JP2022155487A - Enzyme and method for decomposing polyester resin - Google Patents

Abstract

To provide a technique for decomposing polyester plastic, using a marine microorganism-derived enzyme.SOLUTION: An enzyme comprises any amino acid sequence selected from specific 10 amino acid sequences, or an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to any one selected from these amino acid sequences, the enzyme having hydrolysis activity to polyester resin.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、ポリエステル樹脂分解酵素、該酵素を発現する組換え微生物、及びこれらを用いたポリエステル樹脂の分解方法、並びに該酵素を含有する樹脂組成物に関する。より詳しくは、海洋微生物由来のポリエステル樹脂分解酵素等に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a polyester resin-degrading enzyme, a recombinant microorganism that expresses the enzyme, a method for decomposing a polyester resin using the same, and a resin composition containing the enzyme. More particularly, it relates to a polyester resin-degrading enzyme derived from marine microorganisms.

マイクロプラスチックによる海洋汚染の懸念をうけ、プラスチック廃棄物による環境汚染問題への取り組みの重要性が改めて高まっており、プラスチック廃棄物の分解、再資源化のための技術の開発が望まれている。 In response to concerns about marine pollution caused by microplastics, the importance of tackling the problem of environmental pollution caused by plastic waste has risen again, and the development of technologies for decomposing and recycling plastic waste is desired.

本発明に関連して、例えば、特許文献１では、レプトスリックス属の微生物由来の酵素を用いたポリエステル系プラスチックの分解方法が提案されている。 In relation to the present invention, for example, Patent Document 1 proposes a method for decomposing a polyester-based plastic using an enzyme derived from a microorganism belonging to the genus Leptothrix.

特開２００６－１９７８８３号公報JP 2006-197883 A

本発明は、海洋微生物由来の酵素を用いた、ポリエステル系プラスチックの分解のための技術を提供することを主な目的とする。 The main object of the present invention is to provide a technique for decomposing polyester plastics using enzymes derived from marine microorganisms.

上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］－［２２］を提供する。
［１］ 配列番号１－１０のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１－１０のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
ポリエステル樹脂に対する加水分解活性を有する、
酵素。
［２］ 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂である、［１］の酵素。
［２－２］ 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂又は非生分解性ポリエステル樹脂であり、
配列番号１０のアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、［１］の酵素。
［３］ 前記生分解性ポリエステル樹脂が、脂肪族ポリエステル樹脂である、［２］の酵素。
［４］ 前記脂肪族ポリエステル樹脂が、炭素数２－２０のジオール化合物と炭素数２－２０のジカルボン酸との重合物である、［３］の酵素。
［５］ ［１］の酵素をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター又は該酵素を発現する組換え微生物。 In order to solve the above problems, the present invention provides the following [1]-[22].
[1] consisting of an amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1-10 or an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-10;
having hydrolytic activity on polyester resins,
enzyme.
[2] The enzyme of [1], wherein the polyester resin is a biodegradable polyester resin.
[2-2] the polyester resin is a biodegradable polyester resin or a non-biodegradable polyester resin,
The enzyme of [1], which consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:10 or an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
[3] The enzyme of [2], wherein the biodegradable polyester resin is an aliphatic polyester resin.
[4] The enzyme according to [3], wherein the aliphatic polyester resin is a polymer of a diol compound having 2 to 20 carbon atoms and a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms.
[5] A nucleic acid encoding the enzyme of [1], an expression vector containing the nucleic acid, or a recombinant microorganism expressing the enzyme.

［６］ ［１］の酵素と、ポリエステル樹脂と、を含有する樹脂組成物。
［７］ 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂である、［６］の樹脂組成物。
［７－２］ 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂又は非生分解性ポリエステル樹脂であり、
前記酵素が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
［６］の樹脂組成物。
［８］ 前記生分解性ポリエステル樹脂が、脂肪族ポリエステル樹脂である、［７］の樹脂組成物。
［９］ 前記脂肪族ポリエステル樹脂が、炭素数２－２０のジオール化合物と炭素数２－２０のジカルボン酸との重合物である、［８］の樹脂組成物。 [6] A resin composition containing the enzyme of [1] and a polyester resin.
[7] The resin composition of [6], wherein the polyester resin is a biodegradable polyester resin.
[7-2] the polyester resin is a biodegradable polyester resin or a non-biodegradable polyester resin,
wherein said enzyme consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10;
The resin composition of [6].
[8] The resin composition of [7], wherein the biodegradable polyester resin is an aliphatic polyester resin.
[9] The resin composition of [8], wherein the aliphatic polyester resin is a polymer of a diol compound having 2 to 20 carbon atoms and a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms.

［１０］ ［１］の酵素又は［５］の組換え微生物と、ポリエステル樹脂と、を接触させる工程を含む、ポリエステル樹脂の分解方法。
［１１］ 前記工程が、海水中で行われる、［１０］の分解方法。
［１２］ 前記工程が、3重量％以上のNaCl存在下で行われる、［１０］の分解方法。
［１３］ 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂である、［１０］－［１２］のいずれかの分解方法。
［１３－２］ 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂又は非生分解性ポリエステル樹脂であり、
前記酵素が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、［１０］－［１２］のいずれかの分解方法。
［１４］ 前記生分解性ポリエステル樹脂が、脂肪族ポリエステルである、［１０］－［１３］のいずれかの分解方法。
［１５］ 前記脂肪族ポリエステル樹脂が、炭素数２－２０のジオール化合物と炭素数２－２０のジカルボン酸との重合物である、［１４］の分解方法。 [10] A method for decomposing a polyester resin, comprising the step of contacting the enzyme of [1] or the recombinant microorganism of [5] with the polyester resin.
[11] The decomposition method of [10], wherein the step is performed in seawater.
[12] The decomposition method of [10], wherein the step is performed in the presence of 3% by weight or more of NaCl.
[13] The decomposition method according to any one of [10] to [12], wherein the polyester resin is a biodegradable polyester resin.
[13-2] the polyester resin is a biodegradable polyester resin or a non-biodegradable polyester resin,
The degradation method of any one of [10]-[12], wherein the enzyme consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:10 or an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
[14] The decomposition method according to any one of [10] to [13], wherein the biodegradable polyester resin is an aliphatic polyester.
[15] The decomposition method of [14], wherein the aliphatic polyester resin is a polymer of a diol compound having 2 to 20 carbon atoms and a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms.

［１６］ ［１］の酵素又は［５］の組換え微生物と、ポリエステル樹脂と、を接触させる工程を含む、ポリエステル樹脂分解物の製造方法。
［１７］ 前記工程が、海水中で行われる、［１６］の製造方法。
［１８］ 前記工程が、3重量％以上のNaCl存在下で行われる、［１６］の製造方法。
［１９］ 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂である、［１６］－［１８］のいずれかの製造方法。
［１９－２］ 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂又は非生分解性ポリエステル樹脂であり、
前記酵素が、配列番号１０のアミノ酸配列、又は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、［１６］－［１８］のいずれかの製造方法。
［２０］ 前記生分解性ポリエステル樹脂が、脂肪族ポリエステル樹脂である、［１６］－［１９］のいずれかの製造方法。
［２１］ 前記脂肪族ポリエステル樹脂が、炭素数２－２０のジオール化合物と炭素数２－２０のジカルボン酸との重合物である、［２０］の製造方法。
［２２］ 前記ポリエステル樹脂分解物が、炭素数２－２０のジオール化合物と炭素数２－２０のジカルボン酸および／またはこれらのオリゴマーである、［２０］の製造方法。 [16] A method for producing a polyester resin decomposition product, comprising the step of contacting the enzyme of [1] or the recombinant microorganism of [5] with a polyester resin.
[17] The production method of [16], wherein the steps are performed in seawater.
[18] The production method of [16], wherein the steps are performed in the presence of 3% by weight or more of NaCl.
[19] The production method of any one of [16]-[18], wherein the polyester resin is a biodegradable polyester resin.
[19-2] the polyester resin is a biodegradable polyester resin or a non-biodegradable polyester resin,
The production method of any one of [16]-[18], wherein the enzyme consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO:10 or an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:10.
[20] The production method of any one of [16]-[19], wherein the biodegradable polyester resin is an aliphatic polyester resin.
[21] The production method of [20], wherein the aliphatic polyester resin is a polymer of a diol compound having 2 to 20 carbon atoms and a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms.
[22] The production method of [20], wherein the polyester resin decomposition product is a diol compound having 2 to 20 carbon atoms, a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms, and/or an oligomer thereof.

本発明により、海洋微生物由来の酵素を用いた、ポリエステル系プラスチックの分解のための技術が提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides techniques for degrading polyester-based plastics using enzymes derived from marine microorganisms.

ｐ－ニトロフェニルブチレートを基質としてエステル結合の分解活性を測定した結果を示す。The results of measuring ester bond-cleaving activity using p-nitrophenyl butyrate as a substrate are shown. PBSの分解活性を測定した結果を示す。図中、縦軸は濁度の減少値、横軸は時間を示す。The results of measuring the decomposition activity of PBS are shown. In the figure, the vertical axis indicates the turbidity decrease value, and the horizontal axis indicates time. PBSフィルム及びPBSAフィルムの分解を評価した結果を示す。The results of evaluating the decomposition of a PBS film and a PBSA film are shown. PEFフィルム及びPETフィルムの分解を評価した結果を示す。The results of evaluating the decomposition of PEF film and PET film are shown.

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。 Preferred embodiments for carrying out the present invention will be described below. It should be noted that the embodiments described below are examples of representative embodiments of the present invention, and the scope of the present invention should not be construed narrowly.

［ポリエステル樹脂］
本発明において、ポリエステル樹脂は、脂肪族ポリエステル樹脂であっても、芳香族ポリエステル樹脂であっても、脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂であってもよい。
ポリエステル樹脂には、生分解性及び非生分解性のものが含まれ得る。
非生分解性のポリエステル樹脂としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンフラノエートおよびポリブチレンテレフタレート等が挙げられる。
ポリエステル樹脂は、生分解性ポリエステル樹脂であってよく、生分解性の高さの観点から脂肪族ポリエステル樹脂であることが好ましく、さらに炭素数２－２０のジオール単位と炭素数２－２０のジカルボン酸単位を有する脂肪族ポリエステル樹脂が好ましい。
ここで、「生分解性」とは、微生物の働きにより、樹脂が加水分解等によりオリゴマーやモノマー等の低分子に分解され、これが更に、水と二酸化炭素等に分解される性質を意味する。
なお、ポリエステル樹脂における各繰返し単位は、それぞれの繰返し単位の由来となる化合物に対する化合物単位とも呼ぶ。例えば、脂肪族ジオールに由来する繰返し単位を「脂肪族ジオール単位」、脂肪族ジカルボン酸に由来する繰返し単位を「脂肪族ジカルボン酸単位」、芳香族ジカルボン酸に由来する繰返し単位を「芳香族ジカルボン酸単位」とも呼ぶ。また、ポリエステル樹脂中の「主構成単位」とは、通常、その構成単位が当該ポリエステル樹脂中に８０重量％以上含まれる構成単位のことであり、主構成単位以外の構成単位が含まれない場合もある。
ポリエステル樹脂は、各構成単位を、１種類を単独で用いても、２種類以上を任意の組み合わせと比率で含んでいてよい。また、ジオール単位、ジカルボン酸単位及び脂肪族オキシカルボン酸単位は、石油から誘導された化合物由来であっても、植物原料から誘導された化合物由来であってもかまわないが、植物原料から誘導された化合物由来であることが環境問題に配慮できることから望ましい。 [Polyester resin]
In the present invention, the polyester resin may be an aliphatic polyester resin, an aromatic polyester resin, or an aliphatic-aromatic polyester resin.
Polyester resins can include biodegradable and non-biodegradable.
Non-biodegradable polyester resins include polyethylene terephthalate, polyethylene furanoate and polybutylene terephthalate.
The polyester resin may be a biodegradable polyester resin, preferably an aliphatic polyester resin from the viewpoint of high biodegradability. Aliphatic polyester resins with acid units are preferred.
Here, the term "biodegradability" means that the resin is decomposed by hydrolysis or the like into low molecular weight molecules such as oligomers and monomers under the action of microorganisms, which are further decomposed into water, carbon dioxide, and the like.
Each repeating unit in the polyester resin is also referred to as a compound unit for the compound from which each repeating unit is derived. For example, a repeating unit derived from an aliphatic diol is an "aliphatic diol unit", a repeating unit derived from an aliphatic dicarboxylic acid is an "aliphatic dicarboxylic acid unit", and a repeating unit derived from an aromatic dicarboxylic acid is an "aromatic dicarboxylic acid unit". Also called "acid unit". In addition, the "main structural unit" in the polyester resin is usually a structural unit that contains 80% by weight or more of the structural unit in the polyester resin, and does not contain structural units other than the main structural unit. There is also
The polyester resin may contain each constitutional unit singly or may contain two or more constitutional units in any combination and ratio. In addition, the diol unit, dicarboxylic acid unit and aliphatic oxycarboxylic acid unit may be derived from a compound derived from petroleum or a compound derived from a plant material. It is desirable that it is derived from a compound such as the above because it is possible to consider environmental issues.

ポリエステル樹脂に含まれるジオール単位は、脂肪族でも芳香族でもよいが、生分解しやすいことから、脂肪族が好ましく、下記一般式（１）で表されるジオール単位が特に好ましい。
－Ｏ－Ｒ¹－Ｏ－ （１）
式（１）中、Ｒ¹は炭素数２以上２０以下の脂肪族炭化水素基を表す。 The diol unit contained in the polyester resin may be aliphatic or aromatic, but is preferably aliphatic because it is easily biodegradable, and particularly preferably a diol unit represented by the following general formula (1).
-OR ¹ -O- (1)
In formula (1), R ¹ represents an aliphatic hydrocarbon group having 2 to 20 carbon atoms.

Ｒ¹で表される脂肪族炭化水素基の炭素数は、通常２以上、好ましくは４以上、また、通常２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは１２以下、さらに好ましくは６以下である。脂肪族炭化水素基として特に好ましい基は、炭素数４の脂肪族炭化水素基である。
式（１）で表される脂肪族ジオール単位を与える脂肪族ジオールとしては、例えば、エチレングリコール、１，３－プロパンジオール、１，４－ブタンジオール、１，４－シクロヘキサンジメタノール等が好ましく、１，４－ブタンジオール、１，３－プロパンジオール及びエチレングリコールがより好ましく、１，４－ブタンジオールが特に好ましい。
ポリエステル樹脂に含まれるジオール単位は、１種類でも、２種類以上の単位を任意の組み合わせと比率で有していてもよい。ポリエステル樹脂に複数種のジオール単位が含まれる場合、脂肪族ジオール単位が３０モル％以上含まれることが好ましく、５０モル％以上含まれることがより好ましい。 The number of carbon atoms in the aliphatic hydrocarbon group represented by R ¹ is usually 2 or more, preferably 4 or more, and usually 20 or less, preferably 16 or less, more preferably 12 or less, still more preferably 6 or less. A particularly preferred group as the aliphatic hydrocarbon group is an aliphatic hydrocarbon group having 4 carbon atoms.
Preferred examples of the aliphatic diol that gives the aliphatic diol unit represented by formula (1) include ethylene glycol, 1,3-propanediol, 1,4-butanediol, and 1,4-cyclohexanedimethanol. More preferred are 1,4-butanediol, 1,3-propanediol and ethylene glycol, with 1,4-butanediol being particularly preferred.
The diol unit contained in the polyester resin may be of one type or may have two or more types of units in any combination and ratio. When the polyester resin contains a plurality of types of diol units, it preferably contains 30 mol % or more of the aliphatic diol unit, more preferably 50 mol % or more.

ポリエステル樹脂に含まれるジオール単位は、芳香族ジオール単位を含んでいてもよい。芳香族ジオール単位を与える芳香族ジオール成分の具体例としては、例えば、キシリレングリコール、４，４’－ジヒドロキシビフェニル、２，２－ビス（４’－ヒドロキシフェニル）プロパン、２，２－ビス（４’－β－ヒドロキシエトキシフェニル）プロパン、ビス（４－ヒドロキシフェニル）スルホン、ビス（４－β－ヒドロキシエトキシフェニル）スルホン酸等が挙げられる。芳香族ジオール成分は、芳香族ジオール化合物の誘導体でもよい。また、複数の脂肪族ジオール化合物及び／又は芳香族ジオール化合物が互いに脱水縮合した構造を有する化合物であってもよい。 The diol units contained in the polyester resin may contain aromatic diol units. Specific examples of aromatic diol components that provide aromatic diol units include xylylene glycol, 4,4′-dihydroxybiphenyl, 2,2-bis(4′-hydroxyphenyl)propane, 2,2-bis( 4'-β-hydroxyethoxyphenyl)propane, bis(4-hydroxyphenyl)sulfone, bis(4-β-hydroxyethoxyphenyl)sulfonic acid and the like. The aromatic diol component may be a derivative of an aromatic diol compound. A compound having a structure in which a plurality of aliphatic diol compounds and/or aromatic diol compounds are dehydrated and condensed with each other may also be used.

ポリエステル樹脂に含まれるジカルボン酸単位は、脂肪族でも芳香族でもよい。また、ポリエステル樹脂に含まれるジカルボン酸単位は、１種類でも、２種類以上の単位を任意の組み合わせと比率で有していてもよく、脂肪族ジカルボン酸単位と芳香族ジカルボン酸単位を有していてもよい。但し、生分解性の観点から、ジカルボン酸単位は、脂肪族のジカルボン酸単位であることが好ましい。ポリエステル樹脂に複数種のジカルボン酸単位が含まれる場合、脂肪族ジカルボン酸単位が３０モル％以上含まれることが好ましく、４０モル％以上含まれることがより好ましい。一方、脂肪族ジカルボン酸単位の下限値は、特にないが、含まれていなくても構わない。また、ポリエステル樹脂に芳香族ジカルボン酸単位が含まれる場合は、芳香族ジカルボン酸単位が７０モル％以下であることが好ましく、６０モル％以下であることがさらに好ましい。
ジカルボン酸単位が有する炭素数は、２～２２であることが好ましい。
ポリエステル樹脂に含まれるジカルボン酸単位は、下記一般式（２）で表されるジカルボン酸単位、またはシュウ酸が好ましい。
－ＯＣ－Ｒ²－ＣＯ－ （２）
式（２）中、Ｒ²は単結合、炭素数１以上２２以下の脂肪族炭化水素基又は炭素数４以上８以下の芳香族炭化水素基若しくは複素芳香族基を表す。 The dicarboxylic acid units contained in the polyester resin may be aliphatic or aromatic. Further, the dicarboxylic acid unit contained in the polyester resin may have one type or two or more types of units in any combination and ratio, and has an aliphatic dicarboxylic acid unit and an aromatic dicarboxylic acid unit. may However, from the viewpoint of biodegradability, the dicarboxylic acid unit is preferably an aliphatic dicarboxylic acid unit. When the polyester resin contains a plurality of types of dicarboxylic acid units, it preferably contains 30 mol % or more of aliphatic dicarboxylic acid units, more preferably 40 mol % or more. On the other hand, although there is no particular lower limit for the aliphatic dicarboxylic acid unit, it does not have to be included. When the polyester resin contains aromatic dicarboxylic acid units, the aromatic dicarboxylic acid units are preferably 70 mol % or less, more preferably 60 mol % or less.
The number of carbon atoms in the dicarboxylic acid unit is preferably 2-22.
The dicarboxylic acid unit contained in the polyester resin is preferably a dicarboxylic acid unit represented by the following general formula (2) or oxalic acid.
-OC-R ² -CO- (2)
In formula (2), R ² represents a single bond, an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 22 carbon atoms, or an aromatic hydrocarbon group or heteroaromatic group having 4 to 8 carbon atoms.

Ｒ²で表される炭化水素基の炭素数は、２以上、２２以下であることが好ましい。
Ｒ²で表される脂肪族炭化水素基の炭素数は、通常１以上、好ましくは２以上であり、また、一方で、好ましくは２２以下、より好ましくは１６以下、さらに好ましくは１２以下、特に好ましくは８以下である。ポリエステル樹脂が、式（２）で表される脂肪族ジカルボン酸単位を２種類以上含む場合、脂肪族炭化水素基の組み合わせとしては、炭素数２の脂肪族炭化水素基と炭素数４以上１０以下の脂肪族炭化水素基との組み合わせが好ましい。 The number of carbon atoms in the hydrocarbon group represented by R ² is preferably 2 or more and 22 or less.
The number of carbon atoms in the aliphatic hydrocarbon group represented by R ² is usually 1 or more, preferably 2 or more, and on the other hand, preferably 22 or less, more preferably 16 or less, still more preferably 12 or less, especially It is preferably 8 or less. When the polyester resin contains two or more types of aliphatic dicarboxylic acid units represented by formula (2), the combination of aliphatic hydrocarbon groups includes an aliphatic hydrocarbon group having 2 carbon atoms and an aliphatic hydrocarbon group having 4 to 10 carbon atoms. with an aliphatic hydrocarbon group is preferred.

式（２）で表される脂肪族ジカルボン酸単位を与える脂肪族ジカルボン酸成分としては、特に限定されないが、その炭素数は、２以上が好ましく、４以上がより好ましく、また、一方で、２２以下が好ましく、１０以下がより好ましい。すなわち、炭素数２以上２２以下の脂肪族ジカルボン酸又はそのアルキルエステル等の誘導体が好ましく、炭素数４以上１０以下の脂肪族カルボン酸又はそのアルキルエステル等の誘導体がより好ましい。
好ましい脂肪族ジカルボン酸又はその誘導体としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸又はその誘導体が挙げられる。これらのうち、アジピン酸、コハク酸及びセバシン酸が好ましく、コハク酸及びセバシン酸がより好ましく、コハク酸が特に好ましい。 The aliphatic dicarboxylic acid component that gives the aliphatic dicarboxylic acid unit represented by formula (2) is not particularly limited, but preferably has 2 or more carbon atoms, more preferably 4 or more carbon atoms. The following is preferable, and 10 or less is more preferable. That is, aliphatic dicarboxylic acids having 2 to 22 carbon atoms or derivatives thereof such as alkyl esters are preferred, and aliphatic carboxylic acids having 4 to 10 carbon atoms or derivatives thereof such as alkyl esters are more preferred.
Preferred aliphatic dicarboxylic acids or derivatives thereof include, for example, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, undecanedioic acid, dodecanedioic acid, or derivatives thereof. is mentioned. Among these, adipic acid, succinic acid and sebacic acid are preferred, succinic acid and sebacic acid are more preferred, and succinic acid is particularly preferred.

式（２）で表される芳香族ジカルボン酸単位を与える芳香族ジカルボン酸成分としては、特に限定されないが、その炭素数は、通常４以上、８以下であり、好ましくは６以上である。好ましい芳香族ジカルボン酸としては、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、２，５－フランジカルボン酸等が挙げられ、中でも、テレフタル酸及び２，５－フランジカルボン酸が好ましく、２，５－フランジカルボン酸が更に好ましい。 The aromatic dicarboxylic acid component that provides the aromatic dicarboxylic acid unit represented by formula (2) is not particularly limited, but usually has 4 or more and 8 or less carbon atoms, preferably 6 or more carbon atoms. Preferable aromatic dicarboxylic acids include phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid and 2,5-furandicarboxylic acid. Acids are more preferred.

ポリエステル樹脂は、オキシカルボン酸単位を含む樹脂であってもよい。
ポリエステル樹脂に含まれるオキシカルボン酸単位は、下記一般式（３）で表される脂肪族オキシカルボン酸単位を含むポリエステル樹脂であってもよい。
－Ｏ－Ｒ³－ＣＯ－ （３）
式（３）中、Ｒ³は炭素数１以上２０以下の脂肪族炭化水素基を表す。 The polyester resin may be a resin containing oxycarboxylic acid units.
The oxycarboxylic acid unit contained in the polyester resin may be a polyester resin containing an aliphatic oxycarboxylic acid unit represented by the following general formula (3).
-OR ³ -CO- (3)
In formula (3), R ³ represents an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms.

Ｒ³で表される脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは１以上、また、一方で、好ましくは１６以下、より好ましくは１２以下、さらに好ましくは８以下である。 The number of carbon atoms in the aliphatic hydrocarbon group represented by R ³ is preferably 1 or more, and is preferably 16 or less, more preferably 12 or less, and even more preferably 8 or less.

式（３）で表される脂肪族オキシカルボン酸単位を与える脂肪族オキシカルボン酸成分としては、特に限定されず、例えば、乳酸、グリコール酸、３－ヒドロキシ酪酸、２－ヒドロキシ－ｎ－酪酸、２－ヒドロキシカプロン酸、６－ヒドロキシカプロン酸、２－ヒドロキシ－３，３－ジメチル酪酸、２－ヒドロキシ－３－メチル酪酸、２－ヒドロキシイソカプロン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、４－ヒドロキシ酪酸、５－ヒドロキシ吉草酸、６－ヒドロキシカプロン酸等のヒドロキシ酸又はこれらの低級アルキルエステル若しくは分子内エステル等の誘導体等が挙げられる。これらに光学異性体が存在する場合には、Ｄ体、Ｌ体のいずれでもよい。これらの中で好ましいものは、乳酸及びグリコール酸である。 The aliphatic oxycarboxylic acid component that provides the aliphatic oxycarboxylic acid unit represented by formula (3) is not particularly limited, and examples thereof include lactic acid, glycolic acid, 3-hydroxybutyric acid, 2-hydroxy-n-butyric acid, 2-hydroxycaproic acid, 6-hydroxycaproic acid, 2-hydroxy-3,3-dimethylbutyric acid, 2-hydroxy-3-methylbutyric acid, 2-hydroxyisocaproic acid, 3-hydroxypropionic acid, 4-hydroxybutyric acid, Hydroxy acids such as 5-hydroxyvaleric acid and 6-hydroxycaproic acid, or derivatives thereof such as lower alkyl esters or intramolecular esters thereof. When optical isomers exist in these, either D-isomer or L-isomer may be used. Preferred among these are lactic acid and glycolic acid.

ポリエステル樹脂に含まれるオキシカルボン酸単位は、芳香族オキシカルボン酸単位を含んでいてもよい。
芳香族オキシカルボン酸単位を与える芳香族オキシカルボン酸成分の具体例としては、例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、ｐ－β－ヒドロキシエトキシ安息香酸等が挙げられる。芳香族オキシカルボン酸成分は、芳香族オキシカルボン酸化合物の誘導体でもよい。また、複数の芳香族オキシカルボン酸化合物及び／又は芳香族オキシカルボン酸化合物が互いに脱水縮合した構造を有する化合物（オリゴマー）であってもよい。すなわち、原料物質としてオリゴマーを用いてもよい。
これらの芳香族化合物単位を与える芳香族化合物成分に光学異性体が存在する場合には、Ｄ体、Ｌ体、及びラセミ体のいずれであってもよい。 The oxycarboxylic acid unit contained in the polyester resin may contain an aromatic oxycarboxylic acid unit.
Specific examples of aromatic oxycarboxylic acid components that give aromatic oxycarboxylic acid units include p-hydroxybenzoic acid and p-β-hydroxyethoxybenzoic acid. The aromatic oxycarboxylic acid component may be a derivative of an aromatic oxycarboxylic acid compound. It may also be a compound (oligomer) having a structure in which a plurality of aromatic oxycarboxylic acid compounds and/or aromatic oxycarboxylic acid compounds are dehydrated and condensed with each other. That is, an oligomer may be used as the raw material.
When optical isomers exist in the aromatic compound components that provide these aromatic compound units, they may be D-, L-, or racemic isomers.

ポリエステル樹脂としては、上記一般式（１）で表されるジオール単位及び上記一般式（２）で表されるジカルボン酸単位を含むポリエステル樹脂；上記一般式（１）で表されるジオール単位、上記一般式（２）で表されるジカルボン酸単位及び上記一般式（３）で表されるオキシカルボン酸単位を含むポリエステル樹脂；上記一般式（３）で表されるオキシカルボン酸単位を含むポリエステル樹脂等が挙げられる。
すなわち、ポリエステル樹脂は、脂肪族ジオール単位及び脂肪族ジカルボン酸単位を主構成単位として含む脂肪族ポリエステル樹脂（以下、「脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ）」と言う場合がある。）、脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ）の繰り返し単位の少なくとも一部が、芳香族化合物単位に置き換えられた樹脂である脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）、脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ）の繰り返し単位が芳香族化合物単位に置き換えられた樹脂である芳香族ポリエステル樹脂（ポリアリレート）（Ｃ）などが挙げられる。 The polyester resin includes a diol unit represented by the general formula (1) and a dicarboxylic acid unit represented by the general formula (2); a diol unit represented by the general formula (1); Polyester resin containing a dicarboxylic acid unit represented by the general formula (2) and an oxycarboxylic acid unit represented by the general formula (3); Polyester resin containing an oxycarboxylic acid unit represented by the general formula (3) etc.
That is, the polyester resin includes an aliphatic polyester resin containing an aliphatic diol unit and an aliphatic dicarboxylic acid unit as main structural units (hereinafter sometimes referred to as "aliphatic polyester resin (A)"), an aliphatic polyester resin Aliphatic-aromatic polyester resin (B), which is a resin in which at least part of the repeating units of (A) are replaced with aromatic compound units, and the repeating units of the aliphatic polyester resin (A) are replaced with aromatic compound units Aromatic polyester resins (polyarylates) (C), which are resins to be replaced, and the like.

（脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ））
脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ）としては、上記の式（１）で表される脂肪族ジオール単位とＲ²が脂肪族炭化水素基である上記の式（２）で表される脂肪族ジカルボン酸単位を含む脂肪族ポリエステル樹脂；上記の式（１）で表される脂肪族ジオール単位とＲ²が脂肪族炭化水素基である上記の式（２）で表される脂肪族ジカルボン酸単位と上記の式（３）で表される脂肪族オキシカルボン酸単位を含む脂肪族ポリエステル樹脂が好ましい。
なお、式（１）で表される脂肪族ジオール単位、Ｒ²が脂肪族炭化水素基である式（２）で表される脂肪族ジカルボン酸単位及び式（３）で表される脂肪族オキシカルボン酸単位については、前述したとおりである。また、脂肪族ポリエステル（Ａ）として好ましい脂肪族ポリエステル樹脂についても、脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ）が、３官能以上の脂肪族多価アルコールと３官能以上の脂肪族多価カルボン酸若しくはその酸無水物又は３官能以上の脂肪族多価オキシカルボン酸成分とを共重合されている場合も含め、前述したとおりである。 (Aliphatic polyester resin (A))
As the aliphatic polyester resin (A), an aliphatic diol unit represented by the above formula (1) and an aliphatic dicarboxylic acid unit represented by the above formula (2) in which R ² is an aliphatic hydrocarbon group an aliphatic polyester resin containing; an aliphatic diol unit represented by the above formula (1) and an aliphatic dicarboxylic acid unit represented by the above formula (2) in which R ² is an aliphatic hydrocarbon group and the above An aliphatic polyester resin containing an aliphatic oxycarboxylic acid unit represented by formula (3) is preferred.
In addition, an aliphatic diol unit represented by formula (1), an aliphatic dicarboxylic acid unit represented by formula (2) in which R ² is an aliphatic hydrocarbon group, and an aliphatic oxy group represented by formula (3) The carboxylic acid unit is as described above. In addition, the aliphatic polyester resin (A), which is preferable as the aliphatic polyester (A), comprises a trifunctional or higher aliphatic polyhydric alcohol and a trifunctional or higher aliphatic polycarboxylic acid or an acid anhydride thereof. It is as described above, including the case where it is copolymerized with a compound or a trifunctional or higher aliphatic polyvalent oxycarboxylic acid component.

脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ）としては、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンサクシネートセバケート（ＰＢＳＳｅ）等のポリブチレンサクシネート系樹脂が特に好ましい。 Polybutylene succinate-based resins such as polybutylene succinate (PBS), polybutylene succinate adipate (PBSA), and polybutylene succinate sebacate (PBSSe) are particularly preferred as the aliphatic polyester resin (A).

（脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ））
脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）は、上述の脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ）の繰り返し単位の少なくとも一部が、芳香族化合物単位に置き換えられた樹脂である。脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）としては、上述の式（１）で表される脂肪族ジオール単位及びＲ²が芳香族基である上述の式（２）で表される芳香族ジカルボン酸単位を含む、
脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂；式（１）で表される脂肪族ジオール単位、Ｒ²が芳香族炭化水素基である上述の式（２）で表される芳香族ジカルボン酸単位及び式（３）で表される脂肪族オキシカルボン酸単位を含む、脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂が好ましい。 (Aliphatic-aromatic polyester resin (B))
The aliphatic-aromatic polyester resin (B) is a resin in which at least part of the repeating units of the above-described aliphatic polyester resin (A) are replaced with aromatic compound units. The aliphatic-aromatic polyester resin (B) includes an aliphatic diol unit represented by the above formula (1) and an aromatic dicarboxylic acid represented by the above formula (2) in which R ² is an aromatic group. including units,
Aliphatic-aromatic polyester resin; an aliphatic diol unit represented by formula (1), an aromatic dicarboxylic acid unit represented by the above formula (2) in which R ² is an aromatic hydrocarbon group, and a ) containing an aliphatic oxycarboxylic acid unit is preferred.

なお、式（１）で表される脂肪族ジオール単位、Ｒ²が芳香族炭化水素基である式（２）で表される芳香族ジカルボン酸単位及び式（３）で表される脂肪族オキシカルボン酸単位については、前述したとおりである。また、脂肪族－芳香族ポリエステル（Ｂ）として好ましい脂肪族ポリエステルについても、脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）が、３官能以上の脂肪族多価アルコールと３官能以上の脂肪族多価カルボン酸若しくはその酸無水物又は３官能以上の脂肪族多価オキシカルボン酸成分とを共重合されている場合も含め、前述したとおりである。 In addition, the aliphatic diol unit represented by the formula (1), the aromatic dicarboxylic acid unit represented by the formula (2) in which R ² is an aromatic hydrocarbon group, and the aliphatic oxy group represented by the formula (3) The carboxylic acid unit is as described above. In addition, for the aliphatic polyester preferable as the aliphatic-aromatic polyester (B), the aliphatic-aromatic polyester resin (B) is a trifunctional or higher aliphatic polyhydric alcohol and a trifunctional or higher aliphatic polyhydric carboxylic acid. It is as described above, including the case where an acid or its acid anhydride or a trifunctional or higher aliphatic polyhydric oxycarboxylic acid component is copolymerized.

脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）は、芳香族ジオール単位を含んでいてもよい。すなわち、脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）は、芳香族ジオール単位と脂肪族ジカルボン酸単位；芳香族ジオール単位と脂肪族ジカルボン酸単位と芳香族ジカルボン酸単位；脂肪族ジオール単位と芳香族のジオール単位と芳香族ジカルボン酸単位；脂肪族ジオール単位と芳香族のジオール単位と脂肪族ジカルボン酸単位と芳香族ジカルボン酸単位を有するポリエステル樹脂であってもよい。なお、ここで、芳香族ジオール成分の具体例については、上述したとおりである。 The aliphatic-aromatic polyester resin (B) may contain aromatic diol units. That is, the aliphatic-aromatic polyester resin (B) comprises an aromatic diol unit and an aliphatic dicarboxylic acid unit; an aromatic diol unit, an aliphatic dicarboxylic acid unit and an aromatic dicarboxylic acid unit; an aliphatic diol unit and an aromatic It may be a polyester resin having a diol unit and an aromatic dicarboxylic acid unit; an aliphatic diol unit, an aromatic diol unit, an aliphatic dicarboxylic acid unit and an aromatic dicarboxylic acid unit. Here, specific examples of the aromatic diol component are as described above.

脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）は、芳香族オキシカルボン酸単位を含んでいてもよい。芳香族オキシカルボン酸単位を与える芳香族オキシカルボン酸成分の具体例としては、上述したとおりである。 The aliphatic-aromatic polyester resin (B) may contain aromatic oxycarboxylic acid units. Specific examples of the aromatic oxycarboxylic acid component that provides the aromatic oxycarboxylic acid unit are as described above.

脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）としては、芳香族化合物単位を与える成分として、芳香族ジカルボン酸成分を用いることが好ましく、この場合の芳香族ジカルボン酸単位の含有量は、脂肪族ジカルボン酸単位と芳香族ジカルボン酸単位の全量を基準（１００モル％）として、１０モル％以上、８０モル％以下であることが好ましい。 As the aliphatic-aromatic polyester resin (B), it is preferable to use an aromatic dicarboxylic acid component as a component that provides aromatic compound units. It is preferably 10 mol % or more and 80 mol % or less based on the total amount of units and aromatic dicarboxylic acid units (100 mol %).

芳香族ジカルボン酸成分としては、テレフタル酸又は２，５－フランジカルボン酸を用いることが好ましい。具体的には、脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）としては、ポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）やポリブチレンサクシネートテレフタレート（ＰＢＳＴ）、ポリブチレンセバケートテレフタレート（ＰＢＳｅＴ）等のポリブチレンテレフタレート系樹脂、及びポリブチレンアジペートフラノエート（ＰＢＡＦ）やポリブチレンサクシネートフラノエート（ＰＢＳＦ）、ポリブチレンセバケートフラノエート（ＰＢＳｅＦ）、ポリブチレンサクシネートセバケートフラノエート（ＰＢＳＳｅＦ）等のポリフランジカルボキシレート系樹脂が好ましい。 Terephthalic acid or 2,5-furandicarboxylic acid is preferably used as the aromatic dicarboxylic acid component. Specifically, the aliphatic-aromatic polyester resin (B) includes polybutylene terephthalate-based resins such as polybutylene adipate terephthalate (PBAT), polybutylene succinate terephthalate (PBST), and polybutylene sebacate terephthalate (PBSeT). , and polyfurandicarboxylate-based resins such as polybutylene adipate furanoate (PBAF), polybutylene succinate furanoate (PBSF), polybutylene sebacate furanoate (PBSeF), and polybutylene succinate sebacate furanoate (PBSSeF) is preferred.

脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）としては、ジカルボン酸単位として、コハク酸、アジピン酸及びセバシン酸を有する樹脂が好ましい。そこで、脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）としては、ＰＢＳＴ、ＰＢＳＦ、ＰＢＳＳｅＦなどのポリブチレンサクシネート系樹脂；ＰＢＡＴ、ＰＢＡＦ、ＰＢＡＳｅＦなどのポリブチレンアジベート系樹脂；及びＰＢＳｅＴ、ＰＢＳｅＦなどのポリブチレンセバケート系樹脂が好ましく、ＰＢＳＴ、ＰＢＳＦ、ＰＢＳＳｅＦなどのポリブチレンサクシネート－芳香族ジカルボン酸系樹脂が更に好ましい。 As the aliphatic-aromatic polyester resin (B), resins having succinic acid, adipic acid and sebacic acid as dicarboxylic acid units are preferred. Therefore, the aliphatic-aromatic polyester resin (B) includes polybutylene succinate resins such as PBST, PBSF and PBSSeF; polybutylene adibate resins such as PBAT, PBAF and PBASeF; Butylene sebacate-based resins are preferred, and polybutylene succinate-aromatic dicarboxylic acid-based resins such as PBST, PBSF and PBSSeF are more preferred.

（芳香族ポリエステル樹脂（Ｃ））
芳香族ポリエステル樹脂（ポリアリレート）（Ｃ）は、上述の脂肪族ポリエステル樹脂（Ａ）の繰り返し単位が、芳香族化合物単位に置き換えられた樹脂である。
芳香族ポリエステル樹脂（Ｃ）としては、上述の脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）が含んでいてもよい芳香族ジオール単位とＲ²が芳香族炭化水素基である上述の式（２）で表される芳香族ジカルボン酸単位を含む芳香族ポリエステル樹脂；脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）が含んでいてもよい芳香族ジオール単位、Ｒ²が芳香族炭化水素基
である上述の式（２）で表される芳香族ジカルボン酸単位及び脂肪族－芳香族ポリエステル樹脂（Ｂ）が含んでいてもよい芳香族オキシカルボン酸単位を含む芳香族ポリエステル樹脂等が挙げられる。 (Aromatic polyester resin (C))
The aromatic polyester resin (polyarylate) (C) is a resin in which the repeating units of the above aliphatic polyester resin (A) are replaced with aromatic compound units.
As the aromatic polyester resin (C), the aromatic diol unit that may be contained in the above-mentioned aliphatic-aromatic polyester resin (B) and the above-mentioned formula (2) in which R ² is an aromatic hydrocarbon group an aromatic diol unit that may be contained in the aliphatic-aromatic polyester resin (B); R ² is an aromatic hydrocarbon group; Examples thereof include aromatic polyester resins containing aromatic dicarboxylic acid units represented by 2) and aromatic oxycarboxylic acid units which may be contained in the aliphatic-aromatic polyester resin (B).

芳香族ポリエステル樹脂（Ｃ）に含まれる各単位等については、上述したとおりである。 Each unit contained in the aromatic polyester resin (C) is as described above.

［酵素］
本発明に係る酵素は、配列番号１－１０のいずれかのアミノ酸配列を含んでなる（comprising of）タンパク質または当該アミノ酸配列からなる（consisting of）タンパク質とできる。
また、本発明に係る酵素は、配列番号１－１０のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるか、及び／又は、配列番号１－１０のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、好ましくは８０％、８５％、より好ましくは９０％、９５％、さらに好ましくは９６％、９７％、特に好ましくは９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ポリエステル樹脂に対する加水分解活性を有するタンパク質とできる。
ここで、「数個」とは、２－４０個、２－３０個、好ましくは２－２０個、２－１０個、より好ましくは２－５個、２－４個、特に好ましくは３個、２個をいう。アミノ酸配列に欠失等を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ、Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。あるいは、欠失等を含む配列を有する遺伝子全体を人工合成してもよい。
「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列の残基ができるだけ多く一致するように両配列を整列させ、一致した残基数を、全残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方または双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全残基数は、１つのギャップを１つの残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全残基数が比較する２つの配列間で異なる場合には、長い方の配列の全残基数で一致した残基数を除して同一性（％）を算出する。 [enzyme]
The enzyme according to the invention can be a protein comprising of or consisting of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1-10.
In addition, the enzyme according to the present invention consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted and/or added in any of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1-10, and/or At least 70%, 75%, preferably 80%, 85%, more preferably 90%, 95%, even more preferably 96%, 97%, particularly preferably 96%, 97% of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1-10 It can be a protein consisting of an amino acid sequence with 98% or 99% sequence identity and having hydrolytic activity for polyester resin.
Here, "several" means 2 to 40, 2 to 30, preferably 2 to 20, 2 to 10, more preferably 2 to 5, 2 to 4, particularly preferably 3 , two. To introduce a deletion or the like into an amino acid sequence, a mutagenesis kit using a site-directed mutagenesis method, such as a QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Inc. ), GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), Takara Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio), and the like can be used. Alternatively, an entire gene having a sequence containing a deletion or the like may be artificially synthesized.
"Sequence identity" means that the two amino acid sequences to be compared are aligned so that as many residues as possible are matched, and the number of matched residues divided by the total number of residues is expressed as a percentage. It is what I did. During the above alignment, appropriate gaps are inserted in one or both of the two sequences to be compared, if necessary. Such sequence alignment can be performed using well-known programs such as BLAST, FASTA, and CLUSTALW. When gaps are inserted, the above total number of residues is the number of residues with one gap counted as one residue. If the total number of residues counted in this way differs between the two sequences being compared, the % identity is calculated by dividing the number of matching residues by the total number of residues in the longer sequence. .

上述のアミノ酸置換の例として、ポリエステル鎖との相互作用を向上させる目的で、活性中心残基の近傍のアミノ酸を、疎水性アミノ酸（Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｐ）又は塩基性アミノ酸（Ｋ、Ｒ、Ｈ）に置換してもよい。例えば、配列番号９のアミノ酸配列からなる酵素にこのようなアミノ酸置換を導入して得た酵素が、配列番号１０のアミノ酸配列からなる酵素である。ここで、活性中心残基とは、－Ｇｌｙ－Ｘ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｘ－（Ｘは任意のアミノ酸）という保存領域におけるセリンを指す。配列番号９の酵素においては１５４番目のセリンが活性中心残基である。また、活性中心残基近傍のアミノ酸とは、酵素の立体構造上において活性残基周辺に位置し、基質との相互作用が予想される残基を指す。例えば、配列９の酵素においては、８０番目のグリシンから８３番目のセリン、１１３番目のグルタミン酸、１５３番目のトリプトファン、１５５番目のメチオニン、１７８番目のチロシン、２００番目のイソロイシン、２０５番目のアスパラギン、２３１番目のスレオニンなどが活性中心残基近傍のアミノ酸である。
また、酵素の構造安定性を高めるため、適当な位置へのジスルフィド結合の導入や、ペプチド主鎖間の空間を狭めるようなアミノ酸置換等を施しても良い。変異を導入する位置は、酵素の立体構造情報から、近接しあう二次構造や主鎖間に空隙が存在する箇所等を見出すことにより設定できる。例えば、配列９の酵素においては、１５５番目のメチオニンから１６６番目のアスパラギンまでのアミノ酸残基からなるαヘリックスと、１１４番目のプロリンから１３３番目のセリンまでのアミノ酸残基からなるαヘリックスとの交差する箇所に空隙が見られる。酵素の立体構造は、Ｘ線結晶構造解析により得られた座標情報や、シミュレーションにより導かれた座標情報等を用いることができる。 As an example of the amino acid substitution described above, for the purpose of improving the interaction with the polyester chain, amino acids near the active center residue are replaced with hydrophobic amino acids (F, Y, W, L, I, V, A, P). Alternatively, they may be substituted with basic amino acids (K, R, H). For example, an enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO:10 is obtained by introducing such amino acid substitutions into the enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO:9. Here, the active center residue refers to serine in the conserved region of -Gly-X-Ser-Gly-X- (where X is any amino acid). In the enzyme of SEQ ID NO: 9, the 154th serine is the active center residue. In addition, amino acids near the active center residue refer to residues that are located around the active residue in the three-dimensional structure of the enzyme and are expected to interact with the substrate. For example, in the enzyme of sequence 9, from 80th glycine to 83rd serine, 113th glutamic acid, 153rd tryptophan, 155th methionine, 178th tyrosine, 200th isoleucine, 205th asparagine, 231 The second threonine is an amino acid near the active center residue.
In addition, in order to increase the structural stability of the enzyme, introduction of disulfide bonds at appropriate positions, amino acid substitutions that narrow the space between peptide main chains, and the like may be performed. The positions to introduce mutations can be set by finding, for example, locations where adjacent secondary structures or main chains have gaps from the three-dimensional structure information of the enzyme. For example, in the enzyme of sequence 9, the crossing of an α-helix consisting of amino acid residues from 155th methionine to 166th asparagine with an α-helix consisting of amino acid residues from 114th proline to 133rd serine Gaps can be seen where Coordinate information obtained by X-ray crystal structure analysis, coordinate information derived by simulation, or the like can be used for the three-dimensional structure of the enzyme.

本発明に係る酵素は、上述のアミノ酸配列からなるものであれば、ポリエステル樹脂に対する加水分解活性を有する限りにおいて、修飾を有していてもよい。修飾には、酵素の安定性を改善するための分子内架橋、アミノ酸側鎖基の修飾、及びアミノ酸配列端での精製タグの追加などが含まれる。 The enzyme according to the present invention may have modifications as long as it has the above-described amino acid sequence, as long as it has hydrolytic activity against polyester resins. Modifications include intramolecular cross-linking to improve enzyme stability, modification of amino acid side groups, and addition of purification tags at the ends of amino acid sequences.

さらに、本発明に係る酵素は、配列番号１１－２０のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含んでなる（comprising of）タンパク質または当該アミノ酸配列からなる（consisting of）タンパク質として定義することもできる。
そして、本発明に係る酵素は、配列番号１１－２０のいずれかの塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ポリエステル樹脂に対する加水分解活性を有するタンパク質であってもよい。
ストリンジェントな条件としては、例えば、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」等の条件を挙げることができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７））等を参照することができる。 Furthermore, the enzyme according to the present invention is a protein comprising an amino acid sequence encoded by a DNA consisting of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 11-20, or a protein consisting of the amino acid sequence. can also be defined.
The enzyme according to the present invention is a protein consisting of an amino acid sequence encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of any of the base sequences of SEQ ID NOS: 11-20, and is resistant to polyester resin. It may be a protein having hydrolytic activity.
As stringent conditions, for example, a DNA-immobilized nylon membrane is treated with 6×SSC (1×SSC is a solution of 8.76 g of sodium chloride and 4.41 g of sodium citrate dissolved in 1 liter of water), 1% Conditions for hybridization in a solution containing SDS, 100 μg/ml salmon sperm DNA, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, and 0.1% Ficoll, incubating with the probe at 65° C. for 20 hours can be mentioned, but are not limited to these. A person skilled in the art would be able to set hybridization conditions by taking into consideration other conditions such as probe concentration, probe length, reaction time, etc. in addition to conditions such as buffer salt concentration and temperature. can be done. Washing conditions after hybridization include, for example, "2×SSC, 0.1% SDS, 42° C." and "1×SSC, 0.1% SDS, 37° C."; more stringent conditions include, for example, Conditions such as “1×SSC, 0.1% SDS, 65° C.” and “0.5×SSC, 0.1% SDS, 50° C.” can be mentioned.
For detailed procedures of the hybridization method, see Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997)), and the like.

酵素は、海洋微生物由来であり、例えばGammaproteobacteria綱に属する微生物に由来するものであってよい。
Gammaproteobacteria綱に属する微生物としては、Pseudomonas、Vibrio、Alcanivorax、Alteromonas及びPseudoalteromonasの属に属する微生物が挙げられる。 The enzyme may be derived from a marine microorganism, for example from a microorganism belonging to the class Gammaproteobacteria.
Microorganisms belonging to the class Gammaproteobacteria include microorganisms belonging to the genera Pseudomonas, Vibrio, Alcanivorax, Alteromonas and Pseudoalteromonas.

Pseudomonas属の微生物としては、P. salina、P. oceani、P. bauzanensis, P. saudimassiliensis, P. litoralis, P. pachastrellae, P. salegens, P. jilinensis, P. aestusnigri, P. abyssi, P. oceani, P. formosensis, P. gallaeciensis, P. pelagia, P. xinjiangensis, P. sabulinigri, P. yangmingensisが挙げられる。 Examples of microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include P. salina, P. oceani, P. bauzanensis, P. saudimassiliensis, P. litoralis, P. pachastrellae, P. salegens, P. jilinensis, P. aestusnigri, P. abyssi, and P. oceani. , P. formosensis, P. gallaeciensis, P. pelagia, P. xinjiangensis, P. sabulinigri, P. yangmingensis.

Vibrio属の微生物としては、V. gazogenes, V. spartinae, V. ruber, V. palustris, V. aerogenes, V. rhizosphiraeが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Vibrio include V. gazogenes, V. spartinae, V. ruber, V. palustris, V. aerogenes, and V. rhizosphirae.

Alcanivorax属の微生物としては、A. balearicus, A. borkumensis, A. dieselolei, A. gelatiniphagus, A. hongdengensis, A. jadensis, A. marinus, A. mobilis, A. pacificus, A. venustensis, A. xenomutans, A. profundi, A. indicus, A. nanhaiticusなどが挙げられる。 Alcanivorax microorganisms include A. balearicus, A. borkumensis, A. dieselolei, A. gelatiniphagus, A. hongdengensis, A. jadensis, A. marinus, A. mobilis, A. pacificus, A. venustensis, and A. xenomutans. , A. profundi, A. indicus, and A. nanhaiticus.

Alteromonas属の微生物としては、A. addita, A. genovensis, A. hispanica, A. macleodii, A. litorea, A. marina, A. simiduii, A, stellipolaris, A. tagae, A. mediterranea, A. naphthalenivorans, A. australica, A. ponticolaなどが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Alteromonas include A. addita, A. genovensis, A. hispanica, A. macleodii, A. litorea, A. marina, A. simiduii, A. stellipolaris, A. tagae, A. mediterranea, and A. naphthalenivorans. , A. australica, A. ponticola, etc.

Pseudoalteromonas属の微生物としては、P. agarivorans, P. aliena, P. antarctica,P. arctica, P. atlantica, P. aurantia, P. bacteriolytica, P. byunsanensis, P. carrageenovora, P. citrea, P. denitrificans, P. distincta, P. donghaensis, P. elyakovii, P. espejiana, P. flavipulchra, P. haloplanktis, P. issachenkonii, P. luteoviolacea, P. lipolytica, P. maricaloris, P. marina, P. mariniglutinosa, P. nigrifaciens, P. paragorgicola, P. peptidolytica, P. phenolica, P. piscicida, P. prydzensis, P. rubra, P. ruthenica, P. sagamiensis, P. spongiae, P. tetraodonis, P. translucida, P. tunicate, P. ulvae, P. undina, P. xiamenensisなどが挙げられる。 Microorganisms belonging to the genus Pseudoalteromonas include P. agarivorans, P. aliena, P. antarctica, P. arctica, P. atlantica, P. aurantia, P. bacteriolytica, P. byunsanensis, P. carrageenovora, P. citrea, and P. denitrificans. , P. distincta, P. donghaensis, P. elyakovii, P. espejiana, P. flavipulchra, P. haloplanktis, P. issachenkonii, P. luteoviolacea, P. lipolytica, P. maricaloris, P. marina, P. mariniglutinosa, P. nigrifaciens, P. paragorgicola, P. peptidolytica, P. phenolica, P. piscicida, P. prydzensis, P. rubra, P. ruthenica, P. sagamiensis, P. spongiae, P. tetraodonis, P. translucida, P. tunicate , P. ulvae, P. undina, P. xiamenensis and the like.

［組換え微生物］
本発明に係る酵素は、上述した海洋微生物から単離・精製してもよく、従来公知の分子生物学的手法を用いて組換え微生物により発現させ、精製することもできる。
組換え微生物の作製は、本発明に係る酵素をコードする核酸を一般的な宿主ベクター系に導入し、該ベクター系で微生物を形質転換することより行われる。宿主としては、上述した海洋微生物に加えて、細菌では大腸菌、Rhodococcus属、Pseudomonas属、Corynebacterium属、Bacillus属、Streptococcus属、Streptomyces属などが挙げられ、酵母ではSaccharomyces属、Candida属、Shizosaccharomyces属、Pichia属、糸状菌ではAspergillus属などが挙げられる。これらの中で、特に大腸菌を用いることが簡便であり、効率もよく好ましい。 [Recombinant microorganisms]
The enzyme according to the present invention may be isolated and purified from the marine microorganisms described above, or may be expressed and purified by recombinant microorganisms using conventionally known molecular biological techniques.
Recombinant microorganisms are produced by introducing a nucleic acid encoding the enzyme of the present invention into a common host vector system and transforming the microorganism with the vector system. Examples of hosts include, in addition to the marine microorganisms described above, bacteria such as Escherichia coli, Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, and Streptomyces, and yeasts such as Saccharomyces, Candida, Shizosaccharomyces, and Pichia. Genus, filamentous fungi include the genus Aspergillus. Among these, the use of Escherichia coli is particularly convenient and efficient, and is therefore preferable.

上述した本発明に係る酵素を発現する海洋微生物又は組換え微生物は、培養液から遠心分離等の集菌操作によって得られる培養液上清を用いるか、菌体またはその処理物等を用いることができる。菌体処理物としては、アセトンおよびトルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、並びにこれらから酵素を抽出した粗酵素または精製酵素等が挙げられる。 For the marine microorganisms or recombinant microorganisms expressing the enzyme according to the present invention described above, it is possible to use the culture supernatant obtained from the culture solution by collecting the bacteria by centrifugation or the like, or use the bacterial cells or their processed products. can. Examples of treated bacterial cells include bacterial cells treated with acetone, toluene, etc., freeze-dried bacterial cells, crushed bacterial cells, cell-free extracts of crushed bacterial cells, and crude or purified enzymes extracted from these. are mentioned.

［ポリエステル樹脂の分解方法］
本発明に係る酵素又は組換え微生物とポリエステル樹脂とを接触させることにより、ポリエステル樹脂を分解させることができる。
ポリエステル樹脂の分解は、例えば、分解に供した樹脂の重量減少や、平均分子量低下などにより、確認できる。また、エマルジョンとして供する場合は樹脂の分解によるクリアゾーンの形成により、確認できる。 [Decomposition method of polyester resin]
The polyester resin can be degraded by contacting the enzyme or recombinant microorganism according to the present invention with the polyester resin.
Decomposition of the polyester resin can be confirmed, for example, by weight reduction or average molecular weight reduction of the resin subjected to decomposition. Moreover, when it is provided as an emulsion, it can be confirmed by the formation of a clear zone due to the decomposition of the resin.

酵素又は組換え微生物とポリエステル樹脂とを接触させる工程は、適当な溶媒中で行えばよい。溶媒には、通常、緩衝液等の水性溶媒が用いられる。
本発明に係る酵素は海洋微生物由来であり高塩濃度下でも加水分解活性を示すため、高塩濃度（例えば3重量％以上のNaCl濃度）の溶媒中でも酵素反応を行うことができる。したがって、溶媒として安価、容易かつ大量に使用可能な海水を溶媒に利用でき、水資源の有効利用にも資する。
また、酵素又は組換え微生物とポリエステル樹脂とを接触させる工程は、酵素又は組換え微生物を含む溶液を、ポリエステル樹脂に直接塗布又は噴霧して行ってもよい。
さらに、酵素又は組換え微生物とポリエステル樹脂とを接触させる工程は、コンポスト中で行われても良い。コンポストは、撹拌・保温を伴う装置であってもよく、開放系で発酵する堆肥であってもよい。コンポスト内におけるコンポスト樹脂の分解は通常遅い。本発明に係る酵素は、塩濃度の高いコンポスト中においても活性を発揮し、コンポスト内にてポリエステル樹脂製品の分解促進効果を示す。したがって、ポリエステル樹脂の焼却量を低減し、二酸化炭素排出量の削減にも資する。 The step of contacting the enzyme or recombinant microorganism with the polyester resin may be performed in a suitable solvent. As the solvent, an aqueous solvent such as a buffer solution is usually used.
Since the enzyme according to the present invention is derived from marine microorganisms and exhibits hydrolytic activity even at high salt concentrations, the enzymatic reaction can be performed even in solvents with high salt concentrations (eg, NaCl concentrations of 3% by weight or more). Therefore, seawater, which can be used inexpensively, easily and in large quantities, can be used as a solvent, contributing to the effective utilization of water resources.
The step of contacting the enzyme or recombinant microorganism with the polyester resin may be carried out by directly applying or spraying the solution containing the enzyme or recombinant microorganism onto the polyester resin.
Additionally, the step of contacting the enzyme or recombinant microorganism with the polyester resin may be performed in compost. The compost may be a compost that is fermented in an open system, or may be a device that accompanies agitation and heat retention. The decomposition of compost resin in compost is usually slow. The enzyme according to the present invention exhibits activity even in compost with a high salt concentration, and exhibits an effect of promoting the decomposition of polyester resin products in the compost. Therefore, the incineration amount of the polyester resin is reduced, which contributes to the reduction of carbon dioxide emissions.

酵素反応の時間や温度、ｐＨ、酵素の添加量は、特に制限されず、適宜調整され得る。反応温度及び時間は、通常１０－６０℃で１時間～１週間とされ、好ましくは２０－５０℃で１日以上であり、より好ましくは３０－４０℃で３日以上である。
酵素反応のｐＨ条件も、例えばｐＨ４～１０の範囲、好ましくはｐＨ５．０～９．０である。
酵素の添加量は、ポリエステル樹脂に対して例えば０．００１－２０％（w/w）、好ましくは０．０１－１０％（w/w）、より好ましくは０．１－５％（w/w）である。 The time, temperature, pH, and amount of enzyme added for the enzymatic reaction are not particularly limited and can be adjusted as appropriate. The reaction temperature and time are generally 10-60° C. for 1 hour to 1 week, preferably 20-50° C. for 1 day or longer, more preferably 30-40° C. for 3 days or longer.
The pH conditions for the enzymatic reaction are also, for example, in the range of pH 4-10, preferably pH 5.0-9.0.
The amount of enzyme added is, for example, 0.001-20% (w/w), preferably 0.01-10% (w/w), more preferably 0.1-5% (w/w), based on the polyester resin. w).

本発明に係る酵素とポリエステル樹脂との反応によって生成するポリエステル樹脂の分解物は、ポリエステル樹脂の再合成のために回収し利用してもよい。
ポリエステル樹脂の分解物は、ポリエステル樹脂の種類に応じて定まるが、炭素数２－２０のジオール化合物と炭素数２－２０のジカルボン酸および／またはこれらのオリゴマー（１０量体程度以下）であり得、例えばコハク酸、アジピン酸、６－ヒドロキシヘキサン酸、１,４－ブタンジオール、エチレングリコール、およびそれらの組み合わせからなるオリゴエステル等であってよい。 A decomposition product of the polyester resin produced by the reaction between the enzyme according to the present invention and the polyester resin may be recovered and used for resynthesis of the polyester resin.
The decomposition product of the polyester resin is determined according to the type of the polyester resin, and may be a diol compound having 2 to 20 carbon atoms and a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms and/or an oligomer thereof (about 10-mer or less). , such as oligoesters of succinic acid, adipic acid, 6-hydroxyhexanoic acid, 1,4-butanediol, ethylene glycol, and combinations thereof.

［樹脂組成物］
本発明に係る酵素とポリエステル樹脂とを含有する樹脂組成物は、優れた生分解性を示す。本発明に係る樹脂組成物は、通常、海水中、淡水中、汽水中、土壌中又はコンポスト中の少なくとも何れかの環境で生分解される。また、特に、海水中では微生物量が少ないため、海水中で生分解性が高いこと（海洋生分解性樹脂組成物）が好ましい。本発明に係る樹脂組成物は、例えば海洋中に投棄された場合にも、酵素が高塩濃度下でも加水分解活性を示すことにより海水中で分解されることが期待できる。
本発明に係るポリエステル樹脂の分解の実施態様には、樹脂を意図的に海水に曝して分解させる態様の他、本発明に係るポリエステル樹脂が海水中に投棄され意図せずに海水中での分解に供される態様も含む。 [Resin composition]
A resin composition containing an enzyme and a polyester resin according to the present invention exhibits excellent biodegradability. The resin composition according to the present invention is generally biodegraded in at least one of seawater, freshwater, brackish water, soil, and compost. In particular, since the amount of microorganisms in seawater is small, it is preferable that the biodegradability in seawater is high (marine biodegradable resin composition). The resin composition according to the present invention can be expected to be decomposed in seawater even when it is dumped into the sea, for example, because the enzyme exhibits hydrolysis activity even at high salt concentrations.
Examples of the decomposition of the polyester resin according to the present invention include an embodiment in which the resin is intentionally exposed to seawater to decompose, and a polyester resin according to the present invention that is discarded in seawater and unintentionally decomposes in seawater. Also includes embodiments provided for.

本発明に係る樹脂組成物において、ポリエステル樹脂は、１種類を単独で用いても、２種類以上の樹脂を任意の組み合わせと比率で用いてもよい。 In the resin composition according to the present invention, one type of polyester resin may be used alone, or two or more types of resin may be used in any combination and ratio.

樹脂組成物中におけるポリエステル樹脂に対する酵素の配合量は、特に限定されないが、例えば０．００１－２０％（w/w）、好ましくは０．０１－１０％（w/w）、より好ましくは０．１－５％（w/w）である。 The amount of the enzyme compounded with respect to the polyester resin in the resin composition is not particularly limited, but is, for example, 0.001-20% (w/w), preferably 0.01-10% (w/w), more preferably 0 .1-5% (w/w).

酵素は、そのまま樹脂組成物中に配合され得る。また、酵素は、樹脂に付着固定した状態や、樹脂に結合固定した状態で樹脂組成物中に配合され得る。さらには、酵素は、形状任意の担体に付着結合または結合固定された状態や、立体格子形の担体の格子空間内に内包された状態、あるいは水溶性のカプセル形の担体内に内包された状態で樹脂組成物中に配合され得る。担体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド、および光硬化性樹脂等の合成高分子や、セルロース、カラギーナン、およびアルギン酸ナトリウム等の天然高分子からなるゲル担体、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリポロピレン、ポリエステル、ポリオレフィン、およびレーヨン等からなる担体が挙げられる。また、活性炭やアンスラサイト等の無機物主成分の担体を用いることも可能である。これらの担体には、いわゆるマイクロスフィアと称されるものも利用できる。 The enzyme can be incorporated into the resin composition as such. In addition, the enzyme may be incorporated into the resin composition in a state of being attached and fixed to the resin, or in a state of being bound and fixed to the resin. Furthermore, the enzyme is in a state in which it is attached or bonded to a carrier of any shape, in a state in which it is contained in the lattice space of a three-dimensional lattice-shaped carrier, or in a state in which it is contained in a water-soluble capsule-shaped carrier. in the resin composition. Examples of carriers include synthetic polymers such as polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyacrylamide, and photocurable resins, gel carriers made of natural polymers such as cellulose, carrageenan, and sodium alginate, polyethylene, Examples include carriers made of polyurethane, polypropylene, polyester, polyolefin, rayon, and the like. In addition, it is also possible to use a carrier mainly composed of an inorganic substance such as activated carbon or anthracite. So-called microspheres can also be used as these carriers.

１．PBS・PBSA乳化寒天培地の作成
2 gのポリブチレンサクシネート（PBS）又はポリブチレンサクシネートアジペート（PBSA）を40 mLのクロロホルムに溶解し、40 mgの界面活性剤（Plysurf A210G）と250 mLの水を加えた。溶液をプロセスホモジナイザーで乳化させた。乳化液をホットスターラーで3時間保温・撹拌し、クロロホルムを揮発させた。水で250 mLにメスアップした後、オートクレーブにて滅菌し、樹脂溶液とした。
ろ過した海水750 mLに対し、1g NH₄Cl、0.05 g K₂HPO₄、0.1 g BD Yeast Extract、15 g 寒天を加え、オートクレーブにて滅菌し、寒天溶液とした。
寒天溶液と乳化液を容量比が３：１となるように混合した後、固化させて平板培地（PBS(A)乳化寒天培地）とした。 1. Preparation of PBS/PBSA emulsified agar medium
2 g of polybutylene succinate (PBS) or polybutylene succinate adipate (PBSA) was dissolved in 40 mL of chloroform and 40 mg of surfactant (Plysurf A210G) and 250 mL of water were added. The solution was emulsified with a process homogenizer. The emulsified liquid was kept warm and stirred with a hot stirrer for 3 hours to volatilize the chloroform. After making up to 250 mL with water, it was sterilized in an autoclave to obtain a resin solution.
To 750 mL of filtered seawater, 1 g NH ₄ Cl, 0.05 g K ₂ HPO ₄ , 0.1 g BD Yeast Extract and 15 g agar were added and sterilized in an autoclave to prepare an agar solution.
After mixing the agar solution and the emulsified liquid at a volume ratio of 3:1, the mixture was solidified to form a plate medium (PBS(A) emulsified agar medium).

２．海洋からのポリエステル分解微生物の探索
限外ろ過膜（分画分子量200,000Da）を用いて海水を体積比1/100となるまで濃縮した。
濃縮海水を培地（Marine Broth 2216）に播種した。培地にPBS又はPBSAの粉末を10 mg / mLで添加し、25℃、200 rpmで数週間培養した。
目視にて微生物の生育が確認でき次第、培地を少量採取し、継代を行った。25℃、200 rpmで数週間培養を行い、培地を分離源１として回収した。 2. Search for polyester-degrading microorganisms from the ocean Seawater was concentrated to 1/100 volume ratio using an ultrafiltration membrane (molecular cut off 200,000 Da).
Concentrated seawater was inoculated into the medium (Marine Broth 2216). PBS or PBSA powder was added to the medium at 10 mg/mL and cultured at 25°C and 200 rpm for several weeks.
As soon as the growth of the microorganisms was visually confirmed, a small amount of the medium was sampled and subcultured. Cultivation was carried out at 25° C. and 200 rpm for several weeks, and the medium was collected as isolation source 1.

濃縮海水100 mLに対し、微量のミネラル（8.5 mg/L KH₂PO₄、22 mg/L K₂HPO₄、33 mg/LNa₂HPO₄・2H₂O、1.7 mg/L NH₄Cl、0.25 mg/L FeCl₃・6H₂O）と30 mgのPBS粉末を添加した溶液を用いて、BOD測定器（Oxitop、セントラル科学株式会社）を用いて生分解試験を実施した。25℃でインキュベートし、生分解度の上昇が見られた時点で溶液を回収し、分離源２とした。 Trace minerals ₍ 8.5 mg/L _KH2PO4 , 22 mg/ _LK2HPO4 , 33 mg/L _{Na2HPO4 2H2O} , 1.7 mg/L _NH4Cl , _0.25 mg/L _per 100 mL of concentrated seawater) /L FeCl ₃ .6H ₂ O) and 30 mg of PBS powder were added, and a biodegradation test was performed using a BOD measuring instrument (Oxitop, Central Kagaku Co., Ltd.). After incubating at 25° C., the solution was collected when biodegradation increased and designated as isolation source 2 .

PBS(A)乳化寒天培地に分離源１又は分離源２を塗布した後、30℃で静置培養した。コロニー周辺に形成されるクリアゾーンを指標に、ポリエステル分解微生物を単離した。 After applying the isolation source 1 or the isolation source 2 to the PBS(A) emulsified agar medium, it was statically cultured at 30°C. Polyester-degrading microorganisms were isolated using the clear zone formed around the colony as an indicator.

３．ポリエステル分解酵素遺伝子の同定
ポリエステル分解微生物を1白金耳とり、培地（Marine Broth 2216）に植菌した。30℃、200 rpmで数日間培養した後、遠心分離により菌体を回収した。
菌体を破砕して得た抽出物からゲノムDNAを抽出し、配列を決定した。ゲノム配列中から加水分解酵素遺伝子を探索し、酵素１－９（アミノ酸配列を配列番号１－９に、核酸配列を配列番号１１－１９に示す）を見出した。なお、酵素３（配列番号３，１３）は、Vibrio gazogenesのゲノム配列から配列５，９との相同性検索により見出した。
酵素１～９の遺伝子を、ベクター（pET26b又はpET22b）にクローニングし、発現ベクターを得た。 3. Identification of Polyester Degrading Enzyme Gene A platinum loop of a polyester degrading microorganism was taken and inoculated in a medium (Marine Broth 2216). After culturing at 30°C and 200 rpm for several days, the cells were collected by centrifugation.
Genomic DNA was extracted from the extract obtained by disrupting the cells and sequenced. The genome sequence was searched for hydrolase genes, and enzymes 1-9 (amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 1-9 and nucleic acid sequences shown in SEQ ID NOS: 11-19) were found. Enzyme 3 (SEQ ID NOs: 3 and 13) was found by homology search with sequences 5 and 9 from the genome sequence of Vibrio gazogenes.
The genes for enzymes 1-9 were cloned into vectors (pET26b or pET22b) to obtain expression vectors.

４．酵素への変異導入
配列番号１９（酵素９）の遺伝子を有する発現ベクター 5-10ngを鋳型とし、50 pmolのプライマー、ＫＯＤＯｎｅポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いて、ＰＣＲ法にてアミノ酸置換の導入を行った。プライマー配列を表１に示す。
ＰＣＲ反応後、反応液に1 μLのＤｐｎＩ酵素溶液を添加し、37℃で１時間保温した。反応液3 μLをE. coli JM109のコンピテントセルに添加し、常法にて形質転換を行った。生じた形質転換体からプラスミドを抽出し、酵素１０の発現ベクターとした。
酵素１０は、酵素９のアミノ酸配列において１１３番目のＧｌｎをＴｙｒに、１５９番目のＧｌｙをＡｌａに、１７８番目のＴｙｒをＴｒｐに、２０５番目のＡｓｎをＬｙｓに置換した改変体酵素である。 4. Introduction of mutations into the enzyme Using 5-10 ng of an expression vector having the gene of SEQ ID NO: 19 (enzyme 9) as a template, 50 pmol of primers and KODOne polymerase (Toyobo Co., Ltd.) were used to introduce amino acid substitutions by PCR. gone. Primer sequences are shown in Table 1.
After the PCR reaction, 1 µL of DpnI enzyme solution was added to the reaction solution and incubated at 37°C for 1 hour. 3 μL of the reaction solution was added to competent cells of E. coli JM109, and transformation was performed by a conventional method. A plasmid was extracted from the resulting transformant and used as an expression vector for Enzyme 10.
Enzyme 10 is a modified enzyme in which, in the amino acid sequence of Enzyme 9, Gln at position 113 is substituted with Tyr, Gly at position 159 with Ala, Tyr at position 178 with Trp, and Asn at position 205 with Lys.

５．加水分解酵素の発現・精製
大腸菌（BL21(DE3)株又はRosetta2(DE3)株）を発現ベクターで形質転換した。10 mLのLB培地（1% Tryptone、0.5% Yeast Extract、1% NaCl）に組換菌を1白金耳植菌した。37℃、200 rpmで1晩培養し、前培養液とした。
前培養液を250 mLの2X YT培地に添加した。30℃、150 rpmで培養し、濁度（OD600）が1を超えたところでイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、150 rpmでさらに1晩培養し、本培養液を得た。 5. Expression and purification of hydrolase Escherichia coli (BL21(DE3) strain or Rosetta2(DE3) strain) was transformed with an expression vector. One platinum loop of the recombinant bacteria was inoculated into 10 mL of LB medium (1% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 1% NaCl). It was cultured overnight at 37°C and 200 rpm to prepare a preculture solution.
Preculture was added to 250 mL of 2X YT medium. Cultivate at 30°C and 150 rpm, add isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) when the turbidity (OD600) exceeds 1, culture at 150 rpm for another night, and perform main culture. I got the liquid.

酵素は、回収した菌体の抽出液、あるいはペリプラズム画分から精製した。
（１）ペリプラズム画分の調製
本培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体を本培養液の1/10量の緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH8.0)、20%(w/v) sucrose、1 mM EDTA）に懸濁した。懸濁液を遠心分離し、上清を除去した後、同量の水で菌体を再懸濁した。さらに懸濁液を遠心分離し、上清（ペリプラズム画分）を回収した。ペリプラズム画分に終濃度20 mMとなるようTris-HCl緩衝液(pH8.0)を加え、メンブレンフィルターでろ過してペリプラズム画分を得た。
（２）菌体抽出液の調製
培養液10 mL相当の菌体に対し8 mLのMerck社製BugBusterを加え、室温で30分から2時間撹拌した。その後、8,000gで10分間遠心し、上清を0.22μmフィルターで除菌し、菌体抽出液を得た。 The enzyme was purified from the collected extract of the cells or from the periplasmic fraction.
(1) Preparation of Periplasmic Fraction The culture medium was centrifuged to collect the cells. The cells were suspended in a buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20% (w/v) sucrose, 1 mM EDTA) of 1/10 volume of the main culture medium. After centrifuging the suspension and removing the supernatant, the cells were resuspended in the same volume of water. Further, the suspension was centrifuged to collect the supernatant (periplasmic fraction). A Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added to the periplasmic fraction to a final concentration of 20 mM, and filtered through a membrane filter to obtain a periplasmic fraction.
(2) Preparation of cell extract 8 mL of Merck BugBuster was added to cells corresponding to 10 mL of the culture medium, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes to 2 hours. Then, it was centrifuged at 8,000 g for 10 minutes, and the supernatant was sterilized with a 0.22 μm filter to obtain a cell extract.

ペリプラズム画分または菌体抽出液をアフィニティーカラム（HisTrap HP）で分画し、精製酵素を得た。 The periplasmic fraction or cell extract was fractionated with an affinity column (HisTrap HP) to obtain a purified enzyme.

６．酵素活性の測定
（１）測定１
ｐ－ニトロフェニルブチレートと精製酵素を反応させ、エステル結合の分解に伴い生じるｐ－ニトロフェノールを吸光度（405 nm）に基づき定量し、酵素活性を測定した。１分間に1 μmolのｐ－ニトロフェノールを生じる酵素量を1ユニットと定義した。反応は100 mMのTris-HCl緩衝液 (pH8.0)中で行い、反応系の液量は200 μLとした。ｐ－ニトロフェニルブチレートをDMSOに溶解し、反応系内への終濃度1 mMで添加した。経時的に405 nmの吸光度を測定し、直線領域から初速度を算出した。 6. Measurement of enzyme activity (1) Measurement 1
p-Nitrophenylbutyrate and the purified enzyme were allowed to react, and p-nitrophenol produced by decomposition of the ester bond was quantified based on the absorbance (405 nm) to measure the enzymatic activity. One unit was defined as the amount of enzyme that produced 1 μmol of p-nitrophenol per minute. The reaction was performed in a 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the liquid volume of the reaction system was 200 μL. p-Nitrophenyl butyrate was dissolved in DMSO and added to the reaction system at a final concentration of 1 mM. The absorbance at 405 nm was measured over time, and the initial velocity was calculated from the linear region.

結果を図１に示す。酵素１－１０について、ｐ－ニトロフェニルブチレートのエステル結合分解活性が確認された。 The results are shown in FIG. Enzyme 1-10 was confirmed to have p-nitrophenyl butyrate ester bond-cleaving activity.

（２）測定２
乳化PBS溶液を、OD660が0.5となるよう20 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)で希釈した。900 μLの乳化PBS溶液に対し、100 μLの精製酵素溶液を添加した。吸光度計で660 nmの濁度減少を経時的に測定した。
酵素の添加量は以下のとおりとした。 (2) Measurement 2
The emulsified PBS solution was diluted with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to an OD660 of 0.5. 100 μL of purified enzyme solution was added to 900 μL of emulsified PBS solution. Turbidity decrease at 660 nm was measured over time with an absorbance meter.
The amount of enzyme added was as follows.

結果を図２に示す。図中、縦軸は濁度の減少値、横軸は時間を示す。酵素１－１０について、PBSの分解活性が確認された。 The results are shown in FIG. In the figure, the vertical axis indicates the turbidity decrease value, and the horizontal axis indicates time. PBS-degrading activity was confirmed for enzymes 1-10.

（３）測定３
精製酵素を含む20 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0) 1 mLに、1 cm²のPBSフィルム又はPBSAフィルムを浸漬し、30℃、約1－3日間静置し反応させた。反応終了後、フィルム表面を70%エタノールで洗浄し、風乾させたのち、フィルムの重量減少を測定した。酵素の添加量は以下のとおりとした。 (3) Measurement 3
A 1 cm ² PBS film or PBSA film was immersed in 1 mL of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing the purified enzyme, and allowed to stand at 30° C. for about 1 to 3 days to react. After completion of the reaction, the film surface was washed with 70% ethanol and air-dried, and the weight loss of the film was measured. The amount of enzyme added was as follows.

結果を図３に示す。酵素１－１０について、PBSフィルム及びPBSAフィルムの分解の進行が確認された。 The results are shown in FIG. Regarding Enzyme 1-10, progress of decomposition of PBS film and PBSA film was confirmed.

（４）測定４
酵素１０を含む200 mM Tris-HCl 緩衝液(pH8.0) 5 mLに、1 cm²のPEFフィルムおよびPETフィルムをそれぞれ浸漬し、40℃、120 rpmで8日間反応を行った。反応終了後、フィルム表面を70%エタノールで洗浄し、風乾させたのち、フィルムの重量減少を測定した。酵素の添加量は50 μgとした。 (4) Measurement 4
A 1 cm ² PEF film and a PET film were immersed in 5 mL of 200 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing enzyme 10, and reacted at 40° C. and 120 rpm for 8 days. After completion of the reaction, the film surface was washed with 70% ethanol and air-dried, and the weight loss of the film was measured. The amount of enzyme added was 50 μg.

結果を図４に示す。PEFフィルムおよびPETフィルムの両方のポリエステルに対して分解の進行が確認された。 The results are shown in FIG. Degradation progress was confirmed for the polyester of both the PEF film and the PET film.

配列番号１：酵素１のアミノ酸配列
配列番号２：酵素２のアミノ酸配列
配列番号３：酵素３のアミノ酸配列
配列番号４：酵素４のアミノ酸配列
配列番号５：酵素５のアミノ酸配列
配列番号６：酵素６のアミノ酸配列
配列番号７：酵素７のアミノ酸配列
配列番号８：酵素８のアミノ酸配列
配列番号９：酵素９のアミノ酸配列
配列番号１０：酵素１０のアミノ酸配列
配列番号１１：酵素１の遺伝子配列
配列番号１２：酵素２の遺伝子配列
配列番号１３：酵素３の遺伝子配列
配列番号１４：酵素４の遺伝子配列
配列番号１５：酵素５の遺伝子配列
配列番号１６：酵素６の遺伝子配列
配列番号１７：酵素７の遺伝子配列
配列番号１８：酵素８の遺伝子配列
配列番号１９：酵素９の遺伝子配列
配列番号２０：酵素１０の遺伝子配列
配列番号２１：プライマーPS2-3_Q113Y_Fの塩基配列
配列番号２２：プライマーPS2-3_Q113Y_Rの塩基配列
配列番号２３：プライマーPS2-3_G159A_Fの塩基配列
配列番号２４：プライマーPS2-3_G159A_Rの塩基配列
配列番号２５：プライマーPS2-3_Y178W_Fの塩基配列
配列番号２６：プライマーPS2-3_Y178W_Rの塩基配列
配列番号２７：プライマーPS2-3_N205K_Fの塩基配列
配列番号２８：プライマーPS2-3_N205K_Rの塩基配列 SEQ ID NO: 1: amino acid sequence of enzyme 1 SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of enzyme 2 SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of enzyme 3 SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of enzyme 4 SEQ ID NO: 5: amino acid sequence of enzyme 5 SEQ ID NO: 6: enzyme SEQ ID NO: 7: amino acid sequence of enzyme 7 SEQ ID NO: 8: amino acid sequence of enzyme 8 SEQ ID NO: 9: amino acid sequence of enzyme 9 SEQ ID NO: 10: amino acid sequence of enzyme 10 SEQ ID NO: 11: gene sequence sequence of enzyme 1 SEQ ID NO: 12: gene sequence of enzyme 2 SEQ ID NO: 13: gene sequence of enzyme 3 SEQ ID NO: 14: gene sequence of enzyme 4 SEQ ID NO: 15: gene sequence of enzyme 5 SEQ ID NO: 16: gene sequence of enzyme 6 SEQ ID NO: 17: enzyme 7 SEQ ID NO: 18: gene sequence of enzyme 8 SEQ ID NO: 19: gene sequence of enzyme 9 SEQ ID NO: 20: gene sequence of enzyme 10 SEQ ID NO: 21: base sequence of primer PS2-3_Q113Y_F SEQ ID NO: 22: primer PS2-3_Q113Y_R Base sequence SEQ ID NO: 23: base sequence of primer PS2-3_G159A_F SEQ ID NO: 24: base sequence of primer PS2-3_G159A_R SEQ ID NO: 25: base sequence of primer PS2-3_Y178W_F SEQ ID NO: 26: base sequence of primer PS2-3_Y178W_R SEQ ID NO: 27: Nucleotide sequence of primer PS2-3_N205K_F SEQ ID NO: 28: Nucleotide sequence of primer PS2-3_N205K_R

Claims (8)

配列番号１－１０のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号１－１０のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
ポリエステル樹脂に対する加水分解活性を有する、
酵素。 consisting of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1-10 or an amino acid sequence having at least 80% sequence identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-10;
having hydrolytic activity on polyester resins,
enzyme. 前記ポリエステル樹脂が、生分解性ポリエステル樹脂である、請求項１に記載の酵素。 2. The enzyme of claim 1, wherein said polyester resin is a biodegradable polyester resin. 前記生分解性ポリエステル樹脂が、脂肪族ポリエステル樹脂である、請求項２に記載の酵素。 3. The enzyme of claim 2, wherein said biodegradable polyester resin is an aliphatic polyester resin. 前記脂肪族ポリエステル樹脂が、炭素数２－２０のジオール化合物と炭素数２－２０のジカルボン酸との重合物である、請求項３に記載の酵素。 4. The enzyme according to claim 3, wherein the aliphatic polyester resin is a polymer of a diol compound having 2 to 20 carbon atoms and a dicarboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms. 請求項１に記載の酵素を発現する組換え微生物。 A recombinant microorganism expressing the enzyme of claim 1. 請求項１に記載の酵素と、ポリエステル樹脂と、を含有する樹脂組成物。 A resin composition comprising the enzyme according to claim 1 and a polyester resin. 請求項１に記載の酵素又は請求項５に記載の組換え微生物と、ポリエステル樹脂と、を接触させる工程を含む、ポリエステル樹脂の分解方法。 A method for decomposing a polyester resin, comprising the step of contacting the enzyme according to claim 1 or the recombinant microorganism according to claim 5 with a polyester resin. 前記工程が、海水中で行われる、請求項７に記載の分解方法。 8. The decomposition method according to claim 7, wherein the step is performed in seawater.

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