JP2022513563A - 三次元バイオリアクター - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞増殖及び細胞の分泌物生産のための３次元（３Ｄ）バイオリアクターの設計、製造、及び応用に関する。このバイオリアクターは、かなり低いレベルの潜在的な細胞毒性化合物を有し、置換又は非置換ポリ（ｐ－キシレン）タイプのコーティングで被覆されていることができ、且つ液晶性重合性モノマーから別途形成されることができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年9月24日に出願された米国仮出願62/735,531号の出願日の利益を主張し、その教示を参照により本願に援用する。

本発明は、細胞増殖及び細胞の分泌物質産生のための三次元（３Ｄ）バイオリアクターの設計、製造、及び応用に関する。本発明は、３Ｄバイオリアクター又はその他の構成要素の細胞毒性浸出を低減又は防止する方法を含み、ここでは、その場での（in situ）光重合に基づく３Ｄ印刷技術によって製造される。この方法には、比較的高い光重合効率を備えた３Ｄ印刷材料、印刷後のＵＶ硬化、印刷後の熱／真空抽出、及び置換又は非置換のポリ（ｐ－キシレン）タイプの材料での印刷後のコーティングの組み合わせが含まれる。

医学におけるバイオテクノロジー革命の最新のフェーズを代表する癌免疫療法は、癌を治療するために患者自身の免疫システムを使用することである。最近成功したケースは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞に基づく癌治療である。典型的なＣＡＲ Ｔ細胞治療法は、Ｔリンパ球が患者自身の血液から収集され、その表面に特別な受容体ＣＡＲを産生するように遺伝子操作がされ、それによりＴ細胞が癌細胞を認識して攻撃できるようになる。遺伝子操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は実験室で増殖され、数十億の数に増やされた後、癌細胞を殺すために患者に注入によって戻される。

ＣＡＲ Ｔ細胞療法が成功したので、次の問題はそれをどのようにしてより安全で費用対効果の高いものにするかである。現在のＴ細胞エンジニアリングプロセスは、依然として一般的に、Ｔ細胞と一緒にインキュベートするための磁気ビーズの使用に基づいている。この磁気ビーズはその表面をＣＤ３及びＣＤ２８でコーティングされており、Ｔ細胞を活性化して増殖させるための抗原として機能し、それによってＴ細胞が増殖できる。Ｔ細胞を含む細胞培養培地中に懸濁されたマイクロビーズは、Ｔ細胞がＣＤ３及びＣＤ２８に接触し且つ一時的に結合し、その後活性化するための比較的大きな表面積を提供する。Ｔ細胞が特定の密度まで増殖した後、Ｔ細胞と磁気ビーズは比較的大きなバイオリアクター、例えばＧＥのＷＡＶＥバイオリアクターに移され、刺激と増殖のプロセスを継続する。このプロセスを複数回繰り返して、比較的多数のＴ細胞を増殖させる。採取時に、磁気分離器を使用してＴ細胞をビーズから分離しなければならない。したがって、現在のＴ細胞増殖プロセスは、一般に、磁気ビーズ、多段階処理、及び手動による相互作用に依存しており、これは費用対効果が高くない。さらに、これはオープンシステムであるため、汚染が発生しやすく、適正製造基準（ＧＭＰ）要件を満たすのにかなりの費用がかかる。

したがって、臨床応用用量要件を達成するために、改善されたバイオリアクター設計、費用対効果の高い製造技術、及び改善されたバイオリアクター操作能力を提供することによって、細胞増殖、特にＴ細胞増殖を向上させる方法及びデバイスの必要性が残っている。

別の差し迫った必要性は、付着細胞、例えば幹細胞の効率的な増殖をもたらすための装置である。幹細胞技術及び再生医療の最近の発展に伴い、幹細胞に基づく治療法の数は大幅に増加している。幹細胞は多くの人間の病気を治療する可能性があり、なぜなら幹細胞は未だ分化していないので、組織の修復及び再生のために多くの種類の細胞へと分化することができるからである。大規模な細胞増殖は、幹細胞に基づく治療及び組織再生におけるボトルネックの１つである。通常、１グラムの組織中には１０^９個の細胞がある。しかしながら、ドナーから採取した複製細胞の数は非常に少なく（約１０^５細胞）、臨床応用のためには約１０，０００倍の細胞増殖が必要である。細胞培養のための従来の二次元（２Ｄ）平面Ｔフラスコ法は、スケールアップするのがかなり困難である。Ｔフラスコを使用する手動プロセスは、労働集約的で、汚染を受けやすく、ｃＧＭＰ細胞製造基準を満たすには高いコストを必要とする。スタックプレート、マイクロキャリア、及び中空糸に基づく市販の３Ｄ細胞増殖デバイスもまた、いくつかの制限を有しており、それには、限定的な規模拡大可能性（スケーラビリティ）、重要なプロセス制御の欠如、高いせん断応力、大きな栄養勾配、複雑な下流処理が含まれる。ここでの開示では、細胞増殖及び細胞分泌物質の産生のための３Ｄバイオリアクターとしてのデバイスの設計、製造、及び応用について説明する。

＜まとめ＞
細胞増殖のための表面領域を有する複数のボイド（前記複数のボイドは直径Ｄを有する）、前記ボイド間の複数の細孔開口部（細孔開口部は、Ｄ＞ｄとなる直径ｄを有する）を含む、細胞増殖のための３Ｄバイオリアクターであって、
ここで、（ａ）前記ボイドの９０％以上が、＋／－１０．０％を超えては変わらない、選択されたボイド体積（Ｖ）を有し；かつ、（ｂ）前記ボイド間の前記細孔開口部の９０％以上が、＋／－１０．０％を超えて変わらないｄの値を有し、
そして、前記バイオリアクターは置換又は非置換ポリ（ｐ－キシリレン）でコーティングされている。

細胞増殖のための表面領域を有する複数のボイド（前記複数のボイドは直径Ｄを有する）、前記ボイド間の複数の細孔開口部（細孔開口部は、Ｄ＞ｄとなる直径ｄを有する）を含む、細胞増殖のための３Ｄバイオリアクターであって、ここで、（ａ）前記ボイドの９０％以上が、＋／－１０．０％を超えては変わらない、選択されたボイド体積（Ｖ）を有し；かつ、（ｂ）前記ボイド間の前記細孔開口部の９０％以上が、＋／－１０．０％を超えて変わらないｄの値を有し；
ここで、前記バイオリアクターは、以下のモノマーの重合生成物を含む：

（式中、Ｘ及びＹは、フリーラジカル重合によって重合される重合性基を含み、Ｒ_２は、Ｒ_１及びＲ_３よりも大きい嵩（bulk）を有する嵩高い有機基であり、ここでＲ_２は、室温でネマチック状態を達成するのに十分な立体障害をもたらすように適合されている）。

図１は、３Ｄバイオリアクター固定床の断面図を示している。 図１ａは、隣接する球の重なりを示すバイオリアクターのユニットネガティブモデルを示している。 図１ｂは、各球が１２個の同一の近傍球に囲まれているユニットネガティブモデルを示している。 図１ｃは、相互接続されたボイドシステムを示す３Ｄバイオリアクター固定床形状を示している。 図１ｄは、３Ｄバイオリアクター固定床形状を断面図で示している。 図１ｅは、２Ｄビューで、３Ｄバイオリアクターの識別された球形ボイド、及び球形ボイド間に相互接続された細孔を形成するためのそれらの重なり合う領域を示している。 図２は、流体灌流のための入口及び出口を備えたハウジング内に配置された３Ｄバイオリアクター固定床を示している。 図３は、典型的な３Ｄバイオリアクター灌流システムを示している。 図４ａは、３Ｄバイオリアクターを通る流速プロファイルを示している。 図４ｂは、３Ｄバイオリアクターを通る流速プロファイルを示している。 図４ｃは、３Ｄバイオリアクターを通る流速プロファイルを示している。 図４ｄは、３Ｄバイオリアクターを通る流速プロファイルを示している。 図４ｅは、３Ｄバイオリアクターを通過する流速のスケールを示している。 図５ａは、３Ｄバイオリアクターにおける表面剪断応力の分布を示している。 図５ｂは、３Ｄバイオリアクターにおける表面剪断応力の分布を示している。 図５ｃは、Ｐａ単位でのせん断応力のスケールを示している。 図６ａは、円筒形の３Ｄバイオリアクター中の流れ方向に沿った圧力降下（勾配）を示している。 図６ｂは、圧力のスケールを示している。 図７ａは、ＦＤＭ ３Ｄ印刷によって生成された３Ｄバイオリアクター固定床を示している。 図７ｂは、３Ｄバイオリアクター固定床をバイオリアクターチャンバーとともに示している。 図７ｃは、３Ｄバイオリアクターの入口及び出口を示している。 図７ｄは、組み立てられた３Ｄバイオリアクターを示している。 図７ｅは、ＳＬＡ ３Ｄ印刷によって生成された３Ｄバイオリアクター固定床を示している。 図７ｆは、ＤＬＰ ３Ｄ印刷によって生成された３Ｄバイオリアクター固定床を示している。 図８は、層流に近づけるための、３Ｄバイオリアクターの入口及び出口に配置された２つの流体分配器を示している。 図９は、流体分配器を使用する場合の３Ｄバイオリアクターを通る流速プロファイルを示している。 図１０ａは、代替のポロゲン浸出法による３Ｄバイオリアクターの形成を示している。 図１０ｂは、代替のポロゲン浸出法による３Ｄバイオリアクターの形成を示している。 図１１は、Ｔ細胞の結合及び活性化のための、３Ｄバイオリアクターの球状ボイドボリュームへの抗体の固定化を示している。 図１２は、Ｔ細胞の活性化及び増殖のための、ビーズフリーの閉ループ灌流に基づく３Ｄバイオリアクターを示している。 図１３は、異なる濃度におけるアビジン及びストレプトアビジンコーティングの蛍光強度を示している。蛍光標識されたアビジン及びストレプトアビジンを使用して、バイオリアクター表面にコーティングされたアビジン及びストレプトアビジンの濃度を示している。 図１４は、アビジン又はストレプトアビジン上のビオチンコーティングの蛍光強度を示している。アビジン又はストレプトアビジンの上に結合したビオチンの濃度を示すために蛍光標識したビオチンを用いた。 図１５は、抗体コーティングされていないバイオリアクターマトリックスに対して、抗体でコーティングされた磁性ビーズ及びバイオリアクターマトリックスで（静的に）インキュベートされた（ビーズ活性化後の）Ｔ細胞増殖を示している。 図１６は、抗体コーティングを伴う、ビーズ、バイオリアクターマトリックス、及び抗体コーティングを伴わないバイオリアクターマトリックスをそれぞれ用いて（静的に）インキュベートされたＴ細胞の活性化及び増殖を示している。 図１７は、連続灌流を伴う３Ｄバイオリアクター中でのＴ細胞の活性化及び増殖を示している。 図１８は、本明細書における３Ｄバイオリアクターのための好ましい印刷後プロトコルを示している。 図１９は、異なる長さのＵＶ／オゾン処理を伴う、パリレンＣでコーティングされた３Ｄバイオリアクターの比較結果を示している。 図２０は、ＵＶ／オゾン処理を伴う、パリレンＣでコーティングされた３Ｄバイオリアクターでのヒト由来脂肪幹細胞（ｈＡＤＳＣ）の細胞増殖を示している。 図２１は、３Ｄバイオリアクターにおける時間の関数としての、生きているＡＤＳＣ細胞の数の増加を示す蛍光顕微鏡画像を示す。

＜好ましい実施形態の詳細な説明＞
ここでの開示は、灌流に基づくスケーラブルなバイオリアクターの設計、及び免疫療法目的のＴ細胞増殖又は再生医療のための幹細胞増殖を達成するための対応する操作性能に関する。患者からの、例えば遺伝子改変後の、Ｔ細胞又は幹細胞の活性化及び増殖は、治療用のＴ細胞又は幹細胞の産生物をもたらし、それは患者に注入して戻すことができ、患者の腫瘍細胞を選択的に標的にし且つ殺すやり方で患者自身の免疫システムを利用するか、あるいは老化関連疾患を治療するために、患者自身の再生細胞を使用する。

本明細書におけるバイオリアクターへの言及は、その中で生物学的及び／又は生化学的プロセスが、選択された環境及び操作条件のもとで実施されることができる、開示された３Ｄリアクターを指す。これには、ボイド（void）の形状／大きさ（サイズ）、ボイド間の相互に接続された細孔のサイズ、及び含まれるボイドの総数（これらがバイオリアクター全体の寸法を決定する）のうちの１つ以上を制御することが含まれる。さらに、表面コーティング、バイオリアクター内のボイドを通る流れ特性、ｐＨ、温度、圧力、酸素、栄養素供給、及び／又は不要物除去を選択的に制御することができる。臨床投与量の要件は、１０^９以上の細胞の投与量を提供する能力を指す。

３Ｄバイオリアクターの好ましい固定床１０は、図１に断面図で一般的に示されており、図１は、好ましく充填され且つ球形であるボイド構造と、球形のボイド間のそれらの相互接続された細孔の例を示している。より具体的には、バイオリアクターは、連続的に相互接続した３Ｄ表面領域１２を含み、これが、抗体の存在下で細胞が結合する能力をもたらし、また、バイオリアクター内で、複数の相互接続された非ランダムボイド１４を規定し、これは、図示しているように、体積に対する表面の比率を最大化するために、内部凹面を備え、好ましくは球形である。ボイドとは、規定された体積の開いた空間（オープンスペース）として理解される。非ランダムであることにより、実際に繰り返されるボイドのサイズ及び／又は所望の許容範囲の形状をもたらす、３Ｄバイオリアクター内の目的とする又は選択された数のボイドを、今や識別できることが理解されるべきである。

連続表面であることを参照すると、増殖する細胞は、３Ｄバイオリアクター内のある表面積領域から別の表面領域に容易へと移動でき、かつその表面はいかなるランダムな中断、例えば、表面のランダムな破壊あるいは０．１ｍｍ以上のランダムなギャップも含まないことが理解される。好ましくは、細胞増殖のための３Ｄバイオリアクター内の表面領域の５０％以上、より好ましくは、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上が連続表面であり、あるいは３Ｄバイオリアクター内の表面領域の９９％以上が連続している。

さらに、バイオリアクター固定床１０は、ボイド間に、ランダムでない相互接続細孔開口部１６を含む。繰り返しになるが、非ランダムであることを考慮すれば、所望の許容誤差（tolerance）の細孔径を有する実際の数の細孔をもたらす、ボイドのための目標とする又は選択された数の選択された細孔径の細孔を今や識別することができることが理解されるべきである。断面図で示されるバイオリアクターはまた、非ランダムボイドの層を最終的に規定し（矢印「Ｌ」を参照されたい）、バイオリアクターの複数の層が、カラム内の複数のそのような非ランダムなボイドの識別（矢印「Ｃ」を参照されたい）を可能にし得ることが理解できる。

バイオリアクターは、生体適合性又は生体不活性高分子材料、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリロニトリル-ブタジエン-スチレン（ＡＢＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ＦＤＭ（熱溶解積層法）３Ｄ印刷技術において使用されるポリカプロラクトン（ＰＣＬ）からできている。生体適合性又は生体不活性というのは、培養細胞に対して無毒である材料として理解されるべきである。さらに、３Ｄバイオリアクター用のポリマー材料は、好ましくは、細胞培養中に加水分解を受けにくいポリマーから選択され、それによって、加水分解の量は、存在するポリマー材料の５．０質量％を超えない、より好ましくは２．５質量％を超えない、最も好ましくは１．０質量％を超えない。バイオリアクターは、ＳＬＡ（ステレオリソグラフィー）及びＤＬＰ（デジタルライトプロセッシング）３Ｄ印刷技術において使用される生体適合性材料（例えば、ポリ（メチルメタクリレート）すなわちＰＭＭＡなど）で作ることもできる。

ここでのバイオリアクターはまた、米国特許第７，０４１，２３４号明細書、同７，０９４，３６０号明細書、同７，０８９，３５９号明細書、同７，１０８，８０１号明細書、同７，１４７，８００号明細書、及び同７，２３８，８３１号明細書に記載されている生体適合性で、液晶性の、光重合性モノマーから好ましくは作ることができ、これらの明細書を参照により本明細書に援用する。したがって、ここでの３Ｄバイオリアクターを形成するためにも使用することができるここでのモノマーは、以下の構造を有するものとして説明することができる。

上記において、Ｘ及びＹは、フリーラジカル重合によって、又はマイケル付加を含むが必ずしもそれに限定されない求核付加によって重合されうる重合性基を含む。例には、不飽和炭素－炭素結合及びエポキシ末端基が含まれる。したがって、好ましい末端基は、不飽和炭素－炭素結合を含む置換及び非置換アルケニルエステル基（例えば、－ＯＣ（Ｏ）－ＣＨ＝ＣＨ_２又は－ＯＣ（Ｏ）－Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ_２）を含みうる。Ｒ_２は、Ｒ_１及びＲ_３よりも大きな嵩を有する嵩高い有機基であり、Ｒ_２は、液晶モノマーの結晶性を抑制しながら、室温においてネマチック状態を達成するのに十分な立体障害をもたらすように適合されている。したがって、Ｒ_１及びＲ_３は、Ｒ_２よりも嵩張らないグループから選択される。適切なＲ_２基には、ｔ－ブチル基、イソプロピル基、フェニル基、及び第二級ブチル基が含まれるが、必ずしもこれらには限定されない。特に好ましいＲ_２基には、ｔ－ブチル基が含まれる。Ｒ_１及びＲ_３は、Ｒ_２よりも嵩張らず、好ましくは水素原子及びメチル基から選択される。このタイプの異なるモノマーのブレンド物を使用して、開始モノマーの粘度及び重合収縮を最小限に抑え、重合変換を最大にして残留モノマーを最小限に抑え、最終的なポリマーの機械的特性を最適化することもできる。出発時ゼロ剪断モノマー粘度は、２５℃～７０℃の温度において５ポアズ～３００ポアズの範囲内にあり、重合転化率は、少なくとも７５％以上、より好ましくは少なくとも９０％以上である。また、形成されたままのポリマーは、好ましくは、以下の機械的強度特性を有する：（１）室温において少なくとも１５００ＭＰａの、及び１５００ＭＰａ～２５００ＭＰａの範囲の曲げ弾性率；（２）室温において少なくとも７０ＭＰａ、及びより好ましくは７０ＭＰａ～１００ＭＰａの曲げ強度。さらに、５％以下、より好ましくは０．５％～４．０％の範囲の重合収縮。さらに、上に示した構造の液晶モノマーのブレンド物は、なお液晶状態を維持しながら、光開始剤及び熱開始剤システム及び粘度調整剤と混合することができる。

バイオリアクターを製造するために使用される材料は、水性媒体中で分解性ではなく、細胞増殖中に水性媒体の流れに耐えるために機械的に安定な構造をもたらすことができることが好ましい。材料及び製造プロセスは、単層セル増殖のための堅固且つ滑らかな相互接続された表面をもたらすことができることが好ましい。固体表面についていうと、表面は、典型的には約２０ミクロン～１００ミクロンの直径を有する培養細胞による浸透又は埋め込みを低減又は防止するようなものであることを理解されたい。好ましくは、ここでの３Ｄバイオリアクターは、評価長さ内に記録された、平均線からのプロファイル高さの偏差の絶対値の算術平均を意味する表面粗さ値（Ｒａ）を有する表面を有するものである。したがって、ここでは、３Ｄバイオリアクター表面のＲａは２０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下の値を有することが考えられている。

ここでの３Ｄバイオリアクターはまた、少なくとも１０の、又は１０～９５の範囲、及びより好ましくは４５～９５の範囲のショアＤ硬度を示す材料から形成されているものである。この点に関して、ここでの３Ｄバイオリアクターは、ある程度の架橋を含み、かなりの量の水（例えば、１０～４０質量％）を吸収する親水性タイプのポリマー構造として理解しうるヒドロゲルタイプの構造を利用しないものであることも注目に値する。ここでの３Ｄバイオリアクターは、細胞が容易に消化してリモデリングを受けうる、コラーゲン、アルギネート、フィブリン、及び他のポリマーを好ましくは利用しないものであることも注目に値する。

さらに、ここでの３Ｄバイオリアクターは、好ましくは、少なくとも０．０１ＧＰａの引張弾性率を有する材料から作られたものである。より好ましくは、引張弾性率は、０．０１ＧＰａの増分で、０．０１ＧＰａ～２０．０ＧＰａの範囲にある値を有する。さらにより好ましくは、３Ｄバイオリアクター用の材料の引張弾性率は、０．０１ＧＰａ～１０．０Ｇｐａ、あるいは１．０ＧＰａ～１０ＧＰａの範囲内にある。例えば、ここでの３Ｄバイオリアクターの製造に適した、先に言及したポリマー材料に関して、ポリスチレンは、約３．０ＧＰａの引張弾性率を示し、ポリカーボネートは約２．６ＧＰａ、ＡＢＳは約２．３ＧＰａ、ＰＬＡは約３．５ＧＰａ、ＰＣＬは約１．２ＧＰａ、そしてＰＭＭＡは約３．０ＧＰａの引張弾性率を示す。

そのような好ましい規則的な幾何学的特性及び連続表面領域を有するここでの３Ｄバイオリアクターの構造は、付加製造技術、例えば、ＦＤＭ、選択的レーザー焼結（ＳＬＳ）、ステレオリソグラフィー（ＳＬＡ）、デジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）３Ｄ印刷技術などによって、例えば、SolidWorks（商標）コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）プログラムによって利用可能になったコンピュータ生成設計により、好ましくは製造される。

好ましい例として、SolidWorks（商標）を利用して３Ｄバイオリアクター設計を作り出すプロセスを以下に説明する。バイオリアクターネガのコンピューターモデルが最初に作り出される。より具体的には、３Ｄバイオリアクターネガとして説明されうるものが、例えば、球の間に１．０ｍｍの直径の接続細孔を作るために、充填（パッキング）された重なり合う６．０ｍｍの直径の球を使用して作り出された。もちろん、その他の可能な寸法が、この開示の広い文脈の中で考えられる。

球は、好ましくは、六方最密充填（ＨＣＰ）格子に組織化されて、各球が１２個の隣接する球に囲まれることをもたらす、効率的に（又は密に）充填された形状（ジオメトリ）を作り出す。この例示的な形状のユニットセルが図１ａに示されている。より具体的には、図１ａには、ＨＣＰ格子のユニットセルがあり、そこでは上部の３つの球が半透明として表示されて、隣接する球の間の６つの放射状の重なり合う領域を示している。細孔は、これらの重なり合う領域に形成される。好ましくは、充填を最適化するために、細孔の最大数は１２である。３Ｄバイオリアクターのボイドを通っての中程度の灌流を可能にするための最小細孔数は２である。したがって、３Ｄバイオリアクター内に存在するボイドの少なくとも９０．０％～１００％は、１つのボイド当たり少なくとも２つの細孔開口部を有する。より好ましくは、３Ｄバイオリアクター内のボイドの少なくとも９０．０％～１００％は、１つのボイド当たり８～１２個の細孔開口部を有する。１つの特に好ましい実施形態では、３Ｄバイオリアクター内のボイドの少なくとも９０．０％～１００％は、１つのボイド当たり１２個の細孔開口部を有する。

図１ｂでは、ユニットの全ての球が示されている。次に、バイオリアクターの形状（幾何形状）は、好ましくは、ネガティブモデルを反転させて、図１ｃに示される相互接続された球形ボイドシステムを含むポジティブモデルを作り出すことによって作成される。さらに、図１ｄでは、通常の幾何形状特性（実質的に上述したものと同じボイド体積の調節）及びそれに対応する相互接続された細孔開口部１６とともに、１４における断面図に示されている相互接続されたボイドの別の図解を提供している。

上述した好ましい通常の幾何構造３Ｄバイオリアクターでは、ボイド直径と相互接続された細孔直径との間の関係を特定することができる。図１ｅに注意が向けられる。この好ましい形状について、球形ボイド１は実線の円で表され、直径はＤ（矢印で示される）である。したがって、直径「Ｄ」は、内部ボイド表面上の任意の２点間の最長距離として理解できる。球形ボイド２は破線の円で表され、直径Ｄを有する（図示せず）。球形ボイド２は、球形ボイド１の１２個の近傍ボイドの１つである。近傍ボイド間の重なりにより、球形ボイド間に相互接続された細孔を形成し、直径「ｄ」を有し、これは概略水平の矢印によっても示されている。直径「ｄ」は、したがって、細孔開口部の任意の２点間の最長距離として理解することができる。ボイドの３Ｄ球面表面積の合計はＳＡ_ｖｏｉｄ＝ ４×π×（Ｄ／２）^２である。ＡとＢの間の表面積、これはＳ_ｃａｐといい、Ｓ_ｃａｐ＝π×Ｄ×ｈ（ここで、

）である。３Ｄバイオリアクター中の特定のボイドに有用なボイド表面は、ＳＡ_ｕ＝ＳＡ_ｖｏｉｄ－［１２×Ｓ_ｃａｐ］になる。

ボイドの直径Ｄが小さければ小さいほど、設定された３Ｄ空間（ボリューム）内に充填できるボイドの数がより多くなり、それによって、より大きな全体の細胞結合面がもたらされる。しかし、灌流をブロックする細胞凝集を最小化又は防止するために、この幾何形状については、細孔の最小直径がｄ＝０．２ｍｍであることが好ましい。細孔の直径ｄは、０．２ｍｍ～１０ｍｍ、より好ましくは０．２ｍｍ～２．０ｍｍの範囲にあることができる。最も好ましくは、ｄ≧０．５ｍｍであり、０．５ｍｍ～２．０ｍｍの範囲にある。

Ｄ＝０．４０ｍｍ以下である場合、ｄ＝０．２ｍｍのときに計算されたＳＡｕは０未満であり、これは不可能な構造となり、したがって、この３Ｄバイオリアクターの形状に対してＤは＞０．４ｍｍでなければならない。しかしながら、Ｄは、０．４ｍｍ～１００．０ｍｍの間、より好ましくは、０．４ｍｍ～５０．０ｍｍの間、及びまた、０．４ｍｍ～２５．０ｍｍの範囲の値を有することができる。Ｄの１つの特に好ましい値は、２．０ｍｍ～１０．０ｍｍの範囲にある。Ｄの値が比較的大きい球形のボイドは、同じバイオリアクター体積内で細胞培養表面積をできるだけ増やすという目的を低下させうる。したがって、図１ｅに示される好ましい形状に対しては、Ｄ＞０．４ｍｍ（ボイドの直径）及びｄ＞０．２０ｍｍ（細孔の直径）である。０．４ｍｍ～１００．０の範囲のボイドについての任意の選択した値、及び０．２ｍｍ～１０．０ｍｍの範囲の細孔についての任意の選択した値に関して、Ｄの値は、それがｄの値よりも大きくなる値である（Ｄ＞ｄ）。

ここでの３Ｄバイオリアクターは、その非ランダム特性に関して特徴付けることができることを理解することができる。好ましくは、３Ｄバイオリアクター内の全てのボイドは、それらが実質的に同じ体積を有していて、最も効率的な３Ｄ空間パッキングを達成し、且つ最大の対応する連続表面領域をもたらすようなものである。任意の与えられた３Ｄバイオリアクター中に存在する相互接続されたボイドの総数に関して、好ましくは、そのようなボイドの９０．０％以上、またはそのようなボイドの９５．０％以上、またはそのようなボイドの９９．０％～１００％が、許容誤差が＋／－１０．０％、又は＋／－５．０％、又は＋／－２．５％、又は＋／－１．０％、又は＋／－０．５％、又は＋／－０．１％より大きくは変動しないボイド体積（Ｖ）を有する。図１中のボイドは、一般的に球形として示されるが、他のボイド形状が考えられる。ボイドの直径は、細胞の凝集を最小化し又は回避し、細胞培養のために最大の有用な表面領域を提供するように選択される。

ここでの３Ｄバイオリアクターの別の非ランダム特性は、直径ｄを有する、ボイド間の細孔開口部である（再び図１ｅを参照されたい）。上と同様に、細孔開口部の９０．０％以上、または細孔開口部の９５．０％以上、又はボイド間の細孔開口部の９９．０％～１００％が、許容誤差が＋／－１０．０％、又は＋／－５．０％、又は＋／－２．５％、又は＋／－１．０％、又は＋／－０．５％、又は＋／－０．１％より大きくは変動しないｄの値を示す。

したがって、非接着性細胞の増殖のためのここでの３Ｄバイオリアクターは、細胞結合のための表面領域、直径Ｄ（内部ボイド表面上の任意の２点間の最長距離）を有する複数のボイド、直径ｄ（細孔開口部の任意の２点間の最長距離）を有する前記ボイド間の複数の細孔開口部を含み、Ｄ＞ｄであることを今や理解することができる。加えて、９０％以上のボイドが、＋／－１０．０％を超えて変化しないボイド体積（Ｖ）を有し、かつ９０％以上の細孔開口部が、＋／－１０．０％より大きくは変動しないｄの値を有する。

さらに、Ｔ細胞のような非付着性細胞の増殖のためのここでの３Ｄバイオリアクターは、直径Ｄ_１を有する第１の複数のボイド、前記第１の複数のボイド間の、直径ｄ_１を有する複数の細孔開口部を含むことができ、Ｄ_１＞ｄ_１であり、ここで、第１の複数のボイドの９０％以上が、＋／－１０．０％を超えて変動しない許容誤差をもつボイド体積（Ｖ_１）を有する。そのような３Ｄバイオリアクターはまた、直径Ｄ_２を有する第２の複数のボイド、前記第２の複数のボイド間の直径ｄ_２を有する複数の細孔開口部を有することができ、Ｄ_２＞ｄ_２であり、ここで、第２の複数のボイドの９０％は、＋／－１０．０％より大きくは変動しない許容誤差をもつボイド体積（Ｖ_２）を有する。Ｖ_１とＶ_２の値は異なり、かつそれらの許容誤差の変動の範囲の外である。別の言い方をすれば、＋／－１０．０％の許容誤差を含むＶ_１の値と、＋／－１０．０％の許容誤差を含むＶ_２の値が異なる、あるいは、［Ｖ_１±１０．０％］≠［Ｖ_２±１０％］である。

ボイド内の表面の曲率半径（Ｒｃ）は、したがって、好ましくは１／０．５（Ｄ）、または１／０．２ｍｍ ＝ ５ｍｍ^－１以下である。好ましくは、Ｒｃは、０．２ｍｍ^－１～１．０ｍｍ^－１の値を有していてよく、これは、１０．０ｍｍ～２．０ｍｍのＤの値に対応する。 曲率の高い（大きなＲｃ）表面は、典型的な単層２Ｄ培養とは大きく異なる環境を提供し、これが細胞の表現型（フェノタイプ）の変化も引き起こしうる。

細胞は、好ましくは、３Ｄバイオリアクターの相互接続された球形のボイド表面に結合している。そのような３Ｄ構造は、好ましくはスケーラブルであり、かつ比較的小さなフットプリントの細胞増殖バイオリアクターでもって、比較的大きな細胞増殖のための比較的高い表面積対体積比（surface area to volume ratio）を提供することができる。表面積対体積比もまた、好ましくは、球形のボイドの直径によって決定される。直径が小さいほど、表面積対体積比はより大きくなる。好ましくは、ボイドは、５μｍ～１００μｍのサイズを有する細胞に対して、さらには細胞の凝集を低減又は回避するために、比較的「平坦な」表面（すなわち、１．０ｍｍ^－１以下の低い曲率半径）を提供する。さらに、上記で示唆したように、細胞凝集はまた、相互接続された細孔の直径ｄを制御することによって低減又は回避され、その直径は、好ましくは少なくとも５００μｍであるが、前述のように、２００μｍより大きな任意のサイズである。

したがって、バイオリアクター固定床１０は、好ましくは、図２にさらに示されるように、単回使用の３Ｄバイオリアクターとして機能しうる。より具体的には、バイオリアクター１０は、ハウジング１８内に配置されることができ、次いで、流体の流入及び流出がもたらされうる入口及び出口コンパートメント２０内に配置されうる。好ましくは、バイオリアクター１０、ハウジング１８、並びに入口及び出口コンパートメント２０は、積層造形技術を使用して単一の構成要素として製造することができる。図３に示すように、ハウジング１８内のバイオリアクター１０並びに入口及び出口コンパートメント２０は、ＭＳＣ増殖のための全体的な３Ｄバイオリアクターシステムの一部となりうる。より具体的には、３Ｄバイオリアクターは、好ましくは、細胞増殖を促進するために３Ｄバイオリアクターを通して細胞培養培地及び酸素を送達する灌流システム内に配置される。２Ｄ Ｔフラスコで使用される複数継代細胞増殖法は、３Ｄバイオリアクターが１０、１００、または１０００のＴフラスコに相当する細胞培養領域を持っていることを除いて、３Ｄバイオリアクターに直接適用することもできる。

今や理解され得るように、ここでの３Ｄバイオリアクターは、相互接続されたボイドの直径に応じて、比較的大きな表面対体積比をもたらす。例として、直径５ｃｍ及び高さ１５ｃｍのシリンダーの形状の従来のローラーボトルは、２３６ｃｍ^２の細胞増殖領域を提供する。同一体積を使用して、ここでの３Ｄバイオリアクターに直径２．０ｍｍの相互接続されたボイドを収める場合、合計４４，９６８個の球形ボイドをそのスペースに詰めることができ、これは、ローラーボトルの表面積よりもほぼ２４倍大きな約５，６４８ｃｍ^２の表面領域をもつマトリックスを提供することができる。

中空繊維またはマイクロキャリアベースのバイオリアクターと比較したここでの３Ｄバイオリアクターの少なくとも１つの独特の特徴は、断片化された表面の代わりに大きな相互に接続された連続表面を提供する能力である。ここでの３Ｄバイオリアクター内の連続表面は、したがって、細胞がある領域から別の領域へより自由に移動することを可能にすると考えられる。図３に示される灌流システムを使用して、細胞移動を誘導するために、バイオリアクター内に栄養又は細胞信号の勾配を容易に作り出すことができると考えられる。

３Ｄバイオリアクターの調製のためにここに記載されている好ましい３Ｄ印刷技術と組み合わせて、計算流体力学（ＣＦＤ）を使用して、バイオリアクター内の媒体の流れをシミュレーションし、三次元の相互接続（３Ｄ相互接続）された表面内の任意の場所における流速とせん断応力を推定でき、細胞培養環境を向上させるための最適化を可能にすることができる。より具体的には、ＣＦＤを使用して、ここでのバイオリアクターの３Ｄ相互接続されたボイドを通る流れ特性をシミュレーションし、（１）流速、（２）圧力降下、及び（３）壁のせん断応力の分布を推定した。後者のパラメータである剪断応力は、細胞増殖にとって重要であることを理解することができる。剪断応力の低下は、剪断によって誘発される細胞分化を減少又は防止することができる。

以下に報告するシミュレーションでは、直径１７．５ｍｍ、高さ５．８３ｍｍ、ボイド直径２ｍｍ、及び細孔径０．５ｍｍの小規模（コンピューターシミュレーションの速度を上げるため）の円筒形３Ｄバイオリアクターを用いた。この場合、バイオリアクターの直径（Φ＝１７．５ｍｍ）と高さ（Ｈ＝５．８３ｍｍ）の比率は３：１（図１ｄ）であり、これはバイオリアクターの入口と出口の間の栄養と酸素の勾配を低減させるために好ましい比率である。固定床球面上において可能な細胞密度に基づいて、酸素及び栄養の消費速度が推定され、どのくらいの頻度で細胞培養培地を交換する必要があるか（すなわち、体積流速）が決定された。このシミュレーションでは、３８．５μｍ／秒の全体的な線形流速が想定された。３Ｄバイオリアクターへの入力として３８．５μｍ／秒の速度の層流を使用しての、ＣＦＤの結果を図４～６に示す。

図４ａ、４ｂ、４ｃ、及び４ｄは、前述した小規模の円筒形３Ｄバイオリアクター全体の流速プロファイルを示している。図４ｅは流速のスケールを示している。より具体的には、図４ａは、バイオリアクターの側面から見た流速分布を示している。流れは、流れの方向に沿って細孔を通って、各球形のボイドを通過する。図中の白／灰色の領域は、流体が流れていない球形のボイド間の固体領域である。図４ｅ中の着色した速度スケールバーと比較することにより、図４ａは、流れ方向に沿った細孔での流速が、２００μｍ／秒～２４０μｍ／秒の最大流速を達成することを示している。対照的に、球面近くの流速は、０．０６μｍ／秒～１９．０μｍ／秒の最小へと低下し、これにより、球面上に存在する細胞に対する、流れが引き起こすせん断応力が大幅に低下する。

図４ｂは、３Ｄ構造の中央断面を通してバイオリアクターの上部から見た速度プロファイルを示している。この場合も、画像は、最大流速が、流れ方向に沿った球形ボイドの細孔の各中心にあることを示している。この最大流速も２００μｍ／秒～２４０μｍ／秒の範囲である。球面付近の流速は再び低く、０．０６μｍ／秒～１９．０μｍ／ｓの値を有する。

図４ｃは、半径方向に相互接続された細孔を通過する流れを示す個々の球体ボイドの速度プロファイルを示している。図４ｃは、したがって、球形のボイド内の流れ分布の有用な図解を提供している。高い流速は、細胞がないボイドの中央の空きスペースにあり、２００μｍ／秒～２４０μｍ／秒のレベルである。細胞は、流速が低下して、流速が再び０．０６μｍ／秒～１９．０μｍ／秒のレベルにある凹状のボイド表面上に存在する。したがって、この独自の構造は、細胞を、比較的高い流動応力への曝露から保護することができる。これは、例えば、マイクロキャリアベースのリアクターに対する、ここに記載した３Ｄバイオリアクターの別の明確な利点であって、マクロキャリアーベースのリアクターでは、細胞培養培地中に懸濁され、バイオリアクター中で撹拌されて細胞に栄養及び酸素が送達される、凸状の球面を備えた直径３００μｍ～４００μｍのマイクロビーズの外表面上で細胞が増殖する。このような凸状の球面上にある細胞は、０．１Ｐａまでの比較的大きなせん断応力に曝される可能性があり、これは、細胞の形態、透過性、及び遺伝子発現に影響を及ぼすことが知られている。図４ｄは、流れ方向に沿った側孔を通る流れの軌道を示しており、それは、ここでの３Ｄバイオリアクターが、全体に栄養素及び酸素を提供する比較的均一な流れパターンを提供することを示している。

したがって、好ましい３Ｄバイオリアクター内で計算された最大線形流速は、２００μｍ／秒～２４０μｍ／秒であり、これは、流れ方向に沿った直径２．０ｍｍのボイド間の直径０．５ｍｍの相互接続細孔において生じる。図４ａ～４ｅに示されるように、流れは流れに沿って優先的に中心方向にあるが、球面の近くに依然として流れ（～１９．０μｍ ／秒）があり、球面上に存在する細胞への栄養供給を可能にする。したがって、細胞は構造物全体のどこにでも存在し、任意の場所で成長できると考えられ、なぜなら、栄養素は流れの対流及び３Ｄバイオリアクター構造の全体にわたる拡散の両方を通じて供給されることができるからである。

図５ａ及び５ｂは、上記の円筒形の３Ｄバイオリアクター全体にわたる並びに単一の球形のボイド表面上での表面剪断応力の分布を示している。図５ｃは、Ｐａの単位での剪断応力のスケールを示す。最も高い剪断応力は、相互接続された細孔の縁で観察された。これは、これらの場所における高い流速のためである。しかしながら、バイオリアクター内の有用な球表面領域の大部分は、３×１０^－４Ｐａ未満の剪断応力を示し、これは、バイオリアクターの表面領域の９０％以上と理解しうる。これは、せん断によって誘発される分化なしでの細胞増殖をもたらす。さらに、４．０×１０^－３Ｐａの最大せん断応力でさえ、中空糸ベースのバイオリアクター、ウェーブバイオリアクター、及びマイクロキャリアベースのバイオリアクター中で培養したときに細胞が経験する平均せん断応力よりも低いと考えられる。したがって、ここでの３Ｄバイオリアクターは、既存の細胞増殖バイオリアクターと比較して、細胞増殖のための比較的低い剪断応力環境を提供すると考えられる。たとえば、Large-Scale Industrialized Cell Expansion: Producing The Critical Raw Material For Biofabrication Processes（大規模な工業化された細胞増殖：バイオファブリケーションプロセスのための重要な原材料の生産）, A. Kumar及びB. Starly, Biofabrication7 (4): 044103 (2015)を参照されたい。

図６ａは、上記の円筒形３Ｄバイオリアクターの底部から上部への流れ方向に沿った圧力降下を示している。図６ｂは、適用可能な圧力の尺度を示している。この図は、バイオリアクターの入口と出口の間の全体での圧力降下が１．０ｐａ以下であることを示している。したがって、圧力降下は、０．１Ｐａ～１．０Ｐａの範囲に収まりうる。言い換えれば、セルバイオリアクターの入口及び出口の近くの細胞は、圧力の大きな違いを受けない。この低い圧力勾配は、そのような設計がバイオリアクターの入口と出口の間の栄養／代謝物濃度に小さな勾配（又は差）しか生み出さないことを示唆している。その低い勾配は、直径Φが高さＨよりも大きいと同時にバイオリアクターの総体積は同じままになる、バイオリアクターの設計のためである。これは、中空糸バイオリアクターよりも優れている。バイオリアクターの入口と出口の間の栄養／代謝物の勾配を減らすΦ＞Ｈ比をもつ中空繊維バイオリアクターを製造することは困難である。

アスペクト比が異なるが同じ総体積の円筒形３Ｄバイオリアクターについても比較をした（すなわち、Φ：Ｈ比、Φ：バイオリアクター固定床の全直径、Ｈ：バイオリアクター固定床の全高）。図１ｄを参照されたい。表１に示すように、同じ体積流量（体積流量＝流れの断面積×直線速度）に対して、低いΦ：Ｈ比をもつバイオリアクターでは直線速度が顕著に大きくなる。直線速度の増大はまた、表面せん断応力、圧力降下、並びに、入口と出口の間の栄養／代謝物濃度の勾配も大きくするが、これは、細胞の増殖に好ましくない影響を及ぼす。したがって、開示した固定床３Ｄバイオリアクターは、好ましくは、Φ：Ｈ比構造、例えば、１：１より大きく、１００：１までの範囲のΦ：Ｈ比に設計される。好ましくは、Φ：Ｈ比は１：１より大きく、１０：１までである。

図７ａは、相互接続された直径６ｍｍのボイド及び１ｍｍの相互接続された細孔を有するＦＤＭ ３Ｄ印刷によって生成された３Ｄバイオリアクター固定床部品を示している。 この３ＤバイオリアクターはＡＢＳフィラメントを用いて印刷された。この具体的な３Ｄバイオリアクターの直径（Φ）と高さ（Ｈ）は、それぞれ４．２８ｃｍ及び１．４３ｃｍである。したがって、Φ：Ｈ比は３：１である。固定床には約１３４の相互接続されたオープンボイドが含まれている。細胞培養のための相互接続された連続球面表面領域ＳＡ_ｕの合計は約１５２ｃｍ^２である。入口及び出口の壁並びにそれらの入口及び出口のところの流体分配器２２（図８）は、細胞培養のための追加の８８ｃｍ^２の表面領域を提供する。言い換えれば、細胞接着のために、３Ｄバイオリアクター中には約２４０ｃｍ^２の総有効表面領域がある。流体分配器は、バイオリアクターを通る層流を改善することができる。 レイノルズ数が２１００未満、あるいは０より大きく２１００までで２１００を含まない範囲の場合、流体分配器は任意選択によりあってもなくてもよい。

図７ｂは、３Ｄバイオリアクターの固定床が、バイオリアクターチャンバー中に溶媒で結合されたものを示している。これにより、固定床とチャンバー壁の間のギャップが封じられ、灌流細胞培養培地がそれらのギャップの代わりに相互接続された細孔を通過するように強制される。好ましくは、固定床及びチャンバーは、製造効率を高めるために統合された部品として一緒に印刷される。図７ｃは、バイオリアクターの入口及び出口を示している。それらは、固定床を通る層流を促進するように幾何学的に設計される。バイオリアクターの入口は、任意選択により、組み込まれた回転ギアを含んでいてもよく、回転ギアはステッピングモーターに結合されて、均一な細胞播種のためにバイオリアクターの回転を制御することができる（以下を参照されたい）。統合されたバイオリアクターを図７ｄに示しており、１／８インチのチューブに接続して流体の流れを導くことができる。あるいは、入口及び出口は繰り返し使用するように作ることができ、この場合は内部のバイオリアクター固定床のみが使い捨てである。図７ｅに示しているのは、３．０ｍｍのボイド及び０．５ｍｍの細孔を有する、ＤＬＡ ３Ｄ印刷によって製造された比較的小さいサイズの３Ｄバイオリアクター固定床である。図７ｆは、同じ直径３．０ｍｍのボイド及び０．５ｍｍの細孔を有するＤＬＰ ３Ｄ印刷を使用した比較的大きなサイズの３Ｄバイオリアクター固定床である。バイオリアクターをスケールアップした場合でも、バイオリアクターの内部構造は維持される。したがって、灌流体積流量は、局所的な線形流速を同じに保ちながら、比例してスケールアップすることができる。このように、スケールアッププロセス時に最小限のプロセス変更しか必要ではなく、プロセス開発コストを削減できる。

次に、流体分配器２２（図８）は、好ましくは３Ｄバイオリアクターを通る流れの均一性を向上させるようなものであることに留意すべきである。入口、出口、及び流体分配器の設計もまた、以下の点を考慮に入れることが好ましい：（１）３Ｄバイオリアクターを通る流れの均一性を向上させる；（２）バイオリアクターの全体的なプライミング（priming）体積を減らすために、入口と出口でのデッドボリューム２４を最小化する；（３）バイオリアクター内での気泡の集まりを防止する。図９は、流体分配器を使用することによる、ＣＦＤシミュレーションに基づく３Ｄバイオリアクター全体の流速プロファイルを示している。流体分配器（図８）の使用は、流れの均一性を向上させた。最大流速（約３０μｍ／秒）と最小流速（約１０μｍ／秒）は互いに比較的近く、均一な層流（つまり、比較的平行な層内の流体の流れ）を促進するのに役立つ。バイオリアクター内の全ての場所での比較的均一な流量はまた、バイオリアクター内の異なる場所に存在する細胞に対する剪断応力のより小さな差をもたらす。

３Ｄバイオリアクターは、他の積層造形技術、例えば、選択的レーザー焼結（ＳＬＳ）、ステレオリソグラフィー（ＳＬＡ）、デジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）などによって製造することができる。
図７ｅ、７ｆ。

積層造形技術又は３Ｄ印刷によってここでの３Ｄバイオリアクターを調製することに加えて、３Ｄバイオリアクターは、相互接続された細胞培養表面をもたらすために従来のポロゲン浸出法によって調製できることが考えられる。図１０ａ及び１０ｂは、ポロゲン浸出法を利用する３Ｄバイオリアクターを示している。これは、型内でポロゲン及びポリマーを混合し、次にポロゲンを浸出させて細孔を生成することを指している。図１０ａ中の３Ｄバイオリアクターは、ビーズが接触するように、ビーズを振とうし、軽くたたき、そして押すことによって、円筒形のステンレス型に４．０ｍｍの水溶性球状糖ビーズ（ポロゲンとして）をしっかりと詰めるステップから始まる。ビーズ間の隙間は、５．０質量％の脱イオン水を含むアセトンで満たされる。これに続いて、真空チャンバー下でアセトンと水を夜通し蒸発させる。次に、ビーズ間の隙間を、低粘度の重合性ビニルモノマー、例えばスチレン、それとともに重合開始剤、例えばベンゾイル又はtert-ブチルペルオキシベンゾエートで充填する。次に、スチレンモノマーが重合してポリスチレンを形成する。そのサンプルを９０℃に８～１２時間保ち、次に１１５℃にさらに３時間加熱し、オーブンから取り出して、図１０ａに示されているものが得られる。次に、糖ビーズを、超音波水浴に沈めている間に浸出させて、相互接続されたボイドを備えたポリスチレン３Ｄバイオリアクター固定床が残る。図１０ｂを参照されたい。この３Ｄバイオリアクターを次に、メタノールで３日間抽出して、全ての残留スチレンモノマーを除去する。しかし、ポロゲン浸出法は、複雑な製造工程を有するだけでなく、ポロゲンビーズの充填がランダムな工程なので、正確な再現性のある構造を達成することが困難でもある。

ＡＢＳ又はＰＭＭＡを用いて３Ｄ印刷されたバイオリアクター（図７ｄ）の場合、バイオリアクターの疎水性内面は、細胞接着を可能にするように改変されることが好ましい。 ポリドーパミンは、バイオリアクター表面へのプライマーコーティングとして使用され、それによって他のタンパク質が、ポリドーパミンコーティングを介してバイオリアクター表面に容易に付着することができる。したがって、ポリドーパミンプライマーコーティングは、その他のコーティング、例えば、ペプチド、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、複数の細胞の細胞外マトリックスタンパク質、又は特定の細胞タイプに必要である選択された抗体と組み合わせることができることに注意することができる。

１０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（２５℃においてｐＨ＝８．５）に溶解した０．２５ｍｇ／ｍＬのドーパミン中でバイオリアクター表面を約１８時間インキュベートすることで、その後のタンパク質コーティングにとって有効なポリドーパミン層が得られた。ポリドーパミンがバイオリアクター表面に沈着した後、他のタンパク質はマイケル付加及び／又はシッフ塩基反応によって機能的リガンドと結合することができる。したがって、リガンド分子は、求核性官能基、例えば、アミン及びチオール官能基を含む。

ここでのバイオリアクターが置換又は非置換のポリ（ｐ－キシレン）でコーティングされている場合、同様に細胞接着を可能にするために、ポリドーパミンは、その置換又は非置換のポリ（ｐ－キシレン）コーティングの上に同様に適用することができることも理解できる。この場合でも、ポリドーパミンはコーティング表面を提供し、それによって他のタンパク質が、ポリ（ｐ－キシレン）コーティングの上のポリドーパミンコーティングを介して付着することができる。このような結合は、マイケル付加及び／又はシッフ塩基反応により、機能性リガンドを介したタンパク質の結合に頼ることがここでも考えられ、リガンド分子は、求核性官能基、例えばアミン及びチオール官能基をここでもまた含むことができる。したがって、より一般的には、ポリドーパミンコーティングは、官能化されたリガンドの使用によって、細胞培養のための追加の層（１つ又は複数）を結合することができるようなものであることを理解することができる。

上記の全てから、本明細書に開示される３Ｄバイオリアクターの追加の特徴の１つは、特定の幾何学的及びボイド体積要件、及び対応する利用可能な表面領域の要件を備えた３Ｄバイオリアクターを今や設計できることであり、比較的最小限の変更でそのような目標を達成できる（すなわち、製造中または製造中に達成できる）ことがわかる。たとえば、今や３Ｄバイオリアクターのための設計要件を特定することができ、その場合、１つ以上の内部ボイドが目標とするボイド体積「Ｖ_ｔ」を有するべきである、３Ｄバイオリアクター自体が細胞培養のための目標とする全表面領域「ＳＡ_ｔ」を有するべきである。したがって、１つ以上の内部ボイドが、Ｖ_ｔの＋／－１０．０％、又はより好ましくはＶ_ｔの＋／－５．０％以内である実際のボイド体積「Ｖ_ａ」を有する３Ｄバイオリアクターを形成することができる。同様に、細胞培養のための実際の表面性ＳＡ_ａは、ＳＡ_ｔの＋／－１０．０％以内、より好ましくはＳＡ_ｔの＋／－５．０％以内である。さらに、目標のボイド内の内面について、製造のための目標とする形状、例えば、曲率半径「Ｒｃ_ｔ」を特定でき、製造において、ボイド内面の実際の曲率半径「Ｒｃ_ａ」がＲｃ_ｔの＋／－５％以内を達成することができる。

印刷後のプロセス
ここでの３Ｄバイオリアクターは、好ましくは、追加の印刷後の手順にかけられる。このような手順は、３Ｄバイオリアクターの印刷に使用された可能性のある残留モノマー及び／又は光開始剤の浸出を低減又は防止する能力があるように設計される。そのような場合は、特に、積層造形手順が、液体樹脂の硬化（重合）を含むステレオリソグラフィー（ＳＬＡ）又はデジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）を伴う場合である。したがって、図１８に注意が向けられ、これは、好ましい印刷後の手順をまとめたものである。図示しているように、最初に光重合（光誘起重合）による積層造形によって製造されたここでの３Ｄバイオリアクターは、好ましくは後硬化、好ましくはＵＶ光への追加の曝露によって後硬化される。ＵＶ光へのそのような追加の曝露は、印刷中の基礎となる重合を増加させ、及び／又は比較的低分子量の材料、例えば重合していないモノマー材料の量を低減させることが考えられる。さらに、そのような後硬化に続いて、そのような比較的低分子量の材料をさらに低減し又は除去するために熱及び／又は真空での処理を行うことができる。たとえば、周囲温度から１２５℃までの温度において１０^－３Ｔｏｒｒ以下の真空を適用することができる。したがって、後硬化を単独で、又は真空及び／又は加熱と組み合わせて使用することによって、比較的低いＭＷの材料（５００以下のＭＷ）の量を２．０質量％以下に、より好ましくは０．０１質量％～１．５０重量％、なおさらに好ましくは０．０１質量％～０．７５質量％の量まで低下させることができると考えられる。

さらに、ここで製造される任意のバイオリアクターについて、生細胞に対して毒性である前述した比較的低分子量の化合物の浸出を同様に低減及び／又は排除するために、コーティング手順を受けさせるが好ましいことがここで考えられる。そのようなコーティングはまた、接着細胞の付着及び成長を促進するために選択的に官能化されてもよい。好ましくは、コーティング手順は、以下の一般的な反応スキームに従って、特定されたＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４基で官能化されていてもよいパリレンモノマー、例えば、［２．２］パラシクロファン類の使用に頼るものであり、ここで、示された重合は、真空下で熱（～５５０℃）に曝露することによって促進されて、置換又は非置換のポリ（ｐ－キシリレン）ポリマー構造をもたらす。以下のスキームにおいて、重合の開始は、３Ｄバイオリアクター上への堆積の前に気相中で、昇温した温度における開環によって開始され、３Ｄバイオリアクターは好ましくは比較的低い温度（例えば、≦１００℃）に維持されることが理解されるべきである。

上記において、繰り返し単位「ｍ」及び／又は繰り返し単位「ｎ」あたりのＲ基の１つが塩素であり、その他のＲ基が水素である場合、上記はパリレンＣの重合を表す。それはＵＳＰクラスＶＩ及びＩＳＯ－１０９９３－６が認定する生体適合性材料である。特定された繰り返し単位の「ｍ」及び「ｎ」の値は、分子量の値が比較的高く、例えば～５００，０００であるような値である。したがって、パリレンモノマーの使用及びポリマーコーティングを確実にすることは、ここでの３Ｄバイオリアクター全体を不浸透性フィルムでコーティングすることができるようなものであると考えられる。このフィルムは、好ましくは、２００オングストローム～１００．０μｍの間の厚さを有しうる。Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４は、水素、ハロゲン（－Ｃｌ又は－Ｂｒ）、並びにその他の官能基、例えば、アミン（－ＮＨ_２）、脂肪族アルデヒド（－ＣＨＯ）、カルボン酸官能基（－ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル（－ＯＨ）、又はカルボキシレート官能基（例えば－Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３中の）から選択することができる。また、パリレンＣの第一の層でコーティングし、次に異なるパリレン、例えば、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４がアミン（－ＮＨ_２）及び／又はアルデヒド（－ＣＨＯ）官能基から選択されるパリレンのコーティングをしてもよい。したがって、ここでの３Ｄバイオリアクターのためのポリマーコーティングを提供することができ、ここでコーティングは、それぞれがそれ自体の特定のかつ異なる化学組成を有する複数の層を含む（すなわち、少なくとも２つの層の間で、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４のうち少なくとも１つの同一性が異なる）。

アルデヒドの官能化コーティングを有する３Ｄバイオリアクターは、例えば、様々な長さのオリゴエチレンオキシドのアミノ末端化（又は他の有機末端基）がされている末端可撓性接合部（tether）を有する抗体タンパク質（例えば、抗ＣＤ３／２８）と反応をすることができることがさらに考えられる。言い換えると、

（式中、ｎの値は１～２００の範囲であることができる）におけるような、官能性末端基、例えばアミン基を含むポリ（エチレンオキシド）タイプの接合部の使用、これは次に以下のように、ここでの３Ｄバイオリアクター上の官能化されたパリレンコーティングに結合することができ、以下では１つの結合反応部位が示されており、反応パラメータ（例えば、結合反応収率を高める温度及び時間）の調節に応じて、複数の結合反応が起こりうることが理解されるべきである。

したがって、理解されうるように、上記では、標的とする細胞表面受容体とのより良い結合を可能にするために、細胞刺激タンパク質の表面移動度を変えて、細胞培養培地からの非特異的タンパク質又はその他のマクロ分子の物理的吸着を最小限にすることができる。

別の考えられる実施態様においては、末端の官能化された接合部(tether)を有するビオチンは、第１ステップにおいて、官能化されたパリレンコーティングに結合されることができる。第２ステップにおいて、ビオチンの末端基がアビジン又はストレプトアビジンと複合化されることができる。第３ステップにおいて、ビオチン－ストレプトアビジン複合体が次にビオチン官能化された刺激性抗体に結合されて、細胞刺激に適した機能表面を完成させる。

本発明は、さらに、免疫療法の目的のために応用するＴ細胞増殖のための、上で述べたここでの３Ｄバイオリアクターの使用へと進む。図１１を参照すると、図１１は、Ｔ細胞の結合及び活性化のための、バイオリアクターの球状ボイド体積表面上への抗体の固定化を示している。より具体的には、この３Ｄバイオリアクターの場合、ビオチン－アビジン／ストレプトアビジン結合メカニズムによって、バイオリアクター表面上に抗体（ビオチン複合球状タンパク質）、例えば、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を固定化することができる。アビジン又はストレプトアビジンが、上で論じた第１のポリドーパミンコーティングを介してバイオリアクター表面上にプレコートされる。より具体的には、ポリドーパミンコーティングがここでの３Ｄバイオリアクターの表面上に適用された後（これはすでに述べたようにポリ（ｐ－キシレン）コーティングを含むことができる）、四量体タンパク質（４つのサブユニットの四次構造をもつタンパク質）、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを付着させることができ、これはビオチンに対する親和性を有する。したがって、ポリドーパミンコーティングは、バイオリアクター表面を比較的より親水性にし、タンパク質及び抗体の付着に対する能力をもたらし、対照的に、ポリ（ｐ－キシレン）コーティングは、モノマー浸出をブロックし、細胞毒性を低減又は回避するのに役立つことが理解できる。したがって、四次構造を有するタンパク質（アビジン又はストレプトアビジン）は、ビオチン化抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体をバイオリアクター表面に固定化するために頼ることができる。ビオチン化抗体は、抗体へのビオチンの共有結合を指す。Ｔ細胞がバイオリアクターを通過すると、それらはＴ細胞の表面受容体（例えばＣＤ３）を介して、そのＣＤ３を介して、抗ＣＤ３抗体結合を介して、結合及び活性化される。これに続いて、活性化されたＴ細胞を、シグナル伝達分子を含む灌流培地に曝して、Ｔ細胞の増殖をもたらす。シグナル伝達分子は、好ましくは、サイトカインシグナル伝達分子、例えば、インターロイキン－２（ＩＬ－２）を含みうる。しかしながら、本発明の広い関連において、ポリドーパミンコーティングの使用の必要性を排除し、抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）を３Ｄリアクターの表面上に直接、抗体を、バイオリアクターの表面上に直接アビジン／ストレプトアビジンを固定化して、ビオチン化抗体を結合させることができる。

ここでの３Ｄバイオリアクターを使用して、Ｔ細胞増殖のための閉ループ灌流に基づくシステムが、図１２に示されるように今や可能である。より具体的には、図１２は、Ｔ細胞の活性化及び増殖のためのビーズフリーの閉ループ灌流に基づく３Ｄバイオリアクターを示している。灌流システムは、好ましくは、細胞に安全な蠕動ポンプ及び培地／細胞リザーバ（貯蔵容器）を含み、これは、より効果的な細胞増殖のために細胞密度を希釈するために培地を添加するか、又は増殖プロセス中に栄養素の濃度を維持するために培地を交換することができる。培地リザーバーは、栄養素と酸素を混合するためのガス注入及び撹拌又は振とう機構を備えた酸素供給器としても機能しうる。３Ｄバイオリアクターを通して灌流される培地中に懸濁されたＴ細胞は、球状表面上のＣＤ３及びＣＤ２８抗体と接触し、それによって活性化される多くのチャンスを有している。大きな表面上に固定化されたＣＤ３及びＣＤ２８は、現在のＴ細胞増殖システムにおいて使用されている磁気ビーズと同等の刺激をＴ細胞にもたらすことが予想される。ビーズなしだと、プロセスが大幅に簡素化される。さらに、この閉ループシステムは、自動化及び費用効果の高いｃＧＭＰ細胞製造を容易にする。

表２は、３つの異なるサイズのバイオリアクターの寸法、培養表面積、同等の総表面積を持つ磁気ビーズの数、予想される培地量などを列挙している。ＦＤＡが承認している移植可能な生体適合性材料であるＰＭＭＡを使用して、ＤＬＰ３Ｄプリンターを使用してバイオリアクターを製造した。表２はまた、特定された３Ｄバイオリアクターを構築するためのおおよその材料費も挙げてある。

＜バイオリアクター表面へのアビジン（またはストレプトアビジン）のコーティング＞
Miltenyi MACSiBeadシステムに似せて、アビジン（ストレプトアビジン）及びビオチン結合メカニズムを使用して、ポリドーパミンでコーティングされたバイオリアクター表面に抗-ＣＤ２、ＣＤ３、及びＣＤ２８抗体を固定した。最初に、様々な濃度の蛍光標識したアビジン及びストレプトアビジンを試験して（図１３）、１００μｇ／ｍＬのアビジン又は３０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンが、バイオリアクター表面上の比較的高いアビジン又はストレプトアビジンのコーティング密度を達成することが発見された。図１３は、様々な濃度でのアビジン及びストレプトアビジンのコーティングの蛍光強度を示している。蛍光標識されたアビジン／ストレプトアビジンを使用して、ポリドーパミンプライムコーティング上に結合することができるアビジン又はストレプトアビジンの濃度を試験した。アビジン／ストレプトアビジンのコーティングの好ましい手順は以下のとおりである。アビジン又はストレプトアビジンのコーティング濃度は、さらに最適化することができる。
１）バイオリアクター表面を、最初に、ここではポリドーパミンによってコーティングする。
２）アビジン又はストレプトアビジンをＴＲＩＳバッファー（ｐＨ８．５）に溶かして、１００μｇ／ｍＬ又は３０μｇ／ｍＬのアビジン又はストレプトアビジンの濃度をそれぞれ有するコーティング溶液を調製する。暗所で穏やかに振とうしながら、バイオリアクターをコーティング溶液中に１２時間浸す。
３）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でその足場（scaffold）を完全に洗浄する。次に、その足場をＰＢＳ中に残しておき、これで、ビオチン化抗体でコーティングする準備ができる。

次に、アビジン又はストレプトアビジンのベース層に結合するための第２層コーティングとしての様々な濃度の蛍光標識ビオチンについて比較を行った（図１４）。１．０μｇ／ｍＬのビオチンが、固定化されたアビジン又はストレプトアビジンへ首尾よく結合したことが確認された。アビジン又はストレプトアビジン上のビオチンコーティングの蛍光強度（ビオチン濃度に比例）を確認している図１４を参照されたい。ビオチンが、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされたバイオリアクター表面に首尾よく結合できることを確認した後、ビオチン化抗-ＣＤ２、ＣＤ３、及びＣＤ２８抗体を、Ｔ細胞の活性化及び増殖のためのバイオリアクターの上に適用した。

２．１ｃｍの直径の足場（scaffold）（すなわち、約７．５×１０^７のビーズの合計表面に相当する）に抗体コーティングを好ましくは適用するために：
１）ＢＰＳからバイオリアクターの足場を取り出す。
２）足場からできるだけ多くのＰＢＤを取り除くが、足場は乾燥させない。
３）１００μｇ／ｍＬのＣＤ２－ビオチン（２００μＬ）、１００μｇ／ｍＬのＣＤ３－ビオチン（２００μＬ）、及び１００μｇ／ｍＬのＣＤ２８－ビオチン（２００μＬ）を１５ｍＬのチューブ中で混合し、１．４ｍＬの抗体標識バッファー（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋なしのＰＢＳ、ｐＨ＝７．２に加えて、０．５％の熱不活化ウシ胎児血清及び２ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、良く混合して、各抗体が１０μｇ／ｍｌの濃度をもつ合計２ｍＬのビオチン化抗体を作る。
４）上記の混合した抗体２ｍＬを添加して、１２ウェルのプレート中のバイオリアクターマトリクスを覆い、ピペットで液を上下させて混合する。
５）２℃～８℃の温度において、穏やかに振とうしながら、冷蔵庫中暗所で２時間、マトリクス中でインキュベートする。
６）ＰＢＳ洗浄により、足場から、未結合の抗体を完全に除去する。

ポリドーパミン、アビジン／ストレプトアビジン、及びビオチン化抗体を使用するコーティング手順を拡張して、完全なバイオリアクターの内面（つまり、バイオリアクターマトリックスに加えて入口及び出口）をコーティングすることができる。

＜Ｔ細胞増殖用の磁気ビーズ及び抗体で被覆されたバイオリアクターマトリックスでインキュベートされたＴ細胞の比較＞
抗体でコーティングされたマトリックス（入口及び出口なし）を、Miltenyi MACSiBeadTMシステムと比較した。磁気ビーズ（すでにストレプトアビジンでコーティングされている）を、上述したコーティング手順と同様に、製造元のプロトコルに従ってビオチン化抗-ＣＤ２、ＣＤ３、及びＣＤ２８抗体でコーティングした。表１に挙げた、直径２．１ｃｍ×高さ０．７ｃｍの比較的小さいバイオリアクター（図７ｅ）を使用した。このバイオリアクターマトリックスは１２ウェルプレートのウェルに収まるので、ビーズとマトリックスの性能を簡単に比較できる。３つのバイオリアクターマトリックスを最初にアビジン又はストレプトアビジンで、次に上述した好ましい手順を使用してビオチン化ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８抗体でコーティングした。同じ濃度の抗体を使用して、バイオリアクターマトリックスとMACSiBeadsをコーティングした。ストレプトアビジンコーティングを施した１つのバイオリアクターマトリックスは、抗体でさらにコーティングされていない（ネガティブコントロール）。

ヒト末梢血ＣＤ３＋Ｐａｎ Ｔ細胞（ReachBio Research Labs）を、製造元のプロトコルに従って、MACSiBeadsを使用して最初に活性化及び増殖させ（７日間）、次に磁性粒子から分離した。次に、４．５×１０^６個のＴ細胞を１２ウェルプレートの４つのウェルにそれぞれ添加した。３ｍＬの培地（１０％ウシ胎児血清及び２０ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２を添加したＲＰＭＩ１６４０）でそれぞれ満たされた４つのウェルには、１）７．５×１０^６個の、抗体でコーティングされた磁気ビーズ、２）抗体でコーティングされたストレプトアビジンマトリックス、３）抗体でコーティングされたアビジンマトリックス、及び４）抗体でコーティングされていないストレプトアビジンマトリックスのいずれかを含んでいた。３日目に追加の培地をウェルに添加した。５日目に、その細胞を、追加のビーズとマトリクスを伴う２つのウェルに分けた。磁気ビーズ又はマトリックスから分離した後の各ウェル中のＴ細胞の数を３、５、及び７日目にカウントした。

図１５は、抗体コーティングされていないマトリックスに対して、抗体でコーティングされた磁気ビーズ及び抗体でコーティングされたマトリックスでインキュベートされたＴ細胞増殖（活性化後）を示している。抗体でコーティングされたマトリックスにおけるＴ細胞増殖の傾向は、抗体でコーティングされたビーズのそれの傾向と類似している。しかし、抗体なしのマトリックスでインキュベートしたＴ細胞は増殖しなかったが、それはおそらく継続的な刺激の欠如のためである。この実験において、マトリックスは静的条件下でウェル中に置いた。したがって、結果は灌流ベースのバイオリアクターとは異なることが予想される。この試験は、抗体がバイオリアクターのマトリックス表面上にうまくコーティングされ、それがＴ細胞の増殖を促進したことを明確に示している。

＜Ｔ細胞の活性化及び増殖の両方のための、抗体でコーティングされたバイオリアクターマトリックス及び磁気ビーズでインキュベートされた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の比較＞
上と同様の研究を、単離されたＴ細胞の代わりにＰＢＭＣを用いて行った。通常、Ｔ細胞及び他の単核細胞、例えば、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球を含むＰＢＭＣを患者から採取し、Ｔ細胞を分離することなく細胞増殖に直接用いた。これは、非Ｔ細胞はＣＤ２、ＣＤ３、及びＣＤ２８によって活性化されることはなく、それらは活性化せずに数日後に自然に排除されるからである。この実験と図１５の実験との別の違いは、抗体でコーティングされたマトリックスを使用するときにサイトカイン活性化ステップを組み込んでいることである。手短に言えば、２．５×１０^６個の細胞／ｍＬの密度でＰＢＭＣを含む培地２ｍＬを１２ウェルプレートの３つのウェルに添加した。その３つのウェルには、それぞれ、１）７．５×１０^６個の、抗体でコーティングされた磁気ビーズ、２）抗体でコーティングされたストレプトアビジンマトリックス、及び３）抗体でコーティングされていないストレプトアビジンマトリックスが含まれている。ストレプトアビジンは最後の２つの実験でアビジンよりも優れていることが示されているので、この実験ではアビジンでコーティングされたマトリックスは使用しなかった。ＰＢＭＣを、活性化のために各ウェル中で２日間インキュベートした。次に、ＩＬ２サイトカインを含む追加の培地をそれらのウェルに添加し、培地に２０ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ２が含まれるようにして増殖期を開始した。５日間の培養中の総細胞数の変化を図１６に示している。これは、抗体でコーティングされたマトリックスで増殖したＴ細胞が、抗体でコーティングされた磁気ビーズと比較した場合、より多くのＴ細胞をもたらしたことを確認するものである。これはまた、抗体でコーティングされたマトリックスが、同等以上のＴ細胞の活性化及び増殖をもたらすことができることを確認するものである。

＜動的灌流ベースのＴ細胞増殖＞
灌流ベースの３Ｄバイオリアクターを、本明細書に記載されているようにして製造した。この３Ｄバイオリアクターの内面は、１２時間ポリドーパミンでコーティングすることによって調製した。次に、バイオリアクターの内面を１２時間ストレプトアビジンでコーティングした。次に、バイオリアクターを滅菌のために７０％エタノールでインキュベートした。滅菌後、上記の手順を使用して、その内面をＰＢＳで洗浄し、ＣＤ２、ＣＤ３、及びＣＤ２８-ビオチンコンジュゲートの等量混合物（各抗体について１０μｇ／ｍＬの濃度）でコーティングして、バイオリアクターの内面に抗体を固定させた。

灌流の流路は、図１２に示すように設定した。この灌流システムには、生細胞とせん断に敏感な液体をポンプで輸送するために設計されたCytoflowポンプヘッド（Cole-Parmer）を備えたMasterflex L/Sを使用した。このアプリケーションは比較的小さなバイオリアクターを使用し、灌流速度は比較的低いことが予測されるので、酸素供給器の代わりに、媒体及び媒体液滴中へのガス拡散を使用する特注の酸素化ユニットを使用した。

約２０×１０^６個のＰＢＭＳを、プライミングされたバイオリアクター灌流システムに播いた。２ｍＬ／分で１５分間循環させることにより、細胞を均一に分配した。活性化段階の間、（サイトカインＩＬ２プロモーターを全く含まない灌流培地）、Ｔ細胞に１日目に０．１ｍＬ／分、２日目に０．１４ｍＬ／分の速度で灌流した。２日間の活性化後、細胞密度を測定し、総ＩＬ-２濃度が２０ＩＵ／ｍＬになるように、ヒトＩＬ-２サイトカインを含む培地をシステムに添加した。Ｔ細胞増殖期は０．２ｍＬ／分の灌流速度で３日間実施した。細胞密度は５日目に決定し、結果を図１７に示している。図１５及び１６に示されている静的試験と同様に、Ｔ細胞は活性化／促進後に３倍の増殖を達成した。

パリレンＣでコーティングした３Ｄバイオリアクターのオゾン／ＵＶ表面処理
上記のように、パリレンコーティングは官能化することができる。例として、ここでのパリレンＣでコーティングしたバイオリアクターの場合、それは紫外線／オゾンシステムで処理され、この処理がヒドロキシル、カルボニル、及びカルボキシレート表面基をもたらすと考えられる。より具体的には、３Ｄバイオリアクターを、片側にＵＶに透明なガラスを備えた密閉チャンバー内に配置した。ＵＶランプ（２５４ｎｍ）をそのガラス上約１．７５インチの距離に配置して、オゾン曝露中に同時に適用される３．２ｍＷ／ｃｍ^２の曝露フラックスを生成させる。密閉チャンバーの入口はＰＴＦＥチューブを介してVMUS-4オゾン発生器（Azco Industries）に接続し、密閉チャンバーの出口は鉱油で満たされたガラス瓶に接続し、これらは全てドラフト内で行った。オゾン発生器は、２Ｌ／分の空気入口流量に設定した。出力は１００％の効率に設定し、１時間あたり約２．５ｇのオゾンを生み出した。パリレンＣでコーティングされたバイオリアクターは、それぞれ１、２、５、１０、及び１５分間オゾン処理した。下の表３から分かるように、パリレンＣ表面を１０分間処理すると、表面は、ポリドーパミン／フィブロネクチン（ＰＤ／ＦＢ）で処理された表面と同じくらい親水性になった。その教示を参照により本明細書に援用する米国特許出願第１５／５８５，８１２号を参照されたい。

図１９は、バイオリアクター上のパリレンＣコーティングを５分間処理するＵＶ／オゾンが、そのバイオリアクターに予め播かれた付着性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞増殖に最適であることを示している。ＭＴＴアッセイを使用した蛍光強度の増加は、細胞数の増加の結果である。この曝露での細胞増殖は、４日間及び７日間の両方についてポリドーパミン及びフィブロネクチンでコーティングされたバイオリアクターによって達成されたものを上回った。これは、比較的複雑なＰＤ／ＦＢ処理が不要であることを示している。図２０は、ヒト由来脂肪幹細胞（ｈＡＤＳＣ）の細胞増殖を示している。図２１は、３Ｄバイオリアクターにおける時間の関数としてＡＤＳＣ細胞の数の増加を示す、対応する蛍光顕微鏡画像を示している。

＜滅菌及び包装＞
本明細書では、パリレンフィルムタイプのコーティングを含み得るここでの３Ｄバイオリアクターのガンマ線滅菌の代わりに、滅菌は、非接着性Ｔ細胞増殖の場合、抗体の表面への固定化前の灌流二酸化塩素（ＣｌＯ_２）ガスに頼ることができることを想定している。ＣｌＯ_２ガスは、官能化されたパリレンフィルムコーティング（すなわち、－Ｃｌ、－ＣＨＯ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ_２、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３）又はその下にある３Ｄバイオリアクターポリマー基材と反応することは予期されない。

例えば、ここでの３Ｄバイオリアクターは、今や、ポリマーフィルム中に密封することができ、これは次に滅菌の目的のために二酸化塩素の雰囲気中に置かれることができる。続いて、そのような滅菌された３Ｄバイオリアクターは、流動する空気の流れに曝されて、残っている二酸化塩素ガスが放出される。滅菌の追加の方法には、スチーム、オゾン、過酸化水素、二酸化硫黄、及び／又はエチレンオキシド滅菌が含まれる。

Claims (22)

1. 細胞増殖のための３Ｄバイオリアクターであって、
   細胞増殖のための表面領域を有する複数のボイド（前記複数のボイドは直径Ｄを有する）、前記ボイド間の複数の細孔開口部（細孔開口部はＤ＞ｄとなる直径ｄを有する）を含み、ここで、（ａ）前記ボイドの９０％以上が、±１０．０％を超えては変わらない、選択されたボイド体積（Ｖ）を有し；かつ、（ｂ）前記ボイド間の前記細孔開口部の９０％以上が、±１０．０％を超えて変わらないｄの値を有し；
   置換又は非置換ポリ（ｐ－キシリレン）のコーティングを有する、３Ｄバイオリアクター。
2. ５００以下のＭＷを有する材料を０．０１質量％～０．２５質量％含む、請求項１に記載の３Ｄバイオリアクター。
3. 前記ポリ（ｐ－キシリレン）が以下の構造：
   

   

   （式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４は、水素、ハロゲン、アミン（－ＮＨ_２）、脂肪族アルデヒド（－ＣＨＯ）、カルボン酸官能基（－ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル（－ＯＨ）、又は－Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３を含めたカルボキシレート官能基から選択される）
   を有する、請求項１に記載の３Ｄバイオリアクター。
4. 前記コーティングが２００オングストローム～１００．０μｍの厚さを有する、請求項１に記載の３Ｄバイオリアクター。
5. 前記ポリ（ｐ－キシリレン）コーティングが、異なる化学組成を有する複数のコーティング層を含む、請求項１に記載の３Ｄバイオリアクター。
6. ポリドーパミンが前記ポリ（ｐ－キシレンコーティング）に適用されており、前記ポリドーパミンが、細胞培養のための追加の１つ又は複数の層に結合していることができる、請求項１に記載の３Ｄバイオリアクター。
7. 前記置換ポリ（ｐ－キシレン）コーティングが、末端置換された抗体タンパク質を含むポリ（エチレンオキシド）に結合している、請求項３に記載の３Ｄバイオリアクター。
8. Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、及びＲ_４のうちの少なくとも１つがアルデヒド（－ＣＨＯ）から選択され、前記３Ｄバイオリアクターが、次の構造：－ＣＨ＝Ｎ－を有する連結基を介して、末端置換された抗体タンパク質を有するポリ（エチレンオキシド）に結合されている、請求項３に記載の３Ｄバイオリアクター。
9. 前記ポリドーパミンコーティングに付いた細胞外マトリックスタンパク質をさらに含む、請求項６に記載の３Ｄバイオリアクター。
10. 前記ポリドーパミンコーティングに付いた四量体タンパク質をさらに含む、請求項６に記載の３Ｄバイオリアクター。
11. 前記四量体タンパク質に固定化されたビオチン化抗体をさらに含む、請求項１０に記載の３Ｄバイオリアクター。
12. 前記四量体タンパク質がアビジン又はストレプトアビジンを含む、請求項１０に記載の３Ｄバイオリアクター。
13. 前記ビオチン化抗体が抗ＣＤ３抗体を含む、請求項１１に記載の３Ｄバイオリアクター。
14. 前記ビオチン化抗体が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項１１に記載の３Ｄバイオリアクター。
15. 前記ビオチン化抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体を含む、請求項１１に記載の３Ｄバイオリアクター。
16. ３Ｄバイオリアクターの製造方法であって、以下のステップ：
    積層造形法によって３Ｄバイオリアクターを形成するステップ（ここで、３Ｄバイオリアクターは、細胞増殖のための表面領域を有する複数のボイド（前記複数のボイドは直径Ｄを有する）、前記ボイド間の複数の細孔開口部（細孔開口部はＤ＞ｄとなる直径ｄを有する）を含み、ここで、（ａ）前記ボイドの９０％以上が、±１０．０％を超えては変わらない、選択されたボイド体積（Ｖ）を有し；かつ、（ｂ）前記ボイド間の前記細孔開口部の９０％以上が、±１０．０％を超えて変わらないｄの値を有し；
    ）；及び
    前記３Ｄバイオリアクターを、置換又は非置換ポリ（ｐ－キシレン）でコーティングするステップ、
    を含む製造方法。
17. 前記の積層造形法が、ステレオリソグラフィー（ＳＬＡ）又はデジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記バイオリアクターを、置換又は非置換ポリ（ｐ－キシレン）でコーティングする前にＵＶ光に曝露する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記バイオリアクターを、置換又は非置換ポリ（ｐ－キシレン）でコーティングする前に真空に曝す、請求項１７に記載の方法。
20. 前記バイオリアクターを、置換又は非置換ポリ（ｐ－キシレン）でコーティングする前に加熱に曝す、請求項１７に記載の方法。
21. 前記置換又は非置換ポリ（ｐ－キシレン）コーティングをＵＶ光及びオゾンに曝す、請求項１６に記載の方法。
22. 細胞増殖のための表面領域を有する複数のボイド（前記複数のボイドは直径Ｄを有する）、前記ボイド間の複数の細孔開口部（細孔開口部はＤ＞ｄとなる直径ｄを有する）を含み、ここで、（ａ）前記ボイドの９０％以上が、±１０．０％を超えては変わらない、選択されたボイド体積（Ｖ）を有し；かつ、（ｂ）前記ボイド間の前記細孔開口部の９０％以上が、±１０．０％を超えて変わらないｄの値を有する、細胞増殖のための３Ｄバイオリアクターであって、
    下記モノマー：
    

    

    （式中、Ｘ及びＹは、フリーラジカル重合によって重合する重合性基を含み、Ｒ_２は、Ｒ_１及びＲ_３よりも大きい嵩高さを有する嵩高い有機基であり、Ｒ_２は、室温でネマチック状態を達成するのに十分な立体障害をもたらすように適合されている）
    の重合生成物を含む、３Ｄバイオリアクター。

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