JP2022174540A - Immunological detection method and reagent for sars-cov-2 - Google Patents
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Abstract
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り 令和２年５月１３日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８２７０８１／００．ｐｄｆ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｔｓｅ．ｏｒ．ｊｐ／ｄｉｓｃ／４５４４０／１４０１２０２００５１２４１１２９０．ｐｄｆ 令和２年６月１９日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８５０４７０／００．ｐｄｆ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｔｓｅ．ｏｒ．ｊｐ／ｄｉｓｃ／４５４４０／１４０１２０２００６１９４４７７６６．ｐｄｆ 令和２年１０月３０日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８９５５２４／００．ｐｄｆ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｔｓｅ．ｏｒ．ｊｐ／ｄｉｓｃ／４５４４０／１４０１２０２０１０３０４１３０５５．ｐｄｆ 令和２年５月１３日以降に検査・研究主体に販売 令和２年６月１９日以降に検査・研究主体に販売 令和２年１０月３０日以降に検査・研究主体に販売 令和２年５月１３日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８２７０８１／００．ｐｄｆ 令和２年６月１９日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｓｓｌ４．ｅｉｒ－ｐａｒｔｓ．ｎｅｔ／ｄｏｃ／４５４４／ｔｄｎｅｔ／１８５０４７０／００．ｐｄｆ 令和２年１０月３０日にウェブサイトで公開 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｐｄｆ／２０２０１０３０＿ｎｅｗｓ．ｐｄｆApplied for application of Article 30,
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法および試薬に関する。 The present invention relates to immunological detection methods and reagents for SARS-CoV-2.
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、コロナウイルス科ベータコロナウイルス属に分類される、新型コロナウイルス感染症であるＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０００年代に中国で流行した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）と近縁ではあるが、異なるウイルスである。 SARS coronavirus-2 (SARS-CoV-2) is the causative virus of COVID-19, a novel coronavirus infection, classified in the genus Betacoronavirus of the family Coronaviridae. SARS-CoV-2 is a virus that is closely related but different from the SARS coronavirus (SARS-CoV) that causes severe acute respiratory syndrome (SARS) in China in the 2000s.
コロナウイルスはプラス鎖１本鎖のＲＮＡをウイルスゲノムとして有するエンベロープウイルスである。ウイルス粒子中のヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）は、Ｃ末端ドメイン（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ：ＣＴＤ）によってダイマーを形成し、さらにそれらが４量体を形成する。さらにヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）のＮ末端ドメイン（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｄｏｍａｉｎ：ＮＴＤ）にゲノムＲＮＡが結合し、ヌクレオキャプシドを形成すると考えられている。ヌクレオキャプシドは、脂質二重膜からなる外被（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）によって覆われた構造を持つ。外被には、Ｓタンパク質、Ｅタンパク質、Ｍタンパク質が、それらの膜貫通部位によって結合している。Ｎタンパク質は、外被を構成するＭタンパク質と結合し、被膜されたウイルス粒子を形成している。 A coronavirus is an enveloped virus having a positive single-stranded RNA as the viral genome. The nucleocapsid protein (N protein) in virus particles forms a dimer with a C-terminal domain (CTD), which in turn forms a tetramer. Furthermore, it is believed that genomic RNA binds to the N-terminal domain (NTD) of a nucleocapsid protein (N protein) to form a nucleocapsid. A nucleocapsid has a structure covered by an envelope consisting of a lipid bilayer membrane. The coat is bound by the S, E and M proteins through their transmembrane sites. The N protein binds to the M protein, which constitutes the coat, to form an enveloped virus particle.
検体中のＮタンパク質の分子性状についての報告は存在しないが、一般的には、（ｉ）ウイルス粒子のヌクレオキャプシドに含まれているものと、（ｉｉ）ウイルスが感染した細胞が、ウイルスの増殖または感染している宿主の免疫反応によって破砕されることで放出されるものが存在すると考えられる。 Although there are no reports on the molecular properties of the N protein in specimens, it is generally believed that (i) it is contained in the nucleocapsid of virus particles and (ii) cells infected with the virus are involved in the proliferation of the virus. Alternatively, it is thought that there are substances that are released by being crushed by the immune response of the infected host.
ＳＡＲＳコロナウイルスの免疫学的測定方法として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質（全長：４２２個のアミノ酸）に対する抗体を使用する方法が報告されている。 A method using an antibody against the SARS-CoV N protein (full length: 422 amino acids) has been reported as an immunoassay method for SARS coronavirus.
特許文献１には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質に対する各種モノクローナル抗体およびそれを使用する免疫測定試薬が記載されている。免疫測定試薬としては、固相抗体と標識抗体とをそれぞれ異なるエピトープを認識する２種以上の抗体を使用するサンドイッチ法の免疫測定試薬が開示されている。特許文献１には、このような免疫測定試薬に含まれる固相抗体と標識抗体のいずれについても、それぞれ２種以上のモノクローナル抗体から選択し組み合わせて使用できることが記載されている。
特許文献２には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質に特異的に結合する第１抗体および第２抗体を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質を測定する方法であって、第１抗体または第２抗体がＮタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目～４２２番目の領域（領域Ｃ）に存在するエピトープを認識する抗体であるＮタンパク質の測定方法が記載されている。特許文献２には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質（１－４２２アミノ酸）を３つの領域（領域Ａ：１－１４１番目の領域、領域Ｂ：１４２－２８２、領域Ｃ：２８３－４２２）に分割した上で、（ａ）２８３－４２２番目の領域に対する抗体と、（ｂ）１－１４１番目の領域または１４２－２８２番目の領域に対する抗体との組合せを使用することで従来よりも高い感度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質を測定できることが記載されている。
本発明の目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を免疫学的に検出できる技術を提供することである。 An object of the present invention is to provide a technology that can immunologically detect SARS-CoV-2.
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質におけるＣ末端領域中の２種のエピトープに対する特定の２種の抗体の組合せ、すなわち、（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体の組合せを使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を高感度で検出できることを見出した。本発明者らはまた、これらの抗体が他の抗体と組み合わせて使用し易く、しかも他の抗体と組み合わせて使用した場合にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のより高感度な検出を実現できる有用な抗体の組合せであることを見出した。 As a result of intensive studies, the present inventors found that a combination of two specific antibodies against two epitopes in the C-terminal region of the SARS-CoV-2 N protein, that is, (1) SARS-CoV-2 N protein and (2) a second antibody against a second epitope in the 365-419 amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein. It was found that SARS-CoV-2 can be detected with high sensitivity by doing so. The present inventors also found useful antibodies that are easy to use in combination with other antibodies and that can achieve more sensitive detection of SARS-CoV-2 when used in combination with other antibodies. found to be a combination.
特許文献１、２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｎタンパク質（全長：４２２個のアミノ酸として報告されている）に対する抗体を使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶの免疫学的検出を可能にする技術であるものの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質（全長：４１９個のアミノ酸として報告されている）に対する抗体を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を免疫学的に検出することを開示していない。また、特許文献１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と異なるウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶの免疫学的検出において標的とすべきＮタンパク質中のエピトープすら記載していない。特許文献２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶの免疫学的検出において、上記（ａ）および（ｂ）で述べたように、３つに分割された異なる領域中の２種のエピトープに対する２種の特定抗体の組合せを使用することを記載しているが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質におけるＣ末端領域中の２種のエピトープに対する２種の特定抗体の組合せがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に優れることを教示も示唆もしていない。
Although
上記知見に基づき、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法および試薬を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。 Based on the above findings, the present inventors have successfully developed an immunological detection method and reagent for SARS-CoV-2, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記（１）および（２）の抗体を使用して、被験体から採取された検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）を検出することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法：
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。
〔２〕ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における１２０～１４７番目のアミノ酸領域中の第３エピトープに対する第３抗体をさらに使用することを含む、〔１〕の方法。
〔３〕ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における４４～７８番目のアミノ酸領域中の第４エピトープに対する第４抗体をさらに使用することを含む、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２４３～２５９番目のアミノ酸領域中の第５エピトープに対する第５抗体をさらに使用することを含む、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３０６～３３９番目のアミノ酸領域中の第６エピトープに対する第６抗体をさらに使用することを含む、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記第１抗体および前記第２抗体の双方が固相抗体または標識抗体として使用される、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕前記第１抗体および前記第２抗体の双方が固相抗体として使用される場合、前記第３抗体が標識抗体として使用され、
前記第１抗体および前記第２抗体の双方が標識抗体として使用される場合、前記第３抗体が固相抗体として使用される、〔６〕の方法。
〔８〕前記第４抗体が固相抗体として使用され、かつ、前記第５抗体が標識抗体として使用されるか、または
前記第４抗体が標識抗体として使用され、かつ、前記第５抗体が固相抗体として使用される、〔６〕または〔７〕の方法。
〔９〕検出が、サンドイッチ法により行われる、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕下記（１）および（２）の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出試薬：
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。
〔１１〕前記試薬が、下記（３）～（６）からなる群より選ばれる１以上の抗体をさらに含む、〔１０〕の試薬：
（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における１２０～１４７番目のアミノ酸領域中の第３エピトープに対する第３抗体：
（４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における４４～７８番目のアミノ酸領域中の第４エピトープに対する第４抗体；
（５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２４３～２５９番目のアミノ酸領域中の第５エピトープに対する第５抗体；および
（６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３０６～３３９番目のアミノ酸領域中の第６エピトープに対する第６抗体。
〔１２〕前記第１抗体および前記第２抗体の双方が固相抗体または標識抗体である、〔１０〕または〔１１〕の試薬。
〔１３〕前記試薬が、サンドイッチ法に用いられる試薬である、〔１０〕～〔１２〕のいずれかの試薬。
〔１４〕前記試薬が固相を含む、〔１１〕～〔１３〕のいずれかの試薬。
That is, the present invention is as follows.
[1] Using the antibodies of (1) and (2) below, including detecting SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (N protein) in a specimen collected from a subject, SARS-CoV- 2 immunological detection methods:
(1) a first antibody against a first epitope in the amino acid region 260-305 in the SARS-CoV-2 N protein; and (2) a first antibody in the amino acid region 365-419 in the SARS-CoV-2 N protein. Second antibody against 2 epitopes.
[2] The method of [1], further comprising using a third antibody against a third epitope in the 120th to 147th amino acid region of the SARS-CoV-2 N protein.
[3] The method of [1] or [2], which further comprises using a fourth antibody against a fourth epitope in the 44th to 78th amino acid region of the SARS-CoV-2 N protein.
[4] The method of any one of [1] to [3], which further comprises using a fifth antibody against a fifth epitope in the 243rd to 259th amino acid region of the SARS-CoV-2 N protein.
[5] The method of any one of [1] to [4], further comprising using a sixth antibody against the sixth epitope in the 306th to 339th amino acid region of the SARS-CoV-2 N protein.
[6] The method of any one of [1] to [5], wherein both the first antibody and the second antibody are used as solid-phase antibodies or labeled antibodies.
[7] when both the first antibody and the second antibody are used as solid-phase antibodies, the third antibody is used as a labeled antibody;
The method of [6], wherein when both the first antibody and the second antibody are used as labeled antibodies, the third antibody is used as the solid-phase antibody.
[8] the fourth antibody is used as a solid phase antibody and the fifth antibody is used as a labeled antibody; or the fourth antibody is used as a labeled antibody and the fifth antibody is a solid phase antibody; The method of [6] or [7], which is used as a phase antibody.
[9] The method of any one of [1] to [8], wherein the detection is performed by a sandwich method.
[10] SARS-CoV-2 immunological detection reagent containing the following antibodies (1) and (2):
(1) a first antibody against a first epitope in the amino acid region 260-305 in the SARS-CoV-2 N protein; and (2) a first antibody in the amino acid region 365-419 in the SARS-CoV-2 N protein. Second antibody against 2 epitopes.
[11] The reagent of [10], wherein the reagent further contains one or more antibodies selected from the group consisting of (3) to (6) below:
(3) a third antibody against a third epitope in the 120th to 147th amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein:
(4) a fourth antibody against a fourth epitope in the 44th to 78th amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein;
(5) a fifth antibody against the fifth epitope in the amino acid region 243-259 in the SARS-CoV-2 N protein; and (6) a fifth antibody in the amino acid region 306-339 in the SARS-CoV-2 N protein. Sixth antibody against six epitopes.
[12] The reagent of [10] or [11], wherein both the first antibody and the second antibody are solid-phase antibodies or labeled antibodies.
[13] The reagent of any one of [10] to [12], wherein the reagent is used in a sandwich method.
[14] The reagent of any one of [11] to [13], wherein the reagent contains a solid phase.
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を高感度で検出できる。 According to the present invention, SARS-CoV-2 can be detected with high sensitivity.
本発明は、下記（１）および（２）の抗体を使用して、被験体から採取された検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を検出することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法を提供する：
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。
The present invention uses the following antibodies (1) and (2) to detect SARS-CoV-2 N protein in a sample collected from a subject, immunology of SARS-CoV-2 provides a method of detection:
(1) a first antibody against a first epitope in the amino acid region 260-305 in the SARS-CoV-2 N protein; and (2) a first antibody in the amino acid region 365-419 in the SARS-CoV-2 N protein. Second antibody against 2 epitopes.
検体が得られる被験体としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染し得る任意の被験体を利用することができる。このような被験体としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等の食肉類）、鳥類（例、ニワトリ）が挙げられる。好ましくは、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。臨床応用の観点から、被験体は、好ましくはヒトである。 Any subject that can be infected with SARS-CoV-2 can be used as a subject from which a specimen can be obtained. Examples of such subjects include mammals (e.g., primates such as humans and monkeys; rodents such as mice, rats and rabbits; ungulates such as cows, pigs, goats, horses and sheep; dogs); , meats such as cats), and birds (eg, chickens). Preferably, the subject is a mammal such as a human. From the point of view of clinical application, the subject is preferably human.
検体としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含み得る任意の生物学的試料を利用することができる。このような検体としては、例えば、唾液、痰、鼻水、スワブ（例、鼻腔スワブ、咽頭スワブ等の粘膜部位のスワブ）、洗浄液（例、鼻腔洗浄液、口腔内洗浄液、気管支洗浄液、肺洗浄液）、血液（例、全血、血漿、血清）、糞便、およびその他の検体（例、感染細胞を含む検体）が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を多量に含み得る検体を低侵襲性で迅速かつ簡便に入手する観点では、検体は、好ましくは、唾液、痰、鼻水、またはスワブである。検体は、予め処理されていてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、希釈、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、および攪拌、ならびに界面活性剤等の成分による処理に付されてもよい。 Any biological sample that can contain SARS-CoV-2 can be used as a specimen. Such specimens include, for example, saliva, sputum, nasal mucus, swabs (e.g., nasal swabs, mucosal swabs such as pharyngeal swabs), washings (e.g., nasal washings, oral washings, bronchial washings, lung washings), Blood (eg, whole blood, plasma, serum), feces, and other specimens (eg, specimens containing infected cells) are included. From the viewpoint of rapidly and conveniently obtaining a specimen that can contain a large amount of SARS-CoV-2 with minimal invasiveness, the specimen is preferably saliva, sputum, nasal mucus, or a swab. The specimen may be pre-processed. Such treatments may include, for example, centrifugation, extraction, dilution, filtration, precipitation, heating, freezing, refrigeration, and agitation, as well as treatment with ingredients such as surfactants.
本発明で検出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の株におけるＮタンパク質（すなわち、天然型または変異型Ｎタンパク質）である。このような株としては、例えば、Ｌ型およびＳ型の主要株、ならびにそれらの亜株が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、多数の株が報告されている。例えば、このような多数の株については、インフルエンザウイルス遺伝子データベースＧＩＳＡＩＤ（Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）を参照することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２については、そのゲノム配列情報が開示されている（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＮ９０８９４７を参照）。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質として、このようなゲノム配列によりコードされるＮタンパク質を参照することができる。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型Ｎタンパク質については、配列番号４のアミノ酸配列を参照してもよい。 The SARS-CoV-2 N protein detected in the present invention is the N protein in any strain of SARS-CoV-2 (ie native or mutant N protein). Such strains include, for example, the L- and S-type major strains and their substrains. Many strains have been reported for SARS-CoV-2. For example, a large number of such strains can be referred to the influenza virus gene database GISAID (Global Initiative on Sharing All Influenza Data). For SARS-CoV-2, its genome sequence information has been disclosed (eg, for SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain, see GenBank Accession Number: MN908947). SARS-CoV-2 N protein can therefore refer to the N protein encoded by such genomic sequences. Also, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may be referred to for the native N protein of SARS-CoV-2.
本発明では、下記（１）および（２）の抗体を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質が検出される：
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。
In the present invention, SARS-CoV-2 N protein is detected using the following antibodies (1) and (2):
(1) a first antibody against a first epitope in the amino acid region 260-305 in the SARS-CoV-2 N protein; and (2) a first antibody in the amino acid region 365-419 in the SARS-CoV-2 N protein. Second antibody against 2 epitopes.
第１エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中に存在する。 The first epitope is present in the 260-305 amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein.
第２エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中に存在する。 A second epitope is present in the 365-419 amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein.
一実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における１２０～１４７番目のアミノ酸領域中の第３エピトープに対する第３抗体をさらに使用することを含んでいてもよい。このような第３抗体を、上記（１）および（２）の抗体とさらに組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を高感度で検出することができる。第３エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における１２０～１４７番目のアミノ酸領域中に存在する。 In one embodiment, the method of the invention may further comprise using a third antibody against a third epitope in the amino acid region 120-147 in the SARS-CoV-2 N protein. SARS-CoV-2 N protein can be detected with high sensitivity by using such a third antibody in combination with the antibodies (1) and (2) above. A third epitope is present in the amino acid region 120-147 in the SARS-CoV-2 N protein.
別の実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における４４～７８番目のアミノ酸領域中の第４エピトープに対する第４抗体をさらに使用することを含んでいてもよい。このような第４抗体を、上記（１）および（２）の抗体とさらに組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を高感度で検出することができる。第４エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における４４～７８番目のアミノ酸領域中に存在する。 In another embodiment, the method of the invention may further comprise using a fourth antibody against a fourth epitope in the 44-78 amino acid region of the SARS-CoV-2 N protein. SARS-CoV-2 N protein can be detected with high sensitivity by using such a fourth antibody in combination with the antibodies (1) and (2) above. A fourth epitope is present in the 44-78 amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein.
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２４３～２５９番目のアミノ酸領域中の第５エピトープに対する第５抗体をさらに使用することを含んでいてもよい。このような第５抗体を、上記（１）および（２）の抗体とさらに組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を高感度で検出することができる。第５エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２４３～２５９番目のアミノ酸領域中に存在する。 In yet another embodiment, the method of the invention may further comprise using a fifth antibody against a fifth epitope in the amino acid region 243-259 in the SARS-CoV-2 N protein. SARS-CoV-2 N protein can be detected with high sensitivity by using such a fifth antibody in combination with the antibodies (1) and (2) above. A fifth epitope is present in the amino acid region 243-259 in the SARS-CoV-2 N protein.
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３０６～３３９番目のアミノ酸領域中の第６エピトープに対する第６抗体をさらに使用することを含んでいてもよい。このような第６抗体を、上記（１）および（２）の抗体とさらに組み合わせて使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を高感度で検出することができる。第６エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３０６～３３９番目のアミノ酸領域中に存在する。 In yet another embodiment, the method of the invention may further comprise using a sixth antibody against a sixth epitope in the amino acid region 306-339 in the SARS-CoV-2 N protein. SARS-CoV-2 N protein can be detected with high sensitivity by using such a sixth antibody in combination with the antibodies (1) and (2) above. A sixth epitope is present in the amino acid region 306-339 in the SARS-CoV-2 N protein.
本発明はまた、下記の抗体の組合せを使用して、被験体から採取された検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を検出することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出方法を提供する：
（１）第３抗体および第１抗体の組合せ；
（２）第３抗体および第２抗体の組合せ；
（３）第４抗体および第１抗体の組合せ；
（４）第４抗体および第２抗体の組合せ；
（５）第６抗体および第１抗体の組合せ；
（６）第５抗体および第１抗体の組合せ；または
（７）第５抗体および第３抗体の組合せ。
The present invention also provides a method for immunological detection of SARS-CoV-2, which comprises detecting SARS-CoV-2 N protein in a specimen collected from a subject using the following antibody combinations: offer:
(1) a combination of a third antibody and a first antibody;
(2) a combination of a third antibody and a second antibody;
(3) a combination of a fourth antibody and a first antibody;
(4) a combination of a fourth antibody and a second antibody;
(5) a combination of a sixth antibody and a first antibody;
(6) a combination of a fifth antibody and a first antibody; or (7) a combination of a fifth antibody and a third antibody.
抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。 Antibodies can be either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies. Antibodies can be of any isotype of immunoglobulin (eg, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY). An antibody may also be a full-length antibody. A full-length antibody refers to an antibody comprising heavy and light chains, each comprising a variable region and a constant region (eg, an antibody comprising two Fab portions and an Fc portion). Antibodies may also be antibody fragments derived from such full-length antibodies. Antibody fragments are portions of full-length antibodies, including, for example, constant region deleted antibodies (eg, F(ab') 2 , Fab', Fab, Fv). Antibodies may also be engineered antibodies such as single chain antibodies.
抗体は、従前公知の方法を使用して作製することができる。例えば、抗体は、上記のエピトープを抗原として使用することにより効率良く作製することができる。 Antibodies can be produced using previously known methods. For example, antibodies can be efficiently produced using the above epitopes as antigens.
一実施形態では、上記抗体は、固相抗体であってもよい。固相抗体とは、固相に固定された抗体をいう。固相としては、例えば、液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子、ビーズ等の固相担体）、ならびに液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、およびウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、シリカ、高分子化合物（例、ポリスチレン、プラスチック）、金属、およびカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、または磁性材料を使用することができる。抗体の固相への固定は、任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、イオン結合法、および物理的吸着法が挙げられる。共有結合法では、例えば、過ヨウ素酸、グルタルアルデヒド、マレイミド、またはＮ－ヒドロキシスクシンイミドを使用することができる。 In one embodiment, the antibody may be a solid phase antibody. A solid-phase antibody refers to an antibody immobilized on a solid phase. Solid phases include, for example, solid phases that can be suspended or dispersed in a liquid phase (e.g., solid phase carriers such as particles and beads), and solid phases that can contain or mount liquid phases (e.g., plates, membranes, supports such as test tubes, and containers such as well plates, microchannels, glass capillaries, nanopillars, and monolith columns). Solid phase materials include, for example, glass, silica, polymeric compounds (eg, polystyrene, plastics), metals, and carbon. Non-magnetic or magnetic materials can also be used as solid phase materials. Any method can be used to immobilize the antibody on the solid phase. Such methods include, for example, covalent binding methods, methods utilizing affinity substances (eg, biotin, streptavidin), ionic binding methods, and physical adsorption methods. Covalent methods can use, for example, periodic acid, glutaraldehyde, maleimide, or N-hydroxysuccinimide.
別の実施形態では、上記抗体は、標識抗体であってもよい。標識抗体とは、標識物質で標識された抗体をいう。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジンおよびビオチンのうちの一方、互いに相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸のうちの一方）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウムエステル、トリス（２，２’－ビピリジル）ルテニウム、ルミノール）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）、金属コロイド（例、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、酸化鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド）、および呈色物質（例、色素、染料及び顔料などで着色されたラテックス粒子）が挙げられる。標識物質による抗体の標識は、任意の方法により行うことができる。このような方法としては、例えば、抗体の固相への固定で述べたような方法が挙げられる。 In another embodiment, the antibody may be a labeled antibody. A labeled antibody refers to an antibody labeled with a labeling substance. Labeling substances include, for example, enzymes (e.g., peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, β-galactosidase), affinity substances (e.g., one of streptavidin and biotin, complementary sense and antisense strand nucleic acids). one of them), fluorescent substances (e.g. fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green fluorescent protein, red fluorescent protein), luminescent substances (e.g. luciferin, aequorin, acridinium ester, tris(2,2'-bipyridyl) ruthenium, luminol), radioactive substances (e.g., 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I), metal colloids (e.g., gold colloid, silver colloid, platinum colloid, iron oxide colloid, aluminum hydroxide colloid), and coloring materials (eg, latex particles colored with dyes, dyes, pigments, etc.). An antibody can be labeled with a labeling substance by any method. Such methods include, for example, the methods described for the immobilization of antibodies on solid phases.
特定の実施形態では、第１抗体および第２抗体の双方は、固相抗体または標識抗体として使用されてもよい。第１抗体および第２抗体の双方を固相抗体または標識抗体として一緒に使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質をより高感度に検出することができ、また、固相抗体および標識抗体間でしばしば見受けられる結合の競合を回避し易くなるというメリットがある。より好ましくは、第１抗体および第２抗体の双方が固相抗体として使用されてもよい。 In certain embodiments, both the first antibody and the second antibody may be used as solid phase antibodies or labeled antibodies. SARS-CoV-2 N protein can be detected with higher sensitivity by using both the first antibody and the second antibody together as a solid-phase antibody or a labeled antibody. There is an advantage that it becomes easy to avoid binding conflicts often seen between them. More preferably, both the first antibody and the second antibody may be used as solid phase antibodies.
別の特定の実施形態では、第３抗体は、標識抗体または固相抗体として使用されてもよい。より具体的には、第１抗体および第２抗体の双方が固相抗体として使用される場合、第３抗体は、標識抗体として使用されてもよい。また、第１抗体および第２抗体の双方が標識抗体として使用される場合、第３抗体は、固相抗体として使用されてもよい。第３抗体は、第１抗体または第２抗体の形態と異なる形態で使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質をより高感度に検出することができる。 In another specific embodiment, a third antibody may be used as a labeled or solid phase antibody. More specifically, when both the first and second antibodies are used as solid phase antibodies, the third antibody may be used as the labeled antibody. Also, when both the first antibody and the second antibody are used as labeled antibodies, the third antibody may be used as the solid phase antibody. The third antibody can detect SARS-CoV-2 N protein with higher sensitivity when used in a form different from that of the first or second antibody.
別の特定の実施形態では、第４抗体および第５抗体は、異なる形態で使用されてもよい。より具体的には、第４抗体が固相抗体として使用される場合、第５抗体は、標識抗体として使用されてもよい。また、第４抗体が標識抗体として使用される場合、第５抗体は、固相抗体として使用されてもよい。第４抗体および第５抗体は、異なる形態で使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質をより高感度に検出することができる。 In another specific embodiment, the fourth and fifth antibodies may be used in different forms. More specifically, when the fourth antibody is used as the solid phase antibody, the fifth antibody may be used as the labeled antibody. Also, when the fourth antibody is used as the labeled antibody, the fifth antibody may be used as the solid phase antibody. The fourth and fifth antibodies are capable of more sensitive detection of SARS-CoV-2 N protein when used in different formats.
別の特定の実施形態では、第６抗体は、標識抗体または固相抗体として使用されてもよい。 In another specific embodiment, the sixth antibody may be used as a labeled or solid phase antibody.
本発明の方法は、上記抗体を使用する免疫学的方法により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質を検出することができる。このような免疫学的方法としては、例えば、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法、ウエスタンブロット法、および免疫組織化学的染色法が挙げられる。このようなイムノアッセイは、好ましくはサンドイッチ法であってもよい。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）（例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ））、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法が挙げられ、抗原と抗体の結合を特異的検出の原理とする測定系であれば適用可能である。本発明の方法は、定性的方法または定量的方法であってもよい。 The method of the present invention can detect SARS-CoV-2 N protein by an immunological method using the antibody described above. Such immunological methods include, for example, direct competition, indirect competition, sandwich, Western blotting, and immunohistochemical staining. Such immunoassays may preferably be sandwich methods. Such immunoassays also include chemiluminescence immunoassays (CLIA) (e.g., chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA)), turbidimetric immunoassays (TIA), enzyme immunoassays (EIA) (e.g., direct competitive ELISA). , indirect competitive ELISA, and sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), latex agglutination method, fluorescence immunoassay (FIA), and immunochromatographic method. applicable if available. The method of the invention may be a qualitative method or a quantitative method.
標識の検出は、標識の種類に応じて適宜選択した手法に基づいて行うことができる。例えば、標識が酵素である場合、シグナル発生基質（例、蛍光基質、発光基質、発色基質）を用いて酵素活性を検出することにより、標識を検出することができる。標識が親和性物質である場合、親和性物質と結合する能力を有する酵素またはシグナル発生物質を用いて、親和性物質に結合した酵素またはシグナル発生物質を検出することにより、標識を検出することができる。そのような親和性物質と結合する能力を有する酵素またはシグナル発生物質は、親和性物質と結合する能力を有する物質を結合した酵素またはシグナル発生物質であってもよい。標識が蛍光物質、発光物質、または放射性物質である場合、これらの標識から発生するシグナルを検出することにより、標識を検出することができる。標識物質として呈色物質が用いられる場合、目視により標識を検出することができる。 Detection of the label can be performed based on a method appropriately selected according to the type of label. For example, when the label is an enzyme, the label can be detected by detecting enzymatic activity using a signaling substrate (eg, fluorescent substrate, luminescent substrate, chromogenic substrate). When the label is an affinity substance, the label can be detected by using an enzyme or signal-generating substance that has the ability to bind to the affinity substance and detecting the enzyme or signal-generating substance bound to the affinity substance. can. The enzyme or signal-generating substance capable of binding such an affinity substance may be an enzyme or signal-generating substance conjugated with a substance capable of binding an affinity substance. When the label is a fluorescent substance, a luminescent substance, or a radioactive substance, the label can be detected by detecting signals generated from these labels. When a coloring substance is used as the labeling substance, the labeling can be detected visually.
特定の実施形態では、本発明の方法は、サンドイッチ法により行われてもよい。サンドイッチ法は、感度や特異性に優れる。 In certain embodiments, the method of the invention may be performed by a sandwich method. The sandwich method is excellent in sensitivity and specificity.
サンドイッチ法では、Ｎタンパク質の検出は、例えば、検体を固相抗体で処理して検体中のＮタンパク質を固相抗体に結合させる工程（例、検体と固相抗体を接触させる工程）、および固相抗体に結合したＮタンパク質を標識抗体で検出する工程により行われてよい。Ｎタンパク質の検出は、固相抗体に結合していないＮタンパク質を除去する工程（例、（Ｂ／Ｆ分離または洗浄工程）をさらに含んでもよい。また、サンドイッチ法では、Ｎタンパク質の検出は、例えば、検体を標識抗体と処理して検体中のＮタンパク質を標識抗体に結合させる工程（例、検体と標識抗体を接触させる工程）、Ｎタンパク質をさらに固相抗体と処理してＮタンパク質を固相抗体に結合させる工程、および固相抗体と標識抗体に結合したＮタンパク質を標識抗体で検出する工程により行われてもよい。また、固相抗体としては、あらかじめ固相に固定された抗体でも、Ｎタンパク質の検出の際に固相に固定される抗体を用いてもよい。例えば、検体を固相に固定されうる抗体で処理して検体中のＮタンパク質を抗体に結合させる工程（例、検体と固相抗体を接触させる工程）、固相に固定されうる抗体に結合したＮタンパク質を標識抗体に結合させる工程、固相に固定されうる抗体を固相に固定する工程、および固相に固定された抗体（固相抗体）と標識抗体に結合したＮタンパク質を標識抗体で検出する工程により行われてもよい。固相に固定される抗体と固相の結合方法としては、上述した親和性物質を用いることができる。 In the sandwich method, the N protein is detected, for example, by treating the sample with a solid-phase antibody to allow the N protein in the sample to bind to the solid-phase antibody (e.g., contacting the sample with the solid-phase antibody); This may be done by detecting the N protein bound to the phase antibody with a labeled antibody. Detection of N protein may further comprise a step of removing N protein that is not bound to the solid phase antibody (e.g., (B/F separation or washing step).Also, in the sandwich method, detection of N protein may include: For example, a step of treating the specimen with a labeled antibody to bind the N protein in the specimen to the labeled antibody (e.g., a step of contacting the specimen with the labeled antibody), further treating the N protein with a solid-phase antibody, and immobilizing the N protein. It may be carried out by the step of binding to the phase antibody, and the step of detecting the N protein bound to the solid phase antibody and the labeled antibody with the labeled antibody.In addition, the solid phase antibody may be an antibody that has been immobilized on a solid phase in advance. Alternatively, an antibody immobilized on a solid phase may be used in the detection of the N protein.For example, a step of treating the sample with an antibody that can be immobilized on a solid phase to allow the N protein in the sample to bind to the antibody (e.g., contacting the specimen with the solid phase antibody), binding the N protein bound to the antibody that can be immobilized on the solid phase to the labeled antibody, immobilizing the antibody that can be immobilized on the solid phase to the solid phase, and It can also be carried out by the step of detecting the N protein bound to the immobilized antibody (solid phase antibody) and the labeled antibody with the labeled antibody.As the binding method of the antibody immobilized on the solid phase and the solid phase, the above-mentioned affinity can be used.
別の特定の実施形態では、本発明の方法は、イムノクロマトグラフィー法により行われてもよい。イムノクロマトグラフィー法は、迅速かつ簡便な定性的方法として好ましい。イムノクロマトグラフィー法及びそれに用いられる器具は周知である。このような器具としては、例えば、固相抗体を含むゾーン、および標識抗体を含むゾーンを備えるイムノクロマトグラフィーカートリッジ（展開液の貯蔵部をさらに備えていてもよい）を用いることができる。以下、イムノクロマトグラフィーの好適な一例として、ラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフィー法および器具の概要を、図１を参照して説明する。 In another particular embodiment, the methods of the invention may be performed by immunochromatographic methods. Immunochromatographic methods are preferred as rapid and convenient qualitative methods. Immunochromatographic methods and equipment used therefor are well known. As such a device, for example, an immunochromatography cartridge (which may further include a developing solution reservoir) comprising a zone containing a solid-phase antibody and a zone containing a labeled antibody can be used. As a preferred example of immunochromatography, an outline of a lateral flow immunochromatography method and apparatus will be described below with reference to FIG.
図１において、イムノクロマトグラフィーカートリッジ１は、ニトロセルロース膜のような多孔性素材からなるマトリクス２上に、捕捉用抗体をライン状に固相化した検出ゾーン３（固相抗体を含むゾーン）と、その上流側（後述する展開液が流れる方向における上流）に、検出用抗体を担持した標識試薬ゾーン４（標識抗体を含むゾーン）を備える。マトリクス２は通常、帯状に形成される。標識試薬ゾーン４は、標識抗体を点着した多孔性のパッドにより構成される。マトリクスの上流端には、展開液を貯蔵した展開液槽５が設けられている。さらに、検出ゾーンの下流に、展開液が流れたことを確認するための展開確認部６と、さらにその下流に、展開液を吸収するための多孔性の吸収パッドが設けられた展開液吸収ゾーン７が設けられている。展開確認部には、抗標識抗体などの、展開液とともに流れる、検出物質（Ｎタンパク質）以外の物質と親和性を有するプローブ（例えば抗体）がライン上に固相化されている。さらに、標識が酵素である場合は、標識試薬ゾーンよりも上流に、当該酵素の基質を担持した基質ゾーン８が設けられる。展開液槽５の近傍に、例えば、突起を有する押し込み部など、それを押し込むことで展開液槽を破ることができる部材（記載なし）を予め設けることで、容易に展開液槽を破って展開液をマトリックスに供給することができる。また、破れた展開液槽中の展開液がマトリックス上端に供給されやすいように、展開液槽とマトリックス上端を覆うように展開液パッド９が設けられてもよい。
In FIG. 1, an
使用時には、検体を標識試薬ゾーン４に添加し、展開液槽５を破って展開液をマトリックスの上端部に接触させて供給する。マトリクスに供給された展開液は、マトリックスの毛管現象により下流に向かって流れる。展開液が基質ゾーンを通過する際に基質が展開液中に溶出され、基質を含む展開液が流れる。続いて、展開液が標識試薬ゾーンを通過する際に、標識抗体と検体とが展開液中に溶出され、基質、標識抗体及び検体を含む展開液が流れる。検体中にＮタンパク質が含まれる場合には、Ｎタンパク質と標識抗体が、抗原抗体反応により結合する。これらが検出ゾーンに到達すると、検出ゾーンにおいて、固相抗体とＮタンパク質とが抗原抗体反応により結合する。その結果、Ｎタンパク質を介して標識抗体が検出ゾーンに固定される。こうして検出ゾーンに固定された標識を検出することにより、Ｎタンパク質が検出されることになる。検体中にＮタンパク質が含まれない場合には、固相化抗体には何も結合されないので、標識抗体は検出ゾーンに固定されない。展開液はさらに下流にながれ、展開液確認部に到達すると、例えば、展開液確認部に抗標識抗体が固定化されている場合は、Ｎタンパク質に結合しなかった標識抗体と抗標識抗体とが抗原抗体反応により結合し、その結果、標識抗体が展開液確認部に固定される。展開液確認部に標識が検出された場合には、展開液が展開確認部まで正しく展開されたことを確認できる。展開液は、さらにその下流の吸収パッドに吸収される。
At the time of use, the sample is added to the
本発明はまた、下記（１）および（２）の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出試薬を提供する：
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。
The present invention also provides an immunological detection reagent for SARS-CoV-2, comprising the following antibodies (1) and (2):
(1) a first antibody against a first epitope in the amino acid region 260-305 in the SARS-CoV-2 N protein; and (2) a first antibody in the amino acid region 365-419 in the SARS-CoV-2 N protein. Second antibody against 2 epitopes.
本発明の試薬は、下記（３）～（６）からなる群より選ばれる１以上の抗体をさらに含んでいてもよい：
（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における１２０～１４７番目のアミノ酸領域中の第３エピトープに対する第３抗体：
（４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における４４～７８番目のアミノ酸領域中の第４エピトープに対する第４抗体；
（５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２４３～２５９番目のアミノ酸領域中の第５エピトープに対する第５抗体；および
（６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３０６～３３９番目のアミノ酸領域中の第６エピトープに対する第６抗体。
The reagent of the present invention may further contain one or more antibodies selected from the group consisting of (3) to (6) below:
(3) A third antibody against a third epitope in the 120th to 147th amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein:
(4) a fourth antibody against a fourth epitope in the 44th to 78th amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein;
(5) a fifth antibody against the fifth epitope in the amino acid region 243-259 in the SARS-CoV-2 N protein; and (6) a fifth antibody in the amino acid region 306-339 in the SARS-CoV-2 N protein. Sixth antibody against six epitopes.
本発明はまた、下記の抗体の組合せを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫学的検出試薬を提供する：
（１）第３抗体および第１抗体の組合せ；
（２）第３抗体および第２抗体の組合せ；
（３）第４抗体および第１抗体の組合せ；
（４）第４抗体および第２抗体の組合せ；
（５）第６抗体および第１抗体の組合せ；
（６）第５抗体および第１抗体の組合せ；または
（７）第５抗体および第３抗体の組合せ。
The present invention also provides an immunological detection reagent for SARS-CoV-2 comprising a combination of the following antibodies:
(1) a combination of a third antibody and a first antibody;
(2) a combination of a third antibody and a second antibody;
(3) a combination of a fourth antibody and a first antibody;
(4) a combination of a fourth antibody and a second antibody;
(5) a combination of a sixth antibody and a first antibody;
(6) a combination of a fifth antibody and a first antibody; or (7) a combination of a fifth antibody and a third antibody.
本発明の試薬における上記抗体等の用語の詳細（例えば、定義、例示、および好ましい例示）は、本発明の方法において述べたものと同様である。 The details (eg, definitions, examples, and preferred examples) of the terms such as the antibody in the reagent of the present invention are the same as those described in the method of the present invention.
本発明の試薬は、上記第１抗体および第２抗体を、混合物の形態（例、同一容器に収容された形態、または同一固相に固定された固相抗体の形態）、または互いに隔離された形態（例、異なる容器に収容された形態）で含むことができる。本発明の試薬はまた、上記第１抗体および第２抗体に加えて、下記（３）～（６）からなる群より選ばれる１以上の抗体を、混合物の形態、または互いに隔離された形態で含むことができる。本発明の試薬はキットの形態で提供されてもよい。本発明の試薬はまた、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、上記抗体の全部がデバイス中に収容されてもよい。あるいは、上記抗体の一部がデバイス中に収容され、残りのものがデバイス中に収容されていなくてもよい（例、異なる容器に収容された形態）。この場合、デバイス中に収容されない抗体は、検出の際に、デバイス中に注入されてもよい。 The reagent of the present invention contains the first antibody and the second antibody in the form of a mixture (e.g., in the form housed in the same container, or in the form of solid-phase antibodies immobilized on the same solid phase), or isolated from each other. It can be included in form (eg, contained in different containers). In addition to the first antibody and the second antibody, the reagent of the present invention also contains one or more antibodies selected from the group consisting of the following (3) to (6) in the form of a mixture or in a form isolated from each other can contain. The reagent of the present invention may be provided in the form of a kit. The reagent of the present invention may also be provided in the form of a device. Specifically, all of the above antibodies may be housed in the device. Alternatively, some of the antibodies may be contained within the device and the remainder not contained within the device (eg, in different containerized forms). In this case, antibodies not housed in the device may be injected into the device upon detection.
本発明の試薬は、固相抗体および／または標識抗体を含むことができる。あるいは、このような試薬は、固相抗体および／または標識抗体を含まない場合、固相および／または標識物質を含んでいてもよい。固相および標識物質は、上述したものと同様である。標識物質が酵素である場合、本発明の試薬は、酵素の基質（例、検出シグナルを発生する基質、または酵素により検出シグナルを発生する生成物に変換される基質、あるいは、検出シグナルを発生する基質、または酵素により検出シグナルを発生する生成物に変換される基質を利用する他の酵素反応と共役し得る反応における基質）を含んでいてもよい。 Reagents of the invention can include solid-phase antibodies and/or labeled antibodies. Alternatively, such reagents may contain a solid phase and/or labeling substance if they do not contain a solid phase antibody and/or a labeled antibody. The solid phase and labeling substance are the same as those described above. When the labeling substance is an enzyme, the reagent of the present invention is an enzyme substrate (e.g., a substrate that generates a detection signal, a substrate that is converted by the enzyme into a product that generates a detection signal, or a substrate that generates a detection signal). substrates, or substrates in reactions that can be coupled with other enzymatic reactions that utilize the substrates that are converted by the enzyme into a product that generates a detectable signal).
本発明の試薬は、免疫学的測定方法に利用できるものである限り特に限定されず、免疫学的測定方法の種類に応じた構成を有することができる。好ましくは、本発明の試薬は、サンドイッチ法に用いられる試薬であってもよい。したがって、本発明の試薬は、サンドイッチ法で用いられる固相（例、磁性粒子等の粒子、ウェルプレート、メンブレン）、またはそのような固相に固定された固相抗体を含んでいてもよい。本発明の試薬はまた、イムノクロマトグラフィー法で用いられる固相を含む器具（すなわち、上述したようなイムノクロマトグラフィーカートリッジ）、またはそのような固相に固定された固相抗体を含んでいてもよい。本発明の試薬は、Ｎタンパク質標品を含んでいてもよい。 The reagent of the present invention is not particularly limited as long as it can be used for an immunoassay method, and can have a configuration according to the type of immunoassay method. Preferably, the reagents of the present invention may be reagents used in sandwich methods. Therefore, the reagent of the present invention may comprise a solid phase used in sandwich methods (eg, particles such as magnetic particles, well plates, membranes), or a solid phase antibody immobilized on such a solid phase. Reagents of the invention may also include devices containing a solid phase for use in immunochromatographic methods (ie, immunochromatographic cartridges as described above), or solid phase antibodies immobilized on such solid phases. The reagents of the invention may contain an N protein preparation.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例で記載される量に関する限り、％は、重量％（ｗｔ％）を意味する。 EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples. As far as the amounts described in the examples below are concerned, % means % by weight (wt %).
実施例１：抗体の製造
国際公開第２００５／０４２５７９号に記載の方法に従って抗体を製造した。具体的には、以下のとおりである。
Example 1: Antibody production An antibody was produced according to the method described in WO2005/042579. Specifically, it is as follows.
（１）リコンビナントＮタンパク質の製造と精製
ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）のヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎタンパク質）遺伝子を発現用プラスミドに挿入し、プラスミドｐＷＳ－Ｎを作製した。これを用い大腸菌を形質転換させ、アンピシリン耐性の形質転換体大腸菌を得た。Ｎタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
(1) Production and Purification of Recombinant N Protein A SARS coronavirus (SARS-CoV) nucleocapsid protein (N protein) gene was inserted into an expression plasmid to prepare a plasmid pWS-N. Escherichia coli was transformed with this to obtain ampicillin-resistant transformant Escherichia coli. The nucleotide sequence and amino acid sequence of N protein are shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively.
得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌ中にて３７℃で培養した。この形質転換体を予備培養にて増殖させ、６００ｎｍでのＯＤが約０．７の密度となるようにしたのち、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、発現誘導を行った。１８時間培養後、遠心分離を行い、大腸菌を回収した。回収した大腸菌に０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心後、可溶性画分に硫酸アンモニウムを加え、２０～４０％の硫酸アンモニウム画分を回収した。この硫酸アンモニウム画分を、０．１Ｍ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で平衡化したＳＰセファロースファーストフロー（アマシャム社製）にアプライし、０．２Ｍ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）で溶出し精製した。溶出画分を０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、精製されたリコンビナントＮタンパク質（ＣｏＶ）溶液を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって、リコンビナントＮタンパク質の精製度を確認したところ、単一のバンドを示した。 The resulting transformant was cultured at 37° C. in 2 ml of LB medium containing 50 μg/ml ampicillin. This transformant was precultured to grow to a density of about 0.7 in OD at 600 nm, and then 0.4 mM IPTG was added to induce expression. After culturing for 18 hours, centrifugation was performed to recover E. coli. A 20 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 0.1 mM PMSF was added to the collected E. coli, and sonication was performed under ice-cooling. After centrifugation, ammonium sulfate was added to the soluble fraction to collect 20-40% ammonium sulfate fraction. This ammonium sulfate fraction was applied to SP Sepharose Fast Flow (manufactured by Amersham) equilibrated with 0.1 M NaCl, 8 M urea, 20 mM phosphate buffer (pH 6.9), and 0.2 M NaCl, 8 M urea, 20 mM Purification was performed by elution with a phosphate buffer (pH 6.9). The eluted fraction was dialyzed against 0.2 M NaCl, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to obtain a purified recombinant N protein (CoV) solution. SDS-PAGE and Western blotting confirmed the purity of the recombinant N protein, which showed a single band.
（２）モノクローナル抗体の作製
上記で作製したリコンビナントＮタンパク質（ＣｏＶ）をマウスに免疫し、同マウスの脾臓リンパ球とミエローマ細胞を融合することにより、抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を作製した。すなわち、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、フロイント完全アジュバントでエマルジョン化したリコンビナントＮタンパク質を５０～１００μｇ／マウスで初回免疫を行い、２～３週間後、フロイント不完全アジュバントでエマルジョン化した同抗原５０～１００μｇ／マウスで追加免疫を行った。抗体価のチェックは、リコンビナントＮタンパク質をコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを用いた固相ＥＬＩＳＡで行った。抗体価の上昇が認められたマウスに遊離のリコンビナントＮタンパク質２５～１００μｇを静脈内投与し、その３～４日後、マウスから脾臓を取り出し、脾細胞を調製した。前もってＲＰＭＩ－１６４０培地で培養していたマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と脾細胞を１：２～１：５の比率で混合し、ＰＥＧを用いて細胞融合を行った。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した後、９６ウェル培養プレートに分注し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養した。
(2) Production of Monoclonal Antibody Anti-N protein monoclonal antibody was produced by immunizing a mouse with the recombinant N protein (CoV) produced above and fusing the mouse's splenic lymphocytes and myeloma cells. That is, BALB/C mice were first immunized with 50 to 100 μg/mouse of recombinant N protein emulsified with Freund's complete adjuvant, and after 2 to 3 weeks, 50 to 100 μg/mouse of the same antigen emulsified with Freund's incomplete adjuvant. Mice were boosted. The antibody titer was checked by solid-phase ELISA using a 96-well ELISA plate coated with recombinant N protein. 25 to 100 μg of free recombinant N protein was intravenously administered to mice in which an increase in antibody titer was observed, and 3 to 4 days later, spleens were removed from the mice to prepare splenocytes. Mouse myeloma cells (P3U1) that had been previously cultured in RPMI-1640 medium and splenocytes were mixed at a ratio of 1:2 to 1:5, and cell fusion was performed using PEG. After the fused cells floated in HAT medium, they were dispensed into 96-well culture plates and cultured in a CO 2 incubator at 37°C.
抗体のスクリーニングは、上記に示した固相ＥＬＩＳＡで行った。すなわち、リコンビナントＮタンパク質を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて一晩放置することにより吸着させた。ウェルを１％スキムミルクでブロッキングした後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で３回洗浄し、細胞融合を行ったプレートの培養上清５０μＬを加え、３７℃にて１時間反応させた。同様に洗浄緩衝液で３回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＣＯ社製）を加え、さらに３７℃にて１時間反応させた。洗浄緩衝液で４回洗浄後、基質ＡＢＴＳを加え、発色の見られるウェルを選択した。次に、選択したウェルの細胞を２４ウェル培養プレートに移し３７℃のＣＯ２インキュベーター中で培養した後、限外希釈法にて単一クローンとし、各モノクローナル抗体を得た。 Antibody screening was performed by solid-phase ELISA as described above. That is, the recombinant N protein was dispensed into 96-well ELISA plates at a concentration of 1 μg/mL at a concentration of 50 μL/well and allowed to stand overnight at 4° C. for adsorption. After blocking the wells with 1% skimmed milk, the wells were washed three times with a washing buffer (PBS containing 0.05% Tween), 50 μL of the culture supernatant of the cell-fused plate was added, and the mixture was reacted at 37° C. for 1 hour. let me After washing three times with washing buffer in the same manner, a POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (manufactured by DACO) was added and allowed to react at 37° C. for 1 hour. After washing four times with washing buffer, the substrate ABTS was added and wells showing color development were selected. Next, the cells in the selected wells were transferred to a 24-well culture plate, cultured in a CO 2 incubator at 37° C., and single cloned by the limiting dilution method to obtain each monoclonal antibody.
また、リコンビナントＮタンパク質（ＣｏＶ）のかわりに、免疫原として、合成ペプチド（Ｎ５ペプチド：ＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＣ：配列番号３）のＫＬＨコンジュゲートをマウスに免疫し、同様に抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を得た。 Also, instead of recombinant N protein (CoV), mice were immunized with a KLH conjugate of a synthetic peptide (N5 peptide: GQTVTKKSAAEASKKPRC: SEQ ID NO: 3) as an immunogen to similarly obtain an anti-N protein monoclonal antibody.
（３）モノクローナル抗体の反応性の確認
確立した各モノクローナル抗体の天然型抗原（ＳＡＲＳ―ＣｏＶ由来のＮタンパク質）に対する反応性を、濃縮ウイルス懸濁液を検体としたウエスタンブロット（ＷＢ）で確認した。ＶｅｒｏＥ６細胞にＳＡＲＳウイルスＨａｎｏｉ株を感染させ、４８時間、ＣＯ２インキュベーターで培養した後、２，０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、ウイルス培養上清（ＴＣＩＤ５０は７．９５×１０６／ｍＬ）を調製した。この培養上清に対して５６℃、９０分で不活性化処理を行なった後、その３１．５ｍＬを日立超遠心機（４０Ｔローター）を用いて、３０，０００ｒｐｍで３時間遠心した。得られた沈殿にＴｒｉｓ－ＮａＣｌ－ＥＤＴＡ緩衝液０．３ｍＬを加え、ピペッティングを行い、濃縮ウイルス懸濁液を調製した。本懸濁液に等量の電気泳動用検体処理液を添加し、次いで過熱処理を行うことにより分析用検体とした。１２．５％ゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、検体をニトロセルロース膜に転写し、ＷＢ用転写膜（抗原転写ＷＢ膜）を作製した。転写膜をスキムミルクでブロッキングした後、各モノクローナル抗体を抗原転写ＷＢ膜と室温にて１時間振盪し、反応に付した後、洗浄緩衝液で３回洗浄（５分の振盪洗浄）した。次にＰＯＤ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を加え、さらに室温で１時間反応させた。洗浄緩衝液で４回洗浄（５分の振盪洗浄）後、基質として４－クロロナフトール溶液を加え、バンドの確認を行い、分子量５０ｋＤ弱のＮタンパク質に相当する位置にバンドが確認されたモノクローナル抗体を選択した。
(3) Confirmation of monoclonal antibody reactivity The reactivity of each established monoclonal antibody to the native antigen (SARS-CoV-derived N protein) was confirmed by Western blot (WB) using a concentrated virus suspension as a sample. . VeroE6 cells were infected with SARS virus Hanoi strain, cultured in a CO 2 incubator for 48 hours, and then centrifuged at 2,000 rpm for 15 minutes to prepare a virus culture supernatant (TCID50 was 7.95×10 6 /mL). . After the culture supernatant was inactivated at 56° C. for 90 minutes, 31.5 mL of the culture supernatant was centrifuged at 30,000 rpm for 3 hours using a Hitachi ultracentrifuge (40T rotor). 0.3 mL of Tris-NaCl-EDTA buffer was added to the resulting precipitate and pipetting was performed to prepare a concentrated virus suspension. An equal amount of sample treatment solution for electrophoresis was added to this suspension, followed by heat treatment to prepare a sample for analysis. After performing SDS-PAGE using a 12.5% gel, the sample was transferred to a nitrocellulose membrane to prepare a WB transfer membrane (antigen-transferred WB membrane). After blocking the transfer membrane with skimmed milk, each monoclonal antibody was shaken with the antigen-transferred WB membrane at room temperature for 1 hour, reacted, and then washed three times with washing buffer (washing with shaking for 5 minutes). Next, a POD-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 4 times with washing buffer (washing with shaking for 5 minutes), a 4-chloronaphthol solution was added as a substrate to confirm the band. selected.
選択したモノクローナル抗体を、さらに、上記（１）と同様に作製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナントＮタンパク質、及びコモンコロナウイルスＮタンパク質を用いたＷＢに供し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナントＮタンパク質に結合し、コモンコロナウイルスのＮタンパク質には結合しないものを、抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体とした。以降の実施例では、特に言及しない限り、Ｎタンパク質として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質を用いた。 The selected monoclonal antibody is further subjected to WB using the SARS-CoV-2 recombinant N protein prepared in the same manner as in (1) above, and the common coronavirus N protein, and the SARS-CoV-2 recombinant N protein. Those that bound but did not bind to the common coronavirus N protein were designated as anti-N protein monoclonal antibodies. In the following examples, the N protein of SARS-CoV-2 was used as the N protein unless otherwise specified.
実施例２：抗体の反応領域の特定（その１）
上記実施例１で得られた複数の抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体について、Ｎタンパク質の部分配列を含むリコンビナント抗原を用いたＷＢ法により、そのエピトープを同定した。
Example 2: Identification of antibody reactive region (part 1)
The epitopes of the multiple anti-N protein monoclonal antibodies obtained in Example 1 above were identified by the WB method using a recombinant antigen containing a partial sequence of the N protein.
まず、上記実施例１と同様に作製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質全長（４１９個のアミノ酸）、ＮＴＤ（４４～１８０番目のアミノ酸）、ＣＴＤ（２４７～３６４番目のアミノ酸）およびＮタンパク質のＣ末端ペプチド（３３０～４１９番目のアミノ酸）のリコンビナント抗原を含む溶液に等量の電気泳動用検体処理液を添加し、次いで過熱処理を行うことにより分析用検体とし、上記実施例１（３）と同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＷＢを行い、各Ｎタンパク質モノクローナル抗体の反応性を確認した。 First, the SARS-CoV-2 N protein full length (419 amino acids), NTD (44th to 180th amino acids), CTD (247th to 364th amino acids) and N protein prepared in the same manner as in Example 1 An equal amount of the sample treatment solution for electrophoresis is added to a solution containing a recombinant antigen of the C-terminal peptide (330th to 419th amino acids), and then subjected to overheating to obtain a sample for analysis, as described in Example 1 (3) above. SDS-PAGE and WB were performed in the same manner as in , and the reactivity of each N protein monoclonal antibody was confirmed.
その結果、６個の抗体（抗Ｎタンパク質抗体Ｎ１～Ｎ６）が全長抗原及びＮＴＤ抗原と反応し、６個の抗体（抗Ｎタンパク質抗体Ｃ１～Ｃ６）が全長抗原及びＣＴＤ抗原と反応することが確認され、ＮＴＤとＣＴＤそれぞれに反応する複数の抗体が取得できた。また、全長抗原とＣ末端ペプチドには反応するが、ＮＴＤやＣＴＤ抗原には反応しない、３６５～４１９番目のアミノ酸配列に含まれる領域を認識する抗体（抗Ｎタンパク質抗体Ｃ１２、Ｃ１３）も得られた。さらに免疫原として、合成ペプチド（Ｎ５ペプチド：ＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＣ：配列番号３）のＫＬＨコンジュゲートをマウスに免疫して得られた、Ｎタンパク質の２４３～２５９番目のアミノ酸領域を認識する抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体も複数（Ｐ１、Ｐ２）得られた。 As a result, 6 antibodies (anti-N protein antibodies N1 to N6) reacted with the full-length antigen and NTD antigen, and 6 antibodies (anti-N protein antibodies C1-C6) reacted with the full-length antigen and CTD antigen. This was confirmed, and multiple antibodies reacting with NTD and CTD were obtained. In addition, antibodies (anti-N protein antibodies C12 and C13) that recognize the region contained in the 365th to 419th amino acid sequences, which react with the full-length antigen and the C-terminal peptide but do not react with the NTD or CTD antigen, were also obtained. rice field. Furthermore, as an immunogen, an anti-N protein monoclonal antibody that recognizes the 243rd to 259th amino acid regions of the N protein obtained by immunizing a mouse with a KLH conjugate of a synthetic peptide (N5 peptide: GQTVTKKSAAEASKKPRC: SEQ ID NO: 3) is also available. Multiple (P1, P2) were obtained.
実施例３：固相抗体（抗体固相化磁性粒子）の調製
カルボキシル－アミン架橋剤（カルボジイミド、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、製品マニュアルに従って、上記で取得した抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を磁性粒子（富士レビオ社製）に化学結合させ、固相抗体（抗体固相化磁性粒子）を得た。
Example 3: Preparation of solid-phase antibody (antibody-immobilized magnetic particles) Using a carboxyl-amine cross-linking agent (carbodiimide, Thermo-Fisher Scientific) according to the product manual, the anti-N protein monoclonal antibody obtained above was applied to magnetic particles. (manufactured by Fujirebio) to obtain solid-phase antibodies (antibody-immobilized magnetic particles).
実施例４：標識抗体（アルカリホスファターゼ標識抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体）の作製
上記で取得した抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体とペプシンとを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間静置してペプシン消化を行った。反応を停止させた後にゲルろ過精製を行い、Ｆｃ領域を除去した抗体を得た。次いで、２－メルカプトエチルアミン塩酸塩（２－ＭＥＡ）を添加して、チオール化を行った。さらに、これを脱塩処理し、Ｆａｂ’断片を得た。
Example 4: Preparation of labeled antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-N protein monoclonal antibody) The anti-N protein monoclonal antibody obtained above and pepsin were mixed in 0.1 M citrate buffer (pH 3.5) and heated at 37°C. The mixture was allowed to stand at 1 hour for pepsin digestion. After stopping the reaction, purification by gel filtration was performed to obtain an antibody from which the Fc region was removed. Thiolation was then carried out by adding 2-mercaptoethylamine hydrochloride (2-MEA). Further, this was desalted to obtain a Fab' fragment.
Ｎ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）処理をしたアルカリホスファターゼと、各抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体から作製したＦａｂ’断片を、モル比１～３：１になるように混合して、カップリングを行った。カップリング液に２－メルカプトエチルアミン塩酸塩及びヨードアセトアミドを加え、反応を停止させた。さらにゲルろ過によりＦａｂ’とＡＬＰとが１～３：１となる分子量のピークをプールし、標識抗体（ＡＬＰ標識抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体）を得た。 N-(4-maleimidobutyryloxy)-succinimide (GMBS)-treated alkaline phosphatase and Fab' fragments prepared from each anti-N protein monoclonal antibody were mixed at a molar ratio of 1 to 3:1, performed the coupling. 2-Mercaptoethylamine hydrochloride and iodoacetamide were added to the coupling solution to terminate the reaction. Further, peaks with a molecular weight of Fab' and ALP of 1 to 3:1 were pooled by gel filtration to obtain a labeled antibody (ALP-labeled anti-N protein monoclonal antibody).
実施例５：粒子を用いたサンドイッチイムノアッセイ
リコンビナントＮタンパク質を含む溶液、又は検体１００μＬを、上記実施例３で調製した抗体固相化磁性粒子を０．０３％含む粒子懸濁希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％ ＢＳＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮａＮ３）５０μＬに加えて３７℃で８分間反応させた。
Example 5 Sandwich Immunoassay Using Particles A solution containing recombinant N protein or 100 μL of a sample was diluted with a particle suspension dilution solution (50 mM Tris, 1% BSA, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% NaN 3 ) was added to 50 μL and reacted at 37° C. for 8 minutes.
反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス（登録商標）洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、上記実施例４で調製したＡＬＰ標識抗体を１μｇ／ｍＬ含む標識体液（５０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＺｎＣｌ２）を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定した。 After the reaction, B/F separation was performed with a magnet, and after washing with Lumipulse (registered trademark) washing solution (manufactured by Fujirebio), the labeled body fluid (50 mM MES, 50 μL of 150 mM NaCl, 1% BSA, 3 mM MgCl2, 0.3 mM ZnCl2) was added and reacted at 37° C. for 8 minutes. After B/F separation with a magnet and washing with Lumipulse washing solution, 3-(2′-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3″-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane disodium salt 200 μL of Lumipulse (registered trademark) substrate solution (manufactured by Fujirebio Co., Ltd.) containing (AMPPD) was added and an enzymatic reaction was performed at 37° C. for 4 minutes, and the amount of luminescence at a wavelength of 463 nm was measured.
実施例６：イムノクロマトグラフィー法
図１に示すように、幅３．７ｍｍ、長さ５０ｍｍのニトロセルロース膜からなるマトリクスの展開液吸収ゾーン側の末端から１５ｍｍの位置に抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体を含む水溶液０．５μＬをニトロセルロース膜に点着し乾燥させ、検出ゾーンを作成した。更に展開液吸収ゾーン側の末端から１２ｍｍの位置に抗アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）抗体溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む炭酸ナトリウム緩衝液）を点着し乾燥させ、展開確認部を作成した。また、基質として５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－リン酸二ナトリウム塩（ＢＣＩＰ）溶液０．９μＬをライン状に点着して基質ゾーンを作成した。次いで、マトリクスにＡＬＰ標識抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体（標識抗体）を含む溶液３μＬを点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッドからなる標識試薬ゾーンを作成した。
Example 6: Immunochromatography Method As shown in FIG. 1, an aqueous solution containing an anti-N protein monoclonal antibody is positioned 15 mm from the end of the developing solution absorption zone side of a matrix consisting of a nitrocellulose membrane having a width of 3.7 mm and a length of 50 mm. 0.5 μL was spotted on a nitrocellulose membrane and dried to create a detection zone. Further, an anti-alkaline phosphatase (ALP) antibody solution (sodium carbonate buffer containing 0.15 M NaCl) was spotted at a position 12 mm from the end of the developing solution absorption zone and dried to form a development confirming portion. In addition, 0.9 μL of a 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate disodium salt (BCIP) solution was spotted in a line as a substrate to form a substrate zone. Next, 3 μL of a solution containing an ALP-labeled anti-N protein monoclonal antibody (labeled antibody) was spotted on the matrix and dried to form a labeling reagent zone consisting of an enzyme-labeling reagent pad.
前記マトリクス、展開液パッド、酵素標識試薬パッドおよび吸収パッド（高保水性ろ紙）を図１のように重ねて粘着テープで固定した後、展開液槽１１を有するプラスチックケースに固定して、ＳＡＲＳ－Ｎタンパク質検出用イムノクロマトグラフィーカートリッジを製造した。 The matrix, developing solution pad, enzyme-labeled reagent pad and absorbent pad (highly water-holding filter paper) are stacked as shown in FIG. 1 and fixed with adhesive tape. An immunochromatographic cartridge for protein detection was manufactured.
リコンビナントＮタンパク質を含む溶液、又は検体２０μＬと処理液１００μＬを混合し、室温で約５分間静置した。得られた混合液中のＮタンパク質を、製造したイムノクロマトグラフィーカートリッジを用いて検出した。具体的には、混合液２０μＬを、イムノクロマトグラフィーカートリッジの標識抗体ゾーンに滴下した後、展開液槽を破り、展開液を展開液パッド及びマトリクス上端に供給し測定を開始した。測定開始３０分後、展開確認部１０の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーンの発色を目視で測定した。 A solution containing the recombinant N protein or 20 μL of the sample and 100 μL of the treatment liquid were mixed and allowed to stand at room temperature for about 5 minutes. The N protein in the resulting mixture was detected using the manufactured immunochromatography cartridge. Specifically, 20 μL of the mixed liquid was dropped onto the labeled antibody zone of the immunochromatography cartridge, and then the developing liquid tank was broken, and the developing liquid was supplied to the developing liquid pad and the upper end of the matrix to start the measurement. Thirty minutes after the start of the measurement, the development of the developing solution was confirmed by the color development of the development confirmation part 10, and then the color development of the detection zone was visually measured.
実施例７：抗体の反応領域の特定（その２）
上記実施例５のサンドイッチイムノアッセイの方法に従って、リコンビナントＮタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ）を測定し、各Ｎタンパク質モノクローナル抗体の反応領域に応じたグループ化を行った。具体的には、抗体固相化磁性粒子（固相抗体）及びＡＬＰ標識抗体として、それぞれ、Ｎ１～Ｎ６抗体、Ｃ１～Ｃ６抗体、及びＣ１２抗体を用い、リコンビナントＮタンパク質を測定した。
Example 7: Identification of antibody reactive region (Part 2)
Recombinant N proteins (SARS-CoV-2 or SARS-CoV) were measured according to the sandwich immunoassay method of Example 5 above, and grouped according to the reactive region of each N protein monoclonal antibody. Specifically, antibody-immobilized magnetic particles (solid-phase antibodies) and ALP-labeled antibodies were N1 to N6 antibodies, C1 to C6 antibodies, and C12 antibodies, respectively, and the recombinant N protein was measured.
その結果、固相抗体と標識抗体として、それぞれＮ１抗体とＮ２抗体を用いて、リコンビナントＮタンパク質（０、１０ｎｇ／ｍＬ）を測定した場合、０ｎｇ／ｍＬの発光量（バックグランド値）に対する１０ｎｇ／ｍＬの発光量比が非常に低く、両者は重複する領域に反応することが確認された（表１）。同様に、固相抗体と標識抗体として、それぞれＮ４、Ｎ５、Ｎ６抗体（Ｎ６抗体グループ）を用いてリコンビナントＮタンパク質（０、１ｎｇ／ｍＬ）を測定した場合、１ｎｇ／ｍＬの発光量から０ｎｇ／ｍＬの発光量を差し引いた発光量差が非常に低く、これら抗体は重複する領域を認識することが確認された（表２）。一方で、固相抗体と標識抗体として、Ｎ１抗体とＮ３抗体を用いた場合、発光量差が他の抗体との組み合わせに比べて小さいことから、一部競合することが確認された。Ｎ１抗体の方がＮ３抗体と比べて、他のＮＴＤ抗体とのサンドイッチイムノアッセイの際の反応性が高いことから、複数抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイにおいては、Ｎ１抗体グループ（Ｎ１、Ｎ２抗体）の方がＮ３抗体よりも有用と考えられた。 As a result, when the recombinant N protein (0, 10 ng/mL) was measured using the N1 antibody and the N2 antibody as the solid-phase antibody and the labeled antibody, respectively, 10 ng/ It was confirmed that the luminescence ratio of mL was very low and that both reacted in overlapping regions (Table 1). Similarly, when measuring recombinant N protein (0, 1 ng/mL) using N4, N5, and N6 antibodies (N6 antibody group) as solid-phase antibodies and labeled antibodies, respectively, the amount of light emitted from 1 ng/mL to 0 ng/mL The luminescence difference after subtracting the luminescence in mL was very low, confirming that these antibodies recognize overlapping regions (Table 2). On the other hand, when the N1 antibody and the N3 antibody were used as the solid-phase antibody and the labeled antibody, the difference in the amount of light emission was smaller than in the combination with other antibodies, confirming partial competition. Compared to the N3 antibody, the N1 antibody has higher reactivity in sandwich immunoassays with other NTD antibodies, so in sandwich immunoassays using multiple antibodies, the N1 antibody group (N1, N2 antibodies) was considered more useful than the N3 antibody.
同様にＣ１～Ｃ６抗体についても検討したところ、Ｃ１抗体とＣ２抗体が重複する領域を認識すること、Ｃ３抗体とＣ４抗体が重複する領域を認識すること、Ｃ５抗体とＣ６抗体が重複する領域を認識することが確認された（表３～５）。しかしながら、Ｃ５及びＣ６抗体は、何れの組合せでも発光量が低くなったことから、Ｃ５抗体グループ（Ｃ５、Ｃ６抗体）が認識する領域に対する抗体は、サンドイッチイムノアッセイによる測定において反応性が低いことが確認された。 Similarly, when C1 to C6 antibodies were also examined, it was found that the C1 antibody and the C2 antibody recognize the overlapping region, the C3 antibody and the C4 antibody recognize the overlapping region, and the C5 antibody and the C6 antibody overlap the region. Recognition was confirmed (Tables 3-5). However, both C5 and C6 antibodies showed low luminescence in any combination, confirming that antibodies against the region recognized by the C5 antibody group (C5 and C6 antibodies) have low reactivity in measurements by sandwich immunoassay. was done.
実施例８：抗体の組合せの検討（その１）
上記実施例７でグループ化された抗体と、Ｃ１２抗体について、固相抗体と標識抗体の組合せを検討した。上記実施例５のサンドイッチイムノアッセイの方法と同様にして、表６に示す抗体の各組合せを用いて、リコンビナントＮタンパク質を測定した。それぞれＮ＝２で測定した。
Example 8: Examination of combination of antibodies (Part 1)
For the antibodies grouped in Example 7 above and the C12 antibody, combinations of solid-phase antibodies and labeled antibodies were examined. Using each combination of antibodies shown in Table 6, the recombinant N protein was measured in the same manner as in the sandwich immunoassay method of Example 5 above. Each was measured with N=2.
結果を表６に示す。表６では、０ｎｇ／ｍＬの検体からの発光量の平均値に対する１ｎｇ／ｍＬの検体からの発光量の平均値の比率（Ｓ／Ｎ比）を示す。 Table 6 shows the results. Table 6 shows the ratio (S/N ratio) of the average luminescence amount from 1 ng/mL specimens to the average luminescence amount from 0 ng/mL specimens.
その結果、サンドイッチイムノアッセイの固相抗体と標識抗体の組合せとして、どちらの組合せでも高いＳ／Ｎ比を示す、Ｎ１抗体とＣ３抗体、Ｎ１抗体とＣ１２抗体、Ｎ４抗体とＣ３抗体、Ｎ４抗体とＣ１２抗体、Ｃ３抗体とＣ１２抗体との組み合わせが好ましいことが確認された。 As a result, as a combination of a solid-phase antibody and a labeled antibody for sandwich immunoassay, both N1 antibody and C3 antibody, N1 antibody and C12 antibody, N4 antibody and C3 antibody, N4 antibody and C12 exhibiting high S/N ratios. It was confirmed that the antibody, the combination of the C3 antibody and the C12 antibody, is preferable.
実施例９：抗体の組合せの検討（その２）
上記実施例７でグループ化された抗体と、Ｐ１抗体、Ｃ１２抗体について、固相抗体と標識抗体の組合せを検討した。上記実施例６のイムノクロマトグラフィー法により、表７および表８に示す抗体の各組合せを用いて、リコンビナントＮタンパク質１０ｎｇ／ｍＬを含む検体を測定した。また、表７及び表８に示す抗体の各組合せを用いて、測定開始３０分後（表７）または６０分後（表８）、展開確認部１０の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーンの発色を目視で測定した。結果を表７と表８に示す。表７および表８では、各条件における検出ゾーンの発色強度を示す。数値が大きいほど、発色が濃く、「ｗ」はより弱いことを示す。つまり、発色強度としては、４．５＞４＞３＞２＞１＞ｗの順に弱くなる。空欄は未実施を示す。
Example 9: Examination of combination of antibodies (Part 2)
For the antibodies grouped in Example 7 above, the P1 antibody, and the C12 antibody, combinations of solid-phase antibodies and labeled antibodies were examined. Samples containing 10 ng/mL of recombinant N protein were assayed using the antibody combinations shown in Tables 7 and 8 by the immunochromatographic method of Example 6 above. Further, using each combination of antibodies shown in Tables 7 and 8, 30 minutes after the start of measurement (Table 7) or 60 minutes (Table 8), after confirming the development of the developing solution by the color development of the development confirmation part 10 , the color development of the detection zone was measured visually. The results are shown in Tables 7 and 8. Tables 7 and 8 show the color intensity of the detection zone under each condition. Higher numbers indicate darker coloration and "w" indicates weaker. That is, the intensity of color development decreases in the order of 4.5>4>3>2>1>w. Empty columns indicate non-implementation.
その結果、粒子を用いたサンドイッチイムノアッセイと同様に、Ｎ１抗体・Ｎ２抗体とＣ３抗体、Ｎ１抗体とＣ１２抗体、Ｎ４抗体とＣ３抗体、Ｎ４抗体とＣ１２抗体、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の組合せで強い発光強度が確認された。さらに、Ｎ１抗体・Ｎ２抗体とＮ４抗体も比較的高い発光強度を示した。 As a result, similar to the sandwich immunoassay using particles, the combination of N1/N2 antibodies and C3 antibodies, N1 antibody and C12 antibody, N4 antibody and C3 antibody, N4 antibody and C12 antibody, and C3 antibody and C12 antibody showed strong luminescence. Strength confirmed. Furthermore, the N1 antibody/N2 antibody and N4 antibody also showed relatively high luminescence intensity.
さらに、Ｃ１抗体とＰ１抗体の、他の抗体との組み合わせについても評価したところ、Ｃ１抗体は、Ｃ３抗体との組み合わせで比較的強い発光強度を示した。一方、Ｐ１抗体は、Ｃ３抗体との組み合わせで強い発光強度を示し、Ｎ１抗体、Ｎ４抗体との組み合わせで比較的強い発光強度を示した。 Furthermore, when the combination of the C1 antibody and the P1 antibody with other antibodies was also evaluated, the C1 antibody showed relatively strong luminescence intensity in combination with the C3 antibody. On the other hand, the P1 antibody showed strong luminescence intensity in combination with the C3 antibody, and showed relatively strong luminescence intensity in combination with the N1 and N4 antibodies.
実施例１０：抗体の組合せの検討（その３）
上記実施例８および９では、単独の固相抗体と単独の標識抗体の組合せについて検討した。このような組合せでも十分に感度の高い測定系を構築することができたが、異なる領域を認識する固相抗体および／または異なる領域を認識する標識抗体を組み合わせて使用することがより好ましい。そこで、上記実施例８および９で単独で効果が認められた抗体の一つを標識抗体とし、それ以外の複数の抗体を固相抗体として用いたイムノアッセイ系を構築し、上記実施例８と同様の方法でリコンビナントＮタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）１０ｎｇ／ｍＬを含む検体を評価した。固相抗体は、上記実施例３の製造方法に従い、複数の抗体と粒子を同時に化学結合させることで調製した。結果を表９に示す。
Example 10: Examination of combination of antibodies (Part 3)
Examples 8 and 9 above discussed the combination of a single solid phase antibody and a single labeled antibody. Although a measurement system with sufficiently high sensitivity could be constructed even with such a combination, it is more preferable to use a combination of solid-phase antibodies recognizing different regions and/or labeled antibodies recognizing different regions. Therefore, an immunoassay system was constructed using a labeled antibody as one of the antibodies for which an effect was observed alone in Examples 8 and 9 above, and a plurality of other antibodies as solid-phase antibodies, in the same manner as in Example 8 above. A sample containing 10 ng/mL of recombinant N protein (SARS-CoV) was evaluated by the method of . Solid-phase antibodies were prepared by simultaneously chemically bonding multiple antibodies and particles according to the production method of Example 3 above. Table 9 shows the results.
その結果、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を用いた場合、発光量（１０００ｐｇ/ｍｌでのカウント）およびＳ／Ｎ比の優れた向上が認められた。特に、標識抗体としてＮ１抗体またはＮ４抗体を用いた場合、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を固相抗体として使用すると、Ｃ３抗体とＣ１２抗体を単独で固相抗体として用いた場合に比べて発光量が増加し、Ｓ／Ｎ比も増加することが確認された。一方、標識抗体としてＣ３抗体またはＣ１２抗体を用いた場合、Ｎ１抗体とＮ４抗体の混合物を固相抗体として用いても、カウント値とＳ／Ｎ比の両方が増加することはなかった。このことから、単に複数の抗体を固相抗体に使用することが理由ではなく、Ｃ３抗体とＣ１２抗体を組み合わせて使用することが、サンドイッチイムノアッセイにおける感度の向上に有効であることが確認された。 As a result, when the mixture of C3 antibody and C12 antibody was used, excellent improvement in luminescence (count at 1000 pg/ml) and S/N ratio was observed. In particular, when the N1 antibody or N4 antibody is used as the labeled antibody, the amount of luminescence when a mixture of the C3 antibody and the C12 antibody is used as the solid phase antibody is higher than when the C3 antibody and the C12 antibody are used alone as the solid phase antibody. increased, and the S/N ratio also increased. On the other hand, when C3 antibody or C12 antibody was used as the labeled antibody, even if a mixture of N1 antibody and N4 antibody was used as the solid-phase antibody, neither the count value nor the S/N ratio increased. From this, it was confirmed that the combined use of the C3 antibody and the C12 antibody is effective in improving the sensitivity of the sandwich immunoassay, rather than simply using a plurality of antibodies for the solid-phase antibody.
実施例１１：抗体の反応領域の特定（その３）
上記実施例８～１０で有効であることが確認された抗体について、Ｎタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のエピトープを解析した。
Example 11: Identification of antibody reactive region (Part 3)
For the antibodies confirmed to be effective in Examples 8 to 10 above, the epitope of N protein (SARS-CoV-2) was analyzed.
ＮＴＤを認識する、Ｎ１抗体グループ（Ｎ１、Ｎ２抗体）及びＮ６抗体グループ（Ｎ４～Ｎ６抗体）については、上記実施例１と同様に作製したＮＴＤのＮ末領域（４４～１１２番目のアミノ酸）、ＮＴＤの中央領域（７９～１４７番目のアミノ酸）、ＮＴＤのＣ末領域（１１３～１８０番目のアミノ酸）からなるリコンビナント抗原、およびＮタンパク質の１～１１９番目、１１０～２２９番目、２２０～３３９番目、及び３３０～４１９番目のアミノ酸領域からなるリコンビナント抗原（ｔｒＮＰ１、ｔｒＮＰ２、ｔｒＮＰ３、ｔｒＮＰ４抗原）を用いたＷＢによって、反応領域を解析した。その結果、Ｎ１抗体グループは、Ｎタンパク質の４４～７８番目のアミノ酸領域を認識することが示された。また、Ｎ６抗体グループは、Ｎタンパク質の１２０～１４７番目のアミノ酸領域を認識することが示された。 For the N1 antibody group (N1, N2 antibodies) and N6 antibody group (N4 to N6 antibodies) that recognize NTD, the NTD N-terminal region (44th to 112th amino acids) prepared in the same manner as in Example 1 above, Central region of NTD (79th to 147th amino acids), recombinant antigen consisting of NTD C-terminal region (113th to 180th amino acids), and 1st to 119th, 110th to 229th, 220th to 339th of N protein, The reaction region was analyzed by WB using recombinant antigens (trNP1, trNP2, trNP3, trNP4 antigens) consisting of the 330th to 419th amino acid regions. As a result, the N1 antibody group was shown to recognize the 44th to 78th amino acid regions of the N protein. Also, the N6 antibody group was shown to recognize the 120th to 147th amino acid region of the N protein.
同様に、ＣＴＤを認識するＣ３抗体グループ、Ｃ１抗体グループについて、上記実施例１と同様に作製したＣＴＤのＮ末領域（２４７～３０５番目のアミノ酸）、ＣＴＤの中央領域（２７６～３３４番目のアミノ酸）、ＣＴＤのＣ末領域（３０６～３６４番目のアミノ酸）からなるリコンビナント抗原およびｔｒＮＰ１、ｔｒＮＰ２、ｔｒＮＰ４およびｔｒＮＰ４抗原を用いたＷＢおよびサンドイッチアッセイ、並びに合成ペプチドおよび他の抗体との反応性に基づき、反応領域を解析した。その結果、Ｃ３抗体グループは、Ｎタンパク質の２６０～３０５番目のアミノ酸領域を認識することが示された。また、Ｃ１抗体グループは、Ｎタンパク質の３０６～３３９番目のアミノ酸領域を認識することが示された。 Similarly, for the C3 antibody group and C1 antibody group that recognize CTD, the CTD N-terminal region (247th to 305th amino acids) prepared in the same manner as in Example 1 above, the CTD central region (276th to 334th amino acids ), WB and sandwich assays using recombinant antigens consisting of the C-terminal region of CTD (amino acids 306-364) and trNP1, trNP2, trNP4 and trNP4 antigens, and reactivity with synthetic peptides and other antibodies, The reaction area was analyzed. As a result, the C3 antibody group was shown to recognize the 260th to 305th amino acid region of the N protein. Also, the C1 antibody group was shown to recognize the 306th to 339th amino acid region of the N protein.
まとめると、解析した抗体のエピトープは、以下のとおりであった。
実施例１２：抗体の組合せの検討（その４）
上記実施例１０にて、Ｎ１抗体またはＮ４抗体を用いた場合、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を固相抗体として使用することが有用であることが示された。これらの抗体の組合せがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でも同様に有用であることを確認するため、表１０に記載された固相抗体と標識抗体の組合せを用い、上記実施例５と同様の方法でリコンビナントＮタンパク質１００ｐｇ／ｍＬを含む溶液を測定した。
Example 12: Examination of combination of antibodies (Part 4)
In Example 10 above, it was shown that it is useful to use a mixture of C3 antibody and C12 antibody as the solid-phase antibody when using the N1 antibody or the N4 antibody. In order to confirm that these antibody combinations are similarly useful for SARS-CoV-2, using the combinations of solid-phase antibodies and labeled antibodies listed in Table 10, recombinants were used in the same manner as in Example 5 above. A solution containing 100 pg/mL of N protein was measured.
具体的には、リコンビナントＮタンパク質を含む溶液１００μＬと、処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ３、２．５％Ｃ１６ＡＰＳ）２０μＬとを、固相抗体を含む粒子懸濁希釈液５０μＬに添加し、３７℃で８分間反応させた。反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄した後、ＡＬＰ標識抗体を含む標識体液を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、ＡＭＰＰＤを含むルミパルス基質液を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定することで、各サンプルのＮタンパク質を測定した。固相抗体は、上記実施例３に従い、各抗体と粒子を化学結合させたのち、それらを１：１で混合することで調製した。標識抗体は、上記実施例４に従い、ＡＬＰに対する各Ｆａｂ’断片のモル比が１：１になるように、ＧＭＢＳ処理をしたＡＬＰと、複数の抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体から作製したＦａｂ’断片を同時に混合して、カップリングを行い、ＡＬＰ標識抗体を調製した。 Specifically, 100 μL of a solution containing a recombinant N protein and 20 μL of a treatment solution (Tris buffer, 150 mM NaCl, 0.1% NaN 3 , 2.5% C16APS) were diluted with a particle suspension containing a solid-phase antibody. It was added to 50 μL of the liquid and reacted at 37° C. for 8 minutes. After the reaction, B/F separation was performed with a magnet, and after washing with a lumipulse washing solution, 50 μL of the labeled body fluid containing the ALP-labeled antibody was added and allowed to react at 37° C. for 8 minutes. After B/F separation with a magnet and washing with a Lumipulse washing solution, 200 μL of a Lumipulse substrate solution containing AMPPD was added, an enzymatic reaction was performed at 37° C. for 4 minutes, and the amount of luminescence at a wavelength of 463 nm was measured to determine the amount of light emitted from each sample. N protein was measured. Solid-phase antibodies were prepared by chemically binding each antibody and particles according to Example 3 above, and then mixing them at a ratio of 1:1. Labeled antibodies are GMBS-treated ALP and Fab' fragments prepared from a plurality of anti-N protein monoclonal antibodies at the same time so that the molar ratio of each Fab' fragment to ALP is 1: 1 according to Example 4 above. Mixed and coupled to prepare ALP-labeled antibody.
結果を表１０に示す。その結果、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を用いた場合、発光量（１００ｐｇ/ｍｌでのカウント）およびＳ／Ｎ比の優れた向上が認められた。Ｃ３抗体とＣ１２抗体を組み合わせて使用することが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のサンドイッチイムノアッセイにおける感度の向上にも有効であることが確認された。 Table 10 shows the results. As a result, when the mixture of C3 antibody and C12 antibody was used, excellent improvement in luminescence (count at 100 pg/ml) and S/N ratio was observed. It was confirmed that the combined use of the C3 antibody and the C12 antibody is also effective in improving the sensitivity of the SARS-CoV-2 sandwich immunoassay.
実施例１３：抗体の組合せの検討（その５）
上記実施例１０及び実施例１２にて、Ｎ１抗体またはＮ４抗体を用いた場合、Ｃ３抗体とＣ１２抗体の混合物を固相抗体として使用することが有用であることが示された。上述した通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では変異等が生じる可能性があるため、異なる領域を認識する抗体を組み合わせて使用することがより好ましい。そこで、Ｎ１／Ｎ２抗体、Ｎ４／Ｎ６抗体、Ｃ３／Ｃ４抗体、Ｃ１２／Ｃ１３抗体のグループとは反応性の異なるグループの抗体であり、上記実施例１０でＮ１抗体、Ｎ４抗体やＣ３抗体と反応性の高い、Ｐ１／Ｐ２抗体との組み合わせを評価した。また、Ｃ１／Ｃ２抗体との組み合わせについても評価した。
Example 13: Examination of combination of antibodies (Part 5)
In Examples 10 and 12 above, it was shown that it is useful to use a mixture of C3 antibody and C12 antibody as the solid-phase antibody when N1 antibody or N4 antibody is used. As described above, SARS-CoV-2 may mutate, so it is more preferable to use a combination of antibodies that recognize different regions. Therefore, it is an antibody of a group different in reactivity from the group of N1/N2 antibody, N4/N6 antibody, C3/C4 antibody, and C12/C13 antibody, and reacts with N1 antibody, N4 antibody, and C3 antibody in Example 10 above. A combination with the P1/P2 antibody, which is highly potent, was evaluated. Combination with C1/C2 antibody was also evaluated.
具体的には、表１１－１～１１－３に記載された固相抗体と標識抗体の組合せを用い、上記実施例８と同様の方法で評価した。固相抗体は、上記実施例３に従い、複数の抗体と粒子を同時に化学結合させることで調製した。標識抗体は、上記実施例４に従い、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対する各Ｆａｂ’断片のモル比が１：１になるように、ＧＭＢＳ処理をしたＡＬＰと、複数の抗Ｎタンパク質モノクローナル抗体から作製したＦａｂ’断片を同時に混合して、カップリングを行い、ＡＬＰ標識抗体を調製した。 Specifically, combinations of solid-phase antibodies and labeled antibodies shown in Tables 11-1 to 11-3 were used and evaluated in the same manner as in Example 8 above. Solid-phase antibodies were prepared by simultaneously chemically coupling multiple antibodies and particles according to Example 3 above. Labeled antibodies are Fabs prepared from GMBS-treated ALP and multiple anti-N protein monoclonal antibodies according to Example 4 above, such that the molar ratio of each Fab' fragment to alkaline phosphatase (ALP) is 1:1. The 'fragments were mixed together and coupling was performed to prepare the ALP-labeled antibody.
検体としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性の唾液検体に、リコンビナントＮタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性患者の鼻腔ぬぐい液１～５（購入検体：Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を添加したものを検体とし、検体１００μＬに、検体処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、０．２５％Ｃ１６ＡＰＳ）１７０μＬを添加した検体を用いた。
As a specimen, SARS-CoV-2 negative saliva specimen, recombinant N protein or SARS-CoV-2 positive patient's
結果を表１１－１～１１－３に示す。表１１－１～１１－３では、リコンビナントＮタンパク質０ｎｇ／ｍＬを測定した際の発光量に対するリコンビナントＮタンパク質１０ｎｇ／ｍＬを測定した際の発光量比（Ｓ／Ｎ比）、およびリコンビナントＮタンパク質０ｎｇ／ｍＬを測定した際の発光量に対する各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性検体を測定した際の発光量比を示す。 The results are shown in Tables 11-1 to 11-3. In Tables 11-1 to 11-3, the light emission amount ratio (S/N ratio) when 10 ng/mL of recombinant N protein is measured to the light emission amount when 0 ng/mL of recombinant N protein is measured, and 0 ng of recombinant N protein. The ratio of the amount of luminescence when measuring each SARS-CoV-2 positive sample to the amount of luminescence when measuring /mL is shown.
その結果、Ｃ３抗体とＣ１２抗体を固相抗体又は標識抗体として使用し、他方にＮ６抗体を使用すると、非常に高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができた。つまり、２６０～３０５番目のアミノ酸領域を認識する抗体と、３６５～４１９番目のアミノ酸領域を認識する抗体を固相抗体又は標識抗体として使用し、他方に１２０～１４７番目のアミノ酸領域を認識する抗体を使用すると、非常に高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができることが確認された。 As a result, SARS-CoV-2 in specimens could be measured with very high sensitivity by using C3 antibody and C12 antibody as solid-phase antibodies or labeled antibodies and using N6 antibody on the other hand. That is, an antibody that recognizes the 260th to 305th amino acid region and an antibody that recognizes the 365th to 419th amino acid region is used as a solid phase antibody or labeled antibody, and the other is an antibody that recognizes the 120th to 147th amino acid region. can be used to measure SARS-CoV-2 in specimens with very high sensitivity.
さらに、Ｎ１抗体とＰ１抗体を組み合わせることでより高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができた。つまり、上記の抗体の組合せに追加して、さらに、４４～７８番目のアミノ酸領域を認識する抗体と２４３～２５９番目のアミノ酸領域を認識する抗体を組合せると、より高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができることが確認された。 Furthermore, SARS-CoV-2 in specimens could be measured with higher sensitivity by combining the N1 antibody and the P1 antibody. That is, in addition to the combination of the above antibodies, further combining an antibody that recognizes the 44-78th amino acid region and an antibody that recognizes the 243-259th amino acid region, SARS in the specimen with higher sensitivity - Confirmed that CoV-2 can be measured.
また、これらの抗体の組合せに、さらにＣ１抗体を追加しても、十分に高い感度で検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を測定することができた。つまり、これらの抗体とは異なるＣＴＤ領域を認識する抗体をさらに組み合わせることも効果があることが確認された。 In addition, SARS-CoV-2 in specimens could be measured with sufficiently high sensitivity by adding C1 antibody to the combination of these antibodies. In other words, it was confirmed that combining an antibody that recognizes a different CTD region from these antibodies is also effective.
実施例１４：反応液中で用いられる界面活性剤の検討
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性の唾液検体に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性患者の鼻腔ぬぐい液（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を添加したものをサンプルとした。このサンプル１００μＬと、表１２に示す界面活性剤を含む処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、各界面活性剤の処理液中濃度２．５％、検体と粒子懸濁液との混和後の濃度０．１９％）２０μＬを、固相抗体を含む粒子懸濁希釈液１５０μＬに添加し、３７℃で８分間反応させた。反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、上記実施例４で調製したＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識抗体を含む標識体液を１５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、ＡＭＰＰＤ（３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ） フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）を含むルミパルス基質液を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定することで、各サンプルのＮタンパク質を測定した。なお、固相抗体としてＮ６抗体およびＰ１抗体を用い、標識抗体としてＮ１抗体、Ｃ３抗体及びＣ１２抗体を用いた。
Example 14: Examination of surfactants used in the reaction solution A SARS-CoV-2 negative saliva sample was added with a nasal swab of a SARS-CoV-2 positive patient (Boca Biolistics, LLC) as a sample. did. 100 μL of this sample and a treatment solution containing surfactants shown in Table 12 (Tris buffer, 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.1% NaN 3 , concentration of each surfactant in treatment solution 2.5%, sample and the concentration of 0.19% after mixing with the particle suspension) was added to 150 μL of the particle suspension diluent containing the solid-phase antibody, and reacted at 37° C. for 8 minutes. After the reaction, B/F separation was performed with a magnet, and after washing with Lumipulse washing solution (manufactured by Fujirebio), 150 μL of the labeled body fluid containing the ALP (alkaline phosphatase)-labeled antibody prepared in Example 4 above was added, and the mixture was heated at 37°C. React for 8 minutes. After B/F separation with a magnet and washing with Lumipulse washing solution, AMPPD (3-(2′-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3″-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane・2 200 μL of Lumipulse substrate solution containing sodium salt) was added, enzyme reaction was performed at 37° C. for 4 minutes, and the amount of light emitted at a wavelength of 463 nm was measured to measure the N protein of each sample. N6 antibody and P1 antibody were used as solid-phase antibodies, and N1 antibody, C3 antibody and C12 antibody were used as labeled antibodies.
結果を表１２に示す。表１２では、測定された発光値に加えて、界面活性剤を添加していない条件における発光値に対する、各界面活性剤添加条件の発光値の比率（％）も示す。 Table 12 shows the results. In addition to the measured luminescence values, Table 12 also shows the ratio (%) of the luminescence value under each surfactant addition condition to the luminescence value under the condition where no surfactant was added.
その結果、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤（Ｃ１２ＡＰＳおよびＣ１４ＡＰＳ）を用いると、陽性検体で非常に高い発光値が得られ、高感度にＮタンパク質を検出することができた。以上のことから、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤が患者検体に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の測定に有効であることが示された。 As a result, when using amphoteric surfactants (C12APS and C14APS) containing a hydrocarbon chain as the hydrophobic part, a very high luminescence value was obtained in the positive sample, and the N protein could be detected with high sensitivity. . From the above, it was shown that a zwitterionic surfactant containing a hydrocarbon chain as a hydrophobic part is effective for measuring SARS-CoV-2 N protein contained in patient specimens.
実施例１５：検体処理液中で用いられる界面活性剤の検討（その１）
上記実施例１４では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の測定において、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を検体と混合することが有用であることが分かった。そこで、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤を用いて処理した検体を用いて、上記実施例６のイムノクロマトグラフィー法により、Ｎタンパク質を検出した。
Example 15: Examination of surfactants used in sample treatment liquid (Part 1)
In Example 14 above, it was found to be useful in measuring the SARS-CoV-2 N protein to mix a zwitterionic surfactant containing a hydrocarbon chain as the hydrophobic part with the sample. Therefore, the N protein was detected by the immunochromatographic method of Example 6 above using a specimen treated with a zwitterionic surfactant containing a hydrocarbon chain as a hydrophobic moiety.
検体としては、購入した鼻咽頭検体（陰性検体、陽性検体、Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を用いた。検体処理液としては、各界面活性剤を含むＴｒｉｓ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）を用いた。また、固相抗体としてＰ１抗体とＮ６抗体を用い、標識抗体としてＮ１抗体、Ｃ３抗体およびＣ１２抗体を用いた。各条件における検出ゾーンの発色状態を表１３に示す。数値が大きいほど、発色が濃く、「ｗ」はより弱いことを示す。つまり、発色強度としては、１＞１ｗ＞１ｗｗの順に弱くなる。その結果、表１３に示すように、Ｎタンパク質を十分な感度で検出できることが確認された。 As specimens, purchased nasopharyngeal specimens (negative specimens, positive specimens, Boca Biolistics, LLC) were used. A Tris buffer solution (150 mM NaCl, 1% BSA, 0.1% NaN 3 ) containing each surfactant was used as the sample treatment solution. P1 antibody and N6 antibody were used as solid-phase antibodies, and N1 antibody, C3 antibody and C12 antibody were used as labeled antibodies. Table 13 shows the color development state of the detection zone under each condition. Higher numbers indicate darker coloration and "w" indicates weaker. In other words, the coloring intensity decreases in the order of 1>1w>1ww. As a result, as shown in Table 13, it was confirmed that the N protein could be detected with sufficient sensitivity.
実施例１６：検体処理液の界面活性剤の検討（その２）
上記実施例１４および１５では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質の測定において、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤で検体を処理することが有用であることが分かった。
Example 16: Investigation of Surfactant for Specimen Treatment Liquid (Part 2)
In Examples 14 and 15 above, it was found to be useful in measuring the SARS-CoV-2 N protein to treat the specimen with a zwitterionic detergent containing a hydrocarbon chain as the hydrophobic moiety.
次に、疎水部として炭化水素鎖を含む両イオン性界面活性剤及び他の界面活性剤との組み合わせを、粒子を用いたサンドイッチイムノアッセイ法にて検討した。 Next, zwitterionic surfactants containing hydrocarbon chains as hydrophobic moieties and combinations with other surfactants were investigated by sandwich immunoassay methods using particles.
検体として、ウイルス輸送液ＳＧＶＴＭ－３Ｒ（スギヤマケン社）３ｍＬにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性鼻咽頭検体（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ， ＬＬＣ）６μＬを添加したものを用いた。購入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性検体（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）のうち、ＲＴ－ＰＣＲ法でウイルス量の異なることが判明している検体を低値検体、中値検体として選んで用いた。 As specimens, 3 mL of virus transport solution SGVTM-3R (Sugiyamaken) was added with 6 μL of SARS-CoV-2 positive nasopharyngeal specimen (Boca Biolistics, LLC). Among the purchased SARS-CoV-2-positive specimens (Boca Biolistics, LLC), specimens that were found to have different viral amounts by RT-PCR were selected and used as low-value specimens and medium-value specimens.
表１４に示す界面活性剤と、０．２５％Ｃ１６ＡＰＳを含む検体処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）２０μＬを、検体１００μＬに添加し、３７℃で６．５分インキュベートした。その後、処理検体に固相抗体を含む粒子懸濁希釈液５０μＬを添加し、３７℃で８分間反応させた。反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、上記実施例４で調製したＡＬＰ標識抗体を含む標識体液を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、ＡＭＰＰＤを含むルミパルス基質液を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定することで、各サンプルのＮタンパク質を測定した。また、既知濃度のリコンビナントＮタンパク質を含む標準溶液（０，１００，５０００，１００００ｐｇ／ｍＬ）を同様に測定し、標準曲線を作成した。各サンプルの発光量と標準曲線から、各サンプルのＮタンパク質の濃度を求めた。結果を表１４に示す。 Surfactants shown in Table 14 and 20 μL of a sample treatment solution containing 0.25% C16APS (Tris buffer, 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.1% NaN 3 ) were added to 100 μL of the sample and heated at 37° C. Incubated for 6.5 minutes. After that, 50 μL of a diluted particle suspension solution containing a solid-phase antibody was added to the treated sample, and reacted at 37° C. for 8 minutes. After the reaction, B/F separation is performed with a magnet, and after washing with Lumipulse washing solution (manufactured by Fujirebio), 50 μL of the labeled body fluid containing the ALP-labeled antibody prepared in Example 4 above is added and allowed to react at 37° C. for 8 minutes. rice field. After B/F separation with a magnet and washing with a Lumipulse washing solution, 200 μL of a Lumipulse substrate solution containing AMPPD was added, an enzymatic reaction was performed at 37° C. for 4 minutes, and the amount of luminescence at a wavelength of 463 nm was measured to determine the amount of light emitted from each sample. N protein was measured. In addition, standard solutions (0, 100, 5000, 10000 pg/mL) containing known concentrations of recombinant N protein were measured in the same manner to create a standard curve. The concentration of N protein in each sample was determined from the amount of light emitted from each sample and the standard curve. The results are shown in Table 14.
その結果、デオキシコール酸、又はコール酸をさらに処理液に添加することで、低値検体（ＬＳ）、中値検体（ＭＳ）ともに、発光量の増加が認められた。特にデオキシコール酸を追加で添加することにより、添加したすべての濃度で発光量が大きく増加した。 As a result, by further adding deoxycholic acid or cholic acid to the treatment liquid, an increase in the amount of luminescence was observed for both the low value sample (LS) and medium value sample (MS). In particular, the additional addition of deoxycholic acid significantly increased the amount of luminescence at all added concentrations.
また、デオキシコール酸などの成分を添加すると、溶液がゲル化する。ゲル化した溶液でも検体処理は可能であるが、取り扱いがより容易になるように、処理液にさらにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０又はＮＰ－４０などの非イオン性界面活性剤を添加すると、溶液がゲル化することなく、高い発光量が得られることが分かった。 Addition of a component such as deoxycholic acid causes the solution to gel. Samples can be treated with a gelled solution, but for easier handling, adding a nonionic surfactant such as Tween 80, Tween 20 or NP-40 to the treatment solution will gel the solution. It was found that a high light emission amount can be obtained without
実施例１７：検体処理によるキャプシドの破壊
検体処理によるキャプシドの破壊効率を検討した。
Example 17 Destruction of Capsid by Specimen Treatment The efficiency of capsid destruction by specimen treatment was examined.
方法としては、ウイルス粒子から抽出されたゲノムＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法で半定量することにより、抽出されたＲＮＡの定量を行った。その際、検体処理液または、コントロールとして用いている検体希釈液中にＲＮａｓｅをあらかじめ加えておく事により、検体処理液によってウイルスのキャプシドが破壊される場合は、ＲＮＡ抽出処理を行う前にＲＮＡが分解される。ＲＮａｓｅ処理を加える前のＲＮＡ量と比較することにより、処理液によって粒子から抽出されたＲＮＡ量を推定することができる。これにより、キャプシドの破壊効率を推定することができる。 As a method, genomic RNA extracted from virus particles was semi-quantified by RT-PCR to quantify the extracted RNA. At that time, by adding RNase in advance to the sample treatment solution or the sample diluent used as a control, if the sample treatment solution destroys the capsid of the virus, the RNA will be removed before the RNA extraction treatment. decomposed. The amount of RNA extracted from the particles by the treatment solution can be estimated by comparison with the amount of RNA before adding the RNase treatment. This allows us to estimate the efficiency of capsid disruption.
具体的には、それぞれにＲＮａｓｅ Ａ（終濃度２００μｇ／ｍＬ）を添加した、検体希釈液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ）、０．２５％Ｃ１６ＡＰＳを含む検体処理液（Ｔｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）、表１６に記載の各濃度の界面活性剤と０．２５％Ｃ１６ＡＰＳを含む検体処理液を、購入した鼻咽頭拭い液（Ｂｏｃａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）を検体希釈液に加えて調製した検体に当量添加し、混和後、室温で５分間静置した。その後、ＲＮＡ抽出キット（ＧｅｎｅＪＥＴ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））を用いて、添付のマニュアルに従い、ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲキット（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ））を用いて測定し、ＲＴ－ＰＣＲのＣｔ値を算出した。Ｃｔ値が大きいほど、ＲＮＡが分解され、キャプシドの破壊効率が高いことを示す。結果を表１５と表１６に示す。 Specifically, sample diluent (Tris buffer, 150 mM NaCl, 1% BSA), 0.25% C16APS containing sample treatment solution (Tris buffer , 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.1% NaN 3 ), each concentration of surfactant listed in Table 16, and 0.25% C16APS. LLC) was added to the specimen prepared by adding the diluent to the specimen, and after mixing, the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Then, RNA was extracted using an RNA extraction kit (GeneJET Viral DNA/RNA Purification kit (Thermo Fisher)) according to the attached manual. The obtained RNA was measured using an RT-PCR kit (SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit (TaKaRa)), and the Ct value of RT-PCR was calculated. A higher Ct value indicates that RNA is degraded and the efficiency of capsid disruption is higher. The results are shown in Tables 15 and 16.
その結果、検体希釈液に対し検体処理液（追加なし）で処理することでＣｔ値が４．９増加した。すなわちＲＮＡ量が約１／３０に減少したことから、ＲＮＡの抽出効率が３０倍増加したことが判明した。 As a result, the Ct value increased by 4.9 by treating the specimen with the specimen treatment liquid (no addition) to the specimen diluent. That is, since the amount of RNA decreased to about 1/30, it was found that the extraction efficiency of RNA increased 30 times.
また、検体処理液にデオキシコール酸を０．５％加えたところＣｔ値に大きな変動は無かったものの、１％、２％と加えていくにつれ、Ｃｔ値は３．８、４．９増加した。すなわち、ＲＮＡ量はそれぞれ約１／１４、１／３０減少し、ＲＮＡ抽出効率はそれぞれ１４倍、３０倍上昇したことが判明した。 In addition, when 0.5% deoxycholic acid was added to the sample treatment solution, the Ct value did not change significantly, but the Ct value increased by 3.8 and 4.9 as it was added to 1% and 2%. . That is, it was found that the amount of RNA decreased by about 1/14 and 1/30, respectively, and the efficiency of RNA extraction increased by 14 times and 30 times, respectively.
さらに、検体処理液に非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を添加すると、Ｃｔ値は１増加した。すなわちＲＮＡ量は１／２減少したことから、ＲＮＡ抽出効率が増加した。 Furthermore, when a nonionic surfactant (Tween 20) was added to the specimen treatment solution, the Ct value increased by 1. That is, the amount of RNA was reduced by 1/2, resulting in an increase in RNA extraction efficiency.
これらの結果から、キャプシドの抽出にはＣ１６ＡＰＳが有効であり、さらにそこにデオキシコール酸を１％以上、および非イオン性界面活性剤を加えると、ＲＮＡの抽出効果、つまりキャプシドの破壊効率が増強されることが判明した。 These results indicate that C16APS is effective for capsid extraction, and that addition of 1% or more deoxycholic acid and a nonionic surfactant enhances the RNA extraction effect, that is, the capsid destruction efficiency. It turned out to be.
１ イムノクロマトグラフィーカートリッジ
２ マトリクス
３ 検出ゾーン
４ 標識試薬ゾーン
５ 展開液槽
６ 展開確認部
７ 展開液吸収ゾーン
８ 基質ゾーン
９ 展開液パッド
1
Claims (14)
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。 SARS-CoV-2 immunization, including detecting SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (N protein) in a specimen taken from a subject using the antibodies of (1) and (2) below method of detection:
(1) a first antibody against a first epitope in the amino acid region 260-305 in the SARS-CoV-2 N protein; and (2) a first antibody in the amino acid region 365-419 in the SARS-CoV-2 N protein. Second antibody against 2 epitopes.
前記第１抗体および前記第２抗体の双方が標識抗体として使用される場合、前記第３抗体が固相抗体として使用される、請求項６記載の方法。 when both the first antibody and the second antibody are used as solid-phase antibodies, the third antibody is used as a labeled antibody;
7. The method of claim 6, wherein when both the first antibody and the second antibody are used as labeled antibodies, the third antibody is used as the solid phase antibody.
前記第４抗体が標識抗体として使用され、かつ、前記第５抗体が固相抗体として使用される、請求項６または７記載の方法。 The fourth antibody is used as a solid phase antibody and the fifth antibody is used as a labeled antibody, or the fourth antibody is used as a labeled antibody and the fifth antibody is used as a solid phase antibody 8. A method according to claim 6 or 7, used.
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２６０～３０５番目のアミノ酸領域中の第１エピトープに対する第１抗体；および
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３６５～４１９番目のアミノ酸領域中の第２エピトープに対する第２抗体。 An immunological detection reagent for SARS-CoV-2, including the following antibodies (1) and (2):
(1) a first antibody against a first epitope in the amino acid region 260-305 in the SARS-CoV-2 N protein; and (2) a first antibody in the amino acid region 365-419 in the SARS-CoV-2 N protein. Second antibody against 2 epitopes.
（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における１２０～１４７番目のアミノ酸領域中の第３エピトープに対する第３抗体：
（４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における４４～７８番目のアミノ酸領域中の第４エピトープに対する第４抗体；
（５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における２４３～２５９番目のアミノ酸領域中の第５エピトープに対する第５抗体；および
（６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質における３０６～３３９番目のアミノ酸領域中の第６エピトープに対する第６抗体。 The reagent according to claim 10, wherein the reagent further comprises one or more antibodies selected from the group consisting of (3) to (6) below:
(3) A third antibody against a third epitope in the 120th to 147th amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein:
(4) a fourth antibody against a fourth epitope in the 44th to 78th amino acid region in the SARS-CoV-2 N protein;
(5) a fifth antibody against the fifth epitope in the amino acid region 243-259 in the SARS-CoV-2 N protein; and (6) a fifth antibody in the amino acid region 306-339 in the SARS-CoV-2 N protein. Sixth antibody against six epitopes.
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|---|---|---|---|
| JP2021080408A JP2022174540A (en) | 2021-05-11 | 2021-05-11 | Immunological detection method and reagent for sars-cov-2 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023167317A1 (en) * | 2022-03-04 | 2023-09-07 | 公立大学法人横浜市立大学 | ANTI-SARS-CoV-2 ANTIBODY AGAINST SARS-CoV-2 ANTIGEN IN BODY FLUID, INCLUDING MUTANT; METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 USING ANTIBODY; AND KIT CONTAINING ANTIBODY |
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2021
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