JP2022512058A - ヌクレアーゼを利用したｒｎａ枯渇 - Google Patents

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Abstract

本開示は、核酸試料から不必要なＲＮＡ種を枯渇させるための方法及び材料に関する。具体的には、本開示は、試料中の標的ＲＮＡ分子の分析、操作及び研究を妨げる可能性のある不必要なｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ種を除去する方法を記載する。試料から不必要なＲＮＡ種が枯渇すると、残りの標的ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することができる。堅牢な試料の結果として実用的なデータを取得することは、癌の予知及び診断のためのより十分な理解及び潜在的な治療オプション、ヒト及びその他の真核生物系におけるヒトマイクロバイオーム及びその重要性のより十分な理解、目的の遺伝子の発現分析のより完全な理解などにつながり得る。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年１２月２１日出願の米国仮出願第６２／７８３，８６９号、及び２０１９年５月１４日出願の同第６２／８４７，７９７号の優先権の利益を主張し、これらのそれぞれは、任意の目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表）
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、２０１９年１２月９日作成の「２０１９－１２－０９＿０１２４３－００１２－００ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題された９４，２０８バイトサイズのファイルとして提供される。電子形式での配列表の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ヒト細胞又は組織から採取した核酸試料のような核酸試料中の不必要なＲＮＡは、その試料の分析、遺伝子発現分析、マイクロアレイ分析、及び試料のシーケンシングなどの分析を複雑にする可能性がある。リボソームＲＮＡ（ribosomal RNA：ｒＲＮＡ）は、細胞中のＲＮＡのおよそ９５％を含むため、その存在は、試料中の標的核酸又は研究者若しくは診断医がより多くを理解することを望む核酸の結果を妨げ、分かりにくくさせるおそれのあるＲＮＡ種の一例である。例えば、不必要なｒＲＮＡ種は、ｔＲＮＡ又はｍＲＮＡなどの試料中の目的のＲＮＡ分子の分析を特に困難にする可能性がある。このことは、例えばホルマリン固定後にワックスに埋め込まれた、生検からのホルマリン固定パラフィン包埋（formalin fixed paraffin embedded：ＦＦＰＥ）組織などの組織の場合に特に常在する問題である。ｒＲＮＡ種は、ＦＦＰＥ組織から除去しないと、組織内の標的ＲＮＡの測定及び特性評価を妨げることで、疾患及び癌の特定、潜在的な治療オプション、疾患又は癌の診断及び予知などの医学的に実用的な情報を標的ＲＮＡから導き出すことを極めて困難にする可能性がある。ＦＦＰＥ組織は一例であるが、ｒＲＮＡに関する同じ問題は、血液、細胞、及びその他の種類の核酸含有試料などのあらゆる種類の試料に当てはまる。
核酸試料から望ましくないＲＮＡを枯渇させるための現在市販されている方法としては、ＲｉｂｏＺｅｒｏ（登録商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）及びＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｒＲＮＡ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎキット（ＮＥＢ）並びに米国特許第９，７４５，５７０号及び同第９，００５，８９１号に記載されているＲＮＡ枯渇法が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、ＲＮＡを枯渇させるのに有用である一方で、試料から望ましくないＲＮＡを枯渇させる際の使いやすさ、高い試料インプット要件、技術者が作業に要する時間、コスト、及び／又は効率などの点で、独自の欠点を有する。試料から不必要なＲＮＡ種をより容易に、又はより低コストに枯渇させることにより、稀少であるか、又は配列変異体の同定が困難であるなどの標的ＲＮＡの、隠されていた可能性のある情報を明らかにすることができる材料及び方法が必要とされている。本開示に記載の単純かつ信頼性の高い方法は、試験用の標的ＲＮＡ分子の利用可能性を大幅に高めることによって、試料及びそれが由来する生物に関してそれらが保持している情報を見出すことを可能にする。
米国特許第９，７４５，５７０号明細書 米国特許第９，００５，８９１号明細書
真核生物又は原核生物に由来する核酸試料などの核酸試料には多数の核酸が含まれているが、これらの多くは研究者の関心を引くものではない。研究者は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの特定の種類の核酸を研究することを望む。ＲＮＡの研究では、研究の焦点である標的ＲＮＡよりも圧倒的」に多数であるためにこれらの発見を困難にするおそれのある様々な種類のＲＮＡ種が目的の試料に含まれている場合がある。したがって、ＲＮＡ枯渇とは、核酸試料から不必要なＲＮＡ種及び／又はＤＮＡ種を除去することによって、研究に必要なＲＮＡが濃縮された核酸試料を残すことを指す。
本開示は、過剰量の不必要なＲＮＡ種を更なる研究の前に核酸試料から枯渇させるための解決策を提供する。例えば、目的のＲＮＡ試料が、研究対象の標的ＲＮＡを含むだけでなく、試料の大半を占め、目的の標的を圧倒してしまうおそれのあるｒＲＮＡ、グロビンｍＲＮＡ、ウイルス汚染物、又は任意の他の不必要な核酸などの転写産物を大量に含むことにより、研究者がトランスクリプトームの所望の部分を正確に分析する能力が大幅に低下する。
したがって、発現マイクロアレイ又はシーケンシングなどの分析の前に、核酸試料から不必要なＲＮＡを枯渇させることで、所望のＲＮＡ標的に対する分析の特異性及び精度が向上する。本開示では、特定のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの分解によってオフターゲットＲＮＡを枯渇させることにより、ライブラリ調製及び分析の前に、試料から不必要なＲＮＡ種を効率的に除去することができる。試料から不必要なＲＮＡ種が枯渇すると、残りの標的ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することができる。堅牢な試料の結果として実用的なデータを取得することは、癌の予知及び診断のためのより十分な理解及び潜在的な治療オプション、ヒト及びその他の真核生物系におけるヒトマイクロバイオーム及びその重要性のより十分な理解、目的の遺伝子の発現分析のより完全な理解などにつながり得る。
一実施形態では、本開示は、核酸試料からオフターゲットＲＮＡ分子を枯渇させるための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＲＮＡ又はＤＮＡ標的配列と、少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子とを含む核酸試料を、少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って不連続な配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと接触させることにより、ＤＮＡプローブをオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成することであって、各ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、所与のオフターゲットＲＮＡ分子配列に沿って、任意の他のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドから少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れていることと、
ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼと接触させることにより、核酸試料中のオフターゲットＲＮＡ分子を分解して、分解混合物を形成することと、を含む方法を記載する。
一実施形態では、本開示は、核酸試料中の少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の（例えば、全長に沿って少なくとも５塩基又は少なくとも１０塩基離れた）不連続な配列と相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、本組成物は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解可能なリボヌクレアーゼを更に含む。別の一実施形態では、本開示は、少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズされた少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットを含む組成物であって、各ＤＮＡプローブは、プローブセット内の任意の他のＤＮＡプローブから、オフターゲットＲＮＡ分子の長さに沿って少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れてハイブリダイズされている、組成物に関する。
一実施形態では、本開示は、核酸試料中の少なくとも１つのオフターゲットｒＲＮＡ分子の（例えば、全長に沿って少なくとも５塩基離れた、又は少なくとも１０塩基離れた）不連続な配列と相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブ含むプローブセットと、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解可能なリボヌクレアーゼと、を備えるキットを記載する。
一実施形態では、本開示は、核酸試料からオフターゲットＲＮＡ核酸分子を枯渇させる際に使用するためのプローブセットを補足する方法であって、ａ）少なくとも１つのＲＮＡ又はＤＮＡ標的配列と、第１の種に由来する少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子とを含む核酸試料を、第２の種に由来する少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って不連続な配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと接触させることにより、ＤＮＡプローブをオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成することであって、各ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、所与のオフターゲットＲＮＡ分子配列に沿って、任意の他のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドから少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れていることと、ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼと接触させることにより、核酸試料中のオフターゲットＲＮＡ分子を分解して、分解混合物を形成することと、ｃ）分解されたｒＲＮＡを分解混合物から分離することと、ｄ）試料の残りのＲＮＡをシーケンシングすることと、ｅ）残りのＲＮＡ配列を、第１の種に由来するオフターゲットＲＮＡ分子の存在について評価することにより、複数のギャップ配列領域を決定することと、ｆ）複数のギャップ配列領域のうちの１つ以上における不連続な配列と相補的な更なるＤＮＡプローブでプローブセットを補足することと、を含む方法を記載する。
試料からのＲＮＡ種の枯渇を実行するための例示的なワークフローを示す。工程１は、核酸の変性とそれに続く枯渇ＤＮＡプローブの添加、プローブと不必要なＲＮＡ種とのハイブリダイゼーション、その結果としてのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの生成を含む。工程２は、ＲＮａｓｅ Ｈなどのリボヌクレアーゼを使用したＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからのＲＮＡの消化を含む。工程３は、ＤＮａｓｅを添加することによる、分解混合物からの残留ＤＮＡプローブの消化を含む。工程４は、試料中の残りの標的ＲＮＡを捕捉すること及び、任意にこれに続く、配列決定又はマイクロアレイ発現分析、ｑＰＣＲ若しくは他の解析技術に曝露される可能性のある不必要なＲＮＡ種を枯渇させることにつながる更なる操作を含む。
ｒＲＮＡ枯渇ワークフローに（２Ａ）０％ホルムアミドのホルムアミドを添加した場合の、枯草菌の試料からのｒＲＮＡ枯渇に関する例示的なデータを示す。各パネルにおいて、Ｘ軸に検出されたｒＲＮＡ種を列挙し、Ｙ軸に枯渇率を配列リードの割合で示す。 ｒＲＮＡ枯渇ワークフローに（２Ｂ）２５％ホルムアミドのホルムアミドを添加した場合の、枯草菌の試料からのｒＲＮＡ枯渇に関する例示的なデータを示す。各パネルにおいて、Ｘ軸に検出されたｒＲＮＡ種を列挙し、Ｙ軸に枯渇率を配列リードの割合で示す。 ｒＲＮＡ枯渇ワークフローに（２Ｃ）４５％ホルムアミドのホルムアミドを添加した場合の、枯草菌の試料からのｒＲＮＡ枯渇に関する例示的なデータを示す。各パネルにおいて、Ｘ軸に検出されたｒＲＮＡ種を列挙し、Ｙ軸に枯渇率を配列リードの割合で示す。
様々な量の配列決定された試料（１００ｎｇ、１０ｎｇ、又は１ｎｇ）を比較したヒト脳ＲＮＡ（Human Brain RNA：ＨＢＲ）及びユニバーサルヒトＲＮＡ（Universal Human RNA：ＵＨＲ）のｒＲＮＡ枯渇試料に関する例示的な次世代シーケンシング（next-generation sequencing：ＮＧＳ）配列データを示す。
ｒＲＮＡ枯渇ワークフローに添加された様々な濃度のホルムアミド（０％、２５％、４５％）を使用したマウスＲＮＡ及びラットＲＮＡ由来のｒＲＮＡ枯渇試料の例示的なＮＧＳ配列データを示す。
低試料インプットを使用した様々な微生物種由来のｒＲＮＡ除去の例示的なデータを、ＲｉｂｏＺｅｒｏ（登録商標）酵素除去ｒＲＮＡ枯渇法とＲＮａｓｅ Ｈ酵素除去ｒＲＮＡ枯渇法とを比較して示したものである。全ての試料のリード深度は正規化されている。Ｘ軸はｒＲＮＡ枯渇法（ＲＺ＝ＲｉｂｏＺｅｒｏ酵素枯渇法、ＥＤ＝ＲＮａｓｅ Ｈ酵素枯渇法）を示し、Ｙ軸はｒＲＮＡリードの割合を示す。
様々なリード深度における枯草菌及び大腸菌の例示的な転写産物検出データを、グラフの左側のＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇後の場合（ＥＤ）と、グラフの右側のｒＲＮＡ枯渇を行わなかった場合（なし）とを比較して示したものである。Ｘ軸はシーケンシングリード（Ｍ）を示し、Ｙ軸は検出された転写産物の数を示す。
開示されたｒＲＮＡ枯渇法の再現性を実証する遺伝子発現のペアワイズ線形回帰データの例示的なグラフである。パネル７Ａは、２つの大腸菌複製遺伝子発現レベルを例示し、パネル７Ｂは、２つの枯草菌複製遺伝子発現レベルを例示している。いずれの細菌型も、ＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇後の遺伝子発現レベル複製間の相関性が高いことを示している。 開示されたｒＲＮＡ枯渇法の再現性を実証する遺伝子発現のペアワイズ線形回帰データの例示的なグラフである。パネル７Ａは、２つの大腸菌複製遺伝子発現レベルを例示し、パネル７Ｂは、２つの枯草菌複製遺伝子発現レベルを例示している。いずれの細菌型も、ＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇後の遺伝子発現レベル複製間の相関性が高いことを示している。
２０株（ＭＳＡ－２００２、左側）及び１２株（ＭＳＡ－２００６、右側）混合試料の例示的なトリプリケートｒＲＮＡリードデータを示す。混合試料トリプリケートを、本明細書に記載のＲｉｂｏＺｅｒｏ枯渇法（ＲＺ）又はＲＮａｓｅ Ｈ枯渇法（ＥＤ）によってｒＲＮＡ枯渇させた。ＭＳＡ２００２試料のＲＮＡインプットは１０ｎｇであったが、ＭＳＡ２００６の場合は８０ｎｇであった。Ｘ軸はｒＲＮＡ枯渇法を示し、Ｙ軸はｒＲＮＡリードの割合を示す。
ユニバーサルマウス参照ＲＮＡ（universal mouse reference RNA：ＵＭＲ）試料からマウス１６Ｓ ｒＲＮＡを枯渇させる際の、マウスミトコンドリア１２Ｓ（ｍｔ－Ｒｎｒ１及び１６Ｓ（ｍｔ－Ｒｎｒ２）ｒＲＮＡ遺伝子座（図の底部）のシーケンシングのリードカバレッジ及び３３３ＤＮＡプローブセット（配列番号１～３３３）の効果を示す。正方形は、５０塩基長にわたって９０％、又は３０塩基対長にわたって７０％の位置が３３３ＤＮＡプローブセットと一致することを示している。更なるマウスプローブ及びラットプローブが存在しない場合、プローブカバレッジのないギャップは、図の上部に示されている２つの複製（Ｒｅｐ １及びＲｅｐ２）の残留又は非枯渇ｒＲＮＡのピークに対応する。
シーケンシングのためのＲＮＡからの核酸ライブラリの作成は、試料の大半を占め、目的のＲＮＡ配列を圧倒してしまうおそれのあるリボソームＲＮＡ、グロビンｍＲＮＡ、ウイルス性汚染物質などの不必要な転写産物が大量に存在するために、困難であることが多い。不必要な転写産物が除去されないと、予知、診断、又は研究に資するトランスクリプトームの分析が妨げられるおそれがある。したがって、シーケンシング又はその他のダウンストリームの用途などの分析の前に核酸試料から不必要なＲＮＡを枯渇させることで、所望の分析の特異性及び精度を向上させることが可能である。
本開示は、望ましくないＲＮＡ転写産物に紛れてしまうことなく重要なＲＮＡを研究することができるように、核酸試料から不必要なＲＮＡ種を枯渇させるのに有用な方法及び材料を記載する。
本開示の方法は、既存のＲＮＡ枯渇方法と比較してより少量のトータルＲＮＡインプットを利用して、同等の性能メトリックを維持することができる。したがって、本開示の方法は、研究者が他の方法では対応できない少量の出発物質しか有していない場合に利用可能である。更に、本開示の方法は、様々な異なる生物の不必要なＲＮＡ種を同時に標的とする１個のプローブプールを使用して、枯渇効率を損なうことなく実施することができる。例えば、本開示は、複数の不必要なＲＮＡのヒト、細菌、ウイルス及び／又は古細菌の供給源を非限定的に含むＲＮＡ試料から、複数の不必要な真核生物及び原核生物のＲＮＡ種を同時に枯渇させることができる。
核酸試料又は混合物とは、望ましくない（オフターゲットの又は不必要な）核酸及び所望の（標的）核酸の両方を含む、ＲＮＡ又はＤＮＡあるいはこれらの両方を含有する試料を指す。試料中のＤＮＡ又はＲＮＡは、未修飾であっても修飾されていてもよく、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡあるいはそれらの誘導体（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの一部の領域は二本鎖である一方で、ＤＮＡ又はＲＮＡの他の領域は一本鎖である）などを非限定的に含む。一般に、核酸試料は、全ての化学的、酵素的、及び／又は代謝的に修飾された形態の核酸、並びに全ての未修飾形態の核酸、あるいはこれらの組み合わせを含む。核酸試料は、ゲノムＤＮＡ又はトータル細胞ＲＮＡあるいはこれらの組み合わせなどの、所望の核酸及び不必要な核酸の双方を含有することができる。不必要な核酸としては、研究対象ではない真核生物由来の核酸、並びに細菌、ウイルス、古細菌種などに由来する汚染性の核酸が挙げられる。必要な又は所望の核酸は、研究の基礎又は焦点である核酸、すなわち標的核酸である。例えば、研究者は、ｍＲＮＡ発現分析を研究することを望む場合があり、その場合には、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びＤＮＡは不必要な核酸と見なされ、ｍＲＮＡは標的核酸と見なされる。同様に、トータルＲＮＡの研究が所望される場合があり、その場合には、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びＤＮＡは不必要な又は望ましくない核酸と見なされ、トータルＲＮＡは標的核酸と見なされる。不必要なＲＮＡとしては、リボソームＲＮＡ（ribosomal RNA：ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアｒＲＮＡ、核ｒＲＮＡ、グロビンＲＮＡなどのｍＲＮＡ、又は転写ＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ、あるいはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、オフターゲットＲＮＡはｒＲＮＡである。いくつかの実施形態では、オフターゲットＲＮＡはグロビンｍＲＮＡである。
例えば、核酸試料は、所望のメッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA：ｍＲＮＡ）又はトータルＲＮＡを含有する一方で、望ましくないリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転写ＲＮＡ（transfer RNA：ｔＲＮＡ）並びに、場合によっては望ましくないＤＮＡも含み得る。血液、組織、細胞、固定組織などの大口試料からのＲＮＡ抽出の一般的な方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）及び多数の分子生物学的方法のマニュアルに見られるように、当該技術分野において周知である。ＲＮＡ単離は、例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラム、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｐａｒｒａｆｉｎ Ｂｌｏｃｋ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）、ＲＮＡ－Ｓｔａｔ－６０（Ｔｅｌ－Ｔｅｓｔ）などの市販の精製キット又は塩化セシウム密度勾配遠心分離によって実施することができる。本方法は、どのようにしてＲＮＡ枯渇の前にＲＮＡを試料から単離するかによって限定されない。
細菌のｒＲＮＡを標的とするプローブとヒトのｒＲＮＡを標的とするプローブとを同じプールに混合すると、望ましい転写産物の大幅なオフターゲット枯渇につながるのではないかという懐疑論が従来から存在する（Ｍａｕｒｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７， ９４：４２２－４２７； Ｍｉｇｎｏｎｅ ａｎｄ Ｐｅｓｏｌｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００２， １：１４５－５４）。驚くべきことに、本開示の方法の開発中に行われた研究では、ＤＮＡプローブと不必要なＲＮＡ転写産物とのハイブリダイゼーションの特異性により、不必要なＲＮＡ種を効率的に枯渇させた試料が得られることから、これが当てはまらないことが示された。また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加は、ホルムアミドが存在しなければ枯渇がより困難となることが示されたいくつかの不必要なＲＮＡを除去するのに役立つことも発見された。ホルムアミドがこれらのＲＮＡの除去にどのように役立つのかを理解する必要はないが、ホルムアミドは、ＤＮＡプローブがより効率的に結合することができるように、不必要なＲＮＡ内の構造的バリアを弛緩させる役割を果たすと考えられる。更に、ホルムアミドの添加は、例えば、非常に安定した二次構造又は三次構造を有し、通常は他のライブラリ調製方法では十分に表されないｍＲＮＡの領域を変性／弛緩させることによって、いくつかの非標的転写産物の検出を改善するという更なる利点を有することが実証された。
核酸試料又は混合物
本開示は、核酸試料の供給源に限定されず、例えば、供給源は、ヒト、非ヒト霊長類、哺乳類、鳥類、爬虫類、植物、細菌、ウイルスを非限定的に含む真核生物又は原核生物、土壌、水又はその他の液体並びにその他の環境試料に含まれる核酸由来であり得る。試料は、細胞、組織、器官、環境、溶解物などから得ることができ、新鮮、凍結、凍結乾燥及び再構成などの任意の状態の試料、あるいはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）又は他の細胞学的若しくは組織学的試料操作を施された組織又は生検標本などの固定試料から得ることができる。
ＲＮＡ枯渇法の恩恵を受けることができる核酸試料は、ヒト、非ヒト、マウス、ラット、細菌などの任意の種、真核生物又は原核生物由来であってもよく、１つの試料中に単一又は複数の種を含むことができる。加えて、本発明の枯渇方法は、ホルマリンを使用して処理されパラフィンに埋め込まれた試料（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋、すなわちＦＦＰＥ試料）を含む生検試料又は組織試料などの新鮮な又は保存された試料に使用することができる。いくつかの実施形態では、核酸試料は、非ヒト真核生物、細菌、ウイルス、植物、土壌、又はこれらの混合物などのヒト由来又は非ヒト供給源由来である。試料から不必要なＲＮＡ種が枯渇した後に、残りの所望の標的を、当業者に周知の更なる処理のためにｃＤＮＡに変換してもよい。
いくつかの実施形態では、核酸試料は、ヒト由来又は非ヒト霊長類由来である。いくつかの実施形態では、核酸試料は、ラット由来又はマウス由来である。いくつかの実施形態では、核酸試料は、非ヒト起源の核酸を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト起源の核酸は、非ヒト真核生物、細菌、ウイルス、植物、土壌、又はこれらの混合物由来である。
枯渇方法
このように、核酸試料中の不必要な又は望ましくないＲＮＡは、記載された方法によって枯渇される。不必要なＲＮＡは、相補的なＤＮＡプローブを不必要なＲＮＡ分子と部分的に又は完全にハイブリダイズさせることにより、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに変換される。核酸プローブを核酸とハイブリダイズさせる方法は、科学技術分野で十分に確立されており、プローブがパートナー配列と部分的に相補的であるか、又は完全に相補的であるかにかかわらず、ＤＮＡプローブが試料の洗浄又はその他の操作の後に不必要なＲＮＡ種にハイブリダイズするという事実は、本開示の方法で使用することができるＤＮＡプローブを立証する。枯渇対象の不必要なＲＮＡセットは、試料からＲＮＡを枯渇させることがシーケンシングなどのダウンストリーム研究において（例えば不必要な核酸種からの結果がより少ないなど）より有利であり得る、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの任意の真核生物種に由来してもよい。研究対象がＲＮＡである場合には、ＤＮＡも不必要な核酸と見なされ、その場合には、ＤＮＡを枯渇によって除去してもよい。
一実施形態では、本開示は、核酸試料からオフターゲットＲＮＡ分子を枯渇させるための方法であって、
ａ）少なくとも１つのＲＮＡ又はＤＮＡ標的配列と、少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子とを含む核酸試料を、少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って不連続な配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと接触させることにより、ＤＮＡプローブをオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成することであって、各ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、所与のオフターゲットＲＮＡ分子配列に沿って、任意の他のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドから少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れていることと、
ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼと接触させることにより、核酸試料中のオフターゲットＲＮＡ分子を分解して、分解混合物を形成することと、を含む方法を記載する。
一実施形態では、ＲＮＡ試料は、ＤＮＡプローブの存在下で変性される。例示的なワークフローを図１に示す。図１の実施例では、ＤＮＡプローブを変性ＲＮＡ試料（９５℃で２分間変性）に添加し、反応物を３７℃で１５～３０分間冷却すると、ＤＮＡプローブがそれぞれの標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズされ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子が作成される。
いくつかの実施形態では、プローブセットとの接触は、核酸試料を不安定化剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、不安定化剤は、熱又は核酸不安定化化学物質である。いくつかの実施形態では、核酸不安定化化学物質は、ベタイン、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、グリセロール、又はこれらの誘導体、又はこれらの混合物である。いくつかの実施形態では、核酸不安定化化学物質は、ホルムアミド又はその誘導体であり、任意選択的に、ホルムアミド又はその誘導体は、全ハイブリダイゼーション反応物体積の約１０～４５％の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、試料を熱で処理することは、少なくとも１つのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度よりも高い熱を加えることを含む。
いくつかの実施形態では、ホルムアミドは、ＲＮＡ試料供給源（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）に関係なく、ハイブリダイゼーション反応物に添加される。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションは、少なくとも３体積％、５体積％、１０体積％、２０体積％、２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％又は４５体積％のホルムアミドの存在下で実施される。一実施形態では、ＲＮＡ枯渇のためのハイブリダイゼーション反応物は、約２５体積％～４５体積％のホルムアミドを含む。
ハイブリダイゼーション反応に続いて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼが反応物に添加される。いくつかの実施形態では、リボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ Ｈ又はＨｙｂｒｉｄａｓｅである。ＲＮａｓｅ Ｈ（ＮＥＢ）又はＨｙｂｒｉｄａｓｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解する酵素の例である。ＲＮａｓｅ Ｈ又はＨｙｂｒｉｄａｓｅなどのリボヌクレアーゼによる分解により、ＲＮＡを小分子に分解し、次いで除去することができる。例えば、ＲＮａｓｅ Ｈは、約７～２１塩基毎にＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡを消化することが報告されている（Ｓｃｈｕｌｔｚ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１：１９４３－１９５５； Ｃｈａｍｐｏｕｘ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，ＦＥＢＳ Ｊ．２００９，２７６：１５０６－１５１６）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡの消化は、図１の工程２及び実施例１に記載されるように、３７℃で約３０分間生じ得る。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子の消化に続いて、残りのＤＮＡプローブ及び核酸試料中のオフターゲットＤＮＡが分解される。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、リボヌクレアーゼ分解混合物をＤＮＡ消化酵素と接触させることによって混合物中のＤＮＡを分解することを含む。いくつかの実施形態では、消化された試料は、ＤＮＡプローブを分解するＤＮａｓｅ ＩなどのＤＮＡ消化酵素に曝露される。ＤＮａｓｅ ＤＮＡ消化反応物を、例えば、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＤＮａｓｅを変性させるために必要な、例えば最大２０分間などの時間にわたり、ＤＮａｓｅ酵素を７５℃で変性させてもよい。
いくつかの実施形態では、枯渇方法は、分解されたＲＮＡを分解混合物から分離することを含む。いくつかの実施形態では、分離は、例えばＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）などのＲＮＡ捕捉ビーズなどの核酸精製培地を使用して、標的ＲＮＡを分解されたＲＮＡ（及び、存在する場合は分解されたＤＮＡ）から精製することを含む。したがって、いくつかの実施形態では、酵素消化に続いて分解産物を除去する一方で、所望のより長いＲＮＡ標的を残すことにより、標的ＲＮＡを濃縮してもよい。好適な濃縮方法には、所望の断片サイズの濃縮されたＲＮＡ標的に結合する磁気ビーズでの分解混合物の処理、スピンカラムなどが含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズ、ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）などの磁気ビーズを、これらのビーズが（例えば、ＲＮａｓｅを含有しないように品質管理されているなど）ＲＮａｓｅ非含有である限りにおいて使用することができる。これらのビーズは、例えば、ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰビーズは１００ｎｔ以上の長さの核酸断片を標的とし、ＳＰＲＩＳｅｌｅｃｔビーズは１５０～８００ｎｔの核酸断片を標的とし、ＲＮａｓｅ Ｈ及びＤＮａｓｅの酵素消化により生じる分解されたＲＮＡ及びＤＮＡなどのより短い核酸配列は標的としないなど、核酸結合に様々なサイズ選択オプションを提供する。ｍＲＮＡが研究対象の標的ＲＮＡである場合には、例えば、ｍＲＮＡのアデニル化された鎖を捕捉するためのオリゴｄＴ配列を含むビーズを使用して、ｍＲＮＡを更に濃縮することができる。ｍＲＮＡ捕捉の方法は、当業者に周知である。
望ましくない分解された核酸を含む反応物成分から標的ＲＮＡが精製された後に、更なる試料操作が生じる場合がある。本開示では、実施例２及び３は、濃縮された標的トータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成する例示的なワークフローに続いて、例えばＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサでの後続のシーケンシングに代表される例示的なライブラリ調製ワークフローを提供する。しかしながら、これらのワークフローは単に例示的なものであることが理解されるべきであり、当業者であれば、濃縮されたＲＮＡは、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析などのような多数の更なる用途に直接に、又は、例えば確立された周知のプロトコルを使用してＲＮＡをｃＤＮＡに変換するなどの更なる操作に続いて使用されてもよいことを理解するであろう。
本明細書に記載されるＲＮＡ枯渇のための方法は、標的ＲＮＡ分子が濃縮された試料をもたらす。例えば、本明細書に記載の方法は、１５％未満、１３％未満、１１％未満、９％未満、７％未満、５％未満、３％未満、２％未満若しくは１％未満、又はこれらの間の任意の範囲の不必要なＲＮＡ種を含む枯渇したＲＮＡ試料をもたらす。この場合の濃縮されたＲＮＡ試料は、少なくとも９９％、９８％、９７％、９５％、９３％、９１％、８９％若しくは８７％、又はこれらの間の任意の範囲の標的トータルＲＮＡを含む。濃縮後の試料は、ライブラリ調製又はその他のダウンストリームの操作に使用することができる。
ＤＮＡプローブセット／ＤＮＡプローブ
ＤＮＡプローブとは、不必要なＲＮＡ種に対する配列相補性を有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを指す。ＤＮＡプローブ配列は、核酸試料における枯渇対象の望ましくないＲＮＡと部分的に又は完全に相補的であり得る。枯渇対象の不必要なＲＮＡとしては、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、各ＤＮＡプローブは、約１０～１００ヌクレオチド長、又は約２０～８０ヌクレオチド長、又は約４０～６０ヌクレオチド長、又は約５０ヌクレオチド長である。ＤＮＡプローブは、不必要なＲＮＡ種にハイブリダイズすることによって、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子を作成することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのＤＮＡプローブが特定のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズするが、これらのＤＮＡプローブは、不必要なＲＮＡ分子配列の全長をカバーしない。例えば、いくつかの実施形態では、プローブセットは、プローブセット内に相補的ＤＮＡプローブがない場合は、不必要なＲＮＡのギャップ又は領域を残す。これらのＤＮＡプローブは、重なり合わないように不必要なＲＮＡに完全に又は部分的にハイブリダイズし、得られるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド間に少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個又はそれ以上のヌクレオチドのギャップを残す。したがって、いくつかの実施形態では、各ＤＮＡプローブは、プローブセット内の任意の他のＤＮＡプローブから、少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って、少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れてハイブリダイズされる。したがって、不必要なＲＮＡは、その全体がＤＮＡプローブと完全にハイブリダイズするわけではない。更に、本開示は、枯渇対象の単一のＲＮＡにハイブリダイズする複数のＤＮＡプローブを提供し、そのため、「１つのＲＮＡに対して１つのＤＮＡプローブ」が存在するのではなく、所与の不必要なＲＮＡを標的とするプローブセット内に複数の不連続なＤＮＡプローブが存在する。例えば、いくつかの実施形態では、枯渇対象の所与のＲＮＡセットについて、各プローブが約２０～８０ヌクレオチド長であり、かつ、各プローブが、セット内の別のＤＮＡプローブから５～１５ヌクレオチド離れた任意の位置で不必要なＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブセットが使用される。ＤＮＡプローブは、枯渇対象のＲＮＡ上の特定の位置に対して完全に又は部分的に相補的であってもよく、例えば、ＤＮＡプローブ配列は、枯渇対象のＲＮＡ転写産物上の標的位置に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％、又はこれらの間の任意の範囲で相補的であってもよい。相補性に対する唯一の制約として、ＤＮＡプローブは、本明細書に記載されるように酵素消化可能なＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが生じるような方法で、枯渇対象の標的ＲＮＡにハイブリダイズする必要がある。ｍＲＮＡが目的の標的であり、枯渇の対象ではない場合もあり得るが、そのような場合には、ＤＮＡプローブは、プローブがｍＲＮＡ種にハイブリダイズしないように、ｐｏｌｙＴ配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプローブは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどの捕捉部分を有するタグ、又は物理的手段によるハイブリッドの枯渇を可能にする磁気ビーズを含まないが、他の実施形態では、ＤＮＡプローブは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどの捕捉部分を有するタグ、又は物理的手段によるハイブリッドの枯渇を可能にする磁気ビーズを含む。
いくつかの実施形態では、プローブセットは、少なくとも、ヒト及び細菌由来のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、少なくとも、ヒト、細菌、及び古細菌由来のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、少なくとも、ヒト、細菌、マウス、及びラット由来のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、少なくとも、ヒト、細菌、マウス、ラット、及び古細菌由来のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、細菌由来のオフターゲットＲＮＡ分子は、グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌、あるいはこれらの混合物に由来する。いくつかの実施形態では、プローブセットは、古細菌種由来の１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、古細菌種由来の２つ以上のｒＲＮＡ配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。
いくつかの実施形態では、プローブセットは、２８Ｓ、２３Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ、１２Ｓ、ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＢ－Ｂ１、ＨＢＢ－Ｂ２、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２から選択される少なくとも１つ、又は少なくとも２つのオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、２８Ｓ、２３Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ、１２Ｓ、ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＢ－Ｂ１、ＨＢＢ－Ｂ２、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２からなる群から選択される２つ以上のｒＲＮＡ配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ヒト由来の２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ及び１２Ｓから選択される１つ以上又は２つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ラット１６Ｓ、ラット２８Ｓ、マウス１６Ｓ及びマウス２８Ｓ、並びにこれらの組み合わせから任意に選択されるラット由来及び／又はマウス由来の１つ以上又は２つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ヘモグロビン由来のＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＢ－Ｂ１、ＨＢＢ－Ｂ２、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２から選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌由来の２３Ｓ、１６Ｓ及び５Ｓから選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。枯渇対象のグロビンｍＲＮＡとしては、ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＢ－Ｂ１、ＨＢＢ－Ｂ２を含むマウス又はラットなどのげっ歯類に見られるもの、並びにＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＧＢ１及びＨＧＢ２を含むヒトに見られるものを挙げることができるが、これらに限定されない。枯渇に好適なミトコンドリアｒＲＮＡとしては、１８Ｓ及び１２Ｓ（ヒト及びげっ歯類）が挙げられる。枯渇に好適な核ｒＲＮＡとしては、２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ及び５Ｓ（ヒト及びげっ歯類）、並びに５Ｓ、１６Ｓ及び２３Ｓを含む原核細胞ｒＲＮＡが挙げられる。いくつかの試料では、古細菌種由来のｒＲＮＡ ２３Ｓ、１６Ｓ又は５ＳなどのｒＲＮＡの枯渇が望ましくてもよい。更なる実施形態では、プローブセットは、グラム陽性又はグラム陰性細菌ｒＲＮＡ ５Ｓ、１６Ｓ及び２３Ｓからなる群から選択される２つ以上のｒＲＮＡ配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、ヒト２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ及び１２Ｓ、グロビンｍＲＮＡ ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２、並びにグラム陽性又はグラム陰性細菌ｒＲＮＡ ５Ｓ、１６Ｓ及び２３Ｓのそれぞれに相補的な、少なくとも２つ（又は少なくとも５つ、又は少なくとも１０、又は少なくとも２０）のＤＮＡプローブを含む。いくつかの実施形態では、特定のオフターゲットＲＮＡ分子に対するプローブは、そのオフターゲットＲＮＡ分子の配列の約８０～８５％に相補的であり、各プローブハイブリダイゼーション部位間に少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基のギャップを有する。
いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号１～３３３（ヒト、グラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３３３の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号１～４２８（ヒト、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、古細菌、マウス、及びラット）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は４００以上、又は４２８の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号１～３７７（ヒト、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、及び古細菌）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３７７の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号１～３３３（ヒト、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌）及び配列番号３７８～４２８（マウス及びラット）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３８４の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号３３４～３７７（古細菌）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は４４の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号３７８～４２８（マウス及びラット）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は５１の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプローブは、部分的又は完全に相補的であり、例えば、表１に配列番号４０～配列番号１５０で示すＤＮＡプローブ配列などの、ヒト２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ及び／又は５Ｓ ｒＲＮＡにハイブリダイズする配列を含む。第２の実施形態では、ＤＮＡプローブは、例えば、表１に配列番号１～配列番号３９で示すＤＮＡプローブ配列などの、ミトコンドリアｒＲＮＡ １６Ｓ及び／又は１２Ｓにハイブリダイズする配列を含む。他の実施形態では、ＤＮＡプローブは、例えば、表１に配列番号１５１～配列番号１９４で示すＤＮＡプローブ配列などの、ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＢ－Ｂ１、ＨＢＢ－Ｂ２、ＨＢＧ１、及び／又はＨＢＧ２を含むヘモグロビンｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプローブは、例えば、表１に配列番号１９５～配列番号２６２（大腸菌に代表されるグラム陰性細菌）及び配列番号２６３～配列番号３３３（枯草菌に代表されるグラム陽性細菌）で示すＤＮＡプローブ配列などの、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌ｒＲＮＡ ２３Ｓ、１６Ｓ及び／又は５Ｓなどの細菌ｒＲＮＡにハイブリダイズする配列を含む。他の実施形態では、ＤＮＡプローブは、例えば、表１に配列番号３３４～配列番号３８４で示す古細菌種Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ由来のｒＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブ配列などの、ｒＲＮＡ ２３Ｓ、１６Ｓ及び／又は５Ｓなどの古細菌ｒＲＮＡにハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプローブは、例えば、表１に配列番号３８５～配列番号３９３及び配列番号４００～配列番号４１９で示すＤＮＡプローブ配列などの、マウス１６Ｓ及び／又は２８ＳなどのマウスｒＲＮＡにハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプローブは、例えば、表１に配列番号３９４～配列番号３９９及び配列番号４２０～配列番号４２８で示すＤＮＡプローブ配列などの、ラット１６Ｓ及び／又は２８ＳなどのラットｒＲＮＡにハイブリダイズする配列を含む。
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一実施形態では、ＲＮＡ試料はヒト由来であり、ＤＮＡプローブセットは、本開示に記載のｒＲＮＡ及びミトコンドリアｍＲＮＡ転写産物などのヒトの不必要なＲＮＡ種に特異的なプローブを含む。別の一実施形態では、ヒトＲＮＡ試料から不必要なＲＮＡを枯渇させるためのＤＮＡプローブセットは、ヒトｒＲＮＡ及びミトコンドリアｍＲＮＡ転写産物に特異的なプローブ、並びにグラム陽性及びグラム陰性の不要なＲＮＡ転写産物に特異的なプローブを含む。更なる実施形態では、ヒトＲＮＡ試料から不必要なＲＮＡを枯渇させるためのＤＮＡプローブセットは、その一例が本開示に記載のＭ．ｓｍｉｔｈｉｉである古細菌種に特異的なプローブを含む。したがって、いくつかの実施形態では、ヒトＲＮＡ試料からｒＲＮＡを枯渇させるためのＤＮＡプローブセットは、ヒトの不必要なＲＮＡ種を標的とするプローブのみを含むか、又は非ヒトの不必要なＲＮＡ転写産物を標的とする混合ＤＮＡプローブセットも更に含む。当業者であれば、ＲＮＡ枯渇に使用されるプローブセットは、試料の研究意図、試料が採取された環境、及びＲＮＡ試料のＲＮＡ枯渇の実験設計につながる任意の他の要因に左右されることを理解するであろう。
一実施形態では、ＲＮＡ試料は非ヒト真核生物由来であり、ＤＮＡプローブセットは、その真核生物を供給源とする試料中の不必要なＲＮＡに特異的なプローブを含む。例えば、ＲＮＡ試料がマウス又はラット由来である場合、ＤＮＡプローブセットは、マウス又はラットの不必要なＲＮＡ種に特異的なプローブを含むが、不必要なグラム陽性及びグラム陰性細菌ＲＮＡ種、又は古細菌種などの他の細菌種に特異的なＤＮＡプローブも更に含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプローブは、削除対象のＲＮＡ種の連続した長さ全体にはハイブリダイズしない。驚くべきことに、枯渇対象のＲＮＡ種の完全長配列を、完全長ＤＮＡプローブ、又はＲＮＡ配列全体を連続的に網羅するプローブセットで標的化する必要はないことが見出され、現に、本明細書に記載のＤＮＡプローブは、形成されるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが連続的とならないように、ギャップを残している。驚くべきことに、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド間の少なくとも５ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、又は２０ｎｔのギャップは、効率的なＲＮＡ枯渇をもたらした。更に、ギャップを含むプローブセットは、枯渇対象のＲＮＡ配列全体をカバーするプローブ、又は互いに重複するプローブでは生じ得るように、ＤＮＡプローブが隣接プローブのハイブリダイゼーションを妨げることがないため、不必要なＲＮＡにより効率的にハイブリダイズすることができる。
加えて、プローブセットを補足して、所与の種のＲＮＡ枯渇方法を改善することが可能である。核酸試料からオフターゲットＲＮＡ核酸分子を枯渇させる際に使用するためのプローブセットを補足する方法が、ａ）少なくとも１つのＲＮＡ又はＤＮＡ標的配列と、第１の種に由来する少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子とを含む核酸試料を、第２の種に由来する少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って不連続な配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと接触させることにより、ＤＮＡプローブをオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成することであって、各ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、所与のオフターゲットＲＮＡ分子配列に沿って、任意の他のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドから少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れていることと、ｂ）ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼと接触させることにより、核酸試料中のオフターゲットＲＮＡ分子を分解して、分解混合物を形成することと、ｃ）分解されたＲＮＡを試料から分離することと、ｄ）試料の残りのＲＮＡをシーケンシングすることと、ｅ）残りのＲＮＡ配列を、第１の種に由来するオフターゲットＲＮＡ分子の存在について評価することにより、複数のギャップ配列領域を決定することと、ｆ）複数のギャップ配列領域のうちの１つ以上における不連続な配列と相補的な少なくとも１つのＤＮＡプローブでプローブセットを補足することと、を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ギャップ配列領域は、少なくとも５０、又は少なくとも６０、又は少なくとも７０の塩基対を含む。いくつかの実施形態では、第１の種は非ヒト種であり、第２の種はヒトである。いくつかの実施形態では、第１の種はラット又はマウスである。マウス試料中のオフターゲットｒＲＮＡ核酸分子の枯渇を改善するための例示的なプローブセット補足方法は、実施例８及び図９に概説されている。
いくつかの実施形態では、第１の種は非ヒト種であり、第２の種はヒトである。いくつかの実施形態では、第１の種はラット又はマウスである。いくつかの実施形態では、第２の種は、ヒト、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、又はこれらの混合物である。
組成物及びキット
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載のプローブセットを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、プローブセットと、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解可能なＲＮａｓｅ Ｈ又はＨｙｂｒｉｄａｓｅなどのリボヌクレアーゼとを含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、核酸試料中の少なくとも１つのオフターゲットｒＲＮＡ分子に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含み、プローブは重複せず、かつオフターゲットｒＲＮＡ分子の長さに対して不連続である（例えば、全長に沿って少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れている）。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズされた少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットを含み、各ＤＮＡプローブは、プローブセット内の任意の他のＤＮＡプローブから、オフターゲットＲＮＡ分子の長さに沿って少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れてハイブリダイズされている。いくつかの実施形態では、組成物は、ホルムアミド、ベタイン、ＤＭＳＯ、グリセロール、又はこれらの誘導体、又はこれらの混合物などの核酸不安定化化学物質を含む。一実施形態では、不安定化化学物質は、全ハイブリダイゼーション反応物体積の１０～４５％の濃度で存在するホルムアミド又はその誘導体である。
一実施形態では、本開示は、核酸試料中の少なくとも１つのオフターゲットｒＲＮＡ分子の（例えば、全長に沿って少なくとも５塩基離れた、又は少なくとも１０塩基離れた）不連続な配列と相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解可能なリボヌクレアーゼと、を備えるキットを記載する。いくつかの実施形態では、プローブセットは、本明細書に記載のＤＮＡプローブのいずれか、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液及び核酸精製培地を備える。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の緩衝液、核酸精製培地、及びＤＮＡプローブセットのうちの１つ以上を備える。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号１～３３３のうちの２つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号１～４２８のうちの２つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号１～３７７（ヒト、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、及び古細菌）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３７７の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号１～３３３及び配列番号３７８～４２８（ヒト、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌、マウス及びラット）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３８４の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号３３４～３７７（古細菌）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は４４の配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブセットは、配列番号３７８～４２８（マウス及びラット）からの２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は５１の配列を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、１）本明細書に記載のプローブセットと、２）リボヌクレアーゼと、３）ＤＮａｓｅと、４）ＲＮＡ精製ビーズと、を備える。いくつかの実施形態では、キットは、ＲＮＡ枯渇緩衝液と、プローブ枯渇緩衝液と、プローブ除去緩衝液と、を備える。
枯渇試料の分析
本開示の方法は、単一試料又は混合試料からのトランスクリプトームの分析においても有用である。トランスクリプトーム分析は、例えば、試料が細菌細胞由来のトータルＲＮＡ中に８５％以上のｒＲＮＡ分子を含む場合があるなど、リボソームＲＮＡの相対的な存在量が多いために妨げられる可能性がある。シーケンシング又はその他の分析試薬をめぐって競合するこのような多量のｒＲＮＡが存在すると、不必要なｒＲＮＡ分析に隠れて見失われる可能性のあるトランスクリプトームのより有益な部分に焦点を当てることが困難となるおそれがある。本開示の方法は、例えば、低インプットのＤＮＡでの微生物単離物又は真核細胞単離物のリッチなトランスクリプトーム分析を容易にすることで、ｒＲＮＡシーケンシングのリードを小さくし、シーケンシングコストを削減し、低バイオマス試料のメタトランスクリプトーム解析を可能にする。このことは、混合試料からの低インプット量（＜８０ｎｇ）を、本開示に記載のＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇法を用いて評価した実施例４に例示されている。本明細書に記載の方法は、核酸シーケンシング技術用のライブラリの作成、ＲＴ－ＰＣＲとそれに続くマイクロアレイ分析、ＰＣＲ、ｑＰＣＲなどへの濃縮試料の使用などの様々なダウンストリームの用途と組み合わせて使用することができる。しかしながら、本明細書に記載のＲＮＡ枯渇法から得られる濃縮ＲＮＡ試料は、シーケンシングなどの特定のダウンストリーム用途に限定されないことが理解されるべきである。
一例として、ＲＮＡ枯渇試料を使用してシーケンシングライブラリを作成し、作成されたライブラリをアレイ内の定位置に貼り付けて、それらの相対的位置が変化しないようにし、アレイを繰り返しイメージングしてもよい。例えば、あるヌクレオチド塩基タイプを別のヌクレオチド塩基タイプと区別するために使用される様々なラベルと一致する様々なカラーチャネルで画像が取得される実施形態は、特に好適である。いくつかの実施形態では、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するプロセスが、自動化プロセスであってもよい。好ましい実施形態としては、合成による配列決定（「sequencing-by-synthesis：ＳＢＳ」）技術が挙げられる。
ＳＢＳ法は一般に、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの反復付加による新生核酸鎖の酵素伸長を伴う。ＳＢＳの従来の方法では、単一のヌクレオチドモノマーが、各送達においてポリメラーゼの存在下で標的ヌクレオチドに提供され得る。ＳＢＳは、ターミネータ部分を有するヌクレオチドモノマー又はいずれのターミネータ部分も有さないヌクレオチドモノマーを利用することができる。ターミネータを含まないヌクレオチドモノマーを利用する方法としては、例えば、γ－リン酸標識ヌクレオチドを用いたパイロシーケンシング及びシーケンシングが挙げられる。ターミネータを含まないヌクレオチドモノマーを使用する方法では、各サイクルで添加されるヌクレオチドの数は一般に可変であり、テンプレート配列及びヌクレオチド送達方法に依存する。ターミネータ部分を有するヌクレオチドモノマーを利用するＳＢＳ技術では、ターミネータは、ジデオキシヌクレオチドを利用する従来のＳａｎｇｅｒシーケンシングの場合のように、使用されるシーケンシング条件下で効果的に不可逆的であってもよく、又は、ターミネータは、Ｓｏｌｅｘａ（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によって開発されたシーケンシング方法の場合のように可逆的であってもよい。
ＲＮＡ枯渇ワークフロー及びＲＮＡ濃縮試料を活用可能なシーケンシング方法には、例えば切断性又は光退色性色素標識を含有する可逆的ターミネータヌクレオチドの段階的添加によって達成されるサイクルシーケンシングが非限定的に含まれる。本明細書に記載される方法を活用することができるＩｌｌｕｍｉｎａ機器の例には、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ登録商標、ＮｏｖａＳｅｑ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）及びｉＳｅｑ（商標）商用機器が含まれる。
更なるシーケンシング技術としては、ライゲーションによるシーケンシングが挙げられる。このような技術は、ＤＮＡリガーゼを利用してオリゴヌクレオチドの組み込み、そのようなオリゴヌクレオチドの組み込みを同定する。
更に、ナノポアシーケンシングも、ライブラリ調製に本開示のＲＮＡ枯渇試料を使用することができる。ナノポアシーケンシング法は、細孔を通過する核酸の鎖をシーケンシングし、細孔を通る電流の変化は、どのヌクレオチドが細孔を通過しているのかを表す。
更に、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを使用したシーケンシングが、ＲＮＡ枯渇試料を利用してもよい。
本明細書に記載のＲＮＡ枯渇試料を使用してシーケンシング用のライブラリを作成することができる更なるＳＢＳ技術としては、ヌクレオチドが伸長産物に組み込まれた時に放出されるプロトンの検出が挙げられる。例えば、放出された陽子の検出に基づくシーケンシングでは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（コネチカット州ギルフォード、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器及び関連する技術を使用することができる。
本明細書に記載のＲＮＡ枯渇後の濃縮試料を活用可能な更なるダウンストリームの用途としては、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ分析などが挙げられる。例えば、マイクロアレイ分析は、遺伝子発現研究の有力な技術である。当業者に公知の方法（例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応ＲＴ－ＰＣＲ）に従って、濃縮ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することにより、濃縮試料をマイクロアレイ分析で使用することができる。次いで、ｃＤＮＡを基質上に固定化し、マイクロアレイプローブを適用し、任意の数のマイクロアレイ分析法（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、及びＩｌｌｕｍｉｎａが市販のマイクロアレイ分析システムを市販している）に従って発現解析を行ってもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）又は定量的ＰＣＲ（quantitative PCR：ｑＰＣＲ）はまた、確立された技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）に従って、濃縮試料を基質として利用することもできる。
したがって、本明細書に記載の方法から得られるＲＮＡ枯渇試料は、ダウンストリームの分析方法に利用可能なシーケンシングライブラリ、増幅産物などの作製に使用することができる。本開示の方法は、いかなるダウンストリームの用途によっても限定されない。
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本願の範囲を限定することを意図するものではない。修正は、本出願の精神及び開示の範囲内に含まれ、当業者に明らかであり、理解されるであろう。
実施例１－試料からの不必要なＲＮＡ種の枯渇
この実施例では、トータルＲＮＡが試料中の標的核酸であり、ＲＮＡ枯渇は、１）ハイブリダイゼーション、２）ＲＮａｓｅ Ｈ処理、３）ＤＮａｓｅ処理、及び４）標的ＲＮＡクリーンアップの４つの主要な工程を含む。
ハイブリダイゼーションは、試料中の変性ＲＮＡにＤＮＡプローブセットをアニーリングすることによって達成される。ＲＮＡ試料１０～１００ｎｇを、１μＬの１μＭ／オリゴＤＮＡオリゴプローブセット（表１に列挙される配列番号１～３３３に対応するプローブ）、３μＬの５×ハイブリダイゼーション緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５及び１０００ｍＭのＫＣｌ）、２．５μＬの１００％ホルムアミド、及び総反応物体積１５μＬとするのに十分な水と共に、管内でインキュベートする。ハイブリダイゼーション反応物を９５℃で２分間インキュベートして核酸を変性させ、０．１℃／秒で温度を低下させることによって３７℃までゆっくりと冷却し、３７℃に保持する。反応物が３７℃に達した後は、インキュベーション時間は不要である。変性が３７℃に達するまでに要する合計時間は、約１５分である。
ハイブリダイゼーションに続いて、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖から不要なＲＮＡ種をＲＮａｓｅ Ｈで除去するために、以下の成分：４μＬの５×ＲＮａｓｅ Ｈ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭのＤＴＴ、４０ｍＭのＭｇＣｌ２）及び１μＬのＲＮａｓｅ Ｈ酵素を反応管に添加する。酵素反応物を３７℃で３０分間インキュベートする。反応管を氷上に保持してもよい。
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからのＲＮＡの除去に続いて、ＤＮＡプローブを分解する。２０μＬの反応管に、以下の成分：３μＬの１０×Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５、５０ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＭｇＣｌ２）、１．５μＬのＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び５．５μＬのＨ２Ｏを添加し、合計体積を３０μＬとする。酵素反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて７５℃で１５分間インキュベートする。７５℃でのインキュベーションは、ダウンストリームの処理で使用するために標的トータルＲＮＡを所望の挿入サイズに断片化する役割を果たし得、この例では、標的挿入サイズはトータルＲＮＡの約２００ｎｔである。このインキュベーション工程のタイミングは、当業者に知られているように、後続の反応に必要な挿入サイズに応じて調整することができる。インキュベーションに続いて、反応管を氷上に保持してもよい。
プローブを不必要なＲＮＡにハイブリダイゼーションし、ＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去した後に、試料中の標的トータルＲＮＡを反応条件から単離してもよい。反応管を４℃から取り出し、室温に戻し、６０μＬのＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を加え、反応管を５分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、管を磁石上に５分間置き、その後、上清を静かに除去して廃棄する。磁石上にある間に、トータルＲＮＡが付着したビーズを、１７５μＬの新鮮な８０％ ＥｔＯＨで２回洗浄する。２回目の洗浄後、ビーズをマイクロ遠心分離器でスピンダウンして、管底部にビーズをペレット化し、管を磁石上に戻し、ビーズを乱すことなく可能な限り多くの残留ＥｔＯＨを除去するように注意しながらＥｔＯＨを除去する。ビーズを数分間風乾し、９．５μＬのＥＬＢ緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に再懸濁し、室温で更に数分間静置し、磁石上に戻してビーズを収集する。８．５μＬの上清を新鮮な管に移し、標的トータルＲＮＡからのｃＤＮＡの作成などの更なるダウンストリームの処理のために氷上に配置する。
別の実施例では、９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェル内で、１００ｎｇのトータルＲＮＡを１１μＬのヌクレアーゼを含有しない超純水に希釈する。各ウェルに、ハイブリダイゼーション緩衝液中の４μＬのＤＮＡプローブ（配列番号１～３３３）を加え、ウェル内容物を混合し、必要に応じて遠心分離する。プレートを９５℃で２分間加熱した後、温度が３７℃に達するまで毎秒０．１℃ずつ温度を下げ、次いで３７℃に保持してプローブをハイブリダイズさせる。プレートを２８０×ｇで１０秒間遠心分離する。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを分解するために、緩衝液中の５μＬのＲＮａｓｅを各ウェルに添加し、ウェルの内容物を混合する。プレートを３７℃で１５分間加熱し、次いで４℃に保持する。緩衝液中の１０μＬのＲＮａｓｅを各ウェルに添加し、ウェルの内容物を混合する。プレートを３７℃で１５分間加熱し、次いで４℃に保持する。試料プレートを２８０×ｇで１０秒間遠心分離する。６０μＬのＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰビーズを各ウェルに添加し、ウェル内容物を混合する。プレートを室温で５分間インキュベートする。プレートを、上清が透明になるまで（約５分間）、磁気スタンド上に置く。各ウェルの上清を除去し、廃棄する。ビーズを８０％エタノールで２回洗浄する。各ウェルから残留エタノールを除去し、プレートを磁気スタンド上で１分間風乾した。各ウェルに、１０．５μＬの溶出緩衝液を添加し、ウェル内容物を混合し、プレートを室温で２分間インキュベートする。プレートを密封し、２８０×ｇで１０秒間遠心分離する。プレートを、上清が透明になるまで（約２分間）、磁気スタンド上に置く。各ウェルから、８．５μＬの上清を新しいプレートの対応するウェルに移す。
実施例２－ｃＤＮＡ合成
実施例１からのＲＮＡの更なる処理が、例えばＮＧＳにより配列決定可能なＲＮＡ標的核酸からのライブラリ調製物の作製であってもよい。実施例１からの８．５μＬの最終反応物に、８．５μＬのＥｌｕｔｅ、Ｐｒｉｍｅ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｒａｎｄｏｍ Ｈｅｘａｍｅｒ Ｍｉｘ緩衝液（ＥＰＨ緩衝液、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を添加して、合計体積を１７μＬとする。試料を６５℃で２分間インキュベートして、核酸を変性させる。変性に続いて、反応管を氷上に保持してもよい。第１の鎖の合成を、８μＬの逆転写酵素混合物（９μＬのＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｉｘ（ＦＳＡ、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及び１μＬのＰｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（ＮＥＢ））を変性試料に添加して、合計体積を２５μＬとすることによって実施する。反応混合物を、加熱蓋サーマルサイクラー中で、２５℃で５分間、４２℃で２５分間、７０℃で１５分間の条件下でインキュベートする。第１の鎖合成反応の完了後に、反応管を氷上に保持してもよい。
第２の鎖のｃＤＮＡ合成を、５μＬのＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＳＢ、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及び２０μＬのＳｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｍａｒｋｉｎｇ Ｍｉｘ（ＳＳＭ緩衝液、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を氷冷試料に添加することで実施してもよい。反応管を１６℃で６０分間インキュベートし、次いで試料を氷上に保持してもよい。
ｃＤＮＡ合成工程に続いて、例えば、９０μＬのＳＰＢ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を反応管に添加し、室温で５分間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡをクリーンアップして反応物成分から分離してもよい。インキュベーションに続いて、管を磁石上に約８分間置いて常磁性ビーズを回収し、上清を静かに除去して廃棄する。磁石上にある間に、ビーズを１７５μＬの新鮮な８０％ ＥｔＯＨで２回洗浄する。洗浄に続いて、ビーズを管の底部まで遠心分離し、管を磁石上に戻し、ＥｔＯＨを静かに除去して廃棄する。ビーズを数分間乾燥させ、１８．５μＬのＲＳＢに再懸濁し、十分に混合し、室温で約５分間インキュベートした後、磁石上に戻す。ダウンストリームの用途に応じて、所望の量の精製されたｃＤＮＡを新しい管に移してもよい。この実施例では、１７．５μＬの上清を新しい管に移して氷上に保持することができるように、ダウンストリームのシーケンシング用のライブラリプリップが作製される。
実施例３－次世代シーケンシング用のライブラリ調製
シーケンシング用のライブラリを調製するための１つの方法は、ｃＤＮＡ断片のＡ－ｔａｉｌｉｎｇ、アダプタのライゲーション、標的断片の増幅及び、得られる断片のシーケンシング前の定量化を含む。
実施例２からの精製ｃＤＮＡ １７．５μＬを入れた管を、処理に使用する。精製ｃＤＮＡに１２．５μＬのＡＴＬ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を添加し、断片をＡ－ｔａｉｌｉｎｇする。反応管を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて７０℃で５分間インキュベートし、管を氷上に戻す。２．５μＬのＲＳＢ、２．５μＬのＩｎｄｅｘ Ａｄａｐｔｏｒｓ（ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及び２．５μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を順次添加することによって、アダプタをＡ－ｔａｉｌｉｎｇした試料にライゲーションさせる。反応管を３０℃で１０分間インキュベートした後、５μＬのＳｔｏｐ Ｌｉｇａｔｉｏｎ緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を添加し、反応物を氷上に保持する。
アダプタライゲーション反応完了後に、ライゲーションされた断片を反応物成分から分離する。アダプタライゲーションされた断片を精製するために、３４μＬのＳＰＢを反応管に添加し、これを室温で約５分間インキュベートした。次いで、管を磁石上に配置して常磁性ビーズを捕捉し、ビーズを１７５μＬの８０％ ＥｔＯＨで２回洗浄し、２回目の洗浄後にＥｔＯＨを穏やかに除去した。ビーズを３分間風乾した後、ビーズを５２μＬのＲＳＢに再懸濁し、混合したスラリーを室温で更に５分間静置し、磁石上に戻した。上清（５０μＬ）を、２回目のビーズクリーンアップ用の新しい管に移した。
２回目のビーズクリーンアップでは、４０μＬのＳＰＢを５０μＬの試料に添加し、上記のプロセスを繰り返す。ただし、最終精製断片を２１μＬのＲＳＢに再懸濁し、２０μＬの最終精製試料を、シーケンシング結果の最適化のために標的配列の量を増加させる後続の増幅用の新しい反応管に移す。
２０μＬの精製アダプタライゲーション試料に、５μＬのＰＣＲプライマカクテル（ＰＰＣ、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及び２５μＬのＰＰＭ（ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を添加し、加熱蓋サーマルサイクラー中で、９８℃で３０秒間の増幅プログラムを実施し、続いて、９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の循環プログラムを実施する。増幅サイクル数は、全プロセスの開始時のＲＮＡインプットの量に依存する。例えば、１００ｎｇのＲＮＡの場合は約１２～１３サイクルが適切であってもよく、１０ｎｇの場合は１５～１６サイクル、１ｎｇの場合は１７～１８サイクルが必要であってもよい。増幅サイクル数は、典型的には、当業者に知られているように、任意の調製のために最適化される。
反応管に５０μＬのＳＰＢを添加し、室温でインキュベートし、管を遠心分離してビーズをペレット化し、ビーズを磁気的に捕捉することにより、増幅産物を反応条件から離れて精製してもよい。上清を廃棄し、ビーズを前述のように洗浄した後に、洗浄したビーズを２６μＬのＲＳＢに再懸濁し、磁気ビーズを捕捉して、シーケンシング用のＤＮＡライブラリを含有する上清を新しい管に移してもよい。ライブラリは通常、例えば、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してアリコートを測定すること、及び／又はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でアリコートを実行することによって、シーケンシングの前に定量化及び分析される。当業者であれば、試料中の核酸を定量化可能な多くの方法を理解するであろう。
次いで、得られたライブラリ調製物を、次世代シーケンシング、マイクロアレイ分析、又はその他のダウンストリームの用途に使用してもよい。シーケンシングなどの用途の場合、ライブラリ調製方法は、使用されるシーケンシング機器、及びそのシーケンシング機器用に定められているコンパニオンライブラリ調製方法によって決定される。この実施例では、ライブラリ調製方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング機器でシーケンシングする場合のライブラリ作成に固有の方法である。当業者であれば、ライブラリ調製方法がシーケンシング機器によって異なり得ることを理解するであろう。したがって、これらの実施例は例示的なものに過ぎず、本発明のＲＮＡ枯渇方法は、いかなる特定のライブラリ調製ワークフローにも限定されない。本発明の方法は、不必要なＲＮＡ種を枯渇させたＲＮＡ試料から利益を得るであろう任意のダウンストリームの用途にインプットすることができるＲＮＡ枯渇試料を提供する。
実施例４－微生物トランスクリプトーム分析
この実施例では、微生物単離物、細菌種の混合試料、及び標準的な細胞混合物を、試験のためにＡＴＣＣから得た。
Figure 2022512058000016
トータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｏｗｅｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、完全性について評価し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＲＮＡ電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって定量化してもよい。各試料からの１０～２５０ｎｇのトータルＲＮＡを、ＲｉｂｏＺｅｒｏ法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、製造元のプロトコルに従う）又は不要なｒＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ酵素分解を使用した本明細書に開示の方法のいずれかに従い、ｒＲＮＡの枯渇に使用してもよい。リボ枯渇及び非リボ枯渇ＲＮＡ（対照）試料を、製造元の指示に従い、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ試料プレップキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、シーケンシング用に調製してもよい。ライブラリを、例えばＭｉＳｅｑ又はＮｅｘｔＳｅｑシーケンシング機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で２×７６対のエンドリード用にプールし、配列決定してもよい。
配列のフィルタリング、アライメント及び転写産物カバレッジを、例えば、オンラインのＢａｓｅＳｐａｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｈｕｂ（ＢＳＳＨ）と、例えば、１）Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｒＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ａｐｐ（ｒＲＮＡ配列を解析して大量の分析配列を示す）、２）ＲＮＡ Ｃｕｓｔｏｍ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｕｉｌｄｅｒ Ａｐｐ（ＳＴＡＲ互換性の微生物トランスクリプトームを作成する）、及び３）ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｐｐ（ＳＴＡＲ互換性及びｓａｌｍｏｎ転写産物の定量化）などの例示的なワークフローとを使用して実行してもよい。微生物試料内の複数の株からのｒＲＮＡを定量化するために、ｒＲＮＡ配列をＮＣＢＩ注釈付きゲノムから取得し、ＢＳＳＨワークフローへのインプットとして使用してもよい。
微生物単離物、微生物混合物及び対照試料のトランスクリプトームを配列決定し、ｒＲＮＡリードの割合を比較した。本明細書に開示するＲＮａｓｅ Ｈ酵素法は、試験対象の種において不必要なｒＲＮＡを枯渇させるのに非常に効果的であった（５％未満のｒＲＮＡリード）。リボソームＲＮＡ枯渇は、ＲＮａｓｅ Ｈ法を使用した大腸菌低インプット試料（１０ｎｇ）で最も有意であり、既存のＲｉｂｏＺｅｒｏ法との比較では、平均ｒＲＮＡリードはそれぞれ、０．５％未満対１３％であった（図５）。
データを、ＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇法を使用した場合の生物学的に重要なＲＮＡリードの濃縮を、ｒＲＮＡ枯渇のない場合と比較して評価するために使用した。図６は、一般に、ｒＲＮＡ枯渇を行わなかった場合と比較して、ライブラリ調製及びシーケンシングの前にＲＮａｓｅ Ｈ法を使用して試料からｒＲＮＡを枯渇させた場合、リード深度の２０～５０×の減少が枯草菌又は大腸菌試料で観察されたという評価結果を示している。
収集したデータを評価して、実験での微生物トランスクリプトームシーケンシングの再現性を判定した。例示的なシステムとして、大腸菌及び枯草菌のＲＮａｓｅ ＨによりｒＲＮＡを枯渇させた複製間での遺伝子発現レベルのペアワイズ線形回帰を求めた。高い相関性（Ｒ２＞０．９９）は、ＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇法が試料からｒＲＮＡを再現可能に除去する能力を示している（図７）。
ＲＮａｓｅ Ｈ酵素ｒＲＮＡ枯渇法が混合試料のｒＲＮＡ枯渇に有用であり得るかどうかを評価するために、図８に、２０株ＭＳＡ２００２及びヒト腸ＭＳＡ２００６の混合試料のトリプリケートでの例示的なデータを示す。ＭＳＡ２００２からの１０ｍｇのトータルＲＮＡ又はＭＳＡ２００６からの８０ｎｇのトータルＲＮＡの低インプット試料を、ｒＲＮＡ枯渇法に使用した。２０株ＭＳＡ２００２試料では、ＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇法は、非枯渇試料と比較してｒＲＮＡリードを８３％減少させ、配列リードのうちの２％未満としたが、ＲｉｂｏＺｅｒｏ ｒＲＮＡ枯渇法は、より不安定でより高いｒＲＮＡ存在量をもたらした。１２株ＭＳＡ２００６試料でも同様に、ＲＮａｓｅ Ｈ法は、非枯渇試料と比較して、ｒＲＮＡリードを約９５％減少させ、シーケンシングリードのうちの１３％未満としたが、ＲｉｂｏＺｅｒｏ法で得られた結果はより不安定であった。
したがって、ＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇法は、試料を評価するための実験において、試料が混合飼料であるか否かにかかわらず、高品質の微生物全トランスクリプトーム研究用の試料中の不必要なｒＲＮＡを低減するための堅牢かつ有効なワークフローを提供することが分かった。ＲＮａｓｅ Ｈ ｒＲＮＡ枯渇法はまた、低インプット試料の場合にも非常に効果的であり、適合性があった。
実施例５－ＲＮＡ枯渇に対するホルムアミドの影響
図２は、ＲＮＡ試料から不必要なＲＮＡ種を枯渇させた例示的なデータを示す。本明細書に記載の方法を使用して、ＲＮＡ試料から不必要なＲＮＡを枯渇させ、不必要なＲＮＡ枯渇に対するホルムアミド濃度の影響を評価した。この例では、ＤＮＡプローブは、グラム陽性細菌（２３Ｓ、１６Ｓ、５Ｓ）、グラム陰性細菌（２３Ｓ、１６Ｓ、５Ｓ）、ヒトミトコンドリア（１６Ｓ、１２Ｓ）、ヒトｒＲＮＡ（２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ）、ヒトヘモグロビンｍＲＮＡ（ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２）由来の不必要なｒＲＮＡ種を枯渇の対象とし、一方、標的ＲＮＡ種は枯草菌由来のトータルＲＮＡであった。ホルムアミドの濃度が増加すると、不必要なＲＮＡ種のリードの割合が大幅に減少した。例えば、ＲＮＡ枯渇中にホルムアミドを添加しなかった場合、グラム陽性２３Ｓ及び１６Ｓ並びに、大腸菌特異的配列を含むグラム陰性（大腸菌を含む）細菌２３Ｓ及び１６ＳのオフターゲットＲＮＡリードが発生した。ハイブリダイゼーション反応物に２５％のホルムアミドを添加すると、グラム陰性２３Ｓ及び１６Ｓのオフターゲットリードは検出不可能となり（大腸菌特異的オフターゲットリードが有意に減少し）、グラム陽性２３Ｓ及び１６Ｓのオフターゲットリードも有意に減少した。ハイブリダイゼーション反応物に４５％のホルムアミドを添加することで、グラム陽性の望ましくないｒＲＮＡ ２３Ｓ及び１６Ｓのオフターゲットリードが更に有意に減少し、オフターゲット大腸菌のリードも更に減少した。したがって、ＲＮＡ枯渇ハイブリダイゼーション反応物へのホルムアミドの添加は、グラム陽性及びグラム陰性の望ましくないＲＮＡの量を、それらの種に対するオフターゲットリードの減少によって証明されるように増加させることが示された。一般に、ホルムアミドの添加は、不必要なｒＲＮＡ転写産物の枯渇を改善することが見出されている。分析の標的ＲＮＡとして枯草菌ＲＮＡを使用する場合、例えば、大腸菌及びヒトのｒＲＮＡ配列のアッセイにより、汚染の危険性への対策を図ることが可能である。
実施例６－インプット出発物質の変化
ＲＮＡ枯渇及びその後のダウンストリームの分析に対するインプット出発物質の影響を確認するために、図３に示すように、ヒト脳（ＨＢＲ）及びユニバーサルヒトＲＮＡ（ＵＨＲ）由来のＲＮＡ枯渇試料及びＲＮＡ濃縮試料を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）５００又は５５０シーケンシング機器でのシーケンシング用のライブラリを作成する実験を実施した。１００ｎｇ、１０ｎｇ又は１ｎｇのインプット試料を使用したＲＮＡ枯渇に続いて、実施例１～３に例示されるようにシーケンシングライブラリを調製した。シーケンシングを、２つのＢａｓｅＳｐａｃｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）アプリケーション、ＲＮＡＳｅｑ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔアプリケーション、及びＲＮＡＥｘｐｒｅｓｓアプリケーションを使用したデータ分析に続いて、ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）ユーザガイドの推奨に従って実施した。枯草菌及び大腸菌の存在についても、修正されたツールＦａｓｔｑｓｃｒｅｅｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑ＿ｓｃｒｅｅｎ／）を使用してデータ分析を実施した。データは、ＲＮＡ試料のインプット量にかかわらず、ＲＮＡの枯渇がＨＢＲ及びＵＨＲの両方で一定のままであることを示し、標的ＲＮＡの総アライメントの割合は、インプット量の減少と共に減少するものの、１ｎｇのインプット試料を使用しても実用的かつ有用な配列データを収集可能であることを示している。更に、比較実験では、本開示のＲＮＡ枯渇法は、ＲＮＡ枯渇用のＲｉｂｏＺｅｒｏ ｒＲＮＡ枯渇キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用した場合のデータ（１００ｎｇで最大３％、２５ｎｇで最大５％、１０ｎｇで最大８％、及び１ｎｇで最大３５％）又はＮＥＢＮｅｘｔ ｒＲＮＡ枯渇方法（ＮＥＢ）（１００ｎで最大８％、２５ｎｇで最大８％、１０ｎｇで最大９％、及び１ｎｇで最大３０％）と比較して、全インプットレベルで非標的リードの存在量が少なかった（１００ｎｇで最大３％、２５ｎｇで最大４％、１０ｎｇで最大３％、及び１ｎｇで最大３％）。
実施例７－マウス及びラットのＲＮＡ試料からのＲＮＡ枯渇
ＲＮＡ枯渇法が非ヒトＲＮＡ試料に有用であり得ることを実証するために、マウスＲＮＡ試料及びラットＲＮＡ試料の両方をＲＮＡ枯渇法に使用した。図４では、マウスＲＮＡ試料又はラットＲＮＡ試料のいずれかから、ヒトＲＮＡ試料の場合と同等の方法及びＤＮＡプローブを使用して、不必要なＲＮＡを枯渇させた。この場合にも、ハイブリダイゼーション反応物中のホルムアミドを、げっ歯類種毎に、ホルムアミドなし、２５％ホルムアミド、又は４５％ホルムアミドの間で変化させた。アライメントされたリードの割合の合計はホルムアミドの増加による影響を受けない一方、非標的リードの検出はホルムアミドの増加に伴って増加する傾向があり得る。したがって、ハイブリダイゼーション反応物へのホルムアミドの添加は、そのような添加を最適化することで一部の転写産物の検出を改善できることから、一部の試料タイプでは有用であり得る。
実施例８－補足用マウスプローブの調製
不必要な配列（配列番号１～３３３）の酵素除去のための上記の３３３ＤＮＡプローブプール内に、真核細胞ｒＲＮＡ枯渇用のＤＮＡオリゴヌクレオチドを、主要なヒトｒＲＮＡ転写産物、すなわち５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ及び２８Ｓ、並びに２つのミトコンドリアｒＲＮＡ配列１２Ｓ及び１６Ｓに基づいて設計した。ヒトのトータルＲＮＡについて試験した場合には、この３３３ＤＮＡプローブプールは、ｒＲＮＡリードを除去するのに非常に効果的であった。しかしながら、マウス（ハツカネズミ）又はラット（ドブネズミ）のトータルＲＮＡ試料で試験した場合には、枯渇はそれほど堅牢ではなく、このことは、これらのマウス及びラットの領域がヒト配列とは異なるために、プローブが十分にハイブリダイズせず、げっ歯類ｒＲＮＡ配列の一部の領域を効率的に除去しなかったことを示唆している。
３３３ＤＮＡプローブ実験から得られた全シーケンシングリードを含むｆａｓｔｑファイルを、マウス及びラットのリボソームＲＮＡ配列及び３３３ＤＮＡプローブ配列にアライメントした。アライメント結果は、全てのリボソームＲＮＡ配列にわたるプローブカバレッジが一般的に良好であることを示したが、プローブ配列がげっ歯類ｒＲＮＡにはそれほど良好にアライメントしなかったいくつかの領域が存在した。より具体的には、プローブプールマップにアライメントしなかったマウス及びラットのｒＲＮＡリードの大部分は、２８Ｓ又は１６Ｓのげっ歯類ｒＲＮＡ転写産物のいずれかに属するものであった（表２）。アライメントを、デフォルト設定のバージョン２．１．０のＢｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２，９：３５７－３５９を参照されたい）で実施した。３３３ＤＮＡプローブ酵素法で枯渇しなかったリボソームＲＮＡの大部分は、プローブアライメントを行わなかった同じ領域に由来するものであった（図９）。
Figure 2022512058000017
これらの領域をより効果的に枯渇させるために、更なるプローブを、マウス及びラットのリボソームＲＮＡ配列について上記で特定された領域をカバーするように設計した。更なるプローブの数及びプローブの冗長性を最小限に抑えるために、マウスｒＲＮＡ配列のギャップに対して更なるプローブを設計し、次いでこれらのデータを、３３３ＤＮＡプローブセットと共に情報としてプールして、混合プールをラットｒＲＮＡ転写産物にアライメントすることにより、ラットｒＲＮＡのカバレッジ内の残りのギャップを特定した。この連続プロセスにより、合計４４個の更なるオリゴヌクレオチドプローブが得られ、３７７プローブの補足用プールが提供された。上記のようなシーケンシング実験を、３７７ＤＮＡプローブセットを使用して繰り返した。マウス試料及びラット試料の両方で４４個の新たなプローブを添加することにより、３３３ＤＮＡプローブセットと比較してライブラリからのｒＲＮＡリードの割合が減少し、枯渇効率が増加したことが示された（表３）。
Figure 2022512058000018
特定のげっ歯類の配列に対する更なるプローブで３３３ＤＮＡプローブプールを補足することにより、試験対象のげっ歯類試料におけるｒＲＮＡ枯渇が改善された。マウス１６Ｓに対する例示的なプローブとしては、配列番号３８５～３９３が挙げられる。マウス２８Ｓに対する例示的なプローブとしては、配列番号４００～４１９が挙げられる。ラット１６Ｓに対する例示的なプローブとしては、配列番号３９４～３９９が挙げられる。ラット２８Ｓに対する例示的なプローブとしては、配列番号４２０～４２８が挙げられる。

Claims (50)

  1. 核酸試料からオフターゲットＲＮＡ分子を枯渇させるための方法であって、
    ａ）少なくとも１つの標的ＲＮＡ又はＤＮＡ配列と、少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子とを含む核酸試料を、前記少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って不連続な配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと接触させることにより、前記ＤＮＡプローブを前記オフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成することであって、各ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、所与のオフターゲットＲＮＡ分子配列に沿って、任意の他のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドから少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れていることと、
    ｂ）前記ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、前記ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドから前記ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼと接触させることにより、前記核酸試料中の前記オフターゲットＲＮＡ分子を分解して、分解混合物を形成することと、
    を含む、方法。
  2. ｃ）前記分解混合物をＤＮＡ消化酵素と接触させることにより、任意選択的に残りのＤＮＡプローブを分解して、ＤＮＡ分解混合物を形成することであって、任意選択的に、前記ＤＮＡ消化酵素がＤＮａｓｅ Ｉであることと、ｄ）前記分解されたＲＮＡを前記分解混合物又は前記ＤＮＡ分解混合物から分離することと、を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記プローブセットとの前記接触は、前記核酸試料を不安定化剤で処理することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記不安定化剤は、熱又は核酸不安定化化学物質であり、任意選択的に、前記核酸不安定化化学物質は、ベタイン、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、グリセロール、又はこれらの誘導体、又はこれらの混合物である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記核酸不安定化化学物質はホルムアミドであり、任意選択的に、前記ホルムアミドは、前記プローブセットとの前記接触の間、約１０～４５体積％の濃度で存在する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記試料を熱で処理することは、前記少なくとも１つのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度よりも高い熱を加えることを含む、請求項４に記載の方法。
  7. 前記リボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ Ｈ又はＨｙｂｒｉｄａｓｅである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記核酸試料は、ヒト由来又は非ヒト霊長類由来である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記核酸試料は、ラット由来又はマウス由来である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記核酸試料は、非ヒト起源の核酸を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記非ヒト起源の核酸は、非ヒト真核生物、細菌、ウイルス、植物、土壌、又はこれらの混合物由来である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記オフターゲットＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はこれらの混合物である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記オフターゲットＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びグロビンｍＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記プローブセットは、２８Ｓ、２３Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ、１２Ｓ、ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＢ－Ｂ１、ＨＢＢ－Ｂ２、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２から選択される少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記プローブセットは、ヒト由来の２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ及び１２Ｓから選択される２つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記プローブセットは、ヘモグロビン由来のＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２並びにグラム陽性又はグラム陰性細菌由来の２３Ｓ、１６Ｓ及び５Ｓから選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記プローブセットは、古細菌種由来の１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記プローブセットは、ラット由来及び／又はマウス由来の、ラット１６Ｓ、ラット２８Ｓ、マウス１６Ｓ及びマウス２８Ｓ、並びにこれらの組み合わせから任意に選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 特定のオフターゲットＲＮＡ分子に対するプローブが、前記オフターゲットＲＮＡ分子の前記配列の約８０～８５％に相補的であり、各プローブハイブリダイゼーション部位間に少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基のギャップを有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ＤＮＡプローブは、
    （ａ）配列番号１～３３３から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３３３配列、又は、
    （ｂ）配列番号１～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は４００以上、又は４２８配列、又は、
    （ｃ）配列番号１～３７７から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３７７配列、又は、
    （ｄ）配列番号１～３３３及び配列番号３７８～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３８４配列、又は、
    （ｅ）配列番号３３４～３７７から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は４４配列、又は、
    （ｆ）配列番号３７８～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は５１配列、
    あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  21. 核酸試料中の少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れた不連続な配列と相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解可能なリボヌクレアーゼと、を含む、組成物。
  22. 前記リボヌクレアーゼがＲＮａｓｅ Ｈである、請求項１９に記載の組成物。
  23. 各ＤＮＡプローブは、前記プローブセット内の任意の他のＤＮＡプローブから、前記少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って少なくとも１０塩基離れてハイブリダイズされている、請求項２１又は２２に記載の組成物。
  24. 前記組成物が不安定化化学物質を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記不安定化化学物質がホルムアミドである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記オフターゲットＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はこれらの混合物である、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記オフターゲットＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びグロビンｍＲＮＡである、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記プローブセットは、２８Ｓ、２３Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ、１２Ｓ、ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２から選択される少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記プローブセットは、ヒト由来の２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ及び１２Ｓから選択される２つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記プローブセットは、ヘモグロビン由来のＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２並びにグラム陽性又はグラム陰性細菌由来の２３Ｓ、１６Ｓ及び５Ｓから選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 前記プローブセットは、古細菌種由来の１つ以上のｒＲＮＡ分子と相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記プローブセットは、ラット由来及び／又はマウス由来の、ラット１６Ｓ、ラット２８Ｓ、マウス１６Ｓ及びマウス２８Ｓ、並びにこれらの組み合わせから任意に選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを含む、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記ＤＮＡプローブは、
    （ａ）配列番号１～３３３から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３３３配列、又は、
    （ｂ）配列番号１～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は４００以上、又は４２８配列、又は、
    （ｃ）配列番号１～３７７から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３７７配列、又は、
    （ｄ）配列番号１～３３３及び配列番号３７８～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３８４配列、又は、
    （ｅ）配列番号３３４～３７７から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は４４配列、又は、
    （ｆ）配列番号３７８～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は５１配列、
    あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 核酸試料中の少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れた不連続な配列と相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解可能なリボヌクレアーゼと、を備える、キット。
  35. 緩衝液及び核酸精製培地を備え、任意選択的に不安定化化学物質を備える、請求項３４に記載のキット。
  36. 前記オフターゲットＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はこれらの混合物である、請求項３４又は３５に記載のキット。
  37. 前記オフターゲットＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びグロビンｍＲＮＡである、請求項３６に記載のキット。
  38. 前記プローブセットは、２８Ｓ、２３Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ、１２Ｓ、ＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２から選択される少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載のキット。
  39. 前記プローブセットは、ヒト由来の２８Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ、５Ｓ、１６Ｓ及び１２Ｓから選択される２つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項３８に記載のキット。
  40. 前記プローブセットは、ヘモグロビン由来のＨＢＡ－Ａ１、ＨＢＡ－Ａ２、ＨＢＢ、ＨＢＧ１及びＨＢＧ２並びにグラム陽性又はグラム陰性細菌由来の２３Ｓ、１６Ｓ及び５Ｓから選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズする少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載のキット。
  41. 前記プローブセットは、古細菌種由来の１つ以上のｒＲＮＡ分子と相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含む、請求項３４～４０のいずれか一項に記載のキット。
  42. 前記プローブセットは、ラット由来及び／又はマウス由来の、ラット１６Ｓ、ラット２８Ｓ、マウス１６Ｓ及びマウス２８Ｓ、並びにこれらの組み合わせから任意に選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを含む、請求項３４～４１のいずれか一項に記載のキット。
  43. 前記ＤＮＡプローブは、
    （ａ）配列番号１～３３３から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３３３配列、又は、
    （ｂ）配列番号１～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は４００以上、又は４２８配列、又は、
    （ｃ）配列番号１～３７７から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３７７配列、又は、
    （ｄ）配列番号１～３３３及び配列番号３７８～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は１００以上、又は１５０以上、又は２００以上、又は２５０以上、又は３００以上、又は３５０以上、又は３８４配列、又は、
    （ｅ）配列番号３３４～３７７から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は４４配列、又は、
    （ｆ）配列番号３７８～４２８から選択される２つ以上、又は５つ以上、又は１０以上、又は２５以上、又は５０以上、又は５１配列、
    あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項３４～４２のいずれか一項に記載のキット。
  44. （１）配列番号１～３３３を含むプローブセットと、
    （２）リボヌクレアーゼであって、任意選択的に、前記リボヌクレアーゼがＲＮａｓｅ Ｈである、リボヌクレアーゼと、
    （３）ＤＮａｓｅと、
    （４）ＲＮＡ精製ビーズと、を備え、
    任意選択的に、ＲＮＡ枯渇緩衝液と、プローブ枯渇緩衝液と、プローブ除去緩衝液と、を更に備える、
    請求項３４に記載のキット。
  45. 核酸試料からオフターゲットＲＮＡ核酸分子を枯渇させる際に使用するためのプローブセットを補足する方法であって、
    ａ）少なくとも１つのＲＮＡ又はＤＮＡ標的配列と、第１の種に由来する少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子とを含む核酸試料を、第２の種に由来する前記少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って不連続な配列に相補的な少なくとも２つのＤＮＡプローブを含むプローブセットと接触させることにより、前記ＤＮＡプローブを前記オフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成することであって、各ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、所与のオフターゲットＲＮＡ分子配列に沿って、任意の他のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドから少なくとも５塩基、又は少なくとも１０塩基離れていることと、
    ｂ）前記ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、前記ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドからＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼと接触させることにより、前記核酸試料中の前記オフターゲットＲＮＡ分子を分解して、分解混合物を形成することと、
    ｃ）前記分解されたＲＮＡを前記分解混合物から分離することと、
    ｄ）前記試料の残りのＲＮＡをシーケンシングすることと、
    ｅ）前記残りのＲＮＡ配列を、前記第１の種に由来するオフターゲットＲＮＡ分子の存在について評価することにより、複数のギャップ配列領域を決定することと、
    ｆ）前記プローブセットを、前記複数のギャップ配列領域のうちの１つ以上の不連続な配列と相補的な更なるＤＮＡプローブで補足することと、
    を含む、方法。
  46. 前記複数のギャップ配列領域が５０以上の塩基対を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記第１の種は非ヒト種であり、前記第２の種はヒトである、請求項４５又は４６に記載の方法。
  48. 前記第１の種がラット又はマウスである、請求項４７に記載の方法。
  49. 請求項２１から３３のいずれか一項に記載の組成物が、前記リボヌクレアーゼ及び、ヒトの前記少なくとも１つのオフターゲットＲＮＡ分子の全長に沿って不連続な配列と相補的なＤＮＡプローブを含む前記プローブセットを提供するために使用される、請求項４７又は４８に記載の方法。
  50. 前記方法が、ラット由来及び／又はマウス由来の、ラット１６Ｓ、ラット２８Ｓ、マウス１６Ｓ及びマウス２８Ｓ、並びにこれらの組み合わせから任意に選択される１つ以上のオフターゲットＲＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを同定するために使用される、請求項４８又は４９に記載の方法。
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