JP2022513399A - 無細胞メッセンジャーｒｎａを使用した骨髄の特徴付け - Google Patents

無細胞メッセンジャーｒｎａを使用した骨髄の特徴付け Download PDF

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Abstract

被験体の骨髄の病状をモニタリングするための方法およびシステムが本明細書に記載されている。さらに、被験体の臓器の処置状況をモニタリングするための方法およびシステムが本明細書に開示されている。さらに、被験体の骨髄の健康状況をモニタリングし、活性薬剤をアッセイするための方法およびシステムが本明細書に開示されている。ある態様では、被験体の骨髄の病状をモニタリングするための方法が本明細書に提示されている。本方法は、病状を有する被験体から生体試料を得るステップと、第１の複数の遺伝子に対応する、骨髄に常在するまたはこれに起源をもつ複数の細胞に由来する第１の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップとを含む。

Description

相互参照
本願は、２０１８年１０月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／７５２，１５５号、および２０１９年３月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／８１８，６０３号の利益を主張し、これら仮出願のそれぞれを全体的に参照により本明細書に組み込む。
参照による援用
本明細書で言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれていると特にかつ個々に指し示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。参照により本明細書に組み込まれた刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含有されている本開示と矛盾する限りにおいて、本明細書は、そのような全ての矛盾した資料に取って代わるおよび／またはこれに優先することが意図される。
血液は、全臓器に灌注する液体結合組織であり、身体の細胞に酸素および栄養素を供給する一方で、脂質、タンパク質および核酸を含む細胞の老廃物を収集する。これらの循環する生体分子は、特異的な臓器の健康に関連付けられる情報を含有する。循環するタンパク質および脂質に着目して研究がなされてきたが、循環する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）も、健康および疾患の診断およびモニタリングのための非侵襲的ツールとして出現した。例えば、ｃｆＤＮＡは、出生前診断学、移植片拒絶およびがんのモニタリングに利用されてきた。これらの進歩にもかかわらず、ｃｆＤＮＡ検査の価値は一般に、遺伝的な差によって特徴付けられる生理的および疾患状況（すなわち、妊娠、移植片または腫瘍）に制限されている。ＲＮＡに基づく非侵襲的バイオマーカーとして、ｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡを含む非コードＲＮＡが、複数の疾患において研究されている。
ある態様では、被験体の骨髄の病状をモニタリングするための方法が本明細書に提示されている。本方法は、病状を有する被験体から生体試料を得るステップと、第１の複数の遺伝子に対応する、骨髄に常在するまたはこれに起源をもつ複数の細胞に由来する第１の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップとを含む。
一部の実施形態では、生体試料は、血液試料を含む。一部の実施形態では、血液試料は、血清試料、血漿試料またはバフィーコート試料を含む。
一部の実施形態では、病状は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、白血病、骨髄増殖性新生物、骨髄異形成症候群、リンパ腫、血小板血症、骨髄線維症、真性赤血球増加症または貧血を含む。一部の実施形態では、病状は、ＭＭを含む。一部の実施形態では、病状が、ＭＭを含む場合、第１の複数の遺伝子は、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＡ１、ＩＧＫＣ、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６、ＩＧＨＶ７、ＩＧＨＶ８、ＩＧＨＶ９、ＩＧＨＶ１０、ＩＧＨＶ１１、ＩＧＨＶ１２、ＩＧＨＶ１３、ＩＧＨＶ１４、ＩＧＨＶ１５、ＩＧＨＶ１６、ＩＧＨＶ１７、ＩＧＨＶ１８、ＩＧＨＶ１９、ＩＧＨＶ２０、ＩＧＨＶ２１、ＩＧＨＶ２２、ＩＧＨＶ２３、ＩＧＨＶ２４、ＩＧＨＶ２５、ＩＧＨＶ２６、ＩＧＨＶ２７、ＩＧＨＶ２８、ＩＧＨＶ２９、ＩＧＨＶ３０、ＩＧＨＶ３１、ＩＧＨＶ３２、ＩＧＨＶ３３、ＩＧＨＶ３４、ＩＧＨＶ３５、ＩＧＨＶ３６、ＩＧＨＶ３７、ＩＧＨＶ３８、ＩＧＨＶ３９、ＩＧＨＶ４０、ＩＧＨＶ４１、ＩＧＨＶ４２、ＩＧＨＶ４３、ＩＧＨＶ４４、ＩＧＨＶ４５、ＩＧＨＶ４６、ＩＧＨＶ４７、ＩＧＨＶ４８、ＩＧＨＶ４９、ＩＧＨＶ５０、ＩＧＨＶ５１、ＩＧＨＶ５２、ＩＧＨＶ５３、ＩＧＨＶ５４、ＩＧＨＶ５５、ＩＧＨＶ５６、ＩＧＨＶ５７、ＩＧＨＶ５８、ＩＧＨＶ５９、ＩＧＨＶ６０、ＩＧＨＶ６１、ＩＧＨＶ６２、ＩＧＨＶ６３、ＩＧＨＶ６４、ＩＧＨＶ６５、ＩＧＨＶ６６、ＩＧＨＶ６７、ＩＧＨＶ６８、ＩＧＨＶ６９、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５、ＩＧＫＶ６、ＩＧＫＶ７、ＩＧＫＶ８、ＩＧＫＶ９、ＩＧＫＶ１０、ＩＧＫＶ１１、ＩＧＫＶ１２、ＩＧＫＶ１３、ＩＧＫＶ１４、ＩＧＫＶ１５、ＩＧＫＶ１６、ＩＧＫＶ１７、ＩＧＫＶ１８、ＩＧＫＶ１９、ＩＧＫＶ２０、ＩＧＫＶ２１、ＩＧＫＶ２２、ＩＧＫＶ２３、ＩＧＫＶ２４、ＩＧＬ１、ＩＧＬＶ １－４０、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、病状は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む。
一部の実施形態では、検出するステップは、ｃｆ－ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、配列決定、アレイハイブリダイゼーションまたは核酸増幅のうち１つまたは複数を行うことにより、ｃＤＮＡを測定するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、本方法は、処置を提供するステップをさらに含む。一部の実施形態では、処置は、イオン化照射（ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）、メルファラン媒介性骨髄アブレーション、ブスルファン媒介性骨髄アブレーション、トレオスルファン媒介性アブレーション、化学療法媒介性アブレーション、同種異系移植、自家移植、増殖因子による刺激、自家もしくは異種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法、またはこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、増殖因子による刺激は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）による刺激を含む。一部の実施形態では、増殖因子による刺激は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）による刺激（ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を含む。
別の態様では、被験体の臓器の処置状況をモニタリングするための方法が本明細書に開示されている。本方法は、処置状況を有する被験体から血漿試料を得るステップと、第２の複数の遺伝子に対応する、被験体の臓器に由来する第２の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップとを含む。
一部の実施形態では、臓器は、骨髄である。一部の実施形態では、生体試料は、血液試料を含む。一部の実施形態では、血液試料は、血清、血漿試料またはバフィーコート試料を含む。
一部の実施形態では、処置状況は、骨髄アブレーション、骨髄再構成、骨髄移植、増殖因子による刺激、免疫療法、免疫調節、ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーション、コルチコステロイド、放射線療法、または自家もしくは異種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を含む。一部の実施形態では、ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーションは、ユビキチンリガーゼ阻害剤の投与を含む。一部の実施形態では、骨髄アブレーションは、物理的アブレーション、化学的アブレーション、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、物理的アブレーションは、イオン化照射を含む。
一部の実施形態では、化学的アブレーションは、メルファラン媒介性骨髄アブレーション、ブスルファン媒介性骨髄アブレーション、トレオスルファン媒介性アブレーション、化学療法媒介性アブレーション、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、骨髄移植は、同種異系移植を含む。一部の実施形態では、骨髄移植は、自家移植を含む。一部の実施形態では、増殖因子による刺激は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）による刺激を含む。一部の実施形態では、増殖因子による刺激は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）による刺激（ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を含む。
一部の実施形態では、処置が、骨髄アブレーションを含む場合、第２の複数の遺伝子に対応する第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは減少し、第２の複数の遺伝子は、赤血球特異的遺伝子を含む。
一部の実施形態では、処置が、骨髄再構成を含む場合、第２の複数の遺伝子に対応する第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは、骨髄アブレーションの際の斯かるｃｆ－ｍＲＮＡレベルと比較して増加し、第２の複数の遺伝子は、赤血球特異的遺伝子を含む。一部の実施形態では、赤血球特異的遺伝子は、ＧＡＴＡ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＴＦ、ＡＶＰ、ＲＵＮＤＣ３Ａ、ＳＯＸ６、ＴＳＰＯ２、ＨＢＺ、ＴＭＣＣ２、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＡＬＡＳ２、ＥＰＢ４２、ＧＹＰＡ、Ｃ１７ｏｒｆ９９、ＨＢＡ２、ＲＨＣＥ、ＨＢＧ２、ＴＲＩＭ１０、ＨＢＡ１、ＨＢＭ、ＨＢＧ１、ＵＣＡ１、ＧＹＰＢ、ＣＴＤ－３１５４Ｎ５．２、およびＡＣ１０４３８９．１からなる群由来の１つまたは複数の遺伝子を含む。
一部の実施形態では、処置が、骨髄再構成を含む場合、第２の複数の遺伝子に対応する第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは増加し、第２の複数の遺伝子は、巨核球特異的遺伝子を含む。一部の実施形態では、巨核球特異的遺伝子は、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＧＰ６、ＨＧＤ、ＰＦ４、ＣＬＥＣ１Ｂ、ＣＭＴＭ５、ＧＰ９、ＳＥＬＰ、ＤＮＭ３、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＸＸｂａｃ－ＢＰＧ３２１３．１９、およびＲＰ１１－８７９Ｆ１４．２からなる群由来の１つまたは複数の遺伝子を含む。
一部の実施形態では、処置が、骨髄アブレーションを含む場合、第２の複数の遺伝子に対応する第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは減少し、第２の複数の遺伝子は、好中球特異的遺伝子を含む。
一部の実施形態では、処置が、骨髄移植を含む場合、第２の複数の遺伝子に対応する第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは、骨髄アブレーションの際の斯かるｃｆ－ｍＲＮＡレベルと比較して増加し、第２の複数の遺伝子は、好中球特異的遺伝子を含む。
一部の実施形態では、処置が、骨髄再構成を含む場合、第２の複数の遺伝子に対応する第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは、骨髄再構成の際の斯かるｃｆ－ｍＲＮＡレベルと比較して増加し、第２の複数の遺伝子は、好中球特異的遺伝子を含む。一部の実施形態では、好中球特異的遺伝子は、前駆体好中球特異的遺伝子を含む。一部の実施形態では、前駆体好中球特異的遺伝子は、ＣＴＳＧ、ＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ８、ＲＮＡＳＥ、ＰＧＬＹＲＰ１、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、前駆体好中球特異的遺伝子に対応する検出されたｃｆ－ｍＲＮＡは、血液試料において、複数の好中球細胞よりも早く現れる。
一部の実施形態では、処置が、同種異系移植を含む場合、第２の複数の遺伝子に対応する第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは検出され、第２の複数の遺伝子は、ドナー細胞由来の前駆体好中球特異的遺伝子を含む。
一部の実施形態では、処置が、Ｇ－ＣＳＦによる刺激（ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を含む場合、第２の複数の遺伝子に対応する第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは検出され、第２の複数の遺伝子は、好中球特異的遺伝子を含む。一部の実施形態では、好中球特異的遺伝子は、ＰＧＬＹＲＰ１、ＬＴＦ、ＡＴＰ２Ｃ２、ＶＮＮ３、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＯＬＦＭ４、ＫＲＴ２３、ＭＭＰ８、ＡＲＧ１、ＥＰＸ、ＰＩ３、ＣＲＩＳＰ２、ＳＴＥＡＰ４、ＬＣＮ２、ＰＲＧ３、ＫＣＮＪ１５、ＡＬＰＬ、ＦＣＧＲ３８、Ｓ１００Ａ１２、ＰＲＯＫ２、ＣＸＣＲ１、ＣＡＭＰ、ＲＮＡＳＥ３、ＣＥＡＣＡＭ３、ＡＺＵ１、ＡＢＣＡ１３、ＣＸＣＲ２、ＣＴＤ－３０８８Ｇ３．８、ＰＲＴＮ３、ＥＬＡＩＮＥ、ＣＤ１７７、ＬＩＮＣ００６７１、ＯＲＭ２、ＯＲＭ１、ＨＰ、およびＲＰ１１－６７８Ｇ１４．４からなる群由来の１つまたは複数の遺伝子を含む。
別の態様では、被験体の骨髄の健康状況（ｈｅａｌｔｈｙ ｓｔａｔｅ）をモニタリングするための方法が本明細書に開示されている。本方法は、健康状況を有する被験体から生体試料を得るステップと、第３の複数の遺伝子に対応する、被験体の骨髄およびその由来細胞に由来する第３の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップとを含む。
一部の実施形態では、第３の複数の遺伝子は、骨髄およびその由来細胞に由来する遺伝子のおおよそ少なくとも４５％、５５％、６５％または７５％を構成する。一部の実施形態では、第３の複数の遺伝子は、表７由来の１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、前駆体好中球特異的遺伝子に対応する第３の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルは、成熟好中球特異的遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡレベルと比較して増加する。
一部の実施形態では、生体試料は、血液試料を含む。一部の実施形態では、血液試料は、血清試料、血漿試料またはバフィーコート試料を含む。一部の実施形態では、検出するステップは、ｃｆ－ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、配列決定、アレイハイブリダイゼーションまたは核酸増幅のうち１つまたは複数を行うことにより、ｃＤＮＡを測定するステップをさらに含む。
別の態様では、活性薬剤をアッセイするための方法が本明細書に開示されている。本方法は、第１の時点で被験体の第１の無細胞発現プロファイルを評価するステップと、被験体に活性薬剤を投与するステップと、第２の時点で被験体の第２の無細胞発現プロファイルを評価するステップとを含む。
一部の実施形態では、第１のまたは第２の無細胞発現プロファイルのいずれかは、骨髄特異的である。一部の実施形態では、本方法は、第１の無細胞発現プロファイルを第２の無細胞発現プロファイルと比較するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、第１の発現プロファイルおよび第２の発現プロファイルの間の差は、治療の効果を指し示す。一部の実施形態では、活性薬剤は、疾患を処置するための医薬化合物を含む。
一部の実施形態では、本方法は、第３の時点で被験体の第３の無細胞発現プロファイルを評価するステップをさらに含む。一部の実施形態では、評価するステップは、配列決定、アレイハイブリダイゼーションまたは核酸増幅のうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、本方法は、追加的な時点で被験体の追加的な無細胞発現プロファイルを評価するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、第２の時点は、第１の時点から１～４週間後である。一部の実施形態では、本方法は、１２～２４ヶ月間の期間にわたり追加的な無細胞発現時点を評価するステップをさらに含む。一部の実施形態では、期間は、約１８ヶ月間である。
一部の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の無細胞発現プロファイルを追跡および／または検出して、治療および／または薬物の発見および／または開発のために１つまたは複数の目的の標的を測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、治療および／または薬物の発見および開発におけるリード最適化および／または臨床開発のために薬力学を測定するステップをさらに含む。
一部の実施形態では、本方法は、遺伝子発現のプロファイルを作成して、治療および／または薬物の発見および／または開発のために特異的標的の関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に関連する１つまたは複数の薬力学的効果を特徴付けるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、治療および／または薬物の発見および開発のために薬力学標的関与の変化を検出するステップをさらに含む。
本開示の新規特色は、添付の特許請求の範囲において詳細に示されている。本開示の特色および利点のより十分な理解は、本開示の原理が利用されている説明的な実施形態を示す次の詳細な説明と、次に示す添付の図面を参照することにより得られるであろう。
図１Ａ～図１Ｇは、ｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームには、循環血液細胞と比較して骨髄由来の未成熟造血転写物が濃縮されていることを示す；図１Ａの左パネルは、健康な被験体由来のｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームおよび全血トランスクリプトームが、非負値行列因子分解を使用して分解され、組織寄与が、公開データベースを使用して推定されたことを示す。Ｃｆ－ｍＲＮＡは、２４名の正常ドナーから配列決定し、１９名の健康な個体由来の全血ＲＮＡ－Ｓｅｑデータは、青年期慢性疲労症候群における全血遺伝子発現から得た：変更されたＢ細胞分化および生存を示唆する探索的横断的試験。Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１７；１５（１）：１０２（その全体を本明細書に組み込む）。試料毎の指し示された細胞型／組織の推定された寄与を示す。右パネル、生体液（２４種のｃｆ－ｍＲＮＡおよび１９種の全血試料）毎の平均値を示す。図１Ｂは、健康な個体由来の３種のペアになった血漿および全血試料においてＲＮＡ－ｓｅｑを行ったことを示す。全３名のドナーについてｃｆ－ｍＲＮＡおよび全血の間で、指し示されている細胞型特異的転写物のレベルを比較した。３名の個体の間の平均の倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）（ｃｆ－ｍＲＮＡ／全血）を表す（対数目盛り）（ｐ－値、ウィルコクソン検定）。左側のドット、好中球前駆体転写物。右側のドット、成熟好中球転写物。細胞型特異的遺伝子は、実施例に説明されている通りに同定した。表７も参照されたい。図１Ｃは、健康な個体由来の５種のペアになった血漿およびバフィーコート試料においてＲＮＡ－ｓｅｑを行ったことを示す。血漿およびマッチするバフィーコート検体における成熟および前駆体好中球転写物のレベルを比較した。５種のペアになった試料におけるこれらの転写物（血漿／バフィーコート）の平均の倍数変化を示す（対数目盛り）。ｐ－値、ウィルコクソン検定。図１Ｄ～図１Ｅは、ＲＮＡ－Ｓｅｑによって測定された、ペアになったバフィーコートおよびｃｆ－ｍＲＮＡ試料における指し示されている転写物の正規化レベル（ＴＰＭ）を比較する箱ひげ図を示し（ｎ＝５、ｐ－値：ウィルコクソン検定）、ｃｆ－ｍＲＮＡには、未成熟（ＰＲＴＮ３）造血転写物（Ｅ）が濃縮され、成熟転写物（ＣＸＣＲ２、Ｄ）が枯渇されていることを示す。箱は、中央値、２５および７５番目の分位数（ｑｕｉｎｔｉｌｅ）をマッピングし、ひげ（ｗｈｉｓｋｅｒ）は、１．５×四分位数間範囲（ＩＱＲ）まで伸長する。図１Ｆは、ＢＭ特異的遺伝子（実線の丸で示す）および末梢血特異的遺伝子（点線の丸で示す）のマッチするｃｆ－ｍＲＮＡ（Ｙ軸）および全血（Ｘ軸）におけるレベルを比較する散布図が、２個の別個の集団を形成し（ｐ＜０．００１）、骨髄特異的遺伝子が、ｃｆ－ｍＲＮＡ画分において濃縮されていることを示す（図６Ａ～図６Ｆも参照されたい）。図１Ｇは、図１Ａに収載されている転写物の分率を示す。 同上。
図２Ａ～図２Ｄは、ｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームが、多発性骨髄腫患者のＢＭに由来するＩｇ転写物を捕捉することを示す。図２Ａは、ＢＭアブレーション前（－２日目）の多発性骨髄腫患者由来のマッチするｃｆ－ｍＲＮＡおよびバフィーコート試料をＲＮＡ－Ｓｅｑによって解析したことを示す。血漿およびバフィーコート試料において同定された免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域由来の転写物の分率を示す（中央および右パネル）。クローナルに増幅された転写物は、パターン形成された部分に指し示されており、ＭＭ患者のｃｆ－ｍＲＮＡで優位を占めた。健康な個体の血漿におけるＩｇ転写物のレベル（左パネル）は、参照として示す。図２Ｂは、ＭＭ患者において行われた治療的処置の概略図を示す。メルファラン媒介性ＢＭアブレーションは－２日目に開始し、自家幹細胞移植は０日目に行った。次に、ステロイドおよびＧ－ＣＳＦを支持的ケアとして投与した。血液を試験の間毎日収集した。図２Ｃは、処置を通した、ペアになった血漿およびバフィーコート試料におけるＲＮＡ－Ｓｅｑによって検出されたＩｇ転写物の正規化値（ＴＰＭ、Ｙ軸）を示す棒グラフを示す。Ｉｇ重鎖およびＩｇカッパー軽鎖の可変領域のレパートリーを色の勾配で示す。血漿において同定された優位な転写物が指し示されている。移植に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。図２Ｄは、ＢＭアブレーションおよび移植の際のｃｆ－ｍＲＮＡにおける可変Ｉｇ領域由来の転写物の分率を示す。移植に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。それぞれＩＧＫＶ２－２４およびＩＧＨ３－１５と標識された実線で示す優位なＩｇ転写物は、メルファラン媒介性ＢＭアブレーション後に減少する（図７Ａ～図７Ｃも参照されたい）。
図３Ａ～図３Ｊは、ｃｆ－ｍＲＮＡが、がん患者におけるＢＭアブレーションおよび再構成の際の造血系列の転写活性を反映することを示す。図３Ａおよび図３Ｂは、ＢＭアブレーションと、それに続いてそれぞれ自家または同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）幹細胞移植（０日目に）を受けている多発性骨髄腫（ＭＭ）（Ａ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｂ）患者における、ｃｆ－ｍＲＮＡ－Ｓｅｑによって同定された時間と共に変動する転写物のヒートマップを示す。各縦列は、下部に指し示されている、移植時に対する時点を表す。各横列は、遺伝子を表す。転写物のクラスター毎の濃縮ジーンオントロジー用語が指し示されている（調整ｐ値）。図３Ｃ～図３Ｈは、試験を通したＭＭ（Ｃ、Ｅ、Ｇ）およびＡＭＬ（Ｄ、Ｅ、Ｈ）患者における赤血球（実線、Ｃ、Ｄ）、巨核球（実線、Ｅ、Ｆ）および好中球（実線、Ｇ、Ｈ）特異的転写物のレベルの時間経過を示す。転写物の正体は、表Ｓ３に提示されている。対応する末梢血計数は、第２軸にプロットされ、黒色の点線により表される（ＲＢＣ計数、百万／ｍＬ（Ｃ、Ｄ）、血小板計数、千／ｍＬ（Ｅ、Ｆ）および好中球計数、千／ｍＬ（Ｇ、Ｈ））。移植に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。図３Ｉ～図３Ｊは、試験を通したＡＭＬ患者１（Ｉ）および２（Ｊ）における前駆体好中球転写物の相対的変動を示す。これらの転写物に関する平均パーセント変化は、破線の青色の線により表される。破線の黒色の線は、血液中の好中球計数を示す。両方の患者において、ＢＭ再構成の際に、血漿中の前駆体好中球転写物回復は、好中球計数に先行する。
図４Ａ～図４Ｅは、ｃｆ－ｍＲＮＡの遺伝的な差による、ＡＭＬ患者におけるＢＭ同種移植片生着のモニタリングを示す。図４Ａは、３名のＡＭＬ患者における同種異系ＨＳＣ移植の前および後の、ｃｆ－ｍＲＮＡにおけるＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１およびＰＲＴＮ３好中球前駆体転写物において検出されたＳＮＰの参照対立遺伝子の平均頻度を示し、移植後の新たな遺伝的プロファイルの植え込みを示す。図４Ｂおよび図４Ｃは、ＡＭＬ患者１および２に関する（Ａ）と（ｔｈａｎ）同じ転写物において検出されたＳＮＰの参照対立遺伝子の頻度を示す。移植時に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。図４Ｄおよび図４Ｅは、移植後に参照ホモ接合型からヘテロ接合型へと（Ｄ）および代替ホモ接合型から参照ホモ接合型へと（Ｅ）変化する、宿主ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて検出された全ＳＮＰの平均参照対立遺伝子頻度を示す。血液収集日をＸ軸に指し示し、移植は０日目に起こった。
図５Ａ～図５Ｄは、ｃｆ－ｍＲＮＡが、刺激後の造血系列の転写活性を捕捉することを示す。図５Ａは、単一ＥＰＯ用量で処置される前（０日目）および後（３、４日目）に、９名の患者から血液を得たことを示す。ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して、ｃｆ－ｍＲＮＡにおける遺伝子発現パターンを解析した。０日目（ＥＰＯ処置前）は、患者毎の参照として使用し、ＥＰＯ処置後の赤血球特異的転写物のレベルの変化を計算した。ＥＰＯ処置に付した全９名の患者および２名の無処置対照における赤血球転写物の平均の倍数変化を示す。エラーバーは、標準誤差（ＳＥ）を表す。図５Ｂは、ＥＰＯ処置患者における３０日間の期間にわたる赤血球転写物の時間経過解析を示す。各線は、患者を表し、参照として使用される０日目に投与された単一ＥＰＯ投薬後の、経時的な赤血球転写物の平均の倍数変化を示す。成熟と標識された破線周囲の実線は、無処置の健康な対照における同じ転写物のゆらぎを示す。図１０も参照されたい。図５Ｃは、Ｇ－ＣＳＦで処置された３名の健康な患者から血液を得たことを示す（処置前（０日目）、ならびに処置１、４および１０日後）。血漿におけるＲＮＡ－ｓｅｑによって、循環トランスクリプトームの変化を解析した。Ｇ－ＣＳＦで処置された代表的な患者に関して、試験を通した未成熟および成熟好中球特異的転写物の相対的変化を示す。未成熟と標識された破線および成熟と標識された破線は、転写物の群毎の平均を指し示す。好中球計数の相対的変化は、黒色で示す。図５Ｄは、ｃｆ－ｍＲＮＡ－Ｓｅｑによって測定された、指し示されているＧ－ＣＳＦ応答性遺伝子の時間経過を示す。プロットは、０日目と比べた経時的な倍数変化を示す。時点は、線によって接続され、各線は、患者を表す。図１０も参照されたい。
図６Ａ～図６Ｆは、循環細胞トランスクリプトームと比較して、ｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームには、骨髄転写物が濃縮されていることを示す。図６Ａは、全血、血漿およびバフィーコート組成の概略図である。図６Ｂおよび図６Ｃは、好中球特異的およびＴ細胞特異的転写物の、末梢血（Ｘ軸）およびｃｆ－ｍＲＮＡ（Ｙ軸）におけるレベルを比較する散布図を示す。好中球前駆体転写物および成熟転写物を指す矢印が、同様に示されている。ｘ－軸およびｙ－軸の両方が、ｌｏｇ２目盛でＴＰＭを示す。図６Ｄ～図６Ｅは、ペアになったバフィーコートおよびｃｆ－ｍＲＮＡ試料におけるＲＮＡ－Ｓｅｑによって測定された、指し示されている造血前駆体転写物の正規化レベル（ＴＰＭ）を比較する箱ひげ図を示す（ｎ＝５；ｐ－値、ｔ－検定）。箱は、中央値、２５および７５番目の分位数（ｑｕｉｎｔｉｌｅ）をマッピングし、ひげは、１．５×四分位数間範囲（ＩＱＲ）まで伸長する。図６Ｆは、ＢＭ特異的（左）および全血特異的遺伝子（右）のレベルが、３名の個体のマッチする血漿および全血において比較されたことを示す。これらの転写物の平均の倍数変化（血漿／全血）を示す。Ｐ値、ｔ検定。
図７Ａ～図７Ｅは、ｃｆ－ｍＲＮＡが、多発性骨髄腫患者のＢＭにおける形質細胞に由来するＩｇ転写物を含有することを示す。図７Ａ～図７Ｃは、ＢＭアブレーション（－２日目開始）および自家幹細胞移植（０日目）を受けているＭＭ患者の血漿およびバフィーコートにおけるＲＮＡ－Ｓｅｑによって測定された、Ｉｇ転写物のレベルを示す。棒グラフは、試験中に検出されたＩｇ重鎖定常領域転写物（Ａ）、軽鎖定常領域転写物（Ｂ）およびラムダ軽鎖可変領域転写物（ｃ）の正規化レベル（ＴＰＭ）を示す。移植時に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。Ｉｇ転写物ＩＧＨＧ１およびＩＧＫＣは、血漿試料で優位を占め、この患者のＢＭ生検において行われた分子検査によって得られた結果とマッチする（表７）。図７Ｄ～図７Ｅは、ＭＭ患者１および患者３のｃｆ－ｍＲＮＡにおける経時的なＩｇ重鎖および軽鎖可変鎖転写物の分率を示す。実線７０２および実線７０４に優位な転写物を示す。移植日に対する時間を示す。
図８Ａ～図８Ｄは、ＢＭアブレーションおよび移植を受けている急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者におけるｃｆ－ｍＲＮＡによる、ＢＭ造血系列の転写活性のモニタリングを示す。図８Ａ～図８Ｃは、ＡＭＬ患者２における赤血球（Ａ）、巨核球（Ｂ）および好中球（Ｃ）特異的転写物の正規化レベル（ＴＰＭ）の時間経過を示す。対応する末梢血計数は、各グラフの第２軸にプロットされ、黒色の点線により表される（ＲＢＣ計数（Ａ）、血小板計数（Ｂ）および好中球計数（Ｃ））。移植時（０日目）に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。図８Ｄは、ＡＭＬ患者における成熟および未成熟好中球成分の時間経過を示す。好中球計数を破線で示す。未成熟転写物は、好中球計数回復の数日前に、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて検出される。移植時に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。
図９Ａ～図９Ｆは、ＢＭアブレーションおよび移植の際の多発性骨髄腫患者におけるｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングによる、ＢＭ転写活性のモニタリングを示す。図９Ａおよび図９Ｂは、化学療法およびＢＭ再構成の際の多発性骨髄腫患者２における赤血球細胞計数（ＲＢＣ、破線の黒色の線）およびヘモグロビン転写物（実線）の時間経過を示す（図３も参照されたい）。移植時に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。図９Ｃ～図９Ｆは、ｃｆ－ｍＲＮＡおよびマッチするバフィーコート試料においてＲＮＡ－Ｓｅｑを行ったことを示す。グラフは、両方の検体における、肝要な赤血球（Ｃ）および巨核球転写物（Ｄ）ならびに成熟好中球（Ｅ）および未成熟好中球特異的転写物（Ｆ）のベースラインと比べた倍数変化を示す。全パネルにおいて、黒色の線は、対応する循環血液細胞（ｃｅｌｌ ｂｌｏｏｄ）計数：ＲＢＣ計数（Ｃ）、血小板計数（Ｄ）および好中球計数（Ｅ、Ｆ）の相対的変化を表す。移植時に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。
図１０Ａ～図１０Ｃは、ＥＰＯ処置後の増殖因子による、ｃｆ－ｍＲＮＡにおける系列特異的遺伝子を示す。図１０Ａは、ベースラインと比べた、ＥＰＯ処置患者における肝要な赤血球発生遺伝子（指し示されている）の経時的な倍数変化を示す。一般的傾向は、ＥＰＯ処置後のこれらの転写物のレベル上昇と、より後の時点における基底レベルへの復帰を示す。図１０Ｂおよび図１０Ｃは、Ｇ－ＣＳＦによる処置後の患者のｃｆ－ｍＲＮＡにおける未成熟（Ａ）および成熟（Ｂ）好中球特異的転写物の倍数変化を示す。０日目（処置前）を参照として使用する。３名の患者に関する指し示されている転写物の倍数変化を示し、患者１は破線により表され、患者２は灰色の実線により表され、患者３は色の濃い実線により表される。各患者にわたる時点は、線によって接続される。処置時に対する血液収集日をＸ軸に指し示す。 同上。
図１１は、試料における本明細書に記載されているｃｆ－ｍＲＮＡ転写物を測定および解析するようにプログラムまたは他の仕方で構成された、コンピュータシステムを示す。
循環中のｍＲＮＡ転写物の存在の根底にある生物学的過程は、未だに不明である。ｃｆＤＮＡの場合、機構は、細胞死の際に循環中への受動的放出であることが研究により示されている。対照的に、ＲＮＡ分子は、細胞から能動的に分泌され得る。研究は、エキソソームおよび他の脂質小胞への非コードおよびより小型のＲＮＡ分子の分泌に着目した。しかし、１分子基準では、ｍＲＮＡは、この現象の僅かな分率を構成し得る。
ｃｆＤＮＡ技術における進歩は、臨床的に適用可能なｃｆ－ＮＡに基づくバイオマーカーの開発をもたらした。ｃｆＤＮＡは、侵襲的組織生検と比較して潜在的な利点を提供することができる；しかし、ｃｆＤＮＡ解析は、変異、多型または構造的変形形態に頼る場合があり、このことは、遺伝的な差に関連しない疾患および生理的シナリオにおけるその使用を妨げ得る。ｃｆＤＮＡメチル化解析は、組織特異的遺伝子発現の代用として使用された。
本発明の様々な実施形態が本明細書に示され記載されてきたが、当業者には、斯かる実施形態が単なる一例として提供されていることが明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形形態、変化および置換を思い浮かべることができる。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替を用いることができることを理解されたい。
他に指示がなければ、限定されない用語（ｏｐｅｎ ｔｅｒｍ）、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」その他は、本明細書で使用される場合、含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ことを一般に意味する。
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、本明細書で使用される場合、文脈がそれ以外のことを明らかに指示しない限り、複数の参照を一般に含む。したがって、反対のことが指し示されていない限り、本願で示されている数的パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。
他に指示がなければ、本明細書における一部の例は、数的範囲を企図する。数的範囲が提示される場合、他に指示がなければ、範囲は、範囲の両端を含む。他に指示がなければ、数的範囲は、あたかも明確に書き出されているかのように、その中にある全ての値および部分範囲を含む。他に指示がなければ、本明細書におけるいずれかの数的範囲および／または値は、その前に用語「約」が置かれているか否かにかかわらず、当該数的範囲および／または値の８５～１１５％（すなわち、プラスマイナス１５％）であり得る。
用語「被験体」は、本明細書で使用される場合、一般に、健康な、または疾患状態を有する、これを有し得る、もしくはこれを有することが疑われ得る、いずれかの個体を指す。疾患状態は、臓器移植、例えば、骨髄移植、肝臓移植、肺移植、心臓移植、顔面移植等を要求し得る、臓器不全を含むことができる。被験体は、動物であり得る。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウスもしくはラット等の齧歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジまたはウサギ等、哺乳動物であり得る。動物は、魚類、爬虫類またはその他であり得る。動物は、新生児、乳幼児、青年期または成体の動物であり得る。被験体は、生きている生物であり得る。被験体は、ヒトであり得る。ヒトは、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０歳またはそれよりも年上を超えるまたはこれに等しい可能性がある。ヒトは、約１８～約９０歳であり得る。ヒトは、約１８～約３０歳であり得る。ヒトは、約３０～約５０歳であり得る。ヒトは、約５０～約９０歳であり得る。被験体は、被験体の臓器状況のモニタリングを必要とし得る健康であり得る。被験体は、状態の１つまたは複数のリスク因子を有し、無症候性であり得る。被験体は、状態について無症候性であり得る。被験体は、状態に関する１つまたは複数のリスク因子を有することができる。被験体は、状態に関して症候性であり得る。被験体は、状態に関して症候性となり、状態の１つまたは複数のリスク因子を有することができる。被験体は、関節炎等の疾患を有し得るまたはこれを有することが疑われ得る。被験体は、関節炎等の疾患に関して処置されている患者であり得る。被験体は、関節炎等の疾患を発症するリスクの素因を有し得る。被験体は、状態に対する処置からの寛解期であり得る。処置は、臓器移植を含むことができる。
用語「試料」は、本明細書で使用される場合、被験体のいずれかの試料を一般に指す（血液試料、尿試料、汗試料、***試料、腟分泌物試料、無細胞試料、組織試料、腫瘍生検試料、骨髄試料、または他のいずれかの種類の生体液等）。試料からゲノムデータを得ることができる。血液試料は、全血試料または末梢血試料であり得る。血液試料は、血清試料であり得る。血液試料は、血漿試料であり得る。血清および血漿は両者共に、細胞が除去された後に残る全血の液体部分に由来する。血清は、血液が凝固した後に残る液体である。血漿は、抗凝固薬の添加により凝固が防止された場合に残る液体である。血液試料は、バフィーコート試料であり得る。バフィーコートは、全血試料の密度勾配遠心分離後に白血球細胞および血小板の大部分を含有する、抗凝固薬処置された血液試料の画分である。
一般に、本明細書で互換的に使用されている用語「無細胞ポリヌクレオチド」および「無細胞核酸」は、細胞からポリヌクレオチドを抽出することなく、試料から単離され得るポリヌクレオチドを指す。本明細書に開示されている無細胞ポリヌクレオチドは典型的に、健康な組織、損傷した組織、健康な臓器または損傷した臓器から放出または分泌されたポリヌクレオチドである。一部の例では、循環細胞、および／または特異的な組織／臓器に存在する細胞に由来する無細胞メッセンジャーＲＮＡは、健康な被験体またはある状態を有する被験体のいずれかに見出される。例えば、組織または臓器に対する損傷は、細胞溶解、損傷した組織の細胞から循環中への無細胞ポリヌクレオチドの放出をもたらした疾患、傷害または他の状態が原因であり得る。一部の例では、本明細書に開示されている無細胞ポリヌクレオチドは、組織特異的である。他の例では、無細胞ポリヌクレオチドは、組織特異的ではない。一部の例では、無細胞ポリヌクレオチドは、細胞中に存在する、または細胞と接触している。一部の例では、無細胞ポリヌクレオチドは、オルガネラ、小胞またはエキソソームと接触している。一部の例では、無細胞ポリヌクレオチドは、無細胞であり、これは、無細胞ポリヌクレオチドが、細胞と接触していないことを意味する。本明細書に記載されている無細胞ポリヌクレオチドは、他に指定がなければ、自由に循環する。一部の例では、無細胞ポリヌクレオチドは、自由に循環し、すなわち、無細胞ポリヌクレオチドは、いかなる小胞、オルガネラおよび細胞とも接触していない。一部の例では、無細胞ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド結合タンパク質（トランスフェラーゼ、リボソームタンパク質等）と会合するが、他のいかなる分子とも会合しない。循環中のｍＲＮＡ転写物の存在の根底にある機構の理解を使用して、その臨床的価値を解釈することができる。例えば、ｃｆＤＮＡは、主に瀕死の細胞に起源をもつことが示された；したがって、この「液体生検」の使用は、細胞死に関連するシナリオに依存する。ｃｆ－ｍＲＮＡレベルの変化は、細胞死を要求することなく、成熟、増殖、および刺激に対する応答の際の生細胞における転写変化によって影響され得る。
用語「マーカー」は、本明細書で使用される場合、多種多様な生体分子を一般に包含する。マーカーは、疾患マーカー、疾患のマーカー、または臓器の状況（例えば、移植後に臓器が機能的に適切であるか否か）を指し示すマーカーと本明細書で称する場合もある。一部の例では、マーカーは、複数の疾患に関連する状態のマーカーである。例えば、マーカーは、がんまたは移植臓器不全に関連し得る炎症のマーカーであり得る。マーカーは、非限定的な例として、ペプチド、ホルモン、脂質、ビタミン、病原体、細胞断片、代謝物および核酸を含む。一部の例では、マーカーは、無細胞核酸である。一部の例では、本明細書に開示されているマーカーは、組織特異的ではない。しかし、一部の例では、マーカーは、組織特異的である。本明細書に開示されているマーカーは、疾患および／または状態バイオマーカーと称することもできる。疾患バイオマーカーは、疾患および／もしくは状態の結果として存在するもしくは産生される、疾患および／もしくは状態の結果として調節不全にされる、疾患および／もしくは状態に機構的に関係付けられる、疾患および／もしくは状態の状況において変異もしくは改変される、またはこれらのいずれかの組合せである、生体分子である。マーカーは、被験体によって産生され得る。マーカーは、他の種によっても産生され得る。例えば、マーカーは、肝炎ウイルスまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌によって作製された核酸またはタンパク質であり得る。斯かるマーカーを同定する方法は、組織特異的ポリヌクレオチドを検出および／または定量化して、いずれの組織が当該病原体によって感染したかまたは罹患したか、また、必要に応じて、組織（複数可）が損傷した程度を決定するステップをさらに含むことができる。本明細書に開示されている疾患のマーカーは一般に、疾患に罹患していない個体中を循環しない。
用語「配列決定」は、本明細書で使用される場合、合成による配列決定、ハイスループット配列決定、次世代配列決定、マクサム・ギルバート配列決定、超並列シグネチャー配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、４５４パイロシークエンシング、ｐＨ配列決定、サンガー配列決定（チェーン・ターミネーション）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体配列決定、ＤＮＡナノボール（ｎａｎｏｂａｌｌ）配列決定、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子配列決定、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定、ナノポア配列決定、ショットガン配列決定、ＲＮＡ配列決定、Ｅｎｉｇｍａ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ライゲーションによる配列決定、またはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。配列決定出力データは、塩基読み取りの品質（例えば、信頼）に対するフィルタリングを含む品質管理に付すことができる。例示的な配列決定システムは、４５４パイロシークエンシング（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔシステムのｐＨ配列決定システムを含む。一部の例では、試料の核酸は、会合された標識またはタグを用いずに配列決定することができる。一部の例では、試料の核酸を配列決定することができ、その場合の核酸は、自身に会合した標識またはタグを有することができる。
健康な被験体の臓器状況、または状態および／または疾患を有する被験体の臓器状況をモニタリングするための、組織および／または臓器特異的無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）転写物の使用に関する方法、システム、データベースおよび組成物が本明細書に開示されている。さらに、組織および／または臓器特異的無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）転写物は、被験体が臓器に向けられた処置を受けた後に、被験体の臓器をモニタリングするために使用することもできる。Ｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームは、全臓器から収集された転写物の一覧として考慮することができる。これらの循環転写物の一部は、十分に特徴付けされた組織特異的遺伝子に対応するため、個々の起源組織の健康または状況をモニタリングするために使用することができる。実際に、ｃｆ－ｍＲＮＡは、妊婦における胎児発生の反映に、早期分娩の予測に、また、がんバイオマーカーとして使用することもできる。
本明細書に記載されている通り、概念実証試験を行った。本開示は、骨髄（ＢＭ）活性をモニタリングするためのｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングの使用の概念実証を提供し、これにより、ＢＭ疾患患者の治療管理改善がもたらされ、侵襲的ＢＭ生検の必要が軽減され得る。例えば、ｃｆ－ｍＲＮＡの次世代配列決定（ＮＧＳ）に基づく全トランスクリプトームプロファイリングを行った。ｃｆ－ｍＲＮＡの発現レベルを、血液の循環細胞（ＣＣ）由来のレベルと比較して、循環転写物の起源を解読し、その潜在的臨床有用性をより十分に理解した。大部分のｃｆ－ｍＲＮＡ転写物は、造血起源のものであり得る。健康な被験体および多発性骨髄腫患者の両方において、ｃｆ－ｍＲＮＡには、ＢＭ特異的転写物が濃縮され得る。さらに、ＢＭアブレーションおよび移植を受けているがん患者の縦断的試験は、ｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングが、ＢＭの時間的転写活性を非侵襲的に捕捉し得ることを示した。機構的には、増殖因子治療薬による特異的ＢＭ系列の刺激は、ｃｆ－ｍＲＮＡのゆらぎが、活性な系列特異的転写活性を反映することを指し示す。まとめると、本開示は、ｃｆ－ｍＲＮＡの生物学的起源への洞察を提供し、生細胞がｃｆ－ｍＲＮＡを分泌し得ることを指し示す。
さらに、ｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングは、他の非侵襲的バイオマーカーと比較して、より広範な分子情報を提供することができ、被験体における疾患および薬物応答のモニタリング等のシナリオにおいて組織機能を調べるための非侵襲的アプローチを構成することができる。例えば、メルファラン誘導性アポトーシスは、ｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを有意に増加させなかった。対照的に、ＢＭ再構成中ならびに周知の生存促進性および抗アポトーシス性増殖因子による刺激後に、循環中の転写物の大幅な増加が観察された。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、細胞外ｍＲＮＡレベルおよび組成が、細胞刺激後に変化し得ること、また、生細胞が、小胞中に包埋されたＲＮＡ分子を分泌し得ることを示した。その上、本開示は、循環トランスクリプトームが、経時的な組織機能の一定の測定を可能にする動的な実体であり得ることを実証する。これは、より動的ではなく、組織恒常性に関して限られた情報を提供し得るｃｆＤＮＡメチル化および変異事象とは対照的である。
被験体の健康状況のモニタリング
ｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームは、遺伝情報と、起源組織およびその生理学に関係する情報の両方への直接的なアクセスを提供することができる。例えば、ｃｆ－ｍＲＮＡにおける遺伝的変更は、同種異系移植のモニタリングに関する情報を提供することができ、同様のアプローチは、胎児染色体異常を診断することができる。循環中の腫瘍由来転写物が同定されたと仮定すると、ｃｆ－ｍＲＮＡによって捕捉された遺伝情報は、がん診断およびモニタリングにおいて興味を引くことができる。加えて、ｃｆ－ｍＲＮＡは、起源組織に関係する機能情報を明らかにする組織特異的転写物を提供することができる。ｃｆ－ｍＲＮＡは、健康な被験体およびがん患者の両方におけるＢＭ生理学を明らかにすることができる転写物を捕捉することができる。したがって、ｃｆ－ｍＲＮＡは、組織の機能および遺伝情報を統合することができる。
非侵襲的アプローチの別の側面は、外科的組織取得の必要を排除することにより、非侵襲的アプローチ（ａｐｐｒｏａｃｈｅｄ）は、経時的な患者の病状の反復評価を可能にすることができることであり得る。これは、罹患組織の生検が依然として絶対的基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）であり得る、がん患者における処置のモニタリング等、いくつかの臨床設定において重要であり得る。これに関して、本明細書に記述されている縦断的ｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングデータは、循環転写物が、ＢＭ等の組織における遺伝子発現プロファイルのスナップショットを捕捉することを示すことができる。これは、ＢＭアブレーション効率の非侵襲的時間的描写、移植片生着の早期検出、およびＢＭ再構成のモニタリングを可能にすることができる。例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者において、ｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングは、詳細なＢＭ系列転写活性によるＢＭにおける悪性形質細胞によって生成されたクローナルＩｇ転写物の時間的測定、および新たな免疫プロファイルの確立を統合することができる。ｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングによって明らかにされた包括的な実態像は、ＭＭ患者の血清におけるクローナル抗体検出等、この悪性疾患において一般的に使用される他の非侵襲的検査と比較して、追加的な関連情報を提供することができる。実際に、このような抗体の一般に困難かつ主観的な定量化および特徴付けを考慮すると、ＢＭ生検は依然として、ＭＭ患者の治療管理における慣行である。加えて、抗体検出とは異なり、ｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングは、本明細書に記述されているＡＭＬ患者２における巨核球系列の発生の欠如によって示される通り、最適に満たないＢＭ再構成の早期同定における役割を果たす。
一部の例では、被験体の骨髄の健康状況をモニタリングするための方法およびシステムであって、健康状況を有する被験体から生体試料を得るステップと、第１の複数の遺伝子に対応する被験体の骨髄およびその由来細胞に由来する第１の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップとを含む方法およびシステムが本明細書に開示されている。第１の複数の遺伝子は、表７由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。例えば、表７由来の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０および３７０種の遺伝子を含む遺伝子のパネルのｃｆ－ｍＲＮＡレベルを使用して、被験体のＢＭの健康状況をモニタリングすることができる。さらに、表７由来の最大３７７、３６５、３５５、３４５、３３５、３２５、３１５、３０５、２９５、２８５、２７５、２６５、２５５、２４５、２３５、２２５、２１５、２０５、１９５、１８５、１７５、１６５、１５５、１４５、１３５、１２５、１１５、１０５、９５、８５、７５、６５、５５、４５、３５、２５、１５および５種の遺伝子を含む遺伝子のパネルのｃｆ－ｍＲＮＡレベルを使用して、被験体のＢＭの健康状況をモニタリングすることができる。
加えて、第１の複数の遺伝子は、表９由来の造血細胞に特異的な遺伝子を含むことができる。複数の遺伝子は、ＧＡＴＡ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＴＦ、ＡＶＰ、ＲＵＮＤＣ３Ａ、ＳＯＸ６、ＴＳＰＯ２、ＨＢＺ、ＴＭＣＣ２、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＡＬＡＳ２、ＥＰＢ４２、ＧＹＰＡ、Ｃ１７ｏｒｆ９９、ＨＢＡ２、ＲＨＣＥ、ＨＢＧ２、ＴＲＩＭ１０、ＨＢＡ１、ＨＢＭ、ＨＢＧ１、ＵＣＡ１、ＧＹＰＢ、ＣＴＤ－３１５４Ｎ５．２、およびＡＣ１０４３８９．１等が挙げられるがこれらに限定されない、赤血球特異的遺伝子を含むことができる。複数の遺伝子は、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＧＰ６、ＨＧＤ、ＰＦ４、ＣＬＥＣ１Ｂ、ＣＭＴＭ５、ＧＰ９、ＳＥＬＰ、ＤＮＭ３、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＸＸｂａｃ－ＢＰＧ３２１３．１９、およびＲＰ１１－８７９Ｆ１４．２等が挙げられるがこれらに限定されない、巨核球特異的遺伝子を含むことができる。複数の遺伝子は、表９に収載されているＴ細胞特異的遺伝子を含むことができる。複数の遺伝子は、表９に収載されている好中球特異的遺伝子を含むことができる。複数の遺伝子は、ＣＴＳＧ、ＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ８、ＲＮＡＳＥおよびＰＧＬＹＲＰ１等が挙げられるがこれらに限定されない、前駆体および／または未成熟好中球特異的遺伝子を含むことができる。表９由来の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０および２００種の遺伝子を含む遺伝子のパネルのｃｆ－ｍＲＮＡレベルを使用して、被験体のＢＭの健康状況をモニタリングすることができる。さらに、表９由来の最大２０５、１９５、１８５、１７５、１６５、１５５、１４５、１３５、１２５、１１５、１０５、９５、８５、７５、６５、５５、４５、３５、２５、１５および５種の遺伝子を含む遺伝子のパネルのｃｆ－ｍＲＮＡレベルを使用して、被験体のＢＭの健康状況をモニタリングすることができる。
他の例では、被験体の組織または臓器の健康状況をモニタリングするための方法およびシステムが本明細書に開示されている。本方法は、被験体から生体試料を得るステップと、相応に組織または臓器に由来するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを検出するステップとを含むことができる。組織または臓器由来ｃｆ－ｍＲＮＡは、組織または臓器に特異的な遺伝子に対応することができる。例えば、組織は、皮膚、骨格筋、脂肪組織等であり得る。臓器は、肝臓、膵臓、肺、心臓、脳等であり得る。
状態および／または疾患の状況による被験体の臓器のモニタリング
一部の例では、被験体の骨髄の病状をモニタリングするための方法およびシステムであって、病状を有する被験体から生体試料を得るステップと、第２の複数の遺伝子に対応する、骨髄に常在するまたはこれに起源をもつ複数の細胞に由来する第２の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップとを含む方法およびシステムが本明細書に開示されている。
一部の例では、臓器は、骨髄である。血液試料等の生体試料から検出されるｃｆ－ｍＲＮＡは、特定の状態または疾患を有する骨髄に特異的な遺伝子に対応することができる。一部の例では、状態は、貧血であり得る。貧血は、一般的な血液障害であり得、国立心肺血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ、Ｌｕｎｇ， ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によると、３百万人を超えるアメリカ人が貧血に罹患している。赤血球細胞は、肺の中で酸素に結合し、体中の組織へと酸素を運ぶ、鉄に富んだタンパク質であるヘモグロビンを運ぶことができる。被験体が、十分な赤血球細胞を有しない場合、または被験体の赤血球細胞が、適切に機能しない場合、貧血が起こり得る。血液検査が、男性で１３．５ｇｍ／ｄｌ未満または女性で１２．０ｇｍ／ｄｌ未満のヘモグロビン値を示す場合、貧血と診断され得る。表９由来の赤血球特異的遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルのモニタリングは、末梢血試料中の赤血球の細胞計数の計数よりも一過性かつ動的であり得る。
一部の例では、疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）であり得る。多発性骨髄腫は、リンパ腫および白血病に関係し得る血液がんである。多発性骨髄腫において、形質細胞と呼ばれるある種の白血球細胞は一般に、異常に増える。正常であれば、形質細胞は、感染と戦う抗体を作製することができる。しかし、多発性骨髄腫において、形質細胞は、過度の量のタンパク質（免疫グロブリンと呼ばれる）を被験体の骨および血液中へと放出することができる。免疫グロブリンは、被験体の体中に集積し、臓器損傷を引き起こすことができる。複数の遺伝子は、ＭＭに関連することができ、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＡ１、ＩＧＫＣ、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６、ＩＧＨＶ７、ＩＧＨＶ８、ＩＧＨＶ９、ＩＧＨＶ１０、ＩＧＨＶ１１、ＩＧＨＶ１２、ＩＧＨＶ１３、ＩＧＨＶ１４、ＩＧＨＶ１５、ＩＧＨＶ１６、ＩＧＨＶ１７、ＩＧＨＶ１８、ＩＧＨＶ１９、ＩＧＨＶ２０、ＩＧＨＶ２１、ＩＧＨＶ２２、ＩＧＨＶ２３、ＩＧＨＶ２４、ＩＧＨＶ２５、ＩＧＨＶ２６、ＩＧＨＶ２７、ＩＧＨＶ２８、ＩＧＨＶ２９、ＩＧＨＶ３０、ＩＧＨＶ３１、ＩＧＨＶ３２、ＩＧＨＶ３３、ＩＧＨＶ３４、ＩＧＨＶ３５、ＩＧＨＶ３６、ＩＧＨＶ３７、ＩＧＨＶ３８、ＩＧＨＶ３９、ＩＧＨＶ４０、ＩＧＨＶ４１、ＩＧＨＶ４２、ＩＧＨＶ４３、ＩＧＨＶ４４、ＩＧＨＶ４５、ＩＧＨＶ４６、ＩＧＨＶ４７、ＩＧＨＶ４８、ＩＧＨＶ４９、ＩＧＨＶ５０、ＩＧＨＶ５１、ＩＧＨＶ５２、ＩＧＨＶ５３、ＩＧＨＶ５４、ＩＧＨＶ５５、ＩＧＨＶ５６、ＩＧＨＶ５７、ＩＧＨＶ５８、ＩＧＨＶ５９、ＩＧＨＶ６０、ＩＧＨＶ６１、ＩＧＨＶ６２、ＩＧＨＶ６３、ＩＧＨＶ６４、ＩＧＨＶ６５、ＩＧＨＶ６６、ＩＧＨＶ６７、ＩＧＨＶ６８、ＩＧＨＶ６９、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５、ＩＧＫＶ６、ＩＧＫＶ７、ＩＧＫＶ８、ＩＧＫＶ９、ＩＧＫＶ１０、ＩＧＫＶ１１、ＩＧＫＶ１２、ＩＧＫＶ１３、ＩＧＫＶ１４、ＩＧＫＶ１５、ＩＧＫＶ１６、ＩＧＫＶ１７、ＩＧＫＶ１８、ＩＧＫＶ１９、ＩＧＫＶ２０、ＩＧＫＶ２１、ＩＧＫＶ２２、ＩＧＫＶ２３、ＩＧＫＶ２４、ＩＧＬ１、およびＩＧＬＶ １－４０等が挙げられるがこれらに限定されない。ＭＭに関連するこれらの遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを血液試料から検出することにより、ＭＭ予後をモニタリングするためにＢＭ生検を得る必要が軽減され得る。
さらに、一部の例では、疾患は、リンパ腫、白血病、骨髄増殖性新生物または骨髄異形成症候群であり得る。リンパ腫は、リンパ球と呼ばれる免疫系の感染と戦う細胞において始まり得るがんである。リンパ球は、リンパ節、脾臓、胸腺、骨髄および身体の他の部分の中に存在することができる。リンパ腫を有する場合、リンパ球は変化し、制御不能に成長し得る。リンパ腫に特異的に関連するまたは関係付けられる遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを血液試料から検出することにより、ＢＭ生検を得る必要を取り除くことができる。
白血病は、初期血液形成細胞のがんであり得る。一般に、白血病は、白血球細胞のがんであるが、一部の白血病は、他の血液細胞型において開始することができる。白血病が、急性（急速に成長する）であるか慢性（より低速に成長する）であるか、また、白血病が、骨髄性細胞において開始するかリンパ性細胞において開始するかに基づき分けることができる数種類の白血病が存在する。様々な種類の白血病に特異的に関連するまたは関係付けられる遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを血液試料から検出することにより、ＢＭ生検を得る必要を取り除くことができる。
骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）は、身体が、多過ぎる白血球もしくは赤血球細胞または血小板を作製する場合に起こる血液がんであり得る。骨髄における血液細胞のこのような過剰産生は、血流に問題を生じ、様々な症状をもたらし得る。ＭＰＮに特異的に関連するまたは関係付けられる遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを血液試料から検出することにより、ＢＭ生検を得る必要を取り除くことができる。
さらに、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄中の未成熟血液細胞が成熟できず、したがって、健康な血液細胞にならない、がんの一群である。初期段階では一般に、症状はない。より後の症状は、疲労感、息切れ、易出血または高頻度感染を含むことができる。ＭＤＳに特異的に関連するまたは関係付けられる遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを血液試料から検出することにより、ＢＭ生検を得る必要を取り除くことができる。骨髄線維症は、身体の正常な血液細胞産生を破壊する、珍しい種類の骨髄がんである。骨髄線維症は、骨髄に広範な瘢痕を引き起こし、脱力および疲労を引き起こし得る重篤な貧血をもたらす。骨髄線維症に特異的に関連するまたは関係付けられる遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを血液試料から検出することにより、ＢＭ生検を得る必要を取り除くことができる。真性赤血球増加症は、骨髄が多過ぎる赤血球細胞を作製する、ゆっくり成長する血液がんである。これらの過剰な細胞は、血液を濃くし、その流れを遅くする。これらは、心発作または卒中発作をもたらし得る血餅等の合併症も引き起こす。骨髄線維症に特異的に関連するまたは関係付けられる遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを血液試料から検出することにより、真性赤血球増加症生検を得る必要を取り除くことができる。
加えて、血小板血症は、骨髄が多過ぎる血小板を作製する疾患である。血小板は、血液凝固に役立つ血液細胞断片である。多過ぎる血小板を有することにより、血液が正常に凝固することが困難となる。これは、過度の凝固または不十分な凝固を引き起こし得る。血小板血症に特異的に関連するまたは関係付けられる遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを血液試料から検出することにより、ＢＭ生検を得る必要を取り除くことができる。
さらに、骨髄特異的無細胞ポリヌクレオチドを使用して、骨髄疾患の処置において本明細書に収載されている化合物／治療をモニタリングすることができる。例えば、ある特定の骨髄特異的無細胞ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されているｃｆ－ｍＲＮＡ）を使用して、いかなる侵襲的手順も用いずに、様々な時点でＭＭの処置におけるユビキチンリガーゼ阻害剤（例えば、セレブロンＥ３リガーゼ酵素を特異的に標的とするイベルドミド（ｉｂｅｒｄｏｍｉｄｅ））の有効性を評価（ａｓｓｅｓ）することができる。血液試料を、第１の時点でイベルドミドを受ける前に被験体から採血して、第１の時点で骨髄特異的ｃｆ－ｍＲＮＡを評価（ａｓｓｅｓ）することができる。その後、イベルドミドによる被験体の処置の２日後、斯かる処置の４日後、その８日後、その１６日後、その３０日後、その６０日後、その１２０日後、その４ヶ月後、その６ヶ月後、その１２ヶ月後、その１８ヶ月後、その２４ヶ月後、その３６ヶ月後、その４８ヶ月後等、様々な時点で様々な血液試料を得て、これらの様々な時点それぞれで骨髄特異的ｃｆ－ｍＲＮＡを評価（ａｓｓｅｓ）することができる。本明細書に収載されている処置開始後の異なる長さの日数および／または月数は、限定を意味するものではない。研究者／医療従事者は、異なる化合物、治療、処置されるべき疾患、および他のパラメーターに基づき、異なる時点を選ぶことができる。
一部の例では、肝臓、心臓、中枢神経系等の被験体の臓器の病状をモニタリングするための方法およびシステムが本明細書に開示されている。例えば、被験体が、非アルコール性脂肪性肝疾患の障害（ＮＡＦＬＤ）を患っている場合、これは、医療（ｈｅａｌｔｈｙ ｃａｒｅ）提供者による一定のモニタリングを要求する場合がある。肝臓特異的ｃｆ－ｍＲＮＡを血液試料から検出することは、ＮＡＦＬＤ状態のモニタリングにおける簡便かつ非侵襲的な方法を提供する。様々な肝臓特異的遺伝子に対応する肝臓特異的ｃｆ－ｍＲＮＡは、ＮＡＦＬＤの処置における化合物／治療の有効性のモニタリングに使用することもできる。
被験体の心臓および心血管系に関連する様々な状態および疾患に関して、血液試料由来の心臓特異的ｃｆ－ｍＲＮＡは、いずれかの心血管状態および疾患のモニタリングにおける簡便かつ非侵襲的な方法を提供する。さらに、様々な心臓特異的遺伝子に対応する心臓特異的ｃｆ－ｍＲＮＡは、特異的な心血管状態の処置における化合物／治療の有効性のモニタリングに使用することもできる。
いずれかの中枢神経系（ＣＮＳ）状態または疾患に対して、ＣＮＳ特異的ｃｆ－ｍＲＮＡを使用して、いずれかのＣＮＳ状態および疾患のモニタリングにおける簡便かつ非侵襲的な方法を提供することができる。さらに、様々なＣＮＳ状態および疾患に対応するＣＮＳ特異的ｃｆ－ｍＲＮＡは、特異的な心血管状態の処置における化合物／治療の有効性のモニタリングに使用することができる。
被験体の臓器の処置状況のモニタリング
一部の例では、被験体の臓器の処置状況をモニタリングするための方法およびシステムであって、処置状況を有する被験体から血漿試料を得るステップと、第２の複数の遺伝子に対応する、被験体の臓器に由来する第３の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップとを含む方法およびシステムが本明細書に開示されている。一部の例では、臓器は、骨髄である。一部の例では、骨髄状態または疾患の処置は、骨髄アブレーション、骨髄再構成、骨髄移植、増殖因子による刺激、免疫療法、免疫調節、ユビキチンリガーゼの活性のモジュレーション、または自家もしくは異種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を含む。
骨髄アブレーションは一般に、血液状態および疾患を処置するために骨髄再構成および骨髄移植の前に行われる。骨髄アブレーションは、イオン化照射等の物理的アブレーション；またはメルファラン媒介性骨髄アブレーション、ブスルファン媒介性骨髄アブレーション、トレオスルファン媒介性アブレーション、化学療法媒介性アブレーション等の化学的アブレーション等を含むことができる。本明細書に提供される方法を利用して、骨髄アブレーション手順が成功裏に行われたか否かを、赤血球特異的遺伝子、好中球特異的遺伝子、前駆体好中球特異的遺伝子、Ｔ細胞特異的遺伝子、および／または本来の罹病骨髄がアブレーションされたことを指し示すのに使用することができる他の遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡレベルを血液試料から測定することにより、迅速かつ非侵襲的な様式でモニタリングすることができる。一部の例では、赤血球特異的遺伝子は、表９に収載されているＧＡＴＡ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＴＦ、ＡＶＰ、ＲＵＮＤＣ３Ａ、ＳＯＸ６、ＴＳＰＯ２、ＨＢＺ、ＴＭＣＣ２、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＡＬＡＳ２、ＥＰＢ４２、ＧＹＰＡ、Ｃ１７ｏｒｆ９９、ＨＢＡ２、ＲＨＣＥ、ＨＢＧ２、ＴＲＩＭ１０、ＨＢＡ１、ＨＢＭ、ＨＢＧ１、ＵＣＡ１、ＧＹＰＢ、ＣＴＤ－３１５４Ｎ５．２、およびＡＣ１０４３８９．１を含むがこれらに限定されない群由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、好中球特異的遺伝子は、好中球の縦列に収載されている表９由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、前駆体好中球特異的遺伝子は、表９に収載されているＣＴＳＧ、ＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ８、ＲＮＡＳＥ、およびＰＧＬＹＲＰ１を含むがこれらに限定されない群由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、Ｔ細胞特異的遺伝子は、Ｔ細胞の縦列における表９由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。
骨髄アブレーション後に、骨髄再構成、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）骨髄移植または自家骨髄移植を行って、血液疾患を患う被験体に、免疫応答の調節において赤血球、白血球細胞、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球へと発生し得る健康な造血幹細胞を補充することができる。本明細書に開示されている方法を使用して、異なる細胞型特異的遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡレベルを血液試料からモニタリングして、ＢＭ再構成または移植手順が成功したか否か決定することができる。さらに、ｃｆ－ｍＲＮＡレベルの測定（例えば、反復測定）を使用して、ＢＭ再構成または移植の処置後に被験体の予後をモニタリングすることができる。例えば、赤血球特異的遺伝子、巨核球特異的遺伝子、好中球特異的遺伝子、前駆体好中球特異的遺伝子、Ｔ細胞特異的遺伝子または他の適した細胞型特異的遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡレベルを測定することができる。一部の例では、巨核球特異的遺伝子は、表９に収載されているＩＴＧＡ２Ｂ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＧＰ６、ＨＧＤ、ＰＦ４、ＣＬＥＣ１Ｂ、ＣＭＴＭ５、ＧＰ９、ＳＥＬＰ、ＤＮＭ３、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＸＸｂａｃ－ＢＰＧ３２１３．１９、およびＲＰ１１－８７９Ｆ１４．２を含むがこれらに限定されない遺伝子の群由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、赤血球特異的遺伝子は、表９に収載されているＧＡＴＡ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＴＦ、ＡＶＰ、ＲＵＮＤＣ３Ａ、ＳＯＸ６、ＴＳＰＯ２、ＨＢＺ、ＴＭＣＣ２、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＡＬＡＳ２、ＥＰＢ４２、ＧＹＰＡ、Ｃ１７ｏｒｆ９９、ＨＢＡ２、ＲＨＣＥ、ＨＢＧ２、ＴＲＩＭ１０、ＨＢＡ１、ＨＢＭ、ＨＢＧ１、ＵＣＡ１、ＧＹＰＢ、ＣＴＤ－３１５４Ｎ５．２、およびＡＣ１０４３８９．１を含むがこれらに限定されない群由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、好中球特異的遺伝子は、好中球の縦列に収載されている表９由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、前駆体好中球特異的遺伝子は、表９に収載されているＣＴＳＧ、ＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ８、ＲＮＡＳＥ、およびＰＧＬＹＲＰ１を含むことができるがこれらに限定されない。一部の例では、Ｔ細胞特異的遺伝子は、Ｔ細胞の縦列における表９由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。
免疫療法および免疫調節処置を使用して、被験体の免疫系をブーストして、ＭＭ、白血病、リンパ腫等のがんを処置することができる。免疫療法の種類は、それを必要とする被験体へのモノクローナル抗体、免疫チェックポイント阻害剤の投与、またはがんワクチン接種を含むがこれらに限定されない。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、別の種類の免疫療法であり得る。一般に、自家ＣＡＲ－Ｔ療法のため、Ｔ細胞は、身体から血液を採取して１つまたは複数の血液成分（血漿、血小板または白血球細胞等）を除去することができる手順である、アフェレーシスにより被験体から収集することができる。その後、Ｔ細胞は、研究室または製薬施設へと送ることができ、そこで、Ｔ細胞は、例えば、ＤＮＡを導入することにより、その細胞の表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を産生するように遺伝子操作される。ＣＡＲは、Ｔ細胞に、標的化された腫瘍細胞表面の抗原を認識させることができるタンパク質である。被験体の遺伝子改変されたＴ細胞の数は、研究室で細胞を育成することにより、「増大」させることができる。十分な細胞が存在する場合、これらのＣＡＲ Ｔ細胞を凍結することができる、および／または被験体へと注入することができる。
免疫療法および／または免疫調節処置の際に、赤血球特異的遺伝子、巨核球特異的遺伝子、好中球特異的遺伝子、前駆体好中球特異的遺伝子、Ｔ細胞特異的遺伝子または他の適した細胞型特異的遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡレベルを利用して、処置の有効性をモニタリングすることができる。一過性および／または非侵襲的測定に基づき、様々な用量を用いた様々な種類の免疫療法および／または免疫調節を調整して、被験体における所望の応答を達成することができる。一部の例では、巨核球特異的遺伝子は、表９に収載されているＩＴＧＡ２Ｂ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＧＰ６、ＨＧＤ、ＰＦ４、ＣＬＥＣ１Ｂ、ＣＭＴＭ５、ＧＰ９、ＳＥＬＰ、ＤＮＭ３、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＸＸｂａｃ－ＢＰＧ３２１３．１９、およびＲＰ１１－８７９Ｆ１４．２を含むがこれらに限定されない遺伝子の群由来の１つまたは複数の遺伝子を含む。一部の例では、赤血球特異的遺伝子は、表９に収載されているＧＡＴＡ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＴＦ、ＡＶＰ、ＲＵＮＤＣ３Ａ、ＳＯＸ６、ＴＳＰＯ２、ＨＢＺ、ＴＭＣＣ２、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＡＬＡＳ２、ＥＰＢ４２、ＧＹＰＡ、Ｃ１７ｏｒｆ９９、ＨＢＡ２、ＲＨＣＥ、ＨＢＧ２、ＴＲＩＭ１０、ＨＢＡ１、ＨＢＭ、ＨＢＧ１、ＵＣＡ１、ＧＹＰＢ、ＣＴＤ－３１５４Ｎ５．２、およびＡＣ１０４３８９．１を含むがこれらに限定されない群由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、好中球特異的遺伝子は、好中球の縦列に収載されている表９由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、前駆体好中球特異的遺伝子は、表９に収載されているＣＴＳＧ、ＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ８、ＲＮＡＳＥ、およびＰＧＬＹＲＰ１を含むことができるがこれらに限定されない。一部の例では、Ｔ細胞特異的遺伝子は、Ｔ細胞の縦列における表９由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。
さらに、エリスロポエチン（ＥＰＯ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）等の増殖因子刺激処置のため、赤血球特異的遺伝子、巨核球特異的遺伝子、好中球特異的遺伝子、前駆体好中球特異的遺伝子、Ｔ細胞特異的遺伝子または他の適した細胞型特異的遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡレベルを利用して、処置の有効性をモニタリングすることができる。一過性および／または非侵襲的測定に基づき、増殖因子の様々な用量および／またはレジメン（ｒｅｇｉｍｅ）を使用して、被験体における所望の応答を達成することができる。一部の例では、巨核球特異的遺伝子は、表９に収載されているＩＴＧＡ２Ｂ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＧＰ６、ＨＧＤ、ＰＦ４、ＣＬＥＣ１Ｂ、ＣＭＴＭ５、ＧＰ９、ＳＥＬＰ、ＤＮＭ３、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＸＸｂａｃ－ＢＰＧ３２１３．１９、およびＲＰ１１－８７９Ｆ１４．２を含むがこれらに限定されない遺伝子の群由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、赤血球特異的遺伝子は、表９に収載されているＧＡＴＡ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＴＦ、ＡＶＰ、ＲＵＮＤＣ３Ａ、ＳＯＸ６、ＴＳＰＯ２、ＨＢＺ、ＴＭＣＣ２、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＡＬＡＳ２、ＥＰＢ４２、ＧＹＰＡ、Ｃ１７ｏｒｆ９９、ＨＢＡ２、ＲＨＣＥ、ＨＢＧ２、ＴＲＩＭ１０、ＨＢＡ１、ＨＢＭ、ＨＢＧ１、ＵＣＡ１、ＧＹＰＢ、ＣＴＤ－３１５４Ｎ５．２、およびＡＣ１０４３８９．１を含むがこれらに限定されない群由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、好中球特異的遺伝子は、好中球の縦列に収載されている表９由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。一部の例では、前駆体好中球特異的遺伝子は、表９に収載されているＣＴＳＧ、ＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ８、ＲＮＡＳＥ、およびＰＧＬＹＲＰ１を含むことができるがこれらに限定されない。一部の例では、Ｔ細胞特異的遺伝子は、Ｔ細胞の縦列における表９由来の１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。
単離、定量化および検出
本明細書に開示されている一部の方法は、少なくとも１つの組織特異的ポリヌクレオチドを単離するステップを含む。一部の例では、少なくとも１つの組織特異的ポリヌクレオチドは、無細胞ポリヌクレオチドを含む。一部の例では、無細胞ポリヌクレオチドを単離するステップは、被験体から試料を分画するステップを含むことができる。一部の方法は、試料からインタクトな細胞を除去するステップを含むことができる。例えば、一部の方法は、血液試料を遠心分離し、血清または血漿である上清を収集するステップ、または試料を濾過して、細胞を除去するステップを含むことができる。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドは、被験体から試料を分画することなく解析することができる。例えば、尿、脳脊髄液、または細胞をほとんど含有しないか全く含有しない他の体液は、分画を要求しない場合がある。一部の方法は、無細胞ポリヌクレオチドを検出、定量化および／または解析するために、無細胞ポリヌクレオチドを十分に精製するステップを含むことができる。様々な試薬、方法およびキットを使用して、無細胞ポリヌクレオチドを精製することができる。試薬は、フェノール、界面活性剤、カオトロピック塩、Ｔｒｉｚｏｌ、フェノール－クロロホルム、グリコーゲン、ヨウ化ナトリウムおよびグアニジン樹脂、親和性カラム、脱塩カラムを含むことができるがこれらに限定されない。キットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）血清キット、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキット、ＺＲ血清ＤＮＡキット、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ精製システム、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液Ｍｉｄｉキット、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キットおよびＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキットを含むがこれらに限定されない。
本明細書に開示されている一部の方法は、無細胞ポリヌクレオチドに対して試料を濃縮するステップを含むことができる。例えば、目的の試料は、細菌由来のＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含有する場合がある。一部の方法は、エキソーム（ｅｘｏｍａｌ）捕捉を含み、これにより、望まれない配列を排除または実質的に排除し、目的のポリヌクレオチドに対して試料を濃縮することができる。一部の例では、エキソーム捕捉は、アレイに基づく捕捉または溶液中（ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ）捕捉を含み、それによると、目的のＲＮＡに対応するＤＮＡの断片は、それぞれ表面またはビーズに繋留されている。一部の方法は、試料から、タンパク質または血小板等の他の生体分子または細胞を濾過または除去するステップも含む。一部の例では、無細胞ポリヌクレオチドに対して試料を濃縮するステップは、血漿試料の血液細胞ＲＮＡ混入を防止するステップを含む。一部の例では、ＥＤＴＡを含まないチューブの使用は、血漿および／または血清試料中の血液細胞ＲＮＡの存在を防止または低下させることができる。
一般に、本明細書に開示されている方法は、少なくとも１つの組織特異的ポリヌクレオチドを検出または定量化するステップを含むことができる。一部の例では、少なくとも１つの組織特異的ポリヌクレオチドを定量化および／または検出するステップは、少なくとも１つの組織特異的ポリヌクレオチドを増幅するステップを含むことができる。無細胞ＲＮＡが関与する一部の例では、少なくとも１つの組織特異的ポリヌクレオチドを定量化および／または検出するステップは、無細胞ＲＮＡを逆転写するステップを含むことができる。種々のプロセスのいずれかを用いて、試料におけるマーカーまたは組織特異的ポリヌクレオチドを検出および／または定量化することができる。無細胞、組織特異的ＲＮＡが関与する一部の例では、増幅および／または配列決定等のさらなる操作に先立ち、ＲＮＡを試料から単離し、逆転写してｃＤＮＡを産生することができる。一部の実施形態では、増幅は、３’末端から開始すると共に、試料中の全トランスクリプトームを通してランダムに開始して、ｍＲＮＡおよび非ポリアデニル化転写物の両方の増幅を可能にすることができる。ｃＤＮＡの増幅に適したキットは、例えば、Ｏｖａｔｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡ－Ｓｅｑシステムを含む。組織特異的ＲＮＡは、アレイハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲおよび配列決定等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の技法によって同定および定量化することができる。
本明細書に開示されている核酸を定量化する一部の方法は、少なくとも１つの核酸を測定するステップを含むことができる。測定は、配列決定によって行うことができる。配列決定は、標的化配列決定であり得る。一部の例では、標的化配列決定は、本明細書に開示されている選択マーカーまたは選択組織特異的ポリヌクレオチドを特異的に増幅し、増幅産物を配列決定するステップを含むことができる。一部の例では、標的化配列決定は、本明細書に開示されている選択されたマーカーのサブセットまたは選択組織特異的ポリヌクレオチドのサブセットを特異的に増幅し、増幅産物を配列決定するステップを含むことができる。その代わりに、標的化配列決定を含む一部の方法は、マーカーまたは組織特異的ポリヌクレオチドを増幅するステップを含まない場合がある。一部の方法は、標的化されない配列決定を含むことができる。一部の例では、標的化されない配列決定は、増幅産物を配列決定するステップを含むことができ、無細胞核酸の部分は、マーカーでも組織特異的ポリヌクレオチドでもない。一部の例では、標的化されない配列決定は、被験体由来の試料中の無細胞核酸を増幅し、増幅産物を配列決定するステップを含むことができ、無細胞核酸の部分は、マーカーでも組織特異的ポリヌクレオチドでもない。一部の例では、標的化されない配列決定は、本明細書に記載されているマーカーまたは組織特異的ポリヌクレオチドを含む無細胞核酸を増幅するステップを含むことができる。配列決定は、マーカーまたは組織特異的ポリヌクレオチドの相対的含量に対応する、多数の読み取りデータを提供することができる。一部の例では、配列決定は、マーカーまたは組織特異的ポリヌクレオチドの絶対的含量に対応する、多数の読み取りデータを提供することができる。一部の実施形態では、増幅されたｃＤＮＡは、全トランスクリプトームショットガン配列決定（「ＲＮＡ－Ｓｅｑ」とも称される）によって配列決定することができる。全トランスクリプトームショットガン配列決定（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザープラットフォーム、ＡＢＩ Ｓｏｌｉｄ配列決定プラットフォームまたはＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅの４５４配列決定プラットフォーム等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の次世代配列決定プラットフォームを使用して達成することができる。一部の例では、特異的標的の同定は、ペプチドアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイ等のマイクロアレイによって行うことができ、それによると、アドレス可能な結合エレメントのアレイが、対応する標的に特異的に結合し、結合の程度に比例するシグナルが、試料における標的の含量の決定に使用される。一部の例では、配列決定は、好ましい定量化方法であり得る。一部の例では、配列決定は、アンプリコン干渉を伴わない数千種の遺伝子の並列照合を可能にすることができる。一部の例では、配列決定による定量化は、Ｑ－ＰＣＲによる定量化よりも好ましい場合がある。一部の例では、Ｑ－ＰＣＲによる遺伝子発現の正確な定量化には、非常に多くの対照遺伝子が要求され得るため、Ｑ－ＰＣＲによる定量化は、非効率的となり得る。他の例では、配列決定による配列決定効率および正確な定量化は、解析される（対照）遺伝子の数によって影響されない場合がある。少なくとも前述の理由から、複数の臓器（例えば、心臓、腎臓および肝臓）の健康状況が評価される場合、配列決定は、本明細書に開示されている一部の方法に特に有用となり得る。
本明細書に開示されている核酸を定量化する一部の方法は、定量的ＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）を含むことができる。一部の例では、Ｑ－ＰＣＲは、対応するｃＤＮＡを産生するために、本明細書に記載されている無細胞ＲＮＡの逆転写反応を含むことができる。一部の例では、無細胞ＲＮＡは、マーカー、組織特異的ポリヌクレオチド、およびマーカーでも組織特異的ポリヌクレオチドでもない無細胞ＲＮＡを含むことができる。一部の無細胞ＲＮＡは、本明細書に記載されているマーカー、本明細書に記載されている組織特異的ポリヌクレオチド、および／または本明細書に記載されているマーカーでも組織特異的ポリヌクレオチドでもない無細胞ＲＮＡを含む。一部の例では、Ｑ－ＰＣＲは、マーカー、組織特異的ポリヌクレオチドまたはハウスキーピング遺伝子（例えば、ＡＣＴＢ、ＡＬＢ、ＧＡＰＤＨ等）に対応するｃＤＮＡを、マーカー、組織特異的ポリヌクレオチドまたはハウスキーピング遺伝子に特異的なＰＣＲプライマーと接触させるステップを含むことができる。
本明細書に開示されている一部の方法は、血液細胞特異的ポリヌクレオチドを定量化するステップを含む。本明細書に開示されているＱ－ＰＣＲを含む方法は、ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を、組織特異的ポリヌクレオチドに対応するプライマーと接触させるステップを含むことができる。本明細書に開示されている一部の造血細胞特異的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の細胞型によって優勢に発現されるまたはさらには排他的に発現される核酸であり得る。血液細胞の型は一般に、白血球細胞（白血球とも称される）、赤血球細胞（赤血球とも称される）および血小板としてカテゴリー化することができる。一部の例では、血液細胞特異的ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている組織特異的ポリヌクレオチドおよび疾患マーカーを定量化するステップを含む方法における対照として使用することができる。一部の例では、血液細胞特異的ポリヌクレオチドに対応するプライマーによる増幅産物の非存在を使用して、方法が、血液細胞において発現されるＲＮＡではなく、血液、血漿または血清試料における無細胞ＲＮＡを検出していることを確認することができる。非限定的な例として、血液細胞特異的ポリヌクレオチドは、白血球細胞、血小板または赤血球細胞、およびこれらの組合せにおいて発現されるポリヌクレオチドを含むことができる。白血球細胞は、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、顆粒球、単球およびマクロファージを含むがこれらに限定されない。非限定的な例として、骨髄特異的ポリヌクレオチドは、表７から選択される遺伝子によってコードされ得る。
一部の例では、Ｑ－ＰＣＲは、好ましい定量化方法であり得る。Ｑ－ＰＣＲは、より高感度な方法であり得、したがって、非常に低レベルで存在するＲＮＡをより正確に定量化することができる。一部の例では、Ｑ－ＰＣＲによる定量化は、配列決定による定量化よりも好ましくなり得る。一部の例では、配列決定は、ＲＮＡ試料のより複雑な調製を要求し、正確な定量化を提供するために核酸の枯渇または濃縮を要求し得る。
ポリヌクレオチドの存在および／または含量（相対的または絶対的）、ならびに亜硫酸水素塩処置に起因する配列の変化は、本明細書に開示されているいずれか適した配列検出方法を使用して検出することができる。例は、プローブハイブリダイゼーション、プライマー指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）増幅および配列決定を含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドは、サンガー配列決定、Ｓｏｌｅｘａ－Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定、ライゲーションに基づく配列決定（ＳＯＬｉＤ）、パイロシークエンシング；ストロボ（ｓｔｒｏｂｅ）配列決定（ＳＭＲ）；および半導体アレイ配列決定（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）を含むがこれらに限定されない、いずれか適したローまたはハイスループット配列決定技法またはプラットフォームを使用して配列決定することができる。ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＳｏｌｅｘａ配列決定は、可逆的色素ターミネーターに基づく。ＤＮＡ分子は一般に、スライド上のプライマーに取り付けられ、局所的クローナルコロニーが形成されるように増幅される。その後、一度に１種類のヌクレオチドを添加することができ、取り込まれていないヌクレオチドは洗い流される。その後、蛍光標識されたヌクレオチドの画像を撮影することができ、色素は、ＤＮＡから化学的に除去され、次のサイクルを可能にする。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ技術は、ライゲーションによる配列決定を用いる。この方法は、配列決定された位置に従って標識された、固定された長さのあらゆる可能なオリゴヌクレオチドのプールの使用に基づく。斯かるオリゴヌクレオチドは、アニールおよびライゲーションされる。その後、マッチする配列のためのＤＮＡリガーゼによる優先的ライゲーションは一般に、当該位置におけるヌクレオチドの情報的に価値のあるシグナルをもたらす。ＤＮＡは典型的に、エマルションＰＣＲによって増幅されるため、その結果得られる、それぞれが同じＤＮＡ分子のコピーのみを含有するビーズを、ガラススライド上に沈着させることができ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に匹敵する含量および長さの配列をもたらす。想定される配列決定方法の別の例は、パイロシークエンシング、特に、例えばＲｏｃｈｅ ４５４ゲノムシーケンサーに基づく４５４パイロシークエンシングである。この方法は、油溶液中の水滴の内側でＤＮＡを増幅し、各液滴は、単一プライマーでコーティングされたビーズに取り付けられた単一ＤＮＡ鋳型を含有し、これは次いで、クローナルコロニーを形成する。パイロシークエンシングは、ルシフェラーゼを使用して、新生ＤＮＡに付加された個々のヌクレオチドの検出のための光を生成し、組み合わせたデータを使用して、配列読み出し情報を生成する。さらに別の方法は、ＨｅｌｉｃｏｓのＨｅｌｉｓｃｏｐｅ技術に基づき、それによると、断片は、アレイに繋留されたポリＴオリゴマーによって捕捉される。各配列決定サイクルにおいて、ポリメラーゼおよび単一の蛍光標識されたヌクレオチドが添加され、アレイが撮像される。蛍光タグはその後除去され、サイクルが反復される。適した配列決定技法のさらに別の例は、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポアの使用による配列決定、顕微鏡に基づく配列決定技法、マイクロ流体サンガー配列決定、またはマイクロチップに基づく配列決定方法である。ハイスループット配列決定プラットフォームは、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７個またはそれよりも多く等、単一反応容器における複数の異なる配列決定読み取りデータの生成を可能にすることができる。
無細胞発現プロファイル
本明細書に記載されている複数の差次的に発現された遺伝子を含む無細胞発現プロファイルは、処置（例えば、医薬化合物）の有効性をモニタリングするため、治療のための１つもしくは複数の目的の標的の薬力学を測定するため、薬物の発見および開発におけるリード最適化のための薬力学を測定するため、または治療における臨床開発をモニタリングするための、高感度かつ非侵入的な検査を容易にする。複数の差次的に発現されたタンパク質コード遺伝子を含む無細胞発現プロファイルは多くの場合、個体からの採血によって容易に得られる。本明細書に開示されている無細胞発現プロファイルの使用の利益は、厄介で信頼できない検査によらない、迅速かつ簡便なモニタリングおよび測定を含む。
単一遺伝子の適中率（ｐｒｅｄｉｃａｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）よりも高い適中率に基づき、様々な遺伝子が、無細胞発現プロファイルに含まれるように選択され得る。各選択された遺伝子が、無細胞発現プロファイルの全体的な健康シグネチャーに対して独立した寄与を提供するように、無細胞発現プロファイルにおける選択された遺伝子は一般に、互いに共変動しない。
一部の例では、異なるモニタリングまたは測定機能のための、それぞれが異なる選択された遺伝子の群を含む様々な無細胞発現プロファイルは、互いと独立に変動する。各無細胞発現プロファイルは、本明細書に開示されている少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、３００および４００種の異なる遺伝子を含むことができる。選択された遺伝子の特定の群を含む一部の無細胞発現プロファイルを使用して、開発中の薬物候補が、処置するように設計された疾患の処置において有効であるか否か検出することができる。
コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実行するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図１１は、試料におけるＡＭＨを測定するようにプログラムまたは他の仕方で構成されたコンピュータシステム２０１を示す。コンピュータシステム２０１は、例えば、生体試料におけるｃｆ－ｍＲＮＡの抽出および検出等、本開示の方法の様々な態様を調節することができる。コンピュータシステム２０１は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに対して遠隔に位置するコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。
コンピュータシステム２０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサーまたは並列処理のための複数のプロセッサーであり得る中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書において同様に「プロセッサー」および「コンピュータプロセッサー」）２０５を含む。コンピュータシステム２０１は、メモリまたはメモリ位置２１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置２１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース２２０（例えば、ネットワークアダプタ）、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子表示アダプター等の周辺デバイス２２５も含む。メモリ２１０、記憶装置２１５、インターフェース２２０および周辺デバイス２２５は、マザーボードのように、通信バス（実線）を介してＣＰＵ２０５と通信している。記憶装置２１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム２０１は、通信インターフェース２２０の助けを借りて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）２３０に操作可能にカップルされ得る。ネットワーク２３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク２３０は、一部の例では、遠隔通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク２３０は、クラウドコンピューティング等の分散型コンピューティングを可能にすることができる、１つまたは複数のコンピュータサーバーを含むことができる。ネットワーク２３０は、一部の例では、コンピュータシステム２０１の助けを借りて、コンピュータシステム２０１にカップルされたデバイスがクライアントまたはサーバーとして振る舞うことを可能にすることができる、ピアツーピアネットワークを実行することができる。
ＣＰＵ２０５は、プログラムまたはソフトウェアにおいて具体化され得る、機械可読命令のシーケンスを遂行することができる。命令は、メモリ２１０等のメモリ位置において記憶され得る。命令は、ＣＰＵ２０５へと向けることができ、これはその後、本開示の方法を実行するようにＣＰＵ２０５をプログラムまたは他の仕方で構成することができる。ＣＰＵ２０５によって行われる演算の例は、フェッチ、デコード、遂行およびライトバックを含むことができる。
ＣＰＵ２０５は、集積回路等の回路の一部であり得る。システム２０１の１つまたは複数の他の構成成分は、回路に含まれ得る。一部の例では、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
記憶装置２１５は、ドライバ、ライブラリおよび保存されたプログラム等、ファイルを記憶することができる。記憶装置２１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザー優先度およびユーザープログラムを記憶することができる。コンピュータシステム２０１は、一部の例では、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム２０１と通信しているリモートサーバーに位置する等、コンピュータシステム２０１の外部にある、１つまたは複数の追加的なデータ記憶装置を含むことができる。
コンピュータシステム２０１は、ネットワーク２３０を介して１つまたは複数の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム２０１は、ユーザーの遠隔コンピュータシステムと通信することができる。遠隔コンピュータシステムの例は、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントを含む。ユーザーは、ネットワーク２３０経由でコンピュータシステム２０１にアクセスすることができる。
本明細書に記載されている方法は、例えば、メモリ２１０または電子記憶装置２１５に等、コンピュータシステム２０１の電子記憶位置に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサー）実行可能コードとして実行することができる。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用の際に、コードは、プロセッサー２０５によって遂行され得る。一部の例では、コードは、プロセッサー２０５による迅速なアクセスのため、記憶装置２１５から検索され、メモリ２１０に記憶され得る。一部の状況では、電子記憶装置２１５が妨害される場合があり、機械実行可能命令は、メモリ２１０に記憶される。
コードは、コードを遂行するように適応されたプロセッサーを有する機械による使用のために、事前にコンパイルおよび構成され得る、またはランタイム中にコンパイルされ得る。コードは、事前にコンパイルまたはアズコンパイル（ａｓ－ｃｏｍｐｉｌｅｄ）された様式でのコードの遂行を可能にするように選択することができる、プログラミング言語で供給され得る。
コンピュータシステム１１０１等、本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。本技術の様々な態様は、典型的に、ある型の機械可読媒体において搬送されるまたは具体化される機械（またはプロセッサー）実行可能コードおよび／または関連データの形態の、「製品」または「製造品」であると考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク等の電子記憶装置において記憶され得る。「記憶」型の媒体は、ソフトウェアプログラミングのために非一時的記憶を常に提供することができる、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ等、コンピュータ、プロセッサーその他の有形メモリ、またはそれらの関連モジュールのうちいずれかまたは全てを含むことができる。ソフトウェアの全てまたは一部は、時に、インターネットまたは様々な他の遠隔通信ネットワークを介して通信することができる。斯かる通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサーへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にすることができる。よって、ソフトウェアエレメントを有することができる別の型の媒体は、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを越えて、有線および光ランドラインネットワークを介して、様々なエアリンク（ａｉｒ－ｌｉｎｋ）にわたって使用されるもの等、光学波、電波および電磁波を含む。有線または無線リンク、光リンク等、斯かる波を搬送する物理的エレメントもまた、ソフトウェアを有する媒体として考慮され得る。本明細書で使用される場合、非一時的、有形「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」等の用語は、遂行のためのプロセッサーへの命令の提供に関与するいずれかの媒体を指す。
したがって、コンピュータ－実行可能コード等の機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない、多くの形態をとることができる。不揮発性記憶媒体は、例えば、いずれかのコンピュータ（複数可）その他における記憶デバイスのいずれか等、光または磁気ディスクを含み、例えば、図面に示すデータベース等の実行に使用することができる。揮発性記憶媒体は、斯かるコンピュータプラットフォームのメインメモリ等、ダイナミックメモリを含む。有形伝送媒体は、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤを含む、同軸ケーブル；銅線および光ファイバを含む。搬送波伝送媒体は、高周波（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるもの等、電気もしくは電磁シグナルまたは音波または光波の形態をとることができる。コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、したがって、例えば：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他のいずれかの磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、他のいずれかの光媒体、パンチカード、紙テープ、孔のパターンによる他のいずれかの物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、他のいずれかのメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を輸送する搬送波、斯かる搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取ることができる他のいずれかの媒体を含む。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、遂行のためのプロセッサーへの１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスの搬送に関与し得る。
コンピュータシステム２０１は、例えば、生体試料における本明細書に開示されているｃｆ－ｍＲＮＡレベルの測定を提供するための、ユーザーインターフェース（ＵＩ）２４０を含む電子表示２３５を含むまたはこれと通信することができる。ＵＩの例は、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェースを限定することなく含む。
本開示の方法およびシステムは、１つまたは複数のアルゴリズムとして実行することができる。アルゴリズムは、中央処理装置１１０５による遂行によるソフトウェアとして実行することができる。アルゴリズムは、例えば、生体試料における本明細書に開示されているｃｆ－ｍＲＮＡのレベルを決定することができる。
分類子
本開示は、生体試料から生成されたデータを処理または解析して出力を得るための分類子を提供する。斯かる出力は、処置の前および後の被験体の臓器または組織のモニタリングに関する、被験体のｃｆ－ｍＲＮＡプロファイルの評価をもたらすことができる。
分類子は、機械学習アルゴリズムであり得る。機械学習アルゴリズムは、訓練された機械学習アルゴリズムであり得る。機械学習アルゴリズムは、例えば、教師ありまたは教師なし学習により訓練することができる。例えば、機械学習アルゴリズムは、発生モデリング（例えば、目標変数Ｙにおける観察可能な変数Ｘにおける同時確率分布の統計モデル；例えば、ナイーブベイズ分類子および線形判別解析）、弁別モデリング（例えば、観察可能な変数Ｘの観察ｘを仮定した、目標変数Ｙの条件付き確率のモデル；例えば、ロジスティック回帰、パーセプトロンまたはサポートベクターマシン）または強化学習（ＲＬ）を含むことができる。
本明細書で使用される場合、用語「機械学習」、「機械学習手順」、「機械学習演算」および「機械学習アルゴリズム」は、タスクのコンピュータ性能を漸進的に（例えば、反復的に）改善し得る、いずれかのシステムまたは解析的および／もしくは統計的手順を一般に指す。機械学習は、機械学習アルゴリズムを含むことができる。機械学習アルゴリズムは、訓練されたアルゴリズムであり得る。機械学習（ＭＬ）は、１つまたは複数の教師あり、半教師付きまたは教師なし機械学習技法を含むことができる。例えば、ＭＬアルゴリズムは、教師あり学習により訓練することができる訓練されたアルゴリズムであり得る（例えば、様々なパラメーターは、重みまたはスケーリング因子として決定される）。ＭＬは、回帰解析、正則化、分類、次元削減、アンサンブル学習、メタ学習、相関ルール学習、クラスター解析、異常検知、深層学習または超深層学習のうち１つまたは複数を含むことができる。ＭＬは、ｋ－平均法、ｋ－平均法クラスタリング、ｋ－最近傍、学習ベクトル量子化、線形回帰、非線形回帰、最小二乗回帰、部分最小二乗回帰、ロジスティック回帰、段階的回帰、多変量適応回帰スプライン、リッジ回帰、主成分回帰、ラッソ回帰、最小角回帰、正準相関解析、因子解析、独立成分解析、線形判別解析、多次元スケーリング、非負値行列因子分解、主成分解析、主座標解析、射影追跡、サモンマッピング、ｔ－分布確率的隣接埋め込み（ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）、アダブースティング（ＡｄａＢｏｏｓｔｉｎｇ）、ブースティング、勾配ブースティング、ブートストラップアグリゲーション（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、アンサンブル平均化、決定木、条件付き決定木、ブースト決定木、勾配ブースト決定木、ランダムフォレスト、積層一般化、ベイジアンネットワーク、ベイジアン信念ネットワーク、ナイーブベイズ、ガウスナイーブベイズ、多項ナイーブベイズ、隠れマルコフモデル、階層隠れマルコフモデル、サポートベクターマシン、エンコーダー、デコーダー、オートエンコーダー、積層オートエンコーダー、パーセプトロン、多層パーセプトロン、人工ニューラルネットワーク、フィードフォワードニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、再帰型ニューラルネットワーク、長・短期記憶、深層信念ネットワーク、深層ボルツマン機械、深層畳み込みニューラルネットワーク、深層再帰型ニューラルネットワーク、または敵対的生成ネットワークを含むことができるがこれらに限定されない場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「強化学習」、「強化学習手順」、「強化学習演算」および「強化学習アルゴリズム」は、それと環境との相互作用に対する累積的報酬のいくつかの概念を増強または最大化するための１つまたは複数の動作をとることができる、いずれかのシステムまたは計算手順を一般に指す。強化学習（ＲＬ）手順を行うエージェントは、環境において１つまたは複数の動作をとること、したがって、様々な新たな状況に自身および環境を置くことに対して、「即時報酬」と呼ばれる正のまたは負の強化を受けることができる。
エージェントの目標は、累積的報酬のいくつかの概念を増強または最大化することであり得る。例えば、エージェントの目標は、「割引された報酬関数」または「平均報酬関数」を増強または最大化することであり得る。「Ｑ－関数」は、状況および当該状況下でとられる動作から入手できる最大累積的報酬を表すことができる。「価値関数」および「一般化利点推定量（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）」は、動作の最適または最良の選択を仮定した状況から入手できる最大累積的報酬を表すことができる。ＲＬは、累積的報酬の斯かる概念のうちいずれか１つまたは複数を利用することができる。本明細書で使用される場合、いずれか斯かる関数は、「累積的報酬関数」と称することができる。したがって、最良または最適な累積的報酬関数のコンピュータ処理は、エージェントのための最良または最適なポリシーの発見に等しい可能性がある。
エージェントおよびそれと環境との相互作用は、例えば、１つまたは複数のマルコフ決定プロセス（ＭＤＰ）として定式化することができる。ＲＬ手順は、ＭＤＰの正確な数理モデルの知識を仮定しなくてよい。ＭＤＰは、エージェントにとって完全に未知、部分的に公知または完全に公知であり得る。ＲＬ手順は、ＭＤＰの予備知識に対する「モデルに基づく」または「モデルなし」の２つの限度の間のスペクトラムに存することができる。したがって、ＲＬ手順は、正確な方法が、ＭＤＰの未知のまたは確率的な性質のために実行不可能または利用不可能となり得る、大きいＭＤＰを標的とすることができる。
ＲＬ手順は、本明細書に記載されている１つまたは複数のコンピュータプロセッサーを使用して実行することができる。デジタル処理装置は、累積的報酬を増強または最大化するための「ポリシー」を訓練し、記憶し、後に展開するエージェントを利用することができる。可能な限りまたは望まれる限りの長さとなり得る期間、ポリシーを求める（例えば、探索する）ことができる。斯かる最適化問題は、最適ポリシーの近似値を記憶することにより、累積的報酬関数の近似値を記憶することにより、またはその両方により解決することができる。一部の例では、ＲＬ手順は、斯かる関数に関する近似値の１つまたは複数の表を記憶することができる。他の例では、ＲＬ手順は、１つまたは複数の「関数アプロキシメーター（ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｏｒ）」を利用することができる。
関数アプロキシメーターの例は、ニューラルネットワーク（深層ニューラルネットワーク等）および確率論的グラフィカルモデル（例えば、ボルツマン機械、ヘルムホルツ機械およびホップフィールドネットワーク）を含むことができる。関数アプロキシメーターは、累積的報酬関数の近似値のパラメーター化を作成することができる。そのパラメーター化に対する関数アプロキシメーターの最適化は、累積的報酬を増強または最大化する、したがってポリシーを増強または最適化する（ポリシー勾配方法において等）方向でのパラメーターの摂動からなることができる、またはベルマンの最適性基準を満たすことへとより近づくよう関数アプロキシメーターを摂動することによることができる（時間差方法において等）。
訓練の際に、エージェントは、環境において動作をとって、環境に関する、および生存またはより良い有用性のためのポリシーの良いまたは最良の選択に関するさらなる情報を得ることができる。エージェントの動作は、ランダムに生成され得る（例えば、特に、訓練の初期ステージにおいて）、または別の機械学習パラダイム（教師あり学習、模倣学習または本明細書に記載されている他のいずれかの機械学習手順等）によって規定され得る。エージェントの動作は、増強されたまたは最適なポリシーがいずれであるかに関するエージェントの知覚により近い動作を選択することにより精緻化され得る。様々な訓練戦略は、探査および開拓の間の選択に対するポリシーをオフにした（ｏｆｆ－ｐｏｌｉｃｙ）およびポリシーをオンにした（ｏｎ－ｐｏｌｉｃｙ）方法の２つの限度の間のスペクトラムに存することができる。
訓練されたアルゴリズムは、複数の入力変数を受け取るように、また、複数の入力変数に基づき１つまたは複数の出力値を生じるように構成され得る。複数の入力変数は、特異的遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡ転写物の存在または存在量を含むことができ、この遺伝子は、臓器または組織特異的である。複数の入力変数は、被験体の臨床健康データを含むこともできる。１つまたは複数の出力値は、被験体の状況または状態を含むことができる。例えば、被験体の状況または状態は、次のうち１つまたは複数を含むことができる：骨髄アブレーション、骨髄再構成または骨髄移植の成功の評価。さらに、被験体の状況または状態は、骨髄移植片拒絶、臓器ドナーおよびレシピエントマッチング、肝臓移植、肝臓移植片拒絶、肺移植、肺移植片拒絶、心臓移植、心臓移植片拒絶、顔面移植、顔面移植片拒絶等を含むことができる。
１つまたは複数の出力値のそれぞれが、分類子により被験体の状況または状態の分類を指し示す、固定された数の可能な値（例えば、線形分類子、ロジスティック回帰分類子等）のうち１つを含むように、訓練されたアルゴリズムは、分類子を含むことができる。１つまたは複数の出力値のそれぞれが、被験体の状況または状態の分類を指し示す、２つの値（例えば、｛０，１｝、｛陽性，陰性｝、｛存在，非存在｝または｛高リスク，低リスク｝）のうち１つを含むように、訓練されたアルゴリズムは、バイナリ分類子を含むことができる。１つまたは複数の出力値のそれぞれが、被験体の状況または状態の分類を指し示す、３つ以上の値（例えば、｛０，１，２｝、｛陽性，陰性，不確定｝、｛存在，非存在，または不確定｝または｛高リスク，中リスク，低リスク｝）のうち１つを含むように、訓練されたアルゴリズムは、別の型の分類子であり得る。
出力値は、記述的標識、数値、またはこれらの組合せを含むことができる。出力値の一部は、記述的標識を含むことができる。斯かる記述的標識は、被験体の状況または状態の同定または指標を提供することができ、例えば、陽性、陰性、存在、非存在、高リスク、中リスク、低リスクまたは不確定を含むことができる。斯かる記述的標識は、被験体の状況または状態のための処置の同定を提供することができ、例えば、被験体の状況または状態の処置に適した治療介入、治療介入の持続時間および／または治療介入の投薬量を含むことができる。斯かる記述的標識は、被験体に行うことが適切となり得る二次臨床検査の同定を提供することができ、例えば、血液検査、遺伝子検査または医療用イメージングを含むことができる。別の例として、斯かる記述的標識は、被験体の状況または状態の予後を提供することができる。別の例として、斯かる記述的標識は、被験体の状況または状態の相対的評価を提供することができる。一部の記述的標識は、例えば、「陽性」を１に、「陰性」を０にマッピングすることにより、数値にマッピングすることができる。
出力値の一部は、バイナリ、整数または連続値等の数値を含むことができる。斯かるバイナリ出力値は、例えば、｛０，１｝、｛陽性，陰性｝、｛存在，非存在｝または｛高リスク，低リスク｝を含むことができる。斯かる整数出力値は、例えば、｛０，１，２｝を含むことができる。斯かる連続出力値は、例えば、少なくとも０かつ１以下の確率値を含むことができる。斯かる連続出力値は、例えば、少なくとも０の非正規化確率値を含むことができる。斯かる連続出力値は、被験体の状況または状態の予後を指し示すことができる。一部の数値は、例えば、１を「陽性」または「存在」に、０を「陰性」または「非存在」にマッピングすることにより、記述的標識にマッピングすることができる。
出力値の一部を、１つまたは複数のカットオフ値に基づき割り当てることができる。例えば、被験体が、少なくとも５０％の、状況または状態を有する確率を有する場合、被験体のバイナリ分類は、「陽性」、「存在」または１の出力値を割り当てることができる。例えば、被験体が、５０％未満の、状況または状態を有する確率を有する場合、被験体のバイナリ分類は、「陰性」、「非存在」または０の出力値を割り当てることができる。この場合、５０％の単一カットオフ値を使用して、被験体を２つの可能なバイナリ出力値のうち１つへと分類する。単一カットオフ値の例は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、および約９９％を含むことができる。
別の例として、被験体が、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも多くの、状況または状態を有する確率を有する場合、被験体の分類は、「陽性」、「存在」または１の出力値を割り当てることができる。被験体が、約５０％より多く、約５５％より多く、約６０％より多く、約６５％より多く、約７０％より多く、約７５％より多く、約８０％より多く、約８５％より多く、約９０％より多く、約９１％より多く、約９２％より多く、約９３％より多く、約９４％より多く、約９５％より多く、約９６％より多く、約９７％より多く、約９８％より多く、または約９９％より多くの、状況または状態を有する確率を有する場合、被験体の分類は、「陽性」または１の出力値を割り当てることができる。
被験体が、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の、状況または状態を有する確率を有する場合、被験体の分類は、「陰性」、非存在または０の出力値を割り当てることができる。被験体が、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下の、状況または状態の確率を有する場合、被験体の分類は、「陰性」または０の出力値を割り当てることができる。
被験体が、「陽性」、「陰性」、「存在」、「非存在」、１または０として分類されない場合、被験体の分類は、「不確定」または２の出力値を割り当てることができる。この場合、２つのカットオフ値のセットを使用して、被験体を３つの可能な出力値のうち１つへと分類する。カットオフ値のセットの例は、｛１％、９９％｝、｛２％、９８％｝、｛５％、９５％｝、｛１０％、９０％｝、｛１５％、８５％｝、｛２０％、８０％｝、｛２５％、７５％｝、｛３０％、７０％｝、｛３５％、６５％｝、｛４０％、６０％｝、および｛４５％、５５％｝を含むことができる。同様に、ｎ個のカットオフ値のセットを使用して、被験体をｎ＋１個の可能な出力値のうち１つへと分類することができ、ｎは、任意の正の整数である。
訓練されたアルゴリズムは、複数の独立した訓練試料により訓練することができる。独立した訓練試料のそれぞれは、被験体に対応する入力変数（例えば、所与の時点で被験体から収集された、臓器／組織特異的である遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡ転写物のうち少なくとも１つの存在または存在量）、および１つまたは複数の公知出力値（例えば、状況または状態）のデータセットを含むことができる。独立した訓練試料は、複数の異なる被験体から得られるまたはこれに由来する入力変数および関連出力値のデータセットを含むことができる。独立した訓練試料は、複数の異なる時点で同じ被験体から得られる（例えば、毎週、隔週または毎月等、定期的に）入力変数および関連出力値のデータセットを含むことができる。独立した訓練試料は、状況または状態の存在に関連することができる（例えば、状況または状態を有することが分かっている複数の被験体から得られるまたはこれに由来する入力変数および関連出力値のデータセットを含む訓練試料）。独立した訓練試料は、状況または状態の非存在に関連することができる（例えば、状況もしくは状態と以前に診断されたことがないことが分かっている複数の被験体、または状況もしくは状態に関して陰性検査結果を受けた複数の被験体から得られるまたはこれに由来する入力変数および関連出力値のデータセットを含む訓練試料）。複数の訓練されたアルゴリズムのそれぞれが、独立した訓練試料の異なるセット（例えば、異なる状況または状態の存在または非存在に対応する独立した訓練試料のセット）を使用して訓練されるように、複数の異なる訓練されたアルゴリズムを訓練することができる。
訓練されたアルゴリズムは、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４５０個、または少なくとも約５００個の独立した訓練試料により訓練することができる。独立した訓練試料は、状況もしくは状態の存在に関連する入力変数のデータセット、および／または状況もしくは状態の非存在に関連する入力変数のデータセットを含むことができる。訓練されたアルゴリズムは、約５００個以下、約４５０個以下、約４００個以下、約３５０個以下、約３００個以下、約２５０個以下、約２００個以下、約１５０個以下、約１００個以下、または約５０個以下の、状況または状態の存在に関連する独立した訓練試料により訓練することができる。一部の実施形態では、入力変数のデータセットは、訓練されたアルゴリズムの訓練に使用される試料から独立している。
訓練されたアルゴリズムは、第１の数の、状況または状態の存在に関連する独立した訓練試料、および第２の数の、状況または状態の非存在に関連する独立した訓練試料により訓練することができる。状況または状態の存在に関連する独立した訓練試料の第１の数は、状況または状態の非存在に関連する独立した訓練試料の第２の数以下であり得る。状況または状態の存在に関連する独立した訓練試料の第１の数は、状況または状態の非存在に関連する独立した訓練試料の第２の数に等しい可能性がある。状況または状態の存在に関連する独立した訓練試料の第１の数は、状況または状態の非存在に関連する独立した訓練試料の第２の数よりも大きい可能性がある。
機械学習アルゴリズムは、生殖障害を有する女性等、同定または診断された状態を有する被験体由来の試料の訓練セットにより訓練することができる。機械学習アルゴリズムは、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００個またはそれよりも多い試料により訓練することができる。訓練後に、機械学習アルゴリズムを使用して、訓練セット由来の試料から独立している１つまたは複数の試料から作成されたデータを処理して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも高い正確度で、１つまたは複数の試料における１つまたは複数の特色を同定することができる（例えば、ｃｆ－ｍＲＮＡ転写物レベル、遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡ転写物の存在量または欠乏）。機械学習アルゴリズムを使用して、データを処理して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも高い感度で、１つまたは複数の特色を同定することができる。機械学習アルゴリズムを使用して、データを処理して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも高い特異度で、１つまたは複数の特色を同定することができる。
訓練されたアルゴリズムは、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４５０個、または少なくとも約５００個の独立した訓練試料に関して、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも多くの正確度で、本明細書に開示されている状況または状態を同定するように構成することができる。訓練されたアルゴリズムによって状況または状態を同定する正確度は、状況または状態を有するまたは有しないと正確に同定または分類された、独立した検査試料（例えば、状況もしくは状態を有することが分かっている被験体、または状況もしくは状態に関して陰性臨床検査結果を有する被験体）のパーセンテージとして計算することができる。
訓練されたアルゴリズムは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも多くの陽性適中率（ＰＰＶ）により、状況または状態を同定するように構成することができる。訓練されたアルゴリズムを使用して状況または状態を同定するＰＰＶは、状況または状態を真に有する被験体に対応する、状況または状態を有すると同定または分類された入力変数のデータセットのパーセンテージとして計算することができる。
訓練されたアルゴリズムは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれよりも多くの陰性適中率（ＮＰＶ）により、状況または状態を同定するように構成することができる。訓練されたアルゴリズムを使用して状況または状態を同定するＮＰＶは、状況または状態を真に有しない被験体に対応する、状況または状態を有しないと同定または分類された入力変数のデータセットのパーセンテージとして計算することができる。
訓練されたアルゴリズムは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、またはそれよりも多くの臨床感度により、状況または状態を同定するように構成することができる。訓練されたアルゴリズムを使用して状況または状態を同定する臨床感度は、状況または状態を有すると正確に同定または分類された、状況または状態の存在に関連する独立した検査試料（例えば、状況または状態を有することが分かっている被験体）のパーセンテージとして計算することができる。
訓練されたアルゴリズムは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、またはそれよりも多くの臨床特異度により、状況または状態を同定するように構成することができる。訓練されたアルゴリズムを使用して状況または状態を同定する臨床特異度は、状況または状態を有しないと正確に同定または分類された、状況または状態の非存在に関連する独立した検査試料（例えば、状況または状態に関して陰性臨床検査結果を有する被験体）のパーセンテージとして計算することができる。
訓練されたアルゴリズムは、少なくとも約０．５０、少なくとも約０．５５、少なくとも約０．６０、少なくとも約０．６５、少なくとも約０．７０、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８０、少なくとも約０．８１、少なくとも約０．８２、少なくとも約０．８３、少なくとも約０．８４、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．８６、少なくとも約０．８７、少なくとも約０．８８、少なくとも約０．８９、少なくとも約０．９０、少なくとも約０．９１、少なくとも約０．９２、少なくとも約０．９３、少なくとも約０．９４、少なくとも約０．９５、少なくとも約０．９６、少なくとも約０．９７、少なくとも約０．９８、少なくとも約０．９９、またはそれよりも多くの受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）により、状況または状態を同定するように構成することができる。ＡＵＲＯＣは、状況または状態を有するまたは有しないとしての入力変数のデータセットの分類における、訓練されたアルゴリズムに関連する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の積分（例えば、ＲＯＣ曲線下面積）として計算することができる。
訓練されたアルゴリズムは、状況または状態を同定する性能、正確度、ＰＰＶ、ＮＰＶ、臨床感度、臨床特異度またはＡＵＲＯＣのうち１つまたは複数を改善するように調整または整調（ｔｕｎｅ）することができる。訓練されたアルゴリズムは、訓練されたアルゴリズムのパラメーター（例えば、本明細書の他の箇所に記載されている入力変数のデータセットの分類に使用されるカットオフ値のセット、またはニューラルネットワークのパラメーターもしくは重み）を調整することにより、調整または整調することができる。訓練されたアルゴリズムは、訓練プロセス中に、または訓練プロセスが完了した後に、継続的に調整または整調することができる。
訓練されたアルゴリズムが最初に訓練された後に、入力のサブセットは、高品質分類を為すために含まれることが最も影響力があるまたは最も重要であると同定することができる。例えば、（例えば、入力変数の）複数の特色のサブセットは、状況または状態の高品質分類または同定を為すために含まれることが最も影響力があるまたは最も重要であると同定することができる。複数の特色またはそのサブセットは、状況または状態の高品質分類または同定を為すことに向かう各特色の影響または重要性を指し示す分類測定基準に基づきランク付けすることができる。斯かる測定基準を使用して、一部の例では有意に、所望の性能レベル（例えば、所望の最小正確度、ＰＰＶ、ＮＰＶ、臨床感度、臨床特異度、ＡＵＲＯＣ、またはこれらの組合せに基づく）まで、訓練されたアルゴリズムの訓練に使用することができる入力変数（例えば、予測変数）の数を低下させることができる。例えば、訓練されたアルゴリズム中の、数十または数百個を含む複数の入力変数により訓練されたアルゴリズムを訓練することが、９９％を超える分類正確度をもたらす場合、その代わりに、この複数のうち約５個以下、約１０個以下、約１５個以下、約２０個以下、約２５個以下、約３０個以下、約３５個以下、約４０個以下、約４５個以下、約５０個以下、または約１００個以下の斯かる最も影響力があるまたは最も重要である入力変数の選択されたサブセットのみによる訓練されたアルゴリズムの訓練は、減少しているが依然として許容できる分類正確度（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）を生じることができる。サブセットは、複数の入力変数全体を序列付けし、最良の分類測定基準により所定の数（例えば、約５以下、約１０以下、約１５以下、約２０以下、約２５以下、約３０以下、約３５以下、約４０以下、約４５以下、約５０以下、または約１００以下）の入力変数を選択することにより選択することができる。
治療標的
疾患関連の生体分子（例えば、骨髄疾患関連の生物学的マーカー）の検出または定量化は、前臨床治療標的発見に使用することができる。疾患関連の生体分子の検出または定量化は、標的関与の前臨床測定に使用することができる。疾患関連の生体分子の検出または定量化は、治療／薬物の発見および開発のために、目的の標的の追跡、検出および測定に使用することができる。
疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ（例えば、骨髄疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ）の検出または定量化は、前臨床および臨床試験における患者層別化のために、遺伝子シグネチャーの決定およびバイオマーカー発見に使用することができる。
疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ（例えば、骨髄疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ）の検出または定量化は、さらなる臨床開発のために、後期リード分子最適化の最適化に使用することができる。疾患関連の無細胞ｍＲＮＡの検出または定量化は、治療／薬物の発見および開発におけるリード最適化および臨床開発のために、薬力学の測定に使用することができる。さらに、疾患関連の無細胞ｍＲＮＡの検出または定量化は、薬物動態（ＰＫ）ならびに安全性および／または毒性の評価に使用することができる。疾患関連の無細胞ｍＲＮＡの検出または定量化は、治療／薬物の発見および開発のために、特異的標的の関与に関連する薬力学的効果を特徴付ける遺伝子発現のプロファイルの作成に使用することができる。疾患関連の無細胞ｍＲＮＡの検出または定量化は、治療／薬物の発見および開発のために、薬力学的標的関与の変化の検出に使用することができる。
疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ（例えば、骨髄疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ）の検出または定量化は、疾患を処置するための医薬品候補の初期臨床開発における標的分子関与の測定に使用することができる。疾患関連の無細胞ｍＲＮＡの検出または定量化は、治験薬申請のための候補を選択する方法において使用することができる。疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ（例えば、骨髄疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ）の検出または定量化は、設定期間にわたる周期的な時点における標的分子関与の測定に使用することができる。時点は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間ごともしくはそれより短い期間ごとのもの、または任意の他の好適な期間ごとのものであり得る。時点は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間ごともしくはそれより長い期間ごとのもの、または任意の他の好適な期間ごとのものであり得る。設定期間は、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２年、３年、４年、５年、または１０年未満またはこれに等しい可能性がある。設定期間は、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２年、３年、４年、５年、または１０年を超えるまたはこれに等しい可能性がある。
疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ（例えば、骨髄疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ）の検出または定量化は、被験体に投与された治療剤の相対的治療有効性を評価するためのエンドポイントの開発に使用することができる。
無細胞ｍＲＮＡ疾患シグネチャー（例えば、無細胞ｍＲＮＡ骨髄疾患シグネチャー）の開発は、候補治療剤の相対的毒性または治療剤に対する被験体の応答の評価に使用することができる。例えば、第１の疾患のために第１の処方を受けている被験体は次に、本明細書に開示されている骨髄疾患関連の無細胞ｍＲＮＡ遺伝子パネルをモニタリングすることにより、投与された第１の処方内の医薬品と、候補治療薬との間の毒性相互作用に関して密接に追跡され得る。
（実施例１ 異なる患者コホート）
自家骨髄移植に適格な多発性骨髄腫患者は、Ｓｃｒｉｐｐｓ骨髄移植センターから募集した。非分泌型疾患または形質細胞白血病を有する患者を除外した。総計３名の患者を登録し、細胞減少性前処置レジメンおよびその後の病院滞在を通して、毎日の採血を収集した。高用量メルファランを使用して、２日間の前処置レジメンにわたり骨髄をアブレーションし、続いて造血幹細胞を移植した。退院日に逐次の毎日収集を中断した。６０～９０日の間に経過観察骨髄生検を行った。試験の一部として全血球計数（ＣＢＣ）を収集した。血漿を血液収集の２時間以内に処理し、貯蔵した。患者の特徴は、表１に記載されている。
表１：多発性骨髄腫患者の特徴
Figure 2022513399000002
エリスロポエチン（ＥＰＯ）処置された患者は、ルーチン医療の一部としてエリスロポエチンを投与されたのであれば、試験登録のために募集した。１）現在、任意の抗がん療法中である；２）任意の原因により活性溶血を有した、または３）妊娠中であった場合、潜在的な患者を除外した。患者は同意し、ＳｃｒｉｐｐｓクリニックがんセンターのＲｅｎａｌ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎｉｃｓから登録された。標準臨床ケアに従って、１ヶ月当たり単一用量のエリスロポエチンを投与した。０日目（ＥＰＯの投与前）ならびにＥＰＯの投与後１、４および１０日目に、血液を収集した。４日目および１０日目収集は、＋／－１日調整を許容して、患者のスケジュールに対応した。患者のサブセットは、最大３０日目まで血液収集を可能にする拡大プロトコールに同意した。ＣＢＣも同様に行った。無細胞ヘモグロビンタンパク質（ＡＲＵＰ研究室）およびアルブミンレベル（ＡＲＵＰ研究室）を各時点で決定した。血漿を血液収集の２時間以内に処理し、バッチ処理のために－８０℃で貯蔵した。患者の特徴を表２に示す。
表２： ＥＰＯ患者の特徴
Figure 2022513399000003
Figure 2022513399000004
 ＰＤ－腹膜透析
健康な対照。Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ血液バンクから健康な対照由来の全血を得た。血漿／血清を血液収集の２時間以内に処理し、バッチ処理のために－８０℃で凍結および貯蔵した。
Ｇ－ＣＳＦコホート。同種移植のために末梢捕集幹細胞の供与の用意がある正常で健康な個体を、Ｓｃｒｉｐｐｓから募集し、Ｇ－ＣＳＦコホートの一部として登録した。総計で３名の患者が同意し、自身の幹細胞動員中に血液を供与した。０日目（Ｇ－ＣＳＦの投与前）ならびにＧ－ＣＳＦの投与後１、４および１０日目に、２本のチューブの血液を収集した。４日目および１０日目収集は、＋／－１日調整を許容して、患者のスケジュールに対応し、その上、１０日目収集は必要に応じたものとなった。幹細胞の末梢捕集は、白血球アフェレーシスによって４日目に行った。試料毎にＣＢＣを行った。血漿を血液収集の２時間以内に処理し、バッチ処理のために－８０℃で貯蔵した。患者の特徴を表３に示す。
表３： Ｇ－ＣＳＦ患者の特徴
Figure 2022513399000005
ＡＭＬコホート。標準ケアの一部として部分的骨髄破壊的（ｓｕｂｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）処置および同種異系幹細胞移植の準備中の、既知の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者を、自身の処置および幹細胞移植を通した毎日の採血のために募集した。試験において３名の患者を登録し（表４における特徴）、部分的骨髄破壊的処置は一般に６日間であり、フルダラビンおよびメルファランの組合せを使用して、移植に先立ち、骨髄の部分的アブレーションを得た。単一ドナーから得た造血幹細胞を０日目に投与し、病院滞在を通して毎日の採血を続けた。院内収集は、移植後４５日目に限定した。経過観察ルーチン骨髄生検を行った。標準ケアの一部としてＣＢＣを収集し、データを試験に含めた。血漿を血液収集の２時間以内に処理し、バッチ処理のために貯蔵した。ＡＭＬ患者のうち２名をほぼ８週間モニタリングした一方、第３の患者の血液試料は、患者が病院から退院した移植１５日後まで収集した。
表４： ＡＭＬ患者の特徴
Figure 2022513399000006
 ＊びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫
＊＊ＢＭ生検は、患者２における巨核球発生の欠如を明らかにした
全試験は、それぞれの施設内ＩＲＢによって承認され、患者は、提出された試験プロトコールに従って同意した。承認は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＩＲＢプロトコール＃２０１６２７４８による血液収集および研究のために維持され、それに従って、健康な対照試料を収集した。ＳｃｒｉｐｐｓがんセンターおよびＳｃｒｉｐｐｓ Ｇｒｅｅｎ ＨｏｓｐｉｔａｌのＢｌｏｏｄ ＆ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍと共同で、Ｓｃｒｉｐｐｓ施設内審査委員会承認プロトコールＩＲＢ－１６－６８０８に従って、Ｇ－ＣＳＦおよびＥＰＯ試験を行った。多発性骨髄腫および急性骨髄性白血病の両方のための造血骨髄移植が関与する試験は、同グループと共同で、Ｓｃｒｉｐｐｓ ＩＲＢプロトコールＩＲＢ－１７－６９５３によって承認され、これに従って行われた。
（実施例２ 試料処理）
血液試料は、血漿処理のためにＥＤＴＡチューブ（ＢＤ＃３６６６４３）に、または血清処理のためにＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ｒｅｄ－ｔｏｐ ｃｌｏｔｔｉｎｇチューブ（ＢＤ＃３６７８２０）に収集した。各実験に使用された生体液は、本実施例における対応するコホート詳細と共に本明細書に指し示す。血液試料を室温で維持し、採血後２時間以内に試料を処理した。５００μｌ～１ｍｌに及ぶ血漿および血清体積を抽出のために使用した。試料は先ず、１９００ｇで１０分間遠心分離した。血漿および血清を新たなチューブへと分離した。細胞デブリを除去するために、血清／血漿をその後、１６０００ｇで遠心分離した。がん患者血漿試料（多発性骨髄腫およびＡＭＬ）のため、２回目の遠心分離ステップを６０００ｇで行った。血漿／血清試料を－８０℃で直ちに凍結および貯蔵した。凍結／融解サイクルは回避した。血液試料の最初の遠心分離後に白血球細胞が濃縮されたバフィーコート層を単離することにより、バフィーコート試料を得た。循環核酸キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、血漿／血清から核酸を単離した。抽出プロセスにおいて、外因的スパイクイン対照として、製造業者の使用説明書（Ａｍｂｉｏｎ）に従ってＥＲＣＣ ＲＮＡスパイクイン（Ｓｐｉｋｅ－Ｉｎ）ミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．＃４４５６７４０）を添加した。製造業者の使用説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ ＬＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、全血およびバフィーコート試料由来の核酸を抽出した。その後、ＲＮＡおよびｃｆ－ＲＮＡ試料を３μｌの阻害剤抵抗性ｒＤＮａｓｅ（Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に２５分間インキュベートして、いかなる残存ＤＮＡも排除し、その後濃縮した。１５μｌのＲＮａｓｅフリーの水にＲＮＡを溶出した。ｃｆＲＮＡの量、サイズおよび完全性は、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏチップにおいて１μｌの試料を泳動することにより推定し、Ｂ－アクチンｑＰＣＲにより確認した。ランダムヘキサマーを使用して、ｃｆ－ＲＮＡ溶出液の２５～３０％をｃＤＮＡに変換し、ＮＧＳライブラリを作製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定のためにエキソーム捕捉を行った。Ｋａｐａ定量化キット（Ｋａｐａ）によるｑＰＣＲによって、また、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ ＯＮＥ ｄｓＤＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用したＱｕａｎｔｉｆｌｕｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｑｕａｎｔｕｓ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）において、ライブラリを定量化し、高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてライブラリサイズをチェックした。試料をプールし、製造業者の使用説明書に従ってＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プラットフォームにおいて配列決定した。
（実施例３ 配列データ処理、アライメントおよびトランスクリプトーム定量化）
ＦＡＳＴＱ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎアプリケーションを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢａｓｅＳｐａｃｅプラットフォームにおいてベースコーリング（Ｂａｓｅ－ｃａｌｌｉｎｇ）を行った。ｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ１．１１）を使用して、アダプター配列を除去し、低品質塩基をトリミングした。１５塩基対よりも短い読み取りデータは、その後の解析から除外した。次に、ＧＥＮＣＯＤＥバージョン２４遺伝子モデルによるＳＴＡＲ（ｖ２．５．２ｂ）を使用して、読み取りデータ配列をヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３８へとアライメントする。重複した読み取りデータは、ｓａｍｔｏｏｌｓ（ｖ１．３．１）ｒｍｄｕｐコマンドを起動することにより除去する。ＲＳＥＭ（ｖ１．３．０）を使用して、重複排除されたＢＡＭファイルから遺伝子発現レベルを推測した。
（実施例４ 差次的発現解析）
ＤＥＳｅｑ２（ｖ１．１２．４）を使用して、異なる状態の間の差次的発現解析を行った。ＲＳＥＭ推定読み取りデータ計数は、ＤＥＳｅｑ２のための入力として使用する。試料にわたって２０個よりも少ない読み取りデータを有する遺伝子は、この解析から除外する。Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｌｉｍｍａ（ｖ３．２８．２１）を使用して、差次的に発現された遺伝子の潜在的ジーンオントロジー濃縮について調べた。
（実施例５ 組織／細胞型特異的遺伝子）
組織（細胞型）特異的遺伝子は、他の組織（細胞型）と比較して、特定の組織（細胞型）においてはるかに高い発現を示す遺伝子として定義される。組織（細胞型）トランスクリプトーム発現レベルに関する情報は、次の２つの公開データベースから得た：５１種のヒト組織にわたる遺伝子発現に関するＧＴＥｘ（ｗｗｗ．ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／）、および５６種のヒト造血細胞型にわたる遺伝子発現に関するＢｌｕｅｐｒｉｎｔ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ（ｗｗｗ．ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ－ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ．ｅｕ／）。遺伝子毎に、その当該の特定の遺伝子の発現によって組織（細胞型）をランク付けし、上位組織（細胞型）における発現が、他の全組織（細胞型）よりも＞２０倍高い場合、この遺伝子は、この上位組織（細胞型）に特異的であるとみなした。ＢＭ濃縮転写物の確立のため、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからヒトＢＭ ＲＮＡを購入し、ＲＮＡ－ｓｅｑを行った。その後、ＢＭトランスクリプトームを、全血トランスクリプトームと比較して、ＢＭおよびＷＢトランスクリプトームにおいて濃縮された遺伝子を同定した（倍数変化＞５）。
（実施例６ 多発性骨髄腫患者における免疫グロブリン遺伝子レパートリー）
クローン型アセンブリのため、Ｔｒｉｎｉｔｙを使用して、ｄｅ ｎｏｖｏトランスクリプトームアセンブリを行った。次に、ｉｇＢＬＡＳＴ（ｖ２．５．１）を使用して、アセンブルされたコンティグを、免疫グロブリン遺伝子アノテーションデータベースＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）と比較して、Ｖ（Ｄ）Ｊ組合せを同定した。可変領域遺伝子の相対的存在量を定量化するために、ＳＴＡＲによってヒト参照ゲノムにアライメントされなかった、またはアノテートされたＩｇ遺伝子にアライメントされたのいずれかであった読み取りデータを収集し、ｉｇＢＬＡＳＴを使用して、ＩＭＧＴデータベースにおいて配列をマッピングした。特定のＩｇ遺伝子にマッピングされた読み取りデータの数の、任意のＩｇ遺伝子にマッピングされた読み取りデータの総数に対する比として、相対的存在量を計算した。
（実施例７ 多発性骨髄腫およびＡＭＬ試料の教師なしクラスタリング）
次の２つの基準を満たした遺伝子をクラスタリングのために選択した：１）５０ＴＰＭ（百万個当たりの転写物）よりも高い、時点にわたる最大発現、および２）最高発現の最低発現に対する比が５を超えた。選択された遺伝子のそれぞれについて、全時点にわたる最大値で各値を割ることにより、発現値を正規化した。この正規化の目的は、全遺伝子を比較できる尺度に移し、その絶対的発現レベルの代わりに、時点にわたるその相対的変化に着目することであった。次に、Ｋ－平均法および階層クラスタリングを行って、同様の時間的発現パターンを共有する遺伝子を見出した。
（実施例８）
非負値行列因子分解（ＮＭＦ）によるデータの分解
その発現が、全試料において２０ＴＰＭよりも低かった遺伝子を、分解解析から除外した。残っている遺伝子のそれぞれについて、全試料にわたる最大値で各値を割ることにより、発現値を正規化した。この正規化ステップの目的は、全遺伝子を比較できる尺度に移すことである。次に、正規化された値においてＮＭＦを行って、遺伝子を８～１２個の成分へと分解した。ｓｃｉｋｉ－ｌｅａｒｎ Ｐｙｔｈｏｎライブラリにおいて「ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．ＮＭＦ」クラスを起動することにより、ＮＭＦ分解を実行した。ＮＭＦ分解は、教師なし様式で、同様の発現パターン（試料にわたり相関）を共有する遺伝子（成分）の群を作成し、これにより、データ内の根底にある構造を明らかにする。発見された成分をより良くアノテートするために、特定の成分において濃縮された遺伝子（すなわち、成分内で最高負荷を有する遺伝子）を選択し、１）ＧＴＥｘにおける５１種のヒト組織にわたるその発現レベル；２）Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ由来の５５種のヒト造血細胞型にわたるその発現レベル；および３）そのジーンオントロジー機能濃縮について調べた。これらの遺伝子の大部分が、ある特定の細胞型（例えば、血小板）において高い発現を示した場合、またはある特定の生物学的過程（例えば、「血小板活性化」および「凝固」）において濃縮された場合、それに従って成分を指定した（例えば、これを「巨核球成分」と呼ぶ）。これらの３つの情報源を統合することにより、大部分の成分について組織／細胞型起源を確認することができた。
（実施例９ ｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームは、造血前駆体転写物が濃縮されている）
ヒト無細胞ＲＮＡトランスクリプトームのランドスケープを特徴付けるために、２４名の健康なドナーの１ｍｌの血清由来のｃｆ－ｍＲＮＡを単離し、配列決定した。このコホートのうち、試料の少なくとも８０％において、＞１ＴＰＭ（百万個当たりの転写物）を有する１０，３５７個の転写物および＞５ＴＰＭを有する７，３８６個の転写物を同定し、健康な被験体の間でのｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームの多様性および一貫性を反映した。
表５：健康なドナー（ｎ＝２４）のｃｆ－ｍＲＮＡにおいて検出された転写物の平均数
Figure 2022513399000007
 表６：配列決定測定基準の概要
Figure 2022513399000008
Figure 2022513399000009
 ＊ＴＰＭは、２を超えるまたはこれに等しい。Ａ１およびＡ２は、反復物を表示する。ＰＣＣ：ピアソン相関係数
非負値行列因子分解を使用して、教師なし様式でｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームを分解し、遺伝子発現参照データベース（ＧＴＥｘおよびＢｌｕｅｐｒｉｎｔ）を使用して、異なる組織および細胞型の相対的寄与を推定した（材料と方法を参照）。ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて検出された転写物の大部分、平均でほぼ８５％は、造血起源のものであり（すなわち、循環細胞およびＢＭに存在する細胞に由来する）、残りのほぼ１５％は、非造血起源のものである（すなわち、固形組織に由来する、図１Ａ）。特に、デコンボリューション解析は、転写物の平均でほぼ２９％が巨核球／血小板起源のものであり（第１～第３の四分位数範囲２３～３６％）、ほぼ２８％がリンパ球起源のものであり（範囲１８～３０％）、１２．８％が顆粒球起源のものであり（範囲６～１６％）、３％が好中球前駆体起源のものであり（範囲０．２～３．７％）、１１％が赤血球起源のものであり（範囲８～１４％）、ほぼ１５％が固形組織に由来する（範囲１１～２０％）ことを推定した（図１Ａ）。これらの転写物の起源への洞察を得るために、以前に報告されたＲＮＡ－Ｓｅｑデータ由来の１９名の健康な個体由来の全血試料において、同様のデコンボリューション解析を行った。予想通りに、全血トランスクリプトームは、リンパ球（平均でほぼ６９％）および顆粒球（平均でほぼ２２％）転写物で大部分が構成され、赤血球起源の転写物の追加的なほぼ７％、ならびに他の細胞型および組織からの少ない寄与を伴う（図１Ａ）。これらの解析は、異なる因子によって影響され得る、これらの生体液のトランスクリプトームの組成の推定を表す。にもかかわらず、データは、全血と比較して、より大きい分率の非造血転写物およびＢＭに由来する造血前駆体遺伝子を含有するｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームのより高い多様性を示す。
循環中のＢＭ特異的転写物の存在を確認するために、健康なドナー由来の３種のペアになった全血（血液の全細胞成分を含む）および血漿試料においてＲＮＡ－Ｓｅｑを行い（図６Ａ）、これらの検体における主要な造血細胞型特異的転写物（すなわち、好中球、赤血球、血小板／巨核球、Ｔ細胞）のレベルを比較した（図１Ｂ、図６Ｂ～図６Ｃ）。好中球特異的転写物の間で著しい差が観察された（図１Ｂ）。造血トランスクリプトーム参照データベース（Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ）を使用すると、成熟循環好中球において発現された転写物は、全血と比較して血漿においてはるかにより低いレベルで検出された（図１Ｂ）。対照的に、ＢＭに存在する好中球前駆体において発現された転写物は、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて高度に濃縮されていた（図１Ｂ）。これらの知見を確認するために、５種のペアになった血漿およびバフィーコート試料（バフィーコートは、白血球細胞が濃縮されている）のＲＮＡ－Ｓｅｑを行った。上記と一致することには、好中球成熟および前駆体転写物は、別個の集団を形成することが見出され（図１Ｃ）、それによると、ｃｆ－ｍＲＮＡは、バフィーコートと比較して、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２等の低レベルの成熟転写物を示す（図１Ｄ、ｐ＜０．０１）が、ＰＲＴＮ３（ミエロブラスチン先駆体）、ＣＴＳＧ（カテプシンＧ）およびＡＺＵ１（アズロシジン先駆体）等の前駆体転写物が濃縮されている（ｐ＜０．０５、図１Ｅ、図６Ｄおよび図６Ｅ）。これらのデータは、ｃｆ－ｍＲＮＡにおけるＢＭ転写物の存在を支持する；実際に、健康なドナー由来の造血転写物の二次計画法デコンボリューション解析は、ＢＭ転写物が、全血におけるほぼ１％とは対照的に、ｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームのほぼ９％に寄与することを指し示した。
この結果をさらに確認するため、ヒトＢＭ試料におけるＲＮＡ－ｓｅｑを行って、これを全血トランスクリプトームと比較した。下の表７に収載されている通り、ＢＭトランスクリプトームにおいて濃縮された３７７種の遺伝子（＞５倍、「ＢＭ遺伝子」）を同定し、これらは造血前駆体（すなわち、ＢＭ由来の好中球前駆体および間葉系幹細胞）を表す。ＰＲＴＮ３、ＣＴＳＧおよびＡＺＵ１等の前駆体転写物は、ＢＭトランスクリプトームにおいて濃縮された上位転写物の中に入る。加えて、全血において濃縮された３７４種の遺伝子が同定され（＞５倍、「ＷＢ遺伝子」）（表８）、予想通り、成熟循環血液細胞遺伝子を表す（すなわち、成熟顆粒球およびリンパ球に関連）。その後、３種のマッチする全血および血漿試料において、「ＢＭ遺伝子」および「ＷＢ遺伝子」のレベルを比較し、これにより、これらの転写物が２つの集団へと別れることが確認され（ｐ＜０．００１）、ｃｆ－ｍＲＮＡは、全血と比較して、造血前駆体遺伝子（「ＢＭ遺伝子」）が濃縮され、成熟遺伝子（「ＷＢ遺伝子」）が「枯渇」される（図１Ｆおよび図６Ｆ）。要約すると、データは、ｃｆ－ｍＲＮＡトランスクリプトームが、ＢＭに由来する転写物を捕捉したことを指し示し、ＢＭ機能を非侵襲的に評価するためのウィンドウを提供する。
表７：全血と比較した骨髄濃縮遺伝子のリスト
Figure 2022513399000010
Figure 2022513399000011
Figure 2022513399000012
Figure 2022513399000013
 表８：骨髄と比較して全血において濃縮された遺伝子のリスト
Figure 2022513399000014
Figure 2022513399000015
Figure 2022513399000016
（実施例１０ 多発性骨髄腫患者におけるｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングによる骨髄特異的転写物の非侵襲的測定）
ＢＭ特異的転写物が、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて検出され得ることのさらなる証明として、また、その潜在的な有用性を評価するために、３名の多発性骨髄腫（ＭＭ）患者を募集した。ＭＭは、ほとんど排他的にＢＭにおける、悪性形質細胞のクローナル増大および蓄積によって特徴付けられる。このような細胞は、複数のＩｇ組合せを発現する健康な個体の形質細胞とは対照的に、特異的な免疫グロブリン（Ｉｇ）再編成を発現する。ＭＭ患者は、メルファラン媒介性ＢＭアブレーションを受け（－２日目に開始）、続いて、自家造血幹細胞（ＨＳＣ）注入を受けた（０日目）（図２Ｂ）。ＢＭアブレーション前（－２日目）のこれらの患者の１ｍｌの血漿由来のＣｆ－ｍＲＮＡを単離し、配列決定した。Ｉｇ重（ＩｇＨ）およびＩｇ軽（ＩｇＬ）鎖転写物のクローナル増大が、３名の患者のうち２名で同定された。例えば、患者２において、最も優勢なＩｇ定常領域としてＩＧＨＧ１およびＩＧＫＣ転写物（図７Ａ～図７Ｃ）が検出された。可変領域に関して、Ｉｇｈｖ３－１５およびＩｇｋｖ２－２４転写物が、試料のトランスクリプトームで優位を占めたが、クローナルラムダ領域は検出されなかった（図２Ａ、図２Ｃおよび図７Ｃ）。対照的に、クローナル転写物は、予想通り、健康な個体の血漿において観察されなかった（図２Ａ）。患者１における同様の解析は、ＩｇＨ定常鎖ＩＧＨＡ１および可変領域ＩＧＨＶ１－６９、ならびにＩｇＬラムダ鎖ＩＧＬ１および可変領域ＩＧＬＶ１－４０で構成されたクローンを明らかにした（図７Ｄ）。どちらの場合でも、悪性クローンは、ＢＭ吸引液から行われた分子検査と一致した（表１）。しかし、患者３に関して、おそらく、本試験の開始時のこの患者のＢＭにおける少ない数の形質細胞が原因で（表１）、優位なＩｇ再編成は検出されなかった（図７Ｅ）。悪性形質細胞は、ＭＭ患者における循環中に稀に見出される；実際に、化学療法処置前の患者２試料のマッチするバフィーコートのＲＮＡ－Ｓｅｑ解析は、低レベルのＩｇＨおよびＩｇＬ転写物のレパートリーのみを示し、優位な再編成はなく（図２Ａ、図２Ｃおよび図７Ａ～図７Ｃ）、ＢＭにおける形質細胞によって生成されたクローナルＩｇ転写物を捕捉するｃｆ－ｍＲＮＡの特有の能力を強調する。
表１０：血漿におけるＭＭ患者２のＢＭアブレーションおよび再構成の際の血漿中のＩｇ転写物のレベル（ＴＰＭ）－カッパー軽鎖可変遺伝子
Figure 2022513399000017
 表１１：血漿におけるＭＭ患者２のＢＭアブレーションおよび再構成の際の血漿中のＩｇ転写物のレベル（ＴＰＭ）－重鎖可変遺伝子
Figure 2022513399000018
 表１２：血漿におけるＭＭ患者２のＢＭアブレーションおよび再構成の際の血漿中のＩｇ転写物のレベル（ＴＰＭ）－重鎖および軽鎖定常遺伝子
Figure 2022513399000019
 表１３：血漿におけるＭＭ患者２のＢＭアブレーションおよび再構成の際の血漿中のＩｇ転写物のレベル（ＴＰＭ）－ラムダ軽鎖可変遺伝子
Figure 2022513399000020
 表１４：バフィーコートにおけるＭＭ患者２のＢＭアブレーションおよび再構成の際の血漿中のＩｇ転写物のレベル（ＴＰＭ）－重鎖および軽鎖定常遺伝子
Figure 2022513399000021
 表１５：バフィーコートにおけるＭＭ患者２のＢＭアブレーションおよび再構成の際の血漿中のＩｇ転写物のレベル（ＴＰＭ）－重鎖可変遺伝子
Figure 2022513399000022
 表１６：バフィーコートにおけるＭＭ患者２のＢＭアブレーションおよび再構成の際の血漿中のＩｇ転写物のレベル（ＴＰＭ）－ラムダ軽鎖可変遺伝子
Figure 2022513399000023
 表１７：バフィーコートにおけるＭＭ患者２のＢＭアブレーションおよび再構成の際の血漿中のＩｇ転写物のレベル（ＴＰＭ）－カッパー軽鎖可変遺伝子
Figure 2022513399000024
ｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングを使用して、悪性Ｉｇクローンのレベルをモニタリングすることができるか検査するために、化学療法および移植後に２週間毎日、これらの患者の血漿由来のｃｆ－ｍＲＮＡを配列決定した。患者１は、治療後に悪性クローンの明らかな低下を示さなかったが（図７Ｄ）、患者２は、形質細胞のメルファラン誘導性アポトーシス後にｃｆ－ｍＲＮＡにおける優勢Ｉｇバリアントの減少したレベルを示した（図２Ｂ～図２Ｄおよび図７Ａ～図７Ｃ）。１０日目までに、免疫プロファイルは、もはやクローナルＩｇ組合せによって優位を占めておらず、治療およびＢＭ再構成の成功を指し示す（図２Ｂ～図２Ｄ）。対照的に、試験を通したマッチするバフィーコート画分において行われたＲＮＡ－Ｓｅｑは、悪性Ｉｇ転写物に関する非常に限られた情報を示し（図２Ｃおよび図７Ａ～図７Ｅ）、ＢＭ活性を非侵襲的に捕捉するｃｆ－ｍＲＮＡの潜在力を支持する。
（実施例１１ ｃｆ－ｍＲＮＡは、ＢＭアブレーションおよび再構成の際の造血系列転写活性を捕捉する）
ＢＭ転写活性を明らかにする循環ｍＲＮＡの能力へのさらなる洞察を得るために、プロトタイプＭＭ患者２を使用して、ＢＭアブレーションおよび再構成動力学を、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて自家移植後に追跡した。その上、部分的骨髄破壊的処置とそれに続いて同種異系移植を受けた急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者を調査した（実施例を参照、ＡＭＬ患者１および２は、８週間モニタリングし、患者３は、移植２週間後に退院した）。ＭＭおよびＡＭＬ患者の血漿ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて検出された転写物の教師なしクラスタリングは、遺伝子のいくつかの群の発現の時間的パターンを同定した（図３Ａ、図３Ｂ）。ジーンオントロジー濃縮解析およびＢｌｕｅｐｒｉｎｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ由来のＲＮＡ－ｓｅｑデータの両方が、同定された成分の多くが、特異的造血系列に対応することを指し示した（図３Ａ、図３Ｂ）。したがって、ＢＭアブレーションおよび再構成の際の循環中で、表９に収載されている造血系列特異的転写物（すなわち、赤血球、巨核球および好中球）の動力学を詳細に調べた。
表９：指し示される造血系列特異的転写物のリスト
Figure 2022513399000025
先ず、赤血球循環転写物およびＲＢＣの間の関係性を明らかにするために、血漿における赤血球系列特異的転写物のレベルを調べ、試験を通してＲＢＣ計数を試験した。ＲＢＣは、循環中の優勢細胞型であり、血流中でほぼ１２０日間安定している２１。実際に、これらの試験の持続時間中のＭＭおよびＡＭＬ患者において、ＲＢＣ数の非常にわずかな変動が認められた（図３Ｃ～図３Ｄ、図８Ａ）。対照的に、ｃｆ－ｍＲＮＡにおける赤血球特異的転写物は、全患者で化学療法媒介性ＢＭアブレーション後に急速に低下し、ＢＭ再構成におけるより後の時点で回復した（図３Ｃ～図３Ｄ、図９Ａ～図９Ｂ、図８Ａ）。ＲＢＣ数およびｃｆ－ｍＲＮＡにおける赤血球転写物の間の劇的な相違は、これらの転写物が、循環成熟ＲＢＣから派生しないことを指し示す。したがって、赤血球転写物は、ＢＭ中または循環中（網状赤血球）のいずれかの未成熟赤血球形態から派生する。ＭＭ患者２のペアになったバフィーコート試料のＲＮＡ－Ｓｅｑ解析を行って、これらの転写物の起源へのさらなる洞察を得た。ＣＣにおける赤血球特異的遺伝子のレベルは、化学療法後に低下しており、これは、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて観察された動力学に似ており（図９Ｃ）、網状赤血球が、全血における大部分の赤血球転写物の供給源であったことを指し示す。しかし、赤血球発生の肝要な転写調節因子であるＧＡＴＡ１等の転写物は、ＢＭ再構成において、バフィーコートよりも早く、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて明らかに検出可能であり（図９Ｃ）、それらのＢＭ起源を示唆する。結論として、データは、高度に豊富な成熟ＲＢＣ由来ではなく、ＢＭに存在する未成熟赤血球細胞および循環網状赤血球に由来する赤血球転写物を示した。
ＣＢＣおよび循環中の系列特異的転写物の間の相違が、他の造血細胞型へと拡大するか検査するために、血小板計数および巨核球特異的転写物の動力学を比較した。ＭＭ患者２において、１２～１３日目までに起こる血小板計数回復に先立ち、移植後９～１０日目までにｃｆ－ｍＲＮＡにおいて巨核球特異的転写物のレベルの劇的な増加が検出された（図３Ｅ）。マッチしたバフィーコート試料由来のＲＮＡ－Ｓｅｑは、ＣＣにおける巨核球転写物レベルが、試験を通して血小板計数の動力学を模倣することを示し（図９Ｃ）、また、ｃｆ－ｍＲＮＡとは異なり、ＢＭ再構成の際のＣＣにおいて巨核球転写物の初期回復は検出不能であった。この相違は、ＢＭ再構成の際にｃｆ－ｍＲＮＡにおいて検出された巨核球転写物は、ＣＣに由来しておらず、ＢＭに由来したことを示唆する。この観察を支持して、ＡＭＬ患者１において、循環中の巨核球転写物は、ＢＭアブレーション後に減少し、９日目までに回復し、１２～１３日目までに起こる血小板計数の増加の前兆になる（図３Ｆ）。際だったことに、この系列の回復は、ＡＭＬ患者２のｃｆ－ｍＲＮＡにおいて起こらなかった（図８Ｂ）。経過観察ＢＭ生検は、この患者における巨核球発生の欠如を確認し（表１）、測定された巨核球シグナルの特異度を示す。よって、データは、ｃｆ－ｍＲＮＡが、その再構成の際のＢＭにおける巨核球転写活性を反映したことを指し示した。
最後に、治療の際にＭＭおよびＡＭＬ患者の循環中の好中球計数および特異的転写物の動態学を調べた。ＭＭ患者２において、好中球計数は、２回のスパイクを示し、１回目は移植の直後に起こり、これはおそらくＧ－ＣＳＦ処置が原因であり、その後に、ＢＭアブレーションが原因で急速な減少が生じ、１２日目までに第２のスパイクが起こり、ＢＭ再構成を指し示す（図３Ｇ）。これは、この手順の際のｃｆ－ｍＲＮＡおよびバフィーコートにおける好中球特異的遺伝子の全体的動力学に似ていた（図３Ｇ、図９Ｅ）。しかし、バフィーコートおよびｃｆ－ｍＲＮＡにおける好中球転写物は、ＢＭ再構成の際に好中球計数と同様の時点でピークに達したが、ＣＴＳＧ等の好中球先駆体遺伝子は、幹細胞移植後８～９日目までに、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて約２日早く増加した。この観察を支持して、全ＡＭＬ患者の血漿における前駆体好中球転写物のレベルは、ＢＭアブレーション後に減少し、好中球計数よりもおよそ５日早く、ＢＭ再構成の際にｃｆ－ｍＲＮＡにおいて増加した（図３Ｈ～図３Ｊおよび図８Ｄ）。これらのデータは、循環中の前駆体好中球転写物が、ＣＣに由来せず、むしろ、顆粒球系列のＢＭ転写活性を反映したことをさらに支持し、移植片生着およびＢＭ再構成に関する有用な情報を提供する。
直交性アプローチも調査して、宿主およびドナー細胞の間に遺伝的な差が存在する同種異系ＨＳＣ移植片を受けているＡＭＬ患者由来のｃｆ－ｍＲＮＡを使用して、移植片生着を測定した。ＳＮＰの参照データベースを使用して、移植前に前駆体好中球転写物における宿主特異的多型を同定した（すなわち、ＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１およびＰＲＴＮ３）。移植後に、これらの転写物を、ドナー細胞由来の新たな遺伝的バリアントによって置換した（図４Ａ）。実際に、ｃｆ－ｍＲＮＡプロファイリングは、患者１および２の治療的処置の際のこれらの転写物の変化のモニタリングを可能にした（図４Ｂ～図４Ｃ）。移植後に異なる遺伝的バリアントへとスイッチする（すなわち、ホモ接合型からヘテロ接合型へと）、宿主由来の検出されたＳＮＰ全てを組み合わせた解析は、複数の遺伝的な差をｃｆ－ｍＲＮＡにおいて同定して、移植片生着を時間的にモニタリングすることができることを指し示す（図４Ｄ～図４Ｅ）。データを全て合わせると、ｃｆ－ｍＲＮＡが、ＢＭから遺伝情報および転写活性の両方を捕捉し、ドナー細胞からの移植片生着およびＢＭ再構成のモニタリングを可能にしたことを示した。
（実施例１２ 増殖因子による刺激の際の系列特異的転写活性は、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて反映された）
増殖因子による刺激後の特異的ＢＭ系列の活性をモニタリングするｃｆ－ｍＲＮＡの潜在力を評価するために、慢性維持エリスロポエチン（ＥＰＯ）療法中で変動する程度の慢性腎臓不全を有する、９名の患者由来の血漿試料を得た。ＥＰＯは、ＢＭにおける赤血球の成熟および増殖の速度を特異的に増加させるペプチドホルモンである。ＥＰＯの投与前（０日目）および処置後最大３０日目までのいくつかの時点で、試料を得た。無血清ヘモグロビンおよびＲＢＣ数は、試験の持続時間においてわずかな一過性変化を示した。ＲＢＣ計数とは異なり、ｃｆ－ｍＲＮＡにおける９名の患者にわたる赤血球転写物の平均レベルは、ＥＰＯ処置の直後に増加した（図５Ａ）。赤血球転写物のレベルは、無処置対照個体と比較して、処置後の初期の日々において増加し続けた（図５Ａおよび図５Ｂ）。実際に、ヘム生合成に関与する肝要な赤血球生成の発生転写物（すなわち、ＡＬＡＳ２、ＨＢＢおよびＨＢＡ２）が、ほぼ全ての患者（９名の患者のうち８名）において誘導された（図１０Ａ）。さらに、ＥＰＯによる処置後４日目までに、血漿において３６４種の調節不全遺伝子が同定された（ｐ＜０．０５）。ＩＰＡ（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙｐａｔｈｗａｙ－ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用した解析は、これらの転写物の上位濃縮経路として「ヘム生合成ＩＩ」を示し（ｐ＝１．４ｅ－９）、この細胞系列の転写誘導を支持する。ＥＰＯ処置の３０日後に、赤血球転写物は、これらの患者において基底発現レベルへと復帰した（図５Ｂおよび図１０Ａ～図１０Ｃ）。よって、縦断的試験は、ｃｆ－ｍＲＮＡレベルが、赤血球系系列の特異的一過性刺激を反映したことを指し示した。
細胞系列の摂動の際のｃｆ－ｍＲＮＡの変化をｉｎ ｖｉｖｏで試験するための別のアプローチとして、好中球性顆粒球のための周知生存促進性因子である、Ｇ－ＣＳＦ処置（顆粒球コロニー刺激因子）を受けた３名の健康な患者由来の試料を収集した。処置前ならびにＧ－ＣＳＦ刺激後１、４および１０日目に血液を採取した（１０日間の時点、およびＣＢＣは、２名の患者に対してしか得ることができなかった）。予想通りに、好中球計数は、Ｇ－ＣＳＦ処置後に増加し、４日目にピークに達し、１０日目までに基底レベルに復帰した（図５Ｃ）。血漿ｃｆ－ｍＲＮＡにおける好中球特異的転写物は、全患者でＧ－ＣＳＦ処置後に二峰性増加を示した（図５Ｃおよび図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。好中球前駆体特異的転写物は、ｃｆ－ｍＲＮＡにおいて増加し、ＢＭから循環中への顆粒球のＧ－ＣＳＦ媒介性動員の結果としての好中球計数のピークと一致する（図５Ｃ、図１０Ｂ）。しかし、成熟好中球転写物は、処置の１日後にｃｆ－ｍＲＮＡにおいて急速に増加し、好中球計数のピークの前兆になる（図５Ｃ、図１０Ｃ）。このことは、Ｇ－ＣＳＦに対する好中球の直接的かつ一過性の転写応答を示唆した。実際に、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、Ｇ－ＣＳＦに応答して好中球において増加（例えば、ＩＲＡＫ３）または減少（例えば、ＩＦＩＴ１）することが以前に報告された転写物は、予想される傾向に従った（図５Ｄ）。結果を全て合わせると、ｃｆ－ｍＲＮＡが、刺激に対する細胞型特異的転写応答を反映したことを指し示した。
本発明の好まれる実施形態が、本明細書に示され記載されてきたが、当業者には、斯かる実施形態が単なる一例として提供されていることが明らかであろう。本発明が、本明細書内に提供される具体例によって限定されることは意図されない。本発明が、上述の明細書を参照しつつ記載されてきたが、本明細書における実施形態の記載および図解は、限定的な意義で解釈されることを意味するものではない。そこで、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形形態、変化および置換が思い浮かぶ。さらに、本発明のあらゆる態様が、種々の条件および変数に依存する本明細書に示される特異的な描写、構成または相対的比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替を、本発明の実施に用いることができることを理解されたい。したがって、本発明が、いかなる斯かる代替、改変、変形形態または均等物も網羅することが企図される。次の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義し、斯かる特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が、それによって網羅されることが意図される。

Claims (63)

  1. 被験体の骨髄の病状をモニタリングするための方法であって、
    前記病状を有する前記被験体から生体試料を得るステップと、
    第１の複数の遺伝子に対応する、前記骨髄に常在するまたはこれに起源をもつ複数の細胞に由来する第１の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップと
    を含む、方法。
  2. 前記生体試料が、血液試料を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記血液試料が、血清試料、血漿試料またはバフィーコート試料を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記病状が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、白血病、骨髄増殖性新生物、骨髄異形成症候群、リンパ腫、血小板血症、骨髄線維症、真性赤血球増加症または貧血を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記病状が、ＭＭを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記病状が、ＭＭを含む場合、前記第１の複数の遺伝子が、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＡ１、ＩＧＫＣ、ＩＧＨＶ１、ＩＧＨＶ２、ＩＧＨＶ３、ＩＧＨＶ４、ＩＧＨＶ５、ＩＧＨＶ６、ＩＧＨＶ７、ＩＧＨＶ８、ＩＧＨＶ９、ＩＧＨＶ１０、ＩＧＨＶ１１、ＩＧＨＶ１２、ＩＧＨＶ１３、ＩＧＨＶ１４、ＩＧＨＶ１５、ＩＧＨＶ１６、ＩＧＨＶ１７、ＩＧＨＶ１８、ＩＧＨＶ１９、ＩＧＨＶ２０、ＩＧＨＶ２１、ＩＧＨＶ２２、ＩＧＨＶ２３、ＩＧＨＶ２４、ＩＧＨＶ２５、ＩＧＨＶ２６、ＩＧＨＶ２７、ＩＧＨＶ２８、ＩＧＨＶ２９、ＩＧＨＶ３０、ＩＧＨＶ３１、ＩＧＨＶ３２、ＩＧＨＶ３３、ＩＧＨＶ３４、ＩＧＨＶ３５、ＩＧＨＶ３６、ＩＧＨＶ３７、ＩＧＨＶ３８、ＩＧＨＶ３９、ＩＧＨＶ４０、ＩＧＨＶ４１、ＩＧＨＶ４２、ＩＧＨＶ４３、ＩＧＨＶ４４、ＩＧＨＶ４５、ＩＧＨＶ４６、ＩＧＨＶ４７、ＩＧＨＶ４８、ＩＧＨＶ４９、ＩＧＨＶ５０、ＩＧＨＶ５１、ＩＧＨＶ５２、ＩＧＨＶ５３、ＩＧＨＶ５４、ＩＧＨＶ５５、ＩＧＨＶ５６、ＩＧＨＶ５７、ＩＧＨＶ５８、ＩＧＨＶ５９、ＩＧＨＶ６０、ＩＧＨＶ６１、ＩＧＨＶ６２、ＩＧＨＶ６３、ＩＧＨＶ６４、ＩＧＨＶ６５、ＩＧＨＶ６６、ＩＧＨＶ６７、ＩＧＨＶ６８、ＩＧＨＶ６９、ＩＧＫＶ２、ＩＧＫＶ３、ＩＧＫＶ４、ＩＧＫＶ５、ＩＧＫＶ６、ＩＧＫＶ７、ＩＧＫＶ８、ＩＧＫＶ９、ＩＧＫＶ１０、ＩＧＫＶ１１、ＩＧＫＶ１２、ＩＧＫＶ１３、ＩＧＫＶ１４、ＩＧＫＶ１５、ＩＧＫＶ１６、ＩＧＫＶ１７、ＩＧＫＶ１８、ＩＧＫＶ１９、ＩＧＫＶ２０、ＩＧＫＶ２１、ＩＧＫＶ２２、ＩＧＫＶ２３、ＩＧＫＶ２４、ＩＧＬ１、ＩＧＬＶ１－４０、またはこれらの組合せを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記病状が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
  8. 前記検出するステップが、ｃｆ－ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換するステップをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 配列決定、アレイハイブリダイゼーションまたは核酸増幅のうち１つまたは複数を行うことにより、前記ｃＤＮＡを測定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 処置を提供するステップをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記処置が、イオン化照射、メルファラン媒介性骨髄アブレーション、ブスルファン媒介性骨髄アブレーション、トレオスルファン媒介性アブレーション、化学療法媒介性アブレーション、同種異系移植、自家移植、増殖因子による刺激、自家もしくは異種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法、またはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記増殖因子による刺激が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）による刺激を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記増殖因子による刺激が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）による刺激を含む、請求項１１に記載の方法。
  14. 被験体の臓器の処置状況をモニタリングするための方法であって、
    前記処置状況を有する前記被験体から血漿試料を得るステップと、
    第２の複数の遺伝子に対応する、前記被験体の臓器に由来する第２の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップと
    を含む、方法。
  15. 前記臓器が、骨髄である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記生体試料が、血液試料を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記血液試料が、血清、血漿試料またはバフィーコート試料を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記処置状況が、骨髄アブレーション、骨髄再構成、骨髄移植、増殖因子による刺激、免疫療法、免疫調節、ユビキチンリガーゼ活性のモジュレーション、コルチコステロイド、放射線療法、または自家もしくは異種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ユビキチンリガーゼ活性の前記モジュレーションが、ユビキチンリガーゼ阻害剤の投与を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記骨髄アブレーションが、物理的アブレーション、化学的アブレーション、またはこれらの組合せを含む、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記物理的アブレーションが、イオン化照射を含む、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記化学的アブレーションが、メルファラン媒介性骨髄アブレーション、ブスルファン媒介性骨髄アブレーション、トレオスルファン媒介性アブレーション、化学療法媒介性アブレーション、またはこれらの組合せを含む、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記骨髄移植が、同種異系移植を含む、請求項１８に記載の方法。
  24. 前記骨髄移植が、自家移植を含む、請求項１８に記載の方法。
  25. 前記増殖因子による刺激が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）による刺激を含む、請求項１８に記載の方法。
  26. 前記増殖因子による刺激が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）による刺激を含む、請求項１８に記載の方法。
  27. 前記処置が、骨髄アブレーションを含む場合、前記第２の複数の遺伝子に対応する前記第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが減少し、前記第２の複数の遺伝子が、赤血球特異的遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
  28. 前記処置が、骨髄再構成を含む場合、前記第２の複数の遺伝子に対応する前記第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが、骨髄アブレーションの際の斯かるｃｆ－ｍＲＮＡレベルと比較して増加し、前記第２の複数の遺伝子が、赤血球特異的遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
  29. 前記赤血球特異的遺伝子が、ＧＡＴＡ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＴＦ、ＡＶＰ、ＲＵＮＤＣ３Ａ、ＳＯＸ６、ＴＳＰＯ２、ＨＢＺ、ＴＭＣＣ２、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＡＬＡＳ２、ＥＰＢ４２、ＧＹＰＡ、Ｃ１７ｏｒｆ９９、ＨＢＡ２、ＲＨＣＥ、ＨＢＧ２、ＴＲＩＭ１０、ＨＢＡ１、ＨＢＭ、ＨＢＧ１、ＵＣＡ１、ＧＹＰＢ、ＣＴＤ－３１５４Ｎ５．２およびＡＣ１０４３８９．１からなる群由来の１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項２６または２７のいずれかに記載の方法。
  30. 前記処置が、骨髄再構成を含む場合、前記第２の複数の遺伝子に対応する前記第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが増加し、前記第２の複数の遺伝子が、巨核球特異的遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
  31. 前記巨核球特異的遺伝子が、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＧＰ６、ＨＧＤ、ＰＦ４、ＣＬＥＣ１Ｂ、ＣＭＴＭ５、ＧＰ９、ＳＥＬＰ、ＤＮＭ３、ＬＹ６Ｇ６Ｆ、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＸＸｂａｃ－ＢＰＧ３２１３．１９およびＲＰ１１－８７９Ｆ１４．２からなる群由来の１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記処置が、骨髄アブレーションを含む場合、前記第２の複数の遺伝子に対応する前記第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが減少し、前記第２の複数の遺伝子が、好中球特異的遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
  33. 前記処置が、骨髄移植を含む場合、前記第２の複数の遺伝子に対応する前記第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが、骨髄アブレーションの際の斯かるｃｆ－ｍＲＮＡレベルと比較して増加し、前記第２の複数の遺伝子が、好中球特異的遺伝子を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記処置が、骨髄再構成を含む場合、前記第２の複数の遺伝子に対応する前記第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが、骨髄再構成の際の斯かるｃｆ－ｍＲＮＡレベルと比較して増加し、前記第２の複数の遺伝子が、好中球特異的遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
  35. 前記好中球特異的遺伝子が、前駆体好中球特異的遺伝子を含む、請求項２０から３４のいずれかに記載の方法。
  36. 前記前駆体好中球特異的遺伝子が、ＣＴＳＧ、ＥＬＡＮＥ、ＡＺＵ１、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ８、ＲＮＡＳＥ、ＰＧＬＹＲＰ１、またはこれらの組合せを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前駆体好中球特異的遺伝子に対応する前記検出されたｃｆ－ｍＲＮＡが、前記血液試料において、複数の好中球細胞よりも早く現れる、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
  38. 前記処置が、同種異系移植を含む場合、前記第２の複数の遺伝子に対応する前記第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが検出され、前記第２の複数の遺伝子が、ドナー細胞由来の前駆体好中球特異的遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
  39. 前記処置が、Ｇ－ＣＳＦによる刺激を含む場合、前記第２の複数の遺伝子に対応する前記第２の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが検出され、前記第２の複数の遺伝子が、好中球特異的遺伝子を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記好中球特異的遺伝子が、ＰＧＬＹＲＰ１、ＬＴＦ、ＡＴＰ２Ｃ２、ＶＮＮ３、ＣＲＩＳＰ３、ＣＴＳＧ、ＯＬＦＭ４、ＫＲＴ２３、ＭＭＰ８、ＡＲＧ１、ＥＰＸ、ＰＩ３、ＣＲＩＳＰ２、ＳＴＥＡＰ４、ＬＣＮ２、ＰＲＧ３、ＫＣＮＪ１５、ＡＬＰＬ、ＦＣＧＲ３８、Ｓ１００Ａ１２、ＰＲＯＫ２、ＣＸＣＲ１、ＣＡＭＰ、ＲＮＡＳＥ３、ＣＥＡＣＡＭ３、ＡＺＵ１、ＡＢＣＡ１３、ＣＸＣＲ２、ＣＴＤ－３０８８Ｇ３．８、ＰＲＴＮ３、ＥＬＡＩＮＥ、ＣＤ１７７、ＬＩＮＣ００６７１、ＯＲＭ２、ＯＲＭ１、ＨＰおよびＲＰ１１－６７８Ｇ１４．４からなる群由来の１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項３０から３９のいずれかに記載の方法。
  41. 被験体の骨髄の健康状況をモニタリングするための方法であって、
    前記健康状況を有する前記被験体から生体試料を得るステップと、
    第３の複数の遺伝子に対応する、前記被験体の骨髄およびその由来細胞に由来する第３の複数の無細胞ｍＲＮＡ（ｃｆ－ｍＲＮＡ）のｃｆ－ｍＲＮＡレベルを検出するステップと
    を含む、方法。
  42. 前記第３の複数の遺伝子が、骨髄およびその由来細胞に由来する遺伝子のおおよそ少なくとも４５％、５５％、６５％または７５％を構成する、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記第３の複数の遺伝子が、表７由来の１つまたは複数の遺伝子を含む、請求項４１に記載の方法。
  44. 前駆体好中球特異的遺伝子に対応する前記第３の複数のｃｆ－ｍＲＮＡのレベルが、成熟好中球特異的遺伝子に対応するｃｆ－ｍＲＮＡレベルと比較して増加する、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記生体試料が、血液試料を含む、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記血液試料が、血清試料、血漿試料またはバフィーコート試料を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記検出するステップが、ｃｆ－ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換するステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
  48. 配列決定、アレイハイブリダイゼーションまたは核酸増幅のうち１つまたは複数を行うことにより、前記ｃＤＮＡを測定するステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 活性薬剤をアッセイする方法であって、
    第１の時点で被験体の第１の無細胞発現プロファイルを評価するステップと、
    前記被験体に活性薬剤を投与するステップと、
    第２の時点で前記被験体の第２の無細胞発現プロファイルを評価するステップと
    を含む、方法。
  50. 前記第１の無細胞発現プロファイルまたは前記第２の無細胞発現プロファイルのいずれかが、骨髄特異的である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記第１の無細胞発現プロファイルを前記第２の無細胞発現プロファイルと比較するステップをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記第１の発現プロファイルおよび前記第２の発現プロファイルの間の差が、治療の効果を指し示す、請求項４９に記載の方法。
  53. 前記活性薬剤が、疾患を処置するための医薬化合物を含む、請求項４９から５２のいずれかに記載の方法。
  54. 第３の時点で前記被験体の第３の無細胞発現プロファイルを評価するステップをさらに含む、請求項４９から５３のいずれかに記載の方法。
  55. 評価するステップが、配列決定、アレイハイブリダイゼーションまたは核酸増幅のうち１つまたは複数を含む、請求項４９から５４のいずれかに記載の方法。
  56. 追加的な時点で前記被験体の追加的な無細胞発現プロファイルを評価するステップをさらに含む、請求項４９から５５のいずれかに記載の方法。
  57. 前記第２の時点が、前記第１の時点から１～４週間後である、請求項４９から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. １２～２４ヶ月間の期間にわたり前記追加的な無細胞発現時点を評価するステップをさらに含む、請求項４９から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記期間が、約１８ヶ月間である、請求項５８に記載の方法。
  60. １つまたは複数の無細胞発現プロファイルを追跡および／または検出して、治療および／または薬物の発見および／または開発のために１つまたは複数の目的の標的を測定するステップをさらに含む、請求項４９から５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 治療および／または薬物の発見および開発におけるリード最適化および／または臨床開発のために薬力学を測定するステップをさらに含む、請求項４９から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 遺伝子発現のプロファイルを作成して、治療および／または薬物の発見および／または開発のために特異的標的の関与に関連する１つまたは複数の薬力学的効果を特徴付けるステップをさらに含む、請求項４９から６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 治療および／または薬物の発見および開発のために薬力学標的関与の変化を検出するステップをさらに含む、請求項４９から６２のいずれか一項に記載の方法。
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