JP2022503675A - 抗ヒト心筋トロポニンiの抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2018年10月10日に中国特許局に提出した、中国特許出願第201811183025.4号で、名称が「抗ヒト心筋トロポニンIの抗体及びその使用」である中国特許出願の優先権を主張する。この中国特許出願の全文を本願に引用している。
相補性決定領域CDR-VH1はA-S-X1-Y-T-F-X2-X3-Y-W-M-Yであり、ここで、
X1がG又はDであり、X2がS又はTであり、X3がT又はSであり、
相補性決定領域CDR-VH2はY-X1-N-P-S-X2-G-H-T-X3-Y-N-Q-X4-F-K-Dであり、ここで、
X1がI又はLであり、X2がS又はTであり、X3がD又はEであり、X4がR又はKであり、
相補性決定領域CDR-VH3はA-R-X1-Y-X2-G-P-F-X3-M-Dであり、ここで、
X1がK又はRであり、X2がF、Y又はWであり、X3がG又はAであり、
相補性決定領域CDR-VL1はS-A-S-X1-X2-V-S-Y-X3-Hであり、ここで、
X1がS又はTであり、X2がT又はSであり、X3がA又はVであり、
相補性決定領域CDR-VL2はW-X1-Y-D-X2-S-K-X3-A-Sであり、ここで、
X1がI又はLであり、X2がT又はSであり、X3がL又はIであり、
相補性決定領域CDR-VL3はQ-X1-W-S-X2-X3-P-Y-Tであり、ここで、
X1がQ又はNであり、X2がT又はSであり、X3がQ又はNである。
1つの重要な利点は、前記結合タンパク質の活性が高く、ヒトのcTnIと非常に高い親和性を有することである。
前記相補性決定領域CDR-VH1では、X1がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VH2では、X3がDであり、
前記相補性決定領域CDR-VH3では、X3がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VL1では、X3がVであり、
前記相補性決定領域CDR-VL2では、X2がTであり、
前記相補性決定領域CDR-VL3では、X1がQである。
軽鎖定常領域の配列はSEQ ID NO:9で示され、
重鎖定常領域の配列はSEQ ID NO:10で示される。
本開示は、上記結合タンパク質をコードする分離される核酸をさらに提供する。
本開示は、上記核酸を含むベクターをさらに提供する。
本開示は、上記核酸又はベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
本開示は、
テストサンプル中のトロポニンI抗原の検出方法であって、
a)十分に抗体/抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のトロポニンI抗原を請求項に記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと、
b)前記テストサンプル中の前記トロポニンI抗原の存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む、検出方法にさらに関する。
A)十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを本開示に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
B)結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、心筋トロポニンIに関連する疾病の存在を指示する、心筋トロポニンIに関連する疾病の診断方法にさらに関する。
本開示をより容易に理解するために、選択される用語を以下に定義する。
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
相補性決定領域CDR-VH1はA-S-X1-Y-T-F-X2-X3-Y-W-M-Yであり、ここで、
X1がG又はDであり、X2がS又はTであり、X3がT又はSであり、
相補性決定領域CDR-VH2はY-X1-N-P-S-X2-G-H-T-X3-Y-N-Q-X4-F-K-Dであり、ここで、
X1がI又はLであり、X2がS又はTであり、X3がD又はEであり、X4がR又はKであり、
相補性決定領域CDR-VH3はA-R-X1-Y-X2-G-P-F-X3-M-Dであり、ここで、
X1がK又はRであり、X2がFであり、Y又はWであり、X3がG又はAであり、
相補性決定領域CDR-VL1はS-A-S-X1-X2-V-S-Y-X3-Hであり、ここで、
X1がS又はTであり、X2がT又はSであり、X3がA又はVであり、
相補性決定領域CDR-VL2はW-X1-Y-D-X2-S-K-X3-A-Sであり、ここで、
X1がI又はLであり、X2がT又はSであり、X3がL又はIであり、
相補性決定領域CDR-VL3はQ-X1-W-S-X2-X3-P-Y-Tであり、ここで、
X1がQ又はNであり、X2がT又はSであり、X3がQ又はNである。
前記相補性決定領域CDR-VH1では、X1がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VH2では、X3がDであり、
前記相補性決定領域CDR-VH3では、X3がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VL1では、X3がVであり、
前記相補性決定領域CDR-VL2では、X2がTであり、
前記相補性決定領域CDR-VL3では、X1がQである。
軽鎖定常領域の配列は、SEQ ID NO:9で示され、
重鎖定常領域の配列は、SEQ ID NO:10で示される。
培地において上記宿主細胞を培養し、生じた結合タンパク質を培地又は培養された宿主細胞から回収するステップを含む、上記結合タンパク質の生産方法をさらに提供する。
テストサンプル中のトロポニンI抗原の検出方法であって、
a)十分に抗体/抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のトロポニンI抗原を請求項に記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと、
b)前記テストサンプル中の前記トロポニンI抗原の存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む、検出方法にさらに関し、
この実施形態では、信号強度を示す指示薬で前記結合タンパク質を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
この実施形態では、前記結合タンパク質は、第1の抗体の形態で前記第2の抗体とペア抗体を形成し、cTnIの異なる抗原エピトープに結合するために用いられ、
信号強度を示す指示薬で前記第2の抗体を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
この実施形態では、前記結合タンパク質が前記第2の抗体の抗原とされており、信号強度を示す指示薬で前記の第2の抗体を標識することができ、前記複合体を容易に検出するようにする。
A)十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを本開示に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
B)結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、心筋トロポニンIに関連する疾病の存在を指示する、心筋トロポニンIに関連する疾病の診断方法にさらに関する。
本実施例では、制限エンドヌクレアーゼ、Prime Star DNAポリメラーゼは、Takara社から購入された。MagExtractor-RNA抽出キットは、TOYOBO社から購入された。SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kitキットは、Takara社から購入された。pMD-18Tベクターは、Takara社から購入された。プラスミド抽出キットは、天根公司から購入された。プライマー合成及び遺伝子の配列測定は、Invitrogen社で完了された。Anti-cTnI 7B9モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株は、本出願者が有するハイブリドーマ細胞株であり、復活された。
重鎖及び軽鎖5’RACEプライマーの増幅:
SMARTER II Aオリゴヌクレオチド:
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX-3’、
5’-RACE CDSプライマー(5’-CDS):5’-(T)25VN-3’(N=A、C、G、又はT、V=A、G、又はC)、
ユニバーサルプライマーA混合物(UPM):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’、
ネステッドユニバーサルプライマーA(NUP):5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’、
mIg-KR:5’-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT-3’、
mIg-HR:5’-TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC-3’。
Anti-cTnI 7B9モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からRNAを抽出し、SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kitキット及びキットにおけるSMARTER II Aオリゴヌクレオチド及び5’-CDSプライマーで第一鎖cDNAの合成を行い、取得された第一鎖cDNA産物をPCR増幅テンプレートとした。軽鎖遺伝子をユニバーサルプライマーA混合物(UPM)、ネステッドユニバーサルプライマーA(NUP)及びmIg-KRプライマーで増幅させ、重鎖遺伝子をユニバーサルプライマーA混合物(UPM)、ネステッドユニバーサルプライマーA(NUP)及びmIg-HRプライマーで増幅させた。軽鎖のプライマーペアにより0.7KBほどの目的バンドを増幅し出し、重鎖のプライマーペアにより1.4KBほどの目的バンドを増幅し出した。アガロースゲル電気泳動で精製回収し、産物をrTaq DNAポリメラーゼでA付加反応(Aを付加する反応)を行ってpMD-18Tベクターに挿入し、DH5αコンピテント細胞に形質転換し、コロニが成長した後、それぞれ重鎖及び軽鎖遺伝子クローンの4つのクローンをInvitrogen社に送って序列測定を行った。
上記序列測定して得られた遺伝子配列をIMGT抗体データベースに入れて分析し、VNTI11.5ソフトウェアを利用して分析して、重鎖及び軽鎖プライマーペアの増幅した遺伝子が全て正確であると決定し、ここで、軽鎖の増幅した遺伝子断片では、VL遺伝子配列は321bpであり、VkII遺伝子ファミリに属し、その前に57bpのリーダーペプチド配列があり、重鎖プライマーペアの増幅した遺伝子断片では、VH遺伝子配列は357bpであり、VH1遺伝子ファミリに属し、その前に57bpのリーダーペプチド配列があった。
pcDNATM 3.4 TOPO(登録商標)ベクターは、構築された組換え抗体の真核発現ベクターであり、該発現ベクターは、HindIII、BamHI、EcoRIなどのポリクローナル酵素切断部位が導入されており、pcDNA 3.4A発現ベクターとして命名され、以下、3.4A発現ベクターと略称される。上記pMD-18Tにおける抗体遺伝子の配列決定結果に基づき、Anti-cTnI 7B9抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子特異性プライマーを設計し、プライマーの両端にそれぞれHindIII、EcoRI酵素切断部位及び保護塩基を持ち、プライマーは、以下のとおりであった。
cTnI-7B9-HR:5’-CCCGAATTCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGGC-3’、
cTnI-7B9-LF:5’-CCCAAGCTTATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGG-3’、
cTnI-7B9-LR:5’-CCCGAATTCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAA-3’。
5.1 プラスミドを超純水で400ng/mlに希釈し、遠心チューブにおいてCHO細胞を1.43×107cells/mlに調整し、100μlのプラスミドを700μlの細胞と混合し、電気的形質転換用カップに移し、電気的形質転換を行い、3日目、5日目、7日目にサンプリングして計数し、7日目にサンプリングして検出した。
Buffer 50μl、DNA 100μg/チューブ、Puv I酵素 10μlという試薬を用意し、無菌水で500μlに補充し、37℃で一晩水浴しながら酵素切断し、まず等体積のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(下層)25:24:1で抽出し、次にクロロホルム(水相)で抽出し、0.1倍の体積(水相)の3M酢酸ナトリウム及び2倍の体積のエタノールで氷において沈殿させ、70%のエタノールで沈殿を洗浄し、有機溶剤を除去し、エタノールが完全に揮発した後に、適量の滅菌水で再び溶かし、最後に濃度を測定した。
6.1 細胞の拡大培養
細胞を復活させた後に、まず125ml仕様の振とうフラスコにおいて培養し、接種体積が30mlであり、培地が100%のDynamis培地であり、回転数が120r/minで、温度が37℃で、二酸化炭素が8%である揺とう器に置いた。72h培養し、50万cells/mlの接種密度で接種して拡大培養を行い、拡大培養体積を生産需要に応じて計算し、培地が100%のDynamis培地であった。次に72hおきに1回拡大培養した。細胞量が生産ニーズを満たすとき、接種密度を50万cells/mlほどに厳密に制御して生産した。
振とうフラスコパラメータは、回転数120r/min、温度37℃、二酸化炭素8%であった。材料の流加供給:振とうフラスコにおいて72h培養してから、毎日に供給し、HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7aは、毎日に初期培養体積の3%を流加し、Feed 7bの毎日の流加量は、初期培養体積の千分の一であり、12日目まで補充した(12日目に供給した)。グルコース3g/Lを6日目に供給した。13日目にサンプリングした。proteinA親和クロマトグラフィーカラムで親和精製を行った。精製後に500mgの組換え抗体を獲得し、4μgの精製された抗体に対して還元性SDS-PAGEを行った。還元性SDS-PAGE後に2本のバンドが示され、一方が25KDほどの軽鎖(配列は、SEQ ID NO:11で示される)であり、他方が50KDほどの重鎖(配列は、SEQ ID NO:12で示される)である。
実施例1で得られたサンプル1の抗体(配列がSEQ ID NO:11及び12で示される軽鎖及び重鎖を有する)は、cTnIタンパク質に結合する能力を有するが、親和性及び抗体活性がいずれも十分に理想的ではないため、出願者は、該抗体の軽鎖CDR及び重鎖CDRに対して突然変異を行った。
CDR-VH1はA-S-D(X1)-Y-T-F-S(X2)-T(X3)-Y-W-M-Yであり、
CDR-VH2はY-L(X1)-N-P-S-S(X2)-G-H-T-E(X3)-Y-N-Q-R(X4)-F-K-Dであり、
CDR-VH3はA-R-K(X1)-Y-F(X2)-G-P-F-A(X3)-M-Dであり、
軽鎖の相補性決定領域:
CDR-VL1はS-A-S-T(X1)-T(X2)-V-S-Y-A(X3)-Hであり、
CDR-VL2はW-L(X1)-Y-D-S(X2)-S-K-I(X3)-A-Sであり、
CDR-VL3はQ-N(X1)-W-S-T(X2)-Q(X3)-P-Y-Tであり、
ここで、X1、X2、X3、X4がいずれも突然変異部位であった。
AMCセンサを利用して、精製された抗体をPBSTにて10μg/mlに希釈し、また、cTnIコントロール遺伝子組換えタンパク質(会社調製の組換え抗原)を、PBSTにて、769.2nmol/ml、384.6nmol/ml、192.3nmol/ml、96.2nmol/ml、48.1nmol/ml、24nmol/ml、12nmol/ml、0nmol/mlという風に段階希釈した。
Claims (18)
- 抗原結合ドメインを含む分離される結合タンパク質であって、
前記抗原結合ドメインは、以下のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも1つの相補性決定領域を含むか、又は、以下のアミノ酸配列の相補性決定領域と少なくとも80%の配列同一性を有し、cTnIとはKD≦7.51×10-8mol/Lの親和性を有し、
相補性決定領域CDR-VH1はA-S-X1-Y-T-F-X2-X3-Y-W-M-Yであり、
X1がG又はDであり、X2がS又はTであり、X3がT又はSであり、
相補性決定領域CDR-VH2はY-X1-N-P-S-X2-G-H-T-X3-Y-N-Q-X4-F-K-Dであり、ここで、
X1がI又はLであり、X2がS又はTであり、X3がD又はEであり、X4がR又はKであり、
相補性決定領域CDR-VH3はA-R-X1-Y-X2-G-P-F-X3-M-Dであり、ここで、
X1がK又はRであり、X2がF、Y又はWであり、X3がG又はAであり、
相補性決定領域CDR-VL1はS-A-S-X1-X2-V-S-Y-X3-Hであり、ここで、
X1がS又はTであり、X2がT又はSであり、X3がA又はVであり、
相補性決定領域CDR-VL2はW-X1-Y-D-X2-S-K-X3-A-Sであり、ここで、
X1がI又はLであり、X2がT又はSであり、X3がL又はIであり、
相補性決定領域CDR-VL3はQ-X1-W-S-X2-X3-P-Y-Tであり、ここで、
X1がQ又はNであり、X2がT又はSであり、X3がQ又はNである、
ことを特徴とする結合タンパク質。 - 前記相補性決定領域CDR-VH1では、X1がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VH2では、X3がDであり、
前記相補性決定領域CDR-VH3では、X3がGであり、
前記相補性決定領域CDR-VL1では、X3がVであり、
前記相補性決定領域CDR-VL2では、X2がTであり、
前記相補性決定領域CDR-VL3では、X1がQであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH1では、X2がSであり、X3がTであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH1では、X2がSであり、X3がSであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH1では、X2がTであり、X3がTであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH1では、X2がTであり、X3がSであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がIであり、X2がSであり、X4がRであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がIであり、X2がTであり、X4がRであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がIであり、X2がSであり、X4がKであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1が1であり、X2がTであり、X4がKであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がLであり、X2がSであり、X4がRであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がLであり、X2がTであり、X4がRであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がLであり、X2がSであり、X4がKであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH2では、X1がLであり、X2がTであり、X4がKであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH3では、X1がKであり、X2がFであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH3では、X1がKであり、X2がYであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH3では、X1がKであり、X2がWであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH3では、X1がRであり、X2がFであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH3では、X1がRであり、X2がYであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VH3では、X1がRであり、X2がWであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL1では、X1がSであり、X2がTであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL1では、X1がSであり、X2がSであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL1では、X1がTであり、X2がTであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL1では、X1がTであり、X2がSであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL2では、X1がIであり、X3がLであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL2では、X1がIであり、X3がIであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL2では、X1がLであり、X3がLであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL2では、X1がLであり、X3がIであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL3では、X2がTであり、X3がQであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL3では、X2がTであり、X3がNであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL3では、X2がSであり、X3がQであり、
さらに、前記相補性決定領域CDR-VL3では、X2がSであり、X3がNであり、
好ましくは、各相補性決定領域の突然変異部位は、以下の突然変異組合せから選ばれるいずれかの1種である、
ことを特徴とする請求項1に記載の結合タンパク質。
- 少なくとも3つのCDRsを含むか、又は、少なくとも6つのCDRsを含み、
さらに、ナノ抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、二重特異性抗体及び抗体最小識別単位のうちの1つであり、
さらに、配列が順にSEQ ID NO:l乃至SEQ ID NO:4で示される軽鎖フレームワーク領域FR-L1、FR-L2、FR-L3及びFR-L4、及び/又は、配列が順にSEQ ID NO:5乃至SEQ ID NO:8で示される重鎖フレームワーク領域FR-H1、FR-H2、FR-H3及びFR-H4を含む、
ことを特徴とする請求項1又は2に記載の結合タンパク質。 - 抗体定常領域の配列をさらに含み、
さらに、前記定常領域の配列は、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgDから選ばれるいずれかの定常領域の配列であり、
さらに、前記定常領域は、牛、馬、乳牛、豚、綿羊、山羊、ラット、マウス、犬、猫、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトの物種に由来し、
さらに、前記定常領域はマウスに由来し、
軽鎖定常領域の配列はSEQ ID NO:9で示される、
重鎖定常領域の配列はSEQ ID NO:10で示される、
ことを特徴とする請求項3に記載の結合タンパク質。 - 請求項1~4のいずれか1項に記載の結合タンパク質をコードする、
ことを特徴とする分離される核酸。 - 請求項5に記載の核酸を含む、
ことを特徴とするベクター。 - 請求項5に記載の核酸又は請求項6に記載のベクターを含む、
ことを特徴とする宿主細胞。 - 培地において請求項7に記載の宿主細胞を培養し、生じた結合タンパク質を培地又は培養された宿主細胞から回収するステップを含む、
ことを特徴とする請求項1~4のいずれか1項に記載の結合タンパク質の生産方法。 - 請求項1~4のいずれか1項に記載の結合タンパク質の、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定なアンギナ、心筋障害を診断するための診断剤又はキットの製造における使用。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載の結合タンパク質、請求項5に記載の分離される核酸又は請求項6に記載のベクターのうちの1種又は複数種を含み、
好ましくは、前記結合タンパク質を標識するためのマーカーをさらに含む、
ことを特徴とするキット。 - テストサンプル中のトロポニンI抗原の検出方法であって、
a)十分に抗体/抗原結合反応が発生できる条件において、前記テストサンプル中のトロポニンI抗原を請求項3に記載の結合タンパク質と接触させて免疫複合体を形成するステップと、
b)前記テストサンプル中の前記トロポニンI抗原の存在を指示する前記免疫複合体の存在を検出するステップと、を含み、
好ましくは、前記免疫複合体は、前記結合タンパク質に結合される第2の抗体をさらに含み、
好ましくは、ステップa)では、前記免疫複合体は、前記トロポニンI抗原に結合される第2の抗体をさらに含み、
好ましくは、前記トロポニンI抗原が心筋トロポニンI抗原である、検出方法。 - 請求項1~4のいずれか1項に記載の結合タンパク質の、心筋トロポニンIに関連する疾病の診断における使用。
- A)十分に結合反応が発生できる条件において、被験者からのサンプルを請求項1~4のいずれか1項に記載の結合タンパク質と接触させて結合反応させるステップと、
B)結合反応の生じた免疫複合体を検出するステップと、を含み、
前記免疫複合体の存在は、心筋トロポニンIに関連する疾病の存在を指示する、
心筋トロポニンIに関連する疾病の診断方法。 - 蛍光免疫技術、化学発光技術、金コロイド免疫技術、放射免疫分析及び/又は酵素結合免疫技術に基づくものである、請求項13に記載の方法。
- 前記サンプルは、全血、末梢血、血清、血漿又は心筋組織から選ばれる少なくとも1種である、
請求項13又は14に記載の方法。 - 前記被験者は、哺乳動物であり、好ましくは霊長類動物であり、さらに好ましくはヒトである、
請求項13~15のいずれか1項に記載の方法。 - 心筋トロポニンIに関連する前記疾病が心血管疾患である、
請求項12に記載の使用又は請求項13~16のいずれか1項に記載の方法。 - 心筋トロポニンIに関連する前記疾病は、急性心筋梗塞、急性冠症候群、肺梗塞、不安定なアンギナ、心筋障害又はこれらの組合せで構成される群から選ばれる、
請求項12に記載の使用又は請求項13~16のいずれか1項に記載の方法。
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