａａ１５はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ１６はグルタミン酸であり、
    Ｘａａ１７はイソロイシン又はリシンであり、
    Ｘａａ１８はアラニン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ１９はグルタミン又はシステインであり、
    Ｘａａ２０はリシンであり、
    Ｘａａ２１はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２３はバリンであり、
    Ｘａａ２４はアスパラギンであり、
    Ｘａａ２７はロイシンであり、
    Ｘａａ２８はアラニン又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ２９はグルタミン又はトレオニンであり、
    Ｘａａ３０はシステインもしくはリシンであるか、又は存在しない、請求項１２に記載の組成物。
  20. 前記ペプチドは、下記一般式３のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１１に記載の組成物。
    Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｘａａ１３－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｘａａ１７－Ｘａａ１８－Ｘａａ１９－Ｌｙｓ－Ｘａａ２１－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ｘａａ２４－Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｘａａ２８－Ｘａａ２９－Ｘａａ３０－Ｘａａ３１－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｘａａ４０（一般式３，配列番号１０５）
    前記一般式３において、
    Ｘａａ１はヒスチジン又はチロシンであり、
    Ｘａａ２はα－メチルグルタミン酸又はＡｉｂであり、
    Ｘａａ１３はアラニン、チロシン又はシステインであり、
    Ｘａａ１７はアルギニン、システイン又はリシンであり、
    Ｘａａ１８はアラニン又はアルギニンであり、
    Ｘａａ１９はアラニン又はシステインであり、
    Ｘａａ２１はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２４はグルタミン又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ２８はシステイン又はアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ２９はシステイン、ヒスチジン又はグルタミンであり、
    Ｘａａ３０はシステイン又はヒスチジンであり、
    Ｘａａ３１はプロリン又はシステインであり、
    Ｘａａ４０はシステインであるか、又は存在しない。
  21. 前記Ｒ１は、システイン、ＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴ（配列番号１０６）、ＣＳＳＧＱＰＰＰＳ（配列番号１０９）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１１０）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ（配列番号１１１）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１１２）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧ（配列番号１１３）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＨＧ（配列番号１１４）、ＰＳＳＧＡＰＰＰＳＳ（配列番号１１５）、ＰＳＳＧＱＰＰＰＳ（配列番号１１６）もしくはＰＳＳＧＱＰＰＰＳＣ（配列番号１１７）であるか、又は存在しない、請求項１２に記載の組成物。
  22. 前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、配列番号１～１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
  23. 前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の組成物。
  24. 前記一般式において、Ｎ末端から１６番目のアミノ酸と２０番目のアミノ酸は、互いに環を形成する、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、そのＣ末端がアミド化したものである、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記インスリンは、天然インスリン、又は天然インスリンの少なくとも１つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が生じたインスリンアナログである、請求項１に記載の組成物。
  27. 前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、３番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、２６番目のアミノ酸、２７番目のアミノ酸、２８番目のアミノ酸、２９番目のアミノ酸、３０番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、５番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、１２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸、１６番目のアミノ酸、１７番目のアミノ酸、１８番目のアミノ酸、１９番目のアミノ酸、及び２１番目のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているか、欠失しているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログである、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記インスリンアナログは、下記一般式４で表される配列番号１１９のＡ鎖と、下記一般式５で表される配列番号１２０のＢ鎖とを含む、請求項２２６に記載の組成物。
    ［一般式４］
    Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｘａａ５－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｘａａ１２－Ｌｅｕ－Ｘａａ１４－Ｇｌｎ－Ｘａａ１６－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｘａａ１９－Ｃｙｓ－Ｘａａ２１（配列番号１１９）
    前記一般式４において、
    Ｘａａ１はアラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ２はアラニン又はイソロイシンであり、
    Ｘａａ５はアラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ１２はアラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ１４はアラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ１６はアラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ１９はアラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニン又はアスパラギンであり、
    Ｘａａ２１はアスパラギン、グリシン、ヒスチジン又はアラニンである。
    ［一般式５］
    Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｘａａ８－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｘａａ１６－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｘａａ２３－Ｘａａ２４－Ｘａａ２５－Ｔｙｒ－Ｘａａ２７－Ｘａａ２８－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ（配列番号１２０）
    前記一般式５において、
    Ｘａａ８はアラニン又はグリシンであり、
    Ｘａａ１６はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸であるか、又は存在せず、
    Ｘａａ２３はグリシン又はアラニンであり、
    Ｘａａ２４はアラニン又はフェニルアラニンであり、
    Ｘａａ２５はアラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であるか、又は存在せず、
    Ｘａａ２７はトレオニンであるか、又は存在せず、
    Ｘａａ２８はプロリン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸であるか、又は存在しない（ここで、配列番号１２１のＡ鎖及び配列番号１２２のＢ鎖を含むペプチドは除く）。
  29. 前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択される１つのアミノ酸がアラニンに置換されているか、Ａ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンに置換されているものである、請求項２６に記載の組成物。
  30. 前記インスリンアナログは、配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８及び１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の１６番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換されているか、２５番目のアミノ酸が欠失しているか、天然インスリンのＡ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸もしくはアラニンに置換されているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログである、請求項２６に記載の組成物。
  32. 前記インスリンアナログは、配列番号１４２又は１４４のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記インスリンアナログは、天然インスリンのＢ鎖の１６番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸に置換されているか、天然インスリンのＢ鎖の２５番目のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸に置換されているか、天然インスリンのＡ鎖の１４番目のアミノ酸がヒスチジン、リシン、アラニンもしくはアスパラギン酸に置換されているか、天然インスリンのＡ鎖の１９番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリンもしくはトレオニンに置換されているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログである、請求項２６に記載の組成物。
  34. 前記インスリンアナログは、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８及び１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記インスリンアナログは、前記一般式４で表される配列番号１１９のＡ鎖と、前記一般式５で表される配列番号１２０のＢ鎖とからなる二重鎖の形態である、請求項２８に記載の組成物。
  36. 前記Ａ鎖及びＢ鎖は、ジスルフィド結合により連結されるものである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記結合体は、下記化学式１で表されるものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
    ［化学式１］
    Ｘ－Ｌａ－Ｆ
    ここで、
    Ｘは前記インスリン、又はグルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドであり、
    Ｌはリンカーであり、
    ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、
    ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質であり、
    前記「－」は共有又は非共有結合である。
  38. 前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール－プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記Ｆは、免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項３７に記載の組成物。
  41. 前記Ｆは、ＩｇＧ Ｆｃ領域である、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されたものである、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、
    （ａ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、
    （ｂ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、
    （ｃ）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、
    （ｄ）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、
    （ｅ）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインの少なくとも１つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ、並びに
    （ｆ）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体からなる群から選択されるものである、請求項４０に記載の組成物。
  44. 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたか、天然ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が欠失されたか、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されたか、補体結合部位が除去されたか、又はＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されたものである、請求項４０に記載の組成物。
  45. 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する免疫グロブリンＦｃフラグメントである、請求項４０に記載の組成物。
  46. 前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項４０に記載の組成物。
  47. 前記Ｌは、ペプチド、脂肪酸、サッカライド、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物。
  48. 前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール－プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記Ｌは、ポリエチレングリコールである、請求項３７に記載の組成物。
  50. （ｉ）インスリンと、
    （ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用キット。
  51. （ｉ）インスリンと、
    （ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与による体重増加を減少させるための薬学的組成物。
  52. 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項５１に記載の組成物。
  54. 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であり、
    前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項５１に記載の組成物。
  55. （ｉ）インスリンと、
    （ｉｉ）グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与患者における体重減少のための複合製剤。
  56. 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項５５に記載の複合製剤。
  57. 前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項５５に記載の複合製剤。
  58. 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であり、
    前記グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項５５に記載の複合製剤。
  59. 前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、
    ここで、インスリン：グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチドが１：１～１００：１のモル比となるように含む、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の複合製剤。
  60. 前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、
    ここで、インスリン又はその結合体：グルカゴン受容体、ＧＬＰ－１受容体及びＧＩＰ受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が１：１～１：１００のモル比となるように含む、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の複合製剤。
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