JP2022184798A - CELL CULTURE METHOD FOR PRODUCING sFGFR3 POLYPEPTIDE - Google Patents
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Abstract
Description
配列表の参照
本出願には、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、これによってその全体が参照により組み込まれる、配列表が収載されている。２０２２年４月１８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＣ０７２６８５Ａ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズが１２５，１０８バイトである。
REFERENCE TO SEQUENCE LISTING This application contains a Sequence Listing which has been submitted electronically in ASCII format and is hereby incorporated by reference in its entirety. Said ASCII copy, created on April 18, 2022, is PC072685A_Sequence_Listing_ST25. txt and is 125,108 bytes in size.
発明の分野
本発明は、可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドを細胞培養で生産する方法に関する。
FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to methods for producing soluble fibroblast growth factor receptor 3 (sFGFR3) polypeptides in cell culture.
線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）は、ヒト発生に関与する細胞シグナル伝達タンパク質の一大ファミリーである線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）に結合する構造ポリペプチドの一ファミリーである。線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）は、骨成長の主要な負の調節因子であり、ＦＧＦＲ３における突然変異は、ヒトにおいて軟骨無形成症または四肢短縮型低身長症を引き起こす。可溶性線維芽細胞成長因子受容体３（ｓＦＧＦＲ３）ポリペプチドは、軟骨無形成症などの骨格成長遅滞障害の処置において有用であることが示されている（たとえば、ＷＯ２０１４／１１１７４４、ＷＯ２０１４／１１１４６７、ＷＯ２０１６／１１０７８６、ＷＯ２０１８／００７５９７、またはＷＯ２０１９／０５７８２０を参照されたい）。天然ＦＧＦＲ３がタンパク質分解切断を受けやすいことも、ウシ肋骨成長板において以前に示されている（Ｐａｎｄｉｔら、２００２）。加えて、安定に形質移入されたＣｏｓ７細胞において、ＦＧＦＲ３の細胞外ドメインの断片化が観察されている（Ｄｅｇｎｉｎら、２０１１）。 Fibroblast growth factor receptors (FGFRs) are a family of structural polypeptides that bind fibroblast growth factors (FGFs), a large family of cell signaling proteins involved in human development. Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) is a major negative regulator of bone growth, and mutations in FGFR3 cause achondroplasia or short-limbed dwarfism in humans. Soluble fibroblast growth factor receptor 3 (sFGFR3) polypeptides have been shown to be useful in the treatment of skeletal growth retardation disorders such as achondroplasia (e.g. WO2014/111744, WO2014/111467, WO2016 /110786, WO2018/007597, or WO2019/057820). It has also been previously shown in bovine rib growth plates that native FGFR3 is susceptible to proteolytic cleavage (Pandit et al., 2002). In addition, fragmentation of the extracellular domain of FGFR3 has been observed in stably transfected Cos7 cells (Degnin et al., 2011).
したがって、医薬として使用するためのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを生産する方法を突き止める必要がある。そのような方法は、好ましくは、大規模で使用されるように十分にロバストであるべきであり、また、たとえば、断片化されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよび／または凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの量を減らすことにより、生産されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの完全性を保つべきである。 Therefore, there is a need to identify methods of producing sFGFR3 polypeptides for use as pharmaceuticals. Such methods should preferably be sufficiently robust to be used on a large scale and, for example, reduce the amount of fragmented and/or aggregated sFGFR3 polypeptides. should preserve the integrity of the sFGFR3 polypeptide produced.
本発明は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを細胞培養で生産する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、
（ｉ）ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地に準備して、細胞培養を開始するステップと、
（ｉｉ）細胞を、約３６．０℃～３７．０℃の間の第１の温度で培養するステップと、
（ｉｉｉ）温度を、約３０．０℃～約３２．０℃の間の第２の温度に移行させるステップと
を含む。
The present invention relates to methods of producing sFGFR3 polypeptides in cell culture. In some embodiments, the method comprises
(i) providing mammalian cells containing a gene encoding an sFGFR3 polypeptide in cell culture medium to initiate cell culture;
(ii) culturing the cells at a first temperature between about 36.0° C. and 37.0° C.;
(iii) transitioning the temperature to a second temperature between about 30.0°C and about 32.0°C;
一部の実施形態では、第１の温度は、約３６．５℃である。 In some embodiments, the first temperature is about 36.5°C.
一部の実施形態では、第２の温度は、約３０．５℃または３１．５℃である。 In some embodiments, the second temperature is about 30.5°C or 31.5°C.
一部の実施形態では、温度は、３日目～７日目の間に、より低い温度に移行される。 In some embodiments, the temperature is transitioned to a lower temperature between days 3-7.
一部の実施形態では、温度は、４日目に、より低い温度に移行される。 In some embodiments, the temperature is transitioned to a lower temperature on day 4.
一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、
（ｉ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドの細胞外ドメインの、連続する１００～３７０アミノ酸を含む、
（ｉｉ）自然に存在する線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）のＥＣＤの、連続する１００、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３１０、３２０、３２５、３３０、３３５、３３６、３４０、３４５、または３５０アミノ酸を含む、
（ｉｉｉ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドのシグナルペプチドおよび／または膜貫通ドメインなどの、シグナルペプチドおよび／または膜貫通ドメインを欠いている、
（ｉｖ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドの細胞内ドメインの、連続する１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５、１３、またはより少数のアミノ酸を含む、
（ｖ）配列番号１～８のアミノ酸配列に対する配列同一性が、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度であるアミノ酸配列を含む、
（ｖｉ）配列番号５に対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、
（ｖｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、
（ｖｉｉｉ）配列番号１０～１８のいずれか１つの核酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％かつ最大１００％である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、および／または
（ｉｘ）配列番号１５の核酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％かつ最大１００％である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、場合により、シグナルペプチドを欠いている。
In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide is
(i) comprises 100 to 370 contiguous amino acids of the extracellular domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(ii) consecutive 100, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 325, 330, 335, 336, 340 ECDs of naturally occurring fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3); containing 345 or 350 amino acids,
(iii) lacks a signal peptide and/or transmembrane domain, such as the signal peptide and/or transmembrane domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(iv) comprises 175, 150, 125, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 15, 13, or fewer contiguous amino acids of the intracellular domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(v) at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% sequence identity to the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1-8; , 96%, 97%, 98%, 99%, or higher,
(vi) an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 98%, at least 99% sequence identity to SEQ ID NO:5;
(vii) comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5;
(viii) encoded by a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence having at least 85% and up to 100% sequence identity to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 10-18; and/or (ix) SEQ ID NO: 15. Encoded by a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence having at least 85% and up to 100% sequence identity to the nucleic acid sequence, optionally lacking a signal peptide.
一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。 In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5.
一部の実施形態では、無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率が、温度移行がない、または３４℃への温度移行を含む、他の点では同一の方法で観察されることになる百分率に比べて増大する。 In some embodiments, the percentage of intact sFGFR3 polypeptide is increased relative to the percentage that would be observed in an otherwise identical method without a temperature shift or including a temperature shift to 34°C. do.
一部の実施形態では、凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率が、温度移行がない、または３４℃への温度移行を含む、他の点では同一の方法で観察されることになる百分率に比べて低減される。 In some embodiments, the percentage of aggregated sFGFR3 polypeptide is reduced relative to the percentage that would be observed in an otherwise identical method without a temperature shift or including a temperature shift to 34°C. be done.
本出願は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドが断片化を被りやすく、したがって、生産するのが難しい分子であるという知見に基づく。本開示は、ＦＧＦＲ３ポリペプチドを生産する方法を対象とする。本明細書で開示する方法は、治療薬として使用されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの生産に特に有用である。本明細書で開示する方法を使用して、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを、大規模で、たとえば、少なくとも１００Ｌ、５００Ｌ、またはさらに、少なくとも３０００Ｌの細胞培養培地体積で製造することができる。 The present application is based on the finding that sFGFR3 polypeptides are susceptible to fragmentation and are therefore difficult molecules to produce. The present disclosure is directed to methods of producing FGFR3 polypeptides. The methods disclosed herein are particularly useful for producing sFGFR3 polypeptides for use as therapeutic agents. Using the methods disclosed herein, sFGFR3 polypeptides can be produced on a large scale, eg, in cell culture medium volumes of at least 100 L, 500 L, or even at least 3000 L.
本出願は、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを細胞培養で生産する方法であって、
（ｉ）ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地に準備して、細胞培養を開始するステップと、
（ｉｉ）細胞を、約３６．０℃～３７．０℃の間の第１の温度で培養するステップと、
（ｉｉｉ）温度を、約３０．０℃～約３２．０℃の間の第２の温度に移行させるステップと
を含む方法に関する。
The present application provides a method of producing a sFGFR3 polypeptide in cell culture comprising:
(i) providing mammalian cells containing a gene encoding an sFGFR3 polypeptide in cell culture medium to initiate cell culture;
(ii) culturing the cells at a first temperature between about 36.0° C. and 37.0° C.;
(iii) transitioning the temperature to a second temperature between about 30.0°C and about 32.0°C.
本明細書で開示する方法の利点は、温度移行がなされない同一の方法に比べて、無傷の（すなわち、断片化されていない）ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率が増大することである。無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの量が最適化されることに加えて、本明細書で開示する方法では、力価が良好になり、凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率も低減される。 An advantage of the methods disclosed herein is that the percentage of intact (ie, non-fragmented) sFGFR3 polypeptide is increased compared to the same method without temperature shift. In addition to optimizing the amount of intact sFGFR3 polypeptide, the methods disclosed herein also yield better titers and reduce the percentage of aggregated sFGFR3 polypeptide.
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、他の方法、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で行われる方法および／または温度移行なしの方法に比べて、無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率の増大（すなわち、より少ない断片）が実現される。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、温度移行が無い、または３４℃への温度移行を含む、他の点では同一の方法に比べて、無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率の増大（すなわち、より少ない断片）が実現される。無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率は、生産されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（無傷および断片化）の合計量に対する無傷のｓＦＧＦＲ３の量に基づいて算出される。無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率は、当業者に知られているいずれかの方法によって求めることができる。一実施形態では、無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率は、キャピラリーゲル電気泳動によって求められる。一実施形態では、無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率は、実施例で開示する方法に従って求められる。 In some embodiments, the methods disclosed herein over other methods, e.g., methods performed at temperatures above or below a temperature or temperature range specified herein and/or methods without temperature transitions. In comparison, an increased percentage of intact sFGFR3 polypeptide (ie, fewer fragments) is achieved. In some embodiments, the methods disclosed herein reduce the percentage of intact sFGFR3 polypeptide compared to an otherwise identical method without a temperature transition or including a temperature transition to 34°C. Augmentation (ie, fewer fragments) is achieved. The percentage of intact sFGFR3 polypeptide is calculated based on the amount of intact sFGFR3 relative to the total amount of sFGFR3 polypeptide (intact and fragmented) produced. The percentage of intact sFGFR3 polypeptide can be determined by any method known to those of skill in the art. In one embodiment, the percentage of intact sFGFR3 polypeptide is determined by capillary gel electrophoresis. In one embodiment, the percentage of intact sFGFR3 polypeptide is determined according to the methods disclosed in the Examples.
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、他の方法、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で実施される方法および／または温度移行なしの方法に比べて、力価の増大が実現される。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、温度移行が無い、または３４℃への温度移行を含む、他の点では同一の方法に比べて、力価の増大が実現される。力価は、当業者に知られているいずれかの方法によって求めることができる。一実施形態では、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって力価が測定される。 In some embodiments, the methods disclosed herein are followed by other methods, e.g., methods performed at temperatures above or below a temperature or temperature range specified herein and/or methods without temperature transitions. An increase in titer is realized compared to In some embodiments, the methods disclosed herein provide increased potency compared to otherwise identical methods without a temperature transition or including a temperature transition to 34°C. . Potency can be determined by any method known to those of skill in the art. In one embodiment, titers are measured by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC).
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、他の方法、たとえば、本明細書で規定する温度もしくは温度範囲より高いもしくは低い温度で実施される方法および／または温度移行なしの方法に比べて、凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率の低減が実現される。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、温度移行が無い、または３４℃への温度移行を含む、他の点では同一の方法に比べて、凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率の低減が実現される。凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの量は、当業者に知られているいずれかの方法によって求めることができる。一実施形態では、凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの量は、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定される。一実施形態では、凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの量は、実施例で開示する方法に従って求められる。 In some embodiments, the methods disclosed herein are followed by other methods, e.g., methods performed at temperatures above or below a temperature or temperature range specified herein and/or methods without temperature transitions. A reduction in the percentage of aggregated sFGFR3 polypeptide is achieved compared to . In some embodiments, the methods disclosed herein reduce the percentage of aggregated sFGFR3 polypeptide compared to an otherwise identical method without a temperature transition or including a temperature transition to 34°C. A reduction is realized. The amount of aggregated sFGFR3 polypeptide can be determined by any method known to those of skill in the art. In one embodiment, the amount of aggregated sFGFR3 polypeptide is measured by size exclusion HPLC. In one embodiment, the amount of aggregated sFGFR3 polypeptide is determined according to the methods disclosed in the Examples.
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、温度移行が無い、または３４℃への温度移行を含む、他の点では同一の方法に比べて、無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率の増大および力価の増大が実現される。 In some embodiments, the methods disclosed herein reduce the percentage of intact sFGFR3 polypeptide compared to an otherwise identical method without a temperature transition or including a temperature transition to 34°C. Augmentation and titer enhancement is achieved.
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、温度移行が無い、または３４℃への温度移行を含む、他の点では同一の方法に比べて、無傷のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率の増大、凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率の低減、および力価の増大が実現される。 In some embodiments, the methods disclosed herein reduce the percentage of intact sFGFR3 polypeptide compared to an otherwise identical method without a temperature transition or including a temperature transition to 34°C. An increase, a reduction in the percentage of aggregated sFGFR3 polypeptide, and an increase in potency are achieved.
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法によって、温度移行が無い、または３４℃への温度移行を含む、他の点では同一の方法に比べて、凝集したｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率の低減および力価の増大が実現される。 In some embodiments, the methods disclosed herein reduce the percentage of aggregated sFGFR3 polypeptide compared to an otherwise identical method without a temperature transition or including a temperature transition to 34°C. A reduction and an increase in potency are realized.
本明細書で開示する方法の一部の実施形態では、第１の温度は、約３６．０、３６．１、３６．２、３６．３、３６．４、３６．５、３６．６、３６．７、３６．８、３６．９、または３７．０℃、好ましくは３６．５℃である。 In some embodiments of the methods disclosed herein, the first temperature is about 36.0, 36.1, 36.2, 36.3, 36.4, 36.5, 36.6, 36.7, 36.8, 36.9 or 37.0°C, preferably 36.5°C.
本明細書で開示する方法の一部の実施形態では、第２の温度は、約３０．０、３０．１、３０．２、３０．３、３０．４、３０．５、３０．６、３０．７、３０．８、３０．９、３１．０、３１．１、３１．２、３１．３、３１．４、３１．５、３１．６、３１．７、３１．８、３１．９、または３２．０℃、好ましくは３１．５℃である。 In some embodiments of the methods disclosed herein, the second temperature is about 30.0, 30.1, 30.2, 30.3, 30.4, 30.5, 30.6, 30.7, 30.8, 30.9, 31.0, 31.1, 31.2, 31.3, 31.4, 31.5, 31.6, 31.7, 31.8, 31. 9, or 32.0°C, preferably 31.5°C.
本明細書で開示する方法の一部の実施形態では、第１の温度は、約３６．５℃であり、第２の温度は、約３１．５℃である。 In some embodiments of the methods disclosed herein, the first temperature is about 36.5°C and the second temperature is about 31.5°C.
本明細書で開示する方法の一部の実施形態では、第１の温度は、約３６．５℃であり、第２の温度は、約３０．５℃である。 In some embodiments of the methods disclosed herein, the first temperature is about 36.5°C and the second temperature is about 30.5°C.
本明細書で開示する方法の一部の実施形態では、温度は、３日目～７日目の間、すなわち、３日目、４日目、５日目、６日目、または７日目に、より低い温度に移行される。温度は、４日目に移行されることが好ましい。
In some embodiments of the methods disclosed herein, the temperature is between
本明細書で開示する方法の一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、
（ｉ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドの細胞外ドメインの、連続する１００～３７０アミノ酸を含む、
（ｉｉ）自然に存在する線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）のＥＣＤの、連続する１００、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３１０、３２０、３２５、３３０、３３５、３３６、３４０、３４５、または３５０アミノ酸を含む、
（ｉｉｉ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドのシグナルペプチドおよび／または膜貫通ドメインなどの、シグナルペプチドおよび／または膜貫通ドメインを欠いている、
（ｉｖ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドの細胞内ドメインの、連続する１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５、１３、またはより少数のアミノ酸を含む、
（ｖ）配列番号１～８のアミノ酸配列に対する配列同一性が、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度であるアミノ酸配列を含む、
（ｖｉ）配列番号５に対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、
（ｖｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、
（ｖｉｉｉ）配列番号１０～１８のいずれか１つの核酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％かつ最大１００％である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、および／または
（ｉｘ）配列番号１５の核酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％かつ最大１００％である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、場合により、シグナルペプチドを欠いている。
In some embodiments of the methods disclosed herein, the sFGFR3 polypeptide is
(i) comprises 100 to 370 contiguous amino acids of the extracellular domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(ii) consecutive 100, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 325, 330, 335, 336, 340 ECDs of naturally occurring fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3); containing 345 or 350 amino acids,
(iii) lacks a signal peptide and/or transmembrane domain, such as the signal peptide and/or transmembrane domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(iv) comprises 175, 150, 125, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 15, 13, or fewer contiguous amino acids of the intracellular domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(v) at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% sequence identity to the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1-8; , 96%, 97%, 98%, 99%, or higher,
(vi) an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 98%, at least 99% sequence identity to SEQ ID NO:5;
(vii) comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5;
(viii) encoded by a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence having at least 85% and up to 100% sequence identity to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 10-18; and/or (ix) SEQ ID NO: 15. Encoded by a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence having at least 85% and up to 100% sequence identity to the nucleic acid sequence, optionally lacking a signal peptide.
好ましい一実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号５に対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む。 In one preferred embodiment, the sFGFR3 polypeptide has at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 98%, at least 99% sequence identity to SEQ ID NO:5. % amino acid sequences.
好ましい一実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。 In one preferred embodiment, the sFGFR3 polypeptide comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5.
一部の実施形態では、細胞培養は、流加培養法である。 In some embodiments, the cell culture is a fed batch method.
一部の実施形態では、本開示はまた、本明細書で開示する方法のいずれかによって取得されたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドに関する。 In some embodiments, the present disclosure also relates to sFGFR3 polypeptides obtained by any of the methods disclosed herein.
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示する方法のいずれかによって取得可能なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドに関する。 In some embodiments, the present disclosure relates to sFGFR3 polypeptides obtainable by any of the methods disclosed herein.
本発明の実施には、別段指摘しない限り、当分野の技量の範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術が用いられる。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ共編、１９９３～１９９８） Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ共編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ共編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら共編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら共編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら共編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ共編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ共編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献において十分に説明されている。 Unless otherwise indicated, the practice of the present invention employs conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques), microbiology, cell biology, biochemistry, and immunology within the skill of the art. is used.そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ : A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather, P.E. 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (edited by A. Doyle, JB Griffiths, and DG Newell, 1993-1998). Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (edited by DM Weir and C.C. Blackwell); Calos, co-ed., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (co-ed., FM Ausubel et al., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (co-ed., Mullis et al., 1994); , 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Eds., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and JD Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
用語「線維芽細胞成長因子」および「ＦＧＦ」とは、内分泌シグナル伝達経路、発育、創傷治癒、および血管新生を始めとする種々の代謝過程に関与する、構造的に関連のあるシグナル伝達分子を包含するＦＧＦファミリーの仲間を指す。ＦＧＦは、広範な細胞および組織型の増殖および分化において重要な役割を果たす。この用語は、ＦＧＦＲ３に結合することが示されている、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、およびＦＧＦ２３を指すことが好ましい。たとえば、ＦＧＦは、ヒトＦＧＦ１（たとえば、配列番号２６のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ２（たとえば、配列番号２７のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ９（たとえば、配列番号２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ１０（たとえば、配列番号４０のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ１８（たとえば、配列番号２９のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ１９（たとえば、配列番号３０のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ヒトＦＧＦ２１（たとえば、配列番号３１のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、およびヒトＦＧＦ２３（たとえば、配列番号４１のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を包含しうる。 The terms "fibroblast growth factor" and "FGF" refer to structurally related signaling molecules involved in a variety of metabolic processes, including endocrine signaling pathways, development, wound healing, and angiogenesis. Refers to the members of the FGF family that it encompasses. FGFs play important roles in the proliferation and differentiation of a wide range of cell and tissue types. The term preferably refers to FGF1, FGF2, FGF9, FGF10, FGF18, FGF19, FGF21 and FGF23, which have been shown to bind to FGFR3. For example, FGF is human FGF1 (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:26), human FGF2 (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:27), human FGF9 (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO:28). ), human FGF10 (e.g., a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:40), human FGF18 (e.g., a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:29), human FGF19 (e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO:30 human FGF21 (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:31), and human FGF23 (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:41).
本明細書で使用する用語「線維芽細胞成長因子受容体３」、「ＦＧＦＲ３」、または「ＦＧＦＲ３受容体」とは、１種または複数のＦＧＦ（たとえば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、および／またはＦＧＦ２３）に特異的に結合するポリペプチドを指す。染色体４の遠位短腕に位置するヒトＦＧＦＲ３遺伝子は、１９のエキソンを含み、シグナルペプチド（たとえば、配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を含む、８０６アミノ酸のタンパク質前駆体（線維芽細胞成長因子受容体３アイソフォーム１前駆体）をコードする。ＦＧＦＲ３アミノ酸配列における、骨格成長障害（たとえば、軟骨無形成症）につながる突然変異には、たとえば、３５８位にあるグリシン残基のアルギニン残基での置換（すなわち、Ｇ３５８Ｒ；配列番号９）が含まれる。自然に存在するヒトＦＧＦＲ３遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１４２．４として示されるヌクレオチド配列を有し、自然に存在するヒトＦＧＦＲ３タンパク質は、本明細書では配列番号８によって表される、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１３３として示されるアミノ酸配列を有する。野生型ＦＧＦＲ３（たとえば、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）は、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１～３を含む細胞外の免疫グロブリン様膜ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内（すなわち、細胞質）ドメインからなる。ＦＧＦＲ３は、全長野生型ＦＧＦＲ３の断片および／または変異体（たとえば、エキソン９でなく、代わりのエキソン８を利用するスプライスバリアントなどのスプライスバリアント）を含みうる。
As used herein, the terms "fibroblast
用語「ドメイン」とは、ポリペプチド内で識別可能な構造および／または機能を有する、ポリペプチド（たとえば、ＦＧＦＲ３ポリペプチド）の保存されたアミノ酸配列領域を指す。ドメインは、たとえば、約２０アミノ酸から約６００アミノ酸まで、長さが様々となりうる。例示的なドメインとしては、ＦＧＦＲ３の免疫グロブリンドメイン（たとえば、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン２、およびＩｇ様Ｃ２型ドメイン３）、ＦＧＦＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、ＦＧＦＲ３の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、またはＦＧＦＲ３の膜貫通ドメイン（ＴＭ）が挙げられ、ＦＧＦＲ３は、たとえば、配列番号８に明記する配列を有するＦＧＦＲ３である。 The term "domain" refers to a conserved amino acid sequence region of a polypeptide (eg, a FGFR3 polypeptide) that has distinguishable structure and/or function within the polypeptide. Domains can vary in length, eg, from about 20 amino acids to about 600 amino acids. Exemplary domains include the immunoglobulin domains of FGFR3 (e.g., Ig-like C2-type domain 1, Ig-like C2-type domain 2, and Ig-like C2-type domain 3), the extracellular domain (ECD) of FGFR3, the cellular Intradomain (ICD), or transmembrane domain (TM) of FGFR3, where FGFR3 is, for example, FGFR3 having the sequence specified in SEQ ID NO:8.
用語「細胞外ドメイン」および「ＥＣＤ」とは、細胞外の空間へと膜貫通ドメインの向こうに伸びている、ＦＧＦＲ３ポリペプチドの部分を指す。ＥＣＤは、ＦＧＦＲ３の１種または複数の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の結合を媒介する。たとえば、ＥＣＤには、ＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン１～３が含まれる。詳細には、野生型（ｗｔ）ＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン１、野生型（ｗｔ）ＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン２、および／またはｗｔＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン３が、ＥＣＤに含まれる。ＦＧＦＲ３のＥＣＤには、たとえば野生型ＦＧＦＲ３ Ｉｇ様Ｃ２型ドメインの、断片も含まれうる。
The terms "extracellular domain" and "ECD" refer to the portion of the FGFR3 polypeptide that extends beyond the transmembrane domain into the extracellular space. ECD mediates the binding of one or more fibroblast growth factors (FGFs) to FGFR3. For example, the ECD includes Ig-like C2-type domains 1-3 of the FGFR3 polypeptide. Specifically, the Ig-like C2-type domain 1 of the wild-type (wt) FGFR3 polypeptide, the Ig-like C2-type domain 2 of the wild-type (wt) FGFR3 polypeptide, and/or the Ig-like C2-
用語「断片」および「部分」とは、基準核酸分子もしくはポリペプチドまたはそのドメイン（たとえば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのＥＣＤ、ＩＣＤ、またはＴＭ）の長さ全体の、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより多くを含んでいるポリペプチドまたは核酸分子などの、全体の一部を指す。断片または部分は、基準ポリペプチドの長さ全体までの、連続する、たとえば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３３６、３４０、３４８、３４９、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、５００、６００、７００、またはより多数のアミノ酸残基を含んでいる場合がある。たとえば、ＦＧＦＲ３断片は、配列番号１～８のいずれか１つの、連続する少なくとも約５アミノ酸～連続する約３５０アミノ酸（両端の終点の数を含める）、たとえば、連続する少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３１０、３２０、３３０、３３５、３３６、３４０、または３５０アミノ酸を有するいずれかのポリペプチドを含むものでよい。一部の実施形態では、ＦＧＦＲ３断片は、配列番号８の、連続する少なくとも３３６アミノ酸を有するポリペプチドを含む。 The terms "fragment" and "portion" refer to, preferably at least 10%, 20%, Polyethylene containing 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more A part of a whole, such as a peptide or nucleic acid molecule. Fragments or portions may be contiguous, e.g. 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, It may contain 320, 330, 336, 340, 348, 349, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 500, 600, 700 or more amino acid residues. For example, the FGFR3 fragment is at least about 5 contiguous amino acids to about 350 contiguous amino acids (including the number of endpoints on each end) of any one of SEQ ID NOS: 1-8, e.g., at least about 10, 20, 30 contiguous amino acids. , 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 , 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310, 320, 330, 335, 336, 340, or 350 amino acids. OK. In some embodiments, the FGFR3 fragment comprises a polypeptide having at least 336 contiguous amino acids of SEQ ID NO:8.
用語「可溶性線維芽細胞成長因子受容体３」、「可溶性ＦＧＦＲ３」、および「ｓＦＧＦＲ３」とは、膜貫通ドメイン、およびＦＧＦＲ３ポリペプチドを細胞膜に固定するいずれかのポリペプチド部分（たとえば、チロシンキナーゼドメイン）の全部または実質的部分の不在または機能崩壊を特徴とするＦＧＦＲ３を指す。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、非膜結合型のＦＧＦＲ３ポリペプチドである。したがって、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチド配列（たとえば、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の膜貫通ドメインのアミノ酸残基の一部分またはすべての欠失を含む場合がある。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ３ポリペプチドの細胞内ドメインの欠失をさらに含む場合もある。
The terms "soluble fibroblast
例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとしては、限定はしないが、配列番号１～８の、少なくとも、アミノ酸１～１００、１～１２５、１～１５０、１～１７５、１～２００、１～２０５、１～２１０、１～２１５、１～２２０、１～２２５、１～２３０、１～２３５、１～２４０、１～２４５、１～２５０、１～２５２、１～２５５、１～２６０、１～２６５、１～２７０、１～２７５、１～２８０、１～２８５、１～２９０、１～２９５、１～３００、または１～３０１を挙げることができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドには、配列番号１～８のこうしたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのいずれかに対する配列同一性が少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）であるいずれのポリペプチドも含まれうる。加えて、例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとして、限定はしないが、配列番号１～８の、少なくとも、アミノ酸１～１００、１～１２５、１～１５０、１～１７５、１～２００、１～２０５、１～２１０、１～２１５、１～２２０、１～２２５、１～２３０、１～２３５、１～２４０、１～２４５、１～２５０、１～２５５、１～２６０、１～２６５、１～２７０、１～２７５、１～２８０、１～２８５、１～２９０、１～２９５、１～３００、１～３０５、１～３１０、１～３１５、１～３２０、１～３２５、１～３３０、１～３３５、１～３３６、１～３４０、１～３４５、または１～３４８も挙げることができる。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号８の連続する１～３３６アミノ酸を含む。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドには、配列番号１～８のアミノ酸配列を有するこうしたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのいずれかに対する配列同一性が少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）であるいずれのポリペプチドも含まれうる。上記ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその変異体はいずれも、Ｎ末端位に、シグナルペプチド、たとえば、配列番号２１のアミノ酸１～２２（ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳ）や配列番号４３のアミノ酸１～１９（たとえば、ＭＭＳＦＶＳＬＬＬＶＧＩＬＦＨＡＴＱＡ）を場合により含みうる。 Exemplary sFGFR3 polypeptides include, but are not limited to, at least amino acids 1-100, 1-125, 1-150, 1-175, 1-200, 1-205, 1-20 of SEQ ID NOs: 1-8. 210, 1-215, 1-220, 1-225, 1-230, 1-235, 1-240, 1-245, 1-250, 1-252, 1-255, 1-260, 1-265, 1-270, 1-275, 1-280, 1-285, 1-290, 1-295, 1-300, or 1-301 can be mentioned. The sFGFR3 polypeptides have at least 50% sequence identity (e.g., 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%) to any of such sFGFR3 polypeptides of SEQ ID NOs: 1-8. , 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher) may also include polypeptides of Additionally, exemplary sFGFR3 polypeptides include, but are not limited to, at least amino acids 1-100, 1-125, 1-150, 1-175, 1-200, 1-205, of SEQ ID NOS: 1-8, 1-210, 1-215, 1-220, 1-225, 1-230, 1-235, 1-240, 1-245, 1-250, 1-255, 1-260, 1-265, 1- 270, 1-275, 1-280, 1-285, 1-290, 1-295, 1-300, 1-305, 1-310, 1-315, 1-320, 1-325, 1-330, 1-335, 1-336, 1-340, 1-345, or 1-348 can also be mentioned. In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide comprises 1-336 contiguous amino acids of SEQ ID NO:8. The sFGFR3 polypeptides have at least 50% (eg, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%) sequence identity to any such sFGFR3 polypeptides having amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-8. %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or higher ) can be included. Any of the above sFGFR3 polypeptides or variants thereof optionally include a signal peptide at the N-terminal position, e.g. can contain
ポリペプチドに関して、用語「変異体」とは、変異体の派生元であるポリペプチド（たとえば、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの基準ポリペプチド）と、アミノ酸配列の１つまたは複数の変更によって異なるポリペプチド（たとえば、シグナルペプチドを含むまたは含まないｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその変異体）を指す。ポリヌクレオチドに関して、用語「変異体」とは、変異体の派生元であるポリヌクレオチド（たとえば、配列番号１０～１８のいずれか１つの核酸配列を有する、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの、基準ポリヌクレオチド）と、核酸配列の１つまたは複数の変更によって異なるポリヌクレオチドを指す。変異体のアミノ酸または核酸配列の変更は、たとえば、アミノ酸または核酸置換、挿入、欠失、Ｎ末端トランケーション、もしくはＣ末端トランケーション、またはこれらのいずれかの組合せになる場合がある。詳細には、アミノ酸置換は、保存的および／または非保存的置換でよい。変異体は、基準ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドに対する、それぞれアミノ酸配列同一性または核酸配列同一性によって特徴付けることができる。たとえば、変異体には、基準ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）である、いずれのポリペプチドも含まれうる。 With respect to polypeptides, the term "variant" refers to the polypeptide from which the variant is derived (eg, a reference polypeptide, such as a polypeptide having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-7) and the amino acid sequence (eg, sFGFR3 polypeptides or variants thereof with or without a signal peptide) that differ by one or more alterations in . With respect to polynucleotides, the term "variant" refers to the polynucleotide from which the variant is derived (e.g., a polynucleotide encoding an sFGFR3 polypeptide having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 10-18, A reference polynucleotide) and a polynucleotide that differs by one or more alterations in the nucleic acid sequence. Variant amino acid or nucleic acid sequence alterations may be, for example, amino acid or nucleic acid substitutions, insertions, deletions, N-terminal truncations, or C-terminal truncations, or any combination thereof. In particular, amino acid substitutions may be conservative and/or non-conservative substitutions. Variants can be characterized by amino acid or nucleic acid sequence identity to a reference polypeptide or parent polynucleotide, respectively. For example, variants may have at least 50% (e.g., 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%) sequence identity to a reference polypeptide or polynucleotide. , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher). can be
本明細書で使用するとき、用語「配列同一性」とは、候補配列、たとえば、ＦＧＦＲ３ポリペプチドのアミノ酸（または核酸）残基が、必要なら、配列を整合させ、ギャップを導入して、最大のパーセント同一性を実現した後（たとえば、最適な整合のために、候補および基準配列の一方または両方にギャップを導入する場合があり、比較目的で、非相同配列を無視する場合がある）、基準配列、たとえば、野生型ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（たとえば、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（たとえば、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその変異体）のアミノ酸（または核酸）残基と同一である百分率を指す。パーセント同一性を決定する目的のための整合は、当分野の技量の範囲内にある種々の手段で、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、実現することができる。当業者は、比較される配列の全長に及ぶ最大の整合を実現するのに必要ないずれかのアルゴリズムを始めとする、整合を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。たとえば、所与の候補配列の、所与の基準配列との、またはそれに対するパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性（別法として、所与の基準配列とに、またはそれに対して、ある特定のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性を有するまたは含む所与の候補配列と呼ぶこともできる）は、次のとおりに算出される：１００×（分数Ａ／Ｂ）［ここで、Ａは、候補配列と基準配列の整合において同一であると記録されたアミノ酸（または核酸）残基の数であり、Ｂは、基準配列におけるアミノ酸（または核酸）残基の合計数である］。詳細には、候補配列との比較のために整合された基準配列によって、候補配列は、候補配列の全長、または候補配列の選択された一部分の連続するアミノ酸（または核酸）残基全体にわたる同一性が、たとえば５０％～１００％であることが示されうる。比較目的のために整合される候補配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、たとえば、少なくとも４０％、たとえば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。候補配列における位置が、基準配列中の対応する位置と同じアミノ酸（または核酸）残基によって占有されるとき、分子は、その位置において同一である。 As used herein, the term "sequence identity" means that the amino acid (or nucleic acid) residues of a candidate sequence, e.g. (e.g., gaps may be introduced in one or both of the candidate and reference sequences for optimal matching, and non-homologous sequences may be ignored for comparison purposes), a reference sequence, such as a wild-type sFGFR3 polypeptide (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:8) or a sFGFR3 polypeptide (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-7; It refers to the percentage of identical amino acid (or nucleic acid) residues of the sFGFR3 polypeptide (or variant thereof). Alignment for purposes of determining percent identity may be performed by various means within the skill in the art, such as BLAST, BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST. -2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring matching, including any algorithms needed to achieve maximal matching over the full length of the sequences being compared. For example, the percent amino acid (or nucleic acid) sequence identity of a given candidate sequence with or to a given reference sequence (alternatively, a specific The percent amino acid (or nucleic acid) sequence identity, which can also be referred to as a given candidate sequence having or containing sequence identity, is calculated as follows: 100 x (fraction A/B) [where A is the candidate B is the total number of amino acid (or nucleic acid) residues in the reference sequence]. In particular, a reference sequence matched for comparison to a candidate sequence indicates that the candidate sequence has identity over the entire length of the candidate sequence, or over contiguous amino acid (or nucleic acid) residues of a selected portion of the candidate sequence. can be shown to be, for example, between 50% and 100%. The length of the candidate sequence matched for comparison purposes is at least 30%, such as at least 40%, such as at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100%. When a position in the candidate sequence is occupied by the same amino acid (or nucleic acid) residue as the corresponding position in the reference sequence, then the molecules are identical at that position.
リガンドに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」ポリペプチド（本明細書では区別なく使用される）は、当業界で十分に理解されている用語であり、そのような特異的または優先的な結合を見極める方法も、当業界でよく知られている。分子が、特定の細胞または物質と、別の細胞または物質より、頻繁に、迅速に、長い持続時間で、かつ／または高度な親和性で、反応または会合する場合、分子は、「特異的な結合」または「優先的な結合」を示すと述べられる。ポリペプチドが、他の物質に結合するより、高度な親和性、アビディティーで、容易に、かつ／または長い持続時間で結合する場合、ポリペプチドは、ターゲットに、「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。たとえば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）に特異的または優先的に結合するｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとは、他の成長因子または他のリガンドに結合するより、高度な親和性、アビディティーで、容易に、かつ／または長い持続時間でＦＧＦを結合するポリペプチドである。この定義を読むことにより、たとえば、第１のターゲットに特異的または優先的に結合するポリペプチドが、第２のターゲットに特異的または優先的に結合するか否かは定かでないことも理解される。そのため、「特異的な結合」または「優先的な結合」には、排他的な結合が（含まれうるとしても）必ずしも必要ではない。必ずではないが一般に、結合への言及は、優先的な結合を意味する。 A polypeptide that "preferentially binds" or "specifically binds" a ligand (used interchangeably herein) are terms well understood in the art, and such specific Alternatively, methods for determining preferential binding are also well known in the art. A molecule is defined as a "specific It is said to indicate "binding" or "preferential binding". A polypeptide "specifically binds" or "Priority binding". For example, a sFGFR3 polypeptide that specifically or preferentially binds to fibroblast growth factor (FGF) is more likely to bind to other growth factors or other ligands with higher affinity, avidity, readily and/or a polypeptide that binds FGF for a long duration. It is also understood that, upon reading this definition, for example, it is not certain whether a polypeptide that specifically or preferentially binds to a first target will specifically or preferentially bind to a second target. . As such, "specific binding" or "preferential binding" does not necessarily require (although it can include) exclusive binding. Generally, but not necessarily, references to binding imply preferential binding.
用語「結合親和性」は、本明細書では、２種の分子間、たとえば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとそのリガンドであるＦＧＦ間の非共有結合性相互作用の強さの尺度として使用される。用語「結合親和性」は、一価相互作用（固有活性）について述べるのに使用される。２種の分子間、たとえば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとそのリガンドであるＦＧＦ間、またはｓＦＧＦＲ３ポリペプチドと受容体ＦＧＦＲ３間の一価相互作用による結合親和性は、解離定数（ＫＤ）を求めることにより定量化することができる。そして次に、ＫＤは、複合体形成および解離の動態を、たとえば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して測定することにより求めることができる。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）および解離速度定数ｋｄ（またはｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによってｋａおよびｋｄと関係付けられる。解離定数の値は、よく知られている方法によって直接求めることができ、複雑な混合物についてでさえ、たとえば、Ｃａｃｅｃｉら（１９８４、Ｂｙｔｅ ９：３４０～３６２）に記載されているものなどの方法によって、コンピューターで計算することができる。ＫＤは、たとえば、ＷｏｎｇおよびＬｏｈｍａｎ（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５４２８～５４３２）で開示されているものなどの二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して定めることができる。たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析、ならびに本明細書における他の場所で例示する他のアッセイを含めて、ターゲット抗原に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価する他の標準アッセイが、当業界で知られている。ポリペプチドの結合動態および結合親和性は、たとえばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムの使用による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や、ＫｉｎＥｘＡなどの、当業界で知られている標準アッセイによって評価することもできる。 The term "binding affinity" is used herein as a measure of the strength of the non-covalent interaction between two molecules, eg, a sFGFR3 polypeptide and its ligand, FGF. The term "binding affinity" is used to describe a monovalent interaction (intrinsic activity). The binding affinity between two molecules, e.g., between a sFGFR3 polypeptide and its ligand, FGF, or between a sFGFR3 polypeptide and its receptor, FGFR3, through monovalent interactions is quantified by determining the dissociation constant ( KD ). can be K D can then be determined by measuring the kinetics of complex formation and dissociation using, for example, surface plasmon resonance (SPR) techniques (Biacore). The rate constants corresponding to the association and dissociation of monovalent complexes are called the association rate constant k a (or k on ) and the dissociation rate constant k d (or k off ), respectively. K D is related to ka and k d by the formula K D =k d / ka . The value of the dissociation constant can be determined directly by well-known methods, even for complex mixtures, for example by methods such as those described by Caceci et al. (1984, Byte 9:340-362). , which can be calculated by computer. K D can be determined, for example, using a dual filter nitrocellulose filter binding assay such as that disclosed by Wong and Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5428-5432). can. Other standard assays to assess the binding ability of a ligand, such as an antibody, to a target antigen, including, for example, ELISA, Western blot, RIA, and flow cytometric analysis, and other assays exemplified elsewhere herein. are known in the art. Binding kinetics and binding affinities of polypeptides can also be assessed by standard assays known in the art, such as surface plasmon resonance (SPR) using the Biacore™ system, or KinExA.
本明細書で使用する用語「骨格成長遅滞障害」とは、骨の変形および／または形成異常を特徴とする骨格疾患を指す。こうした障害には、限定はしないが、成長板（骨端軟骨）骨折によって引き起こされた骨格成長遅滞障害、特発性骨格成長遅滞障害、またはＦＧＦＲ３関連骨格疾患が含まれる。詳細には、骨格成長遅滞障害（たとえば、軟骨無形成症）を有する患者は、骨が、健康な患者の骨より短い場合がある。たとえば、骨格成長遅滞障害には、骨格異形成、たとえば、軟骨無形成症、ホモ接合性軟骨無形成症、ヘテロ接合性軟骨無形成症、軟骨無発生症、先端骨形成不全症、遠位中間肢異形成症（ａｃｒｏｍｅｓｏｍｅｌｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、成長不全性骨形成症（ａｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）、弯曲肢異形成症、点状軟骨異形成症、肢根型の点状軟骨異形成症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、先天性大腿骨短縮症、頭蓋骨癒合症（たとえば、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、Ｃｒｏｕｚｏｎ症候群、Ａｐｅｒｔ症候群、Ｊａｃｋｓｏｎ－Ｗｅｉｓｓ症候群、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ症候群、またはＣｒｏｕｚｏｎｏｄｅｒｍｏｓｋｅｌｅｔａｌ症候群）、指の異常（ｄａｃｔｙｌｙ）、短指症、屈指症、多指症、合指症、捻曲性骨異形成症、低身長症（ｄｗａｒｆｉｓｍ）、分節異常骨異形成症、内軟骨腫症、線維軟骨形成症（ｆｉｂｒｏｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、線維性骨異形成症、遺伝性多発性外骨腫症、低軟骨形成症、低ホスファターゼ症、低リン血症性くる病、Ｊａｆｆｅ－Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ症候群、Ｋｎｉｅｓｔ異形成症、Ｋｎｉｅｓｔ症候群、Ｌａｎｇｅｒ型中間肢異形成症、Ｍａｒｆａｎ症候群、ＭｃＣｕｎｅ－Ａｌｂｒｉｇｈｔ症候群、小肢症、骨幹端異形成症、Ｊａｎｓｅｎ－ｔｙｐｅ骨幹端異形成症、変容性骨異形成症、Ｍｏｒｑｕｉｏ症候群、Ｎｉｅｖｅｒｇｅｌｔ－ｔｙｐｅ中間肢異形成症、神経線維腫症、骨関節炎、骨軟骨異形成症、骨形成不全症、周産期致死型の骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、末梢性異骨症、Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ症候群、Ｒｏｂｅｒｔｓ症候群、Ｒｏｂｉｎｏｗ症候群、短肋骨多指症候群、低身長、先天性脊椎骨端異形成症、および脊椎骨端骨幹端異形成症（ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｍｅｔａｐｈｙｓｅａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）が含まれうる。 As used herein, the term "skeletal growth retardation disorders" refers to skeletal disorders characterized by deformities and/or malformations of bones. Such disorders include, but are not limited to, skeletal growth retardation disorders caused by growth plate (epiphyseal cartilage) fractures, idiopathic skeletal growth retardation disorders, or FGFR3-associated skeletal diseases. Specifically, patients with skeletal growth retardation disorders (eg, achondroplasia) may have shorter bones than those of healthy patients. For example, skeletal growth retardation disorders include skeletal dysplasias, e.g., achondroplasia, homozygous achondroplasia, heterozygous achondroplasia, achondroplasia, achondroplasia, distal intermediate acromesomelic dysplasia, atelosteogenesis, dysplasia of the curved limb, chondrodysplasia punctate, chondrodysplasia punctate of the limb root type, clavicular hypoplasia, congenital femoral shortness, craniosynostosis (e.g., Muenke syndrome, Crouzon syndrome, Apert syndrome, Jackson-Weiss syndrome, Pfeiffer syndrome, or Crouzonodermoskeletal syndrome), dactyly, brachydactyly, quadrandactyly, polydactyly disease, syndactyly, torsional dysplasia, dwarfism, segmental dysostosis, enchondromatosis, fibrochondrogenesis, fibrous dysplasia, hereditary Multiple exostoses, hypochondrogenesis, hypophosphatasia, hypophosphatemic rickets, Jaffe-Lichtenstein syndrome, Kniest dysplasia, Kniest syndrome, Langer's middle limb dysplasia, Marfan syndrome, McCune-Albright syndrome, microlimb, metaphyseal dysplasia, Jansen-type metaphyseal dysplasia, degenerative bone dysplasia, Morquio syndrome, Nievergelt-type metaphyseal dysplasia, neurofibromatosis, osteoarthritis, osteochondral dysplasia, osteogenesis imperfecta, perinatal lethal osteogenesis imperfecta, osteopetrosis, osteopetrosis, dysostosis peripheral, Reinhardt syndrome, Roberts syndrome, Robinow syndrome, short rib polydactyly syndrome, low Height, congenital vertebral epiphyseal dysplasia, and spondyloepimetaphyseal dysplasia may be included.
本明細書で使用する用語「ＦＧＦＲ３関連骨格疾患」とは、たとえば、ＦＧＦＲ３の機能獲得型突然変異体の発現による、ＦＧＦＲ３の活性の異常な増大によって引き起こされる骨格疾患を指す。語句「ＦＧＦＲ３の機能獲得型突然変異体」とは、下流シグナル伝達の誘発などの生物活性が、ＦＧＦリガンド存在下での、対応する野生型ＦＧＦＲ３（たとえば、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の生物活性より高い、ＦＧＦＲ３の突然変異体を指す。ＦＧＦＲ３関連骨格疾患は、遺伝性または散発性疾患を包含しうる。例示的なＦＧＦＲ３関連骨格疾患として、限定はしないが、軟骨無形成症、タナトフォリック骨異形成症Ｉ型（ＴＤＩ）、タナトフォリック骨異形成症ＩＩ型（ＴＤＩＩ）、発達遅滞および黒色表皮腫を伴う重症軟骨無形成症（ＳＡＤＤＡＮ）、低軟骨形成症、頭蓋骨癒合症候群（たとえば、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、Ｃｒｏｕｚｏｎ症候群、およびＣｒｏｕｚｏｎｏｄｅｒｍｏｓｋｅｌｅｔａｌ症候群）、ならびに屈指症、高身長、および失聴症候群（ＣＡＴＳＨＬ）が挙げられる。 As used herein, the term "FGFR3-associated skeletal disease" refers to a skeletal disease caused by an abnormal increase in the activity of FGFR3, eg, due to expression of a gain-of-function mutant of FGFR3. The phrase "gain-of-function mutant of FGFR3" means that a biological activity, such as induction of downstream signaling, is reduced in the presence of an FGF ligand by the corresponding wild-type FGFR3 (e.g., a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:8). ) that have higher biological activity than that of FGFR3. FGFR3-associated skeletal disorders can include hereditary or sporadic disorders. Exemplary FGFR3-associated skeletal disorders include, but are not limited to, Achondroplasia, Thanatophoric Osteodysplasia Type I (TDI), Thanatophoric Osteodysplasia Type II (TDII), Developmental Delay and Acanthosis Acanthosis Severe achondroplasia with tumors (SADDAN), hypochondrogenesis, cranial fusion syndromes (e.g., Muenke syndrome, Crouzon syndrome, and Crouzonodermoskeleta syndrome), and quadrature, tall stature, and deafness syndrome (CATSHL). be done.
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド
いずれのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドも、本明細書で開示する方法に従って生産することができる。
sFGFR3 Polypeptides Any sFGFR3 polypeptide can be produced according to the methods disclosed herein.
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法に従って生産されるｓＦＧＦＲ３は、ＷＯ２０１４／１１１７４４、ＷＯ２０１４／１１１４６７、ＷＯ２０１６／１１０７８６、ＷＯ２０１８／００７５９７、およびＷＯ２０１９／０５７８２０で開示されているｓＦＧＦＲ３ポリペプチドから選択され、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 In some embodiments, the sFGFR3 produced according to the methods disclosed herein is from the sFGFR3 polypeptides disclosed in WO2014/111744, WO2014/111467, WO2016/110786, WO2018/007597 and Selected, each of these documents is incorporated herein by reference in its entirety.
一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１～７からなる群から選択される。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなることが好ましい。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３（配列番号５、ＰＦ－０７２５６４７２としても知られる）を含む、またはそれからなる。 In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-7. Preferably, the sFGFR3 polypeptide comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5. In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide comprises or consists of sFGFR3_Del4-D3 (SEQ ID NO: 5, also known as PF-07256472).
一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在する線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）ポリペプチド（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１３３として示される配列を有するＦＧＦＲ３ポリペプチド、配列番号８も参照されたい）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の、連続する少なくとも５０アミノ酸を含むものでよい。詳細には、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在する線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）ポリペプチドのＥＣＤの、連続する１００～３７０アミノ酸（たとえば、連続する３５０未満のアミノ酸）を含むものでよい。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在する線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１３３として示される配列を有するＦＧＦＲ３ポリペプチド、配列番号８も参照されたい）のＥＣＤの、連続する１００、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３１０、３２０、３２５、３３０、３３５、３３６、３４０、３４５、または３５０アミノ酸を含む。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在する線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１３３として示される配列を有するＦＧＦＲ３ポリペプチド、配列番号８も参照されたい）のＥＣＤの、連続する３３６アミノ酸を含むことが好ましい。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン１、２、および／または３を有するものでもよい。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン１、２、および３を有することが好ましい。
In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide is a naturally occurring fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) polypeptide (e.g., a FGFR3 polypeptide having the sequence shown as GenBank Accession No. NP_000133, also SEQ ID NO:8). see at least 50 contiguous amino acids of the extracellular domain (ECD). Specifically, sFGFR3 polypeptides are those that comprise between 100 and 370 contiguous amino acids (eg, less than 350 contiguous amino acids) of the ECD of a naturally occurring fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) polypeptide. good. In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide is a naturally occurring fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) (e.g., a FGFR3 polypeptide having the sequence shown as GenBank Accession No. NP_000133, see also SEQ ID NO:8). containing 100, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 325, 330, 335, 336, 340, 345, or 350 contiguous amino acids of the ECD. sFGFR3 polypeptides are the ECDs of naturally occurring fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) (e.g., the FGFR3 polypeptide having the sequence shown as GenBank Accession No. NP_000133; see also SEQ ID NO:8). preferably contains 336 amino acids. The sFGFR3 polypeptide may have Ig-like C2-type domains 1, 2, and/or 3 of a naturally occurring FGFR3 polypeptide. The sFGFR3 polypeptide preferably has the Ig-like
例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとしては、限定はしないが、配列番号１～８の、少なくとも、アミノ酸１～１００、１～１２５、１～１５０、１～１７５、１～２００、１～２０５、１～２１０、１～２１５、１～２２０、１～２２５、１～２３０、１～２３５、１～２４０、１～２４５、１～２５０、１～２５２、１～２５５、１～２６０、１～２６５、１～２７０、１～２７５、１～２８０、１～２８５、１～２９０、１～２９５、１～３００、または１～３０１を挙げることができる。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドには、配列番号１～８のこうしたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのいずれかに対する配列同一性が少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）であるいずれのポリペプチドも含まれうる。加えて、例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとして、限定はしないが、配列番号１～８の、少なくとも、アミノ酸１～１００、１～１２５、１～１５０、１～１７５、１～２００、１～２０５、１～２１０、１～２１５、１～２２０、１～２２５、１～２３０、１～２３５、１～２４０、１～２４５、１～２５０、１～２５５、１～２６０、１～２６５、１～２７０、１～２７５、１～２８０、１～２８５、１～２９０、１～２９５、１～３００、１～３０５、１～３１０、１～３１５、１～３２０、１～３２５、１～３３０、１～３３５、１～３３６、１～３４０、１～３４５、または１～３４８も挙げることができる。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号８の連続する１～３３６アミノ酸を含む。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドには、配列番号１～８のアミノ酸配列を有するこうしたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのいずれかに対する配列同一性が少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）であるいずれのポリペプチドも含まれうる。 Exemplary sFGFR3 polypeptides include, but are not limited to, at least amino acids 1-100, 1-125, 1-150, 1-175, 1-200, 1-205, 1-20 of SEQ ID NOs: 1-8. 210, 1-215, 1-220, 1-225, 1-230, 1-235, 1-240, 1-245, 1-250, 1-252, 1-255, 1-260, 1-265, 1-270, 1-275, 1-280, 1-285, 1-290, 1-295, 1-300, or 1-301 can be mentioned. The sFGFR3 polypeptides have at least 50% sequence identity (e.g., 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%) to any of such sFGFR3 polypeptides of SEQ ID NOs: 1-8. , 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher) may also include polypeptides of Additionally, exemplary sFGFR3 polypeptides include, but are not limited to, at least amino acids 1-100, 1-125, 1-150, 1-175, 1-200, 1-205, of SEQ ID NOS: 1-8, 1-210, 1-215, 1-220, 1-225, 1-230, 1-235, 1-240, 1-245, 1-250, 1-255, 1-260, 1-265, 1- 270, 1-275, 1-280, 1-285, 1-290, 1-295, 1-300, 1-305, 1-310, 1-315, 1-320, 1-325, 1-330, 1-335, 1-336, 1-340, 1-345, or 1-348 can also be mentioned. In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide comprises 1-336 contiguous amino acids of SEQ ID NO:8. The sFGFR3 polypeptides have at least 50% (eg, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%) sequence identity to any such sFGFR3 polypeptides having amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-8. %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or higher ) can be included.
上記ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその変異体はいずれも、Ｎ末端位に、シグナルペプチド、たとえば、配列番号２１のアミノ酸１～２２（ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳ）や配列番号４３のアミノ酸１～１９（たとえば、ＭＭＳＦＶＳＬＬＬＶＧＩＬＦＨＡＴＱＡ）を場合により含みうる。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３は、シグナルペプチドを欠いている成熟ポリペプチドであり、シグナルペプチドは、細胞からの発現および分泌の際に切断されている。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、たとえば、自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドのＴＭも欠いている場合がある。 Any of the above sFGFR3 polypeptides or variants thereof optionally include a signal peptide at the N-terminal position, e.g. can contain In some embodiments, the sFGFR3 is a mature polypeptide that lacks a signal peptide, and the signal peptide is cleaved upon expression and secretion from cells. The sFGFR3 polypeptide may also lack a transmembrane domain (TM), such as the TM of naturally occurring FGFR3 polypeptides.
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ＦＧＦＲ３ポリペプチドの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）のすべてまたは一部分も含んでいる場合がある。たとえば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩＣＤの、連続する４００アミノ酸またはより少数のアミノ酸（たとえば、連続する５～３９９の間のアミノ酸、たとえば、連続する１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５、１３、１０、５、またはより少数のアミノ酸）を有する場合がある。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチド（たとえば、配列番号８）のＩＣＤの連続する１３アミノ酸を含む。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのＩＣＤは、自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドのチロシンキナーゼドメインを欠いている場合もある。別法として、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチド（たとえば、配列番号８のＦＧＦＲ３ポリペプチド）のＩＣＤのいずれかのアミノ酸を欠いていてもよい。 The sFGFR3 polypeptide may also include all or part of the intracellular domain (ICD) of the FGFR3 polypeptide. For example, an sFGFR3 polypeptide may have 400 contiguous amino acids or fewer amino acids (eg, between 5 and 399 contiguous amino acids, such as 175, 150, 125, contiguous, etc.) of the ICD of a naturally occurring FGFR3 polypeptide. 100, 75, 50, 40, 30, 20, 15, 13, 10, 5, or fewer amino acids). In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide comprises 13 contiguous amino acids of the ICD of a naturally occurring FGFR3 polypeptide (eg, SEQ ID NO:8). An sFGFR3 polypeptide ICD may lack the tyrosine kinase domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide. Alternatively, the sFGFR3 polypeptide may lack any amino acid of the ICD of a naturally occurring FGFR3 polypeptide (eg, the FGFR3 polypeptide of SEQ ID NO:8).
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸４０１～４１３に対する配列同一性が少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％である、またはその配列である、アミノ酸配列を有するものでもよい。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸４０１～４１３を含む。 The sFGFR3 polypeptide has an amino acid sequence that is or is at least 90%, 92%, 95%, 97%, 99%, or 100% sequence identity to amino acids 401-413 of SEQ ID NO:8 Anything is fine. In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide comprises amino acids 401-413 of SEQ ID NO:8.
本明細書に記載の方法によって生産されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、長さが４７５、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３００、２５０、２００、１５０、または１００アミノ酸より短くてよく、かつ／または配列番号８のアミノ酸残基１～２８０に対する配列同一性が少なくとも８５％（たとえば、配列同一性が８６％～１００％、たとえば、配列同一性が８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）であるアミノ酸配列を有するものでよい。ｓＦＧＦＲポリペプチドは、配列番号１～７のいずれか１つ（たとえば、配列番号１、２、３、４、５、６、または７）のアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（たとえば、配列同一性が８６％～１００％、たとえば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）であるアミノ酸配列を有するものでもよい。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３は、配列番号５または６のアミノ酸配列（たとえば、配列番号５のアミノ酸配列）を有する。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、２５３位にある残基がアラニン、グリシン、プロリン、またはスレオニンである以外は、配列番号６の配列を有するものでもよい。本明細書で開示する方法によって生産することのできるｓＦＧＦＲ３ポリペプチド変異体には、配列番号１～８のいずれか１つのアミノ酸配列（たとえば、配列番号８の、少なくともアミノ酸１～２００、１～２０５、１～２１０、１～２１５、１～２２０、１～２２５、１～２３５、１～２３０、１～２４０、１～２４５、１～２５０、１～２５３、１～２５５、１～２６０、１～２６５、１～２７５、１～２８０、１～２８５、１～２９０、１～３００）または配列番号１～８のいずれか１つに対する配列同一性が少なくとも５０％（たとえば、配列同一性が５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）であり、（たとえば、シグナルペプチドおよびＴＭドメインを欠いている）ポリペプチドの断片も含まれる。加えて、例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドとして、限定はしないが、配列番号１～８の、少なくとも、アミノ酸１～１００、１～１２５、１～１５０、１～１７５、１～２００、１～２０５、１～２１０、１～２１５、１～２２０、１～２２５、１～２３０、１～２３５、１～２４０、１～２４５、１～２５０、１～２５５、１～２６０、１～２６５、１～２７０、１～２７５、１～２８０、１～２８５、１～２９０、１～２９５、１～３００、１～３０５、１～３１０、１～３１５、１～３２０、１～３２５、１～３３０、１～３３５、１～３３６、１～３４０、１～３４５、または１～３４８も挙げることができる。一部の実施形態では、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号８の連続する１～３３６アミノ酸を含む。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドには、配列番号１～８のアミノ酸配列を有するこうしたｓＦＧＦＲ３ポリペプチドのいずれかに対する配列同一性が少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）であるいずれのポリペプチドも含まれうる。 The sFGFR3 polypeptides produced by the methods described herein may be less than 475, 450, 425, 400, 375, 350, 300, 250, 200, 150, or 100 amino acids in length, and/or At least 85% sequence identity to amino acid residues 1-280 of SEQ ID NO:8 (eg, 86%-100% sequence identity, such as 86%, 87%, 88%, 89%, 90% sequence identity) %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%). The sFGFR polypeptide has at least 85% sequence identity (eg, sequence 86% to 100% identity, such as 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%). In some embodiments, the sFGFR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO:5 or 6 (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO:5). The sFGFR3 polypeptide may have the sequence of SEQ ID NO: 6, except that the residue at position 253 is alanine, glycine, proline, or threonine. sFGFR3 polypeptide variants that can be produced by the methods disclosed herein include the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-8 (eg, at least amino acids 1-200, 1-205 of SEQ ID NO:8) , 1 to 210, 1 to 215, 1 to 220, 1 to 225, 1 to 235, 1 to 230, 1 to 240, 1 to 245, 1 to 250, 1 to 253, 1 to 255, 1 to 260, 1 -265, 1-275, 1-280, 1-285, 1-290, 1-300) or at least 50% sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 1-8 (eg, sequence identity of 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher) and also include fragments of the polypeptide (eg, lacking the signal peptide and TM domain). Additionally, exemplary sFGFR3 polypeptides include, but are not limited to, at least amino acids 1-100, 1-125, 1-150, 1-175, 1-200, 1-205, of SEQ ID NOs: 1-8, 1 to 210, 1 to 215, 1 to 220, 1 to 225, 1 to 230, 1 to 235, 1 to 240, 1 to 245, 1 to 250, 1 to 255, 1 to 260, 1 to 265, 1 to 270, 1-275, 1-280, 1-285, 1-290, 1-295, 1-300, 1-305, 1-310, 1-315, 1-320, 1-325, 1-330, 1-335, 1-336, 1-340, 1-345, or 1-348 can also be mentioned. In some embodiments, the sFGFR3 polypeptide comprises 1-336 contiguous amino acids of SEQ ID NO:8. The sFGFR3 polypeptides have at least 50% (eg, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%) sequence identity to any such sFGFR3 polypeptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-8. %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or higher ) can be included.
本明細書で開示する方法に従って生産されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）への結合として特徴付けることもできる。詳細には、ＦＧＦは、維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１、配列番号２６）、維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２、配列番号２７）、維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９、配列番号２８）、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０、配列番号４０）、維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８、配列番号２９）、維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ１９、配列番号３０）、維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１、配列番号３１）、および維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ２３、配列番号４１）からなる群から選択される。結合は、約０．２ｎＭ～約２０ｎＭの平衡解離定数（Ｋｄ）（たとえば、Ｋｄが、場合に応じて、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、または約１０ｎｍとなる、約１ｎＭ～約１０ｎＭのＫｄ）を特徴とする。 sFGFR3 polypeptides produced according to the methods disclosed herein can also be characterized as binding to fibroblast growth factor (FGF). Specifically, FGFs are fibroblast growth factor 1 (FGF1, SEQ ID NO: 26), fibroblast growth factor 2 (FGF2, SEQ ID NO: 27), fibroblast growth factor 9 (FGF9, SEQ ID NO: 28), fibroblast blast growth factor 10 (FGF10, SEQ ID NO: 40), fibroblast growth factor 18 (FGF18, SEQ ID NO: 29), fibroblast growth factor 19 (FGF19, SEQ ID NO: 30), fibroblast growth factor 21 (FGF21, SEQ ID NO: 31), and fibroblast growth factor 23 (FGF23, SEQ ID NO: 41). Binding is achieved with an equilibrium dissociation constant (K d ) of about 0.2 nM to about 20 nM (eg, a K d optionally of about 1 nm, about 2 nm, about 3 nm, about 4 nm, about 5 nm, about 6 nm, about 7 nm). , about 8 nm, about 9 nm, or about 10 nm, with a K d of about 1 nM to about 10 nM).
本明細書に記載の方法は、特定のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドまたはその変異体の生産に限定されない。上で論じた例示的なｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびその変異体に加えて、配列番号１～７のアミノ酸配列を有するＦＧＦＲ３ポリペプチドと同様の結合親和性で１種または複数のＦＧＦを結合する、いずれのｓＦＧＦＲ３ポリペプチドも、本明細書で開示する方法によって生産されることが構想される。ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、たとえば、ＦＧＦＲ３転写物変異体２（受託番号ＮＭ＿０２２９６５）の断片に相当する、ｌｇＧ３ドメインのＣ末端側半分をコードするエキソン８および９と、膜貫通ドメインを含むエキソン１０を欠いている、ＦＧＦＲ３アイソフォーム２の断片（たとえば、配列番号８のアミノ酸配列の断片）でもよい。 The methods described herein are not limited to the production of specific sFGFR3 polypeptides or variants thereof. In addition to the exemplary sFGFR3 polypeptides and variants thereof discussed above, any that bind one or more FGFs with binding affinities similar to FGFR3 polypeptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-7. sFGFR3 polypeptides are also envisioned to be produced by the methods disclosed herein. The sFGFR3 polypeptide lacks exons 8 and 9, which encode the C-terminal half of the lgG3 domain, and exon 10, which contains the transmembrane domain, corresponding to, for example, a fragment of FGFR3 transcript variant 2 (accession number NM_022965). It may also be a fragment of FGFR3 isoform 2 (eg, a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO:8).
上で指摘したとおり、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、Ｎ末端位にシグナルペプチドを含む場合がある。例示的なシグナルペプチドとして、限定はしないが、配列番号２１のアミノ酸１～２２（たとえば、ＭＧＡＰＡＣＡＬＡＬＣＶＡＶＡＩＶＡＧＡＳＳ）を挙げることができる。したがって、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドには、Ｎ末端シグナルペプチドを欠いている分泌型と、Ｎ末端シグナルペプチドを含む非分泌型の両方が含まれる。たとえば、分泌ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を、Ｎ末端シグナルペプチド（たとえば、配列番号２１の配列）なしで、含みうる。別法として、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（たとえば、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド）は、配列番号２１のアミノ酸配列などのシグナルペプチドを含む。Ｎ末端シグナルペプチドの位置には、異なるｓＦＧＦＲ３ポリペプチド間でばらつきがあり、たとえば、ポリペプチドのＮ末端上の最初の５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、３０、またはより多数のアミノ酸残基が含まれうることは、当業者の認識するところとなる。当業者は、たとえば、Ｂｅｎｄｔｓｅｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（４）：７８３～７９５、２００４）に記載され、cbs.dtu.dk/services/SignalP/においてＷｅｂ上で利用可能であるものなどの、適切なコンピューターアルゴリズムによって、シグナル配列切断部位の位置を予測することができる。 As indicated above, the sFGFR3 polypeptide may include a signal peptide at the N-terminal position. Exemplary signal peptides can include, but are not limited to, amino acids 1-22 of SEQ ID NO:21 (eg, MGAPACALALCVAVAIVAGASS). Thus, sFGFR3 polypeptides include both secreted forms lacking an N-terminal signal peptide and non-secreted forms that contain an N-terminal signal peptide. For example, a secreted sFGFR3 polypeptide can comprise the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1-7 without an N-terminal signal peptide (eg, the sequence of SEQ ID NO:21). Alternatively, the sFGFR3 polypeptide (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs:1-7) includes a signal peptide such as the amino acid sequence of SEQ ID NO:21. The position of the N-terminal signal peptide varies between different sFGFR3 polypeptides, e.g., the first 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, Those skilled in the art will recognize that 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, or more amino acid residues can be included. Those skilled in the art are familiar with, for example, those described in Bendtsen et al. , the position of the signal sequence cleavage site can be predicted by suitable computer algorithms.
加えて、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、グリコシル化されていてもよい。詳細には、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを改変して、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドがグリコシル化される程度を増減することができる。１つまたは複数のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、グリコシル化部位のｓＦＧＦＲ３ポリペプチドへの付加または欠失を実現することができる。たとえば、オリゴ糖がアスパラギン残基のアミド窒素に取り付けられる、Ｎ連結グリコシル化を、配列番号５または６のアミノ酸配列およびその変異体のＡｓｎ７６、Ａｓｎ１４８、Ａｓｎ１６９、Ａｓｎ２０３、Ａｓｎ２４０、Ａｓｎ２７２、および／またはＡｓｎ２９４位において生じさせることができる。Ａｓｎ残基の１つまたは複数を置換して、グリコシル化部位を除去することもできる。たとえば、配列番号５または６のアミノ酸配列およびその変異体のＳｅｒ１０９、Ｔｈｒ１２６、Ｓｅｒ１９９、Ｓｅｒ２７４、Ｔｈｒ２８１、Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ２９９、および／またはＴｈｒ３０１位において、オリゴ糖がアミノ酸残基の酸素原子に取り付けられる、Ｏ連結グリコシル化を生じさせることもできる。加えて、ｓＦＧＦＲ３内のセリン残基においても、Ｏ連結グリコシル化を生じさせることができる。ＳｅｒまたはＴｈｒ残基の１つまたは複数を置換して、グリコシル化部位を除去することもできる。 Additionally, the sFGFR3 polypeptide may be glycosylated. Specifically, the sFGFR3 polypeptide can be modified to increase or decrease the degree to which the sFGFR3 polypeptide is glycosylated. Glycosylation sites can be added or deleted from the sFGFR3 polypeptide by altering the amino acid sequence such that one or more glycosylation sites are created or removed. For example, N-linked glycosylation, in which the oligosaccharide is attached to the amide nitrogen of an asparagine residue, can be performed using the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6 and variants thereof Asn76, Asn148, Asn169, Asn203, Asn240, Asn272, and/or Asn294. can be generated at the Glycosylation sites can also be eliminated by substituting one or more of the Asn residues. O Linked glycosylation can also occur. In addition, O-linked glycosylation can also occur at serine residues within sFGFR3. Glycosylation sites can also be eliminated by substituting one or more of the Ser or Thr residues.
ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド
本明細書に記載の方法によって産生されるｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（たとえば、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列（たとえば、配列番号１、２、３、４、５、６、７）を有するｓＦＧＦＲ３ポリペプチド、またはそれに対する配列同一性が少なくとも８５％（たとえば、それに対して、配列同一性が８６％～１００％、たとえば、配列同一性が８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）であるその変異体を、異種ポリペプチド（たとえば、結晶化可能断片領域（Ｆｃ領域、たとえば、配列番号３５および３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、たとえば、配列番号３７のアミノ酸配列を有するポリペプチド））由来の機能ドメインに融合させて、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドを得ることができる。場合により、セリンまたはグリシンリッチ配列（たとえば、ポリグリシンまたはポリグリシン／セリンリンカー、たとえば、配列番号３８および３９）などの、可動性リンカーを、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドと異種ポリペプチド（たとえば、Ｆｃ領域やＨＳＡ）の間に含めてもよい。
sFGFR3 Fusion Polypeptides sFGFR3 polypeptides produced by the methods described herein (eg, the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-7 (eg, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7), or at least 85% sequence identity thereto (e.g., 86% to 100% sequence identity thereto, such as 86%, 87%, 88% sequence identity thereto, A heterologous polypeptide (e.g. crystallizable fused to a functional domain from a fragment region (Fc region, e.g., polypeptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs:35 and 36) or human serum albumin (HSA, e.g., a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:37) Optionally, a flexible linker, such as a serine or glycine-rich sequence (e.g., polyglycine or polyglycine/serine linker, e.g., SEQ ID NOs: 38 and 39) is attached to the sFGFR3 polypeptide. and a heterologous polypeptide (eg, Fc region or HSA).
たとえば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドおよびその変異体は、Ｎ末端またはＣ末端ドメインの箇所に、たとえば免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、融合ポリペプチドになる場合がある。詳細には、有用なＦｃ領域は、いずれかの哺乳動物（たとえば、ヒト）由来の、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびこれらの種々のサブクラス（たとえば、ｌｇＧ－１、ｌｇＧ－２、ｌｇＧ－３、ｌｇＧ－４、ｌｇＡ－１、ｌｇＡ－２）を始めとする、いずれかの免疫グロブリン分子のＦｃ断片を含むものでよい。たとえば、ヒトｌｇＧ－１（配列番号３５）またはヒトｌｇＧ－１の変異体、たとえば、配列番号３５の２９７位にあるアスパラギンのアラニンでの置換を含む変異体（たとえば、配列番号３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のＦｃ断片。Ｆｃ断片には、たとえば、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびにヒンジ領域のいずれかの部分が含まれうる。ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、たとえば、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインなどの単量体Ｆｃを含むものでもよい。Ｆｃ領域は、当業者に知られている適切ないずれか１つまたは複数のアミノ酸残基において、場合によりグリコシル化されていてもよい。本明細書に記載するとおりのＦｃ断片は、本明細書に記載のＦｃ断片のいずれかを基準として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはより多数の付加、欠失、または置換を有する場合がある。 For example, the sFGFR3 polypeptides and variants thereof may be made into fusion polypeptides comprising, for example, the Fc region of an immunoglobulin at the N-terminal or C-terminal domain. In particular, useful Fc regions include IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE from any mammal (eg, human), and various subclasses thereof (eg, lgG-1, lgG-2). , lgG-3, lgG-4, lgA-1, lgA-2). For example, human lgG-1 (SEQ ID NO: 35) or a variant of human lgG-1, e.g., a variant comprising an asparagine to alanine substitution at position 297 of SEQ ID NO: 35 (e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36). Fc fragment of a polypeptide having the same structure. The Fc fragment can include, for example, the CH2 and CH3 domains of the heavy chain and any part of the hinge region. A sFGFR3 fusion polypeptide may comprise, for example, a monomeric Fc such as a CH2 or CH3 domain. The Fc region may optionally be glycosylated at any suitable amino acid residue or residues known to those of skill in the art. Fc fragments as described herein are 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 relative to any of the Fc fragments described herein. , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 or more additions, deletions or substitutions.
加えて、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、タンパク質の水溶液への溶解性および安定性を向上させる目的で、Ｎ末端またはＣ末端ドメインにおいて、他の分子にコンジュゲート化される場合もある。そのような分子の例として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰＥＧ、ＰＳＡ、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。たとえば、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドは、ヒトＨＳＡ（たとえば、配列番号３７のアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはその断片にコンジュゲート化される場合がある。 In addition, the sFGFR3 polypeptide may be conjugated to other molecules at the N-terminal or C-terminal domains for the purpose of improving aqueous solubility and stability of the protein. Examples of such molecules include human serum albumin (HSA), PEG, PSA, and bovine serum albumin (BSA). For example, the sFGFR3 polypeptide may be conjugated to human HSA (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO:37) or fragment thereof.
ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチドは、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドと異種ポリペプチド（たとえば、Ｆｃ領域やＨＳＡ）間にペプチドリンカー領域を含む場合がある。リンカー領域は、ｓＦＧＦＲ３が生物活性を有するまま、たとえば、立体障害のないままとなるのを可能にする、いずれの配列および長さのものでもよい。例示的なリンカー長さは、１～２００の間のアミノ酸残基、たとえば、１～５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、２６～３０、３１～３５、３６～４０、４１～４５、４６～５０、５１～５５、５６～６０、６１～６５、６６～７０、７１～７５、７６～８０、８１～８５、８６～９０、９１～９５、９６～１００、１０１～１１０、１１１～１２０、１２１～１３０、１３１～１４０、１４１～１５０、１５１～１６０、１６１～１７０、１７１～１８０、１８１～１９０、または１９１～２００アミノ酸残基である。たとえば、リンカーは、可動性部分、たとえば、固定された重要な二次または三次構造のない領域を含む、またはそれからなる。長さの好ましい範囲は、５～２５および１０～２０アミノ酸である。このような可動性は、アミノ酸が、小さく、またアミノ酸鎖の回転または屈曲を妨げる嵩高い側鎖をもたない場合、一般に増大する。したがって、本発明のペプチドリンカーは、小さいアミノ酸、詳細には、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、およびイソロイシンの含有量が増大していることが好ましい。 A sFGFR3 fusion polypeptide may include a peptide linker region between the sFGFR3 polypeptide and a heterologous polypeptide (eg, Fc region or HSA). The linker region may be of any sequence and length that allows the sFGFR3 to remain biologically active, eg, sterically unhindered. Exemplary linker lengths are between 1-200 amino acid residues, eg, 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36- 40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-110, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190, or 191-200 amino acid residues. For example, a linker comprises or consists of a flexible portion, eg, a region without significant secondary or tertiary structure that is fixed. Preferred ranges of length are 5-25 and 10-20 amino acids. Such flexibility is generally increased when the amino acids are small and do not have bulky side chains that prevent rotation or bending of the amino acid chain. Therefore, the peptide linkers of the invention preferably have an increased content of small amino acids, in particular glycine, alanine, serine, threonine, leucine and isoleucine.
例示的な可動性リンカーは、たとえば、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらに１００％のグリシン残基を含んでいるグリシンリッチリンカーである。たとえば、リンカーには、たとえば、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらに１００％のセリン残基を含んでいるセリンリッチリンカーも含まれうる。一部の場合では、リンカーのアミノ酸配列は、グリシンおよびセリン残基だけからなる。たとえば、リンカーは、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号３８）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）のアミノ酸配列になる場合がある。リンカーは、適切ないずれか１つまたは複数のアミノ酸残基の箇所で、場合によりグリコシル化されていてもよい。リンカーは、存在しない場合もあり、その場合、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドと異種ポリペプチド（たとえば、Ｆｃ領域やＨＳＡ）は、残基を介在させずに直接融合している。 Exemplary flexible linkers include, for example, at least 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or even 100% glycine residues. It is a glycine-rich linker. For example, the linker may include, for example, serine-rich A linker may also be included. In some cases, the amino acid sequence of the linker consists only of glycine and serine residues. For example, the linker may be the amino acid sequence GGGGAGGG (SEQ ID NO:38) or GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO:39). The linker may optionally be glycosylated at any suitable amino acid residue or residues. A linker may also be absent, in which case the sFGFR3 polypeptide and the heterologous polypeptide (eg, Fc region or HSA) are directly fused with no intervening residues.
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、患者（たとえば、胎児、新生児、小児、児童、青年、または成人などのヒト）において使用して、異常な内蔵脂肪沈着を有する患者を処置することができる。たとえば、ポリヌクレオチドは、配列番号１０～１８のいずれか１つの核酸配列、または配列番号１０～１８のいずれか１つの核酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（たとえば、配列同一性が８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）であるその変異体を有する場合がある。加えて、ポリヌクレオチドは、配列番号１４もしくは１５の核酸配列、または配列番号１４もしくは１５の核酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％（たとえば、配列同一性が８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度）であるその変異体を有する場合もある。
Polynucleotides Encoding sFGFR3 Polypeptides Polynucleotides encoding sFGFR3 polypeptides are used in patients (e.g., humans such as fetuses, neonates, children, children, adolescents, or adults) with abnormal visceral fat deposits Patients can be treated. For example, the polynucleotide has at least 85% sequence identity (e.g., 86% sequence identity, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher) Sometimes. Additionally, the polynucleotide has at least 85% sequence identity (e.g., 86%, 87%, 88%, 89% sequence identity) to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 14 or 15, or to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 14 or 15. %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher).
また、ｓＦＧＦＲ３融合ポリペプチド（たとえば、Ｆｃ領域やＨＳＡなどの異種ポリペプチドに融合したｓＦＧＦＲ３ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド、およびシグナルペプチドをもたないｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（たとえば、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド）またはシグナルペプチドを有するｓＦＧＦＲ３ポリペプチド（たとえば、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドも扱う。加えて、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する、またはポリペプチド中に存在することが知られているグリコシル化部位のいずれかを改変するために、１つまたは複数の突然変異を有する場合がある。 Also, polynucleotides encoding sFGFR3 fusion polypeptides (e.g., sFGFR3 polypeptides fused to a heterologous polypeptide such as an Fc region or HSA), and sFGFR3 polypeptides without a signal peptide (e.g., SEQ ID NOS: 1-7). Polynucleotides encoding a sFGFR3 polypeptide (eg, a polypeptide having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-7) or having a signal peptide (eg, a polypeptide having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-7) are also addressed. In addition, the polynucleotide may have one or more mutations to alter any of the glycosylation sites described herein or known to exist in polypeptides. be.
場合により、本発明のポリヌクレオチドをコドン最適化して、ポリヌクレオチドの核酸配列によってコードされているｓＦＧＦＲ３ポリペプチドを改変することなく、核酸中のコドンを変更する、詳細には、宿主生物（たとえば、ヒト）の典型的なコドン使用頻度を反映させてもよい。たとえば、コドン最適化されたポリヌクレオチド（たとえば、配列番号１４または１６の核酸配列を有するポリヌクレオチド）では、ＧＣ含量を低減することにより、かつ／または宿主細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３細胞やＣＨＯ細胞）において発現させるために、遺伝子操作を容易にすることができる。コドン最適化は、たとえば、ＪＡＶＡ Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ（www.jcat.de）やＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｔｏｏｌ（www.eu.idtdna.com/CodonOpt）などのオンラインツールを使用して、ポリヌクレオチドの核酸配列およびコドン最適化の目的である宿主生物を単に入力することにより、当業者の手で行うことができる。異なる生物のコドン使用頻度は、オンラインデータベース、たとえば、www.kazusa.or.jp/codonにおいて入手可能である。 Optionally, the polynucleotides of the invention are codon-optimized to alter codons in the nucleic acid without altering the sFGFR3 polypeptide encoded by the nucleic acid sequence of the polynucleotide, particularly a host organism (e.g., It may also reflect typical codon usage in humans. For example, in a codon-optimized polynucleotide (e.g., a polynucleotide having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 14 or 16), by reducing GC content and/or in a host cell (e.g., HEK293 or CHO cells) Genetic manipulation can be facilitated for expression. Codon optimization is performed using online tools such as the JAVA Codon Adaptation Tool (www.jcat.de) and the Integrated DNA Technologies Tool (www.eu.idtdna.com/CodonOpt) to analyze the nucleic acid sequence and codons of the polynucleotide. It can be done in the hands of those skilled in the art by simply entering the host organism for which optimization is desired. Codon usage of different organisms is available in online databases, eg, www.kazusa.or.jp/codon.
細胞培養培地
本明細書で使用する用語「培地」、「細胞培養培地」、および「培養培地」とは、成長する哺乳動物細胞を養う栄養素を含有する溶液を指す。通常、そのような溶液は、細胞が最小限の成長および／または生存のために必要とする、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、および微量元素を賄う。一実施形態では、培地は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ならびにシスチンおよび／またはＣｙｓを含む場合がある。
Cell Culture Medium As used herein, the terms “media,” “cell culture medium,” and “culture medium” refer to a solution containing nutrients that nourish growing mammalian cells. Such solutions typically provide essential and non-essential amino acids, vitamins, energy sources, lipids, and trace elements that cells require for minimal growth and/or survival. In one embodiment, the medium contains Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, and Cystine and/or Cys. may include
このような溶液は、限定はしないが、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子、特定のイオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、リン酸など）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（普通は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物（たとえば、鉄）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースもしくは他のエネルギー源を始めとする、最小限の速度より高度に成長および／または生存を増進する補充成分も含有する場合がある。一部の実施形態では、細胞生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に培地を処方することが有利である。たとえば、培地は、概ね６．９～７．３の間のｐＨ、および概ね１０００～１３００ｍＯｓｍの間の最終重量オスモル濃度に処方される場合がある。 Such solutions include, but are not limited to, hormones and/or other growth factors, specific ions (sodium, chloride, calcium, magnesium, phosphate, etc.), buffers, vitamins, nucleosides or nucleotides, trace elements ( minimal rate, including inorganic compounds that are normally present at very low final concentrations), inorganic compounds that are present at high final concentrations (e.g., iron), amino acids, lipids, and/or glucose or other energy sources It may also contain supplemental components that promote greater growth and/or survival. In some embodiments, it is advantageous to formulate the medium at optimal pH and salt concentrations for cell survival and growth. For example, the medium may be formulated to a pH of approximately between 6.9-7.3 and a final osmolality of approximately between 1000-1300 mOsm.
本明細書で開示する方法において使用することのできる既知の基本および／またはフィード細胞培養培地の例としては、ＷＯ２００６／０２６４４５、ＷＯ２００８／１０９４１０、ＷＯ２００８／０６３８９２、ＥＰ２２４３８２７、ＷＯ２００２／０６６６０３、ＷＯ２０１５／１４０７０８、およびＷＯ２００６／０５００５０で開示されているものが挙げられる。 Examples of known basal and/or feed cell culture media that can be used in the methods disclosed herein include: and those disclosed in WO2006/050050.
好ましい一実施形態では、本発明の方法において使用されるフィード培地は、４～１０ｍＭのＡｌａ、３０～６０ｍＭのＡｒｇ、５０～９０ｍＭのＡｓｎ、１０～３０ｍＭのＡｓｐ、２～４０ｍＭのＧｌｕ、２～１５ｍＭのＧｌｙ、８～２０ｍＭのＨｉｓ、２５～３２ｍＭのＩｌｅ、３５～６０ｍＭのＬｅｕ、２８～６０ｍＭのＬｙｓ、９～２５ｍＭのＭｅｔ、１０～３０ｍＭのＰｈｅ、１５～４０ｍＭのＰｒｏ、４４～８０ｍＭのＳｅｒ、２０～４５ｍＭのＴｈｒ、２～１０ｍＭのＴｒｐ、および２０～５０ｍＭのＶａｌを含む。 In one preferred embodiment, the feed medium used in the method of the invention contains 4-10 mM Ala, 30-60 mM Arg, 50-90 mM Asn, 10-30 mM Asp, 2-40 mM Glu, 2-40 mM 15 mM Gly, 8-20 mM His, 25-32 mM He, 35-60 mM Leu, 28-60 mM Lys, 9-25 mM Met, 10-30 mM Phe, 15-40 mM Pro, 44-80 mM Ser, 20-45 mM Thr, 2-10 mM Trp, and 20-50 mM Val.
一部の実施形態では、培地は、無血清培地である。一部の実施形態では、培地は、無タンパク質培地である。 In some embodiments, the medium is serum-free medium. In some embodiments, the medium is protein-free medium.
一部の実施形態では、培地は、培地の成分が既知であり、かつ制御される、化学的限定培地である。一部の実施形態では、培地は、培地の成分すべてが、既知であり、かつ／または制御されるとは限らない、複合培地である。 In some embodiments, the medium is a chemically defined medium in which the components of the medium are known and controlled. In some embodiments, the medium is a complex medium in which not all components of the medium are known and/or controlled.
哺乳動物細胞培養のための化学的に限定された成長培地は、ここ数十年にかけて、大々的に開発され、公表されている。限定培地の成分はすべて、十分に特徴付けられており、そのため、限定培地は、血清や加水分解物などの複雑な添加物を含有しない。初期の培地処方は、タンパク質生産についての懸念がほとんどまたはゼロに払拭された細胞成長および生存度の維持を可能にするために開発された。より最近では、組換えタンパク質を生産する生産性の高い細胞培養を支えるという明確な目的で、培地処方が開発されている。そのような培地は、本明細書で開示する方法における使用に好ましい。そうした培地は、高密度での細胞の成長および／または維持を支えるために、一般に、高度な量の栄養素、特にアミノ酸を含む。必要なら、こうした培地を、本明細書で開示する方法において使用するために、当業者が改良してもよい。 Chemically defined growth media for mammalian cell culture have been extensively developed and published over the last several decades. All components of defined media are well characterized, so defined media do not contain complex additives such as serum or hydrolysates. Early media formulations were developed to allow maintenance of cell growth and viability with little or no concern about protein production. More recently, media formulations have been developed with the express purpose of supporting highly productive cell cultures that produce recombinant proteins. Such media are preferred for use in the methods disclosed herein. Such media generally contain high amounts of nutrients, particularly amino acids, to support growth and/or maintenance of cells at high density. If necessary, such media may be modified by those skilled in the art for use in the methods disclosed herein.
複合培地の成分は、すべてが十分に特徴付けられているとは限らず、そのため、複合培地は、数ある中でも、単純および／または複雑な炭素供給源、単純および／または複雑な窒素供給源、血清などの、添加物を含有する場合がある。一部の実施形態では、本発明に適する複合培地は、本明細書に記載するとおりの限定培地の他の成分に加えて、加水分解物などの添加物を含有する。 The components of complex media are not all well characterized, so complex media may include, among other things, simple and/or complex carbon sources, simple and/or complex nitrogen sources, May contain additives, such as serum. In some embodiments, complex media suitable for the present invention contain additives such as hydrolysates in addition to other components of defined media as described herein.
一部の実施形態では、限定培地は、通常、水中に、既知の濃度の、おおよそ５０種の化学的存在物を含む。限定培地のあるものは、十分に特徴付けられた１種または複数のタンパク質、たとえば、インスリン、ＩＧＦ－１、トランスフェリン、ＢＳＡも含有するが、他のものは、タンパク質成分を必要とせず、そのため、無タンパク質限定培地と呼ばれる。培地の典型的な化学成分は、５つの広いカテゴリー、すなわち、アミノ酸、ビタミン、無機塩、微量元素、およびきちんと分類しきれない、種々雑多なものからなるカテゴリーに分けられる。 In some embodiments, defined media typically contain approximately 50 chemical entities at known concentrations in water. Some of the defined media also contain one or more well-characterized proteins, such as insulin, IGF-1, transferrin, BSA, while others do not require a protein component and are therefore It is called protein-free defined medium. The typical chemical constituents of media are divided into five broad categories: amino acids, vitamins, inorganic salts, trace elements, and the miscellaneous that cannot be neatly grouped.
細胞培養培地は、場合により、補充成分で補充してもよい。本明細書で使用する用語「補充成分」とは、限定はしないが、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子、特定のイオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、リン酸など）、緩衝剤、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（普通は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、および／またはグルコースもしくは他のエネルギー源を始めとする、最小限の速度より高度に成長および／または生存を増進する成分を指す。一部の実施形態では、最初の細胞培養物に補充成分が加えられる場合がある。一部の実施形態では、細胞培養の開始後に、補充成分が加えられる場合がある。 Cell culture media may optionally be supplemented with supplemental components. As used herein, the term "supplementary ingredients" includes, but is not limited to, hormones and/or other growth factors, specific ions (such as sodium, chloride, calcium, magnesium, phosphate), buffers, vitamins. , nucleosides or nucleotides, trace elements (inorganic compounds usually present at very low final concentrations), amino acids, lipids, and/or glucose or other energy sources. Or refers to a component that enhances survival. In some embodiments, supplemental components may be added to the initial cell culture. In some embodiments, supplemental components may be added after initiation of cell culture.
通常、微量元素とは、マイクロモル濃度以下のレベルで含まれる様々な無機塩を指す。たとえば、一般に含まれる微量元素は、亜鉛、セレン、銅などである。一部の実施形態では、マイクロモル濃度の鉄（第一鉄または第二鉄塩）が、微量元素として、最初の細胞培養培地に含まれる場合がある。微量元素の中では、マンガンも、ナノモル濃度からマイクロモル濃度の濃度範囲で、二価カチオン（ＭｎＣｌ２またはＭｎＳＯ４）として含まれることがよくある。それほど一般的でない数多くの微量元素が、ナノモル濃度の濃度で加えられるのが普通である。 Trace elements generally refer to various inorganic salts present at sub-micromolar levels. For example, commonly included trace elements are zinc, selenium, copper, and the like. In some embodiments, micromolar concentrations of iron (ferrous or ferric salts) may be included as a trace element in the initial cell culture medium. Among the trace elements, manganese is also frequently included as a divalent cation (MnCl 2 or MnSO 4 ) in the nanomolar to micromolar concentration range. Many less common trace elements are commonly added at nanomolar concentrations.
一部の実施形態では、本発明の方法において使用する培地は、細胞培養において、たとえば、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬ、５×１０８細胞／ｍＬなどの、高い生細胞密度を支えるのに適する培地である。一部の実施形態では、細胞培養は、ＣＨＯ細胞流加培養法である。一部の実施形態では、細胞は、１×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、１×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬ、１×１０８細胞／ｍＬ、または５×１０８細胞／ｍＬより高い生細胞密度に成長する。 In some embodiments, the medium used in the methods of the invention is, for example, 1×10 6 cells/mL, 5×10 6 cells/mL, 1×10 7 cells/mL, 5×10 Medium suitable to support high viable cell densities such as 7 cells/mL, 1×10 8 cells/mL, 5×10 8 cells/mL. In some embodiments, the cell culture is a CHO cell fed-batch method. In some embodiments, the cells are 1 x 106 cells/mL, 5 x 106 cells/mL, 1 x 107 cells/mL, 5 x 107 cells/mL, 1 x 108 cells/mL, or grow to a viable cell density greater than 5×10 8 cells/mL.
本明細書で使用する用語「生細胞密度」とは、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を指す。生細胞密度は、当業者に知られているいずれの方法によって測定してもよい。Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ（登録商標）などの自動細胞カウンターを使用して生細胞密度を測定することが好ましい。本明細書で使用する、最大細胞密度という用語は、細胞培養の間に実現される最大の細胞密度を指す。本明細書で使用する用語「細胞生存度」とは、培養下の細胞が、所与の一式の培養条件または実験バリエーションのもとで生存しうる能力を指す。細胞生存度を求めるための多くの方法の１つが本発明に含まれることは、当業者の理解するところとなる。たとえば、細胞生存度を求めるために、生きている細胞の膜を通過しないが、死んだまたは死にゆく細胞の崩壊した膜は通過しうる色素（たとえば、トリパンブルー）が使用される場合がある。 As used herein, the term "viable cell density" refers to the number of cells present in a given volume of medium. Viable cell density may be measured by any method known to those of skill in the art. Viable cell density is preferably measured using an automated cell counter such as the Bioprofile Flex®. As used herein, the term maximum cell density refers to the maximum cell density achieved during cell culture. As used herein, the term "cell viability" refers to the ability of cells in culture to survive under a given set of culture conditions or experimental variations. One skilled in the art will appreciate that one of many methods for determining cell viability is encompassed by the present invention. For example, to determine cell viability, a dye (eg, trypan blue) may be used that does not cross the membranes of living cells, but can cross the disrupted membranes of dead or dying cells.
細胞培養法
本明細書で使用する用語「培養物」および「細胞培養物」とは、細胞集団の生存および／または成長に適する条件下にある培地に懸濁している細胞集団を指す。当業者には明白となるように、一部の実施形態において、本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団と、細胞集団が懸濁している培地とを含む組合せを指す。
Cell Culture Methods As used herein, the terms "culture" and "cell culture" refer to a cell population suspended in medium under conditions suitable for the survival and/or growth of the cell population. As will be apparent to those skilled in the art, in some embodiments these terms as used herein refer to a combination comprising a cell population and medium in which the cell population is suspended.
本明細書で使用する用語「流加培養法」または「流加細胞培養法」とは、培養工程を始める時点またはその後の諸時点で、培地に追加成分が提供される、細胞の培養方法を指す。そうした、提供される成分は、培養工程の間に枯渇してしまった、細胞のための栄養成分を通常は含む。流加培養法は、通常は、ある時点で止められ、培地中の細胞および／または成分が回収され、場合により精製される。一部の実施形態では、流加培養物は、フィード培地で補充された基本培地を含む。 As used herein, the term "fed-batch method" or "fed-batch cell culture method" refers to a method of culturing cells in which additional components are provided to the medium at the beginning of the culturing process or at various times thereafter. Point. Such provided components typically include nutritional components for the cells that have been depleted during the culturing process. Fed-batch methods are usually stopped at some point and the cells and/or components in the medium are harvested and optionally purified. In some embodiments, the fed-batch culture comprises basal medium supplemented with feed medium.
細胞は、実施者が選択した好都合ないずれの体積に成長させてもよい。たとえば、体積が２～３ミリリットルから数リットルの範囲の小規模反応容器において細胞を成長させる場合がある。別法として、体積が、少なくとも５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００、１５０００、２００００、２５０００リットルもしくはより大規模、またはこれらの間のいずれかの体積からの範囲の大規模バイオリアクターにおいて細胞を成長させる場合もある。一部の実施形態では、細胞培養物の体積は、少なくとも１００Ｌ、３００Ｌ、または５００Ｌである。一部の実施形態では、細胞培養物の体積は、少なくとも３０００Ｌである。 Cells may be grown to any convenient volume selected by the practitioner. For example, cells may be grown in small-scale reaction vessels ranging in volume from a few milliliters to several liters. Alternatively, the volume ranges from at least 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000, 15,000, 20,000, 25,000 liters or greater, or any volume therebetween. Cells may also be grown in large-scale bioreactors. In some embodiments, the cell culture volume is at least 100L, 300L, or 500L. In some embodiments, the cell culture volume is at least 3000L.
一部の実施形態では、細胞は、最初の成長段階（または成長段階）の間、実施者の要望および細胞それ自体の要件に応じて、より長いまたはより短い時間成長させてもよい。一部の実施形態では、予め定めた細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を成長させる。一部の実施形態では、約１×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０６細胞／ｍＬ、約１×１０７細胞／ｍＬ、約５×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０８細胞／ｍＬ、または約５×１０８細胞／ｍＬという予め定めた細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を成長させる。一部の実施形態では、細胞が妨害されずに成長することが許されれば最終的に到達することになる最大細胞密度に対する所与の百分率である細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を成長させる。たとえば、最大細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセントの所望の生細胞密度を実現するのに十分な時間をかけて、細胞を成長させる場合がある。一部の実施形態では、細胞密度が１培養日あたり１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％を超えて増大しなくなるまで、細胞を成長させる。一部の実施形態では、細胞密度が１培養日あたり５％を超えて増大しなくなるまで、細胞を成長させる。 In some embodiments, cells may be grown for a longer or shorter period of time during the initial growth phase (or growth phase), depending on the wishes of the practitioner and the requirements of the cells themselves. In some embodiments, the cells are grown for a period of time sufficient to achieve a predetermined cell density. In some embodiments, about 1×10 6 cells/mL, about 5×10 6 cells/mL, about 1×10 7 cells/mL, about 5×10 7 cells/mL, about 1×10 8 cells/mL Cells are grown for sufficient time to achieve a predetermined cell density of mL, or approximately 5×10 8 cells/mL. In some embodiments, sufficient time is taken to achieve a cell density that is a given percentage of the maximum cell density that the cells would eventually reach if allowed to grow unhindered. to grow the cells. For example, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, or 99 percent of maximum cell density Cells may be grown long enough to achieve the desired viable cell density. In some embodiments, the cell density is 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% per culture day, Cells are grown until they no longer grow beyond 3%, 2%, or 1%. In some embodiments, cells are grown until cell density does not increase by more than 5% per culture day.
一部の実施形態では、細胞は、定められた期間にかけて成長させることが可能になる。たとえば、細胞培養物の出発濃度および細胞固有の成長速度に応じて、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日、またはより多い日数をかけて、好ましくは、４～１０日間、細胞を成長させる場合がある。本明細書で開示する方法の実施者は、タンパク質生産要件および細胞それ自体の要求に応じて、初期成長段階の継続期間を選択することができる。 In some embodiments, cells are allowed to grow for a defined period of time. For example, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, depending on the starting concentration and cell-specific growth rate of the cell culture. Cells may be grown for 16, 17, 18, 19, 20 or more days, preferably 4-10 days. The practitioner of the methods disclosed herein can choose the duration of the initial growth phase depending on the protein production requirements and the demands of the cells themselves.
細胞への酸素供給および栄養素の分散を増進するために、初期培養段階の間、細胞培養物を撹拌または振盪してもよい。本開示によれば、限定はしないが、ｐＨ、温度、酸素供給などを始めとする、バイオリアクターのある特定の内部条件を、初期成長段階の間に制御または調節することが有益となりうることは、当業者に理解される。 The cell culture may be agitated or shaken during the initial culture stage to enhance oxygenation and distribution of nutrients to the cells. According to the present disclosure, it can be beneficial to control or adjust certain internal conditions of the bioreactor, including but not limited to pH, temperature, oxygenation, etc., during the initial growth stage. , is understood by those skilled in the art.
本明細書で開示する方法では、より低い温度への温度移行が使用される。培養物の温度を移行させるとき、温度移行は、比較的段階的でよい。たとえば、温度変更を完了するのに、数時間または数日かかる場合がある。別法として、温度移行は、比較的急峻でもよい。たとえば、温度変更が数時間未満で完了する場合がある。ポリペプチドまたはタンパク質の大規模工業生産において標準的であるような、適切な生産および制御設備を考えると、温度変更が１時間未満のうちに完了する場合さえある。 The methods disclosed herein use temperature transitions to lower temperatures. When transitioning the temperature of the culture, the temperature transition may be relatively gradual. For example, it may take hours or days to complete a temperature change. Alternatively, the temperature transition may be relatively steep. For example, temperature changes may be completed in less than a few hours. Given appropriate production and control equipment, as is standard in large-scale industrial production of polypeptides or proteins, temperature changes can even be completed in less than an hour.
一部の実施形態では、細胞培養の条件を上で論じたとおりに移行させたなら、後続の生産段階の間、細胞培養物の生存および生存度のためになり、所望のポリペプチドまたはタンパク質の工業的に妥当なレベルでの発現に相応しい条件下で、細胞培養物が維持される。一部の実施形態では、細胞は、所望の細胞密度または生産力価に達するまで、後続の生産段階において維持される場合がある。一部の実施形態では、生産段階の継続期間は、２日～１０日の間、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日、好ましくは、４日～８日の間、好ましくは、６、７、または８日からなる。 In some embodiments, once the cell culture conditions have been transferred as discussed above, during subsequent stages of production, it is conducive to the viability and viability of the cell culture and the production of the desired polypeptide or protein. Cell cultures are maintained under conditions suitable for expression at industrially relevant levels. In some embodiments, cells may be maintained in subsequent production stages until a desired cell density or production titer is reached. In some embodiments, the duration of the production phase is between 2 and 10 days, i.e. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 days, preferably 4 to For 8 days, preferably consisting of 6, 7 or 8 days.
一部の実施形態では、成長段階の継続期間は、約４日であり、生産段階の継続期間は、約８日である。 In some embodiments, the duration of the growth phase is about 4 days and the duration of the production phase is about 8 days.
細胞への酸素供給および栄養素の分散を増進するために、後続の生産段階の間、細胞培養物を撹拌または振盪してもよい。本開示によれば、限定はしないが、ｐＨ、温度、酸素供給などを始めとする、バイオリアクターのある特定の内部条件を、後続の成長段階の間に制御または調節することが有益となりうることは、当業者に理解される。 The cell culture may be agitated or shaken during subsequent stages of production to enhance oxygenation and distribution of nutrients to the cells. According to the present disclosure, it may be beneficial to control or adjust certain internal conditions of the bioreactor, including but not limited to pH, temperature, oxygenation, etc., during subsequent growth stages. is understood by those skilled in the art.
細胞
細胞培養が可能であるいずれの哺乳動物細胞も、本発明に従って利用することができる。本発明に従って使用することのできる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、オランダ国ライデン）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児由来腎臓系（２９３細胞、または懸濁培養での成長用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３～２５１、１９８０）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス***腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４～６８、１９８２）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒトヘパトーマ系（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。好ましい実施形態の一部において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。好ましい実施形態の一部において、細胞は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞である。
Cells Any mammalian cells capable of cell culture can be utilized in accordance with the present invention. Non-limiting examples of mammalian cells that can be used in accordance with the present invention include the BALB/c mouse myeloma line (NSO/l, ECACC number: 85110503), human retinoblasts (PER.C6, CruCell, The Netherlands). Leiden, Japan), monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), human embryonic kidney line (293 cells, or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977), baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL10), Chinese hamster ovary cells +/- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4216, 1980), mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980), monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL70), African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1) 587), human cervical cancer cells (HeLa, ATCC CCL2), canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL34), buffalo rat liver cells (BRL3A, ATCC CRL1442), human lung cells (W138, ATCC CCL75), human liver cells ( HepG2, HB8065), mouse mammary tumors (MMT060562, ATCC CCL51), TRI cells (Mather et al., Annals NY Acad. Sci., 383:44-68, 1982), MRC5 cells, FS4 cells, and human hepatoma lines ( HepG2). In some preferred embodiments, the cells are CHO cells. In some preferred embodiments, the cells are GS-CHO cells.
タンパク質の発現
上で指摘したとおり、多くの例において、細胞は、所望の産物を高レベルで産生するように選択または操作される。多くの場合、細胞は、組換えタンパク質を高レベルで産生するように、人間の手によって、たとえば、目的のタンパク質をコードする遺伝子の導入、および／または（内在性もしくは導入のいずれであろうと）その遺伝子の発現を調節する遺伝子制御エレメントの導入により、巧みに操作される。
Protein Expression As noted above, in many instances cells are selected or engineered to produce high levels of a desired product. In many cases, the cells are man-made to produce high levels of the recombinant protein, e.g., by introduction of a gene encoding the protein of interest and/or (whether endogenous or transgenic). It is engineered by the introduction of genetic control elements that regulate the expression of that gene.
ある決まったタンパク質を発現するように操作された特定の１タイプの細胞の集団の中でさえ、細胞集団内でのばらつきが存在するため、個々のある特定の細胞が、より良好に成長し、より多くの目的タンパク質を産生する。ある特定の実施形態では、細胞を培養するために選択された特定の条件下で力強く成長する細胞株が、実施者によって経験的に選択される。一部の実施形態では、特定のタンパク質を発現するように操作された個々の細胞が、細胞成長、最終細胞密度、パーセント細胞生存度、発現されたタンパク質の力価、もしくはこれらのいずれかの組合せ、または実施者が重要と考える他のいずれかの条件に基づき、大規模生産向けに選択される。 Even within a population of one particular type of cell engineered to express a given protein, there is variability within the cell population so that individual particular cells grow better and Produce more protein of interest. In certain embodiments, cell lines that grow vigorously under the particular conditions chosen for culturing the cells are empirically selected by the practitioner. In some embodiments, individual cells engineered to express a particular protein are measured for cell growth, final cell density, percent cell viability, titer of expressed protein, or any combination thereof. , or any other criteria that the practitioner deems important.
本明細書で使用する用語「宿主細胞」とは、本明細書に記載するような目的のタンパク質を産生するように巧みに操作されている細胞を指す。タンパク質は、細胞にとって内在性である遺伝子から、または細胞に導入されている異種遺伝子から、発現される場合がある。タンパク質は、自然界に存在するものでもよいし、または、別法として、人間の手によって操作もしくは選択された配列を含んでいてもよい。 As used herein, the term "host cell" refers to a cell that has been engineered to produce a protein of interest as described herein. Proteins may be expressed from genes that are endogenous to the cell or from heterologous genes that have been introduced into the cell. A protein may be naturally occurring or, alternatively, may comprise sequences that have been engineered or selected by the hand of man.
発現されたタンパク質の単離
一般に、本発明に従って発現させたタンパク質は、単離および／または精製することが通常は望ましい。ある特定の実施形態では、発現されたタンパク質は、培地中に分泌され、したがって、細胞および他の固体が、たとえば、精製工程における最初のステップとしての遠心分離や濾過によって、除去される場合がある。
Isolation of Expressed Protein In general, it is usually desirable to isolate and/or purify proteins expressed in accordance with the present invention. In certain embodiments, the expressed protein is secreted into the medium, so cells and other solids may be removed, for example, by centrifugation or filtration as a first step in the purification process. .
発現されたタンパク質は、限定はしないが、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、もしくは較差溶解度、エタノール沈殿を始めとする標準の方法によって、および／またはタンパク質精製のための他の利用可能ないずれかの技術によって、単離および精製することができる（たとえば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（共編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ Ｐｒｅｓｓ、１９９９；ならびにＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（共編）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、第１８２巻）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい）。特に、イムノアフィニティークロマトグラフィーについて、タンパク質は、そのタンパク質に対して産生され、固定支持体に取り付けられた抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることにより、単離することができる。別法として、インフルエンザ外被配列、ポリヒスチジン、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼなどのアフィニティータグを、標準の組換え技術によってタンパク質に取り付けて、適切なアフィニティーカラムに通すことによる、容易な精製を可能にすることもできる。精製工程の間のタンパク質の分解を低減または排除するために、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤を、いずれかまたはすべての段階で加えてもよい。プロテアーゼ阻害剤は、発現されたタンパク質を単離および精製するために細胞を溶解させなければならないとき、特に便利である。 Expressed proteins are analyzed by standard methods including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, size exclusion, and hydroxyapatite chromatography), gel filtration, centrifugation, or differential solubility, ethanol precipitation. and/or by any other available technique for protein purification (e.g., Scopes, Protein Purification Principles and Practices, each of which is incorporated herein by reference). 2nd ed., Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, SJ and Hames, BD (co-eds), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; Simon, MI, Abelson, JN (co-ed.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182, Academic Press, 1997). In particular, for immunoaffinity chromatography, proteins can be isolated by binding to an affinity column containing antibodies directed against the protein and attached to a stationary support. Alternatively, affinity tags such as influenza coat sequences, polyhistidine, glutathione S-transferase, etc. can be attached to the protein by standard recombinant techniques to allow easy purification by passage over a suitable affinity column. can also To reduce or eliminate protein degradation during the purification process, protease inhibitors such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), leupeptin, pepstatin, aprotinin, etc. may be added at any or all steps. Protease inhibitors are particularly useful when cells must be lysed in order to isolate and purify the expressed protein.
厳密な精製技術は、精製されるタンパク質の特徴、タンパク質の発現元である細胞の特徴、および／または細胞を成長させた培地の組成に応じて様々となることは、当業者の認識するところとなる。 Those skilled in the art will appreciate that the exact purification technique will vary depending on the characteristics of the protein to be purified, the characteristics of the cell from which the protein is expressed, and/or the composition of the medium in which the cells were grown. Become.
タンパク質発現用遺伝子の宿主細胞への導入
一般に、細胞に導入された核酸分子が、本開示に従って発現させることが所望されるタンパク質をコードする。
Introduction of Genes for Protein Expression into Host Cells Generally, a nucleic acid molecule introduced into a cell encodes the protein desired to be expressed in accordance with this disclosure.
目的のタンパク質の発現の実現に十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するのに適する方法は、当業界で知られている。たとえば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０～６２５、１９８１；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０～４６、１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ１１７，０６０およびＥＰ１１７，０５８を参照されたい。哺乳動物細胞について、遺伝物質を哺乳動物細胞に導入する一般的な方法としては、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６～４５７、１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法またはＨａｗｌｅｙ－Ｎｅｌｓｏｎ（Ｆｏｃｕｓ １５：７３、１９９３）のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）法が挙げられる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的側面は、１９８３年８月１６日に発行されたＡｘｅｌによる米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。遺伝物質を哺乳動物細胞に導入するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９；Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７～５３７、１９９０：およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８～３５２、１９８８を参照されたい。 Suitable methods for introducing nucleic acids into mammalian host cells sufficient to effect expression of a protein of interest are known in the art. See, for example, Gethin et al., Nature, 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et al., EP 117,060 and EP 117,058, each of which is incorporated herein by reference. Please refer to For mammalian cells, common methods for introducing genetic material into mammalian cells include the calcium phosphate precipitation method of Graham and van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978) or the Hawley-Nelson (Focus 15:73) method. , 1993) lipofectamine™ (Gibco BRL) method. General aspects of mammalian cell host system transformations are described in Axel, US Pat. No. 4,399,216, issued Aug. 16, 1983. US Pat. Various techniques for introducing genetic material into mammalian cells are described in Keown et al., Methods in Enzymology, 1989; Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990; and Mansour et al., Nature, 336:348. ~352, 1988.
一部の実施形態では、導入される核酸は、裸の核酸分子の形である。たとえば、細胞に導入された核酸分子は、タンパク質および必要な遺伝子制御エレメントをコードする核酸だけからなる場合がある。別法として、タンパク質をコードする核酸（必要な調節エレメントを含む）が、プラスミドベクター内に含まれている場合もある。哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に適するベクターの非限定的な代表例としては、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６～１１４２、１９８５を参照されたい）、ｐＭＣｌｎｅｏ Ｐｏｌｙ－Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ ５１：５０３～５１２、１９８７を参照されたい）、ｐＡＣ３７３やｐＡＣ６１０などのバキュロウイルスベクター、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０、１９８７を参照されたい）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７～１９５、１９８７を参照されたい）が挙げられ、これら文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、細胞に導入される核酸分子は、ウイルスベクター内に含まれている。たとえば、タンパク質をコードする核酸が、ウイルスゲノム（または部分的なウイルスゲノム）に挿入される場合がある。タンパク質の発現を指令する調節エレメントは、ウイルスゲノムに挿入された核酸と共に含まれる（すなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結されている）場合もあり、またはウイルスゲノムそれ自体によって提供される場合もある。 In some embodiments, the introduced nucleic acid is in the form of a naked nucleic acid molecule. For example, a nucleic acid molecule introduced into a cell may consist solely of nucleic acids encoding proteins and necessary genetic control elements. Alternatively, the protein-encoding nucleic acid (including the necessary regulatory elements) may be contained within a plasmid vector. Non-limiting representative examples of vectors suitable for expression of proteins in mammalian cells include pCDNA1, pCD (see Okayama et al., Mol. Cell Biol. 5:1136-1142, 1985), pMClneo Poly-A ( Thomas et al., Cell 51:503-512, 1987), baculovirus vectors such as pAC373 and pAC610, CDM8 (see Seed, B., Nature 329:840, 1987), and pMT2PC (Kaufman et al.). , EMBO J. 6:187-195, 1987), each of which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the nucleic acid molecule to be introduced into the cell is contained within a viral vector. For example, a nucleic acid encoding a protein may be inserted into the viral genome (or partial viral genome). Regulatory elements that direct protein expression may be included with the nucleic acid inserted into the viral genome (i.e., linked to the inserted gene into the viral genome) or may be provided by the viral genome itself. There is also
裸のＤＮＡは、ＤＮＡおよびリン酸カルシウムを含有する沈殿を生成することにより、細胞に導入することができる。別法として、ＤＮＡとＤＥＡＥ－デキストランの混合物を生成し、混合物を細胞と共にインキュベートする、または細胞とＤＮＡを適切な緩衝液中で一緒にインキュベートし、細胞を（たとえば、電気穿孔法によって）高電圧電気パルスに曝すことにより、裸のＤＮＡを細胞に導入することもできる。裸のＤＮＡを細胞に導入するさらなる方法は、ＤＮＡを、カチオン脂質を含有するリポソーム懸濁液と混合することによるものである。ＤＮＡ／リポソーム複合体は、次いで、細胞と共にインキュベートされる。裸のＤＮＡは、たとえば、マイクロインジェクションによって、細胞に直接注入することもできる。 Naked DNA can be introduced into cells by producing a precipitate containing the DNA and calcium phosphate. Alternatively, a mixture of DNA and DEAE-dextran is produced and the mixture is incubated with the cells, or the cells and DNA are incubated together in a suitable buffer and the cells are subjected to high voltage (eg, by electroporation). Naked DNA can also be introduced into cells by exposure to electrical pulses. A further method of introducing naked DNA into cells is by mixing the DNA with a liposomal suspension containing cationic lipids. The DNA/liposome complex is then incubated with the cells. Naked DNA can also be injected directly into cells, eg, by microinjection.
別法として、ＤＮＡを、細胞表面受容体のリガンドに結合しているポリリシンなどのカチオンと複合体形成させることによって、裸のＤＮＡを細胞に導入することもできる（たとえば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１、１９８８；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３～９６７、１９９２；および米国特許第５，１６６，３２０号を参照されたい）。ＤＮＡ－リガンド複合体が受容体に結合することで、受容体仲介エンドサイトーシスにより、ＤＮＡの取込みが促進される。 Alternatively, naked DNA can be introduced into cells by complexing the DNA with cations such as polylysine that bind ligands for cell surface receptors (e.g., each of which is incorporated by reference in its entirety). Wu, G. and Wu, CH, J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; See Patent No. 5,166,320). Binding of the DNA-ligand complex to the receptor promotes DNA uptake by receptor-mediated endocytosis.
特定の核酸配列、たとえば、タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むウイルスベクターの使用は、核酸配列を細胞に導入するための一般的な手法である。ウイルスベクターによる細胞の感染には、細胞の大部分が核酸を受け取るという利点があり、これにより、核酸を受け取った細胞を選択する必要をなくすことができる。加えて、ウイルスベクター内に、たとえば、ウイルスベクターに含まれたｃＤＮＡによってコードされている分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞において、一般に効率よく発現される。 The use of viral vectors containing specific nucleic acid sequences, such as cDNAs encoding proteins, is a common technique for introducing nucleic acid sequences into cells. Infection of cells with a viral vector has the advantage that a majority of the cells receive the nucleic acid, thereby eliminating the need to select for those cells that receive the nucleic acid. In addition, molecules encoded within a viral vector, eg, by a cDNA contained in the viral vector, are generally efficiently expressed in cells that have taken up the viral vector nucleic acid.
欠陥レトロウイルスは、遺伝子治療目的での遺伝子移入における使用について、十分に特徴付けられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、１９９０を参照されたい）。目的のタンパク質をコードする核酸がレトロウイルスゲノムに挿入されている、組換えレトロウイルスを構築することができる。加えて、レトロウイルスゲノムの諸部分を除去して、レトロウイルスを複製不全にすることができる。次いで、このような複製不全レトロウイルスは、ビリオンに詰め込まれ、これを使用して、標準技術によるヘルパーウイルスの使用を介して、標的細胞への感染を生じさせることができる。 Defective retroviruses are well characterized for use in gene transfer for gene therapy purposes (for review see Miller, AD, Blood 76:271, 1990). A recombinant retrovirus can be constructed in which a nucleic acid encoding a protein of interest is inserted into the retroviral genome. Additionally, portions of the retroviral genome can be removed to render the retrovirus replication-defective. Such replication-deficient retroviruses are then packaged into virions, which can be used to effect infection of target cells through the use of helper viruses according to standard techniques.
アデノウイルスのゲノムは、目的のタンパク質をコードし、発現するが、正常な溶解性ウイルス生活環におけるその複製能に関しては不活性化されるように、巧みに操作することができる。たとえば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１～４３４、１９９１；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４３～１５５、１９９２を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（たとえば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適切なアデノウイルスベクターが、当業者に知られている。組換えアデノウイルスは、有効な遺伝子送達媒体にするために細胞を***させる必要がなく、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、前掲）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６４８２～６４８６、１９９２）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８１２～２８１６、１９９３）、および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２５８１～２５８４、１９９２）を始めとする、多種多様な細胞型の感染に使用することができるという点で有利である。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれている外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれないが、エピソームのままとなり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれていく状況（たとえば、レトロウイルスＤＮＡ）における挿入突然変異誘発の結果として生じかねない、潜在的な問題が回避される。そのうえ、アデノウイルスゲノムが外来ＤＮＡを運搬する能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前掲；Ｈａｊ－ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７、１９８６）。現在使用されているほとんどの複製不全アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデノウイルス遺伝物質の８０％程度を保持している。
The adenoviral genome can be engineered to encode and express a protein of interest, but be inactivated with respect to its replication capacity in the normal lytic virus life cycle. See, eg, Berkner et al., BioTechniques 6:616, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; and Rosenfeld et al., Cell 68:143-155, 1992. Suitable adenoviral vectors derived from adenoviral
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および増殖性の生活環のために、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどの別のウイルスをヘルパーウイルスとして必要とする、自然に存在する欠陥ウイルスである（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７～１２９、１９９２を参照されたい）。このウイルスは、そのＤＮＡを非***細胞に組み込むことができ、安定した組み込みを高頻度で示す、数少ないウイルスの１つでもある（たとえば、Ｆｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９～３５６、１９９２；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２～３８２８、１９８９；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３～１９７３、１９８９を参照されたい）。ＡＡＶに詰め込むことができ、組み込むことができるのは、わずか３００塩基対程度を含むベクターである。外因性ＤＮＡのための空間は、約４．５ｋｂに限定される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１～３２６０、１９８５）に記載されているものなどのＡＡＶベクターを使用して、ＤＮＡを細胞に導入することができる。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されている（たとえば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６～６４７０、１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２～２０８１、１９８５；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２～３９、１９８８；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１～６１９、１９８４；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１～３７９０、１９９３を参照されたい）。 Adeno-associated virus (AAV) is a naturally occurring defective virus that requires another virus, such as adenovirus or herpes virus, as a helper virus for an efficient replicative and productive life cycle (reviewed in See Muzyczka et al., Curr. Topics in Micro. and Immunol., 158:97-129, 1992). This virus is also one of the few viruses capable of integrating its DNA into non-dividing cells and showing a high frequency of stable integration (eg Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356, 1992; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828, 1989; and McLaughlin et al., J. Virol. AAV can pack and integrate vectors containing as little as 300 base pairs. Space for exogenous DNA is limited to about 4.5 kb. AAV vectors, such as those described by Tratschin et al. (Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, 1985), can be used to introduce DNA into cells. Various nucleic acids have been introduced into different cell types using AAV vectors (eg, Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470, 1984; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. Wondisford et al., Mol.Endocrinol.2:32-39, 1988; Tratschin et al., J. Virol.51:611-619, 1984; : 3781-3790, 1993).
核酸分子の細胞集団への導入に使用した方法の結果として、大部分の細胞が改変され、細胞によってタンパク質が効率よく発現されるとき、改変された細胞集団は、集団内の個々の細胞のさらなる分離またはサブクローニングなしで使用することができる。すなわち、細胞集団によってタンパク質が十分に産生されうるため、さらなる細胞分離が必要なく、タンパク質を生産するための細胞培養物への播種に、集団を直ちに使用することができる。別法として、タンパク質を効率よく産生する数個の細胞または単一細胞からの均一な集団を分離し、増殖させることが望ましい場合もある。 When a majority of the cells are modified as a result of the method used to introduce the nucleic acid molecule into the cell population, and the protein is efficiently expressed by the cells, the modified cell population will be further enhanced by the addition of individual cells within the population. Can be used without isolation or subcloning. That is, protein can be sufficiently produced by the cell population that it can be used immediately for seeding cell cultures to produce protein without the need for further cell separation. Alternatively, it may be desirable to isolate and grow homogeneous populations from a few cells or single cells that efficiently produce protein.
目的のタンパク質をコードする遺伝子は、場合により、１つまたは複数の調節性遺伝子制御エレメントに連結させてもよい。ある特定の実施形態では、遺伝子制御エレメントによって、タンパク質の恒常的発現が指令される。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質をコードする遺伝子の誘導発現をもたらす遺伝子制御エレメントを使用することができる。誘導性遺伝子制御エレメント（たとえば、誘導性プロモーター）を使用すると、細胞におけるタンパク質の生産のモジュレーションが可能になる。真核細胞において使用される潜在的に有用な誘導性遺伝子制御エレメントの非限定的な例として、ホルモンによって調節されるエレメント（たとえば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３～５６０７、１９９３を参照されたい）、合成リガンドによって調節されるエレメント（たとえば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１０１９～１０２４、１９９３を参照されたい）、および電離放射線によって調節されるエレメント（たとえば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０６０７～１０６１３、１９９３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０１４９～１０１５３、１９９２を参照されたい）が挙げられる。その他の当業界で知られている細胞特異的または他の調節系も、本発明に従って使用することができる。 The gene encoding the protein of interest may optionally be linked to one or more regulatory genetic control elements. In certain embodiments, a genetic control element directs constitutive expression of a protein. In certain embodiments, genetic control elements can be used that provide inducible expression of the gene encoding the protein of interest. Inducible genetic control elements (eg, inducible promoters) allow modulation of protein production in cells. Non-limiting examples of potentially useful inducible genetic control elements for use in eukaryotic cells include hormone-regulated elements (eg, Mader, S. and White, JH, Proc. Natl. USA 90:5603-5607, 1993), elements regulated by synthetic ligands (see, e.g., Spencer, DM et al., Science 262:1019-1024, 1993), and elements regulated by ionizing radiation (see, eg, Manome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10149-10153, 1992). I want to be). Other cell-specific or other regulatory systems known in the art can also be used in accordance with the present invention.
当業者なら、本発明の教示に従い、細胞に目的のタンパク質を発現させる遺伝子を導入する方法を選択し、場合により適切に改良することができる。 A person skilled in the art can select, and optionally improve appropriately, a method for introducing a gene that expresses a protein of interest into a cell according to the teachings of the present invention.
医薬組成物
本明細書に記載の方法に従って生産されたｓＦＧＦＲ３は、医薬組成物中に含めることができる。たとえば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第６３／１１５，１７０号に記載されている製剤中に、本明細書に記載の方法に従って生産されたｓＦＧＦＲ３を含めることができる。
Pharmaceutical Compositions sFGFR3 produced according to the methods described herein can be included in pharmaceutical compositions. For example, sFGFR3 produced according to the methods described herein can be included in the formulations described in US Provisional Application No. 63/115,170, which is hereby incorporated by reference in its entirety.
このような生産されたポリペプチドを、対象に投与してもよいし、または、限定はしないが、非経口（たとえば、静脈内）、皮内、皮下、経口、経鼻、気管支、眼内、経皮（局所）、経粘膜、直腸、および経膣経路を始めとする、利用可能ないずれかの経路によって送達されるように、まず製剤される場合もある。医薬組成物は、通常、哺乳動物細胞株から発現された精製ポリペプチド、送達剤（すなわち、カチオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体、界面活性剤など、上述のとおり）を、薬学的に許容できる担体との組合せとして含む。本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容できる担体」は、医薬品投与に適合した、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤などを包含する。追加の活性化合物を組成物に組み込んでもよい。 Such produced polypeptides may be administered to a subject or may be administered to a subject by, but not limited to, parenteral (eg, intravenous), intradermal, subcutaneous, oral, nasal, bronchial, intraocular, It may be initially formulated for delivery by any available route, including transdermal (topical), transmucosal, rectal, and vaginal routes. Pharmaceutical compositions typically comprise a purified polypeptide expressed from a mammalian cell line, a delivery agent (i.e., cationic polymers, peptide molecular transporters, surfactants, etc., as described above) in a pharmaceutically acceptable carrier. Including as a combination with As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" includes solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like, which are compatible with pharmaceutical administration. Additional active compounds may be incorporated into the compositions.
医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤される。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、次の成分、すなわち、滅菌希釈剤、たとえば、注射用の水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌剤、たとえば、ベンジルアルコールやメチルパラベン；酸化防止剤、たとえば、アスコルビン酸や亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、たとえば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、たとえば、酢酸、クエン酸、リン酸、ならびに浸透圧を調整するための薬剤、たとえば、塩化ナトリウムやデキストロースを含むものでよい。ｐＨは、酸または塩基、たとえば、塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入することができる。 A pharmaceutical composition is formulated to be compatible with its intended route of administration. Solutions or suspensions used for parenteral, intradermal, or subcutaneous application may contain the following components: sterile diluents such as water for injection, saline solutions, fixed oils, polyethylene glycol, glycerin, propylene glycol or other synthetic solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol and methylparaben; antioxidants such as ascorbic acid and sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; Acids, as well as agents to adjust osmotic pressure, such as sodium chloride and dextrose, may be included. pH can be adjusted with acids or bases, such as hydrochloric acid or sodium hydroxide. A parenteral preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes, or multiple dose vials made of glass or plastic.
注射用途に適する医薬組成物には、通常、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、および注射用滅菌溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与について、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、無菌にすべきであり、注射容易性（ｅａｓｙ ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性にすべきである。好ましい医薬製剤は、製造および保管条件下で安定であり、細菌や真菌などの微生物の汚染活動から保護されなければならない。一般に、妥当な担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でよい。適正な流動度は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。種々の抗菌および抗かび剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって、微生物の活動の防止を実現することができる。多くの場合では、等張剤、たとえば、糖、多価アルコール、たとえば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましくなる。組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより、注射用組成物の吸収を長引かせることができる。 Pharmaceutical compositions suitable for injectable use generally include sterile aqueous solutions (where water soluble) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. For intravenous administration, suitable carriers include saline, bacteriostatic water, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ), or phosphate buffered saline (PBS). In all cases, the composition should be sterile and should be fluid to the extent that easy syringability exists. Preferred pharmaceutical formulations should be stable under the conditions of manufacture and storage and preserved from the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. In general, suitable carriers can be solvents or dispersion media containing, for example, water, ethanol, polyols (eg, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycols, etc.), and suitable mixtures thereof. Proper fluidity can be maintained, for example, by use of a coating such as lecithin, maintenance of the required particle size in the case of dispersions, and use of surfactants. Prevention of microbial activity can be accomplished by various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, or sodium chloride in the composition. Absorption of an injectable composition can be prolonged by including in the composition an agent that delays absorption, such as aluminum monostearate and gelatin.
注射用滅菌溶液は、必要な量の精製ポリペプチドまたはタンパク質を、必要に応じて、上で列挙した成分の１種または組合せと共に、適切な溶媒に混ぜた後、濾過滅菌することによって調製できる。分散液は、一般に、塩基性分散媒および上で列挙したものからの他の必要な成分を含有する滅菌媒体に、哺乳動物細胞株から発現された精製ポリペプチドまたはタンパク質を混ぜることによって調製される。注射用滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、こうした方法では、活性成分と、所望される任意の追加成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液からもたらされる。 Sterile injectable solutions can be prepared by incorporating the purified polypeptide or protein in the required amount in an appropriate solvent with one or a combination of ingredients enumerated above, as required, followed by filtered sterilization. Dispersions are generally prepared by incorporating the purified polypeptide or protein expressed from a mammalian cell line into a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. . In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization, in which a powder of the active ingredient plus any desired additional ingredients has been previously sterile filtered. derived from its solution.
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。治療経口投与の目的では、精製ポリペプチドは、賦形剤と混ぜることができ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用される。洗口剤として使用するために、流体担体を使用して経口組成物を調製することもできる。薬学的に適合した結合剤および／または佐剤材料を、組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分、すなわち、結合剤、たとえば、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、ゼラチン；賦形剤、たとえば、デンプンやラクトース；崩壊剤、たとえば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチ；滑沢剤、たとえば、ステアリン酸マグネシウムやＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、たとえば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、たとえば、スクロースやサッカリン；または着香剤、たとえば、ハッカ、サリチル酸メチル、オレンジ風味料のいずれか、または同様の性質の化合物を含有する場合がある。経口送達用の製剤に、消化管内での安定性を向上させる、および／または吸収を高めるための薬剤を混ぜることが有利な場合もある。 Oral compositions generally include an inert diluent or an edible carrier. For the purpose of oral therapeutic administration, the purified polypeptide can be incorporated with excipients and used in the form of tablets, troches, or capsules, eg, gelatin capsules. Oral compositions can also be prepared using a fluid carrier for use as a mouthwash. Pharmaceutically compatible binding agents, and/or adjuvant materials can be included as part of the composition. Tablets, pills, capsules, lozenges and the like contain the following ingredients: binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, gelatin; excipients such as starch and lactose; disintegrants such as alginic acid; Lubricants such as magnesium stearate and Sterotes; Glidants such as colloidal silicon dioxide; Sweeteners such as sucrose and saccharin; or Flavoring agents such as mint, methyl salicylate, orange flavor. material, or compounds of similar nature. It may be advantageous to include agents for improving stability in the gastrointestinal tract and/or enhancing absorption in formulations for oral delivery.
吸入による投与については、哺乳動物細胞株から発現された精製ポリペプチドと送達剤とを含む組成物が、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などの気体を含んだ加圧容器もしくは計量分配装置から、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達されることが好ましい。本開示は、鼻腔用スプレー、吸入器、または上および／もしくは下気道への他の直接送達を使用する組成物の送達を特に企図する。インフルエンザウイルス向けのＤＮＡワクチンの鼻腔内投与によって、ＣＤ８ Ｔ細胞応答が誘導されることが示され、この経路で送達されたとき、呼吸路における少なくともいくらかの細胞によって、ＤＮＡが取り込まれうること、および本発明の送達剤によって、細胞取込みが強化されることが示唆された。本開示のある特定の実施形態によれば、哺乳動物細胞株から発現された精製ポリペプチドと送達剤とを含む組成物は、エアロゾル投与のための大きい多孔質粒子として製剤される。 For administration by inhalation, a composition comprising a purified polypeptide expressed from a mammalian cell line and a delivery agent is dispensed from a pressurized container or dispensing device containing a suitable propellant, for example a gas such as carbon dioxide. , or from a nebulizer, preferably in the form of an aerosol spray. The present disclosure specifically contemplates delivery of the compositions using nasal sprays, inhalers, or other direct delivery to the upper and/or lower respiratory tract. that intranasal administration of a DNA vaccine for influenza virus has been shown to induce a CD8 T cell response and that the DNA can be taken up by at least some cells in the respiratory tract when delivered by this route; and It was suggested that the delivery agents of the present invention enhance cellular uptake. According to certain embodiments of the present disclosure, compositions comprising purified polypeptides expressed from mammalian cell lines and delivery agents are formulated as large porous particles for aerosol administration.
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段による場合もある。経粘膜または経皮投与については、浸透する障壁に相応しい浸透剤が、製剤の中に使用される。そのような浸透剤は、当業界で一般に知られており、たとえば、経粘膜投与については、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体がこれに含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤の使用によって実現することができる。経皮投与については、精製ポリペプチドおよび送達剤が、当業界で一般に知られているような軟膏、膏薬（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに製剤される。 Systemic administration can also be by transmucosal or transdermal means. For transmucosal or transdermal administration, penetrants appropriate to the barrier to be permeated are used in the formulation. Such penetrants are generally known in the art, and include, for example, for transmucosal administration detergents, bile salts, and fusidic acid derivatives. Transmucosal administration can be accomplished through the use of intranasal sprays or suppositories. For transdermal administration, the purified polypeptide and delivery agents are formulated into ointments, salves, gels, or creams as commonly known in the art.
組成物は、直腸送達用に、（たとえば、カカオ脂や他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いた）坐剤または停留浣腸の形態に調製することもできる。 The compositions may also be prepared in the form of suppositories or retention enemas (eg, using conventional suppository bases such as cocoa butter or other glycerides) for rectal delivery.
一部の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質を身体からの急速な排出から保護する担体を用いて、植込錠およびマイクロカプセル化送達系を始めとする制御放出製剤などの組成物が調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤を調製する方法は、当業者に明白となる。材料は、たとえば、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品として入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む）を、薬学的に許容できる担体として使用することもできる。これらは、たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に知られている方法に従って調製することができる。 In some embodiments, compositions are prepared with carriers that will protect the polypeptide or protein against rapid elimination from the body, such as controlled release formulations, including implants and microencapsulated delivery systems. . Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid. Methods for preparing such formulations will be apparent to those skilled in the art. Materials are available from, for example, Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. It is also available as a commercial product from Liposomal suspensions (including liposomes targeted to infected cells with monoclonal antibodies to viral antigens) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These can be prepared according to methods known to those skilled in the art, for example, as described in US Pat. No. 4,522,811.
経口または非経口組成物を投与量単位形態として製剤することは、投与が容易になり、投与量が均一になるため、有利である。本明細書で使用する投与量単位剤形とは、処置を受ける対象のための単位式投与量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じるように算出された、予め決められた量の活性ポリペプチドまたはタンパク質を含有する。 It is advantageous to formulate oral or parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form as used herein refers to physically discrete units suited as unitary dosages for the subjects to be treated, each unit in association with a required pharmaceutical carrier. It contains a predetermined amount of active polypeptide or protein calculated to produce the desired therapeutic effect.
本方法に従って発現されたポリペプチドは、必要に応じて、様々な間隔で、異なる期間にわたって、たとえば、１週間に１回、約１週間～１０週間の間の期間、２週間～８週間の間の期間、約３週間～７週間の間の期間、約４、５、または６週間などの期間にわたって投与される場合がある。限定はしないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全般的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む、ある特定の要素が、対象を有効に処置するのに必要となる投与量およびタイミングに影響を及ぼしうることは、当業者の認識するところとなる。一般に、本明細書に記載するとおりのポリペプチドまたはタンパク質による対象の処置は、１回の処置を含む場合もあり、または、多くの場合では、一続きの処置を含む場合もある。さらに、適切な用量が、ポリペプチドまたはタンパク質の効力に応じて決まりうること、および、たとえば、予め選択された所望の応答が実現されるまで漸増用量を投与することにより、場合に応じて、特定のレシピエントに合わせて調整してよいことも理解される。特定のいずれかの動物対象のための詳細な用量レベルは、用いられる特定のポリペプチドまたはタンパク質の活性、対象の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食事、投与時期、投与経路、排出速度、薬物併用、ならびにモジュレートしようとする発現または活性の程度を含む様々な要素に応じて決まりうると理解される。 Polypeptides expressed according to this method are optionally administered at various intervals for different time periods, such as once a week, for a period of between about 1 week and 10 weeks, between 2 weeks and 8 weeks. for a period of about 3 to 7 weeks, such as about 4, 5, or 6 weeks. Certain factors, including, but not limited to, the severity of the disease or disorder, previous treatments, the general health and/or age of the subject, and other diseases present, may contribute to effective treatment of the subject. One of ordinary skill in the art will recognize that this can affect the dosage and timing required. In general, treatment of a subject with a polypeptide or protein as described herein may involve one treatment, or, in many cases, a series of treatments. In addition, appropriate doses may depend on the potency of the polypeptide or protein and, optionally, by administering increasing doses until a preselected desired response is achieved, for example, by administering specific doses. It is also understood that it may be tailored to the recipient of the Specific dosage levels for any particular animal subject include the activity of the particular polypeptide or protein employed, the subject's age, weight, general health, sex, and diet, timing of administration, route of administration, excretion. It is understood that this may depend on a variety of factors, including rate, drug combination, and degree of expression or activity to be modulated.
医薬組成物は、容器、パック、または計量分配装置に、投与についての説明書を添えて、収めることができる。 Pharmaceutical compositions can be enclosed in a container, pack, or dispensing device together with instructions for administration.
本明細書で引用する公表文献、特許、および特許出願はすべて、これによって、個々の各公表文献、特許、および特許出願について、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれることが詳細かつ個々に指摘されたかの如く、そのように参照により組み込まれる。定義される用語、用語の用法、記載される技術などがあるがそれに限らず、組み込まれる文献および同様の資料の１つまたは複数が本出願と異なるまたは矛盾する事象では、本出願に統一される。 All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated herein by reference in their entirety for all purposes with respect to each individual publication, patent and patent application. As if specifically and individually pointed out, it is so incorporated by reference. In the event that one or more of the incorporated literature and similar material differs from or conflicts with this application, including but not limited to defined terms, usage of terms, techniques described, etc., this application is unified. .
グルタミンシンテターゼ発現系を含むＣＨＯ細胞（以下ではＧＳ－ＣＨＯ）において発現させた組換え可溶性形態のＦＧＦＲ３として、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３を開発した。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３は、たとえば、軟骨無形成症の処置に有用である。流加生産の開発中に、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３が、断片化および凝集の増加を被ったこと、ならびに生産されたポリペプチドが、かなりの量の望ましくない断片および凝集体を含んでいたことが観察された。ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３断片の特徴付けを行うと、カテプシン－Ｌが介在するタンパク質分解切断が示された。 sFGFR3_Del4-D3 was developed as a recombinant soluble form of FGFR3 expressed in CHO cells containing a glutamine synthetase expression system (hereinafter GS-CHO). sFGFR3_Del4-D3 is useful, for example, in treating achondroplasia. During development of fed-batch production, it was observed that sFGFR3_Del4-D3 suffered from increased fragmentation and aggregation, and that the produced polypeptide contained significant amounts of undesirable fragments and aggregates. rice field. Characterization of the sFGFR3_Del4-D3 fragment showed cathepsin-L mediated proteolytic cleavage.
こうした発見の結果として、ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの断片化および凝集を制限しながら、適切な発現レベルを実現することになるｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３細胞培養生産工程を開発すべく、研究を実施した。 As a result of these findings, research was conducted to develop a sFGFR3_Del4-D3 cell culture production process that would achieve adequate expression levels while limiting fragmentation and aggregation of the sFGFR3 polypeptide.
（実施例１）
ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３の断片レベルを低減しながら力価を向上させる条件を決定するための小規模実験
実験目標
この実験は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３タンパク質の断片化を低減しながら生産性の向上をもたらす培養条件を特定するために実施した。実験は、ＡＭＢＲ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）自動バイオリアクターシステムを利用する高処理ＤＯＥとした。様々なレベルのｐＨ設定点、温度移行温度、供給速度、および溶存酸素（ＤＯ）を評価した。
(Example 1)
Small Scale Experiment to Determine Conditions That Increase Titer While Reducing Fragmentation Levels of sFGFR3_Del4-D3 Experimental Objectives This experiment was conducted to determine culture conditions that lead to increased productivity while reducing fragmentation of the sFGFR3_Del4-D3 protein. carried out to identify The experiment was a high-throughput DOE utilizing an AMBR (Sartorius) automated bioreactor system. Various levels of pH set points, temperature transition temperatures, feed rates, and dissolved oxygen (DO) were evaluated.
材料および方法
細胞および培地：この実験では、グルタミンシンテターゼ発現系を含み、組換えポリペプチドｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３を発現するＣＨＯ細胞（以下では、ＧＳ－ＣＨＯ、細胞株Ａ）を使用した。細胞株Ａを解凍し、振とうフラスコ中の限定細胞培養培地において培養し、増殖させた。解凍から６日で、細胞株Ａを使用して、１２のＡＭＢＲ容器（１５ｍＬの作動体積）に、生産工程のためのＮ－１接種材料として接種した。４日後、生産のために、３６のＡＭＢＲ容器（１５ｍＬの作動体積）に接種した。
Materials and Methods Cells and media: CHO cells containing the glutamine synthetase expression system and expressing the recombinant polypeptide sFGFR3_Del4-D3 (hereinafter GS-CHO, cell line A) were used in this experiment. Cell line A was thawed and grown in defined cell culture medium in shake flasks. Six days after thawing, cell line A was used to inoculate 12 AMBR vessels (15 mL working volume) as the N-1 inoculum for the production run. After 4 days, 36 AMBR vessels (15 mL working volume) were inoculated for production.
実験全体において終始、限定細胞培養培地およびフィードを使用した。 Defined cell culture media and feeds were used throughout the experiment.
ＡＭＢＲ１５マイクロバイオリアクター設備：ＡＭＢＲシステムは、小規模バイオリアクター設備である。容器には、マリン型インペラが備えられ、培養物の要求に基づいて酸素またはＣＯ２がスパージングされる。実験の間は終始、溶存酸素およびｐＨをモニターし、制御する。 AMBR15 Microbioreactor Facility: The AMBR system is a small-scale bioreactor facility. The vessel is equipped with a marine-type impeller and is sparged with oxygen or CO2 based on the needs of the culture. Dissolved oxygen and pH are monitored and controlled throughout the experiment.
実験は、ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３の力価および産物品質に関して最適な条件に注目するように設計された。この実施例において強調された主要変数は、温度移行温度であった（表１を参照されたい）。各温度移行条件について、いくつもの反応器を動かした。この実験に含めた他の変数（供給速度、ｐＨ、ＤＯ）は、力価または断片化レベルに最小限の影響しか及ぼさなかった。すべての反応器について、ｐＨ不感帯は、設定点から±０．１５単位とし、ＲＰＭは１３００とし、供給は、すべて３日目に開始した。また、すべての条件を、３６．５℃の温度で開始した。培養５日目に、すべての反応器条件を、そのそれぞれの温度に移行させた。グルコースも周期的に加えて、培養物中に２ｇ／Ｌを上回るレベルを維持した。
Experiments were designed to focus on optimal conditions with respect to sFGFR3_Del4-D3 titer and product quality. The primary variable highlighted in this example was the temperature transition temperature (see Table 1). A number of reactors were run for each temperature transition condition. Other variables included in this experiment (feed rate, pH, DO) had minimal effect on titer or fragmentation level. For all reactors, the pH deadband was ±0.15 units from the set point, the RPM was 1300, and all feeds started on
培養１０日目にサンプルを採取し、力価およびパーセント無傷（非断片化）タンパク質レベルについて分析した。 Samples were taken on day 10 of culture and analyzed for titer and percent intact (non-fragmented) protein levels.
分析の方法：
逆相ＨＰＬＣ法を使用して、組換えタンパク質ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３を検出および定量化し、タンパク質力価を決定した。
Method of analysis:
A reverse-phase HPLC method was used to detect and quantify the recombinant protein sFGFR3_Del4-D3 and to determine the protein titer.
キャピラリーゲル電気泳動（還元条件、脱Ｎグリコシル化）を使用して、還元および脱グリコシル化されたｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３ポリペプチドの純度を求めた。サンプルをＲａｐｉｇｅｓｔ（登録商標）で変性させ、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦで脱グリコシル化し、次いで、還元剤の存在下で加熱した。還元後、主要種より小さい断片化された種を、蛍光色素含有ふるい分け媒質を含んだキャピラリーにおいて電気泳動的に分離し、蛍光を使用して検出する。分離によって、分割された種の定量化が可能になる。結果は、生産されたｓＦＧＦＲ３の合計量（無傷＋断片）に対する非断片化ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの百分率を表す、無傷の種の百分率（パーセント主ピーク）として示す。 Capillary gel electrophoresis (reducing conditions, N-deglycosylation) was used to determine the purity of the reduced and deglycosylated sFGFR3_Del4-D3 polypeptide. Samples were denatured with Rapigest®, deglycosylated with peptide-N-glycosidase F, and then heated in the presence of reducing agents. After reduction, fragmented species that are smaller than the main species are separated electrophoretically in capillaries containing sieving media containing fluorescent dyes and detected using fluorescence. Separation allows quantification of the split species. Results are presented as percentage of intact species (percent major peak), which represents the percentage of unfragmented sFGFR3 polypeptide relative to the total amount of sFGFR3 produced (intact + fragments).
結果
図１および２において示されるとおり、温度移行の存在によって、力価、および非断片化ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３の百分率が増大した。加えて、温度移行のこのような効果は、温度を３４℃より３１．５℃に移行させたときに、さらに増大した。
Results As shown in FIGS. 1 and 2, the presence of a temperature shift increased the titer and percentage of unfragmented sFGFR3_Del4-D3. In addition, this effect of temperature transition was further enhanced when the temperature was transitioned from 34°C to 31.5°C.
結論
３６．５℃から３４℃または３１．５℃への温度移行は、培養物を終始３６．５℃で維持する場合に比べて力価を向上させることにおいて、線形の傾向を示した（図１）。温度を移行させることで、無傷の産物の百分率も、温度移行なしに比べて増大した（図２）。３１．５℃への移行によって、最も高い量の非断片化ｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３ポリペプチドが得られた。
Conclusions Temperature transitions from 36.5°C to 34°C or 31.5°C showed a linear trend in improving titers compared to maintaining cultures at 36.5°C throughout (Fig. 1). The temperature shift also increased the percentage of intact product compared to no temperature shift (Figure 2). A shift to 31.5° C. yielded the highest amount of unfragmented sFGFR3_Del4-D3 polypeptide.
（実施例２）
１Ｌバイオリアクターにおける、流加培養法での温度移行がｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３の力価、断片化、および凝集に与える効果
実験目標
さらなる実験を１Ｌバイオリアクターにおいて行って、実施例１において観察された効果を、より大きい規模で確認した。実験では、より低い温度への移行を用いるおよび用いない流加工程を比較した。全体としての培養性能を、細胞成長、生存度、細胞培養代謝産物（乳酸およびアンモニア）、および力価に基づいて評価した。また、産物品質に関して２つの条件を比較して、温度移行によって、ある特定の品質属性、すなわち、ポリペプチドｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３の断片化および凝集が改善されたかどうかを調べた。実施例１において確認された有利な温度移行条件（３１．５℃）を、この実験でも使用した。
(Example 2)
Effect of Fed-Batch Temperature Transitions on sFGFR3_Del4-D3 Titer, Fragmentation, and Aggregation in a 1 L Bioreactor Experimental Objective , confirmed on a larger scale. Experiments compared fed-batch processes with and without transitions to lower temperatures. Overall culture performance was assessed based on cell growth, viability, cell culture metabolites (lactate and ammonia), and titer. The two conditions were also compared with respect to product quality to determine whether temperature transition improved certain quality attributes, namely fragmentation and aggregation of the polypeptide sFGFR3_Del4-D3. The favorable temperature transition conditions (31.5° C.) identified in Example 1 were also used in this experiment.
材料および方法
細胞および培地：この実験では、グルタミンシンテターゼ発現系を含み、組換えポリペプチドｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３を発現するＣＨＯ細胞（細胞株Ｂ）を使用した。細胞株Ｂを解凍し、振とうフラスコならびに１Ｌの撹拌槽バイオリアクター中の培地において培養し、増殖させた。解凍から１７日で、細胞株Ｂを使用して、２つの１Ｌ撹拌槽バイオリアクターに接種した。
Materials and Methods Cells and media: CHO cells (cell line B) containing the glutamine synthetase expression system and expressing the recombinant polypeptide sFGFR3_Del4-D3 were used in this experiment. Cell line B was thawed and cultured and grown in medium in shake flasks as well as 1 L stirred-tank bioreactors. Seventeen days after thawing, cell line B was used to inoculate two 1 L stirred-tank bioreactors.
バイオリアクター設備：２つの１Ｌバイオリアクター（１Ｌの作動体積）に接種し、１２日間の流加工程を進めた。次の工程パラメーター、すなわち、出発温度（３６．５℃）、ｐＨ（６．９～７．２）、撹拌（２５９ＲＰＭ）、溶存酸素（４０％）、およびオーバーレイ気体（９３％の空気、７％のＣＯ２）は、２つの１Ｌバイオリアクター間で一定にした。加えて、両方の反応器に、一定量の補充フィード（半継続的に供給）ならびにグルコースを与えて、残存グルコースレベルを２．５ｇ／Ｌに保った。 Bioreactor Facility: Two 1 L bioreactors (1 L working volume) were inoculated and proceeded through a 12 day fed-batch process. The following process parameters: starting temperature (36.5° C.), pH (6.9-7.2), agitation (259 RPM), dissolved oxygen (40%), and overlay gas (93% air, 7% of CO 2 ) was kept constant between the two 1 L bioreactors. In addition, both reactors were given a constant make-up feed (semi-continuous feed) as well as glucose to keep the residual glucose level at 2.5 g/L.
２つの反応器間の唯一の違いは、一方の反応器が、培養５日目に、３１．５℃に下げる温度移行を経たことであった（表２）。温度移行値および温度移行のタイミングには、実施例１からの、力価および断片レベルの低減に関して有利な条件を反映させた。
The only difference between the two reactors was that one reactor underwent a temperature transition down to 31.5° C. on
培養７日、１０～１２日目に、条件培地サンプルを採取して、タンパク質力価を決定した。加えて、さらなる産物品質分析のために、卓上規模のアフィニティー精製法を使用して、回収物サンプル（１２日目）を調製した。次いで、サンプルを、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．２に緩衝液交換し、５～１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質力価および無傷のポリペプチドの百分率を、実施例１で開示したとおりに求めた。 On day 7, 10-12 of culture, conditioned media samples were taken to determine protein titers. In addition, a harvest sample (day 12) was prepared using a bench-scale affinity purification method for further product quality analysis. Samples were then buffer exchanged to 20 mM histidine, pH 6.2 and concentrated to 5-10 mg/mL. Protein titer and percentage of intact polypeptide were determined as disclosed in Example 1.
サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を使用して、高分子質量種（凝集したポリペプチド）の存在を明らかにした。試験サンプルを希釈し、サイズ排除カラムに注入した。高分子質量種（ＨＭＭＳ）および単量体の含有量を、すべてのタンパク質関連ピークについての合計面積に対するパーセントとして報告した。 Size exclusion HPLC (SE-HPLC) was used to reveal the presence of high molecular weight species (aggregated polypeptides). Test samples were diluted and injected onto a size exclusion column. High molecular mass species (HMMS) and monomer content were reported as percent of total area for all protein-related peaks.
結果：
実施例２の実験では、より大きい規模の設備（１Ｌ）において、３１．５℃への温度移行が、培養物を終始３６．５℃で維持する場合に比べて、１２日目における力価を向上させることにおいて、線形の傾向を示したがことが確認された（図３）。実験によって、３１．５℃への温度移行は、細胞成長、細胞生存度、ならびにアンモニアおよび乳酸の濃度に有意な影響を及ぼさなかったことが証明された。温度を３１．５℃に移行させることで、温度移行なしに比べて、無傷の産物の百分率も増大し、すなわち、パーセント断片化種も減少した（図４）。加えて、図５は、３１．５℃への温度移行によって、凝集のレベルが強力に低下することを示している。
result:
In the experiment of Example 2, in the larger scale facility (1 L), a temperature transition to 31.5°C reduced the titer at day 12 compared to maintaining the culture at 36.5°C throughout. It was confirmed that there was a linear trend in improving (Fig. 3). Experiments demonstrated that a temperature shift to 31.5° C. had no significant effect on cell growth, cell viability, and ammonia and lactate concentrations. A temperature shift to 31.5° C. also increased the percentage of intact product, ie, decreased the percent fragmented species compared to no temperature shift (FIG. 4). In addition, Figure 5 shows that a temperature transition to 31.5°C strongly reduces the level of aggregation.
（実施例３）
温度移行範囲の拡大、ならびにそれがｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３の力価、断片化、および凝集に及ぼす影響
実験目標
この実験は、温度移行温度がｓＦＧＦＲ３ポリペプチドの断片化および凝集に及ぼす影響をさらに評価するために実施した。実施例１で概略を述べた実験では、３６．５℃、３４℃、および３１．５℃が評価された。この実験では、３１．５℃と比較される温度移行範囲について拡大して、３０．５℃および２９．５℃を含めた。全体としての培養性能を、細胞成長、生存度、細胞培養代謝産物（乳酸およびアンモニア）、および力価に基づいて評価した。また、産物品質に関して条件を比較して、３１．５℃を下回るより低い温度移行によって、ある特定の品質属性、すなわち、ポリペプチドｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３の断片化および凝集がさらに改善されたかどうかを調べた。
(Example 3)
Expansion of temperature transition range and its effect on sFGFR3_Del4-D3 titer, fragmentation, and aggregation Experimental Goal This experiment was conducted to further evaluate the effect of temperature transition temperature on sFGFR3 polypeptide fragmentation and aggregation. was carried out on In the experiments outlined in Example 1, 36.5°C, 34°C, and 31.5°C were evaluated. In this experiment, the temperature transition range compared to 31.5°C was expanded to include 30.5°C and 29.5°C. Overall culture performance was assessed based on cell growth, viability, cell culture metabolites (lactate and ammonia), and titer. Conditions were also compared with respect to product quality to determine whether a lower temperature transition below 31.5° C. further improved certain quality attributes, namely fragmentation and aggregation of the polypeptide sFGFR3_Del4-D3. .
材料および方法
細胞および培地：この実験は、実施例２と同じ細胞（細胞株Ｂ）を使用して行った。細胞株Ｂを解凍し、振とうフラスコならびに１Ｌの撹拌槽バイオリアクター中の培地において培養し、増殖させた。解凍から１７日で、細胞株Ｂを使用して、３つの１Ｌ撹拌槽バイオリアクターに接種した。
Materials and Methods Cells and Media: This experiment was performed using the same cells as in Example 2 (cell line B). Cell line B was thawed and cultured and grown in medium in shake flasks as well as 1 L stirred-tank bioreactors. Seventeen days after thawing, cell line B was used to inoculate three 1 L stirred-tank bioreactors.
バイオリアクター設備：３つの１Ｌバイオリアクター（１Ｌの作動体積）に接種し、１２日間の流加工程を進めた。次の工程パラメーター、すなわち、出発温度（３６．５℃）、ｐＨ（６．９～７．２）、撹拌（２５９ＲＰＭ）、溶存酸素（４０％）、およびオーバーレイ気体（９３％の空気、７％のＣＯ２）は、３つの１Ｌバイオリアクター間で一定にした。加えて、反応器には、一定量の補充フィード（半継続的に供給）ならびにグルコースを与えて、残存グルコースレベルを２．５ｇ／Ｌに保った。 Bioreactor Facility: Three 1 L bioreactors (1 L working volume) were inoculated and proceeded through a 12 day fed-batch process. The following process parameters: starting temperature (36.5° C.), pH (6.9-7.2), agitation (259 RPM), dissolved oxygen (40%), and overlay gas (93% air, 7% of CO 2 ) was kept constant between the three 1 L bioreactors. In addition, the reactor was given a constant make-up feed (semi-continuous feed) as well as glucose to keep the residual glucose level at 2.5 g/L.
反応器間の唯一の違いは、反応器が移行を経る温度にあった。この実験については、すべての温度を培養４日目に移行させた。表３における条件を参照されたい。 The only difference between the reactors was the temperature at which the reactors went through the transition. For this experiment, all temperatures were transitioned on day 4 of culture. See conditions in Table 3.
条件培地サンプルを採取することに加えて、さらなる産物品質分析のために、実施例２で開示したとおりに回収物サンプルを精製した。タンパク質力価、無傷のポリペプチドおよびＨＭＭＳの百分率を、実施例１および２で開示したとおりに、Ｄ１２サンプルにおいて求めた。 In addition to taking conditioned media samples, harvest samples were purified as disclosed in Example 2 for further product quality analysis. Protein titer, percentage of intact polypeptide and HMMS were determined in D12 samples as disclosed in Examples 1 and 2.
結果
実験によって、２９．５℃、３０．５℃、または３１．５℃への温度移行は、細胞成長、細胞生存度、ならびにアンモニアおよび乳酸の濃度に有意な影響を及ぼさなかったことが証明された。温度移行パラメーターを２９．５℃にまで広げることで、継続的な力価増大傾向が明らかになった（図６）。しかし、温度を２９．５℃に移行させると、３０．５℃または３１．５℃への温度移行に比べて、パーセント主要種（非断片化）が減少し、ＨＭＭＳが増加した。したがって、約３０．５℃～約３１．５℃への温度移行に最適温度があると思われる（図７および８）。
Results Experiments demonstrated that temperature transitions to 29.5°C, 30.5°C, or 31.5°C had no significant effect on cell growth, cell viability, and concentrations of ammonia and lactate. rice field. Extending the temperature transition parameter to 29.5° C. revealed a continuous titer increasing trend (FIG. 6). However, temperature shift to 29.5°C decreased percent major species (unfragmented) and increased HMMS compared to temperature shifts to 30.5°C or 31.5°C. Therefore, there appears to be an optimum temperature for the temperature transition from about 30.5° C. to about 31.5° C. (FIGS. 7 and 8).
（実施例４）
５００Ｌバイオリアクターにおける、３１．５℃への温度移行がｓＦＧＦＲ３＿Ｄｅｌ４－Ｄ３の力価、断片化、および凝集に与える効果
(Example 4)
Effect of Temperature Transition to 31.5° C. on sFGFR3_Del4-D3 Titer, Fragmentation, and Aggregation in a 500 L Bioreactor
３１．５℃への温度移行をベースとした最適化された工程を５００Ｌ反応器（３５０Ｌ～４８０Ｌの培養体積）において実施して、断片化および凝集体のレベルの低下を大規模で評価した。規模拡大したバイオリアクターを、実施例２の条件Ｒ１３として略述したパラメーターに従って動かした。唯一の違いは、５日目でなく４日目に温度を３１．５℃に移行させたことであった。条件培地サンプルを採取することに加えて、さらなる産物品質分析のために、実施例２および３で開示したとおりに回収物サンプルを精製した。
An optimized process based on temperature transition to 31.5° C. was performed in a 500 L reactor (350-480 L culture volume) to evaluate the reduction of fragmentation and aggregate levels on a large scale. The scaled-up bioreactor was operated according to the parameters outlined in Example 2, condition R13. The only difference was that the temperature was shifted to 31.5° C. on day 4 instead of
タンパク質力価、無傷のポリペプチドおよびＨＭＭＳの百分率を、実施例１および２で開示したとおりに求めた。 Protein titer, percentage of intact polypeptide and HMMS were determined as disclosed in Examples 1 and 2.
結果は、以下で表４に略述する。 The results are outlined in Table 4 below.
このデータから、工程の規模を拡大することができ、大規模でも高い力価ならびに好都合な断片化およびＨＭＭＳ結果を取得できることが示された。 This data indicated that the process could be scaled up and yielded high titers and favorable fragmentation and HMMS results even at large scale.
以下の表は、上記配列番号に対応する配列を含む。 The table below contains the sequences corresponding to the above SEQ ID NOs.
Claims (32)
（ｉ）ｓＦＧＦＲ３ポリペプチドをコードする遺伝子を含んでいる哺乳動物細胞を細胞培養培地に準備して、細胞培養を開始するステップと、
（ｉｉ）細胞を、約３６．０℃～３７．０℃の間の第１の温度で培養するステップと、
（ｉｉｉ）温度を、約３０．０℃～約３２．０℃の間の第２の温度に移行させるステップと
を含む方法。 A method of producing a sFGFR3 polypeptide in cell culture, comprising:
(i) providing mammalian cells containing a gene encoding an sFGFR3 polypeptide in cell culture medium to initiate cell culture;
(ii) culturing the cells at a first temperature between about 36.0° C. and 37.0° C.;
(iii) transitioning the temperature to a second temperature between about 30.0°C and about 32.0°C.
（ｉ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドの細胞外ドメインの、連続する１００～３７０アミノ酸を含む、
（ｉｉ）自然に存在する線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）のＥＣＤの、連続する１００、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３１０、３２０、３２５、３３０、３３５、３３６、３４０、３４５、または３５０アミノ酸を含む、
（ｉｉｉ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドのシグナルペプチドおよび／または膜貫通ドメインなどの、シグナルペプチドおよび／または膜貫通ドメインを欠いている、
（ｉｖ）自然に存在するＦＧＦＲ３ポリペプチドの細胞内ドメインの、連続する１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５、１３、またはより少数のアミノ酸を含む、
（ｖ）配列番号１～８のアミノ酸配列に対する配列同一性が、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高度であるアミノ酸配列を含む、
（ｖｉ）配列番号５に対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、
（ｖｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、
（ｖｉｉｉ）配列番号１０～１８のいずれか１つの核酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％かつ最大１００％である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、および／または
（ｉｘ）配列番号１５の核酸配列に対する配列同一性が少なくとも８５％かつ最大１００％である核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、場合により、シグナルペプチドを欠いている、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 the sFGFR3 polypeptide is
(i) comprises 100 to 370 contiguous amino acids of the extracellular domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(ii) consecutive 100, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 325, 330, 335, 336, 340 ECDs of naturally occurring fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3); containing 345 or 350 amino acids,
(iii) lacks a signal peptide and/or transmembrane domain, such as the signal peptide and/or transmembrane domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(iv) comprises 175, 150, 125, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 15, 13, or fewer contiguous amino acids of the intracellular domain of a naturally occurring FGFR3 polypeptide;
(v) at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% sequence identity to the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1-8; , 96%, 97%, 98%, 99%, or higher,
(vi) an amino acid sequence having at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 98%, at least 99% sequence identity to SEQ ID NO:5;
(vii) comprising or consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:5;
(viii) encoded by a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence having at least 85% and up to 100% sequence identity to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 10-18; and/or (ix) SEQ ID NO: 15. encoded by a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence having at least 85% and up to 100% sequence identity to the nucleic acid sequence, optionally lacking a signal peptide;
A method according to any one of the preceding claims.
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