JP2022157432A - Carotenoid compound, method for producing the compound, and screening method for oxidosqualene cyclase mutant - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カロテノイド化合物、該化合物の製造方法、並びに、酸化スクアレン環化酵素の変異体のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a carotenoid compound, a method for producing the compound, and a method for screening mutants of oxidized squalene cyclase.
（トリテルペン）
トリテルペンは、動物・植物・微生物がつくる巨大な化合物群であり，20,000を超える化合物が知られている。トリテルペンの中には、ステロールやホパノイドといった細胞膜の重要な構成成分やステロイドホルモンや植物サポニンなどの種々の生理活性を持つものが多数知られ、その生合成経路の解明や異種宿主での再構築が盛んに行われている。興味深いことに，20,000を超えるトリテルペンのほぼ全て（カロテノイド・ボトリオコッセン以外）は、スクアレンというただ一つの化合物を出発物質として生合成される（参照：図１）。
(triterpene)
Triterpenes are a huge group of compounds produced by animals, plants, and microorganisms, and more than 20,000 compounds are known. Many triterpenes, such as sterols and hopanoids, which are important constituents of cell membranes, as well as steroid hormones and plant saponins, are known to have various physiological activities. It is actively carried out. Interestingly, nearly all of the more than 20,000 triterpenes (other than the carotenoid botryococcenes) are biosynthesized starting from a single compound, squalene (see Figure 1).
（エポキシカロテノイドの生合成）
カロテノイド類のエポキシ化カロテノイドは、大腸菌等を使用した異種発現が困難だとされていた。しかし、近年、本発明者らのグループを含むいくつかのグループが、ゼアキサンチンを自然界に知られるヴィオラキサンチンに転換することに成功している。
(Biosynthesis of epoxy carotenoids)
Epoxidized carotenoids of carotenoids have been considered difficult to express heterologously using Escherichia coli or the like. However, in recent years, several groups, including our group, have succeeded in converting zeaxanthin to violaxanthin, which is known in nature.
（スクアレン消費酵素のスクリーニング方法）
本発明者らは、「スクアレン消費酵素遺伝子を、スクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞に導入し、該色素合成量の増加又は低下を指標とする、スクアレン消費酵素及び／又はその変異体のスクリーニング方法」を開発し、さらに該方法により変異型スクアレンホペン環化酵素を取得している（参照：特許文献１）。
しかし、エポキシ基を持つカロテノイド化合物を取得する方法は開示又は示唆はされていない。
(Screening method for squalene-consuming enzyme)
The present inventors introduced a squalene-consuming enzyme gene into a cell capable of synthesizing a pigment via squalene, and used an increase or decrease in the amount of pigment synthesis as an index to obtain a squalene-consuming enzyme and/or its Mutant Screening Method”, and obtained a mutant squalenehopene cyclase by the method (see Patent Document 1).
However, there is no disclosure or suggestion of how to obtain a carotenoid compound having an epoxy group.
（テルペン合成酵素をコードする遺伝子のスクリーニング方法）
本発明者らは、「酵素活性および／またはその発現が野生型酵素と比較して増強されたテルペン合成酵素変異体を導入した細胞に被検遺伝子を導入して培養し、細胞に導入した被検遺伝子のうち生存した細胞に導入した被検遺伝子を選択することにより、テルペン合成に関わる酵素をコードする遺伝子および／またはその変異体をスクリーニングする方法」を報告している（参照：特許文献２）。
(Screening method for gene encoding terpene synthase)
The inventors of the present invention have conducted a method of "introducing a test gene into cells into which a terpene synthase mutant whose enzymatic activity and/or expression is enhanced compared to the wild-type enzyme has been introduced, culturing the cells, and introducing the test gene into the cells. A method for screening genes encoding enzymes involved in terpene synthesis and/or variants thereof by selecting test genes that have been introduced into living cells from among the test genes" (see
高等生物型の生理活性トリテルペンは、すべてがオキシドスクアレンを経由して合成され、該合成の最初のボトルネックがオキシドスクアレンの環化反応である。
本発明者らは、カロテノイド化合物、該化合物の製造方法、並びに、酸化スクアレン環化酵素変異体のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
All higher biotype bioactive triterpenes are synthesized via oxidosqualene, and the first bottleneck in the synthesis is the cyclization reaction of oxidosqualene.
An object of the present inventors is to provide a carotenoid compound, a method for producing the compound, and a screening method for mutant oxidized squalene cyclase.
本発明は、カロテノイド不飽和化酵素がオキシドスクアレンを各種のカロテノイドに転換するという新たな知見により、カロテノイド化合物（特に、エポキシ基を持つカロテノイド化合物）、該化合物の製造方法、並びに、酸化スクアレン環化酵素変異体のスクリーニング方法を完成した。 The present invention provides a carotenoid compound (especially a carotenoid compound having an epoxy group), a method for producing the compound, and oxidized squalene cyclization based on the new finding that carotenoid desaturase converts oxidosqualene into various carotenoids. A screening method for enzyme mutants was completed.
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物。
１）SQS (squalene synthase) をコードする遺伝子、SQE (squalene epoxidase) をコードする遺伝子及びCrtN(4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子群が導入されたファルネシル二リン酸産生能を持つ宿主を培養し、培養後の宿主から式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物を抽出する；
２）SQE (squalene epoxidase) をコードする遺伝子、及びCrtN (4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子群が導入されたスクアレン産生能を持つ宿主を培養し、培養後の宿主から式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物を抽出する；又は
３）CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子が導入されたオキシドスクアレン産生能を持つ宿主を培養し、培養後の宿主から式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物を抽出する、
ことを特徴とする製造方法。
８．以下の１）～８）のいずれか１に記載の前項７に記載のスクリーニング方法：
１）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレン-ラノステロールシクラーゼライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
２）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がβ-Amyrin合成酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
３）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がdammarenediol-IIsynthaseライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
４）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がCycloartenol合成酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
５）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレンのエポキシ基への糖転移酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
６）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレンのエポキシ基を有さない側をエポキシ化するスクアレンエポキシダーゼライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
７）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレンの切断酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；及び
８）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレンの不飽和化活性を有する不飽和化酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレンエポキシダーゼおよびオキシドスクアレン環化酵素であり、前記色素合成量の増加を指標とする。
That is, the present invention is as follows.
1. A compound represented by any one of the following formulas (1) to (4).
1) farnesyl diphosphate-producing ability into which a gene group of genes encoding SQS (squalene synthase), genes encoding SQE (squalene epoxidase) and genes encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) has been introduced; culturing a host having the compound, and extracting a compound represented by any one of formulas (1) to (4) from the cultured host;
2) Culturing a host with squalene-producing ability into which a gene group of a gene encoding SQE (squalene epoxidase) and a gene group encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) has been introduced, and expressing from the host after culture (1) extracting a compound represented by any one of formulas (4); or 3) having oxidosqualene-producing ability introduced with a gene encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) Culturing the host and extracting a compound represented by any one of formulas (1) to (4) from the cultured host,
A manufacturing method characterized by:
8. The screening method according to any one of the following 1) to 8) according to the preceding item 7:
1) The oxidosqualene-consuming enzyme gene is an oxidosqualene-lanosterol cyclase library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme that competes with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the pigment synthesis amount is indexed by a decrease in
2) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is a β-Amyrin synthase library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the pigment synthesis amount is indexed by a decrease in
3) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is a dammarenediol-II synthase library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the amount of pigment synthesis is reduced. indexed by;
4) The oxidosqualene-consuming enzyme gene is a cycloartenol synthase library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the amount of pigment synthesis is reduced. indexed by;
5) The oxidosqualene-consuming enzyme gene is a glycosyltransferase library for oxidosqualene epoxy group, the substrate is oxidosqualene, and the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase. , with the decrease in the amount of pigment synthesis as an index;
6) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is a squalene epoxidase library that epoxidizes the side of oxidosqualene not having an epoxy group, the substrate is oxidosqualene, and the enzyme that competes with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapo It is a phytoene desaturase, and the decrease in the amount of pigment synthesis is used as an index;
7) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is an oxidosqualene-cleaving enzyme library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the pigment synthesis amount is and 8) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is a desaturase library having oxidosqualene desaturation activity, the substrate is oxidosqualene, and the enzyme competes with the oxidosqualene-consuming enzyme. The enzymes are squalene epoxidase and oxidosqualene cyclase, and the increase in the pigment synthesis amount is used as an index.
本発明は、新規カロテノイド化合物（特に、新規エポキシ基を持つカロテノイド化合物）、該化合物の製造方法、並びに、酸化スクアレン環化酵素の変異体のスクリーニング方法を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide novel carotenoid compounds (in particular, novel carotenoid compounds having an epoxy group), methods for producing the compounds, and screening methods for mutants of oxidized squalene cyclase.
（本発明の対象）
本発明は、カロテノイド化合物、該化合物の製造方法、並びに、酸化スクアレン環化酵素変異体のスクリーニング方法に関する。
(Subject of the present invention)
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a carotenoid compound, a method for producing the compound, and a screening method for mutant oxidized squalene cyclase.
（カロテノイド化合物）
本発明は、以下の実施例により、式（１）～式（４）で表される構造を有する新規カロテノイド化合物（特に、新規エポキシ基を持つカロテノイド化合物、以後、「目的化合物」と称する）を取得した。
(carotenoid compound)
The present invention provides novel carotenoid compounds having structures represented by formulas (1) to (4) (in particular, novel epoxy group-containing carotenoid compounds, hereinafter referred to as "target compounds") by the following examples. Acquired.
（6-Hydro-7’,8’-dihydro-4,4’-diapolycopene-5-ol）
6-Hydro-7’,8’-dihydro-4,4’-diapolycopene-5-ol（6-ハイドロ-7 '、8'-ジヒドロ-4,4'-ジアポリコペン-5-オール）は、下記式（１）で表される構造を有する（参照：図３，図５の「peak I」）。
6-Hydro-7',8'-dihydro-4,4'-diapolycopene-5-ol (6-hydro-7',8'-dihydro-4,4'-diapolycopene-5-ol) has the following formula It has a structure represented by (1) (see “peak I” in FIGS. 3 and 5).
（6-Hydro-4,4’-diapolycopene-5-ol）
6-Hydro-4,4’-diapolycopene-5-ol（6-ハイドロ-4,4'-ジアポリコペン-5-オール)は、下記式（２）で表される構造を有する（参照：図３，図５の「peak II」）。
6-Hydro-4,4'-diapolycopene-5-ol (6-hydro-4,4'-diapolycopene-5-ol) has a structure represented by the following formula (2) (see: Fig. 3, “peak II” in FIG. 5).
（Diaponeurosporene 5,6-epoxide）
Diaponeurosporene 5,6-epoxide（ジアポニューロスポレン5,6-エポキシド）は、下記式（３）で表される構造を有する（参照：図３，図５の「peak III」）。
（Diapophytoene 5,6-epoxide）
Diapophytoene 5,6-epoxide（ジアポフィトエン5,6-エポキシド）は、下記式（４）で表される構造を有する（参照：図３，図５の「peak IV」）。
（式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物の製造方法）
本発明の目的化合物の製造方法は、特に限定されないが、以下の宿主を使用する方法を例示することができる。
(Method for producing a compound represented by any one of formulas (1) to (4))
The method for producing the target compound of the present invention is not particularly limited, but the following method using the host can be exemplified.
（式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物を産生する宿主）
本発明の目的化合物を産生する宿主は、式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物の合成に関与する遺伝子群に加えて、好ましくは、Idi (IPPisomerase) をコードする遺伝子、電子伝達系タンパク質をコードする外来性の遺伝子及び／又はNADPH再生系タンパク質をコードする外来性の遺伝子が導入された遺伝子組換え宿主のことである。
具体的には、下記を列挙するが、特に限定されない。
(Host that produces a compound represented by any one of formulas (1) to (4))
The host that produces the target compound of the present invention preferably encodes Idi (IPPisomerase) in addition to the gene group involved in the synthesis of the compound represented by any one of formulas (1) to (4). It is a genetically modified host into which a gene, an exogenous gene encoding an electron transport system protein and/or an exogenous gene encoding a NADPH regeneration system protein has been introduced.
Specifically, the following are listed, but are not particularly limited.
１）SQS (squalene synthase) をコードする遺伝子、SQE (squalene epoxidase) をコードする遺伝子及びCrtN(4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子群が導入されたファルネシル二リン酸産生能を持つ宿主。
２）SQE (squalene epoxidase) をコードする遺伝子、及びCrtN (4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子群が導入されたスクアレン産生能を持つ宿主。
３）CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子が導入されたオキシドスクアレン産生能を持つ宿主。
宿主としては、組換え大腸菌、昆虫系、酵母系、植物細胞系、無細胞系（コムギ胚芽等）等を使用することができるが、特に好ましいのは大腸菌である。
1) farnesyl diphosphate-producing ability into which a gene group of genes encoding SQS (squalene synthase), genes encoding SQE (squalene epoxidase) and genes encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) has been introduced; host to have.
2) A host capable of producing squalene into which a gene group encoding SQE (squalene epoxidase) and a gene group encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) has been introduced.
3) A host capable of producing oxidosqualene into which a gene encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) has been introduced.
As a host, recombinant Escherichia coli, insect systems, yeast systems, plant cell systems, cell-free systems (such as wheat germ) and the like can be used, but Escherichia coli is particularly preferable.
（目的化合物合成に関与する酵素をコードする遺伝子群）
目的化合物合成に関与する酵素をコードする遺伝子群は、以下の遺伝子を例示するが、特に限定されない。
（１）ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate; FPP）からスクアレンを合成する酵素であるスクアレン合成酵素（SQS）をコードする遺伝子
（２）スクアレンから2,3-オキシドスクアレンを合成する酵素であるスクアレンエポキシダーゼ（SQE）をコードする遺伝子
（３）ジアポフィトエンを3段階不飽和化してジアポニューロスポレンを合成する等の作用を有する酵素（ジアポフィトエン不飽和化酵素：CrtN）をコードする遺伝子
さらに、本発明では、好ましくは、電子伝達系タンパク質をコードする遺伝子、NADPH再生系タンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入する。
(Gene group encoding enzymes involved in target compound synthesis)
Genes encoding enzymes involved in target compound synthesis are exemplified by the following genes, but are not particularly limited.
(1) Gene encoding squalene synthase (SQS), an enzyme that synthesizes squalene from farnesyl diphosphate (FPP) (2) Squalene epoxy, an enzyme that synthesizes 2,3-oxidosqualene from squalene (3) A gene encoding an enzyme (diapophytoene desaturase: CrtN) that has actions such as synthesizing diaponeurosporene by desaturating diapophytoene in three steps. Furthermore, in the present invention, preferably, a gene encoding an electron transport system protein and a gene encoding a NADPH regeneration system protein are introduced into the host.
（大腸菌形質転換ベクター）
目的化合物を合成する酵素遺伝子（群）は、公知の方法により、例えば、大腸菌に導入される。大腸菌への外来性遺伝子の導入方法は特に限定されず、例えば、導入したい外来性遺伝子を、公知の方法により適当なプロモータとターミネータの利用により発現する形にして大腸菌の形質転換用ベクターに挿入してプラスミドを作製し、該プラスミドを大腸菌の細胞に導入すればよい。複数の遺伝子を導入する場合、それらの遺伝子は、１つの形質転換用ベクターにより導入されてもよく、それぞれ異なる形質転換用ベクターにより導入されてもよい。
大腸菌の形質転換用ベクターは、導入遺伝子の数や種類等により適宜選択すればよいが、大腸菌のタンパク質発現用ベクター等が好ましい。また、プロモータは、大腸菌中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
また、大腸菌形質転換ベクターにより目的とする外来性遺伝子（例えば、SQEをコードする遺伝子等）が導入された大腸菌細胞を効率よく選抜するために、各種選抜マーカー遺伝子を用いてもよい。
(E. coli transformation vector)
The enzyme gene(s) for synthesizing the target compound is introduced into, for example, Escherichia coli by a known method. The method of introducing the exogenous gene into Escherichia coli is not particularly limited. For example, the exogenous gene to be introduced is inserted into an Escherichia coli transformation vector in a form in which it is expressed by using an appropriate promoter and terminator by a known method. A plasmid may be prepared by the method described above, and the plasmid may be introduced into Escherichia coli cells. When introducing a plurality of genes, those genes may be introduced by one transformation vector, or may be introduced by different transformation vectors.
A vector for E. coli transformation may be appropriately selected according to the number and type of transgenes, but an E. coli protein expression vector is preferable. Any promoter may be used as long as it can be expressed in E. coli.
In addition, various selection marker genes may be used to efficiently select E. coli cells into which a target exogenous gene (for example, a gene encoding SQE) has been introduced by an E. coli transformation vector.
（大腸菌の形質転換と遺伝子組換え大腸菌の取得）
大腸菌の形質転換は、公知の方法により行うことができる。例えば、導入したい外来遺伝子や選抜マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子など）を適当なプロモータとターミネータの利用により発現する形にしたDNA断片を作製し、該DNA断片を熱ショック法等により導入すればよい。遺伝子が導入された大腸菌は、薬剤により選抜することにより得られる。
大腸菌に導入した外来性遺伝子が遺伝子組換え大腸菌において発現していることは、例えば、ノザンブロッティング、RT-PCR、ウェスタンブロッティング等の方法により確認することができる。また、該大腸菌において目的化合物が産生されていることは、例えば、GC-MS分析等の方法により確認することができる。
(Transformation of E. coli and acquisition of genetically modified E. coli)
Transformation of E. coli can be performed by a known method. For example, a DNA fragment is prepared in which a foreign gene to be introduced or a selection marker gene (such as a drug resistance gene) is expressed by using an appropriate promoter and terminator, and the DNA fragment is introduced by a heat shock method or the like. Escherichia coli into which the gene has been introduced is obtained by selection with a drug.
Expression of exogenous genes introduced into E. coli can be confirmed by methods such as Northern blotting, RT-PCR, and Western blotting, for example. In addition, production of the target compound in the E. coli can be confirmed, for example, by a method such as GC-MS analysis.
（遺伝子組換え大腸菌から目的化合物の抽出方法）
作出した遺伝子組換え大腸菌を、通常、培養することにより、該大腸菌内に目的化合物が産生される。遺伝子組換え大腸菌の培養方法は、特に限定されない。
例えば、遺伝子組換え大腸菌には、目的化合物が含まれる。このため公知の抽出方法（溶媒・固相抽出等）により、遺伝子組換え大腸菌から目的化合物を精製することができる。
(Method for extracting target compound from genetically modified Escherichia coli)
By culturing the produced genetically modified E. coli, the target compound is produced in the E. coli. A method for culturing the genetically modified E. coli is not particularly limited.
For example, genetically modified E. coli contain the compound of interest. Therefore, the target compound can be purified from the genetically modified E. coli by a known extraction method (solvent/solid phase extraction, etc.).
（組換え大腸菌以外の宿主）
本発明の目的化合物の製造方法において、組換え大腸菌以外の宿主としては、昆虫系、酵母系、植物細胞系、無細胞系（コムギ胚芽等）等を使用することができる。
これらの宿主においても、適切な各合成酵素遺伝子（SQS、SQE、及びCrtN）及び必要に応じてidi遺伝子（1型及び／又は2型）、電子伝達系タンパク質をコードする遺伝子とNADPH再生系タンパク質をコードする遺伝子等を導入することにより、組換え大腸菌系と同様に、目的化合物の製造が可能になる。
すなわち、各宿主に追加で必要な合成酵素遺伝子は、以下の通りである。
酵母系：SQS、SQE、及びCrtN
昆虫系：SQS、SQE、及びCrtN
植物系：SQS、SQE、及びCrtN
ただし、昆虫系、酵母系、植物細胞系（ただし細胞質）、無細胞系（コムギ胚芽等）等の真核生物が宿主の場合、大腸菌と違って、これらの宿主は元々SQSとSQE遺伝子を持っているので、この２つの遺伝子の導入は必ずしも必要とされない場合もある。
(Hosts other than recombinant E. coli)
In the method for producing the target compound of the present invention, insect systems, yeast systems, plant cell systems, cell-free systems (wheat germ, etc.), etc. can be used as hosts other than recombinant E. coli.
Also in these hosts, appropriate synthase genes ( SQS , SQE , and CrtN ) and, if necessary, idi genes (
That is, the synthase genes additionally required for each host are as follows.
Yeast systems: SQS , SQE , and CrtN
Insect system: SQS , SQE , and CrtN
Plant systems: SQS , SQE , and CrtN
However, when the host is a eukaryotic organism such as an insect system, a yeast system, a plant cell system (but cytoplasmic), or a cell-free system (wheat germ, etc.), unlike E. coli, these hosts originally have the SQS and SQE genes. Therefore, introduction of these two genes may not always be required.
（本発明のスクリーニング方法）
本発明のオキシドスクアレン消費酵素のスクリーニング方法は、オキシドスクアレン消費酵素の探索を行うため、基質から色素を合成することができる細胞にオキシドスクアレン消費酵素遺伝子（候補オキシドスクアレン消費酵素遺伝子）を導入し発現させて、基質の消費をオキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素と競合させ、色素合成量の増減を検出することによる、オキシドスクアレン消費酵素遺伝子のスクリーニング方法に関する。
さらに、本発明は、オキシドスクアレン消費酵素遺伝子ライブラリ（特に、ランダム変異を導入したオキシドスクアレン消費酵素遺伝子ライブラリ）を色素合成可能な細胞に導入し、色素合成量の増減を検出することによる、野生型オキシドスクアレン消費酵素と比較して活性の高い又は安定性が高い変異型オキシドスクアレン消費酵素遺伝子のスクリーニング方法に関する。
(Screening method of the present invention)
In the method of screening for an oxidosqualene-consuming enzyme of the present invention, an oxidosqualene-consuming enzyme gene (candidate oxidosqualene-consuming enzyme gene) is introduced into a cell capable of synthesizing a pigment from a substrate and expressed in order to search for an oxidosqualene-consuming enzyme. The present invention relates to a method of screening for an oxidosqualene-consuming enzyme gene by allowing an enzyme to compete with the oxidosqualene-consuming enzyme for substrate consumption and detecting an increase or decrease in the amount of pigment synthesis.
Furthermore, the present invention provides a wild-type wild-type enzyme gene library (particularly, random mutation-introduced oxidosqualene-consuming enzyme gene library) into a cell capable of pigment synthesis and detecting an increase or decrease in the amount of pigment synthesis. The present invention relates to a method for screening a mutant oxidosqualene-consuming enzyme gene that has higher activity or stability than an oxidosqualene-consuming enzyme.
（オキシドスクアレン消費酵素）
本発明での「オキシドスクアレン消費酵素」とは、オキシドスクアレンの消費に関与する酵素（複数の酵素群も含む）である。特に、オキシドスクアレン消費酵素は、スクアレンを直接又は間接的に色素に転換する作用を有すれば特に限定されない。
例えば、オキシドスクアレン-ラノステロールシクラーゼ、β-Amyrin合成酵素、dammarenediol-IIsynthase、Cycloartenol合成酵素、オキシドスクアレンのエポキシ基への糖転移酵素、オキシドスクアレンのエポキシ基を有さない側をエポキシ化するスクアレンエポキシダーゼ、オキシドスクアレンの切断酵素、オキシドスクアレンの不飽和化活性を有する不飽和化酵素等を例示することができる。
また、本発明での「オキシドスクアレン消費酵素遺伝子」とは、オキシドスクアレン消費酵素をコードする遺伝子である。「その変異体」とは、オキシドスクアレン消費酵素遺伝子のＤＮＡがその一部のヌクレオチドの置換、欠失、付加などにより変異した遺伝子の概念である。自然界で生じた変異でもよいし、人工的になされた変異でもよい。
変異は、発現酵素の酵素活性、発現量又は安定性が高くなる変異が好ましい。また基質特異性を高めるような変異も好ましい。特に、酵素活性を高める変異が好ましい。
変異体のライブラリを作成し、そのライブラリから、その宿主において酵素活性、発現量又は安定性が高い変異体を本発明の方法により、スクリーニングできる。
本発明における「オキシドスクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞へ導入されるオキシドスクアレン消費酵素遺伝子」とは、オキシドスクアレン消費酵素遺伝子若しくはその変異体を含むと考えられる遺伝子又は遺伝子群である。天然の細胞から抽出した遺伝子、作製したライブラリの遺伝子、化学合成遺伝子、ＰＣＲ増幅遺伝子など由来は問わない。本発明のスクリーニング方法は、発現する酵素の基質消費能を指標とするため、未同定の遺伝子をスクリーニングすることができる。
オキシドスクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体の、オキシドスクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞への導入は、遺伝子組み換え技術で用いられている常法によることができる。例えば、ベクターにスクリーニング対象の遺伝子を組み込み、細胞を形質転換する等である。
(Oxidosqualene consuming enzyme)
"Oxidosqualene-consuming enzymes" in the present invention are enzymes (including groups of multiple enzymes) involved in the consumption of oxidosqualene. In particular, the oxidosqualene-consuming enzyme is not particularly limited as long as it has the action of directly or indirectly converting squalene into a pigment.
For example, oxidosqualene-lanosterol cyclase, β-Amyrin synthase, dammarenediol-IIsynthase, cycloartenol synthase, glycosyltransferase to the epoxy group of oxidosqualene, squalene epoxidase that epoxidizes the non-epoxy side of oxidosqualene , oxidosqualene cleaving enzymes, desaturases having oxidosqualene desaturation activity, and the like.
In addition, the "oxidosqualene-consuming enzyme gene" in the present invention is a gene encoding an oxidosqualene-consuming enzyme. "The mutant" is a concept of a gene in which the DNA of the oxidosqualene-consuming enzyme gene is mutated by partial nucleotide substitution, deletion, addition, or the like. It may be a mutation that occurs in nature or may be an artificial mutation.
The mutation is preferably a mutation that enhances the enzymatic activity, expression level, or stability of the expressed enzyme. Mutations that increase substrate specificity are also preferred. Mutations that enhance enzymatic activity are particularly preferred.
A library of mutants can be prepared, and mutants having high enzymatic activity, high expression level, or high stability in the host can be screened from the library by the method of the present invention.
In the present invention, the "oxidosqualene-consuming enzyme gene to be introduced into a cell capable of synthesizing a pigment synthesized via oxidosqualene" is a gene or gene group thought to include an oxidosqualene-consuming enzyme gene or a variant thereof. be. Genes extracted from natural cells, genes in prepared libraries, chemically synthesized genes, PCR-amplified genes, etc., may be of any origin. Since the screening method of the present invention uses the ability of the expressed enzyme to consume the substrate as an index, unidentified genes can be screened.
Introduction of an oxidosqualene-consuming enzyme gene or a variant thereof into a cell capable of synthesizing a pigment synthesized via oxidosqualene can be carried out by a conventional method used in gene recombination technology. For example, a gene to be screened is incorporated into a vector, and cells are transformed.
（オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素）
本発明での「オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素」とは、基質の消費をオキシドスクアレン消費酵素と競合する特性を有する。
例えば、図１５に記載の酵素を例示することができる。
(an enzyme that competes with the oxidosqualene-consuming enzyme)
An "enzyme that competes with an oxidosqualene-consuming enzyme" in the present invention has the property of competing with the oxidosqualene-consuming enzyme for substrate consumption.
For example, the enzymes shown in FIG. 15 can be exemplified.
（色素合成に関与又は競合する酵素の基質）
本発明での「色素合成に関与又は競合する酵素の基質」とは、オキシドスクアレンだけでなく、diapophytoeneepoxide（式（４）で表される化合物）も対象とする。
(Substrates of Enzymes Participating in or Competing with Pigment Synthesis)
In the present invention, the term "substrate of an enzyme that participates in or competes with pigment synthesis" includes not only oxidosqualene but also diapophytoeneepoxide (compound represented by formula (4)).
（本発明のスクリーニング方法での組合せ）
本発明のスクリーニング方法では、図１５に記載の組合せを例示することができるが、特に限定されない。
(Combination in the screening method of the present invention)
In the screening method of the present invention, the combinations shown in FIG. 15 can be exemplified, but are not particularly limited.
オキシドスクアレン-ラノステロールシクラーゼ（ERG7）の変異体（酵素活性が高い変異体）を取得する場合には、野生型と比較して、色素合成量（黄色）が少ない形質転換体を選択する。さらに、必要に応じて、該変異体のLanosterolの合成量を確認することにより、酵素活性が高いかを確認することができる。
β-Amyrin合成酵素（AS) の変異体（酵素活性が高い変異体）を取得する場合には、野生型と比較して、色素合成量（黄色）が少ない形質転換体を選択する。さらに、必要に応じて、該変異体のβ-Amyrinの合成量を確認することにより、酵素活性が高いかを確認することができる。
dammarenediol-IIsynthase (DDS）の変異体（酵素活性が高い変異体）を取得する場合には、野生型と比較して、色素合成量（黄色）が少ない形質転換体を選択する。さらに、必要に応じて、該変異体のdammarenediol-Iの合成量を確認することにより、酵素活性が高いかを確認することができる。
Cycloartenol合成酵素の変異体（酵素活性が高い変異体）を取得する場合には、野生型と比較して、色素合成量（黄色）が少ない形質転換体を選択する。さらに、必要に応じて、該変異体のCycloartenolの合成量を確認することにより、酵素活性が高いかを確認することができる。
オキシドスクアレンのエポキシ基への糖転移酵素の変異体（酵素活性が高い変異体）を取得する場合には、野生型と比較して、色素合成量（黄色）が少ない形質転換体を選択する。さらに、必要に応じて、該変異体のsqualene glycosideの合成量を確認することにより、酵素活性が高いかを確認することができる。
オキシドスクアレンのエポキシ基を有さない側をエポキシ化するスクアレンエポキシダーゼの変異体（酵素活性が高い変異体）を取得する場合には、野生型と比較して、色素合成量（黄色）が少ない形質転換体を選択する。さらに、必要に応じて、該変異体のSqualene Diepoxideの合成量を確認することにより、酵素活性が高いかを確認することができる。
オキシドスクアレンの切断酵素の変異体（酵素活性が高い変異体）を取得する場合には、野生型と比較して、色素合成量（黄色）が少ない形質転換体を選択する。さらに、必要に応じて、該変異体のapooxidosqualeneの合成量を確認することにより、酵素活性が高いかを確認することができる。
オキシドスクアレンの不飽和化活性を有する不飽和化酵素の変異体（酵素活性が高い変異体）を取得する場合には、野生型と比較して、色素合成量（黄色）が多い形質転換体を選択する。さらに、必要に応じて、該変異体の式（１）～（３）で表される化合物の合成量を確認することにより、酵素活性が高いかを確認することができる。
When obtaining a mutant of oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7) (mutant with high enzymatic activity), a transformant that synthesizes less pigment (yellow) than the wild type is selected. Furthermore, if necessary, it is possible to confirm whether the enzyme activity is high by confirming the amount of Lanosterol synthesized by the mutant.
When obtaining a mutant of β-Amyrin synthase (AS) (mutant with high enzymatic activity), a transformant that synthesizes less pigment (yellow) than the wild type is selected. Furthermore, if necessary, it is possible to confirm whether the enzyme activity is high by confirming the amount of β-amyrin synthesized in the mutant.
When obtaining a mutant of dammarenediol-II synthase (DDS) (mutant with high enzymatic activity), a transformant with a lower amount of pigment synthesis (yellow) than the wild type is selected. Furthermore, if necessary, it is possible to confirm whether the enzyme activity is high by confirming the amount of dammarenediol-I synthesized by the mutant.
When obtaining a mutant of cycloartenol synthase (mutant with high enzymatic activity), a transformant that synthesizes less pigment (yellow) than the wild type is selected. Furthermore, if necessary, it is possible to confirm whether the enzyme activity is high by confirming the amount of cycloartenol synthesized by the mutant.
When obtaining a mutant of glycosyltransferase to the epoxy group of oxidosqualene (mutant with high enzymatic activity), a transformant that synthesizes less pigment (yellow) than the wild type is selected. Furthermore, if necessary, it can be confirmed whether the enzyme activity is high by confirming the amount of squalene glycoside synthesized by the mutant.
When obtaining a mutant of squalene epoxidase that epoxidizes the side of oxidosqualene that does not have an epoxy group (a mutant with high enzymatic activity), the amount of pigment synthesized (yellow) is less than that of the wild type. Select transformants. Furthermore, if necessary, it is possible to confirm whether the enzyme activity is high by confirming the amount of Squalene Diepoxide synthesized by the mutant.
When obtaining mutants of the oxidosqualene-cleaving enzyme (mutants with high enzymatic activity), a transformant that synthesizes less pigment (yellow) than the wild type is selected. Furthermore, if necessary, it is possible to confirm whether the enzyme activity is high by confirming the amount of apooxidosqualene synthesized by the mutant.
When obtaining a desaturase mutant (mutant with high enzymatic activity) that has desaturation activity for oxidosqualene, a transformant that synthesizes a large amount of pigment (yellow) compared to the wild type is selected. select. Furthermore, if necessary, it is possible to confirm whether the enzyme activity is high by confirming the amount of synthesis of the compounds represented by formulas (1) to (3) of the mutant.
（オキシドスクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞）
本発明での「オキシドスクアレンを経由して合成される色素合成可能な細胞」は、上記の酵素により色素を生合成することができる細胞であれば制限されない。天然の細胞でも、遺伝子組み換えにより形質転換されている細胞でもよい。遺伝子組み換え細胞は、遺伝子組み換えの操作に簡便な細胞である、大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。
本発明で用いる好ましい色素合成可能な細胞は、色素合成に関与する酵素遺伝子若しくはその変異体、及び／又は、色素合成に競合する酵素遺伝子若しくはその変異体により形質転換されている細胞である。また、さらにイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子により、Idiを細胞に導入し、イソプレノイド経路を強化した細胞が好ましい。
本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、ジアポフィトエン合成酵素（CrtM）遺伝子若しくはその変異体、及び／又はデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子若しくはその変異体を形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能細胞は、C15PPを基質として、ジアポニューロスポレン（黄色）、ジアポリコペン（赤色）等を生成し、細胞が黄色や赤色等になる。CrtM遺伝子とCrtN遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
また、本発明で用いる色素合成可能な細胞は、必要に応じて、CrtM遺伝子若しくはその変異体、及び／又はCrtN遺伝子若しくはその変異体に加え、さらにファルネシル二リン酸合成酵素（FPPS）遺伝子又はその変異体により形質転換された細胞でも良い。その色素合成可能な細胞は、C15PPを基質として、ジアポニューロスポレン（黄色）、ジアポリコペン（赤色）等を生成し、細胞が黄色や赤色等になる。CrtM遺伝子、CrtN遺伝子及びFPPS遺伝子又はそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。
(Cells capable of synthesizing pigments synthesized via oxidosqualene)
The “cells capable of synthesizing pigments synthesized via oxidosqualene” in the present invention are not limited as long as they are cells capable of biosynthesizing pigments using the enzymes described above. It may be a natural cell or a cell that has been transformed by genetic recombination. Genetically modified cells include E. coli, Bacillus subtilis, yeast, etc., which are cells that are easy to manipulate for genetic modification.
Preferred cells capable of pigment synthesis for use in the present invention are cells transformed with enzyme genes involved in pigment synthesis or mutants thereof and/or enzyme genes competing in pigment synthesis or mutants thereof. In addition, the isopentenyl diphosphate isomerase (idi) gene is preferably introduced into the cell to enhance the isoprenoid pathway.
Cells capable of pigment synthesis used in the present invention are optionally transformed with a diapophytoene synthase (CrtM) gene or a variant thereof and/or a dehydrosqualene desaturase (CrtN) gene or a variant thereof. It is also possible to use cells that have undergone The pigment-synthesizing cells use C15PP as a substrate to produce diaponeurosporene (yellow), diapolycopene (red), etc., and the cells become yellow or red. The CrtM gene and CrtN gene or variants thereof may be integrated into the same vector or may be integrated into separate vectors.
In addition, the cells capable of synthesizing pigments used in the present invention may, if necessary, contain the CrtM gene or its mutants and/or the CrtN gene or its mutants, as well as the farnesyl diphosphate synthase (FPPS) gene or its Cells transformed with mutants may also be used. The pigment-synthesizing cells use C15PP as a substrate to produce diaponeurosporene (yellow), diapolycopene (red), etc., and the cells become yellow or red. The CrtM gene, CrtN gene and FPPS gene or variants thereof may be integrated into the same vector or may be integrated into different vectors.
（色素合成量の増加又は低下）
本発明での「色素合成量の増加又は低下」は、細胞における色素生合成の量が増加又は低下し、細胞中の色素量が増加又は減少することである。オキシドスクアレン消費酵素とオキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素が基質の消費を競合することにより、色素合成量が増加又は低下する。すなわち、本発明のスクリーニング方法では、オキシドスクアレン消費酵素遺伝子を導入した色素合成可能な細胞における色素合成量を、オキシドスクアレン消費酵素遺伝子を導入していない色素合成可能な細胞における色素合成量と比較し、色素合成量が増加又は低下した細胞を選択し、その細胞に導入された該遺伝子を酵素活性の高いオキシドスクアレン消費酵素遺伝子であると決定する。
(Increase or decrease in pigment synthesis amount)
"Increase or decrease in the amount of pigment synthesis" in the present invention means that the amount of pigment biosynthesis in cells increases or decreases, and the amount of pigment in cells increases or decreases. Competing for substrate consumption by the oxidosqualene-consuming enzyme and the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme increases or decreases the amount of pigment synthesized. That is, in the screening method of the present invention, the amount of pigment synthesized in cells capable of pigment synthesis into which an oxidosqualene-consuming enzyme gene has been introduced is compared with the amount of pigment synthesized in cells capable of pigment synthesis into which an oxidosqualene-consuming enzyme gene has not been introduced. , cells with increased or decreased pigment synthesis are selected, and the gene introduced into the cells is determined to be an oxidosqualene-consuming enzyme gene with high enzymatic activity.
色素合成量の増加若しくは低下を検出する方法、又は色素合成量の増加若しくは低下を測定する方法は、視認により実施できる。また、各種測定機器、マイクロプレートリーダー、分光光度計、測色光度計などの各種測定機器により検出できる。
本発明のスクリーニング方法を用いれば、細胞を破壊することなく、オキシドスクアレン消費酵素の活性を検出又は測定することができる。具体的には、視認によるときは、細胞のコロニーをプレート上に作成し、コロニー色を観察する。視認によるものであれば、0.3-1.5 mm、特に0.5-1.0 mm直径のコロニーを形成させ、目視により探索する。
スループットをあげる必要があるときは、低倍率拡大鏡などを用い、より小さなコロニーを密集させる手法を用いることができる。また、画像解析ソフトウエアを用いることによって、コロニー色の強弱を定量化し、コロニーピッカーを用いてスクリーニング全般を半自動化することもできる。
A method for detecting an increase or decrease in the amount of dye synthesis, or a method for measuring an increase or decrease in the amount of dye synthesis can be performed visually. In addition, it can be detected by various measuring instruments such as various measuring instruments, microplate readers, spectrophotometers, and colorimetric photometers.
Using the screening method of the present invention, the activity of an oxidosqualene-consuming enzyme can be detected or measured without destroying cells. Specifically, when visual observation is performed, a colony of cells is formed on a plate and the color of the colony is observed. Visually, a colony with a diameter of 0.3-1.5 mm, especially 0.5-1.0 mm is formed and searched visually.
When it is necessary to increase the throughput, a method of concentrating smaller colonies using a low-magnification magnifying glass or the like can be used. In addition, by using image analysis software, the intensity of colony color can be quantified, and overall screening can be semi-automated using a colony picker.
（色素合成可能細胞の製造方法）
色素合成可能細胞は、常法により製造することができる。例えば、各遺伝子を、購入又はＰＣＲなどにより常法により調製し、その遺伝子を宿主に適する発現ベクターに常法により組み込み、目的のベクターを選択し、そのベクターにより宿主細胞を常法により形質転換することにより得られる。
用いる宿主細胞は、制限されないが、培養時間の短縮やクローニングの容易さを考えれば、大腸菌、枯草菌、酵母などが好ましい。特に大腸菌、酵母が好ましく、好適な大腸菌としては、Escherichia coli XL1-Blueのようなクローニング株、HB101やBL21などの発現株に加え、テルペン前駆体の合成量が豊富な遺伝子ノックアウト株、たとえばJW1750ΔgdhA (glutamate dehydrogenase欠損)、JW0110 ΔaceE(pyruvate dehydrogenase欠損)（Baba,T. et al.; Mol Syst Biol 2, 2006 0008 (2006)）等が挙げられ、好適な酵母としては、標準的な発芽酵母、INVSc1(invitrogen)、YPH499(stratagene)等が挙げられる。
好適なベクターは、特に制限はなく、一般に用いられているベクターでよい。例えば、宿主が大腸菌であるときは、pUC18、pACYC184、などに由来するものが挙げられ、宿主が枯草菌であるときはpUB110、pE194、pC194、pHY300PLKDNAなどが、宿主が酵母であるときは、pRS303、YEp213、TOp2609等が挙げられる。
(Method for Producing Cells Capable of Pigment Synthesis)
Pigment-synthesizing cells can be produced by a conventional method. For example, each gene is purchased or prepared by a conventional method such as PCR, the gene is incorporated into an expression vector suitable for the host by a conventional method, a target vector is selected, and the host cell is transformed by the vector by a conventional method. obtained by
The host cells to be used are not limited, but Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast and the like are preferable in consideration of shortening of culture time and easiness of cloning. Escherichia coli and yeast are particularly preferred, and preferred E. coli include cloning strains such as Escherichia coli XL1-Blue, expression strains such as HB101 and BL21, and gene knockout strains that synthesize abundant amounts of terpene precursors, such as JW1750ΔgdhA ( glutamate dehydrogenase-deficient), JW0110 ΔaceE (pyruvate dehydrogenase-deficient) (Baba, T. et al.;
Suitable vectors are not particularly limited, and may be commonly used vectors. Examples include those derived from pUC18, pACYC184, etc. when the host is E. coli, pUB110, pE194, pC194, pHY300PLKDNA, etc. when the host is Bacillus subtilis, and pRS303 when the host is yeast. , YEp213, TOP2609 and the like.
（オキシドスクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体のスクリーニング用キット）
本発明のオキシドスクアレン消費酵素遺伝子又はその変異体のスクリーニング用キットは、色素合成可能細胞を含むものであり得る。色素合成可能細胞は、冷凍保存してバイアル内に封入したものが好適である。あるいは、本発明に係るキットは、所望の細胞を色素合成可能細胞に形質転換するための色素合成酵素遺伝子発現ベクターを構成要素として含むものであり得る。
さらに、上記本発明に係るキットは、被検遺伝子用の発現ベクター、クローニング酵素セット、メタゲノムソース、あるいは配列データベースをもとに作製された（候補）遺伝子ライブラリ、マイクロプレート、イソプレノイド経路（テルペン上流経路）の強化された菌株、培地や添加剤などのスクリーニングに有用な物質や器具（画像スキャナや測色光度計、色見本、コロニーピッカー）などをキットの構成要素として加えることができる。
(Kit for Screening Oxidosqualene Consuming Enzyme Gene or Mutant Thereof)
The kit for screening an oxidosqualene-consuming enzyme gene or a variant thereof of the present invention may contain cells capable of pigment synthesis. The cells capable of chromogenic synthesis are preferably cryopreserved and sealed in vials. Alternatively, the kit according to the present invention may contain, as a component, a chromogenic enzyme gene expression vector for transforming desired cells into cells capable of chromogenic synthesis.
Furthermore, the kit according to the present invention includes an expression vector for a test gene, a cloning enzyme set, a metagenomic source, or a (candidate) gene library prepared based on a sequence database, a microplate, an isoprenoid pathway (terpene upstream pathway ), substances useful for screening such as media and additives, and instruments (image scanner, colorimetric photometer, color sample, colony picker), etc. can be added as components of the kit.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
（新規カロテノイド化合物の製造）
本発明者らは、カロテノイド不飽和化酵素がオキシドスクアレンを各種のカロテロノイドに転換するという新たな知見により、新規カロテノイド化合物（特に、エポキシ基を持つカロテノイド化合物）を製造した。詳細は、以下の通りである。
(Production of novel carotenoid compounds)
The present inventors produced novel carotenoid compounds (in particular, carotenoid compounds having an epoxy group) based on the new knowledge that carotenoid desaturase converts oxidosqualene into various carotenoids. Details are as follows.
（発現系の構築）
シロイヌナズナ（Arabidopsis thariana）由来のスクアレンエポキシダーゼの遺伝子（sqe)を大腸菌にコドン最適化した形で合成した。
コドン最適化したスクアレンエポキシダーゼの遺伝子（sqe：（配列番号１）をT5/lacO-promoter下流の制限酵素EcoRIおよびSpeIサイトに挿入し，pJ404-pT5/lacO-SQEを作製した。
(Construction of expression system)
A squalene epoxidase gene (sqe) from Arabidopsis thaliana was synthesized in a codon-optimized form for E. coli.
A codon-optimized squalene epoxidase gene (sqe: (SEQ ID NO: 1) was inserted into restriction enzyme EcoRI and SpeI sites downstream of T5/lacO-promoter to prepare pJ404-pT5/lacO-SQE.
（エポキシ基を持つ新規カロテノイドの生合成及び合成確認）
SQS (スクアレン合成酵素)およびSQE(スクアレンエポキシダーゼ)をCrtN(ジアポフィトエン不飽和化酵素）と共存させた大腸菌株XL1Blueの生産物解析をHPLC-MSを用いて行ったところ、スクアレン/カロテノイド/オキシドスクアレン以外の新規な化合物が3つ検出された（参照：図２のpeak I, II, III）。
peak IIIの化合物の吸収波長は、Diaponeurosporene（peak IV）と同じであり、m/zの値から Squaleneにエポキシ基が付加されていることが分かる。よって、peak IIIの化合物はDiaponeurosporeneの末端にエポキシ基を持つ新規カロテノイドであることを確認した。これにより、peak IIIの化合物は、Diaponeurosporene 5,6-epoxideであると特定した。
peak IIの吸収波長は、共役二重結合数が10のSpheroidene [参照文献：（George Britton, Synnove Liaaen-Jensen, & Hanspeter Pfander,“Carotenoids Handbook”, Birkhäuser Basel (2004)）]とほぼ同じため、peak IIIがさらにもう1回不飽和化された化合物である。しかし，m/zの値は419とpeak IIIと同じであり、不飽和化されていればm/zはpeak IIIよりも2小さくなるはずである。この結果から，peak IIの構造は、peak IIIがさらにもう一回不飽和化されかつエポキシ基が開環した構造である。これにより、peak IIの化合物は、6-Hydro-4,4’-diapolycopene-5-olであると特定した。
peak Iの吸収波長はpeak IIIよりも短波長側にシフトしており，m/zはpeak IIよりも2大きい。そのため、peak I は、peak IIよりも不飽和化が一段階手前の化合物であると考えられる。これにより、peak Iの化合物は、6-Hydro-7’,8’-dihydro-4,4’-diapolycopene-5-olであると特定した。
CrtM (ジアポフィトエン合成酵素)およびSQE(スクアレンエポキシダーゼ)をCrtN(ジアポフィトエン不飽和化酵素)と共存させた大腸菌株XL1Blueの生産物解析をHPLC-MSを用いて行ったところ、ジアポフィトエン/カロテノイド以外の新規な化合物が1つ検出された（参照：図４のpeak VI）。
peak VIのm/zは、Diapophytoeneよりも16大きい。そのため、peak VIの化合物は、Diapophytoeneの末端にエポキシ基を持つDiapophytoene 5,6-epoxideであることを特定した。
以上により、本実施例により、4つの新規カロテノイドを合成できることを確認した。
(Biosynthesis and synthesis confirmation of novel carotenoids with epoxy groups)
HPLC-MS was used to analyze the products of E. coli strain XL1Blue in which SQS (squalene synthase) and SQE (squalene epoxidase) coexisted with CrtN (diapophytoene desaturase). Three novel compounds other than oxidosqualene were detected (see peaks I, II, and III in FIG. 2).
The peak III compound has the same absorption wavelength as Diaponeurosporene (peak IV), and the m/z value indicates that an epoxy group is added to Squalene. Therefore, it was confirmed that the compound of peak III is a novel carotenoid having an epoxy group at the end of diaponeurosporene. Accordingly, the peak III compound was identified as
The absorption wavelength of peak II is almost the same as that of spheroidene with 10 conjugated double bonds [reference: (George Britton, Synnove Liaaen-Jensen, & Hanspeter Pfander, “Carotenoids Handbook”, Birkhäuser Basel (2004))] Therefore, peak III is the compound that is desaturated one more time. However, the value of m/z is the same as 419 and peak III, and if desaturated, m/z should be 2 less than peak III. From this result, the structure of peak II is a structure in which peak III is desaturated one more time and the epoxy group is ring-opened. Accordingly, the peak II compound was identified as 6-Hydro-4,4'-diapolycopene-5-ol.
The absorption wavelength of peak I is shifted to the shorter wavelength side than that of peak III, and m/z is 2 larger than that of peak II. Therefore, peak I is considered to be a compound one step before peak II in desaturation. Accordingly, the peak I compound was identified as 6-Hydro-7',8'-dihydro-4,4'-diapolycopene-5-ol.
When CrtM (diapophytoene synthase) and SQE (squalene epoxidase) coexisted with CrtN (diapophytoene desaturase), Escherichia coli strain XL1Blue was subjected to product analysis using HPLC-MS. One novel compound other than phytoene/carotenoid was detected (see peak VI in FIG. 4).
The m/z of peak VI is 16 higher than that of diapophytoene. Therefore, the peak VI compound was identified as
From the above, it was confirmed that four novel carotenoids could be synthesized according to this example.
（新規カロテノイドの生合成経路の特定）
CrtNは、Diapophytoeneの不飽和化を担う酵素であるが，基質特異性の低い酵素である（参照：図３）。そのため，peak I, IIの化合物はOxidosqualeneがCrtNによって不飽和化されて合成されると考えられる。これを確かめるために，SQEをCrtMまたはCrtM-CrtNと共発現して，その生産物解析を行った（参照：図４）。SQEをCrtM-CrtNと共発現したところpeak I, II,およびIIIは検出されなかった。一方、SQEをCrtMと共発現した場合、Diapophytoeneのエポキシ化物と思われるpeak VIがわずかではあるが検出された。peak VIのm/zはDiapophytoeneよりも16大きい。そのため，peak VIの化合物はDiapophytoeneの末端にエポキシ基を持つDiapophytoene 5,6-epoxideである。つまり，SQEはSqualeneに対する活性よりは弱いがDiapophytoeneもエポキシ化することを確認した。
これらの結果から，エポキシカロテノイドの合成は、先にSqualeneがエポキシ化された後不飽和化されて合成されるルートが主であることを確認した（参照：図５）。
(Identification of novel carotenoid biosynthetic pathways)
CrtN is an enzyme responsible for desaturation of diapophytoene, but it has low substrate specificity (see Fig. 3). Therefore, the compounds of peaks I and II are considered to be synthesized by desaturation of oxidosqualene with CrtN. To confirm this, SQE was co-expressed with CrtM or CrtM-CrtN and the product analysis was performed (see Fig. 4). When SQE was co-expressed with CrtM-CrtN, peaks I, II and III were not detected. On the other hand, when SQE was co-expressed with CrtM, a small amount of peak VI, which is thought to be an epoxidation product of diapophytoene, was detected. The m/z of peak VI is 16 larger than that of diapophytoene. Therefore, the peak VI compound is
From these results, it was confirmed that the synthesis of epoxy carotenoids is mainly synthesized by first epoxidizing Squalene and then desaturating it (see FIG. 5).
（オキシドスクアレン消費酵素の活性スクリーニング）
本実施例では、Oxidosqualeneの色素化経路との共存によってERG7の活性を可視化できるかを確認した。
Squalene合成plasmidとしてpSC-hsqsを、色素化plasmidとしてpAC-crtN-idiまたはpAC-crtN-crtNb-idiを、Oxidosqualene合成およびその消費としてpJ404-sqe-erg7をXL1Blueに導入し、コロニーの色を観察した（参照：図６）。
SQEのみの場合では、濃く色が付いた。一方で、ERG7を追加発現するとコロニーの色は薄くなった。さらに、CrtNbという末端をアルデヒド化し共役系を広げる酵素を追加すると、コロニーの色は赤くなり、より視認性が高まると共に、ERG7追加発現による色の変化が大きくなった。
より詳しくは、SQEの存在により、ERG7の活性の強弱を確認することができる。例えば、図３を参照すると、スクリーニングしたERG7（図３中の“cyclase”）の活性が高い場合には、図３の右上方向の合成が優位になる。なお、右下方向にいくには、crtNが必要である。また、スクリーニングしたSQEの活性が弱い場合には、図３の左下方向の合成が優位になる。
この結果から、Oxidosqualene消費酵素の変異体のスクリーニングも可能であることが分かり、様々なOxidosqualene環化酵素の機能発現や活性改良に使用することができる。
(Activity screening of oxidosqualene-consuming enzymes)
In this example, it was confirmed whether ERG7 activity could be visualized by coexistence with the pigmentation pathway of oxidosqualene.
Introduce pSC-hsqs as a squalene-synthesizing plasmid, pAC-crtN-idi or pAC-crtN-crtNb-idi as a chromogenic plasmid, and pJ404-sqe-erg7 as a oxidosqualene-synthesizing and consuming plasmid into XL1Blue, and observe colony colors. (Ref: Fig. 6).
In the case of SQE only, it was darkly colored. On the other hand, additional expression of ERG7 resulted in lighter colonies. Furthermore, addition of CrtNb, an enzyme that aldehydes the ends and expands the coupling system, made the color of the colonies red, which enhanced visibility, and increased the color change due to the additional expression of ERG7.
More specifically, the presence of SQE can confirm the intensity of ERG7 activity. For example, referring to FIG. 3, when the activity of the screened ERG7 (“cyclase” in FIG. 3) is high, synthesis in the upper right direction of FIG. 3 becomes dominant. Note that crtN is required to go to the lower right direction. Moreover, when the activity of the screened SQE is weak, the synthesis in the lower left direction of FIG. 3 becomes dominant.
From this result, it was found that it is possible to screen mutants of oxidosqualene-consuming enzymes, and it can be used to express the function and improve the activity of various oxidosqualene cyclases.
詳しくは、以下のオキシドスクアレン消費酵素をスクリーニングすることができる。
１）スクアレンエポキシダーゼの存在下において、各種ステロール化合物の合成量を向上させる酸化スクアレン環化酵素（例えば，β-Amyrin，Lanosterol，Cycloartenol，Dammarenediol II等の合成酵素，およびそれらのより活性が高い・安定性が高い変異体）
２）スクアレンエポキシダーゼの存在下において、オキシドスクアレンの二重結合を水素化する飽和化酵素
３）スクアレンエポキシダーゼの存在下において、オキシドスクアレンのエポキシ基への糖転移酵素
４）スクアレンエポキシダーゼの存在下において、オキシドスクアレンのエポキシ基を有さない側をエポキシ化するスクアレンエポキシダーゼ
５）スクアレンエポキシダーゼの存在下において、オキシドスクアレンの切断酵素
６）スクアレンエポキシダーゼおよびオキシドスクアレン環化酵素（例えばLanosterol合成酵素）の存在下において、オキシドスクアレンの不飽和化活性を有する不飽和化酵素
Specifically, the following oxidosqualene consuming enzymes can be screened.
1) In the presence of squalene epoxidase, an oxidative squalene cyclase that improves the amount of synthesis of various sterol compounds (e.g., β-Amyrin, Lanosterol, Cycloartenol, Dammarenediol II synthase, etc., and their higher activity mutant with high stability)
2) a saturase that hydrogenates the double bond of oxidosqualene in the presence of squalene epoxidase 3) a glycosyltransferase to the epoxy group of oxidosqualene in the presence of squalene epoxidase 4) the presence of squalene epoxidase 5) oxidosqualene cleaving enzyme in the presence of squalene epoxidase 6) squalene epoxidase and oxidosqualene cyclase (e.g. Lanosterol synthesis). desaturase having desaturation activity of oxidosqualene in the presence of
（オキシドスクアレン消費酵素の活性スクリーニングによる変異体取得）
本実施例では、本発明のスクリーニング方法により、野生型と比較して活性の高いオキシドスクアレン-ラノステロールシクラーゼ（ERG7）、野生型と比較して活性の高いβ-Amyrin合成酵素（AS）及びdammarenediol-IIsynthase (DDS)を取得できることを確認した。詳細は、以下の通りである。
(Obtaining mutants by activity screening of oxidosqualene-consuming enzymes)
In this example, the screening method of the present invention demonstrated that oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7), which has higher activity than the wild type, β-Amyrin synthase (AS), and dammarenediol- It was confirmed that IIsynthase (DDS) could be obtained. Details are as follows.
Saccharomyces cerevisiae由来のERG7（配列番号２）、Euphorbia tirucalli由来のAS（配列番号３）又はPanax ginseng 由来のDDSの遺伝子（配列番号４）をpT5-LacO下流に配置した発現系を構築した。
上記の遺伝子をepPCR法によって増幅した。
〇反応条件は以下の通りである。
テンプレートplamsid 量：5 ng/ 反応体積50 μL
PCRバッファNEB10×Thermo Pol Reaction Buffer
dNTP濃度0.2 mM each，Mg濃度0.2 mM，Mn濃度10 μM
NEB Taq DNA Polymerase，5 units
最終収量5000 ng，増幅率1000倍
〇得られたDNAをゲル抽出および精製し，ベクターにライゲーションした。
vector：100 ng，insert：122 ng，反応体積10 μL，
反応時間16時間、反応温度16℃、NEB T4 DNA Ligase，40 units
得られらLigation液を精製し、大腸菌株BW25113を形質転換した。得られた形質転換体を40 mLのLB培地にて一晩37℃で振とう培養した。得られた培養液のうち2 mLを回収し，菌体からプラスミドを回収しライブラリを得た。形質転換体の一部を固体培地上に植菌し，コロニー形成数からライブラリサイズは以下のようになった。また，各ライブラリのBack ligationは1%以下であった。
[AS]lib: 7.2×104
[DDS]lib: 4.1×104
[ERG7]lib: 1.2×104
An expression system was constructed in which the Saccharomyces cerevisiae-derived ERG7 (SEQ ID NO: 2), Euphorbia tirucalli-derived AS (SEQ ID NO: 3), or Panax ginseng-derived DDS gene (SEQ ID NO: 4) was arranged downstream of pT5-LacO.
The above genes were amplified by the epPCR method.
o The reaction conditions are as follows.
Amount of template plamsid: 5 ng/50 μL reaction volume
PCR BufferNEB10×Thermo Pol Reaction Buffer
dNTP concentration 0.2 mM each, Mg concentration 0.2 mM,
NEB Taq DNA Polymerase, 5 units
Final yield: 5000 ng, amplification rate: 1000 times. The resulting DNA was gel-extracted, purified, and ligated to the vector.
vector: 100 ng, insert: 122 ng,
Reaction time 16 hours, reaction temperature 16°C, NEB T4 DNA Ligase, 40 units
The resulting ligation solution was purified and transformed into E. coli strain BW25113. The resulting transformant was cultured overnight at 37°C in 40 mL of LB medium with shaking. 2 mL of the resulting culture medium was collected, and plasmids were collected from the cells to obtain a library. A part of the transformant was inoculated on a solid medium, and the library size was as follows from the number of colonies formed. Back ligation of each library was less than 1%.
[AS]lib: 7.2×10 4
[DDS] lib: 4.1×10 4
[ERG7]lib: 1.2×10 4
上記得られた各ライブラリpSC-SQS（参照：図１４）およびpAC-CrtN-SQE-idi（参照：図１３）と共に大腸菌株XL1Blueに導入した。得た形質転換体をニトロセルロース（NC）膜上に植菌し、37℃で24時間静置培養しコロニーを形成させた。その後22℃にてさらに72時間培養し、スクリーニングを行った。[AS]libはおよそ4000個のコロニーのうち、約5%が親よりも薄い色のコロニーであった。[DDS]libはおよそ3000個のコロニーのうち、約5%が親よりも薄い色のコロニーであった（図７）。
すなわち、親より薄い色のコロニーのDDSおよびASは、親と比較して、それぞれDammarenediol-IIおよびβ-Amyrin合成酵素活性が高い。
Each library pSC-SQS (see FIG. 14) and pAC-CrtN-SQE-idi (see FIG. 13) obtained above were introduced into E. coli strain XL1Blue. The obtained transformants were inoculated onto a nitrocellulose (NC) membrane and allowed to stand and culture at 37°C for 24 hours to form colonies. After that, the cells were further cultured at 22°C for 72 hours and screened. Of approximately 4000 [AS]lib colonies, about 5% were lighter in color than the parent. Of approximately 3000 [DDS]lib colonies, approximately 5% were lighter in color than the parent (Fig. 7).
That is, DDS and AS in colonies lighter than the parent have higher Dammarenediol-II and β-Amyrin synthase activity, respectively, compared to the parent.
（総論）
本実施例では、以下の点を確認及び構築した。
新しい、オキシドスクアレンを経由した色素合成経路を構築した。ここで得られる色素は、末端にエポキシ基を有する特徴的な機能性色素・抗酸化剤であり、エポキシ基を反応点として，適切な触媒の元、タンパク質や機能性化合物と反応させることが可能である。また，末端エポキシ基は有機無機表面・基盤上への固定点となるため，太陽電池や電極上への光捕集機能の付与・固定が可能となる。
これらの色素群は，オキシドスクアレンを経由して合成されるため、オキシドスクアレンを基質とする様々な酵素活性のスクリーニングに使うことが出来る。すなわち，オキシドスクアレン消費活性に応じて、色素合成量が上昇又は低下し、細胞の色の違いとして視認することが出来る。生理活性を持つ高等生物型の様々なオキシドスクアレン環化酵素変異体を取得することができる。
(general)
In this example, the following points were confirmed and constructed.
We constructed a new dye synthesis route via oxidosqualene. The dyes obtained here are characteristic functional dyes and antioxidants with epoxy groups at their ends, and can be reacted with proteins and functional compounds using appropriate catalysts using the epoxy groups as reaction sites. is. In addition, since the terminal epoxy group serves as a fixing point on the organic/inorganic surface/substrate, it is possible to impart/fix the light-collecting function on the solar cell or electrode.
Since these dyes are synthesized via oxidosqualene, they can be used for screening various enzymatic activities using oxidosqualene as a substrate. That is, depending on the oxidosqualene consumption activity, the amount of pigment synthesis increases or decreases, which can be visually recognized as a difference in cell color. Various oxidosqualene cyclase mutants of higher biotypes with physiological activity can be obtained.
新規カロテノイド化合物（特に、新規エポキシ基を持つカロテノイド化合物）、該化合物の製造方法、並びに、酸化スクアレン環化酵素の変異体のスクリーニング方法を提供することができる。 A novel carotenoid compound (in particular, a novel carotenoid compound having an epoxy group), a method for producing the compound, and a screening method for mutants of oxidized squalene cyclase can be provided.
Claims (8)
１）SQS (squalene synthase) をコードする遺伝子、SQE (squalene epoxidase) をコードする遺伝子及びCrtN(4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子群が導入されたファルネシル二リン酸産生能を持つ宿主を培養し、培養後の宿主から式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物を抽出する；
２）SQE (squalene epoxidase) をコードする遺伝子、及びCrtN (4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子群が導入されたスクアレン産生能を持つ宿主を培養し、培養後の宿主から式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物を抽出する；又は
３）CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase)をコードする遺伝子の遺伝子が導入されたオキシドスクアレン産生能を持つ宿主を培養し、培養後の宿主から式（１）～式（４）のいずれか１で表される化合物を抽出する、
ことを特徴とする製造方法。
1) farnesyl diphosphate-producing ability into which a gene group of genes encoding SQS (squalene synthase), genes encoding SQE (squalene epoxidase) and genes encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) has been introduced; culturing a host having the compound, and extracting a compound represented by any one of formulas (1) to (4) from the cultured host;
2) Culturing a host with squalene-producing ability into which a gene group of a gene encoding SQE (squalene epoxidase) and a gene group encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) has been introduced, and expressing from the host after culture (1) extracting a compound represented by any one of formulas (4); or 3) having oxidosqualene-producing ability introduced with a gene encoding CrtN (4,4'-diapophytoene desaturase) Culturing the host and extracting a compound represented by any one of formulas (1) to (4) from the cultured host,
A manufacturing method characterized by:
An oxidosqualene-consuming enzyme gene, a substrate, and an enzyme that competes with the oxidosqualene-consuming enzyme or the enzyme gene are introduced into cells capable of synthesizing a pigment synthesized via oxidosqualene, thereby increasing or decreasing the amount of the pigment synthesized. A screening method for an oxidosqualene-consuming enzyme and/or a mutant thereof used as an index.
１）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレン-ラノステロールシクラーゼライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
２）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がβ-Amyrin合成酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
３）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がdammarenediol-IIsynthaseライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
４）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がCycloartenol合成酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
５）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレンのエポキシ基への糖転移酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
６）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレンのエポキシ基を有さない側をエポキシ化するスクアレンエポキシダーゼライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；
７）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレンの切断酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がジアポフィトエン不飽和化酵素であり、前記色素合成量の低下を指標とする；及び
８）前記オキシドスクアレン消費酵素遺伝子がオキシドスクアレンの不飽和化活性を有する不飽和化酵素ライブラリであり、前記基質がオキシドスクアレンであり、前記オキシドスクアレン消費酵素と競合する酵素がスクアレンエポキシダーゼおよびオキシドスクアレン環化酵素であり、前記色素合成量の増加を指標とする。 The screening method according to claim 7, any one of the following 1) to 8):
1) The oxidosqualene-consuming enzyme gene is an oxidosqualene-lanosterol cyclase library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme that competes with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the pigment synthesis amount is indexed by a decrease in
2) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is a β-Amyrin synthase library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the pigment synthesis amount is indexed by a decrease in
3) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is a dammarenediol-II synthase library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the amount of pigment synthesis is reduced. indexed by;
4) The oxidosqualene-consuming enzyme gene is a cycloartenol synthase library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the amount of pigment synthesis is reduced. indexed by;
5) The oxidosqualene-consuming enzyme gene is a glycosyltransferase library for oxidosqualene epoxy group, the substrate is oxidosqualene, and the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase. , with the decrease in the amount of pigment synthesis as an index;
6) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is a squalene epoxidase library that epoxidizes the side of oxidosqualene not having an epoxy group, the substrate is oxidosqualene, and the enzyme that competes with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapo It is a phytoene desaturase, and the decrease in the amount of pigment synthesis is used as an index;
7) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is an oxidosqualene-cleaving enzyme library, the substrate is oxidosqualene, the enzyme competing with the oxidosqualene-consuming enzyme is diapophytoene desaturase, and the pigment synthesis amount is and 8) the oxidosqualene-consuming enzyme gene is a desaturase library having oxidosqualene desaturation activity, the substrate is oxidosqualene, and the enzyme competes with the oxidosqualene-consuming enzyme. The enzymes are squalene epoxidase and oxidosqualene cyclase, and the increase in the pigment synthesis amount is used as an index.
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