JP2022511203A - 標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出方法及びキット - Google Patents

標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出方法及びキット Download PDF

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Abstract

本発明は、標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出方法及びキットを開示する。この方法は、複合サンプルにおけるマーカー標的に対する検出方法であり、特異的標的のアプタマー群を標的に結合し、標的マーカーシグナルを核酸シグナルに変換し、多重リアルタイム定量ＰＣＲを用いて動的定量検出を行う方法である。該キットは、捕捉磁気ビーズ試薬、ブロッキング液、検出試薬、洗浄液及びリアルタイム定量ＰＣＲ反応液を含み、該捕捉磁気ビーズ試薬に粒径が５～５０００ｎｍの捕捉磁気ビーズが溶解し、該ブロッキング液は、タンパク質ブロッキング液であり、該検出試薬に腫瘍及び非腫瘍血清特異的アプタマー群が溶解し、該リアルタイム定量ＰＣＲ反応液は、プライマーと、アプタマーに対する蛍光プローブとを含む。該方法は、迅速で、感度が高く、特異性が高く、複数のリガンドを同時に検出するなどの利点を有する。

Description

本発明は、生物医学検出の分野に関し、具体的には、標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出方法及びキットに関する。
ＳＥＬＥＸ技術の発展に伴い、アプタマーは、特異性が高く、適用範囲が広く、修飾しやすい新規なリガンド分子として、疾患の検出と治療、薬物のスクリーニングと応用、食品と環境安全のモニタリング、生物学的検出などに適用されている。
核酸ビーコンリガンドは、アプタマーから誘導された新たな検出分子であり、そのアプタマーの５’末端に蛍光標識プローブ付きの二重鎖ヌクレオチド配列と特異的標的分子が既知であるアプタマーとを連結して調製されたものであり、アプタマーの識別能力を有すると共に、シグナル蓄積、伝達、増幅機能を有しており、構築しやすく、特異性が高く、感度が高く、使用範囲が広い新規な検出分子である。しかしながら、核酸ビーコンリガンドについては、ビーコン配列が追加されるため、アプタマーの核酸分子配列が変化してしまい、分子空間構造及びアプタマーとリガンドの結合力に影響を与えるため、アプタマーの構造を変化させずにリアルタイム定量ＰＣＲで検出することができれば、より便利で実用的になる。
磁気ビーズは、新規な多機能材料として、優れた生体適合性と表面官能基特性を有するためアプタマー検出のための理想的な担体であり、食品、医学、環境及び生体分離などの分野でも広く応用されている。
血清は、臨床作業において最も入手しやすいサンプルであり、また大量の生体機能情報を提供することができる。生体内にはほとんど全ての細胞が直接又は間接的に血液と接触しているため、いずれの疾患でも血清タンパク質に跡が残り、何らかの特徴的な変化をもたらす可能性がある。
従来のタンパク質の検出には、多くの場合、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用い、抗体と血清中の抗原結合を捕捉し、さらに結合酵素が連結された検出抗体を加えて、捕捉抗体－抗原－検出抗体のような「サンドイッチ」複合物を形成し、最後に結合酵素の活性を検出して検出結果を表示するが、検出範囲は、捕捉抗体と抗原との反応Ｋｄ値によって制限され、感度が低い。
核酸ビーコンリガンド検出技術は、現在、２つの具体的な方法がある。その１つは、核酸ビーコンリガンド媒介による免疫－ＰＣＲ検出であり、その過程はＥＬＩＳＡ法と類似しているが、抗原を検出するのは捕捉抗体に対応する酵素標識二次抗体ではなく、特異的な核酸ビーコンリガンドと捕捉抗体との複合物であり、リアルタイム定量ＰＣＲで検出して完了するという点で相違し、もう１つは、核酸ビーコンリガンド媒介によるＰＣＲ検出法であり、この方法では、標的分子に対応する核酸ビーコンリガンドを検出分子として標的分子に結合させ、さらに溶出させて分離した後、リアルタイム定量ＰＣＲで検出する。これら２つの方法は、いずれも核酸ビーコンリガンド分子によりまず標的分子を特異的に識別し、さらにシグナルを伝達し、最後にリアルタイム定量ＰＣＲにより信号増幅機能を完了して標的分子の検出を実現する。核酸ビーコンリガンド法による標的分子の検出は、迅速で、感度が高く、特異性が高いなどの利点を有する。
アプタマー媒介によるリアルタイム定量－ＰＣＲ検出技術は、核酸ビーコンリガンド検出技術の改良型であり、核酸ビーコンリガンドは、アプタマー配列の両端に１本の二重鎖ビーコン配列を加えて得られるものであり、アプタマーを標的分子に結合することによりシグナルをアプタマーを介してビーコン配列に伝達し、さらにリアルタイム定量－ＰＣＲによりビーコンを検出することにより、標的分子の検出を間接的に実現することを目的とする。しかしながら、実施の過程では、アプタマーの標的分子に対する作用は、多くの場合、一本鎖により単独で完了するものではなく、数本の鎖が協同作用して完了するものであり、またビーコン二重鎖もアプタマーの空間構造に影響を与えるため、ビーコン配列はアプタマー構造に影響を与えるだけでなく、同様にアプタマー間の相乗作用にも影響を与えるため、アプタマーと標的分子との結合及び検出結果に影響を与えることが見出された。そのため、この欠点を克服するために、検出技術を改善する必要がある。
従来技術における上記欠点を克服するために、本発明は、標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出方法及びキットを提供する。本発明は、以下の技術的手段により実現される。標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キットは、捕捉磁気ビーズ試薬、ブロッキング液、検出試薬、洗浄液及びリアルタイム定量ＰＣＲ反応液を含み、
前記捕捉磁気ビーズ試薬に粒径が５～５０００ｎｍの捕捉磁気ビーズが溶解し、
前記ブロッキング液は、タンパク質ブロッキング液であり、
前記検出試薬に腫瘍及び非腫瘍血清特異的アプタマー群が溶解し、
前記リアルタイム定量ＰＣＲ反応液は、プライマーと、アプタマーに対する蛍光プローブとを含む。
上記捕捉磁気ビーズ試薬は、具体的には、５ｍＬのｐＨ７．４の０．０１ＭのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒとして選択することができ、その中に粒子径５～５０００ｎｍの５０％の捕捉磁気ビーズ微粒子が溶解し、上記検出試薬には、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）、肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）などの腫瘍血清特異的アプタマー群及び非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）血清特異的アプタマーが溶解し、前記検出試薬内の各アプタマーは、１０９分子コピー数の０．１×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ混合液であり、上記洗浄液は、具体的には、１０ｍＬのｐＨ７．４の０．０１ＭのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．１７％のＴｗｅｅｎを含む）として選択することができる第１の洗浄液と、具体的には、クエン酸、塩化ナトリウムが溶解した１０ｍＬの３×ＳＳＣとして選択することができる第２の洗浄液とを含み、上記リアルタイム定量ＰＣＲ反応液は、具体的には、１対のプライマー及び異なる発光波長アプタマー蛍光プローブを含むＰＣＲシステムとして選択することができる。
好ましくは、前記腫瘍及び非腫瘍血清特異的アプタマー群は、いずれも双方向熱サイクル減算ＳＥＬＥＸ技術でスクリーニングして得られる。具体的には、胃癌、肝臓癌及び肺癌血清（それぞれ１０例以上の血清混合液）と非腫瘍血清（１０例以上の血清混合液）とをそれぞれ互いに減算標的にして双方向（又は多方向）減算ＳＥＬＥＸ技術でスクリーニングを行って得られた胃癌、肝臓癌及び肺癌血清特異的アプタマー群、及び非腫瘍血清特異的アプタマー群として選択することができる。検出試薬における各血清特異的アプタマーの含量は、１０６～１０９分子コピー数であることが好ましい。
好ましくは、前記腫瘍及び非腫瘍血清特異的アプタマー群におけるアプタマーは前記蛍光プローブと１つずつ対応する。即ち、蛍光プローブは、各アプタマー配列に対して１対１の対応で設計された蛍光プローブである。具体的には、蛍光プローブは、ＭＧＢプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ及び分子ビーコンなどの少なくとも１種を含み、長さが５～２５ｂｐの配列を有することが好ましく、配列の３’末端及び５’末端にそれぞれ蛍光基と消光基（蛍光基はＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴを含み、消光基はＴＡＭＲＡ、ＢＨＱなどの蛍光消光材料を含む）で標識されており、リアルタイム定量ＰＣＲ検出を補助することができる。
好ましくは、前記捕捉磁気ビーズの表面には、標的分子とカップリング可能な官能基又は捕捉分子を有し、前記官能基は、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基及びＮＨＳのうちの少なくとも１種を含み、化学結合により標的分子をカップリングする。前記捕捉分子は、抗原、抗体、親和性タンパク質及びアプタマーなどのうちの１種以上であり、標的分子と特異的に結合し、官能基により磁気ビーズの表面に結合し、免疫結合、タンパク質リガンド結合及びアプタマー結合などの方法により標的分子と結合することができ、前記標的分子は、核酸、タンパク質、脂質、アミノ酸及びその他の生体分子のうちの少なくとも１種以上を含む。
好ましくは、前記プライマーは、プローブがアプタマー配列上の５～２５個の塩基配列であり、配列の３’及び５’末端に消光基及び蛍光基を有するアプタマープライマーである。
好ましくは、前記ブロッキング液は、脱脂粉乳及びカゼイン、又はウシ血清アルブミンを含む。
本発明は、上記キットを用いて標的－腫瘍血清アプタマー複合物検出を行う方法を提供し、この方法は、以下のステップ１）～６）を含む。
ステップ１）では、検出対象サンプルを準備する。即ち、血液から血球及び血中脂質を除去し、分離して血清を得る。
ステップ２）では、検出用標的分子を捕捉する。即ち、捕捉磁気ビーズ試薬と検出対象サンプルとを混合し、３７℃で１ｈインキュベートし、磁気ビーズ－標的分子複合物を形成し（例えば、非特異的に結合する場合に、ブロッキング液で３７℃で１時間ブロッキングする必要がある）、第１の洗浄液で３回洗浄し、３分間／回とし、磁気分離し、磁気ビーズを採取する。
ステップ３）では、ビーコンリガンドと結合させる。即ち、検出試薬を９５℃で５ｍｉｎ加熱し、氷水に入れて５ｍｉｎ急冷し、磁気ビーズに加えて３７℃で１時間結合させ、磁気分離し、上清液を捨てる。
ステップ４）では、洗浄する。即ち、０．５ｍｌの第２の洗浄液を加え、１回洗浄し、３分間／回とし、磁気分離し、さらに０．５ｍｌの第１の洗浄液を加え、３回洗浄し、３分間／回とし、磁気分離して、磁気ビーズを採取する。
ステップ５）では、リガンドを抽出する。即ち、磁気ビーズに１５μＬの１×ＰＣＲ緩衝液を加え、９５℃で５分間加熱し、磁気分離し、上清液を採取する。
ステップ６）では、リガンドを検出する。即ち、ステップ５）に記載の２μＬの上清液を吸い取って１８μＬのリアルタイム定量ＰＣＲ反応液に加え、ＰＣＲを行い、データを収集して処理する（又は遺伝子配列決定法で多標的アプタマーの定性定量を完了する）。
上記ステップ１）は、静脈穿刺法で血液を採取して抗凝固剤を含む試験管に入れ、直ちに軽く振って血液と抗凝固剤とを均一に混合し、その後、３０００回転で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を収集して－８０℃で３０ｍｉｎ凍結した後、１２０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、血中脂質を除去し、分離して検出対象血清を得る（又はそれぞれ水：アセトニトリル：血清＝２：０．５：１の割合で混合処理し、５０００ｒ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ低温遠心分離し、上清液を吸い取り、豊富なタンパク質を除去する）ように行うことができる。
上記ステップ６）は、必要に応じて、多重リアルタイム定量－ＰＣＲ検出、マルチライブラリースクリーニングマルチプライマー検出、遺伝子配列決定などの方法で捕捉磁気ビーズに特異的に結合したアプタマー又はアプタマー群を検出することが好ましい。多重リアルタイム定量ＰＣＲ（遺伝子配列決定など）によりアプタマー群を検出して、特異的マーカー群に対する定性定量検出を実現することができる。
アプタマーに対するリアルタイム定量－ＰＣＲ検出法は、アプタマーに任意の配列を追加する必要がなく、アプタマーの空間構造を変えることなく、リアルタイム定量－ＰＣＲでプローブ配列がアプタマー配列上の５～２５個の塩基配列であることだけを検出する。このように、アプタマー構造、アプタマー及びリガンドの結合力を変更する必要がなく、検出感度を向上させることができる。
本発明の利点は以下のとおりである。
１、本発明の検出キットは、標的複合物に対する検出に用いられ、特異的アプタマー群を血清特異的標的に結合させ、標的血清マーカー複合物のタンパク質シグナルを核酸シグナルに変換すれば、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて動的定量検出を行うことができる。この検出方法は、様々な標的分子のシグナルをアプタマーにより核酸シグナルに変換することができ、迅速で、感度が高く、特異性が高く、複数のリガンドを同時に検出するなどの利点を有する。
２、本発明は、磁気ビーズを担体として標的分子を付着させ、検出分子を磁気分離し、操作しやすい。
３、本発明のアプタマーは、双方向熱サイクル減算ＳＥＬＥＸ急速スクリーニング法で得られた非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）、肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）血清特異的アプタマー配列である。アプタマーに応じて蛍光プローブをそれぞれ設計し、ＰＣＲ増幅により標的分子シグナルの指数関数的な増幅を実現する。
４、非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）血清アプタマーは、非腫瘍血清中のマーカーを特異的に識別することができ、腫瘍血清を検出するための陰性対照とすることができる。
５、本発明では、非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）血清アプタマーと、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）、肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）血清特異的アプタマーとからなる検出試薬を採用し、その利点は、検出により血清中に腫瘍マーカーがあるか、それとも非腫瘍マーカーがあるかを相対的に明確に区別することができる。
以下、図面及び具体的な実施例を結合して本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の実施例２における多重リアルタイム定量－ＰＣＲで腫瘍及び非腫瘍血清を検出する場合の原理概略図である。
以下、具体的な実施形態を結合して本発明をさらに説明する。
一例として、下記各実施例で使用されるキットは、以下の試薬１～試薬６を含む。
試薬１は、ｐＨ値が７．４の０．０１ＭのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒであり、５０％粒子径の５～５０００ｎｍの捕捉磁気ビーズ微粒子が溶解した５ｍＬの捕捉磁気ビーズ試薬である。
試薬２は、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）、肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）などの腫瘍血清特異的アプタマーと、非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）血清特異的アプタマーとを、それぞれ０．１×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１０９分子コピー数の混合液に溶解して得られる検出試薬である。
試薬３は、脱脂粉乳及びカゼインを含む１０ｍＬのブロッキング液である。
試薬４は、ｐＨ値が７．４の０．０１ＭのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．１７％のＴｗｅｅｎを含む）である１０ｍＬの洗浄液１である。
試薬５は、クエン酸及び塩化ナトリウムを含む３×ＳＳＣである１０ｍＬの洗浄液２である。
試薬６は、１対のプライマー及び異なる発光波長アプタマー蛍光プローブを含むＰＣＲシステムである１ｍｌのリアルタイム定量ＰＣＲ反応液である。
実施例１：腫瘍及び非腫瘍血清のリアルタイム定量－ＰＣＲ検出
本実施例は、以下のステップ（１）～（６）を含む。
ステップ（１）では、検出対象サンプルを準備する。即ち、静脈穿刺法に従って血液を採取して抗凝固剤を含む試験管に入れ、直ちに軽く振って血液と抗凝固剤とを均一に混合し、その後、３０００回転で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を収集して－８０℃で３０ｍｉｎ凍結した後、１２０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、血中脂質を除去し、さらに水：アセトニトリル：血清＝２：０．５：１の割合で混合処理し、５０００ｒ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ低温遠心分離し、上清液を吸い取り、豊富なタンパク質を除去し、検出対象血清を得る。
ステップ（２）では、磁気ビーズが標的分子を捕捉する。即ち、２部の５０μＬの同量のＮＨＳ基寒天ビーズを１．５ｍｌのＥＰチューブに入れ、それぞれＨ１とＨ２と標識し、Ｈ１、Ｈ２にそれぞれ５０μＬの検出対象血清を加え、３７℃で１ｈインキュベートし、さらにタンパク質ブロッキング液で３７℃で１時間ブロッキングした後に洗浄液１で３回洗浄し、３分間／回で磁気分離する。
ステップ（３）では、リガンドと結合させる。即ち、それぞれ２００μＬの非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）アプタマー検出液と、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）及び肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）アプタマー検出液を９５℃で５ｍｉｎ加熱して氷水に入れて５ｍｉｎ急冷した後、非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）アプタマー検出液をＨ１磁気ビーズに加え、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）及び肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）アプタマー検出液の混合液をＨ２磁気ビーズに加え、３７℃で１時間結合させ、磁気分離し、上清液を捨てる。
ステップ（４）では、洗浄する。即ち、上記２つのチューブに洗浄液２をそれぞれ加え、０．５ｍｌで３回洗浄し、３分間／回とし、さらに洗浄液１を０．５ｍｌ加え、３回洗浄し、３分間／回とする。
ステップ（５）では、検出テンプレートを準備する。即ち、Ｈ１及びＨ２磁気ビーズに１５μＬの１×ＰＣＲ緩衝液を加え、９５℃で５分間加熱し、磁気分離して上清液を採取する。
ステップ（６）では、検出する。即ち、それぞれステップ（５）におけるＨ１とＨ２の２μＬの上清液を１８μＬのリアルタイム定量ＰＣＲ反応システム（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ）に加え、リアルタイム定量－ＰＣＲを行い、データを収集して処理する。
検出結果を分析したところ、結果１として、Ｈ１のＣＴ値はＨ２のＣＴ値より小さく、血清サンプルが非腫瘍血清に属することを示し、結果２として、Ｈ１のＣＴ値はＨ２のＣＴ値より大きく、血清検体が腫瘍血清に属することを示す。
実施例２：腫瘍及び非腫瘍血清の多重リアルタイム定量－ＰＣＲ検出
本実施例は、以下のステップ（１）～（６）を含む。
ステップ（１）では、検出対象サンプルを準備する。即ち、静脈穿刺法に従って血液を採取して抗凝固剤を含む試験管に入れ、直ちに軽く振って血液と抗凝固剤とを均一に混合し、その後、３０００回転で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を収集して－８０℃で３０ｍｉｎ凍結した後、１２０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、血中脂質を除去し、さらに水：アセトニトリル：血清＝２：０．５：１の割合で混合処理し、５０００ｒ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ低温遠心分離し、上清液を吸い取り、豊富なタンパク質を除去し、検出対象血清を得る。
ステップ（２）では、磁気ビーズ標的分子複合物を調整する。即ち、１部の５０μＬの捕捉寒天ビーズを１．５ｍｌのＥＰチューブに入れ、５０μＬの検出対象血清を加え、３７℃で１ｈインキュベートし、洗浄液１で３回洗浄し、３分間／回で磁気分離する。（注：核酸アプタマー捕捉寒天ビーズは、化学結合によりストレプトアビジンをカップリングし、さらにアビジンによりビオチン化されたアプタマーと結合して形成された捕捉磁気ビーズであり、標的分子を捕捉するアプタマーと検出アプタマーは、同一の分子であってもよいし、異なる核酸ライブラリーからスクリーニングして得られた標的分子特異的アプタマーであってもよく、その他の捕捉磁気ビーズは、化学結合により抗体又は抗原をカップリングして捕捉磁気ビーズを形成してもよく、或いは化学結合によりカップリングして標的分子を捕捉してもよい）
ステップ（３）では、リガンドと結合させる。即ち、それぞれ２００μＬの非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）アプタマー検出液と、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）及び肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）アプタマー混合検出液を９５℃で５ｍｉｎ加熱し、かつ氷水に入れて５ｍｉｎ急冷した後、ステップ（２）の磁気ビーズに加え、３７℃で１時間結合させ、磁気分離し、上清液を捨てる。
ステップ（４）では、洗浄する。即ち、チューブに洗浄液２を加え、０．５ｍｌで３回洗浄し、３分間／回とし、さらに洗浄液１を加え、０．５ｍｌで３回洗浄し、３分間／回とする。
ステップ（５）では、検出テンプレートを準備する。即ち、磁気ビーズに１５μＬの１×ＰＣＲ緩衝液を加え、９５℃で５分間加熱し、磁気分離して上清液を採取する。
ステップ（６）では、多重ＰＣＲで検出する。即ち、ステップ（５）で得られた２μＬの上清液を１８μＬのリアルタイム定量ＰＣＲ反応液に加える。図１に示す原理を参照されたい。反応液にはアプタマーの上流プライマー及び下流プライマーＰ７、Ｐ１１と４つの異なる波長のＴａｑＭａｎプローブで標識された非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）及び肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）アプタマーが含まれている。プローブの発光波長はそれぞれ４チャネルであり、多重リアルタイム定量ＰＣＲを行い、データを採取して処理する。
検出結果を分析したところ、結果１として、第１のチャネルのＣＴ値は第２、３及び４のチャネルのＣＴ値より小さく、血清サンプルが非腫瘍血清に属することを示し、結果２として、第２のチャネルのＣＴ値は第１、３及び４のチャネルのＣＴ値より小さく、血清サンプルが胃癌血清に属する可能性があることを示し、結果３として、第３のチャネルのＣＴ値は第１、２及び４のチャネルのＣＴ値より小さく、血清サンプルが肝臓癌血清に属する可能性があることを示し、結果４として、第４のチャネルのＣＴ値は第１、２及び３のチャネルのＣＴ値より小さく、血清サンプルが肺癌血清に属する可能性があることを示す。
以下のことに留意されたい。
１、検出サンプルがリアルタイム定量ＰＣＲ検出の４チャネルより大きい場合、各チューブのＰＣＲシステムごとに１つの参照を追加し、３つのサンプルを検出してもよい。例えば、１０種類の腫瘍を検出する場合、４組のＰＣＲ検出システムに分けることができる。各組で、非腫瘍アプタマーのＴａｑＭａｎプローブをＰＣＲチューブ間のエラーの参照として用いる。
２、各腫瘍が２種類以上のアプタマーを有する場合、グループ化することができる。ＴａｑＭａｎプローブは１つの発光波長を採用し、ＰＣＲ検出システムで検出される。
３、本実施例では必要に応じて異なるサンプルマーカーに対して異なる核酸ライブラリーを用いてアプタマーをスクリーニングしてもよい。このように、サンプルを検出する際に、同じ検出テンプレートに対して異なるプライマーＰＣＲシステムを用いて検出し、マーカー情報を取得し、サンプルタイプを決定することができる。
実施例３：腫瘍及び非腫瘍血清を検出するための遺伝子配列決定
本実施例は、以下のステップ（１）～（６）を含む。
ステップ（１）では、検出対象サンプルを準備する。即ち、静脈穿刺法に従って血液を採取して抗凝固剤を含む試験管に入れ、直ちに軽く振って血液と抗凝固剤とを均一に混合し、その後、３０００回転で１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を収集して－８０℃で３０ｍｉｎ凍結した後、１２０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、血中脂質を除去し、さらに水：アセトニトリル：血清＝２：０．００２３５：１の割合で混合処理し、５０００ｒ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ低温遠心分離し、上清液を吸い取り、豊富なタンパク質を除去し、検出対象血清を得る。
ステップ（２）では、磁気ビーズ標的分子複合物を調整する。即ち、１部の５０μＬの捕捉寒天ビーズを１．５ｍｌのＥＰチューブに入れ、５０μＬの検出対象血清を加え、３７℃で１ｈインキュベートし、洗浄液１で３回洗浄し、３分間／回で磁気分離する。（注：核酸アプタマー捕捉寒天ビーズは、化学結合によりストレプトアビジンをカップリングし、さらにアビジンによりビオチン化されたアプタマーと結合して形成された捕捉磁気ビーズであり、標的分子を捕捉するアプタマーと検出アプタマーは、同一の分子であってもよいし、異なる核酸ライブラリーからスクリーニングして得られた標的分子特異的プタマーであってもよく、その他の捕捉磁気ビーズは、化学結合により抗体又は抗原をカップリングして捕捉磁気ビーズを形成してもよく、或いは化学結合によりカップリングして標的分子を捕捉してもよい）
ステップ（３）では、リガンドと結合させる。即ち、アプタマーを、それぞれ、最終濃度が１０９である、非腫瘍（Ｎ－ｓｅｑ）アプタマーと、胃癌（Ｇ－ｓｅｑ）、肝臓癌（Ｈ－ｓｅｑ）及び肺癌（Ｌ－ｓｅｑ）アプタマーとの混合検出液２００μＬに調製して９５℃で５ｍｉｎ加熱し、かつ氷水に入れて５ｍｉｎ急冷した後、ステップ（２）の磁気ビーズに加え、３７℃で１時間結合させ、磁気分離し、上清液を捨てる。
ステップ（４）では、洗浄する。即ち、チューブに洗浄液２を加え、０．５ｍｌで３回洗浄し、３分間／回とし、さらに洗浄液１を加え、０．５ｍｌで３回洗浄し、３分間／回とする。
ステップ（５）では、検出テンプレートを準備する。即ち、磁気ビーズに１５μＬの１×ＰＣＲ緩衝液を加え、９５℃で５分間加熱し、磁気分離して上清液を採取する。
ステップ（６）では、遺伝子配列決定を行う。即ち、遺伝子２世代又は３世代の配列決定方法を用いてステップ（５）で得られた上清液に対して配列決定して検出し、その後、各リガンドを分析する。要するに、アプタマーのコピー数は、特異的標的分子の多さを表し、検出対象血清の性質を表す。
当業者であれば、上記説明に基づいて改良して変換することができるが、これらの改良及び変換は、いずれも本発明の特許請求の保護範囲に属するものであると理解すべきである。
以上、本発明の特許を例示的に説明したが、明らかに、本発明の特許の実現は、上記形態に限定されるものではなく、本発明の特許の技術的思想及び技術的手段を適用して行われた種々の改良、又は改良せずに本発明の技術的思想及び技術的手段をそのまま他の用途に適用したものは、いずれも本発明の保護範囲に包含される。

Claims (9)

  1. 捕捉磁気ビーズ試薬、ブロッキング液、検出試薬、洗浄液及びリアルタイム定量ＰＣＲ反応液を含み、
    前記捕捉磁気ビーズ試薬に粒径が５～５０００ｎｍの捕捉磁気ビーズが溶解し、
    前記ブロッキング液は、タンパク質ブロッキング液であり、
    前記検出試薬に腫瘍及び非腫瘍血清特異的アプタマー群が溶解し、
    前記リアルタイム定量ＰＣＲ反応液は、プライマーと、アプタマーに対する蛍光プローブとを含むことを特徴とする標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
  2. 前記腫瘍及び非腫瘍血清特異的アプタマー群は、いずれも双方向熱サイクル減算ＳＥＬＥＸ技術でスクリーニングして得られることを特徴とする請求項１に記載の標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
  3. 前記腫瘍及び非腫瘍血清特異的アプタマー群におけるアプタマーは前記蛍光プローブと１つずつ対応することを特徴とする請求項１に記載の標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
  4. 前記蛍光プローブはＭＧＢプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ及び分子ビーコンのうちの少なくとも１種を含み、かつ前記蛍光プローブはアプタマー配列に対して設計されるものであることを特徴とする請求項３に記載の標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
  5. 前記捕捉磁気ビーズの表面には、標的分子とカップリング可能な官能基又は捕捉分子を有し、前記官能基は、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基及びＮＨＳのうちの少なくとも１種を含み、化学基により前記標的分子をカップリングすることができ、前記捕捉分子は、抗原、抗体、親和性タンパク質及びアプタマーのうちの１種以上であり、免疫結合、タンパク質リガンド結合又はアプタマー結合により前記標的分子を捕捉することができ、前記標的分子は、核酸、タンパク質、脂質、アミノ酸及びその他の生体分子のうちの少なくとも１種以上を含むことを特徴とする請求項１に記載の標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
  6. 前記検出試薬に、非腫瘍血清に対してＳＥＬＥＸで減算してスクリーニングされた胃癌、肝臓癌及び肺癌の腫瘍血清特異的アプタマーと、腫瘍血清に対してＳＥＬＥＸで減算してスクリーニングされた非腫瘍血清特異的アプタマーが溶解することを特徴とする請求項１に記載の標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
  7. 前記洗浄液は、Ｔｗｅｅｎが溶解したＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒである第１の洗浄液と、クエン酸及び塩化ナトリウムが溶解したＳＳＣである第２の洗浄液とを含むことを特徴とする請求項１に記載の標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
  8. 前記ブロッキング液は、脱脂粉乳及びカゼイン、又はウシ血清アルブミンを含むことを特徴とする請求項１に記載の標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
  9. 前記プライマーは、プローブがアプタマー配列上の５～２５個の塩基配列であり、配列の３’及び５’末端に消光基及び蛍光基を有するアプタマープライマーであることを特徴とする請求項１に記載の標的－腫瘍血清アプタマー複合物の検出キット。
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