JP2022506745A - ケト酸を含む培地 - Google Patents

Abstract

本発明は、ケトロイシン、ケトバリン、ケトイソロイシンおよびケトフェニルアラニンから選択される少なくとも１つのケト酸、ならびに／またはこれらのケト酸の塩を含む培地、好ましくは細胞培地に関する。本発明はさらに、細胞、好ましくは植物細胞、動物細胞または哺乳動物細胞を培養するための、本発明に係る培地の使用に関する。本発明の別の態様は、（ｉ）細胞培養体を製造可能な細胞を提供する工程と、（ｉｉ）前記細胞を本発明に係る培地と接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記培地または前記細胞から前記細胞培養体を得る工程と、を含む細胞培養体の製造方法に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、生物工学的製造方法に関する。より具体的には、本発明は、生物工学的製造方法に用いる改善された培地、そのような改善培地を使用する方法、および前記改善培地を使用する方法から得られる生成物に関する。

生物工学的方法は、生物学的生成物の製造に広く用いられている。これらの方法は、通常、培養した細胞の増殖および培養した細胞による生成物形成を許容する条件下における、培地での細胞培養を伴う。生物工学的製造に有用な細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、および動物または植物由来の細胞である。

動物細胞培養は、治療用タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、または他の生体分子（例：治療用多糖類）などの生物学的生成物の製造に長い間用いられてきた。このような細胞培養法では、所望の生成物を生成するために正常に遺伝子組み換えが行われた動物細胞を、細胞増殖および生成物形成のために、液体、固体または半固体の培地で培養する。細胞培養の重要な利点の１つは、動物細胞と植物細胞が一次生成物の翻訳後修飾（例：ポリペプチドの折りたたみや翻訳後修飾）を行い得る点である。

生物工学的製造方法、特に動物細胞培養では、細胞培養条件の制御と最適化が細胞増殖と生成物形成に重要である。決定的な要因の１つは、培地の組成である。最終的な細胞培養体の濃度と品質は、培地の組成に大きく左右される。動物および植物細胞の培養は、必要とされる栄養素の組成と培養条件の点で特に過酷である。必要な栄養素には、基本となる炭素源、窒素源およびエネルギー源（例：糖やアンモニア）の他に、より複雑な栄養素（例：必須アミノ酸や成長因子、ビタミン）も含まれる。このため、動物細胞に多種多様な栄養素を提供するために、血清などの複雑な栄養素組成物を動物細胞培地に補充することが行われてきた。しかし、規制や安全性への懸念、さらに利用可能な血清源の異種性に関する問題により、当業界は、工業的細胞培養法からの血清およびその他の非特定培地の排除に努めている。しかし、無血清培地で増殖した細胞培養体は、栄養不足を示すことが多い。このため、細胞培養体の十分な増殖とタンパク質形成に必要な、複合培地の栄養成分とそれらの最適濃度を特定するために多くの努力が払われている。栄養不足を克服するために一般的に用いられる戦略は、培養中に使用済み培地成分を供給する方法である。補充に用いられる高濃度溶液は、フィード培地と呼ばれている。基礎培地とともにそれらの組成を最適化するのは同じ論理に従っている。

特有の用途の一部に、ワクチンまたは遺伝子治療用ベクターとしてのウイルスの生成がある。いずれの場合も、細胞培養方法は、２つの段階に明確に分かれる。第１段階は、ウイルス収率を最大化することを目的としたウイルスの生成である。第２段階は、細胞をトランスフェクトするためのベクターの使用である。培地は、理想的には、高いトランスフェクト効率をサポートする。

アミノ酸を含む細胞培養体の供給は、増殖速度と生成に大きな影響を与えることが知られている。グルタミンは、培養細胞にとって重要な炭素源、窒素源およびエネルギー源であるため、細胞培地やフィードにルーチン的に使用されている。動物細胞培養の最適な増殖に必要なグルタミン量は、他のアミノ酸量よりも３～１０倍多いことが実証された（非特許文献１）。しかし、栄養素としてのグルタミンは、ピログルタミン酸とアンモニアが熱下で生成されるため、熱滅菌条件などの高温で水に溶解すると不安定になる（非特許文献２）。このため、グルタミン酸がグルタミンの代わりに細胞培地でよく使用される（非特許文献３）。

Ｌ－グルタミン代謝とクレブスエネルギーサイクルの両方で重要な役割を果たすグルタル酸、α－ケトグルタル酸（ＡＫＧ）のケトン誘導体の、細胞培養用途での使用は、以前から説明されている（非特許文献４）。ＣＨＯおよびハイブリドーマ細胞株の場合、ＡＫＧを市販培地に添加することにより、最大生存細胞密度（ＶＣＤ）を３０％以上、かつ積分生存細胞密度（ＩＶＣＤ）を５０％以上増加させられることを実証できた。

上記の先行技術に記載されている細胞培地は、特定の細胞培養方法に対し満足のいく性能や特性を提供するが、従来技術の培地は依然として最適ではない。生物工学的製造方法におけるより良好な増殖と生成物形成を促進する、さらに改善された培地の必要性が依然として存在する。これは、ワクチンまたは治療としての細胞系ウイルス生成に関する新興分野と特に関連している。この分野での重要な課題は、血清を除去して増殖性を向上することと、一般的なウイルス収率をアップさせることである。後者は、両方の用途に特に関連がある。パンデミックの場合、極めて短時間で大量のワクチンを作る必要がある。遺伝子治療の場合、ベクターの製造を開始してから投与するまでの時間を最小限に抑えることは、治療を成功させるための重要なパラメーターである。

Ｅａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０：４３２～４３７頁 Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．、１９８８年、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４（７）：６９６～６９８頁 Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ、５２、Ｓａｄｅｔｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｄｓ．、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ、２００６年 Ｈａｓｓｅｌ ＆ Ｂｕｔｌｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９６、５０１～５０８頁、Ｅｖｏｎｉｋ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ＆ Ｃａｒｅ ＧｍｂＨ社、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｏｖｅｒｖｉｅｗ：ｃＱｒｅｘ（商標）ＡＫＧ、２０１６年２月

したがって、本発明の目的は、種々の細胞株のより良好な増殖と生成物形成を促進し、さらに毒性アンモニアの量を低減する高度な培地を提供することであった。

既知の培地の上記欠点は、本発明によって対処される。本発明は、添付の独立請求項の用語によって規定される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項に規定されている。

したがって、本発明は、ケトロイシン、ケトバリン、ケトイソロイシンおよびケトフェニルアラニンから選択される少なくとも１つのケト酸、ならびに／またはこれらのケト酸の塩を含む培地、好ましくは細胞培地に関する。
本発明はさらに、細胞、好ましくは植物細胞、動物細胞または哺乳動物細胞を培養するための本発明に係る培地の使用に関する。
本発明の別の態様は、（ｉ）細胞培養体を製造可能な細胞を提供する工程と、（ｉｉ）前記細胞を本発明に係る培地と接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記培地または前記細胞から前記細胞培養体を得る工程と、を含む細胞培養体の製造方法に関する。
本発明の好ましい実施形態は、本発明の以下の詳細な説明においてさらに詳細に説明される。

α－ケト酸は、代謝において様々な機能を有する。分岐鎖アミノ酸のケト酸類似体は、特に骨格筋と肝臓におけるアミノ酸代謝で重要な役割を果たす。筋肉タンパク質の３分の１は、体で生成できないために食事で摂取する必要がある分岐鎖アミノ酸で構成されている。筋肉では、特に身体運動をする場合、タンパク質が継続的に合成、分解されるが、アミノ酸の分解中に、アミノ基をキャリアに転移することによって対応するα－ケト酸が形成される。得られたケト酸を、エネルギー生成のためにさらに酵素的に酸化させてもよい。キャリアは肝臓に運ばれ、そこでアンモニアを遊離させ、それが尿素に転化されて腎臓から***される。

分岐鎖アミノ酸に由来するα－ケト酸の製薬目的での使用は、古くから知られている。例えば、α－ケトイソカプロン酸（ケトロイシン）は、特に、筋肉中のタンパク質分解を低減し、かつ筋肉手術後のタンパク質分解に起因する尿素形成を低減するために使用されることができる（米国特許公報第４，６７７，１２１号）。栄養失調、筋ジストロフィーまたは***、そして筋肉中のタンパク質分解の二次結果であるその他の障害におけるケトロイシンの使用もそこに記載されている。この場合、ケトロイシンは静脈内投与される。さらに、腎不全等のためにタンパク質を減らした食事を維持しなければならない患者に、ロイシン、イソロイシンおよびバリンのα－ケト酸を投与することが提案されている（米国特許公報第４，１００，１６１号）。種々の医療適用に関するタンパク質代謝におけるα－ケト酸の役割は、Ｗａｌｓｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、３８巻（１９９０年）、５９５～６０４頁にも記載されている。

対照的に、機能性食品分野では、分岐鎖アミノ酸は、アスリート等の筋肉増強をサポートするために直接使用されている（Ｓｉｍｏｍｕｒａ， Ｙ、米国栄養学会）。筋肉性能を向上し、疲労後の筋肉回復をサポートするための、ロイシン、イソロイシンおよびバリンのα－ケト酸の使用は、米国特許公報第６，１００，２８７号に記載されており、対応するアニオン性ケト酸と対イオンとしてのカチオン性アミノ酸との塩（例：アルギニンまたはリジン）が使用されている。しかし、その結果、アポトーシス（プログラムされた細胞死）を引き起こす可能性があることが知られているポリアミンも形成される。ポリアミンの分解生成物の***は、腎臓を介して行われるが、その結果、さらにストレスがかかる。
しかし、これまで培養細胞では効果が見られなかった。

本発明による「培地」は、栄養素を含む液体または固体培地であると理解されるものとし、当該培地は、培養中の細胞の生命および／または生成物形成に栄養を与え、サポートするのに適している。本発明による培養細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞などの動物細胞、および／または藻類などの植物細胞であってよい。一般的に、培地は、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、少なくとも１つのエネルギー源、脂質、および微量元素を提供し、これらはすべて、生命、増殖および／または生成物形成を維持するために細胞に必要なものである。培地はまた、ホルモンや成長因子など、増殖性および／または生存性を最小速度以上で向上させる成分を含んでいてもよい。培地は、細胞の生命、増殖および／または生成物形成をサポートするｐＨおよび塩濃度であることが好ましい。本発明による培地は、好ましくは、細胞培養体の生命および増殖を維持するために必要なすべての栄養素を含む。培地は、特定されていても特定されていなくてもよい。好ましい培地は、特定培地である。

本発明に係る「特定培地」は、細胞抽出物、細胞加水分解物、またはタンパク質加水分解物を含まない培地である。好ましい特定培地は、組成が不明の成分を含まない。当業者に一般的に理解されているように、特定培地は、通常、動物由来の成分を含まない。好ましくは、特定培地の成分はすべて、既知の化学構造を有する。好ましい特定培地は無血清培地である。他の好ましい特定培地は合成培地である。「特定培地」以外の培地は、「複合」培地と呼ばれる。

「細胞培地」は、動物細胞および／または植物細胞の生命、増殖および／または生成物形成を維持するのに適した培地であると理解されるものとする。特定の実施形態では、基礎培地とフォード培地とを区別することができる。

「基礎培地」は、細胞の培養を引き起こす栄養素を含む溶液または物質であると理解されるものとする。「フィード培地」は、培養過程を開始した後に細胞が供給される溶液または物質であると理解されるものとする。特定の実施形態では、フィード培地は、基礎培地に存在しない１つまたは複数の成分を含む。フィード培地はまた、基礎培地に存在する１つまたは複数の成分を欠いていてもよい。フィード培地中の栄養素の濃度は、希釈による生産性の損失を回避するために、基礎培地中の濃度よりも高いことが好ましい。

本発明による「栄養素」は、細胞が生存し増殖するために必要とされる化合物または物質である。栄養素は、好ましくは、環境から細胞に取り込まれる。栄養素は、「有機栄養素」と「無機栄養素」であってよい。有機栄養素には、炭水化物、脂肪、タンパク質（またはそれらのビルディングブロック、例：アミノ酸）、およびビタミンが含まれる。無機栄養素は、食事性ミネラルや微量元素などの無機化合物である。「必須栄養素」とは、細胞がそれ自体を合成することができない栄養素であり、したがって、培地によって細胞に提供されなければならない栄養素である。

本発明による「細胞培養体」は、細胞培養において細胞によって生成される任意の有用な生物学的化合物であると理解されるものとする。本発明の好ましい細胞培養体は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、治療用多糖類（例：ヘパリン）、抗体（例：モノクローナル抗体）、成長因子、インターロイキン、ペプチドホルモン、酵素、およびウイルス（ウイルスベクターやワクチンを含むが、これらに限定されないウイルス）である。他の実施形態では、治療用途のための幹細胞の培養が含まれるがこれに限定されず、細胞自体が細胞培養体であるとして理解されるものとする。

本明細書の文脈における「アミノ酸」は、各アミノ酸に特有な側鎖とともに、アミノ官能基（－ＮＨ２）とカルボン酸官能基（－ＣＯＯＨ）を含む分子であると理解されるものとする。本明細書の文脈では、α－アミノ酸とβ－アミノ酸の両方が含まれる。本発明の好ましいアミノ酸は、α－アミノ酸であり、特に下記のような２０個の「天然アミノ」酸である。
アラニン（Ａｌａ／Ａ）
アルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）
アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）
アスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）
システイン（Ｃｙｓ／Ｃ）
グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）
グルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）
グリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）
ヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）
イソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）
ロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）
リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）
メチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）
フェニルアラニン（Ｐｈｅ／Ｆ）
プロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）
セリン（Ｓｅｒ／Ｓ）
スレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）
トリプトファン（Ｔｒｐ／Ｗ）
チロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）
バリン（Ｖａｌ／Ｖ）

本明細書の文脈において、表現「天然アミノ酸」は、上記の２０個のアミノ酸のＬ型およびＤ型の両方を含むと理解されるものとする。ただし、Ｌ型が好ましい。一実施形態では、用語「アミノ酸」には、それらのアミノ酸の類似体または誘導体も含まれる。

本発明による「遊離アミノ酸」は、そのアミノ基およびその（アルファ）カルボン酸官能基を遊離形態で有する（すなわち、他の分子に共有結合していない）アミノ酸（例：ペプチド結合を形成していないアミノ酸）であると理解される。遊離アミノ酸はまた、塩としてあるいは水和物の形で存在していてもよい。オリゴペプチドの一部としてのアミノ酸、またはオリゴペプチド内のアミノ酸を指す場合、これは、既知の生化学メカニズムおよびペプチド生合成に従って、各アミノ酸に由来する、各オリゴペプチド構造内の該当部分を指すと理解されるものとする。

本発明による「分岐鎖アミノ酸」（ＢＣＡＡ）は、分岐（３つ以上の炭素原子に結合した中心炭素原子）を有する脂肪族側鎖を持つアミノ酸であると理解される。タンパク質新生アミノ酸には、３つのＢＣＡＡ（ロイシン、イソロイシン、バリン）がある。非タンパク質新生ＢＣＡＡには、２－アミノイソ酪酸が含まれる。

本発明による「ケト酸」は、カルボン酸基およびケトン基を含む有機化合物であると理解される。

「α―ケト酸」は、カルボン酸に隣接するケト基を有するケト酸として理解されるものとする。本発明によるケト酸は、アミノ酸のケト類似体、すなわち、ケトロイシン、ケトバリン、ケトイソロイシンおよびケトフェニルアラニン、ならびに／またはこれらのケト酸の塩から選択される。ケト酸の塩には、そのようなケト酸の混合塩も含まれるものとする。このような混合塩は、異なるケト酸の共結晶化によって生成されることができる。

本発明による「分岐鎖ケト酸」（ＢＣＫＡ）は、ＢＣＡＡのケト類似体、すなわち、ケトロイシン、ケトバリンおよびケトイソロイシン、ならびに／またはこれらのＢＣＫＡの塩として理解されるものとする。ＢＣＫＡの塩には、そのようなＢＣＫＡの混合塩も含まれるものとする。このような混合塩は、異なるＢＣＫＡの共結晶化によって生成されることができる。

本発明による「成長因子」は、細胞の成長、増殖および細胞分化を活性化することができる任意の天然起源物質であると理解されるものとする。好ましい成長因子は、タンパク質またはステロイドホルモンの形である。本発明の一実施形態によれば、表現「成長因子」は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦを含む）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ ａｌｐｈａおよびＴＧＦ ｂｅｔａを含む）、インターロイキン－１、－２，－６などのサイトカイン、顆粒球刺激因子、および白血球抑制因子（ＬＩＦ）からなるリストから選択される成長因子に関連すると解釈されるものとする。

栄養素組成物、培地、細胞培地などの「無菌形態」とは、前記組成物、培地、細胞培地などに生物が存在しないことを規定すると理解されるものとする。

本明細書の文脈における「固体培地」は、任意の非液体または非気体の培地であると理解されるものとする。本発明の好ましい固体培地は、寒天、カラギーナンまたはゼラチンなどのゲル様培地である。

本明細書の文脈における「細胞の継代」（細胞の継代培養または***としても知られる）は、少数の細胞を新たな培養容器に移すことを意味すると理解される。細胞を定期的に***させると、細胞密度の上昇に伴う老化を回避できるため、細胞をより長く培養することができる。浮遊培養は、大量の新鮮培地で希釈された少数の細胞を含む少量の培養で、簡単に継代される。

本発明は、一般に、培地、好ましくは細胞培地に関する。前記培地は、ケトロイシン、ケトバリン、ケトイソロイシンおよびケトフェニルアラニンから選択される少なくとも１つのケト酸、ならびに／またはこれらのケト酸の塩を含む。ケト酸は、好ましくは、分岐鎖ケト酸（ケトロイシン、ケトバリンおよびケトイソロイシン）から選択される。

特定の実施形態では、培地は、２つ以上のケト酸の混合塩を含む。この実施形態では、ケトロイシン、ケトバリン、ケトイソロイシンおよびケトフェニルアラニンから選択される２つ以上の遊離ケト酸が、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、および酢酸マグネシウムから選択されることが好ましい１つまたは複数のアルカリ土類金属塩と共結晶化される。

本発明の好ましい構成では、培地は、ケトロイシン、ケトバリンおよびケトイソロイシンをおよそ２：１：１の比率で含む。

前記ケト酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を使用することがさらに好ましい。好ましい塩は、前記ケト酸のＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋塩である。特に好ましいのは、前記ケト酸のＮａ^＋またはＫ^＋塩である。

一実施形態では、培地は、少なくとも１つの炭水化物、少なくとも１つの遊離アミノ酸、少なくとも１つの無機塩、緩衝剤、および／または少なくとも１つのビタミンをさらに含む。特に好ましい実施形態では、培地は、少なくとも１つの炭水化物、少なくとも１つの遊離アミノ酸、少なくとも１つの無機塩、緩衝剤、および少なくとも１つのビタミンをすべて含む。

本発明の別の実施形態によれば、培地は、液体、ゲル、粉末、顆粒、ペレットまたは錠剤の形状である。

好ましい実施形態では、本発明の培地は、特定培地または無血清培地である。例えば、本発明のケト酸は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ドイツ ベルギッシュ・グラートバッハ）のＣＨＯＭＡＣＳ ＣＤ培地、ＬＯＮＺＡ社（スイス バーゼル）から入手可能なＰｏｗｅｒＣＨＯ－２ ＣＤ培地、ＰＡＡ社（オーストリア パシング、ＰＡＡ実験室）のＡｃｔｉ－ＣＨＯ Ｐ培地、ＳＡＦＣ社から入手可能なＥｘ－Ｃｅｌｌ ＣＤ ＣＨＯ培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社（米国 ウォルサム）のＳＦＭ４ＣＨＯ培地およびＣＤＭ４ＣＨＯ培地に補充されてもよい。本発明のケト酸はまた、ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．社、米国 カールスバッド）に補充されてもよい。ただし、本発明は、上記培地への補充に限定されない。

他の好ましい実施形態では、培地は、使用時の培地濃度に対し、２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍または１０倍に濃縮された形（体積／体積）の液体培地である。そのため、当該濃縮培地を各量の無菌水で簡単に希釈することにより、「すぐに使用できる」培地を調製することができる。本発明に係るそのような濃縮形態の培地はまた、それを培養体に添加することによって、例えば流加培養法において使用されてもよい。

本発明の培地は、持続的な増殖および生成物形成に必要なすべての栄養素を含むことが好ましい。培地、特に細胞培地を調製するためのレシピは、当業者によく知られている（製薬および細胞系治療のための細胞培養技術、ＯｚｔｕｒｋおよびＷｅｉ－Ｓｈｏｕ Ｈｕ編、ＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓグループ、２００６年などを参照）。様々な培地が様々なメーカーから市販されている。

本発明の培地は、炭水化物源を含むことが好ましい。細胞培地で使用される主な炭水化物はグルコースであり、通常、５ｎＭ～２５ｎＭで補充される。さらに、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの任意のヘキソース、またはそれらの組み合わせを使用してもよい。

培地はまた、通常、特定の非必須アミノ酸とともに、少なくとも必須アミノ酸（すなわち、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｙ、Ｖａｌ）も含む。細胞株がアミノ酸を合成することができない場合、あるいは細胞株が最大増殖をサポートするのに十分な量のアミノ酸を生成できない場合、非必須アミノ酸は通常、細胞培地に含まれる。さらに、哺乳類細胞は、主要なエネルギー源としてグルタミンを使用することもできる。グルタミンは、他のアミノ酸よりも高い濃度（２ｍＭ～８ｍＭ）で含まれていることが多い。しかし、上述のように、グルタミンは自発的に分解してアンモニアを形成し得るので、特定の細胞株は、毒性のアンモニアをより速く生成する。

本発明の培地は、塩を含むことが好ましい。塩は、等浸透圧条件を維持し、浸透圧の不均衡を防ぐために、細胞培地に添加される。本発明の培地の浸透圧は、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであるが、多くの細胞株は、この値の約１０％以上の浸透圧変化に耐えることができる。一部の昆虫細胞培養の浸透圧は、３００ｍＯｓｍ／ｋｇを超える傾向があり、これは３００ｍＯｓｍ／ｋｇより０．５％、１％、２～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％高くてよい。細胞培地に最も一般的に使用される塩には、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｌ^－、ＳＯ４^２－、ＰＯ４^３－、およびＨＣＯ^３－（例：ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４）がある。

他の無機元素が培地中に存在してもよい。それらには、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｖａ、Ｓｅ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｍｇ、ＳｉおよびＮｉが含まれる。これらの元素の多くは、酵素活性に関与する。それらは、ＣａＣｌ_２、Ｆｅ（ＮＯ_３）_３、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＭｎＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ２ＨＰＯ４などの塩、およびセレン、バナジウムおよび亜鉛などの微量元素のイオンの形で提供されてよい。これらの無機塩および微量元素は、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州 セントルイス）などから商業的な方法で入手されることができる。

本発明の培地は、好ましくは、ビタミンを含む。ビタミンは通常、補因子として細胞に使用される。各細胞株のビタミン要件は大きく異なるが、細胞培地に血清がほとんどまたはまったく含まれていない場合、あるいは細胞が高密度で増殖している場合、通常、追加のビタミンが必要である。本発明の培地に存在することが好ましい例示的ビタミンには、ビオチン、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ニコチンアミド、Ｄ－Ｃａ^＋＋－パントテン酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ナイアシンアミド、Ａ、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ３、Ｅ、Ｋ、およびｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）が含まれる。

本発明の培地はまた、血清を含んでいてもよい。血清は、凝固した血液の上清である。血清成分には、付着因子、微量栄養素（例：微量元素）、成長因子（例：ホルモン、プロテアーゼ）、および保護元素（例：抗毒素、抗酸化剤、抗プロテアーゼ）が含まれる。血清は、さまざまな動物源から入手でき、ヒト、ウシまたはウマの血清を含む。本発明による細胞培地に血清が含まれる場合、当該血清は通常、５～１０（体積）％の濃度で添加される。好ましい細胞培地は、無血清のものである。

血清の非存在下または血清低減培地での細胞増殖を促進するために、以下のポリペプチドの１つまたは複数を本発明の細胞培地に添加することができる。例：線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦを含む）、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ ａｌｐｈａおよびＴＧＦ ｂｅｔａを含む）、インターロイキン－１、－２，－６などのサイトカイン、顆粒球刺激因子、白血球抑制因子（ＬＩＦ）など。

他の実施形態では、培地は、ポリペプチド（すなわち、２０個を超えるアミノ酸を有するペプチド）を含まない。

本発明の培地はまた、短鎖ペプチドも含んでよい：例には、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギンおよびセリンのジペプチドが含まれる。

１つまたは複数の脂質を本発明の培地に添加することもできる。例：１２個、１４個、１６個、１８個、２０個または２４個の炭素原子（各炭素原子は分岐または非分岐）のリノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、パルミトリン酸、オレイン酸、ポリエン酸および／または脂肪酸、リン脂質、レシチン（ホスファチジルコリン）、およびコレステロール。これらの脂質の１つまたは複数を、無血清培地に補足物質として含めることができる。無血清培地において、ホスファチジン酸とリゾホスファチジン酸は、特定の足場依存性細胞（例：ＭＤＣＫ、マウス上皮細胞株、その他の腎臓細胞株）の増殖を活性化し、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルイノシトールはヒト線維芽細胞の増殖を活性化する。エタノールアミンとコレステロールは、特定の細胞株の成長を促進することも示されている。特定の実施形態では、細胞培地は脂質を含まない。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やトランスフェリンなどの１つまたは複数のキャリアタンパク質を培地に添加することもできる。キャリアタンパク質は、特定の栄養素や微量元素の運搬を助ける。ＢＳＡは通常、水溶液に対し不溶性のリノール酸やオレイン酸などの脂質のキャリアとして使用される。さらに、ＢＳＡは、Ｆｅ、ＣｕおよびＮｉなどの特定の金属のキャリアとしても機能する。タンパク質を含まない配合物では、動物由来ではないＢＳＡの代替品（例：シクロデキストリン）を脂質キャリアとして使用できる。

１つまたは複数の付着タンパク質（例：フィブロネクチン、ラミニンおよびプロネクチン）を細胞培地に添加して、足場依存性細胞の基材への付着を促進することもできる。

培地は、必要に応じて１つまたは複数の緩衝剤を含んでもよい。適切な緩衝剤は、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］－ピペラジン－Ｎ’－［２－エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、重炭酸塩、および細胞培養用途に適した他の緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。適切な緩衝剤は、培養された細胞に対する実質的細胞毒性を有することなく、緩衝能力を提供する緩衝剤である。適切な緩衝剤の選択は、細胞培養分野の当業者の対応範囲内である。

ポリアニオン性またはポリカチオン性化合物を培地に添加して、細胞が凝集するのを防ぎ、かつ懸濁液中での細胞の増殖を促進してもよい。

好ましい実施形態では、培地は液状である。しかし、培地は、ゲル様培地（例：寒天、カラギーナンまたはゼラチン培地）などの固体培地であってもよい。

好ましくは、培地は無菌形態である。

本発明の好ましい実施形態では、ケト酸は、０．０１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌまたは０．１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌまたは０．１ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌの濃度で、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌの濃度で、前記培地中に存在する。

上記の濃度は、非濃縮培地中の濃度、すなわち実際の培養体に存在する濃度として示されている。濃縮培地は、Ｘ倍高い濃度を有してよい。

本発明の代替実施形態の１つでは、ケト酸は、不足している非ケト類似体を含む培地にそれぞれ補充される。特定の実施形態では、培地は、ケトロイシンとロイシンの両方、および／またはケトバリンとバリンの両方、および／またはケトイソロイシンとイソロイシンの両方、および／またはケトフェニルアラニンとフェニルアラニンの両方を含む。代替実施形態では、アミノ酸は、培地中でケト類似体に置き換えられている。特定の実施形態では、培地は、ロイシンの代わりにケトロイシン、および／またはバリンの代わりにケトバリン、および／またはイソロイシンの代わりにケトイソロイシン、および／またはフェニルアラニンの代わりにケトフェニルアラニンを含む。

本発明の培地は、濃縮形態であってもよい。それは、（細胞の増殖と生成物形成をサポートする濃度に対し、）例えば、２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍の濃縮形態であってよい。このような濃縮培地は、当該濃縮培地を水性溶媒（例：水）で希釈して使用する培地を調製するのに有用である。そのような濃縮培地は、バッチ培養で使用されてもよいが、流加培養または連続培養（培養中に細胞に消費される栄養素を補充するために、濃縮栄養素組成物を進行中の細胞培養に添加する培養）においても有利に使用される。

本発明の他の実施形態では、培地は、乾燥形態、例えば、乾燥粉末の形態、または顆粒の形態、またはペレットの形態、または錠剤の形態である。

本発明はまた、細胞を培養するための本発明の培地の使用に関する。本発明の別の態様は、細胞培養体を生成するための本発明の培地の使用に関する。

本発明の好ましい実施形態は、動物細胞または植物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞を培養するための本発明による培地の使用に関する。特定の実施形態では、培養対象の細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＡＥ－１細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞、およびハイブリドーマ細胞である。本発明の好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ細胞である。

また、本発明の範囲に含まれるのは、細胞を培養する方法であり、前記方法は、前記細胞を本発明による細胞培地と接触させる工程を含む。本発明の一実施形態では、細胞を培養する方法は、細胞の培養をサポートする条件下で細胞を基礎培地と接触させる工程、および基礎細胞培地に本発明に係る濃縮培地を補充する工程を含む。好ましい実施形態では、基礎培地は、１日より長く濃縮供給物または培地で補充される。

別の態様は、本発明による培地の製造方法に関する。前記培地は、本発明による少なくとも１つのケト酸を含む。本発明による培地の製造方法は、本発明に係る少なくとも１つのケト酸を培地に添加する少なくとも１つの工程を有する。同様に、本発明の一態様は、細胞培地を作製するための本発明のケト酸の使用に関する。

別の態様は、培地の改変方法に関する。前記培地の改変は、本発明に係る少なくとも１つのケト酸を前記培地に添加する工程を有する。

別の態様は、液体培地の製造方法に関する。前記方法は、本発明による固体培地（例：乾燥粉末形態または顆粒形態またはペレット形態または錠剤形態の培地）を提供する工程と、前記固体培地を水などの水性培地に溶解する工程を含む。

本発明の別の態様は、細胞を培養するための培地における本発明に係るケト酸の使用に関する。本発明の別の態様は、細胞培養のための本発明に係るケト酸の使用に関する。

本発明はまた、（ｉ）前記細胞培養体を生成することができる細胞を提供する工程、（ｉｉ）前記細胞を本発明に係る培地と接触させる工程、および（ｉｉｉ）前記培地または前記細胞から前記細胞培養体を得る工程を有する細胞培養体の製造方法に関する。同様に、本発明は、細胞培養体を製造するための本発明に係るケト酸の使用に関する。

好ましい方法では、細胞培養体は、治療用タンパク質、診断用タンパク質、ヘパリンなどの多糖類、抗体、モノクローナル抗体、成長因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子、または酵素である。

本発明による細胞の培養は、バッチ培養、流加培養または連続培養で実施されることができる。

図１は、本発明に係る分岐鎖ケト酸（ＢＣＫＡ）カリウム塩の混合物の非存在下および存在下でのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）９型（ＡＡＶ９）およびアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）のウイルスベクター力価を示す。 図２は、本発明に係る分岐鎖ケト酸（ＢＣＫＡ）カリウム塩の混合物の非存在下および存在下でのＨＥＫ細胞におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）９型（ＡＡＶ９）およびアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）のウイルスベクター感染力（ルシフェラーゼ活性で測定）を示す。 図３は、Ｌ－ロイシンの代わりに様々な量のケトロイシンを含む細胞培地で培養したチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞の３回目の継代の積算生細胞密度を示す。 図４は、Ｌ－ロイシンの代わりに様々な量のケトロイシンを含む細胞培地で培養したＣＨＯ細胞によって生成された抗体の相対濃度を示す。 図５は、Ｌ－バリンに加えて様々な量のケトバリンを含む細胞培地で培養したＣＨＯ細胞の最大生細胞密度を示す。 図６は、Ｌ－バリンに加えて様々な量のケトバリンを含む細胞培地で培養したＣＨＯ細胞によって生成された抗体の相対濃度を示す。 図７は、３つの炎症誘発性サイトカイン分泌に対するＢＣＫＡ（１００μｇ ／ｍＬ）の効果を示す。 図８は、３つの炎症誘発性サイトカインの分泌に対するケトバリン（１００μｇ／ｍＬ）の効果を示す。 図９は、３つの炎症誘発性サイトカインの分泌に対するケトロイシン（１００μｇ／ｍＬ）の効果を示す。 図１０は、３つの炎症誘発性サイトカインの分泌に対するケトイソロイシン（１００μｇ／ｍＬ）の効果を示す。

実施例１：ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）９型（ＡＡＶ９）およびアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）のウイルスベクターの作製
カリウム塩の形のＢＣＫＡ混合物（１ｍＭ）を添加して、または添加せずに、無血清培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ ２９３Ｔ）細胞を培養した。使用した混合物は、ケトロイシン：ケトイソロイシン：ケトバリンの比率が２：１：１である分岐鎖ケト酸のＫ^＋－塩を含んでいた。細胞をプラスミドＤＮＡでトランスフェクトして、分岐鎖ケト酸の混合物の存在下または非存在下で、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）９型（ＡＡＶ９）およびアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）のウイルスベクターを作製した。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞で生成されたプラスミドの量を、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて測定した。
ｑＰＣＲ分析では、培養細胞をウェルから削りとり、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレット化した。上清を除去し、残りの１．０ｍＬを培地に残した。細胞を再懸濁し、－８０℃で凍結した。細胞の溶解を確実にするために、それらを三度凍結、解凍した。最終解凍の後、細胞を１，０００ｘｇで５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。カプセル化されていない遊離ウイルスＤＮＡとカプシドを無傷ウイルス粒子から除去するために、上清をデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）とプロテイナーゼ Ｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）で処理した。リアルタイムｑＰＣＲを行い、ＡＡＶ ＤＮＡのポリＡ領域を検出した。
分岐鎖ケト酸（ＢＣＫＡ）カリウム塩の混合物の非存在下および存在下でのアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）９型（ＡＡＶ９）およびアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）のウイルスベクター力価を図１に示す。ＢＣＫＡを添加していない無血清培地で測定されたウイルスベクター力価を「１」として基準化し、培地にＢＣＫＡを添加した場合と比較したウイルスベクター力価の違いを示した。予期せぬことに、細胞培養のために無血清培地にＢＣＫＡカリウム塩の混合物を添加すると、ＡＡＶ２では２．３倍高いウイルスベクター力価、ＡＡＶ９では３．７倍高いウイルスベクター力価が得られた。

実施例２：アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）９型（ＡＡＶ９）およびアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）のウイルスベクターによる、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞の感染
実施例１に記載のようにトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞によって生成されたウイルス粒子を収集し、新鮮なＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、実施例１で使用されたＢＣＫＡカリウム塩の混合物の非存在下または存在下で、無血清培地中でウイルス上清とともに培養した。ルシフェラーゼアッセイを用いてウイルス粒子の感染力を分析した。ルシフェラーゼ遺伝子もウイルスベクターに組み込まれており、検出されるルシフェラーゼ活性は、生成されるルシフェラーゼの量に比例し、細胞へのウイルス粒子の取り込みの計測値として機能する。
図２は、ＢＣＫＡカリウム塩の混合物の非存在下および存在下でのアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）９型（ＡＡＶ９）およびアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）のウイルスベクター感染力（ルシフェラーゼ活性で測定）を示す。ＢＣＫＡを添加していない無血清培地で測定した感染力を「１」として基準化し、培地にＢＣＫＡを添加した場合と比較したウイルスベクター感染力の違いを示した。予期せぬことに、細胞培養のために無血清培地にＢＣＫＡカリウム塩の混合物を添加すると、ＡＡＶ２の感染力が１．５倍に増加し、ＡＡＶ９の感染力が１．６５倍に増加した。

実施例３：濃度の異なるケトロイシンの存在下でのチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞における抗体生成
チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞（サブクローン ＤＧ４４）を生成する抗体を、Ｌ－グルタミン（８ｍＭ）を含むＴＣ４２／ＣＨＯＭＡＣＳ ＣＤ培地（ＴｅｕｔｏＣｅｌｌ ＡＧ社）の振とうフラスコ（培養容量がそれぞれ５０ｍＬまたは１００ｍＬである１２５ｍＬ容量振とうフラスコまたは２５０ｍＬ容量振とうフラスコ）で培養した。培地については、２つの溶液を混合することにより調製した。１つ目の溶液は、従来の培地配合物（Ｌ－ロイシンと塩化カルシウムを含む）を含んでいた。２つ目の溶液では、培地中のアミノ酸Ｌ－ロイシンを、等モル量でカルシウム塩としてケトロイシン（１７８ｍｇ／Ｌ）に置き換えた。これらの溶液を異なる比率で混合した。異なる混合物で培養した細胞の増殖を、従来培地で培養した細胞と比較した。
図３は、Ｌ－ロイシンの代わりに様々な量のケトロイシンを含む培地で培養したＣＨＯ細胞の積算生細胞密度を示す。Ｘ軸は、１ｍＬあたり１０^６個の細胞の積算生細胞密度（ＶＣＤ）を示す。Ａは１７８ｍｇ／Ｌのケトロイシンを含む培地で培養した細胞に対応し、Ｂは３０％（体積％）のケトロイシン溶液を含む混合物に対応し、Ｃは５％（体積％）のケトロイシン溶液を含む混合物に対応する。比較例は、Ｌ－ロイシンのみを含む。最終培地中のケトロイシンの濃度を表１に示す。Ｌ－ロイシンの代わりにケトロイシンを含む培地では、生細胞密度がわずかに減少した。しかし、アミノ酸Ｌ－ロイシンをケト類似体ケトロイシンに置き換え得ることは明確に示すことができた。
表１：最終培地中のケトロイシン（ｋｅｔｏ－ｌｅｕ）濃度

図４は、図３に示すようにＬ－ロイシンの代わりに様々な量のケトロイシンを含む培地で培養したＣＨＯ細胞によって生成された抗体の相対濃度を示す。Ｌ－ロイシンを含む比較培地（比較例）で培養した細胞によって生成された抗体の濃度を「１．０」として標準化した。これは、抗体生成のために、培養ＣＨＯ細胞においてＬ－ロイシンを分岐鎖ケト酸であるケトロイシンに置き換え得ることを明確に示している。

実施例４：濃度の異なるケトバリンの存在下でのチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞における抗体生成
チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞（サブクローン ＤＧ４４）を生成する抗体を、８ｍＭのＬ－グルタミンを含むＴＣ４２／ＣＨＯＭＡＣＳ ＣＤ培地（ＴｅｕｔｏＣｅｌｌ ＡＧ社）の振とうフラスコ（培養容量がそれぞれ５０ｍＬまたは１００ｍＬである１２５ｍＬ容量振とうフラスコまたは２５０ｍＬ容量振とうフラスコ）で培養した。培地については、２つの溶液を混合することにより調製した。１つ目の溶液は、従来の培地配合物（Ｌ－バリンおよび塩化カルシウム）を含んでいた。２つ目の溶液では、ケト酸であるケトバルをカルシウム塩として１６３ｍｇ／Ｌで従来培地に添加した。これらの溶液を異なる比率で混合した。
図５は、Ｌ－バリンに加えて様々な量のケトバリンを含む培地で培養したＣＨＯ細胞の最大生細胞密度を示す。Ｘ軸は、１ｍＬあたり１０^６個の細胞の最大生細胞密度（ＶＣＤ）を示す。ＡはＬ－バリンとケトバリンを１６３ｍｇ／Ｌで含む溶液を表す。Ｂは、ケトバリンを含む培地を７０％（体積％）と従来培地を３０％（体積％）含む混合物である。Ｃは、ケトバリンを含む培地を５５％（体積％）と従来培地を４５％（体積％）含む混合物である。Ｄは、５％（体積％）のケトバリン溶液を含む。比較例は、上記の従来培地に対応する。最終培地中のケトバリンの濃度を表２に示す。
表２：最終培地中のケトバリン（ｋｅｔｏ－ｖａｌ）濃度

図６は、図５に示すように様々な量のケトバリンとＬ－バリンを含む培地で培養したＣＨＯ細胞によって生成された抗体の相対濃度を示す。比較例で培養した細胞によって生成された抗体の濃度を「１．０」として標準化した。ケトバリンの非存在下で培養した細胞と比較すると、ケトバリンの存在下では抗体生成が増強されることを明確に示すことができた。

実施例５：サイトカイン分泌に対するＢＣＫＡの効果
最初に、マクロファージを、分化を介してＴＨＰ－１単球から得た。予防的シナリオを調査する場合、ケトロイシン：ケトイソロイシン：ケトバリンの比率が２：１：１である分岐鎖ケト酸のＣａ^＋－塩を含むＢＣＫＡ混合物を、ＬＰＳによる免疫反応を誘発する２４時間前に添加した。ＢＣＫＡによる処理では、さまざまな期間を選択した。ＬＰＳ処理が開始されると、ＢＣＫＡによる処理を停止するか（ＬＰＳ刺激の前のＢＣＫＡ処理）、あるいはＢＣＫＡによる処理を継続した（ＬＰＳ刺激に対する一定のＢＣＫＡ処理）。免疫反応のレベルを評価するために、炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－６を細胞培養上清で測定した。ＢＣＫＡで処理した細胞の炎症誘発性サイトカインの発現を図１に示す。
図７は、３つの炎症誘発性サイトカイン分泌に対するＢＣＫＡ（１００μｇ ／ｍＬ）の効果を示す。サイトカイン量を３つの独立したアッセイで測定し、各アッセイは３回ずつ行われた。サイトカイン量を対応する各サンプルの細胞数に正規化した。エラーバーは標準偏差を表す。
陽性対照および陰性対照は、いかなるときもＢＣＫＡには曝露されず、刺激されたベースラインに対してリポ多糖によって引き起こされたサイトカイン放出を示す。ＢＣＫＡで処理し、その後炎症刺激としてＬＰＳで処理した細胞を「炎症前（＋）」としてマークし、ＬＰＳには曝露されていないが、ＢＣＫＡで同様に処理した細胞を「炎症前（－）」としてマークする。後者は、ＢＣＫＡ自体がサイトカイン放出を引き起こしたか、または別の方法でアッセイを妨害したかどうかをチェックするための対照群として機能した。天然化合物で処理した細胞は陰性対照と同じサイトカインプロファイルを示したので、これを除外した。ＬＰＳ刺激の前にＢＣＫＡで前処理した場合、サイトカイン放出の著しい減少が観察された。これにより、免疫反応に対するＢＣＫＡによる前処理および継続処理の顕著な効果が確認された。さらに、単一のケト酸であるケトバリン、ケトロイシンおよびケトイソロイシンを使用して、同様の結果が得られた。
ケトバリンで処理した細胞の炎症誘発性サイトカインの発現を図８に示す。図９は、ケトロイシンで処理した炎症誘発性サイトカインの発現を示す。図１０では、細胞はケトイソロイシンで処理されている。
図８は、３つの炎症誘発性サイトカインの分泌に対するケトバリン（１００μｇ／ｍＬ）の効果を示す。サイトカイン量を３つの独立したアッセイで測定し、各アッセイは２回ずつ行われた。サイトカイン量を対応する各サンプルの細胞数に正規化した。エラーバーは標準偏差を表す。
図９は、３つの炎症誘発性サイトカインの分泌に対するケトロイシン（１００μｇ／ｍＬ）の効果を示す。サイトカイン量を３つの独立したアッセイで測定し、各アッセイは２回ずつ行われた。サイトカイン量を対応する各サンプルの細胞数に正規化した。
図１０は、３つの炎症誘発性サイトカインの分泌に対するケトイソロイシン（１００μｇ／ｍＬ）の効果を示す。サイトカイン量を３つの独立したアッセイで測定し、各アッセイは２回ずつ行われた。サイトカイン量を対応する各サンプルの細胞数に正規化した。エラーバーは標準偏差を表す。

Claims (16)

1. ケトロイシン、ケトバリン、ケトイソロイシンおよびケトフェニルアラニンから選択される少なくとも１つのケト酸、ならびに／またはこれらのケト酸の塩を含む、細胞培地などの培地。
2. 前記ケト酸がケトロイシン、ケトバリン、ケトイソロイシンから選択される分岐鎖ケト酸である、請求項１記載の培地。
3. ケトロイシン、ケトバリンおよびケトイソロイシンを約２：１：１の比率で含む、請求項１または請求項２記載の培地。
4. 前記ケト酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を含む、請求項１～請求項３のいずれか一項記載の培地。
5. 前記ケト酸のＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋塩、好ましくはＮａ^＋またはＫ^＋塩を含む、請求項１～請求項４のいずれか一項記載の培地。
6. 少なくとも１つの炭水化物、少なくとも１つの遊離アミノ酸、少なくとも１つの無機塩、緩衝剤、および／または少なくとも１つのビタミンをさらに含む、請求項１～請求項５のいずれか一項記載の培地。
7. 液体、ゲル、粉末、顆粒、ペレットまたは錠剤の形状である、請求項１～請求項６のいずれか一項記載の培地。
8. 無血清培地または特定培地である、請求項１～請求項７のいずれか一項記載の培地。
9. 前記ケト酸が、０．０１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌまたは０．１ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌまたは０．１ｇ／Ｌ～０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ～０．２ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項１～請求項８のいずれか一項記載の培地。
10. 使用時の濃度に対し、２倍、３倍、３．３３倍、４倍、５倍または１０倍に濃縮されている、請求項１～請求項９のいずれか一項記載の培地。
11. 細胞を培養するための、請求項１～請求項１０のいずれか一項記載の培地の使用。
12. 前記細胞が動物細胞または植物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である、請求項１１記載の使用。
13. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＡＥ－１細胞、昆虫細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、幹細胞、皮膚細胞、内皮細胞およびハイブリドーマ細胞からなるリストから選択される、請求項１２記載の使用。
14. 細胞を培養するための、培地でのケトロイシン、ケトバリン、ケトイソロイシンおよびケトフェニルアラニンから選択される１つまたは複数のケト酸、ならびに／またはこれらのケト酸の塩の使用。
15. 細胞培養体を製造可能な細胞を提供し、
    前記細胞を、請求項１～請求項９のいずれか一項記載の培地と接触させ、
    前記培地または前記細胞から前記細胞培養体を得る工程
    を含む、細胞培養体の製造方法。
16. 前記細胞培養体が、治療用タンパク質、診断用タンパク質、ヘパリン等の多糖類、抗体、モノクローナル抗体、成長因子、インターロイキン、ウイルス、ウイルス様粒子および酵素からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。

Images