JP2022515229A - グルカゴン、glp-1及びgip受容体の全てに活性を有する三重活性体と、インスリンとを含む薬学組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体の全てに活性を有する三重活性体と、インスリンとを含む組成物、並びにそれを含む複合製剤に関する。
Description
本発明は、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体の全てに活性を有する三重活性体と、インスリンとを含む組成物、並びにそれを含む複合製剤に関する。
インスリンは、人体の膵臓から分泌される血糖調節ホルモンであり、血液中の余剰グルコースを細胞に送り、細胞にエネルギー源を供給すると共に、血糖を正常レベルに維持する役割を果たす。しかし、糖尿病患者においては、このようなインスリンの不足や、インスリン抵抗性及びβ細胞の機能喪失により、インスリンが正常な機能を果たせない。よって、糖尿病患者は、血液中のグルコースをエネルギー源として用いることができず、血中グルコースレベルが高くなる高血糖症状を起こし、結局は尿により糖を排出することになり、様々な合併症を引き起こすこともある。よって、インスリン分泌に異常がある糖尿病患者(Type I)や、インスリン耐性による糖尿病患者(Type II)にはインスリン治療が必須であり、インスリンを投与すると正常レベルに血糖を調節することができる。
現在、1型糖尿病の25%及び2型糖尿病の80%以上は、高血糖だけでなく、肥満状態であることが多く、インスリンの単独投与は、血糖調節に優れるが、体重が増加する副作用があることが知られている。よって、インスリンの血糖減少効果を発揮しながらも、その副作用である体重増加を効果的に減少させることのできる治療剤の開発が求められている。
一方、本出願人は、インスリン活性を有する様々なインスリンアナログを開発し(特許文献1及び2)、また、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体の全てに活性を有する三重活性体を開発した(特許文献3及び4)。しかし、それらを組み合わせた併用製剤として用いられてはいない。
H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
本願は、インスリンと三重活性体を共に用いると、それぞれの単独投与群に比べて血糖調節能力が著しく向上し、かつインスリンによる体重増加が効果的に改善されることが確認された。
本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1(Glucagon-like peptide-1)受容体、及びGIP(Glucose-dependent insulinotropic polypeptide)受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む組成物を提供することを目的とする。
具体的には、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与による体重増加を減少させるための薬学的組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与患者における体重減少のための複合製剤を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むキットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、薬剤の製造における、前記組成物の用途を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法を提供することを目的とする。
具体的には、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法を提供する。
本発明のインスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを含む組成物又は複合製剤は、インスリン関連疾患、例えば糖尿病に対する予防又は治療効果を発揮すると共に、体重増加などのインスリン投与による副作用を緩和する新規な併用療法を提供する。
本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1(Glucagon-like peptide-1)受容体、及びGIP(Glucose-dependent insulinotropic polypeptide)受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む組成物である。
一具体例として、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関する。
他の具体例として、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与による体重増加を減少させるための薬学的組成物である。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であり、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、インスリン投与が求められる個体に投与されるものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリン関連疾患は、インスリン抵抗性疾患、糖尿病、過血糖症及び肥満からなる群から選択されるものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、血糖降下効力及びインスリン単独投与の際に現れる体重増加を抑制する効力をどちらも有することを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、ここで、インスリン又はその結合体:グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が1:1~100:1のモル比となるように含むか、インスリン又はその結合体:グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が1:1~1:100のモル比となるように含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、天然グルカゴン配列の少なくとも1つのアミノ酸の置換(substitution)、付加(addition)、欠失(deletion)、修飾(modification)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた、天然グルカゴンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、付加されるアミノ酸配列は、天然GLP-1、天然GIP又は天然エキセンジン-4のアミノ酸配列に由来するものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、一般式1で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-R1(一般式1,配列番号103)
一般式1において、Xaa1はヒスチジン(His,H)、4-イミダゾアセチル(CA)又はチロシン(Tyr,Y)であり、Xaa2はグリシン(Gly,G)、α-メチルグルタミン酸又はAib(aminoisobutyric acid)であり、Xaa3はグルタミン酸(Glu,E)又はグルタミン(Gln,Q)であり、Xaa7はトレオニン(Thr,T)又はイソロイシン(Ile,I)であり、Xaa10はロイシン(Leu,L)、チロシン(Tyr,Y)、リシン(Lys,K)、システイン(Cys,C)又はバリン(Val,V)であり、Xaa12はリシン(Lys,K)、セリン(Ser,S)又はイソロイシン(Ile,I)であり、Xaa13はグルタミン(Gln,Q)、チロシン(Tyr,Y)、アラニン(Ala,A)又はシステイン(Cys,C)であり、Xaa14はロイシン(Leu,L)、メチオニン(Met,M)又はチロシン(Tyr,Y)であり、Xaa15はシステイン(Cys,C)、アスパラギン酸(Asp,D)、グルタミン酸(Glu,E)又はロイシン(Leu,L)であり、Xaa16はグリシン(Gly,G)、グルタミン酸(Glu,E)又はセリン(Ser,S)であり、Xaa17はグルタミン(Gln,Q)、アルギニン(Arg,R)、イソロイシン(Ile,I)、グルタミン酸(Glu,E)、システイン(Cys,C)又はリシン(Lys,K)であり、Xaa18はアラニン(Ala,A)、グルタミン(Gln,Q)、アルギニン(Arg,R)又はヒスチジン(His,H)であり、Xaa19はアラニン(Ala,A)、グルタミン(Gln,Q)、システイン(Cys,C)又はバリン(Val,V)であり、Xaa20はリシン(Lys,K)、グルタミン(Gln,Q)又はアルギニン(Arg,R)であり、Xaa21はグルタミン酸(Glu,E)、グルタミン(Gln,Q)、ロイシン(Leu,L)、システイン(Cys,C)又はアスパラギン酸(Asp,D)であり、Xaa23はイソロイシン(Ile,I)又はバリン(Val,V)であり、Xaa24はアラニン(Ala,A)、グルタミン(Gln,Q)、システイン(Cys,C)、アスパラギン(Asn,N)、アスパラギン酸(Asp,D)又はグルタミン酸(Glu,E)であり、Xaa27はバリン(Val,V)、ロイシン(Leu,L)、リシン(Lys,K)又はメチオニン(Met,M)であり、Xaa28はシステイン(Cys,C)、リシン(Lys,K)、アラニン(Ala,A)、アスパラギン(Asn,N)又はアスパラギン酸(Asp,D)であり、Xaa29はシステイン(Cys,C)、グリシン(Gly,G)、グルタミン(Gln,Q)、トレオニン(Thr,T)、グルタミン酸(Glu,E)又はヒスチジン(His,H)であり、Xaa30はシステイン(Cys,C)、グリシン(Gly,G)、リシン(Lys,K)もしくはヒスチジン(His,H)であるか、又は存在せず、R1はシステイン(Cys,C)、GKKNDWKHNIT(配列番号106)、m-SSGAPPPS-n(配列番号107)もしくはm-SSGQPPPS-n(配列番号108)であるか、又は存在せず、ここで、mはCys、Pro又はGly-Proであり、nはCys、Gly、SerもしくはHis-Glyであるか、又は存在しない。
上記具体例のいずれかによる組成物において、Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン、アスパラギン酸又はロイシンであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式1にて、Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシン、システイン又はバリンであり、Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、Xaa13はチロシン、アラニン、グルタミン又はシステインであり、Xaa14はロイシン、システイン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン、ロイシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン、グルタミン酸又はリシンであり、Xaa18はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン、バリン又はシステインであり、Xaa20はリシン、アルギニン又はグルタミンであり、Xaa21はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、Xaa24はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Xaa27はロイシン又はリシンであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記ペプチドは、一般式2で表されるアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
Xaa1-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Ser-Ser-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa40(一般式2,配列番号104)
一般式2において、Xaa1は4-イミダゾアセチル、ヒスチジン又はチロシンであり、Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa10はチロシン又はシステインであり、Xaa13はアラニン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、Xaa14はロイシン、メチオニン又はチロシンであり、Xaa15はアスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシンであり、Xaa16はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン、システイン又はバリンであり、Xaa20はリシン、グルタミン又はアルギニンであり、Xaa21はシステイン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、Xaa24はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン又はグルタミン酸であり、Xaa28はリシン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa29はグリシン、グルタミン、システイン又はヒスチジンであり、Xaa30はシステイン、グリシン、リシン又はヒスチジンであり、Xaa31はプロリン又はシステインであり、Xaa40はシステインであるか、又は存在しない。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式1にて、Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシン、システイン又はバリンであり、Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、Xaa13はチロシン、アラニン又はシステインであり、Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン又はアスパラギン酸であり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Xaa20はリシン又はグルタミンであり、Xaa21はグルタミン酸、システイン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はバリンであり、Xaa24はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa27はロイシン又はリシンであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式2にて、Xaa13はアラニン、チロシン又はシステインであり、Xaa15はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa21はシステイン、グルタミン酸、グルタミン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、Xaa24はシステイン、グルタミン又はアスパラギンであり、Xaa28はシステイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa29はグルタミン、システイン又はヒスチジンであり、Xaa30はシステイン、リシン又はヒスチジンであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式1にて、Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシン又はシステインであり、Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、Xaa13はチロシン、アラニン又はシステインであり、Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン又はアスパラギン酸であり、Xaa16はグルタミン酸であり、Xaa17はアルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Xaa20はリシン又はグルタミンであり、Xaa21はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Xaa23はバリンであり、Xaa24はグルタミン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa27はロイシンであり、Xaa28はシステイン、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、一般式1にて、Xaa1はヒスチジン又は4-イミダゾアセチルであり、Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa3はグルタミンであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシンであり、Xaa12はイソロイシンであり、Xaa13はアラニン又はシステインであり、Xaa14はメチオニンであり、Xaa15はアスパラギン酸であり、Xaa16はグルタミン酸であり、Xaa17はイソロイシン又はリシンであり、Xaa18はアラニン又はヒスチジンであり、Xaa19はグルタミン又はシステインであり、Xaa20はリシンであり、Xaa21はアスパラギン酸であり、Xaa23はバリンであり、Xaa24はアスパラギンであり、Xaa27はロイシンであり、Xaa28はアラニン又はアスパラギンであり、Xaa29はグルタミン又はトレオニンであり、Xaa30はシステインもしくはリシンであるか、又は存在しないことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記ペプチドは、一般式3のアミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする。
Xaa1-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Glu-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Val-Xaa24-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Ser-Ser-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa40(一般式3,配列番号105)
一般式3において、Xaa1はヒスチジン又はチロシンであり、Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa13はアラニン、チロシン又はシステインであり、Xaa17はアルギニン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン又はアルギニンであり、Xaa19はアラニン又はシステインであり、Xaa21はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Xaa24はグルタミン又はアスパラギンであり、Xaa28はシステイン又はアスパラギン酸であり、Xaa29はシステイン、ヒスチジン又はグルタミンであり、Xaa30はシステイン又はヒスチジンであり、Xaa31はプロリン又はシステインであり、Xaa40はシステインであるか、又は存在しない。
上記具体例のいずれかによる組成物において、R1は、システイン、GKKNDWKHNIT(配列番号106)、CSSGQPPPS(配列番号109)、GPSSGAPPPS(配列番号110)、GPSSGAPPPSC(配列番号111)、PSSGAPPPS(配列番号112)、PSSGAPPPSG(配列番号113)、PSSGAPPPSHG(配列番号114)、PSSGAPPPSS(配列番号115)、PSSGQPPPS(配列番号116)もしくはPSSGQPPPSC(配列番号117)であるか、又は存在しないことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、配列番号1~102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、配列番号42のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記一般式にて、N末端から16番目のアミノ酸と20番目のアミノ酸は、互いに環を形成することを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、そのC末端がアミド化したものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンは、天然インスリン、又は天然インスリンの少なくとも1つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が生じたインスリンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、3番目のアミノ酸、5番目のアミノ酸、8番目のアミノ酸、10番目のアミノ酸、12番目のアミノ酸、16番目のアミノ酸、23番目のアミノ酸、24番目のアミノ酸、25番目のアミノ酸、26番目のアミノ酸、27番目のアミノ酸、28番目のアミノ酸、29番目のアミノ酸、30番目のアミノ酸、A鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、5番目のアミノ酸、8番目のアミノ酸、10番目のアミノ酸、12番目のアミノ酸、14番目のアミノ酸、16番目のアミノ酸、17番目のアミノ酸、18番目のアミノ酸、19番目のアミノ酸、及び21番目のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているか、欠失しているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、一般式4で表される配列番号119のA鎖と、一般式5で表される配列番号120のB鎖とを含むことを特徴とする。
[一般式4]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(配列番号119)
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(配列番号119)
一般式4において、Xaa1はアラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Xaa2はアラニン又はイソロイシンであり、Xaa5はアラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン又はアスパラギンであり、Xaa12はアラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン又はアスパラギンであり、Xaa14はアラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Xaa16はアラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Xaa19はアラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニン又はアスパラギンであり、Xaa21はアスパラギン、グリシン、ヒスチジン又はアラニンである。
[一般式5]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(配列番号120)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(配列番号120)
一般式5において、Xaa8はアラニン又はグリシンであり、Xaa16はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸であるか、又は存在せず、Xaa23はグリシン又はアラニンであり、Xaa24はアラニン又はフェニルアラニンであり、Xaa25はアラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であるか、又は存在せず、Xaa27はトレオニンであるか、又は存在せず、Xaa28はプロリン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸であるか、又は存在しない(ここで、配列番号121のA鎖及び配列番号122のB鎖を含むペプチドは除く)。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の8番目のアミノ酸、23番目のアミノ酸、24番目のアミノ酸、25番目のアミノ酸、A鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、及び19番目のアミノ酸からなる群から選択される1つのアミノ酸がアラニンに置換されているか、A鎖の14番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンに置換されているものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、配列番号124、126、128、130、132、134、136、138及び140からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の16番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換されているか、25番目のアミノ酸が欠失しているか、天然インスリンのA鎖の14番目のアミノ酸がグルタミン酸もしくはアラニンに置換されているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、配列番号142又は144のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の16番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸に置換されているか、天然インスリンのB鎖の25番目のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸に置換されているか、天然インスリンのA鎖の14番目のアミノ酸がヒスチジン、リシン、アラニンもしくはアスパラギン酸に置換されているか、天然インスリンのA鎖の19番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリンもしくはトレオニンに置換されているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、配列番号146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168及び170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記インスリンアナログは、一般式4で表される配列番号119のA鎖と、一般式5で表される配列番号120のB鎖とからなる二重鎖の形態であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記A鎖及びB鎖は、ジスルフィド結合により連結されるものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記結合体は、化学式1で表されるものであることを特徴とする。
[化学式1]
X-La-F
X-La-F
ここで、Xは前記インスリン、又はグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドであり、Lはリンカーであり、aは0又は自然数であるが、aが2以上であればそれぞれのLは互いに独立しており、FはXの生体内半減期を延長させることのできる物質であり、前記「-」は共有又は非共有結合である。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Fは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、FcRn結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン(Transferrin)、サッカライド(saccharide)、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択されることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Fは、免疫グロブリンFc領域であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Fは、IgG Fc領域であることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンFc領域は、非グリコシル化されたものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンFc領域は、(a)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメイン、(b)CH1ドメイン及びCH2ドメイン、(c)CH1ドメイン及びCH3ドメイン、(d)CH2ドメイン及びCH3ドメイン、(e)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインの少なくとも1つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ、並びに(f)重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体からなる群から選択されるものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンFc領域は、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたか、天然FcからN末端の一部のアミノ酸が欠失されたか、天然FcのN末端にメチオニン残基が付加されたか、補体結合部位が除去されたか、又はADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity)部位が除去されたものであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンFc領域は、IgG、IgA、IgD、IgE又はIgMに由来する免疫グロブリンFcフラグメントであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記免疫グロブリンFc領域は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Lは、ペプチド、脂肪酸、サッカライド、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
上記具体例のいずれかによる組成物において、前記Lは、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。
本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与患者における体重減少のための複合製剤である。
本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むキットである。
本発明を実現する一態様は、薬剤の製造における、前記組成物の用途である。
本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療方法である。
本発明を実現する一態様は、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法である。
具体的には、本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法である。
以下、本発明をより詳細に説明する。
なお、本願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明の範囲が制限されるものではない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本発明に含まれることが意図されている。
本明細書全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の1文字及び3文字コードが用いられるだけでなく、Aib(α-アミノイソブチル酸)、Sar(N-methylglycine)、α-メチルグルタミン酸(α-methyl-glutamic acid)などの他のアミノ酸に対して一般に許容される3文字コードが用いられる。また、本明細書において略語で言及したアミノ酸は、IUPAC-IUB命名法に従って記載したものである。
アラニン Ala,A
アルギニン Arg,R
アスパラギン Asn,N
アスパラギン酸 Asp,D
システイン Cys,C
グルタミン酸 Glu,E
グルタミン Gln,Q
グリシン Gly,G
ヒスチジン His,H
イソロイシン Ile,I
ロイシン Leu,L
リシン Lys,K
メチオニン Met,M
フェニルアラニン Phe,F
プロリン Pro,P
セリン Ser,S
トレオニン Thr,T
トリプトファン Trp,W
チロシン Tyr,Y
バリン Val,V
アラニン Ala,A
アルギニン Arg,R
アスパラギン Asn,N
アスパラギン酸 Asp,D
システイン Cys,C
グルタミン酸 Glu,E
グルタミン Gln,Q
グリシン Gly,G
ヒスチジン His,H
イソロイシン Ile,I
ロイシン Leu,L
リシン Lys,K
メチオニン Met,M
フェニルアラニン Phe,F
プロリン Pro,P
セリン Ser,S
トレオニン Thr,T
トリプトファン Trp,W
チロシン Tyr,Y
バリン Val,V
本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1(Glucagon-like peptide-1)受容体、及びGIP(Glucose-dependent insulinotropic polypeptide)受容体に対して活性を有する分離されたペプチド(「三重活性体」ともいう)とを含む組成物を提供する。
一具体例として、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
他の具体例として、本発明は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与による体重増加を減少させるための薬学的組成物を提供する。
具体的には、前記組成物は、(a)インスリンと、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むものであってもよく、(b)インスリンとその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、インスリンの持続型結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むものであってもよく、(c)インスリンと、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、(d)インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよい。
本発明のインスリン関連疾患の予防又は治療用薬学組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを含むものであり、インスリンの欠乏、不足又は機能低下により発生するインスリン関連疾患の予防又は治療効果を有するインスリンの薬効を示すと共に、インスリン投与による副作用(例えば、体重増加)を緩和することができる。
本発明の実施例においては、前記インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを含む組成物を投与したdb/dbマウスにおいて血糖降下効果が確認されただけでなく、体重増加抑制効果が確認されたので、本発明による薬学組成物がインスリンの薬効を維持しつつ、その副作用を改善できることが確認された。
本発明における「インスリン関連疾患」とは、インスリンの欠乏、不足、機能低下など、インスリン固有の血糖調節機能に異常が生じて発症する疾患を意味し、インスリンの投与により予防又は治療効果が期待される疾患であればいかなるものでもよい。具体的には、前記インスリン関連疾患は、インスリン抵抗性疾患、糖尿病、過血糖症及び肥満からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
インスリン関連疾患の治療のためにインスリンを投与する場合、所望の治療効果が得られる一方で、意図しない副作用、例えば体重増加が生じるので、患者にさらなる疾病や苦痛をもたらすという問題がある。本発明による薬学組成物は、インスリン及び三重活性体の併用使用により、インスリンの副作用である体重増加を抑制しつつ、インスリン関連疾患に対する治療効果を発揮することができる。
本発明の組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体を、インスリン関連疾患に対する治療効果を発揮すると共に、副作用、特に体重増加を緩和できる含有量比で含むものである。
具体的には、前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを全て含み、ここで、インスリン:三重活性体を1:1~100:1のモル比で含むものであるか、又は1:1~1:100のモル比で含むものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一具体例として、前記組成物は、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質又はその結合体を併用する治療学的用途を提供するものであってもよい。「インスリン」については前述した通りである。
本発明における「組成物」は、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質とを含む「併用物」と併用される。前記組成物は、キットの形態で提供されてもよい。
本発明における「併用物(combination)」とは、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質又はその結合体の併用投与用途を有するものであり、「併用用途(combined used)」と同義である。前記併用物は、a)(i)インスリンもしくはその結合体と、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が混合された1つの混合物(mixture)で投与されるものであるか、又はb)(i)インスリンもしくはその結合体と、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が分離された形態で投与されるものであるが、これらに限定されるものではない。
インスリンもしくはその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が分離された形態の場合、インスリンもしくはその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が別個の製剤に製剤化され、同時、個別、順次又は逆順に投与されてもよい。
本発明における併用投与とは、単に同時の投与を意味するだけでなく、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質又はその結合体が個体に共に作用し、各物質が本然の機能と同等又はそれ以上のレベルの機能を果たす投与形態であると理解されるべきである。よって、本願における「併用」とは、同時、個別、順次又は逆順の投与を意味するものと理解されるべきである。前記投与が順次、逆順又は個別の場合、投与の順序は、特に限定されるものではないが、2次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないものでなければならない。
本発明における「組成物(composition)」とは、前記インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質又はその結合体とを含む併用物自体、又はそれらを含み、治療学的用途を有するものであるが、これらに限定されるものではない。例えば、インスリン関連疾患の予防又は治療用途を有するものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明による組成物は、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質又はその結合体を併用投与するためのものであり、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質又はその結合体が一つの製剤に製剤化されたものであってもよく、個別に製剤化されたものであってもよい。具体的には、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質又はその結合体を同時、個別、順次又は逆順に投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明における「キット」は、インスリン又はその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質又はその結合体を併用投与するために、本発明による併用物又は組成物を含むものであってもよい。具体的には、本発明によるキットは、インスリンもしくはその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が1つの製剤に製剤化されたもの、又はインスリンもしくはその結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質もしくはその結合体が個別に製剤化されたものを含むものであってもよく、2つの物質の併用投与に必要な物質をさらに含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記インスリン、並びにグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する物質には、インスリン、並びにグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して有意なレベルの活性を示す様々な物質、例えば化合物又はペプチドの形態の物質が含まれる。
本発明における前記「グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチド」は、三重活性体と混用される。一方、三重活性体及びその持続型結合体に関して、特許文献3及び4の全文が本発明に参考資料として援用される。
このような三重活性体には、グルカゴン、GLP-1及びGIP受容体に対して有意なレベルの活性を有する様々な物質、例えば様々なペプチドが含まれる。
特に、これらに限定されるものではないが、前記グルカゴン、GLP-1及びGIP受容体に対して有意なレベルの活性を有する三重活性体は、グルカゴン、GLP-1及びGIP受容体の少なくとも1つの受容体、具体的には少なくとも2つの受容体、より具体的には3つの受容体の全てに対するin vitro活性が、当該受容体の天然リガンド(天然グルカゴン、天然GLP-1及び天然GIP)に比べて、0.1%以上、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、100%以上である。
このような三重活性体のin vitro活性を測定する方法は、本願明細書の実験例1に示すが、特にこれに限定されるものではない。
一方、前記三重活性体は、i)GLP-1受容体の活性化、ii)グルカゴン受容体の活性化、iii)GIP受容体の活性化の少なくとも1つ、少なくとも2つ、具体的には3つの活性化を有すること、より具体的には有意な活性化を有することを特徴とする。
ここで、受容体を活性化するとは、例えば、天然のものに比べて、受容体に対するin vitro活性が0.1%以上、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、7%以上、8%以上、9%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、100%以上になることを意味する。しかし、これらに限定されるものではない。
また、前記三重活性体は、天然GLP-1、天然グルカゴン及び天然GIPのいずれかに比べて体内半減期が延長されたものであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
特に、これに限定されるものではないが、このような前記ペプチドは、非自然発生(non-naturally occurring)のものである。
具体的には、前記三重活性体は、天然グルカゴンアナログであるが、特にこれに限定されるものではない。
本発明による天然グルカゴンアナログには、天然グルカゴンと比較してアミノ酸配列に少なくとも1つの差異のあるペプチド、天然グルカゴン配列を修飾(modification)することにより改変されたペプチド、天然グルカゴンの模倣体が含まれる。
一方、特にこれに限定されるものではないが、天然グルカゴンは次のアミノ酸配列を有する。
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(配列番号118)
具体的には、前記三重活性体は、天然グルカゴン配列の少なくとも1つのアミノ酸の置換(substitution)、付加(addition)、欠失(deletion)、修飾(modification)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた、天然グルカゴンのアナログであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
また、前記アミノ酸の置換には、アミノ酸への置換や、非天然化合物への置換が全て含まれる。
さらに、付加は、三重活性体のN末端及び/又はC末端において行われうる。一方、付加されるアミノ酸の長さは、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上であるが、特にこれらに限定されるものではなく、広義ではポリペプチドの付加が含まれるが、特にこれに限定されるものではない。
前記天然グルカゴンに導入されるアミノ酸は、チロシン、α-メチルグルタミン酸、Aib、メチオニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、バリン、グリシン、アラニン、システイン、セリン、アスパラギン酸及びアルギニンからなる群から選択されるが、特にこれらに限定されるものではない。
例えば、前記付加されるアミノ酸配列は、天然GLP-1、天然GIP又は天然エキセンジン-4のアミノ酸配列に由来する1つ以上のアミノ酸配列であってもよい。
このような三重活性体は、分子内架橋(intramolecular bridge)を含み(例えば、共有結合的架橋又は非共有結合的架橋)、具体的には環を含む形態であってもよく、例えば三重活性体の16番目のアミノ酸と20番目のアミノ酸間に環が形成された形態であるが、特にこれらに限定されるものではない。
前記環の例として、ラクタム架橋(又はラクタム環)が挙げられるが、特にこれに限定されるものではない。
また、前記三重活性体には、目的とする位置に環を形成するアミノ酸を含むことにより環を含むように改変されたものが全て含まれる。
例えば、三重活性体の16番目と20番目のアミノ酸対がそれぞれ環を形成するグルタミン酸又はリシンに置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。
このような環は、前記三重活性体内のアミノ酸側鎖間に形成されてもよく、例えばリシンの側鎖とグルタミン酸の側鎖間にラクタム環が形成される形態であるが、特にこれらに限定されるものではない。
上記方法の組み合わせにより作製される三重活性体の例として、天然グルカゴンとアミノ酸配列が少なくとも1つ異なり、N末端のアミノ酸残基のα炭素が除去された、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、アナログ作製のための様々な方法の組み合わせにより、本発明に用いられる三重活性体を作製することができる。
また、特にこれらに限定されるものではないが、本発明の三重活性体は、体内半減期の延長のために、活性体の分解酵素の認識作用を回避するように、一部のアミノ酸を他のアミノ酸又は非天然化合物に置換することができる。
具体的には、前記三重活性体のアミノ酸配列のうち2番目のアミノ酸配列の置換により分解酵素の認識作用を回避し、体内半減期を延長させたペプチドであってもよいが、体内の分解酵素の認識作用を回避するためのアミノ酸の置換又は変更であればいかなるものでもよい。
また、天然グルカゴンのアナログの作製のためのこのような改変には、L型もしくはD型アミノ酸及び/又は非天然アミノ酸を用いた改変、並びに/又は天然配列の修飾、例えば側鎖官能基の改変、分子内の共有結合、一例として側鎖間の環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などの修飾による改変が全て含まれる。
さらに、天然グルカゴンのN及び/又はC末端に少なくとも1つのアミノ酸が付加されたものが全て含まれる。
前記置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される20種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Sigma-Aldrich、ChemPep、Genzyme pharmaceuticalsが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のAmerican peptide companyやBachem、又は韓国のAnygenにおいて合成及び購入することができる。
アミノ酸誘導体も同じ方式で入手することができ、一例として4-イミダゾ酢酸(4-imidazoacetic acid)などが挙げられる。
また、本発明によるグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドは、生体内のタンパク質切断酵素から保護して安定性を増加させるために、そのN末端及び/又はC末端などが化学的に修飾された形態、有機基により保護された形態、又はペプチド末端などにアミノ酸が付加されて改変された形態であってもよい。
特に、化学的に合成したペプチドの場合、N及びC末端が電荷を帯びているので、その電荷を除去するために、N末端のアセチル化(acetylation)及び/又はC末端のアミド化(amidation)を行ってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。また、C末端が改変されていない形態、すなわちカルボキシ基を有する形態も含まれる。
また、本発明によるグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチド、すなわち三重活性体は、ペプチド自体、その塩(例えば、前記ペプチドの薬学的に許容される塩)又はその溶媒和物の形態が全て含まれる概念である。さらに、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドは、薬学的に許容されるものであれば、いかなる形態であってもよい。
前記塩の種類は、特に限定されるものではない。もっとも、個体、例えば哺乳類に安全かつ効果的な形態であることが好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。
前記「薬学的に許容される」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応などを誘発することなく所望の用途に効果的に使用できる物質を意味する。
本発明における「薬学的に許容される塩」には、薬学的に許容される無機酸、有機酸又は塩基から誘導された塩が含まれる。好適な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸,マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。好適な塩基から誘導された塩には、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、アンモニウムなどが含まれる。
また、本発明における「溶媒和物」とは、本発明によるペプチド又はその塩が溶媒分子と複合体を形成したものを意味する。
なお、後述するインスリンには、前述した内容が全て適用される。
具体的な一態様として、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドは、一般式1で表されたアミノ酸配列を含む。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-R1(一般式1,配列番号103)
一般式1において、Xaa1はヒスチジン、4-イミダゾアセチル又はチロシンであり、Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa3はグルタミン酸又はグルタミンであり、Xaa7はトレオニン又はイソロイシンであり、Xaa10はロイシン、チロシン、リシン、システイン又はバリンであり、Xaa12はリシン、セリン又はイソロイシンであり、Xaa13はグルタミン、チロシン、アラニン又はシステインであり、Xaa14はロイシン、メチオニン又はチロシンであり、Xaa15はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシンであり、Xaa16はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン、システイン又はバリンであり、Xaa20はリシン、グルタミン又はアルギニンであり、Xaa21はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、Xaa24はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Xaa27はバリン、ロイシン、リシン又はメチオニンであり、Xaa28はシステイン、リシン、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa29はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸又はヒスチジンであり、Xaa30はシステイン、グリシン、リシンもしくはヒスチジンであるか、又は存在せず、R1はシステイン、GKKNDWKHNIT(配列番号:106)、m-SSGAPPPS-n(配列番号107)もしくはm-SSGQPPPS-n(配列番号108)であるか、又は存在せず、ここで、mはCys、Pro又はGly-Proであり、nはCys、Gly、SerもしくはHis-Glyであるか、又は存在しない。
前記三重活性体の例として、配列番号1~102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むもの、配列番号1~102からなる群から選択されるアミノ酸配列(必須)からなるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本願に「特定配列番号で表されるペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異(silent mutation)を除外するものではなく、このような配列付加又は突然変異を有するものも本願に含まれることは言うまでもない。
以上の内容は、本発明の他の具体例又は他の態様にも適用されるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、一般式1において、Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン、アスパラギン酸又はロイシンであってもよい。ここで、一般式1において、Xaa14及びXaa15を除く他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
このようなペプチドの例として、配列番号1~12、14~17、及び21~102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドや、それら(必須)からなるペプチドが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
これらのペプチドは、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体の少なくとも1つを有意に活性化させることができるが、特にこれらに限定されるものではない。具体的には、GLP-1を有意に活性化させるものであるか、さらにグルカゴン受容体及び/又はGIP受容体を有意に活性化させるものであるが、特にこれらに限定されるものではない。
より具体的には、一般式1において、Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシン、システイン又はバリンであり、Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、Xaa13はチロシン、アラニン、グルタミン又はシステインであり、Xaa14はロイシン、システイン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン、ロイシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン、グルタミン酸又はリシンであり、Xaa18はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン、バリン又はシステインであり、Xaa20はリシン、アルギニン又はグルタミンであり、Xaa21はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、Xaa24はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Xaa27はロイシン又はリシンであるペプチドであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本態様における変数以外の一般式1の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
より具体的には、一般式1において、Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシン、システイン又はバリンであり、Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、Xaa13はチロシン、アラニン又はシステインであり、Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン又はアスパラギン酸であり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Xaa20はリシン又はグルタミンであり、Xaa21はグルタミン酸、システイン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はバリンであり、Xaa24はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa27はロイシン又はリシンであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本態様における変数以外の一般式1の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
より具体的には、一般式1において、Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシン又はシステインであり、Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、Xaa13はチロシン、アラニン又はシステインであり、Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン又はアスパラギン酸であり、Xaa16はグルタミン酸であり、Xaa17はアルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Xaa20はリシン又はグルタミンであり、Xaa21はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Xaa23はバリンであり、Xaa24はグルタミン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa27はロイシンであり、Xaa28はシステイン、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸であってもよい。
本態様における変数以外の一般式1の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
具体的には、一般式1において、Xaa1はヒスチジン又は4-イミダゾアセチルであり、Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa3はグルタミンであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシンであり、Xaa12はイソロイシンであり、Xaa13はアラニン又はシステインであり、Xaa14はメチオニンであり、Xaa15はアスパラギン酸であり、Xaa16はグルタミン酸であり、Xaa17はイソロイシン又はリシンであり、Xaa18はアラニン又はヒスチジンであり、Xaa19はグルタミン又はシステインであり、Xaa20はリシンであり、Xaa21はアスパラギン酸であり、Xaa23はバリンであり、Xaa24はアスパラギンであり、Xaa27はロイシンであり、Xaa28はアラニン又はアスパラギンであり、Xaa29はグルタミン又はトレオニンであり、Xaa30はシステインもしくはリシンであるか、又は存在しない。
本態様における変数以外の一般式1の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
より具体的には、一般式1において、Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa3はグルタミンであり、Xaa7はトレオニンであり、Xaa10はチロシン、システイン又はバリンであり、Xaa12はリシンであり、Xaa13はチロシンであり、Xaa14はロイシンであり、Xaa15はアスパラギン酸であり、Xaa16はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン又はグルタミンであり、Xaa20はリシン又はグルタミンであり、Xaa21はグルタミン酸、システイン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はバリンであり、Xaa24はアラニン、グルタミン又はシステインであり、Xaa27はロイシン又はリシンであり、Xaa29はグリシン、グルタミン、トレオニン又はヒスチジンであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本態様における変数以外の一般式1の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
このようなグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドは、GLP-1受容体及びグルカゴン受容体の活性化の程度が有意であり、GIP受容体の活性化の程度に比べて高くてもよく、GLP-1受容体、グルカゴン受容体及びGIP受容体の活性化の程度が全て有意であってもよく、GLP-1受容体及びGIP受容体の活性化の程度が有意であり、グルカゴン受容体の活性化の程度に比べて高くてもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
GLP-1受容体及びGIP受容体の活性化の程度が有意であり、グルカゴン受容体の活性化の程度に比べて高い場合、体重減少効力を有すると共に血糖調節能力が向上したペプチドを提供することができ、GLP-1受容体、グルカゴン受容体及びGIP受容体の活性化の程度が全て有意である場合、体重減少効果を最大化できるという利点がある。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
このようなペプチドの例として、配列番号8、9、21~37、39、42、43、49~61、64~83、85、86、88、89、91~93、95~102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドや、それら(必須)からなるペプチドが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
具体的な態様として、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドは、一般式2で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
Xaa1-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Ser-Ser-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa40(一般式2,配列番号104)
上記式において、Xaa1は4-イミダゾアセチル、ヒスチジン又はチロシンであり、Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa10はチロシン又はシステインであり、Xaa13はアラニン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、Xaa14はロイシン、メチオニン又はチロシンであり、Xaa15はアスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシンであり、Xaa16はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa19はアラニン、グルタミン、システイン又はバリンであり、Xaa20はリシン、グルタミン又はアルギニンであり、Xaa21はシステイン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、Xaa24はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン又はグルタミン酸であり、Xaa28はリシン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa29はグリシン、グルタミン、システイン又はヒスチジンであり、Xaa30はシステイン、グリシン、リシン又はヒスチジンであり、Xaa31はプロリン又はシステインであり、Xaa40はシステインであるか、又は存在しない。
より具体的には、一般式2において、Xaa13はアラニン、チロシン又はシステインであり、Xaa15はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Xaa17はグルタミン、アルギニン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、Xaa21はシステイン、グルタミン酸、グルタミン又はアスパラギン酸であり、Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、Xaa24はシステイン、グルタミン又はアスパラギンであり、Xaa28はシステイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、Xaa29はグルタミン、システイン又はヒスチジンであり、Xaa30はシステイン、リシン又はヒスチジンであってもよい。
本態様における変数以外の一般式2の他の変数は、前述したアミノ酸の組み合わせであってもよい。
このようなグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドの例として、配列番号21、22、42、43、50、64~77、及び95~102からなる群から選択されるアミノ酸配列、より具体的には、配列番号21、22、42、43、50、64~77、及び96~102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドや、それら(必須)からなるペプチドが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
具体的な態様として、前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドは、一般式3のアミノ酸配列を含んでもよい。
Xaa1-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Glu-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Val-Xaa24-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Ser-Ser-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa40(一般式3,配列番号105)
一般式3において、Xaa1はヒスチジン又はチロシンであり、Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、Xaa13はアラニン、チロシン又はシステインであり、Xaa17はアルギニン、システイン又はリシンであり、Xaa18はアラニン又はアルギニンであり、Xaa19はアラニン又はシステインであり、Xaa21はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、Xaa24はグルタミン又はアスパラギンであり、Xaa28はシステイン又はアスパラギン酸であり、Xaa29はシステイン、ヒスチジン又はグルタミンであり、Xaa30はシステイン又はヒスチジンであり、Xaa31はプロリン又はシステインであり、Xaa40はシステインであるか、又は存在しない。
このようなグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有するペプチドの例として、配列番号21、22、42、43、50、64~71、75~77、及び96~102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドや、それら(必須)からなるペプチドが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
また、一般式1において、R1はシステイン、GKKNDWKHNIT(配列番号106)、CSSGQPPPS(配列番号109)、GPSSGAPPPS(配列番号110)、GPSSGAPPPSC(配列番号111)、PSSGAPPPS(配列番号112)、PSSGAPPPSG(配列番号113)、PSSGAPPPSHG(配列番号114)、PSSGAPPPSS(配列番号115)、PSSGQPPPS(配列番号116)もしくはPSSGQPPPSC(配列番号117)であるか、又は存在しないが、特にこれらに限定されるものではない。
さらに、本発明のペプチドは、その長さに応じてこの分野で周知の方法、例えば自動ペプチド合成機により合成することができ、遺伝子操作技術により産生することができる。
具体的には、本発明のペプチドは、標準合成方法、組換え発現システム又は任意の他の当該分野の方法により作製することができる。よって、本発明によるペプチドは、例えば(a)ペプチドを固相もしくは液相法で段階的に又はフラグメント組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離及び精製する方法、(b)ペプチドをコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法、(c)ペプチドをコードする核酸作製物を無細胞試験管内で発現させ、発現生成物を回収する方法、又は(a)、(b)及び(c)の任意の組み合わせによりペプチドのフラグメントを得て、次にフラグメントを連結してペプチドを得ることにより当該ペプチドを回収する方法が含まれる多くの方法で合成することができる。
本発明における「インスリン」とは、膵臓のβ細胞から分泌されるホルモンの一種であり、一般に細胞内へのグルコース取り込みを促進し、脂肪の分解を抑制し、体内の血糖を調節する役割を果たす。インスリンは、血糖調節機能のないプロインスリン(proinsulin)前駆体の形態からプロセシングを経て血糖調節機能を有するインスリンとなる。インスリンは2つのポリペプチド鎖、すなわちそれぞれ21個及び30個のアミノ酸残基を含むA鎖及びB鎖からなり、それらは2つのジスルフィド架橋により互いに連結されている。前記インスリンは、ヒトインスリンであってもよい。天然ヒトインスリンのA鎖及びB鎖は、それぞれ配列番号121及び122で表示されるアミノ酸配列を含む。
A鎖:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(配列番号121)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(配列番号121)
B鎖:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(配列番号122)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(配列番号122)
本発明における「プロインスリン(proinsulin)」とは、インスリンの前駆体分子を意味する。前記プロインスリンは、インスリンA鎖及びB鎖、並びにその間にC-ペプチドを含んでもよい。前記プロインスリンは、ヒトプロインスリンであってもよい。
本発明におけるインスリンは、天然インスリンであってもよく、天然インスリンの少なくとも1つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が生じたアナログ、誘導体又はフラグメントであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明における「インスリンアナログ(insulin analog)」とは、天然インスリンとは異なる非天然インスリンを意味する。
このインスリンアナログには、天然インスリンの一部のアミノ酸が付加、欠失又は置換により改変されたアナログが含まれる。例えば、天然インスリンのB鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、3番目のアミノ酸、5番目のアミノ酸、8番目のアミノ酸、10番目のアミノ酸、12番目のアミノ酸、16番目のアミノ酸、23番目のアミノ酸、24番目のアミノ酸、25番目のアミノ酸、26番目のアミノ酸、27番目のアミノ酸、28番目のアミノ酸、29番目のアミノ酸、30番目のアミノ酸、A鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、5番目のアミノ酸、8番目のアミノ酸、10番目のアミノ酸、12番目のアミノ酸、14番目のアミノ酸、16番目のアミノ酸、17番目のアミノ酸、18番目のアミノ酸、19番目のアミノ酸、及び21番目のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているか、又は欠失しているインスリンアナログであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明のインスリンアナログについては、特許文献5又は6(又は特許文献1及び2)に開示されており、それらの明細書の全文が本願に参考資料として援用される。
本発明に用いられるインスリンアナログは、単鎖であってもよく、二重鎖(two polypeptide chains)の形態であってもよく、二重鎖の形態がより好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。前記二重鎖は、天然インスリンのA鎖に対応するポリペプチドと、天然インスリンのB鎖に対応するポリペプチドの2つのポリペプチドからなるものであってもよい。ここで、前記天然インスリンのA鎖又はB鎖に対応するものとは、前記二重鎖のポリペプチドのいずれか一方の鎖と天然インスリンのA鎖又はB鎖の配列同一性を比較した場合に、少なくとも60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上又は95%以上の配列同一性を有するものであるが、特にこれらに限定されるものではなく、二重鎖を構成する配列と天然インスリンのA鎖又はB鎖の配列との比較により当業者が容易に把握することができる。
本発明における「相同性(homology)」とは、野生型(wild type)タンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列と類似する程度を示すものであり、本発明のアミノ酸配列又は塩基配列と上記パーセント以上同一である配列を有する配列を含む。このような相同性は、2つの配列を肉眼で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析するバイオインフォマティクスアルゴリズム(bioinformatic algorithm)を用いて決定することもできる。上記2つのアミノ酸配列間の相同性は百分率で表される。有用な自動化されたアルゴリズムは、Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, Madison, W, USA)のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTAコンピュータソフトウェアモジュールで用いることができる。前記モジュールで自動化された配列アルゴリズムには、Needleman & Wunsch、Pearson & Lipman及びSmith & Waterman配列配列アルゴリズムが含まれる。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST及びCLUSTAL Wが含まれるソフトウェアで自動化されている。
本発明に用いられるインスリンの配列及びそれをコードする塩基配列の情報は、NCBIなどの公知のデータベースから得られる。
具体的な一実施例において、本発明のインスリンアナログは、一般式4で表される配列番号119のA鎖と、一般式5で表される配列番号120のB鎖とを含む組成物である。
[一般式4]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(配列番号119)
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(配列番号119)
一般式4において、Xaa1はアラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Xaa2はアラニン又はイソロイシンであり、Xaa5はアラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン又はアスパラギンであり、Xaa12はアラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン又はアスパラギンであり、Xaa14はアラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Xaa16はアラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、Xaa19はアラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニン又はアスパラギンであり、Xaa21はアスパラギン、グリシン、ヒスチジン又はアラニンである。
[一般式5]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(配列番号120)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(配列番号120)
一般式5において、Xaa8はアラニン又はグリシンであり、Xaa16はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸であるか、又は存在せず、Xaa23はグリシン又はアラニンであり、Xaa24はアラニン又はフェニルアラニンであり、Xaa25はアラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であるか、又は存在せず、Xaa27はトレオニンであるか、又は存在せず、Xaa28はプロリン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸であるか、又は存在しない(ここで、配列番号121のA鎖及び配列番号122のB鎖を含むペプチドは除く)。
より具体的には、前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の8番目のアミノ酸、23番目のアミノ酸、24番目のアミノ酸、25番目のアミノ酸、A鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、及び19番目のアミノ酸からなる群から選択される1つのアミノ酸がアラニンに置換されたものであり、かつ/又はA鎖の14番目のアミノ酸がグルタミン酸もしくはアスパラギンに置換されたものであってもよく、特に配列番号124、126、128、130、132、134、136、138及び140からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであるか、又は上記アミノ酸配列からなるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
また、前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の16番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換されたものであり、かつ/又は25番目のアミノ酸が欠失したものであり、かつ/又は天然インスリンのA鎖の14番目のアミノ酸がグルタミン酸もしくはアラニンに置換されたものであり、特に配列番号142もしくは144のアミノ酸配列を含むものであるか、又は前記アミノ酸配列からなるものであるが、これらに限定されるものではない。
また、前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の16番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸に置換されたものであり、かつ/又は25番目のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸に置換されたものであり、かつ/又は天然インスリンのA鎖の14番目のアミノ酸がヒスチジン、リシン、アラニンもしくはアスパラギン酸に置換されたものであり、かつ/又は19番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリンもしくはトレオニンに置換されたものであり、特に配列番号146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168及び170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものであるか、又は前記アミノ酸配列からなるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
なお、本発明のインスリンアナログは、C-ペプチドが除去されていない単鎖インスリンの形態であり、一般式4で表される配列番号119のA鎖と、一般式5で表される配列番号120のB鎖とを含み、インスリンの活性及び機能を有する物質であってもよい。
また、本発明のインスリンアナログは、A鎖とB鎖間にC-ペプチドを含むプロインスリンから前記C-ペプチドを除去して作製したものであってもよい。前記C-ペプチドの除去は、当該技術分野で公知の方法により行うことができ、具体的にはトリプシン(Trypsin)とカルボキシペプチダーゼB(Carboxypeptidase B)の処理により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、本発明のインスリンアナログは、一般式4で表される配列番号119のA鎖と、一般式5で表される配列番号120のB鎖とからなるものであってもよく、より具体的には、前記A鎖及びB鎖が互いに2つのジスルフィド架橋により連結された二重鎖インスリンの形態であるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、特定配列番号で表される、プロインスリン形態のインスリンアナログからC-ペプチドを除去して二重鎖の形態に作製したインスリンアナログも本発明に含まれることは言うまでもない。
具体的には、前記インスリンアナログは、天然インスリン、特に天然ヒトインスリン配列に次のアミノ酸改変を有するものであり、表4のアナログ1~24から選択されるものである。
本発明における「インスリン誘導体」には、天然インスリンと比較してアミノ酸配列に少なくとも1つの差異のあるペプチド、天然インスリン配列を修飾(modification)することにより改変されたペプチド、天然インスリンのように生体内の血糖調節機能を調節する天然インスリン模倣体が含まれる。この天然インスリンの誘導体は、生体内血糖調節機能を有するものであってもよい。
具体的には、インスリン誘導体は、天然インスリンの一部のアミノ酸が置換(substitution)、付加(addition)、欠失(deletion)及び修飾(modification)のいずれかの方法又はそれらの方法の組み合わせにより改変されたものであってもよい。
具体的には、天然インスリンのA鎖、B鎖とそれぞれ少なくとも80%のアミノ酸配列相同性を示し、かつ/又はインスリンのアミノ酸の1つの残基の一部の基が化学的に置換(例えば、alpha-methylation、alpha-hydroxylation)、除去(例えば、deamination)もしくは修飾(例えば、N-methylation)された形態であってもよいが、これらに限定されるものではない。
誘導体作製のための様々な方法の組み合わせにより、本発明に用いられる天然インスリンの誘導体を作製することができる。
また、インスリン誘導体の作製のためのこのような改変には、L型もしくはD型アミノ酸及び/又は非天然アミノ酸を用いた改変、並びに/あるいは天然配列を修飾又は翻訳後修飾(例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内の共有結合など)することによる改変が全て含まれる。
さらに、インスリンのN及び/又はC末端に1つ又は1つ以上のアミノ酸が付加されたものが全て含まれる。
前記置換されるか、付加されるアミノ酸としては、ヒトタンパク質において通常観察される20種のアミノ酸だけでなく、異常又は非天然アミノ酸を用いることができる。異常アミノ酸の市販元には、Sigma-Aldrich、ChemPep、Genzyme pharmaceuticalsが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと定型的なペプチド配列は、民間のペプチド合成会社、例えば米国のAmerican peptide companyやBachem、又は韓国のAnygenにおいて合成及び購入することができるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明における「天然インスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体のフラグメント」とは、天然インスリン、インスリンアナログ又は天然インスリンの誘導体のN末端又はC末端の少なくとも1つのアミノ酸が欠失した形態を意味する。このようなフラグメントは、体内で血糖調節機能を有する。
また、本発明のインスリンアナログは、前記天然インスリンの誘導体及びフラグメントの作製に用いる各作製方法を単独で用いるか、組み合わせて用いて作製したものであってもよい。
具体的には、本発明によるインスリンアナログは、このような天然インスリンのA鎖及びB鎖の特定アミノ酸残基が改変されたものを含み、より具体的には、天然インスリンのA鎖の特定アミノ酸残基が改変され、かつ/又はB鎖の特定アミノ酸残基が改変されたものであってもよい。
本発明による薬学組成物は、インスリンの血糖調節能力を有するものであれば、(a)天然インスリン、(b)インスリンアナログ、(c)インスリン誘導体、(d)それらのフラグメント、又は(e)それらの組み合わせを有効成分の1つであるインスリンとして含むものであってもよい。
一具体例において、本発明のインスリン、又はグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であってもよい。
本発明における、インスリン、又はグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドの「持続型結合体」又は「結合体」とは、インスリン、又はグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドと生体適合性物質が結合された構造を有し、前記生体適合性物質が結合されていないインスリン、又はグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドより効力の持続性が向上したものを意味する。
前記持続型結合体における生体適合性物質は、インスリン、又はグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドに共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明において、前記結合体の一構成要素であるインスリンは、天然配列を有するインスリンであるか、又は天然配列の少なくとも1つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾もしくはそれらの組み合わせの変異が生じたインスリンのアナログ、誘導体又はフラグメントであってもよいが、天然インスリンの血糖降下/上昇効果を有するものであれば、いかなるものでも本発明の結合体の一構成要素として用いられる。
本発明における「生体適合性物質」とは、生理活性物質(例えば、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド、インスリンなど)に結合され、生体適合性物質部又はキャリアに結合されていない生理活性物質より生理活性物質の効果の持続性を向上させることのできる物質を意味する。前記生体適合性物質は、生理活性物質に共有結合で連結されたものであってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
具体的には、前記結合体は、化学式1で表される結合体である。
[化学式1]
X-La-F
X-La-F
ここで、Xは前記インスリン、又はグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド(すなわち、三重活性体)であり、Lはリンカーであり、aは0又は自然数であるが、aが2以上であればそれぞれのLは互いに独立しており、FはXの半減期を延長させることのできる物質である。
本発明の組成物は、(a)インスリンと、三重活性体とを含むものであってもよく、(b)インスリンの持続型結合体と、三重活性体とを含むものであってもよく(c)インスリンと、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、(d)インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、前記持続型結合体の形態のインスリン又は三重活性体は、向上した体内持続性に基づいて優れた血糖調節効果を発揮すると共に、インスリンの副作用を改善することができる。
前記結合体におけるFは、X、すなわちインスリン又は三重活性体の半減期を延長させることのできる物質であり、本発明の前記結合体の一部をなす構成である。
前記Fは、Xに共有化学結合又は非共有化学結合により互いに結合されたものであってもよく、Lを介して、Xに共有化学結合、非共有化学結合又はそれらの組み合わせにより互いに結合されたものであってもよい。
前記Xの半減期を延長させることのできる物質は、生体適合性物質であってもよく、例えば高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、FcRn結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン(Transferrin)、サッカライド(saccharide)、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択されるものであるが、特にこれらに限定されるものではない。
前記エラスチンの場合、水溶性前駆体であるヒトトロポエラスチン(tropoelastin)であってもよく、それらの一部の配列又は一部の繰り返し単位の重合体であってもよく、例えばエラスチン様ポリペプチドであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
前記高分子重合体の例として、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される高分子重合体が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
前記ポリエチレングリコールとは、エチレングリコール同種重合体、PEG共重合体、又はモノメチル置換PEG重合体(mPEG)の形態を包括するものであるが、特にこれらに限定されるものではない。
また、前記生体適合性物質には、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸などのポリアミノ酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。
さらに、脂肪酸は、生体内アルブミンとの結合力を有するものであるが、特にこれに限定されるものではない。
より具体的な例として、前記FcRn結合物質は、免疫グロブリンFc領域であり、さらに具体的にはIgG Fc領域であるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明のペプチド内の少なくとも1つのアミノ酸側鎖は、生体内で可溶性及び/又は半減期を向上させ、かつ/又はバイオアベイラビリティを増加させるために、このような生体適合性物質に接合されてもよい。また、このような改変は、治療学的タンパク質及びペプチドのクリアランス(clearance)を減少させる。
前述した生体適合性物質は、水溶性(両親媒性又は親水性)のもの及び/又は無毒性のもの及び/又は薬学的に許容されるものであってもよい。
前記Fは、Xに直接連結されたもの(すなわち、化学式1において、aが0である)であってもよく、リンカーLを介して連結されたものであってもよい。
本発明における「免疫グロブリンFc領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除いたものであり、重鎖定常領域2(CH2)及び/又は重鎖定常領域3(CH3)部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンFc領域は、本発明の結合体の一部をなす構成である。
このような免疫グロブリンFc領域は、重鎖定常領域にヒンジ(hinge)領域を含んでもよいが、これに限定されるものではない。また、本発明の免疫グロブリンFc領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域1(CH1)及び/又は軽鎖定常領域1(CL1)を含む拡張されたFc領域であってもよい。さらに、CH2及び/又はCH3に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が欠失した領域であってもよい。
例えば、本発明の免疫グロブリンFc領域は、1)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメイン、2)CH1ドメイン及びCH2ドメイン、3)CH1ドメイン及びCH3ドメイン、4)CH2ドメイン及びCH3ドメイン、5)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインの少なくとも1つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域(又はヒンジ領域の一部)との組み合わせ、6)重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体である。しかし、これらに限定されるものではない。
また、一具体例として、前記免疫グロブリンFc領域は、二量体形態(dimeric form)であってもよく、二量体形態の1つのFc領域にX1分子が共有結合的に連結されたものであってもよく、ここで前記免疫グロブリンFcとXは非ペプチド性重合体により互いに連結されたものであってもよい。一方、二量体形態の1つのFc領域にX2分子が対称に結合されたものであってもよい。ここで、前記免疫グロブリンFcとXは、非ペプチド性リンカーにより互いに連結されてもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
また、本発明の免疫グロブリンFc領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列の少なくとも1つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。
例えば、IgG Fcの場合、結合に重要であることが知られている214~238、297~299、318~322又は327~331番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられてもよい。
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然FcからN末端のいくつかのアミノ酸が欠失された誘導体、又は天然FcのN末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な種類の誘導体が用いられる。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばC1q結合部位が除去されてもよく、ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity)部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンFc領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献7、8などに開示されている。
分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知である(非特許文献1)。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly間の交換である。場合によっては、リン酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、グリコシル化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミド化(amidation)などにより修飾(modification)されてもよい。
前述したFc誘導体は、本発明のFc領域と同等の生物学的活性を示し、Fc領域の熱、pHなどに対する構造的安定性を向上させたものであってもよい。
また、このようなFc領域は、ヒトや、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得る方法であってもよい。パパインで処理するとFab及びFcに切断され、ペプシンで処理するとpF’c及びF(ab)2に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー(size-exclusion chromatography)などを用いてFc又はpF’cを分離することができる。より具体的な実施形態において、ヒト由来のFc領域は、微生物から得られた組換え型免疫グロブリンFc領域である。
また、免疫グロブリンFc領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンFc糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられる。ここで、Fcから糖鎖が除去された免疫グロブリンFc領域は、補体(c1q)との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンFc領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する。
本発明における「糖鎖の除去(Deglycosylation)」とは、酵素で糖を除去したFc領域を意味し、非グリコシル化(Aglycosylation)とは、原核動物、より具体的な実施形態においては大腸菌で産生されてグリコシル化されていないFc領域を意味する。
一方、免疫グロブリンFc領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、より具体的な実施形態においてはヒト起源である。
また、免疫グロブリンFc領域は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM由来であるか、又はそれらの組み合わせ(combination)もしくはそれらのハイブリッド(hybrid)によるFc領域である。より具体的な実施形態においては、ヒト血液に最も豊富なIgG又はIgM由来であり、さらに具体的な実施形態においては、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることと知られているIgG由来である。一層具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンFc領域はIgG4 Fc領域であり、最も具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンFc領域はヒトIgG4由来の非グリコシル化されたFc領域であるが、これらに限定されるものではない。
一方、本発明における「組み合わせ(combination)」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンFc領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及びIgE Fcフラグメントからなる群から選択される少なくとも2つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。
また、前述した結合体は、天然インスリンもしくは三重活性体、又はFが修飾されていないXに比べて、効力の持続性が向上したものであってもよく、そのような結合体には、前述した形態だけでなく、生分解性ナノパーティクルに封入された形態などが全て含まれる。
また、前記Lは、ペプチド性リンカー又は非ペプチド性リンカーであってもよい。
前記Lがペプチド性リンカーである場合、1つ以上のアミノ酸を含み、例えば1個~1000個のアミノ酸を含むが、特にこれらに限定されるものではない。本発明において、FとXを連結するために、公知の様々なペプチドリンカーが用いられ、例えば[GS]xリンカー、[GGGS]xリンカー、[GGGGS]xリンカーなどが挙げられ、ここでxは1以上の自然数である。しかし、上記例に限定されるものではない。
本発明における「非ペプチド性リンカー」には、繰り返し単位が少なくとも2つ結合された生体適合性重合体が含まれる。前記繰り返し単位は、ペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。前記非ペプチド性リンカーは、本発明の結合体の一部をなす構成であり、化学式1のLに該当する。本発明における前記非ペプチド性リンカーは、非ペプチド性重合体と混用される。
本発明における非ペプチド性リンカーは、末端に反応基を含み、結合体を構成する他の構成要素との反応により結合体を形成することができる。両末端に反応性官能基を有する非ペプチド性リンカーが各反応基を介して化学式1のX及びFに結合することにより結合体を形成する場合、前記非ペプチド性リンカー又は非ペプチド性重合体を非ペプチド性リンカー連結部又は非ペプチド性重合体連結部(linker moiety)ともいう。
前記Laにおいて、aは1以上であってもよく、aが2以上であればそれぞれのLは独立したものであってもよい。
また、具体的な一実施形態における前記結合体は、F、具体的には免疫グロブリンFc領域、及びX、具体的にはペプチド薬物に結合される反応基を両末端に含む非ペプチド性リンカーを介して、FとXが互いに共有結合的に連結されたものであってもよい。
具体的には、前記非ペプチド性リンカーは、脂肪酸、サッカライド(saccharide)、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。
本発明における前記高分子重合体は、0超、約100kDa以下の範囲、具体的には約1~約100kDaの範囲、より具体的には約1~約20kDaの範囲であるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明における「約」とは、±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値が全て含まれるが、これらに限定されるものではない。
前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。より具体的な実施形態における前記Lは、ポリエチレングリコールであるが、これに限定されるものではない。また、当該分野で公知のそれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明に含まれる。
本発明に用いられる非ペプチド性リンカーは、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であればいかなるものでもよい。非ペプチド性重合体の分子量は、約1~約100kDaの範囲、具体的には約1~約20kDaの範囲であるが、これらに限定されるものではない。また、前記Fに該当するポリペプチドに結合される本発明の非ペプチド性リンカーは、1種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
具体的な一実施形態における前記非ペプチド性リンカーの両末端は、それぞれF、例えば免疫グロブリンFc領域のアミノ基又はチオール基、及びXのアミノ基又はチオール基に結合することができる。
具体的には、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれF(例えば、免疫グロブリンFc領域)とXに結合される反応基、具体的には、X、あるいはF(例えば、免疫グロブリンFc領域)のN末端もしくはリシンに位置するアミノ基、又はシステインのチオール基に結合される反応基を含むが、これらに限定されるものではない。
また、F、例えば免疫グロブリンFc領域、及びXに結合される前記非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるが、これらに限定されるものではない。
上記において、アルデヒド基の例として、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記において、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、N-ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられるが、これらに限定されるものではない。
非ペプチド性リンカーは、このような反応基を介してXとFに連結されるが、特にこれに限定されるものではない。
また、アルデヒド結合による還元性アミン化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりはるかに安定している。アルデヒド反応基は、低いpHではN末端に選択的に反応し、高いpH、例えばpH9.0の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
また、前記非ペプチド性リンカーの両末端の反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有してもよい。しかし、非ペプチド性リンカーの各末端にF、具体的には免疫グロブリンFc領域とXが結合されるものであれば、特にこれらに限定されるものではない。
例えば、前記非ペプチド性リンカーの一末端には反応基としてマレイミド基を含み、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基などを含んでもよい。
両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応基として活性化するか、市販されている修飾された反応基を有するポリエチレングリコールを用いることにより、本発明の持続型タンパク質結合体を作製することができる。
具体的な一実施形態において、前記非ペプチド性重合体は、三重活性体のシステイン残基、より具体的にはシステインの-SH基に連結されたものであるが、これらに限定されるものではない。
例えば、前記三重活性体において、10番目のシステイン残基、13番目のシステイン残基、15番目のシステイン残基、17番目のシステイン残基、19番目のシステイン残基、21番目のシステイン残基、24番目のシステイン残基、28番目のシステイン残基、29番目のシステイン残基、30番目のシステイン残基、31番目のシステイン残基、40番目のシステイン残基、又は41番目のシステイン残基に前記非ペプチド性重合体が連結されたものが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
具体的には、前記システイン残基の-SH基に非ペプチド性重合体の反応基が連結されてもよい。反応基については前述した通りである。マレイミド-PEG-アルデヒドを用いる場合、マレイミド基はXの-SH基にチオエーテル(thioether)結合で連結することができ、アルデヒド基はF、具体的には免疫グロブリンFcの-NH2基に還元的アミン化反応により連結することができるが、これらに限定されるものではなく、これらは一例にすぎない。
具体的な一実施形態における前記非ペプチド性重合体は、インスリン又はそのアナログのアミノ基、より具体的にはN末端に位置するアミノ基、又はリシンの側鎖に位置するアミノ基に連結されたものであってもよいが、これらに限定されるものではなく、これらは一例にすぎない。
また、前記結合体において、非ペプチド性重合体の反応基が免疫グロブリンFc領域のN末端に位置する-NH2に連結されたものであってもよいが、これは一例にすぎない。
本発明における「予防」とは、前記組成物の投与によりインスリン関連疾患の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、前記組成物の投与によりインスリン関連疾患の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、特にこれらに限定されるものではないが、前記組成物を生体内標的に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路で投与することができ、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。
本発明による薬学組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
本発明における「薬学的に許容される」とは、治療効果を発揮する程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。
薬学的に許容される担体は、経口投与の場合は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを用いることができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して様々に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。
なお、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
さらに、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有してもよい。
さらに、前記結合体は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容される様々な担体(carrier)と混合して用いることができ、安定性や吸水性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸(ascorbic acid)、グルタチオンなどの抗酸化剤(antioxidants)、キレート剤、低分子タンパク質、他の安定化剤(stabilizers)などを薬剤として用いることができる。
本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。
本発明の組成物の総有効量は、単回投与量(single dose)で患者に投与してもよく、複数回投与量(multiple dose)で長期間投与される分割治療方法(fractionated treatment protocol)により投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。具体的には、本発明の結合体の総用量は、1日体重1kg当たり約0.0001mg~500mgであることが好ましい。しかし、前記結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、***率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。
また、本発明の前記薬学的組成物は、上記併用剤、すなわち三重活性体又はその持続型結合体、及びインスリン又はその持続型結合体(又は上記併用剤の各成分)を0.01~99%(w/v)含有してもよい。
本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与患者における体重減少のための複合製剤を提供する。
前記インスリン、並びにグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドと共に組成物に含まれる成分については前述した通りである。
具体的には、前記複合製剤は、(a)インスリンと、三重活性体とを含むものであってもよく、(b)インスリンとその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、インスリンの持続型結合体と、三重活性体とを含むものであってもよく、(c)インスリンと、三重活性体とその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、(d)インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよい。
具体的には、前記複合製剤は、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを全て含み、ここでインスリン:三重活性体が1:1~100:1のモル比となるように含むものであるか、インスリン:三重活性体が1:1~1:100のモル比となるように含むものであり、また、インスリン又はその持続型結合体:三重活性体又はその持続型結合体が1:1~100:1のモル比となるように含むものであるか、インスリン又はその持続型結合体:三重活性体又はその持続型結合体が1:1~1:100のモル比となるように含むものであるが、これらに限定されるものではない。
本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含むキットを提供する。
前記インスリン、並びにグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドについては前述した通りである。
前記キットは、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドの投与のための指示書を含んでもよい。
具体的には、前記キットは、(a)インスリンと、三重活性体とを含むものであってもよく、(b)インスリンとその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、インスリンの持続型結合体と、三重活性体とを含むものであってもよく、(c)インスリンと、三重活性体とその生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよく、(d)インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体とを含むものであってもよい。
具体的には、前記キットは、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを全て含み、ここでインスリン:三重活性体を1:1~100:1のモル比、又は1:1~1:100のモル比で個体に投与させる指示書を含むものであってもよく、インスリン又はその持続型結合体:三重活性体又はその持続型結合体を1:1~100:1のモル比、又は1:1~1:100のモル比で個体に投与させる指示書を含むものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明を実現する一態様は、薬剤の製造における、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む組成物又は複合製剤の用途を提供する。
前記組成物又は複合製剤については前述した通りである。前記薬剤は、前述した全ての用途に用いられる。
本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療方法を提供する。
本発明を実現する一態様は、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法を提供する。
具体的には、本発明を実現する一態様は、(i)インスリンと、(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを個体に投与するステップを含む、インスリン投与による体重増加を減少させる方法を提供する。
前記個体は、インスリン関連疾患を発症するリスクのある個体であってもよく、発症した個体であってもよい。また、インスリン投与が必要な個体であってもよく、インスリン投与が必要な個体であって、体重減少が必要な個体であってもよい。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
前記投与するステップは、(a)インスリンと、三重活性体を併用投与することにより行ってもよく、(b)インスリンの持続型結合体と、三重活性体を併用投与することにより行ってもよく、(c)インスリンと、三重活性体の持続型結合体を併用投与することにより行ってもよく、(d)インスリンの持続型結合体と、三重活性体の持続型結合体を併用投与することにより行ってもよい。
本願における「併用」とは、同時、順次又は個別投与を意味するものと理解されるべきである。前記投与が順次又は個別の場合、2次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないものでなければならない。
前記物質は、それぞれ同時、順次又は逆順に投与してもよく、適切な有効量の組み合わせで同時に投与してもよいが、特定の投与方法又は順序に限定されるものではない。
また、本発明の予防又は治療方法は、前記(a)~(d)のいずれかを含む組成物又は複合製剤を個体に投与するものであるが、これらに限定されるものではない。
インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体とを含む本発明の組成物又は複合製剤は、インスリンの活性又は機能を補充し、血糖を著しく低下させると共に、体重増加などのインスリンの副作用を抑制するので、インスリン関連疾患治療に優れた効果を発揮する。
また、前記組成物又は複合製剤は、薬学的分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単回投与型の製剤、具体的にはタンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化し、当該技術分野で通常用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内もしくは直腸経路が含まれる非経口投与経路で投与することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法は、前記有効成分を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。好適な総1日使用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定され、1回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否か、具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に又は同時に投与される薬物をはじめとする様々な因子や、医薬分野で周知の類似の因子に応じて異なる量であることが好ましい。
具体的には、インスリン又はその持続型結合体と、三重活性体又はその持続型結合体は、インスリン:三重活性体を1:1~100:1のモル比、又は1:1~1:100のモル比で個体に投与してもよく、インスリン又はその持続型結合体:三重活性体又はその持続型結合体を1:1~100:1のモル比、又は1:1~1:100のモル比で個体に投与してもよいが、これらに限定されるものではない。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
三重活性体及びその持続型結合体の作製
(1)三重活性体の作製
グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体の全てに活性を有する三重活性体を作製した。表1にその配列を示す。
(1)三重活性体の作製
グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体の全てに活性を有する三重活性体を作製した。表1にその配列を示す。
表1の配列において、Xで表記したアミノ酸は非天然アミノ酸であるAib(aminoisobutyric acid)を意味し、下線を引いたアミノ酸は当該アミノ酸が互いに環を形成することを意味する。また、表1の配列において、CAは4-イミダゾアセチル(4-imidazoacetyl)を意味し、Yはチロシンを意味する。
(2)三重活性体の持続型結合体の作製
両末端にそれぞれマレイミド基及びアルデヒド基を有する10kDaのPEG、すなわちマレイミド-PEG-アルデヒド(10kDa,NOF,日本)を実施例1の三重活性体(配列番号21、22、42、43、50、77及び96)のシステイン残基にペグ化するために、三重活性体とマレイミド-PEG-アルデヒドのモル比を1:1~3とし、タンパク質の濃度を1~5mg/mlとし、低温で0.5~3時間反応させた。ここで、反応は、50mM Tris緩衝液(pH7.5)に20~60%イソプロパノールを添加した環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をSPセファロースHP(GE healthcare, 米国)に適用し、システインにモノペグ化された三重活性体を精製した。
両末端にそれぞれマレイミド基及びアルデヒド基を有する10kDaのPEG、すなわちマレイミド-PEG-アルデヒド(10kDa,NOF,日本)を実施例1の三重活性体(配列番号21、22、42、43、50、77及び96)のシステイン残基にペグ化するために、三重活性体とマレイミド-PEG-アルデヒドのモル比を1:1~3とし、タンパク質の濃度を1~5mg/mlとし、低温で0.5~3時間反応させた。ここで、反応は、50mM Tris緩衝液(pH7.5)に20~60%イソプロパノールを添加した環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をSPセファロースHP(GE healthcare, 米国)に適用し、システインにモノペグ化された三重活性体を精製した。
次に、前記精製したモノペグ化三重活性体と免疫グロブリンFcのモル比を1:1~5とし、タンパク質の濃度を10~50mg/mlとし、4~8℃で12~18時間反応させた。反応は、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)に還元剤である10~50mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムと10~30%イソプロパノールを添加した環境下で行った。反応終了後に、前記反応液をブチルセファロースFF精製カラム(GE healthcare, 米国)とSource ISO精製カラム(GE healthcare, 米国)に適用し、三重活性体と免疫グロブリンFcとを含む結合体を精製した。
作製後に逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーで分析した純度は95%以上であった。
ここで、配列番号21の三重活性体及び免疫グロブリンFcがPEGを介して連結された結合体を「配列番号21と免疫グロブリンFcとを含む結合体」、「配列番号21の持続型結合体」又は「配列番号21持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号22の三重活性体及び免疫グロブリンFcがPEGを介して連結された結合体を「配列番号22と免疫グロブリンFcとを含む結合体」、「配列番号22の持続型結合体」又は「配列番号22持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号42の三重活性体及び免疫グロブリンFcがPEGを介して連結された結合体を「配列番号42と免疫グロブリンFcとを含む結合体」、「配列番号42の持続型結合体」又は「配列番号42持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号43の三重活性体及び免疫グロブリンFcがPEGを介して連結された結合体を「配列番号43と免疫グロブリンFcとを含む結合体」、「配列番号43の持続型結合体」又は「配列番号43持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号50の三重活性体及び免疫グロブリンFcがPEGを介して連結された結合体を「配列番号50と免疫グロブリンFcとを含む結合体」、「配列番号50の持続型結合体」又は「配列番号50持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号77の三重活性体及び免疫グロブリンFcがPEGを介して連結された結合体を「配列番号77と免疫グロブリンFcとを含む結合体」、「配列番号77の持続型結合体」又は「配列番号77持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
ここで、配列番号96の三重活性体及び免疫グロブリンFcがPEGを介して連結された結合体を「配列番号96と免疫グロブリンFcとを含む結合体」、「配列番号96の持続型結合体」又は「配列番号96持続型結合体」と命名した。これらは本願において混用される。
天然インスリンの持続型結合体の作製
天然ヒトインスリン(インド,Biocon社)のB鎖のN末端に3.4K propion-ALD(2) PEG(両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基を1つずつ有する3.4kDaのPEG,米国,NOF社)をペグ化するために、天然インスリン:PEGのモル比を1: 4とし、天然インスリンの濃度を5mg/mlとし、4℃で約2時間反応させた。ここで、反応は、50mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)と45%イソプロパノールの混合溶媒において、3mMの濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride (NaCNBH3))還元剤を添加して行った。反応液は、クエン酸ナトリウム(pH3.0)、45%EtOHを含むバッファとKClの濃度勾配を用いたSP-HP(GE Healthcare)カラムで精製した。
天然ヒトインスリン(インド,Biocon社)のB鎖のN末端に3.4K propion-ALD(2) PEG(両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基を1つずつ有する3.4kDaのPEG,米国,NOF社)をペグ化するために、天然インスリン:PEGのモル比を1: 4とし、天然インスリンの濃度を5mg/mlとし、4℃で約2時間反応させた。ここで、反応は、50mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)と45%イソプロパノールの混合溶媒において、3mMの濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride (NaCNBH3))還元剤を添加して行った。反応液は、クエン酸ナトリウム(pH3.0)、45%EtOHを含むバッファとKClの濃度勾配を用いたSP-HP(GE Healthcare)カラムで精製した。
次に、前記天然インスリンが結合されたPEGを免疫グロブリンFcフラグメントのN末端に結合させるために、前記精製したモノペグ化(mono-PEGylated)インスリンと免疫グロブリンFcフラグメントのモル比を1:1.2とし、総タンパク質濃度を20mg/mlとし、25℃で15時間反応させた。ここで、反応液は、100mMヘペス(HEPES)緩衝液(pH8.2)と塩化ナトリウムに、還元剤として20mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。
反応終了後に、反応液は、Tris-HCl(pH7.5)バッファーとNaClの濃度勾配を用いてQ-HP(GE, 米国)カラムに適用し、硫酸アンモニウム(ammoniumsulfate)とTris-HCl(pH7.5)の濃度勾配を用いて、Source 15ISO(GE, 米国)に適用し、天然インスリン-3.4K PEG-免疫グロブリンFc結合体を精製した。
実験例1:三重活性体及びその持続型結合体のin vitro活性の測定
実施例1で製造した三重活性体及びその持続型結合体の活性を測定するために、GLP-1受容体、グルカゴン(GCG)受容体及びGIP受容体がそれぞれ形質転換された細胞株を用いて、in vitroで細胞活性を測定する方法を行った。
実施例1で製造した三重活性体及びその持続型結合体の活性を測定するために、GLP-1受容体、グルカゴン(GCG)受容体及びGIP受容体がそれぞれ形質転換された細胞株を用いて、in vitroで細胞活性を測定する方法を行った。
前記各細胞株は、CHO(chinese hamster ovary)にヒトGLP-1受容体、ヒトGCG受容体及びヒトGIP受容体遺伝子をそれぞれ発現するように形質転換されたものであり、GLP-1、GCG及びGIPの活性を測定するのに適している。よって、各部分の活性を各形質転換細胞株を用いて測定した。
実施例1及び2で作製した三重活性体及びその持続型結合体のGLP-1活性の測定のために、ヒトGLP-1を連続的に希釈し、実施例1及び2で作製した三重活性体及びその持続型結合体を連続的に希釈した。前記培養したヒトGLP-1受容体が発現したCHO細胞から培養液を除去し、連続的に希釈した各物質を5μlずつ前記細胞に添加し、次いでcAMP抗体を含む緩衝液を5μlずつ追加し、その後常温で15分間培養した。次に、細胞溶解緩衝液(cell lysis buffer)を含むdetection mixを10μlずつ加えて細胞を溶解させ、常温で90分間反応させた。前記反応が終了した細胞溶解物をLANCE cAMP kit(PerkinElmer, USA)に適用し、蓄積されたcAMPからEC50値を算出し、相互比較した。ヒトGLP-1に対する相対力価を表2及び表3に示す。
実施例1及び2で作製した三重活性体及びその持続型結合体のGCG活性の測定のために、ヒトGCGを連続的に希釈し、実施例1及び2で作製した三重活性体及びその持続型結合体を連続的に希釈した。前記培養したヒトGCG受容体が発現したCHO細胞から培養液を除去し、連続的に希釈した各物質を5μlずつ前記細胞に添加し、次いでcAMP抗体を含む緩衝液を5μlずつ追加し、その後常温で15分間培養した。次に、細胞溶解緩衝液(cell lysis buffer)を含むdetection mixを10μlずつ加えて細胞を溶解させ、常温で90分間反応させた。前記反応が終了した細胞溶解物をLANCE cAMP kit(PerkinElmer, USA)に適用し、蓄積されたcAMPからEC50値を算出し、相互比較した。ヒトGCGに対する相対力価を表2及び表3に示す。
実施例1及び2で作製した三重活性体及びその持続型結合体のGIP活性の測定のために、ヒトGIPを連続的に希釈し、実施例1及び2で作製した三重活性体及びその持続型結合体を連続的に希釈した。前記培養したヒトGIP受容体が発現したCHO細胞から培養液を除去し、連続的に希釈した各物質を5μlずつ前記細胞に添加し、次いでcAMP抗体を含む緩衝液を5μlずつ追加し、その後常温で15分間培養した。次に、細胞溶解緩衝液(cell lysis buffer)を含むdetection mixを10μlずつ加えて細胞を溶解させ、常温で90分間反応させた。前記反応が終了した細胞溶解物をLANCE cAMP kit(PerkinElmer, USA)に適用し、蓄積されたcAMPからEC50値を算出し、相互比較した。ヒトGIPに対する相対力価を表2及び表3に示す。
実験例2:インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与による2型糖尿病モデルマウスにおける血糖調節効果及び体重変化(△Body weight)の確認
実施例1で作製した三重活性体(配列番号42)の持続型結合体、もしくは実施例2で作製した天然インスリンの持続型結合体を含む組成物の投与、又は三重活性体(配列番号42)の持続型結合体及び天然インスリンの持続型結合体の併用投与によるインビボ(in vivo)効力を測定するために、2型糖尿病モデルであるdb/dbマウス(Charles River, Japan)を用いた。db/dbマウス(BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd mouse)は、レプチン(leptin)受容体の除去により糖尿病症状を示すので本実験例に用いた。
実施例1で作製した三重活性体(配列番号42)の持続型結合体、もしくは実施例2で作製した天然インスリンの持続型結合体を含む組成物の投与、又は三重活性体(配列番号42)の持続型結合体及び天然インスリンの持続型結合体の併用投与によるインビボ(in vivo)効力を測定するために、2型糖尿病モデルであるdb/dbマウス(Charles River, Japan)を用いた。db/dbマウス(BKS.Cg-+Leprdb/+ Leprdb/OlaHsd mouse)は、レプチン(leptin)受容体の除去により糖尿病症状を示すので本実験例に用いた。
8週齢のdb/dbマウスの尾静脈から26G注射器で得た1~2滴の血液を用いて、血糖分析器(OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., USA)で血糖を測定した。測定された血糖に基づいて糖尿病が誘発されたか否かを判断した(350~600mg/dlの範囲)。糖尿病が誘導されたマウスを血糖に応じて1群当たり7匹ずつ、G1、G2、G3及びG4の4つの群に分けた。
上記群を、それぞれ対照群(Vehicle)、天然インスリンの持続型結合体(15.8nmol/kg/Q2D)を投与した群、三重活性体の持続型結合体(1.4nmol/kg/Q2D)投与した群、天然インスリンの持続型結合体(15.8nmol/kg/Q2D)及び三重活性体の持続型結合体(1.4nmol/kg/Q2D)を併用投与した群に分けた。そして、上記試験物質を2週間にわたって繰り返し投与し、その後上記各群に対してグリコヘモグロビン(HbA1c)を測定した。グリコヘモグロビンは赤血球に正常に存在する血色素に糖が結合した形態であり、血糖が高く維持されるとグリコヘモグロビン値も高くなる。また、薬物投与前と試験最終日に試験動物の体重変化値(△Body weight)を計算した。
その結果、天然インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与群においてグリコヘモグロビン値が低下することが確認された(図1)。具体的には、図1において、対照群と比較したグリコヘモグロビン値の変化は、インスリンの持続型結合体投与群は-0.1であり、三重活性体の持続型結合体投与群は-0.3であり、インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与群は-0.5である。
これは、天然インスリンの持続型結合体又は三重活性体の持続型結合体をそれぞれ投与した群に比べて著しく改善された結果である。
△Body weight測定の結果、天然インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体を併用投与した群は、天然インスリンの持続型結合体の単独投与群より体重増加効果が改善されるだけでなく、対照群と比べても著しい体重減少効果を示す(図2)。具体的には、図2に示すように、対照群は+15.8%であり、インスリンの持続型結合体投与群は+23.1%であり、三重活性体の持続型結合体投与群は-9.3%であり、インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与群は-3.8%である。
これらの結果は、本発明のインスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体を併用投与すると、それぞれの単独投与に比べて優れた血糖調節効果を示すことを意味し、また、インスリンの持続型結合体及び三重活性体の持続型結合体の併用投与は、インスリン単独投与による体重増加の副作用を大幅に減少させることを示唆するものである。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Claims (60)
- (i)インスリンと、
(ii)グルカゴン受容体、GLP-1(Glucagon-like peptide-1)受容体、及びGIP(Glucose-dependent insulinotropic polypeptide)受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用薬学組成物。 - 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項1に記載の組成物。
- 前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項1に記載の組成物。
- 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であり、
前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項1に記載の組成物。 - 前記組成物は、インスリン投与が求められる個体に投与されるものである、請求項1に記載の組成物。
- 前記インスリン関連疾患は、インスリン抵抗性疾患、糖尿病、過血糖症及び肥満からなる群から選択されるものである、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物は、血糖降下効力及びインスリン単独投与の際に現れる体重増加を抑制する効力をどちらも有する、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、
ここで、インスリン又はその結合体:グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が1:1~100:1のモル比となるように含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、
ここで、インスリン又はその結合体:グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が1:1~1:100のモル比となるように含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、天然グルカゴン配列の少なくとも1つのアミノ酸の置換(substitution)、付加(addition)、欠失(deletion)、修飾(modification)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた、天然グルカゴンのアナログである、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
- 付加されるアミノ酸配列は、天然GLP-1、天然GIP又は天然エキセンジン-4のアミノ酸配列に由来するものである、請求項10に記載の組成物。
- 前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、下記一般式1で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項1に記載の組成物。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-R1(一般式1,配列番号103)
前記一般式1において、
Xaa1はヒスチジン(His,H)、4-イミダゾアセチル(CA)又はチロシン(Tyr,Y)であり、
Xaa2はグリシン(Gly,G)、α-メチルグルタミン酸又はAib(aminoisobutyric acid)であり、
Xaa3はグルタミン酸(Glu,E)又はグルタミン(Gln,Q)であり、
Xaa7はトレオニン(Thr,T)又はイソロイシン(Ile,I)であり、
Xaa10はロイシン(Leu,L)、チロシン(Tyr,Y)、リシン(Lys,K)、システイン(Cys,C)又はバリン(Val,V)であり、
Xaa12はリシン(Lys,K)、セリン(Ser,S)又はイソロイシン(Ile,I)であり、
Xaa13はグルタミン(Gln,Q)、チロシン(Tyr,Y)、アラニン(Ala,A)又はシステイン(Cys,C)であり、
Xaa14はロイシン(Leu,L)、メチオニン(Met,M)又はチロシン(Tyr,Y)であり、
Xaa15はシステイン(Cys,C)、アスパラギン酸(Asp,D)、グルタミン酸(Glu,E)又はロイシン(Leu,L)であり、
Xaa16はグリシン(Gly,G)、グルタミン酸(Glu,E)又はセリン(Ser,S)であり、
Xaa17はグルタミン(Gln,Q)、アルギニン(Arg,R)、イソロイシン(Ile,I)、グルタミン酸(Glu,E)、システイン(Cys,C)又はリシン(Lys,K)であり、
Xaa18はアラニン(Ala,A)、グルタミン(Gln,Q)、アルギニン(Arg,R)又はヒスチジン(His,H)であり、
Xaa19はアラニン(Ala,A)、グルタミン(Gln,Q)、システイン(Cys,C)又はバリン(Val,V)であり、
Xaa20はリシン(Lys,K)、グルタミン(Gln,Q)又はアルギニン(Arg,R)であり、
Xaa21はグルタミン酸(Glu,E)、グルタミン(Gln,Q)、ロイシン(Leu,L)、システイン(Cys,C)又はアスパラギン酸(Asp,D)であり、
Xaa23はイソロイシン(Ile,I)又はバリン(Val,V)であり、
Xaa24はアラニン(Ala,A)、グルタミン(Gln,Q)、システイン(Cys,C)、アスパラギン(Asn,N)、アスパラギン酸(Asp,D)又はグルタミン酸(Glu,E)であり、
Xaa27はバリン(Val,V)、ロイシン(Leu,L)、リシン(Lys,K)又はメチオニン(Met,M)であり、
Xaa28はシステイン(Cys,C)、リシン(Lys,K)、アラニン(Ala,A)、アスパラギン(Asn,N)又はアスパラギン酸(Asp,D)であり、
Xaa29はシステイン(Cys,C)、グリシン(Gly,G)、グルタミン(Gln,Q)、トレオニン(Thr,T)、グルタミン酸(Glu,E)又はヒスチジン(His,H)であり、
Xaa30はシステイン(Cys,C)、グリシン(Gly,G)、リシン(Lys,K)もしくはヒスチジン(His,H)であるか、又は存在せず、
R1はシステイン(Cys,C)、GKKNDWKHNIT(配列番号106)、m-SSGAPPPS-n(配列番号107)もしくはm-SSGQPPPS-n(配列番号108)であるか、又は存在せず、
ここで、
mはCys、Pro又はGly-Proであり、
nはCys、Gly、SerもしくはHis-Glyであるか、又は存在しない。 - Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、Xaa15はシステイン、アスパラギン酸又はロイシンである、請求項12に記載の組成物。
- 前記一般式1において、
Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、
Xaa7はトレオニンであり、
Xaa10はチロシン、システイン又はバリンであり、
Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、
Xaa13はチロシン、アラニン、グルタミン又はシステインであり、
Xaa14はロイシン、システイン又はメチオニンであり、
Xaa15はシステイン、ロイシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン、グルタミン酸又はリシンであり、
Xaa18はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Xaa19はアラニン、グルタミン、バリン又はシステインであり、
Xaa20はリシン、アルギニン又はグルタミンであり、
Xaa21はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン又はアスパラギン酸であり、
Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、
Xaa24はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
Xaa27はロイシン又はリシンである、請求項12に記載の組成物。 - 前記ペプチドは、下記一般式2で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項12に記載の組成物。
Xaa1-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Ser-Ser-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa40(一般式2,配列番号104)
前記一般式2において、
Xaa1は4-イミダゾアセチル、ヒスチジン又はチロシンであり、
Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、
Xaa10はチロシン又はシステインであり、
Xaa13はアラニン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、
Xaa14はロイシン、メチオニン又はチロシンであり、
Xaa15はアスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシンであり、
Xaa16はグリシン、グルタミン酸又はセリンであり、
Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン又はリシンであり、
Xaa18はアラニン、グルタミン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Xaa19はアラニン、グルタミン、システイン又はバリンであり、
Xaa20はリシン、グルタミン又はアルギニンであり、
Xaa21はシステイン、グルタミン酸、グルタミン、ロイシン又はアスパラギン酸であり、
Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、
Xaa24はシステイン、アラニン、グルタミン、アスパラギン又はグルタミン酸であり、
Xaa28はリシン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、
Xaa29はグリシン、グルタミン、システイン又はヒスチジンであり、
Xaa30はシステイン、グリシン、リシン又はヒスチジンであり、
Xaa31はプロリン又はシステインであり、
Xaa40はシステインであるか、又は存在しない。 - 前記一般式1において、
Xaa2はグリシン、α-メチルグルタミン酸又はAibであり、
Xaa7はトレオニンであり、
Xaa10はチロシン、システイン又はバリンであり、
Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、
Xaa13はチロシン、アラニン又はシステインであり、
Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、
Xaa15はシステイン又はアスパラギン酸であり、
Xaa17はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、
Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Xaa19はアラニン、グルタミン又はシステインであり、
Xaa20はリシン又はグルタミンであり、
Xaa21はグルタミン酸、システイン又はアスパラギン酸であり、
Xaa23はバリンであり、
Xaa24はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、
Xaa27はロイシン又はリシンである、請求項12に記載の組成物。 - 前記一般式2において、
Xaa13はアラニン、チロシン又はシステインであり、
Xaa15はアスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
Xaa17はグルタミン、アルギニン、システイン又はリシンであり、
Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Xaa21はシステイン、グルタミン酸、グルタミン又はアスパラギン酸であり、
Xaa23はイソロイシン又はバリンであり、
Xaa24はシステイン、グルタミン又はアスパラギンであり、
Xaa28はシステイン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、
Xaa29はグルタミン、システイン又はヒスチジンであり、
Xaa30はシステイン、リシン又はヒスチジンである、請求項15に記載の組成物。 - 前記一般式1において、
Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、
Xaa7はトレオニンであり、
Xaa10はチロシン又はシステインであり、
Xaa12はリシン又はイソロイシンであり、
Xaa13はチロシン、アラニン又はシステインであり、
Xaa14はロイシン又はメチオニンであり、
Xaa15はシステイン又はアスパラギン酸であり、
Xaa16はグルタミン酸であり、
Xaa17はアルギニン、イソロイシン、システイン又はリシンであり、
Xaa18はアラニン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Xaa19はアラニン、グルタミン又はシステインであり、
Xaa20はリシン又はグルタミンであり、
Xaa21はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
Xaa23はバリンであり、
Xaa24はグルタミン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、
Xaa27はロイシンであり、
Xaa28はシステイン、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸である、請求項12に記載の組成物。 - 前記一般式1において、
Xaa1はヒスチジン又は4-イミダゾアセチルであり、
Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、
Xaa3はグルタミンであり、
Xaa7はトレオニンであり、
Xaa10はチロシンであり、
Xaa12はイソロイシンであり、
Xaa13はアラニン又はシステインであり、
Xaa14はメチオニンであり、
Xaa15はアスパラギン酸であり、
Xaa16はグルタミン酸であり、
Xaa17はイソロイシン又はリシンであり、
Xaa18はアラニン又はヒスチジンであり、
Xaa19はグルタミン又はシステインであり、
Xaa20はリシンであり、
Xaa21はアスパラギン酸であり、
Xaa23はバリンであり、
Xaa24はアスパラギンであり、
Xaa27はロイシンであり、
Xaa28はアラニン又はアスパラギンであり、
Xaa29はグルタミン又はトレオニンであり、
Xaa30はシステインもしくはリシンであるか、又は存在しない、請求項12に記載の組成物。 - 前記ペプチドは、下記一般式3のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項11に記載の組成物。
Xaa1-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Xaa13-Leu-Asp-Glu-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Lys-Xaa21-Phe-Val-Xaa24-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Ser-Ser-Gly-Gln-Pro-Pro-Pro-Ser-Xaa40(一般式3,配列番号105)
前記一般式3において、
Xaa1はヒスチジン又はチロシンであり、
Xaa2はα-メチルグルタミン酸又はAibであり、
Xaa13はアラニン、チロシン又はシステインであり、
Xaa17はアルギニン、システイン又はリシンであり、
Xaa18はアラニン又はアルギニンであり、
Xaa19はアラニン又はシステインであり、
Xaa21はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、
Xaa24はグルタミン又はアスパラギンであり、
Xaa28はシステイン又はアスパラギン酸であり、
Xaa29はシステイン、ヒスチジン又はグルタミンであり、
Xaa30はシステイン又はヒスチジンであり、
Xaa31はプロリン又はシステインであり、
Xaa40はシステインであるか、又は存在しない。 - 前記R1は、システイン、GKKNDWKHNIT(配列番号106)、CSSGQPPPS(配列番号109)、GPSSGAPPPS(配列番号110)、GPSSGAPPPSC(配列番号111)、PSSGAPPPS(配列番号112)、PSSGAPPPSG(配列番号113)、PSSGAPPPSHG(配列番号114)、PSSGAPPPSS(配列番号115)、PSSGQPPPS(配列番号116)もしくはPSSGQPPPSC(配列番号117)であるか、又は存在しない、請求項12に記載の組成物。
- 前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、配列番号1~102からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の組成物。
- 前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、配列番号42のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の組成物。
- 前記一般式において、N末端から16番目のアミノ酸と20番目のアミノ酸は、互いに環を形成する、請求項12~21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、そのC末端がアミド化したものである、請求項12~21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記インスリンは、天然インスリン、又は天然インスリンの少なくとも1つのアミノ酸に置換、付加、欠失、修飾及びそれらの組み合わせからなる群から選択される変異が生じたインスリンアナログである、請求項1に記載の組成物。
- 前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、3番目のアミノ酸、5番目のアミノ酸、8番目のアミノ酸、10番目のアミノ酸、12番目のアミノ酸、16番目のアミノ酸、23番目のアミノ酸、24番目のアミノ酸、25番目のアミノ酸、26番目のアミノ酸、27番目のアミノ酸、28番目のアミノ酸、29番目のアミノ酸、30番目のアミノ酸、A鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、5番目のアミノ酸、8番目のアミノ酸、10番目のアミノ酸、12番目のアミノ酸、14番目のアミノ酸、16番目のアミノ酸、17番目のアミノ酸、18番目のアミノ酸、19番目のアミノ酸、及び21番目のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているか、欠失しているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログである、請求項26に記載の組成物。
- 前記インスリンアナログは、下記一般式4で表される配列番号119のA鎖と、下記一般式5で表される配列番号120のB鎖とを含む、請求項226に記載の組成物。
[一般式4]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(配列番号119)
前記一般式4において、
Xaa1はアラニン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、
Xaa2はアラニン又はイソロイシンであり、
Xaa5はアラニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン又はアスパラギンであり、
Xaa12はアラニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン又はアスパラギンであり、
Xaa14はアラニン、チロシン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、
Xaa16はアラニン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸又はアスパラギンであり、
Xaa19はアラニン、チロシン、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、トレオニン又はアスパラギンであり、
Xaa21はアスパラギン、グリシン、ヒスチジン又はアラニンである。
[一般式5]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(配列番号120)
前記一般式5において、
Xaa8はアラニン又はグリシンであり、
Xaa16はチロシン、グルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸であるか、又は存在せず、
Xaa23はグリシン又はアラニンであり、
Xaa24はアラニン又はフェニルアラニンであり、
Xaa25はアラニン、フェニルアラニン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であるか、又は存在せず、
Xaa27はトレオニンであるか、又は存在せず、
Xaa28はプロリン、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸であるか、又は存在しない(ここで、配列番号121のA鎖及び配列番号122のB鎖を含むペプチドは除く)。 - 前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の8番目のアミノ酸、23番目のアミノ酸、24番目のアミノ酸、25番目のアミノ酸、A鎖の1番目のアミノ酸、2番目のアミノ酸、及び19番目のアミノ酸からなる群から選択される1つのアミノ酸がアラニンに置換されているか、A鎖の14番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンに置換されているものである、請求項26に記載の組成物。
- 前記インスリンアナログは、配列番号124、126、128、130、132、134、136、138及び140からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の組成物。
- 前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の16番目のアミノ酸がグルタミン酸に置換されているか、25番目のアミノ酸が欠失しているか、天然インスリンのA鎖の14番目のアミノ酸がグルタミン酸もしくはアラニンに置換されているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログである、請求項26に記載の組成物。
- 前記インスリンアナログは、配列番号142又は144のアミノ酸配列を含む、請求項31に記載の組成物。
- 前記インスリンアナログは、天然インスリンのB鎖の16番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリン、トレオニンもしくはアスパラギン酸に置換されているか、天然インスリンのB鎖の25番目のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸に置換されているか、天然インスリンのA鎖の14番目のアミノ酸がヒスチジン、リシン、アラニンもしくはアスパラギン酸に置換されているか、天然インスリンのA鎖の19番目のアミノ酸がグルタミン酸、セリンもしくはトレオニンに置換されているか、又はそれらの組み合わせにより変異したインスリンアナログである、請求項26に記載の組成物。
- 前記インスリンアナログは、配列番号146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168及び170からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の組成物。
- 前記インスリンアナログは、前記一般式4で表される配列番号119のA鎖と、前記一般式5で表される配列番号120のB鎖とからなる二重鎖の形態である、請求項28に記載の組成物。
- 前記A鎖及びB鎖は、ジスルフィド結合により連結されるものである、請求項35に記載の組成物。
- 前記結合体は、下記化学式1で表されるものである、請求項2~4のいずれか一項に記載の組成物。
[化学式1]
X-La-F
ここで、
Xは前記インスリン、又はグルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドであり、
Lはリンカーであり、
aは0又は自然数であるが、aが2以上であればそれぞれのLは互いに独立しており、
FはXの生体内半減期を延長させることのできる物質であり、
前記「-」は共有又は非共有結合である。 - 前記Fは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、FcRn結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン(Transferrin)、サッカライド(saccharide)、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択される、請求項37に記載の組成物。
- 前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項38に記載の組成物。
- 前記Fは、免疫グロブリンFc領域である、請求項37に記載の組成物。
- 前記Fは、IgG Fc領域である、請求項40に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンFc領域は、非グリコシル化されたものである、請求項41に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンFc領域は、
(a)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメイン、
(b)CH1ドメイン及びCH2ドメイン、
(c)CH1ドメイン及びCH3ドメイン、
(d)CH2ドメイン及びCH3ドメイン、
(e)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインの少なくとも1つのドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ、並びに
(f)重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体からなる群から選択されるものである、請求項40に記載の組成物。 - 前記免疫グロブリンFc領域は、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたか、天然FcからN末端の一部のアミノ酸が欠失されたか、天然FcのN末端にメチオニン残基が付加されたか、補体結合部位が除去されたか、又はADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity)部位が除去されたものである、請求項40に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンFc領域は、IgG、IgA、IgD、IgE又はIgMに由来する免疫グロブリンFcフラグメントである、請求項40に記載の組成物。
- 前記免疫グロブリンFc領域は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項40に記載の組成物。
- 前記Lは、ペプチド、脂肪酸、サッカライド、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項37に記載の組成物。
- 前記高分子重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項47に記載の組成物。
- 前記Lは、ポリエチレングリコールである、請求項37に記載の組成物。
- (i)インスリンと、
(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン関連疾患の予防又は治療用キット。 - (i)インスリンと、
(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与による体重増加を減少させるための薬学的組成物。 - 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項51に記載の組成物。
- 前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項51に記載の組成物。
- 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であり、
前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項51に記載の組成物。 - (i)インスリンと、
(ii)グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドとを含む、インスリン投与患者における体重減少のための複合製剤。 - 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項55に記載の複合製剤。
- 前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項55に記載の複合製剤。
- 前記インスリンは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態であり、
前記グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドは、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質が結合された持続型結合体の形態である、請求項55に記載の複合製剤。 - 前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、
ここで、インスリン:グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチドが1:1~100:1のモル比となるように含む、請求項55~58のいずれか一項に記載の複合製剤。 - 前記組成物は、インスリン又はその持続型結合体と、グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその持続型結合体とを全て含み、
ここで、インスリン又はその結合体:グルカゴン受容体、GLP-1受容体及びGIP受容体に対して活性を有する分離されたペプチド又はその結合体が1:1~1:100のモル比となるように含む、請求項55~58のいずれか一項に記載の複合製剤。
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