JP2022512597A - Microbial analysis without cell purification - Google Patents
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Abstract
本発明は、検体調製を伴わない、患者検体からの直接的な微生物の迅速な自動化された同定および抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）のためのシステムおよび方法を提供する。検体は、処理のための分析カートリッジにロードされる。分析カートリッジには、検体中の微生物を同定および列挙するために使用される種特異的標識が予めロードされる。分析器などの機器を使用して、分析カートリッジと相互作用させて、カートリッジ内で本発明の方法をすべて行うことができる。 The present invention provides systems and methods for rapid automated identification of microorganisms and antimicrobial susceptibility testing (AST) directly from patient specimens without sample preparation. The specimen is loaded into an analytical cartridge for processing. The analysis cartridge is preloaded with species-specific labels used to identify and enumerate microorganisms in the sample. Instruments such as analyzers can be used to interact with the analytical cartridge to perform all of the methods of the invention within the cartridge.
Description
本開示は、感染症の検出、感染性微生物病原体の同定、および感染症のための有効な抗微生物処置の決定に関する。 The present disclosure relates to the detection of infectious diseases, the identification of infectious microbial pathogens, and the determination of effective antimicrobial treatments for infectious diseases.
抗生物質耐性菌によって引き起こされる生命を脅かす感染症の流行は、世界的な医療危機を煽っている。この問題の一因は、現在の診断方法が、感染症を処置するための最適な抗微生物処置を決定するのに数日が必要であるという事実である。時間がかかる試験によって引き起こされる遅延は、準最適な処置、劣った転帰、および抗生物質耐性の広がりを引き起こす強力な広域スペクトル抗生物質の過使用をもたらす。耐性菌によって引き起こされる感染症に起因する死亡率は、急激に増加している。ｔｈｅ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅによる２０１４年の報告は、２０５０年までに、抗微生物薬耐性が、年間１，０００万人よりも多くの死亡者の原因になると推定している。 The epidemic of life-threatening infectious diseases caused by antibiotic-resistant bacteria has fueled the global medical crisis. Part of this problem is the fact that current diagnostic methods require several days to determine the optimal antimicrobial treatment for treating an infection. The delay caused by time-consuming tests results in suboptimal treatment, poor outcomes, and overuse of strong broad-spectrum antibiotics that cause widespread antibiotic resistance. Mortality from infectious diseases caused by resistant strains is increasing exponentially. A 2014 report by the Review on Antimicrobial Resistance estimates that by 2050, antimicrobial resistance will cause more than 10 million deaths annually.
感染症を引き起こす特定の病原体について標的化された最適な有効な抗生物質による早期の処置は、死亡を防止することを含む医学的転帰を劇的に改善することができる。残念ながら、抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）法と呼ばれる有効な標的化された抗生物質を同定する現在の方法は、結果を届けるのに数日が必要である。現在の抗微生物薬感受性試験が非常に時間がかかる１つの理由は、試験が、数百万のオーダーという多数の精製された病原体細胞を必要とすることである。これは、ペトリ皿中で培養することによるこの数の細胞を精製するために使用される１３０年よりも前のコロニー精製法を使用すると、１日またはそれよりも長く必要である。精製された細胞が利用可能になると、これは、一般に、病原体を同定するため、およびどの抗生物質が患者を処置するために有効かを決定するために、１日またはそれよりも長くかかる。 Early treatment with optimally effective antibiotics targeted for the particular pathogen that causes the infection can dramatically improve medical outcomes, including preventing mortality. Unfortunately, current methods for identifying effective targeted antibiotics, called antimicrobial susceptibility testing (AST) methods, require several days to deliver results. One reason that current antimicrobial susceptibility testing is so time consuming is that the test requires a large number of purified pathogen cells on the order of millions. This requires a day or longer using the pre-130 year colony purification method used to purify this number of cells by culturing in Petri dishes. Once purified cells are available, it generally takes a day or longer to identify the pathogen and to determine which antibiotic is effective in treating the patient.
その間に、患者は、感染症を引き起こす可能性がある広範囲の病原体を死滅させる広域スペクトル抗生物質で「経験的」に処置される。これらの薬物は広範囲の病原体を処置することができるとはいえ、それらは、一般に、患者の特定の病原体に対して最適な治療ではないが、感染症を有効に完全に処置できない場合もある。広域スペクトル抗生物質の経験的な使用は、抗生物質耐性の広がりも引き起こす。これらの広く作用する薬物は、疾患を引き起こす病原体だけでなく、人体に生息する数兆の無害な微生物にも耐性を引き起こす。抗生物質耐性の広がりをさらに悪化させるのは、どの患者が実際に感染症を有しているかを決定するための迅速な診断がない場合において、感染していない患者が、高い頻度で、耐性を引き起こす抗生物質で不必要に処置されるという事実である。 In the meantime, patients are treated "empirically" with broad-spectrum antibiotics that kill a wide range of pathogens that can cause infections. Although these drugs can treat a wide range of pathogens, they are generally not the optimal treatment for a particular pathogen in a patient, but they may not be able to effectively and completely treat the infection. The empirical use of broad-spectrum antibiotics also causes the spread of antibiotic resistance. These widespread drugs cause resistance not only to disease-causing pathogens, but also to the trillions of harmless microorganisms that inhabit the human body. Further exacerbating the spread of antibiotic resistance is that uninfected patients frequently develop resistance in the absence of a rapid diagnosis to determine which patients actually have the infection. The fact that it is unnecessarily treated with the antibiotics that cause it.
どの抗微生物処置が、現在の方法を使用して可能な限り早く有効であるかを決定することは、医学的転帰を改善することができるだけでなく、医療の費用を下げることができる。例えば、手術部位感染症および人工呼吸器関連肺炎などの一般的な生命を脅かす院内感染は、米国において１００億ドル近い医療費の原因である。入院期間は、これらの感染症に起因する最大の費用である。患者を最適な抗微生物治療において症状の開始により接近させることで、患者の回復を著しく加速し、長期で費用のかかる入院を低減することができる。 Determining which antimicrobial treatment is effective as soon as possible using current methods can not only improve medical outcomes, but also reduce medical costs. Common life-threatening nosocomial infections, such as surgical site infections and ventilator-related pneumonia, are responsible for nearly $ 10 billion in medical costs in the United States. Length of stay is the highest cost due to these infections. Bringing the patient closer to the onset of symptoms in optimal antimicrobial treatment can significantly accelerate patient recovery and reduce long-term and costly hospitalizations.
要約すると、現在の方法は、患者が感染症を有するか、およびもしそうならば、どの抗微生物剤が効果的である可能性が最も高いかを決定するために数日を必要とする。主に、この遅延は、方法が必要とする時間がかかる細胞精製ステップに起因する。患者が症状を提示したときにタイムリーな診断情報がない場合において、患者は、広域スペクトル抗生物質で経験的に処置され、これは、準最適である場合があり、耐性の広がりを引き起こす場合がある。抗生物質が、診断結果が利用できる前に処方されるので、感染していない患者でさえも、不必要に処置され、耐性を獲得する。 In summary, current methods require several days to determine if a patient has an infection and, if so, which antimicrobial agent is most likely to be effective. Primarily, this delay is due to the time-consuming cell purification step required by the method. In the absence of timely diagnostic information when the patient presents symptoms, the patient is empirically treated with broad-spectrum antibiotics, which may be suboptimal and may cause widespread tolerance. be. Antibiotics are prescribed before diagnostic results are available, so even uninfected patients are treated unnecessarily and develop resistance.
本発明は、現在の方法よりもはるかに迅速に、感染症を検出し、有効な抗微生物処置を決定する診断試験の必要性に対処する。本発明は、多数の精製細胞を得るための今日の方法によって必要とされる時間のかかるステップを除外する。本発明の方法は、現在の方法によって必要な数日よりもむしろ数時間で、感染症を検出し、感染性病原体および有効な抗微生物剤を同定することができる。症状の開始により接近して、感染症を検出すること、および有効な標的抗微生物剤を同定することによって、本発明は、医学的転帰を劇的に改善し、耐性を引き起こす広域スペクトル抗生物質による経験的な処置を最小化する可能性を有する。 The present invention addresses the need for diagnostic testing to detect infections and determine effective antimicrobial treatments much faster than current methods. The present invention excludes the time-consuming steps required by today's methods for obtaining large numbers of purified cells. The methods of the invention can detect infectious diseases and identify infectious pathogens and effective antimicrobial agents in hours rather than days required by current methods. By detecting infections closer to the onset of symptoms and identifying effective targeted antimicrobial agents, the present invention is by broad-spectrum antibiotics that dramatically improve medical outcomes and cause resistance. It has the potential to minimize empirical treatment.
症状の開始の近くで有効な抗生物質で患者を処置することで、医学的転帰は劇的に改善し、生命および医療費の両方を節約する。本発明のシステムおよび方法は、現在の方法によって必要とされる日数と比較して、数時間で抗微生物薬感受性試験の結果を届けることを可能にする。より早い日に有効な抗生物質を投与することで、医学的転帰を改善することができ、耐性の広がりを引き起こす経験的に処方される広域スペクトル抗生物質の過使用を少なくするのを助けることができる。 Treating patients with antibiotics that are effective near the onset of symptoms dramatically improves medical outcomes and saves both life and medical costs. The systems and methods of the invention make it possible to deliver the results of antimicrobial susceptibility testing in hours compared to the number of days required by current methods. Administering effective antibiotics on an earlier day can improve medical outcomes and help reduce overuse of empirically prescribed broad-spectrum antibiotics that cause widespread tolerance. can.
抗微生物薬感受性試験法と呼ばれる有効な処置を決定するための従来の方法は、一部分において、これらの方法が数百万個の精製病原体細胞を必要とするので、結果を届けるのに数日が必要である。これらの精製細胞を得るためのプロセスは、ペトリ皿において疾患を引き起こす病原体細胞を培養するための時間がかかるコロニー精製法を使用する。コロニー精製は、典型的には、完了までに１日またはそれよりも長くかかる。コロニー精製後、病原体種を同定し、どの抗微生物剤を患者を処置するために使用すべきかを決定するための抗微生物薬感受性試験のために、一般に、さらに１日またはそれよりも長く必要である。 Traditional methods for determining effective treatments, called antimicrobial susceptibility testing methods, in part require days to deliver results as these methods require millions of purified pathogen cells. is necessary. The process for obtaining these purified cells uses a time-consuming colony purification method for culturing disease-causing pathogen cells in Petri dishes. Colony purification typically takes one day or longer to complete. After colony purification, generally an additional day or longer is required for antimicrobial susceptibility testing to identify pathogen species and determine which antimicrobial agent should be used to treat the patient. be.
本発明は、コロニーまたは細胞の精製なしで検体から病原体を同定するための方法または抗微生物薬感受性を決定するための方法を提供する。現在の方法と比較して、本発明の方法についての結果までの時間の著しい改善は、多数の精製病原体細胞を調製するための時間がかかるステップを必要とせずに、患者検体を直接的に分析する本発明の能力に由来する。 The present invention provides methods for identifying pathogens from specimens or determining antimicrobial susceptibility without purification of colonies or cells. A significant improvement in time to results for the method of the invention compared to current methods is the direct analysis of patient specimens without the need for time-consuming steps to prepare a large number of purified pathogen cells. Derived from the ability of the present invention to
抗微生物薬感受性試験は、段階的なプロセスと見なされ得る。目的は、抗微生物剤のパネルのどのメンバーが、患者の感染を引き起こしている特定の病原体株に対して有効であるかを決定することである。典型的には、感染が検出されると、病原体の種が最初に同定される。病原体の種を同定することは、その種を処置するために一般に使用され得る抗微生物薬および投薬を選択するために有用である。しかし、感染を引き起こしている特定の病原体株は、抗微生物薬のいずれかに対して耐性になっている場合があるので、その病原体が実際に感受性である潜在的処置を決定するために、抗微生物薬感受性試験を実施する必要がある。 Antimicrobial susceptibility testing can be considered a step-by-step process. The purpose is to determine which members of the panel of antimicrobial agents are effective against the particular pathogen strain causing the patient's infection. Typically, when an infection is detected, the pathogen species is first identified. Identifying the species of pathogen is useful for selecting antimicrobial agents and medications that can be commonly used to treat the species. However, the particular pathogen strain causing the infection may be resistant to any of the antimicrobial agents, so antibacterial to determine potential treatments to which the pathogen is actually susceptible. It is necessary to carry out a microbial drug susceptibility test.
種の同定後、患者の検体からの病原体細胞は、種々の濃度の種々の抗微生物薬を含む栄養成長培地を含む一連の液体溶液へと割り振られ、またはアリコート化される。次いで、アリコートは、微生物複製につながる温度（一般には３５～３７℃）でインキュベートされる。病原体が抗微生物薬に対して感受性である場合、この病原体は正常に複製できる、即ち、病原体細胞の数は、抗微生物薬の非存在下での微生物学的成長培地中と同様に増加する。病原体が抗微生物薬に対して感受性である場合、この病原体は、複製できない、はるかに低い程度までしか複製しない、または形態学的もしくは他の異常を示し、これは、抗微生物剤の有効性を示す。最後に、病原体細胞の複製が、どの抗微生物剤が有効であるかを決定するために、種々のアリコート中で評価される。本発明者らは、一連の抗微生物薬についての病原体の抗微生物薬感受性／耐性結果のセットを、その抗微生物薬感受性プロファイルと呼ぶ。 After species identification, pathogen cells from the patient's specimen are assigned or aliquoted into a series of liquid solutions containing vegetative growth medium containing different concentrations of different antimicrobial agents. The aliquot is then incubated at a temperature that leads to microbial replication (typically 35-37 ° C.). If the pathogen is sensitive to an antimicrobial agent, the pathogen can replicate normally, i.e., the number of pathogen cells increases as in the microbiological growth medium in the absence of the antimicrobial agent. If the pathogen is sensitive to an antimicrobial agent, the pathogen cannot replicate, replicates to a much lower degree, or exhibits morphological or other abnormalities, which indicates the effectiveness of the antimicrobial agent. show. Finally, pathogen cell replication is evaluated in various aliquots to determine which antimicrobial agent is effective. We refer to the set of pathogen antimicrobial susceptibility / resistance results for a set of antimicrobial agents as its antimicrobial susceptibility profile.
抗微生物薬感受性試験のための従来の方法および本発明の方法は両方とも、上記にステップに従うが、本発明の方法は、数時間で病原体の抗微生物薬感受性プロファイルを決定し、一方、従来の方法は数日必要である。本発明の方法を使用する迅速な抗微生物薬感受性試験結果は、高濃度の純粋な細胞を達成するための時間のかかる培養ベースの予めの富化成長なしに患者検体を直接的に試験する、新たな方法の能力から生じる。この富化および精製は、ペトリ皿上でのコロニー精製を使用して行われることが最も一般的である。 Both the conventional method for antimicrobial susceptibility testing and the method of the invention follow the steps described above, whereas the method of the invention determines the antimicrobial susceptibility profile of a pathogen in a matter of hours, while conventional methods. The method takes a few days. Rapid antimicrobial susceptibility test results using the methods of the invention directly test patient specimens without the time-consuming culture-based prior enrichment growth to achieve high concentrations of pure cells. It arises from the ability of new methods. This enrichment and purification is most commonly performed using colony purification on Petri dishes.
従来法について、コロニー精製後に回収された細胞は、生化学的、微生物学的、核酸方法またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）を使用して最初に同定される。病原体種の正体が既知になると、その種の病原体についての抗微生物薬感受性プロファイルを決定するのに適切な、適切な抗微生物薬および濃度が選択され得る。 For conventional methods, cells recovered after colony purification are first identified using biochemical, microbiological, nucleic acid methods or matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS). Will be done. Once the identity of the pathogen species is known, the appropriate antimicrobial agents and concentrations suitable for determining the antimicrobial susceptibility profile for the pathogen can be selected.
本発明のシステムおよび方法のいくつかの新規な態様は、患者検体から直接的に抗微生物薬感受性の結果を迅速に届ける能力を可能にする。 Several novel aspects of the systems and methods of the invention enable the ability to rapidly deliver antimicrobial susceptibility results directly from patient specimens.
第１に、患者検体は、一般に、従来の抗微生物薬感受性試験のために必要な細胞よりも数桁少ない細胞を含有する。本発明の方法は、現在の培養－事前濃縮依存法とは対照的に、非拡大デジタルイメージングを使用して、感受性の単一細胞計数によって少数の病原体細胞を列挙することができる。さらにまた、本方法は、少数の個々の細胞を列挙するので、細胞が抗微生物薬および成長培地を含有するアリコートで数が増加したか否かを、数世代の細菌のみで、非常に迅速に決定することができる。 First, patient specimens generally contain orders of magnitude less cells than are required for conventional antimicrobial susceptibility testing. The method of the invention can enumerate a small number of pathogen cells by single cell counting of susceptibility using non-enlarged digital imaging, as opposed to the current culture-pre-concentration dependent method. Furthermore, since the method enumerates a small number of individual cells, whether or not the cells were increased in aliquots containing antimicrobial agents and growth medium can be determined very quickly with only a few generations of bacteria. Can be decided.
第２に、患者検体は、感染性病原体に関係しない試料マトリックスおよび共生微生物を含有する。Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＥＣＡＳＴ）からのガイドラインなどの従来の方法のためのガイドラインは、ペトリ皿中の寒天系の成長培地上でのコロニーのクローン成長から生じる精製培養細胞を必要とする。これらの細胞は、単一の微生物種のみを含有し、試料マトリックスは含有しない。 Second, patient specimens contain a sample matrix and symbiotic microorganisms that are not associated with infectious pathogens. Guidelines for growth from conventional methods, such as guidelines from Clinical Laboratories Standards Institute (CLSI) or European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (ECAST), grow from heavenly colony growth medium to agar in a petri dish. Requires cultured cells. These cells contain only a single microbial species and no sample matrix.
上で論じたように、病原体種の正体は、有効な臨床処置選択肢に到達するために抗微生物薬感受性試験結果を正確に解釈するために、既知でなければならない。これは、従来の最も新興の抗微生物薬感受性試験法が細胞の純粋な培養物をなぜ必要とするかの根底にある重要な理由である。 As discussed above, the identity of the pathogen species must be known in order to accurately interpret antimicrobial susceptibility test results in order to reach effective clinical treatment options. This is an important reason why traditional and most emerging antimicrobial susceptibility testing methods require pure cultures of cells.
上記のように抗微生物薬感受性プロファイルを決定するために、従来の最も新興の方法は、標的病原体の成長に対する異なる濃度の異なる抗微生物薬の影響を評価する。これらの方法が、抗微生物薬感受性試験結果を解釈するために、同定された細胞の純粋な集団を必要とする理由は、これらの方法が、抗微生物薬含有アリコートにおける成長を評価するために、非特異的方法、例えば、光散乱または顕微鏡法を使用するからである。１つよりも多くの種、例えば、病原体と、ヒトマイクロバイオームの一部である正常微生物の種とが存在した場合 － これは、ほとんどの初代患者検体においてあてはまる － を考慮する。成長が抗微生物薬含有アリコートにおいて観察された場合、疾患原因病原体、または共生種のうち１つもしくは複数が耐性であり、成長することが可能であったかどうかを、成長を検出するための一般的な方法を使用して言うことは不可能である。 To determine the antimicrobial susceptibility profile as described above, the most emerging method of the past is to assess the effect of different concentrations of different antimicrobials on the growth of the target pathogen. The reason these methods require a pure population of identified cells to interpret antimicrobial susceptibility test results is that these methods assess growth in antimicrobial-containing aliquots. This is because non-specific methods such as light scattering or microscopy are used. Consider the presence of more than one species, eg, pathogens and species of normal microorganisms that are part of the human microbiome-this is true for most primary patient specimens. When growth is observed in aliquots containing antimicrobial agents, it is common to detect growth whether one or more of the disease-causing pathogens, or symbiotic species, was resistant and capable of growing. It is impossible to say using the method.
精製病原体細胞を必要とする従来の方法および他の方法とは対照的に、それらは、病原体が抗微生物薬の存在下で成長するか否かを検出するための非特異的方法を使用するので、本発明の方法は、病原体特異的検出を使用して、様々な抗微生物薬の存在下で病原体の成長を評価する。疾患を引き起こす病原体細胞のみがインキュベーションステップ後に列挙されるので（任意の共生微生物は列挙されない）、本発明の方法は、１種または多くの共生微生物種を含有する非滅菌一次検体中で直接的に抗微生物薬感受性を決定するために使用することができる。 In contrast to traditional and other methods that require purified pathogen cells, they use non-specific methods to detect whether the pathogen grows in the presence of antimicrobial agents. The methods of the invention use pathogen-specific detection to assess pathogen growth in the presence of various antimicrobial agents. Since only the disease-causing pathogen cells are listed after the incubation step (any symbiotic microorganism is not listed), the method of the invention is directly in a non-sterile primary specimen containing one or many symbiotic microbial species. It can be used to determine antimicrobial susceptibility.
病原体同定のための本発明のシステムおよび方法は、検体が、感染症を引き起こすことが疑われる十分な数で病原体種の細胞を含有するか否かを決定するために使用することができる。 The systems and methods of the invention for pathogen identification can be used to determine if a specimen contains a sufficient number of cells of a pathogen species suspected of causing an infection.
抗微生物薬感受性試験のための本発明のシステムおよび方法は、１つまたは複数の抗微生物剤のどれが患者検体中の感染症を引き起こすことが疑われる病原体の正常な細胞複製を防止することができるかを決定するために使用することができる。このような抗微生物剤は、患者の感染症を有効に処置するために、潜在的に使用することができる。 The systems and methods of the invention for antimicrobial susceptibility testing are capable of preventing normal cell replication of pathogens suspected of causing infection in patient specimens, which of one or more antimicrobial agents. It can be used to determine if it can be done. Such antimicrobial agents can potentially be used to effectively treat an infection in a patient.
抗微生物薬感受性試験のための本発明の方法の好ましい実施形態では、検体は、微生物学的な細胞の複製または成長を促進するために、栄養成長培地を含有する部分に分けられる。前記部分の１つまたは複数は、病原体細胞の数および量を決定するために成長を促進する温度でのインキュベーションの前に、直接的に処理され、本発明の方法によって分析される、参照またはベースライン部分として使用されてもよい。 In a preferred embodiment of the method of the invention for antimicrobial susceptibility testing, the specimen is divided into portions containing vegetative growth medium to promote microbiological cell replication or growth. One or more of the above portions is treated directly and analyzed by the method of the invention, reference or base, prior to incubation at a temperature that promotes growth to determine the number and amount of pathogen cells. It may be used as a line portion.
これらの部分のうち１つまたは複数は、病原体細胞が生存可能かどうかを確認するために、病原体細胞の成長を促進する温度でインキュベートされ得る。さらに、他の部分は各々、特定の濃度の１つまたは複数の抗微生物剤を含み、病原体細胞複製に対する抗微生物剤の影響を決定するためにインキュベートされる。 One or more of these portions may be incubated at a temperature that promotes the growth of pathogen cells to determine if the pathogen cells are viable. In addition, each of the other moieties contains a particular concentration of one or more antimicrobial agents and is incubated to determine the effect of the antimicrobial agent on pathogen cell replication.
本発明のシステムおよび方法は、次いで、インキュベートされた部分中の病原体細胞の数および量を分析するため、ならびにこれらの結果をインキュベートされていない参照部分中の病原体細胞の数および量と比較するために使用される。病原体細胞が、特定の抗微生物剤を含有する部分中で正常に複製するためのそれらの能力が著しく損なわれる場合、病原体は、分析ソフトウェアによって、その部分中の濃度で抗微生物剤に感受性であるとしてスコア化される。あるいは、その部分中で正常な成長が損なわれていない場合、病原体は、分析ソフトウェアによって、その部分中の濃度で抗微生物剤に感受性ではないとしてスコア化された。 The systems and methods of the invention are then used to analyze the number and amount of pathogen cells in the incubated portion, and to compare these results to the number and amount of pathogen cells in the unincubated reference portion. Used for. If pathogen cells are significantly impaired in their ability to replicate normally in a particular antimicrobial agent-containing moiety, the pathogen is susceptible to the antimicrobial agent at concentrations in that moiety by analytical software. Is scored as. Alternatively, if normal growth was not impaired in that portion, the pathogen was scored by analytical software as insensitive to antimicrobial agents at concentrations in that portion.
本発明のシステムおよび方法は、細胞の複製が、抗微生物剤を含有する部分中の病原体もしくは微生物標的の抗微生物薬感受性または耐性の決定のために評価される評価基準を含む。これらの基準は、標的微生物の種、検体の種類、抗微生物剤、成長培地の組成、温度およびインキュベーション時間を含むがこれらに限定されないパラメーターの特定の組合せについて決定され得る。 The systems and methods of the invention include endpoints in which cell replication is assessed for determining antimicrobial agent susceptibility or resistance to pathogens or microbial targets in moieties containing antimicrobial agents. These criteria may be determined for a particular combination of parameters including, but not limited to, target microbial species, sample type, antimicrobial agent, growth medium composition, temperature and incubation time.
評価基準は、好ましくは、抗微生物薬感受性試験のために認められた参照方法との相関によって、経験的に決定される。１つの標準的な参照方法は、他で（参照によって組み込まれるＰａｔｅｌ， ２０１５， Ｍ０７－Ａ１０， ＣＬＳＩ ３５（２）を参照されたい）十分に記載され、かつ当業者によって理解されている方法である、微量液体希釈法（ＢＭＤ）である。ブロス微量希釈は、抗微生物剤に対する微生物株の抗微生物薬感受性が標準的な条件下で評価される方法である。標的微生物の精製された細胞は、種々の抗微生物剤の２倍連続希釈を含む規定された栄養成長培地の一連の部分またはアリコートに、規定された濃度で添加される。微生物株の抗微生物薬感受性は、規定された期間の成長インキュベーション後の種々の部分の濁度を視覚的に評価した後に決定される。濁度が視覚的に存在しない、または抗微生物剤を含まない部分と比較して顕著に低下されている、抗微生物剤の最も低い濃度は、最小阻害濃度（ＭＩＣ）と呼ばれる。抗微生物薬感受性試験のための標準を決定する組織（例えば、ＣＬＳＩまたはＥＵＣＡＳＴ）は、特定の微生物種および特定の抗微生物剤の組合せについてのＭＩＣ値を、臨床実務における特定の治療用量の抗微生物剤の有効性と相関させている。ＭＩＣ値は、カテゴリー的範囲：感受性、中間耐性および耐性へと一般にビニングされる。これらは、ＳＩＲまたはカテゴリー的抗微生物薬感受性試験結果と呼ばれる。この方法で、特定の抗微生物剤に対する特定の種の特定の株についてのＭＩＣは、ＳＩＲまたはカテゴリー的結果として報告され得る。決定するために使用される他の標準的な方法には、－Ｂａｕｅｒまたはディスク拡散および寒天希釈が含まれる。これらの方法は、ＣＬＳＩおよびＥＵＣＡＳＴ文書に記載されており、当業者に公知である。 The evaluation criteria are preferably determined empirically by correlation with the reference methods accepted for antimicrobial susceptibility testing. One standard reference method is a method well described and understood by those of skill in the art elsewhere (see Patell, 2015, M07-A10, CLSI 35 (2) incorporated by reference). , Trace liquid dilution method (BMD). Bros microdilution is a method by which the antimicrobial susceptibility of a microbial strain to an antimicrobial agent is assessed under standard conditions. Purified cells of the target microorganism are added at a defined concentration to a series of portions or aliquots of a defined vegetative growth medium containing a 2-fold serial dilution of various antimicrobial agents. The antimicrobial susceptibility of a microbial strain is determined after a visual assessment of the turbidity of the various parts after growth incubation for a defined period. The lowest concentration of antimicrobial agent, in which the turbidity is visually absent or significantly reduced compared to the antimicrobial agent-free portion, is called the minimum inhibitory concentration (MIC). Organizations that determine standards for antimicrobial susceptibility testing (eg, CLSI or EUCAST) have MIC values for specific microbial species and specific antimicrobial agent combinations, and specific therapeutic doses of antimicrobials in clinical practice. Correlates with the efficacy of the agent. MIC values are generally binned into a categorical range: susceptibility, intermediate resistance and resistance. These are referred to as SIR or categorical antimicrobial susceptibility test results. In this way, the MIC for a particular strain of a particular species against a particular antimicrobial agent can be reported as an SIR or categorical result. Other standard methods used to determine include-Bauer or disc diffusion and agar dilution. These methods are described in CLSI and EUCAST documents and are known to those of skill in the art.
本発明の方法およびシステムを使用して抗微生物薬感受性試験結果を決定するための評価基準は、ブロス微量希釈法と同様、種々の濃度の特定の抗微生物剤における特定の種の種々の株の細胞複製の程度および品質を評価するために、本発明を使用することによって経験的に決定される。特定の抗微生物剤について、抗微生物薬感受性試験結果（一般に、ＭＩＣまたはＳＩＲカテゴリー的結果）を特定の種の株に割り当てるための基準は、種々の株についての結果が、本発明を使用して、参照ブロス微量希釈法の結果と一貫して相関するように、選択される。例えば、抗微生物薬感受性試験結果を決定するための本発明のシステムおよび方法によって使用され得る基準は、ある特定の温度における栄養成長培地中での、種々の濃度のある特定の抗微生物剤の存在下でのある特定の期間のインキュベーションにわたる、ある特定の種の標的微生物の成長倍率（標的細胞の数における増加倍率）の評価である。この場合、抗微生物薬感受性を評価するための本発明のシステムおよび方法についての使用に関する有効な基準を決定するための経験的な研究は、種々の濃度の抗微生物剤における種の種々の株の成長倍率を評価する。成長倍率についての閾値は、本発明を使用してある株について測定された成長倍率が、同じ抗微生物剤の存在下で成長した同じ株についてのブロス微量希釈の結果と相関するように選択され得る。閾値は、株の成長倍率が閾値を超える場合に、その株が、本発明によって、その濃度の抗微生物剤の存在下で顕著に成長したとカテゴライズされるように、標的種の種々の株を使用して経験的に選択される。株の成長倍率が成長倍率閾値未満である場合、その株は、本発明によって、顕著に成長しなかったとカテゴライズされる。したがって、この例では、成長倍率についての閾値は、参照ブロス微量希釈法および本発明の方法の両方が、種々の株が種々の抗微生物剤濃度において顕著に成長したかしなかったと決定されるかどうかについて同じ結果を返すように選択される。 The criteria for determining antimicrobial susceptibility test results using the methods and systems of the invention are similar to the broth microdilution method, for different strains of a particular species in a particular antimicrobial agent at different concentrations. It is empirically determined by using the present invention to assess the degree and quality of cell replication. The criteria for assigning antimicrobial susceptibility test results (generally MIC or SIR categorical results) to a particular species of strain for a particular antimicrobial agent are the results for various strains using the present invention. , Reference Broth is selected to consistently correlate with the results of the microdilution method. For example, the criteria that can be used by the systems and methods of the invention to determine antimicrobial susceptibility test results are the presence of certain antimicrobial agents at varying concentrations in nutrient growth medium at certain temperatures. Below is an assessment of the growth rate (growth rate in the number of target cells) of a particular species of target microorganism over a particular period of incubation. In this case, empirical studies to determine effective criteria for use of the systems and methods of the invention for assessing antimicrobial susceptibility have been conducted with different strains of species in different concentrations of antimicrobial agent. Evaluate the growth rate. The threshold for growth ratio can be selected such that the growth ratio measured for a strain using the present invention correlates with the result of microdilution of broth for the same strain grown in the presence of the same antimicrobial agent. .. Thresholds are used to categorize various strains of the target species so that when the growth ratio of the strain exceeds the threshold, the strain is categorized as having significantly grown in the presence of the antimicrobial agent at that concentration by the present invention. Used and empirically selected. If the growth ratio of a strain is less than the growth ratio threshold, the strain is categorized as having not grown significantly by the present invention. Therefore, in this example, the threshold for growth rate is determined whether both the reference broth microdilution method and the method of the invention have significantly grown different strains at different antimicrobial concentrations. You are selected to return the same result.
他の評価基準も、抗微生物薬感受性試験の結果を決定するための本発明のシステムおよび方法によって使用することができる。例えば、抗微生物剤中でのインキュベーションによって引き起こされる正常な細胞複製の撹乱を反映する形態特性の評価である。別の例として、インキュベーションステップ後に抗生物質を含有しない部分と比較される、抗微生物剤を含有する部分中での成長阻害の程度を評価することができる。複数の評価基準を、抗微生物剤が特定の濃度で標的細胞の正常な細胞複製に著しい撹乱を引き起こすか否かを決定するために、同時に使用することもできる。 Other criteria can also be used by the systems and methods of the invention to determine the results of antimicrobial susceptibility testing. For example, an assessment of morphological properties that reflect the disruption of normal cell replication caused by incubation in antimicrobial agents. As another example, the degree of growth inhibition in the antimicrobial agent-containing moiety compared to the antibiotic-free moiety after the incubation step can be assessed. Multiple endpoints can also be used simultaneously to determine if an antimicrobial agent causes significant disruption to normal cell replication of target cells at a particular concentration.
したがって、本発明の方法は、患者検体から直接的に感染症を検出することができ、感染性病原体を同定することができ、かつどの抗微生物薬が処置のために有効かを決定することができる。 Accordingly, the methods of the invention can detect infectious diseases directly from patient specimens, identify infectious pathogens, and determine which antimicrobial agents are effective for treatment. can.
患者検体、例えば、尿、糞便、呼吸器、創傷、脳脊髄液または血液は、好ましくは、ユーザーによるいずれの検体調製もなしに、微生物分析のために分析カートリッジ中に直接的に移動される。したがって、多数の純粋な病原体細胞を単離するためのコロニー精製、核酸精製、または他の時間もしくは労働集約的な検体調製プロトコールをユーザーが実施する必要は、好ましくは存在しない。検体は、好ましくは、例えば、生物学的残骸を除去するための予めの富化も浄化もなしに、試験カートリッジ中に直接的にロードされる。カートリッジは、本開示の微生物定量化および同定ならびに抗微生物薬感受性試験のための試薬を含む。検体中の微生物の種特異的標識およびイメージングなどのステップは全て、検体が直接的にロードされたカートリッジ上で行われる。カートリッジは、標的細胞特異的標識、例えば、本発明のシステムおよび方法によって検体中の微生物を同定するために使用される蛍光プローブを含む。微生物を同定するために、分析器は、好ましくは、カートリッジ中の標識された微生物をイメージングするためのイメージングサブシステムを含む。 Patient specimens such as urine, feces, respiratory organs, wounds, cerebrospinal fluid or blood are preferably transferred directly into the analysis cartridge for microbiological analysis without any specimen preparation by the user. Therefore, there is preferably no need for the user to perform colony purification, nucleic acid purification, or other time- or labor-intensive sample preparation protocols to isolate large numbers of pure pathogen cells. The specimen is preferably loaded directly into the test cartridge, for example, without prior enrichment or purification to remove biological debris. The cartridge contains reagents for microbial quantification and identification as well as antimicrobial susceptibility testing of the present disclosure. All steps, such as species-specific labeling and imaging of microorganisms in the specimen, are performed on the cartridge in which the specimen is directly loaded. The cartridge contains a target cell-specific label, eg, a fluorescent probe used to identify microorganisms in a specimen by the systems and methods of the invention. To identify the microorganism, the analyzer preferably comprises an imaging subsystem for imaging the labeled microorganism in the cartridge.
本発明のシステムおよび方法を使用して、感染症を迅速に検出すること、病原体を同定すること、および抗微生物薬感受性を決定することは、長い培養ステップを必要とする従来の方法よりもはるかに迅速に患者の感染症の有効な処置を導くためのすぐに使用可能な結果を届けるための可能性を提供する。本発明のシステムおよび方法は、単に、患者検体を分析カートリッジ中に直接移入すること、およびカートリッジを機器にロードすることによって、臨床医に、約３０分で感染症を検出し、かつ感染性病原体を同定する能力、および数時間で抗微生物薬感受性試験の結果を決定する能力を提供することができる。 Rapid detection of infectious diseases, identification of pathogens, and determination of antimicrobial susceptibility using the systems and methods of the invention are far more than conventional methods that require long culture steps. Provides the potential to deliver ready-to-use results to quickly guide the effective treatment of a patient's infection. The systems and methods of the invention detect an infectious disease and infectious pathogens in about 30 minutes to the clinician by simply implanting the patient specimen directly into the analysis cartridge and loading the cartridge into the device. Can be provided with the ability to identify and determine the results of antimicrobial susceptibility testing in a matter of hours.
本発明の実施形態は、患者検体から直接的な微生物の検出および有効な処置の同定を含む。 Embodiments of the invention include the detection of microorganisms directly from patient specimens and the identification of effective treatments.
ある特定の態様では、本開示は、抗微生物薬感受性試験のための方法を提供する。本方法は、多微生物検体を得るステップ；検体をウェル中に分割するステップであって、少なくとも一部のウェルが、異なる薬剤または異なる濃度の１種もしくは複数の薬剤を含む、ステップ；ウェル中の検体をインキュベートして、異なる薬剤または異なる濃度の薬剤に応答した差次的成長を可能にするステップ；および各ウェル中の特定の種の個々の細胞を計数して、特定の種の成長を阻害する薬剤または薬剤の濃度を同定するステップを含む。本方法は、抗微生物剤を含有しない対照ウェル中の細胞を計数するステップを含んでいてもよい（例えば、３０～４０℃の規定の温度で、１～１２時間の規定の時間の対照ウェルのインキュベーション後）。本方法は、各ウェル中で計数された細胞の数を対照ウェルからの計数と比較して、異なる薬剤または異なる濃度の薬剤に曝露された場合の微生物の生存率を決定するステップを含んでいてもよい。インキュベートするステップは、種特異的な様式で微生物を蛍光標識するステップを含んでいてもよく、計数するステップは、各ウェルをイメージングするステップ、およびイメージ中の蛍光スポットを計数するステップを含んでいてもよい。標識するステップは、標的特異的なフルオロフォアで標識された核酸または核酸アナログプローブを使用してもよく、計数するステップは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用してもよい。好ましくは、ステップは、核酸増幅を含まない。インキュベートするステップは、約１時間未満続いてもよく、成長培地中で約４０℃より低い温度で行われてもよい。 In certain embodiments, the present disclosure provides methods for antimicrobial susceptibility testing. The method is a step of obtaining a multimicrobial sample; a step of dividing the sample into wells, wherein at least some of the wells contain different agents or different concentrations of one or more agents; Steps to incubate specimens to allow differential growth in response to different or different concentrations of drug; and count individual cells of a particular species in each well to inhibit growth of a particular species. Includes steps to identify the drug or concentration of drug to be used. The method may include counting cells in a control well that does not contain an antimicrobial agent (eg, at a defined temperature of 30-40 ° C., for a defined time of 1-12 hours in the control well. After incubation). The method comprises comparing the number of cells counted in each well with the count from the control well to determine the viability of the microorganism when exposed to different or different concentrations of drug. May be good. The step of incubating may include the step of fluorescently labeling the microorganism in a species-specific manner, and the step of counting includes the step of imaging each well and the step of counting the fluorescent spots in the image. May be good. The labeling step may utilize a nucleic acid or nucleic acid analog probe labeled with a target-specific fluorophore, and the counting step may utilize fluorescence in situ hybridization. Preferably, the step does not include nucleic acid amplification. The incubating step may last less than about 1 hour and may be performed in growth medium at a temperature below about 40 ° C.
ある特定の実施形態では、分割するステップ、インキュベートするステップおよび計数するステップは、ウェルを含むカートリッジを使用して行われる。本方法は、検体の一部をカートリッジ中に移入するステップ、およびカートリッジを分析器にロードするステップを含んでいてもよい。カートリッジは、微生物結合性磁気ビーズを含んでいてもよく、分析器は、磁石を使用して、微生物を検体の他の部分から分離し、イメージングサブシステムを使用して、計数するステップを行ってもよい。一部の実施形態では、分析器は、空気式サブシステムを使用して、ウェルがカートリッジ内にあり、異なる薬剤または異なる濃度の薬剤を予めロードされる、カートリッジ内で分割するステップを行い、分割するステップおよびインキュベートするステップの後、分析器は、ウェルの内容物を対応する試薬ウェルに移入して、そこでインキュベートされた検体を磁気結合性磁気ビーズおよび種特異的な検出可能な標識に曝露させる。分析器は、磁石を使用して、微生物結合性磁気ビーズおよび結合した個々の微生物を、カートリッジ内の検出表面に引き寄せてもよい。 In certain embodiments, the dividing, incubating, and counting steps are performed using a cartridge containing wells. The method may include the step of transferring a portion of the sample into the cartridge and the step of loading the cartridge into the analyzer. The cartridge may contain microbially binding magnetic beads, and the analyzer uses a magnet to separate the microorganism from the rest of the specimen and uses an imaging subsystem to perform a counting step. May be good. In some embodiments, the analyzer uses a pneumatic subsystem to perform and divide within the cartridge, where wells are in the cartridge and preloaded with different or different concentrations of agent. After the steps of .. The analyzer may use magnets to attract the micro-bound magnetic beads and the bound individual microbes to the detection surface within the cartridge.
一部の実施形態では、磁石は、未結合の検出可能な標識を検出表面から排除する色素クッションを介して微生物結合性磁気ビーズを引き寄せる。分析器は、カルーセルおよび／または機械式カートリッジ運搬体を使用して、カートリッジをイメージングサブシステムに移動させて、計数するステップが行われてもよい。一部の実施形態では、種特異的な検出可能な標識は、特定の種の微生物の核酸を標的化するようにハイブリダイズする蛍光核酸プローブを含む。インキュベートするステップおよび計数するステップは、分析器内で生理学的温度で実質的に蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を達成してもよい。 In some embodiments, the magnet attracts microbially bound magnetic beads through a dye cushion that removes unbound detectable labels from the detection surface. The analyzer may use a carousel and / or a mechanical cartridge carrier to move the cartridge to the imaging subsystem and perform a counting step. In some embodiments, the species-specific detectable label comprises a fluorescent nucleic acid probe that hybridizes to target the nucleic acid of a particular species of microorganism. The incubating and counting steps may achieve substantially fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis at physiological temperature within the analyzer.
微生物の成長を阻害する抗微生物剤を同定するステップは、インキュベートされた検体中の複合体の数を、インキュベートされていない検体中の複合体の数と比較するステップを含んでいてもよい。分析器は、カートリッジを使用して、差次的成長後の個々の微生物の種特異的な計数を行ってもよい。 The step of identifying an antimicrobial agent that inhibits microbial growth may include comparing the number of complexes in an incubated sample with the number of complexes in an unincubated sample. The analyzer may use a cartridge to perform species-specific counting of individual microorganisms after differential growth.
ある特定の実施形態では、ウェルは、カートリッジ内にあり、本方法は、検体の一部をカートリッジ中に移入するステップ、およびカートリッジを分析器にロードするステップを含む。分析器は、カートリッジをマニピュレートして、分割するステップ、インキュベートするステップ、および計数するステップを行う。検体は、移入するステップの前に、ユーザーによる任意の化学試料または分子試料の調製技術を必要としない。移入するステップは、検体の一部を収集容器からカートリッジ上の試料ウェル中にピペッティングするステップによって行われてもよい。 In certain embodiments, the well is in a cartridge, the method comprising the step of transferring a portion of the specimen into the cartridge and the step of loading the cartridge into the analyzer. The analyzer performs steps of manipulating the cartridge, dividing it, incubating it, and counting it. The sample does not require any chemical or molecular sample preparation technique by the user prior to the transfer step. The transfer step may be performed by pipetting a portion of the sample from the collection container into the sample well on the cartridge.
一部の態様では、本開示は、微生物の分析方法を提供する。本方法は、微生物を含む検体を得るステップ；任意のコロニーもしくは細胞の精製または培養のステップを伴わずに、検体の一部をウェル中に移入するステップであって、ウェルが、種特異的な検出可能な標識および微生物結合性磁気ビーズを含む、ステップ；磁石を使用して、イメージング表面上のビーズを収集するステップ；ならびにイメージング表面上の検出可能な標識をイメージングして、それにより検体の一部中の種の細胞の存在を決定するステップを含む。検体は、移入するステップの前に、ユーザーによる任意の化学試料または分子試料の調製技術を必要としない。本方法は、標的微生物を、ウェル中で種特異的な検出可能な標識で標識するステップ、および微生物を、微生物結合性磁気ビーズに結合させるステップをさらに含んでいてもよく、観察するステップは、未結合の検出可能な標識を洗い流すことなく、標識された磁石結合細胞をイメージングするステップを含む。本方法は、標識された磁石結合細胞の個々の細胞を計数するステップをさらに含んでいてもよい。 In some embodiments, the present disclosure provides a method for analyzing microorganisms. The method is a step of obtaining a sample containing a microorganism; a step of transferring a part of the sample into a well without a step of purifying or culturing any colony or cells, wherein the well is species-specific. Steps containing detectable labels and microbiologically bound magnetic beads; steps to collect beads on the imaging surface using a magnet; and imaging the detectable label on the imaging surface, thereby one of the specimens. Includes steps to determine the presence of seed cells throughout the part. The sample does not require any chemical or molecular sample preparation technique by the user prior to the transfer step. The method may further comprise labeling the target microorganism with a species-specific detectable label in the well, and binding the microorganism to the microbially binding magnetic beads, the observing step. It comprises imaging labeled magnet-bound cells without flushing unbound detectable labels. The method may further include counting the individual cells of the labeled magnet-bound cells.
ある特定の実施形態では、ウェルは、カートリッジ内に提供され、収集するステップおよびイメージングするステップは、ビーズおよび細胞がカートリッジ内にある間に起こる。本方法は、以下を含んでいてもよい。 In certain embodiments, wells are provided within the cartridge, and the steps of collecting and imaging occur while the beads and cells are in the cartridge. The method may include:
カートリッジを、収集するステップおよびイメージングするステップを行う分析器にロードするステップ。分析器は、標識された微生物をイメージングするための少なくとも１つのイメージングサブシステムを含む、複数のサブシステム、およびサブシステム間で試験カートリッジを輸送するために動作可能なカルーセルを含んでいてもよい。 The step of loading the cartridge into an analyzer that performs the steps of collecting and imaging. The analyzer may include multiple subsystems, including at least one imaging subsystem for imaging labeled microorganisms, and a carousel capable of transporting test cartridges between the subsystems.
移入するステップは、検体をカートリッジの受け入れウェル中に移入するステップを含んでいてもよく、その後、分析器は、検体をカートリッジ内の複数の分割ウェルに分割してもよい（ウェルは、分割ウェルの１つである）。種特異的な検出可能な標識は、種の細胞の核酸と特異的にハイブリダイズする蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含んでいてもよい。イメージングするステップは、カートリッジ内で一定の生理学的温度での蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を含んでいてもよい。 The transfer step may include the step of transferring the sample into the receiving well of the cartridge, after which the analyzer may divide the sample into multiple split wells within the cartridge (wells are split wells). It is one of). The species-specific detectable label may include a fluorescently labeled oligonucleotide probe that specifically hybridizes to the nucleic acid of the species cell. The step of imaging may include fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis at a constant physiological temperature within the cartridge.
一部の実施形態では、イメージング表面上のビーズを収集するステップは、色素クッションが未結合の検出可能な標識をイメージング表面から排除しながら、ウェル中の色素クッションを介してビーズを磁気的に引き寄せるステップを含む。好ましくは、種の細胞は、移入するステップの約３０分以内に、検体中に存在すると決定される。 In some embodiments, the step of collecting the beads on the imaging surface magnetically attracts the beads through the dye cushion in the well, while removing the detectable label from which the dye cushion is unbound from the imaging surface. Including steps. Preferably, the seed cells are determined to be present in the sample within about 30 minutes of the transfer step.
一部の実施形態では、本発明は、患者検体から直接的な、微生物検出および有効な処置の同定を含む。ある特定の態様では、本発明は、微小生物の同定を提供する。微生物同定は、患者検体、例えば、全血、血漿、血清、尿、痰、唾液、糞便、脳脊髄液、羊水、腹水、膿、リンパ液、膣分泌物、鼻分泌物、嘔吐物、汗および組織から、検体調製ステップなしに直接的に達成される。例えば、方法は、微生物同定のために、尿検体を分析カートリッジデバイス中に直接的に移動させるステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、患者検体を分析カートリッジの試料ウェル中に直接的に移動させるステップ、および種特異的様式で微生物を標識し、標識された微生物をイメージングし、標識された微生物を同定するためにカートリッジを操作するステップを含む。微生物を標識するステップは、検体を種特異的標識に曝露するステップを含む。標識は、標的特異的磁気タグおよび検出可能な標識を含んでいてもよい。検出可能な標識は、種特異的蛍光プローブを含んでいてもよい。プローブは、微生物の種の核酸のみ優遇であってもよい。特定の種の微生物に曝露されると、プローブは、微生物の種の検出について可能にするその種とのみハイブリダイズする。このように、検体中の微生物の複数の種を同定することができ、異なる抗微生物薬または他の処置に対する感受性を単一の分析カートリッジで試験することができる。一部の実施形態では、カートリッジを操作するステップは、カートリッジを機器にロードして、カートリッジ内の患者検体中の微生物を同定するステップを含んでいてもよい。本発明は、患者検体を直接受け入れ、処理して、微生物を同定する、および／またはカートリッジ内で治療感受性および有効性をすべて決定することができる、分析カートリッジおよび機器を提供する。 In some embodiments, the invention comprises detecting microorganisms and identifying effective treatments directly from a patient specimen. In certain aspects, the invention provides identification of microbes. Microbial identification includes patient specimens such as whole blood, plasma, serum, urine, sputum, saliva, feces, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascites, pus, lymph, vaginal secretions, nasal secretions, vomitus, sweat and tissues. From, it is achieved directly without the sample preparation step. For example, the method may include moving the urine sample directly into the analysis cartridge device for microbial identification. In some embodiments, the method involves moving the patient sample directly into the sample well of the analysis cartridge, and labeling the microorganism in a species-specific manner, imaging the labeled microorganism, and labeling the microorganism. Includes steps to operate the cartridge to identify. The step of labeling the microorganism comprises the step of exposing the specimen to the species-specific label. The label may include a target-specific magnetic tag and a detectable label. The detectable label may include a species-specific fluorescent probe. The probe may be preferential only for nucleic acids of microbial species. Upon exposure to a particular species of microorganism, the probe hybridizes only with that species, which allows for detection of the species of microorganism. Thus, multiple species of microorganisms in a sample can be identified and susceptibility to different antimicrobial agents or other treatments can be tested with a single analytical cartridge. In some embodiments, the step of manipulating the cartridge may include loading the cartridge into an instrument and identifying the microorganism in the patient specimen in the cartridge. The present invention provides analytical cartridges and instruments capable of directly accepting and processing patient specimens to identify microorganisms and / or determine all therapeutic susceptibility and efficacy within the cartridge.
本発明のシステムおよび方法は、本発明の方法を実施するために分析カートリッジとインタラクトするために使用され得る機器または分析器を含む。機器は、本発明の方法を実施するための複数のサブシステムを含み得る。分析カートリッジは、カートリッジ内の検体を処理するための複数のサブシステムを有する機器中にロードされ得る。好ましい実施形態では、複数のサブシステムのうち１つは、カートリッジ内で標識された微生物をイメージングするためのイメージングサブシステムであり得る。機器のサブシステムには、空気圧サブシステム、磁気サブシステムおよび廃棄物サブシステムもまた含まれ得る。機器はまた、カルーセル、機械式カートリッジ運搬体、および機器内でカートリッジを動かし、マニピュレートするためのタスクスケジューラーを含んでいてもよい。機器は、一定温度で、処理するステップのすべてを行うことができる。 The systems and methods of the invention include instruments or analyzers that can be used to interact with analytical cartridges to carry out the methods of the invention. The device may include a plurality of subsystems for carrying out the method of the present invention. The analytical cartridge can be loaded into a device that has multiple subsystems for processing the specimens in the cartridge. In a preferred embodiment, one of the plurality of subsystems can be an imaging subsystem for imaging labeled microorganisms within a cartridge. Instrument subsystems may also include pneumatic subsystems, magnetic subsystems and waste subsystems. The device may also include a carousel, a mechanical cartridge carrier, and a task scheduler for moving and manipulating the cartridge within the device. The device can perform all the steps of processing at a constant temperature.
機器およびデバイスを含む本発明のシステムおよび方法は、感染を検出すること；全ての型の病原体細胞を検出、同定および定量化すること；抗微生物薬感受性を決定すること；毒素、ウイルス、および宿主－応答因子を含むバイオマーカーを検出および定量化すること；ならびに診断的に情報価値のあるヒトまたは宿主細胞を検出および定量化することを含む、広範な診断機能を実施することができる。本発明のシステムおよび方法は、単一のデバイス（例えば、分析カートリッジ）中で、単一の検体に対してかかる診断機能を単独でまたは組み合わせて同時に実施することが可能である。本発明のシステムおよび方法は、（例えば、***、血液感染および呼吸器感染についての）異なる型の診断試験を実施する複数のかかるデバイスが、単一の機器上で同時に処理され得るように、ランダムアクセス処理の性能を含む。このように、本明細書に記載される機器およびカートリッジは、かかる機能性を提供し、デバイス内で検体を処理するためにしかるべくマニピュレートされ得る。 The systems and methods of the invention, including devices and devices, detect infections; detect, identify and quantify all types of pathogen cells; determine antimicrobial susceptibility; toxins, viruses, and hosts. -A wide range of diagnostic functions can be performed, including detecting and quantifying biomarkers containing response factors; as well as detecting and quantifying diagnostically informative human or host cells. The systems and methods of the invention can simultaneously perform such diagnostic functions on a single sample, alone or in combination, in a single device (eg, an analytical cartridge). The systems and methods of the invention allow multiple such devices that perform different types of diagnostic tests (eg, for urinary tract infections, blood infections and respiratory infections) to be processed simultaneously on a single device. , Includes random access processing performance. As such, the devices and cartridges described herein provide such functionality and can be appropriately manipulated to process specimens within the device.
本発明の方法およびシステムは、分析カートリッジを、機器内のカルーセルを介して機器の複数のサブシステムに輸送するステップを含むことができる。本発明の一部の実施形態では、機器内の機械式運搬体の機構は、各々の分析カートリッジをカルーセルおよび機器の様々なサブシステムの間を移動させる。機械式カートリッジ運搬体は、押力を適用して、カートリッジをカルーセルに移動させ、かつそれを外す。一部の実施形態では、機器は、複数のサブシステムのなかで、各々の分析カートリッジの輸送および移動を管理するためのタスクスケジューラーを含む。 The methods and systems of the invention can include transporting the analytical cartridge through a carousel within the instrument to multiple subsystems of the instrument. In some embodiments of the invention, the mechanical carrier mechanism within the instrument moves each analytical cartridge between the carousel and various subsystems of the instrument. The mechanical cartridge carrier applies a pushing force to move the cartridge to the carousel and remove it. In some embodiments, the instrument comprises a task scheduler for managing the transport and movement of each analytical cartridge within a plurality of subsystems.
一部の実施形態では、各カートリッジがサブシステム中で費やす時間を含む、機器内の各々の分析カートリッジの動きの管理は、機器内のタスクスケジューラーによって行われてもよい。本方法は、各々のカートリッジのために必要な様々なサブシステムにおける時間を予約するステップを含んでいてもよい。本方法は、カートリッジをサブシステムの１つからカルーセルに移動させ、別のサブシステムの１つに隣接するカートリッジの位置にカルーセルを回転させる、機械式カートリッジ運搬体を操作するステップも含んでいてもよい。本発明の一部の実施形態では、タスクスケジューラーは、カートリッジの内容物を同定することによって、分析カートリッジの動き（すなわち、行われる分析のステップ／パラメーター）を管理してもよい。カートリッジの内容物および必要な処理は、カートリッジ上のタグに関連していてもよい。本発明の一部の実施形態では、各々の分析カートリッジは、機器によって読み取り可能なタグを含む。機器は、バーコード分析器を介してタグを読み取り、タグをタスクスケジューラーが実行する命令の特定のセットに関連付けてもよい。タグは、バーコードであってもよく、機器中の検体に特異的／固有であってもよい。 In some embodiments, management of the movement of each analytical cartridge within the instrument, including the time each cartridge spends in the subsystem, may be performed by a task scheduler within the instrument. The method may include reserving time in the various subsystems required for each cartridge. The method may also include manipulating a mechanical cartridge carrier, moving the cartridge from one of the subsystems to the carousel and rotating the carousel to the position of the cartridge adjacent to one of the other subsystems. good. In some embodiments of the invention, the task scheduler may manage the movement of the analytical cartridge (ie, the steps / parameters of the analysis performed) by identifying the contents of the cartridge. The contents of the cartridge and the necessary processing may be related to the tags on the cartridge. In some embodiments of the invention, each analytical cartridge comprises a tag readable by an instrument. The instrument may read the tag through a bar code analyzer and associate the tag with a particular set of instructions executed by the task scheduler. The tag may be a barcode or may be specific / specific to the sample in the device.
本発明のシステムおよび方法は、カートリッジ内で検体を空気圧で分配するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、検体を、試料ウェルからカートリッジ内の複数のウェルに分配するステップを含む。本方法は、検体の分配を、カートリッジ内の複数のバルブの操作によって制御するステップをさらに含む。本発明のある特定の実施形態では、方法は、カートリッジを機器の空気式サブシステムに輸送するステップ、およびサブシステムを操作して、検体を試料ウェルからカートリッジ内の複数のウェルに分配するステップを含む。 The system and method of the present invention comprises the step of pneumatically distributing the specimen within the cartridge. In some embodiments, the method comprises the step of distributing the sample from the sample well to multiple wells in the cartridge. The method further comprises controlling the distribution of the specimen by operating a plurality of valves in the cartridge. In certain embodiments of the invention, the method involves transporting the cartridge to a pneumatic subsystem of the instrument and manipulating the subsystem to distribute the sample from the sample well to multiple wells within the cartridge. include.
本発明のシステムおよび方法は、微生物を標識するために使用される。微生物を標識する方法は、本発明の方法に従って、検体を処理するための特異的な試薬を含有する分析カートリッジ中に検体を直接ロードするステップを含む。試薬としては、例えば、種特異的標識、成長培地、抗微生物剤および色素が挙げられ得る。試薬は、液体形態であってもよく、または好ましくは凍結乾燥されていてもよく、分析カートリッジ（例えば、試験デバイス）内のある特定のウェルにロードされてもよい。試薬は、試験に対して特異的であってもよく、例えば、カートリッジは、試験特異的であってもよい。本発明の方法は、検体を、カートリッジ内に予めロードされた種特異的磁気タグおよび検出可能な標識に曝露することによって、微生物を標識するステップを含む。検体は、空気式分配によって、カートリッジのウェル内の磁気タグおよび検出可能な標識に曝露されてもよい。検出可能な標識としては、蛍光オリゴヌクレオチドまたは抗体プローブ、特異的および非特異的リガンド、レクチン、染料、ならびに標的に結合する色素が挙げられ得る。ある特定の実施形態では、磁気タグは、標的微生物を磁気的に選択およびイメージングする前に、標的微生物に結合する検出可能な標識と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、検出可能な標識は、微生物の種の核酸と特異的にハイブリダイズする蛍光プローブであってもよい。好ましい実施形態では、検出可能な標識は、特定の種の微生物とハイブリダイズする、蛍光性のｒＲＮＡ標的化蛍光性のオリゴヌクレオチドプローブである。ある特定の実施形態では、標識およびイメージングする方法は、細胞標的を標識するための蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ならびにイメージングおよび分析のために標識された標的を検出表面に置く、標識された細胞標的の磁気選択を含む。ある特定の実施形態では、標識および磁気選択ステップは、一定温度で起こる。一部の好ましい実施形態では、これらのステップは、すべて、約３６～３９℃の温度で行われる。 The systems and methods of the invention are used to label microorganisms. The method for labeling a microorganism comprises loading the sample directly into an analytical cartridge containing a specific reagent for processing the sample according to the method of the invention. Reagents may include, for example, species-specific labels, growth media, antimicrobial agents and dyes. The reagents may be in liquid form, or preferably lyophilized, and may be loaded into certain wells within the analytical cartridge (eg, test device). Reagents may be test-specific, for example cartridges may be test-specific. The method of the invention comprises labeling the microorganism by exposing the specimen to a species-specific magnetic tag and detectable label preloaded into the cartridge. Specimens may be exposed to magnetic tags and detectable labels within the wells of the cartridge by pneumatic distribution. Detectable labels may include fluorescent oligonucleotides or antibody probes, specific and non-specific ligands, lectins, dyes, and dyes that bind to the target. In certain embodiments, the magnetic tag is used in combination with a detectable label that binds to the target microorganism prior to magnetically selecting and imaging the target microorganism. In some embodiments, the detectable label may be a fluorescent probe that specifically hybridizes to the nucleic acid of the microbial species. In a preferred embodiment, the detectable label is a fluorescent rRNA-targeted fluorescent oligonucleotide probe that hybridizes to a particular species of microorganism. In certain embodiments, the labeling and imaging methods are fluorescent in situ hybridization (FISH) for labeling cellular targets, as well as placing labeled targets for imaging and analysis on the detection surface, labeled. Includes magnetic selection of cell targets. In certain embodiments, the labeling and magnetic selection steps occur at a constant temperature. In some preferred embodiments, all of these steps are performed at a temperature of about 36-39 ° C.
本発明のある特定の実施形態では、方法は、カートリッジを機器の磁気サブシステムに輸送するステップ、および磁気サブシステムを操作して、標識された微生物を、不透明で高密度の水性色素クッション層を介してカートリッジ内の検出表面に引き出すステップを含む。色素クッション層は、検出表面から未結合の蛍光標識および検体マトリックスを光学的に隔離するように設計することができる。これは、洗浄ステップのための必要性を排除して、標的細胞に結合していない蛍光標識を除去し、ノイズに対してシグナルを増加させ、試料調製ステップのための必要性を最小化または排除することができる。本方法は、標識された微生物を、検出表面に達する前に、色素クッション層を介して引き出すステップを含む。 In certain embodiments of the invention, the method involves transporting a cartridge to a magnetic subsystem of an instrument, and manipulating the magnetic subsystem to dispose of labeled microorganisms, an opaque, dense aqueous dye cushion layer. Includes a step of pulling out to the detection surface in the cartridge through. The dye cushion layer can be designed to optically isolate the unbound fluorescent label and sample matrix from the detection surface. This eliminates the need for the wash step, removes fluorescent labels that are not bound to the target cells, increases the signal to noise, and minimizes or eliminates the need for the sample preparation step. can do. The method comprises the step of withdrawing the labeled microorganism through the dye cushion layer before reaching the detection surface.
本発明のシステムおよび方法は、検体のイメージング分析を提供する。検体は、直接処理され、カートリッジ内でイメージングされて、検体に存在する微生物の正体を決定する。特に、カートリッジの検出表面は、イメージングされ、イメージング分析は、検体中の微生物を同定する。微生物を同定する方法はまた、微生物を定量化するステップを含んでいてもよい。本発明のある特定の実施形態では、方法は、カートリッジを、カルーセルを操作することによって機器のイメージングサブシステムに輸送するステップ、およびサブシステムを操作して、カートリッジの検出表面をイメージングおよび分析するステップを含む。デジタルの非拡大技術は、微生物を同定し、定量化するために使用することができる。 The systems and methods of the invention provide imaging analysis of specimens. The specimen is processed directly and imaged in the cartridge to determine the identity of the microorganism present in the specimen. In particular, the detection surface of the cartridge is imaged and the imaging analysis identifies the microorganism in the specimen. The method for identifying a microorganism may also include a step of quantifying the microorganism. In certain embodiments of the invention, the method transports the cartridge to the imaging subsystem of the instrument by manipulating the carousel, and manipulating the subsystem to image and analyze the detection surface of the cartridge. including. Digital non-expansion techniques can be used to identify and quantify microorganisms.
検体はまた、イメージングの前に、抗微生物剤または各種の種類の他の処置の存在下、様々な濃度でインキュベートされてもよい。インキュベーションは、同じ分析カートリッジまたは異なる分析カートリッジで起こり得る。とにかく、本明細書に記載のようにして処理された検体は、本明細書に記載のインキュベーションステップを含んで、一定の温度で処理することができる。一定温度は、哺乳動物の生理学的温度であり得る。生理学的温度は、４０℃を下回る温度であり得る。好ましい実施形態では、温度は、３６～３９℃である。 Specimens may also be incubated at various concentrations prior to imaging in the presence of antimicrobial agents or other treatments of various types. Incubation can occur on the same or different analytical cartridges. Anyway, the specimens treated as described herein can be treated at a constant temperature, including the incubation steps described herein. The constant temperature can be the physiological temperature of the mammal. The physiological temperature can be below 40 ° C. In a preferred embodiment, the temperature is 36-39 ° C.
本発明のシステムおよび方法は、微生物を同定するため、および検体中の微生物の抗微生物薬感受性について試験するために使用することができる。本発明の方法は、別々の分析カートリッジで、または同じカートリッジ内で行われてもよい。本発明の好ましい実施形態では、分析カートリッジは、検体を直接受け入れ、内部で検体を別々の部分に分割し、ここで、１つまたは複数の部分は、１つまたは複数の種特異的な検出可能な標識に曝露されてもよい。部分は、処理およびイメージングされて、各々の部分中の微生物を同定する。ある特定の実施形態では、同定および抗微生物薬感受性試験は、同じデバイス中で１種の同じ検体で行うことができる。 The systems and methods of the invention can be used to identify microorganisms and to test the antimicrobial susceptibility of microorganisms in specimens. The method of the invention may be performed on separate analytical cartridges or within the same cartridge. In a preferred embodiment of the invention, the analytical cartridge directly receives the sample and internally divides the sample into separate parts, where one or more parts can be detected one or more species-specific. May be exposed to various labels. The parts are processed and imaged to identify the microorganisms in each part. In certain embodiments, identification and antimicrobial susceptibility testing can be performed on the same sample of one species in the same device.
本発明の方法は、多微生物検体の抗微生物薬感受性試験を含む。方法は、対象からの多微生物検体を複数の区画中に分配するステップを含む。１つまたは複数の区画は、異なる抗微生物剤を含有していてもよく、異なる抗微生物剤の存在下でインキュベートされて、インキュベートされた部分中の差次的成長を決定してもよい。１つまたは複数の区画は、他の区画中の変化を決定するためのベースラインを提供するために、抗微生物剤に曝露されなくてもよい。区画はまた、成長培地の存在下でインキュベートされてもよい。区画は、種特異的な検出可能な標識に曝露される。区画は、各々の区画中の微生物を同定および定量化するためにイメージングされる。各々の区画中の微生物の数を分析することで、病原因子の成長を低減、またはさらには防止する上での各抗微生物剤の有効性を同定する。各々の区画中の微生物の数を計数し、比較することによって、処置の有効性が決定される。一部の実施形態では、方法は、インキュベートされた区画中の微生物の数をベースライン区画中の微生物の数と比較するステップを含む。ある特定の態様では、抗微生物薬感受性試験の方法は、検体を分析カートリッジに直接置くことによって行われてもよい。分析カートリッジは、抗微生物薬感受性試験を行うために、検体をカートリッジ内の複数の区画中に分割する。抗微生物薬感受性試験の方法は、機器にカートリッジを導入する時間内、好ましくは約４時間以内に行われる。 The methods of the invention include antimicrobial susceptibility testing of multimicrobial specimens. The method comprises the step of distributing a multimicrobial specimen from a subject into multiple compartments. One or more compartments may contain different antimicrobial agents and may be incubated in the presence of different antimicrobial agents to determine differential growth in the incubated portion. One or more compartments may not be exposed to antimicrobial agents to provide a baseline for determining changes in the other compartments. The compartment may also be incubated in the presence of growth medium. The compartment is exposed to species-specific detectable labels. The compartments are imaged to identify and quantify the microorganisms in each compartment. Analyzing the number of microorganisms in each compartment identifies the effectiveness of each antimicrobial agent in reducing or even preventing the growth of virulence factors. The effectiveness of the treatment is determined by counting and comparing the number of microorganisms in each compartment. In some embodiments, the method comprises comparing the number of microorganisms in the incubated compartment with the number of microorganisms in the baseline compartment. In certain embodiments, the method of antimicrobial susceptibility testing may be performed by placing the specimen directly on an analytical cartridge. The analytical cartridge divides the specimen into multiple compartments within the cartridge for antimicrobial susceptibility testing. The method of antimicrobial susceptibility testing is performed within the time of introducing the cartridge into the device, preferably within about 4 hours.
ある特定の態様では、本発明は、検体中の微生物の抗微生物薬感受性を同定および決定するためのシステムを提供する。好ましいシステムは、分析カートリッジを含み、患者検体を受け入れるように動作可能であり、分析カートリッジを受け入れるように動作可能な機器を含む。ある特定の実施形態では、同定、抗微生物薬感受性試験のための分析カートリッジは、種特異的標識、抗微生物剤、および様々な微生物に特異的な成長培地などの試薬を予めロードされて、提供される。一部の実施形態では、分析カートリッジは、カートリッジ内に複数のウェル（または区画）を含有する。カートリッジ内の複数のウェルは、少なくとも試料ウェル、分配ウェルおよびイメージングウェルを含んでいてもよい。一部の実施形態では、本発明のシステムは、検体を、試料ウェルからカートリッジ内の複数のウェルに分配する。ある特定の態様では、検体は、試料ウェルから、抗微生物剤およびインキュベーションのための成長培地を予めロードされた複数の分配ウェルに分配される。インキュベートされた検体は、次いで、分配ウェルから、インキュベートされた検体を複合体を形成するための種特異的標識に曝露する試薬ウェルに移入されてもよい。 In certain aspects, the invention provides a system for identifying and determining the antimicrobial susceptibility of a microorganism in a specimen. A preferred system includes an analytical cartridge, an instrument capable of operating to accept a patient specimen, and an instrument capable of accepting an analytical cartridge. In certain embodiments, analytical cartridges for identification, antimicrobial susceptibility testing are preloaded with reagents such as species-specific labels, antimicrobial agents, and growth media specific for various microorganisms. Will be done. In some embodiments, the analytical cartridge contains a plurality of wells (or compartments) within the cartridge. The plurality of wells in the cartridge may include at least a sample well, a distribution well and an imaging well. In some embodiments, the system of the invention distributes a sample from a sample well into a plurality of wells in a cartridge. In certain embodiments, the sample is dispensed from the sample well into a plurality of preloaded distribution wells with antimicrobial agents and growth medium for incubation. The incubated sample may then be transferred from the distribution well into a reagent well that exposes the incubated sample to a species-specific label for forming a complex.
ユーザーは、適切な適用に特異的なカートリッジを選択し、特異的診断試験および分析を行うためにそれら中の患者検体を直接移入してもよい。カートリッジは、適用可能な分析により検体を処理する機器にロードされてもよい。機器は、カートリッジ上のバーコードなどのタグをスキャンすることによって必要な処理ステップを同定してもよく、ここで、タグは、行われる分析に特異的である。 The user may select cartridges specific for the appropriate application and directly transfer the patient specimens in them for specific diagnostic testing and analysis. The cartridge may be loaded into a device that processes the specimen with applicable analysis. The instrument may identify the required processing steps by scanning tags such as barcodes on the cartridge, where the tags are specific to the analysis performed.
本発明のシステムおよび方法を使用して得られる結果は、処置の決定の情報を提供するために使用されてもよい。方法は、病原因子として同定された微生物の成長または生存率を低減させる上で有効であるとして同定された患者に処置を投与することを含んでいてもよい。 Results obtained using the systems and methods of the invention may be used to provide information on treatment decisions. The method may include administering the treatment to a patient identified as effective in reducing the growth or viability of the microorganism identified as a virulence factor.
本発明は、検体調製を伴わない、微生物の迅速な自動化された分析のためのシステムおよび方法を提供する。本発明のシステムおよび方法は、患者検体から直接的な微生物の同定および抗微生物薬感受性試験（ＡＳＴ）を提供する。検体中の微生物は、様々な抗微生物剤の存在下で差次的成長について分析され得る。検体のマニピュレーション、インキュベーション、処理および分析ステップはすべて単一の分析カートリッジ内で行われる。同定分析は、約３０分で完了することができ、抗微生物薬感受性試験は、約４時間半で完了し得る。本発明のシステムおよび方法は、種特異的標識、ならびに非拡大デジタルイメージングおよびイメージ分析を使用して、微生物などの標的を同定して、検体中の標的を正確かつ迅速に同定および定量化する。本発明のシステムおよび方法は、好ましくは、標的の病原体細胞を精製するために処理されていない、好ましくは、ユーザーによる手動の検体調製を必要としない検体において、微生物の同定および抗微生物薬感受性試験分析を可能にする。検体とのユーザーの相互作用についての必要性を最小化して、本発明のシステムおよび方法は、従来技術で必要な数日と比較して、それぞれ数分および数時間以内に、患者検体から直接的な微生物同定および抗微生物薬感受性試験分析の結果を提供する。分析カートリッジは、機器によって自動的に処理されて、微生物を同定するため、および抗微生物薬感受性試験分析を行うために必要なステップの各々を行うことができる。 The present invention provides systems and methods for rapid automated analysis of microorganisms without sample preparation. The systems and methods of the invention provide microbial identification and antimicrobial susceptibility testing (AST) directly from patient specimens. Microorganisms in the specimen can be analyzed for differential growth in the presence of various antimicrobial agents. Specimen manipulation, incubation, processing and analysis steps are all performed within a single analysis cartridge. The identification analysis can be completed in about 30 minutes and the antimicrobial susceptibility test can be completed in about 4 and a half hours. The systems and methods of the invention use species-specific labeling, as well as non-magnifying digital imaging and image analysis, to identify targets such as microorganisms to accurately and rapidly identify and quantify targets in specimens. The systems and methods of the invention preferably identify microorganisms and test antimicrobial susceptibility in specimens that have not been treated to purify target pathogen cells, preferably that do not require manual specimen preparation by the user. Enables analysis. Minimizing the need for user interaction with the specimen, the systems and methods of the invention are directly from the patient specimen within minutes and hours, respectively, compared to the days required by prior art. The results of microbial identification and antimicrobial susceptibility test analysis are provided. Analytical cartridges can be automatically processed by the instrument to perform each of the steps required to identify microorganisms and to perform antimicrobial susceptibility test analysis.
図１は、抗微生物薬感受性試験のための方法１０１の略図である。方法１０１は、多微生物検体を得るステップ１０５を含む。任意の試料調製、コロニー精製または他の方法なしで、生の元の検体は、ウェルに分割される１０９。少なくとも一部のウェルは、異なる薬剤または異なる濃度の１つもしくは複数の薬剤を含む。方法１０１は、ウェル中で検体をインキュベートして１１５、異なる薬剤または異なる濃度の薬剤に応答した差次的成長を可能にするステップを含む。最後に、特定の種の個々の細胞は、各ウェル中で計数されて１２１、特定の種の成長を阻害する薬剤または薬剤の濃度を同定する。抗微生物薬感受性試験のための方法について重要なことは、（ｉ）細胞／コロニー精製なし；（ｉｉ）多微生物試料；（ｉｉｉ）差次的成長；（ｉｖ）種特異的検出；および（ｖ）個々の細胞の計数である。細胞またはコロニーの精製が含まれないと言うことは、血液または別の体液である検体を、方法に直接インプットしてもよいこと、生の検体はウェルに分割されて１０９、異なる薬剤または１つもしくは複数の薬剤の濃度でインキュベートされる１１５ことも意味する。方法１０１は、多微生物試料に不応性であり、他の微生物の存在にかかわらず、種特異的な結果を提供する。種特異的検出は、特定の種のｒＲＮＡとハイブリダイズする蛍光標識されたオリゴなどの種特異的プローブを介して操作する。差次的成長は、特定の種の細胞が、異なる抗微生物薬またはその濃度の存在に依存して、異なるウェル中で異なって成長することを意味する。最後に、標識後、本開示の方法およびデバイスは、拡大なしで個々の細胞を計数するために有用である。インキュベート１１５するステップは、種特異的な様式で微生物を蛍光標識するステップを含んでいてもよく、計数する１２１ステップは、各ウェルをイメージングするステップ、およびイメージ中の蛍光スポットを計数するステップを含んでいてもよい。標識するステップは、標的特異的なフルオロフォアで標識された核酸または核酸アナログプローブを使用してもよく、計数するステップは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用してもよい。とりわけ、ステップは、核酸の抽出、精製または増幅を必要としない。ある特定の実施形態では、分割する１０９ステップ、インキュベートする１１５ステップおよび計数する１２１ステップは、ウェルを含むカートリッジ内で行われる。
FIG. 1 is a schematic representation of
図２は、例示的なカートリッジ２０１（例えば、分析カートリッジ、試験デバイス）を示す。カートリッジ２０１は、チャネル２１５を介して分割ウェル２０５に接続される試料ウェル２０３を含む。各分割ウェルは、スライディングバルブ２０７を介したチャネルによって対応する試薬ウェル２０９に接続可能である。試薬ウェル２０９は、１つまたは任意の数の試薬を含んでいてもよく、これは、例えば凍結乾燥ビーズであってもよい粒子２４１中に存在してもよい。各試薬ウェル２０９は、対応するイメージングウェル２１１に流体的に接続されてもよい。１つまたは複数のイメージングウェル２１１は、色素クッション２１５を含んでいてもよい。カートリッジは、必要に応じて、希釈剤リザーバー２２１を含み、ボタン２２７が押されると、希釈剤（例えば、トリプチケースソイブロスまたは生理食塩水などの成長培地）は分割ウェル２０５中に流入する。カートリッジは、一般に、長さｌ、高さｈおよび幅ｗの寸法、例えば、約６ｃｍのｌ、約４ｃｍのｈおよび約２ｃｍのｗに従って記載され得る。分析カートリッジ２０１は、手動で、または検体が、例えば、種特異的な検出可能な標識、およびイメージングのために検体中の標的と四元複合化体を一緒に形成することができる磁気タグに曝露される機器（例えば、分析器）と組み合わせて、動作可能である。例えば、種特異的な検出可能な標識は、当技術分野において公知のイメージングによって検出される任意の好適な標識であってもよい。好ましい実施形態では、検出可能な標識は、微生物の種に専用のリボソームＲＮＡ配列に相補的なフルオロフォアで標識されたオリゴヌクレオチドプローブである。複合体は、分析カートリッジ２０１上の磁場を使用することによって未結合の標識から分離して、複合体をカートリッジ２０１内の表面に引き寄せることができる。次いで、微生物複合体をイメージングすることができ、イメージを分析して（手動で、またはコンピューターデバイスによって）、検体中に存在する微生物を同定することができる。報告が生成されてもよい。報告は、例えば、微生物標的および／またはイメージの同定を与えてもよい。報告は、定性的な結果（「検出された感染症」）を含んでいてもよい。報告は、結果が、病原体標的のパネルについての閾値レベルを上回るか、または下回るかを述べてもよい。報告は、抗微生物薬感受性プロファイルを与えてもよい。微生物同定の実施形態などの様々な実施形態では、分析カートリッジ２０１は、検体が１つまたは複数の微生物を含有すると疑ったユーザーが、微生物同定のために事前充填された分析カートリッジを選択することができるように、１つまたは複数の種特異的標識を予めロードされていてもよい。抗微生物薬感受性試験の実施形態では、検体１０５は、カートリッジ２０１内の部分に分配されてもよく、各部分は、異なる抗微生物薬、または１つまたは複数の抗微生物薬の異なる濃度などの異なる試薬を含有していてもよい。
FIG. 2 shows an exemplary cartridge 201 (eg, analytical cartridge, test device).
検出可能な標識としては、蛍光分子、放射性同位元素、質量分析のための質量タグ、または化学発光分子が挙げられ得る。検出可能な標識は、特定の種の微生物に優先的に結合する種特異的部分を含んでいてもよい。種特異的結合性分子としては、例えば、標的特異的分子または抗原に対する抗体、または種特異的核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドプローブが挙げられ得る。好ましい実施形態では、微生物の検出可能な標識化は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を含む。ＦＩＳＨ分析は、微生物の種が次いで光学的に検出され得るように、核酸（または核酸アナログ）プローブ部、および種特異的核酸配列との再会合を介して結合するフルオロフォアプローブ部を含む蛍光プローブを使用する。例えば、種特異的１６Ｓ ｒＲＮＡを標的化するプローブは、選択的にタグ化し、微生物を検出するために使用することができる。参照によって組み込まれるＶｏｌｋｈａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｌｌｏｗｓ Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３８（２）：８３０－８３８を参照されたい。好ましい実施形態では、検出可能な標識は、微生物の種に専用のリボソームＲＮＡに相補的な蛍光で標識されたプローブのオリゴヌクレオチドである。 Detectable labels may include fluorescent molecules, radioactive isotopes, mass tags for mass spectrometry, or chemiluminescent molecules. The detectable label may include a species-specific moiety that preferentially binds to a particular species of microorganism. Species-specific binding molecules may include, for example, antibodies to target-specific molecules or antigens, or oligonucleotides or polynucleotide probes complementary to species-specific nucleic acid sequences. In a preferred embodiment, the detectable labeling of the microorganism comprises fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH analysis is a fluorescent probe that includes a nucleic acid (or nucleic acid analog) probe and a fluorophore probe that binds through reassociation with a species-specific nucleic acid sequence so that the species of microorganism can then be detected optically. To use. For example, probes that target species-specific 16S rRNA can be selectively tagged and used to detect microorganisms. Volkhard, et al. Incorporated by reference. , 2000, Fluorescent In Situ Hybridization Allows Rapid Identification of Microorganisms in Blood Cultures, J Clin Microbiol. , 38 (2): 830-838. In a preferred embodiment, the detectable label is a fluorescence-labeled probe oligonucleotide complementary to ribosomal RNA dedicated to the species of microorganism.
種特異的プローブは、当技術分野において公知の方法に従って設計される。例えば、種特異的プローブは、ＡＲＢ、ＰＲＩＭＲＯＳＥおよびｍａｔｈＦＩＳＨなどのソフトウェア、ならびにｐｒｏｂｅＢＡＳＥ、ＲＤＰおよびＳＩＬＶＡなどの公開されているデータベースを使用することによって設計されてもよい。検体中の微生物を同定することに関する本発明の実施形態は、単一検体中の複数の別個の種の微生物を独立して同定するための別個の種特異的蛍光プローブなどの多くの検出可能な標識を含んでいてもよい。別個の蛍光プローブは、アッセイの再会合条件下で、蛍光プローブの核酸プローブ部が、別個の種の微生物の種特異的核酸配列と優先的に再会合するように設計された別個の核酸プローブ部を含むことができる。 Species-specific probes are designed according to methods known in the art. For example, species-specific probes may be designed using software such as ARB, PRIMROSE and matFISH, as well as publicly available databases such as probeBASE, RDP and SILVA. Embodiments of the invention relating to the identification of microorganisms in a sample are many detectable, such as distinct species-specific fluorescent probes for independently identifying microorganisms of multiple distinct species in a single sample. It may include a sign. The separate fluorescent probe is a separate nucleic acid probe section designed so that under conditions of assay reassociation, the nucleic acid probe section of the fluorescent probe preferentially reassociates with the species-specific nucleic acid sequence of a separate species of microorganism. Can be included.
別個の蛍光プローブ上のフルオロフォアは、アッセイ中の異なる種の微生物に対する蛍光シグナルがそれらの別個の光子シグナルによって区別することができるように、別個の光子シグナルを有することができる。複数の別個の光子シグナルを識別するためのイメージング方法は、当業者に公知である。例えば、複数のイメージは、別個のフルオロフォアの作用スペクトルに対応する励起および放出光学フィルターの別個の対を使用して取得することができる。したがって、単一検体の部分は、単一の処理およびイメージングウェル中の複数の特異的標的細胞または微生物の存在について試験することができる。磁気タグは、常磁性粒子を含む、当技術分野において公知の任意のものであり得る。標的特異的磁気タグは、微生物のクラスに、例えば、細菌のみに特異的に結合し得る。 Fluorophores on separate fluorescent probes can have separate photon signals so that fluorescent signals for different species of microorganisms in the assay can be distinguished by their separate photon signals. Imaging methods for identifying multiple distinct photon signals are known to those of skill in the art. For example, multiple images can be obtained using separate pairs of excitation and emission optical filters that correspond to the working spectra of separate fluorophores. Thus, a single sample portion can be tested for the presence of multiple specific target cells or microorganisms in a single treatment and imaging well. The magnetic tag can be any known in the art, including paramagnetic particles. Target-specific magnetic tags can specifically bind to a class of microorganisms, eg, bacteria only.
ある特定の実施形態では、検体中の微生物の同定は、一定温度でのＦＩＳＨ分析を使用することによって行われ、分析が細胞の固定化を必要としない場合、分析の間に追加の試薬を添加し、洗浄を必要としないユーザーは、未結合の蛍光標識を除去し、このようにして、反応の開始からイメージング結果を得るまでの間が約３０分またはそれよりも短く、単一のカートリッジ内での自動検体処理が可能になる。 In certain embodiments, identification of microorganisms in a sample is performed by using FISH analysis at constant temperature, and if the analysis does not require cell immobilization, additional reagents are added during the analysis. However, users who do not require cleaning remove the unbound fluorescent label, thus the time from the start of the reaction to the acquisition of the imaging result is about 30 minutes or less, in a single cartridge. Automatic sample processing is possible.
磁気タグおよび検出可能な標識は、好ましくは、検体中に存在する標的細胞と複合体を形成する。磁場は、磁気粒子に適用されて、洗浄ステップなしで、溶液中で未結合の検出可能な標識から結合した検出可能な標識を物理的に分離することができる。色素クッション層、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第９，６４３，１８０号に記載のものを、磁気粒子および磁場と組み合わせて使用して、高密度で不透明な水性色素クッション層を介して微生物を引き寄せ、イメージング分析のために分析カートリッジのウェル中の検出表面にそれらを置くことができる。色素クッション層中の色素は、好ましくは、イメージングのための機器によって使用される励起光および放出光を吸収するように選択される。したがって、色素クッション層（「アッセイ層」）の上の未結合の検出可能な標識からのシグナルは、検出表面上に磁気的に置かれた標識された標的細胞または微生物複合体からのシグナルの検出を著しく妨げない。同様に、色素クッションの使用は、置かれた標識された標的細胞または微生物複合体からのシグナルの検出を著しく妨げることから、アッセイ層中に含有されていてもよい検体マトリックスからの自己蛍光を防止し得る。色素クッションのこれらの特質は、ユーザーによる検体調製なしで、かつ未結合の標識をカートリッジから除去する洗浄するステップなしで、微生物を検出することを可能にし得る。 Magnetic tags and detectable labels preferably form a complex with the target cells present in the sample. A magnetic field can be applied to the magnetic particles to physically separate the bound detectable label from the unbound detectable label in solution without a wash step. Dye cushioning layers, eg, those described in US Pat. No. 9,643,180, which is incorporated herein by reference, are used in combination with magnetic particles and magnetic fields to create a dense, opaque aqueous dye cushioning layer. Microorganisms can be attracted through and placed on the detection surface in the wells of the analysis cartridge for imaging analysis. The dye in the dye cushion layer is preferably selected to absorb the excitation and emission light used by the instrument for imaging. Therefore, the signal from the unbound detectable label on the dye cushion layer (“assay layer”) is the detection of the signal from the labeled target cell or microbial complex magnetically placed on the detection surface. Does not significantly interfere. Similarly, the use of dye cushions significantly interferes with the detection of signals from placed labeled target cells or microbial complexes, thus preventing autofluorescence from the sample matrix that may be contained in the assay layer. Can be. These properties of the dye cushion may allow the detection of microorganisms without the preparation of the specimen by the user and without the washing step of removing the unbound label from the cartridge.
非拡大デジタルイメージングは、好ましくは、検出表面上に置かれている標識された標的細胞を検出するために使用される。蛍光標識化の好ましい場合では、様々なレンズ、照明光源、励起光源およびフィルターが使用され得る。イメージングシステムは、溶液中の検出可能に標識された標的微生物のデジタルイメージを生成することができるか、またはカートリッジのウェル中の検出表面に引き寄せる、任意のデバイスを含んでいてもよい。イメージングシステムは、本明細書に記載の機器のサブシステム中に含有されていてもよい。イメージングシステムとしては、例えば、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、ライン走査カメラ、ＣＭＯＳアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、フォトダイオードアレイ、光電子増倍管アレイ、または他の種類のデジタルイメージング検出器が挙げられ得る。イメージングは、条件または光源の単一のセット下で行うことができ、フィルターおよび／またはレンズは、異なる光学的に識別可能な標識（例えば、異なる微生物に対応する異なる蛍光プローブ）を検出するためにイメージ間で変更されてもよい。参照によっていずれも組み込まれる米国特許第９，６４３，１８０号および同第８，０２１，８４８号に記載のイメージング技術、分析器および機器は、個々の微生物または他の標的細胞の同定および列挙を可能にし得る。 Non-magnifying digital imaging is preferably used to detect labeled target cells located on the detection surface. In the preferred case of fluorescent labeling, various lenses, illumination light sources, excitation light sources and filters can be used. The imaging system may include any device capable of generating a digital image of the detectably labeled target microorganism in solution or attracting to the detection surface in the wells of the cartridge. The imaging system may be included in a subsystem of the equipment described herein. Imaging systems may include, for example, CCD cameras, CMOS cameras, line scanning cameras, CMOS avalanche photodiodes (APDs), photodiode arrays, photomultiplier tube arrays, or other types of digital imaging detectors. Imaging can be done under a single set of conditions or light sources, and the filter and / or lens to detect different optically identifiable labels (eg, different fluorescent probes corresponding to different microorganisms). It may be changed between images. The imaging techniques, analyzers and instruments described in US Pat. Nos. 9,643,180 and 8,021,848, both incorporated by reference, allow the identification and enumeration of individual microorganisms or other target cells. Can be.
図３は、本発明の別の例示的な方法３０１のステップの略図である。患者検体１０５（例えば、多微生物検体）は、分析カートリッジ２０１中に直接導入されてもよく１０７、任意の事前処置ステップを必要としない。分析カートリッジ２０１は、検体１０５を分析カートリッジ２０１内の複数の部分１１３（例えば、区画）に分割するために１１１、手動で、または機器と組み合わせて動作可能である。１つまたは複数の部分１１３は、抗微生物剤に曝露されなくてもよく、および／またはインキュベートされていなくてもよい。最も左の通路は、抗微生物剤に曝露されるか、および／またはインキュベートされていない検体１５０の部分１１３を示し、成長インキュベーションの前（「時間０計数」）のその部分に存在する標的細胞の数を確立するためにイメージングされる１２３。部分１１３は、分析カートリッジ２０１中に既に存在し得、検体１０５に存在することが疑われるかもしくは知られている標的細胞または微生物に基づいて選択され得る、異なる抗微生物剤の存在下でインキュベートすることができる１１７。例えば、***症に関連する細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）などの細菌の種は、検体中に存在すると疑われ得る。
FIG. 3 is a schematic representation of the steps of another
検体１０５は、検体１０５の分析カートリッジ２０１への導入１０７およびインキュベーション１１５の間の任意の時点で、カートリッジ２０１内の成長培地の量と混合されてもよい。インキュベーション１１５ステップは、約４時間などの好適な時間の量で続け、検体１０５中の微生物の測定可能な差次的成長を可能にし得る。成長培地および／または抗微生物剤は、検体１０５中の分析される微生物に基づいて、選択され、カートリッジ２０１中に含まれてもよい。例えば、同定された微生物の成長を支援することが公知の成長培地、および同定された微生物を処置するために通常使用される治療剤または抗微生物剤が選択されてもよい。好ましい実施形態では、分析カートリッジは、検体中の同定された微生物（例えば、患者の感染症の起源を決定）を有するユーザーが、同定された標的微生物の抗微生物薬感受性試験分析のために適切な事前パッケージ化分析カートリッジを選択することができるように、ある特定の標的のための成長培地および治療剤を予めロードされていてもよい。
インキュベーション１１５後、インキュベートされた部分１１７は、例えば、イメージング１２３のために部分中の特異的な微生物と複合体を形成することができる１１９、種特異的磁気タグおよび検出可能な標識に曝露され得る。次いで、微生物１２１複合体を部分中でイメージングすることができ１２３、イメージ１２５を分析して１２７（手動で、またはコンピューターデバイスによって）、各部分中に存在する微生物１２１の量を定量化することができる。様々な抗微生物剤の存在下でインキュベートされた部分中の微生物の量を比較することによって、それらの薬剤のどれが成長を阻害するかを決定することができる。比較は、好ましくは、元の検体から分割され、処理され、インキュベーションなしでイメージングされた、「時間ゼロ計数」の成長参照部分からの標的細胞量を含む。報告１２９は、分析１２７の結果を生成させてもよく、イメージ１２５および処置についての推奨を含んでいてもよい。
After
本発明のシステムおよび方法を使用して試験するために企図される標的微生物および細胞としては、ウイルスまたは細菌が挙げられる。標的微生物は、優先的に、調査される特定の種類の感染症を通常引き起こすものである。例えば、***症のためには、標的病原体としては、２～３例を挙げると、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられ得る。 Targeted microorganisms and cells intended for testing using the systems and methods of the invention include viruses or bacteria. The target microorganism is, preferentially, the one that usually causes the particular type of infectious disease being investigated. For example, for urinary tract infections, the target pathogens include Bacillus antracis, Clostridium difficile, Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis, Acinetobacter ban. Colli, Klebsiella pneumoniae or Pseudomonas aeruginosa can be mentioned.
細菌標的の場合では、例えば、検体は、様々な抗細菌剤の存在下でインキュベートすることができ、検体中の標的細菌の成長に対するこれらの薬剤の効果を分析して、有効性を決定することができる。本明細書に記載のシステムおよび方法は、がん細胞に対する化学療法剤の細胞傷害性効果の測定、または検体中のウイルス負荷に対する様々な抗ウイルス剤の有効性を測定するために同様に適用することができる。様々な標的細胞および微生物にわたって必要とされ得る唯一の変化は、標的特的結合性分子（例えば、細菌細胞表面特異的抗体、ウイルス特異的オリゴヌクレオチドプローブまたは細胞特異的色素）、試験される処置（例えば、抗ウイルス薬、抗細菌剤またはがん療法）、インキュベーション時間、および一部の場合では、イメージ分析で分析される特性（例えば、ＣＦＵ定量化、ウイルス負荷、または細胞の数、形態もしくは機能）である。 In the case of bacterial targets, for example, the specimen can be incubated in the presence of various antibacterial agents and the effect of these agents on the growth of the target bacteria in the specimen is analyzed to determine efficacy. Can be done. The systems and methods described herein are similarly applied to measure the cytotoxic effects of chemotherapeutic agents on cancer cells, or to measure the effectiveness of various antiviral agents on viral loading in specimens. be able to. The only changes that may be required across a variety of target cells and microorganisms are target specific binding molecules (eg, bacterial cell surface-specific antibodies, virus-specific oligonucleotide probes or cell-specific dyes), treatments tested (eg. For example, antiviral agents, antibacterial agents or cancer therapies), incubation time, and in some cases the properties analyzed by image analysis (eg, CFU quantification, viral loading, or cell number, morphology or function. ).
カートリッジ２０１は、検体を受け入れるための入口または試料ウェル２０３、分配ウェル２０５、試薬ウェル２０９、イメージングウェル２１１、およびウェルの間を検体が動くためのチャネル２１３、ならびにその動きを制御するためのバルブ２０７を含む。カートリッジ２０１は、分析器などの機器と適合する場合、試料ウェル２０３中の検体を受け入れ、検体をチャネル２１３を介して分配ウェル２０５中の部分に分割するために動作可能である。バルブ２０７は、分配ウェル２０５および試薬ウェル２０９およびイメージングウェル２１１の間の流体の動きを制御することができる。本発明の微生物同定の適用では、バルブ２０７は、１つまたは複数の部分が分配ウェル２０５を迂回すること、ならびに１つまたは複数の試薬ウェル２０９およびイメージングウェル２１１に直接進むことを可能にするように構成されてもよい。試薬ウェル２０９は、イメージングのために、微生物を標識するための試薬で事前に充填されていてもよい。標識化試薬は、保管のために凍結乾燥され、流体の検体部分との接触の際の活性化されてもよい。試薬ウェル２０９は、例えば、検体部分が試薬ウェル２０９を通過する時に、標的微生物、検出可能な標識および磁気タグを含む微生物特異的複合体が形成されるように、検出可能な標識および磁気タグを含有していてもよい。
The
本発明の他の実施形態では、バルブ２０７はまた、１つまたは複数の部分が分配ウェル２０５を迂回すること、ならびに１つまたは複数の試薬ウェル２０９およびイメージングウェル２１１に直接進んで、抗微生物薬感受性試験のためのゼロ成長参照またはベースラインを提供することを可能にするように構成されてもよい。分配ウェル２０５は、成長培地、および／または１つもしくは複数の抗微生物剤で事前充填することができる。バルブ２０７は、様々な抗微生物剤の存在下、任意の期間インキュベートするために、分配ウェル２０５に検体部分を保持することができる。
In another embodiment of the invention, the
図４は、カートリッジ２０１内の検体の微生物同定および抗微生物薬感受性試験を行うための例示的な機器６０１（例えば、分析器）を示す。機器６０１は、検体の標的細胞の同定および抗微生物薬感受性試験を行うために、カートリッジ２０１と相互作用させるために使用されてもよい。機器６０１は、プロンプト、結果、報告を表示するため、およびコマンドを受信するための少なくとも１つのユーザーインターフェース６０３（例えば、タッチスクリーン）を含む。機器６０１は、異なる機能領域およびサブシステムを含むことができる。これらは、分析カートリッジを輸送およびインキュベートするためのカルーセル；カートリッジの流体との空気式インターフェースを提供する流体サブシステム；磁気；処理およびインキュベーション機器を収容するための上側部分６０７；ならびに電子機器、イメージングおよび空気式機器を収容するための下側部分６０９を含んでいてもよい。
FIG. 4 shows an exemplary device 601 (eg, analyzer) for performing microbial identification and antimicrobial susceptibility testing of a sample in
図５は、機器６０１の上側部分６０７内の構成要素の上面図であり、機器６０１の周囲のカートリッジ２０１を動かすのを助けるカルーセルを示す。機器６０１は、複数の分析カートリッジ２０１を受け入れ、分類するためのローディングトレイ７０３を含んでいてもよい。
FIG. 5 is a top view of the components in the
機器６０１はまた、機器６０１内の分析カートリッジを受け入れ、動かし、マニピュレートするためのカルーセル６０５、および機械式カートリッジ運搬体７０７を含んでいてもよい。機器６０１はまた、タスクスケジューラーを含んでいてもよい。機器６０１は、好ましくは、分析カートリッジのマニピュレーション、微生物同定および抗微生物薬感受性試験の実行、ならびに結果の生成を自動化するコンピューターによって制御される。機器６０１は、本発明の方法を行うための複数のサブシステムを含んでいてもよい。
機器６０１のサブシステムは、空気式サブシステム７０９、磁気サブシステム７１１、イメージングサブシステム７１３、および廃棄物サブシステム７１５（例えば、使用済みカートリッジ２０１を押し出すことができる使い捨てビン）を含んでいてもよい。磁気サブシステム７１１は、例えば、イメージングのために分析カートリッジの検出表面上に磁気粒子および標的の複合体を置くための磁場を提供する、永久磁石および電磁石を含んでいてもよい。イメージングサブシステム７１３は、微生物のイメージをキャプチャーするための、参照によっていずれも本明細書に組み込まれる米国特許第９，６４３，１８０号および同第８，０２１，８４８号に記載されているもの、ならびに機器６０１のイメージングモジュールに対して分析カートリッジ２０１の検出表面をマニピュレートするためのステージなどであってもよい。イメージングサブシステム７１３は、イメージ処理、分析および表示能力を提供するコンピューターに動作可能に関連し得る。空気式サブシステム７０９は、空気圧または真空によって提供される機能を使用する、例えばバルブ２０７（例えば、プランジャーおよびアクチュエーター）のマニピュレーションを介して、分析カートリッジ２０１内の検体１０５および試薬の動きを駆動するように、動作可能であってもよい。一部の実施形態では、油圧手段または機械的手段はまた、検体１０５の動きをもたらす空気式サブシステム７０９に組み込まれていてもよい。廃棄物サブシステム７１５は、使用後にカートリッジ２０１の廃棄のための容器（例えば、取り外し可能なビン）を含んでいてもよい。
The subsystem of
機器６０１はまた、成長のためのインキュベーションおよび／またはアッセイインキュベーションの間に、分析カートリッジを保持する（または保管する）ための１つまたは複数のインキュベーション領域を含んでいてもよい。インキュベーション領域は、加熱および／または冷却要素、ならびに標的細胞もしくは微生物の成長のため、またはアッセイインキュベーションを行うための所望の温度（例えば、３５℃）でインキュベーション領域を維持するための要素を制御するサーモスタットを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、機械式カートリッジ運搬体７０７（例えば、機械式コンベヤーアーム）は、機器６０１内の様々なサブシステムのなかで分析カートリッジ２０１をマニピュレートするように動作可能であり得る。本発明の一部の実施形態では、機械式カートリッジ運搬体７０７は、各々のカートリッジ２０１をカルーセル６０５および機器の様々なサブシステムの間を移動させる。機械式カートリッジ運搬体７０７は、押力を適用して、カートリッジ２０１をカルーセル６０５に移動させ、かつそれを外す。カルーセル６０５は、別の１つのサブシステムに隣接する分析カートリッジ２０１の位置に回転し、機械式カートリッジ運搬体７０７は、次いで、サブシステム上の分析カートリッジ２０１をスライドさせる力を適用してもよい。カートリッジ２０１は、機械式カートリッジ運搬体７０７または機器６０１の任意の他の要素によって決してつかみ取られない。機器６０１内の分析カートリッジ２０１をスライドするまたは押すことで、残屑への曝露を低減する。
In some embodiments, the mechanical cartridge carrier 707 (eg, a mechanical conveyor arm) may be operable to manipulate the
一部の実施形態では、機器は、機器６０１内のカートリッジ２０１を管理するためのタスクスケジューラーを含む。タスクスケジューラーは、複数のサブシステムのなかで各々のカートリッジ２０１の輸送および移動などの動きを制御するように動作可能である。一部の実施形態では、サブシステム中で各分析カートリッジ２０１が費やす時間もタスクスケジューラーによって管理されてもよい。タスクスケジューラーは、各々のカートリッジ２０１の分析のために必要な様々なサブシステムにおける時間を予約してもよい。本発明の一部の実施形態では、タスクスケジューラーは、カートリッジの内容物を同定することによって、分析カートリッジ２０１の動き（すなわち、行われる分析のステップ／パラメーター）を管理してもよい。
In some embodiments, the device includes a task scheduler for managing
一部の実施形態では、機器６０１はまた、分析カートリッジ２０１上に位置する固有の識別子（例えば、バーコード）２１９を分析するように動作可能なリーダーを含んでいてもよい。分析カートリッジ２０１の内容物および必要な処理は、分析カートリッジ２０１上の固有の識別子２１９に関連していてもよい。各々のカートリッジ２０１は、機器６０１によって読み取り可能な固有の識別子を含んでいてもよい。機器６０１は、リーダーを介して固有の識別子２１９を読み取り、固有の識別子２１９をタスクスケジューラーが実行する命令の特定セットに関連付けてもよい。リーダーは、機器６０１の外側に位置してもよく、分析カートリッジ２０１がローディングラック７０３からカルーセル６０５に移動する前に、固有の識別子２１９を読み取ってもよい。固有の識別子２１９は、バーコードであってもよく、分析カートリッジ２０１中の検体に特異的／固有であってもよい。
In some embodiments, the
検体は、試料ウェル２０３に直接挿入されてもよい。空気口２１７は、検体を分析カートリッジ２０１内のウェルに分配するために、圧力または真空を適用するように開放されてもよい。検体は、最初に、試料ウェル２０３から分配ウェル２０３に分配され、インキュベーションの間バルブ２０７によってそこで保持され、標識化のために試薬ウェル２０９に、次いで、イメージングのためにイメージングウェル２１１に放出されてもよい。分析カートリッジ２０１は、機器または機器中のリーダーによって分析または読み取られる場合に、機器内の処理のための命令のセットを伴なうカートリッジに関連する固有の識別子２１９（例えば、バーコード）を有する。
The sample may be inserted directly into the sample well 203. The
カートリッジ２０１は、次いで、磁場に付して（例えば、永久磁石上に配置）、イメージングウェル２１１の底部の検出表面２１５に複合体を引き寄せることができる。イメージングウェル２１１は、本明細書に記載のイメージングウェル２１１中の上側層（生物学的物質、検出可能な標識、複合体、磁気タグを含有する）の下にある高密度で不透明な水性層を形成する色素クッションを含有していてもよい。複合体化磁気粒子は、下の色素クッション層を通して押し出され、複合体および微生物複合体を色素クッション層を介してイメージングウェル２１１上の検出表面２１５に引き寄せる磁場によって、イメージングウェル２１１の検出表面２１５に置かれる。検出表面２１５は、微生物の光学的検出を可能にするために光学的に透明であってもよい。処理および磁場による引き下ろしの後、カートリッジ２０１は、本明細書に記載のイメージ処理のためのイメージングシステムに配置することができる。
The
種特異的蛍光オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光標識のイメージングが標的微生物の同定および定量化（例えば、検体中の標的細菌の細胞計数）を提供するように、標的微生物を蛍光標識するために使用されてもよい。分析カートリッジは、任意の数の分配ウェル、ならびに対応する試薬ウェルおよびイメージングウェルを有することができる。好ましい実施形態では、分析カートリッジは、「時間０計数」参照部分を有し、１種または複数の抗微生物剤の差次的成長分析は、少なくとも２つの別々の濃度でそれぞれ存在する。一部の実施形態では、選択される濃度は、好ましくは、特定の標的種および抗微生物剤についてＣＬＳＩならびに／またはＥＵＣＡＳＴによって確立された、受け入れられる抗微生物薬感受性試験のブレークポイント濃度に相当するはずである。
Species-specific fluorescent oligonucleotide probes have been used to fluorescently label a target microorganism so that imaging of the fluorescent label provides identification and quantification of the target microorganism (eg, cell count of the target bacterium in the sample). May be good. The analysis cartridge can have any number of distribution wells, as well as corresponding reagent wells and imaging wells. In a preferred embodiment, the analysis cartridge has a "
本発明のシステムおよび方法は、主に、自動化された処理のための相互接続されたウェルを有する分析カートリッジの文脈で本明細書に記載されているが、本技術は、マイクロタイタープレートのウェル中、または液滴が同様に機能する基板上での手動処理を含む任意の公知の流体プラットフォームにおいて行うこともできる。一部の実施形態では、カートリッジは、少なくとも８個のウェルを含み、２個の８ウェルのセクションで構成される少なくとも１６ウェルを含む２つの部分からなり得る。とはいえ、ウェルの数は、好ましくは、多く（例えば、１００またはそれよりも多く）、カートリッジおよび機器のサイズ制限によってのみ制限される。 Although the systems and methods of the invention are described herein primarily in the context of analytical cartridges with interconnected wells for automated processing, the art is described in the wells of microtiter plates. , Or on any known fluid platform, including manual processing on a substrate on which the droplets function similarly. In some embodiments, the cartridge may consist of two parts, including at least 8 wells and at least 16 wells consisting of 2 8-well sections. However, the number of wells is preferably large (eg, 100 or more) and is limited only by the size limits of the cartridges and equipment.
様々な抗微生物剤の存在下でのインキュベーション後の各検体部分に存在する標的細胞または微生物の量を定量化することによって、およびインキュベーション前に決定された「時間０計数」参照との比較によって、標的の細胞複製に対する各抗微生物剤の効果を決定することができる。どの抗微生物剤が成長を最も阻害するかを決定することによって、患者の感染症を処置するための有効な治療を決定することができる。
By quantifying the amount of target cells or microorganisms present in each sample portion after incubation in the presence of various antimicrobial agents, and by comparison with the "
図６は、細菌を含む検体の抗微生物薬感受性試験を行うためのワークフローの例である。ワークフローは、様々な本発明の方法に従って分析カートリッジで行われ得る、例示的なインキュベーションおよび処理ステップである。検体は、検体中に存在する標的微生物の知識に基づいて選択され得る成長培地５０１（例えば、検体中のＥ．ｃｏｌｉの分析のために選択された陽イオン調整ミューラーヒントンブロス）と混合することができる。検体および成長培地は、次いで、インキュベーション５０７のために、多く（ｎ）の分配ウェルに分割することができる５０３。１つまたは複数の分配ウェルは、様々な抗微生物剤を含有していてもよい。１つまたは複数の部分は、インキュベーションなし（ｔ０の検体）で分析されて５０５、抗微生物薬の存在下または非存在下でのインキュベーション後に分析される検体部分とのその後の比較のために、標的微生物を定量化してもよい。治療剤の非存在下でのインキュベーションは、例えば患者が既に抗微生物剤で処置されている場合に起こり得る生存できない微生物の指示を含む重要な情報を提供し得る。このようなインキュベートされた部分の分析は、成長阻害の妨害および試薬の安定性のための内部対照としての機能も果たし得る。
FIG. 6 is an example of a workflow for performing an antimicrobial drug susceptibility test on a sample containing bacteria. Workflow is an exemplary incubation and processing step that can be performed on analytical cartridges according to various methods of the invention. The specimen can be mixed with growth medium 501 (eg, cation-adjusted Mueller-Hinton broth selected for analysis of E. coli in the specimen) which can be selected based on the knowledge of the target microorganism present in the specimen. can. The specimen and growth medium can then be divided into many (n) distribution wells for
好ましくは、細菌または他の標的細胞は、既に同定されており、種々の抗微生物薬、例えば、同定された細菌を処置するために一般に使用される抗微生物薬は、しかるべく選択されている。各分布ウェルは、標的細胞成長に対する組み合わされた効果を評価するために、単一の抗微生物剤または抗微生物剤の独自の組合せを含み得る。異なる濃度の異なる抗微生物剤が、異なる分布ウェル中で検体部分またはアリコートと組み合わされ得、一部の分布ウェルは、結果を強化するために同一の抗微生物剤による処置を再現するために使用され得る。一部の分布ウェル中の検体部分またはアリコートは、阻害されていない成長を定量化するためおよび／または非抗微生物推論もしくは試薬不安定性のいずれかに起因する成長阻害を検出するために、抗微生物剤と組み合わされなくてもよい。 Preferably, the bacterium or other target cell has already been identified and various antimicrobial agents, eg, antimicrobial agents commonly used to treat the identified bacteria, have been appropriately selected. Each distribution well may contain a single antimicrobial agent or a unique combination of antimicrobial agents to assess the combined effect on target cell growth. Different concentrations of different antimicrobial agents can be combined with specimen moieties or aliquots in different distribution wells, some distribution wells being used to reproduce treatment with the same antimicrobial agent to enhance results. obtain. Specimen portions or aliquots in some distribution wells are antimicrobial to quantify uninhibited growth and / or to detect growth inhibition due to either non-antimicrobial reasoning or reagent instability. It does not have to be combined with the agent.
インキュベーション５０７後、インキュベートされた検体アリコートは、「時間０計数」検体アリコート５０５と同様の方法で処理およびイメージングされ、細菌および他の微生物の計数は、互いに比較することができ、「時間０計数」検体アリコート、または他の対照は、計数して５０９、ある特定の濃度の抗微生物剤またはその組合せについての有効性が決定される。好ましくは、抗生物質は、成長を許容しない濃度での処置のために推奨される。
After
図７は、ユーザーが検体１０５を分析カートリッジ２０１の試料ウェル２０３に直接移入するステップを示す。この実施例では、検体１０５は、検体収集デバイス１００１（例えば、検体収集容器、スワブなど）から分析カートリッジ２０１の試料ウェル２０３にピペッティングされる。他の実施形態では、検体収集デバイス１００１（例えば、スワブ）は、分析カートリッジ２０１の試料ウェル２０３に直接挿入されてもよい。
FIG. 7 shows a step in which the user directly populates the sample well 203 of the
図８は、機器６０１に輸送される前に、ローディングトレイ７０３にロードされている複数のカートリッジ２０１を表す。
FIG. 8 represents a plurality of
機器は、本方法のステップを行うために有用なコンピューターを含んでいてもよく、またはそれと接続されていてもよい。コンピューターは、機器６０１およびカートリッジ２０１を制御するように、ならびに／またはイメージングの結果を処理するように、動作可能であってもよい。コンピューターは、非一時的メモリーデバイスに連結されたプロセッサを含んでいてもよい。メモリーは、好ましくは、システムに機器６０１内のカートリッジ２０１をマニピュレートさせるため、ならびに標識された微生物のイメージを入手および処理させるためのプロセッサによって実行可能な命令を保存する。
The device may include or be connected to a computer useful for performing the steps of the method. The computer may be operable to control
プロセッサーは、処理操作を実施する任意のデバイスまたはデバイスのシステムを指す。プロセッサーは、一般に、中央処理装置（ＣＰＵ）を提供するために、チップ、例えば、シングルコアまたはマルチコアチップを含む。プロセスは、ＩｎｔｅｌまたはＡＭＤからのチップによって提供され得る。プロセッサーは、Ｉｎｔｅｌ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）によって商標ＸＥＯＮ Ｅ７の下で販売されるマイクロプロセッサーまたはＡＭＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって商標ＯＰＴＥＲＯＮ ６２００の下で販売されるマイクロプロセッサーなどの、任意の適切なプロセッサーであり得る。 A processor refers to any device or system of devices that performs processing operations. Processors generally include chips, such as single-core or multi-core chips, to provide a central processing unit (CPU). The process may be provided by a chip from Intel or AMD. The processor may be any suitable processor, such as a microprocessor sold under the trademark Xeon E7 by Intel (Santa Clara, CA) or a microprocessor sold under the trademark OPTERON 6200 by AMD (Sunnyvale, CA). possible.
メモリーは、機械可読フォーマットでデータまたは命令を保存するデバイスまたはデバイスのシステムを指す。メモリーは、コンピューターの１つまたは複数のプロセッサによって実行される場合に、本明細書に記載の方法もしくは機能の一部またはすべてを達成することができる命令の１つまたは複数のセット（例えば、ソフトウェア）を含んでいてもよい。好ましくは、コンピューターは、ソリッドステートドライブ、フラッシュドライブ、ディスクドライブ、ハードドライブ、加入者識別モジュール（ＳＩＭ）カード、セキュアデジタルカード（ＳＤカード）、マイクロＳＤカード、またはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、光および磁気メディアなど、またはそれらの組合せなどの非一時的メモリーを含む。好ましい実施形態では、メモリーは、タスクスケジューラーソフトウェアを含む。異なるタスクスケジューラーの命令は、特異的な固有の識別子に関連していてもよい。リーダーまたはバーコードスキャナーを介した分析カートリッジ２０１上の、または機器６０１中の固有の識別子のスキャニングは、プロセッサに、固有の識別子に特異的なタスクスケジューラーの命令を実行させてもよい。
Memory refers to a device or system of devices that stores data or instructions in a machine-readable format. Memory is one or more sets of instructions (eg, software) that, when executed by one or more processors in a computer, can accomplish some or all of the methods or functions described herein. ) May be included. Preferably, the computer is a solid state drive, flash drive, disk drive, hard drive, subscriber identification module (SIM) card, secure digital card (SD card), micro SD card, or solid state drive (SSD), optical and Includes non-temporary memory such as magnetic media or combinations thereof. In a preferred embodiment, the memory comprises task scheduler software. Instructions from different task schedulers may be associated with unique and unique identifiers. Scanning of a unique identifier on the
インプット／アウトプットデバイス６０３は、コンピューターに、もしくはコンピューターからデータを移動させるための機構またはシステムである。タッチスクリーンなどの例示的なインプット／アウトプットデバイスとしては、ビデオディスプレイユニット（例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ））、英数字インプットデバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウス）、バーコードスキャナー、リーダー、ディスクドライブユニット、信号生成デバイス（例えば、スピーカー）、加速度計、マイクロホン、セルラー無線周波数アンテナ、および例えばネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ－Ｆｉカードまたはセルラーモデムであり得るネットワークインターフェースデバイスが挙げられる。インプット／アウトプットデバイスは、ユーザーが、機器６０１を制御し、結果を表示し、機器６０１によって受け入れられたカートリッジの分析から得られる報告を生成することを可能にするように使用されてもよい。
The input /
（実施例Ａ）
マイクロタイタープレートを使用する***症（ＵＴＩ）の同定および抗微生物薬感受性試験／最小発育阻止濃度分析
(Example A)
Identification of urinary tract infections (UTI) and antimicrobial susceptibility testing / minimum inhibitory concentration analysis using microtiter plates
尿検体の分析を行って、***症の存在、患者が、４種の最も一般的なＵＴＩの原因微生物（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の１種に感染しているか、および４種の主な抗微生物薬のどれがＵＴＩを処置するのに有効かを決定した。尿を、試験のために本発明の分析カートリッジに、およびにカートリッジ内でのインキュベーションのために成長培地に、直接添加した。４種のＵＴＩ微生物の１種について陽性の場合、次いで、抗微生物薬感受性試験を行った。同定結果は３０分以内に得られ、抗微生物薬感受性試験の結果は４時間以内に得られた。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）分析は、本発明の例示的な技術を使用して行った。 Analysis of urinary specimens revealed the presence of urinary tract infections, one of the four most common causative microorganisms of UTI (ie, E. coli, K. pneumoniae, Enterococcus spp. And P. aeruginosa). It was determined if the species was infected and which of the four major antimicrobial agents was effective in treating UTI. Urine was added directly to the analytical cartridges of the invention for testing and to the growth medium for incubation within the cartridges. If one of the four UTI microorganisms was positive, then an antimicrobial susceptibility test was performed. Identification results were obtained within 30 minutes and antimicrobial susceptibility test results were obtained within 4 hours. Minimum inhibitory concentration (MIC) analysis was performed using the exemplary technique of the invention.
尿検体を、それぞれ１０，０００ＣＦＵ／ｍＬ（ＵＴＩを診断するための一般的な閾値）未満またはそれに等しい検出限界で、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在について試験した。種特異的標識を使用した。この実施例では、４種の標的微生物すべてが、等温ＦＩＳＨ反応および一般的な反応希釈剤を使用して、３０分以内に検出された。各検体のすべての株（１０のＥ．ｃｏｌｉ、１１のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．、１０のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよび６のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）の検出を、オフターゲット検出なしに達成した。ＦＩＳＨプローブの交差反応性を、１５、１０、１０および１０の異なる種の細菌に対して、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについて丁寧に分析し、交差反応性は観察されなかった。 Each urine sample was detected at a detection limit of less than or equal to 10,000 CFU / mL (a common threshold for diagnosing UTI). colli, K. pneumoniae, Enterococcus spp. And P. The presence of aeruginosa was tested. Species-specific labeling was used. In this example, all four target microorganisms were detected within 30 minutes using an isothermal FISH reaction and common reaction diluents. Detection of all strains of each sample (10 E. coli, 11 Klebsiella spp., 10 P. aeruginosa and 6 Enterococcus spp.) Was achieved without off-target detection. The cross-reactivity of the FISH probe was measured against 15, 10, 10 and 10 different species of bacteria by E. coli. colli, K. pneumoniae, Enterococcus spp. And P. Careful analysis of aeruginosa revealed no cross-reactivity.
４種の検体にわたる微生物Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａがスパイクされた３０％の尿を使用する検出限界（ＬｏＤ）の結果を表１に示し、ＵＴＩ原因微生物についての高い分析感度を示す。 Microorganisms across four specimens E. colli, K. pneumoniae, Enterococcus spp. And P. The results of the detection limit (LoD) using 30% urine spiked with aeruginosa are shown in Table 1 and show high analytical sensitivity for UTI-causing microorganisms.
図９は、異なる数の１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で尿にスパイクされた試料を分析するために本開示の機器、方法およびカートリッジを使用して計数されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の数を示す。 FIG. 9 is an E.I. The number of colli cells is shown.
図１０は、異なる数の１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で尿にスパイクされた試料を分析するために本開示の機器、方法およびカートリッジを使用して計数されたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ細胞の数を示す。 FIG. 10 shows the number of Enterococcus faecalis cells counted using the instruments, methods and cartridges of the present disclosure to analyze samples spiked in urine with different numbers of colony forming units (CFU) per mL. ..
本明細書に記載の微生物の検出および同定の方法を使用して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ（Ｂ．ａｎｔｒａｃｉｓ）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＣ．ｄｉｆｆ）のような他の種の微生物を迅速に検出することができる。 The methods of detection and identification of microorganisms described herein are used to rapidly detect other species of microorganisms such as Bacillus anthracis (B. anthracis) and Clostridium difficile (C. difficile or C. diff). be able to.
別の実験では、各々の４種の同定された微生物の７～１０株を、例示的な本発明の方法および従来の微量液体希釈法の両方を使用して、一般的な抗微生物薬についてのＡＳＴ分析に付し、次いで、結果を比較した。 In another experiment, 7-10 strains of each of the 4 identified microorganisms were used with both exemplary methods of the invention and conventional trace liquid dilution methods for common antimicrobial agents. The results were then compared for AST analysis.
図１１は、例えば、ニトロフラントインに関するＥ．ｃｏｌｉのＡＴＣＣ２４６９株についての特異的な結果を与える。従来法および本発明の方法の間の本質的一致の結果を、下記の表２に示す。 FIG. 11 shows, for example, E. nin for nitrofurantoin. Gives specific results for the ATCC2469 strain of colli. The results of the essential agreement between the conventional method and the method of the present invention are shown in Table 2 below.
可変の接種レベルに対する頑強性を試験するために、４桁をカバーする接種を、迅速ＡＳＴ法を使用して試験し、公知のＭＩＣ結果と比較した。表３に示すように、１００％の本質的一致が、すべての試験した検体（４種の異なる抗微生物薬に対して３種）について観察された。 To test robustness to variable inoculation levels, inoculations covering four digits were tested using the rapid AST method and compared to known MIC results. As shown in Table 3, 100% intrinsic agreement was observed for all tested specimens (3 for 4 different antimicrobial agents).
図１２は、ニトロフラントインのＭＩＣ試験のための様々な接種濃度にわたる結果を表す。多微生物検体の影響を、標的のＥ．ｃｏｌｉを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、およびＮＤＭ１を分泌するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む非標的細菌で検体をスパイクすることによって試験した。高濃度の１ｅ５、１ｅ６および１ｅ７ ＣＦＵ／ｍｌの非標的細菌を使用して、それぞれ、１００％、１００％および９６％の本質的一致が、５種の異なる抗微生物剤のＭＩＣ試験で観察された。９８％よりも高い本質的一致が、８４種の試験した検体にわたって観察された。イミペネムについてのＥ．ｃｏｌｉのＭＩＣは、１Ｅ７ ＣＦＵ／ｍＬのＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＤＭ１が分泌するカルバペネマーゼの存在下で影響を受けなかった。 FIG. 12 shows the results over various inoculation concentrations for the MIC test of nitrofurantoin. The effects of multimicrobial specimens on the target E.I. coryne, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Corynebacterium luteissimum, Staphylococcus aureus, Accinetobacter baumannii, Citrobacter secreting bacteria, Citrobacter freund, Citrobacter freund. Essential agreements of 100%, 100% and 96%, respectively, were observed in MIC tests of 5 different antimicrobial agents using high concentrations of 1e5, 1e6 and 1e7 CFU / ml non-target bacteria, respectively. .. Essential agreements of greater than 98% were observed across 84 tested specimens. E. about Imipenem. The MIC of colli is 1E7 CFU / mL K.I. It was unaffected in the presence of carbapenemase secreted by pneumoniae NDM1.
（実施例Ｂ）
抗微生物薬感受性試験：Ｅ．ｃｏｌｉ
(Example B)
Antimicrobial susceptibility test: E.I. coli
尿検体に、クロファジミン感受性およびクロファジミン耐性のＥ．ｃｏｌｉの株をスパイクした。検体を、例示的な本明細書に記載のシステム（分析カートリッジおよび機器）を使用して試験した。検体を、３２μｇ／ｍＬのクロファジミン中で４時間、インキュベートした。 Clofazimine-sensitive and clofazimine-resistant E. coli in urine specimens. I spiked the stock of colli. Specimens were tested using an exemplary system (analytical cartridges and instruments) described herein. Specimens were incubated in 32 μg / mL clofazimine for 4 hours.
図１３は、本開示の方法およびシステムが、本明細書に記載のＥ．ｃｏｌｉのクロファジミン感受性株およびクロファジミン耐性株の間の区別に成功したことを証拠付ける成長の結果を表す。 FIG. 13 shows that the methods and systems of the present disclosure are described in E.I. Represents the results of growth demonstrating the successful distinction between clofazimine-sensitive and clofazimine-resistant strains of coli.
（実施例１）
新規な迅速な蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを使用するグラム陰性菌についての検出限界（ＬｏＤ）
(Example 1)
Detection limit (LoD) for Gram-negative bacteria using a novel rapid fluorescence in situ hybridization assay
概説：以下の実施例は、非常に低い濃度の細胞を、新規等温蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用して検出することができることを実証している。３つの一般的なヒト***（ＵＴＩ）病原体についての検出限界が示される。
実験方法：
Overview: The following examples demonstrate that very low concentrations of cells can be detected using a novel isothermal fluorescence in situ hybridization method. Detection limits for three common human urinary tract infection (UTI) pathogens are shown.
experimental method:
細菌細胞調製：Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ １９１３８、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ７００６０３およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ９７２１についての細菌培養物を、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に、新鮮なトリプシンソイ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３～５個のコロニーを接種し、３５℃で１．５～３時間成長させて対数期成長を達成することによって得た。細胞が、０．１５～０．３０の、６００ｎｍにおける光学密度読み取りに達した後、細胞を氷上に少なくとも１５分間置き、その後希釈した。冷却後、細胞を、１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に、アッセイされる濃度（およそ１９２００、９６００、４８００、２４００、１２００、６００、３００および１５０コロニー形成単位（ＣＦＵ）／反応）になるように希釈した。より正確な細胞濃度のために、これらの推定された細菌入力を、コロニー計数を使用して調整した。プレート計数を、対数期培養物をＭＨＢＩＩ中に約５００ＣＦＵ／ｍＬになるように希釈し、１００μＬをＴＳＡプレート上にプレートし、３５℃で１６～２４時間の成長後にコロニーを計数することによって決定した。平均プレート計数を使用して、試験した各濃度中に存在する実際のＣＦＵを計算した。
Bacterial cell preparation:
磁気粒子の調製：ポリアスパラギン酸コンジュゲートされた磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）およびカルボキシルコーティングされた高鉄磁気粒子（Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、カタログＣＭ－０２５－１０Ｈ）を使用して、細菌細胞を非特異的に捕捉した。各粒子を、ポリアスパラギン酸粒子については１反応当たりおよそ１．３８×１０９粒子、カルボキシル粒子については１反応当たり３．４６×１０９粒子の終濃度で、５０ｍＭ Ｅｐｐｓ緩衝剤、ｐＨ８．２中に１：４０希釈した。緑色色素を含む蛍光磁気ミクロスフェア（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を、３×１０６粒子／ｍＬの終濃度で懸濁物に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。磁気粒子混合物を、使用直前に１分間超音波処理して、凝集を最小化した。 Preparation of Magnetic Particles: Using polyaspartic acid conjugated magnetic particles (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) and carboxyl-coated high iron magnetic particles (Carboxyl Magnetic Particles, Spherotech, Catalog CM-025-10H). And non-specifically captured bacterial cells. Each particle was prepared at a final concentration of approximately 1.38 × 109 particles per reaction for polyaspartic acid particles and 3.46 × 10 9 particles per reaction for carboxyl particles, in 50 mM Epps buffer, pH 8.2. Was diluted 1:40. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles / mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration.
ＦＩＳＨプローブの調製：Ｅ．ｃｏｌｉおよびＫ．ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅのための２つの種特異的ＤＮＡオリゴマーセットならびにＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのための１つの種特異的ＤＮＡオリゴマーセットを、８０～８５℃の間の水浴中で１０分間加熱し、次いで、氷上に置いて、凝集を低減させた。ＤＮＡオリゴマーセットは、オリゴヌクレオチドの５’末端、または５’末端および３’末端の両方のいずれかにおいて蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７Ｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で標識した種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ならびに特異的プローブに隣接してまたはその近傍で結合する、リボソームサブユニットの局所的二次構造を破壊し、標識された特異的プローブの、標的ｒＲＮＡに対するより高いハイブリダイゼーション効率を可能にするように設計された２～６個のヘルパーオリゴヌクレオチドを含んだ。この実施例で使用したプローブ配列は、図１７中の表Ａに示される。 Preparation of FISH probe: E.I. colli and K. Two species-specific DNA oligomer sets for pnuemoniae as well as P. et al. One species-specific DNA oligomer set for aeruginosa was heated in a water bath between 80-85 ° C. for 10 minutes and then placed on ice to reduce aggregation. The DNA oligomer set flanks species-specific DNA oligonucleotides labeled with fluorescent dyes (Alexa647N, Thermo Fisher) at either the 5'end, or both the 5'end and the 3'end of the oligonucleotide, as well as specific probes. 2-6 designed to disrupt the local secondary structure of ribosomal subunits that bind to or in the vicinity thereof, allowing for higher hybridization efficiency of labeled specific probes to target rRNA. Contains a number of helper oligonucleotides. The probe sequences used in this example are shown in Table A in FIG.
乾燥されたハイブリダイゼーション緩衝剤プレートの調製：１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ、カタログＳ６６３９）、２．６％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、２．４％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．４３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）および０．６％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５）の混合物を調製した。３０ｕＬのこの混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、５０℃の対流式オーブン中に置き、一晩乾燥させた。１００ｕＬの液体をこれらのウェルに添加すると、３×ＳＳＣ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．７７％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、０．７２％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．１３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）および０．１８％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５）の正確なハイブリダイゼーション緩衝剤濃度が達成される。 Preparation of dried hybridization buffer plate: 10 × SSC (1.5M NaCl, 0.15M sodium citrate, Sigma, Catalog S6639), 2.6% w / v CHASPO (Sigma Catalog C3649), 2.4 A mixture of% w / v SB3-12 (Sigma Catalog D0431), 0.43M guanidine thiocyanate (Sigma Catalog G9277) and 0.6% w / v cetrimid (Sigma Catalog M7365) was prepared. 30 uL of this mixture was added to each well of a 96-well plate. The plates were placed in a convection oven at 50 ° C. and dried overnight. When 100 uL of liquid is added to these wells, 3 × SSC (0.45M NaCl, 0.045M sodium citrate), 0.77% w / v CHASPSO (Sigma Catalog C3649), 0.72% w / v SB3. Accurate hybridization buffer concentrations of -12 (Sigma Catalog D0431), 0.13M guanidine thiocyanate (Sigma Catalog G9277) and 0.18% w / v cetrimid (Sigma Catalog M7365) are achieved.
検出限界（ＬｏＤ）アッセイ手順：目的の細菌に適切なＤＮＡオリゴヌクレオチドセットの混合物を、尿および濃縮カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｓｔｏｃｋ（ＭＨＢＩＩ）と合わせて、１×ＭＨＢＩＩおよび３０％のプールされたヒト尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を含む最終溶液を作製した。プローブ濃度は、異なる細菌種の間で変動したが、標識されたオリゴヌクレオチドについては０．２～０．６μＭ、対応するヘルパープローブについては１．５～６μＭの範囲であった。９０ｕＬのこの混合物を、適切な乾燥されたハイブリダイゼーション緩衝剤プレート中に置いた。１０ｕＬの磁気粒子混合物を添加し、その後、１０ｕＬの適切な細胞希釈物を添加した。各細胞濃度の１２個の複製およびブランク（細菌を含まない培地）の２４個の複製を、試験した各標的細菌について評価した。１００μＬの最終反応混合物を、１ウェル当たり５０μＬ（前もって乾燥させた）の「色素クッション」（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含むマイクロタイタープレートに移動させ、３５℃で３０分間インキュベートして、「色素クッション」の再水和、細菌細胞の標識化、および細菌細胞表面への磁気粒子の結合を同時に可能にした。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを、磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置いて、標識された細胞を含む画分である磁気粒子を、「色素クッション」を介してウェルの底部にあるイメージング表面に近接させた。 Detection Limit (LoD) Assay Procedure: A mixture of DNA oligonucleotide sets suitable for the bacterium of interest combined with a Mueller Hinton Stock (MHBII) prepared with urine and concentrated cations, 1 x MHBII and 30% pooled humans. A final solution containing urine (Innovative Research, Catalog IRHURE500ML) was made. Probe concentrations varied between different bacterial species, ranging from 0.2 to 0.6 μM for labeled oligonucleotides and 1.5 to 6 μM for the corresponding helper probes. 90 uL of this mixture was placed in a suitable dried hybridization buffer plate. A 10 uL magnetic particle mixture was added, followed by 10 uL of the appropriate cell dilution. Twelve replications at each cell concentration and 24 replications in blank (bacteria-free medium) were evaluated for each target bacterium tested. 100 μL of final reaction mixture, 50 μL (pre-dried) “dye cushion” per well (50 mM TRIS pH 7.5 (Sigma Catalog T1075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma Catalog D1556), 50 mg / Transfer to a microtiter plate containing mL Direct Black 19 (Orient Catalog 191L) and incubate at 35 ° C. for 30 minutes to rehydrate the "dye cushion", label the bacterial cells, and magnetize the bacterial cell surface. It enabled the binding of particles at the same time. After incubation, the microtiter plate is placed on a magnetic field (Dexter magnetic techniques, Catalog 54170260) for 4 minutes and magnetic particles, which are fractions containing labeled cells, are placed at the bottom of the well via a "dye cushion". Close to the imaging surface.
標識された細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）ラボラトリーイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能な特注の機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）の高精度リニアステージを使用して、蛍光ベースのイメージ獲得サブシステム上に各ウェルを位置決めする。機器は、４つの別々の色チャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルターセットおよびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートウェル全体のイメージを捕捉するように設計された視野を有する。照明モジュール光供給源は、色チャネル１つ当たり２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームを、１ピクセル量子化当たり１２ビットで、３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５モノクロセンサーを使用してカメラで捕捉する。次いで、各ウェルについての最終イメージを、複数のフレームを合計することによって形成する。１６フレームを、６３５／２５ｎｍ励起および６８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。焦点粒子（ｆｏｃｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を、４７０／４０ｎｍ励起および５２０／４０ｎｍ励起フィルターでイメージングし、２０ミリ秒の曝露で２フレームを捕捉する。 Imaging of Labeled Cells: MultiPath ™ Laboratory Imaging Systems are custom instruments and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well on a fluorescence-based image acquisition subsystem. The instrument can be imaged in four separate color channels and uses an objective lens, an illuminated LED, a fluorescent filter set and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire microtiter plate well. The lighting module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames are captured by a camera using a 3.1MP Sony IMX265 monochrome sensor at 12 bits per pixel quantization. The final image for each well is then formed by summing multiple frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation and a 680/40 nm emission filter. Focus particles are imaged with 470/40 nm excitation and 520/40 nm excitation filters and capture 2 frames with 20 ms exposure.
データ分析：各細胞濃度において、検出された蛍光物体の数を決定した。８つ全ての細胞濃度からのデータを、線形回帰直線にフィットさせ、最も低い３つの細胞入力の傾き、切片および標準偏差を使用して、試験した各細菌についてのブランク上限（ＬｏＢ）および検出限界（ＬｏＤ）を決定した。
結果：
Data analysis: At each cell concentration, the number of fluorescent objects detected was determined. Data from all eight cell concentrations are fitted to a linear regression line, using the lowest three cell input slopes, intercepts and standard deviations for a blank upper bound (LoB) and detection limit for each cell tested. (LoD) was determined.
result:
試験した３つ全ての細菌は、低い検出限界を示した。図１４、図１５および図１６は、ＬｏＢおよびＬｏＤを計算するために使用した線形フィットを用いてＥ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについて生成したデータを示す。ＬｏＢおよびＬｏＤを、単一の反応ウェル中の検出可能なＣＦＵで示す。 All three bacteria tested showed low detection limits. 14, 15 and 16 show E.I. using the linear fit used to calculate LoB and LoD. colli, K. pneumoniae and P. pneumoniae. The data generated for aeruginosa is shown. LoB and LoD are shown as detectable CFUs in a single reaction well.
結論。この実施例に記載される新規かつ迅速なＦＩＳＨ法は、最小限に処理された尿マトリックスを使用して、１反応当たり約５００ＣＦＵまたはそれ未満の検出限界の、高感度の方法であることが示される。 Conclusion. The novel and rapid FISH method described in this example has been shown to be a sensitive method with a detection limit of about 500 CFU or less per reaction using a minimally treated urine matrix. Is done.
バリエーション。この実施例は、この新規ＦＩＳＨ法のパフォーマンスの例示であって、記載に含まれる具体的な詳細に限定されない。したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成要素濃度）、尿の濃度および尿処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを、当業者は容易に理解する。この方法論は、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体にも明らかに拡張することができる。 variation. This embodiment is an example of the performance of this novel FISH method and is not limited to the specific details contained in the description. Therefore, different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, component concentrations), urine concentrations and It is readily appreciated by those skilled in the art that many variations are possible, including the use of urine treatment procedures. This methodology can be clearly extended to other biological specimens as well as other bacterial and non-bacterial pathogens.
（実施例２）
包括性：本発明の迅速ＦＩＳＨ法を使用する細菌種の異なる株を検出および同定する
(Example 2)
Comprehensiveness: Detects and identifies different strains of bacterial species using the rapid FISH method of the invention.
概説。この実施例は、標的化された細菌種について異なる株を検出するための本発明の使用を実証している。１１個の異なるＥ．ｃｏｌｉ株についての生データが示され、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．についてのデータが要約される。細菌細胞標的を、等温蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して３０分で標識し、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）ＣＣＤカメラベースの検出システムで検出した。
実験方法。
Overview. This example demonstrates the use of the invention to detect different strains of targeted bacterial species. 11 different E. Raw data for the coli strain are presented and K.K. pneumoniae, P. p. aeruginosa, P. et al. mirabilis and Enterococcus spp. The data about is summarized. Bacterial cell targets were labeled in 30 minutes using isothermal fluorescence in situ hybridization (FISH) and detected with a MultiPath ™ CCD camera-based detection system.
experimental method.
細菌細胞調製：異なる株についての細菌培養物を、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に、新鮮なトリプシンソイ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３～５個のコロニーを接種し、３５℃で１．５～３時間成長させて対数期成長を達成することによって得た。細胞濃度を推定するために６００ｎｍでの光学密度を使用して、細胞を、１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に、１反応当たりおよそ６００ＣＦＵおよび３０００ＣＦＵになるように希釈した。より正確なパーセント細胞検出計算のために、これらの推定された細菌入力を、コロニー計数を使用して調整した。プレート計数を、対数期培養物をＭＨＢＩＩ中に約５００ＣＦＵ／ｍＬになるように希釈し、１００μＬをＴＳＡプレート上にプレートし、３５℃で１６～２４時間の成長後にコロニーを計数することによって決定した。
Bacterial cell preparation: Bacterial cultures from different strains are inoculated into Trypticase Soy Broth (TSB, Hardy Dynamics Catalog U65) with 3-5 colonies from fresh trypticase soy agar plates (TSA, BD Catalog 221185). , Obtained by growing at 35 ° C. for 1.5-3 hours to achieve logarithmic growth. Using optical densities at 600 nm to estimate cell concentration, cells were placed in Mueller-Hinton broth (MHBII, Teknova Catalog M5860) adjusted with 1 × cations to approximately 600 CFU and 3000 CFU per reaction. Diluted to. These estimated bacterial inputs were adjusted using colony counts for more accurate percent cell detection calculations. Plate counting was determined by diluting the logarithmic culture into MHBII to approximately 500 CFU / mL,
磁気粒子の調製：細菌細胞を非特異的に捕捉するために使用したポリアスパラギン酸コンジュゲートされた磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を、５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中に、２．７５×１０１２粒子／ｍＬになるように１：２０希釈した。緑色色素を含む蛍光磁気ミクロスフェア（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を、３×１０６粒子／ｍＬの終濃度で懸濁物に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。磁気粒子混合物を、使用直前に１分間超音波処理して、凝集を最小化した。別々の磁気粒子懸濁物を、以下に記載される時間ゼロおよび時間４時間アッセイのために調製した。
Preparation of Magnetic Particles: Polyaspartic acid conjugated magnetic particles (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) used to capture bacterial cells non-specifically in 50 mM EPPS buffer, pH 8.2. It was diluted 1:20 to 2.75 × 10 12 particles / mL. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles / mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. Separate magnetic particle suspensions were prepared for the time zero and
細菌細胞の標識化：１００μＬ標識化反応を、希釈した細胞、等温ハイブリダイゼーション緩衝剤（０．９×ＭＨＢＩＩ、３×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ、カタログＳ６６３９）、０．７７％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、０．７２％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．１３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）、０．１８％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５））、１６Ｓまたは２３Ｓ細菌ｒＲＮＡに標的化された種特異的Ａｌｅｘａ６４７Ｎ標識されたＤＮＡまたはＬＮＡ含有ＤＮＡプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）、有効なハイブリダイゼーションを促進するためのヘルパープローブ（ＩＤＴ）および３０μＬのプールされたヒト尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を合わせることによって調製した。プローブ配列は、図２１中の表に示される。 Labeling of bacterial cells: 100 μL labeling reaction, diluted cells, isothermal hybridization buffer (0.9 × MHBII, 3 × SSC (1.5M NaCl, 0.15M sodium citrate, Sigma, Catalog S6639), 0.77% w / v CHASPO (Sigma Catalog C3649), 0.72% w / v SB3-12 (Sigma Catalog D0431), 0.13M guanidine thiocyanate (Sigma Catalog G9277), 0.18% w / v cetrimid (Sigma Catalog M7365)), species-specific Alexa647N-labeled DNA or LNA-containing DNA probes targeted to 16S or 23S bacterial rRNA (Integrated DNA Technologies, IDT), helper probes to promote effective hybridization (IDT). It was prepared by combining IDT) and 30 μL of pooled human urine (Innovative Research, Catalog IRHUURE 500ML). The probe sequences are shown in the table in FIG.
尿を、製造業者の使用説明書に従って、Ｚｅｂａ ７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、尿体積に依存してカタログ８９８９３または８９８９２）を介して最初に処理した。次いで、１０μＬの磁気粒子調製物をこの混合物に添加した。最終反応混合物を、５０μＬ（前もって乾燥させた）の「色素クッション」（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含むマイクロタイタープレートに移動させ、３５℃で３０分間インキュベートして、「色素クッション」の再水和、細菌細胞の標識化、および細菌細胞表面への磁気粒子の結合を同時に可能にした。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを、磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置いて、標識された細胞を含む画分である磁気粒子を、「色素クッション」を介してウェルの底部にあるイメージング表面に近接させた。 Urine was first treated via a Zeba 7K MWCO spin column (Thermo Fisher, Catalog 89893 or 89892 depending on urine volume) according to the manufacturer's instructions. Then 10 μL of magnetic particle preparation was added to this mixture. The final reaction mixture was subjected to 50 μL (pre-dried) “dye cushion” (50 mM TRIS pH 7.5 (Teknova Catalog T1075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma Catalog D1556), 50 mg / mL Sign Black 19 (50 mM TRIS pH 7.5 (Teknova Catalog T1075)). Transfer to a microtiter plate containing Orient Catalog 191L)) and incubate at 35 ° C. for 30 minutes to simultaneously rehydrate the "dye cushion", label the bacterial cells, and bind the magnetic particles to the bacterial cell surface. Made possible. After incubation, the microtiter plate is placed on a magnetic field (Dexter magnetic techniques, Catalog 54170260) for 4 minutes and magnetic particles, which are fractions containing labeled cells, are placed at the bottom of the well via a "dye cushion". Close to the imaging surface.
標識された細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈラボラトリーイメージングシステム上の標識された細菌細胞は、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能な特注の機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）の高精度リニアステージを使用して、蛍光ベースのイメージ獲得サブシステム上に各ウェルを位置決めする。機器は、４つの別々の色チャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルターセットおよびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートウェル全体のイメージを捕捉するように設計された視野を有する。照明モジュール光供給源は、色チャネル１つ当たり２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームを、１ピクセル量子化当たり１２ビットで、３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５モノクロセンサーを使用してカメラで捕捉する。次いで、各ウェルについての最終イメージを、複数のフレームを合計することによって形成する。１６フレームを、６３５／２５ｎｍ励起および６８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。焦点粒子を、４７０／４０ｎｍ励起および５２０／４０ｎｍ励起フィルターでイメージングし、２０ミリ秒の曝露で２フレームを捕捉する。 Imaging of Labeled Cells: Labeled Bacterial Cells on MultiPath Laboratory Imaging Systems are custom instruments and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a Precision Linear Stage of Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well on a fluorescence-based image acquisition subsystem. The instrument can be imaged in four separate color channels and uses an objective lens, an illuminated LED, a fluorescent filter set and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire microtiter plate well. The lighting module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames are captured by a camera using a 3.1MP Sony IMX265 monochrome sensor at 12 bits per pixel quantization. The final image for each well is then formed by summing multiple frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation and a 680/40 nm emission filter. Focus particles are imaged with 470/40 nm excitation and 520/40 nm excitation filters and capture 2 frames with 20 ms exposure.
データ分析：各細菌について、蛍光物体の数を決定した（アッセイシグナル）。細胞なし条件におけるシグナルの３標準偏差を上回るシグナルが検出された場合、細菌株が検出されたとみなした。 Data analysis: For each bacterium, the number of fluorescent objects was determined (assay signal). Bacterial strains were considered to be detected if a signal greater than the 3 standard deviations of the signal under cell-free conditions was detected.
結果。図１８は、１１個のＥ．ｃｏｌｉ株についてのアッセイシグナルを示す。１１個全ての株が、１アッセイ当たりおよそ６００ＣＦＵの細胞入力について、背景「細胞なし」条件を上回って検出された。図１９は、検出された細胞のパーセンテージ（細胞入力ウェルにおける総アッセイシグナル－背景アッセイシグナル／総細胞入力＊１００）として示されるデータを示す。検出効率は株ごとに幾分可変であるが、これは、１１個の異なるＥ．ｃｏｌｉ株の各々を検出するアッセイの能力を阻害しなかった。 result. FIG. 18 shows 11 E.I. The assay signal for the coli strain is shown. All 11 strains were detected with a cell input of approximately 600 CFU per assay, above the background "cellless" condition. FIG. 19 shows the data shown as the percentage of cells detected (total assay signal in cell input well-background assay signal / total cell input * 100). The detection efficiency is somewhat variable from strain to strain, which is 11 different E. coli. It did not interfere with the ability of the assay to detect each of the coli strains.
図２０中の表は、Ｅ．ｃｏｌｉと同じ様式で分析したＥ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．についての包括性結果を要約する。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて試験した株は、ＡＴＣＣ １３８３３、ＣＤＣ８０、ＣＤＣ４４、ＣＤＣ８７、ＣＤＣ４７、ＣＤＣ４３、ＢＡＡ２４７０、ＣＤＣ３４、ＣＤＣ３９、ＡＴＣＣ ７００６０３およびＢＡＡ－２４７２であった。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについて試験した株は、ＣＤＣ２６３、ＣＤＣ２４２、９７２１、ＣＤＣ２３６、２７８５３、ＢＡＡ－２１１０、ＣＤＣ２３３、１５６９２、ＣＤＣ２３４、ＣＤＣ２４６およびＣＤＣ２６１であった。Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓについて試験した株は、ＣＤＣ１５５、ＣＤＣ２９、ＣＤＣ１５９、ＣＤＣ５９、ＡＴＣＣ ７００２およびＣＤＣ１５６であった。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓについて試験した株は、ＡＴＣＣ １９４３３、ＡＴＣＣ ２９２１２、ＡＴＣＣ ３３１８６、ＡＴＣＣ ５１５７５、ＡＴＣＣ ５１２９９およびＢＡＡ－２１２８を含んだ。
The table in FIG. 20 shows E.I. E. coli analyzed in the same manner as E. coli. colli, K. pneumoniae, P. p. aeruginosa, P. et al. mirabilis and Enterococcus spp. Summarize the comprehensive results for. K. The strains tested for pneumoniae were ATCC 13833, CDC80, CDC44, CDC87, CDC47, CDC43, BAA2470, CDC34, CDC39, ATCC 700603 and BAA-2472. P. The strains tested for aeruginosa were CDC263, CDC242, 9721, CDC236, 27853, BAA-2110, CDC233, 15692, CDC234, CDC246 and CDC261. P. The strains tested for mirabilis were CDC155, CDC29, CDC159, CDC59, ATCC 7002 and CDC156. Strains tested for Enterococcus included ATCC 19433,
結論。この実施例に記載される新規ＦＩＳＨ法は、ＵＴＩを有する患者において臨床症状をもたらす主要な病原体の中にある５つの異なる細菌種について、試験した全ての株を検出した。 Conclusion. The novel FISH method described in this example detected all strains tested for five different bacterial species among the major pathogens that cause clinical symptoms in patients with UTI.
バリエーション。この実施例は、この新規ＦＩＳＨ法のパフォーマンスの例示であって、記載に含まれる具体的な詳細に限定されない。したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成要素濃度）、尿の濃度および尿処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを、当業者は容易に理解する。この方法論は、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体にも明らかに拡張することができる。 variation. This embodiment is an example of the performance of this novel FISH method and is not limited to the specific details contained in the description. Therefore, different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, component concentrations), urine concentrations and It is readily appreciated by those skilled in the art that many variations are possible, including the use of urine treatment procedures. This methodology can be clearly extended to other biological specimens as well as other bacterial and non-bacterial pathogens.
（実施例３）
迅速等温ＦＩＳＨを使用する標的細菌の特異的検出
(Example 3)
Specific detection of target bacteria using rapid isothermal FISH
概説。この実施例は、新規等温ＦＩＳＨ法が、関連の非標的細菌を、非常に高い濃度であっても検出することなしに、標的細菌を特異的に検出することを実証している。この実施例は、これもまた***（ＵＴＩ）を引き起こす、類似のｒＲＮＡ配列を有する、または共生生物である１６個の他の細菌を検出しないが、Ｅ．ｃｏｌｉを特異的に検出するアッセイ条件を示す。
実験方法。
Overview. This example demonstrates that the novel isothermal FISH method specifically detects the target bacterium without detecting the associated non-target bacterium, even at very high concentrations. This example does not detect 16 other bacteria that also cause urinary tract infections (UTIs), have similar rRNA sequences, or are symbiotic organisms, but E. coli. The assay conditions for specifically detecting coli are shown.
experimental method.
細菌細胞調製：１６個のオフターゲット細菌（表１に列挙される）およびＥ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ ２５９２２についての細菌培養物を、新鮮なトリプシンソイ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）から選択された単一のコロニーから成長させ、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）中に接種し、振盪しながら３５℃で一晩成長させた。５０～８０μＬの一晩培養物を、新鮮なＴＳＢ中に添加し、６００ｎｍにおける光学密度が０．１５～０．３に達するまで、１．５～２時間成長させた。次いで、各細菌を、カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に、およそ１×１０８細胞／ｍＬになるように希釈した。
Bacterial cell preparation: 16 off-target bacteria (listed in Table 1) and E. coli. Bacterial cultures of the
評価する細菌標的の選択：特異性について試験する細菌病原体を、標的細菌のｒＲＮＡ配列とのｒＲＮＡ配列類似性について、またはそれらが、***（疾患標的）において一般に見出される病原体であり、したがって、これらの生物に対する交差反応性が最も問題になることに起因して、選択した。図２２中の表は、試験した細菌種および株を示す。 Selection of Bacterial Targets to Evaluate: Bacterial pathogens tested for specificity are pathogens commonly found in urinary tract infections (disease targets), such as for rRNA sequence similarity to the rRNA sequence of the target bacterium, or therefore. It was chosen because cross-reactivity to these organisms is of paramount concern. The table in FIG. 22 shows the bacterial species and strains tested.
ＦＩＳＨプローブの調製：Ｅ．ｃｏｌｉのためのＤＮＡプローブセットを、８０～８５℃の間の水浴中で１０分間加熱し、次いで、氷上に置いて、凝集を低減させた。このＤＮＡプローブセットは、図２３中の表に示される。このセットは、蛍光色素（Ａｌｅｘａ６４７Ｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で標識した種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド、および特異的プローブに隣接してまたはその近傍で結合する、リボソームサブユニットの局所的二次構造を破壊し、標識された特異的プローブの、標的ｒＲＮＡに対するより高いハイブリダイゼーション効率を可能にするように設計されたヘルパーオリゴヌクレオチドを含んだ。 Preparation of FISH probe: E.I. The DNA probe set for colli was heated in a water bath between 80-85 ° C. for 10 minutes and then placed on ice to reduce aggregation. This DNA probe set is shown in the table in FIG. This set disrupts species-specific DNA oligonucleotides labeled with fluorescent dyes (Alexa647N, Thermo Fisher) and local secondary structures of ribosomal subunits that bind adjacent to or in the vicinity of specific probes. Included helper oligonucleotides designed to allow higher hybridization efficiency of the labeled specific probe to the target rRNA.
磁気粒子の調製：細菌細胞を非特異的に捕捉するために使用したポリアスパラギン酸コンジュゲートされた磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を、５０ｍＭ ＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中に、２．７５×１０１２粒子／ｍＬになるように１：２０希釈した。緑色色素を含む蛍光磁気ミクロスフェア（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を、３×１０６粒子／ｍＬの終濃度で懸濁物に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。磁気粒子混合物を、使用直前に１分間超音波処理して、凝集を最小化した。 Preparation of Magnetic Particles: Polyaspartic acid conjugated magnetic particles (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) used to capture bacterial cells non-specifically in 50 mM EPPS buffer, pH 8.2. It was diluted 1:20 to 2.75 × 10 12 particles / mL. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles / mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration.
細菌細胞の標識化：１００μＬ標識化反応を、希釈した細胞、等温ハイブリダイゼーション緩衝剤（０．９×ＭＨＢＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）、３×ＳＳＣ（０．４５Ｍ ＮａＣｌ、０．０４５Ｍクエン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ、カタログＳ６６３９）、０．７７％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、０．７２％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．１３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）、０．１８％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５））、１６Ｓまたは２３Ｓ細菌ｒＲＮＡに標的化された種特異的Ａｌｅｘａ６４７Ｎ標識されたプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）、有効なハイブリダイゼーションを促進するためのヘルパープローブ（ＩＤＴ）および３０μＬのプールされたヒト尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を合わせることによって調製した。試験した特異的プローブセットは、図２３中の表に示される。尿を、製造業者の使用説明書に従って、Ｚｅｂａ ７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、尿体積に依存してカタログ８９８９３または８９８９２）を介して最初に処理した。次いで、１０μＬの磁気粒子調製物を、この混合物に添加した。最終反応混合物を、１ウェル当たり５０μＬ（前もって乾燥させた）の「色素クッション」（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含むマイクロタイタープレートに移動させ、３５℃で３０分間インキュベートして、「色素クッション」の再水和、細菌細胞の標識化、および細菌細胞表面への磁気粒子の結合を同時に可能にした。各細菌を、１反応当たり１×１０６細胞の終濃度で試験した。この濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉについての決定された検出限界よりもおおよそ３０００倍高い。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを、磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置いて、標識された細胞を含む画分である磁気粒子を、「色素クッション」を介してウェルの底部にあるイメージング表面に近接させた。 Labeling of bacterial cells: 100 μL labeling reaction, diluted cells, isothermal hybridization buffer (0.9 x MHBII (Teknova Catalog M5860), 3 x SSC (0.45M NaCl, 0.045M sodium citrate, Sigma). , Catalog, Catalog S6639), 0.77% w / v CHASPO (Sigma Catalog C3649), 0.72% w / v SB3-12 (Sigma Catalog D0431), 0.13M Guanidin Thiocitrate (Sigma Catalog G9277), 0 .18% w / v cetrimid (Sigma Catalog M7365)), species-specific Alexa647N-labeled probe (Integrated DNA Technologies, IDT) targeted to 16S or 23S bacterial rRNA, helper to promote effective hybridization. Prepared by combining a probe (IDT) and 30 μL of pooled human urine (Innovative Research, Catalog IRHUURE 500ML). The specific probe sets tested are shown in the table in FIG. Urine was first treated via a Zeba 7K MWCO spin column (Thermo Fisher, Catalog 89893 or 89892 depending on urine volume) according to the manufacturer's instructions. 10 μL of magnetic particle preparation was then added to this mixture. 50 μL (pre-dried) “dye cushion” per well (50 mM TRIS pH 7.5 (Sigma Catalog T1075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma Catalog D1556), 50 mg / mL Direct) of the final reaction mixture. Transfer to a microtiter plate containing Black 19 (Orient Catalog 191L) and incubate at 35 ° C. for 30 minutes for rehydration of the "dye cushion", labeling of bacterial cells, and magnetic particles to the surface of the bacterial cells. Allowed binding at the same time. Each bacterium was tested at a final concentration of 1 × 106 cells per reaction. This concentration is E.I. Approximately 3000 times higher than the determined detection limit for coli. After incubation, the microtiter plate is placed on a magnetic field (Dexter magnetic techniques, Catalog 54170260) for 4 minutes and magnetic particles, which are fractions containing labeled cells, are placed at the bottom of the well via a "dye cushion". Close to the imaging surface.
標識された細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）ラボラトリーイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能な特注の機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）の高精度リニアステージを使用して、蛍光ベースのイメージ獲得サブシステム上に各ウェルを位置決めする。機器は、４つの別々の色チャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルターセットおよびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートウェル全体のイメージを捕捉するように設計された視野を有する。照明モジュール光供給源は、色チャネル１つ当たり２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームを、１ピクセル量子化当たり１２ビットで、３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５モノクロセンサーを使用してカメラで捕捉する。次いで、各ウェルについての最終イメージを、複数のフレームを合計することによって形成する。１６フレームを、６３５／２５ｎｍ励起および６８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。焦点粒子を、４７０／４０ｎｍ励起および５２０／４０ｎｍ励起フィルターでイメージングし、２０ミリ秒の曝露で２フレームを捕捉する。 Imaging of Labeled Cells: MultiPath ™ Laboratory Imaging Systems are custom instruments and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well on a fluorescence-based image acquisition subsystem. The instrument can be imaged in four separate color channels and uses an objective lens, an illuminated LED, a fluorescent filter set and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire microtiter plate well. The lighting module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames are captured by a camera using a 3.1MP Sony IMX265 monochrome sensor at 12 bits per pixel quantization. The final image for each well is then formed by summing multiple frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation and a 680/40 nm emission filter. Focus particles are imaged with 470/40 nm excitation and 520/40 nm excitation filters and capture 2 frames with 20 ms exposure.
データ分析：各細菌について、蛍光物体の数を決定した（アッセイシグナル）。ブランク（細胞の添加なし）におけるシグナルの３標準偏差以内のシグナルが検出された場合、細菌を交差反応性とみなした。
結果。
Data analysis: For each bacterium, the number of fluorescent objects was determined (assay signal). Bacteria were considered cross-reactive if signals were detected within 3 standard deviations of the signal in the blank (without cell addition).
result.
図２４および図２５は、迅速な新規ＦＩＳＨ法が、Ｅ．ｃｏｌｉのみを検出し、他の１６個の異なるチャレンジ細菌を検出しないことを示している。図２４および２５は各々、非常に高い濃度（１反応当たり１×１０６細胞）の８個の臨床的に関連するチャレンジ細菌が、標的化されたＥ．ｃｏｌｉ細菌について高いアッセイシグナルを生じる同じアッセイ条件下で検出されないことを示している。２つのバーは、Ｅ．ｃｏｌｉに特異的であるように設計した２つの異なるプローブセットを示す（図２３中の表を参照のこと）。１６個のチャレンジ細菌の各々についてのアッセイシグナルは、細胞なし対照プラス３標準偏差未満であった（１２５）。 In FIGS. 24 and 25, a rapid novel FISH method is described in E. coli. It shows that only colli is detected and no other 16 different challenge bacteria are detected. In FIGS. 24 and 25, eight clinically relevant challenge bacteria were targeted at very high concentrations (1 × 106 cells per reaction), respectively. It has been shown that the coli bacteria are not detected under the same assay conditions that produce high assay signals. The two bars are E.I. Two different probe sets designed to be colli-specific are shown (see table in FIG. 23). Assay signals for each of the 16 challenge bacteria were less than cellless control plus 3 standard deviations (125).
結論。この実施例に記載される新規の迅速なＦＩＳＨ法は、設計により、Ｅ．ｃｏｌｉを特異的に検出するが、１６個の臨床的に関連する潜在的交差反応性細菌は検出しない。これは、この方法が、感染の臨床処置にとって非常に重要な標的ＵＴＩ病原体の同定のための高い特異性を有することを実証している。 Conclusion. The novel rapid FISH method described in this example is by design E.I. It specifically detects coli, but does not detect 16 clinically relevant potentially cross-reactive bacteria. This demonstrates that this method has high specificity for the identification of targeted UTI pathogens that are of great importance for the clinical treatment of infection.
バリエーション。この実施例は、この新規ＦＩＳＨ法のパフォーマンスの例示であって、記載に含まれる具体的な詳細に限定されない。したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成要素濃度）、尿の濃度および尿処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを、当業者は容易に理解する。この方法論は、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体にも明らかに拡張することができる。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓについて高い特異性を実証するアッセイもまた設計されている。 variation. This embodiment is an example of the performance of this novel FISH method and is not limited to the specific details contained in the description. Therefore, different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, component concentrations), urine concentrations and It is readily appreciated by those skilled in the art that many variations are possible, including the use of urine treatment procedures. This methodology can be clearly extended to other biological specimens as well as other bacterial and non-bacterial pathogens. K. pneumoniae, K. pneumoniae, K. pneumoniae. oxytoca, P. et al. aeruginosa, P. et al. mirabilis and E. Assays that demonstrate high specificity for faecalis have also been designed.
（実施例４）
４種の別個の微生物を同時に同定するマルチプレックスＦＩＳＨ法
(Example 4)
Multiplex FISH method for simultaneous identification of 4 distinct microorganisms
概説。この実施例は、各細菌のｒＲＮＡに特異的な蛍光標識されたプローブを使用して、単一の反応において、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＫ．ｏｘｙｔｏｃａを同時に検出するための本発明の使用を実証している。各病原体は、異なる励起／発光スペクトル特徴を有する４個の別個のフルオロフォア － 各細菌種について１つ － の使用を介して、混合物中で特異的に検出された。 Overview. This example uses a fluorescently labeled probe specific for each bacterial rRNA in a single reaction with E. coli. colli, K. pneumoniae, P. p. aeruginosa and K. a. It demonstrates the use of the present invention to detect oxytoca simultaneously. Each pathogen was specifically detected in the mixture through the use of four distinct fluorophores with different excitation / emission spectral characteristics-one for each bacterial species.
実験方法。細菌細胞成長：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＡＴＣＣ ８７２４についての細菌培養物を、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に、新鮮なトリプシンソイ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３～５個のコロニーを接種し、３７℃で１．５～３時間成長させて対数期成長を達成することによって得た。次いで、各培養物を、カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＭ５８６０）中に、およそ１．０×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬである６００ｎｍの光学密度が０．１５になるように希釈した。
experimental method. Bacterial cell growth:
磁気粒子の調製：ポリアスパラギン酸コンジュゲートされた磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）およびカルボキシルコーティングされた磁気粒子（Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、カタログＣＭ－０２５－１０Ｈ）を使用して、細菌細胞を非特異的に捕捉した。各粒子を、ポリアスパラギン酸粒子については１反応当たりおよそ１．３８×１０９粒子、カルボキシル粒子については３．４６×１０９の終濃度で、５０ｍＭ Ｅｐｐｓ緩衝剤、ｐＨ８．２中に１：４０希釈した。 Preparation of Magnetic Particles: Using polyaspartic acid conjugated magnetic particles (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) and carboxyl coated magnetic particles (Carboxyl Magnetic Particles, Spherotech, Catalog CM-025-10H), Bacterial cells were captured non-specifically. Each particle was prepared at a final concentration of approximately 1.38 × 109 particles per reaction for polyaspartic acid particles and 3.46 × 109 for carboxyl particles, 50 mM Epps buffer, 1:40 in pH 8.2. Diluted.
細菌細胞の標識化：１００μＬ標識化反応を、４個全ての細菌の希釈した細胞、等温ハイブリダイゼーション緩衝剤（０．９×ＭＨＢＩＩ、３×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ、カタログＳ６６３９）、０．７７％ｗ／ｖ ＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログＣ３６４９）、０．７２％ｗ／ｖ ＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログＤ０４３１）、０．１３Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ カタログＧ９２７７）、０．１８％ｗ／ｖセトリミド（Ｓｉｇｍａ カタログＭ７３６５））、１６Ｓまたは２３Ｓ細菌ｒＲＮＡに標的化された種特異的ＤＮＡプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）、有効なハイブリダイゼーションを促進するためのヘルパープローブ（ＩＤＴ）および３０μＬのプールされたヒト尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を合わせることによって調製した。次いで、１０μＬの磁気粒子調製物を、この混合物に添加した。プローブ配列およびそれらの色素改変の場所は、図２７中の表に示される。 Bacterial Cell Labeling: 100 μL Labeling Reaction, Diluted Cells of All 4 Bacteria, Isothermal Hybridization Buffer (0.9 × MHBII, 3 × SSC (1.5M NaCl, 0.15M Sodium Citrate, Sigma, Catalog S6639), 0.77% w / v CHASPO (Sigma Catalog C3649), 0.72% w / v SB3-12 (Sigma Catalog D0431), 0.13M guanidine thiocyanate (Sigma Catalog G9277), 0. 18% w / v cetrimid (Sigma Catalog M7365)), species-specific DNA probes targeted to 16S or 23S bacterial rRNA (Integrated DNA Technologies, IDT), helper probes to promote effective hybridization (IDT). And 30 μL of pooled human urine (Innovative Research, Catalog IRHUURE 500ML) were prepared by combining. 10 μL of magnetic particle preparation was then added to this mixture. The probe sequences and the locations of their dye modifications are shown in the table in FIG.
細胞／ハイブリダイゼーション混合物（１ｍＬ）を、カートリッジ中に移動させた。カートリッジを、残りのアッセイステップならびにイメージの獲得および分析を自動化する分析器（以下に記載される）上に置いた。簡潔に述べると、分析器の流体システムは、１ウェル当たり４６μＬ（前もって乾燥させた）の「色素クッション」（５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含む反応混合物を光学窓中に動かした。カートリッジを、分析器内で３５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後、カートリッジを、磁石ステーション（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間動かして、標識された細胞を含む画分である磁気粒子を、再水和された「色素クッション」を介してウェルの底部にあるイメージング表面に近接させた。磁石ステーションの後、カートリッジを、分析器内のイメージングステーションに動かし、４つの色チャネル（赤（励起６３５／２５ｎｍ、発光６８０／４０ｎｍ）、黄色（励起５３０／２０ｎｍ、発光５７２／２３ｎｍ）、緑（励起４７０／４０ｎｍ、発光５２０／４０ｎｍ）、オレンジ（励起５６９／２５ｎｍ、発光６０９／３４ｎｍ））の各々において、一連のイメージを得た。
The cell / hybridization mixture (1 mL) was transferred into the cartridge. The cartridge was placed on an analyzer (described below) that automates the remaining assay steps and image acquisition and analysis. Briefly, the analyzer fluid system is a 46 μL (pre-dried) “dye cushion” per well (50 mM TRIS pH 7.5 (Sigma Catalog T1075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma Catalog). A reaction mixture containing D1556), 50 mg / mL Direct Black 19 (Orient Catalog 191L)) was moved into the optical window. The cartridge was incubated in the analyzer at 35 ° C. for 30 minutes. After this incubation, the cartridge is run on a magnet station (Dexter magnetic techniques, Catalog 54170260) for 4 minutes to disperse the magnetic particles, which are fractions containing labeled cells, via a rehydrated "dye cushion". Close to the imaging surface at the bottom of the well. After the magnet station, the cartridge was moved to the imaging station in the analyzer and four color channels (excitation 635/25 nm, emission 680/40 nm), yellow (excitation 530/20 nm, emission 572/23 nm), green (excitation 530/20 nm, emission 572/23 nm). A series of images were obtained for each of excitation 470/40 nm, emission 520/40 nm) and orange (excitation 569/25 nm,
標識された細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ分析器イメージングシステムは、完全に自動化された試験の一部として、ＭｕｌｔｉＰａｔｈカートリッジの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能な特注の機器およびソフトウェアである。これは、注文設計された高精度３軸位置決めシステムを使用して、蛍光ベースのイメージ獲得サブシステム上に各ウェルを場所決めする。分析器は、４つの別々の色チャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルターセットおよびカメラを使用する。対物レンズは、カートリッジイメージングウェル全体のイメージを捕捉するように設計された視野を有する。照明モジュール光供給源は、色チャネル１つ当たり２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームを、１ピクセル量子化当たり１２ビットで、３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５モノクロセンサーを使用してカメラで捕捉する。次いで、各ウェルについての最終イメージを、複数のフレームを合計することによって形成する。赤チャネルについて、１６フレームを、６３５／２５ｎｍ励起および６８０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。オレンジチャネルについて、２４フレームを、５６９／２５ｎｍ励起および６０９／３４ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。黄色チャネルについて、４８フレームを、５３０／２０ｎｍ励起および５７２／２３ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。緑チャネルについて、３２フレームを、４７０／４０ｎｍ励起および５２０／４０ｎｍ発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の曝露で捕捉した。標識された細胞をイメージングするための焦点平面を、この実施例において実験的に決定した。 Imaging of Labeled Cells: The MultiPath Analyzer Imaging System is a custom instrument and software capable of automatically capturing image data from selected wells of MultiPath cartridges as part of a fully automated test. Is. It uses a custom-designed precision 3-axis positioning system to locate each well on a fluorescence-based image acquisition subsystem. The analyzer can be imaged in four separate color channels and uses an objective lens, illuminated LEDs, a fluorescent filter set and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire cartridge imaging well. The lighting module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames are captured by a camera using a 3.1MP Sony IMX265 monochrome sensor at 12 bits per pixel quantization. The final image for each well is then formed by summing multiple frames. For the red channel, 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation and a 680/40 nm emission filter. For the orange channel, 24 frames were captured at 100 ms exposure using a 569/25 nm excitation and a 609/34 nm emission filter. For the yellow channel, 48 frames were captured at 100 ms exposure using a 530/20 nm excitation and a 572/23 nm emission filter. For green channels, 32 frames were captured at 100 ms exposure using 470/40 nm excitation and 520/40 nm emission filters. The focal plane for imaging labeled cells was experimentally determined in this example.
結果。
図２６は、各々４つの入力細菌のうち１つに特異的な４つの色チャネルの各々において蛍光を検出した、完全な獲得されたイメージの一部分を示す。各スポットは、単一細胞または細胞の群に対応する。アルゴリズムを使用して、アーチファクト（例えば、破片）とは別個の意味ある物体を同定し、それらの物体を細胞として計数する。各細菌についての差し込み図でわかるように、類似の数の細胞が予想どおり検出されたが、それは、入力細胞濃度がおよそ同じだったからである。オーバーレイすると、これらのスポットは対応せず、これは、４つの異なる細菌標的で、異なる物体が予想どおり各チャネルにおいて観察されたことを示している。
result.
FIG. 26 shows a portion of a fully acquired image in which fluorescence was detected in each of the four color channels specific for one of the four input bacteria each. Each spot corresponds to a single cell or group of cells. Algorithms are used to identify meaningful objects that are separate from artifacts (eg, debris) and count those objects as cells. As can be seen in the inset for each bacterium, similar numbers of cells were detected as expected, as the input cell concentrations were approximately the same. When overlaid, these spots do not correspond, indicating that different objects were observed in each channel as expected at four different bacterial targets.
結論。この方法は、単一の迅速なＦＩＳＨ法が、カートリッジの単一のウェルにおいて４つの異なる細菌を同時に検出および定量化するのを可能にする。
バリエーション：
Conclusion. This method allows a single rapid FISH method to simultaneously detect and quantify four different bacteria in a single well of the cartridge.
variation:
この実施例は、この新規ＦＩＳＨ法の多重性能の例示であって、記載に含まれる具体的な詳細に限定されない。したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）および代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成要素濃度）を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを、当業者は容易に理解する。この方法論は、それに対する特異的プローブを設計することができる他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体にも明らかに拡張することができる。
（実施例６）
機器上のカートリッジにおける臨床尿検体中のＥ．ｃｏｌｉの自動化迅速ＡＳＴ
This embodiment is an example of the multiplicity performance of this novel FISH method and is not limited to the specific details contained in the description. Therefore, it is recommended to use different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.) and alternative assay chemistry (different detergents, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, component concentration). It is easy for those skilled in the art to understand that many variations are possible, including. This methodology can be clearly extended to other biological specimens for which specific probes can be designed as well as other bacterial and non-bacterial pathogens.
(Example 6)
E. in clinical urine specimens in a cartridge on the instrument. col automation rapid AST
概要：この実施例は、細胞の精製を必要とすることなく、４時間で、尿中の標的化細菌病原体（この実施例ではＥ．ｃｏｌｉ）の抗微生物薬感受性を決定するための発明のシステム、デバイス、および方法の使用を実証する。標識化と磁気選別のための、かつ非拡大デジタルイメージングを使用する差示的成長後に特異的標的細胞を定量する、協奏的なＦＩＳＨ方法を使用する実施例。この新たな方法は、ゴールドスタンダードであるＣＬＳＩブロス微量希釈（ＢＭＤ）方法と匹敵する性能を有する。
実験方法：
Summary: This example is a system of invention for determining the antimicrobial susceptibility of a targeted bacterial pathogen in urine (E. coli in this example) in 4 hours without the need for cell purification. , Devices, and methods to demonstrate the use. Examples using a concerted FISH method for labeling and magnetic sorting and quantifying specific target cells after differential growth using non-enlarged digital imaging. This new method has performance comparable to the gold standard CLSI broth microdilution (BMD) method.
experimental method:
尿検体：***症（ＵＴＩ）を有する患者から採取され、Ｅ．ｃｏｌｉを含有することが公知の４８個の残遺物である匿名化された尿検体をベスイスラエル病院（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のＫｉｒｂｙ医師の研究所から受領した。試料は、採取の１～５日後に受領し、細胞生存率の損失を制限する尿防腐剤を含有した。各試料について、尿の色、ｐＨ、および微粒子の存在を記録した。受領の際に、存在する細菌のおよそのＣＦＵ／ｍＬを決定し、Ｋｉｒｂｙ医師の研究所によって報告された単一のまたは混合した細菌の形態学を確認するために、従来の尿培養を実施した。簡潔には、較正した１μＬのループを十分に混合した尿試料中に入れ、１μＬをトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）プレート上に均一に広げ、３５℃のインキュベーター中で１８～２４時間インキュベートした。尿試料の残りを以下に記載したように処理およびアッセイした。 Urine specimens: Collected from patients with urinary tract infections (UTI), E.I. Anonymized urine specimens, 48 relics known to contain colli, were received from Dr. Kirby's laboratory at the Beth Israel Hospital (Boston, MA). Samples were received 1-5 days after collection and contained a urinary preservative that limited loss of cell viability. For each sample, the color of urine, pH, and the presence of particulates were recorded. Upon receipt, conventional urine cultures were performed to determine the approximate CFU / mL of the bacteria present and to confirm the morphology of the single or mixed bacteria reported by Dr. Kirby's laboratory. .. Briefly, 1 μL of calibrated loops are placed in a well-mixed urine sample, 1 μL is spread evenly on a tryptic soybean agar (TSA, BD Catalog 211185) plate and incubated in a 35 ° C. incubator for 18-24 hours. did. The rest of the urine sample was processed and assayed as described below.
尿の処理：試験の前に、尿防腐剤および他の妨害する可能性のある化合物をサイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。各臨床的に陽性の尿試料２．５ｍＬを事前に洗浄したＺｅｂａ（商標）７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８９３）に適用し、製造業者の使用説明書に従って遠心分離した。処理後の細菌の損失を調査するために、上記のように、この処理した試料に関して尿培養を繰り返した。 Urine treatment: Prior to testing, urine preservatives and other potentially disturbing compounds were removed using size exclusion chromatography. 2.5 mL of each clinically positive urine sample was applied to a pre-washed Zeba ™ 7K MWCO spin column (Thermo Fisher, Catalog No. 89893) and centrifuged according to the manufacturer's instructions. Urine cultures were repeated for this treated sample as described above to investigate the loss of bacteria after treatment.
磁気粒子の調製：細菌細胞を非特異的に捕捉するために使用したポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
Preparation of Magnetic Particles: Polyaspartic acid-conjugated magnetic particles (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) used to capture bacterial cells non-specifically into 50 mM EPPS buffer, pH 8.2. Up to 2.75 × 10 12 particles per mL were diluted 1:20. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. Separate magnetic particle suspensions were prepared for the
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前の時間０（Ｔ０）におけるアッセイシグナルを各臨床尿検体について決定した。それぞれ処理済尿３０μＬを、種特異的Ａｌｅｘａ６４７Ｎで標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブを含有する１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）７０μＬに添加した。使用したプローブ配列を表Ａに示す。次いで、混合物１００μＬを、脱水したハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．１８％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、０．７２％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１） ０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７））を含有するマイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、調製した磁気粒子混合物１０μＬをウェルに添加した。この反応混合物１００μＬを、ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。 Bacterial cell labeling at AST time 0: Assay signals at time 0 (T0) prior to the initiation of bacterial growth in the presence or absence of antibiotics were determined for each clinical urine sample. 30 μL of each treated urine was added to 70 μL of Mueller-Hinton Broth (MHBII) prepared with 1 × cation containing a species-specific Alexa647N-labeled DNA oligonucleotide FISH probe and an unlabeled DNA helper probe. The probe sequences used are shown in Table A. Then, 100 μL of the mixture was added to dehydrated hybridization buffer (3X SSC (0.45 M NaCl, 0.045 M Na citrate) buffer (Sigma, catalog number S6639), 0.18% cetrimid (Sigma, catalog). No. H9151), 0.77% CHASPO (Sigma Catalog No. C3649), 0.72% SB3-12 (Sigma Catalog No. D0431) 0.13M guanidine thiocyanate (Sigma, Catalog No. G9277)). Added to the wells of the titer plate. Then 10 μL of the prepared magnetic particle mixture was added to the wells. 100 μL of this reaction mixture is 50 μL per well (pre-dried) “dye cushion” (50 mM TRIS pH 7.5 (Sigma Catalog T1075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma Catalog D1556), 50 mg. It was transferred to a microtiter plate containing / mL of Direct Black 19 (Orient Catalog 191L) and incubated at 35 ° C. for 30 minutes. After incubation, the microtiter plate is placed in a magnetic field (Dexter magnetic techniques, Catalog 54170260) for 4 minutes and the fraction containing magnetic particles, labeled cells is placed near the imaging surface at the bottom of the well via a "dye cushion". Moved to.
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに関する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して、１００ミリ秒の露出で１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 Imaging of Labeled Cells: The MultiPath ™ laboratory imaging system is a custom built-in device and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well with respect to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The device can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire well of the microtiter plate. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames is captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
抗生物質プレートの調製：予想された最少阻止濃度（ＭＩＣ）よりも１０倍高い濃度で開始して、２倍連続希釈系列で各抗生物質の６つの濃度を含有するマイクロタイタープレートを調製した。使用した抗生物質は、セファゾリン、シプロフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾールであった。抗生物質の希釈液を、少なくとも２つのＣＬＳＩ ＱＣ株に関するＭＩＣがＣＬＳＩの文献Ｍ１００Ｅｄ２９Ｅ－２０１９において報告されたＱＣ範囲内にあることを確認することによって、適切な忍容性の範囲内にあることを検証した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗生物質に関してＣＬＳＩにより報告されたブレイクポイントをまたいだ。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水または希釈液を含有する８つのウェルがプレート中に含まれ、抗生物質なしの陽性成長対照および陰性成長対照を可能とした。 Preparation of antibiotic plates: Starting with a concentration 10-fold higher than the expected minimum inhibitory concentration (MIC), microtiter plates containing 6 concentrations of each antibiotic were prepared in a 2-fold serial dilution series. The antibiotics used were cefazolin, ciprofloxacin, nitrofurantoin, and trimethoprim-sulfamethoxazole. Antibiotic dilutions are within the appropriate tolerability range by ensuring that the MICs for at least two CLSI QC strains are within the QC range reported in CLSI literature M100Ed29E-2019. Verified. The concentration selected to test each antibiotic is E. coli. Crossed the breakpoints reported by CLSI regarding antibiotics against coli. In addition to the wells containing the antimicrobial dilution series, eight wells containing water or diluent were included in the plate, allowing for positive and negative growth controls without antibiotics.
４時間の成長：時間０での細胞の定量化がなされている間に、処理済臨床尿３２．４μＬと１．４３Ｘ ＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０）７５．６μＬを抗生物質プレート（既に抗生物質１２μＬを含有する）の各ウェルに添加した。標準的インキュベーター中で、３５℃で４時間、試料を成長させた。
4 hours of growth: 32.4 μL of treated clinical urine and 75.6 μL of 1.43X MHB II (Teknova, Catalog No. M5860) on an antibiotic plate (already antibiotic) while cell quantification at
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートの各ウェルの１００μＬを脱水緩衝剤プレートの対応するウェルに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
Bacterial cell labeling in
比較方法：ＭｕｌｉｔＰａｔｈ（商標）アッセイに関する結果を、ＣＬＳＩの方法Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。 Comparative Method: Results for the MultiPath ™ assay were compared to broth microdilution (BMD) performed according to the CLSI method M07-Ed13E 2018.
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の６つの濃度全てを含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各尿試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
結果。
Data analysis and threshold creation: Images captured by a CCD camera were used to estimate the detected cells by an algorithm that considers both the number of objects in the field and the intensity of those objects. Cell counts based on this detection algorithm were obtained at
result.
図２８から図３１は、ゴールドスタンダードであるブロス微量希釈方法に一致する３つの個体の尿に関するＭＩＣを得るためにこの方法をどのように使用することができるかを実証する本発明者らのより大きなデータセットからの３つの実施例を示す。図２８は、単一の薬物（ニトロフラントイン）に対する単一の臨床尿試料（ＢＩＵＲ００１７）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数の結果を示す。ブロス微量希釈に関するＭＩＣは、成長倍率閾値によって決定されたＭＩＣと正確に一致する。図２９は、単一の薬物（セファゾリン）に対する単一の臨床尿試料（ＢＩＵＲ００４７）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数の結果を示す。ブロス微量希釈に関するＭＩＣは、成長倍率閾値によって決定されたＭＩＣと正確に一致する。図３０は、単一の薬物（シプロフロキサシン）に対する単一の臨床尿試料（ＢＩＵＲ００５７）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数の結果を示す。ブロス微量希釈に関するＭＩＣは、成長倍率閾値によって決定されたＭＩＣと正確に一致する。図３１は、単一の薬物（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）に対する単一の臨床尿試料（ＢＩＵＲ００５２）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数の結果を示す。ブロス微量希釈に関するＭＩＣは、成長倍率閾値によって決定されたＭＩＣと正確に一致する。 28-31 are from the inventors demonstrating how this method can be used to obtain MICs for the urine of three individuals consistent with the gold standard broth microdilution method. Three examples from a large dataset are shown. FIG. 28 shows the results of the number of growth rates at different antibiotic concentrations for a single clinical urine sample (BIUR0017) for a single drug (nitrofurantoin). The MIC for broth microdilution is in exact agreement with the MIC determined by the growth factor threshold. FIG. 29 shows the results of the number of growth rates at different antibiotic concentrations for a single clinical urine sample (BIUR0047) for a single drug (cefazolin). The MIC for broth microdilution is in exact agreement with the MIC determined by the growth factor threshold. FIG. 30 shows the results of the number of growth rates at different antibiotic concentrations for a single clinical urine sample (BIUR0057) for a single drug (ciprofloxacin). The MIC for broth microdilution is in exact agreement with the MIC determined by the growth factor threshold. FIG. 31 shows the results of the number of growth rates at different antibiotic concentrations for a single clinical urine sample (BIUR0052) for a single drug (trimethoprim / sulfamethoxazole). The MIC for broth microdilution is in exact agreement with the MIC determined by the growth factor threshold.
結論。この新規方法は、正確なＡＳＴの結果（ＭＩＣの決定）が、注目すべきことに、長時間に及ぶコロニー精製ステップを用いずに、最小限に処理された尿臨床検体の４時間のみの差示的成長によってなされ得ることを示す。ＡＳＴの結果は、ＭＩＣカテゴリーの抗生物質感受性結果として報告されたかどうかにかかわらず、ゴールドスタンダードであるブロス微量希釈方法と比較するのが好都合である。 Conclusion. This novel method results in accurate AST results (MIC determination), notably only a 4-hour difference in minimally treated urinary clinical specimens without the lengthy colony purification step. Show that it can be done by demonstrative growth. It is convenient to compare the AST results with the gold standard broth microdilution method, whether or not it was reported as an antibiotic susceptibility result in the MIC category.
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度など）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の抗生物質、生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体に明らかに拡張され得る。 variation. This embodiment is an illustration of the performance of this novel AST method and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, constituents). It will be easy to see that many variations are possible, including the use of concentrations), urine concentrations and urine processing procedures. This methodology can also be clearly extended to other antibiotics, biological specimens and other bacterial and non-bacterial pathogens.
（実施例７）
尿試料中の細菌についての迅速で正確な抗微生物薬感受性試験
(Example 7)
Rapid and accurate antimicrobial susceptibility testing for bacteria in urine samples
概要。この実施例は、細菌を含まない尿中に添加された公知の抗生物質感受性プロファイルを有する病原体の抗微生物薬感受性を正確に決定するための本発明の使用について実証する。抗微生物剤を含有する微生物学的培地における差示的成長、その後の標的特異的細胞の定量化のための本発明と協奏するＦＩＳＨ方法を使用する成長の評価には、ちょうど４．５時間を要した。この新たな方法は、ゴールドスタンダードであるＣＬＳＩブロス微量希釈（ＢＭＤ）方法と匹敵する性能を有する。
実験方法。
Overview. This example demonstrates the use of the invention to accurately determine the antimicrobial susceptibility of pathogens with known antibiotic susceptibility profiles added to bacteria-free urine. Exactly 4.5 hours to assess growth using the FISH method in concert with the present invention for differential growth in microbiological media containing antimicrobial agents and subsequent quantification of target-specific cells. It took. This new method has performance comparable to the gold standard CLSI broth microdilution (BMD) method.
experimental method.
細菌細胞の調製：公知の耐性プロファイルを有する５０種の細菌株を、ＡＴＣＣまたはＣＤＣ抗生物質耐性バンク（ＡＲバンク）のいずれかから採取し、表Ａに示す。これらのうちのそれぞれに関する細菌培養物は、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に新鮮なトリプシンダイズ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３から５個のコロニーを接種し、３５℃で１．５から３時間成長させて対数期成長を達成することによって得られた。６００ｎｍの光学密度を使用して細胞濃度を推定し、各培養物をカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中でおよそ５×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬまで希釈した。 Bacterial Cell Preparation: Fifty bacterial strains with known resistance profiles are collected from either the ATCC or CDC antibiotic resistance bank (AR bank) and are shown in Table A. Bacterial cultures for each of these are obtained by inoculating Trypticase Soy Broth (TSB, Hardy Diagnostics Catalog U65) with 3 to 5 colonies from a fresh trypticase soybean agar plate (TSA, BD Catalog 221185) at 35 ° C. It was obtained by growing in 1.5 to 3 hours to achieve logarithmic growth. Cell concentrations were estimated using an optical density of 600 nm and each culture was diluted to approximately 5 × 10 6 colony forming units (CFU) / mL in cation-adjusted Mueller Hinton II (MHBII, Teknova Catalog M5860). ..
尿の処理：試験する前に、プールしたヒトの尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲＨＵＵＲＥ５００ＭＬ）を事前に洗浄したＺｅｂａ（商標）７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラムに、４ｍＬの尿の１つの事前に洗浄した１０ｍＬのスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８９３）に対する比で適用し、製造業者の使用説明書に従って遠心分離した。 Urine Treatment: One pre-washed 10 mL spin column of 4 mL urine on a Zeba ™ 7K MWCO spin column pre-washed pooled human urine (Innovative Research, Catalog IRHUURE 500ML) prior to testing. It was applied in a ratio to (Thermo Fisher, Catalog No. 89893) and centrifuged according to the manufacturer's instructions.
磁気粒子の調製：細菌細胞を非特異的に捕捉するために使用したポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
Preparation of Magnetic Particles: Polyaspartic acid-conjugated magnetic particles (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) used to capture bacterial cells non-specifically into 50 mM EPPS buffer, pH 8.2. 2.75 × 10 per mL 12 particles were diluted 1:20. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. Separate magnetic particle suspensions were prepared for the
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前の時間０（Ｔ０）におけるアッセイシグナルを各細菌について決定した。処理済尿３０μＬ、５×１０６ＣＦＵ／ｍＬの細菌希釈液１０μＬ、ＭＨＢＩＩ（１００μＬ中の１×終濃度）６０μＬならびに標的細菌種に対して適切な種特異的なＡｌｅｘａ６４７Ｎで標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよびそれに関連する未標識ＤＮＡヘルパープローブからなる反応混合物を調製した。使用したプローブ配列を図３６の表に示す。次いで、混合物１００μＬを、脱水したハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．１８％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、０．７２％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１）、０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７））を含有するマイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、調製した磁気粒子混合物１０μＬをウェルに添加した。この反応混合物１００μＬを、ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。 Bacterial cell labeling at AST time 0: Assay signals at time 0 (T0) prior to the initiation of bacterial growth in the presence or absence of antibiotics were determined for each bacterium. 30 μL of treated urine, 10 μL of bacterial diluent of 5 × 10 6 CFU / mL, 60 μL of MHBII (1 × final concentration in 100 μL) and species-specific Alexa647N-labeled DNA oligonucleotide suitable for the target bacterial species. A reaction mixture consisting of a FISH probe and its associated unlabeled DNA helper probe was prepared. The probe sequences used are shown in the table of FIG. Then, 100 μL of the mixture was added to dehydrated hybridization buffer (3X SSC (0.45 M NaCl, 0.045 M Na citrate) buffer (Sigma, catalog number S6639), 0.18% cetrimid (Sigma, catalog). No. H9151), 0.77% CHASPO (Sigma Catalog No. C3649), 0.72% SB3-12 (Sigma Catalog No. D0431), 0.13M guanidine thiocyanate (Sigma, Catalog No. G9277)). Added to the wells of the microtiter plate. Then 10 μL of the prepared magnetic particle mixture was added to the wells. 100 μL of this reaction mixture is 50 μL per well (pre-dried) “dye cushion” (50 mM TRIS pH 7.5 (Sigma Catalog T1075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma Catalog D1556), 50 mg. It was transferred to a microtiter plate containing / mL of Direct Black 19 (Orient Catalog 191L) and incubated at 35 ° C. for 30 minutes. After incubation, the microtiter plate is placed in a magnetic field (Dexter magnetic techniques, Catalog 54170260) for 4 minutes and the fraction containing magnetic particles, labeled cells is placed near the imaging surface at the bottom of the well via a "dye cushion". Moved to.
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 Imaging of Labeled Cells: The MultiPath Laboratory imaging system is a custom built-in device and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well with respect to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The device can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire well of the microtiter plate. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames is captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
抗生物質プレートの調製：２倍連続希釈系列で各抗生物質の６つの濃度を含有するマイクロタイタープレートを調製した。２倍希釈系列を、追加の細胞／尿／培地混合物によって正しい抗生物質範囲が得られるように、最終ブロス微量希釈における所望の濃度よりも１０倍高い濃度で調製した。次いで、各抗生物質の希釈液１２ｕＬを９６ウェルプレートの適切なウェル中にアリコートした。異なる抗体を異なる細菌について試験した。抗生物質の希釈液を、少なくとも２つのＣＬＳＩ ＱＣ株に関するＭＩＣがＣＬＳＩの文献Ｍ１００Ｅｄ２９Ｅ－２０１９において報告されたＱＣ範囲内にあることを確認することによって、適切な忍容性の範囲内にあることを検証した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、適切な細菌種に対する抗生物質に関してＣＬＳＩにより報告されたブレイクポイントをまたぎ、その結果、カテゴリーの決定（感受性／中間／耐性）はこのデータからなされた。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水または他の希釈液を含有するいくつかのウェルは、抗生物質なしの陽性成長対照および陰性成長（細胞なし）対照のために含まれた。抗生物質プレートを－８０℃で凍結させ、使用前に完全に解凍した。 Preparation of antibiotic plates: Microtiter plates containing 6 concentrations of each antibiotic were prepared in a 2-fold serial dilution series. The 2-fold dilution series was prepared at a concentration 10-fold higher than the desired concentration in the final broth microdilution so that the correct antibiotic range was obtained with the additional cell / urine / medium mixture. 12 uL of each antibiotic diluent was then aliquoted into the appropriate wells of a 96-well plate. Different antibodies were tested against different bacteria. Antibiotic dilutions are within the appropriate tolerability range by ensuring that the MICs for at least two CLSI QC strains are within the QC range reported in CLSI literature M100Ed29E-2019. Verified. The concentration selected to test each antibiotic spanned the breakpoints reported by CLSI for antibiotics against the appropriate bacterial species, so that category determination (susceptibility / intermediate / resistance) was made from this data. .. In addition to the wells containing the antimicrobial dilution series, some wells containing water or other diluents were included for positive and negative growth (cellless) controls without antibiotics. Antibiotic plates were frozen at −80 ° C. and thawed completely before use.
４時間の成長：時間０での細胞の定量化がなされている間に、調製した細菌培養物１２μＬ、時間０のアッセイに対してなされたように処理したプールしたヒトの尿３６ｕＬ、２Ｘ ＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０）６０ｕＬおよび水２ｕＬを調製した抗生物質プレートの各ウェルに添加した。標準的インキュベーター中で、３５℃で４時間、試料を成長させた。
4 hours of growth: 12 μL of bacterial culture prepared during
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートの各ウェルの１００μＬを脱水緩衝剤プレートの対応するウェルに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
Bacterial cell labeling in
比較方法：ＭｕｌｉｔＰａｔｈ（商標）アッセイに関する結果を、ＣＬＳＩの方法Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。 Comparative Method: Results for the MultiPath ™ assay were compared to broth microdilution (BMD) performed according to the CLSI method M07-Ed13E 2018.
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の全ての濃度を含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各細菌試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、結果を、ＡＴＣＣまたはＣＤＣによって報告されたＭＩＣ値およびカテゴリーコールと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が各試料に添加されたことを確認するための、または阻害倍率を計算する際に使用するための対照条件である。
Data analysis and threshold creation: Images captured by a CCD camera were used to estimate the detected cells by an algorithm that considers both the number of objects in the field and the intensity of those objects. Cell counts based on this detection algorithm were obtained at
さらに、セフタジジム（ＣＡＺ）に対して試験した細菌について、独占的な糸状菌の存在が（図３３、左側（正常細菌）と右側（糸状菌）を比較して、目視で容易に識別することができるように）、その抗生物質濃度において差し迫った細胞死の指標として得られたこと、およびＭＩＣ濃度が、可能ならばこれに従って調整されたことを示す。トリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＸＴ）について試験した細菌の場合には、閾値は、阻害倍率（抗生物質と細菌の両方を含有するウェルによって分割された細菌を含有するが抗生物質を含有しないウェルにおけるアッセイシグナル）に基づいて作成された。
結果。
Furthermore, for the bacteria tested against ceftazidime (CAZ), the presence of exclusive filamentous fungi (FIG. 33, left side (normal bacteria) and right side (filamentous fungi) can be compared and easily identified visually. (As possible) to indicate that the antibiotic concentration was obtained as an indicator of imminent cell death, and that the MIC concentration was adjusted accordingly if possible. For bacteria tested for trimethoprim / sulfamethoxazole (TMP / SXT), the threshold is the inhibition factor (containing bacteria divided by wells containing both antibiotics and bacteria but containing antibiotics). Not based on assay signals in wells).
result.
図３４は、ＣＤＣまたはＣＬＳＩにより公表されたＭＩＣと一致する、尿マトリックスの存在下での個々の細菌に関するＭＩＣを得るためにこの方法をどのように使用することができるかを示す。この実施例は、単一の薬物（シプロフロキサシン）に対する単一の細菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ０１２６）に関する異なる抗生物質濃度における成長倍率の数を示す。公表されたＭＩＣ（≧０．２５μｇ／ｍＬ）は、本発明において記載した新規の、迅速ＡＳＴ方法によって決定したＭＩＣと正確に一致する。成長倍率に関する閾値（この実施例では２０）は、灰色の横線で示す。 FIG. 34 shows how this method can be used to obtain a MIC for an individual bacterium in the presence of a urinary matrix, consistent with a MIC published by CDC or CLSI. This example shows the number of growth rates at different antibiotic concentrations for a single bacterium (K. pneumoniae CDC0126) to a single drug (ciprofloxacin). The published MIC (≧ 0.25 μg / mL) is in exact agreement with the MIC determined by the novel, rapid AST method described in the present invention. The threshold for growth rate (20 in this example) is indicated by a gray horizontal line.
図３５の表は、試験した全ての株にわたる全体的性能を示す。試験したＭＩＣは、新規ＡＳＴ方法によって決定したＭＩＣが、正確に一致するか、または公表された値の１つの２倍希釈内にある場合に、本質的一致内にある。２つの場合を除き、全ての細菌／抗生物質の組合せが１００％の本質的一致を有した。 The table in FIG. 35 shows the overall performance across all strains tested. The MICs tested are within essential agreements if the MICs determined by the novel AST method are in exact agreement or within one 2-fold dilution of the published values. Except for two cases, all bacterial / antibiotic combinations had 100% intrinsic agreement.
結論。本新規方法は、多剤耐性機序を有する高度に特徴付けられた細菌株に対して公表された値と一致するＭＩＣの決定が、試料マトリックスの文脈において、４時間のみの成長によってなされ得ることを示す。 Conclusion. This novel method allows MIC determinations consistent with published values for highly characterized bacterial strains with a multidrug resistance mechanism to be made by growth for only 4 hours in the context of a sample matrix. Is shown.
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度など）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の抗生物質、生物学的検体および特異的プローブが設計され得る他の細菌に明らかに拡張され得る。 variation. This embodiment is an illustration of the performance of this novel AST method and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, constituents). It will be easy to see that many variations are possible, including the use of concentrations), urine concentrations and urine processing procedures. This methodology can also be clearly extended to other antibiotics, biological specimens and other bacteria for which specific probes can be designed.
（実施例８）
細胞精製を使用しない臨床尿試料についての迅速で正確な自動ＡＳＴ結果
(Example 8)
Rapid and accurate automated AST results for clinical urine samples without cell purification
概要。この実施例は、長時間に及ぶ細胞精製ステップを必要としない、４時間での臨床尿試料中の病原体に関するＡＳＴの結果を自動的に決定するための本発明のシステムおよび方法の使用について実証する。自動化された機器は、一定の生理的温度で抗微生物薬感受性を決定するために、試薬を含有するカートリッジにおいて必要とされるステップを実施する。温度は、微生物成長と標的細胞を検出および定量するための本発明の方法との両方に適合する。後者の方法は、ＦＩＳＨに基づく標識化、磁気選別、および非拡大デジタルイメージングを使用する本発明のシステムで実施される。 Overview. This example demonstrates the use of the systems and methods of the invention to automatically determine AST results for pathogens in clinical urine samples at 4 hours without the need for lengthy cell purification steps. .. Automated equipment performs the steps required for cartridges containing reagents to determine antimicrobial susceptibility at constant physiological temperatures. The temperature is compatible with both microbial growth and the methods of the invention for detecting and quantifying target cells. The latter method is carried out in the system of the invention using FISH-based labeling, magnetic sorting, and non-magnifying digital imaging.
機器の空気圧サブシステムを使用して、カートリッジ内の検体を、様々な濃度の様々な抗微生物剤と微生物学的培地とを含有するポーションまたはアリコート中に自動的に分配する。ポーションのうちの１つを使用して、成長インキュベーションの前に病原体細胞を定量する。このシステムはカートリッジを４時間インキュベートし、次いで、抗微生物剤を含有するウェル中の標的細胞数を定量する。抗微生物剤を含有するインキュベートしたポーション中の細胞数のインキュベーション前に測定した細胞数との比較を使用して、様々な抗生物質における病原体の抗微生物薬感受性を決定する。 The instrument's pneumatic subsystem is used to automatically dispense the specimens in the cartridge into potions or aliquots containing different concentrations of different antimicrobial agents and microbiological media. One of the potions is used to quantify pathogen cells prior to growth incubation. The system incubates the cartridge for 4 hours and then quantifies the number of target cells in the well containing the antimicrobial agent. Comparison of the number of cells in an incubated portion containing an antimicrobial agent with the number of cells measured prior to incubation is used to determine the antimicrobial susceptibility of the pathogen to various antibiotics.
この実施例は、尿中にＥ．ｃｏｌｉを有する入院患者からの臨床検体において直接的に、迅速かつ自動化された抗微生物薬感受性試験のための本発明の自動化システム、デバイス、および方法を使用する結果を示す。本発明は、ちょうど４時間で、ゴールドスタンダードであるＣＬＳＩブロス微量希釈（ＢＭＤ）方法と比較して正確な性能を実現した。
実験方法。
In this example, E. coli in urine. The results of using the automated systems, devices, and methods of the invention for direct, rapid and automated antimicrobial susceptibility testing in clinical specimens from inpatients with coli are shown. The present invention has achieved accurate performance in just 4 hours compared to the gold standard CLSI broth microdilution (BMD) method.
experimental method.
尿検体：***症（ＵＴＩ）を有する患者から採取され、Ｅ．ｃｏｌｉを含有することが知られている残遺物である匿名化された尿検体をベスイスラエル病院（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のＫｉｒｂｙ医師の研究所から受領した。試料は、採取の１～５日後に受領し、細胞生存率の損失を制限する尿防腐剤を含有した。各試料について、尿の色、ｐＨ、および微粒子の存在を記録した。受領の際に、存在する細菌についておよそのＣＦＵ／ｍＬを決定し、Ｋｉｒｂｙ医師の研究所によって報告された単一または混合した細菌の形態学を確認するために、従来の尿培養を実施した。簡潔には、較正した１μＬのループを十分に混合した尿試料中に入れ、１μＬをトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上に均一に広げ、３５℃のインキュベーター中で１８～２４時間インキュベートした。尿試料の残りを以下に記載したように処理およびアッセイした。
ＡＳＴカートリッジの調製－培地および抗微生物薬
Urine sample: Collected from a patient with a urinary tract infection (UTI), E.I. An anonymized urine specimen, a relic known to contain colli, was received from Dr. Kirby's laboratory at the Beth Israel Hospital (Boston, MA). Samples were received 1-5 days after collection and contained a urinary preservative that limited loss of cell viability. For each sample, the color of urine, pH, and the presence of particulates were recorded. Upon receipt, a conventional urine culture was performed to determine the approximate CFU / mL for the bacteria present and to confirm the morphology of the single or mixed bacteria reported by Dr. Kirby's laboratory. Briefly, calibrated 1 μL loops were placed in a well-mixed urine sample, 1 μL was spread evenly on a tryptic soybean agar (TSA) plate and incubated in a 35 ° C. incubator for 18-24 hours. The rest of the urine sample was processed and assayed as described below.
Preparation of AST cartridges-medium and antimicrobial agents
４Ｘ ＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号１０１３２０－３５６）２５ｕＬを８個の個々の成長ウェルのそれぞれの中に分配することによってカートリッジを調製する何日か前に（カートリッジの図としての図３７を参照されたい）、成長ウェル１および２は時間０の測定のためのものであり（以下の記載を参照されたい）、よって、成長ウェルには成長培地のみが含有されている。成長ウェル３および４も培地しか含有しなかった。これらのウェルは、成長が４時間をかけて観察されることを確認するための陽性対照としての役割を果たす。成長ウェル５および６、ならびに７および８中に、２つの濃度の抗生物質を添加した。これを行うために、１ｍＬ当たりのマイクログラムで標的濃度より２２．２倍高い倍率で濃縮した抗生物質４．５μＬを適切な成長ウェル中に沈着させた。カートリッジは、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）とニトロフラントイン（ＮＩＴ）との両方またはセファゾリン（ＣＦＺ）とトリメトプリム／スルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＸＴ）との両方のいずれかを２つの濃度で含有した。カートリッジ中の各抗生物質の終濃度については、図３８を参照されたい。次いで、培地および抗生物質を４０℃のコンベクションオーブン中で１６～２０時間乾燥させた。
A few days before preparing the cartridge by distributing 25 uL of 4X MHB II (Teknova, Catalog No. 101320-356) into each of the eight individual growth wells (see Figure 37 as a diagram of the cartridge). The
ＡＳＴカートリッジの調製－ハイブリダイゼーション試薬
３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．１８％ｗ／ｖのセトリミド、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、０．７２％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１）、および０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７）を含有するハイブリダイゼーション緩衝剤を調製した。トレハロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９４４９）をこの混合物中に溶解させ、終濃度を１０％ｗ／ｖとした。このハイブリダイゼーション緩衝剤－トレハロース混合物を８．３μＬ体積のビーズ中で凍結乾燥させた。２つの８．３ｕＬビーズを８つの試薬ウェルのそれぞれの中に入れた（カートリッジ上の位置について、図３７を参照されたい）。
ＡＳＴカートリッジの調製－磁気粒子
Preparation of AST Cartridge-Hybridation Reagent 3X SSC (0.45M NaCl, 0.045M Sodium Citrate, pH 7.5) (Sigma, Catalog No. S6639), 0.18% w / v cetrimid, 0.77 A hybridization buffer containing% CHASPO (Sigma Catalog No. C3649), 0.72% SB3-12 (Sigma Catalog No. D0431), and 0.13 M guanidine thiocyanate (Sigma, Catalog No. G9277) was prepared. .. Trehalose (Sigma, Catalog No. T9449) was dissolved in this mixture to a final concentration of 10% w / v. The hybridization buffer-trehalose mixture was lyophilized in 8.3 μL volumes of beads. Two 8.3 uL beads were placed in each of the eight reagent wells (see Figure 37 for position on the cartridge).
Preparation of AST cartridges-magnetic particles
ポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を５０ｍＭのＥｐｐｓ緩衝剤、ｐＨ８．２中に１：２０で希釈し、１０％ｗ／ｖのトレハロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９４４９）の終濃度を含む１ｍＬ当たり２．７５×１０１４個の粒子の濃度とした。これを希釈するために、緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。次いで、混合物を１０μＬ体積のビーズ（反応ごとに２．６４×１０１２個の粒子）中で凍結乾燥させた。１つの磁気粒子を凍結乾燥させたビーズを２つのハイブリダイゼーションミックスビーズと一緒に８個の試薬ウェルのそれぞれの中に入れた。
試料をカートリッジ中に入れるための手順－尿の処理
Magnetic particles conjugated with polyaspartic acid (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) were diluted 1:20 in 50 mM Epps buffer, pH 8.2 and 10% w / v trehalose (Sigma, catalog number). The concentration was 2.75 × 10 14 particles per mL, including the final concentration of T9449). To dilute this, fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. The mixture was then lyophilized in 10 μL volumes of beads (2.64 × 10 12 particles per reaction). Beads lyophilized from one magnetic particle were placed in each of the eight reagent wells together with two hybridization mixed beads.
Procedure for placing the sample in the cartridge-treatment of urine
試験の前に、尿防腐剤および他の妨害する可能性のある化合物をサイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。各臨床的に陽性の尿試料２．５ｍＬを事前に洗浄したＺｅｂａ（商標）７Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８９３）に適用し、製造業者の使用説明書に従って遠心分離した。処理後の細菌損失を調査するために、上記のようにこの処理した試料に関して尿培養を繰り返した。
試料をカートリッジ中に入れるための手順－試料をカートリッジ上に置く
Prior to testing, urinary preservatives and other potentially disturbing compounds were removed using size exclusion chromatography. 2.5 mL of each clinically positive urine sample was applied to a pre-washed Zeba ™ 7K MWCO spin column (Thermo Fisher, Catalog No. 89893) and centrifuged according to the manufacturer's instructions. Urine cultures were repeated for this treated sample as described above to investigate bacterial loss after treatment.
Procedure for placing the sample in the cartridge-put the sample on the cartridge
各処理済尿試料７５０μＬを水１７０５μＬおよび種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチド蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プローブ４５μＬおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブと合わせて、３０％ｖ／ｖの終濃度の尿を含有する溶液を作製した。各細菌に対して使用したオリゴヌクレオチド、それらの濃度および色素標識は図３９に見出すことができる。混合物１ｍＬをカートリッジの試料ポットに添加し、カートリッジを分析器上に置いた。
自動分析器上でのＡＳＴカートリッジの実行
A solution containing 750 μL of each treated urine sample combined with 1705 μL of water and 45 μL of species-specific DNA oligonucleotide fluorescence in situ hybridization (FISH) probe and an unlabeled DNA helper probe to contain a final concentration of 30% v / v of urine. Was produced. The oligonucleotides used for each bacterium, their concentrations and dye labels can be found in FIG. 1 mL of the mixture was added to the sample pot of the cartridge and the cartridge was placed on the analyzer.
Running AST cartridges on an automated analyzer
次いで、カートリッジを機器上に置いた後、データ分析以外の全てのその後の作動は自動で行われた。尿／水／ＦＩＳＨプローブ混合物（試料）は、最初に、真空下で、カートリッジ上部の８つの成長ウェル中に向けられた。次いで、最初の２つの成長ウェル中の試料を反応ウェルにすぐに再度位置付け、ハイブリダイゼーション緩衝剤／ＦＩＳＨプローブミックスおよび凍結乾燥させた磁気粒子を再水和させた。次いで、試料は、脱水した「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）、コンベクションオーブン中で６０℃で３時間乾燥させた）４６μＬを含有するイメージングウインドウに続き、分析器上で３５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後に、次いで、カートリッジを磁石ステーションに再配置させ、強力な永久磁石（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）の上に４分間置いて、標識された磁気粒子と相互作用する細菌細胞をイメージング表面の近傍に移動させた。最後に、カートリッジをイメージングステーションまで動かし、以下に記載した非拡大ＣＣＤイメージャーを使用してイメージングを撮影した。 Then, after placing the cartridge on the instrument, all subsequent operations except data analysis were performed automatically. The urine / water / FISH probe mixture (sample) was first directed under vacuum into the eight growth wells at the top of the cartridge. The samples in the first two growth wells were then immediately repositioned in the reaction wells and the hybridization buffer / FISH probe mix and lyophilized magnetic particles were rehydrated. The sample was then dehydrated "dye cushion" (50 mM TRIS pH 7.5 (Teknova, Catalog T5075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma, Catalog D1556), 5 mg / mL Direct Black-19 ( Orient, Catalog No. 3222), dried in a convection oven at 60 ° C. for 3 hours) followed by an imaging window containing 46 μL) followed by incubation at 35 ° C. for 30 minutes on the analyzer. After this incubation, the cartridge is then relocated to a magnet station and placed on a strong permanent magnet (Dexter magnetic techniques, Catalog 54170260) for 4 minutes to image bacterial cells interacting with the labeled magnetic particles on the imaging surface. Moved to the vicinity. Finally, the cartridge was moved to the imaging station and the imaging was taken using the non-magnifying CCD imager described below.
残りの６つの成長ウェル中の試料をその場所に保ち、細菌を、抗生物質の存在下または非存在下で、再水和した培地中で３５℃で４時間成長させた。成長後に、細胞懸濁液を、時間０のアッセイについて行ったように、試薬ウェルに再度位置付け、正確に同じハイブリダイゼーション反応、磁気プルダウン、およびイメージングを上記のように実施した。
分析器のイメージングシステムおよびイメージングプロセス
Samples in the remaining 6 growth wells were kept in place and the bacteria were grown at 35 ° C. for 4 hours in rehydrated medium in the presence or absence of antibiotics. After growth, the cell suspension was repositioned in the reagent wells as was done for the
Analyzer imaging system and imaging process
ＭｕｌｔｉＰａｔｈ Ａｎａｌｙｚｅｒイメージングシステムは、完全に自動化された試験の一部として、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、カスタム設計された精度の高い３軸位置決めシステムを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この分析器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｅｌｌ全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 The MultiPath Analyzer Imaging System is a custom built-in device and software that can automatically capture image data from selected wells of MultiPath Cartridge as part of a fully automated test. It uses a custom designed, highly accurate 3-axis positioning system to position each well relative to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The analyzer can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire Cartridge Imaging Well. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames is captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
データ分析：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度との両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の両濃度を含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各尿試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率とＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察とを比較して、閾値を、ブロス微量希釈の結果との一致を最大化する成長倍率カットオフのために選択した。細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）条件では成長倍率が多くなり、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）条件では成長倍率の数が少なくなる。これらのカートリッジでは、両濃度の抗生物質がそれらの成長倍率の数に基づいて成長を示さなければ、その尿試料中の細菌は感受性と呼ばれる。低い方の濃度では成長が存在するが、高い方の濃度では成長が存在しない場合、その尿試料中の細菌は、シプロフロキサシン、ニトロフラントインおよびトリメトプリム／スルファメトキサゾールの場合には中間であり、セファゾリンの場合には耐性である。両濃度の抗生物質がそれらの成長倍率閾値に基づいて成長を示す場合、その尿試料中の細菌は耐性と呼ばれる。全ての感受性／耐性コールデータを、ＣＬＳＩ対応の標準的ＢＭＤにおけるＭＩＣ決定によって作製された感受性／耐性コールと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。 Data analysis: Using images captured by a CCD camera, the detected cells were estimated by an algorithm that considers both the number of objects in the field of view and the intensity of those objects. Cell counts based on this detection algorithm were obtained at 0 hours, and 4 hours without antibiotics and 4 hours with both concentrations of each antibiotic. For each urine sample for each drug concentration, the growth factor was calculated as a signal in the well containing the antibiotic after growth (time 4) to the signal in the urine sample before growth (time 0). The threshold was selected for the growth factor cutoff to maximize concordance with the result of the broth microdilution by comparing the growth factor with the observation of growth in the corresponding well in the CLSI-compatible broth microdilution. Growth is increased in conditions where cells are growing in the presence of antibiotics (and thus resistant to that concentration), and growth is in conditions where cells are in the process of dying (and thus sensitive to that concentration). The number of magnifications is reduced. In these cartridges, if both concentrations of antibiotics do not show growth based on the number of their growth rates, the bacteria in the urine sample are called susceptibility. If growth is present at lower concentrations but not at higher concentrations, the bacteria in the urine sample are ciprofloxacin, nitrofurantoin and trimethoprim / sulfamethoxazole. It is intermediate and resistant in the case of cefazolin. Bacteria in the urine sample are called resistant when both concentrations of antibiotic show growth based on their growth factor threshold. All susceptibility / tolerance call data were compared to susceptibility / tolerance calls made by MIC determination in a standard CLSI-compatible BMD. Growth for 4 hours in the absence of antibiotics is a control condition to confirm the presence of viable bacteria in the treated urine sample.
結果。図４０は、Ｅ．ｃｏｌｉ株を含有した臨床尿試料ＢＩＵＲ００６７を含有する２つのカートリッジ中の４つの複製の平均成長倍率を示す。このグラフは、２つの異なるカートリッジ中の４つの複製にわたるシプロフロキサシンとニトロフラントインとのそれぞれの２つの濃度のそれぞれにおける平均成長倍率を示す。両抗生物質に対する成長倍率値２を使用して、ＭｕｌｉｔＰａｔｈアッセイは、両シプロフロキサシン（ＣＩＰ）濃度を成長とコールし、両ニトロフラントイン（ＮＩＴ）濃度を成長なしとコールする。したがって、ＭｕｌｉｔＰａｔｈによって、ＢＩＵＲ００６７はシプロフロキサシンに対して耐性であり、ニトロフラントインに対して感受性である。この尿から単離され、ＣＬＳＩ－標準的ブロス微量希釈で試験されたＥ．ｃｏｌｉ株は、これらの感受性／耐性コールと一致した。 result. FIG. 40 shows E.I. The average growth rate of 4 replicas in 2 cartridges containing the clinical urine sample BIUR0067 containing the coli strain is shown. This graph shows the average growth rate at each of the two concentrations of ciprofloxacin and nitrofurantoin over four replications in two different cartridges. Using a growth factor of 2 for both antibiotics, the MultiPath assay calls both ciprofloxacin (CIP) concentrations growth and both nitrofurantoin (NIT) concentrations no growth. Therefore, by MultiPath, BIUR0067 is resistant to ciprofloxacin and sensitive to nitrofurantoin. E. coli isolated from this urine and tested with CLSI-standard broth microdilution. The coli strain was consistent with these susceptible / resistant calls.
図４１は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅ株を含有した臨床尿試料ＢＩＵＲ００８４を含有する２つのカートリッジ中の４つの複製の平均成長倍率を示す。このグラフは、２つの異なるカートリッジ中の４つの複製にわたるセファゾリンとトリメトプリム／スルファメトキサゾールとのそれぞれの２つの濃度のそれぞれにおける平均成長倍率を示す。両抗生物質に対する成長倍率値２を使用して、ＭｕｌｉｔＰａｔｈアッセイは、セファゾリンとトリメトプリム／スルファメトキサゾールとの両抗生物質の濃度の全てを成長とコールする。したがって、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのこの株は、両抗生物質に対して耐性である。これは、社内でなされた両方のＣＬＳＩ－標準的ブロス微量希釈と一致する。 FIG. 41 shows K.K. The average growth rate of 4 replicas in 2 cartridges containing the clinical urine sample BIUR0084 containing the pneumonaie strain is shown. This graph shows the average growth rate at each of the two concentrations of cefazolin and trimethoprim / sulfamethoxazole over four replications in two different cartridges. Using a growth factor of 2 for both antibiotics, the MultiPath assay calls all concentrations of both antibiotics, cefazolin and trimethoprim / sulfamethoxazole, growth. Therefore, K.K. This strain of pneumoniae is resistant to both antibiotics. This is consistent with both CLSI-standard broth microdilutions made in-house.
結論。この実施例は、尿中にＥ．ｃｏｌｉを有する入院患者からの臨床検体において直接的に、迅速かつ自動化された抗微生物薬感受性試験のための本発明の自動化システム、デバイス、および方法を使用する結果を示す。本発明は、ちょうど４時間で、ゴールドスタンダードであるＣＬＳＩブロス微量希釈（ＢＭＤ）方法と比較して正確な性能を実現した。 Conclusion. In this example, E. coli in urine. The results of using the automated systems, devices, and methods of the invention for direct, rapid and automated antimicrobial susceptibility testing in clinical specimens from inpatients with coli are shown. The present invention has achieved accurate performance in just 4 hours compared to the gold standard CLSI broth microdilution (BMD) method.
バリエーション。この実施例は、カートリッジに関するこの新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）、尿の濃度および尿の処理手順ならびに反応物および抗微生物薬の安定化に対する変更、異なる細菌標的、異なる抗微生物剤などを使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体に明らかに拡張され得る。 variation. This embodiment is an illustration of the performance of this novel AST method for cartridges and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, constituents). Concentrations), urine concentrations and urine treatment procedures and modifications to the stabilization of reactants and antimicrobial agents, making it easy to allow many variations including the use of different bacterial targets, different antimicrobial agents, etc. You will understand. This methodology can also be clearly extended to other biological specimens as well as other bacterial and non-bacterial pathogens.
（実施例９）
尿検体における直接的な迅速ＡＳＴ法は、病原体濃度の変動に頑強である
(Example 9)
Direct rapid AST method in urine specimens is robust to fluctuations in pathogen concentration
概要。可変的な接種濃度に対する頑強性は、検体に直接由来する検体を試験する際に、標的細胞の濃度が知られていないため、迅速ＡＳＴ方法にとって重要である。この実施例は、人為的検体に対して、広範囲の標的細胞濃度を網羅する場合に、尿検体から直接的に正確かつ一致する結果をもたらす本発明の使用を実証する。この実施例は、１０％の尿の存在下でのＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ７００６０３およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ－００４３の可変的な細胞入力によって、ＡＳＴに対するゴールドスタンダードであるブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較して正確なＡＳＴの結果が実現されることを実証する。
実験手順。
Overview. Robustness to variable inoculation concentrations is important for rapid AST methods because the concentration of target cells is not known when testing specimens that are directly derived from the specimen. This example demonstrates the use of the invention for anthropogenic specimens, which yields accurate and consistent results directly from urine specimens when covering a wide range of target cell concentrations. In this example, E. coli in the presence of 10% urine. colli BAA-2469, P.I. aeruginosa ATCC 27853, K. et al. pneumoniae ATCC 700603 and K. et al. We demonstrate that the variable cell input of pneumoniae CDC-0043 achieves accurate AST results compared to the gold standard for AST, broth microdilution (BMD).
Experimental procedure.
抗生物質プレートの調製：２倍連続希釈系列で３から５つの抗生物質のいずれかの濃度を含有する抗生物質プレートを、所望の終濃度よりも１０倍高い濃度の１０μＬを９６ウェルプレートのウェル中に分配することによって調製した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、試験した細菌株に対するＣＬＳＩにより報告されたＭＩＣをまたいだ。以下の抗生物質の全てまたはサブセットを用いてプレートを調製した：セファゾリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾール。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、４つのウェルは、陽性（抗生物質の非存在下での細菌成長）および陰性（細菌細胞なし）の対照を可能とするための水を含有した。 Preparation of antibiotic plate: An antibiotic plate containing a concentration of any of 3 to 5 antibiotics in a 2-fold serial dilution series, 10 μL at a concentration 10-fold higher than the desired final concentration, in the wells of the 96-well plate. Prepared by distributing to. The concentration selected to test each antibiotic spanned the MICs reported by CLSI for the bacterial strains tested. Plates were prepared with all or a subset of the following antibiotics: cefazolin, ciprofloxacin, levofloxacin, nitrofurantoin, and trimethoprim-sulfamethoxazole. In addition to the wells containing the antimicrobial dilution series, the four wells contained water to allow positive (bacterial growth in the absence of antibiotics) and negative (no bacterial cells) controls.
培養物の調製：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ ７００６０３、およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ－００４３に関する細菌培養物は、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）に新鮮なトリプシンダイズ寒天プレート（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）からの３から５個のコロニーを接種し、３５℃で１．５から３時間成長させて対数期成長を達成することによって得られた。これらの細胞を、様々な接種（２×１０３ＣＦＵ／ｍＬ～１×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）に対して、１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中で希釈した。より正確な細胞濃度のために、これらの推定された細菌入力を、コロニー計数を使用して調整した。プレート計数は、対数期培養物をＭＨＢＩＩ中で約５００ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、ＴＳＡプレート上に１００μＬをプレーティングし、３５℃で１６から２４時間の成長後にコロニーを計数することによって決定した。平均プレート計数を使用して、試験した各濃度で存在する実際のＣＦＵを計算した。 Culture preparation: E. colli BAA-2469, P.I. aeruginosa ATCC 27853, K. et al. Pneumoniae ATCC 700603, and K. pneumoniae ATCC 700603. Bacterial cultures for pneumoniae CDC-0043 are inoculated into Trypticase Soy Broth (TSB, Hardy Diagnostics Catalog U65) with 3 to 5 colonies from a fresh trypticase soybean agar plate (TSA, BD Catalog 211185) at 35 ° C. It was obtained by growing for 1.5 to 3 hours to achieve logarithmic growth. These cells were diluted in Mueller-Hinton broth (MHBII, Teknova Catalog M5860) prepared with 1 x cations for various inoculations (2 x 10 3 CFU / mL to 1 x 10 7 CFU / mL). .. These estimated bacterial inputs were adjusted using colony counting for more accurate cell concentrations. Plate counting was determined by diluting log-phase cultures in MHBII to approximately 500 CFU / mL, plating 100 μL on TSA plates, and counting colonies after growth at 35 ° C. for 16 to 24 hours. The average plate count was used to calculate the actual CFU present at each concentration tested.
磁気粒子の調製：２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
Preparation of Magnetic Particles: Silica magnetic particles coated with 2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride (SiMag-Q, Chemicell, Catalog 1206-5) in 50 mM EPPS buffer, pH 8.2 x 2.75 x per mL. 10 To 12 particles were diluted 1:20. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. Separate magnetic particle suspensions were prepared for the
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前のアッセイシグナル（時間０またはＴ０）を各生物および接種について決定した。各試料１０μＬをハイブリダイゼーション緩衝剤８０μＬに添加し、３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、１％のＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３０２３）、１％のＮＯＧ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号０８００１）、１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）、種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブの終濃度とした。使用したオリゴヌクレオチドプローブを表Ｂに示す。プールした尿（社内で採取し濾過した）１０μＬを混合物に直接添加することによって、終濃度１０％の尿を得た。次いで、上記のように調製した磁気粒子混合物１０μＬを添加した。この反応混合物１００μＬを１ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）（乾燥－クッションプレート）を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
Bacterial cell labeling at AST time 0: Assay signals (
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 Imaging of Labeled Cells: The MultiPath ™ laboratory imaging system is a custom built-in device and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well with respect to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The device can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire well of the microtiter plate. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames is captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
４時間の成長：時間０での細胞の定量化がなされている間に、各生物接種材料１０μＬ、プールした尿１０μＬ、および１Ｘ ＭＨＢＩＩ ７０μＬを抗生物質プレート（既に抗生物質１０μＬを含有する）の適切なウェルに添加した。標準的エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間、試料を成長させた。
4 Hours Growth: Appropriate for each
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートのうちの１０μＬ（１０％）をマイクロタイタープレートに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、１００μＬのハイブリダイゼーション緩衝剤、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
Bacterial cell labeling in
比較方法：本明細書に記載の新規ＡＳＴ方法を使用する結果を、ＣＬＳＩ Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。 Comparative Method: Results using the novel AST method described herein were compared to broth microdilution (BMD) performed according to CLSI M07-Ed13E 2018.
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度との両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の全ての濃度を含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各試料接種について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
結果。
Data analysis and creation of thresholds: Images captured by a CCD camera were used to estimate the detected cells by an algorithm that considers both the number of objects in the field and the intensity of those objects. Cell counts based on this detection algorithm were obtained at
result.
図４２から図４５は、この方法が、ゴールドスタンダードであるブロス微量希釈方法と一致する一方で、接種レベルの変化に対してどのように頑強であるかを示す。図４２は、新規ＡＳＴ方法により得られた結果を、試験した全ての薬物に対して単一の濃度で実施した標準的ＢＭＤの結果と比較する。３行目は、新規ＡＳＴ方法およびゴールドスタンダードであるＢＭＤによって得られたＭＩＣを比較した。全てのＭＩＣコールは、ＣＬＳＩに対応するＢＭＤの１回の２倍希釈（本質的一致）内にあった。４行目は、ＭＩＣに基づくカテゴリーの抗生物質感受性の結果（Ｓ＝感受性、Ｉ＝中間、Ｒ＝耐性）を比較した（カテゴリー一致）。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａのサブセットの濃度は、ブロス微量希釈においてＭＩＣと異なるカテゴリーコールを与えるが、これらの全ては、標準的ＡＳＴ方法論によって軽度のエラーとして分類されるに過ぎなかった。図４４は、標準的ブロス微量希釈方法（２４時間のＢＭＤ、破線）と比較したＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９に対する全ての接種レベルに関して上記した新規４時間の方法により得られたＭＩＣ（塗りつぶしの丸）を示す。この新規方法により決定した全てのＭＩＣは本質的一致内にあった（影付きの領域）。図４５は、図４３に関する生データを示す。 42-45 show how this method is consistent with the gold standard broth microdilution method, while being robust to changes in inoculation levels. FIG. 42 compares the results obtained by the novel AST method with the results of standard BMD performed at a single concentration for all drugs tested. The third line compared the MICs obtained by the novel AST method and the gold standard BMD. All MIC calls were within a single 2-fold dilution (essential match) of the BMD corresponding to the CLSI. The fourth line compared the results of antibiotic susceptibility in the MIC-based category (S = susceptibility, I = intermediate, R = resistance) (category match). Concentrations of a subset of Klebsiella give different category calls than MICs in broth microdilution, but all of these were only classified as mild errors by standard AST methodologies. FIG. 44 shows E. coli compared to a standard broth microdilution method (24 hour BMD, dashed line). The MICs (filled circles) obtained by the novel 4-hour method described above for all inoculation levels for colli BAA-2469 are shown. All MICs determined by this new method were within an essential match (shaded area). FIG. 45 shows raw data for FIG. 43.
結論。本明細書で提示された迅速な４時間のＡＳＴ方法は、広範囲の標的細胞濃度に対して初期細胞濃度に対して頑強である。可変的な接種濃度に対する頑強性は、検体に直接由来する検体を試験する際に、標的細胞の濃度が知られていないため、迅速ＡＳＴ方法にとって重要である。 Conclusion. The rapid 4-hour AST method presented herein is robust against initial cell concentrations for a wide range of target cell concentrations. Robustness to variable inoculation concentrations is important for rapid AST methods because the concentration of target cells is not known when testing specimens that are directly derived from the specimen.
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体ならびに特異的プローブが設計され得る他の細菌および非細菌病原体に、ならびに他の抗微生物剤または化学薬剤に対して、明らかに拡張され得る。 variation. This embodiment is an illustration of the performance of this novel AST method and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, constituents). It will be easily understood that many variations are possible, including the use of concentration), urine concentration and urine processing procedures. This methodology can also be clearly extended to other biological specimens as well as other bacterial and non-bacterial pathogens for which specific probes can be designed, as well as to other antimicrobial or chemical agents.
（実施例１０）
細胞精製なしでの複数の細菌種を含有する尿臨床検体中の標的病原体のための迅速抗微生物薬感受性試験
(Example 10)
Rapid antimicrobial susceptibility testing for target pathogens in urinary clinical specimens containing multiple bacterial species without cell purification
概要。抗微生物薬感受性試験に関する現在の方法には、他の微生物を含まない標的病原体細胞の純粋な集団を確保するために長時間に及ぶ培養ベースのコロニー精製が必要とされる。通常の方法であるコロニー精製は、結果を実現するために２～５日を要する。その間、患者は、感染を引き起こす病原体を死滅させるのに最適でない場合があり、さらに完全に無効である可能性のある強力な広域スペクトルの抗生物質により経験的に処置される。加えて、広域スペクトルの抗生物質による経験的処置によって、抗生物質耐性の広がりがもたらされる。 Overview. Current methods for antimicrobial susceptibility testing require lengthy culture-based colony purification to ensure a pure population of target pathogen cells free of other microorganisms. Colony purification, which is the usual method, takes 2-5 days to achieve the results. In the meantime, patients are empirically treated with a powerful broad spectrum antibiotic that may not be optimal for killing the pathogen that causes the infection and may be completely ineffective. In addition, empirical treatment with broad-spectrum antibiotics results in widespread antibiotic resistance.
現在の方法は、これらの方法が、濁度の増加などの非特異的検出方法を使用するため、どの抗微生物剤が微生物学的培地中の標的病原体の成長を阻害するかを決定するために、長時間に及ぶ細胞精製プロセスを必要とする。細胞複製物の非特異的測定を使用する場合、仮に標的病原体の細胞のみが含有されるならば、見られる成長は標的病原体によるものであることを知ることができるに過ぎない。ほとんどの医療用検体は滅菌されていないため、現在の抗微生物薬感受性試験方法では細胞の精製が行われなければならない。検体は、一般的に、ヒトの体で生息する良性の通常の細菌集団であるヒトマイクロバイオームを構成する微生物を含有する。 Current methods use non-specific detection methods, such as increased turbidity, to determine which antimicrobial agent inhibits the growth of target pathogens in microbiological media. Requires a lengthy cell purification process. When using non-specific measurements of cell replication, it is only possible to know that the growth seen is due to the target pathogen, if only the cells of the target pathogen are contained. Since most medical specimens are not sterilized, cell purification must be performed with current antimicrobial susceptibility test methods. Specimens generally contain microorganisms that make up the human microbiome, a benign normal bacterial population that lives in the human body.
対照的に、本発明の方法は、コロニー精製ステップを用いずに、検体から直接的に正確な抗微生物薬感受性試験結果を実現することができる。この方法は、抗微生物剤を含有する微生物学的培地中で標的病原体に特異的な成長を評価するという点で、現在の方法と異なる。 In contrast, the methods of the invention can achieve accurate antimicrobial susceptibility test results directly from specimens without the use of colony purification steps. This method differs from current methods in that it assesses target pathogen-specific growth in microbiological media containing antimicrobial agents.
この実施例は、迅速な抗微生物薬感受性試験方法によって、１５個の異なる培養陰性尿試料に関する尿マトリックス（１０％）を含む人為的試料中で、Ｅ．ｃｏｌｉ株に関する最少阻止濃度（ＭＩＣ）が正確に決定されることを実証する。ここで、本発明者らは、新たな方法を使用する抗微生物薬感受性試験結果が正確であり、高濃度の他の微生物種を含有する尿試料中のオフターゲット細菌によって有意に影響を受けないことを示す。
実験手順。
This example was performed in an artificial sample containing a urine matrix (10%) for 15 different culture-negative urine samples by a rapid antimicrobial susceptibility test method. Demonstrate that the minimum inhibitory concentration (MIC) for the coli strain is accurately determined. Here, we find that the antimicrobial susceptibility test results using the new method are accurate and are not significantly affected by off-target bacteria in urine samples containing high concentrations of other microbial species. Show that.
Experimental procedure.
抗生物質プレートの調製：実験手順を開始する前に、２倍連続希釈系列で５つの濃度を含有するプレートを、所望の濃度よりも１０倍高い濃度の１０μＬを分配することによって調製した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗生物質に関してＣＬＳＩにより報告されたブレイクポイントをまたいだ。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水を含有する４つのウェルが、陽性および陰性の対照を可能とするためにプレート中に含まれた。 Preparation of antibiotic plates: Before starting the experimental procedure, plates containing 5 concentrations in a 2-fold serial dilution series were prepared by dispensing 10 μL at a concentration 10-fold higher than the desired concentration. The concentration selected to test each antibiotic is E. coli. Crossed the breakpoints reported by CLSI regarding antibiotics against coli. In addition to the wells containing the antimicrobial dilution series, four wells containing water were included in the plate to allow positive and negative controls.
培養物の調製：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９、ならびに８つの他のオフターゲット種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＡＴＣＣ ４３８６４、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １９６０６、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＴＣＣ １２２２８、Ｍ． ｌｕｔｅｕｓ（環境分離株）、Ｃ．ｍｉｎｕｔｉｓｓｍｕｍ ＡＴＣＣ ２３３４８－ＢＡＡ ９４９、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ００４３、およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ０１４１）のうちの３から５個のコロニーを、５ｍＬのＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）中にそれぞれ別々に接種し、３５℃で１～２時間、振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に希釈した。Ｅ．ｃｏｌｉをおよそ５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（最終アッセイ濃度は５×１０５ＣＦＵ／ｍである）まで希釈し、一方、他のオフターゲット種は様々な接種のために希釈した（１×１０５から５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの範囲に及ぶ）。
Culture preparation: E. cori BAA-2469, as well as eight other off-target species (S. aureus ATCC 25923, C. fluendii ATCC 43864, A. baumannii ATCC 19606, S. epidermidis ATCC 12228, M. luteus (environmental isolate), Cmin. 3 to 5 colonies of ATCC 23348-BAA 949,
磁気粒子の調製：２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
Preparation of Magnetic Particles: Silica magnetic particles coated with 2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride (SiMag-Q, Chemicell, Catalog 1206-5) in 50 mM EPPS buffer, pH 8.2 x 2.75 x per mL. 10 To 12 particles were diluted 1:20. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. Separate magnetic particle suspensions were prepared for the
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前（時間０またはＴ０）のアッセイシグナルをＥ．ｃｏｌｉの各種について決定した。各試料１０μＬをハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、１％のＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３０２３）、１％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号０８００１）、１Ｘ カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）、Ｅ．ｃｏｌｉ－特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブ）８０μＬに添加した。プローブ配列を図５１の表に示す。プールした尿（社内で採取し濾過した）１０μＬを混合物に直接添加することによって、終濃度９．１％の尿を得た。上記のように調製した磁気粒子混合物１０μＬをこの混合物に直接添加した。ここで、ハイブリダイゼーション混合物、尿、および磁気粒子を含有する試料１００μＬを１ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
Bacterial cell labeling at AST time 0: Assay signals prior to the initiation of bacterial growth (
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 Imaging of Labeled Cells: The MultiPath ™ laboratory imaging system is a custom built-in device and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well with respect to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The device can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire well of the microtiter plate. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames is captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
４時間の成長：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ ２４６９を３つの抗微生物剤：シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、レボフロキサシン（ＬＶＸ）、およびニトロフラントイン（ＮＩＴ）に対するそれらの感受性について試験した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ ２４６９を５つの抗微生物剤：セファゾリン（ＣＦＺ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、レボフロキサシン（ＬＶＸ）、ニトロフラントイン（ＮＩＴ）、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾール（ＴＭＰ／ＳＸＴ）に対して試験した。これらの抗微生物剤を含有する抗生物質プレートを、上記方法に従って調製した。時間０での細胞の定量化がなされている間に、いずれかのＥ．ｃｏｌｉ種（５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ）１０μＬ、オフターゲット種（１×１０５から５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）１０μＬ、プールした尿１０μＬ、およびＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０）６０μＬを、抗生物質１０μＬを既に含有する抗生物質プレートの各ウェルに添加した。試料を静置型エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間成長させた。
Growth for 4 hours: Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Corynebacterium luminitissimum, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, in the presence of Citrobacter.
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートのうちの１０μＬ（１０％）を乾燥させた「色素クッション」を含有するマイクロタイタープレートに移し、時間０のアッセイに関して上記したように、ハイブリダイゼーション緩衝剤、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子の混合物１００μＬと合わせた。
Bacterial cell labeling in
比較方法：本明細書に記載の新規アッセイ方法に関する結果を、Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。 Comparative Methods: The results for the novel assay method described herein were compared to broth microdilution (BMD) performed according to M07-Ed13E 2018.
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の全ての濃度含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各細菌試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。
結果。
Data analysis and threshold creation: Images captured by a CCD camera were used to estimate the detected cells by an algorithm that considers both the number of objects in the field and the intensity of those objects. Cell counts based on this detection algorithm were obtained at 0 hours, and 4 hours without antibiotics and 4 hours with all concentrations of each antibiotic. For each bacterial sample for each drug concentration, the growth factor was calculated as a signal in the well containing the antibiotic after growth (time 4) to the signal in the urine sample before growth (time 0). Using a logistic regression model, using growth factor and observation of growth in the corresponding wells at CLSI-compatible broth microdilution, cells are growing in the presence of antibiotics (and thus resistant at that concentration). We have created a threshold to determine a growth factor cutoff that exceeds (there is) and is lower than those in the process of cell death (and thus sensitive at that concentration). The point where the number of growth ratios is below the determined threshold is the MIC value produced by this assay. Correspondingly, the results were assigned to categories of susceptibility, intermediate, or resistance to each antibiotic.
result.
示されたデータは、上記４時間のＡＳＴ方法が滅菌されていない試料に対して頑強である一方、余分な細菌が存在するＣＬＳＩ ＢＭＤ方法が頑強でないことを実証する。図４６は、ニトロフラントインの存在下で、最大１００倍過剰な漸増濃度のＳ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９に関するデータを示す。ＣＬＳＩ様ブロス微量希釈方法におけるＥ．ｃｏｌｉのＭＩＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の添加によって影響を受け（図ではＸとマークした）、ここで、ＭＩＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの非存在下での８から１００倍過剰のＳ．ａｕｒｅｕｓでの３２まで増加する。対照的に、本発明において記載した新規４時間のＡＳＴアッセイ（ＭｕｌｔｉＰａｔｈ、丸）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞の量にかかわらず、同じＭＩＣ（８）（破線）を有した。 The data shown demonstrate that the 4-hour AST method is robust to unsterilized samples, while the CLSI BMD method with extra bacteria is not robust. FIG. 46 shows S. cerevisiae with an excess concentration of up to 100-fold in the presence of nitrofurantoin. E. with aureus ATCC 25923. The data about colli BAA-2469 is shown. E. in the CLSI-like broth microdilution method. The MIC of colli is S.I. Affected by the addition of the aureus strain (marked as X in the figure), where the MIC is S. cerevisiae. 8 to 100 times excess of S. in the absence of aureus. Increases to 32 in aureus. In contrast, the novel 4-hour AST assay (MultiPath, circle) described in the present invention is described in S.I. It had the same MIC (8) (dashed line) regardless of the amount of aureus cells.
図４８から図５０は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９のみが存在するＣＬＳＩブロス微量希釈と比較した、この新規方法（ＭｕｌｔｉＰａｔｈ）を使用して決定した生のＭＩＣ値を示す。図４７の表は、漸増するオフターゲット細菌の存在下でのＥ．ｃｏｌｉの全体的な本質的一致を示す。単一の条件 －ニトロフラントインと１ｅ７のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ－ のみが本質的一致の欠如をもたらしたが、これは、全ての抗生物質および全てのオフターゲット細菌にわたって１００％の一致を有したカテゴリー感受性／中間／耐性の決定を変化させなかった。 48 to 50 show E.I. The raw MIC values determined using this novel method (MultiPath) compared to the CLSI broth microdilution in which only colli BAA-2469 is present are shown. The table in FIG. 47 shows E. coli in the presence of increasing off-target bacteria. Shows the overall essential agreement of colli. Only a single condition-nitrofurantoin and 1e7 Citrobacter freundii-caused a lack of intrinsic concordance, which was category susceptibility with 100% concordance across all antibiotics and all off-target bacteria. Did not change the intermediate / resistance determination.
結論。この実施例は、抗微生物薬感受性試験のために本発明を使用すると、他の種の他の微生物をさらに多数含有する試料においてさえも、標的病原体に関する正確な抗微生物薬感受性試験の結果を達成するために細胞精製が必要でないことを実証する。 Conclusion. This example uses the present invention for antimicrobial susceptibility testing to achieve accurate antimicrobial susceptibility testing results for target pathogens, even in samples containing even higher numbers of other microorganisms of other species. Demonstrate that no cell purification is required to do this.
バリエーション：この実施例は、この新規ＦＩＳＨ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、別の代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体に明らかに拡張され得る。 Variations: This embodiment is an illustration of the performance of this novel FISH method and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), different alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, composition). It will be easily understood that many variations are possible, including the concentration of components), the concentration of urine and the use of urine processing procedures. This methodology can also be clearly extended to other biological specimens as well as other bacterial and non-bacterial pathogens.
（実施例１１）
迅速抗微生物薬感受性試験は、ベータ－ラクタマーゼを発現する細菌の存在下でラクタム系抗生物質について正確である
(Example 11)
Rapid antimicrobial susceptibility testing is accurate for lactam antibiotics in the presence of beta-lactamase-expressing bacteria
概要。抗微生物薬感受性試験に関する現在の方法には、他の微生物を含まない標的病原体細胞の純粋な集団を確保するために長時間に及ぶ培養ベースのコロニー精製が必要とされる。通常の方法であるコロニー精製は、結果を実現するために２～５日を要する。その間、患者は、感染を引き起こす病原体を死滅させるのに最適でない場合があり、さらに完全に無効である可能性のある強力な広域スペクトルの抗生物質により経験的に処置される。加えて、広域スペクトルの抗生物質による経験的処置によって、抗生物質耐性の広がりがもたらされる。 Overview. Current methods for antimicrobial susceptibility testing require lengthy culture-based colony purification to ensure a pure population of target pathogen cells free of other microorganisms. Colony purification, which is the usual method, takes 2-5 days to achieve the results. In the meantime, patients are empirically treated with a powerful broad spectrum antibiotic that may not be optimal for killing the pathogen that causes the infection and may be completely ineffective. In addition, empirical treatment with broad-spectrum antibiotics results in widespread antibiotic resistance.
現在の方法が、これらの方法が、濁度の増加などの非特異的検出方法を使用するため、どの抗微生物剤が微生物学的培地中の標的病原体の成長を阻害するかを決定するために、長時間に及ぶ細胞精製プロセスを必要とする理由の１つである。細胞複製物の非特異的測定を使用する場合、仮に標的病原体の細胞のみが含有されるならば、見られる成長は標的病原体によるものであることを知ることができるに過ぎない。 Current methods, because these methods use non-specific detection methods such as increased turbidity, to determine which antimicrobial agent inhibits the growth of the target pathogen in the microbiological medium. This is one of the reasons why a long cell purification process is required. When using non-specific measurements of cell replication, it is only possible to know that the growth seen is due to the target pathogen, if only the cells of the target pathogen are contained.
対照的に、本発明の方法は、コロニー精製ステップを用いずに、検体から直接的に正確な抗微生物薬感受性試験結果を実現することができる。この方法は、抗微生物剤を含有する微生物学的培地中で標的病原体に特異的な成長を評価するという点で、現在の方法と異なる。本発明者らは、別の実施例において、本発明の方法が、オフターゲット種由来の多数の細胞の存在下で正確であることを実証する。 In contrast, the methods of the invention can achieve accurate antimicrobial susceptibility test results directly from specimens without the use of colony purification steps. This method differs from current methods in that it assesses target pathogen-specific growth in microbiological media containing antimicrobial agents. In another example, we demonstrate that the method of the invention is accurate in the presence of a large number of cells from off-target species.
この実施例では、本発明者らは、オフターゲット種の存在下での標的病原体に関する抗微生物薬感受性試験を実施することによって生じ得る別の課題に対処する。ここで、本発明者らは、本発明の方法が、試験される抗微生物剤を分解することが公知の酵素を作製する多数のオフターゲット種を含有する人為的尿検体中の標的病原体に関する正確な抗微生物薬感受性試験の結果を実現することを実証する。理論的には、このことは、抗微生物薬感受性試験の結果を変更するのに十分有意に抗微生物剤の濃度を変化させる可能性がある。 In this example, we address another challenge that can arise from conducting antimicrobial susceptibility testing on target pathogens in the presence of off-target species. Here, we present exactly the target pathogens in anthropogenic urinary specimens containing a large number of off-target species for which the methods of the invention produce enzymes known to degrade the antimicrobial agent being tested. Demonstrate the realization of the results of various antimicrobial susceptibility tests. Theoretically, this could change the concentration of antimicrobial agent significantly enough to alter the results of the antimicrobial susceptibility test.
この実施例では、本発明者らは、迅速な抗微生物薬感受性試験によって、このタイプの抗微生物剤を分解する酵素を生成する多数のオフターゲット病原体の存在下で、２つのカルバペネム抗生物質（メロペネムおよびイミペネム）に関する正確な抗微生物薬感受性試験の結果が達成されることを実証する。 In this example, we have two carbapenem antibiotics (Melopenem) in the presence of a number of off-target pathogens that produce enzymes that degrade this type of antimicrobial agent by rapid antimicrobial susceptibility testing. And imipenem) to demonstrate that accurate antimicrobial susceptibility test results are achieved.
実験手順。抗生物質プレートの調製：抗生物質プレートは、標的ＭＩＣへの滅菌されていない試料の影響の実施例において記載されたように調製した。 Experimental procedure. Preparation of Antibiotic Plates: Antibiotic plates were prepared as described in the Examples of Effects of Non-Sterile Samples on Target MICs.
培養物の調製：Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、ほとんどの抗生物質に対して感受性である細菌株およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ０１４１（多くの他の耐性遺伝子の中で、ベータ－ラクタマーゼＯＸＡ－１８１を発現する株）のうちの３から５個のコロニーを、Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）５ｍＬ中にそれぞれ別々に接種し、３５℃で１～２時間、振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に希釈した。Ｅ．ｃｏｌｉを５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ（ＣＬＳＩの標準的濃度）まで希釈し、一方、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは様々な接種のために希釈した（１×１０６から５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの範囲に及ぶ）。
Culture preparation:
磁気粒子の調製：２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり３．７５×１０６個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
Preparation of Magnetic Particles: Silica magnetic particles coated with 2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride (SiMag-Q, Chemicell, Catalog 1206-5) in 50 mM EPPS buffer, pH 8.2 x 3.75 x per mL. Up to 10 6 particles were diluted 1:20. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. Separate magnetic particle suspensions were prepared for the
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前の時間０（Ｔ０）におけるアッセイシグナルを各臨床尿検体について決定した。それぞれ処理済尿３０μＬを、種特異的Ａｌｅｘａ６４７Ｎで標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブを含有する１×カチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）７０μＬに添加した。使用したプローブ配列を図５４に示す。次いで、混合物１００μＬを、脱水したハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．１８％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、０．７２％のＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１）０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７））を含有するマイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、調製した磁気粒子混合物１０μＬをウェルに添加した。この反応混合物１００μＬを、ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ カタログＴ１０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ カタログＤ１５５６）、５０ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ １９（Ｏｒｉｅｎｔ カタログ１９１Ｌ））を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。 Bacterial cell labeling at AST time 0: Assay signals at time 0 (T0) prior to the initiation of bacterial growth in the presence or absence of antibiotics were determined for each clinical urine sample. 30 μL of each treated urine was added to 70 μL of Mueller-Hinton Broth (MHBII) prepared with 1 × cation containing a species-specific Alexa647N-labeled DNA oligonucleotide FISH probe and an unlabeled DNA helper probe. The probe sequence used is shown in FIG. Then, 100 μL of the mixture was added to dehydrated hybridization buffer (3X SSC (0.45 M NaCl, 0.045 M Na citrate) buffer (Sigma, catalog number S6639), 0.18% cetrimid (Sigma, catalog). No. H9151), 0.77% CHASPO (Sigma Catalog No. C3649), 0.72% SB3-12 (Sigma Catalog No. D0431) 0.13M guanidine thiocyanate (Sigma, Catalog No. G9277)). Added to the wells of the titer plate. Then 10 μL of the prepared magnetic particle mixture was added to the wells. 100 μL of this reaction mixture is 50 μL per well (pre-dried) “dye cushion” (50 mM TRIS pH 7.5 (Sigma Catalog T1075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma Catalog D1556), 50 mg. It was transferred to a microtiter plate containing / mL of Direct Black 19 (Orient Catalog 191L) and incubated at 35 ° C. for 30 minutes. After incubation, the microtiter plate is placed in a magnetic field (Dexter magnetic techniques, Catalog 54170260) for 4 minutes and the fraction containing magnetic particles, labeled cells is placed near the imaging surface at the bottom of the well via a "dye cushion". Moved to.
標識化細胞のイメージング ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 Imaging of Labeled Cells The imaging system of the MultiPath ™ laboratory is a custom built-in device and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well with respect to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The device can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire well of the microtiter plate. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames are captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
４時間の成長：変化するＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ－ＯＸＡ接種の存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉを２つの抗微生物剤：イミペネムおよびメロペネムに対する感受性について試験した。時間０での細胞の定量化がなされている間に、Ｅ．ｃｏｌｉ種（５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ）１０μＬ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（１×１０６から１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）１０μＬまたは培地（対照）１０ｕＬ、プールした尿１０μＬ、およびＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０）６０μＬを、抗生物質１０μＬを既に含有する抗生物質プレートの各ウェルに添加した。試料を静置型エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間成長させた。
4 hours growth: changing K. In the presence of pneumoniae-OXA inoculation, E. pneumoniae-OXA inoculation. col was tested for susceptibility to two antimicrobial agents: imipenem and meropenem. While cell quantification was done at
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートの各ウェルの１００μＬを脱水緩衝剤プレートの対応するウェルに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
Bacterial cell labeling in
比較方法：ＭｕｌｉｔＰａｔｈ（商標）アッセイに関する結果を、ＣＬＳＩの方法Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。 Comparative Method: Results for the MultiPath ™ assay were compared to broth microdilution (BMD) performed according to the CLSI method M07-Ed13E 2018.
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の６つの濃度全てを含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各尿試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
Data analysis and threshold creation: Images captured by a CCD camera were used to estimate the detected cells by an algorithm that considers both the number of objects in the field and the intensity of those objects. Cell counts based on this detection algorithm were obtained at
結果。図５２は、イミペネム抗生物質を分解するベータ－ラクタマーゼを生成することによってイミペネム抗生物質に耐性であるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅ株の漸増量の存在下での、イミペネムに対して感受性のＥ．ｃｏｌｉ株のＭＩＣを示す。本発明の新規な迅速ＡＳＴ方法をＢＭＤ方法と比較する。新規な４．５時間のＡＳＴ方法は、一貫して１μｇ／ｍＬイミペネム未満のＭＩＣを有するさらに高濃度のベータ－ラクタマーゼを生成するＫ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅの存在によって影響を受けない。対照的に、１６～２４時間の成長後のＢＭＤ方法は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎａｉｅのレベルの増加に伴う感受性Ｅ．ｃｏｌｉ株に関するＭＩＣの増加を示し、この抗生物質に対して耐性であると誤って決定されることになる。図５３は、ラクタム系抗生物質のメロペネムについての同様の結果を示す。 result. FIG. 52 shows K. imipenem antibiotic resistant by producing beta-lactamase that degrades imipenem antibiotics. In the presence of an increasing dose of the pneumonaie strain, E. ci. The MIC of the coli strain is shown. The novel rapid AST method of the present invention is compared with the BMD method. The novel 4.5 hour AST method consistently produces higher concentrations of beta-lactamase with a MIC of less than 1 μg / mL imipenem. Not affected by the presence of pneumonaie. In contrast, the BMD method after 16-24 hours of growth was described in K.I. Sensitivity with increasing levels of pneumonaie E. It shows an increase in MICs for the coli strain and will be erroneously determined to be resistant to this antibiotic. FIG. 53 shows similar results for the lactam antibiotic meropenem.
結論。本発明の新規の４．５時間のＡＳＴ方法は、抗生物質を分解するカルバペネマーゼ（ｃａｒｂａｐｅｍａｓｅ）酵素を発現する高濃度の耐性細菌の存在下においても、カルバペネム抗微生物剤に対して感受性の細菌の正確なＭＩＣ決定を示す。 Conclusion. The novel 4.5 hour AST method of the present invention is accurate for bacteria sensitive to carbapenem antimicrobial agents, even in the presence of high concentrations of resistant bacteria expressing the carbapenemase enzyme that degrades antibiotics. Shows a good MIC decision.
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度など）、尿の濃度および尿の処理手順を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、ラクタム感受性細菌とベータ－ラクタマーゼ発現細菌のさらなるペアリングに拡張され得る。 variation. This embodiment is an illustration of the performance of this novel AST method and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, constituents). It will be easy to see that many variations are possible, including the use of concentrations), urine concentrations and urine processing procedures. This methodology can also be extended to further pairing of lactam-sensitive and beta-lactamase-expressing bacteria.
（実施例１２）
培養に基づく細胞精製なしでの尿中の細菌の正確な迅速抗微生物薬感受性試験
(Example 12)
Accurate rapid antimicrobial susceptibility testing of bacteria in urine without culture-based cell purification
概要：抗微生物薬感受性試験のための現在の方法には、病原体細胞をまさに含まない検体自体の純粋な集団を確保するために長時間に及ぶ培養ベースのコロニー精製が必要とされる。結論として、どの抗生物質が感染を引き起こす病原体を死滅させるのに最適であるかを示す抗微生物薬感受性試験の結果を２～５日間利用できない。その間、患者は、感染を引き起こす病原体を死滅させるのに最適でない場合があり、さらに完全に無効である可能性のある強力な広域スペクトルの抗生物質により経験的に処置される。加えて、広域スペクトルの抗生物質による経験的処置によって、抗生物質耐性の広がりがもたらされる。 Summary: Current methods for antimicrobial susceptibility testing require lengthy culture-based colony purification to ensure a pure population of specimens themselves that are exactly free of pathogen cells. In conclusion, the results of antimicrobial susceptibility tests showing which antibiotics are optimal for killing the pathogen that causes the infection are not available for 2-5 days. In the meantime, patients are empirically treated with a powerful broad spectrum antibiotic that may not be optimal for killing the pathogen that causes the infection and may be completely ineffective. In addition, empirical treatment with broad-spectrum antibiotics results in widespread antibiotic resistance.
対照的に、本発明の方法は、長時間に及ぶコロニー精製ステップを用いずに検体から直接的に正確な抗微生物薬感受性試験の結果を実現することができる。ここで、本発明者らは、新たな抗微生物薬感受性試験の結果は、尿試料中の細菌がコロニー精製を用いずに試験される際に有意な影響を受けないことを示す。この実施例は、迅速な抗微生物薬感受性試験方法によって、１５個の異なる培養陰性尿試料に関する尿マトリックス（１０％）を含む人為的試料中で、Ｅ．ｃｏｌｉ株に関する最少阻止濃度（ＭＩＣ）が正確に決定されることを実証する。 In contrast, the methods of the invention can achieve accurate antimicrobial susceptibility testing results directly from specimens without the need for lengthy colony purification steps. Here, we show that the results of the new antimicrobial susceptibility test are not significantly affected when the bacteria in the urine sample are tested without colony purification. This example was performed in an artificial sample containing a urine matrix (10%) for 15 different culture-negative urine samples by a rapid antimicrobial susceptibility test method. Demonstrate that the minimum inhibitory concentration (MIC) for the coli strain is accurately determined.
実験手順。尿検体：１５種の培養陰性臨床尿試料（残遺物）は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。試料は、採取後７日を超えて受領し、使用まで－８０℃で保管した。各試料について、尿の色、ｐＨ、および微粒子の存在を記録した。受領の際に、試料が培養陰性であったことを決定するために従来の尿培養を尿に関して実施した。簡潔には、較正した１ｕＬのループを十分に混合した尿試料中に入れ、トリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上に均一に広げ、３５℃のエアーインキュベーター中で１８～２４時間インキュベートした。尿試料の残りを以下に記載したようにアッセイした。 Experimental procedure. Urine samples: 15 culture-negative clinical urine samples (relics) were purchased from Discovery Life Sciences. Samples were received more than 7 days after collection and stored at -80 ° C until use. For each sample, the color of urine, pH, and the presence of particulates were recorded. Upon receipt, conventional urine cultures were performed on the urine to determine that the sample was culture negative. Briefly, calibrated 1 uL loops were placed in a well-mixed urine sample, spread evenly on tryptic soybean agar (TSA) plates and incubated in a 35 ° C. air incubator for 18-24 hours. The rest of the urine sample was assayed as described below.
抗生物質プレートの調製：予想された最少阻止濃度（ＭＩＣ）よりも１０倍高い濃度で開始して、２倍連続希釈系列で各抗生物質の６つの濃度を含有するマイクロタイタープレートを調製した。使用した抗生物質は、セファゾリン、シプロフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾールであった。抗生物質の希釈液を、少なくとも２つのＣＬＳＩ ＱＣ株に関するＭＩＣがＣＬＳＩの文献Ｍ１００Ｅｄ２９Ｅ－２０１９において報告されたＱＣ範囲内にあることを確認することによって、適切な忍容性の範囲内にあることを検証した。各抗生物質を試験するために選択した濃度は、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗生物質に関してＣＬＳＩにより報告されたブレイクポイントをまたいだ。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水または希釈液を含有する８つのウェルがプレート中に含まれ、抗生物質なしの陽性成長対照および陰性成長対照を可能とした。 Preparation of antibiotic plates: Starting with a concentration 10-fold higher than the expected minimum inhibitory concentration (MIC), microtiter plates containing 6 concentrations of each antibiotic were prepared in a 2-fold serial dilution series. The antibiotics used were cefazolin, ciprofloxacin, nitrofurantoin, and trimethoprim-sulfamethoxazole. Antibiotic dilutions are within the appropriate tolerability range by ensuring that the MICs for at least two CLSI QC strains are within the QC range reported in CLSI literature M100Ed29E-2019. I verified it. The concentration selected to test each antibiotic is E. coli. Crossed the breakpoints reported by CLSI regarding antibiotics against coli. In addition to the wells containing the antimicrobial dilution series, eight wells containing water or diluent were included in the plate, allowing for positive and negative growth controls without antibiotics.
培養物の調製：Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＡＡ－２４６９）の対数培養を、Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）５ｍＬ中に接種した３から５個のコロニーを使用して成長させ、３５℃で１～２時間、振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中で、５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（それぞれ１００μＬの反応物中で５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの終濃度として）に希釈した。 Culture preparation: E. Logarithmic cultures of colli (BAA-2469) were grown using 3 to 5 colonies inoculated in 5 mL of Tlyptic Soy Broth (TSB, Hardy Diagnostics Catalog U65) and shaken at 35 ° C. for 1-2 hours. Incubated while incubating. Optical density was measured with a spectrophotometer and the organism was conditioned with 1X cations in Mueller-Hinton Bros (MHBII, Teknova Catalog M5860) at 5 × 10 6 CFU / mL (5 × 10 5 in 100 μL each). Diluted to (as the final concentration of CFU / mL).
磁気粒子の調製：２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０と時間４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。
Preparation of Magnetic Particles: Silica magnetic particles coated with 2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride (SiMag-Q, Chemicell, Catalog 1206-5) in 50 mM EPPS buffer, pH 8.2 x 2.75 x per mL. 10 To 12 particles were diluted 1:20. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. Separate magnetic particle suspensions were prepared for the
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前（時間０またはＴ０）のアッセイシグナルを各尿試料について決定した。希釈したＥ．ｃｏｌｉ １０μＬをハイブリダイゼーション緩衝剤７０μＬに添加した：終濃度：３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、１％のＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ３０２３）、１％のＮＯＧ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号０８００１）、１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）（２Ｘストックから）（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＭ５８６６）、ならびに非特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブ（プローブレベル、配列、および濃度については図５８を参照されたい）。１０％の尿の終濃度は、各個体の尿１０μＬを混合物に直接添加することによって得られた。上記のように調製した磁気粒子混合物１０μＬをこの混合物に直接添加した。ここで、ハイブリダイゼーション混合物、尿、および磁気粒子を含有する試料１００μＬを１ウェル（事前に乾燥させた）当たり５０μＬの「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）、コンベクションオーブン中で、６０℃で３時間乾燥させた）を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、マイクロタイタープレートを磁場（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、磁気粒子、標識化細胞を含有する画分を「色素クッション」を介して、ウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。
Bacterial cell labeling at AST time 0: Assay signals prior to the initiation of bacterial growth (
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 Imaging of Labeled Cells: The MultiPath ™ laboratory imaging system is a custom built-in device and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well with respect to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The device can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire well of the microtiter plate. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames are captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
４時間の成長：スパイクされた培養陰性臨床ＵＴＩ尿試料を５つの抗微生物剤に対するそれらの感受性について試験した：セファゾリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、およびトリメトプリム－スルファメトキサゾール。これらの抗微生物剤を含有する抗生物質プレートを、上記方法に従って調製した。時間０での細胞の定量化がなされているのと同時に、Ｅ．ｃｏｌｉ １０μＬ、尿１０μＬ、および１Ｘ ＭＨＢ ＩＩ（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＭ５８６０）７０μＬを、抗生物質プレートの各ウェルに添加した。試料を静置型エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間成長させた。
4-hour growth: Spike culture-negative clinical UTI urine samples were tested for their susceptibility to five antimicrobial agents: cefazolin, ciprofloxacin, levofloxacin, nitrofurantoin, and trimethoprim-sulfamethoxazole. Antibiotic plates containing these antimicrobial agents were prepared according to the above method. At the same time that the cells were quantified at
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートの各ウェルの１００μＬを脱水緩衝剤プレートの対応するウェルに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
Bacterial cell labeling in
比較方法：ＭｕｌｉｔＰａｔｈ（商標）アッセイに関する結果を、ＣＬＳＩの方法Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。 Comparative Method: Results for the MultiPath ™ assay were compared to broth microdilution (BMD) performed according to the CLSI method M07-Ed13E 2018.
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および各抗生物質の６つの濃度全てを含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各尿試料について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、結果を、各抗生物質に対して感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。抗生物質の非存在下での４時間の成長は、生存可能な細菌が処理済尿試料中に存在することを確認するための対照条件である。
Data analysis and threshold creation: Images captured by a CCD camera were used to estimate the detected cells by an algorithm that considers both the number of objects in the field and the intensity of those objects. Cell counts based on this detection algorithm were obtained at
結果。図５５から図５７は、ＡＳＴの結果にマトリックスの影響はほとんど存在しないことを示す。図５５は、レボフロキサシンに関して尿が存在しないゴールドスタンダードであるＣＬＳＩ ＢＭＤ方法によって決定されたＭＩＣ（破線）と比較した、新規ＡＳＴ方法によって決定されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９のＭＩＣ（黒丸）を示す。影付きの領域は本質的一致の領域であり、これは、一般的に、ＣＬＳＩ対応のＢＭＤプロセスに関する許容される誤差の範囲内であると考えられる。新規ＡＳＴ方法を使用してＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９に関して決定されたレボフロキサシンに関するＭＩＣのほとんどは、ＣＬＳＩ方法と正確に一致し、残りの２つは２倍の本質的一致ゾーンの範囲内にあった。図５６は、５種の抗生物質全てについて得られた結果をまとめる。標準的ＢＭＤに対する１００％の本質的一致と１００％のカテゴリー一致が、新規ＡＳＴ法を使用して、１５種の培養陰性臨床尿試料にわたって観察された。図５７は、試験した５つの抗生物質にわたってＣＬＳＩ対応のＢＭＤプロセスにおいて観察されたＭＩＣと比較した、新規ＡＳＴ方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉによりスパイクされた１５個の培養陰性臨床尿試料に関して決定されたＭＩＣを示す。 result. 55-57 show that there is little matrix effect on the AST results. FIG. 55 shows E. coli determined by the novel AST method compared to the MIC (dashed line) determined by the CLSI BMD method, which is the gold standard for levofloxacin in the absence of urine. The MIC (black circle) of colli BAA-2469 is shown. The shaded area is the area of essential match, which is generally considered to be within the permissible error for the CLSI-enabled BMD process. Using the new AST method, E. Most of the MICs for levofloxacin determined for colli BAA-2469 were in exact agreement with the CLSI method, and the other two were within the double essential coincidence zone. FIG. 56 summarizes the results obtained for all five antibiotics. 100% intrinsic and 100% categorical matches for standard BMDs were observed over 15 culture-negative clinical urine samples using the novel AST method. FIG. 57 uses a novel AST method compared to the MIC observed in a CLSI-compatible BMD process over the five antibiotics tested. The MICs determined for 15 culture-negative clinical urine samples spiked by colli are shown.
図５６は、標準的ＢＭＤに対する、１５個のスパイクインされた培養陰性臨床ＵＴＩ尿試料のそれぞれとのレボフロキサシンに関する１００％の本質的一致を示す。
FIG. 56
結論。本発明の方法は、１５個の別個の尿マトリックス全てにおいて試験された５つの抗生物質全てに対してＵＴＩ病原体（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関するＭＩＣ（ゴールドスタンダードであるＢＭＤ方法に対して本質的一致ゾーン内）を正確に決定した。よって、この新規の４時間の抗微生物薬感受性試験は、長時間に及ぶ成長ベースのコロニー精製を必要とすることなく、尿検体から直接的に正確な結果をもたらす能力を有し、実質的な時間を節約する。迅速なＡＳＴの結果によって、正しく、有効な抗生物質処置の素早い開始、および抗生物質耐性の広がりを加えることの回避を可能にすることによって患者のケアを改善することができる。 Conclusion. The method of the invention is within an essentially consistent zone for the MIC (gold standard BMD method) for UTI pathogen (E. coli) for all five antibiotics tested in all 15 separate urinary matrices. ) Was determined accurately. Thus, this novel 4-hour antimicrobial susceptibility test has the ability to produce accurate results directly from urine specimens without the need for lengthy growth-based colony purification, which is substantial. Save time. The results of rapid AST can improve patient care by allowing the quick initiation of correct and effective antibiotic treatment, and the avoidance of adding spread of antibiotic resistance.
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）および尿の濃度を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の細菌および非細菌病原体ならびに尿以外の最小限に処理された臨床マトリックスに明らかに適応され得る。 variation. This embodiment is an illustration of the performance of this novel AST method and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, constituents). It will be easily understood that many variations are possible, including the use of concentration) and urine concentration. This methodology can also be clearly applied to other bacterial and non-bacterial pathogens as well as minimally treated clinical matrices other than urine.
（実施例１３）
多微生物性の複数の標的についての迅速で正確なＡＳＴ
(Example 13)
Rapid and accurate AST for multiple multimicrobial targets
概要。多微生物感染症は、創傷を含む多くのタイプの感染症において一般的である。生命を脅かす可能性のあるこのような感染症では、どの抗微生物剤が各感染病原体に対して有効であり得るかを決定することが重要である。現在の抗微生物薬感受性試験方法は、多微生物感染症における多数の各感染病原体を、それらが分析され得る前に精製するために２～５日を要する。 Overview. Multimicrobial infections are common in many types of infections, including wounds. In such potentially life-threatening infections, it is important to determine which antimicrobial agents may be effective against each infectious agent. Current antimicrobial susceptibility testing methods require 2-5 days to purify each of the numerous infectious agents in multimicrobial infections before they can be analyzed.
この実施例は、長時間に及ぶコロニー精製を必要とせずに、患者の検体から直接的に、ちょうど４．５時間で迅速なＡＳＴの結果を生じる本発明のシステムおよび方法に関する可能性を実証する。本方法は、ブロス微量希釈の参照基準結果と比較した、人為的な２つの標的複数菌混合物における各標的種に関する正確なＡＳＴの結果（ＭＩＣ値）を達成する。
実験手順。
This example demonstrates the potential of the system and method of the invention to produce rapid AST results directly from a patient's specimen in just 4.5 hours without the need for lengthy colony purification. .. The method achieves accurate AST results (MIC values) for each target species in an artificial mixture of two target multibacteria compared to reference criteria results for microdilution of broth.
Experimental procedure.
抗生物質プレートの調製：６つのシプロフロキサシン濃度の２倍連続希釈系列を含有するマイクロタイタープレートを調製した。２倍希釈系列を、追加の細胞／尿／培地混合物によって正しい抗生物質範囲が得られるように、最終ブロス微量希釈における所望の濃度よりも１０倍高い濃度で調製した。次いで、各抗生物質の希釈液１０ｕＬを９６ウェルプレートの適切なウェル中にアリコートした。抗生物質の希釈液を、少なくとも２つのＣＬＳＩ ＱＣ株に関するＭＩＣがＣＬＳＩの文献Ｍ１００Ｅｄ２９Ｅ－２０１９において報告されたＱＣ範囲内にあることを確認することによって、適切な忍容性の範囲内にあることを検証した。抗微生物希釈系列を含有するウェルに加えて、水または他の希釈液を含有する十分なウェルが、抗生物質なしの陽性成長対照のために含まれた。抗生物質プレートを－８０℃で凍結させ、使用前に完全に解凍した。 Preparation of antibiotic plates: Microtiter plates containing a 2-fold serial dilution series of 6 ciprofloxacin concentrations were prepared. The 2-fold dilution series was prepared at a concentration 10-fold higher than the desired concentration in the final broth microdilution so that the correct antibiotic range was obtained with the additional cell / urine / medium mixture. 10 uL of each antibiotic diluent was then aliquoted into the appropriate wells of a 96-well plate. Antibiotic dilutions are within the appropriate tolerability range by ensuring that the MICs for at least two CLSI QC strains are within the QC range reported in CLSI literature M100Ed29E-2019. I verified it. In addition to the wells containing the antimicrobial dilution series, sufficient wells containing water or other diluents were included for positive growth control without antibiotics. Antibiotic plates were frozen at −80 ° C. and thawed completely before use.
培養物の調製：感受性株と耐性株の両方を４つの異なる生物に対して選択した（Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＡＡ－２４６９、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ００７６、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＤＣ ００４３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＣＤＣ ０２３３、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＣＤＣ ０２３６、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２、およびＥ．ｆａｅｃｉｕｍ ＡＴＣＣ １９４３４）。試験した株および各抗生物質に対するそれらの耐性を表Ａに示す。各株をＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）５ｍＬ中に接種した３から５個のコロニーと一緒に、別々に成長させ、３５℃で１～２時間振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中に１×１０７ＣＦＵ／ｍＬまで希釈した。
Culture Preparation: Both susceptible and resistant strains were selected for four different organisms (
磁気粒子の調製：ポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）の溶液を、５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子まで１：２０で希釈した。緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。これらの粒子により、光学システムが正しい平面に焦点を当てることが可能になる。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。以下に記載した時間０のアッセイと４時間とのアッセイのために、別々の磁気粒子懸濁液を調製した。２－ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリドをコーティングしたシリカ磁気粒子（ＳｉＭａｇ－Ｑ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ１２０６－５）を用いて同一の手順を行った。
Preparation of Magnetic Particles: A solution of magnetic particles conjugated with polyaspartic acid (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) into 50 mM EPPS buffer, pH 8.2, 2.75 x 10 12 pieces per mL. The particles were diluted 1:20. Fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. These particles allow the optical system to focus on the correct plane. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. Separate magnetic particle suspensions were prepared for the
ＡＳＴ時間０における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下または非存在下で、細菌成長の開始前（時間０またはＴ０）のアッセイシグナルを各種および株について決定した。標的Ａ５μＬを、生物ごとに５×１０６ＣＦＵ／ｍＬの終濃度のために、標的Ｂ５μＬまたはＭＨＢ ＩＩ ５μＬのいずれかと合わせ、ハイブリダイゼーション緩衝剤（終濃度：３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸ナトリウム ｐＨ７）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．２５Ｍのチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号５０３－８４－０）、５％のＰＥＧ ＭＷ ３３５０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ－３６４０）、７．５％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３０２１）、０．２％のセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ）、種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブ（配列および濃度は表Ｂに見られる））８０μＬに添加した。１０％の尿の終濃度は、プールした尿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログＩＲ１００００７Ｐ－２４２０３）１０μＬを総反応液１００μＬのために混合物に直接添加することによって得られた。上記のように調製したＳｉＭａｇ－Ｑ磁気粒子混合物（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの株が標識されている条件に関する）またはＦｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ磁気粒子混合物（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．が標識された条件に関する）のいずれか１０μＬをこの混合物に直接添加した。ここで、ハイブリダイゼーション混合物、尿、および磁気粒子を含有する試料１００μＬを５０μＬの色素クッション（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）、６０℃で乾かした）（乾燥－クッションプレート）を含有するマイクロタイタープレートに移し、３５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後に、マイクロタイタープレートを強力な永久磁石（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）上に４分間置き、標識された磁気粒子と相互作用する細菌細胞をイメージング表面の近傍に移動させた。
Bacterial cell labeling at AST time 0: Assay signals prior to the initiation of bacterial growth (
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）研究所のイメージングシステムは、マイクロタイタープレートの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、Ｐｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）からの高精度リニアステージを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この機器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタープレートのウェル全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 Imaging of Labeled Cells: The MultiPath ™ laboratory imaging system is a custom built-in device and software capable of automatically capturing image data from selected wells of microtiter plates. It uses a precision linear stage from Prior Scientific (Rockland, MA) to position each well with respect to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The device can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire well of the microtiter plate. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames are captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
４時間の成長：２つの種を含有する複数菌試料を１種の抗微生物剤：シプロフロキサシンに対する感受性について試験した。これらの抗微生物剤を含有する抗生物質プレートを、上記方法に従って調製した。時間０での細胞の定量化がなされているのと同時に、標識される種と検出される種のいずれか５μＬおよび複数菌ＵＴＩ感染症において存在し得る（しかし標識しない）細菌種または対照としてのＭＨＢ ＩＩのいずれか５μＬ、プールした尿１０μＬ、およびＭＨＢ ＩＩ ７０μＬを、抗生物質プレートの各ウェルに添加した。試料を静置型エアーインキュベーター中で、３５℃で４時間成長させた。この実施例における各株は、１回の例では、標識された標的種としての、別の例では、複数菌のペアの未標識メンバーとしての役割を果たす。
Growth for 4 hours: Multiple bacterial samples containing two species were tested for susceptibility to one antimicrobial agent: ciprofloxacin. Antibiotic plates containing these antimicrobial agents were prepared according to the above method. At the same time as cell quantification at
ＡＳＴの時間４時間の成長における細菌細胞の標識化：抗生物質の存在下および非存在下で、試料を４時間（Ｔ４）インキュベートした後に、細胞を標識化し、定量して、もしあれば、どの程度の成長が起こったかを決定した。インキュベートした試料－抗生物質プレートのうちの１０μＬ（１０％）をマイクロタイタープレートに移し、時間０のアッセイに関して上記したのと同じ手法で、１００μＬのハイブリダイゼーション緩衝剤、ＦＩＳＨプローブ、ヘルパープローブ、磁気粒子、および焦点粒子と合わせた。
Bacterial cell labeling in
比較方法：本明細書に記載の新規ＡＳＴ方法を使用する結果を、ＣＬＳＩ Ｍ０７－Ｅｄ１３Ｅ ２０１８に従って実施したブロス微量希釈（ＢＭＤ）と比較した。 Comparative Method: Results using the novel AST method described herein were compared to broth microdilution (BMD) performed according to CLSI M07-Ed13E 2018.
データ分析および閾値の作成：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数とその物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。この検出アルゴリズムに基づく細胞数は、時間０、ならびに抗生物質を含まない時間４時間および全部で６つの濃度のシプロフロキサシンを含む時間４時間において得られた。薬物濃度ごとの各試料接種について、成長前（時間０）の尿試料中のシグナルに対する成長後（時間４）の抗生物質を含有するウェル中のシグナルとして、成長倍率を計算した。成長倍率およびＣＬＳＩ対応のブロス微量希釈における対応するウェル中の成長の観察を使用して、ロジスティック回帰モデルを使用し、細胞が抗生物質の存在下で成長している（よって、その濃度において耐性である）ものを超え、細胞が死滅する過程にある（よって、その濃度において感受性である）ものより低い成長倍率カットオフを決定するための閾値を作成した。成長倍率の数が決定した閾値未満にある点は、このアッセイによって生じたＭＩＣ値である。それに対応して、ＭＩＣの結果を、ＣＬＳＩ Ｍ１００Ｅｄ２８ ２０１８ガイドラインに基づく感受性、中間、または耐性のカテゴリーに割り当てた。次いで、全てのデータをＣＬＳＩの標準的ＢＭＤと比較した。 Data analysis and threshold creation: Images captured by a CCD camera were used to estimate the detected cells by an algorithm that considers both the number of objects in the field and the intensity of those objects. Cell counts based on this detection algorithm were obtained at 0 hours, and 4 hours without antibiotics and 4 hours with a total of 6 concentrations of ciprofloxacin. For each sample inoculation for each drug concentration, the growth factor was calculated as a signal in the well containing the antibiotic after growth (time 4) to the signal in the urine sample before growth (time 0). Using a logistic regression model, using growth factor and observation of growth in the corresponding wells at CLSI-compatible broth microdilution, cells are growing in the presence of antibiotics (and thus resistant at that concentration). We have created a threshold to determine a growth factor cutoff that exceeds (there is) and is lower than those in the process of cell death (and thus sensitive at that concentration). The point where the number of growth ratios is below the determined threshold is the MIC value produced by this assay. Correspondingly, MIC results were assigned to the susceptibility, intermediate, or tolerance categories under the CLSI M100Ed28 2018 guidelines. All data were then compared to the standard BMD of the CLSI.
結果。図５９、図６０および図６１は、抗生物質シプロフロキサシンとの４８の異なるペアワイズの組合せのすべての結果をまとめる。図５９は、新規の４．５時間のＡＳＴ法によって標的細菌について決定されたすべてのＭＩＣが、第２の感受性または耐性細菌の存在にかかわらず、各標的細菌についてのゴールドスタンダードのＢＭＤ法（第２の細菌の非存在下で決定される）について許容される２倍の許容差範囲内であった（本質的一致と称する）ことを示す。図６２および図６３は、新たなＡＳＴ方法による各標的細菌に関する感受性および耐性のカテゴリーの決定は、これらの対の組合せによっても影響を受けず、ＢＭＤの決定と１００％一致したことを示す。 result. 59, 60 and 61 summarize the results of all 48 different pairwise combinations with the antibiotic ciprofloxacin. FIG. 59 shows that all MICs determined for a target bacterium by a novel 4.5 hour AST method are gold standard BMD methods for each target bacterium, regardless of the presence of a second susceptible or resistant bacterium. It is shown that it was within the allowable double tolerance range (referred to as essential agreement) for (determined in the absence of 2 bacteria). FIGS. 62 and 63 show that the determination of susceptibility and resistance categories for each target bacterium by the new AST method was also unaffected by the combination of these pairs and was 100% consistent with the determination of BMD.
結論。本発明のＡＳＴ方法は、現在の方法で必要とされる時間を消費するコロニー精製を必要とすることなく、４．５時間で複数菌試料における各種に関する抗生物質感受性を正確に決定することができる。この結果は、今日の方法で必要とされる日数よりもむしろ適正な時間で生命を脅かす多微生物感染症を有効に処置することができる抗微生物剤を決定する本発明の可能性を示す。 Conclusion. The AST method of the present invention can accurately determine antibiotic susceptibility to a variety of bacterial samples in 4.5 hours without the time-consuming colony purification required by current methods. .. This result demonstrates the potential of the invention to determine an antimicrobial agent capable of effectively treating a life-threatening multimicrobial infection in a reasonable amount of time rather than the number of days required by today's methods.
バリエーション。この実施例は、この新規ＡＳＴ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）ならびに代替的なアッセイ化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体、他の細菌および他の抗生物質に明らかに拡張され得る。 variation. This embodiment is an illustration of the performance of this novel AST method and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.) and alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, constituents). It will be easily understood that many variations are possible, including the use of concentration). This methodology can also be clearly extended to other biological specimens, other bacteria and other antibiotics.
（実施例１４）
自動化された機器中のカートリッジにおける単一検体中の複数の標的病原体の迅速で正確な検出
(Example 14)
Rapid and accurate detection of multiple target pathogens in a single sample in cartridges in automated equipment
概要。２種以上の細菌種によって引き起こされる感染である多微生物感染症は一般的である。病原体を同定するための現在の、培養に基づく方法およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦに基づく方法には、標的種それぞれの多数の細胞を別々に精製するために長時間に及ぶコロニー精製ステップが必要とされる。この実施例は、全てのアッセイ試薬を含有する自動化された分析器の内側の使い捨ての消耗カートリッジにおいて、人為的尿試料中に存在する複数種の標的病原体を３０分間で検出および同定する本発明のＦＩＳＨ方法の使用について実証する。本実施例は、多微生物感染症の複数の標的病原体を迅速かつ特異的に同定する本発明のシステムおよび方法の可能性を示す。
実験手順。
Overview. Multimicrobial infections, which are infections caused by more than one bacterial species, are common. Current culture-based and MALDI-TOF-based methods for identifying pathogens require lengthy colony purification steps to separately purify large numbers of cells for each target species. This example of the invention detects and identifies multiple target pathogens present in anthropogenic urine samples in a disposable consumable cartridge inside an automated analyzer containing all assay reagents in 30 minutes. Demonstrate the use of the FISH method. This example demonstrates the potential of the systems and methods of the invention to rapidly and specifically identify multiple target pathogens for multimicrobial infections.
Experimental procedure.
尿検体：１０種の培養陰性臨床尿試料（残遺物）は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。試料は、採取後７日を超えて受領し、使用まで－８０℃で保管した。各試料について、尿の色、ｐＨ、および微粒子の存在を記録した。受領の際に、試料が培養陰性であることを決定するために従来の尿培養を尿に関して実施した。簡潔には、較正した１ｕＬのループを十分に混合した尿試料中に入れ、トリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ、ＢＤ カタログ２２１１８５）プレート上に均一に広げ、３５℃のエアーインキュベーター中で１８～２４時間インキュベートした。尿試料の残りを以下に記載したように処理およびアッセイした。 Urine samples: 10 culture-negative clinical urine samples (relics) were purchased from Discovery Life Sciences. Samples were received more than 7 days after collection and stored at -80 ° C until use. For each sample, the color of urine, pH, and the presence of particulates were recorded. Upon receipt, conventional urine cultures were performed on the urine to determine if the sample was culture negative. Briefly, calibrated 1 uL loops were placed in a well-mixed urine sample, spread evenly on tryptic soybean agar (TSA, BD Catalog 221185) plates and incubated in a 35 ° C. air incubator for 18-24 hours. .. The rest of the urine sample was processed and assayed as described below.
尿処理：同定（ＩＤ）を実施する前に、尿防腐剤および他の妨害する可能性のある化合物をサイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。各臨床的に陰性の尿試料２．５ｍＬを事前に洗浄したＺｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム、７Ｋ ＭＷＣＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８９８９３）に適用した。製造業者によって説明された通り、試料を遠心分離によってカラムに通過させた。 Urine treatment: Before performing identification (ID), urine preservatives and other potentially disturbing compounds were removed using size exclusion chromatography. 2.5 mL of each clinically negative urine sample was applied to a pre-washed Zeba ™ Spin Deserting column, 7K MWCO (Thermo Fisher, Catalog No. 89893). The sample was passed through the column by centrifugation as described by the manufacturer.
カートリッジ内での脱水試薬の調製：同定（ＩＤ）を実施する前に、２．２×に濃縮されたハイブリダイゼーション緩衝剤（６．７Ｘ ＳＳＣ（１ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ６６３９）、０．４％ｗ／ｖのセトリミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ９１５１）、１．７１％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳＯ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｃ３６４９）、１．６％ｗ／ｖのＳＢ３－１２（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｄ０４３１）、および０．２９Ｍチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９２７７））４５μＬをカートリッジの試薬ウェルのうちの６つ中に分配した。分析器による処理後に最終１００ｕＬ体積で再水和させると、標準的な１×ハイブリダイゼーション緩衝剤（３Ｘ ＳＳＣ（０．４５ＭのＮａＣｌ、０．０４５Ｍのクエン酸Ｎａ）、０．１８％のセトリミド、０．７７％のＣＨＡＰＳＯ、０．７２％のＳＢ３－１２、および０．１３Ｍのチオシアン酸グアニジン）が実現されることになる。それぞれ標的種特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＦＩＳＨプローブおよび未標識ＤＮＡヘルパープローブの混合物１．８μＬを試薬ウェルの８つのうちの２つに添加した（１カートリッジ中の各標的ごとにＮ＝２）。Ｅ．ｃｏｌｉ ＦＩＳＨオリゴヌクレオチドプローブのセットをカートリッジの場所Ａ１およびＡ２に対応する試薬ウェルに添加し、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅプローブセットをカートリッジの場所Ａ３およびＡ４に対応する試薬ウェルに添加し、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａプローブセットをカートリッジの場所Ａ５およびＡ６に対応する試薬ウェルに添加した。次いで、ハイブリダイゼーション緩衝剤および特異的プローブを含有するこれらのカートリッジウェルを５０℃のコンベクションオーブン中で１６～２０時間インキュベートし、材料を脱水した。 Preparation of Dehydration Reagents in Cartridge: Hybridization Buffer Concentrated to 2.2x (6.7X SSC (1M NaCl, 0.1M Sodium Citrate, 0.1M Sodium Citrate,) prior to performing identification (ID). Sigma, Catalog No. S6639), 0.4% w / v cetrimid (Sigma, Catalog No. H9151), 1.71% w / v CHASPO (Sigma Catalog No. C3649), 1.6% w / v SB3- 45 μL of 12 (Sigma Catalog No. D0431) and 0.29 M guanidine citrate (Sigma, Catalog No. G9277)) were dispensed into 6 of the reagent wells of the cartridge and rehydrated in the final 100 uL volume after treatment with the analyzer. When combined, standard 1x hybridization buffer (3X SSC (0.45M NaCl, 0.045M Na citrate), 0.18% cetrimid, 0.77% CHASPO, 0.72%. SB3-12, and 0.13M guanidine thiocyanate) will be realized. 1.8 μL of a mixture of target species-specific DNA oligonucleotide FISH probe and unlabeled DNA helper probe, respectively, out of eight reagent wells. (N = 2 for each target in one cartridge). A set of E. coli FISH oligonucleotide probes was added to the reagent wells corresponding to cartridge locations A1 and A2 and the K. pneumoniae probe set. Was added to the reagent wells corresponding to cartridge locations A3 and A4, and the P. aeruginosa probe set was added to the reagent wells corresponding to cartridge locations A5 and A6, which in turn contained a hybridization buffer and a specific probe. These cartridge wells were incubated in a 50 ° C. convection oven for 16-20 hours to dehydrate the material.
磁気粒子の調製：ポリアスパラギン酸がコンジュゲートした磁気粒子（Ｆｌｕｉｄｍａｇ－ＰＡＡ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、カタログ４１０８）を、１０％ｗ／ｖのトレハロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９４４９）の終濃度で、５０ｍＭのＥｐｐｓ緩衝剤、ｐＨ８．２中へ、１ｍＬ当たり２．７５×１０１２個の粒子の濃度まで１：２０で希釈した。この希釈のために、緑色色素（Ｄｒａｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ＢＡＮＧＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログＭＥＤＧ００１）を含有する蛍光磁気マイクロスフェアを１ｍＬ当たり３×１０６個の粒子の終濃度で懸濁液に添加した。凝集を最小限にするために、使用する直前に、磁気粒子混合物を１分間超音波処理した。次いで、混合物を１０μＬ体積のビーズ（反応ごとに２．６４×１０１２個のＰＡＡ粒子）中で凍結乾燥させ、１つのビーズを６つの試薬ウェルのそれぞれの中に入れた。 Preparation of Magnetic Particles: Polyaspartic acid conjugated magnetic particles (Fluidmag-PAA, Chemicell, Catalog 4108) at a final concentration of 10% w / v trehalose (Sigma, Catalog No. T9449), 50 mM Epps buffer. , To pH 8.2, diluted 1:20 to a concentration of 2.75 × 10 12 particles per mL. For this dilution, fluorescent magnetic microspheres containing a green dye (Dragon Green Fluorescent Microspheres, BANGS Laboratories, Catalog MEDG001) were added to the suspension at a final concentration of 3 × 10 6 particles per mL. The magnetic particle mixture was sonicated for 1 minute immediately prior to use to minimize agglomeration. The mixture was then lyophilized in 10 μL volumes of beads (2.64 × 10 12 PAA particles per reaction) and one bead was placed in each of the six reagent wells.
培養物の調製：３つの異なる標的病原体（Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３）の対数培養を、Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ カタログＵ６５）５ｍＬ中に接種した３から５個のコロニーと共に別々に成長させ、３５℃で１～２時間、振盪させながらインキュベートした。光学密度を分光光度計によって測定し、生物を１Ｘカチオンで調整したＭｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢＩＩ、Ｔｅｋｎｏｖａ カタログＭ５８６０）中で、約５×１０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。
Culture Preparation: A logarithmic culture of three different target pathogens (
同定のための細菌細胞の標識化およびイメージング：３０％の処理済尿の終濃度で目的の２種の細菌を含有する人為的複数菌混合物（全部で２種の細菌の組合せを３つ）中の各標的病原体について、アッセイシグナルを決定した。各複数菌の組合せを１０個の固有の異なる培養陰性臨床試料中で試験した（全部で３０個の尿を試験した）。細菌標的Ａ（反応ごとに約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）１０３．５μＬ、細菌標的Ｂ（反応ごとに約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）１０３．５μＬ、尿３６０μＬ、および６３３μＬを合わせて総体積１．２ｍＬとし、この混合物１ｍＬをカートリッジの試料添加ポートに移した。次いで、カートリッジを機器上に置き、その後の動作は全て自動的に実施された。試料は、最初に、真空下で、カートリッジ上部の６つの成長ウェル中に向けられた。次いで、試料を反応ウェルにすぐに移動させ、ハイブリダイゼーション緩衝剤／ＦＩＳＨプローブミックスおよび凍結乾燥させた磁気粒子を再水和させた。次いで、試料は、脱水した「色素クッション」（５０ｍＭのＴＲＩＳ ｐＨ７．５（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログＴ５０７５）、７．５％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、カタログＤ１５５６）、５ｍｇ／ｍＬのＤｉｒｅｃｔ Ｂｌａｃｋ－１９（Ｏｒｉｅｎｔ、カタログ番号３２２２）、コンベクションオーブン中で６０℃で３時間乾燥させた）４５μＬを含有する光学ウインドウに続き、分析器上で３５℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーション後に、カートリッジを磁石ステーションに再度位置付け、強力な永久磁石（Ｄｅｘｔｅｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ５４１７０２６０）の上に４分間置き、標識した磁気粒子と相互作用する細菌細胞をウェルの底のイメージング表面の近傍に移動させた。最後に、カートリッジをイメージングステーションまで動かし、以下に記載した非拡大ＣＣＤイメージャーを使用してイメージングを得た。簡潔には、標識された細菌細胞をイメージングするために、緑色チャネルで蛍光磁気マイクロスフェアの連続イメージ、決定された焦点面、および赤色チャネルで得たその場所の対応するイメージを撮ることによって、個々のウェルそれぞれに焦点が当てられた。 Bacterial cell labeling and imaging for identification: In an artificial multibacterial mixture (three combinations of two bacteria in all) containing the two bacteria of interest at a final concentration of 30% treated urine. Assay signals were determined for each target pathogen. Each combination of multiple strains was tested in 10 unique and different culture-negative clinical samples (30 urine tested in total). Bacterial target A (about 5 × 10 5 CFU / mL per reaction) 103.5 μL, bacterial target B (about 5 × 10 5 CFU / mL per reaction) 103.5 μL, urine 360 μL, and 633 μL combined to total volume To 1.2 mL, 1 mL of this mixture was transferred to the sample addition port of the cartridge. The cartridge was then placed on the device and all subsequent operations were performed automatically. The sample was first directed under vacuum into the six growth wells at the top of the cartridge. The sample was then immediately transferred to the reaction wells to rehydrate the hybridization buffer / FISH probe mix and lyophilized magnetic particles. The sample was then dehydrated "dye cushion" (50 mM TRIS pH 7.5 (Teknova, Catalog T5075), 7.5% v / v Optiprep (Sigma, Catalog D1556), 5 mg / mL Direct Black-19 ( Orient, Catalog No. 3222), dried in a convection oven at 60 ° C. for 3 hours) followed by an optical window containing 45 μL, incubated on the analyzer at 35 ° C. for 30 minutes. After this incubation, the cartridge is repositioned in the magnet station and placed on a strong permanent magnet (Dexter magnetic technologies, Catalog 54170260) for 4 minutes to allow bacterial cells interacting with the labeled magnetic particles near the imaging surface at the bottom of the well. Moved to. Finally, the cartridge was moved to the imaging station and imaging was obtained using the non-magnifying CCD imager described below. Briefly, to image labeled bacterial cells, individually by taking a continuous image of the fluorescent magnetic microspheres in the green channel, a determined focal plane, and a corresponding image of the location obtained in the red channel. Each well was focused on.
標識化細胞のイメージング：ＭｕｌｔｉＰａｔｈ（商標）分析器イメージングシステムは、完全に自動化された試験の一部として、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの選択されたウェルからイメージデータを自動的に捕捉することが可能なカスタムビルト機器およびソフトウェアである。これは、カスタム設計された精度の高い３軸位置決めシステムを使用し、各ウェルを蛍光ベースのイメージ獲得サブシステムに対して位置付ける。この分析器は、４色の別々のカラーチャネルでイメージングすることができ、対物レンズ、ＬＥＤ照明、蛍光フィルターセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｅｌｌ全体のイメージを捕捉するよう設計された視野を有する。イルミネーションモジュール光源は、カラーチャネルごとに２つの高出力ＬＥＤからなる。一連の蛍光イメージフレームは、ピクセル当たり１２ビットを量子化する３．１ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサーを使用するカメラで捕捉される。次いで、複数のフレームを合計することによって、各ウェルに対する最終イメージが形成される。６３５／２５ｎｍの励起フィルターおよび６６７／３０ｎｍの発光フィルターを使用して１００ミリ秒の露出で、１６フレームを捕捉した。４７０／４０ｎｍの励起フィルターおよび５２０／４０ｎｍの励起フィルターで焦点粒子をイメージングし、２０ミリ秒の露出で２フレームを捕捉した。 Imaging of Labeled Cells: The MultiPath ™ Analyzer Imaging System is a custom built-in device that can automatically capture image data from selected wells of MultiPath Cartridge as part of a fully automated test. And software. It uses a custom designed, highly accurate 3-axis positioning system to position each well relative to a fluorescence-based image acquisition subsystem. The analyzer can image in four separate color channels and uses an objective lens, LED lighting, a fluorescent filter set, and a camera. The objective lens has a field of view designed to capture an image of the entire Cartridge Imaging Well. The illumination module light source consists of two high power LEDs per color channel. A series of fluorescent image frames are captured by a camera that uses a 3.1MP Sony IMX265 monochromatic sensor that quantizes 12 bits per pixel. The final image for each well is then formed by summing the plurality of frames. 16 frames were captured at 100 ms exposure using a 635/25 nm excitation filter and a 667/30 nm emission filter. Focus particles were imaged with a 470/40 nm excitation filter and a 520/40 nm excitation filter and captured 2 frames with 20 ms exposure.
データ分析：ＣＣＤカメラによって捕捉したイメージを使用して、視野内の物体の数と物体の強度の両方を考慮するアルゴリズムによって、検出した細胞を推定した。アッセイシグナルが１３０を超えると、チャネルのシグナルが検出されたと考えられた。 Data analysis: Using images captured by a CCD camera, the detected cells were estimated by an algorithm that considers both the number of objects in the field of view and the intensity of the objects. When the assay signal exceeded 130, it was considered that the channel signal was detected.
結果。データは、存在しない病原体は検出せずに（すなわち、非標的細菌に対するＦＩＳＨプローブの交差反応性なし）単一の試料中の２つの標的病原体の同定に成功することを実証する。図６４は、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ混合試料が試験されるカートリッジを実行することを示す（Ｎ＝１０）。図６５は、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ混合試料が試験されるカートリッジを実行することを示す（Ｎ＝１０）。図６６は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ混合試料が試験されるカートリッジを実行することを示す（Ｎ＝１０）。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのカートリッジ番号６は、そのカートリッジが有効な結果を得ることができなかったため、分析から除去した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのカートリッジ番号９のＡ３では、ウェル中のシグナルが異常に高く表れる原因となるアーチファクトが観察され、そのため、このシグナルの複製は排除された。この除外された点（ウェルＡ４）の複製はこのアーチファクトを有さず、そのため、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは依然として検出されずとしてカテゴライズされた。アッセイシグナルは異なるカートリッジにわたり変化したが、すでに記載されたもの以外の全ての場合に、培養陰性尿に添加された２種の細菌が検出されたが、一方、添加されなかった細菌に関するプローブを含有するウェル中では非常に低いシグナルしか観察されない。 result. The data demonstrate successful identification of two target pathogens in a single sample without detecting non-existent pathogens (ie, no cross-reactivity of the FISH probe to non-target bacteria). FIG. 64 shows E.I. colli / K. It is shown that the cartridge in which the pneumoniae mixed sample is tested is run (N = 10). FIG. 65 shows E. colli / P. It is shown that the cartridge in which the aeruginosa mixed sample is tested is run (N = 10). FIG. 66 shows K.K. pneumoniae / P. It is shown that the cartridge in which the aeruginosa mixed sample is tested is run (N = 10). K. pneumoniae / P. Cartridge number 6 of aeruginosa was removed from the analysis as the cartridge failed to give valid results. Furthermore, E. colli / P. In A3 of cartridge number 9 of aeruginosa, artifacts were observed that caused the signal to appear abnormally high in the wells, so replication of this signal was excluded. The duplication of this excluded point (well A4) does not have this artifact and therefore K.I. Pneumoniae was still categorized as undetected. Assay signals varied across different cartridges, but in all cases other than those already described, two bacteria added to culture-negative urine were detected, while containing probes for bacteria that were not added. Only very low signals are observed in the wells.
結論。この実施例は、消耗カートリッジの内部に安定化試薬を含む自動化された分析器で実施される本発明の恒温ＦＩＳＨ方法によって、人為的尿試料中の複数の標的細菌種が特異的に同定され得ることを実証する。このことは、多微生物感染症における複数の病原体を同定する本方法の可能性を示す。この実施例はまた、異種間の検出が観察されなかったため、本方法の特異性も実証する。 Conclusion. In this example, a plurality of target bacterial species in an artificial urine sample can be specifically identified by the constant temperature FISH method of the present invention performed in an automated analyzer containing a stabilizing reagent inside a consumable cartridge. Demonstrate that. This indicates the possibility of this method for identifying multiple pathogens in multimicrobial infections. This example also demonstrates the peculiarities of the method, as no cross-species detection was observed.
バリエーション。この実施例は、カートリッジに関するこの新規ＦＩＳＨ方法の性能の例証であり、本明細書に含まれる具体的詳述に限定されるものではない。当業者であれば、したがって、異なるプローブ配列および核酸構造（ＰＮＡ、ＬＮＡなど）、代替的なアッセイの化学（異なる界面活性剤、カオトロープ、フルオロフォア、緩衝剤、ｐＨ、温度、反応時間、構成成分の濃度）、尿の濃度および尿の処理手順ならびに反応物の安定化に対する変更（構成成分の凍結乾燥）を使用することを含む多くのバリエーションが可能であることを容易に理解するであろう。この方法論はまた、他の生物学的検体ならびに他の細菌および非細菌病原体に明らかに拡張され得る。
参照による組み込み
variation. This embodiment is an illustration of the performance of this novel FISH method for cartridges and is not limited to the specific details contained herein. Those of skill in the art therefore have different probe sequences and nucleic acid structures (PNA, LNA, etc.), alternative assay chemistry (different surfactants, chaotropes, fluorophores, buffers, pH, temperature, reaction time, components). It will be easy to see that many variations are possible, including the use of changes to the concentration of urine), the concentration of urine and the procedure for processing urine and the stabilization of the reactants (freeze-drying of the constituents). This methodology can also be clearly extended to other biological specimens as well as other bacterial and non-bacterial pathogens.
Built-in by reference
特許、特許出願、特許公報、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書に対する参照および引用は、本開示全体を通してなされる。全てのこのような文書は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
均等物
References and citations to other documents such as patents, patent applications, patent gazettes, journals, books, articles and web content are made throughout this disclosure. All such documents are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.
Equal
本明細書に示されかつ記載されたものに加えて、本発明の様々な修正およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書において引用された科学文献および特許文献への参照を含む、この文書の全内容から当業者に対して明らかとなるであろう。本明細書における主題は、本発明の様々な実施形態およびその均等物において、本発明の実践のために採用され得る重要な情報、例証およびガイダンスを含有する。 In addition to those shown and described herein, various modifications of the invention and many further embodiments thereof include references to the scientific and patent documents cited herein. It will be clear to those skilled in the art from the whole contents of. The subject matter herein contains important information, illustrations and guidance that may be employed for the practice of the invention in various embodiments of the invention and their equivalents.
Claims (34)
多微生物検体を得るステップ；
前記検体をウェル中に分割するステップであって、少なくとも一部の前記ウェルが、異なる薬剤または異なる濃度の１種もしくは複数の薬剤を含む、ステップ；
前記ウェル中の前記検体をインキュベートして、前記異なる薬剤または異なる濃度の薬剤に応答した差次的成長を可能にするステップ；および
各ウェル中の特定の種の個々の細胞を計数して、前記特定の種の成長を阻害する薬剤または薬剤の濃度を同定するステップ
を含む、方法。 A method for antimicrobial susceptibility testing,
Steps to obtain multimicrobial specimens;
A step of dividing the sample into wells, wherein at least some of the wells contain different agents or different concentrations of one or more agents;
The step of incubating the specimen in the well to allow differential growth in response to the different drug or different concentration of drug; and counting individual cells of a particular species in each well, said. A method comprising identifying a drug or concentration of drug that inhibits the growth of a particular species.
前記カートリッジを分析器にロードするステップであって、前記分析器が、磁石を使用して、前記微生物を前記検体の他の部分から分離し、イメージングサブシステムを使用して、前記計数するステップを行う、ステップ
をさらに含む、請求項８に記載の方法。 A step of transferring a portion of the sample into the cartridge, wherein the cartridge comprises microbiologically binding magnetic beads; and a step of loading the cartridge into an analyzer, wherein the analyzer. 8. The method of claim 8, further comprising a step of separating the microorganism from the rest of the specimen using a magnet and performing the counting step using an imaging subsystem.
前記ウェルが、前記カートリッジ内にあり、前記異なる薬剤または異なる濃度の薬剤を予めロードされ、
前記分割するステップおよび前記インキュベートするステップの後、前記分析器が、前記ウェルの内容物を対応する試薬ウェルに移入して、そこでインキュベートされた検体を前記磁気結合性磁気ビーズおよび種特異的な検出可能な標識に曝露させる、請求項９に記載の方法。 The analyzer performs the split step within the cartridge using a pneumatic subsystem.
The wells are in the cartridge and are preloaded with the different or different concentrations of the agent.
After the dividing step and the incubating step, the analyzer transfers the contents of the well into the corresponding reagent well, where the incubated sample is subjected to the magnetically binding magnetic beads and species-specific detection. The method of claim 9, wherein the method is exposed to a possible label.
前記検体の一部を前記カートリッジ中に移入するステップ、および前記カートリッジを前記分析器にロードするステップを含む、請求項１に記載の方法。 The well is in the cartridge and the method described above
The method of claim 1, comprising the step of transferring a portion of the sample into the cartridge and the step of loading the cartridge into the analyzer.
微生物を含む検体を得るステップ；
任意のコロニーもしくは細胞の精製または培養のステップを伴わずに、前記検体の一部をウェル中に移入するステップであって、前記ウェルが、種特異的な検出可能な標識および微生物結合性磁気ビーズを含む、ステップ；
磁石を使用して、イメージング表面上の前記ビーズを収集するステップ；ならびに
前記イメージング表面上の前記検出可能な標識をイメージングして、それにより前記検体の前記一部中の前記種の細胞の存在を決定するステップ
を含む、方法。 It is a method of analyzing microorganisms.
Steps to obtain a sample containing microorganisms;
A step of transferring a portion of the specimen into a well without the step of purifying or culturing any colony or cell, wherein the well is a species-specific detectable label and microbial binding magnetic beads. Including, steps;
The step of collecting the beads on the imaging surface using a magnet; as well as imaging the detectable label on the imaging surface, thereby detecting the presence of cells of the type in said portion of the specimen. A method that includes steps to determine.
微生物を、前記微生物結合性磁気ビーズに結合させるステップ
をさらに含み、観察するステップが、未結合の検出可能な標識を洗い流すことなく、標識された磁石結合細胞をイメージングするステップを含む、請求項２３に記載の方法。 A step of labeling the target microorganism with the species-specific detectable label in the well; and a step of further comprising binding the microorganism to the microorganism-binding magnetic beads and observing is unbound detectable. 23. The method of claim 23, comprising imaging labeled magnet-bound cells without flushing the labeled.
23. The method of claim 23, wherein the cells of the species are determined to be present in the sample within about 30 minutes of the step of transfer.
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