JP2022136096A - PROMOTER OF Hspa5 GENE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｈｓｐａ５遺伝子のプロモーターを有する外来遺伝子発現ベクターで哺乳動物宿主細胞を形質転換して構築した哺乳動物細胞を用いた該外来蛋白質の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a foreign protein using a mammalian cell constructed by transforming a mammalian host cell with a foreign gene expression vector having an Hspa5 gene promoter.
遺伝子組換え技術の発展によって、治療用蛋白質や抗体医薬といった蛋白質性医薬品が急速にその市場を拡大している。中でも、抗体医薬は人体に投与しても有害な免疫反応を引き起こさず、その特異性の高さから開発が盛んに進められている。 With the development of gene recombination technology, the market for protein drugs such as therapeutic proteins and antibody drugs is rapidly expanding. Among them, antibody drugs do not cause harmful immune reactions even when administered to the human body, and are being actively developed because of their high specificity.
抗体医薬に代表される蛋白質性医薬を生産させる宿主としては、微生物や酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動植物等を挙げることができる。蛋白質性医薬の生理活性や抗原性には、フォールディングや糖鎖修飾といった翻訳後修飾が必須であるため、複雑な翻訳後修飾を行うことができない微生物や糖鎖構造の大きく異なる植物は宿主として不適である。ヒトと類似した糖鎖構造を有し、翻訳後修飾が可能、さらには安全性の面を考慮し、ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ：チャイニーズハムスターの卵巣）等の哺乳動物培養細胞が現在の主流となっている。 Examples of hosts for producing proteinaceous drugs represented by antibody drugs include microorganisms, yeast, insects, animal and plant cells, transgenic animals and plants, and the like. Since post-translational modifications such as folding and glycosylation are essential for the physiological activity and antigenicity of protein drugs, microorganisms that cannot carry out complex post-translational modifications and plants that have significantly different glycosylation structures are not suitable hosts. is. Mammalian cultured cells such as CHO cells (Chinese Hamster Ovary) are currently the mainstream, considering their sugar chain structure similar to that of humans, post-translational modification, and safety. It's becoming
哺乳動物培養細胞を宿主とする場合、微生物等と比較して、増殖速度の低さ、生産性の低さ、高価なコスト等の問題を抱えている（非特許文献１）。また、蛋白質性医薬品を臨床で利用するためには大量の投与が必要となるため、世界的にもその生産能力の不足が問題となっている。哺乳類培養細胞発現系で蛋白質性医薬品を製造する場合、合成低分子医薬品に比べて製造コストが高いため、各製造工程の改良によって製造コストの低減が図られているが、哺乳類培養細胞発現系における生産量の向上も製造コスト低減の有力な方法である（非特許文献２、３）。そこで、哺乳動物培養細胞における外来遺伝子の生産性を向上させるため、これまでに、プロモーターやエンハンサー、薬剤選択マーカー、遺伝子増幅、培養工学的手法等多くのアプローチが試行錯誤されてきている。ＣＨＯ細胞を宿主細胞として用いられる場合、外来遺伝子の発現、すなわち蛋白質性医薬品の生産にはウイルス由来のＨｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（以下ＣＭＶプロモーター）が一般的に用いられている（非特許文献４、５、６）。また、ＣＨＯ細胞において、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ であるＥＦ－１α（特許文献１、非特許文献７）、ヒトリボソーム蛋白質遺伝子であるＲＰＬ３２やＲＰＳ１１の転写開始点の上流域のポリヌクレオチド（プロモーター領域）を単独または他の異種プロモーターと組み合わせて蛋白質発現に使用できることが知られている（非特許文献８、特許文献２）。しかしながら、これらのプロモーターは、宿主となる哺乳動物培養細胞の細胞内の生理状況に応答して下流の外来遺伝子の発現を調整しており、多くは哺乳動物培養細胞の増殖が活発である対数増殖期にその活性が最大になる。従って、最大細胞密度の到達以降の定常期では、その発現調節機能は減弱することが多いため、哺乳動物培養細胞の培養期間を通して外来遺伝子の強力な発現が可能なプロモーターの開発が望まれている。
When cultured mammalian cells are used as hosts, they have problems such as low growth rate, low productivity, and high cost compared to microorganisms (Non-Patent Document 1). In addition, since a large amount of administration is required for clinical use of protein pharmaceuticals, the lack of production capacity has become a problem worldwide. When manufacturing protein drugs using mammalian cultured cell expression systems, manufacturing costs are higher than for synthetic low-molecular-weight drugs. Improving production volume is also an effective method for reducing manufacturing costs (Non-Patent
本発明の課題は、哺乳動物培養細胞等の宿主細胞において、高い外来遺伝子発現亢進活性を有するプロモーターを用いて、蛋白質性医薬品となる外来蛋白質の生産量を亢進させる手段を提供することにある。ＣＨＯ細胞等においてヒトＥＦ－１αプロモーターと同程度以上のプロモーター活性を有し、且つ、哺乳動物培養細胞の対数増殖期から定常期までの広範な期間において高いプロモーター活性を維持するプロモーターを見出すことにより、哺乳動物細胞が安定的に外来遺伝子の高発現を達成する手段を提供し、哺乳類培養細胞発現系における蛋白質生医薬品の生産量の向上、すなわち製造コスト低減に貢献する手段を提供することができる。 An object of the present invention is to provide means for enhancing the production of a foreign protein, which is a proteinaceous drug, in host cells such as cultured mammalian cells, using a promoter having a high foreign gene expression-enhancing activity. By discovering a promoter that has a promoter activity equivalent to or higher than that of the human EF-1α promoter in CHO cells or the like and maintains high promoter activity over a wide period from the logarithmic growth phase to the stationary phase of cultured mammalian cells. , mammalian cells can provide means for stably achieving high expression of exogenous genes, and can provide means for improving the production of crude protein drugs in mammalian cultured cell expression systems, that is, contributing to reducing production costs. .
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒートショックプロテインＡ５（Ｈｓｐａ５／ＧＲＰ７８）遺伝子の開始コドンの上流約３ｋｂｐのポリヌクレオチドが、優れたプロモーター活性を有し、哺乳動物培養細胞において発現対象となる外来蛋白質の生産性を著しく向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５遺伝子のプロモーターであって、配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、配列番号１に記載のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の部分配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号６に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（６）配列番号８に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（７）配列番号９に記載のヌクレオチド配列からなる、前記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（８）ヒト由来Ｈｓｐａ５遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（９）マウス由来Ｈｓｐａ５遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（１０）ラット由来Ｈｓｐａ５遺伝子のプロモーターである、配列表の配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（１１）前記（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９５％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（１２）前記（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９９％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（１３）前記（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（１４）前記（１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、外来遺伝子発現ユニット。
（１５）外来遺伝子が多量体蛋白質をコードする遺伝子である、前記（１４）に記載の外来遺伝子発現ユニット。
（１６）外来遺伝子がヘテロ多量体蛋白質をコードする遺伝子である、前記（１４）に記載の外来遺伝子発現ユニット。
（１７）外来遺伝子が抗体又はその抗原結合性断片をコードする遺伝子である、前記（１４）に記載の外来遺伝子発現ユニット。
（１８）前記（１４）乃至（１７）のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニットを含む外来遺伝子発現ベクター。
（１９）前記（１４）乃至（１７）のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ユニット及び下記Ａ群の（ａ）乃至（ｅ）に記載のポリヌクレオチドから選択されるいずれか一つ
又は複数のポリヌクレオチドを含む外来遺伝子発現ベクター；
Ａ群
（ａ）配列表の配列番号３５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号３６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ）配列表の配列番号３７に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｄ）前記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９５％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド、
（ｅ）上記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に対して９９％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
（２０）前記（１８）又は（１９）に記載の外来遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
（２１）細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、前記（２０）に記載の形質転換細胞。
（２２）哺乳動物由来の培養細胞が、ＣＯＳ－１細胞、２９３細胞、又はＣＨＯ細胞である、前記（２１）に記載の形質転換細胞。
（２３）前記（２０）乃至（２２）のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から外来遺伝子由来の蛋白質を取得することを特徴とする、該蛋白質の製造方法。
（２４）形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、前記（１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
（２５）形質転換細胞において外来遺伝子を発現させることを目的とする、前記（１８）又は（１９）に記載の外来遺伝子発現ベクターの使用。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors found that a polynucleotide of about 3 kbp upstream of the start codon of the heat shock protein A5 (Hspa5/GRP78) gene has excellent promoter activity, The inventors have found that it is possible to markedly improve the productivity of a foreign protein to be expressed in cultured animal cells, and have completed the present invention. That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A promoter of the Hspa5 gene derived from Chinese hamsters, comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, from the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence of the nucleotide sequence Polynucleotides.
(2) The polynucleotide according to (1), which consists of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1.
(3) The polynucleotide according to (1), which consists of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:5.
(4) The polynucleotide according to (1), which consists of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:6.
(5) The polynucleotide according to (1), which consists of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:7.
(6) The polynucleotide according to (1), which consists of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:8.
(7) The polynucleotide according to (1), which consists of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:9.
(8) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, which is the promoter of the human-derived Hspa5 gene.
(9) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing, which is the mouse-derived Hspa5 gene promoter.
(10) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, which is the promoter of the rat-derived Hspa5 gene.
(11) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 95% or more identity to the nucleotide sequence according to any one of (1) to (10) above, and having promoter activity.
(12) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 99% or more identity to the nucleotide sequence according to any one of (1) to (10) above, and having promoter activity.
(13) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence according to any one of (1) to (12) above, and has promoter activity. Polynucleotide.
(14) A foreign gene expression unit comprising the polynucleotide according to any one of (1) to (13) above.
(15) The foreign gene expression unit according to (14) above, wherein the foreign gene is a gene encoding a multimeric protein.
(16) The foreign gene expression unit according to (14) above, wherein the foreign gene is a gene encoding a heteromultimeric protein.
(17) The foreign gene expression unit according to (14) above, wherein the foreign gene is a gene encoding an antibody or an antigen-binding fragment thereof.
(18) A foreign gene expression vector comprising the foreign gene expression unit according to any one of (14) to (17) above.
(19) Any one or more selected from the foreign gene expression unit according to any one of (14) to (17) above and the polynucleotides according to (a) to (e) of Group A below a foreign gene expression vector comprising a polynucleotide of;
Group A (a) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 in the sequence listing;
(b) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 36 in the sequence listing;
(c) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 in the sequence listing;
(d) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 95% or more identity to the nucleotide sequence according to any one of (a) to (c) above, which has exogenous gene expression-enhancing activity. ,
(e) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 99% or more identity to the nucleotide sequence according to any one of (a) to (c) above, and having foreign gene expression-enhancing activity. .
(20) A transformed cell into which the foreign gene expression vector according to (18) or (19) has been introduced.
(21) The transformed cell according to (20) above, wherein the cell is a mammal-derived cultured cell.
(22) The transformed cell according to (21) above, wherein the mammal-derived cultured cell is COS-1 cell, 293 cell, or CHO cell.
(23) A method for producing a protein, which comprises culturing the transformed cell according to any one of (20) to (22) above, and obtaining the foreign gene-derived protein from the culture.
(24) Use of the polynucleotide according to any one of (1) to (13) above for the purpose of expressing a foreign gene in transformed cells.
(25) Use of the foreign gene expression vector according to (18) or (19) above for the purpose of expressing a foreign gene in transformed cells.
本発明の外来遺伝子の製造方法によって、治療用蛋白質や抗体等の外来遺伝子の発現を著しく亢進することが可能になる。また、本発明のプロモーターは、ＤＮＡエレメントと組み合わせることにより、治療用蛋白質や抗体等の外来遺伝子の発現をさらに亢進することが可能になる。 The method for producing a foreign gene of the present invention makes it possible to remarkably enhance the expression of foreign genes such as therapeutic proteins and antibodies. In addition, the promoter of the present invention can further enhance the expression of foreign genes such as therapeutic proteins and antibodies by combining with DNA elements.
以下、本発明を具体的に説明する。 The present invention will be specifically described below.
本明細書において、「遺伝子」とは、ｍＲＮＡに転写され、蛋白質に翻訳される部分を意味し、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのＲＮＡも含まれるものとする。 As used herein, the term "gene" means a portion that is transcribed into mRNA and translated into protein, and includes not only DNA but also its mRNA, cDNA and its RNA.
本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。 As used herein, "polynucleotide" is used synonymously with nucleic acid and includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers.
本明細書において、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。 As used herein, the terms "polypeptide" and "protein" are used interchangeably.
本明細書において、「遺伝子発現」とは、ある遺伝子がｍＲＮＡに転写される現象、及び／又は該ｍＲＮＡから蛋白質が翻訳される現象を意味している。 As used herein, "gene expression" means a phenomenon in which a certain gene is transcribed into mRNA and/or a phenomenon in which protein is translated from the mRNA.
本明細書において、「外来遺伝子」とは、人工的に宿主細胞に導入される遺伝子を意味している。 As used herein, the term "foreign gene" means a gene that is artificially introduced into host cells.
本明細書において、「外来蛋白質」とは、外来遺伝子にコードされる蛋白質を意味している。 As used herein, the term "foreign protein" means a protein encoded by a foreign gene.
本明細書において、「遺伝子発現ユニット」とは、転写の読み枠の方向に、少なくともプロモーター領域、外来遺伝子、転写ターミネーター領域（ポリＡ付加シグナル）を有するポリヌクレオチドを意味している。 As used herein, a "gene expression unit" means a polynucleotide having at least a promoter region, a foreign gene, and a transcription terminator region (poly A addition signal) in the direction of the transcription reading frame.
本明細書において、「プロモーター」とは、ＤＮＡからＲＮＡへの転写の開始に関与する転写因子が結合する領域を意味する。本明細書においては、「プロモーター領域」ということもある。プロモーターとして、例えば、開始コドンの上流約３ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列直前のヌクレオチドまでのポリヌクレオチ
ドを例示でき、５’ＵＴＲ、及びイントロンを含んでもよい。
As used herein, the term "promoter" refers to a region bound by a transcription factor involved in the initiation of transcription from DNA to RNA. In the present specification, it is sometimes referred to as "promoter region". Examples of promoters include, for example, a polynucleotide from about 3 kbp upstream of the initiation codon to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon, and may include a 5'UTR and an intron.
本明細書において、「プロモーター活性」とは、転写因子がプロモーターに結合し、転写を開始し、遺伝子にコードされる蛋白質の生産を行う活性をいい、ホタルルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子にコードされる蛋白質の活性を指標として検定することが可能である。 As used herein, the term "promoter activity" refers to the activity of a transcription factor binding to a promoter, initiating transcription, and producing a protein encoded by a gene. Protein encoded by a reporter gene such as firefly luciferase can be assayed using the activity of
本明細書において、「プロモーター活性を有する」とは、後記（実施例５）に記載の流加培養での抗体発現量を指標としたプロモーター活性の評価と同様の条件で、ヒトＥＦ－１α遺伝子プロモーターと同等以上の抗体発現量を示すことをいう。 As used herein, the term "having promoter activity" refers to the evaluation of promoter activity using the antibody expression level in fed-batch culture described later (Example 5) as an indicator, under the same conditions as those described below, human EF-1α gene It refers to exhibiting an antibody expression level equal to or higher than that of the promoter.
本明細書中において、「ＤＮＡエレメント」とは、遺伝子発現ユニットの近傍又は、遺伝子発現ユニットの含まれる外来遺伝子発現ベクター上に配置された場合に、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチドを意味する。 As used herein, the term "DNA element" means a polynucleotide having foreign gene expression-enhancing activity when placed in the vicinity of a gene expression unit or on a foreign gene expression vector containing a gene expression unit. .
本明細書中において、「抗体の抗原結合性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等を含むが、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。 As used herein, the term "antigen-binding fragment of an antibody" means a partial fragment of an antibody having antigen-binding activity, and includes Fab, F(ab') 2 and the like. It is not limited to these molecules as long as they have binding ability.
本明細書中において、「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の、配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、一列の２つ以上のヌクレオチド配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の一致によって決定したときの、核酸分子間またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されるギャップアラインメント（存在する場合）との間の同一一致のパーセントを算出することにより評価することができる。具体的には、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ－Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）が提供するＣｌｕｓｔａｌＷ２等のソフトを使用することにより評価することができるが、当業者において使用されるものであればこれに限定されない。 As used herein, "identity" refers to the relationship between sequences of two or more nucleotide or amino acid sequences, as determined by comparing the sequences, as is known in the art. In the art, "identity" also refers to sequences between nucleic acid molecules or polypeptides, as the case may be, as determined by the correspondence between two or more nucleotide sequences or between two or more amino acid sequences in a row. It means the degree of relevance. "Identity" is an identical match between the minor of two or more sequences and a gapped alignment (if any) addressed by a particular mathematical model or computer program (i.e., "algorithm"). can be evaluated by calculating the percentage of Specifically, it can be evaluated by using software such as ClustalW2 provided by the European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), but it is limited to those used by those skilled in the art. not.
本明細書中において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ある核酸に対する同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましく９９％以上のヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。より具体的には、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７乃至１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１乃至２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１５ ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。 As used herein, "hybridize under stringent conditions" refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, a complementary strand of a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence with 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more identity to a certain nucleic acid hybridizes, and the identity is lower than that Examples include conditions under which a complementary strand of a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence does not hybridize. More specifically, hybridization is carried out at 68° C. in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech), or in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a DNA-immobilized filter. After hybridization at 68° C., washing at 68° C. with a 0.1 to 2-fold SSC solution (1-fold SSC is 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate), or It means to hybridize under equivalent conditions.
１．外来遺伝子の発現亢進に使用されるプロモーター
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来プロモーターは、ヒートショックプロテインＡ５遺伝子（以下、「Ｈｓｐａ５」という）のプロモーターである。Ｈｓｐａ５プロモーターとしての活性を有するポリヌクレオチドであれば特に限定されないが、Ｈｓｐａ５のプロモーターとしては、開始コドンの上流約３ｋｂｐのヌクレオチド
から開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでのポリヌクレオチドが好ましい。
1. Promoter Used for Enhancing Expression of Foreign Gene The foreign promoter used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention is the promoter of the heat shock protein A5 gene (hereinafter referred to as "Hspa5"). A polynucleotide having activity as an Hspa5 promoter is not particularly limited, but a preferred Hspa5 promoter is a polynucleotide from about 3 kbp upstream of the initiation codon to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon.
Ｈｓｐａ５のプロモーターの由来は特に限定されないが、哺乳類由来であってもよく、例えばチャイニーズハムスター、ヒト、マウス、ラット等由来のＨｓｐａ５のプロモーターを挙げることができる。 Although the origin of the Hspa5 promoter is not particularly limited, it may be derived from mammals, and examples thereof include Hspa5 promoters derived from Chinese hamsters, humans, mice, rats, and the like.
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用されるプロモーターとして、好適には、チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５のプロモーターであり、さらに好適には配列表の配列番号１及び図１２に記載のポリヌクレオチドである。配列番号１のヌクレオチド配列は、チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５の開始コドンの上流約３ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドからなる配列である。配列番号２、３、及び４のヌクレオチド配列は、それぞれ、ヒト、マウス、ラット由来Ｈｓｐａ５の開始コドンの上流約１ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドからなる配列である。配列番号２、３、及び４のヌクレオチド配列を、それぞれ、図１３、図１４、図１５にも示す。 The promoter used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention is preferably the Chinese hamster-derived Hspa5 promoter, and more preferably the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 and FIG. be. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a sequence consisting of nucleotides about 3 kbp upstream of the initiation codon of Chinese hamster-derived Hspa5 and immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon. The nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 2, 3, and 4 are sequences consisting of nucleotides approximately 1 kbp upstream of the start codon of human, mouse, and rat-derived Hspa5 and immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the start codon, respectively. The nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 2, 3 and 4 are also shown in Figures 13, 14 and 15, respectively.
チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５のプロモーターとしては配列番号１に記載の配列の部分配列からなるヌクレオチド配列であってもよく、それぞれＨｓｐａ５の開始コドンの上流約２．５、２．０、１．５、１．１及び０．６ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドからなる配列の配列番号５、６、７、８及び９記載の配列を含むポリヌクレオチドが例示され、配列番号７、８及び９に記載のポリヌクレオチドが好ましく、配列番号８及び９に記載のポリヌクレオチドがより好ましい。 The promoter of Chinese hamster-derived Hspa5 may be a nucleotide sequence consisting of a partial sequence of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and approximately 2.5, 2.0, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5, 1.5 and 1.5, may also be used. Polynucleotides containing the sequences set forth in SEQ ID NOS: 5, 6, 7, 8 and 9, consisting of nucleotides of 1 and 0.6 kbp to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon, are exemplified, and SEQ ID NOS: 7 and 8 and 9 are preferred, and the polynucleotides set forth in SEQ ID NOS: 8 and 9 are more preferred.
また、本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用されるプロモーターは配列番号１乃至９に示すいずれか一つのヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであっても良い。 In addition, the promoter used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% of any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 9. As mentioned above, most preferably, it may be a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 99% or more identity and having promoter activity.
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用されるプロモーターは、配列番号１乃至９に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。 The promoter used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention is a nucleotide complementary to a polynucleotide consisting of any one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 9. It may be a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of a sequence under stringent conditions and has promoter activity.
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用されるプロモーターは、配列番号１乃至９に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列において、１又は複数、好ましくは１乃至３００個、さらに好ましくは１乃至３０個のヌクレオチドが欠失、置換、及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなる変異ポリヌクレオチドであって、かつプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。 The promoter used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention has one or more, preferably one nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 9. It may be a mutant polynucleotide consisting of a nucleotide sequence in which 1 to 300 to 300, more preferably 1 to 30, nucleotides are deleted, substituted, and/or added, and having promoter activity.
前記ヌクレオチド配列の変異（欠失、置換、及び／又は付加）の導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の当該技術分野で公知の手法、又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ－Ｋ（タカラバイオ社製）若しくはＭｕｔａｎｔ－Ｇ（タカラバイオ社製）、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキット等が利用できる。このような変異ポリヌクレオチドも本発明のプ
ロモーターとして使用することができる。
The introduction of mutations (deletion, substitution, and/or addition) in the nucleotide sequence can be performed by a method known in the art such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method equivalent thereto. Mutagenesis kits using selective mutagenesis (for example, Mutant-K (manufactured by Takara Bio) or Mutant-G (manufactured by Takara Bio), LA PCR in vitro Mutagenesis series kits of Takara Bio, etc. can be used. Such mutant polynucleotides can also be used as promoters of the present invention.
本発明のプロモーターの有する外来遺伝子発現亢進活性は、ホタルルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子にコードされる蛋白質の活性、あるいは、流加培養での抗体生産量を指標として検定することが可能である。ヒトＥＦ－１αプロモーターを使用した場合と本発明のプロモーターを使用した場合を比較して、流加培養での抗体生産量が同等以上、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上に上昇した場合、該プロモーターが外来遺伝子発現亢進活性を有すると判断することができる。１．２倍程度以上の亢進によっても、細胞の培養スケールの削減、培養時間、及び精製工程の短縮が期待され、結果として収量の向上と培養コストの削減が可能となる。収量が向上すれば、医薬としての外来蛋白質を安定して供給することが可能となる。又、培養コストが削減されれば、医薬としての外来蛋白質の原価が軽減される。 The foreign gene expression-enhancing activity of the promoter of the present invention can be assayed using the activity of a protein encoded by a reporter gene such as firefly luciferase or the amount of antibody produced in fed-batch culture as an index. Compared to the case of using the human EF-1α promoter and the case of using the promoter of the present invention, the amount of antibody produced in fed-batch culture is equivalent or higher, preferably 1.2-fold or higher, more preferably 1.5-fold. If the level is increased to above, it can be judged that the promoter has exogenous gene expression-enhancing activity. Even with an enhancement of about 1.2 times or more, it is expected that the cell culture scale will be reduced, the culture time and the purification process will be shortened, and as a result, it will be possible to improve the yield and reduce the culture cost. If the yield is improved, it becomes possible to stably supply the foreign protein as a drug. Also, if the culture cost is reduced, the cost of the foreign protein as a drug will be reduced.
２．外来遺伝子発現ユニット
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来遺伝子発現ユニット（以下、「本発明の遺伝子発現ユニット」ということもある）は、転写の読み枠の方向に、少なくとも前記１．に記載の本発明のプロモーター、外来遺伝子、及び転写ターミネーター領域（ポリＡ付加シグナル）を有するものである。
2. Foreign gene expression unit The foreign gene expression unit (hereinafter sometimes referred to as the "gene expression unit of the present invention") used in the method for producing a protein derived from a foreign gene of the present invention has at least 1 above. The promoter of the present invention described in 1, a foreign gene, and a transcription terminator region (poly A addition signal).
また、ポリＡ付加配列は、プロモーターからの転写に対して転写終結を起こす活性を有する配列であればよく、プロモーターの遺伝子と同じ又は異なる遺伝子のものであってもよい。 Moreover, the poly(A) addition sequence may be any sequence that has the activity of terminating transcription from the promoter, and may be of the same or different gene as the gene of the promoter.
３．外来遺伝子の発現亢進に使用されるＤＮＡエレメント
前記２．に記載の本発明の遺伝子発現ユニットとＤＮＡエレメントを組み合わせて使用することにより、外来遺伝子の発現をさらに亢進することができる。組み合わせて使用するＤＮＡエレメントは、アセチル化ヒストンＨ３との相互作用を指標として取得することが可能である。一般にヒストン（Ｈ３、Ｈ４）のアセチル化は転写の活性化に関与しているといわれており、主に２つの説が考えられている。ヒストンテールがアセチル化することで電荷的に中和され、ＤＮＡとヒストンとの結合が緩くなるというヌクレオソームの立体構造変化が関係している説（Ｍｅｌｌｏｒ Ｊ． （２００６） Ｄｙｎａｍｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ２２（６）：３２０－３２９）と、様々な転写因子のリクルートに関与するという説（Ｎａｋａｔａｎｉ Ｙ． （２００１） Ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｓｅｓ－ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｙｅｒｓ． Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ． ６（２）：７９－８６）である。いずれの説においても、ヒストンのアセチル化が転写活性化に関与している可能性は高く、抗アセチル化ヒストンＨ３抗体を用いたクロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）によって、アセチル化ヒストンＨ３と相互作用するＤＮＡエレメントを濃縮することが可能である。
3. DNA element used for enhancing expression of
本発明のプロモーターと組み合わせて使用する、外来遺伝子の発現亢進に使用されるＤＮＡエレメントとして、Ａ２、Ａ７、及び、Ａ１８を挙げることができる。 A2, A7 and A18 can be exemplified as DNA elements used in combination with the promoter of the present invention to enhance the expression of foreign genes.
Ａ２はヒト１５番染色体８０９６６４２９～８０９７４８７８に位置しており、ＡＴ含量６２．２％、８４５０ｂｐのポリヌクレオチドである。Ａ２のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５に記載されている。 A2 is located on human chromosome 15 from 80966429 to 80974878 and is an 8450 bp polynucleotide with an AT content of 62.2%. The nucleotide sequence of A2 is set forth in SEQ ID NO: 35 of the Sequence Listing.
Ａ７はヒト１１番染色体８８９９２１２３～８９０００５４２に位置しており、ＡＴ含量６４．５２％、８４２０ｂｐのポリヌクレオチドである。Ａ７のヌクレオチド配列は、
配列表の配列番号３６に記載されている。
A7 is located on human chromosome 11 88992123-89000542 and is an 8420 bp polynucleotide with an AT content of 64.52%. The nucleotide sequence of A7 is
It is described in SEQ ID NO: 36 of the Sequence Listing.
Ａ１８は、ヒト４番染色体１１１２７５９７６～１１１２８４４５０に位置しており、ＡＴ含量６２．５４％、８４７５ｂｐのポリヌクレオチドである。Ａ１８のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７に記載されている。
A18 is located on
本発明のプロモーターと組み合わせて使用する、ＤＮＡエレメントの有する外来遺伝子発現亢進活性は、ＳＥＡＰ等のレポーター遺伝子にコードされる蛋白質の活性を指標として検定することが可能である。 The foreign gene expression-enhancing activity of the DNA element used in combination with the promoter of the present invention can be assayed using the activity of a protein encoded by a reporter gene such as SEAP as an index.
本発明のプロモーターと組み合わせて使用する場合、前記ＤＮＡエレメントのいずれか１種を単独で使用しても良く、ＤＮＡエレメントの１種を２コピー以上使用しても良い。あるいは２種以上ＤＮＡエレメントを組み合わせて使用しても良い。 When used in combination with the promoter of the present invention, any one of the above DNA elements may be used alone, or two or more copies of one of the DNA elements may be used. Alternatively, two or more DNA elements may be used in combination.
本発明において使用されるＤＮＡエレメントは、配列番号３５乃至３７に示すヌクレオチド配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するヌクレオチド配列であっても良い。ヌクレオチド配列のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ）等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴ等のプログラムを用いて行うことができる。 DNA elements used in the present invention have 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more identity to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS:35-37. It may be a nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence and having foreign gene expression-enhancing activity. Homology search of nucleotide sequences can be performed, for example, using programs such as FASTA and BLAST with DNA Databank of JAPAN as a target.
当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １０ Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｄｒｉｖｅ Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，
ＮＹ （１９８９））等を参照することにより、本発明のプロモーターのこうしたホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、前記のヌクレオチド配列の同一性は、同様に、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
Those of ordinary skill in the art are familiar with Molecular Cloning (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Planview,
NY (1989)), etc., such homologous genes of the promoter of the present invention can be easily obtained. In addition, the identity of the above nucleotide sequences can be similarly determined by FASTA search or BLAST search.
前記ポリヌクレオチドの変異（欠失、置換、及び／又は付加）の導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の当該技術分野で公知の手法、又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ－Ｋ（タカラバイオ社製）若しくはＭｕｔａｎｔ－Ｇ（タカラバイオ社製）、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキット等が利用できる。このような変異ポリヌクレオチドも本発明のＤＮＡエレメントとして使用することができる。 Introduction of mutation (deletion, substitution, and/or addition) of the polynucleotide can be performed by a method known in the art such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method equivalent thereto. Mutagenesis kits using selective mutagenesis (for example, Mutant-K (manufactured by Takara Bio) or Mutant-G (manufactured by Takara Bio), LA PCR in vitro Mutagenesis series kits of Takara Bio, etc. can be used. Such mutated polynucleotides can also be used as DNA elements of the present invention.
４．ポリヌクレオチドの取得
本発明において、後記の産生亢進の対象となる外来蛋白質をコードする外来遺伝子を含むポリヌクレオチドは、以下に示す一般的な方法により取得することができる。例えば、外来遺伝子が発現している細胞や組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを、当該遺伝子断片をもとにして合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。ｍＲＮＡの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、前記細胞又は組織を、グアニジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ－セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡをさらに分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該一本鎖ｃＤＮＡからＤＮＡ合成酵素Ｉ、ＤＮＡリガーゼ及びＲＮａｓｅＨ等を用いて二本鎖ｃＤＮ
Ａを合成する。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、ＥｃｏＲＩアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λｇｔ１１等のλファージに組み込んでｉｎ ｖｉｖｏパッケージングすることによってｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、λファージ以外にもプラスミドベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することもできる。その後、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株（ポジティブクローン）を選択すればよい。
4. Acquisition of Polynucleotide In the present invention, a polynucleotide containing a foreign gene encoding a foreign protein whose production is to be enhanced can be obtained by the following general method. For example, a cDNA library derived from cells or tissues in which a foreign gene is expressed can be isolated by screening using a DNA probe synthesized based on the gene fragment. Preparation of mRNA can be performed by a technique commonly used in the technical field. For example, the cells or tissues are treated with a guanidininine reagent, a phenol reagent, or the like to obtain total RNA, and then subjected to an affinity column method using an oligo(dT) cellulose column or poly U-Sepharose with Sepharose 2B as a carrier. Alternatively, poly(A)+RNA (mRNA) is obtained by a batch method. Furthermore, poly(A)+RNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. Next, using the obtained mRNA as a template, a single-stranded cDNA is synthesized using an oligo dT primer and reverse transcriptase, and the single-stranded cDNA is treated with DNA synthetase I, DNA ligase, RNase H, etc. to form a double-stranded cDNA. cDNAs
Synthesize A. After the synthesized double-stranded cDNA is blunted by T4 DNA synthetase, it is ligated with an adapter (e.g., EcoRI adapter), phosphorylated, etc., incorporated into a λ phage such as λgt11, and packaged in vivo to form a cDNA library. make. A cDNA library can also be constructed using a plasmid vector other than the λ phage. After that, strains (positive clones) having the desired DNA may be selected from the cDNA library.
また、蛋白質の産生に用いる前記プロモーター、ターミネーター領域を含むポリヌクレオチド、前記ＤＮＡエレメント又は外来遺伝子を含むポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡから単離する場合は、一般的手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９４（１９９１））に従い、採取源となる生物の細胞株よりゲノムＤＮＡを抽出し、ポリヌクレオチドを選別することにより行う。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、Ｃｒｙｅｒ らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １２， ３９－４４（１９７５））及びＰ． Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４， １６９－１８２（１９９１））に従って行うことができる。 Further, when isolating the polynucleotide containing the promoter and terminator regions used for protein production, the DNA element or the polynucleotide containing the foreign gene from genomic DNA, general techniques (Molecular Cloning (1989), Methods in Enzymology 194 (1991)), genomic DNA is extracted from a cell line of a source organism, and polynucleotides are screened. Extraction of genomic DNA is performed, for example, by the method of Cryer et al. (Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)) and P.M. It can be carried out according to the method of Philippsen et al. (Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991)).
目的とするプロモーター、ＤＮＡエレメント、又は外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの取得は、例えばＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｈｅｎｒｙ Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ａｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９））によって行うこともできる。ＰＣＲ法を用いたポリヌクレオチドの増幅には、プライマーとして２０～３０ｍｅｒの合成１本鎖ＤＮＡを、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる。増幅された遺伝子はポリヌクレオチド配列を確認した後、用いる。ＰＣＲの鋳型としては、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）等のゲノムＤＮＡライブラリーを使用することが可能である。 Polynucleotides containing the desired promoter, DNA element, or foreign gene can also be obtained, for example, by the PCR method (PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989)). Amplification of polynucleotides using the PCR method uses 20- to 30-mer synthetic single-stranded DNA as a primer and genomic DNA as a template. The amplified gene is used after confirming the polynucleotide sequence. Genomic DNA libraries such as bacterial artificial chromosomes (BACs) can be used as templates for PCR.
一方、配列未知の外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの取得は、（ａ）常法により遺伝子ライブラリーを作製し、（ｂ）作製された遺伝子ライブラリーから所望のポリヌクレオチドを選択し、当該ポリヌクレオチドを増幅する、ことによって行うことができる。遺伝子ライブラリーは、採取源となる生物の細胞株から常法により得た染色体ＤＮＡを適当な制限酵素によって部分消化して断片化し、得られた断片を適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによって調製することができる。また、細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ここからｃＤＮＡを合成後、適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによっても調製することができる。この際用いられるベクターとしては、通常公知の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られるプラスミドを用いることができ、ファージベクター又はコスミド等も広く用いることができる。形質転換又は形質導入を行う宿主は、前記ベクターの種類に応じたものを用いればよい。外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの選択は、前記遺伝子ライブラリーから、外来遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等によって行う。 On the other hand, to obtain a polynucleotide containing a foreign gene of unknown sequence, (a) a gene library is prepared by a conventional method, (b) a desired polynucleotide is selected from the prepared gene library, and the polynucleotide is obtained. It can be done by amplifying. A gene library is prepared by partially digesting chromosomal DNA obtained from a cell line of a source organism by a conventional method with an appropriate restriction enzyme to fragment it, ligating the obtained fragments into an appropriate vector, and inserting the vector into an appropriate vector. can be prepared by introducing into a suitable host. It can also be prepared by extracting mRNA from cells, synthesizing cDNA therefrom, ligating it to a suitable vector, and introducing the vector into a suitable host. As a vector used in this case, a plasmid commonly known as a gene library preparation vector can be used, and a phage vector, a cosmid, and the like can also be widely used. A host for transformation or transduction may be used according to the type of the vector. Polynucleotides containing a foreign gene are selected from the gene library by colony hybridization, plaque hybridization, or the like using a labeled probe containing a sequence specific to the foreign gene.
また外来遺伝子を含むポリヌクレオチドを化学的に全合成することもできる。例えば相補的な２対のオリゴヌクレオチドを作製しこれらをアニールさせる方法や、数本のアニールされたＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより連結する方法、又は一部相補的な数本のオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲによりギャップを埋める方法等により、遺伝子を合成することができる。 Polynucleotides containing exogenous genes can also be chemically totally synthesized. For example, a method of preparing two pairs of complementary oligonucleotides and annealing them, a method of ligating several annealed DNAs by DNA ligase, or a method of preparing several partially complementary oligonucleotides and performing PCR. Genes can be synthesized by gap-filling methods and the like.
ポリヌクレオチド配列の決定は、通常の方法、例えばジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ７４， ５４６３－５４６７（１９７７））等により行うことができる。更に前記ポリヌクレオチド配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行い得る。 A polynucleotide sequence can be determined by a conventional method such as the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)). Furthermore, the polynucleotide sequence can be easily determined using a commercially available sequencing kit or the like.
５．外来遺伝子発現ベクター
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来遺伝子発現ベクターとしては、前記１．に記載のプロモーターを含む前記２．に記載の外来遺伝子発現ユニットを含むベクターが提供される。本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来遺伝子発現ベクターは、前記３．に記載のＤＮＡエレメントの１種、ＤＮＡエレメントの１種を２個以上のコピー数、ＤＮＡエレメントの２種以上の組み合わせを含んでもよい。前記の外来遺伝子発現ベクターによって外来遺伝子を宿主細胞内で発現させる際には、ＤＮＡエレメントを遺伝子発現ユニットの直前又は直後に配置してもよく、又は遺伝子発現ユニットから離れた位置に配置しても良い。また、複数のＤＮＡエレメントを含む１つの外来遺伝子発現ベクターを用いてもよい。なお、ＤＮＡエレメントの向きは、遺伝子発現ユニットに対して順方向又は逆方向のいずれであっても良い。
5. Foreign Gene Expression Vector As the foreign gene expression vector used in the method for producing a protein derived from a foreign gene of the present invention, the above-mentioned 1. 2. above containing the promoter according to 2. above. A vector is provided comprising the foreign gene expression unit described in . The foreign gene expression vector used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention is described in 3. above. 2 or more copies of one DNA element, or a combination of two or more DNA elements. When a foreign gene is expressed in a host cell using the foreign gene expression vector, the DNA element may be placed immediately before or after the gene expression unit, or may be placed at a position distant from the gene expression unit. good. Alternatively, a single foreign gene expression vector containing multiple DNA elements may be used. The orientation of the DNA element may be forward or reverse with respect to the gene expression unit.
外来遺伝子としては、特に限定はされないが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子、α－アミラーゼ遺伝子、α－ガラクトシダーゼ遺伝子等の各種酵素遺伝子、医薬上有用な生理活性蛋白質であるインターフェロンα、インターフェロンγ等の各種インターフェロン遺伝子、ＩＬ１、ＩＬ２等の各種インターロイキン遺伝子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）遺伝子等の各種サイトカイン遺伝子、成長因子遺伝子、又は多量体蛋白質をコードする遺伝子、例えば抗体又はその抗原結合性断片であるヘテロ多量体をコードする遺伝子等を挙げることができる。これらの遺伝子はいかなる手法によって得られるものでもよい。 Foreign genes include, but are not limited to, secretory alkaline phosphatase (SEAP), green fluorescent protein (GFP), reporter genes such as luciferase, various enzyme genes such as α-amylase gene and α-galactosidase gene, and pharmaceutically useful genes. Various interferon genes such as interferon α and interferon γ which are physiologically active proteins, various interleukin genes such as IL1 and IL2, various cytokine genes such as erythropoietin (EPO) gene, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) gene, Examples include growth factor genes, genes encoding multimeric proteins, such as genes encoding heteromultimers that are antibodies or antigen-binding fragments thereof, and the like. These genes may be obtained by any method.
「抗体の抗原結合性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の抗原結合性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。 The term "antigen-binding fragment of an antibody" means a partial fragment of an antibody having antigen-binding activity, and includes Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabodies, linear antibodies, and antibody fragments. Including multispecific antibodies etc. formed by Antigen-binding fragments of antibodies also include Fab', which are monovalent fragments of antibody variable regions obtained by treating F(ab')2 under reducing conditions. However, it is not limited to these molecules as long as they have the ability to bind to antigens. These antigen-binding fragments include not only full-length antibody protein molecules treated with appropriate enzymes, but also proteins produced in appropriate host cells using genetically engineered antibody genes. included.
また、本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来遺伝子発現ベクターには、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含めることができる。例えば、セルレニン、オーレオバシジン、ゼオシン、カナバニン、シクロヘキシミド、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストシジン、テトラサイクリン、カナマイシン、アンピシリン、ネオマイシン等の薬剤に対して耐性を付与する薬剤耐性マーカー等を使用することで、形質転換体の選抜を行うことが可能である。また、エタノール等に対する溶剤耐性や、グリセロールや塩等に対する浸透圧耐性、銅等の金属イオン耐性等を付与する遺伝子をマーカーにすることで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。 In addition, the foreign gene expression vector used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention can contain a selection marker for selecting transformants. For example, by using drug resistance markers that confer resistance to drugs such as cerulenin, aureobasidin, zeocin, canavanine, cycloheximide, hygromycin, puromycin, blasticidin, tetracycline, kanamycin, ampicillin, and neomycin, It is possible to select for transformants. Transformants can also be selected by using genes that confer solvent resistance to ethanol and the like, osmotic pressure resistance to glycerol, salts and the like, resistance to metal ions such as copper, and the like as markers.
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される外来遺伝子発現ベクターは、染色体ＤＮＡに組込まれないベクターであってもよい。一般的に、外来遺伝子発現ベクターは宿主細胞に遺伝子導入された後、ランダムに染色体に組込まれるが、ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）やｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＢＰＶ、ＨＰＶ）、ＥＢＶ等の哺乳動物ウイルス由来の構成成分を用いることにより、導入された宿主細胞中で自己複製が可能なｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒとして使用することができる。例えば、ＳＶ４０由来の複製起点及びｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒであるＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原をコードした配列を有するベクターやＥＢＶ由来のｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ－１をコードした配列を有するベクター等が広く用いられている。ＤＮＡエレメントの効果はベクターの種類、あるいは染色体への組込み有無を問わず、外来遺伝子発現亢進活性を示すことが可能である。 The foreign gene expression vector used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention may be a vector that is not integrated into chromosomal DNA. In general, foreign gene expression vectors are randomly integrated into chromosomes after gene introduction into host cells. can be used as an episomal vector capable of self-replication in introduced host cells. For example, a vector having a sequence encoding an SV40-derived replication origin and a trans-acting factor SV40 large T antigen, a vector having a sequence encoding EBV-derived oriP and EBNA-1, and the like are widely used. The effect of the DNA element is that it can exhibit exogenous gene expression-enhancing activity regardless of the type of vector or whether or not it is integrated into the chromosome.
６．形質転換細胞
本発明の外来遺伝子由来の蛋白質の製造方法に使用される形質転換細胞は、前記５．の外来遺伝子発現ベクターを用いて導入した形質転換細胞である。
6. Transformed Cells Transformed cells used in the method for producing a foreign gene-derived protein of the present invention are those described in 5. above. It is a transformed cell introduced using a foreign gene expression vector.
形質転換させる宿主細胞としては、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、又はウシ由来の細胞である。哺乳動物細胞としては、ＣＯＳ－１細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯ ｄｈｆｒ－、ＣＨＯ－Ｓ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。 Host cells to be transformed are eukaryotic cells, preferably mammalian cells, more preferably cells of human, mouse, rat, hamster, monkey, or bovine origin. Mammalian cells include, but are not limited to, COS-1 cells, 293 cells, CHO cells (CHO-K1, DG44, CHO dhfr-, CHO-S) and the like.
本発明において、宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、導入遺伝子が宿主内にて安定に存在し、かつ適宜発現させることができる方法であればいかなる方法でもよく、一般的に用いられている方法、例えば、リン酸カルシウム法（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，３４１）、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４，１８２－１８７）、スフェロプラスト法（Ｃｒｅｇｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３３７６（１９８５））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ， Ｈ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５３， １６３－１６８）、リポフェクション法等を挙げることができる。 In the present invention, any method may be used to introduce an expression vector into a host cell as long as the transgene is stably present in the host and can be appropriately expressed. methods such as calcium phosphate method (Ito et al., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341), electroporation method (Becker, DM et al. (1990) Methods. Enzymol., 194, 182-187), spheroplast method (Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985)), lithium acetate method (Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163 -168), lipofection method, and the like.
７．外来蛋白質の製造方法
本発明の外来蛋白質の製造方法は、前記６．の項目に記載の形質転換細胞を公知の方法により培養し、その培養物から採取し、精製することにより行うことができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、又は細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。なお、６．の項目に記載の形質転換細胞を用いて産生することのできる外来蛋白質としては、単量体蛋白質のみならず多量体蛋白質を選択することも可能である。異なる複数のサブユニットから構成されるヘテロ多量体蛋白質の生産を行う場合、これらのサブユニットをコードしている複数の遺伝子を、それぞれ６．の項目に記載の宿主細胞に導入する必要がある。
7. Method for Producing Foreign Protein The method for producing a foreign protein of the present invention is the same as in 6 above. The transformed cells described in 1. above can be cultured by a known method, collected from the culture, and purified. The term "culture" refers to culture supernatants, cultured cells, and cell lysates. In addition, 6. Not only monomeric proteins but also multimeric proteins can be selected as the foreign proteins that can be produced using the transformed cells described in 1. above. When producing a heteromultimeric protein composed of a plurality of different subunits, a plurality of genes encoding these subunits are respectively 6. It is necessary to introduce into the host cell described in the item.
形質転換細胞を培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。 A method for culturing transformed cells can be carried out according to a conventional method used for culturing the host cells.
形質転換細胞が哺乳動物細胞の場合は、例えば３７℃、５％又は８％ＣＯ２条件下で培養し、培養時間は２４～１０００時間程度であり、培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養、流加培養、灌流培養又は連続培養等により実施することができる。 When the transformed cells are mammalian cells, for example, they are cultured under conditions of 37° C., 5% or 8% CO 2 , the culture time is about 24 to 1000 hours, and the culture is left still, shaken, stirred, or aerated. It can be carried out by batch culture, fed batch culture, perfusion culture, continuous culture, or the like.
前記の培養物（培養液）から外来蛋白質遺伝子の発現産物の確認は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタン解析、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。 The expression product of the foreign protein gene can be confirmed from the culture (culture solution) by SDS-PAGE, Western analysis, ELISA, and the like.
８．抗体蛋白質の製造方法
前記７．の項目に記載の製造方法を用いて製造されるヘテロ多量体蛋白質としては抗体蛋白質を挙げることができる。抗体蛋白質は、２分子の重鎖ポリペプチド及び２分子の軽鎖ポリペプチドからなる４量体蛋白質である。従って、抗原結合能を維持した形態で抗体蛋白質を取得するためには、前記６．の項目に記載の形質転換細胞において、重鎖及び軽鎖の遺伝子の双方が導入されている必要がある。この場合に、重鎖及び軽鎖の遺伝子発現ユニットは、同じ発現ベクター上に存在しても良く、あるいは異なる発現ベクター上に存在していても良い。
8. Method for producing
本発明において製造される抗体としては、ウサギ、マウス、ラット等実験動物を所望の抗原で免疫して作製された抗体を挙げることができる。また、前記の抗体を原料とするキメラ抗体、及びヒト化抗体も本発明において製造される抗体として挙げることができる。さらに、遺伝子改変動物又はファージディスプレイ法によって取得されるヒト抗体についても、本発明において製造される抗体である。 Antibodies produced in the present invention include antibodies produced by immunizing experimental animals such as rabbits, mice and rats with desired antigens. In addition, chimeric antibodies and humanized antibodies derived from the aforementioned antibodies can also be included as antibodies produced in the present invention. Furthermore, genetically modified animals or human antibodies obtained by phage display methods are also antibodies produced in the present invention.
抗体製造に用いる抗体遺伝子としては、該抗体遺伝子より転写・翻訳される重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの組合せが、任意の抗原蛋白質と結合する活性を保持している限り、特定のポリヌクレオチド配列を持つ抗体遺伝子に限定されない。 Antibody genes used for antibody production include specific polynucleotides as long as the combination of heavy chain polypeptide and light chain polypeptide transcribed and translated from the antibody gene retains the activity of binding to any antigen protein. It is not limited to antibody genes with sequences.
また、抗体遺伝子としては、必ずしも抗体の全長分子をコードしている必要はなく、抗体の抗原結合性断片をコードしている遺伝子を用いることができる。これらの抗原結合性断片をコードする遺伝子は、抗体蛋白質の全長分子をコードする遺伝子を遺伝子工学的に改変することによって取得することができる。 Moreover, the antibody gene does not necessarily have to encode a full-length antibody molecule, and a gene encoding an antigen-binding fragment of an antibody can be used. Genes encoding these antigen-binding fragments can be obtained by genetically modifying genes encoding full-length antibody protein molecules.
９．その他の外来蛋白質の製造方法
本発明の製造方法の対象となる外来蛋白質としては、前述の抗体に加え、ヒト又は非ヒト動物由来の各種蛋白質、その抗原結合性断片、その改変体等を挙げることができる。そのような蛋白質等としては、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、バソプレッシン、ソマトスタチン、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン、オキシトシン、グレリン、レプチン、アディポネクチン、レニン、カルシトニン、オステオプロテジェリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等のペプチドホルモン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα／βほかＴＮＦスーパーファミリー等）、神経成長因子（ＮＧＦ）、細胞増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ等）、造血因子（ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、エリスロポエチン等）、アディポカイン等のサイトカイン、ТＮＦ受容体等の受容体、リゾチーム、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ等の酵素、その機能性断片（元の蛋白質の生物活性を一部又は全部保持している断片）、それらの蛋白質を含むことからなる融合蛋白質等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
9. Methods for producing other foreign proteins Examples of the foreign proteins to be produced by the production method of the present invention include various proteins derived from humans or non-human animals, antigen-binding fragments thereof, variants thereof, etc., in addition to the aforementioned antibodies. can be done. Examples of such proteins include atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP), C-type natriuretic peptide (CNP), vasopressin, somatostatin, growth hormone (GH), insulin, oxytocin, ghrelin, peptide hormones such as leptin, adiponectin, renin, calcitonin, osteoprotegerin, insulin-like growth factor (IGF), interleukin, chemokine, interferon, tumor necrosis factor (TNFα/β and other TNF superfamily, etc.), nerve growth factor (NGF) ), cell growth factors (EGF, FGF, PDGF, HGF, TGF, etc.), hematopoietic factors (CSF, G-CSF, erythropoietin, etc.), cytokines such as adipokines, receptors such as TNF receptors, lysozymes, proteases, proteinases, Examples include, but are not limited to, enzymes such as peptidases, functional fragments thereof (fragments retaining some or all of the biological activity of the original protein), and fusion proteins containing these proteins. not something.
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド、制限酵素、ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、ＤＮＡのクローニング、ポリヌクレオチド配列の決定、宿主細胞の形質転換、形質転換細胞の培養、得られる培養物からの蛋白質の採取、精製等に用いた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. However, these examples do not limit the technical scope of the present invention. Plasmids, restriction enzymes, DNA modifying enzymes and the like used in Examples of the present invention are commercially available and can be used according to conventional methods. Also, the procedures used for cloning DNA, determining polynucleotide sequences, transforming host cells, culturing transformed cells, collecting and purifying proteins from the resulting cultures, etc., are well known to those skilled in the art. or can be known from the literature.
（実施例１）ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現株の構築
１－１）ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現ベクターの構築
非特許文献９記載のｐＤＳＬＨ４．１をベクター基本骨格として有する、ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現ベクターｐＤＳＬＨ４．１－Ｘを構築した。
(Example 1) Construction of humanized antibody gene X expression strain 1-1) Construction of humanized antibody gene X expression vector Humanized antibody gene X expression vector having pDSLH4.1 described in Non-Patent Document 9 as a vector backbone pDSLH4.1-X was constructed.
１－２）ヒト化抗体Ｘ発現ステーブルプールの作製
ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）を無血清培地を用いた浮遊状態での培養が可能となるように馴化し、宿主細胞ＣＨＯ－Ｏ１細胞を得た。ＣＨＯ－Ｏ１細胞に、（１－１）で構築したヒト化抗体遺伝子Ｘ発現ベクターｐＤＳＬＨ４．１－Ｘを遺伝子導入装置Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入
し、Ｔ－２５フラスコにて５％ＣＯ２、３７℃で培養した。遺伝子導入の１日後にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を終濃度８００ μｇ／ｍＬで添加し、１週間薬剤選択培養を行った。その後、１２５ｍＬ容三角フラスコにて５％ＣＯ２、３７℃で培養し、ヒト化抗体Ｘ発現ステーブルプールを作製した。
1-2) Preparation of Humanized Antibody X-Expressing Stable Pool CHO-K1 cells (ATCC) were conditioned in a serum-free medium so that they could be cultured in suspension to obtain host CHO-O1 cells. rice field. CHO-O1 cells were transfected with the humanized antibody gene X expression vector pDSLH4.1-X constructed in (1-1) using the gene transfer device Neon Transfection System (Invitrogen), and 5 in a T-25 flask. Cultured at 37° C., % CO 2 . One day after gene transfer, Geneticin (Life Technologies Corporation) was added at a final concentration of 800 μg/mL, and drug-selective culture was performed for one week. Thereafter, the cells were cultured in a 125 mL Erlenmeyer flask under 5% CO 2 at 37° C. to prepare a humanized antibody X-expressing stable pool.
１－３）ヒト化抗体Ｘ発現株の構築
（１－２）で作製したヒト化抗体Ｘ発現ステーブルプールをモノクローン化してヒト化抗体Ｘ発現株Ｘ＃１およびＸ＃２を取得した。
1-3) Construction of Humanized Antibody X-Expressing Strains Humanized antibody X-expressing strains
具体的には、（１－２）で作製したヒト化抗体Ｘ発現ステーブルプールを軟寒天培地に懸濁、６ ｗｅｌｌプレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。培養後、ＣｌｏｎｅＰｉｘ ２（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を用いてヒト化抗体Ｘ高発現コロニーを９６ ｗｅｌｌプレートにピックした。ピッキングしたコロニーは、２４ ｗｅｌｌプレート、６ ｗｅｌｌプレート、Ｔ－２５フラスコ、１２５ｍＬ容三角フラスコと順次拡大培養し、ヒト化抗体Ｘ発現株Ｘ＃１およびＸ＃２を取得した。
Specifically, the humanized antibody X-expressing stable pool prepared in (1-2) was suspended in a soft agar medium, seeded in a 6-well plate, and cultured at 37° C. in 5% CO 2 . After culturing, colonies with high humanized antibody X expression were picked into a 96-well plate using ClonePix 2 (Genetix). The picked colonies were successively expanded into 24-well plates, 6-well plates, T-25 flasks, and 125 mL Erlenmeyer flasks to obtain humanized antibody X-expressing
（実施例２）ヒト化抗体Ｘ発現株Ｘ＃１およびＸ＃２のトランスクリプトーム解析
実施例１で構築したヒト化抗体Ｘ発現株Ｘ＃１およびＸ＃２を用いて流加培養を行い、その経時サンプルについてトランスクリプトーム解析を実施し、高発現遺伝子を特定した。
(Example 2) Transcriptome Analysis of Humanized Antibody X-Expressing Strains
２－１）ヒト化抗体Ｘ発現株Ｘ＃１およびＸ＃２の流加培養
実施例１で構築したヒト化抗体Ｘ発現株を、１Ｌ Ｊａｒにて流加培養を行った。Ｊａ
ｒ＃１は、細胞株にＸ＃１、基礎培地／フィード培地にＧ１３（ＪＸエネルギー製カスタム培地）／Ｆ１３（ＪＸエネルギー製カスタム培地）を、Ｊａｒ＃２は、細胞株にＸ＃１、基礎培地／フィード培地にＤＡ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製カスタム培地）／ＤＡＦＭ３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製カスタム培地）を、Ｊａｒ＃３は、細胞株にＸ＃２、基礎培地／フィード培地に、Ｇ１３／Ｆ１３を用いた。
2-1) Fed-Batch Culture of Humanized Antibody X-Expressing Strains
生細胞数と抗体生産量の推移をそれぞれ図１Ａ、図１Ｂに示す。抗体生産量は、細胞株間で比較するとＸ＃１のほうがＸ＃２より高く、基礎培地／フィード培地間の比較ではＧ１３／Ｆ１３のほうがＤＡ１／ＤＡＦＭ３より高かった。
Figures 1A and 1B show the changes in the number of viable cells and the amount of antibody production, respectively. Antibody production was higher in
２－２）ヒト化抗体Ｘ発現株Ｘ＃１およびＸ＃２のトランスクリプトーム解析
（２－１）で実施した流加培養の４、７、９、１１、１４日目の細胞からＲＮＡｉｓｏ
Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。続いて、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｖ２（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスライブラリーを作製した。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＰｏｌｙＡ＋ ＲＮＡを単離、断片化して取得したＲＮＡ断片を鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ｃＤＮＡの両末端を平滑化・リン酸化処理した後、３’－ｄＡ突出処理を行い、Ｉｎｄｅｘ付きアダプターを連結した。アダプターを連結した二本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによる増幅を行った後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いた磁気ビーズ法にて得られたＰＣＲ産物を精製し、シーケンスライブラリーとした。そして、シーケンスライブラリーを用いてシーケンスの鋳型となるクラスターを形成し、ＨｉＳｅｑ ２０００システム（ｉｌｌｕｍｉｎａ）に供し、高速シーケンス解析を実施、シーケンスデータを取得した。
2-2) Transcriptome analysis of humanized antibody X-expressing
Total RNA was extracted using Plus (Takara Bio). Subsequently, a sequencing library was generated using TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (illumina). Specifically, PolyA + RNA was isolated from total RNA, fragmented, and RNA fragments obtained were used as templates to synthesize double-stranded cDNAs. Both ends of the synthesized double-stranded cDNA were blunted and phosphorylated, followed by 3′-dA protrusion treatment and ligation with indexed adapters. After amplification by PCR using the adapter-ligated double-stranded cDNA as a template, the PCR product obtained by the magnetic bead method using AMPure XP (BECKMAN COULTER) was purified to prepare a sequence library. A sequence template cluster was formed using the sequence library, subjected to the
２－３）トランスクリプトーム解析結果のデータ解析
シーケンス解析によって得られたリード配列は非特許文献１０記載のＢｏｗｔｉｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ． １．０．０）を用いてリファレンス配列にマッピングした。リファレンス配列はＮＣＢＩに登録されているチャイニーズハムスターの染色体配列に、ＮＣＢＩに登録されているチャイニーズハムスターの遺伝子情報に基づき抽出したｓｐｌｉｃｅｓ配列を加えて作成した。また、リード配列の発現量（ＲＰＫＭ：Ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ［ｉｎｔｒｏｎ／ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ］ ｍｏｄｅｌ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）と新規遺伝子発現領域は非特許文献１１記載のＥＲＡＮＧＥ ３．２を用いて検討した。
2-3) Data Analysis of Transcriptome Analysis Results The lead sequences obtained by sequence analysis were mapped to reference sequences using Bowtie (version. 1.0.0) described in
Ｊａｒ＃１の４日目の細胞での発現量上位２０遺伝子を表１に、Ｊａｒ＃１、Ｊａｒ＃２、Ｊａｒ＃３の各サンプリング日における前記２０遺伝子の発現量を、それぞれ、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃに示す。Ｈｓｐａ５（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ５）遺伝子はＪａｒ＃１、２、３の全ての条件で、Ｆｔｈ１（ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎ １）遺伝子はＪａｒ＃２、３の条件で、培養後期での発現量上昇が見られた。Ｈｓｐａ５遺伝子は、細胞株、培地の条件によらず、培養後期に発現量が上昇していて、培養後期にそのプロモーター活性が向上していると示唆された。
Table 1 shows the top 20 genes expressed in cells on
The chain 1) gene showed an increase in the expression level in the latter stage of culture under the conditions of
（実施例３）高発現遺伝子のプロモーター領域のクローニング
実施例２で見出した発現量上位２０遺伝子のうち、ｔＲＮＡを除く１８遺伝子について、各遺伝子のプロモーター領域のクローニングを行った。
(Example 3) Cloning of Promoter Regions of Highly Expressed Genes Of the 20 genes with the highest expression levels found in Example 2, the promoter regions of each gene were cloned for 18 genes excluding tRNA.
３－１）Ｈｓｐａ５のプロモーター領域のクローニング
Ｈｓｐａ５のプロモーター領域としては、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１２４６７３９．１で登録されているｍＲＮＡの配列およびＮＷ＿００３６１５１０８．１で登録されているチャイニーズハムスターゲノムのスキャフォールド配列を参考にして、Ｈｓｐａ５の開始コドン配列の上流約３．０ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を用いた。
3-1) Cloning of Hspa5 Promoter Region For the Hspa5 promoter region, refer to the mRNA sequence registered under NM_001246739.1 and the scaffold sequence of the Chinese hamster genome registered under NW_003615108.1 in GenBank. , approximately 3.0 kbp upstream of the initiation codon sequence of Hspa5 to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon sequence.
Ｈｓｐａ５のプロモーター領域は、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲで増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ
）で精製した。精製したＤＮＡ断片をＫｐｎＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］（ＰＲＯＭＥＧＡ）のＫｐｎＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入して、ｐＧＬ４．１０－Ｈｓｐａ５を構築した。クローニングしたＨｓｐａ５のプロモーター領域のヌクレオチド配列を配列表の配列番号１に示す。
Ｈｓｐａ５プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ＫｐｎＩ－Ｆ：ＧＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＴＴＧ（配列番号１０）
Ｈｓｐａ５－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｒ：ＧＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴ（配列番号１１）
The promoter region of Hspa5 was amplified by PCR using the following primer set and KOD FX Neo (TOYOBO) using the genomic DNA of CHO cells as a template, and using the QIAquick PCR Purification kit (QIAGEN
). The purified DNA fragment was digested with KpnI-HindIII and inserted between the KpnI-HindIII sites of pGL4.10[luc2] (PROMEGA) to construct pGL4.10-Hspa5. The nucleotide sequence of the cloned Hspa5 promoter region is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
Hspa5 promoter primer set Hspa5-KpnI-F: GGGGGGGTACCTATAGCCCAGGGCACACATGAACTTG (SEQ ID NO: 10)
Hspa5-HindIII-R: GGGGGAAGCTTCTTGCCGGCGCTGTGGGCCAGTGCT (SEQ ID NO: 11)
３－２）他の高発現遺伝子のプロモーター領域のクローニング
前記３－１）に記載の方法に準じて、Ｒｐｓ１４（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓ１４）、Ｇａｐｄｈ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、Ｅｅｆ１ａ１（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ １）、Ｒｐｓ１１（４０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１１－ｌｉｋｅ）、Ｒｐｌｐ０（６０Ｓ ａｃｉ
ｄｉｃ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ０－ｌｉｋｅ）、Ｒｐｓ４（ｒｉｂｏｓ
ｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ４）、ＰＫＭ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅｓ Ｍ１／Ｍ２－ｌｉｋｅ）、Ｒｐｓ２（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ２
）、Ａｃｔｂ（ａｃｔｉｎ, ｂｅｔａ）、Ｃｈｕｂ２（ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｒｐｓ３（４０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ３ａ－ｌｉｋｅ）、Ｐｒｄｘ
１（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ １）、Ｒｐｓａ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳＡ）、Ｒｐｓ２５（４０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ２５－ｌｉｋｅ）、Ｒｐｌ８（６０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ８－ｌｉｋｅ）、Ｆｔｈ１（ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）、Ｈｓｐｄ１（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ １）のプロモーター領域のクローニングを行い、ｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］のマルチクローニングサイトに挿入した。
3-2) Cloning of promoter regions of other highly expressed genes According to the method described in 3-1) above, Rps14 (ribosomal protein
n S14), Gapdh (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), Eef1a1 (eukaryotic translat
dic ribosomal protein P0-like), Rps4 (ribos
omal protein S4), PKM (pyruvate kinase isozymes M1/M2-like), Rps2 (ribosomal protein S2
), Actb (actin, beta), Chub2 (polyubiquitin), Rps3 (40S ribosomal protein S3a-like), Prdx
1 (peroxiredoxin 1), Rpsa (ribosomal protein
SA), Rps25 (40S ribosomal protein S25-like), Rpl8 (60S ribosomal protein L8-like), Fth1 (ferritin heavy chain 1), Hspd1 (heat shock protein 1) promoter regions were cloned and pGL4.10 [ luc2] was inserted into the multiple cloning site.
３－３）ｐＧＬ４．１０－ｈＥＦ１αの構築
次に、ｐＥＦ１／Ｖ５－Ｈｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）をテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲでヒトＥＦ１－αプロモーターを増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。精製したＤＮＡ断片をＮｈｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］のＮｈｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入して、ｐＧＬ４．１０－ｈＥＦ１αを構築した。
ｈＥＦ１αプロモーターのプライマーセット
ｈＥＦ１α－ＮｈｅＩ－Ｆ：ＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号１２）
ｈＥＦ１α－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｒ：ＧＡＧＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧ（配列番号１３）
3-3) Construction of pGL4.10-hEF1α Next, using pEF1/V5-His A (Invitrogen) as a template, the following primer set and KOD-Plus-Ver. The human EF1-α promoter was amplified by PCR using 2 (TOYOBO) and purified with the QIAquick PCR Purification kit. The purified DNA fragment was digested with NheI-HindIII and inserted between the NheI-HindIII sites of pGL4.10[luc2] to construct pGL4.10-hEF1α.
hEF1α promoter primer set hEF1α-NheI-F: GAGTGGGCTAGCGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG (SEQ ID NO: 12)
hEF1α-HindIII-R: GAGTGGAAGCTTCCTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ ID NO: 13)
（実施例４）ホタルルシフェラーゼの一過性発現量を指標とした各プロモーターの活性評価
４－１）トランスフェクション
（１－２）に記載のＣＨＯ－Ｏ１細胞を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にて２．５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、２４ ｗｅｌｌプレートに１ｍＬずつ播種した。実施例３で構築した各プロモーターを挿入したｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］ ３．２μｇとトランスフェクション効率補正用のコントロールベクターｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］（ＰＲＯＭＥＧＡ） ０．４μｇをＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ） ６８μＬで希釈した。一方、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ＣＤ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ） ８μＬをＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ ６８μＬで希釈し、前記プラスミド溶液と混合し、２０分間、室温で放置した。その後、半量ずつ２ ｗｅｌｌに添加し、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
(Example 4) Activity evaluation of each promoter using the transient expression level of firefly luciferase as an index 4-1) Transfection The CHO-O1 cells described in (1-2) were treated with Opti-MEM I Reduced Serum Medium ( Life Technologies Corporation) to 2.5×10 5 cells/mL, and seeded on a 24-well plate by 1 mL each. OptiPro SFM (Life Technologies Corporation ) 68 μL. On the other hand, 8 µL of
４－２）ルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクションの翌日、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いてルシフェラーゼの一過性発現量を測定した。具体的には培養液を９０００Ｇ×１分間遠心して上清を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、キット添付のＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞ライセートを調製した。そして前記キットとルミノメーターを用いて、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの発光量を測定した。
4-2) Luciferase Assay On the day after transfection, the transient luciferase expression level was measured using Dual-Luciferase Reporter Assay System (PROMEGA). Specifically, the culture medium was centrifuged at 9000 G for 1 minute, the supernatant was removed, and the cells were washed once with PBS, and then a cell lysate was prepared using the Passive Lysis Buffer attached to the kit. Using the kit and luminometer, the luminescence levels of firefly luciferase and Renilla luciferase were measured.
図３に各プロモーターを挿入したルシフェラーゼ発現ベクターでトランスフェクションし、その翌日に測定したホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ２）の発光量をウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）の発光量で標準化した値を示す。Ｅｅｆ１ａ１は強いプロモーター活性を示し、コントロールとして用いたヒトＥＦ１－αと同程度であった。Ｈｓｐａ５は検討したプロモーターの中ではＥｅｆ１ａ１の次に強いプロモーター活性を示した。 FIG. 3 shows the luminescence level of firefly luciferase (luc2) transfected with the luciferase expression vector into which each promoter was inserted and measured the next day, normalized by the luminescence level of Renilla luciferase (Rluc). Eef1a1 exhibited strong promoter activity, comparable to human EF1-α used as a control. Hspa5 exhibited the second strongest promoter activity after Eef1a1 among the promoters examined.
（実施例５）抗体発現量を指標としたＨｓｐａ５プロモーターの流加培養による評価
Ｈｓｐａ５遺伝子は、トランスクリプトーム解析で培養後期に発現量が上昇していたことから、培養後期でのプロモーター活性の増強が示唆された。また、Ｈｓｐａ５遺伝子のプロモーターは、ルシフェラーゼアッセイを利用した一過性発現による評価において強いプロモーター活性を示した。そこで、本プロモーターの評価を、抗体の安定発現細胞を作製し、流加培養により行った。
(Example 5) Evaluation of Hspa5 promoter by fed-batch culture using antibody expression level as an index Since transcriptome analysis revealed that the expression level of the Hspa5 gene increased in the late stage of culture, promoter activity was enhanced in the late stage of culture. was suggested. In addition, the Hspa5 gene promoter showed strong promoter activity in transient expression evaluation using luciferase assay. Therefore, the evaluation of this promoter was carried out by preparing antibody-stably expressing cells and performing fed-batch culture.
５－１）抗体発現ベクターの構築
非特許文献９記載のｐＤＳＬＨ４．１をベクター基本骨格として有し、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターに特許文献２に記載のヒトＲＰＳ７、ＤＮＡエレメントに特許文献２に記載のＡ７を使用したヒト化抗体遺伝子Ｙ発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＲＰＳ７－Ｙを構築した。続いて、ヒト化抗体遺伝子Ｙ発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＲＰＳ７－Ｙの、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターをＨｓｐａ５、あるいは、ヒトＥＦ１－αに置換した、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－Ｙ、および、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＥＦ１α－Ｙを構築した。ベクター概略を図４に示す。
5-1) Construction of antibody expression vector It has pDSLH4.1 described in Non-Patent Document 9 as the vector backbone, human RPS7 described in
ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－Ｙは、以下の方法により構築した。まず、ｐＧＬ４．１０－Ｈｓｐａ５をテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いたＰＣＲでチャイニーズハムスターＨｓｐａ５プロモーターを増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。精製したＤＮＡ断片をＮｏｔＩ－ＸｂａＩで消化した後、Ｈ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＨ１．１－ｈＲＰＳ７－Ｙ、および、Ｌ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＬ２．１－ｈＲＰＳ７－ＹのＮｏｔＩ－ＮｈｅＩサイト間に挿入して、それぞれｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ５－Ｙ、ｐＤＳＬ２．１－Ｈｓｐａ５－Ｙを構築した。次に、ｐＤＳＬ２．１－Ｈｓｐａ５－ＹをＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られたＤＮＡ断片をｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ５－ＹのＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ間に挿入して、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ５－Ｙを構築した。ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ５－Ｙの発現カセット上流に特許文献２に記載のＤＮＡエレメントＡ７を挿入して、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－Ｙを構築した。
Ｈｓｐａ５プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－Ｆ：ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＴＴＧ（配列番号１４）
Ｈｓｐａ５－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴ（配列番号１５）
pDSLHA4.1-Hspa5-Y was constructed by the following method. First, using pGL4.10-Hspa5 as a template, the Chinese hamster Hspa5 promoter was amplified by PCR using the following primer set and PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio), and purified using a QIAquick PCR Purification kit. After digesting the purified DNA fragment with NotI-XbaI, it was inserted between the NotI-NheI sites of the H chain gene expression vector pDSH1.1-hRPS7-Y and the L chain gene expression vector pDSL2.1-hRPS7-Y. , pDSH1.1-Hspa5-Y and pDSL2.1-Hspa5-Y, respectively. Next, a DNA fragment obtained by digesting pDSL2.1-Hspa5-Y with AatII-HindIII was inserted between AatII-HindIII of pDSH1.1-Hspa5-Y to construct pDSLH3.1-Hspa5-Y. did. The DNA element A7 described in
Hspa5 promoter primer set Hspa5-NotI-F: GGGGGGCGGCCGCTATAGCCCAGGCCACACATGAACTTG (SEQ ID NO: 14)
Hspa5-XbaI-R: GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCGCTGTGGGCCAGTGCT (SEQ ID NO: 15)
一方、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＥＦ１α－Ｙは、以下の方法により構築した。まず、ｐＧＬ４．１０－ｈＥＦ１αをテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＫＯＤ
－Ｐｌｕｓ－ Ｖｅｒ．２を用いたＰＣＲでヒトＥＦ１－αプロモーターを増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。精製したＤＮＡ断片をＮｏｔＩ－ＮｈｅＩで消化した後、Ｈ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＨ１．１－ｈＲＰＳ７－Ｙ、および、Ｌ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＬ２．１－ｈＲＰＳ７－ＹのＮｏｔＩ－ＮｈｅＩサイト間に挿入して、それぞれｐＤＳＨ１．１－ｈＥＦ１α－Ｙ、ｐＤＳＬ２．１－ｈＥＦ１α－Ｙを構築した。次に、ｐＤＳＬ２．１－ｈＥＦ１α－ＹをＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られたＤＮＡ断片をｐＤＳＨ１．１－ｈＥＦ１α－ＹのＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ間に挿入して、ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＥＦ１α－Ｙを構築した。ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＥＦ１α－Ｙの発現カセット上流に特許文献２に記載のＤＮＡエレメントＡ７を挿入して、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＥＦ１α－Ｙを構築した。
ｈＥＦ１αプロモーターのプライマーセット
ｈＥＦ１α－ＮｏｔＩ－Ｆ：ＧＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号１６）
ｈＥＦ１α－ＮｈｅＩ－Ｒ：ＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧ（配列番号１７）
On the other hand, pDSLHA4.1-hEF1α-Y was constructed by the following method. First, using pGL4.10-hEF1α as a template, the following primer set and KOD
-Plus- Ver. The human EF1-α promoter was amplified by PCR using 2 and purified with the QIAquick PCR Purification kit. After digesting the purified DNA fragment with NotI-NheI, it was inserted between the NotI-NheI sites of the H chain gene expression vector pDSH1.1-hRPS7-Y and the L chain gene expression vector pDSL2.1-hRPS7-Y. , pDSH1.1-hEF1α-Y and pDSL2.1-hEF1α-Y, respectively. Next, a DNA fragment obtained by digesting pDSL2.1-hEF1α-Y with AatII-HindIII was inserted between AatII-HindIII of pDSH1.1-hEF1α-Y to construct pDSLH3.1-hEF1α-Y. did. The DNA element A7 described in
hEF1α promoter primer set hEF1α-NotI-F: GAGTGGGCGGCCGCGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG (SEQ ID NO: 16)
hEF1α-NheI-R: GAGTGGGCTAGCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ ID NO: 17)
５－２）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの作製
（５－１）で構築した抗体発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＲＰＳ７－Ｙ、あるいは、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＥＦ１α－Ｙを、（１－２）に記載のＣＨＯ－Ｏ１細胞に（４－１）に記載の方法でトランスフェクションした。遺伝子導入の１日後、培養液を遠心して上清を除去、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ ８００ μｇ／ｍＬを含む培地で懸濁し、６ ｗｅｌｌプレートで１週間薬剤選択培養を行った。その後、Ｔ－２５フラスコ、続いて、１２５ ｍＬ容三角フラスコにて５％ＣＯ２、３７℃で培養し、ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれの抗体発現ベクターでＮ＝２で作製した。
5-2) Production of humanized antibody Y expression stable pool Antibody expression vector pDSLHA4.1-Hspa5-Y, pDSLHA4.1-hRPS7-Y, or pDSLHA4.1-hEF1α-Y constructed in (5-1) was transfected into the CHO-O1 cells described in (1-2) by the method described in (4-1). One day after gene transfer, the culture solution was centrifuged to remove the supernatant, suspended in a medium containing 800 μg/mL of geneticin, and subjected to drug selection culture in a 6-well plate for 1 week. Subsequently, the cells were cultured in a T-25 flask and then in a 125 mL Erlenmeyer flask in 5% CO 2 at 37° C. to prepare a humanized antibody Y-expressing stable pool. Stablepools were generated with N=2 for each antibody expression vector.
５－３）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養による抗体生産量評価
（５－２）で作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いて、１２５ ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。
5-3) Evaluation of antibody production by fed-batch culture of humanized antibody Y-expressing stable pool Using the humanized antibody Y-expressing stable pool prepared in (5-2), fed-batch in a 125 mL Erlenmeyer flask cultured. G13 was used as the basal medium and F13 was used as the feed medium.
生細胞数、抗体生産量、１細胞１日当たりの抗体生産量（ＳＰＲ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）の推移を、それぞれ、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃに示す。１細胞１日当たりの抗体生産量は、サンプリング時点での抗体生産量を、サンプリング時点までの積算生細胞数で割って算出した。培養初期では、Ｈｓｐａ５のプロモーターでの抗体生産量、１細胞１日当たりの抗体生産量共に、コントロールとして用いたヒトＲＰＳ７プロモーターと同程度、ヒトＥＦ１－αプロモーターよりも低かった。しかしながら、Ｈｓｐａ５プロモーターでは培養の中期以降で１細胞１日当たりの抗体生産量が大幅に上昇し、培養１０日目の時点ではそれぞれヒトＲＰＳ７プロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーターの１．３、０．９倍、培養１４日目の時点ではそれぞれヒトＲＰＳ７プロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーターの１．８、１．４倍の値を示した。その結果、培養１４日目のＨｓｐａ５プロモーターでの抗体生産量は、それぞれヒトＲＰＳ７プロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーターの１．５、１．４倍の値に達し、現在頻繁に使用されているプロモーターでの抗体生産量を大きく上回った。
Figures 5A, 5B, and 5C show changes in the number of viable cells, the amount of antibody produced, and the amount of antibody produced per cell per day (SPR: specific production rate), respectively. The antibody production amount per cell per day was calculated by dividing the antibody production amount at the time of sampling by the cumulative number of viable cells up to the time of sampling. At the early stage of culture, both the amount of antibody produced by the Hspa5 promoter and the amount of antibody produced per day per cell were similar to that of the human RPS7 promoter used as a control and lower than that of the human EF1-α promoter. However, with the Hspa5 promoter, the amount of antibody produced per cell per day increased significantly after the middle stage of the culture, and at the 10th day of culture, it was 1.3 and 0.9 times higher than the human RPS7 promoter and human EF1-α promoter, respectively. , 1.8 and 1.4 times higher than the human RPS7 promoter and human EF1-α promoter, respectively, on the 14th day of culture. As a result, the amount of antibody produced by the Hspa5 promoter on
５－４）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養によるｍＲＮＡ発現量評価
（５－３）で実施した流加培養で経時的に取得した細胞を用いて、目的の抗体Ｙ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現量をリアルタイムＰＣＲにより比較した。流加培養の４、６、９、１０、１１日目の細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡをテンプレートとして、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。次に、逆転写反応液をテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。Ｈ鎖遺伝子は遺伝子導入時に使用したヒト化抗体Ｙ発現ベクター、Ｇａｐｄｈ遺伝子は以下に示すプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片をＴＯＰＯクローニングしたプラスミドＤＮＡを用いて検量線を作成し、各サンプルのＨ鎖遺伝子およびＧａｐｄｈ遺伝子のコピー数を算出した。各サンプルのＨ鎖遺伝子のコピー数をＧａｐｄｈ遺伝子のコピー数で割って標準化したＨ鎖遺伝子の発現量を図６に示す。Ｈｓｐａ５プロモーターでのＨ鎖遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、培養初期ではコントロールとして用いたヒトＲＰＳ７プロモーターと同程度、ヒトＥＦ１－αプロモーターよりも低かった。しかしながら、培養中期以降ではＨｓｐａ５プロモーターでのＨ鎖遺伝子の発現量は大きく上昇し、ヒトＲＰＳ７プロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーターの値を大きく上回った。このｍＲＮＡ発現量の経時変化は図５Ｃで示したタンパク質発現量の結果と同様の結果であった。以上から、Ｈｓｐａ５プロモーターでの培養後期におけるタンパク質発現量の上昇がプロモーター活性の上昇によるものと示された。
Ｈ鎖遺伝子のプライマーセット
ＨＣ－Ｆ：ＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡ（配列番号１８）
ＨＣ－Ｒ：ＴＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＣＴＴ（配列番号１９）
Ｇａｐｄｈ遺伝子のプライマーセット
Ｇａｐｄｈ－Ｆ：ＧＴＡＴＴＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＴＴＡＣＣＡＧ（配列番号２０）
Ｇａｐｄｈ－Ｒ：ＡＧＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＴＧＴＡＧＡＣ（配列番号２１）
5-4) Evaluation of mRNA expression level by fed-batch culture of humanized antibody Y-expressing stable pool Using cells obtained over time in fed-batch culture performed in (5-3), mRNA of the antibody Y gene of interest The level of expression was compared by real-time PCR. Total RNA extracted from cells on
H chain gene primer set HC-F: TGGCTGAACGGCAAAGAGTA (SEQ ID NO: 18)
HC-R: TTGGCCTTGGAGATGGTCTT (SEQ ID NO: 19)
Gapdh gene primer set Gapdh-F: GTATTGGACGCCTGGTTACCAG (SEQ ID NO: 20)
Gapdh-R: AGTCATACTGGAACATGTAGAC (SEQ ID NO: 21)
（実施例６）ウミシイタケルシフェラーゼ発現量を指標としたＨｓｐａ５プロモーターの流加培養による評価 (Example 6) Evaluation of Hspa5 promoter by fed-batch culture using Renilla luciferase expression level as an index
６－１）ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターの構築
ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ４．８２［ｈＲｌｕｃ／Ｐｕｒｏ］（ＰＲＯＭＥＧＡ）のマルチクローニングサイトにＨｓｐａ５プロモーター、ヒトＲＰＳ７プロモーター、あるいは、ヒトＥＦ１－αプロモーターを挿入し、ｐＧＬ４．８２－Ｈｓｐａ５、ｐＧＬ４．８２－ｈＲＰＳ７、あるいは、ｐＧＬ４．８２－ｈＥＦ１αを構築した。
6-1) Construction of Renilla luciferase expression vector Insert Hspa5 promoter, human RPS7 promoter, or human EF1-α promoter into multiple cloning site of Renilla luciferase expression vector pGL4.82 [hRluc/Puro] (PROMEGA), pGL4.82-Hspa5, pGL4.82-hRPS7, or pGL4.82-hEF1α were constructed.
具体的には、（３－１）で調製したＫｐｎＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化済みのＨｓｐａ５のプロモーター配列を、ｐＧＬ４．８２［ｈＲｌｕｃ／Ｐｕｒｏ］のＫｐｎＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入して、ｐＧＬ４．８２－Ｈｓｐａ５を構築した。 Specifically, the KpnI-HindIII-digested Hspa5 promoter sequence prepared in (3-1) was inserted between the KpnI-HindIII sites of pGL4.82 [hRluc/Puro], pGL4.82-Hspa5 built.
次に、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＲＰＳ７－Ｙをテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いたＰＣＲでヒトＲＰＳ７プロモーターを増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。精製したＤＮＡ断片をＸｈｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ｐＧＬ４．８２［ｈＲｌｕｃ／Ｐｕｒｏ］のＸｈｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入して、ｐＧＬ４．８２－ｈＲＰＳ７を構築した。
ｈＲＰＳ７プロモーターのプライマーセット
ｈＲＰＳ７－ＸｈｏＩ－Ｆ：ＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＴＡＴＴＡＡＣＡＧＣＡＣ
ＡＴＴＡ（配列番号２２）
ｈＲＰＳ７－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｒ：ＧＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＧＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣ（配列番号２３）
また、（３－３）で調製したＮｈｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化済みのヒトＥＦ１－αプロモーター配列を、ｐＧＬ４．８２［ｈＲｌｕｃ／Ｐｕｒｏ］のＮｈｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入して、ｐＧＬ４．８２－ｈＥＦ１αを構築した。
Next, using pDSLHA4.1-hRPS7-Y as a template, the human RPS7 promoter was amplified by PCR using the following primer set and PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio), and purified with a QIAquick PCR Purification kit. The purified DNA fragment was digested with XhoI-HindIII and inserted between the XhoI-HindIII sites of pGL4.82[hRluc/Puro] to construct pGL4.82-hRPS7.
hRPS7 promoter primer set hRPS7-XhoI-F: GGGGGCTCGAGTGTATATTAACAGCAC
ATTA (SEQ ID NO: 22)
hRPS7-HindIII-R: GGGGGAAGCTTCGGCTTTTCTCCTGGGAGAAC (SEQ ID NO: 23)
In addition, the NheI-HindIII-digested human EF1-α promoter sequence prepared in (3-3) was inserted between the NheI-HindIII sites of pGL4.82 [hRluc/Puro] to create pGL4.82-hEF1α. It was constructed.
６－２）ウミシイタケルシフェラーゼ発現ステーブルプールの作製
（６－１）で構築したウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ４．８２－Ｈｓｐａ５、ｐＧＬ４．８２－ｈＲＰＳ７、あるいは、ｐＧＬ４．８２－ｈＥＦ１αを、（１－２）に記載のＣＨＯ－Ｏ１細胞に（４－１）に記載の方法でトランスフェクションした。遺伝子導入の１日後、培養液を遠心して上清を除去、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ８ μｇ／ｍＬを含む培地で懸濁し、６ ｗｅｌｌプレートで１２日間薬剤選択培養を行った。その後、Ｔ－２５フラスコ、続いて、１２５ ｍＬ容三角フラスコにて５％ＣＯ２、３７℃で培養し、ウミシイタケルシフェラーゼ発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれのウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターでＮ＝３で作製した。
6-2) Preparation of Renilla luciferase expression stable pool The Renilla luciferase expression vector pGL4.82-Hspa5, pGL4.82-hRPS7, or pGL4.82-hEF1α constructed in (6-1) is added to (1- CHO-O1 cells described in 2) were transfected by the method described in (4-1). One day after gene transfer, the culture solution was centrifuged to remove the supernatant, suspended in a medium containing 8 μg/mL of puromycin, and subjected to drug selective culture for 12 days in a 6 well plate. Subsequently, the cells were cultured in a T-25 flask and then in a 125 mL Erlenmeyer flask in 5% CO 2 at 37° C. to prepare Renilla luciferase-expressing stable pools. Stablepools were generated with N=3 with each Renilla luciferase expression vector.
６－３）ウミシイタケルシフェラーゼ発現ステーブルプールの流加培養による生産量評価
（６－２）で作製したウミシイタケルシフェラーゼ発現ステーブルプールを用いて、１２５ ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。流加培養の３，４，７，９，１１日目の細胞についてＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて、ウミシイタケルシフェラーゼの発現量を測定した。
6-3) Evaluation of production volume by fed-batch culture of Renilla luciferase-expressing stable pool Using the Renilla luciferase-expressing stable pool prepared in (6-2), perform fed-batch culture in a 125 mL Erlenmeyer flask. rice field. G13 was used as the basal medium and F13 was used as the feed medium. The Renilla Luciferase Assay System (PROMEGA) was used to measure the expression level of Renilla luciferase in cells on
具体的には培養液を９０００Ｇ×１分間遠心して上清を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、キット添付のＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞ライセートを調製した。そして前記キットとルミノメーターを用いて、ウミシイタケルシフェラーゼの発光量を測定した。 Specifically, the culture medium was centrifuged at 9000 G for 1 minute, the supernatant was removed, and the cells were washed once with PBS, and a cell lysate was prepared using Renilla Luciferase Assay Lysis Buffer attached to the kit. Using the kit and a luminometer, the luminescence level of Renilla luciferase was measured.
生細胞数、および、１０３細胞当たりのウミシイタケルシフェラーゼ発光量の推移を、それぞれ、図７Ａ、図７Ｂに示す。培養初期の細胞では、Ｈｓｐａ５プロモーターでのウミシイタケルシフェラーゼ発光量は、コントロールとして用いたヒトＲＰＳ７プロモーターよりも高く、ヒトＥＦ１－αプロモーターと同程度であった。しかしながら、培養の中期以降の細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼ発光量は、Ｈｓｐａ５プロモーターでは経時的に上昇した一方、ヒトＲＰＳ７プロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーターでは大きく低下した。そのため、培養１１日目時点の細胞では、Ｈｓｐａ５プロモーターでのウミシイタケルシフェラーゼ発光量は、それぞれヒトＲＰＳ７プロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーターの４．５、４．８倍と大きな値を示した。すなわち、ウミシイタケルシフェラーゼの発現を試みた結果、Ｈｓｐａ５プロモーターでは、既存のヒトＲＰＳ７プロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーターと比較して、抗体発現系を上回る生産量の増強効果を確認することができた。以上より、抗体以外のタンパク質の生産においてもＨｓｐａ５プロモーターが有用であることが示された。 The number of viable cells and changes in Renilla luciferase luminescence per 10 3 cells are shown in FIGS. 7A and 7B, respectively. In cells at an early stage of culture, Renilla luciferase luminescence with the Hspa5 promoter was higher than with the human RPS7 promoter used as a control, and comparable with that with the human EF1-α promoter. However, the amount of Renilla luciferase luminescence in the cells after the middle stage of the culture increased over time with the Hspa5 promoter, while it significantly decreased with the human RPS7 promoter and the human EF1-α promoter. Therefore, in the cells on the 11th day of culture, Renilla luciferase luminescence levels with the Hspa5 promoter were 4.5 and 4.8 times higher than those of the human RPS7 promoter and human EF1-α promoter, respectively. That is, as a result of trying to express Renilla luciferase, the Hspa5 promoter was able to confirm an effect of enhancing the production amount, which exceeds that of the antibody expression system, compared to the existing human RPS7 promoter and human EF1-α promoter. From the above, it was shown that the Hspa5 promoter is also useful in the production of proteins other than antibodies.
（実施例７）流加培養での抗体発現量を指標としたＨｓｐａ５プロモーター長の検討 (Example 7) Examination of Hspa5 promoter length using antibody expression level in fed-batch culture as an indicator
７－１）抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体遺伝子Ｙ発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＲＰＳ７－Ｙの、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターをＨｓｐａ５プロモーターの部分配列に置換した、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－２．５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－２．０－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－１．５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－１．１－Ｙ、および、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－０．６－Ｙを構築した。それぞれの発現ベクターで、Ｈｓｐａ５の開始コドン配列の上流約２．５、２．０、１．５、１．１、０．６ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を、Ｈｓｐａ５プロモーターの部分配列として用いた。
7-1) Construction of antibody expression vector Humanized antibody gene Y expression vector pDSLHA4.1-hRPS7-Y, the antibody H chain and L chain gene promoters are replaced with partial sequences of the Hspa5 promoter, pDSLHA4.1-Hspa5- 2.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y, and pDSLHA4.1-Hspa5- 0.6-Y was constructed. In each expression vector, from about 2.5, 2.0, 1.5, 1.1, 0.6 kbp upstream of the initiation codon sequence of Hspa5 to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon sequence. The sequences were used as partial sequences of the Hspa5 promoter.
ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－２．５－Ｙは、以下の方法により構築した。まず、ｐＧＬ４．１０－Ｈｓｐａ５をテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲでチャイニーズハムスターＨｓｐａ５プロモーターの部分配列を増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。精製したＤＮＡ断片をＮｏｔＩ－ＸｂａＩで消化した後、Ｈ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＨ１．１－ｈＲＰＳ７－Ｙ、および、Ｌ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＬ２．１－ｈＲＰＳ７－ＹのＮｏｔＩ－ＮｈｅＩサイト間に挿入して、それぞれｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ５－２．５－Ｙ、ｐＤＳＬ２．１－Ｈｓｐａ５－２．５－Ｙを構築した。次に、ｐＤＳＬ２．１－Ｈｓｐａ５－２．５－ＹをＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られたＤＮＡ断片をｐＤＳＨ１．１－Ｈｓｐａ５－２．５－ＹのＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ間に挿入して、ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ５－２．５－Ｙを構築した。ｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ５－２．５－Ｙの発現カセット上流に特許文献２に記載のＤＮＡエレメントＡ７を挿入して、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－２．５－Ｙを構築した。同様の方法で、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－２．０－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－１．５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－１．１－Ｙ、および、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－０．６－Ｙを構築した。
Ｈｓｐａ５プロモーター ２．５ｋｂｐのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－２５００Ｆ：ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＴＣＧＧＴＧＧＴＴＡＡＧＡＧＣＡＣ（配列番号２４）
Ｈｓｐａ５－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴ（配列番号１５）
Ｈｓｐａ５プロモーター ２．０ｋｂｐのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－２０００Ｆ：ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＴＡＡＴ（配列番号２５）
Ｈｓｐａ５－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴ（配列番号１５）
Ｈｓｐａ５プロモーター １．５ｋｂｐのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－１５００Ｆ：ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＣＴＡＣＣＴＧＴＡＣＣＡＣＴＣＡ（配列番号２６）
Ｈｓｐａ５－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴ（配列番号１５）
Ｈｓｐａ５プロモーター １．１ｋｂｐのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－１１００Ｆ：ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＡＣＡＴＴＡＴＧＧＧＧＣＧＡＣ（配列番号２７）
Ｈｓｐａ５－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴ（配列番号１５）
Ｈｓｐａ５プロモーター ０．６ｋｂｐのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－６００Ｆ：ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＣＡＣＧＣＡＧＡＣＣＣＣ（配列番号２８）
Ｈｓｐａ５－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴ（配列番号１５）
pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y was constructed by the following method. First, using pGL4.10-Hspa5 as a template, the partial sequence of the Chinese hamster Hspa5 promoter was amplified by PCR using the primer set shown below and PrimeSTAR Max DNA Polymerase, and purified with the QIAquick PCR Purification kit. After digesting the purified DNA fragment with NotI-XbaI, it was inserted between the NotI-NheI sites of the H chain gene expression vector pDSH1.1-hRPS7-Y and the L chain gene expression vector pDSL2.1-hRPS7-Y. , pDSH1.1-Hspa5-2.5-Y and pDSL2.1-Hspa5-2.5-Y, respectively. Next, a DNA fragment obtained by digesting pDSL2.1-Hspa5-2.5-Y with AatII-HindIII was inserted between AatII-HindIII of pDSH1.1-Hspa5-2.5-Y to obtain pDSLH3. .1-Hspa5-2.5-Y was constructed. The DNA element A7 described in
Hspa5 promoter 2.5 kbp primer set Hspa5-NotI-2500F: GGGGGGCGGCCGCTGGTCGGTGGTTAAGAGACAC (SEQ ID NO: 24)
Hspa5-XbaI-R: GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCGCTGTGGGCCAGTGCT (SEQ ID NO: 15)
Hspa5 promoter 2.0 kbp primer set Hspa5-NotI-2000F: GGGGGGCGGCCGCTCCCAACTGGACACAGTAAT (SEQ ID NO: 25)
Hspa5-XbaI-R: GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCGCTGTGGGCCAGTGCT (SEQ ID NO: 15)
Hspa5 promoter 1.5 kbp primer set Hspa5-NotI-1500F: GGGGGGCGGCCGCAATTCTACCTGTACCACTCA (SEQ ID NO: 26)
Hspa5-XbaI-R: GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCGCTGTGGGCCAGTGCT (SEQ ID NO: 15)
Hspa5 promoter 1.1 kbp primer set Hspa5-NotI-1100F: GGGGGGCGGCCGCCGGGAACATTATGGGGCGAC (SEQ ID NO: 27)
Hspa5-XbaI-R: GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCGCTGTGGGCCAGTGCT (SEQ ID NO: 15)
Hspa5 promoter 0.6 kbp primer set Hspa5-NotI-600F: GGGGGGCGGCCGCGGAACTGACACGCAGACCCC (SEQ ID NO: 28)
Hspa5-XbaI-R: GGGGGTCTAGACTTGCCGGCGCGCTGTGGGCCAGTGCT (SEQ ID NO: 15)
７－２）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの作製
（５－１）および（７－１）で構築した抗体発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＲＰＳ７－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＥＦ１α－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－Ｙ
、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－２．５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－２．０－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－１．５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－１．１－Ｙ、あるいは、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－０．６－Ｙを、（１－２）に記載のＣＨＯ－Ｏ１細胞に（４－１）に記載の方法でトランスフェクションした。そして、（５－２）に記載の方法で薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれの抗体発現ベクターでＮ＝３で作製した。
7-2) Production of humanized antibody Y expression stable pool Antibody expression vectors pDSLHA4.1-hRPS7-Y, pDSLHA4.1-hEF1α-Y, pDSLHA4.1 constructed in (5-1) and (7-1) -Hspa5-Y
, pDSLHA4.1-Hspa5-2.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-2.0-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.5-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y, or , pDSLHA4.1-Hspa5-0.6-Y was transfected into the CHO-O1 cells described in (1-2) by the method described in (4-1). Then, drug-selective culture was performed by the method described in (5-2) to prepare a humanized antibody Y-expressing stable pool. Stablepools were generated with N=3 for each antibody expression vector.
７－３）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養による抗体生産量評価
（７－２）で作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いて、１２５ ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。
7-3) Evaluation of antibody production by fed-batch culture of humanized antibody Y-expressing stable pool Using the humanized antibody Y-expressing stable pool prepared in (7-2), fed-batch in a 125 mL Erlenmeyer flask cultured. G13 was used as the basal medium and F13 was used as the feed medium.
生細胞数、抗体生産量、１細胞１日当たりの抗体生産量（ＳＰＲ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）の推移を、それぞれ、図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃに示す。意外にも、Ｈｓｐａ５プロモーターの長さを３．０ｋｂｐから０．６あるいは１．１ｋｂｐに短くしたところ、培養初期段階から高い生産性を示し、培養５日目の時点で、抗体生産量、１細胞１日当たりの抗体生産量共に、コントロールとして用いたヒトＲＰＳ７プロモーター、ヒトＥＦ１－αプロモーターよりも高かった。更に、Ｈｓｐａ５プロモーターの長さに関わらず、培養の中期以降で１細胞１日当たりの抗体生産量が上昇し、培養１４日目時点における０．６および１．１ｋｂｐのＨｓｐａ５プロモーターでの値は、共にヒトＥＦ１－αプロモーターの２．３倍の値を示した。その結果、培養１４日目の０．６および１．１ｋｂｐのＨｓｐａ５プロモーターでの抗体生産量は共に０．５ ｇ／Ｌを上回り、それぞれヒトＥＦ１－αプロモーターでの２．１、２．０倍の値に達した。Ｈｓｐａ５プロモーターの長さを最適化することで、そのプロモーター能を最大限発揮できるようになり、現在頻繁に使用されているプロモーターでの抗体生産量を凌駕する結果が得られた。
Figures 8A, 8B, and 8C show changes in the number of viable cells, the amount of antibody produced, and the amount of antibody produced per cell per day (SPR: specific production rate), respectively. Surprisingly, when the length of the Hspa5 promoter was shortened from 3.0 kbp to 0.6 or 1.1 kbp, it showed high productivity from the initial stage of culture. Both the amount of antibody produced per day was higher than those of the human RPS7 promoter and human EF1-α promoter used as controls. Furthermore, regardless of the length of the Hspa5 promoter, the antibody production per cell per day increased after the middle stage of the culture, and the values at the 0.6 and 1.1 kbp Hspa5 promoters at the 14th day of culture were both It showed a value 2.3 times that of the human EF1-α promoter. As a result, the antibody production amounts with the 0.6 and 1.1 kbp Hspa5 promoters on
７－４）ヒト化抗体Ｙ発現モノクローンの流加培養による抗体生産量評価
（７－２）で、Ｈｓｐａ５プロモーターの部分配列０．６ｋｂｐを使用して作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールからモノクローンを取得し、流加培養による抗体生産量の評価を行った。
7-4) Evaluation of antibody production by fed-batch culture of humanized antibody Y-expressing monoclonal clones (7-2) from the humanized antibody Y-expressing stable pool prepared using the partial sequence 0.6 kbp of the Hspa5 promoter Monoclones were obtained and evaluated for antibody production by fed-batch culture.
まず、フローサイトメーターを利用して、高発現細胞の濃縮を行った。具体的には培養液を２００Ｇ×３分間遠心して上清を除去し、２％ ＢＳＡ－ＰＢＳで２回洗浄した後、２％ ＢＳＡ－ＰＢＳで再懸濁した。得られた細胞浮遊液にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏａｔ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ ＋ Ｌ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加し、４℃で３０分間静置して染色した。その後、２００Ｇ×３分間遠心して上清を除去し、２％ ＢＳＡ－ＰＢＳで２回洗浄した後、２％ ＢＳＡ－ＰＢＳで再懸濁した。得られた細胞浮遊液をＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎｓｏｒｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を利用してソーティングした。ソーティングは以下の条件で実施した。最初に、横軸にＦＳＣ－Ａｒｅａ、縦軸にＳＳＣ－Ａｒｅａを取ったドットプロットにて、ＳＳＣの値で２つに、更にＦＳＣの値で４つに分画した。そして、ＦＳＣの値が最も小さく、かつ、ＳＳＣの値が小さい分画の細胞集団において、高蛍光強度を示した上位５％の細胞集団をソーティングした。 First, high expression cells were enriched using a flow cytometer. Specifically, the culture medium was centrifuged at 200 G×3 minutes, the supernatant was removed, washed twice with 2% BSA-PBS, and then resuspended in 2% BSA-PBS. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated Goat F(ab′) 2 Fragment Anti-Human IgG (H+L) (Beckman Coulter) was added to the obtained cell suspension, and the cells were allowed to stand at 4° C. for 30 minutes for staining. . Thereafter, the cells were centrifuged at 200G×3 minutes, the supernatant was removed, washed twice with 2% BSA-PBS, and resuspended in 2% BSA-PBS. The resulting cell suspension was sorted using a BD FACS Aria Fusionsorter (Becton Dickinson). Sorting was performed under the following conditions. First, in a dot plot with FSC-Area on the horizontal axis and SSC-Area on the vertical axis, the sample was divided into two by the SSC value and four by the FSC value. Then, in the cell population fraction with the smallest FSC value and small SSC value, the top 5% cell populations exhibiting high fluorescence intensity were sorted.
次に、ソーティングした細胞集団を培養した後、軟寒天培地に懸濁、６ ｗｅｌｌプレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。培養後、ＣｌｏｎｅＰｉｘ ２を用いてヒト化抗体Ｙ高発現コロニーを９６ ｗｅｌｌプレートにピックした。ピッキングしたコロニーは、２４ ｗｅｌｌプレート、６ ｗｅｌｌプレート、Ｔ－２５フラスコ、１２５ ｍＬ容三角フラスコと順次拡大培養した。
Next, after culturing the sorted cell population, it was suspended in a soft agar medium, seeded in a 6-well plate, and cultured at 37° C. in 5% CO 2 . After culturing, using
得られたヒト化抗体Ｙ発現モノクローンについてｂａｔｃｈ培養を行って高発現モノクローンを選択した。続いて、選択したヒト化抗体Ｙ発現モノクローンについて、１２５ ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。 The resulting humanized antibody Y-expressing monoclonal clones were batch cultured to select high-expressing monoclonal clones. Subsequently, the selected humanized antibody Y-expressing monoclones were fed-batch cultured in a 125 mL Erlenmeyer flask. G13 was used as the basal medium and F13 was used as the feed medium.
生細胞数、抗体生産量、１細胞１日当たりの抗体生産量（ＳＰＲ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）の推移を、それぞれ、図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃに示す。ステーブルプールの場合と同様に、多数のクローンにおいて培養の中期以降で１細胞１日当たりの抗体生産量が上昇していた。また、評価した１２クローンのうち、５クローンが２ ｇ／Ｌ以上を示し、最も生産量が高い＃４８では約４ ｇ／Ｌに達した。以上より、プロモーター長を最適化したＨｓｐａ５プロモーターを用いることで、多数のクローンを評価しなくても高生産クローンを取得可能であり、その中に約４ ｇ／Ｌと非常に高い生産量を示すクローンが含まれていることがわかった。 Figures 9A, 9B, and 9C show changes in the number of viable cells, the amount of antibody produced, and the amount of antibody produced per cell per day (SPR: specific production rate), respectively. As in the stable pool, antibody production per cell per day increased after the middle stage of culture in many clones. In addition, among the 12 clones evaluated, 5 clones showed 2 g/L or more, and #48, which has the highest production, reached about 4 g/L. From the above, by using the Hspa5 promoter with the optimized promoter length, it is possible to obtain high-producing clones without evaluating a large number of clones, and among them, it shows a very high production amount of about 4 g / L. found to contain clones.
（実施例８）抗体発現量を指標とした、ヒト、マウス、ラットＨｓｐａ５プロモーターの流加培養による評価 (Example 8) Evaluation of human, mouse, and rat Hspa5 promoters by fed-batch culture using antibody expression level as an index
８－１）抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体遺伝子Ｙ発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＲＰＳ７－Ｙの、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子のプロモーターをヒト、マウス、ラットＨｓｐａ５プロモーターに置換した、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＨｓｐａ５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｍＨｓｐａ５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｒＨｓｐａ５－Ｙを構築した。それぞれ、Ｈｓｐａ５の開始コドン配列の上流約１．０ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドン配列に対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでの配列を、Ｈｓｐａ５プロモーターとして用いた。クローニングしたヒト、マウス、ラットＨｓｐａ５プロモーターののヌクレオチド配列をそれぞれ配列表の配列番号２、３、４に示す。
8-1) Construction of antibody expression vector Humanized antibody gene Y expression vector pDSLHA4.1-hRPS7-Y, the antibody H chain and L chain gene promoters are replaced with human, mouse, rat Hspa5 promoter, pDSLHA4.1- hHspa5-Y, pDSLHA4.1-mHspa5-Y, pDSLHA4.1-rHspa5-Y were constructed. Each sequence from approximately 1.0 kbp upstream of the Hspa5 initiation codon sequence to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon sequence was used as the Hspa5 promoter. The nucleotide sequences of the cloned human, mouse, and rat Hspa5 promoters are shown in SEQ ID NOS: 2, 3, and 4, respectively.
ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＨｓｐａ５－Ｙは、以下の方法により構築した。まず、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下に示すプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲでヒトＨｓｐａ５プロモーターを増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製した。精製したＤＮＡ断片をＮｏｔＩ－ＮｈｅＩで消化した後、Ｈ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＨ１．１－ｈＲＰＳ７－Ｙ、および、Ｌ鎖遺伝子発現ベクターｐＤＳＬ２．１－ｈＲＰＳ７－ＹのＮｏｔＩ－ＮｈｅＩサイト間に挿入して、それぞれｐＤＳＨ１．１－ｈＨｓｐａ５－Ｙ、ｐＤＳＬ２．１－ｈＨｓｐａ５－Ｙを構築した。次に、ｐＤＳＬ２．１－ｈＨｓｐａ５－ＹをＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られたＤＮＡ断片をｐＤＳＨ１．１－ｈＨｓｐａ５－ＹのＡａｔＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ間に挿入して、ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＨｓｐａ５－Ｙを構築した。ｐＤＳＬＨ３．１－ｈＨｓｐａ５－Ｙの発現カセット上流に特許文献２に記載のＤＮＡエレメントＡ７を挿入して、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＨｓｐａ５－Ｙを構築した。同様の方法で、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｍＨｓｐａ５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｒＨｓｐａ５－Ｙを構築した。
ヒトＨｓｐａ５プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ｈｕｍａｎ－ＮｏｔＩ－Ｆ：ＧＴＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＧＴＡＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣ（配列番号２９）
Ｈｓｐａ５－ｈｕｍａｎ－ＮｈｅＩ－Ｒ：ＧＴＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号３０）
マウスＨｓｐａ５プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ｍｏｕｓｅ－ＮｏｔＩ－Ｆ：ＧＧＴＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣＧＴＴＴＧＡＣＣ（配列番号３１）
Ｈｓｐａ５－ｍｏｕｓｅ－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＧＴＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＴＣＧＣＴＣ（配列番号３２）
ラットＨｓｐａ５プロモーターのプライマーセット
Ｈｓｐａ５－ｒａｔ－ＮｏｔＩ－Ｆ：ＧＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＡＡＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＧＧＡＣ（配列番号３３）
Ｈｓｐａ５－ｒａｔ－ＸｂａＩ－Ｒ：ＧＧＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＣ（配列番号３４）
pDSLHA4.1-hHspa5-Y was constructed by the following method. First, using human genomic DNA as a template, human Hspa5 promoter was amplified by PCR using the following primer set and PrimeSTAR Max DNA Polymerase, and purified with QIAquick PCR Purification kit. After digesting the purified DNA fragment with NotI-NheI, it was inserted between the NotI-NheI sites of the H chain gene expression vector pDSH1.1-hRPS7-Y and the L chain gene expression vector pDSL2.1-hRPS7-Y. , pDSH1.1-hHspa5-Y and pDSL2.1-hHspa5-Y, respectively. Next, a DNA fragment obtained by digesting pDSL2.1-hHspa5-Y with AatII-HindIII was inserted between AatII-HindIII of pDSH1.1-hHspa5-Y to construct pDSLH3.1-hHspa5-Y. did. The DNA element A7 described in
Human Hspa5 promoter primer set Hspa5-human-NotI-F: GTGTTGCGGCCGCACAGTAGGGAGGGGGACTCAGAGC (SEQ ID NO: 29)
Hspa5-human-NheI-R: GTGGGGCTAGCCTTGCCAGCCAGTTGGGCAGCAG (SEQ ID NO: 30)
Mouse Hspa5 promoter primer set Hspa5-mouse-NotI-F: GGTGGGCGGCCGCATGGTGGAAAGTGCTCGTTTGACC (SEQ ID NO: 31)
Hspa5-mouse-XbaI-R: GGTGGTCTAGAGCCGGCGCGCTGAGGACCAGTCGCTC (SEQ ID NO: 32)
Rat Hspa5 promoter primer set Hspa5-rat-NotI-F: GGTGAGCGGCCGCCTCAACGGGAGAAGGGCTCCGGAC (SEQ ID NO: 33)
Hspa5-rat-XbaI-R: GGTAGGTCTAGACTTGCCGGCGCGCTGTGGACCAGTC (SEQ ID NO: 34)
８－２）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの作製
（７－１）および（８－１）で構築した抗体発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－１．１－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－０．６－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｈＨｓｐａ５－Ｙ、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｍＨｓｐａ５－Ｙ、あるいは、ｐＤＳＬＨＡ４．１－ｒＨｓｐａ５－Ｙを、（１－２）に記載のＣＨＯ－Ｏ１細胞に（４－１）に記載の方法でトランスフェクションした。そして、（５－２）に記載の方法で薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれの抗体発現ベクターでＮ＝２で作製した。
8-2) Preparation of humanized antibody Y expression stable pool Antibody expression vector pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y, pDSLHA4.1-Hspa5-0 constructed in (7-1) and (8-1) .6-Y, pDSLHA4.1-hHspa5-Y, pDSLHA4.1-mHspa5-Y, or pDSLHA4.1-rHspa5-Y into the CHO-O1 cells described in (1-2) (4-1) were transfected by the method described in . Then, drug-selective culture was performed by the method described in (5-2) to prepare a humanized antibody Y-expressing stable pool. Stablepools were generated with N=2 for each antibody expression vector.
８－３）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養による抗体生産量評価
（８－２）で作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いて、１２５ ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。
8-3) Evaluation of antibody production by fed-batch culture of humanized antibody Y-expressing stable pool Using the humanized antibody Y-expressing stable pool prepared in (8-2), fed-batch in a 125 mL Erlenmeyer flask cultured. G13 was used as the basal medium and F13 was used as the feed medium.
生細胞数、抗体生産量、１細胞１日当たりの抗体生産量（ＳＰＲ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）の推移を、それぞれ、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃに示す。ヒト、マウス、ラットのいずれのＨｓｐａ５プロモーターを用いて作製したステーブルプールでも、チャイニーズハムスターのＨｓｐａ５プロモーターと同様に、培養の中期以降で１細胞１日当たりの抗体生産量が上昇し、高い抗体生産量を達成することができた。以上より、ヒト、マウス、ラット、チャイニーズハムスターのいずれのＨｓｐａ５プロモーターを用いた場合でも、抗体生産性を向上させることができ、その効果が生物種によらないと示唆された。 Figures 10A, 10B, and 10C show changes in the number of viable cells, the amount of antibody produced, and the amount of antibody produced per cell per day (SPR: specific production rate), respectively. In stable pools prepared using any of the human, mouse, and rat Hspa5 promoters, the antibody production per cell per day increased from the middle stage of culture onwards, as with the Chinese hamster Hspa5 promoter, resulting in high antibody production. was able to achieve From the above, it was suggested that the antibody productivity could be improved by using any of the Hspa5 promoters of humans, mice, rats, and Chinese hamsters, and that the effect does not depend on species.
（実施例９）流加培養での抗体発現量を指標としたＨｓｐａ５プロモーターとＡ７の組み合わせ効果の検討 (Example 9) Investigation of the combination effect of Hspa5 promoter and A7 using antibody expression level in fed-batch culture as an index
９－１）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの作製
（７－１）で構築したＤＮＡエレメントＡ７を含む抗体発現ベクターｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－１．１－Ｙ、あるいは、ｐＤＳＬＨＡ４．１－Ｈｓｐａ５－０．６－Ｙ、または、ＤＮＡエレメントＡ７を含まない抗体発現ベクターｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ５－１．１－Ｙ、あるいはｐＤＳＬＨ３．１－Ｈｓｐａ５－０．６－Ｙを、（１－２）に記載のＣＨＯ－Ｏ１細胞に（４－１）に記載の方法でトランスフェクションした。そして、（５－２）に記載の方法で薬剤選択培養を行い、ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを作製した。ステーブルプールはそれぞれの抗体発現ベクターでＮ＝２で作製した。
9-1) Preparation of humanized antibody Y expression stable pool Antibody expression vector pDSLHA4.1-Hspa5-1.1-Y or pDSLHA4.1-Hspa5- containing DNA element A7 constructed in (7-1) 0.6-Y, or the antibody expression vector pDSLH3.1-Hspa5-1.1-Y or pDSLH3.1-Hspa5-0.6-Y that does not contain the DNA element A7, described in (1-2) CHO-O1 cells were transfected by the method described in (4-1). Then, drug-selective culture was performed by the method described in (5-2) to prepare a humanized antibody Y-expressing stable pool. Stablepools were generated with N=2 for each antibody expression vector.
９－２）ヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールの流加培養による抗体生産量評価
（９－１）で作製したヒト化抗体Ｙ発現ステーブルプールを用いて、１２５ ｍＬ容三角フラスコにて流加培養を行った。基礎培地にＧ１３、フィード培地にＦ１３を用いた。
9-2) Evaluation of antibody production by fed-batch culture of humanized antibody Y-expressing stable pool (9-1) Using the humanized antibody Y-expressing stable pool prepared in (9-1), fed-batch in a 125 mL Erlenmeyer flask cultured. G13 was used as the basal medium and F13 was used as the feed medium.
生細胞数、抗体生産量、１細胞１日当たりの抗体生産量（ＳＰＲ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）の推移を、それぞれ図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃに示す。０．６および１．１ｋｂｐのＨｓｐａ５プロモーターのどちらを用いた場合でも、Ａ７を含む抗体発現ベクターでは、Ａ７を含まない抗体発現ベクターと比較して、抗体生
産量、１細胞１日当たりの抗体生産量共に高かった。培養１４日目時点におけるＡ７を含む０．６および１．１ｋｂｐのＨｓｐａ５プロモーターでの抗体生産量は、Ａ７を含まない０．６および１．１ｋｂｐのＨｓｐａ５プロモーターのそれぞれ２．１、１．５倍の値を示した。また、Ａ７の有無に関わらず、培養の中期以降で１細胞１日当たりの抗体生産量が上昇していた。以上より、ＤＮＡエレメントＡ７とＨｓｐａ５プロモーターを組み合わせて使用することで、相乗効果によって効果的に高生産を実現していることがわかった。
Figures 11A, 11B, and 11C show changes in the number of viable cells, the amount of antibody produced, and the amount of antibody produced per cell per day (SPR: specific production rate), respectively. Both the 0.6 and 1.1 kbp Hspa5 promoters produced antibody expression vectors containing A7, compared to antibody expression vectors not containing A7, showed higher antibody production per cell per day. both were high. The amount of antibody produced by the 0.6 and 1.1 kbp Hspa5 promoters containing A7 on
本発明の外来遺伝子の製造方法によって、治療用蛋白質や抗体等の外来遺伝子の生産性を向上させることが可能となる。特に、哺乳動物細胞の培養期間を通して、外来遺伝子発現調節機能を減弱させず、哺乳動物培養細胞の培養期間を通して外来遺伝子の強力な発現が可能なヒートショックプロテインＡ５遺伝子のプロモーターを用いる本発明の製造方法によって、生産性を向上させることが可能となる。 The method for producing foreign genes of the present invention makes it possible to improve the productivity of foreign genes such as therapeutic proteins and antibodies. In particular, the production of the present invention using a heat shock protein A5 gene promoter capable of strong expression of foreign genes throughout the culture period of mammalian cells without weakening the foreign gene expression regulation function throughout the culture period of mammalian cells. The method allows for increased productivity.
配列番号１：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５のプロモーター
配列番号２：ヒト由来Ｈｓｐａ５のプロモーター
配列番号３：マウス由来Ｈｓｐａ５のプロモーター
配列番号４：ラット由来Ｈｓｐａ５のプロモーター
配列番号５：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５のプロモーター Ｈｓｐａ５の開始コドンの上流約２．５ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号６：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５のプロモーター Ｈｓｐａ５の開始コドンの上流約２．０ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号７：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５のプロモーター Ｈｓｐａ５の開始コドンの上流約１．５ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号８：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５のプロモーター Ｈｓｐａ５の開始コドンの上流約１．１ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号９：チャイニーズハムスター由来Ｈｓｐａ５のプロモーター Ｈｓｐａ５の開始コドンの上流約０．６ｋｂｐのヌクレオチドから開始コドンに対応するヌクレオチド配列の直前のヌクレオチドまでからなるヌクレオチド配列
配列番号１０：Ｈｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ＫｐｎＩ－Ｆ
配列番号１１：Ｈｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｒ配列番号１２：ｈＥＦ１αプロモーターのプライマー ｈＥＦ１α－ＮｈｅＩ－Ｆ
配列番号１３：ｈＥＦ１αプロモーターのプライマー ｈＥＦ１α－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｒ配列番号１４：Ｈｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－Ｆ
配列番号１５：Ｈｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ＸｂａＩ－Ｒ
配列番号１６：ｈＥＦ１αプロモーターのプライマー ｈＥＦ１α－ＮｏｔＩ－Ｆ
配列番号１７：ｈＥＦ１αプロモーターのプライマー ｈＥＦ１α－ＮｈｅＩ－Ｒ
配列番号１８：ヒト化抗体ＹのＨ鎖遺伝子のプライマー ＨＣ－Ｆ
配列番号１９：ヒト化抗体ＹのＨ鎖遺伝子のプライマー ＨＣ－Ｒ
配列番号２０：Ｇａｐｄｈ遺伝子のプライマー Ｇａｐｄｈ－Ｆ
配列番号２１：Ｇａｐｄｈ遺伝子のプライマー Ｇａｐｄｈ－Ｒ
配列番号２２：ｈＲＰＳ７プロモーターのプライマー ｈＲＰＳ７－ＸｈｏＩ－Ｆ
配列番号２３：ｈＲＰＳ７プロモーターのプライマー ｈＲＰＳ７－ＨｉｎｄＩＩＩ－Ｒ配列番号２４：Ｈｓｐａ５プロモーター ２．５ｋｂｐのプライマー Ｈｓｐａ５－Ｎｏ
ｔＩ－２５００Ｆ
配列番号２５：Ｈｓｐａ５プロモーター ２．０ｋｂｐのプライマー Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－２０００Ｆ
配列番号２６：Ｈｓｐａ５プロモーター １．５ｋｂｐのプライマー Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－１５００Ｆ
配列番号２７：Ｈｓｐａ５プロモーター １．１ｋｂｐのプライマー Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－１１００Ｆ
配列番号２８：Ｈｓｐａ５プロモーター ０．６ｋｂｐのプライマー Ｈｓｐａ５－ＮｏｔＩ－６００Ｆ
配列番号２９：ヒトＨｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ｈｕｍａｎ－ＮｏｔＩ－Ｆ
配列番号３０：ヒトＨｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ｈｕｍａｎ－ＮｈｅＩ－Ｒ
配列番号３１：マウスＨｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ｍｏｕｓｅ－ＮｏｔＩ－Ｆ
配列番号３２：マウスＨｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ｍｏｕｓｅ－ＸｂａＩ－Ｒ
配列番号３３：ラットＨｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ｒａｔ－ＮｏｔＩ－Ｆ
配列番号３４：ラットＨｓｐａ５プロモーターのプライマー Ｈｓｐａ５－ｒａｔ－ＸｂａＩ－Ｒ
配列番号３５：ＤＮＡエレメントＡ２のヌクレオチド配列
配列番号３６：ＤＮＡエレメントＡ７のヌクレオチド配列
配列番号３７：ＤＮＡエレメントＡ１８のヌクレオチド配列
SEQ ID NO: 1: Chinese hamster-derived Hspa5 promoter SEQ ID NO: 2: Human-derived Hspa5 promoter SEQ ID NO: 3: Mouse-derived Hspa5 promoter SEQ ID NO: 4: Rat-derived Hspa5 promoter SEQ ID NO: 5: Chinese hamster-derived Hspa5 promoter Start of Hspa5 Nucleotide sequence consisting of nucleotides approximately 2.5 kbp upstream of the codon to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon SEQ ID NO: 6: Promoter of Hspa5 from Chinese hamster Starts nucleotides approximately 2.0 kbp upstream of the initiation codon of Hspa5 Nucleotide sequence SEQ ID NO: 7: Promoter of Hspa5 from Chinese hamster from about 1.5 kbp upstream of the start codon of Hspa5 to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the start codon. Nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 8: promoter of Hspa5 derived from Chinese hamster Nucleotide sequence consisting of nucleotides about 1.1 kbp upstream of the start codon of Hspa5 to the nucleotide immediately before the nucleotide sequence corresponding to the start codon SEQ ID NO: 9: derived from Chinese hamster Promoter of Hspa5 Nucleotide sequence SEQ ID NO: 10 consisting of nucleotides approximately 0.6 kbp upstream of the initiation codon of Hspa5 to the nucleotide immediately preceding the nucleotide sequence corresponding to the initiation codon: Hspa5 promoter primer Hspa5-KpnI-F
SEQ ID NO: 11: Hspa5 promoter primer Hspa5-HindIII-R SEQ ID NO: 12: hEF1α promoter primer hEF1α-NheI-F
SEQ ID NO: 13: hEF1α promoter primer hEF1α-HindIII-R SEQ ID NO: 14: Hspa5 promoter primer Hspa5-NotI-F
SEQ ID NO: 15: Hspa5 promoter primer Hspa5-XbaI-R
SEQ ID NO: 16: hEF1α promoter primer hEF1α-NotI-F
SEQ ID NO: 17: hEF1α promoter primer hEF1α-NheI-R
SEQ ID NO: 18: H chain gene primer HC-F of humanized antibody Y
SEQ ID NO: 19: H chain gene primer HC-R of humanized antibody Y
SEQ ID NO: 20: Gapdh gene primer Gapdh-F
SEQ ID NO: 21: Gapdh gene primer Gapdh-R
SEQ ID NO: 22: hRPS7 promoter primer hRPS7-XhoI-F
SEQ ID NO: 23: hRPS7 promoter primer hRPS7-HindIII-R SEQ ID NO: 24: Hspa5 promoter 2.5 kbp primer Hspa5-No
tI-2500F
SEQ ID NO: 25: Hspa5 promoter 2.0 kbp primer Hspa5-NotI-2000F
SEQ ID NO: 26: Hspa5 promoter 1.5 kbp primer Hspa5-NotI-1500F
SEQ ID NO: 27: Hspa5 promoter 1.1 kbp primer Hspa5-NotI-1100F
SEQ ID NO: 28: Hspa5 promoter 0.6 kbp primer Hspa5-NotI-600F
SEQ ID NO: 29: Human Hspa5 promoter primer Hspa5-human-NotI-F
SEQ ID NO: 30: Human Hspa5 promoter primer Hspa5-human-NheI-R
SEQ ID NO: 31: mouse Hspa5 promoter primer Hspa5-mouse-NotI-F
SEQ ID NO: 32: mouse Hspa5 promoter primer Hspa5-mouse-XbaI-R
SEQ ID NO: 33: Rat Hspa5 promoter primer Hspa5-rat-NotI-F
SEQ ID NO: 34: Rat Hspa5 promoter primer Hspa5-rat-XbaI-R
SEQ ID NO: 35: nucleotide sequence of DNA element A2 SEQ ID NO: 36: nucleotide sequence of DNA element A7 SEQ ID NO: 37: nucleotide sequence of DNA element A18
Claims (18)
Ａ群
（ａ）配列表の配列番号３５ に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号３６ に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ）配列表の配列番号３７ に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｄ）前記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列の全長に対して９５％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド、
（ｅ）上記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列の全長に対して９９％以上同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。 A foreign gene comprising the foreign gene expression unit according to any one of claims 4 to 7 and any one or more polynucleotides selected from the polynucleotides according to (a) to (e) of Group A below gene expression vectors;
Group A (a) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35 in the sequence listing;
(b) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 36 in the sequence listing;
(c) a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 in the sequence listing;
(d) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 95% or more identity to the full-length nucleotide sequence according to any one of (a) to (c) above, and having exogenous gene expression-enhancing activity. polynucleotide,
(e) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 99% or more identity to the full-length nucleotide sequence according to any one of (a) to (c) above, and having exogenous gene expression-enhancing activity. Polynucleotide.
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