JP2022174016A - ラクトバチルスアシドフィルス菌tw01分離株及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、上記のラクトバチルスアシドフィルス菌TW01分離株を含み、炎症関連障害を軽減する組成物も提供する。
本明細書で使用する場合、用語「炎症関連障害」及び「免疫関連障害」は、互換的に使用することができる。
本開示によれば、該組成物は、当業者によく知られた標準的な技術を用いて、食品として配合することができる。例えば、該組成物は、食用材料に直接添加してもよく、後に食用材料に添加することに適した中間組成物(例えば、食品添加物又はプレミックス)を調製することに使用してもよい。
本開示によれば、経口投与の適切な剤形は、滅菌粉末、錠剤、トローチ、ロゼンジ、持続性フィルムコーティング錠剤、口腔軟膏、ペレット、カプセル、分散性粉末または顆粒、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル剤、スラリー、ドロップなどがあるが、それらに限定されない。
一般実験材料
1.以下の実験で使用したウシ胆汁(脱水精製した新鮮な胆汁)、塩化ナトリウム、グリセロールは、Sigma-Aldrich社から購入したものである。
2.以下の実験で使用した寒天、BD Difco(商標)ラクトバチルスMRS(De Man,Rogosa and Sharpe)ブロス,トリプシン大豆ブロスは、BD(Becton,Dickinson and Company)Biosciences社から購入したものである。
3.API50CHL微生物同定キットは、台湾のCreative Life Science Co, Ltd.社から購入したものである。
4.以下の実験で使用したラクトバチルスMRS寒天培地は、BD Difco(商標)ラクトバチルスMRSブロスに1.5%の寒天を加えて調製した。
5.マウスマクロファージ細胞株RAW 264.7は、財団法人食品工業發展研究所(FIRDI)のバイオソース収集・研究センター(BCRC)(No.331,Shih-Pin Rd.,Hsinchu City 300,Taiwan)から購入したものである。RAW264.7細胞(BCRC 60001)は、10%牛胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Cat.No.D0819、Sigma-Aldrich)を含む10cmペトリ皿で増殖させた。RAW264.7細胞は、培養条件を37℃、5%CO2に設定した培養器で培養した。培地交換は2~3日おきに行った。細胞継代は、培養細胞が80%~90%のコンフルエンスに達した時点で行った。
1. 統計分析
実験データは、平均±標準偏差(SD)で表した。すべてのデータは、グループ間の差異を評価するために、SASソフトウェアを使用して分析された。
A. テストされた菌株の出所と分離
古坑郷(雲林、台湾)で購入したコーヒー粉を発酵反応させ、そして、得られたコーヒー発酵ブロスを適切な量の0.85%の生理食塩水と混合して希釈物を得た(希釈倍率105倍で調製)。0.1mLの希釈液をラクトバチルスMRS寒天培地に均一に広げた後、嫌気性条件下、37℃の培養器で72時間培養した。
B. LAB分離株の細菌懸濁液の調製
この実施例のセクションAで得られた6つのLAB分離株のそれぞれをBD Difco(商標)ラクトバチルスMRSブロスに接種し、そして嫌気性条件下、37℃の培養器で24時間培養した。1200g、10分間の遠心分離を行った後、得られた細胞ペレットを収集してから0.85%の滅菌生理食塩水で洗浄した後、1200g、10分間の遠心分離を行った。前記洗浄及び遠心分離のステップを2回繰り返した。
上澄みを除去した後、1x108CFU/mLの細菌濃度を有する細菌懸濁液を有するように細菌細胞を適切な量の0.85%の滅菌生理食塩水に再懸濁させた。上記のように得られた6つの細菌懸濁液を以下の実験に使用した。
実験手順
A. 耐酸性試験
0.85%の滅菌生理食塩水に5Nの塩酸溶液と0.1Nの滅菌水酸化ナトリウム溶液を加えてpH2.0に調整して、耐酸性試験溶液を得た。実施例1のセクションBで得られた6つの細菌懸濁液のそれぞれ1mLずつを、1.5mLの0.85%の滅菌生理食塩水及び5mLの耐酸性試験溶液と混合した後、培養器(37℃)で合計60分間培養する。培養後の第30分と第60分とに、得られた細胞培養物を100mL収集し、当業者によく知られた平板塗抹法を用いて生存菌数を計数した。更に、コロニー形成単位(CFU)の対数値を算出し、生細胞数をlogCFU/mLで示す。
B.耐胆汁酸塩試験
0.3%(w/v)ウシ胆汁(脱水精製した新鮮な胆汁)含有の滅菌生理食塩水に0.1Nの滅菌水酸化ナトリウム溶液を加えてpH8.0に調整して、模擬胆汁酸塩溶液を得た。実施例1のセクションBで得られた6つの細菌懸濁液のそれぞれ1mLずつを、1.5mLの0.85%の滅菌生理食塩水及び5mLの模擬胆汁酸塩溶液と混合した後、培養器(37℃)で240分間培養する。得られた細胞培養物を100mL収集し、当業者によく知られた平板塗抹法を用いて生存菌数を計数した。更に、コロニー形成単位(CFU)の対数値を算出し、生細胞数をlogCFU/mLで示す。
下記の表1に示されるように、酸性環境(pH2)で培養後の第30分において、LAB分離株B-1の生細胞数は、LAB分離株F3-4、S2-1、K1-2及びD-1の生細胞数より多い。酸性環境(pH2)で培養後の第60分において、LAB分離株F3-4、K1-2及びB-1は、依然として良好な生存性を示した。
実験手順
A.LAB分離株の試験サンプルの調整
実施例1のセクションBで得られた各LAB分離株F3-4、S2-1、B-1及びD-1の細菌懸濁液を凍結乾燥処理させて、LAB分離株F3-4の凍結乾燥粉末、LAB分離株S2-1の凍結乾燥粉末、LAB分離株B-1の凍結乾燥粉末及びLAB分離株D-1の凍結乾燥粉末を得た。4つの凍結乾燥粉末のそれぞれを、適切な量のBD Difco(商標)ラクトバチラスMRSブロスと混合し、得られた試験サンプルを以下の実験にかけた。
B.IL-10及びIL-12の含有量の測定
「一般実験材料」のセクション5で調製したRAW264.7細胞を、ブランク対照群1つ、陽性対照群1つ、実験群8つ(実験群1~8)を含む10のグループに分けた。RAW264.7細胞の各グループを、10%FBSを添加した5mLのDMEM含有の24ウェル培養皿のそれぞれのウェルで6.25×105細胞/ウェルで培養した後、培養器(37度、5%CO2)で48時間培養した。その後、8つの実験群と陽性対照群の各細胞培養物を対応する処理剤で処理し、各グループの細胞培養物が表2に示す対応する処理剤の最終濃度になるようにした。ブランク対照群は処理を受けなかった。
図1及び図2に示されているように、実験群5及び6で測定されたIL-10及びIL-12の含有量は、実験群1~4及び7~8および陽性対照群で測定されたものよりも高く、即ち、LAB分離株B-1の、マクロファージによりIL-10及びIL-12の分泌を刺激する能力は、他のLAB分離株よりも優れていることを示している。従って、LAB分離株B-1は、高い開発の可能性を有し、以下に説明する特性分析を行った。
LAB分離株B-1の細菌種を特定するために、以下の予備的な特性決定、16SrDNA配列分析及び炭水化物発酵プロファイリングを実施した。
A.予備試験
LAB分離株B-1に対して実施された予備試験の項目は、グラム染色、形態学的観察、可動性、カタラーゼ試験、好気状態および嫌気状態下での成長、及び内生胞子を生成する能力を含む。
前記予備試験の結果により、LAB分離株B-1は、グラム陽性、非運動性、且つカタラーゼ陰性、嫌気状態下で成長、且つ内生胞子生成無しと示された。LAB分離株B-1細胞は、球菌型または棒状である。
B.16S rDNA配列分析
LAB分離株B-1のゲノムDNAは、ゲノムDNA精製キット(BioVision、カタログ番号K1457)を使用して抽出した。上記のように得られたゲノムDNAをテンプレートとして使用し、16SリボソームDNA(rDNA)に特異に設計されたプライマー対と表3に示す反応条件とを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、約1460bpのサイズを有するPCR産物を得た。
その後、台湾のSeeing Bioscience Co.、Ltd.に委託して配列解析によりPCR産物を検証して、LAB分離株B-1の16S rDNA配列(SEQ ID No:3)を得た。NCBIの遺伝子データベースのデータとの比較を通じて、LAB分離株B-1の16S rDNA配列は、ラクトバチルスアシドフィルス菌のそれと最も一致する。
前記の実験結果を考慮して、本開示のLAB分離株B-1は、ラクトバチルスアシドフィルス菌であると分かった。
C. 炭水化物発酵プロファイリング
ラクトバチルスアシドフィルス菌TW01分離株(即ちLAB分離株B-1)の炭水化物発酵プロファイリングは、API(登録商標)50CHL識別システム(bioMerieux)を使用して決定した。その結果は、下記の表4に示される。
Claims (7)
- ラクトバチルスアシドフィルス菌TW01分離株を含み、炎症関連障害を軽減する組成物であって、
前記ラクトバチルスアシドフィルス菌TW01分離株は、ドイツ微生物および細胞培養コレクションGmbHに寄託番号DSM 33990で寄託されているものである、組成物。 - 食品または医薬組成物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記医薬組成物は、経口剤形、非経口剤形及び局所剤形からなる群から選択される剤形である、請求項2に記載の組成物。
- 前記炎症関連障害は、アレルギー、喘息、関節炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患及びこれらの組み合わせからなる群から選択される障害である、請求項2に記載の組成物。
- ラクトバチルスアシドフィルス菌TW01分離株を含み、腸内環境を改善する組成物であって、
前記ラクトバチルスアシドフィルス菌TW01分離株は、ドイツ微生物および細胞培養コレクションGmbHに寄託番号DSM 33990で寄託されているものである、組成物。 - 食品または医薬組成物である、請求項5に記載の組成物。
- 前記医薬組成物は、経口剤形、非経口剤形及び局所剤形からなる群から選択される剤形である、請求項6に記載の組成物。
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