JP2022504139A - バイオフィルムの除去のためのｈｍｇｂ１タンパク質誘導体 - Google Patents

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Abstract

Figure 2022504139000001
同じ有効な抗バイオフィルム活性を有するように操作されているが、より小型であり、炎症を誘発しないＨＭＧＢ１の誘導体が本明細書で提供される。本出願人は、自然免疫エフェクターの誘導体を転用することにより、細菌バイオフィルム媒介性感染症の処置における新たな概念を本明細書に開示する。ＨＭＧＢ１ドメインは機能的に異なる。抗バイオフィルム活性を有するドメインバリアントであって、炎症促進性転帰を伴わないドメインバリアントは、過度な炎症の結果を伴わずにバイオフィルム媒介性感染症を処置するためのＨＭＧＢ１の一実施形態に相当する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１８年１０月５日に出願された米国仮出願６２／７４２，１０２号（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
連邦政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられた認可番号ＤＣ０１１８１８の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
開示の分野
本発明は、一般に、臨床的または工業的細菌バイオフィルムを低減および／または治癒するための方法および組成物に関する。
背景
人体内のバイオフィルム中で生き残っている細菌は、すべての慢性／再発性疾患の約３分の２を引き起こす。これらのバイオフィルムは、自然免疫系および適応免疫系、抗生物質ならびに他の抗菌剤がバイオフィルム内の細菌にアクセスするのを妨げるＤＮＡから主に構成されることが多い外側「スライム」により保護された細菌から構成される。バイオフィルムは、体から感染を除去することを極めて困難にする。さらに、バイオフィルムは、致命的な結果を伴うことが多い将来の急性感染症の保菌物として作用し得る。
公知の真正細菌すべてにおいて、ＤＮＡＢＩＩタンパク質ファミリーの少なくとも１つのタンパク質が見出され、細菌細胞の外側に天然に見出される。それらは強力な自然免疫反応を誘発するが、宿主被験体は、感染の結果として、ファミリーメンバーに対する特異的な抗体を自然に産生することができない。細菌バイオフィルムに伴う主な問題は、宿主免疫系ならびに／または抗生物質および他の抗菌薬がバイオフィルム内に保護された細菌にアクセス不可能であることである。
バイオフィルムは工業環境にも存在する。例えば、バイオフィルムは、生産現場からガソリンスタンドの貯蔵タンクまでの広範囲の石油処理問題に関係する。前記現場では、硫酸還元バイオフィルム細菌は硫化水素を産生する（サワーオイル（ｓｏｕｒｅｄ ｏｉｌ））。プロセスパイプラインでは、バイオフィルム活性は、フィルタおよび開口部を妨げるスライムを発生させる。バイオフィルムおよびバイオフィルム生物はまた、パイプラインおよび石油処理装置の腐食を引き起こす。これらの問題は、油またはガス生産設備全体を通して、汚損および腐食性バイオフィルム生物が最終製品貯蔵タンクの表面上にさえ見出される程度まで顕在化し得る。
家庭では、バイオフィルムは、微生物成長を支える任意の表面中にまたはその上に、例えば、排水管に、調理面に、トイレに、ならびにスイミングプールおよびスパに見出される。
バイオフィルムは、家庭および工業の両方の広範囲の水処理に関係する。それらは処理装置の表面上で成長し、装置の性能を害し得る（例えば、熱伝達の劣化またはフィルタおよび膜の閉塞）。冷却塔充填材上で成長するバイオフィルムは、充填材の崩壊を引き起こすために十分な重量を追加し得る。バイオフィルムは、高度に特殊化されたステンレス鋼の腐食でさえも引き起こす。水処理におけるバイオフィルムは、最終製品の価値を劣化させ得る。飲料水配送システムにおいて成長するバイオフィルムは、水の美的品質を劣化させる潜在的な病原生物、腐食性生物または細菌を有し得る。
したがって、関連細菌感染症を処置または死滅させて表面および水系からそれらを除去するために、バイオフィルム保護壁を突破する必要性が存在する。本開示はこの必要性を満たし、関連利点も提供する。
概要
細菌バイオフィルムは、既存の処置モダリティに対して抵抗性であることで有名である（例えば、それらは、抗菌薬に対して、それらの浮遊性カウンターパートよりも１０００倍を超えて耐性である）。バイオフィルム媒介性感染症の寄与死亡率および経済的負担の点で高い有病率および重大な結果を考慮すると、新規治療アプローチが緊急に必要とされる。バイオフィルムの明確な特徴の１つは、バイオフィルム細胞が埋め込まれた細胞外高分子物質である。細胞外高分子物質の重要な構成成分は、バイオフィルムの構造的完全性に重要な細胞外ＤＮＡおよび細菌ＤＮＡＢＩＩファミリーのタンパク質である。ＤＮＡＢＩＩタンパク質のターゲティングおよび隔離は、バイオフィルムを破壊し得る。高移動度群Ｂ１（ＨＭＧＢ１）タンパク質は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質と同じＤＮＡ構造に結合して細菌バイオフィルムの破壊を引き起こすＤＮＡ結合真核生物タンパク質である。ＨＭＧＢ１の誘導体は、同じ有効な抗バイオフィルム活性を有するように操作され得るが、より小型であり、炎症を誘発しない。
本出願人は、自然免疫エフェクターの誘導体を転用することにより、細菌バイオフィルム媒介性感染症の処置における新たな概念を本明細書に開示する。ＨＭＧＢ１ドメインは機能的に異なる。抗バイオフィルム活性を有するドメインバリアントであって、炎症促進性転帰を伴わないドメインバリアントは、過度な炎症の結果を伴わずにバイオフィルム媒介性感染症を処置するためのＨＭＧＢ１の一実施形態に相当する。インビボおよびエクスビボ実験は、細菌核様体関連タンパク質（ＩＨＦおよびＨＵ）のＤＮＡＢＩＩファミリーに対する抗体が、様々な難治性ヒト感染症を引き起こす多くの異なる細菌バイオフィルムに対して非常に有効であることを示した。対照的に、本開示は、免疫反応構成成分ＨＭＧＢ１を利用して、過剰な炎症の結果を伴わずにバイオフィルム媒介性疾患を処置する。インビトロで細菌バイオフィルムをＨＭＧＢ１およびその様々な短縮ドメイン（Ａボックス、Ｂボックス、Ｂボックスリンカー、変異ＢボックスＣ１０６Ｓ、ＡＢボックスおよびリンカーを有するすべて）の抗バイオフィルム特性に曝露した。
タンパク質誘導体を含有する組成物および製剤は、難治性または慢性または再発性バイオフィルム媒介性感染症の処置において有用である。組成物は、耐性院内感染症（留置医療器具関連感染症、例えばカテーテルまたは補綴デバイス関連感染症、ならびに嚢胞性線維症患者における慢性／再発性感染症、例えば耳感染症および呼吸器感染症を含む）を処置するために有用である。加えて、バイオフィルムから放出される多くの細菌は、宿主防御および抗菌剤の両方に対してより感受性であることが示されているので、それらは、確立された処置（すなわち、抗生物質）と組み合わせて使用され得る。
したがって、一態様では、本開示は、Ｋ１２、Ｃ２３およびＣ４５から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸に改変されたネイティブＫまたはＣの変異）を必要に応じて含むか、もしくはあるいはそれから本質的になるか、もしくはさらにはそれからなる単離されたＡボックスポリペプチド、またはＫ１２、Ｃ２３およびＣ４５から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸に改変されたネイティブＫまたはＣの変異）を含むその同等物を提供する。一態様では、変異はＣ４５Ｓ変異である。Ａボックスポリペプチドは、一方または両方の末端に位置するリンカーまたはペプチド配列をさらに含み得る。非限定的な例は、配列ＰＰＫＧＥＴＫＫＫＦのポリペプチドリンカーである。組換え的に産生される場合、Ｂボックスポリペプチドは、部分的または完全にアセチル化、酸化、またはリン酸化され得る。一態様では、Ａボックスポリペプチドは、１つまたはそれを超える上記変異を必要に応じて含有する野生型ＨＭＧＢ１ポリペプチドのアミノ酸１～７０を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
アミノ酸Ｃ１０６における変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸へのネイティブシステインの変異）を必要に応じて含むか、もしくはあるいはそれから本質的になるか、もしくはさらにはそれからなる単離されたＢボックスポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）、またはアミノ酸Ｃ１０６における変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸へのネイティブシステインの変異）を含むその同等物も本明細書で提供される。一態様では、Ｂボックスポリペプチドは、ＨＭＧＢ１ポリペプチドの約８０～約１７６または約８８～約１６４または約８９～約１６２またはさらには約８０～約１６４を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。野生型ＨＭＧＢ１ Ｂボックスポリペプチドの改変のためのさらなる位置は図１Ｃに示されている。
Ｂボックスポリペプチドは、一方または両方の末端に位置するリンカーまたはペプチド配列をさらに含み得る。非限定的な例は、配列ＰＰＫＧＥＴＫＫＫＦのポリペプチドリンカーである。組換え的に産生される場合、Ｂボックスポリペプチドは、部分的または完全にアセチル化、酸化、またはリン酸化され得る。
さらなる態様では、Ｋ１２、Ｃ２３、Ｃ４５またはＣ１０６から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸に改変されたネイティブＫまたはＣの変異）を必要に応じて含むか、もしくはあるいはそれから本質的になるか、もしくはさらにはそれからなる単離されたＡＢボックスポリペプチド、またはＫ１２、Ｃ２３およびＣ４５から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸に改変されたネイティブＫまたはＣの変異）を含むその同等物が本明細書で提供される。一態様では、変異はＣ４５Ｓ変異である。別の態様では、ポリペプチドは、アミノ酸Ｃ１０６における変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸へのネイティブシステインの変異）を含むか、またはＫ１２、Ｃ２３、Ｃ４５から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異と、アミノ酸Ｃ１０６における変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸へのネイティブシステインの変異）とを含むその同等物である。一態様では、ＡＢボックスポリペプチドおよび同等物は、Ｃ４５ＳおよびＣ１０６Ｓ変異を含む。一態様では、ＡＢボックスポリペプチドまたはその同等物は、前記アミノ酸変異を有する野生型ＨＭＧＢ１ポリペプチドのアミノ酸１～１７６または１～１６２またはさらには１～１６４を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
さらに別の態様では、単離されたＡＢボックスポリペプチドは、ＡボックスポリペプチドおよびＢボックスポリペプチドを連結する位置にあるリンカーポリペプチドと、一態様では、ＢボックスおよびＣボックスポリペプチドを連結する第２のリンカーとをさらに含む。非限定的な例は、配列ＰＰＫＧＥＴＫＫＫＦのポリペプチドリンカーである。組換え的に産生される場合、ＡＢまたはＡ、ＢおよびＣボックスポリペプチドは、部分的または完全にアセチル化、酸化、またはリン酸化され得る。一態様では、必要に応じて部分的または完全にアセチル化、酸化またはリン酸化され得るＡおよび／またはＢボックスドメインにおいて１つまたはそれを超える本明細書に記載されるアミノ酸置換を有する単離された変異ＨＭＧＢ１ポリペプチドが提供される。
一態様では、単離されたポリペプチドは、検出可能な標識をさらに含む。
本明細書に記載される単離されたポリペプチドの１つまたはそれよりも多くを含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる組換えポリペプチドであって、いずれかまたは両方の末端に位置する少なくとも１つのさらなるアミノ酸をさらに含む組換えポリペプチドも本明細書で提供される。
本開示はまた、本明細書に記載される変異ポリペプチドに結合するかまたはそれに対して産生された抗体を提供する。抗体は、診断剤および予後予測剤として有用である。１つまたはそれを超える本明細書に記載される単離されたポリペプチドおよび／または抗体ならびに担体、例えば薬学的に許容され得る担体がさらに提供される。
本開示はまた、本明細書に記載される単離されたポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドおよびそれらの相補体を提供する。一態様では、ポリヌクレオチドは検出可能に標識される。ポリヌクレオチドは、必要に応じて、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび／またはエンハンサーに機能的に連結され得る。宿主細胞などの適切な発現系においてポリヌクレオチドを発現させ、次いで産生させ、組換えにより産生されたポリペプチドを単離することにより、ポリペプチドを組換え的に生産する方法がさらに提供される。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなるベクターがまたさらに提供される。
別の態様では、本明細書に記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターの１つまたはそれよりも多く（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）を含む単離された宿主細胞が本明細書で提供される。担体と、本明細書に記載されるポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはベクターの１つまたはそれよりも多く（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）とを含む組成物がさらに提供される。一態様では、担体は、薬学的に許容され得る担体である。
ポリペプチドおよびそれらを含む組成物は、複数の用途を有する。例えば、それらは、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質または微生物ＤＮＡを本明細書に記載されるポリペプチドまたは組成物と接触させることにより、微生物ＤＮＡへのＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質の結合を阻害、競合または滴定するための方法において使用され得る。それらはまた、バイオフィルムを本明細書に記載されるポリペプチドまたは組成物と接触させることにより、微生物バイオフィルムを阻害、防止または破壊するための方法において使用され得る。
ポリペプチドおよび組成物はまた、被験体に、有効量の本明細書に記載される組成物またはポリペプチドを投与することにより、被験体におけるバイオフィルムを阻害、防止もしくは破壊するか、またはそれに関連する感染症もしくは疾患を処置する方法において使用され得る。
ポリペプチドおよび組成物は、被験体に、有効量の本明細書に記載される組成物またはポリペプチドを投与することにより、被験体においてバイオフィルムを産生する微生物感染症を阻害、予防または処置するための方法においてさらに使用され得る。
前記方法は、有効量のさらなる薬剤、例えば抗菌剤と接触させるかまたはそれを投与して、根底にある感染症を処置することをさらに含み得る。
これらの方法により処置され得るバイオフィルムおよび感染症は、細菌感染、例えば、ＥＳＫＡＰＥ病原体、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍｅｓ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（分類不能）（ＮＴＨＩ）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる感染により引き起こされ得る。バイオフィルムにより引き起こされるデバイス関連感染症としては、例えば、心室派生物（ventricular derivation）、コンタクトレンズ上の、気管内チューブ、人工心臓弁、ペースメーカーおよび血管移植片上の、組織充填材および豊胸インプラント上の、末梢血管カテーテル上の、尿カテーテル上の、整形外科インプラントおよび補綴関節上のバイオフィルムにより引き起こされる感染症が挙げられる。前記組成物および方法により処置され得る組織関連感染症としては、例えば、慢性中耳炎、慢性副鼻腔炎、慢性扁桃炎、歯垢、慢性喉頭炎、心内膜炎、肺感染症（上気道、中気道および下気道感染症（耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、さらには慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の悪化、慢性咳、嚢胞性線維症（ＣＦ）および市中肺炎（ＣＡＰ）の合併症および／または主因）、腎臓結石、胆道感染症、***症、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ感染症、骨髄炎、表皮の創傷および慢性創傷が挙げられる。
被験体は、哺乳動物、例えばヒトまたは乳児または若年者（ｊｕｖｅｎｉｌｌｅ）であり得る。
本明細書に記載される単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または組成物と使用のための指示とを含むか、またはあるいはそれらからなるか、またはさらにはそれらからなるキットがさらに提供される。
図１Ａ～１Ｄ：ＨＭＧＢ１、ＤＮＡＢＩＩ／ＨＭＧＢ１－ＤＮＡ複合体の構造。（図１Ａ）ＨＭＧＢ１は、３つのドメイン：Ａボックス、Ｂボックスおよび酸性Ｃテールから構成される。Ａ＋Ｂボックスは主にＤＮＡ結合ドメイン（ブラケット）であり、Ｃテールは核機能、転写刺激および抗菌活性を媒介する。各ドメインのＡＡが示されている（左）。Ｃ２３およびＣ４５はジスルフィド結合を形成して、ＤＮＡ結合親和性の減少および炎症促進性活性の増加をもたらし得る。Ｃ１０６は、ＲＬＲ４－ＭＤ２結合を介して炎症促進性活性を媒介する。Ｃ１０６Ｓ変異は、結合の喪失を伴わずに炎症促進性反応を減少させることが示されている。（図１Ｂ）左：ＤＮＡに結合したＩＨＦ二量体。ＩＨＦのβ－リボンアームは副溝を貫通してＤＮＡを屈曲させ、凹面側からＮ末端α－ヘリックス周囲に分子を巻き付ける。右：ＤＮＡに結合した２つのＨＭＧＢ１ Ａボックスドメイン。ネイティブＨＭＧＢ１中のＡボックスおよびＢボックスの結合を模倣する。α－ヘリックスは副溝に結合し、凸面からＤＮＡ分子を屈曲させる。ＰＤＢ ４ＱＲ９からの改変。ＨＭＧＢ１ポリペプチド、短縮体（truncate）、融合体および変異バージョンのアミノ酸配列は、後掲の配列表に提供されている。（図１Ｃ）ＨＭＧＢ１ Ｂボックス構築物は、ＮおよびＣ末端リンカーと、間にフレキシブルリンカーを有する２つの予測α－ヘリックス領域（ｔｗｏ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ α－ｈｅｌｏｃａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ）とから構成される。Ｂボックス中の複数のアミノ酸（ＡＡ）は翻訳後修飾され得る（ＰＴＭ、Ｌｙｓのアセチル化／メチル化、Ａｓｎのグリコシル化、Ｔｙｒのリン酸化またはＣｙｓの酸化）。しかしながら、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析からｒＨＭＧＢ１またはｎＨＭで観察されたペプチドの＞２０％で、ＢボックスＰＴＭは存在しなかった。（図１Ｄ）トランケーションは、ＮおよびＣ末端ならびに２つのα－ヘリックス領域のいずれかからフレキシブルリンカーを除去する。２つの最小ヘリックス領域トランケーション（ＡＡ９９～１３３、１３８～１６４）は、抗バイオフィルム活性を維持すると考えられる。
図２：ＨＭＧＢ１媒介性バイオフィルム崩壊のモデル。ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ホリデイジャンクション（ＨＪ）に似た頂点構造への結合を介してｅＤＮＡ足場を安定化する。抗体（Ｙ）はＤＮＡＢＩＩタンパク質を隔離し、動的平衡をシフトさせ、崩壊をもたらし得る。ＨＭＧＢ１もまた、ＤＮＡに結合して一過性の不安定な中間体（ブラケット）を形成することにより、ｅＤＮＡ構造を不安定化し得る。
図３：ＨＭＧＢ１および構築したバリアントの構造。大腸菌において発現される全長組換えＨＭＧＢ１（ｒＨＭＧＢ１）は、Ａボックス、ＢボックスおよびＣテールから構成される３つのドメインを含有する。ＨＭＧＢ１ ＡＢボックス構築物は、ＡおよびＢドメインと、ＢボックスおよびＣテールの間のＣ末端リンカーとから構成されるが、Ｃテールを欠く。Ａボックス構築物は、Ａボックスと、ＡおよびＢボックスの間のＣ末端リンカーとを含有するが、ＢボックスおよびＣテールを欠く。Ｂボックス構築物は、ＮおよびＣ末端リンカーを含有するが、ＡボックスおよびＣテールを欠く。ｒＨＭＧＢ１（ｍＨＭＧＢ１）中のＣ４５Ｓ変異と、Ｂボックス（ｍＢボックス）中のＣ１０６Ｓ変異とを作製して、ＨＭＧＢ１の炎症促進性活性を減少させた。図１も参照のこと。
図４：ＨＭＧＢ１バリアントはＤＮＡ結合能力を維持する。漸増濃度（１００および２５０ｎＭ）の市販のウシＨＭＧＢ１（ｂＨＭＧＢ１）、ＢボックスＣ１０６Ｓ（ｍＢボックス）、ｒＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ１ Ｃ４５Ｓ（ｍＨＭＧＢ１）、Ａボックス、ＢボックスおよびＡ＋Ｂボックスを５’末端標識６－カルボキシフルオレセイン標識ホリデイジャンクション（ＨＪ）ＤＮＡ（２０ｎＭ）と共にインキュベートし、次いで、６％非変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。ＨＪ移動の差異により示されているように、ＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ１バリアントはＤＮＡ結合活性を保持する。
図５Ａ～５Ｅ：優先度の高い細菌病原体に対するＨＭＧＢ１バリアントの抗バイオフィルム効果（Ａｎｔｉ－ｂｌｏｆｌｌｍ ｅｆｆｅｃｔ）。示されているＨＭＧＢ１バリアントまたはＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗体（α－ｌＨＦＥｃｌｇＧ、１μＭ）を２４時間の時点で各予備形成細菌バイオフィルムにインビトロで添加した。１６時間のインキュベーション後、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、次いで、共焦点レーザー走査顕微鏡法により視覚化した。ＣＯＭＳＴＡＴにより画像を分析して平均厚さを計算し、対照との比較をプロットした。（図５Ａ）ＵＰＥＣ、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、ＮＴＨＩまたはＥＳＫＡＰＥ病原体に添加した全長ＨＭＧＢ１アイソフォーム（特に指示がない限り２００ｎＭ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＥＳＫＡＰＥ）については、８００ｎＭ ｒＨＭＧＢ１および２００ｎＭ ｍＨＭＧＢ１を添加した。Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（ＥＳＫＡＰＥ）については、８００ｎＭ ｒＨＭＧＢ１、８００ｎＭ ｍＨＭＧＢ１、または３．３μＭのα－ｌＨＦＥｃｌｇＧを添加し、１６時間ではなく１時間インキュベートして、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍプロテアーゼによる潜在的な分解を回避した。（図５Ｂ）漸増濃度のｒＨＭＧＢ１と共にインキュベートしたＵＰＥＣバイオフィルムの代表的な画像。（図５Ｃ）上記のように抗バイオフィルム活性（ａｎｔｉ－ｂｌｏｆｉｌｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ）について、ＨＭＧＢ１（２００ｎＭ）の個々のドメインを試験した（点線は対照値を示す）。バーはＳＥＭを表す。対応のないｔ検定を用いて、対照と比較した統計的有意性を評価した。＊Ｐ＜０．０５。ＨＭＧＢ１およびそのバリアントは、優先度の高いヒト病原体により形成された樹立されたバイオフィルムを有意に破壊することができたが、Ａボックスは破壊することができなかった。（図５Ｄ～５Ｅ）ＨＭＧＢ１およびバリアントは、予備形成Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバイオフィルムを破壊する。ｒＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ１ Ｃ４５Ｓ（ｍＨＭＧＢ１）、ウシＨＭＧＢ１（ｂＨＭＧＢ１）、Ｂボックス、ＢボックスＣ１０６Ｓ（ｍＢボックス）、ＡボックスおよびＡ＋Ｂボックスを２４時間の時点で予備形成Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバイオフィルムに添加した（２００ｎＭ）。１６時間のインキュベーション後、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、次いで、共焦点レーザー走査顕微鏡法により視覚化した。ＣＯＭＳＴＡＴにより画像を分析して、平均厚さおよび総バイオマスを計算した。エラーバーはＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ＝非有意。ＨＭＧＢ１およびそのバリアントは、樹立されたＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバイオフィルムを有意に破壊したが、Ａボックスは破壊しなかった。 図５Ａ～５Ｅ：優先度の高い細菌病原体に対するＨＭＧＢ１バリアントの抗バイオフィルム効果（Ａｎｔｉ－ｂｌｏｆｌｌｍ ｅｆｆｅｃｔ）。示されているＨＭＧＢ１バリアントまたはＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗体（α－ｌＨＦＥｃｌｇＧ、１μＭ）を２４時間の時点で各予備形成細菌バイオフィルムにインビトロで添加した。１６時間のインキュベーション後、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、次いで、共焦点レーザー走査顕微鏡法により視覚化した。ＣＯＭＳＴＡＴにより画像を分析して平均厚さを計算し、対照との比較をプロットした。（図５Ａ）ＵＰＥＣ、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、ＮＴＨＩまたはＥＳＫＡＰＥ病原体に添加した全長ＨＭＧＢ１アイソフォーム（特に指示がない限り２００ｎＭ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＥＳＫＡＰＥ）については、８００ｎＭ ｒＨＭＧＢ１および２００ｎＭ ｍＨＭＧＢ１を添加した。Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ（ＥＳＫＡＰＥ）については、８００ｎＭ ｒＨＭＧＢ１、８００ｎＭ ｍＨＭＧＢ１、または３．３μＭのα－ｌＨＦＥｃｌｇＧを添加し、１６時間ではなく１時間インキュベートして、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍプロテアーゼによる潜在的な分解を回避した。（図５Ｂ）漸増濃度のｒＨＭＧＢ１と共にインキュベートしたＵＰＥＣバイオフィルムの代表的な画像。（図５Ｃ）上記のように抗バイオフィルム活性（ａｎｔｉ－ｂｌｏｆｉｌｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ）について、ＨＭＧＢ１（２００ｎＭ）の個々のドメインを試験した（点線は対照値を示す）。バーはＳＥＭを表す。対応のないｔ検定を用いて、対照と比較した統計的有意性を評価した。＊Ｐ＜０．０５。ＨＭＧＢ１およびそのバリアントは、優先度の高いヒト病原体により形成された樹立されたバイオフィルムを有意に破壊することができたが、Ａボックスは破壊することができなかった。（図５Ｄ～５Ｅ）ＨＭＧＢ１およびバリアントは、予備形成Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバイオフィルムを破壊する。ｒＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ１ Ｃ４５Ｓ（ｍＨＭＧＢ１）、ウシＨＭＧＢ１（ｂＨＭＧＢ１）、Ｂボックス、ＢボックスＣ１０６Ｓ（ｍＢボックス）、ＡボックスおよびＡ＋Ｂボックスを２４時間の時点で予備形成Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバイオフィルムに添加した（２００ｎＭ）。１６時間のインキュベーション後、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、次いで、共焦点レーザー走査顕微鏡法により視覚化した。ＣＯＭＳＴＡＴにより画像を分析して、平均厚さおよび総バイオマスを計算した。エラーバーはＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ＝非有意。ＨＭＧＢ１およびそのバリアントは、樹立されたＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバイオフィルムを有意に破壊したが、Ａボックスは破壊しなかった。
図６：ＨＭＧＢ１バリアントは病原性バイオフィルムを破壊する。上記のように抗バイオフィルム活性について、ＨＭＧＢ１（２００ｎＭ）の個々のドメインを試験した（点線は対照値を示す）。バーはＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。ＨＭＧＢ１およびそのバリアントは、優先度の高いヒト病原体により形成された樹立されたバイオフィルムを有意に破壊することができたが、Ａボックスは破壊することができなかった。
図７Ａ～７Ｇ：ＨＭＧＢ１は、敗血症を誘発せずに、マウスからのＳ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃａのクリアランスを促進する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０７ＣＦＵを気管内チャレンジし、同時に（防止）または２４時間後に（処置）０．２ｎｍｏｌのＨＭＧＢ１バリアントを投与した。（図７Ａ）α－Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ抗体でプローブした肺切片における蛍光顕微鏡法により、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａの凝集体を見ることができた。防止の場合、（図７Ｂ）接種の１８時間後（ｈｐｉ）に収集した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）をＣＦＵについて分析した。（図７Ｃ）鑑別細胞計算により、ＢＡＬ中の好中球を定量した。（図７Ｄ）７２ｈｐｉに収集した肺組織を固定し、包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（倍率１０倍）。処置の場合、７２ｈｐｉ（図７Ｅ）ＣＦＵをＢＡＬ中で定量した。（図７Ｆ）ＨＭＧＢ１バリアントの腹腔内（intrapelitoneal）（ｉ．ｐ．）投与の２４時間後に、α－ＣＤ４５、α－ＣＤ１１ｂおよびαＬｙ－６Ｇで染色した腹膜洗浄物（pelitoneal lavage）の蛍光活性化細胞選別により、好中球動員を分析した。（図７Ｇ）０．２ｎｍｏｌ ＨＭＧＢ１バリアント、５ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳまたはその両方を腹腔内注射したマウスにおいてＥＬＩＳＡにより、血清ＴＮＦ－αを測定した。ＬｏＤ：検出限界。バーはＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５。ＨＭＧＢ１処置は、肺におけるＢ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ ＣＦＵを有意に減少させ、ＨＭＧＢ１ ＣｙｓからＳｅｒへの変異は炎症促進性活性を排除し、ＨＭＧＢ１バリアントはいずれも敗血症を誘発しなかった。
図８Ａ～８Ｆ：ｒＨＭＧＢ１およびｍＨＭＧＢ１は、実験的中耳炎モデルにおいてバイオフィルム分解を促進する。ＮＴＨＩのチャレンジの４および５日後に、希釈剤、０．２ｎｍｏｌ ｒＨＭＧＢ１または０．２ｎｍｏｌ ｍＨＭＧＢ１をチンチラの中耳に直接送達した。２４時間後に動物を屠殺し、中耳をイメージングし（図８Ｃ、代表的な画像）、（図８Ａ、バイオフィルム（ｂｌｏｆｉｌｍ））および（図８Ｂ、炎症）に記載されている基準に基づいて、バイオフィルム（図８Ｄ）および炎症（図８Ｆ）の存在について盲検的にスコア化した。粘膜バイオマスに存在するＮＴＨｌのＣＦＵを定量した（図８Ｅ）。平均値およびＳＥＭがプロットされている。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。画像スコア化およびＣＦＵ定量は、ｒＨＭＧＢ１およびｍＨＭＧＢ１が両方とも、インビボにおける樹立されたＮＴＨＩバイオフィルムのクリアランスを促進したことを実証している。特に、ｍＨＭＧＢ１は、明白な炎症を誘発しなかった。
図９：ＨＭＧＢ１は抗生物質媒介性殺滅を強化する。ミノサイクリン（１μｇ／ｍｌ）、ｒＨＭＧＢ１（２００ｎＭ）またはｒＨＭＧＢ１（２００ｎＭ）＋ミノサイクリン（１μｇ／ｍｌ）をさらに１６時間添加する前に、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａバイオフィルムを２４時間形成した。バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、ＣＬＳＭによりイメージングした。生細胞は緑色で示され、死細胞は赤色で示されている。ＨＭＧＢ１およびミノサイクリンの両方の存在下では、死細胞の増加が認められる。
図１０Ａ～１０Ｂ：バイオフィルム関連疾患由来の検体中のＨＭＧＢ１。（図１０Ａ）免疫蛍光顕微鏡検査のためにＨＭＧＢ１およびＤＮＡＢＩＩタンパク質について、ＮＴＨＩ感染チンチラ中耳由来のＯＣＴ包埋粘膜バイオマスの切片を共標識した。二本鎖ｅＤＮＡをＤＡＰＩ（白色）で標識した。（図１０Ｂ）ＣＦ痰を抗バイオフィルム処置（ＰＢＳ、１：１０ウサギａ－ｌＨＦＥｃ、血清、１００Ｕ／ｍｌ Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（ＤＮａｓｅ）、１ｍＭ ｒＨＭＧＢ１）と共に３７℃で１時間インキュベートし、０時間および２時間の時点で周辺培地の光学密度を測定した。ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびＨＭＧＢ１は、インビボで広がる粘膜バイオフィルムに存在するが、ｅＤＮＡに共局在しない。外因性ＨＭＧＢ１は、ＣＦ痰に存在するバイオフィルムを破壊し得る。
詳細な説明
特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を使用し得るが、好ましい方法、デバイスおよび材料を次に記載する。本明細書で引用されるすべての技術的刊行物および特許公報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなるものも、先行開示によるこのような開示に本開示が先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
特に指示がない限り、本開示の実施は、当技術分野の技術範囲内の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｄｓ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、（１９９１）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇａｉｔ ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｄ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら、ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと。
範囲を含むすべての数字表示、例えばｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は近似であり、必要な場合には１．０もしくは０．１の増分で、またはあるいは＋／－１５％もしくはあるいは１０％もしくあるいは５％もしくあるいは２％の変動で（＋）または（－）に変動する。必ずしも明記に記述されているとは限らないが、すべての数字表示は、「約」という用語が前に付くことを理解すべきである。必ずしも明記に記述されているとは限らないが、本明細書に記載される試薬は単に例示的なものであり、このようなものの同等物は当技術分野で公知であることも理解すべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の参照を含む。例えば、「ポリペプチド」という用語は、それらの混合物を含む複数のポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が、列挙されているエレメントを含むが他のものを除外しないことを意味することを意図する。組成物および方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる」は、目的の用途のための組み合わせに対して任意の本質的に重要な他のエレメントを除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義されるエレメントから本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量夾雑物ならびに薬学的に許容され得る担体、例えばリン酸緩衝食塩水、保存剤などを除外しない。「からなる」は、他の成分の微量元素および本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップを超えるものを除外することを意味するものとする。これらの各移行用語により定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
「バイオフィルム」は、微生物が分泌および／または放出するＤＮＡなどのポリマーと一緒に、有機または無機の構造物であり得る構造物の表面にときどき接着することができる微生物の薄層または組織化されたコミュニティを意図する。バイオフィルムは、マクロビオティックおよび抗菌剤に対して非常に耐性である。それらは、歯肉組織、歯および修復物に生息し、歯周プラーク疾患としても公知の齲歯および歯周病を引き起こす。それらはまた、慢性中耳感染症を引き起こす。バイオフィルムはまた、歯科インプラント、ステント、カテーテルラインおよびコンタクトレンズの表面上に形成し得る。それらは、ペースメーカー、心臓弁置換物、人工関節および他の外科インプラント上で成長する。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、院内感染（病院内感染）の６５％超がバイオフィルムにより引き起こされると推定する。真菌バイオフィルムはまた、医療デバイスを頻繁に汚染する。それらは慢性膣感染症を引き起こし、妨げられた免疫系（ｈｏｂｂｌｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）を有する人々において生命を脅かす全身感染症をもたらす。バイオフィルムはまた、多数の疾患に関与する。例えば、嚢胞性線維症患者は、抗生物質耐性バイオフィルムをもたらすことが多いシュードモナス感染症を有する。
「ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質」は、ＤＮＡ結合ドメインから構成されるＤＮＡ結合タンパク質またはポリペプチドであって、したがって、ＤＮＡに対する特異的または一般的な親和性を有するＤＮＡ結合タンパク質またはポリペプチドを意図する。一態様では、それらは、副溝中のＤＮＡに結合する。ＤＮＡＢＩＩタンパク質の非限定的な例は、組み込み宿主因子（ＩＨＦ）タンパク質および大腸菌株Ｕ９３（ＨＵ）由来のヒストン様タンパク質である。バイオフィルムに関連し得る他のＤＮＡ結合タンパク質としては、ＤＰＳ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＣＡＡ４９１６９）、Ｈ－ＮＳ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＣＡＡ４７７４０）、Ｈｆｑ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＣＥ６３２５６）、ＣｂｐＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＢＡＡ０３９５０）およびＣｂｐＢ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿４１８８１３）が挙げられる。
「組み込み宿主因子」または「ＩＨＦ」タンパク質は、バクテリオファージがそれらのＤＮＡを宿主細菌に組み込むために使用する細菌タンパク質である。これらは、遺伝子組換えならびに転写および翻訳調節において機能するＤＮＡ結合タンパク質である。それらはまた、細胞外微生物ＤＮＡに結合する。大腸菌におけるＩＨＦタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、ｈｉｍＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＰＯＡ６Ｘ７．１）およびｈｉｍＤ（ＰＯＡ６Ｙ１．１）遺伝子である。これらの遺伝子のホモログは他の生物に見出され、他の生物由来のこれらの遺伝子に対応するペプチドは表１に見出され得る。
「ＨＭＧＢ１は、ＤＮＡの副溝に結合してそれを歪めると報告されている高移動度群タンパク質ボックス（ＨＭＧＢ）１タンパク質であり、干渉剤の例である。組換えまたは単離されたタンパク質およびポリペプチドは、Ａｔｇｅｎｇｌｏｂａｌ、ＰｒｏＳｐｅｃＢｉｏ、Ｐｒｏｔｅｉｎ１およびＡｂｎｏｖａから市販されている。
「Ａボックス」ポリペプチドは、ＨＭＧＢ１タンパク質のＡボックスドメインを含むポリペプチドを意図する。Ａボックスポリペプチド（ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅ）は変異され得るか、またはさらなる配列、例えばリンカー配列、シグナル配列もしくは分泌配列を含有し得る。非限定的な例は図および配列表に示されている。アミノ酸Ｋ１２、Ｃ２３およびＣ４５における１つまたはそれを超える点変異が導入され得る。
「Ｂボックス」ポリペプチドは、ＨＭＧＢ１タンパク質のＢボックスドメインを含むポリペプチドを意図する。Ｂボックスポリペプチド（ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅ）は変異され得るか、またはさらなる配列、例えばリンカー配列、シグナル配列もしくは分泌配列を含有し得る。アミノ酸Ｋ１１４またはＣ１０６における点変異を導入して、ＤＮＡ結合、炎症特性および抗バイオフィルム活性に影響を与え得る。非限定的な例は図および配列表に示されている。
「ＡＢボックス」ポリペプチドは、互いに融合したＨＭＧＢ１タンパク質のＡおよびＢボックスドメインを含むポリペプチドであって、しかし、全長野生型タンパク質に対応するアミノ酸が存在しないポリペプチドを意図する。ＡＢボックスポリペプチド（ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅ）は変異され得るか、またはさらなる配列、例えばリンカー配列、シグナル配列もしくは分泌配列を含有し得る。本明細書に記載されるアミノ酸（例えば、アミノ酸Ｋ１２、Ｃ２３、Ｃ４５、Ｃ１０６および／またはＫ１１４）における１つまたはそれを超える点変異を導入して、ＤＮＡ結合、炎症特性および抗バイオフィルム活性に影響を与え得る。非限定的な例は図および配列表に示されている。
「ＨＵ」または「大腸菌株Ｕ９３由来のヒストン様タンパク質」は、典型的には大腸菌に関連するヘテロ二量体タンパク質のクラスを指す。ＨＵタンパク質は、ＤＮＡ接合部に結合することが公知である。関連タンパク質は他の微生物から分離されている。大腸菌ＨＵの完全なアミノ酸配列は、Ｌａｉｎｅら、（１９８０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３（３）：４４７－４８１により報告された。ＨＵタンパク質に対する抗体はＡｂｃａｍから市販されている。
「リンカー」または「ペプチドリンカー」は、ポリペプチド配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結されたペプチド配列を指す。一態様では、リンカーは、約１～約２０アミノ酸残基長またはあるいは２～約１０、約３～約５アミノ酸残基長である。ペプチドリンカーの例は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＬｅｕまたはＰＰＫＧＥＴＫＫＫＦである。
「微生物ＤＮＡ」は、バイオフィルムを産生する微生物由来の一本鎖または二本鎖ＤＮＡを意図する。
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、「標識」組成物を生成するために、検出すべき組成物に直接的または間接的にコンジュゲートされた直接的または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えばＮ末端ヒスチジンタグ（Ｎ－Ｈｉｓ）、磁気的に活性な同位体、例えば１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、非放射性同位体、例えば１３Ｃおよび１５Ｎ、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば抗体を意図する。この用語はまた、挿入配列の発現によりシグナルを提供するポリヌクレオチド、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などにコンジュゲートされた配列を含む。標識は、それ自体により検出可能であり得るか（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変更を触媒し得る。標識は、小規模な検出に適切であり得るか、またはハイスループットスクリーニングのためにより適切であり得る。そのため、適切な標識としては、限定されないが、磁気的に活性な同位体、非放射性同位体、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素および酵素を含むタンパク質が挙げられる。標識は単に検出され得るか、またはそれは定量され得る。単に検出される反応は、一般に、その存在が単に確認される反応を含むが、定量される反応は、一般に、定量可能な（例えば、数値的に報告可能な）値、例えば強度、偏光および／または他の特性を有する反応を含む。発光または蛍光アッセイでは、検出可能な反応は、結合に実際に関与するアッセイ構成成分に関連する発光団もしくはフルオロフォアを使用して直接的に生成され得るか、または別の構成成分（例えば、レポーターまたは指示薬）に関連する発光団もしくはフルオロフォアを使用して間接的に生成され得る。シグナルを生成する発光標識の例としては、限定されないが、生物発光および化学発光が挙げられる。検出可能な発光反応は、一般に、発光シグナルの変化または出現を含む。アッセイ構成成分を発光標識するための適切な方法および発光団は当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（６ｔｈｅｄ）に記載されている。発光プローブの例としては、限定されないが、エクオリンおよびルシフェラーゼが挙げられる。
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入ポリヌクレオチドを宿主細胞内に運搬し得る任意の分子と定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌またはウイルス、例えばバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに様々な真核生物および原核生物宿主における発現について記載されている当技術分野で典型的に使用される他の組換えビヒクルであり、遺伝子療法のために、および単純なタンパク質発現のために使用され得る。
本開示のポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達され得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「形質導入」などは、導入に使用される方法に関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」と称されることもある）の導入に関する用語である。このような方法としては、様々な周知の技術、例えば、ベクター媒介性遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクションまたは様々な他のタンパク質ベースもしくは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）、および「ネイキッド」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技術（例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達およびポリヌクレオチドの導入に使用される様々な他の技術）が挙げられる。導入ポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定にまたは一過性に維持され得る。安定な維持は、典型的には、導入ポリヌクレオチドが宿主細胞と適合性の複製起点を含有するか、または宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）もしくは核もしくはミトコンドリア染色体に組み込まれることを必要とする。当技術分野で公知であり、本明細書に記載されているように、多くのベクターが、哺乳動物細胞への遺伝子の移入を媒介することができることが公知である。
本明細書で使用される場合、「ｅＤＮＡ」という用語は、病原性バイオフィルムの構成成分として見られる細胞外ＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、ＥＳＫＡＰＥ病原体は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種を含む。これらの病原体は、世界中で院内感染の主な原因である。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子であって、染色体ＤＮＡと独立して複製することができる染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、それは環状二本鎖である。プラスミドは、微生物の集団内における水平な遺伝子移入の維持を提供し、典型的には、所定の環境状態下で選択的利点を提供する。プラスミドは、競合的な環境ニッチにおいて天然に存在する抗生物質への耐性を提供する遺伝子を保有し得るか、またはあるいは産生されるタンパク質は、同様の状況下で毒素として作用し得る。
遺伝子操作で使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と称される。多くのプラスミドが、このような用途のために市販されている。複製すべき遺伝子は、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子と、この場所におけるＤＮＡ断片の挿入を容易にすることを可能にするいくつかの一般的に使用される制限部位を含有する短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳまたはポリリンカー）とを含有するプラスミドのコピーに挿入される。プラスミドの別の主な用途は、大量のタンパク質を作製することである。この場合、研究者は、目的の遺伝子を有するプラスミドを含有する細菌を成長させる。細菌はタンパク質を産生してその抗生物質耐性を付与するのと同じように、それはまた、挿入遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導され得る。これは、遺伝子またはそれがコードするタンパク質を大量生産する安価かつ簡単な方法である。
「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」は、（１００ｋｂを超える最大３０００ｋｂの）大きなＤＮＡ断片をクローニングするために使用されるベクターを指す。それは人工的に構築された染色体であり、酵母細胞における複製および保存に必要なテロメア、セントロメアおよび複製起点配列（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含有する。初期環状プラスミドを使用して構築し、それらは、制限酵素を使用することにより線状化され、次いで、ＤＮＡリガーゼが、突出末端の使用により、目的の配列または遺伝子を線状分子内に付加し得る。酵母はそれ自体が真核細胞であるため、翻訳後修飾を有する真核生物タンパク質産物を得ることができるので、酵母発現ベクター、例えばＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組み込みプラスミド）およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド）は極めて有用であるが、しかしながら、ＹＡＣは、ＢＡＣよりも不安定であり、キメラ効果を生じさせることが見出されている。
「ウイルスベクター」は、宿主細胞に送達すべきポリヌクレオチドを含むインビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで組換え的に産生されるウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベースのベクターは、タンパク質を製造するために使用され得、タバコ葉においてＧｒｉｆｆｉｔｈｓｉｎを発現することが報告されている（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６（１５）：６０９９－６１０４）。アルファウイルスベクター、例えばセムルキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターもまた、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ＆Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４－４３９およびＹｉｎｇら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３－８２７を参照のこと。レトロウイルスベクターにより遺伝子移入が媒介される態様では、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部および治療遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス媒介性遺伝子移入」または「レトロウイルス形質導入」は同じ意味を有し、細胞に侵入してそのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスにより、遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定に移入されるプロセスを指す。ウイルスは、その通常の感染機構を介して宿主細胞に侵入し得るか、またはウイルスが異なる宿主細胞表面受容体もしくはリガンドに結合して細胞に侵入するように改変され得る。本明細書で使用される場合、レトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様侵入機構により、外因性核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。
レトロウイルスは、ＲＮＡの形態でそれらの遺伝情報を有する；しかしながら、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡはＤＮＡ形態に逆転写され、感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態はプロウイルスと称される。
ＤＮＡウイルスベクター、例えばアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）により遺伝子移入が媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその部分および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０個を超える血清型を含む比較的十分に特性評価された同一祖先からのウイルス群である。例えば、国際公開第９５／２７０７１号を参照のこと。Ａｄは、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび生成の可能性を減少させるベクターも構築されている。例えば、国際公開第９５／００６５５号および国際公開第９５／１１９８４号を参照のこと。野生型ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムに組み込まれる高い感染力および特異性を有する。Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６－６４７０およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８－３９９６を参照のこと。
プロモーターと、ポリヌクレオチドが機能的に連結され得るクローニング部位との両方を含有するベクターは当技術分野で周知である。このようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの供給源から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変化させて、転写または翻訳レベルのいずれかで発現に干渉し得るかまたはそれを減少させ得る余分な潜在的な不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を排除することが必要であり得る。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位が開始コドンのすぐ５’側に挿入され得る。
遺伝子送達ビヒクルはまた、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよび標的ウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体を含む。本開示の方法では、ターゲティング抗体またはその断片も含むリポソームが使用され得る。細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、細胞または細胞集団への本明細書に記載されるタンパク質の直接的な導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技術により行われ得るか、あるいは発現を増強し、および／または本開示のタンパク質の活性を促進し得る培養条件が他の非限定的な技術である。
バイオフィルムの「阻害、防止または破壊」は、バイオフィルムの構造の予防的または治療的減少を意図する。一態様では、「阻害、競合または滴定」という用語は、微生物バイオフィルムの構成成分であるＤＮＡ／タンパク質マトリックス（例えば、図６に示されている）の形成の減少を意図する。一態様では、防止は処置から除外される。
「ベントポリヌクレオチド」は、他の鎖およびいかなるポリヌクレオチドとも対形成しない１本の鎖上に小さなループを含有する二本鎖ポリヌクレオチドを意図し、末端間距離は天然熱ゆらぎ（natural thermal fluctation）を超えて減少する（すなわち、ネイティブＢ型二本鎖ＤＮＡの場合には１５０ｂｐの持続長を超えて屈曲する。いくつかの実施形態では、ループは、１塩基～約２０塩基長、もしくはあるいは２塩基～約１５塩基長、もしくはあるいは約３塩基～約１２塩基長、もしくはあるいは約４塩基～約１０塩基長であるか、またはあるいは約４、５もしくは６もしくは７もしくは８もしくは９もしくは１０個の塩基を有する。
診断または処置の「被験体」は、細胞または動物、例えば哺乳動物またはヒトなどである。診断または処置に供される非ヒト動物は、感染を受けるものまたは動物モデル、例えばサル、ネズミ、例えばラット、マウス、チンチラ、イヌ科動物、例えばイヌ、ウサギ科動物、例えばウサギ、家畜、スポーツ動物およびペットである。
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は互換的に使用され、それらの最も広範な意味では、２つまたはそれを超えるサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合により連結され得る。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテルなどにより連結され得る。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、アミノ酸の最大数について制限はなく、タンパク質またはペプチド配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにＤおよびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体ならびにペプチド模倣物を含む天然および／もしくは非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用される場合、「単離された」または「組換え」という用語は、高分子およびポリペプチドの天然供給源に存在するそれぞれ他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。「単離されたまたは組換え核酸」という用語は、断片として天然に存在しない核酸断片であって、天然状態で見出されない核酸断片を含むことを意図する。「単離された」という用語はまた、本明細書では、他の細胞タンパク質から単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびタンパク質を指すために使用され、精製および組換えポリペプチドの両方を包含することを意図する。他の実施形態では、「単離されたまたは組換え」という用語は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）が天然で通常付随する構成要素、細胞などから分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、そのネイティブまたは天然環境で、例えば染色体上で通常付随する３’および５’近接ヌクレオチドから分離されている。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、それをその天然に存在するカウンターパートと区別するために「単離」を必要としない。
明示的な記載がなく、特に意図がない限り、本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、このようなものの同等物または生物学的同等物は本開示の範囲内であると推定されるべきである。本明細書で使用される場合、「その生物学的同等物」は、参照のタンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸に言及する場合の「その同等物」と同義であることを意図し、所望の構造または機能性を依然として維持しながら最小の相同性を有するものを意図する。特に本明細書に具体的な記載がない限り、本明細書で言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はまた、その同等物を含むことが企図される。例えば、同等物は、少なくとも約７０％の相同性または同一性、またはあるいは少なくとも約８０％の相同性または同一性、あるいは少なくとも約８５％、またはあるいは少なくとも約９０％、またはあるいは少なくとも約９５％、またはあるいは９８％パーセントの相同性または同一性を意図し、参照タンパク質、参照ポリペプチドまたは参照核酸と実質的に同等の生物学的活性を示す。別の態様では、この用語は、高ストリンジェンシーの条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドを意図する。
別の配列と特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、アラインメントされた場合に、塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが、２つの配列の比較において同じであることを意味する。アラインメントおよび相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌらｅｄｓ．１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ ７．７．１に記載されているものを使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトパラメータがアラインメントに使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴに見出し得る。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較目的でアラインメントされ得る各配列中の位置を比較することにより決定され得る。比較配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合、それらの分子は、その位置において相同である。配列間の相同性の程度は、それらの配列により共有される一致または相同位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列の１つと３０％未満の同一性またはあるいは２５％未満の同一性、２０％未満の同一性またはあるいは１０％未満の同一性を共有する。
「相同性」または「同一性」または「類似性」はまた、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする２つの核酸分子を指し得る。
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的な方法で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つもしくはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセスのステップ、例えばＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成し得る。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中等度のハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣのバッファー濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣのバッファー濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は５分間～２４時間であり、１つ、２つまたはそれを超える洗浄ステップがあり、洗浄インキュベーション時間は約１、２または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸バッファーである。他の緩衝系を使用した同等のＳＳＣが用いられ得ると理解される。
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」などの用語は、本明細書では、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、障害もしくはその兆候もしくは症状の完全なもしくは部分的な防止の点で予防的であり得、ならびに／または障害および／もしくは障害に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であり得る。一態様では、「処置」は防止を除外する。
「予防」することは、障害または作用の素因がある系または被験体において、インビトロまたはインビボで障害または作用を予防することを意図する。このようなものの例は、バイオフィルムを産生することが公知の微生物を感染させた系において、バイオフィルムの形成を予防することである。
「薬学的に許容され得る担体」は、本開示の組成物において使用され得る任意の希釈剤、賦形剤または担体を指す。薬学的に許容され得る担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的なグリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。適切な医薬担体は、この分野における標準の参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。それらは、好ましくは、意図された投与形態、すなわち経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して選択され、従来の医薬実務と一致している。
「投与」は、処置過程を通して１つの用量で連続的または断続的に行われ得る。投与の最も有効な手段および投与量を決定する方法は当業者に公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置されている標的細胞、および処置されている被験体により変動する。単回または複数回投与は、処置医師により選択される用量のレベルおよびパターンで行われ得る。適切な投与用製剤および薬剤の投与方法は当技術分野で公知である。投与経路もまた決定され得、最も有効な投与経路を決定する方法は当業者に公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置されている被験体の健康状態または疾患ステージ、および標的細胞または組織によって異なる。投与経路の非限定的な例としては、経口投与、経鼻投与、注射および局所適用が挙げられる。
「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果または効果を達成するために十分な量を指す。治療的または予防的用途の文脈では、有効量は、問題の状態のタイプおよび重症度、ならびに個々の被験体の特徴、例えば一般的健康、年齢、性別、体重および医薬組成物に対する耐性に依存する。免疫原性組成物の文脈では、いくつかの実施形態では、有効量は、病原体に対する防御反応をもたらすために十分な量である。他の実施形態では、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすために十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、受動免疫をそれを必要とする被験体に付与するために必要な量である。免疫原性組成物に関して、いくつかの実施形態では、有効量は、上記要因に加えて、使用目的、特定の抗原性化合物の免疫原性の程度、および被験体の免疫系の健康／反応性に依存する。熟練技術者は、これらのおよび他の要因に応じて、適切な量を決定することができる。
インビトロ用途の場合、いくつかの実施形態では、有効量は、問題の用途のサイズおよび性質に依存する。それはまた、インビトロ標的の性質および感度ならびに使用の方法に依存する。当業者は、これらおよび他の検討事項に基づいて有効量を決定することができる。有効量は、実施形態に応じて、組成物の１回またはそれを超える投与を含み得る。
薬剤および組成物は、医薬組成物中の有効成分などの従来の手順に従う投与により、医薬の製造ならびにヒトおよび他の動物の処置に使用され得る。
本開示の薬剤は、任意の適切な投与経路による治療のために投与され得る。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置されている疾患により変動することも認識されよう。
固相支持体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース、改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、ある程度まで可溶性であり得るか、または不溶性であり得る。カップリングされた分子がポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体に結合することができる限り、支持材料は、実質的に任意の可能な構造形態を有し得る。したがって、支持体の配置は、ビーズのように球状であり得るか、または試験管の内面もしくはロッドの外面のように円柱状であり得る。あるいは、表面は平坦、例えばシート、試験紙などであり得るか、またはあるいはポリスチレンビーズであり得る。当業者は、抗体もしくは抗原に結合させるための多くの他の適切な担体を把握しているか、またはルーチンな実験の使用によりそれらを確認することができる。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、全抗体および任意の抗原結合断片またはその一本鎖を含む。したがって、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。このようなものの例としては、限定されないが、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）もしくはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域もしくはその任意の部分または結合タンパク質の少なくとも一部が挙げられる。
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得、任意の適切な生物学的供給源、例えばマウス、ラット、ヒツジまたはイヌから単離され得る。
「免疫反応」は、異物へのリンパ球の抗原特異的反応を広く指す。免疫反応を誘発し得る任意の物質は「免疫原性」であるといわれ、「免疫原」と称される。しかしながら、すべての免疫原は抗原であるが、すべての抗原が免疫原性であるとは限らない。本開示の免疫反応は、体液性（抗体活性による）または細胞性（Ｔ細胞活性化による）であり得る。
本明細書で使用される場合、「被験体において免疫反応を誘導する」という用語は、当技術分野で十分によく理解されている用語であり、被験体への抗原（またはエピトープ）の導入後に、被験体への抗原（またはエピトープ）の導入前の免疫反応（もしあれば）と比べて、抗原（またはエピトープ）への免疫反応の少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、さらにより好ましくは少なくとも約５００倍、さらにより好ましくは少なくとも約１０００倍またはそれを超える増加が検出または測定され得ることを意図する。抗原（またはエピトープ）への免疫反応としては、限定されないが、抗原特異的（またはエピトープ特異的）抗体の産生、および抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子をその表面上に発現する免疫細胞の産生が挙げられる。所定の抗原（またはエピトープ）への免疫反応が誘導されたかを決定する方法は当技術分野で周知である。例えば、抗原特異的抗体は、限定されないが、ＥＬＩＳＡを含む当技術分野で公知の様々なイムノアッセイのいずれかを使用して検出され得、例えば、検出可能に標識された第２の抗体（例えば、酵素標識マウス抗ヒトＩｇ抗体）を用いて、固定化抗原（またはエピトープ）へのサンプル中の抗体の結合が検出される。
「免疫反応をモジュレートする」という用語は、免疫反応を誘導すること（増加させること、誘発すること）；免疫反応を減少させること（抑制すること）を含む。免疫調節方法（またはプロトコール）は、被験体における免疫反応をモジュレートするものである。
「ＨＭＧドメイン」または「高移動度群（ＨＭＧ）ボックスドメイン」は、ＤＮＡの結合に関与するアミノ酸配列を指す（Ｓｔｒｏｓら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６４（１９－２０）：２５９０－６０６（２００７））。一実施形態では、ＨＭＧボックスドメインの構造は、不規則な配列の３つのヘリックスからなる。別の実施形態では、ＨＭＧボックスドメインは、タンパク質が高い親和性で（捻れたまたは巻き戻された）非Ｂ型ＤＮＡコンフォメーションに結合することを可能にする。ＨＭＧボックスドメインは、ＤＮＡ依存性プロセス、例えば転写、複製およびＤＮＡ修復の調節に関与する高移動度群タンパク質に見出され、これらはすべて、クロマチンのコンフォメーションの変化を必要とする（Ｔｈｏｍａｓ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２９（Ｐｔ ４）：３９５－４０１）。
本開示の実施態様
ポリペプチド組成物
本明細書に記載されるＨＭＧボックスドメイン短縮体および／または変異体を含むポリペプチドならびにタンパク質、これらのタンパク質のＨＭＧボックスドメイン短縮体、変異体および同等物の１つまたはそれよりも多くを含有するこれらのタンパク質の断片、または開示されるアミノ酸置換を有する断片が本明細書で提供される。
したがって、一態様では、本開示は、Ｋ１２、Ｃ２３およびＣ４５から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸に改変されたネイティブＫまたはＣの変異）を必要に応じて含むか、もしくはあるいはそれから本質的になるか、もしくはさらにはそれからなる単離されたＡボックスポリペプチド、またはＫ１２、Ｃ２３およびＣ４５から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸に改変されたネイティブＫまたはＣの変異）を含むその同等物を提供する。一態様では、変異はＣ４５Ｓ変異である。Ａボックスポリペプチドは、一方または両方の末端に位置するリンカーまたはペプチド配列をさらに含み得る。ペプチドリンカーの例はＰＰＫＧＥＴＫＫＫＦである。
組換え的に産生される場合、Ａボックスポリペプチドは、当技術分野、例えばＯｌｉａ ＡＳら、（２０１５）ＡＣＳ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．１０（９）：２０３４－４７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００３４２，ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６０８３６７４；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４６１０８１０；Ｕｇｒｉｎｏｖａ Ｉら、（２１０２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１２；３９（１１）：９９４７－５３．Ｅｐｕｂ ２０１２／０６／２９．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０３３－０１２－１８６３－ｘ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２７４０１４１；およびＩｔｏ Ｔら、（２００７）ＪＴＨ，５（１）：１０９－１６．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５３８－７８３６．２００６．０２２５５．ｘ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７２３９１６６で公知の方法を使用して、部分的または完全にアセチル化、酸化、またはリン酸化され得る。一態様では、Ａボックスポリペプチドは、前述の変異を有する野生型ＨＭＧＢ１ポリペプチドのアミノ酸１～７０を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。Ａボックスポリペプチドの例は、
Figure 2022504139000002
 を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの同等物は、参照ポリペプチドと少なくとも約７０％、またはあるいは少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の配列であって、一態様では変異アミノ酸（複数可）を保持する配列を指す。いくつかの態様では、ポリペプチドの同等物は、例えば、ＨＭＧボックスドメインを含有するポリペプチドの目的の機能および／または構造特徴を保持する。一態様では、同等なポリペプチドは、ＨＭＧボックスドメインと少なくとも約７０％、またはあるいは少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一のドメインであって、一態様では変異アミノ酸（複数可）を保持するドメインを含む。いくつかの態様では、このような同等なドメインは、ＨＭＢボックスドメインの機能および／または構造特徴、例えば、ＨＭＢボックス結合標的への結合を保持する。一態様では、同等なポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で、ＨＭＢボックスドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによりコードされる。
アミノ酸Ｃ１０６もしくはＫ１１４における変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸へのネイティブシステインの変異）を必要に応じて含むか、もしくはあるいはそれから本質的になるか、もしくはさらにはそれからなる単離されたＢボックスポリペプチド、またはアミノ酸Ｃ１０６もしくはＫ１１４における変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸へのネイティブシステインの変異）を含むその同等物も本明細書で提供される。一態様では、Ｂボックスポリペプチドは、前述の変異を有するｗｔ ＨＭＧＢ１ポリペプチドのアミノ酸、約８０～約１７６、または約８８～約１６４、または約８９～約１６２、またはさらには約８０～約１６４を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。野生型ＨＭＧＢ１ Ｂボックスポリペプチドの改変のためのさらなる位置は図１Ｃに示されている。Ｂボックスポリペプチドの例は、
Figure 2022504139000003
 を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
Ｂボックスポリペプチドは、一方または両方の末端に位置するリンカーまたはペプチド配列をさらに含み得る。ペプチドリンカーの例はＰＰＫＧＥＴＫＫＫＦである。組換え的に産生される場合、開示されるＢボックスポリペプチドは、当技術分野、例えばＯｌｉａ ＡＳら、（２０１５）ＡＣＳ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．１０（９）：２０３４－４７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００３４２，ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６０８３６７４；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４６１０８１０；Ｕｇｒｉｎｏｖａ Ｉら、（２１０２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１２；３９（１１）：９９４７－５３．Ｅｐｕｂ ２０１２／０６／２９．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０３３－０１２－１８６３－ｘ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２７４０１４１；およびＩｔｏ Ｔら、（２００７）ＪＴＨ，５（１）：１０９－１６．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５３８－７８３６．２００６．０２２５５．ｘ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７２３９１６６で公知の方法を使用して、部分的または完全にアセチル化、酸化、またはリン酸化され得る。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの同等物は、参照ポリペプチドと少なくとも約７０％またはあるいは少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の配列であって、一態様では変異アミノ酸（複数可）を保持する配列を指す。いくつかの態様では、ポリペプチドの同等物は、例えば、ＨＭＧボックスドメインを含有するポリペプチドの目的の機能および／または構造特徴を保持する。一態様では、同等なポリペプチドは、ＨＭＧボックスドメインと少なくとも約７０％、またはあるいは少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一のドメインであって、一態様では変異アミノ酸（複数可）を保持するドメインを含む。いくつかの態様では、このような同等なドメインは、ＨＭＢボックスドメインの機能および／または構造特徴、例えば、ＨＭＢボックス結合標的への結合を保持し、必要に応じて炎症促進反応を喪失する。一態様では、同等なポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で、ＨＭＢボックスドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによりコードされる。
さらなる態様では、Ｋ１２、Ｃ２３、Ｃ４５；およびＣ１０６またはＫ１１４から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸に改変されたネイティブＫまたはＣの変異）を必要に応じて含むか、もしくはあるいはそれから本質的になるか、もしくはさらにはそれからなる単離されたＡＢボックスポリペプチド、またはＫ１２、Ｃ２３およびＣ４５；およびＣ１０６またはＫ１１４から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸に改変されたネイティブＫまたはＣの変異）を含むその同等物が本明細書で提供される。一態様では、変異はＣ４５Ｓ変異である。別の態様では、ポリペプチドは、アミノ酸Ｃ１０６における変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸へのネイティブシステインの変異）を含むか、またはＫ１２、Ｃ２３、Ｃ４５から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異と、アミノ酸Ｃ１０６における変異（例えば、セリン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンまたはトレオニンから選択される群からのアミノ酸へのネイティブシステインの変異）とを含むその同等物である。一態様では、ＡＢボックスポリペプチドは、Ｃ４５ＳおよびＣ１０６Ｓ変異を含み、同等物はこれらの変異を保持する。一態様では、ＡＢボックスポリペプチドは、前述の変異を有する野生型ＨＭＧＢ１ポリペプチドのアミノ酸１～１７６、または１～１６２、またはさらには１～１６４を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
さらに別の態様では、単離されたＡＢボックスポリペプチドは、ＡボックスポリペプチドおよびＢボックスポリペプチドを連結する位置にあるリンカーポリペプチドと、一態様では、ＢボックスおよびＣボックスポリペプチドを連結する第２のリンカーとをさらに含む。組換え的に産生される場合、ＡＢまたはＡ、ＢおよびＣボックスポリペプチドは、部分的または完全にアセチル化、酸化、またはリン酸化され得る。ペプチドリンカーの例はＰＰＫＧＥＴＫＫＫＦである。一態様では、当技術分野、例えばＯｌｉａ ＡＳら、（２０１５）ＡＣＳ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ．１０（９）：２０３４－４７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｃｈｅｍｂｉｏ．５ｂ００３４２，ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２６０８３６７４；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４６１０８１０；Ｕｇｒｉｎｏｖａ Ｉら、（２１０２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１２；３９（１１）：９９４７－５３．Ｅｐｕｂ ２０１２／０６／２９．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０３３－０１２－１８６３－ｘ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２２７４０１４１；およびＩｔｏ Ｔら、（２００７）ＪＴＨ，５（１）：１０９－１６．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５３８－７８３６．２００６．０２２５５．ｘ．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１７２３９１６６で公知の方法を使用して必要に応じて部分的または完全にアセチル化、酸化またはリン酸化され得るＡおよび／またはＢボックスドメインにおいて１つまたはそれを超える本明細書に記載されるアミノ酸置換を有する単離された変異ＨＭＧＢ１ポリペプチドが提供される。
ＡＢボックスポリペプチドの例は、前述の変異を有する：
Figure 2022504139000004
 を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの同等物は、参照ポリペプチドと少なくとも約７０％またはあるいは少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の配列であって、一態様では変異アミノ酸（複数可）を保持する配列を指す。いくつかの態様では、ポリペプチドの同等物は、例えば、ＨＭＧボックスドメインを含有するポリペプチドの目的の機能および／または構造特徴を保持する。一態様では、同等なポリペプチドは、ＨＭＧボックスドメインと少なくとも約７０％、またはあるいは少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一のドメインであって、一態様では変異アミノ酸（複数可）を保持するドメインを含む。いくつかの態様では、このような同等なドメインは、ＨＭＢボックスドメインの機能および／または構造特徴、例えば、ＨＭＢボックス結合標的への結合を保持するが、炎症促進反応を誘導しない。一態様では、同等なポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で、ＨＭＢボックスドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによりコードされる。
さらなる態様では、単離されたＡＢボックスポリペプチドは、ＡボックスポリペプチドおよびＢボックスポリペプチドを連結する位置にあるリンカーポリペプチドをさらに含む。
Ａ、ＢおよびＣドメインを含む単離されたＨＭＧＢ１ポリペプチドであって、Ｋ１２、Ｃ２３、Ｃ４５、Ｃ１０６もしくはＫ１１４から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異を含むか、もしくはそれから本質的になるか、もしくはさらにはそれからなるＨＭＧＢ１ポリペプチド、またはＫ１２、Ｃ２３、Ｃ４５、Ｃ１０６もしくはＫ１１４から選択される１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異を含むその同等物も提供される。本明細書で使用される場合、ポリペプチドの同等物は、参照ポリペプチドと少なくとも約７０％またはあるいは少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の配列であって、一態様では変異アミノ酸（複数可）を保持する配列を指す。いくつかの態様では、ポリペプチドの同等物は、例えば、ＨＭＧボックスドメインを含有するポリペプチドの目的の機能および／または構造特徴を保持するが、炎症促進反応を誘導しない。一態様では、同等なポリペプチドは、ＨＭＧボックスドメインと少なくとも約７０％、またはあるいは少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一のドメインであって、一態様では変異アミノ酸（複数可）を保持するドメインを含む。いくつかの態様では、このような同等なドメインは、ＨＭＢボックスドメインの機能および／または構造特徴、例えば、ＨＭＢボックス結合標的への結合を保持するが、炎症促進反応を誘導しない。一態様では、同等なポリペプチドは、ストリンジェントな条件下で、ＨＭＢボックスドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによりコードされる。
さらなる態様では、単離されたＨＭＧＢ１ボックスポリペプチドは、ＡボックスポリペプチドおよびＢボックスポリペプチドを連結する位置にあるリンカーポリペプチドと、ＢボックスポリペプチドおよびＣボックスポリペプチドを連結する第２のリンカーポリペプチドとをさらに含む。ペプチドリンカーの例はＰＰＫＧＥＴＫＫＫＦである。
ポリペプチドは、担体、例えば薬学的に許容され得る担体で検出可能に標識され得、および／またはそれと組み合わされ得る。
抗体およびその誘導体
本開示はまた、本明細書に開示される方法において使用するための、単離されたポリペプチドに結合し、ならびに／またはそれを特異的に認識してそれに結合する抗体を提供する。抗体は、本明細書に記載される様々な抗体のいずれかであり得、このようなものの非限定的な例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ベニア化抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、抗体誘導体、組換えヒト化抗体またはそれらのそれぞれの誘導体もしくは断片が挙げられる。一態様では、断片は、抗体のＣＤＲを含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。一態様では、抗体は検出可能に標識されるか、またはそれにコンジュゲートされた検出可能な標識をさらに含む。本明細書に開示されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も提供される。上記実施形態の１つまたはそれよりも多くを含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる組成物が本明細書でさらに提供される。抗体および断片のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに抗体ポリペプチドおよびその断片を組換え的にまたは化学的に合成するための方法がさらに提供される。抗体ポリペプチドは、真核もしくは原核細胞において、または本明細書に記載される当技術分野で公知の他の方法により産生され得る。
抗体は、文献に十分に記載されている当技術分野で公知の従来の技術を使用して生成され得る。ポリクローナル抗体の産生のためのいくつかの方法が存在する。例えば、ポリクローナル抗体は、典型的には、適切な哺乳動物、例えば限定されないが、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラットおよびウサギを免疫することにより産生される。抗原を哺乳動物に注射し、抗原に特異的な免疫グロブリンを産生するようにＢリンパ球を誘導する。免疫グロブリンは、哺乳動物の血清から精製され得る。
モノクローナル抗体は、文献に十分に記載されている当技術分野で公知の従来のハイブリドーマ法を使用して生成され得る。例えば、ハイブリドーマは、適切な不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株、例えば限定されないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０－ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ－１、Ｌ．５、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、Ｓｐ２ ＳＳ１、Ｓｐ２ ＳＡ５、Ｕ３９７、ＭＩＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ－１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ－５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３１３、ＨＬ－６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａ、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ．６、ＹＢ２／Ｏ）など、またはヘテロミエローマ、それらの融合生成物、またはそれらに由来する任意の細胞もしくは融合細胞、または当技術分野で公知の任意の他の適切な細胞株（以下のウェブアドレス、例えば２００７年１１月２６日に最終アクセスされたａｔｃｃ．ｏｒｇ，ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍにおけるものを参照のこと）を抗体産生細胞、例えば限定されないが、単離またはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ、扁桃腺、または他の免疫もしくはＢ細胞含有細胞、または内因性もしくは異種核酸として、組換え体もしくは内因性ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、齧歯類、ウマ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、霊長類、真核生物ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはミトコンドリアＲＮＡ、クロロプラストＤＮＡもしくはクロロプラストＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖核酸、ハイブリダイズ核酸などもしくはそれらの任意の組み合わせとして重鎖もしくは軽鎖定常もしくは可変もしくはフレームワークＣＤＲ配列を発現する任意の他の細胞と融合させることにより産生される。また、目的の抗原で免疫されたヒトまたは他の適切な動物の末梢血または特定の実施形態では脾臓またはリンパ節から抗体産生細胞を得、次いで、目的の活性についてスクリーニングし得る。任意の他の適切な宿主細胞もまた、本開示の抗体、その指定断片またはバリアントをコードする異種または内因性核酸を発現させるために使用され得る。融合細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択培養条件または他の適切な公知の方法を使用して単離され得、限界希釈もしくは細胞選別または他の公知の方法によりクローニングされ得る。
必須の特異性の抗体を産生または単離する他の適切な方法が使用され得、限定されないが、当技術分野で公知の方法を使用してペプチドまたはタンパク質ライブラリー（例えば限定されないが、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡなどのディスプレイライブラリー；例えば、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｄｅｌ．）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ａｆｆｉｔｅｃｈ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）などの様々な商業的供給業者から入手可能）から組換え抗体を選択する方法が挙げられる。当技術分野で公知の方法は特許文献に記載されており、それらのいくつかとしては、米国特許第４，７０４，６９２号；米国特許第５，７２３，３２３号；米国特許第５，７６３，１９２号；米国特許第５，８１４，４７６号；米国特許第５，８１７，４８３号；米国特許第５，８２４，５１４号；および米国特許第５，９７６，８６２号が挙げられる。代替的な方法は、当技術分野で公知であり、および／または本明細書に記載されるように、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎら、（１９７７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１－９０７（１９９７）；Ｓａｎｄｈｕら、（１９９６）Ｃｒｉｔ，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５－１１８；Ｅｒｅｎら、（１９９８）Ｍｕｍｍａ ９３：１５４－１６１）の免疫に依拠する。このような技術としては、限定されないが、リボソームディスプレイ（Ｗａｎｅｓら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７－４９４２；Ｈａｎｅｓら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４１３０－１４１３５）；単一細胞抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号；Ｗｅｎら、（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １７：８８７－８９２；Ｂａｂｃｏｏｋら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３－７８４８）；ゲルマイクロ液滴およびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌら、（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３－３３７；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）；Ｇｒａｙら、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５－１６３；およびＫｅｎｎｙら、（１９９５）Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７－７９０）；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら、（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１２５－１３４）が挙げられる。
本開示の抗体誘導体はまた、本明細書に開示される抗体をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主に送達して、例えばミルク中にこのような抗体を産生するトランスジェニック動物または哺乳動物、例えばヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどを提供することにより調製され得る。これらの方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；米国特許第５，８４９，９９２号；米国特許第４，８７３，３１６号；米国特許第５，８４９，９９２号；米国特許第５，９９４，６１６号；米国特許第５，５６５，３６２号；および米国特許第５，３０４，４８９号に記載されている。
「抗体誘導体」という用語は、抗体または断片の線状ポリペプチド配列への翻訳後修飾を含む。例えば、米国特許第６，６０２，６８４号Ｂ１は、免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含み、増強したＦｅ媒介性細胞傷害性を有する抗体（全抗体分子、抗体断片または融合タンパク質を含む）の改変グリコール形態の生産のための方法、およびそのようにして生産された糖タンパク質について記載している。
本明細書に開示される抗体はまた、共有結合的付着が抗体による抗イディオタイプ反応の生成を妨げないように、抗体への任意のタイプの分子の共有結合的付着により改変された誘導体を含む。抗体誘導体としては、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞内リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより改変されている抗体が挙げられる。加えて、誘導体は、１つまたはそれを超える非古典的アミノ酸を含有し得る。
抗体誘導体はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを送達して、植物部分またはそれから培養された細胞においてこのような抗体、指定部分またはバリアントを産生するトランスジェニック植物および培養植物細胞（例えば限定されないが、タバコ、トウモロコシおよびウキクサ）を提供することにより調製され得る。例えば、Ｃｒａｍｅｒら、（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５－１１８およびそこで引用されている参考文献は、例えば、誘導性プロモーターを使用した、大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の生産について記載している。トランスジェニックトウモロコシは、他の組換え系において産生されたかまたは天然供給源から精製されたものと同等の生物学的活性を有する商業生産レベルの哺乳動物タンパク質を発現させるために使用されている。例えば、Ｈｏｏｄら、（１９９９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６４：１２７－１４７およびそこで引用されている参考文献を参照のこと。抗体誘導体はまた、タバコ種子およびジャガイモ塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物種子から大量に生産されている。例えば、Ｃｏｎｒａｄら、（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１０１－１０９およびそこで引用されている参考文献を参照のこと。したがって、抗体はまた、公知の方法にしたがって、トランスジェニック植物を使用して生産され得る。
免疫原性を改変するか、または結合、親和性、オン速度、オフ速度、アビディティ、特異性、半減期もしくは任意の他の適切な特徴を減少、増強もしくは改変するために、抗体誘導体はまた、例えば、外因性配列を付加することにより産生され得る。一般に、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部または全部は維持され、可変および定常領域の非ヒト配列は、ヒトもしくは他のアミノ酸または他のアイソタイプ由来の可領もしくは定常領域で置き換えられる。
一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的におよび最も実質的に関与する。抗体のヒト化または操作は、任意の公知の方法、例えば限定されないが、米国特許第５，７２３，３２３号；米国特許第５，９７６，８６２号；米国特許第５，８２４，５１４号；米国特許第５，８１７，４８３号；米国特許第５，８１４，４７６号；米国特許第５，７６３，１９２号；米国特許第５，７２３，３２３号；米国特許第５，７６６，８８６号；米国特許第５，７１４，３５２号；米国特許第６，２０４，０２３号；米国特許第６，１８０，３７０号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，２２５，５３９号；および米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているものを使用して実施され得る。
本開示のキメラ、ヒト化または霊長類化抗体は、標準的な分子生物学技術を使用して調製された参照モノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは目的のハイブリドーマから得られ得、標準的な分子生物学技術を使用して、非参照（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作され得る。例えば、キメラ抗体を作るために、マウス可変領域は、当技術分野で公知の方法（米国特許第４，８１６，５６７号）を使用して、ヒト定常領域に連結され得る。ヒト化抗体を作るために、マウスＣＤＲ領域は、当技術分野で公知の方法（米国特許第５，２２５，５３９号および米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６２号；および米国特許第６，１８０，３７０号）を使用して、ヒトフレームワークに挿入され得る。同様に、霊長類化抗体を作るために、マウスＣＤＲ領域は、当技術分野で公知の方法（国際公開第９３／０２１０８号および国際公開第９９／５５３６９号）を使用して、霊長類フレームワークに挿入され得る。
部分ヒト抗体から完全ヒト抗体までを作製するための技術は当技術分野で公知であり、任意のこのような技術が使用され得る。一実施形態によれば、完全ヒト抗体配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製される。異なるクラスの抗体を産生することができるこのようなトランスジェニックマウスの複数の系統が作製されている。所望の抗体を産生するトランスジェニックマウス由来のＢ細胞を融合させて、所望の抗体の持続的産生のためのハイブリドーマ細胞株を作製し得る（例えば、Ｒｕｓｓｅｌら、（２０００）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ａｐｒｉｌ ２０００：１８２０－１８２６；Ｇａｌｌｏら、（２０００）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．３０：５３４－５４０；Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１－２３；Ｙａｎｇら、（１９９９Ａ）Ｊ．ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６６：４０１－４１０；Ｙａｎｇ（１９９９Ｂ）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９（６）：１２３６－１２４３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３１：３３－４２；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（３）：４８３－４９５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７－６１４；Ｔｓｕｄａら、（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４２：４１３－４２１；Ｓｈｅｒｍａｎ－Ｇｏｌｄ（１９９７）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １７（１４）；Ｍｅｎｄｅｚら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖｏｌ．ＩＶ，１９４．１－１９４．７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５６１－５６６；Ｍｅｎｄｅｚら、（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６：２９４－３０７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４（８）：７６１－７６３；Ａｒｂｏｎｅｓら、（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １（４）：２４７－２６０；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２（６４１７）：２５５－２５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（６）：２５５１－２５５５；および米国特許第６，０７５，１８１号を参照のこと）。
本明細書に開示される抗体はまた、キメラ抗体を作るように改変され得る。キメラ抗体は、抗体の重鎖および軽鎖の多様なドメインが、１つを超える種由来のＤＮＡによりコードされるものである。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。
あるいは、本明細書に開示される抗体はまた、ベニア化抗体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作るように改変され得る。ベニア化抗体は、第１の種の抗体が第２の種において免疫原性ではなく、それにより、抗体の免疫原性を減少させるように、第１の種の抗体の外部アミノ酸残基が、第２の種のもので賢明に置き換えられたかまたは「ベニア化」されたものである。タンパク質の免疫原性はその表面の性質に主に依存するので、抗体の免疫原性は、別の哺乳動物種抗体に通常見られるものとは異なる露出残基を置き換えることにより低減され得る。外部残基のこの賢明な置き換えは、内部ドメインまたはドメイン間接触に対してほとんどまたは全く効果を有しないはずである。したがって、可変領域フレームワーク残基に限定される変更の結果として、リガンド結合特性は影響を受けないはずである。抗体の外面または皮のみが変更され、支持残基は依然として乱されないので、前記プロセスは「ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と称される。
「ベニア化」の手順は、Ｋａｂａｔら、（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによりコンパイルされたヒト抗体可変ドメインの利用可能な配列データ、このデータベースの更新、ならびに他のアクセス可能な米国および外国データベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。ベニア化抗体を産生するために使用される方法の非限定的な例としては、欧州特許第５１９５９６号；米国特許第６，７９７，４９２号が挙げられ、Ｐａｄｌａｎら、（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４－５）：４８９－４９８に記載されている。
「抗体誘導体」という用語はまた、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であって、同じポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む「ダイアボディ」を含む（例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８を参照のこと）。同じ鎖上の２つのドメイン間における対形成を可能にするには過度に短いリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成し、２つの抗原結合部位を作る（親抗体の超可変領域に挿入された１つまたはそれを超えるアミノ酸と、抗原に対する親抗体の結合親和性よりも少なくとも約２倍強い標的抗原に対する結合親和性とを有する抗体バリアントについて開示しているＣｈｅｎらの米国特許第６，６３２，９２６号も参照のこと）。
「抗体誘導体」という用語は、操作された抗体分子、断片および単一ドメイン、例えばｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ミニボディ、ユニボディおよびアフィボディをさらに含む、およびＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（９）：１１２６－３６；米国特許出願公開第２００６／０２１１０８８号；国際公開第２００７／０５９７８２号；米国特許第５，８３１，０１２号）。
「抗体誘導体」という用語は、「線状抗体」をさらに含む。線状抗体を作製するための手順は当技術分野で公知であり、Ｚａｐａｔａら、（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２に記載されている。簡潔に言えば、これらの抗体は、一組の抗原結合領域を形成する一組のタンデムＥｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
本明細書に開示される抗体は、限定されないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用され得る。
本開示の抗体は、普通に精製した生成物、化学合成手順の生成物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主から、またはあるいは上記原核生物宿主から組換え技術により産生された生成物を含む。多くの抗体産生系がＢｉｒｃｈ＆Ｒａｄｎｅｒ（２００６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５８：６７１－６８５に記載されている。
試験されている抗体がタンパク質またはポリペプチドと結合する場合、試験されている抗体および本開示により提供される抗体は同等である。抗体が、本明細書に開示される抗体と同じ特異性を有するかどうかについては、過度の実験を用いずに、本明細書に開示される抗体が、その抗体が通常反応性であるタンパク質またはポリペプチドに結合することを、試験されている抗体が防止するかどうかを決定することにより、決定することも可能である。試験されている抗体が、本明細書に開示されるモノクローナル抗体による結合の減少により示されるように本明細書に開示される抗体と競合する場合、２つの抗体は同じまたは近縁エピトープに結合する可能性がある。あるいは、本明細書に開示される抗体を、それが通常反応性であるタンパク質と共にプレインキュベートし、試験されている前記抗体がその抗原結合能力を阻害されるかを決定し得る。試験されている抗体が阻害される場合、そのときには、その抗体は、ほとんど確実に本明細書に開示される抗体と同じまたは近縁エピトープ特異性を有する。
「抗体」という用語はまた、すべての免疫グロブリンアイソタイプおよびサブクラスの抗体を含むことを意図する。特定のアイソタイプのモノクローナル抗体は、初期融合から選択することにより直接調製され得るか、またはＳｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６５３もしくはＳｐｉｒａら、（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７４：３０７に記載されている手順を使用してクラススイッチバリアントを単離するためのｓｉｂ選択技術を使用することにより、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製され得る。あるいは、組換えＤＮＡ技術も使用され得る。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体の特異性を有する他のモノクローナル抗体の単離もまた、抗イディオタイプ抗体を産生することにより、当業者により達成され得る。Ｈｅｒｌｙｎら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１００。抗イディオタイプ抗体は、目的のモノクローナル抗体に存在するユニークな決定基を認識する抗体である。
本明細書に開示されるいくつかの態様では、抗体を検出可能にまたは治療的に標識することが有用である。適切な標識は上記に記載されている。抗体をこれらの剤にコンジュゲートするための方法は当技術分野で公知である。単に例示目的で、抗体は、検出可能な部分、例えば放射性原子、発色団、フルオロフォアなどで標識され得る。このような標識抗体は、インビボまたは単離された試験サンプルのいずれかで診断技術に使用され得る。
低分子量ハプテンへの抗体のカップリングは、アッセイにおける抗体の感度を増加させ得る。次いで、ハプテンは、第２の反応により特異的に検出され得る。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特定の抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロフェノール、ピリドキサールおよびフルオレセインなどのハプテンを使用することが一般的である。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）前掲を参照のこと。
本開示の抗体の可変領域は、抗体の１つまたはそれを超える結合特性（例えば、親和性）を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることにより改変され得る。変異は、部位特異的変異誘発もしくはＰＣＲ媒介変異誘発により導入され得るか、または抗体結合または目的の他の機能特性に対する効果は、適切なインビトロもしくはインビボアッセイで評価され得る。特定の実施形態では、保存的改変が導入され、典型的にはＣＤＲ領域内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下または５個以下の残基が変更される。変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得る。
例えば、１つまたはそれを超えるフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列に「復帰変異」させることにより、フレームワーク改変を抗体に行って、免疫原性を減少させ得る。
加えて、本明細書に開示される抗体は、抗体の１つまたはそれを超える機能特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害性を変化させるためのＦｃ領域内の改変を含むように操作され得る。このような改変としては、限定されないが、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするか、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるためのヒンジ領域中のシステイン残基の数の変化（米国特許第５，６７７，４２５号）、および抗体の生物学的半減期を減少させるためのＦｃヒンジ領域中のアミノ酸変異（米国特許第６，１６５，７４５号）が挙げられる。
加えて、本明細書に開示される抗体は、化学的に改変され得る。抗体のグリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように、抗体配列内の１つまたはそれを超えるグリコシル化部位を改変することにより変化させ得る（米国特許第５，７１４，３５０号；および米国特許第６，３５０，８６１号）。あるいは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性を増加させるために、低減した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加した二分枝ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体は、変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることにより得られ得る（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０；Ｕｍａｎａら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０）。
本明細書に開示される抗体は、１つまたはそれを超えるＰＥＧ基が抗体または抗体断片に結合される条件下で、抗体またはその断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体と反応させることにより、生物学的半減期を増加させるようにペグ化され得る。抗体ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応またはアルキル化反応により行われ得る。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれか、例えばモノ（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドを包含することを意図する。ペグ化すべき抗体は非グリコシル化抗体であり得る。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野で公知であり、本明細書に開示される抗体に適用され得る（欧州特許出願公開第０１５４３１６号および欧州特許出願公開第０４０１３８４号）。
加えて、抗体は、抗体の抗原結合領域を血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンにコンジュゲートまたは融合させることにより、得られる分子の半減期を増加させるように化学的に改変され得る。このようなアプローチは、例えば、欧州特許出願公開第０３２２０９４号および欧州特許出願公開第０４８６５２５号に記載されている。
本開示の抗体またはその断片は診断剤にコンジュゲートされ、診断的に、例えば、疾患の発症または進行をモニタリングし、所定の処置レジメンの有効性を決定するために使用され得る。診断剤の例としては、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、様々な陽電子放射トモグラフィーを使用した陽電子放出性金属および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は直接的に、または当技術分野で公知の技術を使用してリンカーを介して間接的にのいずれかで抗体またはその断片にカップリングまたはコンジュゲートされ得る。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光材料の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる。適切な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、インジウム－１１１、ルテチウム－１７１、ビスマス－２１２、ビスマス－２１３、アスタチン－２１１、銅－６２、銅－６４、銅－６７、イットリウム－９０、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、リン－３２、リン－３３、スカンジウム－４７、銀－１１１、ガリウム－６７、プラセオジム－１４２、サマリウム－１５３、テルビウム－１６１、ジスプロシウム－１６６、ホルミウム－１６６、レニウム－１８６、レニウム－１８８、レニウム－１８９、鉛－２１２、ラジウム－２２３、アクチニウム－２２５、鉄－５９、セレン－７５、ヒ素－７７、ストロンチウム－８９、モリブデン－９９、ロジウム－１１０５、パラジウム－１０９、プラセオジム－１４３、プロメチウム－１４９、エルビウム－１６９、イリジウム－１９４、金－１９８、金－１９９および鉛－２１１が挙げられる。モノクローナル抗体は、抗体に共有結合的に連結された二官能性のキレート剤の使用により、放射性金属イオンと間接的にコンジュゲートされ得る。キレート剤は、アミン（Ｍｅａｒｅｓら、（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：６８－７８）、アミノ酸残基のスルフヒドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ ｇｒｏｕｐ）（Ｋｏｙａｍａ（１９９４）Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．１２０：２１７－２６２）および炭水化物基（Ｒｏｄｗｅｌｌら、（１９８６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３：２６３２－２６３６；Ｑｕａｄｒｉら、（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：５５９－５７０）を介して結合され得る。
さらに、本開示の抗体またはその断片は、治療剤にコンジュゲートされ得る。適切な治療剤としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシル、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチンおよび他の白金誘導体、例えばカルボプラチン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、ジフテリア毒素および関連分子（例えば、ジフテリア毒素Ａ鎖およびその活性断片、ならびにハイブリッド分子）、リシン毒素（例えば、リシン毒素Ａまたは脱グリコシル化リシン毒素Ａ鎖）、コレラ毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ－Ｉ、ＳＬＴ－ＩＩ、ＳＬＴ－ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ダイズボーマン－バークプロテアーゼ阻害剤、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、アロリン、サポリン、モデクシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｅｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン毒素および混合毒素が挙げられる。
さらなる適切なコンジュゲート分子としては、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、アンチセンス核酸、阻害性ＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ分子、免疫賦活性核酸、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子および外部ガイド配列が挙げられる。アプタマーは、規定の二次構造および三次構造、例えばステムループまたはＧカルテットにフォールディングされる１５～５０塩基長の範囲の小さな核酸であり、小分子、例えばＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）ならびに大きな分子、例えば逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）に結合し得る。リボザイムは、分子内的にまたは分子間的に化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、典型的には、その後の切断を伴う標的基質の認識および結合を介して、核酸基質を切断する。三重鎖形成機能核酸分子は、三重鎖を形成することにより二本鎖または一本鎖核酸と相互作用し得、ＤＮＡの３つの鎖は、ワトソン・クリックおよびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存して複合体を形成する。三重鎖分子は、高度な親和性および特異性で標的領域に結合し得る。
機能的核酸分子は、標的分子により保有される特異的活性のエフェクター、阻害剤、修飾物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）および刺激剤として作用し得るか、または機能的分子は、いかなる他の分子とも独立してデノボ活性を保有し得る。
治療剤は、利用可能な多数の方法のいずれかを使用して、抗体に直接的にまたは間接的に連結され得る。例えば、薬剤は、Ｎ－スクシニル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの架橋剤を使用してジスルフィド結合形成を介して、または抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して、還元抗体構成成分のヒンジ領域に結合され得る（Ｙｕら、１９９４ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら、（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ １８７－２３０（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら、（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ ６０－８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ
１９９５））。
治療剤を抗体にコンジュゲートするための技術は周知である（Ａｍｏｎら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３－５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら、（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら、（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３－１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９－５８）。
少なくとも２つまたはそれを超える異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性または多重特異性分子を生成するために、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合領域は、別の機能的分子、例えば別の抗体または受容体のリガンドに連結され得る。１つまたはそれを超える他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物への抗体の連結は、例えば、化学的カップリング、遺伝子融合または非共有結合的会合により行われ得る。多重特異性分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含み得る。
二重特異性および多重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、二重特異性分子（ｈｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の各結合単位を個別に生成し、次いで、互いにコンジュゲートされ得る。結合分子がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリングまたは架橋剤が共有結合的コンジュゲーションに使用され得る。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸））（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－Ｉ－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８）が挙げられる。結合分子が抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートされ得る。
本開示の抗体またはその断片は、抗体が結合して「枯渇」抗体を形成する細胞に対して毒性の部分に連結され得る。これらの抗体は、ＮＫ細胞を枯渇させることが望まれる用途において特に有用である。
本明細書に開示される抗体はまた固体支持体に結合され得、これは、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。このような固体支持体としては、限定されないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
抗体はまた、多くの異なる担体に結合され得る。したがって、本開示はまた、抗体と、活性または不活性な別の物質とを含有する組成物を提供する。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本明細書に開示される目的のために可溶性または不溶性であり得る。当業者は、モノクローナル抗体を結合させるために適切な他の担体について把握しているか、またはルーチンな実験を使用してこのようなものを確認することができる。
本明細書で提供される抗体の態様のいくつかでは、抗体は全長抗体である。
本明細書で提供される抗体の態様のいくつかでは、抗体はモノクローナル抗体である。
本明細書で提供される抗体の態様のいくつかでは、抗体はキメラまたはヒト化である。
本明細書で提供される抗体の態様のいくつかでは、抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖおよびＦｖからなる群より選択される。
本明細書で提供される抗体の態様のいくつかでは、抗体はＦｃドメインを含む。本明細書で提供される抗体の態様のいくつかでは、抗体は、非ヒト動物、例えばラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコまたはウサギ抗体である。本明細書で提供される抗体の態様のいくつかでは、抗体は、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。
本明細書で提供される抗体の態様のいくつかでは、抗体はヒト抗体フレームワーク領域を含む。
他の態様では、本明細書で提供される抗体のＣＤＲ中の１つまたはそれを超える残基は、別のアミノ酸で置換される。置換は、同じアミノ酸ファミリー内の置換であるという意味で、「保存的」であり得る。天然に存在するアミノ酸は以下の４つのファミリーに分けられ得、保存的置換はこれらのファミリー内で起こる。
１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン。
２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸。
３）非電荷極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン。
４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
別の態様では、１つまたはそれを超える残基が、抗体の１つまたはそれを超えるＣＤＲに付加されるか、またはそれらから欠失される。このような付加または欠失は、ＣＤＲのＮもしくはＣ末端またはＣＤＲ内の位置において起こる。
アミノ酸の付加、欠失または置換により抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を変えることにより、標的抗原に対する結合親和性の増加などの様々な効果が得られ得る。
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本開示はまた、上記で特定されているポリペプチドまたは抗体の１つまたはそれよりも多くをコードする単離されたまたは組換えポリヌクレオチドおよびそれらの各相補鎖を提供する。単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを含むベクターがさらに提供され、その例は当技術分野で公知であり、本明細書に簡単に記載されている。１つを超える単離されたまたは組換えポリヌクレオチドが単一ユニットとして発現させるべき一態様では、単離されたまたは組換えポリヌクレオチドは、ポリシストロン性ベクター内に含有され得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡであり得る。
本開示はさらに、ＲＮＡ転写のプロモーターならびにＤＮＡまたはＲＮＡの複製および／または一過性発現もしくは安定的発現のための他の調節配列に機能的に連結された単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される場合、「機能的に連結された」という用語は、プロモーターが、ＤＮＡ分子からのＲＮＡの転写を指令するように配置されていることを意味する。このようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４およびＴ７である。特定の実施形態では、細胞特異的プロモーターは、挿入されたポリヌクレオチドの細胞特異的発現に使用される。終始コドンおよび選択マーカー配列、ならびにＤＮＡの挿入片がそのプロモーターに機能的に連結され得るクローニング部位と共にプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーを含有するベクターが当技術分野で公知であり、市販されている。一般的な方法およびクローニング戦略については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９１））およびそこで引用されている参照文献、ならびに様々な適切なベクターについてのマップ、機能的特性、商業的供給業者およびＧｅｎＥＭＢＬ受託番号の参照を含有するＥｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄａｔａ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｇａｃｅｓａ ａｎｄ Ｒａｍｊｉ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４））を参照のこと。
一実施形態では、本開示のポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される診断的および治療的有用性を有するポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片、ならびにタンパク質の転写産物を同定するためのプローブ（これは存在してもよいしまたは存在しなくてもよい）をコードする。これらの核酸断片は、例えば、より大きなポリヌクレオチドの制限酵素消化により調製され、次いで、検出可能なマーカーで標識され得る。あるいは、ランダム断片は、分子のニックトランスレーションを使用して生成され得る。このような断片の調製および標識のための方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前掲を参照のこと。
これらの核酸を含有する発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを産生するための宿主ベクター系を得るために有用である。これらの発現ベクターは、宿主生物において、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な一部として複製可能でなければならないことが示されている。適切な発現ベクターの非限定的な例としては、プラスミド、酵母ベクター、ウイルスベクターおよびリポソームが挙げられる。インビトロおよびインビボの両方における高レベルの発現および細胞の効率的な形質転換により、アデノウイルスベクターはインビボで遺伝子を組織に導入するために特に有用である。核酸が適切な宿主細胞、例えば原核または真核細胞および宿主細胞複製物に挿入される場合、タンパク質は組換え的に産生され得る。適切な宿主細胞はベクターに依存し、公知の方法を使用して構築された原核および真核細胞、例えば哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞および細菌細胞を含み得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前掲を参照のこと。細胞への外因性核酸の挿入のためのウイルスベクターの使用に加えて、核酸は、当技術分野で公知の方法、例えば細菌細胞のための形質転換；哺乳動物細胞のための、リン酸カルシウム沈降を使用したトランスフェクション；またはＤＥＡＥ－デキストラン；エレクトロポレーション；またはマイクロインジェクションにより、宿主細胞に挿入され得る。方法についてはＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前掲を参照のこと。したがって、本開示はまた、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体もしくはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、動物細胞（ラットまたはマウス）、ヒト細胞または原核細胞、例えば細菌細胞を提供する。
ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前にまたはその後に付与され得る。非ヌクレオチド構成成分がヌクレオチドの配列の途中に挿入されていてよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識構成成分とのコンジュゲーションによりさらに改変され得る。この用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。特に指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される２つの各相補的一本鎖形態との両方を包含する。
ベクターが、インビボまたはエクスビボで遺伝子療法に使用される場合、複製能力欠損レトロウイルスまたはアデノウイルスベクターなどの薬学的に許容され得るベクターが好ましい。本開示の核酸を含有する薬学的に許容され得るベクターは、挿入されたポリヌクレオチドを一過性または安定的発現のためにさらに改変され得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得るベクター」という用語は、限定されないが、核酸を選択的に標的としそれを***細胞へと導入する能力を有するベクターまたは送達ビヒクルを含む。このようなベクターの例は、ウイルスタンパク質を産生して感染宿主細胞においてベクターを拡散させることができないことにより定義される「複製能力欠損」ベクターである。複製能力欠損レトロウイルスベクターの例は、ＬＮＬ６（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０－９９０）である。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介遺伝子移入のために複製能力欠損レトロウイルスを使用する方法が確立されている（Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：８９１２－８９５２；Ｃｕｌｖｅｒ（１９９１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：３１５５；およびＲｉｌｌ（１９９１）Ｂｌｏｏｄ ７９（１０）：２６９４－２７００）。
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドを含有し、および／またはそれを発現する遺伝子改変細胞を提供する。遺伝子改変細胞は、上流調節配列、例えばプロモーターまたは遺伝子活性化因子の挿入により作製され得る（米国特許第５，７３３，７６１号を参照のこと）。
ポリヌクレオチドは、細胞における核酸の検出および／または遺伝子の発現のために、検出可能マーカー、例えば酵素標識または放射性同位体にコンジュゲートされ得る。検出可能なシグナルを生じさせることができる蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンドまたは他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンを含む多種多様な適切な検出可能なマーカーが当技術分野で公知である。一態様では、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬に代えて、蛍光標識または酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼを用いることが望まれる可能性がある。酵素タグの場合、熱量測定インジケーター基質（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を用いて、相補的な核酸含有サンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを同定するための、目視可能な手段または分光光度的に検出可能な手段を提供し得る。したがって、本開示はさらに、相補的一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能になる条件下で（好ましくは、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）、またはより好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的一本鎖ポリヌクレオチドを、本開示のポリヌクレオチドの一部である標識一本鎖ポリヌクレオチド（プローブ）と接触させることにより、一本鎖ポリヌクレオチドまたはその相補体を検出するための方法を提供する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対は、ハイブリダイズしなかった一本鎖ポリヌクレオチドから分離される。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対は、当業者に公知の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）前掲に記載されている方法を使用して検出される。
本開示で具体化されるポリヌクレオチドは、化学合成、組換えクローニング法、ＰＣＲまたはそれらの任意の組み合わせを使用して得られ得る。化学的なポリヌクレオチド合成は当技術分野で公知であり、本明細書に詳細に記載される必要はない。当業者は、本明細書で提供される配列データを使用して、ＤＮＡ合成機を用いることにより、または商業的サービスを依頼することにより所望のポリヌクレオチドを得ることができる。
本開示のポリヌクレオチドは、ＰＣＲを使用して単離または複製され得る。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５、米国特許第４，８００，１５９、米国特許第４，７５４，０６５、米国特許第４，６８３，２０２号の主題であり、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４））またはＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、（１９９１）および（１９９５）ならびにそこで引用されている参考文献に記載されている。あるいは、当業者は、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して、ＤＮＡを複製し得る。したがって、本開示はまた、ポリヌクレオチドの線状配列、ヌクレオチド、適切なプライマー分子、化学物質、例えば酵素およびそれらを複製のための指示を提供し、ポリヌクレオチドを得るために適切な方向でヌクレオチドを化学的に複製または連結することにより、本開示のポリヌクレオチドを得るためのプロセスを提供する。別の実施形態では、これらのポリヌクレオチドはさらに単離される。なおさらに、当業者は、複製および増幅のために、ポリヌクレオチドを適切な複製ベクターに挿入し、ベクターを適切な宿主細胞（原核または真核細胞）に挿入し得る。そのようにして増幅されたＤＮＡは、当業者に公知の方法により、細胞から単離され得る。この方法によりポリヌクレオチドを得るためのプロセス、およびそのようにして得られたポリヌクレオチドが本明細書でさらに提供される。
ＲＮＡは、最初に、ＤＮＡポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に挿入することにより得られ得る。ＤＮＡは、任意の適切な方法により、例えば、適切な遺伝子送達ビヒクル（例えば、リポソーム、プラスミドまたはベクター）の使用により、またはエレクトロポレーションにより送達され得る。細胞が複製してＤＮＡがＲＮＡに転写されたら、次いで、ＲＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前掲に記載されている当業者に公知の方法を使用して単離され得る。例えば、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前掲に記載されている手順にしたがって、様々な溶菌酵素または化学溶液を使用して単離され得、製造業者により提供される添付の指示にしたがって、核酸結合樹脂により抽出され得る。
本開示のポリヌクレオチドとの配列相補性または相同性を示すポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして、または本明細書で同定された特定のポリヌクレオチドの同等物として有用である。転写産物の完全なコード配列は公知であるので、この配列または相同配列の任意の部分は、本開示の方法において使用され得る。
「完全に一致する」プローブは、特異的なハイブリダイゼーションに必要ではないことが当技術分野で公知である。少数の塩基の置換、欠失または挿入により達成されるプローブ配列の軽微な変化は、ハイブリダイゼーション特異性に影響を及ぼさない。一般に、２０％程度の塩基対ミスマッチ（最適にアラインメントされた場合）が許容され得る。好ましくは、前述のｍＲＮＡを検出するために有用なプローブは、相同領域と少なくとも約８０％同一である。より好ましくは、プローブは、相同領域のアラインメント後に、対応する遺伝子配列と８５％同一であり、さらにより好ましくは、それは９０％の同一性を示す。
これらのプローブは、様々な細胞またはこれらの細胞を含有する組織を検出、予後診断、診断またはモニタリングするために、ラジオアッセイ（例えば、サザンおよびノーザンブロット分析）において使用され得る。プローブはまた、本開示のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現の検出のためのハイスループットスクリーニングアッセイにおいて使用するために、チップなどの固体支持体またはアレイに結合され得る。したがって、本開示は、ハイスループットスクリーニングにおいて使用するために固体支持体に結合された本開示のポリヌクレオチドまたはその同等物またはその相補体またはその断片を含むかまたはそれに対応するプローブを提供する。
断片の合計サイズおよび相補的ストレッチのサイズは、特定の核酸セグメントの目的の使用または適用に依存する。より小さな断片は、一般に、ハイブリダイゼーション実施形態において使用され、相補領域の長さは、例えば、少なくとも５から１０から約１００ヌクレオチドまでの間で、またはさらには検出したい相補配列に応じて全長で変動し得る。
ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それにより、得られる特定のハイブリッド分子の特異性を改善するために、５～１０ヌクレオチド長を超えるストレッチにわたる相補配列を有するヌクレオチドプローブが一般に好ましい。より好ましくは、１０ヌクレオチド長もしくはそれを超えるまたは５０ヌクレオチド長もしくはそれを超えるまたはさらには所望の場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有するポリヌクレオチドを設計し得る。このような断片は、例えば、化学的手段により断片を直接合成することにより、核酸複製技術、例えば米国特許第４，６０３，１０２号に記載されている２つのプライミングオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ技術の適用により、または組換え産生のために選択配列を組換えベクターに導入することにより容易に調製され得る。一態様では、プローブは、約５０～７５ヌクレオチド長もしくはそれを超えるあるいは５０～１００ヌクレオチド長である。
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される細胞において発現される遺伝子または遺伝子転写産物の検出のためのプライマーとして機能し得る。この文脈では、増幅は、妥当な忠実度で標的配列を複製することができるプライマー依存的ポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然または組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片および逆転写酵素により行われ得る。単に例示目的で、プライマーは、プローブについて特定されているものと同じ長さである。
ポリヌクレオチドを増幅するための１つの方法はＰＣＲであり、ＰＣＲ増幅のためのキットは市販されている。増幅後、得られるＤＮＡ断片は、当技術分野で公知の任意の適切な方法により、例えば、アガロースゲル電気泳動、続いて、臭化エチジウム染色および紫外線照射による可視化により検出され得る。
有効量の遺伝子送達ベクターまたはビヒクルを細胞に投与するための方法は開発されており、当業者に公知であり、本明細書に記載されている。細胞における遺伝子発現を検出するための方法は当技術分野で公知であり、ＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイおよびノーザンブロット分析などの技術が挙げられる。このような方法は、細胞における遺伝子の発現を検出および定量するために有用である。あるいは、コードされるポリペプチドの発現は、様々な方法により検出され得る。特に、標的ポリペプチドと特異的に反応性であるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製することが有用である。このような抗体は、例えば、免疫組織学法、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法などの技術を使用して、ポリペプチドを発現する細胞を可視化するために有用である。これらの技術は、発現されたポリヌクレオチドの発現レベルを決定するために使用され得る。
一態様では、ＨＭＧボックスドメインを含むポリペプチドは、原核生物および真核生物宿主細胞由来の野生型および組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質を含む。
タンパク質およびポリペプチドは、精製、化学合成および組換え法を含む当業者に公知の多くのプロセスにより入手可能である。ポリペプチドは、抗体を用いた免疫沈降などの方法、ならびにゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニティークロマトグラフィーなどの標準的な技術により、宿主細胞系などの調製物から単離され得る。このような方法については、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、（１９９９）Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．１８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。したがって、本開示はまた、これらのポリペプチドを得るためのプロセス、ならびにこれらのプロセスにより取得可能なおよび得られた生成物を提供する。
ポリペプチドはまた、市販の自動ペプチド合成機、例えばＰｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａまたは４３ｌＡ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡにより製造されたものを使用して化学合成により得られ得る。合成したポリペプチドを沈殿させ、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりさらに精製し得る。したがって、本開示はまた、タンパク質の配列および試薬、例えばアミノ酸および酵素を提供し、適切な配向および線状配列でアミノ酸を一緒に連結することにより、本開示のタンパク質を化学的に合成するためのプロセスを提供する。
あるいは、タンパク質およびポリペプチドは、例えば、本明細書に記載される宿主細胞およびベクター系を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前掲に記載されている周知の組換え法により得られ得る。
本発明のポリペプチドはまた、様々な固相担体、例えば埋込物、ステント、ペースト、ゲル、歯科インプラントもしくは医療用インプラント、または液相担体、例えばビーズ、滅菌溶液もしくは水溶液、薬学的に許容され得る担体、懸濁液およびエマルジョンと組み合わされ得る。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコールおよび植物油が挙げられる。インビボで抗体を調製するかまたは免疫反応を誘導するために使用される場合、担体はまた、特異的免疫反応を非特異的に増大させるために有用なアジュバントを含み得る。当業者は、アジュバントが必要であるかを容易に決定し、それを選択し得る。しかしながら、単に例示目的で、適切なアジュバントとしては、限定されないが、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント、無機塩類およびポリヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントとしては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、大腸菌易熱性エンテロトキシンの変異体誘導体、コレラ毒素の変異体誘導体、ＣＰＧオリゴヌクレオチドおよびスクアレンに由来するアジュバントが挙げられる。
治療方法
本開示の一実施形態は、微生物ＤＮＡへのＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質の結合を阻害、競合または滴定するための方法であって、前記ＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質または前記微生物ＤＮＡを本明細書に記載されるポリペプチドと接触させ、それにより、前記微生物ＤＮＡへの前記ＤＮＡＢＩＩタンパク質またはポリペプチドの前記結合を阻害、競合または滴定することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、接触はインビトロまたはインビボである。
本開示の別の実施形態は、微生物バイオフィルムを阻害、防止または破壊するための方法であって、前記バイオフィルムを本明細書に記載されるポリペプチドと接触させ、それにより、前記微生物バイオフィルムを阻害、防止または破壊することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、接触はインビトロまたはインビボである。
本開示の別の実施形態は、炎症反応を増強も誘導もせずにバイオフィルムを破壊することおよびクリアランスするための方法であって、前記バイオフィルムを、本明細書に記載されるＢボックスポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなるポリペプチドと接触させ、それにより、炎症反応を増強も誘導もせずにバイオフィルムを破壊することおよびクリアランスすることを含む方法を提供する。いくつかの態様では、接触はインビトロまたはインビボである。
本開示のさらに別の実施形態は、被験体におけるバイオフィルムを阻害、防止または破壊する方法であって、前記被験体に、有効量の本明細書に記載されるポリペプチドを投与し、それにより、前記微生物バイオフィルムを阻害、防止または破壊することを含む方法を提供する。一態様では、前記方法は、本明細書に開示されるＢボックスポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる有効量のポリペプチドを投与することを含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
別の実施形態では、被験体においてバイオフィルムを産生する微生物感染症を阻害、防止または処置するための方法であって、前記被験体に、有効量の本明細書に記載されるポリペプチドを投与し、それにより、前記被験体において前記バイオフィルムを産生する微生物感染症を阻害、防止または処置することを含む方法も提供される。一態様では、前記方法は、本明細書に開示されるＢボックスポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる有効量のポリペプチドを投与することを含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
上記実施形態の態様ではいずれも、ＨＭＧボックスドメインを含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなるポリペプチドは、本明細書に記載されるＡＢボックス、ＡボックスおよびＢボックスならびに変異体、短縮体および融合タンパク質（図３を参照のこと）ならびにそれらの同等物として記載される。
その同等物は、本明細書に記載されるＡＢボックス、ＡボックスおよびＢボックスならびに変異体、短縮体および融合タンパク質と少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一のポリペプチドを含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる（図３を参照のこと）。いくつかの態様では、同等物は、ポリペプチド中の変化したアミノ酸を保持し、親または参照タンパク質、ペプチド、融合または変異バージョンの能力を保持する。いくつかの態様では、ＨＭＧボックスドメインを含むポリペプチドは、任意の上記ポリペプチドの生物学的同等物を含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
いくつかの態様では、単離されたまたは組換えタンパク質は、哺乳動物タンパク質である。特定の態様では、哺乳動物タンパク質は、マウスまたはヒトタンパク質である。さらなる態様では、タンパク質は、真核または原核細胞において産生される哺乳動物タンパク質である。それらは、当技術分野で公知の方法を使用して翻訳後修飾され得る。
上記方法はいずれも、被験体に、抗菌薬、抗原性ペプチドまたはアジュバントのうちの有効量の１つまたはそれよりも多くを投与することをさらに含み得るか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。一態様では、被験体は、非ヒト動物またはヒト患者である。一態様では、患者は、若年者または幼児ヒトである。
ポリペプチドは、局所、経皮、舌下、直腸、膣、眼、皮下、筋肉内、腹腔内、尿道、鼻腔内、吸入または経口を含む方法により投与される。
いくつかの態様では、被験体は小児患者であり、ポリペプチドは、小児患者のための製剤で投与される。
上記実施形態ではいずれも、バイオフィルムは、表１に特定されている微生物由来の微生物ＤＮＡを含み得る。
Figure 2022504139000005
Figure 2022504139000006
一実施形態では、ポリペプチドは微生物感染症に局所投与され、バイオフィルムを破壊する。
一実施形態では、本開示は、免疫反応の誘導または提供を必要とする被験体において免疫反応を誘導または提供するための方法であって、前記被験体に、有効量の本明細書に記載されるポリペプチドを投与することを含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる方法を提供する。別の実施形態では、投与は、免疫反応が望まれる場所に局所的である。一態様では、前記方法は、本明細書に開示されるＢボックスポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる有効量のポリペプチドを投与することを含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。ＨＭＧボックスドメインを含むポリペプチドの例は本明細書に記載されている。一態様では、前記方法は、本明細書に開示されるＢボックスポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる有効量のポリペプチドを投与することを含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにはそれからなる。
単離されたまたは組換えタンパク質は、哺乳動物タンパク質、または特定の態様ではヒトタンパク質であり得る。いくつかの態様では、被験体は、非ヒト動物またはヒト患者である。
本開示の薬剤および組成物は、他の抗菌剤および／または表面抗原と共に同時投与または逐次投与され得る。特定の一態様では、投与は、感染部位に局所的である。投与の他の非限定的な例としては、経皮、舌下、直腸、膣、眼、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、吸入または経口を含む１つまたはそれを超える方法によるものが挙げられる。
一実施形態では、バイオフィルムの分解、またはバイオフィルムを産生する微生物感染症の阻害、防止もしくは処置、および本明細書に記載される医学的利益の提供における医薬の製造のための上記ポリペプチドのいずれかの使用も提供される。
これらの方法のいくつかでは、接触は、インビトロまたはインビボで実施され得る。接触がインビトロである場合、前記方法は、動物研究または臨床研究の前に本開示の薬剤の有効性を決定する手段を提供し、本開示の薬剤がさらなる抗菌薬と相乗的に作用するかを決定するために使用され得る。動物モデルにおいてインビボで実施される場合、前記方法は、ヒト患者における研究の前に本開示の薬剤の有効性を決定する手段を提供し、本開示の薬剤がさらなる抗菌剤と相乗的に作用するかを決定するために使用され得る。
本開示の方法により処置され得る微生物感染症および疾患としては、表１に特定されている生物、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍｅｓ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａまたはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉによる感染症が挙げられる。一態様では、微生物感染症は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（分類不能）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＥＳＫＡＰＥ病原体の１つまたはそれよりも多くである。これらの微生物感染症は、上気道、中気道および下気道（耳炎、副鼻腔炎または気管支炎）、さらには慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の悪化、慢性咳、嚢胞性線維症（ＣＦ）および市中肺炎（ＣＡＰ）の合併症および／または主因に存在し得る。
感染症はまた、口腔において起こり得（齲歯、歯周炎）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓにより引き起こされ得る。感染症はまた、皮膚に局在し得（膿瘍、「ブドウ球菌」感染症、膿痂疹、熱傷の二次感染症、ライム病）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉにより引き起こされ得る。尿路（ＵＴＩ）の感染症もまた処置され得、典型的には大腸菌により引き起こされる。消化管（ＧＩ）の感染症（下痢、コレラ、胆石、胃潰瘍）は、典型的には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉにより引き起こされる。生殖管の感染症はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含み、典型的にはそれにより引き起こされる。感染症は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓにより引き起こされる膀胱または留置デバイスのものであり得る。典型的には、様々な細菌により引き起こされる埋め込み人工デバイス、例えば人工股もしくは膝関節置換物（artificial hip or knee replacements）または歯科インプラントまたは医療デバイス、例えばポンプもしくはモニタリングシステムに関連する感染症は、本開示の方法により処置され得る。これらのデバイスは、本明細書で記載される薬剤でコーティングされ得るか、またはそれにコンジュゲートされ得る。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅにより引き起こされる感染症は、新生児における細菌性敗血症の主な原因である。このような感染症もまた、本開示の方法により処置され得る。同様に、髄膜炎を引き起こし得るＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより引き起こされる感染症も処置され得る。
したがって、本開示の方法に適用可能な投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、直腸、経鼻、経口的、吸入および他の経腸および非経口的な投与経路が挙げられる。投与経路は、所望により組み合わされ得るか、または薬剤および／もしくは所望の効果に応じて調整され得る。活性剤は、単回用量または複数回用量で投与され得る。送達に適切なこれらの方法および経路の実施形態は、全身経路または局所経路を含む。一般に、本開示の方法に適切な投与経路としては、限定されないが、経腸経路、非経口的経路または吸入による経路が挙げられる。
吸入投与以外の非経口投与経路としては、限定されないが、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内および静脈内経路、すなわち、消化管を通る経路以外の任意の投与経路が挙げられる。非経口投与は、阻害剤の全身送達または局所送達をもたらすように行われ得る。全身送達が望まれる場合、投与は、典型的には、医薬調製物の侵襲的または全身的に吸収される局所投与または粘膜投与を伴う。
本開示の化合物はまた、経腸投与により被験体に送達され得る。経腸投与経路としては、限定されないが、経口および直腸（例えば、坐薬を使用する）送達が挙げられる。
皮膚または粘膜を介した活性物質の投与方法としては、限定されないが、適切な医薬調製物の局所適用、経皮透過（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）、経真皮透過、注射および表皮投与が挙げられる。経真皮透過については、吸収促進剤またはイオン泳動が適切な方法である。イオン泳動的浸透は、数日間またはそれを超える期間にわたって、非損傷皮膚を通じて電気的パルスによりそれらの生成物を連続的に送達する市販の「パッチ」を使用して達成され得る。
本開示の方法の様々な実施形態では、活性物質は、連続的に、毎日、少なくとも１日１回（ＱＤ）、様々な実施形態では１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）またはさらには１日４回経口投与される。典型的には、治療有効１日量は、少なくとも約１ｍｇ、または少なくとも約１０ｍｇ、または少なくとも約１００ｍｇまたは約２００ｍｇ～約５００ｍｇ、時には化合物に応じて約１ｇ～約２．５ｇまでである。
投与は、本開示の方法にしたがって、カプセル剤、錠剤、経口懸濁剤、筋肉内注射用懸濁剤、静脈内注入用懸濁剤、局所適用用ゲル剤もしくはクリーム剤または関節内注射用懸濁剤を使用して達成され得る。
標準的な薬学的手順により、細胞培養または実験動物において、本明細書に記載される組成物の投与量、毒性および治療有効性を決定して、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い治療指標を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得るが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、それにより副作用を減少させるために、このような化合物を罹患組織部位に向ける送達系を設計するように注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための範囲の投与量の製剤化において使用され得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く伴わずにＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で異なり得る。前記方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて製剤化され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
いくつかの実施形態では、治療効果または予防効果を達成するために十分な組成物の有効量は、約０．０００００１ｍｇ／体重キログラム／投与～約１０，０００ｍｇ／体重キログラム／投与の範囲である。適切には、投与量は、約０．０００１ｍｇ／体重キログラム／投与～約１００ｍｇ／体重キログラム／投与の範囲である。投与は、初回用量、続いて１回またはそれを超える「追加」用量として提供され得る。追加用量は、初回用量の１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、１カ月後、２カ月後、３カ月後、６カ月後または１２カ月後に提供され得る。いくつかの実施形態では、追加用量は、前の投与に対する被験体の反応の評価後に投与される。
当業者は、限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、被験体の一般的健康および／もしくは年齢、ならびに／または存在する他の疾患を含む特定の要因が、被験体を有効に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響を与え得ることを認識する。また、治療有効量の本明細書に記載される治療用組成物による被験体の処置は、単一の処置または一連の処置を含み得る。一態様では、「処置」という用語は予防を除外する。
本開示の組成物および関連方法は、他の治療の投与と組み合わせて、またはこのような治療の非存在下で使用され得る。これらとしては、限定されないが、ＤＮａｓｅ酵素、抗生物質、抗菌薬または他の抗体の投与が挙げられる。一態様では、嚢胞性線維症に付随する微生物感染症およびバイオフィルムを処置するために、ポリペプチドは、ＤＮａｓｅ酵素と共に投与される。
いくつかの実施形態では、前記方法および組成物は、本開示の組成物と相乗的に作用するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素、例えばＤＮａｓｅを含む。ＤＮａｓｅは、ＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合の切断を触媒する任意の酵素である。十字構造だけではなく、ＤＮＡの様々な二次構造もまた標的とすることが公知のＤＮａｓｅ酵素の３つの非限定的な例としては、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ｔ４ Ｅｎｄｏ ＶＩＩおよびＴ７ Ｅｎｄｏ Ｉが挙げられる。特定の実施形態では、バイオフィルムを不安定化するために必要な抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の有効量は、ＤＮａｓｅと組み合わされた場合に低減される。インビトロで投与される場合、ＤＮａｓｅは、アッセイに直接添加され得るか、または酵素を安定化することが公知の適切なバッファー中に添加され得る。ＤＮａｓｅの有効単位用量およびアッセイ条件は様々であって良く、当技術分野で公知の手順にしたがって最適化され得る。
他の実施形態では、前記方法および組成物は、抗生物質および／または抗菌薬と組み合わされ得る。抗菌薬は、細菌、真菌または原虫などの微生物を死滅させるか、またはそれらの成長を阻害する物質である。バイオフィルムは、一般に、抗生物質の作用に対して耐性であるが、本明細書に記載される組成物および方法は、バイオフィルムを伴う感染症を、感染症を処置するための従来の治療方法に対して感受性にするために使用され得る。他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物と組み合わせた抗生物質または抗菌薬の使用は、抗菌薬および／またはバイオフィルム減少剤の有効量の低減を可能にする。本開示の方法と組み合わせて有用な抗菌薬および抗生物質のいくつかの非限定的な例としては、ミノサイクリン、アモキシシリン、アモキシシリン－クラブラン酸、セフジニル、アジスロマイシンおよびスルファメトキサゾール－トリメトプリムが挙げられる。バイオフィルム減少剤と組み合わされた抗菌薬および／または抗生物質の治療有効量は、従来の方法により容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、バイオフィルム減少剤と組み合わされた抗菌剤の用量は、他の細菌感染症、例えば、感染症の病因がバイオフィルムを含まない細菌感染症において有効であることが示されている平均有効用量である。他の実施形態では、用量は、平均有効用量の０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０または５倍である。抗生物質または抗菌薬は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の添加前に、それに併せてまたはその後に添加され得る。
他の実施形態では、前記方法および組成物は、細菌感染症を処置する抗体と組み合わされ得る。本明細書に記載される方法および組成物と組み合わせて有用な抗体の一例は、関連のない外膜タンパク質（例えば、ＯＭＰ Ｐ５）に対する抗体である。この抗体のみによる処置は、インビトロでバイオフィルムを減量しない。この抗体とバイオフィルム減少剤との併用療法は、同じ濃度で使用されるいずれかの試薬により達成され得るよりも大きな効果をもたらす。バイオフィルム減少剤またはバイオフィルムを減少させるための方法と組み合わされた場合に相乗効果を提供し得る他の抗体としては、抗ｒｓＰｉｌＡ、抗ＯＭＰ２６、抗ＯＭＰ Ｐ２および抗全ＯＭＰ調製物が挙げられる。
本明細書に記載される組成物および方法は、バイオフィルムを伴わない細菌感染症の処置において有効であるが、バイオフィルムが関与する細菌感染症の処置において別段有効でない一般的な治療モダリティに対して、バイオフィルムが関与する細菌感染症を感受性にするために使用され得る。他の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、バイオフィルムを伴う細菌感染症の処置において有効な治療モダリティと組み合わせて使用され得るが、このようなさらなる治療とバイオフィルム減少剤または方法との組み合わせは、バイオフィルム減少剤またはさらなる治療剤のいずれかの有効用量が低減され得るような相乗効果を生じさせる。他の場合では、このようなさらなる治療とバイオフィルム減少剤または方法との組み合わせは、処置が増強されるような相乗効果を生じさせる。処置の増強は、感染症を処置するために必要な時間の短縮により証明され得る。
さらなる治療的処置は、バイオフィルムを減少させるために使用される方法または組成物の前に、それに併せてまたはその後に添加され得、同じ製剤内にまたは別個の製剤として含められ得る。
キット
薬剤と、本明細書に記載されるインビトロおよびインビボ方法を実施するために必要な指示とを含有するキットも特許請求されている。したがって、本開示は、これらの方法を実施するためのキットであって、本開示の生物学的薬剤と、本開示の方法を行う（例えば、組織を収集し、および／またはスクリーニングを実施し、および／または結果を分析し、および／または有効量の本明細書で定義される生物学的薬剤を投与する）ための指示とを含み得るキットを提供する。これらは単独で、または他の適切な抗菌剤と組み合わせて使用され得る。
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドと、バイオフィルムの分解またはバイオフィルムを産生する微生物感染症の阻害、予防もしくは処置において使用するための指示とを含むキットを提供する。一実施形態では、キットは、アジュバント、抗原性ペプチドまたは抗菌薬の１つまたはそれよりも多くをさらに含む。さらに別の実施形態では、キットは、液体担体、薬学的に許容され得る担体、固相担体、薬学的に許容され得る担体、埋込物、ステント、ペースト、ゲル、歯科インプラントまたは医療用インプラントの群から選択される担体をさらに含む。
以下の例は本開示を例示するものであり、限定するものではない。
細菌バイオフィルム媒介性感染症は、すべての慢性／再発性ヒト感染症の約８０％に相当する。バイオフィルムは、微生物成長の保護様式を構成する。すなわち、それらは、表面に付着してそれら自体の合成の水和ポリマーマトリックスに埋め込まれた微生物群落から構成される。これらの固着性群落の形成は、抗菌剤および宿主防御を含む従来の処置モダリティに対してそれらを本質的に耐性にして、不利な環境における細菌生存を可能にする。バイオフィルム関連感染症は非常に蔓延しており、寄与死亡率および経済的負担の点で悪名高い結果に関連するので、新規治療アプローチが緊急に必要性となる。これに関して、本出願人は、難治性細菌バイオフィルム媒介性感染症の処置のための新たな免疫療法アプローチを開発した。この新たなアプローチは、バイオフィルム細胞外マトリックスで起こる核タンパク質相互作用に基づく。バイオフィルム細胞外マトリックスは、タンパク質、脂質、多糖および細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）の様々な混合物から構成されることが公知である。細菌バイオフィルムの構造的完全性に重要な細胞外マトリックスの重要な構成成分は、ｅＤＮＡおよび細菌ＤＮＡＢＩＩファミリーのタンパク質（ＩＨＦおよびＨＵ）である。ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、プレベンドＤＮＡ（pre-bend DNA）に対する高い親和性で二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に結合してそれを屈曲させる（図１）。形成されたバイオフィルムにはインターレースｅＤＮＡ鎖の広大なネットワークがあり、これが、ｅＤＮＡの屈曲交差鎖（bent crossed strand）の頂点に位置するＤＮＡＢＩＩタンパク質により安定化されることがインビボで示された。本明細書において、本出願人は、１つまたはそれを超えるＨＭＧボックスドメインを有する真核生物起源のポリペプチド、例えばＨＭＧＢ１が、バイオフィルム内の細胞外ＤＮＡ足場の構造に干渉し得ることを開示する。バイオフィルム中のＤＮＡ足場に結合する微生物タンパク質と競合することにより、これらのポリペプチドはバイオフィルムを不安定化し、宿主免疫系によるバイオフィルムの破壊および除去をもたらす（図２）。
ＨＭＧＢ１およびそのバリアントが、それらの細菌抗バイオフィルム治療潜在性について試験されるのは初めてであるので、この新たな治療アプローチは革新的である。また、最高の抗バイオフィルム、より低い抗炎症活性および最小のタンパク質断片サイズを有する最適なタンパク質断片を決定するために、異なる抗バイオフィルムおよび抗炎症特性を有するＨＭＧＢ１ドメインならびに変異バリアント、Ａボックス、Ｂボックス、ＣテールおよびＡ＋Ｂボックス（図３）を試験した。これに関して、このタンパク質断片は、過度な炎症の結果を伴わずに細菌バイオフィルム疾患を処置することができる。加えて、バイオフィルムからの細菌の放出は、これらの細菌を抗生物質媒介性殺滅に対してより感受性にするので、これは、ＨＭＧＢ１処置を潜在的に抗生物質のような従来の処置と組み合わせて使用し得、抗バイオフィルム有効性を増加させ、抗菌耐性の発生を減少させることを示すことになる。
インビトロバイオフィルムアッセイを使用して、樹立された細菌バイオフィルムに対するＨＭＧＢ１およびそのバリアントの効果を試験した。本出願人は、ヒト組換え全長ＨＭＧＢ１（ｒＨＭＧＢ１；１～２１５）、Ｃ４５Ｓ変異バリアント（ｍＨＭＧＢ１）ならびにＨＭＧＢ１ドメインＡボックス（１～８９）、Ａ＋Ｂボックス（１～１７６）、Ｂボックス（８０～１７９）およびＢボックスＣ１０６Ｓ（ｍＢボックス）を（大腸菌において）発現させ、９５％より高く精製した（図３）。すべての全長およびＨＭＧＢ１バリアントはＤＮＡ結合活性を保持していたが、これは、これらのドメインが適切にフォールディングされて機能的であったことを示していた（図４）。樹立された細菌バイオフィルムに対するＨＭＧＢ１およびそのバリアントならびに市販のネイティブウシＨＭＧＢ１（対照として使用）の効果を評価するために、２４時間の成長後、各タンパク質を予備形成Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバイオフィルムに添加した（２００ｎＭ）。１６時間のインキュベーション（４０時間の総バイオフィルム成長）の後、バイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）およびＣＯＭＳＴＡＴ分析を使用して分析して、バイオフィルムの平均厚さおよび総バイオマスを計算した。全長組換えＨＭＧＢ１は、Ｂボックスドメインを含有するすべての短縮ＨＭＧＢ１型と同様に、樹立されたＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバイオフィルムを有意に破壊することができた（図５）。この研究の結果は、これらの非抗菌化合物の単回投与が難治性バイオフィルムを破壊することができたという注目に値する観察につながる。加えて、ＨＭＧＢ１バリアントは、尿路病原性大腸菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、分類不能Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを含むこれまでに試験したあらゆる細菌種を破壊した（図６）。保護遮蔽物から細菌を放出させるこの濃度の単回投与により、細菌は抗生物質および免疫系によるクリアランスを受け易くなる。
ＨＭＧＢ１タンパク質およびそのバリアントのような非抗菌剤をバイオフィルム関連感染症の処置に使用する本出願人の新規アプローチは、古典的な治療概念からの根本的な脱却を象徴する。全長ＨＭＧＢ１と、最大破壊活性がインビトロで見出されたこれまでに試験した最小バリアントと、Ｂボックスと、位置１０６のシステインをセリンに変異させてその炎症誘導能力を無効化した改変Ｂボックス（ｍＢボックス）とを、バイオフィルム破壊および炎症活性についてインビボで試験した（図７）。凝集バイオフィルム感染肺モデルを利用して、本出願人は、ＨＭＧＢ１、Ｂボックスおよびそれぞれの改変バージョンがインビボでバイオフィルム形成を防止することができ、改変タンパク質が炎症反応を誘導しなかったことを示す（図７Ｂおよび図７Ｃ）。さらに、本出願人は、ＨＭＧＢ１バリアントがいずれも、バイオフィルムを破壊することができる投与用量で敗血症を誘発しなかったことを実証した（図７Ｄ）。
方法
実験番号１
院内感染の一般的な原因であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＫＰ）をすべてのＢＢ破壊アッセイに使用した。ヒト組換え全長ＨＭＧＢ１（ｒＨＭＧＢ１；１～２１５）、Ｃ４５Ｓ変異バリアント（ｍＨＭＧＢ１）ならびにＨＭＧＢ１ドメインＡボックス（１～８９）、Ｂボックス（９０～１７６）、ＡＢボックス（１～１７６）、Ｂ－リンカーボックス（８０～１７９）およびＢ－リンカーボックスＣ１０６Ｓを（大腸菌において）発現させ、９５％より高く精製した。樹立されたＢＢに対するｒＨＭＧＢ１および様々なドメインの効果を評価するために、２４時間の時点で、各タンパク質種（２００ｎＭ）を予備形成ＢＢに添加した。４０時間の時点で、ＢＢを洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡法により可視化し、ＣＯＭＳＴＡＴにより画像を分析して、平均厚さおよびバイオマスを計算した。
Ａボックスを除く外因性ｒＨＭＧＢ１およびその個々のドメインは、未処置ＫＰバイオフィルムと比較して、ＫＰバイオフィルムの平均厚さ（ＡＴ）およびバイオマス（ＢＭ）の有意な減少（ｐ＜０．０５）を引き起こした（それぞれｒＨＭＧＢ１、ｍＨＭＧＢ１、Ｂボックス、Ｂリンカーボックス、ＡＢボックスおよびＢリンカーボックスＣ１０６Ｓにより誘導された％減少 平均±ＳＥ、ＡＴでは：４４％±０．３３、７５％±０．０４、６３％±０．１、７７％±０．０３、６４％±０．０８、５４％±０．１５およびＢＭでは：６１％±０．０１、８０％±０．０１、６８％±０．０２、６７％±０．０１、７３％±０．０２、５６％±０．０２）。
実験番号２
ＨＭＧＢ１は病原性バイオフィルムを破壊する：細菌バイオフィルムに対するＨＭＧＢ１の効果を試験するために（図５）、本出願人は、タグ無しヒト組換えＨＭＧＢ１（ｒＨＭＧＢ１）と、還元型のＨＭＧＢ１を模倣する操作されたＣ４５Ｓバリアント（ｍＨＭＧＢ１）とをクローニングし（ＩＭＰＡＣＴ（登録商標），ＮＥＢ Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、（大腸菌において）発現させ、（ヘパリンセファロースクロマトグラフィーで９５％より高い純度に）精製した。ｒＨＭＧＢ１は、炎症促進性活性に寄与するＣ２３とＣ４５との間の分子内ジスルフィド結合を容易に形成するのに対して、ｍＨＭＧＢ１は形成することができない。（添加前に２４時間形成させた）樹立されたバイオフィルムを破壊する能力について、これらのＨＭＧＢ１アイソフォームを評価した。ｒＨＭＧＢ１の単回投与（２００ｎＭ；典型的な敗血症血清濃度よりも約２５倍高いが、敗血症を直接誘発することができない）への１６時間の曝露後、多種多様な優先度の高い種により形成されたバイオフィルムをＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）で染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）およびＣＯＭＳＴＡＴ分析を使用して分析し、対照バイオフィルムと比較した。本出願人は、各バイオフィルムの平均厚さおよびバイオマス（示さず）の有意な減少（Ｐ＜０．０５）を観察した（図５Ａ）。Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍおよびＳ．ａｕｒｅｕｓのみが、同様の結果を達成するために（非殺菌性であるが）より高い濃度を必要とした。仔ウシ胸腺から精製されたネイティブＨＭＧＢ１（ｎＨＭＧＢ１；Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）は、ｒＨＭＧＢ１と比較して選択バイオフィルム（ＵＰＥＣ、Ｂｃ、ＮＴＨＩ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を同等に破壊したことも示されたが（図５Ａ）、これは、ｎＨＭＧＢ１とｒＨＭＧＢ１との間の翻訳後修飾（ＰＴＭ）のいかなる潜在的な差異も、この抗バイオフィルム機能に有意な影響を与えなかったことを示していた。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析（ＭＳ Ｂｉｏｗｏｒｋｓ，ＬＬＣ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によるＰＴＭの予備分析は、ｒＨＭＧＢ１およびｎＨＭＧＢ１の両方の改変が最小であることを示した（観察されたペプチドの２０％未満が任意の所定のＰＴＭを有していた、図１Ｃ）。次第に高い濃度のｒＨＭＧＢ１（最大４００ｎＭ）は、ＵＰＥＣバイオフィルムを用量依存的に単層（平均厚さ約１μｍ；図５Ｂ）に破壊したが（すなわち、３Ｄバイオフィルム構造の完全な排除）、これは、宿主免疫エフェクターまたは他の抗菌化合物が根絶を遂行し得るようにバイオバーデンを減少させ得ることを示している。したがって、病原体の間で感受性の本質的な差異はあるが、試験した優先度の高い病原体のすべてにより形成されたバイオフィルムは、これらの非抗菌化合物の単回投与に対して感受性であった。
実験番号３
ＨＭＧＢ１ドメイン構造および抗バイオフィルム活性：次いで、本出願人は、１）Ａボックス、自己完結型ＤＮＡ結合ドメイン（残基１～８９）；２）Ａ－Ｂボックス構築物（Ｃテールを欠く；残基１～１８５）；および３）Ｂボックス（残基８０～１７６、図１Ａおよび１Ｃ）の組換えＨＭＧＢ１短縮バリアントを作り出した。樹立されたバイオフィルム（ＵＰＥＣ、Ｂｃ、ＮＴＨＩおよびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）へのＡボックスの添加は、測定されたバイオフィルムパラメータに対する有意な効果を有しなかった（図５Ｃ）。対照的に、Ａ－Ｂボックスおよび９７アミノ酸（ＡＡ）Ｂボックスは、完全な抗バイオフィルム活性を保持していた（図５Ｃ）。理論に縛られるものではないが、ＢボックスのみがＤＮＡ屈曲をモジュレートし得るので、ＨＭＧＢ１は、少なくとも部分的にＤＮＡ結合／屈曲を介してバイオフィルムを破壊すると仮定した。Ｂボックスは、残基Ｃ１０６に依存するＴＬＲ４－ＭＤ２との相互作用により主に媒介される炎症促進性活性を含有すると報告されているので、本出願人は、Ｃ１０６Ｓ変異を有する改変Ｂボックスバリアント（ｍＢボックス）を作製した（図１Ａおよび１Ｃ）。ｍＢボックスバリアントは、Ｂボックスと比較して、インビトロで細菌バイオフィルム（ＵＰＥＣ、ＮＴＨＩ、Ｂｃ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を同等に破壊した（図５Ｃ）。
実験番号４
ｒＨＭＧＢ１およびｍＨＭＧＢ１は、２つの異なる動物モデルにおいてバイオフィルムを破壊するが、炎症反応は、ＣｙｓからＳｅｒへの変異を用いて大きく減弱される。本出願人は、付着粘膜バイオフィルム形成が病因において重要な役割を果たすＮＴＨＩ４９、６７、６８による実験的ＯＭの十分に確立されたチンチラモデルを使用して、中耳感染症および対応する炎症反応を処置する能力について、ｒＨＭＧＢ１およびｍＨＭＧＢ１の両方を試験した（図８Ａ）。性別混合の非近交系成体チンチラの中耳に、経水泡注射（transbullar injection）により１０００ＣＦＵのＮＴＨＩを接種した。豊富なバイオフィルムが中耳腔に存在するチャレンジ後４および５日目に、５μｇ（０．２ｎｍｏｌ）のｒＨＭＧＢ１、ｍＨＭＧＢ１または希釈剤を中耳に直接送達した（合計２回の処置）。６日目に、動物を屠殺し、中耳をイメージングし、残ったバイオフィルム（図８Ａ）および粘膜炎症（図８Ｂ）について盲検的にスコア化した。希釈剤で処置した動物は、骨性中隔を覆い隠す厚い粘膜バイオフィルムを有していた（図８Ｃおよび８Ｄ）。全く対照的に、ｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１で処置した動物では、残存粘膜バイオフィルムは劇的に減少し、ＣＦＵの減少は約１０００倍であった（図８Ｅ）。インビトロでＮＴＨＩにより形成されたバイオフィルムは、試験した他の細菌種ほどＨＭＧＢ１添加に対して反応性ではなかったので、これらの結果は特に注目に値する（図５）。ｒＨＭＧＢ１処置動物から収集した中耳液（ＭＥＦ）は、ｍＨＭＧＢ１および希釈剤処置動物の両方と比較して増加した炎症促進性サイトカイン［ＩＬ－１β（３倍）、ＩＬ－１７Ａ（２倍）］を有していたが（データは示さず））、これは、ｒＨＭＧＢ１が中耳粘膜の目に見える炎症を増強したことと一致している（図８Ｃおよび８Ｆ）。対照的に、ｍＨＭＧＢ１処置動物由来のＭＥＦは、増加した抗炎症性サイトカイン［ＩＬ－４（２倍）、ＩＬ－１０（５倍）］を有していたが（データは示さず）、これは、粘膜炎症の減少に対応していた（図８Ｃおよび８Ｆ）。したがって、ｍＨＭＧＢ１は、インビボでＮＴＨＩバイオフィルムのクリアランスを効率的に促進し、炎症促進性シグナルをトリガーせずにそのように作用した。次に、本出願人は、ｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１がバイオフィルム発達を防止または凝集し得るかを決定した。防止の場合、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０７ＣＦＵのＢｃを気管内（ｉ．ｔ．）チャレンジし、０．２ｎｍｏｌのｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１を同時に添加した。１８時間後、マウスを安楽死させ、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）および肺を収集した。Ｂｃは、Ｂｃ抗体でプローブした肺切片において容易に目に見える凝集体を形成した（図７Ａ）。組織をホモジナイズし、ＣＦＵを数えた。ｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１を投与したマウスは、対照マウスと比較して、ＢＡＬ（図７Ｂ）および肺組織（データは示さず；Ｐ＜０．０５）において有意に少ないＢｃを含有していたが、これは、ＨＭＧＢ１がマウス気道におけるバイオフィルム形成を阻害し、このプロセスが細菌クリアランスを促進したことを示唆していた。ＢボックスおよびｍＢボックス誘導体による処置の予備的結果は、これらの９７ＡＡポリペプチドがインビボでバイオフィルム発達を阻害し（ＢＡＬ中のＣＦＵの減少、図７Ｂ）、Ｃ１０６Ｓ変異が炎症促進性活性を無効化する（Ｂボックスと比較して２倍の減少）（図７Ｃ）ことを示していた。次いで、この同じ動物モデルを使用して、ＢｃのチャレンジおよびｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１の投与の７２時間後に肺損傷を調査した。肺を収集し、組織を固定し、パラフィン包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。ｍＨＭＧＢ１で処置したマウス由来の肺は未感染マウス肺に酷似していたのに対して、ｒＨＭＧＢ１処置マウスでは、重度の炎症および好中球反応の増加が起こったが（図７Ｄ）、これは、ｍＨＭＧＢ１が、ｒＨＭＧＢ１の炎症促進性活性を伴わずに抗バイオフィルム活性を保持していたことを示している。次に、本出願人は、確立されたＢｃ感染症を処置するｒＨＭＧＢ１およびｍＨＭＧＢ１の能力を評価した。上記のようにマウスをチャレンジし、２４時間後に０．２ｎｍｏｌのｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１を投与した。処置の４８時間後、マウスを安楽死させ、ＢＡＬおよび肺を収集し、上記のように処理した。ｒＨＭＧＢ１またはｍＨＭＧＢ１で処置したマウスは、それらの肺において有意に少ないＢｃを有していたが（図７Ｅ）、ｍＨＭＧＢ１処置は、肺へのより少ない好中球および炎症性単球動員を誘導した（Ｐ＜０．０５、データは示さず）。まとめると、これらのデータは、ｍＨＭＧＢ１およびｍＢボックスが炎症反応を増強しなかったが、むしろ凝集バイオフィルム形成、細菌取り込みおよびクリアランスを阻害したことを示している。ｍＨＭＧＢ１の減少した炎症促進性活性をさらに検証するために、本出願人は、走化性のインビボモデルを使用して、好中球を動員する相対的能力を決定した７０，７１。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．２ｎｍｏｌのｍＨＭＧＢ１もしくはｒＨＭＧＢ１または１ｍｌの４％チオグリコレート（陽性対照；好中球動員の誘導物質）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。４時間後、マウスを安楽死させ、腹膜洗浄を実施した。細胞を抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１１ｂおよび抗Ｌｙ６Ｇ抗体で染色し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により全好中球を定量した。ｒＨＭＧＢ１は腹腔への好中球動員を誘導したのに対して、ｍＨＭＧＢ１は誘導しなかった（図７Ｆ）。
実験番号５
ＨＭＧＢ１バリアントは、バイオフィルム疾患を処置するために必要な用量で敗血症を誘発しない：ＣｙｓからＳｅｒへの変異を有するＨＭＧＢ１バリアント（ｍＨＭＧＢ１、ｍＢボックス）は、ＨＭＧＢ１およびＢボックスの単回投与で炎症促進性後遺症を誘発しなかったが、強力な抗バイオフィルム活性を依然として示したという事実にもかかわらず、本出願人は、ＨＭＧＢ１バリアントの投与が、ＬＰＳの存在下または非存在下で敗血症を誘発するかを厳密に調査した。本出願人は、ナイーブマウスまたは非致死用量のＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ）でプライミングしたマウスに、０．２ｎｍｏｌ（インビボバイオフィルムの処置で治療利益を示したのと同じ量）のエンドトキシンフリーｒＨＭＧＢ１、ＢボックスまたはｍＢボックス［高容量エンドトキシン除去樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ）で精製し、エンドトキシン定量（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）により、タンパク質１μｇ当たり３００ｐｇ未満のエンドトキシンを含有することを検証したもの］を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。敗血症の兆候についてマウスを２４時間モニタリングし、次いで、ＥＬＩＳＡにより、敗血症誘発の代用として血清ＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦ－α）レベルを測定した。研究エンドポイントの前に、安楽死を必要とする敗血症の兆候を示したマウスはいなかった。ＬＰＳは単独で１００ｐｇ／ｍｌを超えるＴＮＦを誘導したが、ｒＨＭＧＢ１、ＢボックスおよびｍＢボックスはそれ自体で検出可能なＴＮＦを誘導せず、ＬＰＳプライミングマウスに投与した場合に、さらなる炎症促進性シグナル伝達を誘導しなかった（図７Ｇ）。敗血症を誘発するためには、本発明者らの用量と比較して、リポ多糖（ＬＰＳ）プライミングマウス２０で４０時間に、Ｂボックス単独の場合には４５０倍を超える量を、または２倍を超える量のｒＨＭＧＢ１の４用量を必要とすることが報告されている。加えて、上記のようにインビトロで抗バイオフィルム活性についてこれらのエンドトキシンフリーポリペプチドを試験したところ、ＵＰＥＣおよびＢｃバイオフィルムに対して完全な機能を維持することが見出された（データは示さず）。したがって、本明細書で試験したバリアントは、強力な治療用量で敗血症を誘発しない。
実験番号６
ＨＭＧＢ１によるバイオフィルム破壊は、放出された細菌を抗生物質に対して感受性にする。上記のようにＢｃバイオフィルムに、２００ｎＭ ＨＭＧＢ１、１μｇ／ｍｌミノサイクリン、またはその両方を添加した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色の使用は相乗的な細菌殺滅を明らかにしたが（図９）、これは、ＨＭＧＢ１処置を併用療法で使用して、抗菌有効性を増加させ、抗菌耐性の発生を減少させ得ることを示している。
実験番号７
ＨＭＧＢ１およびＤＮＡＢＩＩタンパク質（複数可）は、インビボで形成されたバイオフィルム内に存在する：本出願人は、ＯＭの実験的モデルにおいてＮＴＨＩにより形成されたバイオフィルムでは、細菌ＤＮＡＢＩＩタンパク質がｅＤＮＡの交差鎖の頂点に位置することを以前に示した。インビボで形成されたＮＴＨＩバイオフィルム内のＨＭＧＢ１の相対的存在および空間分布を決定するために、チンチラ中耳から回収した未固定バイオフィルムをＨＭＧＢ１およびＤＮＡＢＩＩ抗体の両方でプローブした。ｅＤＮＡをＤＡＰＩ（白色）で染色した。ＨＭＧＢ１は、ｄｓＤＮＡ鎖の長さに沿って明確な周期性で標識されており、ｅＤＮＡの交差鎖で（予想通り）検出された標識ＤＮＡＢＩＩタンパク質に近接しているが、共局在していない（図１０Ａ）。特に、ＨＭＧＢ１は頂点で観察されなかった。これらのデータは、ＨＭＧＢ１がＥＰＳ内で組み込まれ得るが、同時に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質と同じｅＤＮＡ部位（頂点）を共占有しないことを示唆しており、これは、ＨＭＧＢ１が、ｅＤＮＡ頂点でＤＮＡＢＩＩタンパク質と競合してＥＰＳを不安定化するという仮説を裏付けている。これらのデータはまた、ＤＮＡＢＩＩおよびＨＭＧＢ１タンパク質が共局在しないので生産的に相互作用しないことを示唆しており、さらに、ＨＭＧＢ１が、ＤＮＡ結合／屈曲を介してのみ機能する可能性があることを示している。
実験番号８
ＨＭＧＢ１は、臨床検体に存在するバイオフィルムを破壊する：慢性疾患部位（例えば、ＣＦ肺）のバイオフィルムは複数の種からなり、本質的に根絶が困難である。抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、ＣＦ痰に存在するバイオフィルムを破壊することが示されている。１ Ｍ Ｂボックスを含有する３７℃で２時間インキュベートしたＰＢＳ中ＣＦ痰の懸濁液は、高濃度のＰｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）（ＣＦ患者において粘液溶解薬として使用される治療用ＤＮａｓｅ）または抗ＤＮＡＢＩＩの添加と同程度に有効に痰を破壊した（図１０Ｂ）。これらのデータは、慢性感染部位で形成されたバイオフィルムが、ＨＭＧＢ１に対して感受性の保存されたｅＤＮＡ依存性アーキテクチャを有することを示しており、ＨＭＧＢ１がバイオフィルムに対する宿主防御であることを立証している。
実験番号９
多くの口腔細菌（例えば、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は、歯槽骨および歯肉を破壊する炎症性疾患、例えば歯周炎およびインプラント周囲炎の病因に関与している。これらの細菌の病因の調査は、有効な動物モデルの欠如により妨げられている。特定の細菌の病原性を調査する課題の１つは、外因性細菌が動物の口腔に入った場合のバイオフィルムを樹立することの困難性である。歯周炎の動物モデルが開発されているが、培養可能な細菌は、接種動物の口腔からほとんど回収されない。特定の細菌の病原性を評価し得る有効な動物モデルの開発は、それらの病原性機構の解明において非常に有用である。この実施例は、口腔疾患の処置において、開示されるポリペプチドおよび組成物ならびにそれらの効果を試験するためのモデルを提供する。
ＡｌＯ３（１００μｍ）およびＨＣｌエッチング（ｐＨ７．８、８０℃で２０分間）を用いてグリットブラストにより、機械加工チタン製歯科インプラント（１．２×４．５ｍｍ）の表面を改変する。Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａａ）のＤ７Ｓ臨床株を接種したＴＳＢ培地中で、機械加工およびナノ加工インプラントを３７℃で１～３日間インキュベートした。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）で染色した後、ＳＥＭおよび共焦点レーザー走査顕微鏡法により、インプラント上の細菌バイオフィルムを分析する。Ａａバイオフィルムの樹立の有無にかかわらず、インプラントを上顎骨の小臼歯と切歯領域との間で雌ラットの歯槽骨に経粘膜的に配置する。インビボで配置したインプラント上のＡａバイオフィルムの存在を検出するために、２日後に、唾液およびインプラントの口腔表面から細菌サンプルを収集する。培養およびＰＣＲ分析により、Ａａを検出し得る。埋め込みの６週間後に、インプラント周囲の骨および粘膜組織のマイクロＣＴおよび組織学的分析を実施し得る。本明細書に記載されるようにポリペプチドおよび組成物を表面に付着させ、バイオフィルムおよび細菌成長をアッセイする。
実験番号１０
この実験は、ライム病を処置するための干渉剤の前臨床試験のためのマウスモデルを提供する。Ｄｒｅｓｓｅｒら、Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ５（１２）ｅ１０００６８０，Ｅｐｕｂ ２００９ Ｄｅｃ．４．を参照のこと。ライム病は、米国で最も一般的なダニ媒介性疾患である。定義によれば、人口が都市から郊外および農村地域に移動し続け、（マダニ種Ｉｘｏｄｅｓを運ぶ）オジロジカがこれらの地域をますますうろつくにつれて、これらの流行地域は拡大している。ライム病は、スピロヘータである微生物Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにより引き起こされる。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉは、Ｉｘｏｄｅｓダニの咬傷を介して伝染し、続いて、血流を介して他の組織および器官に感染する。
この動物モデルでは、背側皮下および腹腔内注射を介して、または静脈内注射を介して、スピロヘータをＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスに注射する。感染のおよそ７日後に、微生物負荷の評価ならびに組織および器官における病理の評価のために、血液および生検標本を回収する。本発明の方法および組成物は、生じたＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉバイオフィルム（これは、チャレンジ後に形成し、疾患の病因および慢性的性質の両方に寄与すると考えられる）の減少および／または排除のための治療的および予防的戦略の両方を開発することが企図される。
実験番号１１
この実験は、嚢胞性線維症を処置するための開示される（desdones）ポリペプチドおよび組成物の前臨床試験のためのブタモデルを提供する。Ｓｔｏｌｔｚら、（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（２９）：２９ｒａ３１を参照のこと。嚢胞性線維症は、ＣＦ膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲと称される）アニオンチャネルをコードする遺伝子の変異による常染色体劣性疾患である。このモデルでは、「ＣＦＴＲ」と称される遺伝子の欠陥を保有するように特別に飼育されているＣＦブタと称されるブタは、複数の細菌種による下気道の感染症を含むＣＦ肺疾患の特徴を自然発生的に発症する。疾患の兆候および関連病状の改善を評価するために、噴霧により組成物をブタに投与して、ポリペプチドをこれらの動物の肺に送達し得る。
実験番号１２
出願人はまた、結核（ＴＢ）の前臨床モデルも提供する。Ｏｒｄｗａｙら、（２０１０）Ａｎｔｉ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５４：１８２０を参照のこと。この動物モデルでは、バリアコロニーでＳＰＦモルモットを維持し、エアロゾルスプレーを介して感染させて、約２０ｃｆｕのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株Ｅｒｄｍａｎ Ｋ０１桿菌をそれらの肺に送達する。チャレンジ後２５、５０、７５、１００、１２５および１５０日目に、動物を屠殺し、組織病理学的評価のために細菌ロードを決定し、組織を回収する。ＴＢの古典的な兆候を発症しないマウスとは異なり、このようにチャレンジしたモルモットは、ヒト疾患の特徴である中枢性壊死を伴う十分に組織化された肉芽腫を発症する。さらに、ヒトと同様に、モルモットは、原発巣複合体の一部として、流入領域リンパ節の重度の化膿性肉芽腫性および壊死性リンパ節炎を発症する。このモデルの使用は、生じたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓバイオフィルム（これは、チャレンジ後にこれらの動物の肺に形成することが観察されており、疾患の病因および慢性化の両方に寄与すると考えられる）の減少および／または排除のための治療的および予防的戦略を確認および特定するための前臨床スクリーニングを提供する。
実験番号１３
カテーテル／留置器具バイオフィルム感染症の複数の動物モデルが公知である。Ｏｔｔｏ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７：５５５を参照のこと。典型的には、正常皮膚フローラと考えられるが、微生物Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、多くが重要な日和見病原体とみなすものになっており、院内感染の原因となる因子の中で第１位にランク付けされている。主に、この細菌は、デバイス挿入中にこの一般的な皮膚生着菌（ｓｋｉｎ ｃｏｌｏｎｉｚｅｒ）により汚染された留置医療デバイスで発生する感染症の大部分の原因である。典型的には生命を脅かすものではないが、これらのバイオフィルム感染症の処置に関連する困難性は、それらの頻度と相まって、それらを深刻な公衆衛生負担にする。ウサギ、マウス、モルモットおよびラットを含むカテーテル関連Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染症のいくつかの動物モデルがあり、これらはすべて、病因の分子機構を研究するために使用されており、予防および／または治療の研究に役立っている。ラット頸静脈カテーテルは、Ｅ．Ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルム形成を妨げる治療法を評価するために使用されている。バイオフィルムの減少は、３つの方法で測定されることが多い－（ｉ）カテーテルを超音波処理し、ＣＦＵを計算するか、（ｉｉ）カテーテルの一部を切断するか、もしくは単にプレート上に置いてスコア化するか、または（ｉｉｉ）クリスタルバイオレットまたは別の色素でバイオフィルムを染色し、溶出させ、ＣＦＵの代用としてＯＤを測定し得る。
結論
全長組換えＨＭＧＢ１は、Ｂボックスドメインを含有するすべての短縮ＨＭＧＢ１型と同様に、樹立されたバイオフィルムを有意に破壊することができた。
均等物
特に定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本技術が属する技術分野における当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書に例示的に記載される技術は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数のエレメント、１つまたは複数の制限するものの非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、限定的ではなく発展的に読まれるものとする。加えて、本明細書で用いられる用語および表現は、限定ではなく説明の観点から使用されており、示されて記載されている特徴またはその部分の任意の均等物を除外するこのような用語および表現の使用を意図するものではなく、様々な改変が、特許請求の範囲に記載されている本技術の範囲内で可能であると認識される。
したがって、本明細書で提供される材料、方法および例は、好ましい態様の代表的なものであり、例示的であり、本技術の範囲に対する限定として意図されないことを理解すべきである。
本技術は、本明細書で広範かつ一般的に記載されている。一般的な開示内に入るより狭い種および亜属分類もまたそれぞれ、本技術の一部を形成する。これは、除外される材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を除く条件付きまたは否定的制限を伴う本技術の一般的な説明を含む。
加えて、本技術の特徴または態様がマーカッシュグループの観点から記載されている場合、当業者は、本技術がまた、それにより、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点から記載されることを認識する。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それぞれが参照により個々に組み込まれるのと同程度に、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾の場合には、定義を含む本明細書が優先する。
他の態様は、以下の特許請求の範囲内に記載されている。
配列表
配列番号１および２－野生型ＨＭＧＢ１（マウスおよびヒト）
Figure 2022504139000007
 （ヒト、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＥ４８２６２．１から複製）
ＨＭＧＢ１は、３つのドメイン（それぞれが８０アミノ酸から構成される２つの正荷電のドメインＡおよびＢボックス、ならびにおよそ３０個の連続アスパラギン酸およびグルタミン酸残基からなる負荷電カルボシル末端の酸性Ｃテール）から構成される２１５アミノ酸タンパク質（約３０Ｋｄａ）の小さなタンパク質である。
太字のアミノ酸（アミノ酸１～７０）はＡボックスドメインを示す。
斜体のアミノ酸（約アミノ酸８８～１６４）はＢボックスドメインを示す。
下線付きのアミノ酸（アミノ酸１８６～２１５）はＣテールドメインを示す。
ＨＭＧＢ１の変異バージョンは、アミノ酸置換と共に図１および図３に示されている。
配列番号３および４
野生型マウスＨＭＧＢ１ Ｂボックス：ＭＷ＝９７３５．２；８７ａａ
Figure 2022504139000008
 野生型ヒトＨＭＧＢ１ Ｂボックス：８７ａａ
Figure 2022504139000009
 配列番号５および６
マウス変異ＨＭＧＢ１ Ｂボックス：ＭＷ＝９７３５．２；８７ａａ
Figure 2022504139000010
 ヒト変異ＨＭＧＢ１ Ｂボックス：８７ａａ
Figure 2022504139000011
 システイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）に変異させている（太字の文字）。
配列番号７および８
野生型マウスＨＭＧＢ１ Ａ＋Ｂボックス：ＭＷ＝２０２６１．４２；１７６ａａ
Figure 2022504139000012
 野生型ヒトＨＭＧＢ１ Ａ＋Ｂボックス：１７６ａａ
Figure 2022504139000013
 システイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）に変異させている（太字の文字）。
配列番号９および１０
野生型マウスＨＭＧＢ１ Ｂボックス＋Ｎリンカー（下線付き）：ＭＷ＝１０８７６．６；９７ａａ
Figure 2022504139000014
 野生型ヒトＨＭＧＢ１ Ｂボックス＋Ｎリンカー（下線付き）：９７ａａ
Figure 2022504139000015
 配列番号１１および１２
変異ＨＭＧＢ１ Ｂボックス＋Ｎリンカー（下線付き）：ＭＷ＝１０８７６．６；９７ａａ
Figure 2022504139000016
 ヒトＨＭＧＢ１ Ｂボックス＋Ｎリンカー（下線付き）：９７ａａ
Figure 2022504139000017

Claims (35)

  1. Ｃ１０６もしくはＫ１１４におけるアミノ酸変異を必要に応じて含む単離されたＢボックスポリペプチド、またはＣ１０６もしくはＫ１１４におけるアミノ酸変異を含むその同等物。
  2. Ｃ１０６におけるアミノ酸変異を含む請求項１に記載の単離されたＢボックスポリペプチド、またはＣ１０６におけるアミノ酸変異を含むその同等物。
  3. アミノ酸変異Ｃ１０６Ｓを含む請求項１もしくは２に記載の単離されたＢボックスポリペプチド、またはアミノ酸変異Ｃ１０６Ｓを含むその同等物。
  4. Ｋ１２、Ｃ２３もしくはＣ４５から選択されるアミノ酸位置における１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異を必要に応じて含む単離されたＡボックスポリペプチド、またはＫ１２、Ｃ２３もしくはＣ４５から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸変異を含むその同等物。
  5. Ｋ１２、Ｃ２３、Ｃ４５、Ｋ１１４もしくはＣ１０６から選択されるアミノ酸位置における１つもしくはそれを超えるアミノ酸変異を必要に応じて含む単離されたＡＢボックスポリペプチド、またはＫ１２、Ｃ２３、Ｃ４５、Ｋ１１４もしくはＣ１０６から選択される位置におけるアミノ酸変異を含むその同等物。
  6. アミノ酸Ｃ１０６におけるアミノ酸変異を含む請求項５に記載の単離されたＡＢボックスポリペプチド、またはアミノ酸Ｃ１０６におけるアミノ酸変異を含むその同等物。
  7. アミノ酸変異Ｃ１０６Ｓを含む請求項５もしくは６に記載の単離されたＡＢボックスポリペプチド、またはアミノ酸変異Ｃ１０６Ｓを含むその同等物。
  8. 前記ポリペプチドのＮもしくはＣ末端に位置するリンカーポリペプチド、または前記ＮおよびＣ末端に位置するリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
  9. 前記Ａボックスポリペプチドおよび前記Ｂボックスポリペプチドを連結するリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項５～８のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
  10. 検出可能な標識をさらに含む、請求項１～９のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
  11. 請求項１～９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドを認識してそれに結合する抗体、または前記抗体のその抗原結合断片。
  12. 担体と、１つまたはそれを超える請求項１～９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドとを含む、組成物。
  13. 担体と、請求項１１に記載の抗体または抗原結合断片とを含む、組成物。
  14. 前記担体が薬学的に許容され得る担体である、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. 請求項１～９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドの相補体。
  16. 請求項１１に記載の抗体もしくは抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドの相補体。
  17. プロモーターおよび／またはエンハンサーに機能的に連結された、請求項１５または１６に記載のポリヌクレオチド。
  18. 検出可能な標識をさらに含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  19. 請求項１５～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  20. プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項１９に記載のベクター。
  21. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１１に記載の抗体もしくは抗原結合断片、請求項１５～１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９もしくは２０に記載のベクターの１つまたはそれよりも多く（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）を含む、単離された宿主細胞。
  22. 請求項２１に記載の宿主細胞と担体とを含む、組成物。
  23. 前記担体が薬学的に許容され得る担体である、請求項２２に記載の組成物。
  24. 微生物ＤＮＡへのＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質の結合を阻害、競合または滴定するための方法であって、前記ＤＮＡＢＩＩポリペプチドもしくはタンパク質または前記微生物ＤＮＡを請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させ、それにより、前記微生物ＤＮＡへの前記ＤＮＡＢＩＩタンパク質またはポリペプチドの結合を阻害、競合または滴定することを含む、方法。
  25. 微生物バイオフィルムを阻害、防止または破壊するための方法であって、前記バイオフィルムを請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させ、それにより、前記微生物バイオフィルムを阻害、防止または破壊することを含む、方法。
  26. 被験体におけるバイオフィルムを阻害、防止または破壊する方法であって、前記被験体に、有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与し、それにより、前記微生物バイオフィルムを阻害、防止または破壊することを含む、方法。
  27. 被験体においてバイオフィルムを産生する微生物感染症を阻害、防止または処置するための方法であって、前記被験体に、有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与し、それにより、前記被験体において前記バイオフィルムを産生する微生物感染症を阻害、防止または処置することを含む、方法。
  28. 炎症反応を増強も誘導もせずにバイオフィルムを破壊することおよびクリアランスするための方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の請求項１～３または５～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与し、それにより、炎症反応を増強も誘導もせずにバイオフィルムを破壊することおよびクリアランスすることを含む、方法。
  29. バイオフィルムの存在に付随する感染症または障害の処置を必要とする被験体におけるバイオフィルムの存在に付随する感染症または障害を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与し、それにより、前記バイオフィルムの存在に付随する感染症または障害を処置することを含む、方法。
  30. 前記バイオフィルムが、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍｅｓ、ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（分類不能）（ＮＴＨＩ）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＥＳＫＡＰＥ病原体の群より選択される生物により産生される、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記被験体が哺乳動物である、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ヒトが乳児または若年者である、請求項３２に記載の方法。
  34. さらなる薬剤、必要に応じて抗菌薬を投与することをさらに含む、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド、請求項１１に記載の抗体または請求項１５～１８に記載のポリヌクレオチドの１つまたはそれよりも多くと、使用のための指示とを含む、キット。
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